DE69930155T2

DE69930155T2 - Spray verabreichung von zellen

Info

Publication number: DE69930155T2
Application number: DE69930155T
Authority: DE
Inventors: M. Julian MARSHALL; Ian Grant; A. Stewart CEDERHOLM-WILLIAMS; Paul East Grinstead MARTIN Robin
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: VIVOLUTION A/S, BIRKEROD, DK
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1999-12-02
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2019-12-03
Also published as: EP1143983A4; ES2257877T3; NO20012695D0; NO20012695L; DK1143983T3; EP1143983B1; NZ528340A; DE69930155D1; JP2002531176A; ATE318608T1; US6479052B1; EP1143983A1; CA2352810A1; AU764347B2; AU1840200A; WO2000032207A1

Description

Spray-Verabreichung von Zellen
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität von US 19980110614P und US 1990155403P .
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Verabreichung und Anhaftung von Zellen an Gewebe.
Bei der Behandlung von geschädigter Haut wie durch Verbrennungs- oder chronische Wunden geschädigte Haut oder anderen Wunden bestand ein Ansatz darin, das von Biopsien, typischerweise autologen Biopsien, stammende Keratinocyten zu züchten, bis eine mehrschichtige hautähnliche Schicht von der Kulturplatte durch Proteaseverdau abgenommen werden kann. Die Schwierigkeiten bei diesem Verfahren beinhalten, dass die zum Wachstum benötigte Zeit, um derartige super-konfluente Kulturen oder „Epithelschichttransplantate" zu züchten, im Bereich von drei Wochen liegt, die dünnen Schichten schwierig zu handhaben sind und die „Annahme", d.h. die stabile Anhaftung, der Schichttransplantate an das Basalgewebe der Verletzungsstelle sich als problematisch erwiesen hat. Vgl. beispielsweise Rennekampff et al., J. Surg Res. 62: 288-295, 1996. Zudem übernehmen in einer derartig hohen Dichte gezüchtete Keratinocyten eher das Wesen von nicht proliferierenden, differenzierten Zellen als von aktiv wachsenden Zellen, die zur Wundheilung beitragen. Vgl. beispielsweise Rennekampff et al. Man hat zahlreiche Ansätze unternommen, gezüchtete Keratinocyten in Wunden einzuführen, während derartige Zellen sich in einer aktiveren Wachstumsphase befinden, wie bei Rennekampff et al. besprochen. Diese beinhalteten die Züchtung der Zellen bis zur Subkonfluenz auf porösen Polymerträgern und die Applikation der Träger, die umgedreht sind, so dass die Zellen nach unten orientiert sind, auf die Wunden. Zudem haben bestimmte Forscher auf diesem Gebiet damit experimentiert, Keratinocyten mit Fibrinogen zu mischen und dann in Thrombin kurz vor der Applikation auf die Wunde zu mischen, so dass Fibrinogen in Fibrin umgewandelt wird, das eine Polymermatrix für die Keratinocyten bildet. Vgl.
Hundyadi et al., J. Dermatol. Surg. Oncol. 14: 75-78, 1988; Kaiser et al., Burns 20: 23-29, 1994. Die enzymatische Umwandlung von Fibrinogen liefert reichlich Zeit, während der die Zusammensetzung eine bearbeitbare Klebrigkeit erhält, so dass die zellenthaltende Zusammensetzung über die Wunde verteilt werden kann. Der Fibrin„Kleber" kann auch verwendet werden, um eine Schutzschicht aus allogener Leichenhaut zu fixieren.
Eine frühere Arbeit der Anmelder zusammen mit anderen, die mit den Anmeldern zusammenarbeiten, haben ein wirksames Dichtungsmittel identifiziert, das Fibrin, in einer „Fibrinmonomer"-Form, die gegen Polymerisierung stabilisiert ist, zu der Stelle liefert, die abgedichtet werden soll. An der Stelle sind die Stabilisierungsbedingungen umgekehrt, und es bildet sich ein wirksames Gerinnsel. Vgl. Edwardson et al., Europäische Patentanmeldung Nr. EP 592242 . Einer der besonderen Vorteile dieses Fibrinmonomerdichtungsmittel von EP 592242 besteht darin, dass das Dichtungsmittel nur Minuten vor dem chirurgischen Eingriff (oder unter Verwendung manueller Zubereitung innerhalb einer Stunde) aus einer geringen Menge Patientenblut schnell hergestellt werden kann, und dies kann unter Verwendung von Standardlaborgeräten erfolgen. Spezialisierte Werkzeuge zur Herstellung von Fibrinmonomer wurden ebenfalls beschrieben, und diese Werkzeuge erlauben, dass ein autologes Dichtungsmittel aus einem Patienten auf eine schnelle, hoch reproduktive, hoch verlässliche und extrem sichere Weise hergestellt wird. Vgl. Holm, „Centrifuge Reagent Delivery System", WO 96/16713, Holm et al., „Method and Device for Separating Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 und Holm, „Centrifuge with Annular Filter", WO 96/16715. Die solubilisierte Fibrinmonomerzusammensetzung kann als Dichtungsmittel, wie bei Edwardson et al., EP 592242 beschrieben, verwendet werden. Diese Verbesserungen erlauben daher, dass ein autologes Dichtungsmittel in einem schnellen, automatisierten Verfahren hergestellt wird und dass das so hergestellte autologe Dichtungsmittel frei von extrinsischen Proteinaseenzymen wie Rinderthrombin oder Rinderproteinen wie Aprotinin ist.
Ein weiteres Fibrindichtungsmittel, das ohne Verwendung eines proteolytischen Enzyms zum Polymerisieren induziert werden kann, verwendet (1) eine erste Komponente eines Fibrinanalogons, wobei der C-terminale Bereich der γ-Kette ausreichend verändert ist, um die Selbstpolymerisierung zu stören, und (2) eine zweite Komponente eines fibrinähnlichen Moleküls wie ein Fibrinogen. Vgl. CederholmWilliams, WO 9529686 A1. Bei Vereinigung der zwei Komponenten polymerisiert das Fibrinanalogon mit dem Fibrin-verwandten Molekül.
Die Anmelder haben nun gezeigt, dass Keratinocyten, die im selben Zeitrahmen auf eine Wunde gesprüht wurden wie fibrinpolymerbildende Zweikomponentensysteme auf die Wunde gesprüht und dabei gemischt wurden, wirksam sind, um Keratinocyten (und in einigen Fällen Fibroblasten) auf der Wunde in einer dreidimensionalen Fibrinpolymermatrix zu fixieren, wobei die Menge der fixierten Zellen wirksam ist, sich auszubreiten, so dass sich eine Epithelschicht bildet. In bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekten werden die Keratinocyten gleichzeitig mit dem Sprühen und Mischungen, das während des Fluges stattfinden, von einem Zweikomponentensystem aufgesprüht, das die fibrinähnlichen Moleküle des Gemisches dynamisch kompetent zum Polymerisieren macht.
Die Erfindung gilt auch für andere Zelltypen, die auf einer Gewebeoberfläche fixiert werden können, beispielsweise, um neues Gewebewachstum zu erzeugen oder die Gegenwart der Zellen für einen ausreichenden Zeitraum zu etablieren, um ein gewünschtes Ergebnis zu erreichen. Die Erfindung betrifft ferner das Aufsprühen von Zellen auf ein Gewebesubstrat ohne Fibrin oder mit anderen biokompatiblen, vorzugsweise bioabbaubaren, adhäsiven Polymeren. Die Erfindung betrifft ferner Zellen, die mit Kollagen und oder ohne Fibrin verabreicht werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt die Verwendung eines Fibrinpolymers, gebildet durch das Beschichten einer Zieloberfläche mit einer Mischung einer ersten Komponente, umfassend ein nicht polymeres fibrinähnliches Protein, und einer zweiten Komponente, die wirksam ist, um das fibrinähnliche Protein in Fibrinpolymer umzuwandeln, zur Herstellung einer beschichteten Zieloberfläche, wobei die Oberfläche eine Gewebeoberfläche eines Säugers oder solch eine Gewebeoberfläche ist, die mit einer bioabbaubaren Polymerschicht beschichtet ist, wobei die gemischten zwei Komponenten ein Fibrinpolymer mit einer Klebrigkeit bilden, die wirksam ist, um Zellen anzuheften, die in einer Suspension auf eine Zieloberfläche gesprüht werden zur Verwendung bei der Wundbehandlung bereit.
Vorzugsweise bildet sich das Fibrinpolymer in einer Menge, die wirksam ist, um eine besiedelungsfördernde Menge der Zellen auf der Zieloberfläche zu gewährleisten. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Mischen einer zellanheftungsfördernden Menge von Kollagen in das Gemisch. Vorzugsweise wird die Mischung aufgesprüht, um die Zieloberfläche zu beschichten. Die Mischung und die Suspension der Zellen können gleichzeitig aufgesprüht werden, um die Zieloberfläche zu beschichten. Vorzugsweise wird eine besiedelungsfördernde wirksame Menge der Zellen in einer dreidimensionalen Matrix aus Fibrinpolymer an der Zieloberfläche eingeschlossen.
Die Verwendung kann das Anhaften der bioabbaubaren Polymerschicht an die Gewebeoberfläche umfassen, wobei die Zellsuspension auf die Polymerschicht aufgesprüht wird, die die Zieloberfläche definiert. In einer Ausführungsform ist die Polymerschicht zusammen mit einer entfernbaren, externen Stützschicht angeheftet, die geeignet ist, den Dampftransport aus dem Gewebe weiter einzuschränken, ohne ihn zu eliminieren, und das Verfahren umfasst ferner: Entfernen der Stützschicht nach dem Anhaften der Polymerschicht an das Gewebe und anschließende Applikation der Zellsuspension. Die Polymerschicht kann ohne Einschränkung eine Glucosaminglucanpolymerschicht oder eine vernetzte Kollagenpolymerschicht umfassen.
Die Verwendung kann ferner umfassen: Züchtung autologer Zellen aus einer dem Säuger entnommenen Biopsie eines Gewebes eines bestimmten Typs und Bildung der Zellsuspension aus den gezüchteten Zellen, wobei das Gewebe, auf das die Zellen appliziert werden, von einem bestimmten Typ ist oder angrenzend an das Gewebe des bestimmten Typs liegt.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist das Gewebe eine Wunde und die Zellsuspension umfasst Keratinocyten. Vorzugsweise werden die gezüchteten Keratinocyten einer die Zellen für die Zellsuspension produzierenden Passage vor dem Erreichen der Konfluenz geerntet. Die Verwendung kann ferner umfassen: Sprühen einer Fibroblastensuspension auf die Wunde, die mit den gemischten zwei Komponenten beschichtet ist. Die Fibroblasten können derselben Mischung zugesetzt werden, so dass ein Fibrinpolymer erzeugt wird, einer getrennten Mischung zugesetzt werden, so dass das Polymer erzeugt wird.
In einer Ausführungsform umfasst die erste Komponente Säuresolubilisiertes Fibrin und die zweite Komponente kann eine Menge an Base umfassen, die wirksam ist, um die Mischung ausreichend zu neutralisieren, um das Fibrin polymerisieren zu lassen. Die Applikation der ersten und zweiten Komponenten (jeglicher Art) kann das Sprühen der ersten und zweiten Komponente umfassen, indem sich ein Strahl der ersten Komponente mit einem Strahl der zweiten Komponente während des Fluges von einer Sprühvorrichtung auf die Oberfläche vereinigt. Das Verfahren kann das Sprühen der Zellsuspension, ersten Komponente und zweiten Komponente umfassen, wobei sich die Strahlen der Zellsuspension, ersten Komponente und zweiten Komponente während des Fluges (von der Sprühvorrichtung auf die Oberfläche) vereinen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt [später zu vervollständigen, unter der Annahme, dass Zeichnungen verwendet werden sollen]
Definitionen
Die folgenden Begriffe sollen für die Zwecke dieser Anmeldung die jeweilige nachstehend dargelegte Bedeutung haben.

– Bioaktives Mittel. Ein bioaktives Mittel ist eine Substanz wie eine Chemikalie, die auf eine Zelle, ein Virus, Gewebe, Organ oder einen Organismus wirken kann, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Arzneistoffe (d.h. pharmazeutisch wirksame Substanzen) oder Hormone (z.B. Wachstumsfaktoren), um eine Änderung der Funktion der Zelle, des Virus, Gewebes, Organs oder Organismus hervorzurufen. Vorzugsweise ist der Organismus ein Säuger, stärker bevorzugt ein Mensch.
– Zellanhaftungsfordernde wirksame Kollagenmenge. Eine zellanhaftungsfördernde wirksame Kollagenmenge ist eine Menge, die die Zellmenge reduziert, die für eine besiedelungsfördernde wirksame Menge der Zellen oder die gewebewachstumsfördernde wirksame Menge der Zellen benötigt wird.
– Besiedelungsfördernde wirksame Menge der Zellen. Eine besiedelungsfördernde wirksame Menge der anhaftenden Zellen ist eine Menge, die wirksam ist, um zur Bildung von Kolonien zu führen oder um zu einem Niedelassen der Zellen zu führen, die wirksam ist, um eine physiologische Änderung bei dem Tier zu verursachen (wenn die anhaftenden Zellen rekombinante Zellen sind, die ein biologisch aktives rekombinantes Mittel produzieren und exportieren), oder um zur Bildung von neuem Gewebe zu führen.
– Dynamische Fibrinsysteme. Dynamische Fibrinsysteme sind binäre fibrinpolymerbildende Systeme, die bei Mischung der beiden Komponenten fibrinähnliche Moleküle erzeugen, die dynamisch kompetent zum Polymerisieren sind.
– Dynamisch kompetent zum Polymerisieren. Der Ausdruck, dass fibrinähnliche Moleküle einer Mischung dynamisch kompetent zum Polymerisieren sind, gibt an, dass jede Barriere zur Polymersierungskompetenz rein eine Funktion der Mischungsdynamik oder der schnellen Kinetik erster Ordnung für jegliche tertiäre Strukturänderungen ist, die auf veränderte Bedingungen des Gemisches wie den pH-Wert zurückzuführen sind.
– Fibrinähnliches Protein. Ein fibrinähnliches Protein basiert auf zwei Paaren von Fibrin-α-Ketten, zwei Paaren von Fibrin-β-Ketten und zwei Paaren von Fibrin-γ-Ketten, die man in Fibrinen oder Fibrinogen findet. Ein fibrinähnliches Protein ist leicht in eine Form umzuwandeln oder kann leicht in eine Form umgewandelt werden, die dynamisch kompetent zum Polymerisieren ist. Wie ansonsten in diesem Dokument angemerkt, können zahlreiche Formen von fibrinabstammenden oder darauf basierenden Molekülen verwendet werden, um ein Fibrinpolymer herzustellen, und sind daher fibrinähnliche Proteine.
– Gewebewachstumsfördernde, wirksame Menge der Zellen. Eine gewebewachstumsfördernde, wirksame Menge der anhaftenden Zellen ist eine besiedelungsfördernde wirksame Menge, die zur Bildung von neuem Gewebe führt.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Zellen werden auf ein Gewebesubstrat gesprüht, wobei die Fibringel-bildenden Komponenten in genügend kurzer Zeit zuvor aufgesprüht wurden, so dass das Fibrinpolymer nicht zu sehr ausgereift ist, um ausreichend Klebrigkeit zu besitzen, um die gesprühten Zellen anzuheften. Vorzugsweise sind die fibrinähnlichen Komponenten zu einem hinreichenden Gel gereift, um adhäsiver zu sein als eine der zwei zur Bildung des Gels gemischten Komponentenzusamensetzungen. Am meisten bevorzugt werden die beiden Komponenten und die Zellen gleichzeitig aufgesprüht, was bedeutet, dass sowohl die Sprühvorrichtung für das Dichtungsmittel als auch die Sprühvorrichtung für die Zellsuspension zu gleichen Zeit in Betrieb sind, wobei die Strahlen auf dasselbe Gewebe gerichtet sind.
Vorzugsweise ist die Bildung von Fibrin, das dynamisch kompetent zum Polymerisieren ist, unabhängig von jeglichen proteolytischen Umwandlungen der fibrinähnlichen Moleküle. Eine schnelle Rate der Fibrinpolymerisierung ist ein wichtiger Aspekt, der einen deutlichen Vorteil gegenüber Fibrinogen/Thrombin/Zellgemischen bereitstellt. Die schnelle Polymerisierung erlaubt die rasche Applikation einer dünnen Fibrinschicht und von Zellen auf im Wesentlichen jede Körperoberfläche oder -höhle. Bei Ansätzen, die eine ungenügende Anfangsadhäsivität bereitstellen, können Probleme mit dem „Auslauf" aus nicht horizontalen Oberflächen auftreten.
In den Studien, über die hier berichtet wird, wird das erfindungsgemäße Verfahren als Vehikel verwendet, um Wunden mit aktiv wachsenden monodispergierten Keratinocytensuspensionen unter Verwendung zweier aneinander befestigter Sprühvorrichtungen zu erzeugen, um Zellen und Fibrindichtungsmittel auf kleine experimentelle Wunden zu sprühen. Die Gesamtzahl und Lebensfähigkeit der auf diese Weise verabreichten Zellen wurden in vitro und in vivo abgeschätzt, und man glaubt, dass in gewissem Maße ein Zellverlust auftritt. Die nachgewiesenen Verluste können ein Verlust von fragilen Zellen sein, die sich der natürlichen Alterung nähern oder die Verluste können auf das Sprühapplikationssystem zurückzuführen sein, das nicht für die Verabreichung von Zellen optimiert wurde. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Variationen im Luftstrom einen signifikanten Effekt haben.
Zelltypen: Gewebetypen
Die auf ein Gewebesubstrat erfindungsgemäß einzuführenden Zellen schließen ohne Einschränkung Keratinocyten, Fibroblasten, Hepatocyten, Pankreaszellen, Lungenzellen, Muskelzellen (glatte, Herz-, gestreifte), Chondrocyten, Osteoblasten, Endothelzellen, befruchtete Eizellen, Nebennierenzellen und Neuronen ein. Die Zellen können erfindungsgemäß appliziert werden, um das Gewebewachstum zu ergänzen oder zu etablieren. Typischerweise werden die Zellen auf ein Gewebesubstrat appliziert, das geeignet für das gewünschte Gewebewachstum gelegen ist. Die applizierten Zellen können Zellen einschließen, die in vitro oder in situ zu einem modifizierten Phänotyp transformiert wurden, wie Zellen, die transformiert wurden, um ein nützliches bioaktives Mittel herzustellen, oder Zellen eines bestimmten Gewebes, die transformiert wurden, um einen genetischen Defekt zu verbessern. In diesem letzteren Fall kann das gewünschte Ergebnis durch mindestens eine leichte Besiedelung der transformierten Zellen am Substratgewebe erreicht werden, an das sie angeheftet sind. Die Zellen können beispielsweise wie durch eine Endoskopievorrichtung auf Lungengewebe aufgesprüht werden, um eine therapeutische Produktion eines bioaktiven Mittels für einen Zeitraum bereitzustellen. Für Zellen, die durch Einbau eines geeigneten Vektors in situ transformiert werden, kann das Fibrin als Verstärkungsmittel der Transformation fungieren, wie bei US-Seriennummer 60/089,543, eingereicht am 17. Juni 1998, und US Seriennummer 09/334,325, eingereicht am16. Juni 1999, diskutiert.
Gewebe, an die die Zellen haften, schließen ohne Einschränkung die basalen Strukturen einer Wunde (die abhängig von der Wundtiefe das basale Epidermisgewebe, die Dermis oder Muskelfaszien umfassen können), Lunge, Leber, Peritoneum oder Myocard ein. Das Vorhandensein einer Wunde im Gewebeepithel stellt ein bevorzugtes Substrat bereit.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine geeignete Fibroblastensuspension, wobei die Fibroblasten vorzugsweise autolog sind, mittels Sprühen auf eine Wunde in Verbindung mit der Sprühverabreichung der Keratinocyten appliziert. Die Fibroblasten beschleunigen dann die Bildung einer Hautschicht, um eine bessere Anhaftungshilfe für die sich neu bildende Epidermisschicht bereitzustellen.
Zellen können direkt von Spendergewebe wie Biopsien oder Blut stammen oder ex vivo gezüchtet werden.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Aspekt schließen (oder umfassen) (a) die primär aufgesprühten Zellen rekombinant transformierte Zellen ein, um ein bioaktives Mittel wie einen Wachstumsfaktor zu exprimieren, der bei der Züchtung oder Aufrechterhaltung der primären Zellen hilfreich ist, oder (b) so transformierte sekundäre Zellen werden den primären aufgesprühten Zellen zugegeben. Die rekombinanten Zellen können stabile Transformanten sein, was bedeutet, dass das neue Merkmal entweder mit oder ohne selektive Bedingungen stabil aufrechterhalten wird. Man kann erwarten, dass derartige stabile Transformanten den rekombinanten Expressionsphänotyp über einen verlängerten Zeitraum aufrechterhalten. Oder die rekombinanten Zellen können transiente Transformanten sein, von denen man erwarten kann, dass sie den Expressionsphänotyp über einige Generationen oder weniger verlieren. Derartige transient transformierte Zellen können durch gemeinsame Applikation auf das Zielgewebe eines geeigneten transformationsinduzierenden Vektors mit Primärzellen erzeugt werden. In bestimmten Ausführungsformen erfolgt die rekombinant induzierte Expression des bioaktiven Mittels am wünschenswertesten früh nach der Applikation der Zellen auf das Gewebeziel, zu der Zeit, während der die Zellen am geringsten durch Blutversorgung oder andere Hilfsmechanismen des Wirtstieres unterstützt werden. Daher können transient transformierte Zellen oder transformierte Zellen, von denen man erwarten kann, dass sie eine begrenzte Lebensfähigkeit an der Stelle des Gewebeziels besitzen, nützlich verwendet werden, um eine frühe Expression der geeigneten bioaktiven Mittel bereitzustellen.
Zweikomponenten-Fibrinsysteme
Die Erfindung kann in Verbindung mit jedem Zweikomponentensystem verwendet werden, das sich kombinieren lässt, so dass sich ein Fibrinpolymer ergibt. Derartige Zweikomponentensysteme schließen herkömmliche Fibrindichtungsmittel ein, wobei das Fibrinogen mit einem Umwandlungsenzym (d.h. einem Enzym, das wirksam ist, eine ausreichende Menge an Fibrinpeptiden zu entfernen, um wirksames Fibrin zu erzeugen) gemischt wird. Derartige Systeme werden beispielsweise bei Hundyadi et al., J. Dermatol. Surg. Oncol. 14: 75-78, 1988 und Kaiser et al., Burns 20: 23-29, 1994, beschrieben. Stärker bevorzugt werden Systeme, bei denen die einzige Barriere zur Polymerisierung eine reversible Änderung der physikalischen Form des Fibrins oder die Trennung von zwei Komponenten ist, die wirksam sind, ein binäres Fibrinpolymer zu bilden. Diese Systeme erzeugen beim Mischen Fibrin, das „dynamisch kompetent zum Polymerisieren" ist, wie vorstehend definiert, und können als „dynamische Fibrinsysteme" bezeichnet werden. Bei diesen Systemen können die zwei Komponenten im Flug während des Sprühens gemischt werden, um schnell ein Polymer zu bilden, so dass eine viskose, zellfixierende Zusammensetzung auf das Empfängergewebe gesprüht wird.
Stärker bevorzugt ist die Verwendung einer ersten Komponente, die Fibrin ist (vorzugsweise Fibrin I), das in relativ milder Säure gelöst ist, und einer zweiten Komponente, die eine ausreichende Menge an Base ist, um die ersten Komponente zu neutralisieren, so dass das Mischen der beiden Komponenten das Fibrin dabei in eine polymerisierungskompetente Form (d.h. dynamisch kompetent zum Polymerisieren) umwandelt. Diese Art des Zweikomponentensystems kann rasch aus autologem Blut hergestellt werden. Die Fibrinkomponente trägt genügend Prothrombin und Faktor XIII, so dass die Bereitstellung von Calciumionen in der zweiten Komponente wirksam ist, Thrombin zu aktivieren, und dadurch die Reifung von Fibrin zu Fibrin II und die Aktivierung von Faktor XIII zu initiieren, um die Fibrinvernetzung bereitzustellen.
Spezialisierte Werkzeuge zur Herstellung von derartigem solubilisiertem Fibrin oder „Fibrinmonomer" wurden beschrieben, und diese Werkzeuge erlauben, das ein autologes Dichtungsmittel aus einem Patienten auf eine schnelle, hoch reproduktive, hoch verlässliche und extrem sichere Weise hergestellt wird. Vgl. Holm, „Centrifuge Reagent Delivery System", WO 96/16713, Holm et al., „Method and Device for Separating Fibrin I from Blood Plasma", WO 96/16714 und Holm, „Centrifuge with Annular Filter", WO 96/16715. Diese Patentanmeldungen beschreiben eine geformte Vorrichtung, die in einer Zentrifuge betrieben wird. Eine erste Kammer des Gerätes wird mit Blut gefüllt und ein Zentrifugationsvorgang trennt das Plasma von einer pelletierten zellulären Blutfraktion. Das Plasma wird in eine zweite Kammer übertragen, in die ein kovalent an Biotin gebundenes Umwandlungsenzym eingebracht wird. Das Enzym bewirkt, dass das Fibrinogen im Plasma zu Fibrin umgewandelt wird, wobei die Fibrinmoleküle aneinander binden, um Polymere zu bilden, die präzipitieren, um einen Feststoff zu bilden. Das Fibrinpräzipitat wird durch Zentrifugation pelletiert, und das übrige Plasma wird in die erste Kammer zurücktransferiert. Das pelletierte Fibrinpräzipitat wird mit einer solubilisierenden Flüssigkeit gelöst, die sehr häufig eine wässrige, bei einem sauren pH-Wert gepufferte Lösung ist. Die viskose Fibrinmonomerlösung wird mit Agarosekügelchen gemischt, die Avidin gebunden haben, um Spuren des biotiylierten Umwandlungsenzyms zu entfernen, und dann in eine dritte Kammer (beispielsweise eine Spritze) über einen Filter gespült, der die Agarosekügelchen entfernt. Die zurückgehaltene Agarose enthält jegliches Restenzym, das über die hochaffine Avindin-Biotin-Interaktion gebunden ist.
In einem bevorzugten Aspekt wird die Fibrinzusammensetzung an geeigneten Wachstumsfaktoren wie Fibroblasten-Wachstumsfaktoren oder Thrombocyten-Wachstumsfaktoren angereichert. In einem anderen Aspekt werden die Zellen gemeinsam mit Thrombocyten oder Makrophagen oder anderen von Blut abstammenden Zellen verabreicht. Vorzugsweise sind derartige gemeinsam verabreichte Zellen autolog.
Es sollte angemerkt werden, dass während autologe Fibrin-, Keratinocytenquellen oder Quellen von anderen Zellen bevorzugt werden, andere Quellen häufig geeignet sind. Derartige Quellen schließen frisch gefrorenes Plasma (autolog, Einzelspender etc.) oder Gesamtblut von der Blutbank ein.
Die Zusammensetzungen, die fibrinähnliche Proteine liefern, schließen ferner vorzugsweise assoziierte Proteine ein. Fibronektin liegt beispielsweise vorzugsweise in einer Menge von 3 μg/ml bis 1000 μg/ml oder mehr, stärker bevorzugt von 30 μg/ml bis 60 μg/ml oder mehr vor.
Prothrombin liegt vorzugsweise auf einer Gewichts- oder einer Aktivitäts- zu einer Volumenbasis in einer Menge von 100% oder mehr, stärker bevorzugt 30-60% oder mehr vor, wobei die prozentuale Menge sich auf die ursprüngliche Plasmakonzentration von Prothrombin bezieht. Faktor XIII liegt vorzugsweise in einer Menge von 20-2000%, stärker bevorzugt 200-1000% oder mehr vor, wobei die prozentuale Menge sich auf die ursprüngliche Plasmakonzentration von Faktor XIII bezieht.
Polymere Träger
In einigen Zusammenhängen, insbesondere bei der Wundversorgung, kann es wünschenswert sein, eine Beschichtung eines bioabbaubaren Polymers bereitzustellen, das die Anhaftung und Infiltration der gewünschten Zellen zulässt.
Polyurethanmembranverbände, die als derartige Beschichtungen nützlich sind, schließen Hydroderm^TM (Wilshire Medical, Inc., Dallas, TX) und Spyrofilm^TM (Polymedica Inc., Denver, CO) ein, die mit einer biokompatiblen Haftbeschichtung geliefert werden. Auf Hyaluronsäure basierende Membranen, die als derartige Beschichtungen nützlich sind, schließen Laserskin^TM (Fidia Advanced Biopolymers, Abano Terme, Italien) ein.
Weitere nützliche Beschichtungen schließen ein: EpiGen^TM-Polymermembran (T.J. Smith & Nephew; Limited, HU3 2BN ENGLAND); Apligraft^TM-Träger (Vgl. Eaglstein et al., „Tissue Engineering and Development of Apligraft in a Human Skin Equivalent," Clinical Therapeutics 19: 894-905,1997; Vertrieb durch Novartis AG), wobei Apligraft^TM ein auf Fibrin basierender Träger ist, der lebende Epidermis- und Dermiszellen enthält und daraus besteht; und BioSeed^TM-Träger (Vgl. Horch et al., „Fibrin Glue and a Carrier for Cultured Human Keratinocyte Suspensions versus Epidermal Skin Grafts," Zusammenfassung 1997 Annual Meeting, American Institute of Chemical Engineering. Wissenschaftliche Veröffentlichung 52H).
Derartige nützliche Polymerbeschichtungen schließen auch Integra^®-Kunsthaut (Integra Life Sciences, Plainsboro, NJ) ein. Integra^®-Kunsthaut ist ein Membrandoppelschichtsystem zum Dermisersatz. Eine Hautersatzschicht wird aus einer porösen Fasermatrix aus vernetztem Rindersehnenkollagen und Glycosaminglycan (Chondroitin-6-sulfat) hergestellt. Die poröse Matrix wird mit kontrollierter Porosität und definierter Abbaurate hergestellt. Eine vorläufige Epidermisersatzschicht wird aus synthetischem Polysiloxanpolymer (Silikon) hergestellt und hat die Funktion, den Feuchtigkeitsverlust aus der Wunde zu kontrollieren. Die kollagenenthaltende Hautersatzschicht dient als Matrix für die Infiltration von Fibroblasten, Makrophagen, Lymphocyten und Kapillaren, die vom Wundbett stammen. Wenn die Heilung voranschreitet, wird eine Kollagenmatrix durch Fibroblasten abgelagert; gleichzeitig wird die Hautschicht der Integra^®-Kunsthaut abgebaut. Vgl. Burke et al., Annals of Surgery 194: 413-427,1981.
Es ist zu beachten, dass diese Erfindung mit der Verwendung einer Membranträgerbeschichtung veranschaulicht wird, aber ein derartiger Träger ist nicht erforderlich. Im Zusammenhang mit der Wundversorgung kann ein derartiger Träger als Träger bei der Bereitstellung einer Barriere z. B. bezüglich des Dampftransportes fungieren. Jedoch stehen andere Verfahren zur Verfügung, eine Wundversorgung bereitzustellen, während das Epidermisgewebe (mit dem erfindungsgemäßen Verfahren) gebildet wird. Beispielsweise können allogene Hautransplantate wie ein Spalthauttransplantat über die aufgesprühten Zellen appliziert werden, um eine Schutzschicht bereitzustellen. In diesem Zusammenhang dient der Fibrinkleber ferner dazu, das Hauttransplantat zu fixieren. Derartige Transplantate weisen typischerweise Glycerin im Falle der allotransplantierten deepithelialisierten Dermis oder der Spalthauttransplantate auf.
Daher stellt die Erfindung eine Alternative zur Bildung einer Epidermis auf der Integra-Hautersatzschicht, zur Verwendung von Spalthauttransplantaten, zu gezüchteten epithelialen Autotransplantaten und dergleichen bereit.
Sprühvorrichtungen
Ein Zweikomponenten-Fibrinsystem kann durch jede Art von im Fachgebiet bekannten Vorrichtungen aufgesprüht werden. Typischerweise sollte das Vermischen kurz vor, während oder unmittelbar nach dem Sprühen erfolgen. Das Mischen, das unmittelbar vor dem Sprühen erfolgt, muss ausreichend zeitnah zum Sprühereignis erfolgen, so dass die Viskosität noch nicht hoch genug ist, um die Tröpfchenbildung zu stören. Im Falle der dynamischen Fibrinsysteme wird ein derartiges vorheriges Mischen, außer von kurzer Dauer, aufgrund der Schnelligkeit, mit der die Viskosität sich erhöht, nicht bevorzugt.
Eine bevorzugte Sprühvorrichtung würde die zwei Komponenten des Fibrinsystems im Flug während des Sprühvorgangs mischen. In einem derartigen System stellt die Mischungskinetik zweier Ströme eine wesentliche Mischungsdynamik bereit. Weitere Mischungsdynamik kann durch die Änderungen der kinetischen Energie bei Kollision der vereinigten Ströme mit dem Zielgewebe erzeugt werden. Eine Vorrichtung ist bei Holm, US-Patent 5,605,541 beschrieben. Die Holm-Vorrichtung besitzt einen zentralen Gasauslass und zwei Ringauslässe, die um den Gasauslass angeordnet sind. Der innere Ringauslass liefert bevorzugt den Neutralisierungspuffer, während der äußere Ringauslass die Fibrinkomponente liefert. Der zentrale Gasauslass hilft, die ausgehenden Ströme zu formen und zu vereinigen. Eine zweite Sprühvorrichtung kann zur ersten ausgerichtet werden, so dass sowohl Zellen als auch Fibrin zum Zielgewebe abgegeben werden. Die Holm-Vorrichtung kann weiter modifiziert werden, so dass ein dritter Auslass wie ein Ringauslass für die Zellsuspension bereitgestellt wird.
Besonders bevorzugte Sprühvorrichtungen werden bei WO 97/20585 und WO 98/20931 beschrieben. Die in diesen Patentanmeldungen beschriebenen Sprühvorrichtungen umfassen Mehrfachlumenkanäle mit Lumendurchmessern mit typischerweise 300 μm oder weniger. Die Auslässe der Lumina münden zu einer flachen Oberfläche aus. Bei drei Lumina sind die Lumina am Auslass vorzugsweise entlang einer geraden Linie ausgerichtet. Beispielsweise kann das eine äußere Lumen verwendet werden, um Luft oder ein anderes Gas zu liefern, das mittlere Lumen kann verwendet werden, um das Fibrinmonomer zu liefern und das andere äußere Lumen kann verwendet werden, um die Basenlösung mit niedrigem Volumen zu liefern. Vorzugsweise besitzen die Flüssigkeitsauslässe einen Durchmesser unter 250 Mikrons wie 25 Mikrons bis 150 Mikrons oder 50 Mikrons bis 125 Mikrons, während der Gasauslass vorzugsweise 20 bis 50% größer ist. Beispielsweise können die Auslässe entlang einer geraden Linie ausgerichtet werden, wobei auf einen 150 Mikron-Gasauslass zwei 100 Mikron-Flüssigkeitsauslässe folgen. Vorzugsweise betragen kombinierte Flüssigkeitsströme weniger als 3,0 ml/min wie 0,5 bis 0,7 ml/min. Die Flüssigkeitsauslässe sind vorzugsweise räumlich angeordnet, so dass die Tröpfchen, die die Auslässe verlassen, einander überschneiden oder berühren.
Gasströme betragen, wenn sie verwendet werden, 500 ml/min bis 800 ml/min. Ein benachbarter Gasstrom tendiert dazu, in den Flüssigkeitsstrom gezogen zu werden und den Strom in kleineren Tröpfchen zu dispergieren, wobei ein „Dispersionsspray" erzeugt wird. Wenn kein Gasstrom verwendet wird, erfolgt die Flüssigkeitsverabreichung in Tropfen oder einem Strom und nicht so sehr als Tröpfchendispersion wie konische Dispersion. Die Verabreichung von Flüssigkeiten durch derartige ausgestoßene Tropfen oder Ströme macht eine Sprühform aus. Derartige ausgestoßene Tropfen oder Ströme können bevorzugt werden, wenn konzentrierte Applikation gewünscht ist.
Wenn die Zellsuspensionen alleine aufgesprüht werden, werden vorzugsweise die vorstehend beschriebenen niedrigen Flüssigkeitsfließraten verwendet.
Die Zellsuspension kann von derselben Sprühvorrichtung verabreicht werden, die das Zweikomponentenfibrinsystem liefert. Beispielsweise kann die Ausführungsform von 9 von WO 98/20931, die mindestens drei Auslässe zur Verabreichung von Flüssigkeiten besitzt, verwendet werden.
Rekombinantes Fibrinogen und Fibrin
Mit Gentechnik können Fibrinogen und Fibrinmonomere in vergleichsweise hohen Erträgen, in wesentlich reiner Form und ohne pathogene Viren wie Hepatitis und HIV hergestellt werden. Die heterologe Expression von Fibrinogen- und Fibrinketten erlaubt auch die Konstruktion von Mutationen, die die natürlich auftretenden Fibrinvarianten nachahmen können, sowie die Isolierung und das Studium dieser Proteine, ohne dass Patienten mit diesen seltenen Gendefekten benötigt werden.
Jede der drei verschiedenen Polypeptidketten (Aα, Bβ und γ) von Fibrinogen wird von einem getrennten Gen codiert. Die cDNAs für jede dieser Ketten wurden hergestellt (Chung et al., Ann. NY. Acad. Sci. 408:449-450, 1983; Rixen et al., Biochemistry 22:3237-3244, 1983; Chung et al., Biochemistry 22:3244-3250, 1983; Chung et al., Biochemistry 22:3250-3256,1983) und in prokaryontischen Organismen exprimiert.
Ferner wurde jede menschliche Fibrinogenkette getrennt (Huang et al., J. Biol. Chem. 268:8919-8926, 1993; Roy et al., J. Biol. Chem. 267:23151-23158, 1992; Roy et al., J. Biol. Chem. 266:4758-4763, 1991) oder in Kombination (Hartwig und Danishefsky, J. Biol. Chem. 266:6578-6585, 1991; Huang et al., J. Biol. Chem. 268:8919-8926,1993; Roy et al., 1991, J. Biol. Chem, 266:4758-4763; Redman und Samar, US-Patent-Anmeldung 07/663,380, eingereicht März 1991, erhältlich vom Natl. Technology Information Service Nr. PAT-APPL07663 380INZ) in Expressionsplasmide eingeführt und in eukaryontische Zellen transfiziert.
Die meisten bei der Expression von rekombinantem menschlichem Fibrinogen verwendeten Plasmide stammen von denjenigen, die von Dr. D. Chung, University of Washington, Seattle, konstruiert wurden und basieren auf cDNA-Clonen (Rixen et al., Biochemistry 22:3237-3244, 1983; Chung et al., Biochemistry 22:3244-3250, 1983; Chung et al., Biochemistry 22:3250-3256,1983). Die Expression von rekombinanten Fibrinogenketten wurde zuerst in E. coli erreicht (Bolyard und Lord, Gene 66:183, 1988; Bolyard und Lord, Blood, 73:1202-1206,1989; Lord und Fowlkes, Blood, 73:166-171, 1989). Die einzeln exprimierten Ketten zeigen antigene Ähnlichkeiten mit Fibrinogen und zeigen Thrombin spaltbare Stellen, die denjenigen ähneln, die man bei nativem Fibrinogen findet (Bolyard und Lord, Blood, 73:1202-1206,1989; Lord und Fowlkes, Blood, 73:166-171, 1989). Die Fibrinpeptide A und B können aus rekombinantem Fibrinogen freigesetzt werden (Bolyard und Lord, Blood, 73:1202-1206,1989; Lord und Fowlkes, Blood, 73:166-171, 1989).
Man hat gezeigt, dass eukaryontische Zellen, die die geeigneten Expressionsplasmide tragen, die einzelne Fibrinogenketten codieren, die codierten Fibrinogenketten synthetisieren und intrazellulär dimere Kettenmoleküle bilden, z.B. Aα₂-, Bβ₂- oder γ₂-Dimere (Roy et al., J. Biol. Chem. 265: 6389-6393, 1990; Zhang und Redman, J. Biol. Chem. 267: 21727-21732, 1992). Wenn geeignete Plasmide, die Gene enthalten, die alle drei menschlichen Fibrinogenketten codieren, in dieselbe Zelle übertragen werden, dann werden ferner nicht nur alle drei Ketten exprimiert, sondern die Polypeptidketten assoziieren in Paaren und intaktes Fibrinogen wird in das umgebende Medium sekretiert (Roy et al., J. Biol. Chem. 266:4758-4763, 1991; Hartwig und Danishefsky, J. Biol. Chem. 266:6578-6585, 1991). Wie natürliches Fibrinogen besteht das sekretierte rekombinante Fibrinogen aus drei Paaren mit unterschiedlichen Polypeptidketten und ist bei der Bildung von Fibrinpolymeren funktional.
Fibrin wird natürlicherweise von der Leber synthetisiert und in Kultur gehaltene Megakaryocytenzellen und transformierte Leberzellen können die Fibrinogensynthese und -sekretion fortsetzen (Vgl. Otto et al., J. Cell. Biol. 105:1067-1072, 1987; Yu et al., Thromb. Res. 46:281-293, 1987; Alving et al., Arch. Biochem. Biophys. 217:19, 1982). Eine derartige Zelllinie sind die Hep G2-Zellen (Drs. Knowles und Aden, Wister Institute, Philadelphia). Diese Linie synthetisiert einen Überschuss an Aα- und γ-Ketten gegenüber den Bβ-Ketten, was zu unproduktiven dimeren Komplexen der α- und γ-Ketten (z.B. Aα2γ2) führt. Das Einführen eines zusätzlichen Bβ-Ketten codierenden Expressionsvektors führte zur Bildung von trimeren Komplexen (AαBβy), die die korrekte Faltung und Intraketten-Disulfidbrückenbildungmuster übernehmen (Roy et al., J. Biol. Chem. 265: 6389-6393, 1990). Der Mechanismus dieser Faltung ist unbekannt, und es können Hilfsproteine und Enzyme beteiligt sein (Roy et al., J. Biol. Chem. 267:23151-23158, 1992). Diese Studien zeigten nicht nur die korrekte Transkription von Bβ-cDNA, sondern auch, dass die überschüssige Bβ-Kette den Zusammenbau und die Sekretion von intaktem Fibrinogen verstärkt.
In Hep G2-Zellen assoziieren die trimeren AαBβy-Komplexe in Paaren, so dass sich intakte Fibrinogenmoleküle bilden, die glycosyliert werden und aktiv von der Zelle sekretiert werden (Huang et al., J. Biol. Chem. 268:8919-8926, 1993). Allerdings werden nur korrekt zusammengebaute Fibrinogenmoleküle sekretiert. Daher besitzen Hep G2-Zellen den Synthese- und sekretorischen Apparat zum Zusammenbau von Fibrinogen.
Bei nachfolgenden Experimenten wurden Fibrinogenketten codierende cDNA-Plasmide in eukaryontische Zellen eingeführt, die Fibrinogen normalerweise nicht synthetisieren. Diese Experimente erzeugten erfolgreich funktionales Fibrinogen, was zeigt, dass die für den Fibrinogen-Zusammenbau und die Sekretion benötigten Faktoren nicht für die von der Leber stammenden Zellen wie Hep G2 einzigartig sind. Eukaryontische Zellen, von denen bekannt ist, dass sie rekombinantes Fibrinogen zusammenbauen und sekretieren können, schließen Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK), COS-Zellen und Chinesische Hamster-Ovarien-Zellen (CHO) ein (Roy et al., J. Biol. Chem. 266:4758-4763, 1991; Hartwig und Danishefsky, J. Biol. Chem. 266:6578-6585, 1991; Farrell et al., Biochemistry 30:9414-9420, 1991).
Intaktes funktionales Fibrinogen, das von stabil transformierten eukaryontischen Zellen sekretiert wird, führt zur Akkumulation von Fibrinogenspiegeln von etwa 1-2 μg/ml: Es sind Verfahren zur Steigerung des Ertrags rekombinanter Proteine aus transfizierten Zellen wie CHO bekannt, so dass sich der Expressionsspiegel einem Tausendfachen des basalen sekretorischen Spiegels annähern kann.
Eine zusätzliche Beschreibung der Verfahren zur rekombinanten Herstellung fibrinähnlicher Moleküle kann man bei PCT/US95/05527 finden.
Kollagen
Die Erfindung betrifft das Sprühen von Zellen auf eine Gewebeoberfläche, die mit zellanhaftungsfördernden wirksamen Kollagenmengen beschichtet ist. Vorzugsweise wird das Kollagen auf die Gewebeoberfläche gesprüht.
Andere adhäsive Matrices
Zellen können auch in anderen polymeren Haftmitteln oder viskositätsverstärkenden, auf Polymer basierenden Zusammensetzungen gesprüht werden. Vorzugsweise wird das adhäsive oder viskositätsverstärkende Polymer gemeinsam verabreicht, wie mit einem der vorstehend beschriebenen Mehrfachauslass-Sprühvorrichtungen. Beispielsweise können Zellen mit adhäsiven Zusammensetzungen, umfassend Kollagen, Hyaluronsäure oder andere geeignete Polymere, verabreicht werden. Zumindest im Falle von bestimmten Polymerzusammensetzungen mit Mehrfachsäuregruppen wie Hyaluronsäure besitzt eine saure Lösung eine signifikant niedrigere Viskosität, so dass das Mischen in Verbindung mit der Applikation einer Basenlösung die Viskosität erhöht. Daher können derartige Polymere bequemer mit einem Mischungsvorgang verabreicht werden, der demjenigen ähnelt, der bei säuresolubilisiertem Fibrin verwendet wird.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung weiter, sollten aber natürlich nicht so ausgelegt werden, dass sie in irgendeiner Weise ihren Umfang einschränken.
Beispiel 1 – Herstellung des Fibrinmonomers
Das biochemische Verfahren zur Herstellung von Fibrinmonomer ist vollautomatisch und wurde früher beschrieben (Kjaergard et al Cardiovascular Engineering 2:204-206, 1997). 120 ml des Patientenblutes werden in dem Präparationsansatz mit Natriumcitrat zur Antikoagulation gemischt. Mit rascher zyklischer Zentrifugation werden 60 ml Plasma isoliert, das man mit biotinyliertem Batroxobin 10 Minuten bei 37°C reagieren lässt. Der Biotin-Batroxobin-Komplex katalysiert die Freisetzung von Fibrinpeptid A aus Fibrinogen, aktiviert jedoch nicht Faktor XIII, was zur Bildung eines Fibrin I-Polymers führt, das säurelöslich ist. Das Fibrin I-Polymer wird durch Zentrifugation isoliert und in 3,5 ml 0,2 M Natriumacetatpuffer (pH 4,0) gelöst. Kovalent an Agarose gebundenes Avidin wird der Lösung zugegeben, um das Biotin-Batroxobin an Agarose zu komplexieren. Der Biotin-Batroxobin:Avidin-Agarose-Komplex wird dann von der Fibrin I-Lösung durch Filtration getrennt.
Die saure Fibrin I-Lösung wird in eine Phiole gezogen und an eine Applikatoreinheit übertragen. Eine Spritze in der Applikatoreinheit enthält 0,75 M Carbonat/Bicarbonatpuffer (pH 10). Die beiden Lösungen werden gleichzeitig verabreicht und gründlich während des Verabreichungsvorganges gemischt. Mischen bei einem Verhältnis von 7:1 (Fibrin I:Puffer) initiiert die Polymerisierung. Bei einem neutralen pH-Wert, der auf das Mischen zurückzuführen ist, und in Gegenwart von Calciumionen, die vom Carbonat/Bicarbonatpuffer geliefert werden, wird das endogene Prothrombin in Thrombin umgewandelt, was dazu führt, dass das Fibrinpeptid B aus Fibrin 1 gespalten wird, so dass sich Fibrin II bildet. Thrombin aktiviert auch Faktor XIII, der auf Fibrin II wirkt, so dass sich ein stabiles Fibrin II-Polymer bildet. Bei Studien am Menschen ist der Vorgang nach 30 Minuten beendet und es ergeben sich etwa 4,5 ml konzentriertes Fibrindichtungsmittel, das reich an fibrinassoziierten Proteinen einschließlich Fibronektin ist.
Beispiel 2 – Zeltwachstum auf Fibrinpolymer
Eine in-vitro-Studie wurde durchgeführt, um zu bewerten, ob subkonfluente Schweine-Keratinocyten polymerisiertes Fibrindichtungsmittel (hergestellt unter Verwendung des Verfahrens aus Bespiel 1) als Substrat zur Anhaftung und zum Wachstum nutzen konnten. Polymerisiertes Fibrindichtungsmittel wurde aus Proben mit Fibrin I-Lösung, hergestellt aus einer einzigen Spende von Schweineblut, unter Verwendung des Verfahrens aus Bespiel 1 hergestellt. Die Fibrin I-Konzentration in der Lösung betrug 23,64 mg ml^–1und der pH-Wert betrug 4,43. Es wurde eine einzelne Plastikgewebekulturtestplatte mit 24 Vertiefungen verwendet (innerer Durchmesser der Vertiefung 0,8 cm). Die Versuchsgruppen werden in der folgenden Tabelle beschrieben:
Figur 8.1a: Gruppen für in-vitro-Studie des Schweine-Keratinocyten-Wachstums auf Fibrindichtungsmittel.
Zu jeder der 6 Vertiefungen wurden 150 μI Fibrin I-Lösung zugegeben. Zu jeder der 3 Vertiefungen in Gruppe 1 wurden 750 μI DMEM-Kulturmedium (enthaltend 10% FKS) mit 50 ml 50 μg/ml Typ I-Rattenschwanz-Kollagenlösung (gelöst in 0,02 M Essigsäure) zugegeben. Den 3 Vertiefungen von Gruppe 2 wurde dieselbe Lösung zugegeben, die Rattenschwanz-Kollagenlösung wurde jedoch weggelassen und durch 50 μI 0,02 M Essigsäure ersetzt. Die Fibrin I-Lösung polymerisierte sofort bei Zugabe der DMEM-Lösung. 50.000 bestrahlte 3T3-Nährzellen in 0,5 ml Keratinocyten-Wachstumsmedium wurden auf die Oberfläche des polymerisierten Fibrindichtungsmittels in den 3 Vertiefungen in Gruppe 1 appliziert und 0,5 ml Keratinocyten-Wachstumsmedium allein wurden zu den Vertiefungen in Gruppe 2 zugegeben. 100.000 (1 × 10⁵) Passage entstammende subkonfluente Schweine-Keratinocyten wurden in 0,5 ml Keratinocyten-Wachstumsmedium auf die Oberfläche aller 6 Vertiefungen appliziert. Nach 2-tägiger Züchtung wurde das Medium durch sanftes Absaugen gewechselt. Nach 4 Tagen war das Gerinnsel aus Fibrindichtungsmittel noch auf dem Boden jeder Vertiefung vorhanden. Nach einem weiteren Mediumswechsel wurde das Gerinnsel unter Verwendung eines Skalpells (Größe 11-Klinge) und mit einer gezähnten Zange von der Vertiefung abgehoben.
Jeder Gerinnsel wurde dann blockiert und in OCT-Blockierzusammensetzung eingefroren. Es wurden Gefrierschnitte mit einer Dicke von 15 μm transversal und tangential zur oberen Oberfläche des Gerinnsels angefertigt. Man hatte gehofft, dass die letzteren Schnitte eine Bewertung der Morphologie der anhaftenden Keratinocyten erlauben würde. Das Gerinnsel aus dem Fibrindichtungsmittel besitzt eine viel geringere Stärke als Gewebebiopsien, und leider fragmentierten alle derartigen Schnitte während der Herstellung der Schnitte. Die intakten transversalen Gefrierschnitte wurden fixiert und auf Keratin 14-Immunreaktivität unter Verwendung von immuncytochemischen Standardverfahren und Fluoreszenzmikroskopie gefärbt. Die Keratinocyten waren auf der Oberfläche des Gerinnsels aus Fibrindichtungsmittel in beiden Versuchsgruppen sichtbar.
Beispiel 3 – Wundversorgung
Anästhetische und chirurgische Verfahren wurden früher in diesem gut etablierten Wundmodell beschrieben (Kangesu et al., Brit J. Plastic Surg. 46:3893-4000, 1994). Drei Vollhautdefekte mit einem zirkulären Durchmesser von 4 cm wurden der exponierten Muskelfaszie an jeder Seite des Brustkorbes des Large White Pigs beigebracht. Wenn der Integra^TM-Hautersatz in diesem Modell verwendet wurde, wurde eine äußerst genaue Hämostase des Wundbettes durch sorgfältige Verwendung einer bipolaren Diathermie (d.h. Erzeugen von Hitze in Gewebe durch elektrische Ströme für medizinische oder chirurgische Zwecke) erreicht. Der Integra^TM-Hautersatz wurde auf die Art und Weise hergestellt, die bei Burke et al., (Artificial Skin, Dermal Regeneration Template, Physician Training Manual, Integra Lifesciences Corporation, 1996) beschrieben wurde, und dann in Scheiben mit einem Durchmesser von 4,5 cm geschnitten, die an die Wundbasis unter Verwendung von unterbrochenen 5°-Nähten aus monofilem Nahtmaterial genäht wurden, die 2 bis 3 mm innen zur Kante der Scheibe positioniert waren. Die Wunden wurden aus der umgebenden Haut unter Verwendung von Polytetrafluorethan (PTFE)-Kammern isoliert, die unter Verwendung von 2°-Nähten aus Seidennahtmaterial fixiert wurden. Der Integra^TM-Hautersatz wurde mit einem nichthaftenden Verband bedeckt und die Kammern mit leicht komprimierter, mit Salzlösung getränkter Gaze gefüllt. Eine mit Schaumstoff ausgekleidete Schutzhülle wurde um den Rumpf des Tieres gebunden, um irgendwelche versehentlichen Schäden an den Wunden zu verhindern. Ein Hautbiopsie zur Initiation der Keratinocytenkulturen wurde am selben Tag wie das Erzeugen von Vollhautdefekten (isoliert durch perkutane Kammern) durchgeführt und mit Integra^TM-Hautersatz auf die Rumpffaszie des Brustkorbes transplantiert.
Aus der linken externen Vena jugularis des Schweins wurde Blut entnommen. Die Vorschrift zur Herstellung von autologem Fibrindichtungsmittel entsprach Beispiel 1.
Die Vorschrift zur Transplantation des Integra^TM-Hautersatzes (oder der Kunsthaut) wurde verfeinert (wie detailliert bei Clayton und Bishop, J. Burn Care Rehabil., Bd. 19: (4):358-363, 1998, beschrieben), um konsistent hohe Annahmeraten zu erreichen.
In diesem Experiment wurde ein 10 Wochen altes Tier verwendet. Bei dieser Vorschrift betrug der Zeitraum nur 10 Tage zwischen der Erstbiopsie und der Applikation der gezüchteten Zellen. (Die Erstbiopsie konnte daher während desselben Anästhetikums entnommen werden, das verwendet wurde, um die isolierten Wunden zu erzeugen und die Integra^TM-Kunsthaut zu verwenden.) Die Verbände wurden unter allgemeiner Anästhesie am 3. und 8. Tag gewechselt.
An Tag 10 wurde das Tier betäubt und die linke externe Vena jugularis kannüliert. Etwa 4,5 cm³-Schweine-Fibrin I-Lösung wurden unter Verwendung eines einzelnen Herstellungslaufes produziert. Die Wunden wurden exponiert und die temporäre Silikongummimembran des Integra^TM-Hautersatzes entfernt. Die „Annahme" des Integra^TM-Hautersatzes bei diesem Experiment betrug in allen 6 Wunden 100%.
Sechs große (T75)-Kolben mit Keratinocyten bei einer 80-90%-igen Konfluenz wurden unter Verwendung von 5 ml vorgewärmter 0,05%-iger Trypsin/0,02%-iger Ethlendiamintetrasäure (Gibco BRL, Life Technology), die jedem Kolben zugegeben wurden, dispergiert, wobei die Kolben bei 37°C inkubiert wurden. Es dauerte 10 Minuten, um die Zellen von dem Gewebekulturkunststoffmaterial abzulösen. Die Wirkung von Trypsin wurde durch Zugabe von serumenthaltenden Medien neutralisiert. Insgesamt wurden etwa 14 × 10⁶ lebensfähige Zellen geerntet. Die Keratinocyten wurden in Keratinocytenwachstumsmedium zum Sprühen suspendiert. Die Lebensfähigkeit wurde anhand einer nicht aufgesprühten Probe am Ende des Sprühverfahrens bewertet.
Etwa 0,6 cm³ des autologen Schweine-Fibrindichtungsmittels (etwa 22 mg/ml Fibrinmonomer) und 0,6 cm³ der Schweine-Zellsuspension wurden auf die Wunden 1-3 appliziert. Etwa 0,6 cm³ des Schweine-Fibrindichtungsmittels mit Schweine-Keratocyten-Wachstumsmedien ohne Zellen wurden auf die Wunden 4-6 appliziert. Das Fibrindichtungsmittel und der Carbonat/Bicarbonatpuffer wurden mit einer Sprühvorrichtung gesprüht, und die Zellen wurden mit einer ähnlichen, auf der ersten Vorrichtung befestigten Vorrichtung gesprüht. Die Sprühköpfe wurden in einem Abstand von 2 bis 5 cm von den Wunden gehalten. Die verwendete Vorrichtung entsprach WO 97/20585, wobei drei linear ausgerichtete 300 μm Auslässe verwendet wurden, um Luft, säuregelöstes Fibrin bzw. Carbonat/Bicarbonatpuffer zu verabreichen. Die Wunden auf der linken Seite des Tieres befanden sich bei einer experimentellen Gruppe, die Wunden auf der rechten Seite des Tieres befanden sich bei einer anderen Gruppe. Mit dieser Anordnung wurde jegliche potenzielle Kontamination von Wunden mit Fibrindichtungsmittel alleine durch gesprühte Keratinocyten aus der anderen experimentellen Gruppe vermieden.
Die Zelldichte der Zellsuspension wurde auf 2,78 × 10⁶ Zellen cm^– ³ geschätzt. Die Gesamtanzahl der pro Wunde aufgesprühten Zellen wurde daher auf 1,67 × 10⁶ Zellen geschätzt. Die Lebensfähigkeit der Zellsuspension vor dem Sprühen wurde auf 92,8% geschätzt. Das Fibrindichtungsmittel polymerisierte auf der Wundoberfläche fast unmittelbar nach der Applikation.
Frühere Studien, die unter Verwendung von zweite Passage (P2)-Kerationocyten desselben Tieres erfolgten, hatten eine 63,2 (SA 5,4) %-ige Lebensfähigkeit für Zellen gezeigt, die auf 5% Agarose unter Verwendung derselben Vorrichtung (in Abwesenheit von autologem Fibrindichtungsmittel) gesprüht wurden. Daher erwartet man, dass die auf jede Wunde applizierte Gesamtanzahl der lebensfähigen Zellen etwa 1,1 × 10⁶ (oder ∼ 8,8 × 10⁴ lebensfähige Zellen cm^– ² Wundfläche) beträgt.
Eine Probe der Zellsuspension (Überschuss derjenigen, die auf die Wunden appliziert wurde) wurde auf einen mit Kollagen beschichteten 75 cm²-Gewebekulturkolben gesprüht, in dem mit 2 × 10⁶ letal bestrahlten Maus-3T3-Zellen gesät waren. Diese Zellen bildeten innerhalb von 3 Tagen eine fast konfluente Population. Diese Population wurde anschließend zwei weitere Passagen ohne offensichtliche Hemmung der Wachstumsrate im Vergleich mit nicht aufgesprühten Keratinocyten gezüchtet.
Die Wunden wurden photographiert und mit einer Schicht eines nicht adhärenten Verbands verbunden, und die Kammern wurden mit Salzlösung befeuchteter Gaze gefüllt. Etwa 5 Minuten nach der Applikation der beiden verschiedenen Wundbehandlungen wurden Stanzbiopsien von den Wunden 3 und 4 entnommen. Weitere Biopsien wurden am 4. Tag nach der Behandlung unter allgemeiner Anästhesie vorgenommen und an Tag 14 wurden die Wunden nach Tötung der Tiere entnommen.
Tag 0: An beiden Wunden war eine Überzugssschicht mit Fibrindichtungsmittel mit einer Dicke von etwa 60 μm vorhanden. Die im Dichtungsmittel suspendierten Keratinocyten waren nur in Biopsien von Wunden nachweisbar, bei denen die Zellen durch Sprühapplikation aufgebracht wurden, und besaßen eine isolierte und sphärische Morphologie.
Die Gesamtanzahl der pro Wunde applizierten Zellen (sowohl lebensfähige als auch nicht lebensfähige) wurde auf etwa 1,7 × 10⁶ geschätzt, so dass die vorhergesagte Dichte der auf die Wunde gesprühten Zellen etwa 1,3 × 10⁵ cm^– ² betrug.
Tag 4: Vier Tage nach der Behandlung mit einer Sprühmischung aus Fibrindichtungsmittel und suspendierten Keratinocyten wurden die Keratinocytenkolonien auf oder genau proximal zur Wundoberfläche nachgewiesen.
Die Fibrindichtungsmittelschicht war nicht mehr offensichtlich. Es wurden keine Keratinocyten in der Biopsie der Kontrollwunde, die nur mit dem Dichtungsmittel plus Medium behandelt worden war, nachgewiesen.
Tag 14: Zwei Wochen nach der Sprühapplikation der Fibrindichtungsmittel/Keratinocyten-Mischung war eine Epithelhülle aus mehreren Schichten auf der Wundoberfläche vorhanden. Es war kein Epithel auf der Oberfläche der Wunden vorhanden, die mit einer Mischung aus gesprühtem Fibrindichtungsmittel und Medium allein behandelt wurde.
Epidermale Bedeckung an Tag 14: Das Epithel auf der Wundoberfläche 14 Tage nach der Sprühapplikation der gezüchteten Keratinocyten wies kein Stratum corneum auf. Makroskopisch ist das Epithel durch eine Änderung der Lichtundurchlässigkeit der Wundoberfläche gekennzeichnet. Anhand der Biopsien wurde bestätigt, dass Bereiche des Epithels ein mattes Erscheinungsbild im Vergleich mit der ansonsten glitzernden Oberfläche der Wunde aufwiesen.
Die mittlere epidermale Bedeckung auf den Wunden 1-3 an Tag 14 nach der Sprühapplikation einer Mischung aus Fibrindichtungsmittel und Keratinocyten (berechnet als Prozentsatz der Gesamtwundfläche) betrug 66%, wie durch die nachstehende Tabelle veranschaulicht. Es war kein Epithel auf den Wunden 4-6 vorhanden, die mit Sprühmischung aus Fibrindichtungsmittel und Medium allein behandelt wurden.
Tabelle: Epidermale Bedeckung.
Eine allmähliche Bewegung der Integra^TM-Hautersatz-Scheibe (und daher des Wundbettes) im Hinblick auf die PTFE-Wundkammer wurde bemerkt. Man nahm an, dass die Bewegung eine Folge des Phänomens der „Wundverlagerung" aufgrund des Wachstums des Tieres war. Ein signifikanter Bruch des Wundbettes, das niemals mit dem Fibrindichtungsmittel/Keratinocyten-Spray behandelt wurde, an Tag 14 nach der Behandlung war eine Folge der Wundverschiebung. Die Rekonstitution der Epidermis, berechnet als Prozentsatz der aufgesprühten Integra^TM-Kunsthaut, wäre beträchtlich höher als die aufgezeichneten 66%, ohne das Migrationsphänomen zu berücksichtigen.
Keratin 6- und Kollagen VII-Färbung
Gewebebiopsien wurden auf Immunreaktivität gegenüber Keratin 6 und Kollagen VII gefärbt. An Tag 4 wurde keine Immunreaktivität gegenüber Keratin 6 oder Kollagen VII nachgewiesen. An Tag 14 färbten jedoch die suprabasalen Keratinocyten stark auf K6. Die Kollagen VII-Immunreaktivität war unterhalb der Epidermisflächen und unmittelbar benachbart zu Keratinocytenzysten nachweisbar. Die Kollagen VII-Immunreaktivität wurden eher in Form von mehrfachen sich überschneidenden Streifen und weniger als einzelnes kontinuierliches Band nachgewiesen. Es war weder eine Keratin 6- noch eine Kollagen VII-Immunreaktivität in Biopsien aus Wunden nachweisbar, die mit einer Mischung aus Fibrindichtungsmittel und Medium allein besprüht wurden.

Claims

Verwendung eines Fibrin-Polymers, ausgebildet durch Beschichten einer Zieloberfläche mit einer Mischung einer ersten Komponente, die ein nichtpolymeres Fibrin-ähnliches Protein umfasst, und einer zweiten Komponente, die wirksam ist zum Umwandeln des Fibrin-ähnlichen Proteins in Fibrin-Polymer, zur Herstellung einer beschichteten Zieloberfläche, wobei die Oberfläche eine Gewebeoberfläche eines Säugers ist oder solch eine Gewebeoberfläche ist, welche mit einer biologisch abbaubaren Polymerschicht beschichtet ist, wobei die gemischten zwei Komponenten ein Fibrin-Polymer mit einer Klebrigkeit ausbilden, die wirksam ist, um Zellen, welche in Suspensionen auf die beschichtete Zieloberfläche gesprüht wurden, anzuheften, zur Verwendung in der Behandlung von Wunden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei sich das Fibrin-Polymer in einer Menge ausbildet, die wirksam ist, um die Besiedelung-fördernde wirksame Menge der Zellen auf der Zieloberfläche zu gewährleisten.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, ferner umfassend das Mischen einer Zellanhaftung-fördernden wirksamen Menge von Kollagen in das Gemisch.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gemisch gesprüht wird, um die Zieloberfläche zu beschichten.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gemisch und die Suspension der Zellen gleichzeitig gesprüht werden, um die Zieloberfläche zu beschichten.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei eine Besiedelung-fördernde wirksame Menge der Zellen in einer dreidimensionalen Matrix aus Fibrin-Polymer an der Zieloberfläche eingeschlossen ist.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, ferner umfassend: das Züchten autologer Zellen aus einer dem Säuger entnommenen Biopsie eines Gewebes eines bestimmten Typs, und das Ausbilden der Zellsuspension aus den gezüchteten Zellen, wobei das Gewebe, auf das die Zellen aufgebracht werden, von dem bestimmten Typ ist oder angrenzend an Gewebe des bestimmten Typs ist.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gewebe eine Wunde ist und die Zellsuspension Keratinocyten umfasst.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, ferner umfassend: das Züchten autologer Keratinocyten aus einer dem Säuger entnommenen Biopsie, wobei das Gewebe, auf das die Zellen aufgebracht werden, eine Wunde ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die gezüchteten Keratinocyten einer die Zellen für die Zellsuspension produzierenden Passage geerntet werden, bevor sie Konfluenz erreichen.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, ferner umfassend: das Anheften einer biologisch abbaubaren Polymerschicht an die Gewebeoberfläche, indem die Zellsuspension auf die Polymerschicht, welche die Zieloberfläche bestimmt, gesprüht wird.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, weiter umfassend das Sprühen der Suspension der Fibroblasten auf die Wunde, beschichtet mit den vermischten beiden Komponenten.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die erste Komponente Säure-solubilisiertes Fibrin umfasst und die zweite Komponente eine Menge an Base umfasst, die wirksam ist, um das Gemisch ausreichend zu neutralisieren, um das Fibrin polymerisieren zu lassen.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend das Sprühen der ersten und zweiten Komponenten, indem sich ein Strahl der ersten Komponente mit einem Strahl der zweiten Komponente während des Fluges von einer Sprühvorrichtung auf die Oberfläche vereinigt.
Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend das Sprühen der Zellsuspension, ersten Komponente und zweiten Komponente, indem sich die Strahlen der Zellsuspension, ersten Komponente und zweiten Komponente während des Fluges von der Sprühvorrichtung auf die Oberfläche vereinigen.