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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Mit
der Erfindung wird das technische Gebiet der Molekulargenetik angewandt,
um die Entwicklung des Genoms von Zellen und Organismen dahin zu
fördern,
neue und verbesserte Eigenschaften anzunehmen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
WO 98/31837 (PCT/US98/00852) stellt bahnbrechende Technologien zur
Entwicklungsförderung des
Genoms von ganzen Zellen und Organismen bereit. Dem Fachmann wird
klar sein, dass die in der WO 98/31837 bereitgestellte Technologie
für den
Fachmann wesentlich ist, Zellen und ganze Organismen in ihrer Entwicklung
schnell fördern
zu können.
Das Dokument lehrt bspw. eine Vielzahl von rekursiven Verfahren
zur künstlichen
Rekombination von Nucleinsäuren
in vivo, einschließlich
ganzer Genome, und Wege zur Auswahl resultierender rekombinanter
Organismen.
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Diese
Fähigkeit,
Gene künstlich
in ihrer Entwicklung fördern
zu können,
ist von grundsätzlicher
Wichtigkeit. So werden Zellen in der Molekularbiologie, der Medizin
und in industriellen Verfahren bspw. für eine Anzahl von etablierten
Verwendungen eingesetzt. So werden bspw. Zellen gewöhnlicherweise
als Wirte zur Manipulation von DNA in Verfahren, wie bspw. der Transformation
und Rekombination eingesetzt. Zellen werden auch für die Expression
von rekombinanten Proteinen eingesetzt, welche von transformierter/transfizierter DNA
codiert sind, oder die anderweitig in die Zellen eingeführt wurden.
Einige Zell-Arten werden als Vorläufer zur Generierung von transgenen
Tieren und Pflanzen eingesetzt. Obwohl all diese Verfahren zwischenzeitlich Routineverfahren
darstellen, so hatten sich – vor
der in der WO 98/31837 offenbarten Technologie – die Genome der in diesen
Verfahren verwendeten Zellen nur wenig von den Genomen natürlicher
Zellen weiterentwickelt, und insbesondere nicht in Richtung Aneignung
neuer oder verbesserter Eigenschaften zur Verwendung in den obigen
Verfahren.
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Zusätzliche
Verfahren zur rekursiven Rekombination von Nucleinsäuren in
vivo und zur Auswahl resultierender Rekombinanten wären daher
nützlich.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Anzahl neuer und wertvoller
Verfahren sowie Zusammensetzungen für die Entwicklungsförderung
für das
Gesamtgenom oder Teile des Genoms bereit.
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EP-A-0262666
beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer Hybrid-Tomatenpflanze
aus einer Tomatenpflanze mit Wildtypus sowie eine kultivierte Spezies
einer Tomatenpflanze, bei welchem Verfahren Protoplasten fusioniert
werden, die aus Zellen jeder Spezies gebildet werden, und bei dem
anschließend eine
Hybridpflanze aus den fusionierten Protoplasten unter selektiven
Regenerationsbedingungen gewonnen wird.
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US-A-4729951
beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-Streptomyces
durch die Fusion von Protoplasten, die aus unterschiedlichen Stämmen von
Streptomyces hergestellt wurden, gefolgt von einer Regeneration
der Zellen und einem Screenen oder einer Auswahl der regenerierten
Zellen mit einem verbesserten Phänotyp
(verbesserte Antibiotika-Produktion).
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Die
US-A-5426040 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung verbesserter
Stämme
von Meeresalgen durch Protoplastenfusion, welches die Schritte des
Herstellens von Protoplasten aus Elternsporen umfasst, und zwar
unter Verwendung einer Enzymmischung, die die Zellwand verdaut.
Die US-A-5426040 beschreibt auch ein Verfahren zur direkten Aufnahme
von Fremd-DNA durch Elektroporation.
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Die
US-A-4677066 beschreibt ein Verfahren zur Förderung der Fusion von Pflanzenprotoplasten,
bei welchem die Protoplasten unter spezifischen experimentellen
Bedingungen fusioniert werden.
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Die
WO 92/17598 beschreibet ein Verfahren zur Herstellung transgener
Sojabohnenpflanzen, bei welchem Fremd-DNA in Sojabohnenprotoplasten
durch Elektroporation eingeführt
wird.
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ZUSAMMENFASSENDE
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt Verfahren zur Förderung
der Entwicklung einer Zelle dahingehend bereit, eine erwünschte Eigenschaft
zu erlangen, wie in den Ansprüchen
dargestellt.
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Solche
Verfahren können
bspw. das Einführen
einer Bibliothek von DNA-Fragmenten in eine Vielzahl von Zellen
mit sich bringen, wobei zumindest eines der Fragmente mit einem
Segment in dem Genom oder mit einem Episom der Zellen rekombiniert,
wodurch modifizierte Zellen hergestellt werden. Wahlweise werden
diese modifizierten Zellen gezüchtet,
um die Diversität
der resultierenden, rekombinierten, zellulären Population zu erhöhen. Die
modifizierten Zellen oder die rekombinierte zelluläre Population
werden anschließend
hinsichtlich modifizierter oder rekombinierter Zellen gescreent,
die sich in Richtung Aneignung der erwünschten Funktion entwickelt
haben. Anschließend
wird die DNA aus den modifizierten Zellen, die sich in Richtung
der gewünschten
Funktion entwickelt haben, wahlweise mit einer weiteren Bibliothek
an DNA-Fragmenten rekombiniert, wobei zumindest eines davon mit
einem Segment in dem Genom oder mit dem Episom der modifizierten Zellen
rekombiniert, um weitere modifizierte Zellen zu produzieren. Die
weiter modifizierten Zellen werden anschließend nach weiter modifizierten
Zellen gescreent, die sich in Richtung Aneignung der erwünschten
Funktion entwickelt haben. Die Schritte der Rekombination und des
Screenens/der Selektion werden so lange wie benötigt wiederholt, bis die weiter
modifizierten Zellen die erwünschte
Funktion erlangt haben. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden die modifizierten Zellen rekursiv rekombiniert, um die Diversität der Zellen
zu erhöhen,
und zwar bevor irgendwelche Selektions schritte bezüglich irgendwelchen
resultierenden Zellen durchgeführt
werden.
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Bei
einigen Verfahren wird die Bibliothek oder die weitere Bibliothek
an DNA-Fragmenten mit recA-Protein beschichtet, um die Rekombination
mit dem Segment des Genoms zu stimulieren. Die Fragmentbibliothek
wird wahlweise denaturiert, um einzelsträngige DNA zu produzieren, die
sich zur Bildung von Duplexen aneinander ausrichtet, und von denen
einige Fehlanpassungen an Variationsstellen in den Fragmenten enthalten.
Die Fehlanpassungen enthaltenden Duplexe werden wahlweise durch
Affinitätschromatographie
an immobilisiertem MutS selektiert.
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Wahlweise
ist die erwünschte
Funktion die Sekretion eines Proteins, und die Vielzahl an Zellen
weist ferner ein Konstrukt auf, welches für das Protein codiert. Das
Protein ist – außer bei
dessen Sekretion – wahlweise
inaktiv, und weiter modifizierte Zellen werden wahlweise hinsichtlich
der Proteinfunktion ausgewählt. Das
Protein ist wahlweise für
die Mehrzahl der Zellen toxisch, außer, wenn es sekretiert wird.
In diesem Falle werden die modifizierten oder weiter modifizierten
Zellen, die sich in Richtung der erwünschten Funktion entwickeln,
durch eine Vermehrung der Zellen und durch Gewinnen der überlebenden
Zellen gescreent.
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Bei
einigen Verfahren ist die erwünschte
Funktion eine verstärkte
Rekombination. Bei solchen Verfahren weist die Fragmentbibliothek
ein Gencluster auf, das gemeinsam zur Rekombinationsfähigkeit
beiträgt. Das
Screenen kann dadurch erreicht werden, dass Zellen verwendet werden,
die ein Gen tragen, welches für einen
Marker codiert, dessen Expression durch eine Mutation verhindert
wird, die durch Rekombination entfernt werden kann. Die Zellen werden
durch ihre Expression des Markers gescreent, der aus der Entfernung der
Mutation durch Rekombination resultiert.
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Bei
manchen Verfahren sind die Mehrzahl der Zellen Pflanzenzellen und
die erwünschte
Eigenschaft ist eine verbesserte Resistenz gegenüber einer Chemikalie oder Mikrobe.
Die modifizierten oder weiter modifizierten Zellen (oder ganzen
Pflanzen) werden der Chemikalie oder Mikrobe ausgesetzt und die
modifizierten oder weiter modifizierten Zellen, die sich in Richtung
Aneignung der erwünschten
Funktion entwickelt haben, werden bezüglich ihrer Fähigkeit
ausgewählt,
die Aussetzung zu überleben.
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Die
Mehrzahl an Zellen kann eine Vielzahl an industriellen Mikroorganismen
sein, die hinsichtlich Mikroorganismen angereichert ist, die gegenüber erwünschten
Verfahrensbedingungen tolerant sind (Hitze, Licht, Strahlung, ausgewählter pH-Wert,
Vorliegen von Detergenzien oder anderen denaturierenden Stoffen, Vorliegen
von Alkohol oder anderen organischen Molekülen, etc.).
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Die
Erfindung stellt auch Verfahren zur Entwicklungsförderung
einer Zelle bereit, eine gewünschte
Eigenschaft zu erlangen. Diese Verfahren beinhalten das Bereitstellen
einer Population unterschiedlicher Zellen. Die Zellen werden unter
Bedingungen kultiviert, bei denen DNA zwischen Zellen ausgetauscht
wird, wodurch Zellen mit Hybrid-Genomen gebildet werden. Die Zellen
werden anschließend
gescreent oder hinsichtlich Zellen ausgewählt, die sich in Richtung Aneignung
der erwünschten Eigenschaft
entwickelt haben. Der DNA-Austausch und die Screening-/Selektionsschritte
werden wie benötigt
wiederholt, wobei die gescreenten/ausgewählten Zellen aus einem Zyklus
die Population an unterschiedlichen Zellen für den nächsten Zyklus bilden, und zwar
so lange, bis eine Zelle die erwünschte
Eigenschaft erlangt hat.
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Wahlweise
kann eine Bibliothek an DNA-Fragmenten transformiert oder in die
Zellen elektroporiert werden.
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Die
Verfahren zur Entwicklungsförderung
einer Zelle, eine gewünschte
Eigenschaft zu erlangen, werden durch einen Protoplasten-vermittelten
Austausch von DNA zwischen den Zellen bewirkt. Solche Verfahren beinhalten
das Bilden von Protoplasten einer Population unterschiedlicher Zellen.
Die Protoplasten werden anschließend fusioniert, um Hybrid-Protoplasten
zu bilden, in welchen die Genome aus den Protoplasten rekombinieren,
um Hybrid-Genome zu bilden. Die Hybrid-Protoplasten werden unter
Bedingungen inkubiert, die die Regeneration der Zellen fördern. Die
regenerierten Zellen werden durch Protoplastenbindung rekombiniert,
um die Diversität
jeglicher resultierenden Zellen zu erhöhen. Die regenerierten Zellen
werden mehrere Male rekombiniert, und zwar durch Protoplastenfusion,
um eine unterschiedliche Population an Zellen zu bilden.
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Der
nächste
Schritt ist die Selektion oder das Screenen, um regenerierte Zellen
zu isolieren, die sich in Richtung Aneignung der gewünschten
Eigenschaft entwickelt haben. Der DNA-Austausch und die Selektions-/Screening-Schritte
werden wie benötigt
wiederholt, wobei die regenerierten Zellen in einem Zyklus verwendet
werden, um die Protoplasten für
den nächsten Zyklus
zu bilden, und zwar so lange, bis die regenerierten Zellen die erwünschte Eigenschaft
erlangt haben. Industrielle Mikroorganismen sind eine bevorzugte
Klasse an Organismen, um die oben beschriebenen Verfahren durchzuführen. Einige
Verfahren weisen ferner einen Schritt der Selektion oder des Screenens
nach fusionierten Protoplasten auf, die keine unfusionierten Protoplasten
der Elternzellen aufweisen. Einige Verfahren weisen ferner einen
Schritt der Selektion oder des Screenens nach fusionierten Protoplasten
auf, welche Hybrid-Genome ohne Zellen mit Eltern-Genomen besitzen.
In einigen Verfahren werden Protoplasten dadurch bereitgestellt,
dass einzelne Zellen, Myzele oder Sporen mit einem Enzym behandelt
werden, welches Zellwände
abbaut. In einigen Verfahren ist der Stamm eine Mutante, der die
Fähigkeit
zur intakten Zellwandsynthese fehlt, und bei dem sich Protoplasten
spontan bilden. In einigen Verfahren werden Protoplasten dadurch
gebildet, dass wachsende Zellen mit einem Inhibitor der Zellwandbildung
behandelt werden, um Protoplasten zu bilden.
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Bei
einigen Verfahren ist die erwünschte
Eigenschaft die Expression und/oder Sektretion eines Proteins oder
eines Sekundär-Metaboliten,
wie bspw. ein industrielles Enzym, ein therapeutisches Protein,
ein Primär-Metabolit,
wie bspw. Milchsäure
oder Ethanol, oder ein Sekundär-Metabolit,
wie bspw. Erythromycin, Cyclosporin A, oder Taxol. Bei anderen Verfahren
ist es die Fähigkeit
der Zellen, Verbindungen umzuwandeln, die der Zelle für unterschiedliche
Verbindungen verliehen wird. In noch anderen Verfahren ist die erwünschte Eigenschaft
die Fähigkeit
zur Meiose. In einigen Verfahren ist die erwünschte Eigenschaft die Kompatibilität, ein Heterokaryon
mit einem anderen Stamm zu bilden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNG
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Figuren,
die sich nicht auf die beanspruchte Erfindung beziehen, werden lediglich
zu Illustrationszwecken bereitgestellt.
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1,
Felder A–D:
Schema für
das in vitro-Shuffling von Genen.
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2:
Schema zur Anreicherung von fehlangepassten Sequenzen unter Verwendung
von MutS.
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3:
Alternatives Schema zur Anreicherung von fehlangepassten Sequenzen
unter Verwendung von MutS.
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4:
Schema zur Entwicklungsförderung
von Wachstumshormon-Genen, um größere Fische
zu produzieren.
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5:
Schema für
das Shuffling von Prokaryonten durch Protoplastenfusion.
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6:
Schema zur Einführung
eines sexuellen Zyklus in Pilzen, die zuvor keine sexuelle Reproduktion durchführen konnten.
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7:
Allgemeines Schema für
das Shuffling von Pilzen durch Protoplastenfusion.
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8:
Shuffling von Pilzen durch Protoplastenfusion, und zwar mit Protoplasten,
die durch Verwendung von Inhibitoren von Enzymen generiert wurden,
die für
die Zellwandbildung verantwortlich sind.
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9:
Shuffling von Pilzen durch Protoplastenfusion, unter Verwendung
von Pilzstämmen,
die eine fehlerhafte Zellwandsynthese besitzen, und die spontan
Protoplasten bilden.
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10: YAC-vermitteltes Gesamtgenom-Shuffling von
Saccharomyces cerevisiae und verwandten Organismen.
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11: YAC-vermitteltes Shuffling von großen DNA-Fragmenten.
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12: (A, B, C und D) DNA-Sequenzen eines
Wildtyp-recA-Proteins
und von fünf
hyperrekombinogenen Varianten davon.
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13: Aminosäuresequenzen
eines Wildtyp-recA-Proteins und von fünf hyperrekombinogenen Varianten
davon.
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14: Darstellung der Kombinatorik.
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15: Wiederholte paarweise Rekombination, zur Gewinnung
vielfach mutierter Nachkommen.
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16: Diagramm der Fitness gegenüber des
Sequenzraumes bezüglich
drei unterschiedlichen Mutationsstrategien.
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17: Diagramm der asexuellen sequenziellen Mutagenese
und der sexuellen rekursiven Rekombination.
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18: Schema für
die nicht-homologe Rekombination.
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19: Schema für
die Aufteilungs- und Poolstrategie.
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20, Feld A: Schema für die Strategie des auswählbaren/gegen-auswählbaren
Markers.
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20, Feld B: Schema der Strategie für RecA bezüglich des
auswählbaren/gegen-auswählbaren Markers.
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21: Pflanzenregenerationsstrategie für die Regeneration
Salz-toleranter Pflanzen.
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22: Gesamt-Genom-Zusammenbau von analysierten
(subklonierten) Genomen.
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23: Schema zum Blindklonieren von Gen-Homologen.
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24: Hochdurchsatz-Familien-Shuffling.
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25: Schema und Diagramm der poolweisen
Rekombination.
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26: Schema der Protoplastenfusion.
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27: Schematisches Assay für die poolweise
Rekombination.
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28: Schema des Hofs-Assays und des integrierten
Systems.
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29: Schematische Zeichnung, die das rekursive,
gepoolte Züchten
von Fischen darstellt.
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30: Schematische Zeichnung, die das rekursive,
gepoolte Züchten
von Pflanzen darstellt.
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31: Schema für
das Shuffling von S. colicolor.
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32: Schematische Zeichnung, die einen HTP-Actinorhodin-Assay
darstellt.
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33: Schematische Zeichnung und Tabelle, die das
Gesamt-Genom-Shuffling von vier Elternstämmen zeigt.
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34: Schematische Zeichnung von WGS durch ein organisiertes
Heteroduplex-Shuffling.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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1. ALLGEMEIN
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A. DER GRUNDLEGENDE ANSATZ
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Die
Erfindung stellt Verfahren zur künstlichen
Entwicklungsförderung
von Zellen bereit, eine neue oder verbesserte Eigenschaft durch
rekursive Sequenzrekombination zu erlangen. Kurz gesagt beinhaltet
die rekursive Sequenzrekombination aufeinander folgende Zyklen der
Rekombination, um eine molekulare Diversität zu bilden, sowie ein Screenen/eine
Selektion, mit welchem ein Vorteil aus der molekularen Diversität gezogen wird.
Dies bedeutet, dass ein Familie von Nucleinsäuremolekülen gebildet wird, die eine
wesentliche Sequenz- und/oder Strukturidentität aufweisen, die sich jedoch
hinsichtlich des Vorliegens von Mutationen unterscheiden. Diese
Sequenzen werden anschließend
durch eine Protoplastenfusion rekombiniert, um die Diversität der Mutanten-Kombinationen
zu optimieren, die in der entstehenden rekombinierten Bibliothek
wiedergegeben werden. Jede resultierende rekombinante Nucleinsäure oder
jedes Genom wird über
einen oder mehrere Rekombinationszyklen rekursiv rekombiniert, um
die Diversität
der entstehenden Produkte zu erhöhen.
Nach diesem rekursiven Rekombinationsverfahren werden die entstehenden
Endprodukte gescreent und/oder bezüglich eines erwünschten
Merkmals oder einer Eigenschaft ausgewählt.
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Die
Zellen, die in der Entwicklung gefördert werden sollen, können Bakterien,
Archebakterien oder eukaryontische Zellen sein, und können eine
homogene Zelllinie oder eine gemischte Kultur darstellen. Geeignete
Zellen für
die Entwicklungsförderung
schließen
die bakteriellen und eukaryontischen Zelllinien mit ein, die gegenwärtig allgemein
in der Konstruktionsgenetik, der Proteinexpression oder der industriellen
Produktion oder bei der Umwandlung von Proteinen, Enzymen, Primär-Metaboliten,
Sekundär-Metaboliten,
feinen, speziellen oder Fachchemikalien verwendet werden. Eukaryontische
Zellen von Interesse schließen
Pflanzenzellen, wie Mais, Reis, Weizen, Baumwolle, Sojabohne, Zuckerrohr,
Tabak und Arabidopsis mit ein; Algen, Pilze (penicillium, aspergillus,
podospora, neurospora, saccharomyces), Hefe (picchia und saccharomyces,
Schizosaccharomyces pombe). Ferner sind viele bakteriellen Zelltypen
von Interesse, sowohl gramnegative als auch grampositive, wie bspw.
Bacillus subtilis, B. licehniformis, B. cereus, Escherichia coli,
Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Actinomycetes, Lactobacillius,
Actinonitobacter, Deinococcus und Erwinia. Die vollständigen Genomsequenzen
von E. coli und Bacillus subtilis sind von Blattner et al., Science
277, 1454–1462
(1997); Kunst et al., Nature 390, 249–256 (1997)) beschrieben.
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Die
Entwicklungsförderung
beginnt durch die Generierung einer Population von verschiedenen
Zellen. Typischerweise sind die Zellen in der Population vom gleichen
Typus, stellen jedoch Varianten einer Vorläuferzelle dar. In manchen Fällen ist
die Variation natürlich,
wie wenn unterschiedliche Zellen von unterschiedlichen Individuen
innerhalb einer Spezies gewonnen werden, von unterschiedlichen Spezies
oder von unterschiedlichen Genera. In anderen Fällen wird die Variation durch
Mutagenese einer Vorläuferzelle
induziert. Die Mutagenese kann dadurch bewirkt werden, dass die
Zelle mutagenen Wirkstoffen ausgesetzt wird, oder wenn die Zelle
eine Mutatorzelle ist (bspw. wenn die Zelle Mutationen in Genen
besitzt, die bei DNA-Replikation
involviert sind, bei der Rekombination und/oder Reparatur, bei welchen
das Einführen
von Mutationen begünstigt ist),
und einfach durch Vermehren der Mutatorzellen. Mutatorzellen können durch
sukzessive Selektionen nach einfachen Phänotyp-Änderungen generiert werden
(wie bspw. Aneignung einer Rifampicin-Resistenz, anschließend Nalidixinsäureresistenz
und anschließend
lac– zu
lac+ (siehe Mao et al. J. Bacteriol. 179, 417–422 (1997)), oder Mutatorzellen
können
durch deren Aussetzen gegenüber
spezifischen Inhibitoren zellulärer
Faktoren generiert werden, was in den Mutator-Phänotyp resultiert. Diese können Inhibitoren
von mutS, mutL, mutD, recD, mutY, mutM, dam, uvrD und Ähnlichen
sein.
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Allgemeiner
gesagt, werden Mutationen in Zellpopulationen unter Verwendung irgendeiner
möglichen Mutationstechnik
induziert. Bekannte Mechanismen zur Induktion von Mutationen schließen – jedoch
nicht ausschließlich – die Verwendung
von Stämmen
mit ein, welche Mutationen aufweisen, wie bspw. solche, die bei
der Reparatur von Fehlanpassungen beteiligt sind, wie bspw. Mutationen
in mutS, mutT, mutL und mutH; einem Aussetzen gegenüber UV-Licht;
ferner eine chemische Mutagenese, d.h. die Verwendung von Inhibitoren
von MMR, DNA-Schädigungs-induzierbare
Gene, oder SOS-Auslöser;
eine Überproduktion/Unterproduktion/Mutation
irgendeiner Komponente des homologen Rekombinationskomplexes/Pfads,
wie bspw. RecA, ssb, etc; Überproduktion/Unterproduktion/Mutation
von Genen, die bei der DNA-Synthese/-Homeostase beteiligt sind; Überproduktion/Unterproduktion/Mutation
von Rekombinations-stimulierenden Genen aus Bakterien, Phagen (bspw.
Lambda Red-Funktion), oder anderen Organismen; Hinzufügen von
Chi-Stellen in/oder flankierend zu den Donor-DNA-Fragmenten; Beschichten
der DNA-Fragmente mit RecA/ssb und Ähnlichem.
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In
anderen Fällen
ist die Variation das Ergebnis des Transfers einer Bibliothek aus
DNA-Fragmenten in die Zellen (bspw. durch Konjugation, Protoplastenfusion,
Liposomenfusion, Transformation, Transduktion oder natürliche Kompetenz).
Zumindest eines der Fragmente, und gewöhnlich viele der Fragmente
aus der Bibliothek, zeigt eine, nicht vollständige, Sequenz- oder Strukturidentität mit einem
verwandten oder allelen Gen innerhalb der Zellen, die ausreichend
ist, eine homologe Rekombination entstehen zu lassen. So führt bspw. bei
einem Verfahren die homologe Integration eines Plasmids, welches
ein zusammengesetztes Gen oder einen Stoffwechselweg trägt, zu dem
Ein bau der Plasmidsequenzen in Angrenzung zu der genomischen Kopie. Wahlweise
wird eine gegen-auswählbare
Marker-Strategie eingesetzt, um Rekombinanten auszuwählen, bei denen
eine Rekombination zwischen homologen Sequenzen vollzogen wurde,
was zur Elimination des gegen-auswählbaren Markers geführt hat.
Diese Strategie ist in 20A dargestellt.
Eine Vielzahl von auswählbaren
und gegen-auswählbaren
Markern sind im Stand der Technik hinreichend beschrieben. Eine
Liste nützlicher
Marker findet sich bspw. in Berg und Berg (1996), Transposable element
tools for microbial genetics; Escherichia coli and Salmonella Neidhardt,
Washington, D. C., ASM Press 2: 2588–2612; LaRossa, ibid., 2527–2587. Diese
Strategie kann rekursiv wiederholt werden, um die Sequenzdiversität der Zielgene
vor dem Screenen/der Selektion bezüglich eines erwünschten
Merkmals oder einer Eigenschaft zu maximieren.
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Die
Fragmentbibliothek kann aus einer oder mehreren Quellen stammen.
Eine Quelle der Fragmente ist eine genomische Bibliothek von Fragmenten
aus unterschiedlichen Spezies, Zelltypen, Organismen oder Individuen
von den Zellen, die transfiziert werden. In diesem Fall besitzen
viele der Fragmente in der Bibliothek ein verwandtes oder alleles
Gen in den Zellen, die transformiert werden sollen, unterscheiden
sich jedoch von dem Gen auf Grund des Vorliegens von natürlich vorkommendes
Spezies-Variationen, Polymorphismen, Mutationen und im Vorliegen
von verschiedenen Kopien einiger homologer Gene in dem Genom. Alternativ
kann die Bibliothek von DNA aus dem gleichen Zelltypus abgeleitet
sein, der transformiert wird, nachdem DNA einer induzierten Mutation
unterzogen worden ist, und zwar durch herkömmliche Verfahren, wie bspw.
Bestrahlung, fehleranfällige
PCR, Wachstum in einem Mutatororganismus, Transposon- Mutagenese oder Kassetten-Mutagenese.
Alternativ kann die Bibliothek aus einer Genom-Bibliothek von Fragmenten
abgeleitet werden, die aus der gepoolten genomischen DNA einer Population
an Zellen mit den gewünschten
Merkmalen hergestellt wurde. Alternativ kann die Bibliothek aus
einer Genom-Bibliothek von Fragmenten abgeleitet sein, die aus der
gepoolten genomischen DNA einer Population von Zellen mit den erwünschten
Charakteristika hergestellt wurde.
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In
allen diesen Fällen
kann die genomische Bibliothek eine komplette genomische Bibliothek
oder eine subgenomische Bibliothek sein, die bspw. von einem ausgewählten Chromosom
abgeleitet ist, oder einem Teil eines Chromosoms oder einem episomalen
Element innerhalb einer Zelle. Genau so gut oder anstelle dieser Quellen
der DNA-Fragmente kann die Bibliothek Fragmente enthalten, die natürliche oder
ausgewählte
Varianten selektierter Gene mit bekannter Funktion darstellen (d.h.
fokussierte Bibliotheken).
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Die
Anzahl der Fragmente in der Bibliothek kann von einem einzelnen
Fragment bis zu über
1010 Fragmente variieren, wobei Bibliotheken
mit 103 bis 108 Fragmenten üblich sind.
Die Fragmente sollten hinreichend lang sein, so dass sie eine homologe
Rekombination vollziehen können,
und hinreichend kurz, so dass sie in eine Zelle eingeführt werden
können,
und, falls notwendig, vor dem Einführen manipuliert werden können. Die Fragmentgrößen können im
Bereich von 10 b bis ungefähr
20 mb reichen. Die Fragmente können
doppel- oder einzelsträngig
sein.
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Die
Fragmente können
in die Zellen als vollständige
Genome oder als Komponenten von Viren, Plasmiden, YACs, HACs oder
BACs eingeführt
werden, oder können
so wie sie sind eingeführt
werden, in welchem Falle alle oder die meisten der Fragmente keinen
Replikationsstartpunkt besitzen. Die Verwendung von viralen Fragmenten
mit einzelsträngigen
Genomen bietet den Vorteil, dass Fragmente in einzelsträngiger Form
bereitgestellt werden können,
was die Rekombination fördert.
Die Fragmente können
auch vor dem Einführen
mit einem Selektionsmarker verbunden werden. Der Einschluss von
Fragmenten in einen Vektor mit einem Replikationsstartpunkt benötigt einen
längeren
Zeitraum nach dem Einführen
in die Zelle, in welcher die Fragmente eine Rekombination mit einem
verwandten Gen eingehen können,
bevor sie abgebaut oder herausselektiert werden, und aus der Zelle
verloren gehen, wodurch der Anteil der Zellen mit rekombinanten
Genomen erhöht wird.
Wahlweise ist der Vektor ein Suizid-Vektor, der dazu in der Lage
ist, länger
als ein isoliertes DNA-Fragment zu existieren, der jedoch nicht
in der Lage ist, in der Zelllinie permanent zu verbleiben. Ein solcher
Vektor kann einen Marker transient exprimieren, und zwar für eine hinreichende
Zeit, um eine Zelle, die den Vektor trägt, zu selektieren oder zu
screenen (bspw., weil die Zellen, die durch den Vektor transduziert
wurden, der Zielzelltyp sind, der in nachfolgenden Selektionsassays
gescreent werden soll), der Vektor wird jedoch dann anschließend abgebaut
oder auf andere Weise dazu unfähig
gemacht, den Marker zu exprimieren. Die Verwendung solcher Vektoren
kann bei der Durchführung
von wahlweise aufeinander folgenden Rekombinationsrunden vorteilhaft
sein, wie nachstehend diskutiert wird. So exprimieren bspw. einige
Suizid-Vektoren ein langlebiges Toxin, welches durch ein kurzlebiges
Molekül
neutralisiert wird, das ausgehend vom gleichen Vektor exprimiert
wird. Durch die Expression des Toxins alleine kann sich der Vektor
nicht behaupten. Jense & Gerdes, Mol.
Microbiol., 17, 205–210
(1995); Bernard et al., Gene 162, 159–160. Alternativ kann ein Vektor
durch den Einbau eines defekten Replikationsstartpunkts (bspw. einem
Temperatursensitiven Replikationsstartpunkts) oder durch Weglassen
eines Replikationsursprungs suizidisch gemacht werden. Vektoren
können auch
durch den Einschluss von negativen Selektionsmarkern, wie bspw.
ura3 in Hefe oder sacB in vielen Bakterien, suizidisch gemacht werden.
Diese Gene werden nur in Gegenwart spezifischer Verbindungen toxisch. Solche
Vektoren können
derart ausgewählt
werden, dass sie eine weite Bandbreite von Stabilitäten besitzen. Eine
Liste von bedingten Replikationsdefekten für Vektoren, die eingesetzt
werden können,
um bspw. die Vektor-Replikation fehlerhaft zu machen, findet sich
bspw. in Berg & Berg
(1996, „Transposable
element tools for microbial genetics" Escherichia coli and Salmonella Neidhardt,
Washington, D. C., ASM Press, 2: 2588–2612. Eine ähnliche
Liste für
gegenauswählbare
Marker, die allgemein für
die Vektorauswahl anwendbar ist, wird auch in Berg & Berg, ebendort,
gefunden. Siehe auch LaRossa (1996) „Mutant selections linking
physiology, inhibitors, and genotypes" Escherichia coli and Salmonella F.
C. Neidhardt, Washington, D. C., ASM Press, 2: 2527–2587.
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Nach
Einführen
in die Zellen können
die Fragmente mit der in dem Genom vorliegenden DNA oder mit Episomen
der Zellen rekombinieren, und zwar durch homologe, nicht homologe
oder Stellen-spezifische Rekombination. Für die vorliegenden Zwecke stellt
die homologe Rekombination den bedeutendsten Beitrag für die Entwicklungsförderung
der Zellen dar, da diese Form der Rekombination die existierende
Diversität
zwischen der DNA der Zellen, die transfiziert werden, und den DNA-Fragmenten
amplifiziert. Wenn z.B. ein zu transfizierendes DNA-Fragment sich von
einem verwandten oder allelen Gen an zwei Positionen unterscheidet,
gibt es vier mögliche
Rekombinationsprodukte, und jedes dieser Rekombinationsprodukte
kann in unterschiedlichen Zellen in der transformierten Population
gebildet werden. Daher verdoppelt die homologe Rekombination der
Fragmente die anfängliche
Diversität
in diesem Gen. Wenn viele Fragmente mit korrespondierenden verwandten
oder allelen Genen rekombinieren, erhöht sich die Diversität der Rekombinationsprodukte
bezüglich
der Ausgangsprodukte exponentiell mit der Anzahl der Mutationen.
Die Rekombination resultiert in modifizierte Zellen mit modifizierten
Genomen und/oder Episomen. Eine rekursive Rekombination vor der
Selektion erhöht
die Diversität
der resultierenden modifizierten Zellen zusätzlich.
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Die
unterschiedlichen Zellen, egal, ob sie ein Ergebnis der natürlichen
Variation, der Mutagenese oder einer Rekombination sind, werden
gescreent oder ausgewählt,
um eine Untereinheit von Zellen zu identifizieren, die sich in Richtung
Aneignung einer neuen oder verbesserten Eigenschaft entwickelt haben.
Die Art des Screenings hängt
selbstverständlich
von der Eigenschaft ab, und mehrere Beispiele werden nachstehend
diskutiert. Vor dem anfänglichen
Screenen wird die Rekombination wiederholt. In den sich wiederholenden
Zyklen des Screenens kann die Stringenz erhöht werden.
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Die
Subpopulation an Zellen, die das Screenen überleben, wird wahlweise einer
weiteren Rekombinationsrunde unterzogen. In manchen Fällen wird
die weitere Rekombinationsrunde dadurch bewirkt, dass die Zellen
unter Bedingungen vermehrt werden, unter welchen der Austausch von
DNA zwischen den Zellen ermöglicht
wird. So können
bspw. Protoplasten aus den Zellen gebildet, fusioniert und regeneriert
werden. Zellen mit rekombinanten Genomen werden aus den fusionierten
Protoplasten vermehrt. Alternativ kann der Austausch von DNA durch
das Vermehren von Zellen oder Protoplasten in einem elektrischen
Feld gefördert
werden. Bezüglich
Zellen mit einem konjugativen Transferapparat kann der Austausch
von DNA einfach durch Vermehrung der Zellen gefördert werden.
-
Bei
anderen Verfahren wird die weitere Rekombinationsrunde durch einen
Aufteilungs- und Pool-Ansatz durchgeführt. Dies bedeutet, dass die überlebenden
Zellen in zwei Pools aufgetrennt werden. Aus einem Pool wird DNA
isoliert und wenn nötig
amplifiziert und dann anschließend
in den anderen Pool transformiert. Entsprechend stellen die DNA-Fragmente
aus dem ersten Pool eine weitere Bibliothek an Fragmenten dar und rekombinieren
mit verwandten Fragmenten in dem zweiten Pool, was in eine weitere
Diversität
resultiert. Ein Beispiel dieser Strategie ist in 19 dargestellt. wie dort gezeigt ist, wird ein
Pool an mutierten Bakterien mit Verbesserung in einem erwünschten
Phänotyp
erhalten und aufgeteilt. Aus der einen Hälfte werden Gene bspw. durch
PCR, durch Klonierung zufälliger
Genomfragmente, durch Infektion mit einem transduzierenden Phagen
und durch Ernten der transduzierenden Partikel erhalten, oder durch
zufälliges
Einführen
eines Transferstartpunkts (OriT) in das relevante Chromosom, um
eine Donorpopulation an Zellen zu schaffen, die dazu in der Lage
sind, zufällige
Fragmente durch Konjugation in eine Akzeptorpopulation zu übertragen.
Diese Gene werden dann neu zusammengebaut (in vitro durch bekannte
Verfahren oder in vivo, wie hierin offenbart wird) oder einfach
in einen allelen Ersatzvektor kloniert (wie bspw. einen, der auswählbare und
gegen-auswählbare Marker
trägt).
Der Genpool wird anschließend
in die andere Hälfte
des ursprünglichen
mutierten Pools transformiert, anschließend werden Rekombinanten selektiert
und bezüglich
weiteren Verbesserungen im Phänotyp gescreent.
Diese besten Varianten werden als Ausgangspunkt für den nächsten Zyklus
eingesetzt. Alternativ kann vor dem Screenen eine rekursive Rekombination
durch eines der genannten Verfahren durchgeführt werden, wobei die Diversität der Population
der Zellen, die gescreent werden sollen, dadurch erhöht wird.
-
In
anderen Verfahren werden einige oder alle der Zellen, die das Screenen überleben,
mit einer frischen Bibliothek an DNA-Fragmenten transfiziert, welche
gleich oder unterschiedlich von der Bibliothek sein kann, die in
der ersten Rekombinationsrunde verwendet wurde. In diesem Falle
rekombinieren die Gene in der frischen Bibliothek mit verwandten
Genen in den überlebenden
Zellen. Wenn die Gene als Komponenten eines Vektors eingeführt werden,
sollte die Kompatibilität
dieses Vektors mit jedem anderen Vektor, der in einer vorherigen
Transfektionsrunde verwendet wurde, bedacht werden. Wenn der Vektor
in einer vorherigen Runde ein Suizidvektor war, gibt es kein Problem
bezüglich
Inkompatibilität.
Wenn der Vektor, der in einer vorherigen Runde benutzt wurde, jedoch
kein Suizidvektor war, sollte ein Vektor mit einem unterschiedlichen
Inkompatibilitätsstartpunkt
in der nachfolgenden Runde verwendet werden. Bei all diesen Formaten
generiert die weitere Rekombination eine zusätzliche Diversität im DNA-Bestandteil
der Zellen, was zu weiter modifizierten Zellen führt.
-
Die
weiter modifizierten Zellen werden einer weiteren Screening-/Selektionsrunde
gemäß den gleichen
Prinzipien der ersten Runde unterzogen. Durch das Screenen/die Selektion
wird eine Sub-Population weiterer modifizierter Zellen identifiziert,
die sich weiter in Richtung Aneignung der Eigenschaft entwickelt
haben. Diese Sub-Population an Zellen kann weiteren Rekombinations-
und Screening-Runden gemäß den gleichen
Prinzipien unterzogen werden, wahlweise wird die Stringenz des Screenens
bei jeder Runde erhöht. Schließlich werden
die Zellen identifiziert, die die erwünschte Eigenschaft erlangt
haben.
-
II. DEFINITIONEN
-
Der
Ausdruck „verwandt" bezieht sich auf
eine Gensequenz, die hinsichtlich Evolution und Funktion zwischen
Spezies verwandt ist. So ist beispielsweise im menschlichen Genom
das menschliche CD4-Gen das verwandte Gen zum Maus-CD4-Gen, da die
Sequenzen und Strukturen dieser zwei Gene darauf hindeuten, dass
sie homolog sind und dass beide Gene für ein Protein kodieren, welches
bei der Signalweiterleitung der T-Zellaktivierung durch MHC-Klasse-II-restringierte
Antigenerkennung eine Rolle spielt.
-
Das
Screenen/Screening ist im Allgemeinen ein Zweischrittverfahren,
bei welchem zuerst bestimmt wird, welche Zellen einen Screening-Marker
oder Phänotyp
exprimieren oder auch nicht (oder einen ausgewählten Level an Marker oder
Phänotyp),
und bei welchem dann anschließend
die Zellen mit der erwünschten Eigenschaft
physikalisch getrennt werden. Die Selektion ist eine Form des Screenens,
bei welcher eine Identifizierung und physikalische Trennung gleichzeitig
mit der Expression eines Selektionsmarkers erreicht wird, welcher – unter
manchen genetischen Umständen – es Zellen,
die den Marker exprimieren, ermöglicht
zu überleben,
wohingegen andere Zellen sterben (oder umgekehrt). Screening-Marker
schließen
Luciferase, β-Galactosidase
und das Green-Fluorescent-Protein mit ein. Selektionsmarker schließen Arzneimittel
und Toxinresistenzgene mit ein.
-
Ein
exogenes DNA-Segment ist ein für
die Zelle fremdes (oder heterologes) Segment oder homolog zu der
Zelle, jedoch in einer Position innerhalb der Wirtszellennucleinsäure, an
welcher das Element normalerweise nicht gefunden wird. Exogene DNA-Segmente
können
exprimiert werden, um exogene Polypeptide zu erhalten.
-
Der
Ausdruck „Gen" wird in einem breiten
Sinne verwendet, um damit jedes DNA-Segment, das mit einer biologischen
Funktion assoziiert ist, zu bezeichnen. Daher schließen Gene
kodierende Sequenzen und/oder regulatorische Sequenzen mit ein,
die für
deren Expression benötigt
werden. Gene schließen
auch nicht-exprimierte DNA-Segmente ein, die bspw. Erkennungssequenzen
für andere
Proteine bilden.
-
Der
Ausdruck „identisch" oder „Prozent-Identität" im Zusammenhang
mit zwei oder mehreren Nucleinsäuren
oder Polypeptidsequenzen bezieht sich auf zwei oder mehrere Sequenzen
oder Sub-Sequenzen, die gleich sind oder einen bestimmten Prozentsatz
an Aminosäureresten
oder Nucleotiden besitzen, die gleich sind, wenn sie hinsichtlich
der maximalen Übereinstimmung
verglichen und ausgerichtet werden, wie durch Verwendung einer der
folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen oder durch visuelle Inaugenscheinnahme
bestimmt wird.
-
Der
Ausdruck „im
Wesentlichen identisch" im
Zusammenhang von zwei Nucleinsäuren
oder Polypeptiden bezieht sich auf zwei oder mehrere Sequenzen oder
Sub-Sequenzen, welche mit zumindest 60%, vorzugsweise 80% und am
bevorzugtesten mit 90 bis 95% in ihren Nucleotiden oder den Aminosäureresten übereinstimmen,
wenn sie hinsichtlich ihrer maximalen Übereinstimmung verglichen und
aneinander ausgerichtet werden, wie durch eine der folgenden Sequenzvergleichsalgorithmen
oder durch visuellen Vergleich gemessen werden kann. Eine vorwiegende
Identität
besteht vorzugsweise über
eine Region der Sequenzen, die zumindest 50 Reste lang ist, vorzugsweise über eine
Region von zumindest 100 Resten und am bevorzugtesten sind die Sequenzen
im Wesentlichen identisch über
zumindest 150 Reste. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform
sind die Sequenzen überwiegend
identisch über
die gesamte Länge
der kodierenden Regionen.
-
Für einen
Sequenzvergleich fungiert typischerweise eine Sequenz als Referenzsequenz,
mit Bezug auf welche die Testsequenzen verglichen werden. Bei Verwendung
eines Sequenzvergleichalgorithmus werden die Test- und die Referenzsequenz
in einen Computer eingegeben, die Sub-Sequenzkoordinaten bestimmt,
wenn notwendig, und die Sequenzalgorithmus-Programmparameter festgehalten.
Der Sequenzvergleichsalgorithmus berechnet dann den Prozentsatz
der Sequenzidentität
bezüglich
der Testsequenz(en) relativ zu der Referenzsequenz, basierend auf
den festgesetzten Programmparametern.
-
Eine
optimale Ausrichtung von Sequenzen für einen Vergleich kann bspw.
durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith & Waterman, Adv.
Appl. Math. 2: 482 (1981), durchgeführt werden, ferner durch den Homologieausrichtungsalgorithmus
von Needleman & Wunsch,
J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), durch das Verfahren der „Suche
nach Ähnlichkeit" von Pearson & Lipman, Proc.
Nat'l. Acad. Sci.
USA 85: 2444 (1988), und durch Computer-Implementierungen der Algorithmen GAP,
BESTFIT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package
Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,
WI.
-
Ein
anderes Beispiel für
einen nützlichen
Ausrichtungsalgorithmus ist PILEUP. PILEUP schafft eine Vielzahl
von Sequenzausrichtungen aus einer Gruppe verwandter Sequenzen,
und zwar unter Verwendung von progressiven, paarweisen Ausrichtungen,
um die Verwandtschaft und den Prozentsatz an Sequenzidentität zu zeigen.
Ferner zeichnet er einen Baum oder ein Dendogramm auf, in welchem
die Verwandtschaft bezüglich
der Clusterbildung gezeigt wird, die zur Bildung der Ausrichtung
verwendet wurde. Bei PILEUP wird eine Vereinfachung des Verfahrens
zur progressiven Ausrichtung von Feng & Doolittle eingesetzt, J. Mol. Evol. 35:
351–360
(1987). Das verwendete Verfahren ist ähnlich zu dem durch Higgins & Sharp beschriebenen
Verfahren, CABIOS 5: 151–153
(1989). Das Programm kann bis zu 300 Sequenzen ausrichten, jede
mit einer maximalen Länge
von 5.000 Nucleotiden oder Aminosäuren. Das Verfahren zur vielfachen
Ausrichtung startet mit der paarweisen Ausrichtung der zwei ähnlichsten
Sequenzen, wodurch ein Cluster von zwei ausgerichteten Sequenzen
entsteht. Dieses Cluster wird anschließend an der am engsten verwandten
Sequenz oder Cluster der ausgerichteten Sequenzen ausgerichtet.
Zwei Sequenzcluster werden durch eine einfache Verlängerung der
paarweisen Ausrichtung zweier einzelner Sequenzen ausgerichtet.
Die schließliche
Ausrichtung wird durch eine Reihe an progressiven, paarweisen Ausrichtungen
erreicht. Das Programm läuft
durch die Bestimmung spezifischer Sequenzen und deren Aminosäuren oder
Nucleotidkoordinaten bezüglich
Regionen des Sequenzvergleichs und durch die Bestimmung der Programmparameter.
So kann bspw. eine Referenzsequenz mit anderen Testsequenzen verglichen
werden, um die Verwandtschaft der Prozentsequenzidentität zu bestimmen,
unter Verwendung der folgenden Parameter: vorgegebenes Lückengewicht
(3,00), vorgegebenes Lückenlängengewicht
(0,10) und gewogene Endlücken.
-
Ein
anderes Beispiel eines Algorithmus, der zur Bestimmung der Prozentsequenzidentität und Sequenzähnlichkeit
geeignet ist, ist der BLAST-Algorithmus, der in Altschul et al.,
J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990)
beschrieben ist. Die Software zur Durchführung von BLAST-Analysen ist über das
National Center for Biotechnology Information öffentlich verfügbar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Bei diesem Algorithmus werden zunächst Sequenzpaare mit hohen
Treffern (HSPs) identifiziert, und zwar durch die Identifizierung
kurzer Wörter
der Länge
W in der nachgefragten Sequenz, welche entweder passt oder einem
positivwertigen Grenzwertbereich T genügt, wenn es mit einem Wort
der gleichen Länge
in einer Datenbanksequenz ausgerichtet wird. Auf T wird als Grenzwert
für die
Nachbarwortrate Bezug genommen (Altschul et al., siehe oben). Diese
anfänglichen
Nachbarworttreffer fungieren als Ausgangspunkte für die Einleitung
von Recherchen zur Identifizierung längerer HSPs, die diese enthalten.
Die Worttreffer werden dann in beide Richtungen verlängert, und
zwar entlang jeder Sequenz so weit, wie der kumulative Ausrichtungstreffer
gesteigert werden kann. Kumulative Treffer werden – bei Nucleotidsequenzen – unter
Verwendung der Parameter M (Belohnungstreffer für ein Paar passender Res te;
immer > 0) und N (Straftreffer
für nicht-passende
Reste; immer < 0)
berechnet. Bei Aminosäuresequenzen
wird eine Treffermatrix verwendet, um den kumulativen Treffersatz
zu berechnen. Die Verlängerung
der Worttreffer in jede Richtung wird dann gestoppt, wenn: der kumulative
Ausrichtungstreffer um die Menge X von dessen maximal erreichtem
Wert abweicht; der kumulative Treffersatz Richtung Null oder darunter
tendiert, auf Grund der Akkumulation von einem oder mehrerer negativ-zählender
Restausrichtungen; oder das Ende von einer der Sequenzen wird erreicht.
Die BLAST-Algorithmusparameter W, T und X bestimmen die Sensitivität und die
Geschwindigkeit der Ausrichtung. Das BLASTN-Programm (für Nucleotidsequenzen)
verwendet als Voreinstellungen eine Wortlänge (W) von 11, eine Erwartung
(E) von 10, M = 5, N = –4,
und einen Vergleich beider Stränge.
Bezüglich
der Aminosäuresequenzen
verwendet das BLASTP-Programm als Voreinstellungen eine Wortlänge (W)
von 3, eine Erwartung (E) von 10 und die BLOSUM62-Treffermatrix
(siehe Henikoff & Henikoff,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).
-
Zusätzlich zu
der Berechnung des Prozentsatzes der Sequenzidentität führt der
BLAST-Algorithmus auch eine statistische Ähnlichkeits-Analyse zwischen
zwei Sequenzen durch (siehe bspw. Karlin & Altschul. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90: 5873–5787
(1993)). Eine Maßgabe
bezüglich
der Ähnlichkeit,
die durch den BLAST-Algorithmus vorgesehen ist, ist die Wahrscheinlichkeit
der kleinsten Summe (P(N)), welche ein Anzeichen für die Wahrscheinlichkeit
darstellt, mit welcher eine Anpassung zwischen zwei Nucleotiden
oder Aminosäurensequenzen
zufällig
auftreten würde.
So wird bspw. eine Nucleinsäure
als ähnlich
mit einer Referenzsequenz betrachtet, wenn die Wahrscheinlichkeit
der kleinsten Summe in einem Vergleich der Testnucleinsäure mit der
Referenznucleinsäure
weniger als ungefähr
0,1, bevorzugter weniger als ungefähr 0,01 und am bevorzugtesten
weniger als ungefähr
0,001 ist.
-
Ein
weiteres Anzeichen, dass zwei Nucleinsäuresequenzen oder Polypeptide
im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das Polypeptid, das durch
die erste Nucleinsäure
kodiert wird, immunologisch mit dem Polypeptid kreuzreagiert, welches
durch die zweite Nucleinsäure
kodiert wird, wie nachstehend beschrieben wird. Aus diesen Gründen ist
ein Polypeptid typischerweise im Wesentlichen identisch mit einem
zweiten Polypeptid, wenn sich bspw. die zwei Peptide lediglich durch
konservative Substitutionen unterscheiden. Ein anderes Anzeichen,
dass zwei Nucleinsäuresequenzen
im Wesentlichen identisch sind, ist, dass die zwei Moleküle unter stringenten
Bedingungen miteinander hybridisieren.
-
Der
Ausdruck „natürlich-vorkommend" wird verwendet,
um ein Objekt zu beschreiben, das in der Natur aufgefunden wird.
So ist bspw. eine Polypeptid- oder Polynucleotidsequenz natürlich vorkommend,
die in einem Organismus (einschließlich Viren) vorliegt, der
aus einer Naturquelle isoliert werden kann, und der nicht absichtlich
durch den Menschen im Labor modifiziert worden ist. Im Allgemeinen
bezieht sich der Ausdruck „natürlich-vorkommend" auf ein Objekt,
wie es in einem nicht-pathologischen (nicht-erkrankten) Individuum vorliegt,
wie es typisch für
die Spezies wäre.
-
Eine
asexuelle Rekombination ist eine Rekombination ohne die Fusion von
Gameten zur Bildung einer Zygote.
-
Ein „Stamm
ohne Fehlanpassungs-Reparatur" kann
jede Mutante in jedem Organismus mit einschließen, der in der Funktion der
Fehlanpassungs-Reparatur beeinträchtigt
ist. Diese schließen
Mutanten-Genprodukte von mutS, mutT, mutH, mutL, ovrD, dcm, vsr,
umuC, umuD, sbcB, recJ, etc. mit ein. Die Beeinträchtigung wird
durch eine genetische Mutation, durch einen Allelen-Ersatz, eine
selektive Inhibierung durch ein hinzugefügtes Reagens, wie bspw. eine
kleine Verbindung oder eine exprimierte Antisens-RNA, oder durch
andere Techniken erreicht werden. Die Beeinträchtigung kann in jedem Organismus
bezüglich
der aufgeführten
Gene vorliegen oder bezüglich
homologer Gene.
-
III. VARIATIONEN
-
A. BESCHICHTUNG VON FRAGMENTEN
MIT RECA-PROTEIN
-
Die
Frequenz der homologen Rekombination zwischen Bibliothekfragmenten
und verwandten endogenen Genen kann vor der Einführung in die Zellen durch Beschichten
der Fragmente mit einem rekombinogenen Protein erhöht werden.
Siehe Pati et al., Molecular Biology of Cancer 1, 1 (1996); Sena & Zarling, Nature Genetics
3, 365 (1996); Revet et al., J. Mol. Biol. 232, 779–791 (1993);
Kowalczkowski & Zarling
in Gene Targeting (CRC 1995), Kapitel 7. Die rekombinogenen Proteine
fördern
das homologe Paaren und/oder den Strangaustausch. Das am besten
charakterisierte recA-Protein stammt von E. coli und kann von Pharmacia (Piscataway,
NJ) bezogen werden. Zusätzlich
zu dem Wildtypprotein wurden einen Anzahl von recA-ähnlichen Proteinen
von Mutanten identifiziert (bspw. recA803). Darüber hinaus haben viele Organismen
recA-ähnliche Rekombinasen
mit Strang-Transferaktivitäten (bspw.
Ogawa et al., Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology
18, 567–576
(1993); Johnson & Symington,
Mol Cell. Biol. 15, 4843–4850
(1995); Fugisawa et al., Nucl. Acids Res. 13, 7473 (1985); Hsieh
et al., Cell 44, 885 (1986); Hsieh et al., J Biol. Chem. 264, 5089 (1989);
Fishel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683 (1988); Cassuto
et al., Mol. Gen. Genet. 208, 10 (1987); Ganea. et al., Mol. Cell
Biol. 7, 3124 (1987); Moore et al., J. Biol. Chem. 19, 11108 (1990);
Keene et al., Nucl. Acids Res. 12, 3057 (1984); Kimiec, Cold Spring
Harbor Symp. 48, 675 (1984); Kimeic, Cell 44, 545 (1986); Kolodner
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5560 (1987); Sugino et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3683 (1985); Halbrook et al., J.
Biol. Chem. 264, 21403 (1989); Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85, 7481 (1988); McCarthy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85, 5854 (1988); Lowenhaupt et al., J. Biol. Chem. 264, 20568 (1989).
Beispiele solcher Rekombinaseproteine schließen recA mit ein, außerdem recA803,
uvsX (Kolodner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5560 (1987);
Tishkoff et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2593), RuvC (Dunderdale
et al., Nature 354, 506 (1991)), DST2, KEM1, XRN1 (Dykstra et al.,
Molec. Cell. Biol. 11, 2583 (1991)), STPα/DST1
(Clark et al., Molec. Cell. Biol. 11, 2576 (1991)), HPP-1 (Moore
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88, 9067 (1991)), und außerdem andere
eukaryontische Rekombinasen (Bishop et al., Cell 69, 439 (1992);
Shinohara et al., Cell 69, 457).
-
Das
recA-Protein bildet, wenn es einzelsträngige DNA umhüllt, ein
Nucleoproteinfilament. In diesem Nucleoproteinfilament ist ein Monomer
recA an ungefähr
drei Nucleotide gebunden. Diese Eigenschaft von recA, einzelsträngige DNA
zu umhüllen,
ist im Wesentlichen sequenzunabhängig,
obgleich besondere Sequenzen ein anfängliches Aufladen von recA
auf ein Polynucleotid (bspw. Nucleation-Sequenzen) begünstigen.
Die Nucleoproteinfilamente können
im Wesentlichen auf jeder DNA gebildet werden, die zusammengesetzt
werden soll, und können
Komplexe sowohl mit einzelsträngiger
als auch mit doppelsträngiger
DNA bilden, sowohl in prokaryontischen als auch in eukaryontischen
Zellen.
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Bevor
die Fragmente mit recA oder anderen Rekombinasen in Kontakt gebracht
werden, werden diese oftmals denaturiert, bspw. durch eine Hitzebehandlung.
Anschließend
wird recA-Protein mit einer Konzentration von ungefähr 1 bis
10 μM hinzugefügt. Nach
der Inkubation wird die recA-beschichtete einzelsträngige DNA durch
konventionelle Verfahren in Empfängerzellen
eingeführt,
wie bspw. durch eine chemische Transformation oder Elektroporation.
Allgemein kann es wünschenswert
sein, die DNA mit einem recA-Homolog zu beschichten, das aus dem
Organismus isoliert wurde, in welchen die beschichtete DNA geliefert
werden soll. Bei der Rekombination sind mehrere zelluläre Faktoren
beteiligt und das Wirtsäquivalent
zu recA tritt im Allgemeinen mit anderen Wirtsfaktoren besser in
Wechselwirkung als weniger nah verwandte recA-Moleküle. Die
Fragmente rekombinieren homolog mit verwandten endogenen Genen.
Auf Grund der erhöhten
Frequenz der Rekombination, die auf die Rekombinase-Beschichtung
zurückzuführen ist,
müssen
die Fragmente nicht als Komponenten von Vektoren eingeführt werden.
-
Fragmente
werden manchmal mit anderen Nucleinsäurebindenden Proteinen beschichtet,
welche ihre Rekombination fördern,
welche ferner Nucleinsäuren
vor Abbau schützen,
oder Nucleinsäuren
zum Nucleus führen.
Beispiele solcher Proteine schließen Agrobacterium virE2 mit
ein (Durrenberger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9154–9158 (1989)).
Alternativ sind die Empfängerstämme in der
RecD-Aktivität
fehlerhaft. Einzelsträngige
Enden können
auch durch eine 3'-5'-Exonucleaseaktivität generiert werden, oder durch
Restriktionsenzyme, die 5'-Überhänge produzieren.
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1. MutS-Selektion
-
Das
Fehlanpassungs-Reparaturprotein aus E. coli MutS kann für eine Affinitäts-Chromatografie
verwendet werden, um Fragmente doppelsträngiger DNA anzureichern, die
zumindest eine Basenfehlanpassung enthalten. Das MutS-Protein erkennt
die durch die einzelnen Stränge
um die Stelle der Fehlanpassung gebildete Blase. Siehe bspw. Hsu & Chang, WO93/20233.
Die Strategie der Affinitätsanreicherung
partiell fehlangepasster Duplexe kann in die vorliegenden Verfahren
eingebaut werden, um die Diversität zwischen einer einzuführenden
Fragment-Bibliothek
und korrespondierenden verwandten oder allelen Genen in Empfängerzellen
zu erhöhen.
-
2 zeigt
ein Schema, bei welchem MutS verwendet wird, um die Diversität zu erhöhen. Die DNA-Substrate
zur Anreicherung sind im Wesentlichen miteinander ähnlich,
unterscheiden sich jedoch an wenigen Stellen. So können bspw.
die DNA-Substrate vollständige
oder partielle Genome (bspw. eine Chromosomen-Bibliothek) aus unterschiedlichen
Individuen darstellen, wobei die Unterschiede auf Polymorphismen zurückzuführen sind.
Die Substrate können
auch induzierte Mutanten einer Wildtypsequenz darstellen. Die DNA-Substrate
werden gepoolt, einem Restriktionsverdau unterzogen und denaturiert,
um Frag mente einzelsträngiger
DNA zu bilden. Der einzelsträngigen
DNA wird es anschließend
ermöglicht,
sich wieder zu verbinden. Einige einzelsträngige Fragmente verbinden sich
wieder mit einem perfekt angepassten komplementären Strang, um perfekt angepasst
Duplexe zu bilden. Andere einzelsträngige Fragmente verbinden sich
und bilden nicht-angepasste Duplexe. Die fehlangepassten Duplexe
werden aus perfekt angepassten Duplexen durch MutS-Chromatographie
angereichert (bspw. mit an Beads immobilisiertem MutS). Die fehlangepassten
Duplexe, die durch die Chromatographie gewonnen werden, werden in
die Empfängerzellen
eingeführt,
wo sie mit verwandten endogenen Genen, wie oben beschrieben, rekombinieren.
Die MutS-Affinitäts-Chromatographie erhöht den Anteil
der Fragmente, die sich voneinander und dem verwandten endogenen
Gen unterscheidet. Aus diesen Gründen
resultiert die Rekombination zwischen den einzuführenden Fragmenten und den
endogenen Genen in eine größere Diversität.
-
3 zeigt
eine zweite Strategie zur MutS-Anreicherung.
Bei dieser Strategie stellen die Substrate zur MutS-Anreicherung
Varianten eines relativ kurzen Segments dar, wie bspw. einem Gen
oder einem Cluster von Genen, bei welchem sich die meisten der unterschiedlichen
Varianten nicht in mehr als in einem einzelnen Nucleotid unterscheiden.
Das Ziel der MutS-Anreicherung ist es, Substrate für die Rekombination
herzustellen, die mehr Variationen enthalten als Sequenzen, die
in der Natur vorkommen. Dies wird durch eine Zufallsfragmentierung
der Substrate erreicht, wodurch überlappende
Fragmente geschaffen werden. Die Fragmente werden denaturiert und
wieder verbunden, wie bei der ersten Strategie. Das Wiederverbinden
generiert einige fehlangepasste Duplexe, die von den perfekt angepassten
Duplexen durch MutS-Affinitäts-Chromatographie getrennt werden
können.
Wie zuvor beschrieben, werden mit der MutS-Chromatographie Duplexe angereichert,
die zumindest eine einzelne Fehlanpassung aufweisen. Die fehlangepassten
Duplexe werden anschließend
in längere
Fragmente zusammengebaut. Dies wird durch Zyklen mit Denaturierungen,
Wiederverbinden und Kettenverlängerungen
von partiell verbundenen Duplexen erreicht (siehe Sektion V). Nach
mehreren solcher Zyklen werden Fragmente erreicht, die die gleiche
Länge wie
die Originalsubstrate besitzen, mit der Ausnahme, dass diese Fragmente
sich voneinander an verschiedenen Stellen unterscheiden. Diese Fragmente werden
dann in Zellen eingeführt,
wo sie mit verwandten endogenen Genen rekombinieren.
-
2. Positive
Auswahl hinsichtlich Allelenaustausch
-
Die
Erfindung kann in Verbindung mit Verfahren zur Anreicherung von
Zellen verwendet werden, welche – im Hinblick auf die Ausgangszellen – modifizierte
Gene tragen. Dies kann durch die Einführung einer DNA-Fragmentbibliothek
(bspw. ein einzelnes spezifisches Segment oder eine ganze oder partielle
genomische Bibliothek) in einen Suizidvektor (d.h., ein Vektor,
dem in der Empfängerzelle
ein funktioneller Replikationsursprung fehlt) erreicht werden, der
sowohl positive als auch negative Selektionsmarker enthält. Wahlweise können verschiedene
Fragmentbibliotheken aus unterschiedlichen Quellen (wie bspw. B.
subtilis, B. licheniformis und B. cereus) in unterschiedliche Vektoren
kloniert werden, die unterschiedliche Selektionsmarker tragen. Geeignete
positive Selektionsmarker schließen neoR,
KanamycinR, hyg, hisD, gpt, ble, tetR mit ein. Geeignete negative Selektionsmarker
schließen
hsv-tk, hprt, gpt, SacB, ura3 und Cytosindeaminase mit ein. Eine
Vielzahl von Beispielen von konditionellen Replikationsvektoren,
Mutationen, die die Vektorreplikation beeinträchtigen, Vektoren mit einem
begrenzten Wirtsspektrum und gegenauswählbaren Markern sind in Berg
und Berg, supra, und LaRossa, ibid. sowie in den hierin zitierten
Referenzen zu finden.
-
In
einem Beispiel wurde ein Plasmid mit R6K- und f1-Replikationsursprüngen, einem positiv auswählbaren
Marker (Beta-Lactamase) und einem gegenauswählbaren Marker (B. subtilis
sacB) verwendet. Nach einer M13-Transduktion der Plasmide, die die
klonierten Gene enthielten, wurden diese effizient in die chromosomale
Kopie des jeweiligen Gens in eine rep-Mutante des E. coli-Stammes
rekombiniert.
-
Eine
andere Strategie, um eine negative Auswahl anzuwenden, ist es, ein
Wildtyp-rpsL-Gen (welches für
das ribosomale Protein S12 kodiert) in einem Vektor zur Verwendung
in Zellen einzuschließen,
die ein mutiertes rpsL-Gen besitzen, was eine Streptomycinresistenz
verleiht. Die mutierte Form von rpsL ist in Zellen mit Wildtyp-rpsL
rezessiv. Aus diesen Gründen
werden durch die Auswahl hinsichtlich einer Sm-Resistenz Zellen selektiert,
die eine Wildtyp-Kopie von rpsL besitzen. Siehe Skorupski & Taylor, Gene
169, 47–52
(1996). Alternativ können
Vektoren verwendet werden, die lediglich einen positiven Selektionsmarker
tragen, und zwar mit einer Selektionsrunde hinsichtlich Zellen,
die den Marker exprimieren, und einer anschließenden Screening-Runde nach
Zellen, die den Marker verloren haben (wie bspw. Screening nach
Arzneimittel-Sensitivität). Das
Screening nach Zellen, die den positiven Selektionsmarker verloren
haben, ist mit einem Screening gegen die Expression eines negativen
Selektionsmarkers äquivalent.
So kann bspw. Bacillus mit einem Vektor transformiert werden, der
ein CAT-Gen sowie eine zu integrierende Sequenz trägt. Siehe
Harwood & Cutting,
Molecular Biological methods for Bacillus, Seiten 31–33. Mit
der Auswahl nach einer Chloramphenicol-Resistenz werden Zellen isoliert,
die den Vektor aufgenommen haben. Nach einem geeigneten Zeitraum,
der für
die Rekombination gestattet wird, können mit der Auswahl für eine CAT-Sensitivität Zellen
isoliert werden, die das CAT-Gen verloren haben. Ungefähr 50% solcher
Zellen werden einer Rekombination mit der zu integrierenden Sequenz
unterzogen worden sein.
-
Suizid-Vektoren,
die einen positiven Selektionsmarker tragen, sowie wahlweise einen
negativen Selektionsmarker und ein DNA-Fragment, können in
chromosomale Wirts-DNA durch ein einziges Crossover an einer Stelle
in der chromosomalen DNA integrieren, die zu dem Fragment homolog
ist. Durch die Rekombination wird ein integrierter Vektor hergestellt,
der von direkten Repeats der homologen Sequenz flankiert ist. In einigen
Zellen resultiert die nachfolgende Rekombination zwischen den Repeats
in einen Ausschluss des Vektors und entweder in die Aneignung der
erwünschten
Mutation von dem Vektor durch das Genom oder in die Herstellung
des Genom-Wildtyps.
-
Bei
solchen Verfahren wird nach dem Transfer der Gen-Bibliothek, die in einen geeigneten
Vektor kloniert ist, eine positive Auswahl hinsichtlich der Expression
des positiven Selektionsmarkers angewandt. Da nicht-integrierte
Kopien des Suizidvektors schnell aus den Zellen beseitigt werden,
werden mit dieser Selektion Zellen angereichert, die den Vektor
in das Wirtschromosom integriert haben. Die Zellen, die die positive Selektion überleben,
können
anschließend
vermehrt und einer negativen Selektion unterzogen werden, oder aber hinsichtlich
des Verlustes des positiven Selektionsmarkers gescreent werden.
Mit einer negativen Selektion können
Zellen ausgewählt
werden, die den negativen Selektionsmarker exprimieren. Daher exprimieren
Zellen, die den integrierten Vektor beibehalten haben, den negativen
Marker und werden selektiv eliminiert. Die Zellen, die beide Selektionsrunden überleben,
sind diejenigen, die den Vektor anfänglich integriert und anschließend eliminiert
haben. Diese Zellen werden hinsichtlich Zellen angereichert, die
Gene besitzen, die durch homologe Rekombination mit dem Vektor modifiziert
sind. Dieser Prozess diversifiziert durch einen einzelnen Austausch
genetischer Information. Wenn der Prozess jedoch entweder mit den
gleichen Vektoren oder mit einer Fragment-Bibliothek wiederholt wird, die durch
eine PCR der gepoolten DNA aus der angereicherten rekombinanten
Population erzeugt wurde, resultiert dies in eine Diversität der Zielgene,
die bei jeder Rekombinationsrunde exponentiell verstärkt werden.
Dieser Prozess kann rekursiv wiederholt werden, wobei jede Selektion
wie erwünscht
durchgeführt
wird.
-
3. Individualisierte
Optimierung der Gene
-
Im
Allgemeinen ist es bei den oben beschriebenen Verfahren nicht notwendig,
die Anzahl der zu optimierenden Gene, deren Lokation oder deren
Funktion zu kennen. Dennoch kann dies, in manchen Fällen, wo diese
Information für
eines oder mehrere Gene verfügbar
ist, genutzt werden. Ist z.B. die Eigenschaft, die durch Entwicklung
erlangt werden soll, eine verstärkte
Rekombination der Zellen, so ist das recA-Gen eines der Gene, das
wahrscheinlich wichtig ist, obwohl auch viele andere Gene, bekannte
und unbekannte, zusätzliche
Beiträge
leisten mögen.
In diesem Fall kann das recA-Gen – zumindest teilweise – getrennt
von anderen Kandidaten-Genen entwickelt werden. Das recA-Gen kann
durch irgendein rekursives Rekombinationsverfahren, das im Abschnitt
V beschrieben ist, entwickelt werden. Kurz gesagt beinhaltet dieser
Ansatz, dass unterschiedliche Formen des recA-Gens gewonnen werden,
dass ferner die Formen rekombiniert werden, Rekombinanten mit verbesserten
Eigenschaften selektiert und die Rekombinanten weiteren Rekombinations- und Selektionszyklen
unterzogen werden. An einer Stelle in der individualisierten Verbesserung
des recA-Gens können
die diversen Formen von recA mit Fragmenten vereinigt werden, die
für andere
Gene in einer Bibliothek kodieren, die in den hierin beschriebenen
allgemeinen Verfahren verwendet werden sollen. Auf diese Weise wird
die Bibliothek dahingehend „angeimpft", dass sie einen
höheren
Anteil an Varianten bezüglich
eines Gens enthält,
welches für
die Eigenschaft bekanntermaßen
wichtig ist, die erlangt werden soll, als anderweitig der Fall sein
würde.
-
In
einem Beispiel (dargestellt in 20B)
wird ein Plasmid konstruiert, das eine nicht-funktionelle (mutierte)
Version eines chromosomalen Gens, wie bspw. URA3, trägt, wobei
das Wildtyp-Gen eine Sensitivität gegenüber einem
Arzneimittel (in diesem Fall 5-Fluororotsäure) verursacht. Das Plasmid
trägt auch
einen auswählbaren
Marker (Resistenz gegenüber
einem anderen Arzneimittel, wie bspw. Kanamycin), sowie eine Bibliothek
von recA-Varianten. Die Transformation des Plasmids in die Zelle
resultiert in die Expression der recA-Varianten, von denen einige
eine homologe Rekombination mit einer erhöhten Rate katalysieren werden. Diese
Zellen, bei denen eine homologe Rekombination auftrat, sind gegenüber dem
auswählbaren
Arzneimittel auf dem Plasmid resistent, und auch gegenüber 5-Fluorotsäure, da
die chromosomale Kopie dieses Gens unterbrochen ist. Die recA-Varianten,
die die höchsten
Raten an homologer Rekombination erzielen, sind in einem Pool von
homologen Rekombinanten diejenigen, die am höchsten repräsentiert sind. Die mutierten
recA-Gene können
durch PCR aus diesem Pool isoliert werden, wieder neu zusammengesetzt
sowie in das Plasmid zurückkloniert
und der Prozess wiederholt werden. Andere Sequenzen können anstelle
von recA eingefügt werden,
um andere Komponenten des homologen Rekombinationssystems zu entwickeln.
-
4. Ernten
der DNA-Substrate für
das Shuffling
-
Bei
einigen Shuffling-Verfahren werden DNA-Substrate aus natürlichen
Quellen isoliert und können auf
Grund von beständigen
Unreinheiten, welche enzymatische Reaktionen vergiften können, nicht
einfach durch eine DNA-Modifizierung oder durch polymerisierende
Enzyme manipuliert werden. Solche Schwierigkeiten können dadurch
vermieden werden, dass die DNA-Substrate über einen
Erntestamm prozessiert werden. Der Erntestamm ist typischerweise
eine Zellart, mit natürlicher
Kompetenz und einer Fähigkeit
zur homologen Rekombination zwischen Sequenzen mit wesentlicher
Diversität
(bspw. Sequenzen mit lediglich 75% Sequenzidentität). Der
Erntestamm trägt
einen Vektor, der für
einen negativen Selektionsmarker kodiert, und der von zwei Segmenten
flankiert ist, die jeweils zu zwei Segmenten komplementär sind,
die ein Gen oder eine Region von Interesse in der DNA eines Zielorganismus
flankieren. Der Erntestamm wird mit DNA-Fragmenten aus dem Ziel-Organismus
in Verbindung gebracht. Die Fragmente werden durch die natürliche Kompetenz
aufgenommen, oder aber durch andere hierin beschriebene Verfahren,
und ein Fragment von Interesse aus dem Zielorganismus rekombiniert
mit dem Vektor des Erntestammes, wodurch der negative Selektionsmarker
verloren geht. Die Selektion hinsichtlich des negativen Markers
ermöglicht
die Isolation von Zellen, die das Fragment von Interesse aufgenommen
haben. Das Shuffling kann entweder im Erntestamm (bspw. einem RecE/T-Stamm) durchgeführt werden,
oder ein Vektor kann aus dem Erntestamm für ein in vitro-Shuffling oder einen
Transfer in ein anderen Zelltypus für ein in vivo-Shuffling isoliert
werden. Alternativ kann der Vektor über Konjugation, Protoplastenfusion
oder Elektrofusion in einen anderen Zelltypus transferiert werden.
Ein Beispiel für
einen geeigneten Erntestamm ist Acinetobacter calcoaceticus mutS.
Melnikov und Youngman, (1999) Nucl Acid Res 27 (4): 1056–1062. Dieser
Stamm ist natürlich
kompetent und nimmt DNA in einer unspezifischen Weise auf. Auch
auf Grund der mutS-Mutation ist der Stamm fähig zur homologen Rekombination
von Sequenzen, die lediglich 75% Sequenzidentität zeigen.
-
IV. ANWENDUNGEN
-
A. REKOMBINOGENIZITÄT
-
Ein
Ziel der Entwicklung ganzer Zellen ist es, Zellen zu generieren,
die eine verbesserte Fähigkeit
zur Rekombination besitzen. Solche Zellen sind für eine Vielzahl von Zwecken
in der molekularen Genetik nützlich, einschließlich der
in vivo-Formate
der rekursiven Sequenzrekombination, die in Abschnitt V beschrieben
ist. In E. coli wurden beinahe dreißig Gene (bspw. recA, recB,
recC, recD, recE, recF, recO, recQ, recR, recT, ruvA, ruvB, ruvC,
sbcB, ssb, topA, gyrA, und B, lig, polA, uvrD, E, recL, mutD, mutH,
mutL, mutT, mutU, helD) und DNA-Stellen
(bspw. chi, recC, sbcC) identifiziert, die bei der genetischen Rekombination
beteiligt sind, und verwandte Formen mehrerer dieser Gene sind in
anderen Organismen gefunden worden (bspw. rad51, rad55–rad57,
Dmc1 in Hefe (siehe Kowalczykowski et al., Microbiol. Rev. 58, 401–465 (1994);
Kowalczykowski & Zarling,
supra), und menschliche Homologe von Rad51 und Dmc1 sind identifiziert
worden (siehe Sandler et al., Nucl. Acids Res. 24, 2125–2132 (1996)).
Zumindest einige der E. coli-Gene, einschließlich recA, sind in Säugetier-Zellen
funktional und können
auf den Nucleus abzielen, und zwar im Rahmen einer Fusion mit der nucleären Zielsequenz
des SV40-großen-T-Antigens
(Reiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 3094–3098 (1996)).
Ferner entzerren Mutationen in fehlangepassten Reparatur-Genen,
wie bspw. mutL, mutS, mutH, mutT die Homologie-Anforderungen, und gestatten eine Rekombination
zwischen weiter voneinander abweichenden Sequenzen (Rayssiguier
et al., Nature 342, 396–401
(1989)). Das Ausmaß der
Rekombination zwischen divergierenden Stämmen kann dadurch verstärkt werden,
dass fehlangepasste Reparatur-Gene und stimulierende SOS-Gene eingebaut
werden. Dies kann durch die Verwendung von geeigneten Mutanten-Stämmen und/oder
einem Wachstum unter Bedingungen eines Stoffwechselstresses erreicht
werden, wodurch SOS-Gene stimuliert und fehlangepasste Reparatur-Gene
inhibiert werden. Vulic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (1997).
Darüber
hinaus kann dies dadurch erreicht werden, dass die Produkte der
fehlangepassten Reparatur-Gene durch ein Aussetzen gegenüber selektiven
Inhibitoren beeinträchtigt
werden.
-
Ausgangssubstrate
für die
Rekombination werden gemäß den allgemeinen
Prinzipien, die weiter oben beschrieben sind, ausgewählt. Dies
bedeutet, dass die Substrate Gesamtgenome oder Fraktionen davon
sein können,
die Rekombination-Gene oder -Stellen enthalten. Große Bibliotheken
von im Wesentlichen Zufallsfragmenten können mit Fragmentsammlungen „angeimpft" werden, die aus
Varianten von einem oder mehreren bekannten Rekombinations-Genen,
wie bspw. recA, bestehen. Alternativ können Bibliotheken durch das Mischen
verschiedener Formen der verschiedenen bekannten Rekombinations-Genen
und -Stellen gebildet werden.
-
Die
Fragment-Bibliothek wird in die Empfängerzellen, die verbessert
werden sollen, eingeführt,
und eine Rekombination findet statt, wodurch modifizierte Zellen
gebildet werden. Die Empfängerzellen
enthalten vorzugsweise ein Markergen, dessen Expression derart außer Kraft
gesetzt wurde, dass es durch eine Rekombination korrigiert werden
kann. So können
die Zellen bspw. zwei Kopien eines Markergens enthalten, die Mutationen
an unterschiedlichen Stellen aufweisen, deren Kopien rekombinieren
können,
wodurch das Wildtyp-Gen wieder hergestellt wird. Ein geeignetes
Markergen ist das Green Fluorescent Protein (grün fluoreszierendes Protein).
Ein Vektor kann konstruiert werden, der für eine Kopie des GFP mit Stopp-Codons
nahe am N-Terminus kodiert, und eine andere Kopie des GFP mit Stopp-Codons
nahe am C-Terminus des Proteins. Die Entfernung zwischen den Stopp-Codons an den jeweiligen
Enden des Moleküls
beträgt
500 bp und ungefähr 25%
der Rekombinationsereignisse resultieren in aktives GFP. Die Expression
von GFP in einer Zelle signalisiert, dass eine Zelle zur homologen
Rekombination in der Lage ist, um zwischen den Stopp-Codons zu rekombinieren,
wodurch eine fortlaufende kodierende Sequenz generiert wird. Durch
das Screenen nach Zellen, die GFP exprimieren, werden Zellen angereichert, die
die höchste
Kapazität
für eine
Rekombination besitzen. Die gleiche Art eines Screens kann dazu
eingesetzt werden, nachdem aufeinander folgende Runden einer Rekombination
durchgeführt
wurden. Dennoch sollten – außer wenn
der in den vorherigen Runden verwendete Selektionsmarker ein Suizidvektor
war – bei
aufeinander folgenden Runden ein zweiter außer Kraft gesetzter Screeningmarker
innerhalb eines zweiten Vektors eingesetzt werden, der einen Replikationsursprung
oder einen positiven Selektionsmarker trägt, der unterschiedlich zu
demjenigen der Vektoren ist, der in den vorherigen Runden eingesetzt
wurde.
-
B. MULTIGENOMISCHE KOPIENANZAHL – GENREDUNDANZ
-
Der
Großteil
der bakteriellen Zellen in Kulturen, die sich in der stationären Phase
befinden, und die in einem nährstoffreichen
Medium gezüchtet
wurden, enthalten zwei, vier oder acht Genome. In Minimalmedium enthalten
die Zellen ein oder zwei Genome. Die Anzahl der Genome pro bakterieller
Zelle hängt
daher von der Wachstumsrate der Zelle mit Eintritt in die stationäre Phase
ab. Dies liegt darin begründet,
dass schnell wachsende Zellen vielfache Replikationsgabeln enthalten,
welche in den Zellen in mehrere Genome nach der Termination resultieren.
Die Anzahl der Genome ist abhängig
vom Stamm, obwohl alle getesteten Stämme mehr als ein Chromosom
in der stationären
Phase besitzen. Die Anzahl der Genome in Zellen in der stationären Phase
nimmt über
die Zeit hin ab. Dies scheint auf eine Fragmentierung und einen
Abbau der gesamten Chromosomen zurückzuführen zu sein, ähnlich der
Apoptose in Säugetierzellen.
Diese Fragmentierung von Genomen in Zellen mit vielfachen Genomkopien
resultiert in eine massive Rekombination und Mutagenese. Geeignete
Mutanten könnten
Wege finden, Energiequellen zu nutzen, die es ihnen ermöglichen,
weiter zu wachsen. Multigenom- oder Gen-redundante Zellen sind wesentlich
resistenter gegenüber
Mutagenese und können schneller
hinsichtlich eines ausgewählten
Merkmals verbessert werden.
-
Einige
Zelltypen, wie bspw. Deinococcus radians (Daly und Minton, J. Bacteriol.
177, 5495–5505 (1995)),
zeigen durch den gesamten Zellzyklus eine Polyploidie. Dieser Zelltypus
ist auf Grund des Vorliegens vieler Kopien des Genoms resistent
gegenüber
hoher Strahlung. Eine Rekombination mit hoher Frequenz zwischen
den Genomen ermöglicht
das schnelle Entfernen von Mutationen, die durch eine Vielzahl von
DNA-verletzenden Agenzien verursacht wurden.
-
Eine
mögliche
Verwendung der vorliegenden Verfahren ist es, andere Zelltypen dahingehend
zu entwickeln, dass sie eine erhöhte
Genom-Kopienanzahl besitzen, ähnlich
zu derjenigen von Deinoccocus radians. Vorzugsweise wird die erhöhte Kopienanzahl über alle
oder die meisten Zellzyklen hinweg, unter allen oder den meisten
Wachstumsbedingungen hindurch aufrechterhalten. Das Vorliegen einer
Vielzahl von Genomkopien in solchen Zellen resultiert in eine höhere Frequenz
der homologen Rekombination in diesen Zellen, sowohl zwischen Kopien
eines Gens in unterschiedlichen Genomen innerhalb der Zelle, als
auch zwischen einem Genom innerhalb der Zelle und einem transfizierten
Fragment. Die erhöhte
Frequenz der Rekombination ermöglicht
es den Zellen, schneller dahingehend entwickelt zu werden, andere
nützliche
Eigenschaften zu erlangen.
-
Ausgangssubstrate
für die
Rekombination können
eine diverse Gen-Bibliothek sein, von welchen Genen nur wenige rele vant
für die
genomische Kopienanzahl sind, ferner eine fokussierte Bibliothek,
die aus Varianten von Genen gebildet ist, die dafür bekannt
sind oder von denen angenommen wird, eine Rolle bei der genomischen
Kopienanzahl zu spielen, oder eine Kombination der beiden. Als eine
allgemeine Regel würde man
erwarten, dass eine erhöhte
Kopienanzahl durch die Entwicklung von Genen erreicht werden würde, die bei
der Replikation und Zelltrennung derart beteiligt sind, dass die
Zelltrennung inhibiert wird, ohne die Replikation zu beeinflussen.
Gene, die bei der Replikation beteiligt sind, schließen tus,
xerC, xerD, dif, gyrA, gyrB, parE, parC, dif, TerA, TerB, TerC,
TerD, TerE, TerF mit ein und Gene, die das Aufteilen der Chromosomen
und die Genkopienanzahl beeinflussen, schließen minD, mukA (tolC), mukB,
mukC, mukD, spoOJ, spoIIIE mit ein (Wake & Errington, Annu. Rev. Genet. 29,
41–67
(1995)). Eine geeignete Quelle für
die Substrate ist das Genom eines Zelltypes, wie bspw. Deinoccocus
radians, von dem bekannt ist, dass er der erwünschte Phänotyp einer multigenomischen
Kopienanzahl besitzt. Genau so gut oder anstelle von den oben genannten
Substraten können
auch Fragmente verwendet werden, die für Protein- oder Antisens-RNA-Inhibitoren für Gene kodieren, von
denen bekannt ist, dass sie bei der Zelltrennung beteiligt sind.
-
In
der Natur würde
die Existenz von vielen genomischen Kopien in einem Zelltypus normalerweise
auf Grund der größeren Nahrungserfordernisse
nicht vorteilhaft sein, die dazu notwendig wären, diese Kopienzahl aufrechtzuerhalten.
Dennoch können
künstliche
Bedingungen aufgestellt werden, um hinsichtlich einer hohen Kopienanzahl
zu selektieren. Modifizierte Zellen mit rekombinierten Genomen werden
in nährstoffreichen
Medien gezüchtet
(unter diesen Bedingungen sollte die vielfache Kopienanzahl keinen
Nachteil bedeuten) und einem Mutagen ausgesetzt, wie bspw. Ultraviolett-
oder Gammastrahlung, oder einem chemischen Mutagen, bspw. Mitomycin,
salpetrige Säure,
photoaktiviertes Psoralene, alleine oder in Kombination, wodurch DNA-Brüche induziert
werden, die durch eine Rekombination wieder repariert werden können. Mit
diesen Bedingungen kann nach Zellen selektiert werden, die eine
Multikopienanzahl besitzen, und zwar auf Grund der höheren Effizienz,
mit welcher die Mutationen ausgeschnitten werden können. Die
modifizierten Zellen, die das Aussetzen einem Mutagen gegenüber überleben,
werden hinsichtlich Zellen angereichert, die eine mehrfache Genomkopienanzahl
besitzen. Falls notwendig, können
die ausgewählten
Zellen individuell hinsichtlich der Genomkopienanzahl analysiert
werden (bspw. durch quantitative Hybridisierung mit geeigneten Kontrollen). Einige
oder alle der gesammelten Zellen, die die Selektion überleben,
stellen die Substrate für
die nächste
Rekombinationsrunde dar. Darüber
hinaus können
individuelle Zellen aussortiert werden, und zwar unter Verwendung
eines Zellsortierers hinsichtlich denjenigen Zellen, die mehr DNA
enthalten, bspw. unter Verwendung von DNA-spezifischen, fluoreszierenden
Verbindungen oder durch eine Auswahl hinsichtlich einer erhöhten Größe unter
Einsatz der Licht-Dispersion. Schließlich werden Zellen entwickelt,
die mindestens 2, 4, 6, 8 oder 10 Kopien des Genoms über den
gesamten Zellzyklus hinweg besitzen. Auf eine ähnliche Weise können auch
Protoplasten rekombiniert werden.
-
C. SEKRETION
-
Die
Sekretionswege eines Proteins (oder eines Metaboliten) von bakteriellen
oder eukaryontischen Zellen kann dahingehend entwickelt werden,
erwünschte
Moleküle
effizienter zu exportieren, wie bspw. für die Herstellung von Protein-Pharmazeutika, Arzneimitteln,
die aus kleinen Molekülen
bestehen, oder speziellen Chemikalien. Verbesserungen in der Effizienz
sind insbesondere hinsichtlich Proteinen wünschenswert, bei welchen ein
Zusammenbau aus vielen Untereinheiten notwendig ist (wie bspw. bei
Antikörpern)
oder bei welchen vor der Sekretion eine aufwändige posttranslationale Modifikation
notwendig ist.
-
Die
Sekretionseffizienz kann von einer Anzahl genetischer Sequenzen
abhängen,
einschließlich
einer kodierenden Sequenz für
ein Signalpeptid, von Sequenzen, die für Proteine kodieren, die die
kodierende Sequenz spalten oder anderweitig erkennen, und die kodierende
Sequenz des Proteins, das sekretiert wird. Letzteres kann die Faltung
des Proteins beeinflussen, sowie die Leichtigkeit, mit welcher es
in Membranen integrieren und diese traversieren kann. Der bakterielle
Sekretionsweg in E. coli schließt
die SecA-, SecB-, SecE-, SecD- und SecF-Gene mit ein. In Bacillus
subtilis sind die Hauptgene secA, secD, secE, secF, secY, ffh, ftsY, zusammen
mit fünf
Signalpeptidasegenen (sipS, sipT, sipU, sipV und sipW) (Kunst et
al., supra). Bezüglich Proteinen,
die eine posttranslationelle Modifikation benötigen, kann die Entwicklung
von Genen, die eine solche Modifizierung bewirken, zu einer verbesserten
Sekretion beitragen. Ähnlich
können
Gene mit Expressionsprodukten, die eine Rolle bei dem Zusammenbau
von Proteinen aus vie len Untereinheiten spielen (bspw. Chaperonine),
auch für
eine verbesserte Sekretion sorgen.
-
Die
Selektion von Substraten für
die Rekombination folgt den allgemeinen, oben diskutierten Prinzipien.
In diesem Fall umfassen die in Frage stehenden Bibliotheken, auf
die oben Bezug genommen wird, Varianten der bekannten Sekretionsgene.
Zur Entwicklung von prokaryontischen Zellen dahingehend, dass sie
eukaryontische Proteine exprimieren, werden die Ausgangssubstrate
für die
Rekombination oftmals zumindest teilweise aus eukaryontischen Quellen
gewonnen. Einzuschleusende Fragmente können eine Rekombination sowohl
mit der chromosomalen DNA in den Empfängerzellen als auch mit dem
Screening-Markerkonstrukt, das in solchen Zellen vorliegt (siehe
unten), eingehen. Letztere Form der Rekombination ist für die Entwicklung der
signalkodierenden Sequenz, die in dem Screening-Markerkonstrukt
eingebaut ist, wichtig. Eine verbesserte Sekretion kann durch den
Einschluss von einem Markerkonstrukt in die Zellen, die entwickelt
werden sollen, gescreent werden. Das Markerkonstrukt kodiert für ein Markergen,
welches operativ mit den Expressionssequenzen verbunden ist, und
das gewöhnlich
mit einer Sequenz, die für
ein Signalpeptid kodiert, operativ verbunden ist. Das Markergen
wird manchmal als Fusionsprotein mit einem rekombinanten Protein
von Interesse exprimiert. Dieser Ansatz ist dann nützlich,
wenn die kodierende Sequenz für
das rekombinante Protein zusammen mit Sekretionsgenen entwickelt
werden soll.
-
In
einer Variation kodiert das Markergen für ein Produkt, das für die Zelle
toxisch ist, die das Konstrukt enthält, außer, wenn das Produkt sekretiert
wird. Geeignete Toxin- Proteine
schließen
das Diphtherietoxin und das Ricintoxin mit ein. Mit der Vermehrung
von modifizierten Zellen, die ein solches Konstrukt tragen, werden dann
Zellen ausgewählt,
die sich in Richtung einer verbesserten Sekretion des Toxins entwickelt
haben. Alternativ kann das Markergen für einen Liganden für einen
bekannten Rezeptor kodieren, und Zellen, die den Liganden tragen,
können
durch FACS unter Verwendung eines markierten Rezeptors detektiert
werden. Wahlweise kann ein solcher Ligand mit einer Phospholipid-Verankerungssequenz
operativ verbunden sein, welche den Liganden nach der Sekretion
an die Zellmembranoberfläche
bindet. (Siehe die gemeinsam angemeldete, ebenfalls anhängige 08/309,345.)
In einer weiteren Variation kann das sekretierte Markerprotein in
unmittelbarer Nachbarschaft zu der Zelle gehalten werden, welche
es sekretiert, und zwar durch Aufteilen einzelner Zellen in Agartropfen.
Dies wird bspw. dadurch erreicht, dass aus einer Zellsuspension
Tröpfchen
gebildet werden. Das sekretierte Protein wird innerhalb der Agarmatrix
gehalten und kann bspw. durch FACS detektiert werden. In einer anderen
Variation wird ein Protein von Interesse als Fusionsprotein zusammen
mit Beta-Lactamase oder alkalischer Phosphatase exprimiert. Diese
Enzyme verstoffwechseln kommerziell erhältliche, chromogene Substrate
(bspw. X-gal), dies jedoch lediglich nach Sekretion in das Periplasma.
Das Auftreten eines gefärbten
Substrats in einer Kolonie von Zellen zeigt daher die Fähigkeit
an, dass das Fusionsprotein sekretiert wird, und die Intensität der Farbe
steht mit der Effizienz der Sekretion in Zusammenhang.
-
Die
Zellen, die durch diese Screening- und Selektionsverfahren identifiziert
werden, besitzen die Fähigkeit,
erhöhte
Mengen an Protein zu sekretieren. Diese Fähigkeit kann auf eine erhöhte Sekretion
und eine erhöhte
Expression oder lediglich auf eine erhöhte Sekretion zurückzuführen sein.
-
1. Expression
-
Zellen
können
auch dahingehend entwickelt werden, eine erhöhte Expression eines rekombinanten Proteins
zu erlangen. Der Expressionsgrad ist selbstverständlich stark von dem Konstrukt
abhängig,
von welchem das rekombinante Protein exprimiert wird, sowie von
den regulatorischen Sequenzen, wie bspw. dem Promoter, dem (den)
Enhancer(n) und der hierin enthaltenen Transkriptionsterminationsstelle.
Die Expression kann auch durch eine große Anzahl von Wirtsgenen beeinflusst
werden, die bei der Transkription, posttranslationellen Modifizierung
und Translation eine Rolle spielen. Darüber hinaus können Wirtsgene,
die bei der Synthese von Ribonucleotiden und Aminosäurenmonomeren
für die
Transkription und Translation beteiligt sind, indirekte Effekte
auf die Expressionseffizienz haben. Die Selektion der Substrate
für die
Rekombination folgt den allgemeinen Prinzipien, die zuvor diskutiert
wurden. In diesem Falle weisen die in Frage kommenden Bibliotheken
Varianten von Genen auf, von denen bekannt ist, dass sie bei der
Expression eine Rolle spielen. Für
die Entwicklung von prokaryontischen Zellen dahingehend, dass sie
eukaryontische Proteine exprimieren, werden die Anfangssubstrate
für die
Rekombination oftmals – zumindest
teilweise – von
eukaryontischen Quellen gewonnen; dies sind bspw. eukaryontische
Gene, die für
Proteine kodieren, wie bspw. Chaperonine, die bei der Sekretion
und bei dem Zusammenbau von Proteinen beteiligt sind. Eingeschleuste
Fragmente können
sowohl mit chromosomaler DNA in den Empfängerzellen als auch mit dem
Screening-Markerkonstrukt, der in diesen Zellen vorliegt, eine Rekombination
eingehen (siehe unten).
-
Das
Screening für
eine verbesserte Expression kann durch Einschluss eines Reportergenkonstrukts in
die Zellen, die entwickelt werden sollen, bewirkt werden. Das Reportergenkonstrukt
exprimiert (und sekretiert gewöhnlicherweise)
ein Reporterprotein, wie bspw. GFP, das einfach detektiert werden
kann und nicht toxisch ist. Das Reporterprotein kann alleine exprimiert
werden, oder aber als Fusionsprotein zusammen mit einem Protein
von Interesse. Wenn das Reportergen sekretiert wird, kann mit dem
Screening effektiv nach Zellen selektiert werden, die entweder eine
verbesserte Sekretion oder eine verbesserte Expression, oder aber beides
aufweisen.
-
2. Pflanzenzellen
-
Eine
weitere Anwendung der rekursiven Sequenz-Rekombination ist die Entwicklung von
Pflanzenzellen und transgenen Pflanzen, die hieraus entwickelt wurden,
um eine Resistenz gegenüber
pathogenen Krankheiten (Pilze, Viren und Bakterien), Insekten, Chemikalien
(wie bspw. Salz, Selen, Umweltgifte, Pestizide, Herbizide oder Ähnliches),
einschließlich
bspw. Atrazin oder Glyphosat zu erlangen, oder aber um die chemische Zusammensetzung,
die Ausbeute oder Ähnliches
zu modifizieren. Die Substrate für
die Rekombination können wiederum
Gesamtgenom-Bibliotheken sein, Fraktionen davon oder gezielte Bibliotheken,
die Varianten von Genen enthalten, von denen bekannt ist oder von
denen man annimmt, dass sie eine Resistenz gegenüber einem der oben genannten
Agenzien vermitteln. Häufig
wer den Bibliothekfragmente aus unterschiedlichen Spezies der Pflanze
erhalten, die entwickelt werden soll.
-
Die
DNA-Fragmente werden in die Pflanzengewebe, in kultivierte Pflanzenzellen,
Pflanzenmikrosporen oder Pflanzenprotoplasten durch Standardverfahren,
einschließlich
der Elektroporation, eingeführt
(From et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)), ferner
durch Infektion mit viralen Vektoren, wie bspw. das Blumenkohl-Mosaikvirus
(CaMV) (Hohn et al., Molecular Biology of Plant Tumors, (Academic
Press, New York, 1982) Seiten 549–560; Howell,
US 4,407,956 ), durch eine ballistische
Penetration mit hoher Geschwindigkeit durch kleine Partikel, bei
welchen die Nucleinsäure
entweder innerhalb der Matrix von kleinen Kügelchen oder Partikeln oder
auf der Oberfläche
vorliegt (Klein et al., Nature 327, 70–73 (1987)), mit der Verwendung
von Pollen als Vektoren (WO 85/01856), durch die Verwendung von
Agrobacterium tumefaciens oder A. rhizogenes, die ein T-DNA-Plasmid
tragen, in welches die DNA-Fragmente kloniert werden. Das T-DNA-Plasmid
wird nach einer Infektion durch Agrobacterium tumefaciens in Pflanzenzellen überführt, und
ein Anteil wird in das Pflanzengenom stabil integriert (Horsch et
al., Science 233, 496–498
(1984); Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4803 (1983)).
-
Eine
Diversität
kann auch durch den genetischen Austausch zwischen Pflanzenprotoplasten
gemäß den gleichen
Prinzipien, die nachstehend für
Pilz-Protoplasten beschrieben sind, hergestellt werden. Verfahren zur
Bildung und Fusion von Pflanzenprotoplasten sind von Takahashi et
al.,
US 4,677,066 ; Akagi
et al.,
US 5,360,725 ;
Shimamotu et al.,
US 5,250,433 ;
Cheney et al.,
US 5,426,040 ,
beschrieben.
-
Nach
einem geeigneten Inkubationszeitraum, in welchem das Auftreten der
Rekombination und die Expression von rekombinanten Genen ermöglicht wird,
werden die Pflanzenzellen mit einem Agens in Verbindung gebracht,
gegenüber
welchem eine Resistenz erlangt werden soll, und die überlebenden
Pflanzenzellen werden gesammelt. Einige oder alle dieser Pflanzenzellen
können
einer weiteren Rekombinations- und Screeningrunde unterzogen werden.
Schließlich
werden Pflanzenzellen erhalten, die den erwünschten Resistenzgrad erhalten
haben.
-
Diese
Zellen können
anschließend
in transgene Pflanzen kultiviert werden. Die Pflanzenregeneration aus
kultivierten Protoplasten ist in Evans et al., „Protoplast Isolation and
Culture", Handbook
of Plant Cell Cultures 1, 124–176
(MacMillan Publishin Co., New York, 1983) beschrieben; ferner in
Davey, „Recent
Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protplasts", Protoplasts, (1983),
Seiten 12–29,
(Birkhauser, Basel 1983); Dale, „Protoplast Culture and Plant
Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops", Protoplasts (1983),
Seiten 31–41,
(Birkhauser, Basel 1983); Binding, "Regeneration of Plants", Plant Protoplasts, Seiten
21–73
(CRC Press, Boca Raton, 1985).
-
In
einer Variation des oben genannten Verfahrens können eine oder mehrere vorläufige Rekombinations-
und Screeningrunden in bakteriellen Zellen durchgeführt werden,
und zwar gemäß der gleichen
allgemeinen Strategie, die für
Pflanzenzellen beschrieben ist. In bakteriellen Zellen kann auf
Grund deren größerer Wachstumsrate
und auf Grund der größeren Effizienz,
mit welcher die DNA in solche Zellen eingeführt werden kann, eine schnellere
Entwicklung erreicht werden. Nach einer oder mehreren Rekombinations-/Screeningrunden
wird eine DNA-Fragmentbibliothek
aus den Bakterien gewonnen und in die Pflanzenzellen transformiert. Die
Bibliothek kann entweder eine vollständige Bibliothek oder eine
ausgewählte
Bibliothek sein. Eine ausgewählte
Bibliothek kann durch Amplifizierung ausgehend von Primern hergestellt
werden, die spezifisch für
die Pflanzensequenzen sind, insbesondere für Pflanzensequenzen, von denen
bekannt ist, oder von denen man annimmt, dass sie bei der Verleihung
von Resistenz eine Rolle spielen.
-
3. Beispiel: Concatamerer
Aufbau eines Atrazin-catabolisierenden Plasmids
-
Die
Atrazin-catabolisierende Gene AtzA und AtzB von Pseudomonas wurden
aus pMD1 (de Souza et al., Appl. Environ. Microbiol. 61, 3373–3378 (1995);
de Souza et al., J. Bacteriol. 178, 4894–4900 (1996)) in pUC18 subkloniert.
Ein 1,9 kb AvaI-Fragment,
das AtzA enthielt, wurde an den Enden aufgefüllt und in eine AvaI-Stelle
von pUC18 eingefügt.
Ein 3,9 kb ClaI-Fragment,
welches AtzB enthielt, wurde an den Enden aufgefüllt und in die HincII-Stelle
von pUC18 kloniert. AtzA wurde dann aus pUC18 mit EcoRI und BamHI
ausgeschnitten, AzB mit BamHI und HindIII, und die beiden Inserts
wurden in pUC18, der mit EcoRI und HindIII verdaut wurde, coligiert.
Als Ergebnis wurde ein 5,8 kb-Insert erhalten, welches AtzA und
AtzB in pUC18 enthielt (Gesamtplasmidgröße 8,4 kb).
-
Die
rekursive Sequenz-Rekombination wurde wie folgt durchgeführt. Das
gesamte 8,4 kb-Plasmid wurde mit DNaseI in 50 mM Tris-Cl pH 7,5,
10 mM MnCl2 behandelt und anschließend Fragmente
mit einer Größe zwischen
500 und 2000 bp gel gereinigt. Die Fragmente wurden in einer PCR-Reaktion
unter Verwendung des Tth-XL-Enzyms und Puffer von Perkin Elmer,
2,5 mM MgOAc, 400 μM
dNTPs und Reihenverdünnungen
von DNA-Fragmenten
zusammengebaut. Die Aufbaureaktion wurde in einem MJ-Research „DNA-Engine" durchgeführt, der
mit den folgenden Zyklen programmiert war: 1) 94°C, 20 Sekunden; 2) 94°C, 15 Sekunden;
3) 40°C,
30 Sekunden; 4) 72°C,
30 Sekunden + 2 Sekunden pro Zyklus; 5) gehe zu Schritt 2, 39 Mal; 6)
4°C.
-
Die
AtzA- und AtzB-Gene wurden aus der Aufbaureaktion unter Verwendung
der Polymerasekettenreaktion nicht amplifiziert, vielmehr wurde
die DNA mittels Phenol-Extraktion und Ethanol-Fällung aus der Reaktion gereinigt,
und anschließend
die aufgebaute DNA mit einem Restriktionsenzym verdaut, das das
Plasmid linearisierte (KpnI: die KpnI-Stelle in pUC18 ging während der
Subklonierung verloren, wodurch lediglich die KpnI-Stelle in AtzA übrig blieb).
Das linearisierte Plasmid wurde Gel-gereinigt, über Nacht wieder ligiert, in
den E. coli-Stamm NM522 transformiert. (Die Auswahl des Wirtsstammes
war relevant: nur sehr wenig Plasmid mit geringer Qualität wurde
aus einer Anzahl von anderen kommerziell verfügbaren Stämmen erhalten, einschließlich TG1,
DH10B, DH12S.)
-
Reihenverdünnungen
der Transformationsreaktion wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Ampicillin
ausplattiert, und der Rest der Transformationsreaktion wurde auf
25% Glycerol gebracht und bei –80°C eingefroren.
Sobald die transformierten Zellen getitert waren, wurden die eingefrorenen
Zellen mit einer Dichte von zwischen 200 und 500 auf 150 mm-Durchmesser-Platten mit 500 μg/ml Atrazin
ausplattiert und bei 37°C
wachsen gelassen.
-
Atrazin
mit einer Konzentration von 500 μg/ml
bildet ein unlösliches
Präzipitat.
Die Produkte der AtzA- und AtzB-Gene
transformieren Atrazin in ein lösliches
Produkt. Zellen, die die Wildtyp-AtzA- und -AtzB-Gene in pUCl8 enthalten,
sind daher von einem klaren Hof umgeben, innerhalb welchem das Atrazin
abgebaut wurde. Je aktiver die AtzA- und AtzB-Enzyme sind, desto
schneller wird sich ein klarer Hof bilden und auf den Atrazin-enthaltenden
Platten wachsen. Als positive Kolonien wurden diejenigen gepickt,
die am schnellsten die größten klaren
Zonen bildeten. Die (annäherungsweise)
40 besten Kolonien wurden gepickt, vereinigt, und in Anwesenheit
von 50 μg/ml
Ampicillin wachsen gelassen; anschließend wurde aus diesen das Plasmid
präpariert.
Das gesamte Verfahren (von der DNase-Behandlung bis zur Ausplattierung auf
Atrazin-Platten) wurde viermal mit 2000–4000 Kolonien/Zyklus wiederholt.
-
Eine
Modifizierung wurde in der vierten Runde vorgenommen. Die Zellen
wurden sowohl auf 500 μg/ml Atrazin
als auch auf 500 μg/ml
des Atrazin-Analogons Terbutylazin ausplattiert, welches durch die
Wildtyp-AtzA- und -AtzB-Gene nicht abgebaut werden kann. Die positiven
Kolonien, die beide Verbindungen abbauten, wurden gewonnen. Die
Atrazin-Chlorhydrolase (Produkt des AtzA-Gens) war 10- bis 100-fach
höher als
diejenige, die vom Wildtyp-Gen produziert wird.
-
D. PFLANZENGENOM-SHUFFLING
-
Durch
Pflanzengenom-Shuffling können
rekursive Zyklen zur Einführung
und Rekombination von Genen oder Wegen eingeführt werden, die der erwünschten
Pflanzenspezies verbesserte Eigenschaften verleihen. Jede Pflanzenspezies,
einschließlich Getreide
und Wildpflanzen, die eine erwünschte
Eigenschaft zeigen, wie bspw. eine Herbizid-Resistenz, Salztoleranz,
Pestizidresistenz oder Temperaturtoleranz, kann als DNA-Quelle verwendet
werden, welche in das Getreide oder in Kultur-Wirtspflanzenspezies
eingeführt
werden soll.
-
Die
genomische DNA, gewonnen aus der Quellpflanze, wird fragmentiert
(bspw. durch DNAaseI, Restriktionsenzyme oder mechanisch) und in
einen Vektor kloniert, der zur Herstellung von Pflanzengenom-Bibliotheken
geeignet ist, wie bspw. pGA482 (An. G., 1995, Methods Mol. Biol.
44: 47–58).
Dieser Vektor enthält die
linken und rechten Grenzbereiche von A. tumefaciens, die für den Gentransfer
in Pflanzenzellen notwendig sind, sowie Antibiotika-Marker zur Selektion
in E. coli, Agrobacterium und Pflanzenzellen. Eine Multiklonierungsstelle
ist für
die Insertion der genomischen Fragmente vorgesehen. Eine cos-Sequenz
ist für
eine effiziente Verpackung der DNA in Lambda-Bacteriophagenköpfen zur
Transfektion der primären
Bibliothek in E. coli vorgesehen. Der Vektor kann DNA-Fragmente
von 25 bis 40 kb aufnehmen.
-
Die
Primärbibliothek
kann auch direkt in einen A. tumefaciens- oder A. rhizogenes-Stamm
elektroporiert werden, der dazu verwendet wird, Wirtspflanzenzellen
zu infizieren und transformieren (Main, GD et al., 1995 Methods
Mol. Biol. 44; 405–412).
Alternativ kann die DNA durch Elektroporation oder eine PEG-vermittelte
Aufnahme in Protoplasten der Empfängerpflanzenspezies eingeführt werden
(Bilang et al., (1994) Plant Mol. Biol Manual, Kluwer Academic Publishers,
Al: 1–16)
oder durch Partikelbeschuss der Zellen oder Gewebe (Christou, ibid.
A2; 1–15).
Falls notwendig können
die Antibiotika-Marker in der T-DNA-Region eliminiert werden, solange
die Selektion für
das Merkmal möglich
ist, so dass die Pflanzenendprodukte keine Antibiotika-Gene enthalten.
-
Stabil
transformierte Gesamtzellen, die sich das Merkmal aneignen, werden
auf festen oder flüssigen Medien,
die das Agens enthalten, gegenüber
welchem die eingeführte
DNA eine Resistenz oder Toleranz verleiht, ausgewählt. Wenn
das in Frage stehende Merkmal nicht direkt ausgewählt werden
kann, können
die transformierten Zellen mit Antibiotika selektiert werden, und
es ihnen anschließend
ermöglicht
werden, einen Kallus zu bilden, oder aber sie werden zu ganzen Pflanzen
regeneriert, und anschließend
hinsichtlich der gewünschten
Eigenschaft gescreent.
-
Der
zweite und die weiteren Zyklen bestehen aus der Isolierung der genomischen
DNA aus jeder transgenen Linie und der Einführung dieser in eine oder mehrere
der anderen transgenen Linien. Bei jeder Runde werden die transformierten
Zellen selektiert oder hinsichtlich einer schrittweisen Verbesserung
gescreent. Um das Verfahren zur Verwendung vielfacher Transformationszyklen
zu beschleunigen, kann von einer Pflanzenregeneration bis zur letzten
Runde abgesehen werden. Das Kallus-Gewebe, das sich aus dem Protoplasten
oder aus transformierten Geweben gebildet hat, kann als Quelle genomischer
DNA und neuer Wirtszellen dienen. Nach der letzten Runde werden
fruchtbare Pflanzen regeneriert und die Nachkommenschaft hinsichtlich
Homozygosität
der insertierten DNAs selektiert. Schlussendlich wird eine neue
Pflanze generiert, die vielfache Inserts trägt, die sich additiv oder synergistisch
dahingehend kombinieren, dass sie hohe Level der gewünschten
Eigenschaft verleihen. Alternativ können Mikrosporen als Homozygote
isoliert werden, die aus spontanen Diploiden generiert wurden.
-
Darüber hinaus
kann die eingeführte
DNA, die das gewünschte
Merkmal verleiht, nachverfolgt werden, da es in dem Vektor von bekannten
Sequenzen flankiert ist. Entweder PCR oder eine Plasmid-Isolierung
wird dazu eingesetzt, die Sequenzen zu isolieren, und sie detaillierter
zu charakterisieren. Eine lange PCR (Foord, OS und Rose, EA, 1995,
PCR Primer: A Laboratory Manual, CSHL Press, Seiten 63–77) des
gesamten 25 bis 40 kb-Inserts wird mit geeigneten Reagenzien und
Techniken erreicht, unter Verwendung der T-DNA-Grenzsequenzen als
Primer. Wenn der Vektor dahingehend modifiziert ist, dass er den
Replikationsursprung von E. coli und einen antibiotischen Marker
zwischen den T-DNA-Grenzen enthält,
wird ein seltenes Restriktionsenzym, wie bspw. NotI oder SfiI, die
lediglich an den Enden der insertierten DNA schneiden, verwendet,
um Fragmente zu bilden, die die Quellpflanzen-DNA enthalten, welche
anschließend
ligiert und in E. coli transformiert wird, wo sie sich als Plasmide
replizieren. Die Gesamt-DNA oder Subfragmente davon, die für das hinzugefügte Merkmal
verantwortlich sind, kann einer in vitro-Entwicklung durch DNA-Shuffling
unterzogen werden. Die geshuffelte Bibliothek kann reiterativ durch
irgendein hierin beschriebenes Verfahren rekombiniert und anschließend in
Wirtspflanzenzellen eingeführt
werden, und anschließend
hinsichtlich der Verbesserung des Merkmals gescreent werden. Auf
diese Weise können
einzelne und Multigen-Eigenschaften von einer Spezies auf die andere übertragen
und hinsichtlich einer höheren
Expression oder Aktivität
optimiert werden, was zu einer Verbesserung des gesamten Organismus führt. Dieses
ganze Verfahren kann auch reiterativ wiederholt werden.
-
Alternativ
können
die Zellen transformierte Mikrosporen sein, wobei die regenerierten
haploiden Pflanzen direkt hinsichtlich der verbesserten Merkmale,
wie nachstehend beschrieben, gescreent werden.
-
E. MIKROSPOREN-MANIPULIERUNG
-
Mikrosporen
sind haploide (1n) männliche
Sporen, die sich in Pollenkörnern
entwickeln. Antheren enthalten eine große Anzahl von Mikrosporen in
den früh-einkernigen
bis zu den ersten-Mitose Stadien. Mikrosporen konnten erfolgreich
zur Entwicklung in Pflanzen hinsichtlich der meisten Spezies eingeführt werden, wie
bspw. Reis (Chen, CC, 1977, In Vitro, 13: 484–489), Tabak (Atanassov, I.
et al., 1998, Plant Mol. Biol. 38: 1169–1178), Tradescantia (Savage
JRK und Papworth DG, 1998, Mutat. Res. 422: 313–322), Arabidopsis (Park SK
et al., 1998, Development 125: 3789–3799), Zuckerrübe (Majewska-Sawka
A. und Rodrigues-Garcia MI, 1996, J. Cell. Sci. 109: 859–866), Gerste
(Olsen FL, 1991, Hereditas 115: 255–266) und Ölsamenraps (Boutillier KA et
al., 1994, Plant Mol. Biol. 26: 1711–1723).
-
Die
Pflanzen, die von Mikrosporen abstammen, sind hauptsächlich haploid
oder diploid (unregelmäßig polyploid
und aneuploid). Die diploiden Pflanzen sind homozygot und fruchtbar
und können
in relativ kurzer Zeit hergestellt werden. Die Mikrosporen, die
aus F1-Hybridpflanzen gewonnen wurden, repräsentieren eine große Diversität, weshalb
sie ein ausgezeichnetes Modell zur Untersuchung der Rekombination
darstellen. Darüber hinaus
können
Mikrosporen mit T-DNA transformiert werden, welche über Agrobacterium
oder andere verfügbare
Mittel eingeführt
wird, und anschließend
in individuelle Pflanzen regeneriert werden. Darüber hinaus können aus
Mikrosporen Protoplasten gebildet werden, die auf ähnliche
Weise fusioniert werden können, wie
es bei Pflanzen und Bakterien vollzogen wird.
-
Auf
Grund ihrer komplexen Ploidie und ihrer Fähigkeit zur Regeneration stellen
Mikrosporen ein Werkzeug für
das Pflanzen-Gesamtgenom-Shuffling dar. Wenn bspw. Pollen aus vier
Elternteilen gesammelt und vereinigt werden, und anschließend dazu
eingesetzt werden, die Elternteile zufällig zu bestäuben, sollten
die Nachkommen 24 = 16 mögliche Kombinationen aufweisen.
Unter der Annahme, dass diese Pflanze 7 Chromosomen hat, werden
Mikrosporen, die aus den 16 Nachkommenschaften gesammelt wurden,
27 × 16
= 2048 mögliche
chromosomale Kombinationen darstellen. Diese Anzahl ist sogar größer, wenn
eine Meiose auftritt. Wenn die Mikrosporen diploid sind, werden
homozygote Embryonen aus diesen Mikrosporen hergestellt, was in
vielen Fällen
der Fall ist, und sie werden anschließend hinsichtlich der gewünschten
Phänotypen
gescreent, bspw. hinsichtlich einer Herbizid- oder Krankheitsresistenz.
Darüber
hinaus können
diese Embryos zu Pflanzenölzusammensetzungen
in zwei Hälften
aufgeteilt werden: eine für
die Analyse und die andere für
die Regeneration in eine lebensfähige
Pflanze.
-
Protoplasten,
die aus Mikrosporen (insbesondere die haploiden) hergestellt werden,
werden vereinigt und fusioniert. Mikrosporen, die aus Pflanzen gewonnen
werden, die durch Protoplastenfusion hergestellt wurden, werden
vereinigt und wieder fusioniert, wodurch die genetische Diversität der resultierenden
Mikrosporen erhöht
wird.
-
Die
Mikrosporen können
auf verschiedenen Arten einer Mutagenese unterzogen werden, wie
bspw. durch chemische Mutagenese, Strahlen-induzierte Mutagenese
und bspw. tDNA-Transformation, und zwar vor der Fusion oder Regeneration.
Neu hergestellte Mutationen können
durch die rekursiven Verfahren, die zuvor beschrieben wurden und
hierin beschrieben sind, rekombiniert werden.
-
F. BEISPIEL: ANEIGNUNG
VON SALZTOLERANZ
-
Wie
in 21 dargestellt, wird die DNA aus einer Salz-toleranten
Pflanze isoliert und dazu eingesetzt, eine genomische Bibliothek
herzustellen. Aus der Empfängerspezies
werden Protoplasten hergestellt, die mit der genomischen Bibliothek
transformiert/transfiziert werden (bspw. durch Elektroporation,
Agrobacterium, etc.). Die Zellen werden auf Medien mit einem normalen
inhibitorischen Grad an NaCl ausgewählt. Lediglich die Zellen mit
einer neu erlangten Salztoleranz werden in Kallus-Gewebe wachsen.
Die besten Linien werden ausgewählt
und aus deren vereinigter DNA werden genomische Bibliotheken hergestellt.
Diese Bibliotheken werden in Protoplasten transformiert, die aus
den in der ersten Runde transformierten Kalli hergestellt wurden. Wiederum
werden die Zellen auf erhöhte
Salzkonzentrationen selektiert. Nachdem der erwünschte Grad an Salztoleranz
erreicht ist, kann das Kallus-Gewebe dahingehend induziert werden,
dass ganze Pflanzen regenerieren. Die Nachkommenschaft dieser Pflanzen
wird typischerweise hinsichtlich Homozygosität der Inserts analysiert, um
die Stabilität des
erlangten Merkmals abzusichern. An den angezeigten Schritten kann
die Pflanzenregeneration oder -isolation und das Shuffling der eingeführten Gene
zu dem Gesamtprotokoll hinzugefügt
werden.
-
J. DIE ENTWICKLUNGSTECHNISCHE
WICHTIGKEIT DER REKOMBINATION
-
Eine
Stammverbesserung ist die ausgerichtete Entwicklungsförderung
eines Organismus, für
eine gewünschte
Aufgabe „fitter" zu sein. In der
Natur wird die Adaption durch sexuelle Rekombination erleichtert.
Sexuelle Rekombination ermöglicht
es einer Population, die genetische Diversität innerhalb der Population
zu verwerten, bspw. durch Verfestigen nützlicher Mutationen und Verwerfen
von schädlichen.
Auf diese Weise kann die Adaption und Evolution in Sprüngen voranschreiten.
In Abwesenheit eines sexuellen Zyklus müssen sich die Mitglieder einer
Population unabhängig
voneinander durch die aufeinander folgende Akkumulierung von Zufallsmutationen
entwickeln. Viele nützliche
Mutationen gehen verloren, wohingegen schädigende Mutationen akkumulieren
können.
Auf diese Weise wird die Adaption und Evolution langsam vollzogen,
verglichen zur sexuellen Evolution.
-
Wie
in 17 gezeigt, ist diese asexuelle Evolution ein
langsamer und ineffizienter Prozess. Populationen bewegen sich eher
als Individuen als als Gruppen. Eine diverse Population wird durch
die Mutagenese eines einzelnen Elternteils generiert, was in eine
Verteilung von fitten und unfitten Individuen resultiert. In Abwesenheit
eines sexuellen Zyklus bleibt jedes Stück genetischer Information
der überlebenden
Population in den einzelnen Mutanten. Die Selektion der „fittesten" resultiert in viele „fitte" Individuen, die
zusammen mit der nützlichen
genetischen Information, die sie tragen, verworfen werden. Die asexuelle
Evolution vollzieht sich als ein genetisches Ereignis zu einem Zeitpunkt
und ist daher durch den intrinsischen Wert eines einzigen genetischen
Ereignisses limitiert. Die sexuelle Evolution bewegt sich schneller
und effizienter. Das Paaren innerhalb einer Population verfestigt
die genetische Information innerhalb der Population und resultiert
in nützliche
Mutationen, die zusammen kombiniert werden. Das Kombinieren nützlicher
genetischer Information resultiert in eine Nachkommenschaft, die
bedeutend fitter als ihre Elternteile ist. Die sexuelle Evolution
schreitet daher durch vielfache genetische Ereignisse viel schneller
fort.
-
In
den vielen Jahren der Pflanzen- und Tierzüchtung konnte gezeigt werden,
dass die Macht des Einsatzes der sexuellen Rekombination die schnelle
Entwicklung von komplexen Genomen in Richtung einer bestimmten Aufgabe
bewirkt. Dieses allgemeine Prinzip wird ferner durch die Verwendung
von DNA-Shuffling
gezeigt, wodurch DNA-Moleküle
in vitro rekombiniert werden, um die Rate der gerichteten molekularen
Evolution zu beschleunigen. Die Bemühungen der Fermentierungs-Industrie,
Stämme
zu verbessern, beruhen auf der gerichteten Evolution von Mikroorganismen
durch eine sequenzielle Zufallsmutagenese. Der Einbau der Rekombination
in diesen iterativen Prozess beschleunigt das Verfahren zur Stammverbesserung
bedeutend, was wiederum die Profitabilität der laufenden Fermentations-Verfahren
steigert und die Entwicklung neuer Produkte erleichtert.
-
K. DNA-SHUFFLING GEGENÜBER NATÜRLICHER
REKOMBINATION – DIE
NÜTZLICHKEIT
EINER POOL-WEISEN REKOMBINATION
-
DNA-Shuffling
schließt
die rekursive Rekombination von DNA-Sequenzen mit ein. Ein bedeutender Unterschied
zwischen dem DNA-Shuffling und der natürlichen sexuellen Rekombination
liegt darin, dass durch das DNA-Shuffling DNA-Sequenzen produziert
werden können,
die von vielen verschiedenen Elternteil-Sequenzen herrühren, wohingegen bei der sexuellen
Rekombination DNA-Sequenzen produziert werden, die lediglich von
zwei Elternteil-Sequenzen herrühren
(25).
-
Wie
in 25 gezeigt, ist die Evolutionsrate
teilweise durch die Anzahl der nützlichen
Mutationen limitiert, die ein Mitglied einer Population zwischen
den Selektionsereignissen akkumulieren kann. Bei der sequenziellen
Zufallsmutagenese werden nützliche
Mutationen jeweils einmal pro Selektionsereignis akkumuliert. Viele
nützliche
Mutationen werden pro Zyklus zugunsten des besten Produzenten verworfen
und neutrale oder schädliche
Mutationen, die überleben,
sind genau so schwer loszuwerden, wie sie erlangt wurden, und akkumulieren
daher. Bei der sexuellen Evolution ermöglicht es die paarweise Rekombination,
dass sich Mutationen aus zwei unterschiedlichen Elternteilen aufspalten
und in unterschiedliche Kombinationen rekombinieren. Nützliche
Mutationen können
akkumulieren und schädliche
Mutationen können
verloren gehen. Die pool-weise Rekombination, wie sie bspw. durch
DNA-Shuffling bewirkt wird, hat die gleichen Vorteile wie paarweise
Rekombination, jedoch ermöglicht
es das DNA-Shuffling, Mutationen von vielen Elternteilen in eine
einzige Nachkommenschaft zu verfestigen. Daher stellt die pool-weise
Rekombination ein Mittel zur Steigerung der Anzahl von nützlichen
Mutationen bereit, die bei jedem Selektionsereignis akkumulieren
können.
Das Diagramm in 25 zeigt eine Darstellung
der möglichen
Anzahl von Mutationen, die ein Individuum durch jedes dieser Verfahren
akkumulieren kann. Die Rekombination ist exponentiell höher gegenüber der
sequenziellen Zufallsmutagenese, und dieser Vorteil erhöht sich
exponentiell mit der Anzahl der Elternteile, die rekombinieren können. Die
sexuelle Rekombination ist daher konservativer. In der Natur kann
die paarweise Eigenschaft der sexuellen Rekombination eine wichtige
Stabilität
innerhalb der Population beitragen, und zwar durch Verhindern großer Veränderungen
in der DNA-Sequenz, die aus einer pool-weisen Rekombination herrühren können. Für die Zwecke
der gerichteten Evolution ist jedoch die pool-weise Rekombination
effizienter.
-
Die
mögliche
Diversität,
die aus einer Population hergestellt werden kann, ist ausgehend
von der pool-weisen Rekombination größer im Vergleich zu derjenigen,
die von der paarweisen Rekombination ausgeht. Darüber hinaus
ermöglicht
es die pool-weise Rekombination, viele verschiedene vorteilhafte
Mutationen zu kombinieren, die von vielen verschiedenen Elternteil-Sequenzen
herrühren.
-
Um
die Wichtigkeit der pool-weisen Rekombination gegenüber der
paarweisen Rekombination bei der Herstellung einer molekularen Diversität zu zeigen,
wird das Züchten
von zehn unabhängigen
DNA-Sequenzen in Betracht gezogen, von denen jede lediglich eine
einzigartige Mutation aufweist. Es gibt 210 =
1024 unterschiedliche Kombinationen dieser zehn Mutationen, die
von einer einzelnen Sequenz mit keinen Mutationen (die Consen sussequenz)
bis zu einer Sequenz reichen, die alle zehn Mutation trägt. Wenn
dieser Pool durch paarweise Rekombination zusammen rekombiniert
werden würde,
würde eine
Population, die die Consensussequenz enthält, die Elternteile und die
45 unterschiedlichen Kombinationen jeder zwei der Mutationen, in
56 oder ca. 5% der möglichen
1024 Mutanten-Kombinationen resultieren. Alternativ, wenn der Pool
auf eine pool-weise Art und Weise miteinander rekombiniert wird,
würden
theoretisch alle 1024 generiert werden, was zu einem ungefähr 20-fachen
Anstieg in der Bibliotheks-Diversität führt. Wenn man nach einer einzigartigen Lösung für ein Problem
in der molekularen Evolution sucht, wird die Bibliothek um so komplexer,
je komplexer die mögliche
Lösung
ist. Tatsächlich
enthält
das fitteste Mitglied oder eine geshuffelte Bibliothek oftmals mehrere
Mutationen, die aus mehreren unabhängigen Startsequenzen herrühren.
-
1. DNA-Shuffling
sorgt für
eine rekursive paarweise Rekombination
-
Das
in vitro-DNA-Shuffling resultiert in der effizienten Produktion
von kombinatorischen genetischen Bibliotheken, und zwar durch das
Katalysieren der Rekombination vieler verschiedener DNA-Sequenzen. Während das
Ergebnis des DNA-Shufflings
eine Population ist, die die pool-weise Rekombination vieler verschiedener
Sequenzen darstellt, beruht das Verfahren nicht auf der Simultanrekombination
vieler verschiedener DNA-Sequenzen, sondern vielmehr auf deren rekursiver
paarweiser Rekombination. Der Aufbau kompletter Gene aus einem gemischten
Pool kleiner Genfragmente macht vielfache neue Ausrichtungs- und Verlängerungszyklen
notwendig, die thermalen Zyklen der primerlosen PCR-Reaktion. Während jedes
thermalen Zyklus rich ten sich viele Fragmentpaare wieder aus und
werden verlängert,
um eine kombinatorische Population von größeren chimären DNA-Fragmenten zu bilden. Nach dem ersten
Zyklus des Wiederaufbaus enthalten chimäre Fragmente Sequenzen, die
aus hauptsächlich
zwei unterschiedlichen Elternteile-Genen herrühren, mit allen möglichen
Paaren der „Elternteile"-Sequenz, die theoretisch
vorliegen. Dies ist zu dem Ergebnis eines einzelnen sexuellen Zyklus
innerhalb einer Population ähnlich.
Während
des zweiten Zyklus richten sich diese chimären Fragmente wieder miteinander
aus oder mit anderen kleinen Fragmenten, was in Chimären resultiert,
die von bis zu vier der unterschiedlichen Ausgangssequenzen herrührt, wiederum
mit allen möglichen Kombinationen
der vier Elternteile-Sequenzen, die theoretisch vorliegen. Dieser
zweite Zyklus ist zu der gesamten Population analog, die aus einer
einzelnen sexuellen Kreuzung herrührt, also einer Inzucht.
-
Weitere
Zyklen resultieren in Chimären,
die aus 8, 16, 32 etc. Elternteile-Sequenzen herrühren, und die
zu weiteren Inzuchten der vorhergehenden Population analog sind.
Dies könnte
als ähnlich
zu der Diversität
betrachtet werden, die aus einer kleinen Population von Vögeln entsteht,
die isoliert auf einer Insel leben, und die miteinander über viele
Generationen hinweg brüten.
Das Ergebnis ahmt die Ausbeute der „pool-weisen" Rekombination nach,
jedoch verläuft
der Weg über
die rekursive paarweise Rekombination. Aus diesem Grund sind die
DNA-Moleküle, die
aus einem in vitro-DNA-Shuffling hergestellt wurden, nicht die „Nachkommenschaft" der Ausgangs-„Elternteile"-Sequenzen, sondern
vielmehr die Groß-,
Groß-,
Groß-,
Großn-, ... (n = Anzahl der thermalen Zyklen)
Groß-Nachkommenschaft
der Ausgangs-„Vorläufer"-Moleküle.
-
L. FERMENTIERUNG
-
Die
Fermentierung von Mikroorganismen zur Herstellung von Naturprodukten
ist die älteste
und ausgeklügeltste
Anwendung der Biokatalyse. Industrielle Mikroorganismen bewirken
die stufenweise Umwandlung erneuerbarer Rohstoffe zu hochwertigen
chemischen Produkten in einem einzelnen Reaktor und katalysieren
auf diese Weise eine Multi-Milliarden-Dollar-Industrie. Fermentationsprodukte
liegen im Bereich von feinen und Handelschemikalien, wie bspw. Ethanol,
Milchsäure,
Aminosäuren
und Vitamine, bis zu hochwertigen kleinen Molekül-Pharmazeutika, Protein-Pharmazeutika
und industriellen Enzymen. (Siehe bspw. McCoy (1998) C & EN 13–19 hinsichtlich
einer Einführung
in die Biokatalyse).
-
Der
Erfolg, diese Produkte auf den Markt zu bringen, und der Erfolg,
im Markt konkurrenzfähig
zu sein, hängt
von der ständigen
Verbesserung der Gesamtzell-Biokatalysatoren ab. Verbesserungen
schließen
eine erhöhte
Ausbeute des erwünschten
Produktes mit ein, ferner die Entfernung ungewollter Ko-Metaboliten,
eine verbesserte Verwendung von günstigen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen,
sowie die Adaption an Fermenter-Bedingungen, eine erhöhte Produktion
eines Primär-Metaboliten,
eine erhöhte
Produktion eines Sekundär-Metaboliten,
eine erhöhte
Toleranz gegenüber
sauren Bedingungen, eine erhöhte
Toleranz gegenüber
basischen Bedingungen, eine erhöhte
Toleranz gegenüber
organischen Lösungsmitteln,
eine erhöhte
Toleranz gegenüber
hohen Salz-Bedingungen und eine erhöhte Toleranz gegenüber hohen
oder niedrigen Temperaturen. Fehler in einem dieser Gebiete können in
hohe Produktionskosten resultieren, in die Unmöglichkeit, den Marktanteil
zu halten oder einzunehmen, und in das Versagen, versprechende Produkte
auf den Markt zu bringen. Aus diesen Gründen investiert die Fermentierungs-Industrie
bedeutende finanzielle und personelle Ressourcen in die Verbesserung
der Produktionsstämme.
-
Gegenwärtige Strategien
zur Stammverbesserung beruhen auf der empirischen und iterativen
Modifizierung von Fermenter-Bedingungen
und der genetischen Manipulation des produzierenden Organismus. Während Fortschritte
in der Molekularbiologie etablierter industrieller Organismen gemacht
wurden, ist eine vernünftige
Stoffwechseltechnik informationsintensiv und nicht auf weniger charakterisierte
industrielle Stämme
anwendbar. Die am meisten verbreitete Strategie zur Stammverbesserung
setzt eine Zufallsmutagenese des produzierenden Stammes ein und
ein Screening nach Mutanten mit verbesserten Eigenschaften. Bei
reifen Stämmen,
zumindest bei denjenigen, die vielen Verbesserungsrunden unterzogen
wurden, sorgen diese Bemühungen
gewöhnlich
für einen
10%igen Anstieg im Produkttiter pro Jahr. Auch wenn diese klassische Strategie
effektiv ist, so ist sie dennoch langsam, aufwändig und teuer. Technologische
Fortschritte in diesem Gebiet zielen auf eine Automatisierung ab
und auf eine Erhöhung
des Durchsatzes des Proben-Screenings, mit der Hoffnung, dass die
Kosten der Stammverbesserung reduziert werden. Die wirklichen technischen Grenzen
liegen jedoch in der intrinsischen Limitierung einzelner Mutationen,
eine bedeutende Stammverbesserung zu bewirken. Die hierin beschriebenen
Verfahren überwinden
diese Limitierung und sorgen für
einen Zugang zu vielen verschiedenen nützlichen Mutationen pro Zyklus,
die dazu eingesetzt werden können,
Automatisierungstechnologien zu ergänzen und Verfahren zur Stammverbesserung
zu katalysieren.
-
Die
hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen es, dass Biokatalysatoren
schneller verbessert werden können
als mit herkömmlichen
Verfahren. Das Gesamtgenom-Shuffling kann die Rate der Stammverbesserung
bei Mikroorganismen, die bei Fermentationen verwendet werden, im
Vergleich zu herkömmlichen
Verfahren mindestens verdoppeln. Dadurch können die Kosten der Fermentationsverfahren
relativ gesenkt werden. Neue Produkte können zügiger auf den Markt gebracht
werden, Hersteller können
ihre Gewinne ebenso wie die Marktanteile steigern, und den Verbrauchern
werden mehr Produkte von höherer
Qualität
und zu niedrigeren Preisen bereitgestellt. Darüber hinaus führt eine
erhöhte
Effizienz der Produktionsverfahren zu einer geringeren Abfallproduktion
und zur sparsameren Verwendung der Ressourcen. Das Gesamtgenom-Shuffling stellt
Mittel bereit, viele verschiedene nützliche Mutationen pro Zyklus
zu akkumulieren, und eliminiert daher die inhärente Limitierung der gegenwärtigen Stammverbesserungs-Programme
(SIPs).
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Das
DNA-Shuffling stellt eine rekursive Mutagenese, Rekombination und
Selektion von DNA-Sequenzen bereit. Ein wesentlicher Unterschied
zwischen einer DNA-Shuffling-vermittelten Rekombination und einer natürlichen
sexuellen Rekombination liegt darin, dass das DNA-Shuffling sowohl
die paarweise (zwei Elternteile) und die pool-weise (viele verschiedene
Elternteile) Rekombination von Elternteile-Molekülen bewirkt, wie weiter oben
beschrieben wurde. Die natürliche
Rekombination ist konservativer und auf die paarweise Rekombination
beschränkt.
In der Natur sorgt die paarweise Rekombination für eine Stabilität innerhalb
einer Population, und zwar durch das Verhindern großer Sprünge in den
Sequenzen oder in der Genomstruktur, die aus einer pool-weisen Rekombination
herrühren
können.
Für die Zwecke
der gerichteten Evolution bietet sich jedoch die pool-weise Rekombination
an, da vorteilhafte Mutationen vieler verschiedener Elternteile
während
einer einzigen Kreuzung kombiniert werden können, um eine bessere Nachkommenschaft
zu produzieren. Die pool-weise Rekombination ist analog zu der Kreuzzüchtung von
Inzucht-Stämmen
bei der klassischen Stammverbesserung, mit der Ausnahme, dass Kreuzungen
zwischen vielen Stämmen
auf einmal auftreten. Im Wesentlichen ist die pool-weise Rekombination
eine Folge von Ereignissen, die die Rekombination einer Population
von Nucleinsäuresequenzen
bewirkt, was in der Generierung neuer Nucleinsäuren resultiert, die eine genetische
Information von mehr als zwei der ursprünglichen Nucleinsäuren enthalten.
Das Potenzial des in vitro-DNA-Shufflings liegt darin, dass große kombinatorische
Bibliotheken aus einem kleinen Pool von DNA-Fragmenten hergestellt
werden können,
die durch rekursive paarweise Ausrichtungs- und Verlängerungsreaktionen, „Paarungen", wieder zusammengebaut
werden. Viele der bekannten in vivo-Kombinationsformate (wie bspw.
Plasmid-Plasmid,
Plasmid-Chromosom, Phage-Phage, Phage-Chromosom, Phage-Plasmid,
konjugale DNA-Chromosom, exogene DNA-Chromosom, Chromosom-Chromosom,
wobei die DNA in die Zelle durch natürliche und nicht-natürliche Kompetenz
eingeführt
wird, Transduktion, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion,
etc.) resultieren hauptsächlich
in der paarweisen Rekombination von zwei DNA-Molekülen. Wenn
diese Formate daher für
lediglich einen einzelnen Rekombinationszyklus ausgeführt werden,
sind sie inhärent
in ihrem Potenzial, eine molekulare Diversität zu generieren, beschränkt. Um
den Grad der Diversität
zu generieren, die durch in vitro-DNA-Shuffling-Verfahren erhalten
werden kann, müssen
Formate zur paarweisen Paarung rekursiv ausgeführt werden, d.h. über viele
Generationen hinweg, und zwar bevor nach verbesserten Sequenzen
gescreent wird. Daher muss ein Pool von DNA-Sequenzen, wie bspw.
vier unabhängige
Chromosomen, rekombiniert werden, bspw. durch Protoplastenfusion,
und die Nachkommenschaft dieser Rekombination (von denen jede eine
einzigartige Nachkommenschaft der paarweisen Paarung darstellt)
muss anschließend
vereint werden, und zwar ohne Selektion, und anschließend wieder
und wieder und wieder rekombiniert werden. Dieses Verfahren sollte
für eine
hinreichende Anzahl von Zyklen wiederholt werden, um in eine Nachkommenschaft
zu resultieren, die die erwünschte
Komplexität
aufweist. Nur wenn die hinreichende Diversität generiert worden ist, sollte
die resultierende Population hinsichtlich neuer und verbesserter
Sequenzen gescreent werden.
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Es
gibt einige wenige Verfahren zur Durchführung einer effizienten Rekombination
in Prokaryonten. Bakterien besitzen einen bekannten sexuellen Zyklus
per se, jedoch existieren natürliche
Mechanismen, mit welchen die Genome dieser Organismen einer Kombination
unterzogen werden. Diese Mechanismen schließen die natürliche Kompetenz, eine Phagen-vermittelte
Transduktion und eine Zell-Zell-Konjugation mit ein. Bakterien,
die natürlich
kompetent sind, sind dazu in der Lage, effektiv nackte DNA aus der
Umgebung aufzunehmen. Wenn diese DNA homolog ist, wird sie einer
Rekombination mit dem Genom der Zelle unterzogen, was zu einem genetischen
Austausch führt.
Bacillus subtilis, der primäre
Produktionsorganismus der Enzymindustrie, ist für seine Effizienz, mit welcher
er diesen Prozess durchführt,
bekannt.
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Bei
der verallgemeinerten Transduktion vermittelt ein Bacteriophage
einen genetischen Austausch. Ein transduzierender Phage wird oftmals
seinen Kopf mit dem Wirtsgenom auffüllen. Dieser Phage kann einen neuen
Wirt infizieren und ein Fragment des vorherigen Wirtsgenoms liefern,
das häufig über eine
homologe Rekombination integriert wird. Durch Konjugation können Zellen
die DNA auch selber zwischen sich austauschen. Zellen, die die geeigneten
Paarungsfaktoren enthalten, übertragen
Episome, genauso wie gesamte Chromosomen, an eine geeignete Empfängerzelle,
wo es mit dem Empfängergenom
rekombinieren kann. Die Konjugation erinnert an die sexuelle Rekombination
bei Mikroben und kann intraspezifisch, interspezifisch und intergenetisch
sein. So ist bspw. ein effizientes Mittel zur Transformierung von
Streptomyces sp., der ein Genus darstellt, das für die Produktion vieler kommerzieller
Antibiotika verantwortlich ist, der konjugale Transfer der Plasmide
von Escherichia coli.
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Hinsichtlich
vieler industrieller Mikroorganismen fehlt das Wissen über die
Kompetenz, über
die Phagentransduktion oder über
Fertilitätsfaktoren.
Als Alternative zu diesen natürlichen
Rekombinationsverfahren wurde die Protoplastenfusion als vielseitige
und allgemeine Alternative entwickelt. Die Protoplasten werden durch
Entfernen der Zellwand durch eine Behandlung der Zellen mit lytischen
Enzymen in Gegenwart von osmotischen Stabilisatoren hergestellt.
In Gegenwart eines fusogenen Agens, wie bspw. Polyethylenglykol (PEG)
werden die Protoplasten dahingehend induziert, dass sie fusionieren
und transiente Hybride oder „Fusionanten" bilden. Während dieses
Hybrid-Stadiums tritt die genetische Rekombination mit höherer Frequenz auf,
wodurch es den Genomen ermöglicht
wird, sich neu zu sortieren. Der letzte wesentliche Schritt ist
die erfolgreiche Auftrennung und Regenerierung von lebensfähigen Zellen
aus den fusionierten Protoplasten. Die Protoplastenfusion kann intraspezifisch,
interspezifisch und intergenetisch sein, und ist sowohl bei Prokaryonten
als auch bei Eukaryonten angewandt worden. Darüber hinaus ist es möglich, mehr
als zwei Zellen zu fusionieren, wodurch ein Mechanismus bereitgestellt
wird, mit dem die pool-weise Rekombination bewirkt werden kann.
Während
für die
Protoplastenfusion keine Fertilitätsfaktoren, transduzierende
Phagen oder eine Kompetenzentwicklung notwendig sind, wird ein Verfahren
für die
Bildung, Fusionierung und Regenerierung der Protoplasten typischerweise
für jeden
Organismus optimiert. Die Protoplastenfusion, wie sie für die pool-weise
Rekombination angewandt wird, ist weiter oben detaillierter beschrieben.
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Ein
Schlüssel
für die
SIP ist es, ein Assay zu besitzen, das jeweils in Abhängigkeit
davon verwendet werden kann, dass wenige Mutanten aus tausenden
identifiziert werden sollen, welche einen leichten Anstieg in der
Produktionsausbeute besitzen. Der limitierende Faktor bei vielen
Assayformaten ist die Einheitlichkeit des Zellwachstums. Diese Variation
ist die Quelle der grundlegenden Variabilität in den nachfolgenden Assays. Die
Größe der Beimpfung
und die Kulturumgebung (Temperatur/Feuchtigkeit) sind Quellen einer
Wachstumsvariation. Eine Automatisierung aller Aspekte der Etablierung
der Anfangskulturen und Inkubatoren mit kontrollierter, bekannter
Temperatur und Feuchtigkeit, sind für die Reduzierung der Variabilität nützlich.
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Mutierte
Zellen oder Sporen werden auf festem Medium getrennt, um einzelne
sporulierende Kolonien zu bilden. Unter Verwendung eines automatisierten
Kolonien-Pickers (Q-bot, Genetics, UK) werden die Kolonien identifiziert,
gepickt und 96-Well-Microtiterplatten werden mit 10000 unterschiedlichen
Mutanten in beimpft, welche zwei 3 mm-Glasbälle/Well enthalten. Der Q-bot
pickt nicht die gesamte Kolonie, sondern führt vielmehr eine Nadel durch
die Mitte der Kolonie ein und führt
diese wieder mit einer kleinen Probe an Zellen (oder an Myzel) und
Sporen heraus. Die Zeit, die die Nadel in der Kolonie eingeführt ist,
die Anzahl der Dips für
das Beimpfen des Kulturmediums und die Zeit, innerhalb derer die
Nadel in diesem Medium ist, beeinflussen jeweils die Größe des Impfmaterials
und können
jeweils kontrolliert und optimiert werden. Der einheitliche Prozess
des Q-bot senkt Fehler, die durch menschliches Handhaben auftreten
können,
und steigert die Rate, mit der Kulturen etabliert werden (ungefähr 10000/4
Stunden). Diese Kulturen werden anschließend in einem temperatur- und
feuchtigkeitskontrollierten Inkubator geschüttelt. Die Glaskügelchen
dienen dazu, für
eine einheitliche Belüftung
der Zellen zu sorgen, und für
eine Verteilung der Myzel-Fragmente, ähnlich zu den Klingen eines
Fermenters. Ein Beispiel dieses Verfahrens ist in 28 näher
dargestellt, einschließlich
einem integrierten System für
das Assay.
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1. Vorscreening
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Die
Fähigkeit,
einen leichten Anstieg in dem Leistungsvermögen einer Mutante gegenüber demjenigen eines
Elternstammes zu detektieren, beruht auf der Sensitivität des Assays.
Die Chance, die Organismen zu finden, die eine Verbesserung besitzen,
wird durch die Anzahl der individuellen Mutanten erhöht, die
durch das Assay gescreent werden können. Um die Chancen, einen
Pool mit hinreichender Größe zu identifizieren,
zu erhöhen,
kann ein Vorscreening eingesetzt werden, mit wel chem die Anzahl
der prozessierten Mutanten um ein Zehnfaches erhöht wird. Das Ziel des primären Screenings
wird es sein, schnell Mutanten mit gleichen oder besseren Produktionstitern
als die Elternstämme
zu identifizieren, und lediglich diese Mutanten in eine flüssige Zellkultur
zu überführen.
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Das
primäre
Screening, ein Agarplatten-Screening, wird durch den Q-bot-Kolonienpicker
analysiert. Obwohl die Assays grundlegend unterschiedlich sein können, resultieren
viele bspw. in der Produktion von Koloniehöfen. So wird bspw. die Antibiotikaproduktion
auf Platten beurteilt, und zwar unter Verwendung einer Auflage eines
empfindlichen Indikator-Stammes, wie bspw. B. subtilis. Die Antibiotikaproduktion
wird typischerweise als eine geklärte Zone (inhibiertes Wachstum
des Indikator-Organismus) um den produzierenden Organismus kontrolliert.
Auf ähnliche
Weise kann die Enzymproduktion auf Platten untersucht werden, die
das Enzymsubstrat enthalten, wobei die Aktivität als eine Zone der Substratmodifizierung
um die produzierende Kolonie herum detektiert wird. Der Produkttiter
steht mit dem Verhältnis
des Gebietes des Hofes zu dem Gebiet der Kolonie in Verbindung.
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Der
Q-bot oder ein anderes automatisiertes System wird derart programmiert,
dass er lediglich Kolonien mit einem Hofverhältnis in den oberen 10% der
Population pickt, d.h. 10.000 Mutanten aus den 100.000, die für das Platten-Vorscreening erfasst
wurden. Dadurch kann die Anzahl an verbesserten Klonen in den sekundären Assays
erhöht
werden und der verschwendete Aufwand, Knock-out- und Niedrig-Produzenten
zu screenen, beseitigt werden. Dies verbessert die „Trefferrate" des sekundären Assays.
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M. UNTERSTÜTZUNG DES
GENETISCHEN AUSTAUSCHS
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1. Allgemein
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Die
Verfahren gemäß der Erfindung
bewirken eine Rekombination zellulärer DNA durch das Vermehren
von Zellen unter Bedingungen, unter denen der Austausch von DNA
zwischen Zellen induziert wird. Der DNA-Austausch wird durch Protoplastenfusion
gefördert.
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Bei
einigen Verfahren wird die anfängliche
Diversität
zwischen den Zellen (d.h. vor dem Genom-Austausch) durch eine chemische
oder strahleninduzierte Mutagenese eines Vorläuferzelltyps induziert, wahlweise
gefolgt von einem Screening nach einem gewünschten Phänotyp. Bei anderen Verfahren
ist die Diversität natürlich, und
zwar dort, wo die Zellen aus unterschiedlichen Individuen, Stämmen oder
Spezies gewonnen wurden.
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Bei
einigen Shuffling-Verfahren wird der induzierte Austausch von DNA
als einziges Mittel zur Bewirkung der Rekombination in jedem Rekombinationszyklus
verwendet. Bei anderen Verfahren wird der induzierte Austausch in
Kombination mit der natürlichen
sexuellen Rekombination eines Organismus kombiniert. Bei anderen
Verfahren werden der induzierte Austausch und/oder die natürliche sexuelle
Rekombination in Kombination mit der Einführung einer Fragment-Bibliothek
verwendet. Eine solche Fragment-Bibliothek kann ein Gesamtgenom,
ein Gesamtchromosom, eine Gruppe funktionell oder genetisch verbundener
Gene, ein Plasmid, ein Cosmid, ein mitochondriales Genom, ein virales
Genom (replikativ oder nicht-replikativ) oder spezifische oder Zufallsfragmente
von jedem dieser sein. Die DNA kann an einen Vektor verbunden sein,
oder kann in freier Form vorliegen. Einige Vektoren enthalten Sequenzen,
die die homologe oder nicht-homologe Rekombination mit dem Wirtsgenom
fördern.
Einige Fragmente enthalten doppelsträngige Brüche, wie bspw. solche, die durch
Scheren mit Glaskügelchen,
Ultraschallbehandlung oder chemische oder enzymatische Fragmentierung verursacht
wurden, um die Rekombination zu stimulieren.
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In
jedem Fall die DNA zwischen den Zellen ausgetauscht werden, wonach
sie zur Bildung von Hybrid-Genomen eine Rekombination eingehen kann.
Im Allgemeinen werden die Zellen einer rekursiven Rekombination
unterzogen, um die Diversität
der Population vor dem Screenen zu steigern. Zellen, die Hybrid-Genome
tragen und die nach mehreren Rekombinationszyklen generiert wurden,
werden hinsichtlich des erwünschten
Phänotyps
gescreent, und Zellen, die diesen Phänotyp besitzen, werden isoliert.
Diese Zellen können
darüber
hinaus das Ausgangsmaterial für
weitere Rekombinationszyklen in einem rekursiven Rekombinations-/Selektionsschema
bilden.
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Ein
Mittel zur Förderung
des Austauschs von DNA zwischen Zellen ist die Fusion von Zellen,
wie bspw. die Protoplastenfusion. Ein Protoplast resultiert aus
der Entfernung von der Zellwand einer Zelle, wodurch eine Membran-gebundene
Zelle zurückgelassen
wird, die zur Aufrechterhaltung ihrer Integrität von einem isotonen oder hypertonen
Medium abhängt.
Wenn die Zellwand teilweise entfernt wird, wird die resultierende
Zelle strikt als Sphaeroplast bezeichnet, und wenn sie vollständig entfernt
wird, als Protoplast. Nichtsdestotrotz schließt vorliegend der Ausdruck
Protoplast Sphaeroplasten mit ein, außer wenn anderweitig angezeigt.
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Die
Protoplastenfusion ist durch Shaffner et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 77, 2163 (1980) beschrieben, und andere beispielhafte Verfahren
sind von Yoakum et al.,
US 4,608,339 ,
Takahashi et al.,
US 4,677,066 und
Sambrooke et al., in Kapitel 16, beschrieben. Die Protoplastenfusion
wurde auch zwischen Stämmen, Spezies
und Genera (bspw. Hefe und Hühnererythrocyten)
beschrieben.
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Protoplasten
können
sowohl für
bakterielle als auch für
eukaryontische Zellen, einschließlich Pflanzenzellen, durch
verschiedene Verfahren hergestellt werden, einschließlich einer
chemischen Behandlung, um die Zellwände abzustreifen. Zellwände können bspw.
durch einen Verdau mit einem Zellwandabbauenden Enzym, wie bspw.
Lysozym, in einem 10–20%
Saccharose und 50 mM EDTA enthaltenden Puffer entfernt werden. Die Umwandlung
von Zellen in sphaerische Protoplasten kann mittels einem Phasenkontrastmikroskop
beobachtet werden. Protoplasten können auch durch die Vermehrung
von Zellen in Medien hergestellt werden, die mit einem Inhibitor
der Zellwandsynthese ergänzt
sind, oder aber durch Verwendung von mutierten Stämmen, denen
die Fähigkeit
zur Zellwandbildung fehlt. Eukaryontische Zellen werden vorzugsweise
in der G1-Phase durch einen Arrest mit Inhibitoren, wie bspw. dem α-Faktor,
dem K. lactis-Killertoxin, Leflonamid und Adenylatcyclase-Inhibitoren
synchronisiert. Wahlweise können
einige, jedoch nicht alle, zu fusionierenden Protoplasten getötet werden
und/oder deren DNA kann durch eine Behandlung mit Ultraviolett-Strahlung,
Hydroxylamin oder Cupferon behandelt werden (Reeves et al., FEMS
Microbiol. Lett., 99, 193–198
(1992)). In diesem Fall werden die getöteten Protoplasten als Donoren
bezeichnet und lebensfähige
Protoplasten als Akzeptoren. Die Verwendung von toten Donor-Zellen
kann bei der nachfolgenden Erkennung von fusionierten Zellen mit
Hybrid-Genomen vorteilhaft
sein, wie nachstehend beschrieben wird. Darüber hinaus ist das Aufbrechen
der DNA in Donorzellen zur Stimulierung der Rekombination mit Akzeptor-DNA
von Vorteil. Wahlweise können
die Akzeptor- und/oder fusionierten Zellen auch kurz, jedoch nicht
letal, einer UV-Strahlung ausgesetzt werden, um die Rekombination
weiter zu stimulieren.
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Sind
die Protoplasten einmal gebildet, können sie in einer Vielzahl
von Osmolyten und Verbindungen, wie bspw. Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Sucrose, Sorbit in Gegenwart von
DTT stabilisiert werden. Die Kombination aus Puffer, pH-Wert, reduzierendem
Agens und osmotischem Stabilisator kann hinsichtlich unterschiedlichen
Zelltypen optimiert werden. Protoplasten können durch die Behandlung mit
einem chemischen Agens, wie bspw. PEG, Calciumchlorid oder Calciumpropionat
oder Elektrofusion zur Fusion induziert werden (Tsoneva, Acta Microbiologica
Bulgaria 24, 53–59
(1989)). Ein Verfahren der Zellfusion, bei welchem elektrische Felder
eingesetzt werden, ist auch beschrieben worden. Siehe Chang,
US 4,970,154 . Die Bedingungen
können
für unterschiedliche
Stämme
optimiert werden.
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Die
fusionierten Zellen sind Heterokaryen, die Genome aus zwei oder
mehreren Protoplasten enthalten. Die fusionierten Zellen können aus
unfusionierten parenteralen Zellen durch eine Sucrosegradientensedimentierung
oder durch Zellsortieren angereichert werden. Die zwei Nuclei in
den Heterokaryen können
fusionieren (Karyogamie) und zwischen den Genomen kann eine homologe
Rekombination auftreten. Die Chromosomen können sich auch asymmetrisch
aufteilen, was zu regenerierten Protoplasten führt, die ganze Chromosomen
verloren oder gewonnen haben. Die Rekombinationsfrequenz kann durch
eine Behandlung mit Ultraviolettstrahlung oder durch Verwendung
von Stämmen
gesteigert werden, die recA oder andere Rekombinationsgene überexprimieren,
oder durch die Hefe-rad-Gene und verwandte Varianten davon in anderen
Spezies, oder durch die Inhibierung der Gen-Produkte von MutS, MutI
oder MutD. Die Überexpression
kann entweder das Ergebnis der Einführung exogener Rekombinationsgene
oder das Ergebnis der Selektion von Stämmen sein, die, als ein Ergebnis
einer natürlichen
Variation oder induzierten Mutation, endogene Rekombinationsgene überexprimieren.
Die fusionierten Protoplasten werden unter Bedingungen vermehrt,
die die Regeneration der Zellwände,
eine Rekombination und die Auftrennung rekombinanter Genome in Nachkommenschafts-Zellen
aus dem Heterokaryon sowie die Expression rekombinanter Gene ermöglichen.
Dieser Prozess wird reiterativ wiederholt, um die Diversität jedes
Sets an Protoplasten oder Zellen zu steigern. Nach oder wahlweise vor
oder während
der Gewinnung der fusionierten Zellen werden die Zellen gescreent
oder hinsichtlich ihrer Entwicklung in Richtung einer gewünschten
Eigenschaft selektiert.
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Anschließend kann
eine nachfolgende Rekombinationsrunde durchgeführt werden, und zwar durch Herstellen
von Protoplasten aus den Zellen, die die Selektion/das Screening
in einer vorherigen Runde überleben.
Die Protoplasten werden fusioniert, die Rekombination findet in
fusionierten Protoplasten statt, und Zellen werden aus den fusionierten
Protoplasten wieder gewonnen. Dieses Verfahren kann wiederum reiterativ wiederholt
werden, um die Diversität
der Ausgangspopulation zu steigern. Die Protoplasten, die regenerierten oder
regenerie renden Zellen werden einer weiteren Selektion oder einem
Screening unterzogen.
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Nachfolgende
Rekombinationsrunden können
auf Basis eines aufgeteilten Pools, wie oben beschrieben, durchgeführt werden.
Dies bedeutet, dass eine erste Subpopulation an Zellen, die das
Screening/die Selektion aus einer vorherigen Runde überlebt
haben, für
die Protoplastenbildung verwendet wird. Eine zweite Subpopulation
an Zellen, die die Selektion/das Screening aus einer vorherigen
Runde überlebt
hat, wird als Quelle für
die DNA-Bibliothek-Herstellung verwendet. Die DNA-Bibliothek aus der
zweiten Subpopulation von Zellen wird anschließend in die Protoplasten aus
der ersten Subpopulation transformiert. Die Bibliothek rekombiniert
mit den Genomen der Protoplasten, wodurch rekombinante Genome gebildet
werden. Dieses Verfahren kann mehrere Male in Abwesenheit eines
Selektions-Ereignisses wiederholt werden, um die Diversität der Zellpopulation
zu steigern. Die Zellen werden aus Protoplasten regeneriert, und
eine Selektion/ein Screening wird hinsichtlich regenerierender oder
regenerierter Zellen angewandt. In einer weiteren Variation wird
eine frische Bibliothek an Nucleinsäurefragmenten in Protoplasten
eingeführt,
welche die Selektion/das Screening aus einer vorherigen Runde überlebt
haben.
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Ein
beispielhaftes Format für
das Shuffling unter Verwendung einer Protoplastenfusion ist in 5 gezeigt.
Die Figur zeigt die folgenden Schritte: Protoplastenbildung der
Donor- und Empfängerstämme, Heterokaryonbildung,
Karyogamie, Rekombination und Aufteilung der rekombinanten Genome
in einzelne Zellen. Wahlweise können
die rekombinanten Genome, wenn ein sexueller Zyklus vorliegt, einer
weiteren Rekombination miteinander unterzogen werden, was ein Ergebnis
der Meiose und der Paarung darstellt. Die rekursiven Zyklen der
Protoplastenfusion oder das rekursive Paaren/die Meiose wird oftmals
zur Steigerung der Diversität einer
Zellpopulation eingesetzt. Nach Erreichen einer hinreichend diversen
Population durch eine dieser Rekombinationsformen werden die Zellen
gescreent oder hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft selektiert. Die
Zellen, die die Selektion/das Screening überleben, können anschließend als
Ausgangsmaterialien in einem weiteren Zyklus der Protoplastenbildung
oder anderen Rekombinationsverfahren, wie hierin beschrieben, verwendet
werden.
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2. Auswahl
hinsichtlich hybrider Stämme
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Die
Erfindung kann in Verbindung mit Selektionsstrategien verwendet
werden, um Zellen zu identifizieren, die sich durch die Fusion von
Komponenten aus parenteralen Zellen aus zwei oder mehreren bestimmten
Subpopulationen gebildet haben. Die Selektion hinsichtlich hybriden
Zellen wird gewöhnlicherweise
vor der Selektion oder dem Screenen hinsichtlich Zellen durchgeführt, die
sich dahingehend entwickelt haben (als ein Ergebnis des genetischen
Austausches), dass sie eine gewünschte
Eigenschaft erlangt haben. Eine grundlegende Voraussetzung der meisten
solcher Selektions-Schemata ist es, dass zwei anfängliche
Subpopulationen zwei bestimmte Marker aufweisen. Zellen mit Hybrid-Genomen
können
daher durch die Selektion hinsichtlich beider Marker identifiziert
werden.
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Bei
einem solchen Schema trägt
zumindest eine Subpopulation an Zellen einen selektiven Marker,
der an seine Zellmembran angeheftet ist. Beispiele für geeignete
Membranmarker schließen
Biotin, Fluorescein und Rhodamin mit ein. Die Marker können an
Amid- oder Thiol-Gruppen oder durch eine spezifischere Derivatisierungs-Chemie
verbunden sein, wie bspw. Jod-Acetate,
Jod-Acetamide, Maleimide. Ein Marker kann bspw. wie folgt beschrieben
angeheftet werden. Zellen oder Protoplasten werden mit einem Puffer
(bspw. PBS) gewaschen, der mit der chemischen Anheftung eines chemisch
aktiven Liganden, der mit den Aminogruppen der Lysine oder den N-terminalen
Aminogruppen der Membranproteine reagiert, nicht wechselwirkt. Der
Ligand ist entweder selber ein Amin-Reaktiv (bspw. Isothiocyanate,
Succinimidylester, Sulfonylchloride) oder wird durch einen heterobifunktionalen
Linker (bspw. EMCS, SIAB, SPDP, SMB) aktiviert, um ein Amin-Reaktiv zu
werden. Der Ligand ist ein Molekül,
das von Protein-abgeleiteten magnetischen Kügelchen oder anderen festen
Träger-Fängern einfach
gebunden wird. Der Ligand kann bspw. Succinimidyl-aktiviertes Biotin
sein (Molecular Probes Inc.: B-1606, B-2603, S-1515, S-1582). Der
Linker wird mit Aminogruppen von Proteinen reagiert, die in und
auf der Oberfläche
einer Zellen liegen. Die Zellen werden anschließend gewaschen, um das überschüssige Markierungs-Agens
zu entfernen, bevor sie mit Zellen aus der zweiten Subpopulation
in Kontakt gebracht werden, welche einen zweiten Selektionsmarker
tragen.
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Die
zweite Subpopulation an Zellen kann ebenfalls einen Membranmarker
tragen, gleichwohl einen Marker, der sich von demjenigen der ersten
Subpopulation unterscheidet. Alternativ kann die zweite Subpopulation
einen genetischen Marker tragen. Der genetische Marker kann eine
bestimmte Eigenschaft, wie bspw. eine Arzneimittelresistenz oder
eine Eigenschaft, nach der gescreent werden kann, verleihen, wie
bspw. die Expression des „green
fluorescent protein".
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Nach
Fusion der ersten und zweiten Zell-Subpopulationen und der Wiedergewinnung
werden die Zellen gescreent oder hinsichtlich des Vorliegens der
Marker auf beiden parenteralen Subpopulationen selektiert. So werden
bspw. fusionierte Zellen durch Adsorption an spezifische Kügelchen
hinsichtlich einer Population angereichert und anschließend durch
FACS hinsichtlich derjenigen sortiert, die einen Marker exprimieren.
Zellen, die beide Screening Vorgänge
für beide
Marker überleben,
sind diejenigen, die eine Protoplastenfusion durchlaufen haben,
und besitzen deshalb eher rekombinierte Genome. Gewöhnlicherweise
werden die Marker getrennt voneinander gescreent oder selektiert.
Membrangebundene Marker, wie bspw. Biotin, können durch Affinitätsanreicherung
hinsichtlich der Zellmembranmarker gescreent werden, bspw. durch
Anbringen fusionierter Zellen an eine Affinitätsmatrix. So können bspw.
hinsichtlich eines Biotin-Membranmarkers
Zellen unter Verwendung der Streptavidinbeschichteten magnetischen
Kügelchen
(Dynal) Affinitäts-gereinigt
werden. Diese Kügelchen
werden mehrere Male gewaschen, um die nicht-fusionierten Wirtszellen
zu entfernen. Alternativ können
die Zellen gegen einen Antikörper
gereinigt werden, der gegen den Membranmarker gerichtet ist. In einer
weiteren Variation – wenn
der Membranmarker fluoresziert – können die
Zellen, die den Marker tragen, durch FRCS identifiziert werden.
Screening-Verfahren hinsichtlich genetischer Marker hängen von
der Natur der Marker ab, und schließen die Fähigkeit mit ein, auf mit Arzneimittel
behandelten Medien zu wachsen, sowie das FACS-Auswahlverfahren hinsichtlich des grün fluoreszierenden
Proteins. Wenn die ersten und die zweiten Zellpopulationen fluoreszierende
Marker mit unterschiedlichen Wellenlängen besitzen, können beide
Marker simultan durch FACS-Sortieren gescreent werden.
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Bei
einem weiteren Selektionsschema hinsichtlich Hybridzellen exprimieren
erste und zweite Populationen an Zellen, die fusioniert werden sollen,
unterschiedliche Einheiten eines heteromultimeren Enzyms. Gewöhnlicherweise
besitzt das heteromultimere Enzym zwei unterschiedliche Untereinheiten,
jedoch können auch
heteromultimere Enzyme mit drei, vier oder mehreren unterschiedlichen
Untereinheiten verwendet werden. Wenn ein Enzym mehr als zwei unterschiedliche
Untereinheiten besitzt, kann jede Untereinheit in einer unterschiedlichen
Zell-Subpopulation
exprimiert werden (bspw. drei Untereinheiten in drei Subpopulationen), oder
mehr als eine Untereinheit kann in der gleichen Subpopulation von
Zellen exprimiert werden (bspw. eine Untereinheit in einer Subpopulation,
zwei Untereinheiten in einer zweiten Subpopulation). In dem Fall,
dass mehr als zwei Untereinheiten verwendet werden, kann eine Selektion
hinsichtlich der pool-weisen Rekombination von mehr als zwei Protoplasten
erreicht werden.
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Hybridzellen,
welche eine Kombination aus Genomen von ersten, zweiten oder mehreren
Subpopulations-Zellen darstellen, können durch ein Assay für das intakte
Enzym identifiziert werden. Solch ein Assay kann ein Bindungsassay
sein, ist jedoch typischerweise eher ein funktionelles Assay (bspw.
die Fähigkeit,
ein Substrat des Enzyms zu verstoffwechseln). Die enzymatische Aktivität kann bspw.
die Prozessierung eines Substrats in ein Produkt detektiert werden,
und zwar mit einem fluoreszierenden oder anderweitig leicht detektierbaren
Absorptions- oder
Emissionsspektrum. Die einzelnen Untereinheiten eines heteromultimeren
Enzyms, die in einem solchen Assay verwendet werden, besitzen vorzugsweise
keine enzymatische Aktivität
in dissoziierter Form, oder besitzen zumindest eine bedeutend niedrigere
Aktivität
in dissoziierter Form als in assoziierter Form. In Zellen, die für die Fusion
verwendet wurden, fehlt vorzugsweise eine endogene Form des heteromultimeren
Enzyms, oder aber dieses besitzt zumindest eine bedeutend niedrigere
endogene Aktivität als
diejenige, die von dem heteromultimeren Enzym herrührt, welches
durch die Fusion der Zellen gebildet wurde.
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Penicillinacylaseenzyme,
die Cephalosporinacylase und Penicillinacyltransferase sind Beispiele
geeigneter heteromultimerer Enzyme. Diese Enzyme werden von einem
einzigen Gen kodiert, welches als Proenzym translatiert und durch
posttranslationelle autokatalytische Proteolyse gespalten wird,
wodurch ein Spacer-Endopeptid entfernt und zwei Untereinheiten gebildet
werden, welche sich zur Bildung des aktiven heterodimeren Enzyms
assoziieren. Keine der Untereinheiten ist in Abwesenheit der anderen
Untereinheit aktiv. Jedoch kann die Aktivität wieder hergestellt werden,
wenn die getrennten Gen-Abschnitte
in der gleichen Zelle durch Ko-Transformation exprimiert werden.
Andere Enzyme, die verwendet werden können, besitzen Untereinheiten,
die durch bestimmte Gene kodiert werden (so kodieren bspw. die faoA-
und faoB-Gene, die 3-Oxoacyl-CoA-thiolase
von Pseudomonas fragi (Biochem. J. 328, 815–820 (1997)).
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Ein
beispielhaftes Enzym ist die Penicillin-G-Acylase von Escherichia
coli, welche zwei Untereinheiten besitzt, die durch ein einzelnes
Gen kodiert werden. Fragmente des Gens, welches für die zwei
Untereinheiten kodiert, die operativ an geeignete Expressions-Regulationssequenzen
gebunden sind, werden in erste und zweite Zell-Subpopulationen transfiziert,
welchen die endogene Penicillin-Acylaseaktivität fehlt. Eine Zelle, die durch
Fusion von Zellen aus der ersten und der zweiten Subpopulation gebildet
wird, exprimiert die zwei Untereinheiten, die sich zur Bildung des
funktionellen Enzyms, bspw. der Penicillinacylase, zusammensetzen.
Die fusionierten Zellen können
anschließend
auf Agar-Platten selektioniert werden, die Penicillin-G enthalten,
welches durch Penicillinacylase abgebaut wird.
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Bei
einer anderen Variation werden die fusionierten Zellen durch die
Komplementierung auxotropher Mutanten identifiziert. Die Eltern-Subpopulationen
der Zellen können
hinsichtlich bekannter auxotropher Mutationen selektiert werden.
Alternativ können
auxotrophe Mutationen in einer Ausgangspopulation von Zellen spontan
dadurch generiert werden, dass sie einem mutagenen Agens ausgesetzt
werden. Zellen mit auxotrophen Mutationen werden durch Replika-Plating
auf minimalem und vollständigem
Medium selektiert. Läsionen, die
zu einer Auxotrophie führen,
werden erwartungsgemäß auf das
Genom verteilt sein, insbesondere in Genen für Aminosäuren-, Nucleotid- und Vitamin-Biosynthesewege.
Nach der Fusion der Elternzellen können die Zellen, die aus der
Fusion resultieren, durch deren Fähigkeit, auf minimalem Medium
zu wachsen, identifiziert werden. Diese Zellen können anschließend hinsichtlich
der Entwicklung in Richtung einer gewünschten Eigenschaft gescreent
oder selektiert werden. Weitere Schritte einer Mutagenese, durch
welche neue auxotrophe Mutationen generiert werden, können in
nachfolgende Rekombinations- und Screening/Selektionszyklen eingebaut
werden.
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Bei
Variationen des oben beschriebenen Verfahrens kann die de novo-Bildung
von auxotrophen Mutationen bei jeder Shuffling-Runde durch die Wiederverwendung
der gleichen Auxotrophen vermieden werden. So können bspw. Auxotrophe durch
eine Transposon-Mutagenese unter Verwendung eines Transposons generiert
werden, welches einen Selektionsmarker trägt. Auxotrophe werden durch
einen Screen, wie bspw. Replika-Plating, identifiziert. Die Auxotrophen
werden gepoolt, und ein allgemeines transduzierendes Phagenlysat
wird durch Wachstum eines Phagen auf einer Population von auxotrophen
Zellen hergestellt. Eine getrennte Population von auxotrophen Zellen
wird einem genetischen Austausch unterzogen, und die Komplementierung
wird dazu eingesetzt, um Zellen zu selektieren, welche einen genetischen
Austausch und eine Rekombination vollzogen haben. Diese Zellen werden
anschließend
hinsichtlich der Erlangung einer erwünschten Eigenschaft gescreent
oder selektiert. Die Zellen, die das Screening oder die Selektion überleben,
besitzen dann die auxotrophen Marker, welche durch Einführen der
transduzierenden Transposon-Bibliothek regeneriert wurden. Die neu
generierten auxotrophen Zellen können
anschließend
einem weiteren genetischen Austausch und einem weiteren Screening/Auswahl
unterzogen werden.
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Bei
einer weiteren Variation werden auxotrophe Mutationen durch eine
homologe Rekombination mit einem Ziel-Vektor hergestellt, welcher
einen Selektionsmarker aufweist, der von Regionen flankiert ist,
die mit einer Biosyntheseregion des Genoms der Zellen homolog ist,
die entwickelt werden sollen. Die Rekombination zwischen dem Vektor
und dem Genom schleust den positiven Selektionsmarker in das Genom
ein, wodurch eine auxotrophe Mutation erzeugt wird. Der Vektor liegt
vor der Einführung
in die Zellen in linearer Form vor. Wahlweise kann die Einführungs-Sequenz
des Vektors dadurch erhöht
werden, dass dessen Enden mit Selbst-Komplementaritäts-Oligonucleotiden
versehen werden, die in einer Haarnadelformation ausgerichtet sind.
Der genetische Austausch und das Screening/die Selektion wird wie
oben beschrieben weiter fortgeführt. Bei
jeder Runde werden Ziel-Vektoren wieder eingeführt, wodurch die gleiche Population
an auxotrophen Markern regeneriert wird.
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Bei
einer anderen Variation werden die fusionierten Zellen durch Screenen
nach einem genomischen Marker identifiziert, der in einer Subpopulation
der Elternzellen vorliegt, und nach einem episomalen Marker, der
auf einer zweiten Subpopulation von Zellen vorliegt. So kann bspw.
eine erste Hefe-Subpopulation,
die Mitochondrien enthält,
eingesetzt werden, um eine zweite Subpopulation von Hefe zu komplementieren,
die einen kleinen Phänotyp
aufweist (d.h., der Mitochondrien fehlen).
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Bei
einer weiteren Variation wird der genetische Austausch zwischen
zwei Zell-Subpopulationen durchgeführt, von denen eine tot ist.
Die Zellen werden vorzugsweise dadurch getötet, dass sie kurz DNA-fragmentierenden
Reagenzien ausgesetzt werden, wie bspw. Hydroxylamin, Cupferon oder
einer Bestrahlung. Lebensfähige
Zellen werden anschließend
hinsichtlich eines Markers gescreent, der auf der toten Eltern-Subpopulation
vorliegt.
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3. Liposomen-vermittelte
Transfers
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In
den oben beschriebenen Verfahren, bei welchen Nucleinsäurefragment-Bibliotheken
in Protoplasten eingeführt
werden, sind die Nucleinsäuren
manchmal in Liposomen eingekapselt, um die Aufnahme durch Protoplasten
zu erleichtern. Die Liposomen-vermittelte Aufnahme von DNA durch
Protoplasten ist in Redford et al., Mol. Gen. Genet. 184, 567–569 (1981)
beschrieben. Die Liposomen können
effizient große
DNA-Volumen an Protoplasten liefern (siehe Deshayes et al., EMBO
J. 4, 2731–2737
(1985)). Siehe auch Philippot und Schuber (Eds.) (1995) Liposomes
as Tools in Basic Research and Industrv CRC press, Boca Raton, bspw.
Kapitel 9, Remy et al., "Gene
Transfer with Cationic Amphiphiles". Darüber hinaus kann die DNA als
lineare Fragmente geliefert werden, die oftmals besser rekombinieren
als Gesamtgenome. Bei einigen Verfahren werden die Fragmente vor
der Einkapselung in Liposomen mutiert. Bei einigen Verfahren werden
Fragmente mit RecA und dessen Homologen, oder Nucleasen (bspw. Restriktionsendonucleasen)
vor der Einkapselung in Liposomen kombiniert, um die Rekombination
zu fördern.
Alternativ können
Protoplasten mit letalen Dosen an aufbrechenden Reagenzien behandelt
werden, und anschließend
fusioniert werden. Die Zellen, die überleben, sind diejenigen,
die durch Rekombination mit anderen genomischen Fragmenten repariert
werden, wodurch ein Selektionsmechanismus bereitgestellt wird, mit
welchem nach rekombinanten (und daher erwünscht diversen) Protoplasten
selektiert werden kann.
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4. Shuffling
filamentöser
Pilze
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Filamentöse Pilze
sind zur Durchführung
der oben beschriebenen Shuffling-Verfahren besonders geeignet. Filamentöse Pilze
werden in vier Hauptklassifizierungen eingeteilt, die auf deren
Strukturen hinsichtlich der sexuellen Reproduktion basieren: Phycomyceten,
Ascomyceten, Basidiomyceten und die Fungi imperfecti. Phycomyceten
(bspw. Rhizopus, Mucor) bilden sexuel le Sporen im Sporangium. Die
Sporen können
einen oder viele Kerne aufweisen, und besitzen oftmals keine septierte
Hyphen (coenocytisch). Ascomyceten (bspw. Aspergillus, Neurospora,
Penicillium) produzieren sexuelle Sporen in einem Ascus als Ergebnis
einer meiotischen Teilung. Die Asci enthalten typischerweise 4 Meioseprodukte,
jedoch enthalten einige 8 als Ergebnis einer zusätzlichen mitotischen Teilung.
Basidiomyceten schließen
Ständerpilze
und Brandpilze mit ein, und bilden sexuelle Sporen auf der Oberfläche eines
Basidiums. Bei den Holobasidiomyceten, wie bspw. den Ständerpilzen,
ist das Basidium ungeteilt. Bei den Hemibasidiomyceten, wie bspw.
bei den Rostpilzen (Uredinales) und den Brandpilzen (Ustilaginales)
ist das Basidium aufgeteilt. Die Fungi imperfecti, die die meisten
menschlichen Pathogene mit einschließen, besitzen kein bekanntes
sexuelles Stadium.
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Pilze
können
sich asexuell, sexuell oder parasexuell reproduzieren. Die asexuelle
Reproduktion schließt
das vegetative Wachstum des Myzels, eine Kernteilung und die Zellteilung
ohne Beteiligung der Gameten und ohne Kernfusion mit ein. Die Zellteilung
kann durch Sporenbildung, Knospung oder durch Fragmentation der
Hyphen geschehen.
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Die
sexuelle Reproduktion stellt einen Mechanismus dar, mit dem genetisches
Material zwischen Zellen neu kombiniert werden kann. Ein sexueller
Reproduktionszyklus ist durch das Abwechseln einer haploiden Phase
mit einer diploiden Phase gekennzeichnet. Eine Diploidie tritt ein,
wenn zwei haploide Gametenkerne fusionieren (Karyogamie). Die Gametenkerne
können
aus dem gleichen Elternstamm (selbstfertil) stammen, wie bspw. bei
den homothallischen Pilzen. Bei den heterothallischen Pil zen stammen
die Elternstämme
aus Stämmen
unterschiedlicher Paarungstypen.
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Eine
diploide Zelle wandelt sich durch Meiose in einen haploiden Typ
um, welche im Wesentlichen aus zwei Kernteilungen besteht, was von
einer Teilung der Chromosomen begleitet ist. Die Produkte der Meiose sind
eine Tetrade (4 haploide Nuclei). Bei einigen Fällen tritt eine mitotische
Teilung nach der Meiose auf, wodurch acht Produktzellen entstehen.
Die Anordnung der resultierenden Zellen (gewöhnlich in Sporen eingeschlossen)
erinnert an diejenige der Elternstämme. Die Länge der haploiden und diploiden
Stadien unterscheidet sich bei den unterschiedlichen Pilzen: so
besitzen die Basiliomyceten und viele der Ascomyceten einen überwiegend
haploiden Lebenszyklus (dies bedeutet, dass die Meiose sofort nach
der Karyogamie auftritt), wohingegen andere (bspw. Saccharomyces
cerevisiae) weitgehend in ihrem Lebenszyklus diploid sind (die Karyogamie
tritt bald nach der Meiose auf). Die sexuelle Reproduktion kann
zwischen den Zellen im gleichem Stamm (selbst) oder zwischen Zellen
aus unterschiedlichen Stämmen
(auskreuzen) auftreten.
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Ein
sexueller Dimorphismus (Diözismus)
ist die getrennte Produktion männlicher
und weiblicher Organe auf unterschiedlichen Myzelien. Unter den
Pilzen ist dies ein seltenes Phänomen,
obwohl doch einige wenige Beispiele bekannt sind. Der Heterothallismus
(ein Locus-zwei Allele) ermöglicht
ein Auskreuzen zwischen Kreuzungs-kompatiblen Stämmen, die selbstinkompatibel
sind. Die einfachste Form ist das zwei Allel-ein Locus-System der
Paarungstypen/-faktoren, was durch die folgenden Organismen dargestellt
wird:
A und a in Neurospora; a und α in Saccharomyces; plus und
minus in Schizosaccharomyces und Zygomycetes; a1 und
a2 in Ustilago.
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Ein
multipler-allelomorpher Heterothallismus zeigt sich bei einigen
der höheren
Basidiomyceten (bspw. bei Gasteromycetes und Hymenomycetes), die
heterothallisch sind und mehrere Paarungstypen besitzen, was durch
verschiedene Allele bestimmt wird. Der Heterothallismus in diesen
Organismen ist entweder bipolar mit einem Paarungstypfaktor, oder
aber tetrapolar mit zwei unverbundenen Faktoren, A und B. Eine stabile,
fruchtbare Heterokaryon-Bildung hängt von der Gegenwart unterschiedlicher
A-Faktoren ab, und, im Falle der tetrapolaren Organismen, auch von
unterschiedlichen B-Faktoren. Dieses System ist bei der Förderung
der Auszüchtung
und dem Verhindern des Selbst-Züchtens
effektiv. Die Anzahl unterschiedlicher Paarungsfaktoren kann sehr
groß sein
(bspw. Tausende) (Kothe, FEMS Microbiol. Rev. 18, 65–87 (1996)),
und nicht-parenterale Paarungsfaktoren können durch Rekombination entstehen.
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Die
parasexuelle Reproduktion stellt ein weiteres Mittel bereit, mit
welchem genetisches Material zwischen Zellen neu kombiniert werden
kann. Dieses Verfahren ermöglicht
die Rekombination parenteraler DNA, ohne die Beteiligung von Paarungstypen
oder Gameten. Parasexuelle Fusion tritt durch Hyphen-Fusion auf, wodurch
ein gemeinsames Cytoplasma mit unterschiedlichen Nuclei entsteht.
Die beiden Nuclei können
sich unabhängig
voneinander im resultierenden Heterokaryon trennen, jedoch fusionieren
sie gelegentlich. Auf die Fusion folgt eine Haploidisierung, bei
welcher ein Verlust der Chromosomen auftreten kann, sowie ein mitotisches
Crossing-over zwischen homo logen Chromosomen. Die Protoplastenfusion
ist eine Form der parasexuellen Reproduktion.
-
Innerhalb
der oben genannten vier Klassen werden die Pilze auch hinsichtlich
vegetativer Kompatibilitätsgruppen
klassifiziert. Pilze innerhalb einer vegetativen Kompatibilitätsgruppe
können
miteinander Heterokaryen bilden. Aus diesen Gründen werden für den Austausch
von genetischem Material zwischen unterschiedlichen Pilzstämmen gewöhnlich Pilze
aus der gleichen vegetativen Kompatibilitätsgruppe bereitgestellt. Jedoch
kann ein genetischer Austausch auch zwischen Pilzen aus unterschiedlichen
Inkompatibilitätsgruppen auftreten,
und zwar als Ergebnis einer parasexuellen Reproduktion (siehe Timberlake
et al.,
US 5,605,820 ). Ferner,
wie anderswo diskutiert, kann die natürliche vegetative Kompatibilitätsgruppe
der Pilze als ein Ergebnis des Shufflings erweitert werden.
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Mehrere
Isolate von Aspergillus nidulans, A. flavus, A. fumigatus, Penicillium
chrysogenum, P. notatum, Cephalosporium chrysogenum, Neurospora
crassa, Aureobasidium pullulans wurden hinsichtlich ihres Karyotyps
untersucht. Die Größe der Genome
befindet sich bei den Aspergilli im Allgemeinen im Bereich zwischen
20 und 50 Mb. Zwischen ähnlichen
Stämmen
bestehen oftmals Unterschiede in den Chromosomensätzen und
werden ebenso durch Transformation mit exogener DNA verursacht.
Filamentöse
Pilzgene enthalten Introns, gewöhnlich
von ungefähr
50 bis 100 bp groß,
mit ähnlichen
5'- und 3'-Consensus-Splice-Sequenzen. Promoter-
und Terminationssignale sind oftmals Kreuz-erkennbar, wodurch die
Expression eines Gens/eines Wegs aus einem der Pilze (bspw. A. nidulans)
in einen anderen (bspw. P. chrysogenum) ermöglicht wird.
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Die
Hauptkomponenten der Pilzzellwände
sind Chitin (oder Chitosan), β-Glucan
und Mannoproteine. Chitin und β-Glucan
bilden das Gerüst,
wohingegen Mannoproteine interstitielle Komponenten sind, die die
Porosität
der Wände,
die Antigenizität
und die Adhäsion
vorgeben. Die Chitinsynthetase katalysiert die Polymerisierung von β-(1,4)-verbundenem
N-Acetylglucosamin(GIcNAc)-Resten, wodurch lineare Stränge gebildet werden,
die antiparallel zueinander verlaufen; die β-(1,3)-Glucansynthetase katalysiert
die Homopolymerisierung von Glucose.
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Ein
allgemeines Ziel des Shuffling ist es, Pilze dahingehend weiterzuentwickeln,
dass sie zu brauchbaren Wirten für
genetische Konstruktionen werden, insbesondere für das Shuffling unverwandter
Gene. A. nidulans und neurospora sind im Allgemeinen die Pilzorganismen
der Wahl, die als Wirte solcher Manipulationen dienen, gerade auf
Grund ihrer sexuellen Zyklen und auf Grund ihrer gut erforschten
Verwendung in der klassischen und der molekularen Genetik. Ein anderes
Ziel ist es, die Fähigkeit
der Pilze dahingehend zu verbessern, spezifische Verbindungen zu
produzieren (wie bspw. antibakterielle Verbindungen (Penicilline,
Cephalosporine), Anti-Pilzverbindungen
(wie bspw. Echinocandine, Aureobasidine) und Holz-abbauende Enzyme).
Unter diesen allgemeinen Zielen gibt es gewisse Überschneidungen, so dass einige
der erwünschten
Eigenschaften zur Erlangung beider Ziele nützlich sind.
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Eine
erwünschte
Eigenschaft ist die Einführung
eines Meiose-Apparats in Pilze, denen gegenwärtig ein sexueller Zyklus fehlt
(siehe Sharon et al., Mol. Gen. Genet. 251, 60–68 (1996)). Ein Schema zur
Einführung
eines sexuellen Zyklus in den Pilz P. chrysogenum (ein Mitglied
der Fungi imperfecti) ist in 6 gezeigt. Protoplasten-Subpopulationen
werden aus A. nidulans (der einen sexuellen Zyklus besitzt) gebildet,
sowie aus P. chrasogenum, welcher keinen sexuellen Zyklus aufweist.
Die beiden Stämme
tragen vorzugsweise unterschiedliche Marker. Die A. nidulans-Protoplasten
werden durch Behandlung mit UV oder Hydroxylamin getötet. Die
beiden Subpopulationen werden zur Bildung von Heterokaryen fusioniert.
Bei einigen Heterokaryen fusionieren die Nuclei und eine gewisse
Rekombination tritt auf. Die fusionierten Zellen werden unter Bedingungen kultiviert,
unter welchen neue Zellwände
generiert werden, wonach anschließend eine sexuelle Rekombination zugelassen
wird. Zellen mit rekombinanten Genomen werden anschließend selektiert
(bspw. durch Auswahl hinsichtlich der Komplementierung auxotropher
Marker, die auf den jeweiligen Elternstämmen vorliegen). Es ist wahrscheinlicher,
dass Zellen mit Hybridgenomen die Gene erlangt haben, die für einen
sexuellen Zyklus notwendig sind. Die Protoplasten der Zellen können anschließend mit
getöteten
Protoplasten einer weiteren Zellpopulation auf die gleiche Art und
Weise gekreuzt werden, von denen bekannt ist, dass sie einen sexuellen Zyklus
besitzen (den gleichen oder einen unterschiedlichen wie in der vorherigen
Runde), gefolgt von einer Auswahl hinsichtlich Zellen, die Hybridgenome
aufweisen.
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Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist die Herstellung eines Pilz-Mutatorstammes. Ein solcher
Pilz kann durch Shuffling eines Pilzstammes erzeugt werden, der
ein Markergen mit einer oder mehreren Mutationen enthält, welche
die Expression eines funktionellen Produktes beeinträchtigen
oder verhindern. Die neu zusammengesetzten Pilze werden unter Bedingungen
vermehrt, unter welchen hinsichtlich der Expression des positi ven
Markers selektiert wird (wobei gleichzeitig eine kleine Menge an
restlichem Wachstum ohne Expression zugelassen wird). Die neu zusammengesetzten
Pilze, die am schnellsten wachsen, werden als Ausgangsmaterial für die nächste Runde
des Shufflings ausgewählt.
-
Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist es, das Wirtsspektrum eines Pilzes derart zu erweitern,
dass es mit Pilzen aus anderen vegetativen Kompatibilitätsgruppen
Heterokaryen bilden kann. Eine Inkompatibilität zwischen Spezies resultiert
aus den Wechselwirkungen spezifischer Allele an unterschiedlichen
Inkompatibilitäts-Loci
(wie bspw. die „het"-Loci). Wenn zwei
Stämme
einer hyphalen Anastomose unterzogen werden, kann eine letale zytoplasmatische
Inkompatibilitätsreaktion
auftreten, wenn sich die Stämme
an diesen Loci unterscheiden. Die Stämme müssen, um vollständig kompatibel
zu sein, identische Loci tragen. Mehrere dieser Loci wurden bei
verschiedenen Spezies identifiziert, und der Inkompatibilitätseffekt
ist in einem gewissen Maße
additiv (daher kann eine „partielle
Inkompatibilität" auftreten). Für diese
Organismen sind einige tolerante und het-negative Mutanten beschrieben
worden (bspw. Dales & Croft,
J. Gen. Microbiol. 136, 1717–1724 (1990)).
Darüber
hinaus ist von einem Toleranzgen (tol) berichtet worden, welches
die Paarungstyp-Heterokaryoninkompatibilität unterdrückt. Das Shuffling wird zwischen
Protoplasten von Stämmen
aus unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen durchgeführt. Bei
einem bevorzugten Format wird ein lebender Empfängerstamm und ein UV-bestrahlter, toter
Empfängerstamm
verwendet. Die UV-Strahlung dient dazu, Mutationen in die DNA einzufügen, wodurch
die het-Gene inaktiviert
werden. Die zwei Stämme
sollten unterschiedliche genetische Marker tragen. Die Protoplasten
der Stämme
wer den fusioniert, die Zellen werden regeneriert und hinsichtlich
der Komplementierung der Marker gescreent. Aufeinander folgende
Shuffling- und Selektionsrunden können auf die gleiche Art und
Weise durchgeführt
werden, indem die Zellen, die das Screening überleben, mit Protoplasten
einer frischen Population an Donorzellen fusioniert werden. Ähnlich wie
bei den hierin beschriebenen Verfahren werden die Zellen, die aus
der Regenerierung der Protoplasten gewonnen werden, wahlweise durch
erneute Protoplastenbildung refusioniert und in Zellen regeneriert,
und zwar ein- oder mehrere Male vor jedem Selektionsschritt, um
die Diversität
der resultierenden Zellpopulation, die gescreent werden soll, zu
erhöhen.
-
Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist die Einführung
eines multiplen allelomorphen Heterothallismus in Ascomycetes und
Fungi imperfectii, die diese Eigenschaft normalerweise nicht aufweisen.
Dieses Paarungssystem gestattet ein Auskreuzen ohne Selbstzüchtung.
Solch ein Paarungssystem kann durch Shuffling von Ascomycetes und
Fungi imperfectii mit DNA aus Gasteromycetes oder Hymenomycetes
eingeführt
werden, welche ein solches System besitzen.
-
Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist die spontane Bildung von Protoplasten, um die Verwendung eines
Pilzstammes als Shuffling-Wirt zu erleichtern. Daher wird der zu
entwickelnde Pilz typischerweise mutagenisiert. Die Sporen des Pilzes,
der entwickelt werden soll, werden kurz mit einem Zellwand-abbauenden Agens
für einen
Zeitraum behandelt, der für
eine vollständige
Protoplastenbildung nicht ausreicht, und werden mit Protoplasten
von anderen Pilzstämmen
gemischt. Protoplasten, die sich durch Fusion der zwei unterschiedlichen Subpopulationen
bilden, werden durch genetisches oder anderes Screening/Auswählen wie
oben beschrieben identifiziert. Diese Protoplasten werden zur Regenerierung
des Myzels und anschließend
der Sporen verwendet, welche das Ausgangsmaterial für die nächste Shuffling-Runde
bilden. In der nächsten
Runde werden zumindest einige der überlebenden Sporen mit einem
Zellwandentfernenden Enzym behandelt, jedoch über einen kürzeren Zeitraum als in der
vorherigen Runde. Nach der Behandlung werden die zum Teil von den
Zellwänden
befreiten Zellen mit einem ersten Marker markiert. Diese Zellen
werden anschließend
mit Protoplasten gemischt, die von anderen Zellen abstammen können, die
die Selektion in einer vorherigen Runde überlebt haben, oder aus einem
frischen Pilzstamm. Diese Protoplasten sind mit einem zweiten Marker
physikalisch markiert. Nach Inkubation der Zellen unter Bedingungen
für die
Protoplastenfusion werden die fusionierten Zellen mit beiden Markern
selektiert. Diese fusionierten Zellen werden zur Bildung von Myzel
und Sporen für
die nächste
Shuffling-Runde eingesetzt, und so weiter. Schließlich wird
die Nachkommenschaft, die spontan Protoplasten bildet (d.h. ohne
Hinzufügung
von Zellwand-abbauenden Agenzien), identifiziert. Wie bei den anderen
hierin beschriebenen Verfahren können
die Zellen oder Protoplasten reiterativ fusioniert und vor der Durchführung jedes
Selektionsschritts regeneriert werden, um die Diversität der resultierenden
Zellen oder Protoplasten, die gescreent werden sollen, zu erhöhen. Auf ähnliche
Weise können
ausgewählte
Zellen oder Protoplasten reiterativ fusioniert und für einen
oder mehrere Zyklen regeneriert werden, ohne eine Auswahl für die resultierenden
zellulären
oder Protoplasten-Populationen notwendig zu machen, wodurch die
Diversität
der Zellen oder Protoplasten, die schließlich gescreent werden sollen,
erhöht
wird. Dieses Verfahren der Durch führung verschiedener Rekombinationszyklen
mit zerstreut angeordneten Selektionsschritten kann wie gewünscht reiterativ
wiederholt werden.
-
Eine
andere gewünschte
Eigenschaft ist die Erlangung und/oder die Verbesserung von Genen,
die für Enzyme
in biosynthetischen Wegen kodieren, ferner für Gene, die Transporterproteine
kodieren, und Gene, die für
Proteine kodieren, die bei der Stoffwechselflusskontrolle beteiligt
sind. In diesem Fall können
die Gene des Weges in den zu entwickelnden Pilz entweder durch genetischen
Austausch mit einem anderen Pilz eingeführt werden, welcher den Weg
besitzt, oder durch Einführen
einer Fragment-Bibliothek aus einem Organismus, der den Weg besitzt.
Das genetische Material dieser Pilze kann anschließend einem
weiteren Shuffling und Screening/einer Selektion durch die in dieser
Anmeldung verschieden diskutierten Verfahren unterzogen werden.
Die neu zusammengesetzten Pilzstämme
werden ausgewählt
(gescreent) hinsichtlich der Produktion der Verbindungen, die durch
den Stoffwechselweg oder Vorläufer
davon produziert werden.
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Eine
andere erwünsche
Eigenschaft ist es, die Stabilität
der Pilze unter extremen Bedingungen, wie Hitze, zu erhöhen. In
diesem Fall können
die Gene, die zur Stabilität
beitragen, durch einen DNA-Austausch oder durch Transformation einer
DNA aus einem Stamm, der diese Eigenschaften bereits besitzt, erlangt
werden. Alternativ kann der zu entwickelnde Stamm einer Zufallsmutagenese
unterzogen werden. Das genetische Material des Pilzes, der entwickelt
werden soll, kann durch jede der in dieser Anmeldung beschriebenen
Verfahren neu zusammengesetzt werden, wobei die neu zusammengesetzten
Pilze dahingehend aus gewählt werden,
dass sie ein Aussetzen gegenüber
extremen Bedingungen überleben.
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Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist die Fähigkeit
eines Pilzes, unter veränderten
ernährungstechnischen
Bedingungen zu wachsen (bspw. Wachstum auf besonderen Kohlenstoff-
oder Stickstoffquellen. Die Änderung
der ernährungstechnischen
Bedingungen ist insbesondere für
bspw. natürliche
Pilzisolate wertvoll, die wertvolle kommerzielle Produkte produzieren,
die jedoch einen komplizierten und daher teuren Nährstoff bedarf
besitzen. Der zu entwickelnde Stamm wird einem genetischen Austausch
und/oder einer genetischen Transformation mit DNA aus einem Stamm
unterzogen, der den erwünschten
Nährstoffbedarf
besitzt. Der zu entwickelnde Pilz kann dann wahlweise einem weiteren
Shuffling unterzogen werden, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben
ist, wobei die rekombinanten Stämme
hinsichtlich ihrer Fähigkeit,
unter den erwünschten
Nährstoffbedingungen
zu wachsen, ausgewählt
werden. Wahlweise können
die Nährstoffbedingungen
in aufeinander folgenden Shuffling-Runden variiert werden, wobei
nahe von den natürlichen
Bedingungen des zu entwickelnde Pilzes ausgegangen wird, und in
nachfolgenden Runden dem erwünschten
Nährstoffbedarf
angenähert
wird.
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Eine
weitere erwünschte
Eigenschaft ist die Aneignung natürlicher Kompetenz in einem
Pilz. Das Verfahren zur Aneignung natürlicher Kompetenz durch Shuffling
ist im Allgemeinen beschrieben in der PCT/US97/04494. Der zu entwickelnde
Pilz wird typischerweise einem genetischen Austausch oder einer
genetischen Transformation mit DNA aus einem bakteriellen Stamm
oder Pilzstamm unterzogen, der bereits diese Eigenschaft besitzt.
Zellen mit den rekombinanten Genomen werden anschließend hinsichtlich
der Fähigkeit,
ein Plasmid mit einem Selektionsmarker aufzunehmen, ausgewählt. Weitere
Rekombinations- und Selektionsrunden können unter Verwendung jeder
der oben beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
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Eine
weitere erwünschte
Eigenschaft ist die reduzierte oder erhöhte Sekretion von Proteasen
und DNase. In diesem Fall kann der zu entwickelnde Pilz DNA durch
einen Austausch oder durch eine Transformation von einem anderen
Stamm erhalten, von dem bekannt ist, dass er die erwünschte Eigenschaft
besitzt. Alternativ kann der zu entwickelnde Pilz einer Zufallsmutagenese
unterzogen werden. Der zu entwickelnde Pilz wird dabei, wie oben
beschrieben, neu zusammengesetzt. Die Gegenwart eines solchen Enzyms
oder der Mangel daran kann dadurch bestimmt werden, dass das Kulturmedium
von einzelnen Isolaten mit einem fluoreszierenden Molekül in Verbindung
gebracht wird, welches über
eine Peptid- oder DNA-Bindung an einen Träger gebunden ist. Die Spaltung
der Verbindung setzt die detektierbare Fluoreszenz in das Medium
frei.
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Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist es, Pilze mit veränderten Transportern (wie bspw.
MDR) herzustellen. Solche veränderten
Transporter sind bspw. bei Pilzen nützlich, die dahingehend entwickelt
wurden, dass sie neue Sekundärmetabolite
entwickeln, um die Aufnahme von Vorläufern in eine Zelle zu ermöglichen, die
für die
Synthese des neuen Sekundärmetaboliten
benötigt
werden, oder dass sie das Ausschleusen des Sekundärmetaboliten
aus der Zelle ermöglichen.
Die Transporter können
durch das Einführen
einer Bibliothek von Transportervarianten in Pilzzellen entwickelt
werden und dadurch, dass man Zellen sexuell oder parasexuell rekombinieren
lässt.
Um einen Trans porter mit der Fähigkeit
zu entwickeln, einen Vorläufer
in Zellen zu transportieren, werden die Zellen in Gegenwart des
Vorläufers
vermehrt und die Zellen anschließend hinsichtlich der Produktion
des Metaboliten gescreent. Um einen Transporter mit der Fähigkeit
zu entwickeln, einen Metaboliten auszuschleusen, werden die Zellen
unter Bedingungen vermehrt, die die Produktion des Metaboliten unterstützen und
anschließend
hinsichtlich des Ausschleusens des Metaboliten in das Kulturmedium
gescreent.
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Ein
allgemeines Verfahren des Pilz-Shufflings ist in 7 gezeigt.
Sporen aus einem eingefrorenen Bestand, einem lyophilisierten Bestand
oder frisch von einer Agar-Platte werden zur Beimpfung eines geeigneten
flüssigen
Mediums eingesetzt (1). Die Sporen werden zur Keimung gebracht,
was in ein Hyphen-Wachstum
resultiert (2). Das Myzel wird geerntet, und durch Filtrieren und/oder
Zentrifugieren gewaschen. Wahlweise kann die Probe mit DTT vorbehandelt
werden, um die Protoplastenbildung zu verstärken (3). Die Protoplastenbildung
wird in einem osmotisch stabilisierenden Medium (bspw. 1 m NaCl/20
mM MgSo4 pH 5,8) unter Hinzufügung eines
Zellwand-abbauenden Enzyms (bspw. Novozym 234) durchgeführt (4).
Das Zellwand-abbauende Enzym wird durch wiederholtes Waschen mit
einer osmotisch stabilisierenden Lösung entfernt (5). Die Protoplasten
können
vom Myzel, dem Abfall und den Sporen durch Filtrieren über ein
Miracloth-Filterpapier und durch Dichten-Zentrifugation getrennt
werden (6). Die Protoplasten werden durch Zentrifugieren geerntet
und zu der geeigneten Konzentration resuspendiert. Dieser Schritt
kann zu einer gewissen Protoplastenfusion führen (7). Die Fusion kann durch
Hinzufügen
von PEG (bspw. PEG 3350) stimuliert werden, und/oder durch wiederholte
Zentrifugation und Resuspension mit oder ohne PEG. Ferner kann auch
eine Elektrofusion durchgeführt
werden (8). Die fusionierten Protoplasten können wahlweise aus den unfusionierten
Protoplasten durch Sucrose-Gradienten-Sedimentierung (oder durch
andere Screening-Verfahren, wie oben beschrieben) angereichert werden.
Die fusionierten Protoplasten können
wahlweise mit einer UV-Strahlung
behandelt werden, um die Rekombination zu stimulieren (9). Anschließend werden
die Protoplasten auf osmotisch stabilisierten Agar-Platten kultiviert,
um die Zellwände
zu regenerieren und um Myzel zu bilden (10). Das Myzel wird dazu verwendet,
um Sporen zu bilden (11), die anschließend als Ausgangsmaterial für die nächste Shuffling-Runde eingesetzt
werden (12).
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Die
Auswahl hinsichtlich einer erwünschten
Eigenschaft kann entweder auf regeneriertem Myzel oder aus Sporen,
die davon abgeleitet sind, durchgeführt werden.
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Bei
einem alternativen Verfahren werden die Protoplasten durch Inhibierung
von einem oder mehreren Enzymen gebildet, die für die Zellwandsynthese benötigt werden
(siehe 8). Der Inhibitor sollte bei
den Einsatzbedingungen eher fungistatisch als fungizid sein. Beispiele
für Inhibitoren
schließen
Antipilz-Verbindungen mit ein, die (von bspw. Georgopapadakou & Walsh, Antimicrob.
Ag. Chemother. 40, 279–291
(1996) oder von Lyman & Walsh,
Drugs 44, 9–35
(1992)) beschrieben sind. Andere Beispiele schließen Chitinsynthaseinhibitoren
(Polyoxin- oder Nikkomycin-Verbindungen) und/oder Glucansyntheseinhibitoren
(bspw. Echinocandine, Papulocandine, Pneumocandine) mit ein. Die
Inhibitoren sollten in einem osmotisch stabilisierten Medium eingesetzt
werden. Die Zellen, die von ihren Zellwänden befreit werden, können fusioniert
werden, oder an derweitig als Spender oder Wirte in genetischen Transformations-Stammentwicklungs-Programmen
eingesetzt werden. Ein mögliches
Schema, bei welchem dieses Verfahren reiterativ eingesetzt wird,
ist in 8 schematisch dargestellt.
-
Bei
einer weiteren Variation werden die Protoplasten unter Verwendung
von Pilzstämmen
hergestellt, die dahingehend genetisch defizient oder in ihrer Fähigkeit
eingeschränkt
sind, intakte Zellwände
zu synthetisieren (siehe
9). Solche
Mutanten werden im Allgemeinen als fragil, osmotisch-rehabilitierend
oder zellwandlos bezeichnet, und sind bei Stamm-Hinterlegungsstellen
erhältlich.
Beispiele solcher Stämme
schließen Neurospora
crassa os-Mutanten (Selitrennikoff, Antimicrob. Agents. Chemother.
23, 757–765
(1983)) mit ein. Einige solcher Mutationen sind temperaturempfindlich.
Temperaturempfindliche Stämme
können
zu Zwecken der Selektion und Amplifizierung bei der toleranten Temperatur
vermehrt werden, und zu Zwecken der Protoplastenbildung und -fusion
bei der nicht-toleranten Temperatur. Ein temperaturempfindlicher
Stamm von Neurospora crassa os ist beschrieben worden, der sich
als Protoplasten vermehrt, wenn man ihn in einem osmotisch stabilisierenden
Medium mit Sorbose und Polyoxiden bei nicht-toleranten Temperaturen
wachsen lässt, der
jedoch ganze Zellen produziert, nachdem er in ein Medium überführt wird,
welches Sorbit bei einer toleranten Temperatur enthält. Siehe
US 4,873,196 .
-
Andere
geeignete Stämme
können
durch eine gezielte Mutagenese von Genen hergestellt werden, die bei
der Chitinsynthese, der Glucansynthese oder anderen Zellwand-verwandten
Verfahren beteiligt sind. Beispiele solcher Gene schließen CHT1,
CHT2 und CALI (oder CSD2) von Saccharomyces cerevisiae und Candida
spp. mit ein (Georgopapadakou & Walsh,
(1996), ETGI/FKSI/CNDI/CWH53/PB RI und deren Homologe in S. cerevisiae,
Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus,
ChvAINdvA Agrobacterium und Rhizobium. Andere Beispiele sind MA
oder IB oder IC, MD, tsE und bimG von Aspergillus nidulans (Borgia,
J. Bacteriol. 174, 377–389
(1992)). Stämme
von A. nidulans, die OrlAl oder tse l-Mutationen enthalten, lysieren
bei restriktiven Temperaturen. Die Lysis dieser Stämme kann
durch eine osmotische Stabilisierung verhindert werden, und die
Mutationen können
durch das Hinzufügen
von N-Acetylglucosamin (GlcNac) komplementiert werden. BimGI l-Mutationen
sind ts hinsichtlich einer Typ-1-Proteinphosphatase (den Keimlinien von
Stämmen,
die diese Mutation tragen, fehlen Chitin und Conidien, und schwellen
daher an und lysieren). Andere geeignete Gene sind chsA, chsB, chsC,
chsD und chsE von Aspergillus fumigatus; chs1 und chs2 von Neurospora
crassa; Phycomyces Blakesleeanus MM und chs1, 2 und 3 von S. cerevisiae.
Chs1 ist ein nicht-essentielles
Reparaturenzym; chs2 ist bei der Septumbildung beteiligt und chs3
ist bei der Zellwandreifung und in der Knospen-Ringbildung beteiligt.
-
Andere
geeignete Stämme
schließen
S. cerevisiae CLY (Zelllyse)-Mutanten mit ein, wie bspw. ts-Stämme (Paravicini
et al., Mol. Cell Biol. 12, 4896–4905 (1992)), und den CLY
15-Stamm, der eine
PKC 1-Gen-Deletion trägt.
Andere geeignete Stämme
schließen
den Stamm VY 1160 mit ein, der in srb (kodiert für Actin) eine ts-Mutation enthält (Schade
et al. Acta Histochem. Suppl. 41, 193–200 (1991)), und einen Stamm mit
einer ses-Mutation, welche in eine erhöhte Sensitivität gegenüber Zellwand-abbauenden
Enzymen resultiert, die aus dem Schneckendarm isoliert werden (Metha & Gregory, Appl.
Environ. Microbi ol. 41, 992–999 (1981)).
Geeignete Stämme
von C. albicans schließen
diejenigen mit Mutationen in chs1, chs2 oder chs3 mit ein (die für die Chitin-Synthetasen
kodieren), wie bspw. osmotisch-rehabilitierende, bedingt letale
Mutanten, die von Payton & de
Tiani, Curr. Genet. 17, 293–296
(1990) beschrieben wurden, C. utilis-Mutanten mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber Zellwand-abbauenden
Enzymen, isoliert aus Schneckendarm (Metha & Gregory, 1981, siehe oben); und
N. crassa-Mutanten os-1, os-2, os-3, os-4, os-5 und os-6. Siehe
Selitrennikoff, Antimicrob. Agents Chemother. 23, 757–765 (1983).
Solche Mutanten wachsen und teilen sich ohne eine Zellwand bei 37°C, jedoch
produzieren sie bei 22°C
eine Zellwand.
-
Eine
zielgerichtete Mutagenese kann durch die Transformation von Zellen
mit einem positiv-negativ-Selektionsvektor erreicht werden, der
homologe Regionen enthält,
welche ein Zielsegment flankieren, einen positiven Selektionsmarker
zwischen den homologen Regionen und einen negativen Selektionsmarker
außerhalb
der homologen Regionen (siehe Capecchi,
US 5,627,059 ). Bei einer Variation
kann der negative Selektionsmarker ein Antisens-Transkript des positiven
Selektionsmarkers sein (siehe
US
5,527,674 ).
-
Andere
geeignete Zellen können
anschließend
durch Zufalls-Mutagenese oder durch Shuffling-Verfahren in Kombination
mit Selektion ausgewählt
werden. So kann man bspw. eine erste Subpopulation von Zellen mutagenisieren,
sie anschließend
von der Mutagenese erholen lassen, sie einem unvollständigen Abbau der
Zellwände
unterziehen und sie mit Protoplasten einer zweiten Zell-Subpopulation
in Kontakt bringen. Hybridzellen, die Marker von beiden Subpopulationen
tragen, werden (wie oben beschrieben) identifiziert und als Ausgangsmaterialien
in nachfolgenden Shuffling-Runden verwendet. Mit diesem Selektionsschema
können sowohl
Zellen selektiert werden, die eine Fähigkeit zur spontanen Protoplastenbildung
besitzen, als auch Zellen, die eine verstärkte Rekombinogenizität besitzen.
-
Bei
einer weiteren Variation können
Zellen mit der Fähigkeit
zur spontanen Protoplastenbildung mit Zellen gekreuzt werden, die
eine verstärkte
Rekombinogenizität
besitzen, welche sich unter Verwendung anderer Verfahren entwickelt
haben. Die Hybridzellen sind besonders geeignete Wirte für das Gesamtgenom-Shuffling.
-
Zellen
mit Mutationen in Enzymen, die bei der Zellwandsynthese oder bei
deren Aufrechterhaltung beteiligt sind, können einer Fusion einfach dadurch
unterzogen werden, dass die Zellen in einer osmotisch geschützten Kultur
auf Grund der Spontanprotoplastenbildung vermehrt werden. Wenn die
Mutation bedingt ist, werden die Zellen in nicht-permissive Bedingungen überführt. Die
Protoplastenbildung und -fusion kann durch das Hinzufügen von
unterstützenden
Agenzien, wie bspw. PEG oder einem elektrischen Feld beschleunigt werden
(siehe Philipova & Venkov,
Yeast 6, 205–212
(1990); Tsoneva et al., FEMS Microbiol. Lett. 51, 61–65 (1989)).
-
5. Zielgerichtetes Shuffling – „Hot Spots"
-
Zielgerichtete
homologe Gene können
in spezifische Genomregionen (bspw. durch homologe Rekombination
oder andere Zielverfahren) kloniert werden, die als Rekombinations-„Hot Spots" bekannt sind (d.h.
Regionen, die erhöhte
Rekombinations level im Vergleich zum Durchschnitts-Rekombinationslevel
zeigen, der bei einem Gesamtgenom beobachtet wird), oder von denen
bekannt ist, dass sie nahe bei solchen Hot Spots liegen. Die resultierenden
rekombinanten Stämme
werden rekursiv gepaart. Während
der meiotischen Rekombination rekombinieren homologe rekombinante
Gene, wodurch die Diversität
der Gene erhöht
wird. Nach mehreren Rekombinationszyklen durch rekursive Paarung
werden die resultierenden Zellen gescreent.
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6. Shuffling-Verfahren
in Hefe
-
Hefestämme stellen
Subspezies der Pilze dar, die als einzelne Zellen wachsen. Hefen
werden zur Herstellung von fermentierten Getränken und Gärstoffen eingesetzt, ferner
für die
Produktion von Ethanol als Kraftstoff, Verbindungen mit niedrigem
Molekulargewicht und für
die heterologe Produktion von Proteinen und Enzymen (siehe beigefügte Liste
der Hefestämme
und deren Verwendungen). Gewöhnlich
verwendete Hefestämme
schließen
Saccharomyces cerevisiae, Pichia sp., Candida sp. und Schizosaccharomyces
pombe mit ein.
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Mehrere
Typen von Vektoren sind zur Klonierung in Hefe verfügbar, einschließlich eines
integrativen Plasmids (YIp), einem Hefe-replizierenden Plasmid (YRp,
wie bspw. die 2 μ-kreisbasierten Vektoren),
das Hefe-episomale Plasmid (YEp), das Hefe-zentromere Plasmid (YCp)
oder das Hefe-künstliche
Chromosom (YAC). Jeder Vektor kann Marker tragen, die zur Selektion
hinsichtlich des Vorliegens des Plasmids nützlich sind, wie bspw. LUE2,
URA3 und HIS3, oder aber hinsichtlich Abwesenheit des Plasmids,
wie bspw. URA3 (welches ein Gen darstellt, das für Zellen toxisch ist, die in
Gegenwart von 5-Fluororotsäure
wachsen).
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Viele
Hefen besitzen einen sexuellen und mehrere asexuelle (vegetative)
Zyklen. Bei dem sexuellen Zyklus ist die Rekombination des Gesamtgenoms
des Organismus beteiligt, und zwar jedes Mal, wenn die Zelle durch
die Meiose geht. So werden bspw. diploide Zellen, wenn diploide
Zellen von S. cerevisiae Stickstoff- und Kohlenstoff-begrenzenden
Bedingungen ausgesetzt werden, einer Meiose unterzogen, wodurch
Asci gebildet werden. Jeder Ascus beinhaltet vier haploide Sporen,
zwei vom Paarungstyp „a" und zwei vom Paarungstyp „α". Nach Überführen in
ein reiches Medium paaren die haploiden Sporen des jeweils entgegengesetzten
Paarungstyps, wodurch wiederum diploide Zellen gebildet werden.
Anisosporen der jeweils entgegengesetzten Paarungstypen können innerhalb
des Ascus paaren, oder aber – wenn
der Ascus bspw. mit Zymolase abgebaut ist – es werden die haploiden Zellen
freigesetzt und können
mit Sporen aus anderen Asci paaren. Dieser sexuelle Zyklus sorgt
für ein
Format, mit welchem endogene Hefegenome und/oder exogene Fragmentbibliotheken
in Hefevektoren neu zusammengesetzt werden können. Dieses Verfahren resultiert
in eine Verlagerung oder Akkumulation von Hybridgenen, und in das
Shuffling von homologen Sequenzen, die von paarenden Zellen geteilt
werden.
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Hefestämme mit
Mutationen in mehreren bekannten Genen besitzen Eigenschaften, die
für das
Shuffling nützlich
sind. Diese Eigenschaften schließen das Erhöhen der Rekombinationsfrequenz
und das Erhöhen der
Frequenz spontaner Mutationen innerhalb einer Zelle mit ein. Diese
Eigenschaften können
das Ergebnis einer Mutation einer kodierenden Sequenz oder einer geänderten
Expression (gewöhnlich Überexpression)
einer Wildtyp-kodierenden Sequenz sein. Die HO-Nuclease bewirkt
die Transposition von HMLa/α und
HMRa/α in
den MAT-Locus, wodurch der Paarungstyp geändert wird. Mutanten in dem
Gen, das für
dieses Enzym kodiert, ändern
ihren Paarungstyp nicht und können
dazu eingesetzt werden, eine Kreuzung zwischen Stämmen mit
definiertem Genotyp zu erzwingen, wie bspw. diejenigen, die eine
Bibliothek beinhalten, oder aber die einen erwünschten Phänotyp besitzen, und können ferner
dazu eingesetzt werden, die Inzucht von Ausgangsstämmen zu
verhindern. PMS1, MLH1, MSH2, MSH6 sind bei der Reparatur von Fehlanpassungen
beteiligt. Mutationen in diesem Genen besitzen sämtlich einen Mutator-Phänotyp (Chambers
et al., Mol. Cell. Biol. 16, 6110–6120 (1996)). Mutationen in
der TOP3-DNA-Topoisomerase weisen eine sechsfache Verstärkung der
interchromosomalen homologen Rekombination auf (Bailis et al., Molecular
and Cellular Biology 12, 4988–4993 (1992)).
Die RAD50-57-Gene verleihen eine Resistenz gegenüber einer Strahlung. Rad3 wirkt
bei der Entfernung von Pyrimidin-Dimeren. RAD52 wirkt bei der Genkonversion.
RAD50, MRE11, XRS2 wirken sowohl bei der homologen Rekombination
als auch bei der illegitimen Rekombination. HOP1, RED1 wirken bei
der frühen meiotischen
Rekombination (Mao-Draayer, Genetics 144, 71–86). Mutationen in entweder
HOP1 oder RED1 reduzieren doppelsträngige Brüche am HIS2-Rekombinations-Hotspot.
Stämme,
denen diese Gene fehlen, sind zur Aufrechterhaltung der Stabilität in hyper-rekombinogenen
Konstrukten nützlich,
wie bspw. in Tandem-Expressionsbibliotheken, welche auf YACs getragen
werden. Mutationen in HPR1 sind hyper-rekombinogen. HDF1 besitzt
eine DNA-Enden-bindende Aktivität
und ist bei der Reparatur von doppelsträngigen Brüchen und der V(D)J-Rekombination
beteiligt. Stämme,
die diese Mutation tragen, sind für die Transformation mit Zufallsgenomfragmenten
mit entweder einer Protoplastenfusion oder Elektroporation geeignet.
Kar-1 ist eine dominante Mutation, die eine Karyogamie verhindert.
Kar-1-Mutanten sind
für den
direkten Transfer einzelner Chromosomen von einem Geber- zu einem
Empfängerstamm
geeignet. Diese Technik ist beim Transfer von YACs zwischen Stämmen weit
verbreitet und ist außerdem
beim Transfer von entwickelten Genen/Chromosomen in andere Organismen
geeignet (Markie, YAC Protocols, (Humana Press, Totowa, NJ, 1996)).
HOT1 ist ein S. cerevisiae-Rekombinations-Hotspot
innerhalb der Promoter- und Enhancer-Region der rDNA-Repeat-Sequenzen. Dieser
Locus induziert die mitotische Rekombination an benachbarten Sequenzen – vermutlich
auf Grund seines hohen Transkriptionslevels. Gene und/oder Wege,
die unter der transkriptionellen Kontrolle dieser Region eingefügt werden,
sind einer erhöhten
mitotischen Rekombination ausgesetzt. Die Regionen, die die arg
4- und his 4-Gene umgeben, sind ebenfalls Rekombinations-Hotspots
und Gene, die in diese Regionen kloniert werden, werden mit erhöhter Wahrscheinlichkeit
einer Rekombination während
der Meiose unterzogen. Homologe Gene können in diese Regionen kloniert
und in vivo zusammengesetzt werden, und zwar durch rekursives Paaren
der rekombinanten Stämme.
CDC2 kodiert für
die Polymerase δ und
ist für
die mitotische Genkonversion notwendig. Eine Überexpression dieses Gens kann
in einem zusammengesetzten oder Mutatorstamm verwendet werden. Eine
temperaturempfindliche Mutation in CDC4 stoppt den Zellzyklus in
G1 bei restriktiver Temperatur und könnte dazu eingesetzt werden,
Protoplasten für
eine optimierte Fusion und nachfolgende Rekombination zu synchronisieren.
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Wie
bei filamentösen
Pilzen schließen
die allgemeinen Ziele des Shufflings in Hefe die Verbesserung der
Hefe als Wirtsorganismus für
eine genetische Manipulation und als Produktionsapparat für verschiedene Verbindungen
mit ein. Eine erwünschte
Eigenschaft in beiden Fällen
ist es, die Fähigkeit
der Hefe zu verbessern, ein heterologes Protein zu exprimieren und
zu sekretieren. Das folgende Beispiel beschreibt die Verwendung
des Shufflings, um Hefe dahingehend zu entwickeln, erhöhte Mengen
an RNase A zu exprimieren und sekretieren.
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RNase
A katalysiert die Spaltung der P-O5'-Bindung von
RNA, und zwar spezifisch nach Pyrimidin-Nucleotiden. Das Enzym ist
ein basisches, 124 Aminosäuren
langes Polypeptid, das acht halbe Cysteinreste besitzt, von denen
jedes für
die Katalyse benötigt
wird. YEpWL-RNase A ist ein Vektor, der die Expression und Sekretion
von RNase A aus der Hefe S. cerevisiae bewirkt, und eine Hefe, die
diesen Vektor trägt,
sekretiert 1–2
mg rekombinanter RNase A pro Liter Kulturmedium (del Cardayre et
al., Protein Engineering 8 (3): 26, 1–273 (1995)). Diese Gesamtausbeute
ist jedoch für
ein Protein, das in Hefe heterolog exprimiert wird, schlecht, und
kann durch Shuffling mindestens um das Zehn- bis Hundertfache verbessert
werden. Die Expression von RNase A kann durch mehrere Platten- und
Mikrotiterplattenassays leicht detektiert werden (del Cardayre & Raines, Biochemistry
33, 6031–6037
(1994)). Jede der beschriebenen Formate für das Gesamtgenom-Shuffling
kann dazu eingesetzt werden, einen Stamm von S. cerevisiae neu zusammenzusetzen,
der YEPWL-RNase
A trägt,
und die resultierenden Zellen können
hinsichtlich der erhöhten
Sekretion von RNase A in das Medium gescreent werden. Die neuen
Stämme
werden einem rekursiven Shuffling-Format unterzogen, bis hinreichend hohe
Level an RNase A-Sekretion
beobachtet werden. Die Verwendung von RNase A ist besonders nützlich,
da hierfür
nicht nur ein richtiges Falten und eine Disulfidbrückenbildung
notwendig ist, sondern auch eine richtige Glycosylierung. Auf diese
Weise können
zahlreiche Komponenten der Expression, des Faltens und der Sekretionssysteme
optimiert werden. Der resultierende Stamm ist auch hinsichtlich
einer verbesserten Sekretion anderer heterologer Proteine entwickelt.
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Ein
anderes Ziel des Shufflings von Hefe ist es, die Toleranz der Hefe
gegenüber
Ethanol zu erhöhen. Dies
ist sowohl für
die kommerzielle Produktion von Ethanol nützlich, als auch für die Produktion
von mehreren alkoholhaltigen Bieren und Weinen. Der neu zusammenzusetzende
Hefestamm erlangt das genetische Material durch Austausch oder Transformation
mit anderen Hefestämmen,
von welchen es bekannt sein mag, oder auch nicht, dass sie eine
erhöhte
Resistenz gegenüber
Ethanol besitzen. Der zu entwickelnde Stamm wird neu zusammengesetzt
und die neu zusammengesetzten Stämme
werden hinsichtlich der Fähigkeit
selektiert, den Aussatz gegenüber
Ethanol zu überleben.
In aufeinander folgenden Shuffling-Runden können erhöhte Ethanol-Konzentrationen eingesetzt werden. Die
gleichen Prinzipien können
dazu eingesetzt werden, Backhefe für eine erhöhte Osmotoleranz neu zusammenzusetzen.
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Eine
andere erwünschte
Eigenschaft für
das Shuffling von Hefe ist die Fähigkeit,
unter bestimmten Nährstoffbedingungen
zu wachsen. So ist es bspw. für
die Hefe nützlich,
auf billigen Kohlenstoffquellen, wie bspw. Methanol, Stärke, Melassen,
Cellulose, Cellobiose oder Xylose zu wachsen, je nach Abhängigkeit
von der Verfügbarkeit.
Die Prinzipien des Shufflings und der Selektion sind ähnlich denjenigen,
die bei den filamentösen
Pilzen erläutert
wurden.
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Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist die Fähigkeit,
Sekundärmetabolite
zu produzieren, die natürlicherweise
durch filamentöse
Pilze oder Bakterien produziert werden. Beispiele solcher Sekundärmetabolite sind
Cyclosporin A, Taxol und Cephalosporine. Die zu entwickelnde Hefe
wird einem genetischen Austausch unterzogen oder wird mit DNA aus
Organismen transformiert, die den Sekundärmetaboliten produzieren. So schließen bspw.
Pilze, die Taxol produzieren, Taxomyces andreanae und Pestalotopis
microspora mit ein (Stierle et al., Science 260, 214–216 (1993);
Strobel et al., Microbiol. 142, 435–440 (1996)). Ferner kann DNA auch
aus Bäumen
gewonnen werden, die natürlicherweise
Taxol produzieren, wie bspw. Taxus brevifolia. Die DNA, die für ein Enzym
in dem Taxolstoffwechselweg kodiert, nämlich die Taxadien-Synthase,
von der angenommen wird, dass sie den wesentlichen Schritt in der
Taxolbiosynthese katalysiert und daher die Rate bei der Gesamttaxolproduktion
limitiert, wurde kloniert (Wildung & Croteau, J. Biol. Chem. 271, 9201–4 (1996)).
Die DNA wird anschließend
neu zusammengesetzt und die neu zusammengesetzten Stämme werden
hinsichtlich der Produktion des Sekundärmetaboliten gescreent/ausgewählt. So
kann bspw. die Taxolproduktion unter Verwendung von Antikörpern gegen
Taxol durch Massenspektroskopie oder durch UV-Spektrometrie beobachtet werden.
Alternativ kann die Produktion von Zwischenprodukten bei der Taxolsynthese
oder von Enzymen im Taxolsyntheseweg beobachtet werden. Concetti & Ripani, Biol.
Chem. Hoppe Seyler 375, 419–23
(1994). Andere Beispiele für
Sekundärmetabolite
sind Polyole, Aminosäuren,
Polyketide, nicht-ribosomale Polypeptide, Ergosterol, Carotenoide,
Terpinoide, Sterole, Vitamin E und ähnliche.
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Eine
andere erwünschte
Eigenschaft ist es, die Flockenbildung der Hefe zu erhöhen, um
die Auftrennung in der Ethanolherstellung zu erleichtern. Die Hefe
kann durch jede der oben beschriebenen Verfahren neu zusammengesetzt
werden mit einer Selektion hinsichtlich einer zusammengesetzten
Hefe, welche die größten Klumpen
bildet.
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7. Beispielhaftes
Verfahren zur Hefe-Protoplastenbildung
-
Die
Protoplastenherstellung in Hefe wird von Morgan ausführlich erläutert, und
zwar in Protoplasts (Birkhauser Verlag, Basel, 1983). Frische Zellen
(~108) werden mit Puffer gewaschen, bspw.
mit 0,1 M Kaliumphosphat, anschließend im gleichen Puffer mit
einem reduzierenden Agens resuspendiert, wie bspw. 50 mM DTT, für 1 Stunde
bei 30°C
unter leichtem Schütteln
inkubiert, und anschließend
wieder mit dem Puffer gewaschen, um das reduzierende Agens zu entfernen.
Diese Zellen werden anschließend
in einem Puffer resuspendiert, der ein Zellwand-abbauendes Enzym
enthält,
wie bspw. Novozym 234 (1 mg/ml), und irgendeinem einer Vielzahl
von osmotischen Stabilisatoren, wie bspw. Sucrose, Sorbit, NaCl,
KCl, MgSO4, MgCl2 oder NH4Cl, bei irgendeiner von einer Vielzahl von
Konzentrationen. Diese Suspensionen werden anschließend bei 30°C unter leichtem
Schütteln
(~60 rpm) so lange inkubiert, bis die Protoplasten freigesetzt werden.
Um Protoplasten herzustellen, die eher produktive fusionierte Zellen
bilden, sind mehrere Strategien möglich.
-
Die
Protoplastenbildung kann erhöht
werden, wenn der Zellzyklus der Protoplasten dahingehend synchronisiert
wurde, dass er in der G1-Phase angehalten wird. Im Falle von S.
cerevisiae kann dies durch das Hinzufügen von Paarungsfaktoren, nämlich entweder
a oder α erreicht
werden (Curran & Carter,
J. Gen. Microbiol. 129, 1589–1591
(1983)). Diese Peptide fungieren als Inhibitoren der Adenylatcyclase,
welche durch Absenken des zellulären
Levels an cAMP den Zellzyklus in der G1-Phase arretieren. Darüber hinaus
konnte von Geschlechtsfaktoren gezeigt werden, dass diese für die Vorbereitung
einer sexuellen Fusion von a- und α-Zellen ein Schwächen der
Zellwand induzieren (Crandall & Brock,
Bacteriol. Rev. 32, 139–163
(1968); Osumi et al., Arch. Microbiol. 97, 27–38 (1974)). Daher können, zur
Vorbereitung von Protoplasten, die Zellen mit Paarungsfaktoren oder
anderen bekannten Inhibitoren der Adenylatcyclase behandelt werden,
wie bspw. Lefunomid oder dem Killertoxin aus K. lactis, um die Zellen
in der G1-Phase zu arretieren (Sugisaki et al., Nature 304, 464–466 (1983)).
Anschließend,
nach der Fusion der Protoplasten (Schritt 2), kann cAMP zu dem Regenerationsmedium
hinzugefügt
werden, um die S-Phase und die DNA-Synthese zu induzieren. Alternativ können Hefestämme mit
einer temperaturempfindlichen Mutation im CDC4-Gen eingesetzt werden,
so dass die Zellen synchronisiert und in der G1-Phase arretiert
werden können.
Nach der Fusion werden die Zellen in die permissive Temperatur zurücküberführt, so
dass die DNA-Synthese und das Wachstum fortschreiten können.
-
Sobald
geeignete Protoplasten hergestellt worden sind, ist es notwendig,
die Fusion durch physikalische oder chemische Mittel zu induzieren.
Eine gleiche Anzahl an Protoplasten jedes Zelltypus wird in Phosphatpuffer
(0,2 M, pH 5,8, 2 × 108 Zellen/ml) mit einem osmotischen Stabilisator,
wie bspw. 0,8 M NaCl und PEG 6000 (33% w/v) gemischt und anschließend 5 Minuten
lang bei 30°C
inkubiert, wobei die Fusion vollzogen wird. Ferner können Polyole
oder andere Verbindungen, die Wasser binden, eingesetzt werden.
Die fusionierten Zellen werden dann gewaschen und in dem osmotisch
stabilisierten Puffer ohne PEG resuspendiert und anschließend in
ein osmotisch stabilisiertes Regenerationsmedium überführt, auf/in
welchem die Zellen hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft selektiert
oder gescreent werden können.
-
8. Shuffling-Verfahren
unter Verwendung künstlicher
Chromosomen
-
Hefe-künstliche
Chromosomen (Yacs) stellen Hefevektoren dar, in welche sehr große DNA-Fragmente (bspw.
50–2000
kb) kloniert werden können
(siehe bspw. Monaco & Larin,
Trends. Biotech. 12 (7), 280–286 (1994);
Ramsey, Mol. Biotechnol. 1 (2), 181–201 (1994); Huxley Genet.
Eng. 16, 65–91
(1994); Jakobovits, Curr. Biol. 4 (8), 761–3 (1994); Lamb & Gearhart, Curr.
Opin. Genet. Dev. 5 (3), 342–8
(1995); Montoliu et al., Reprod. Fertil. Dev. 6, 577–84 (1994)).
Diese Vektoren besitzen Telomere (Tel), ein Centromer (Cen), eine
sich autonom replizierende Sequenz (ARS) und können Gene für eine positive (bspw. TRP1)
und negative (bspw. URA3) Selektion aufweisen. YACs werden als andere
Hefechromosomen aufrechterhalten, repliziert und abgetrennt, und
zwar sowohl durch die Meiose und Mitosebindung, wodurch ein Mittel
bereitgestellt wird, klonierte DNA einer echten meiotischen Rekombination
zu unterziehen.
-
Mit
YACs wird ein Träger
für das
Shuffling von Bibliotheken großer
DNA-Fragmente in vivo bereitgestellt. Die Substrate für das Shuffling
sind typischerweise große
Fragmente von 20 kb bis 2 Mb. Die Fragmente können Zufallsfragmente sein,
oder aber Fragmente, von denen bekannt ist, dass sie für eine erwünschte Eigenschaft
kodieren. So kann bspw. ein Fragment ein Operon an Genen mit einschließen, welche
bei der Produktion von Antibiotika beteiligt sind. Die Bibliotheken
können
ferner Gesamtgenome oder Chromosomen mit einschließen. Virale
Genome und einige bakterielle Genome können intakt in ein einzelnes
YAC kloniert werden. In einigen Bibliotheken werden die Fragmente
von einem einzelnen Organismus erhalten. Andere Bibliotheken schließen Fragmentvarianten
mit ein, und wiederum andere Bibliotheken werden von unterschiedlichen Individuen
oder Spezies erhalten. Fragmentvarianten können auch durch eine induzierte
Mutation hergestellt werden. Typischerweise werden die Gene innerhalb
von Fragmenten ausgehend von natürlich
assoziierten, regulatorischen Sequenzen innerhalb der Hefe exprimiert.
Nichtsdestotrotz können
alternativ einzelne Gene mit Hefe-regulatorischen Elementen verbunden
werden, um eine Expressionskassette zu bilden, und ein Concatemer
solcher Kassetten, von denen jede ein unterschiedliches Gen enthält, kann
in ein YAC eingefügt
werden.
-
In
manchen Fällen
werden die Fragmente in das Hefegenom eingebaut und dieses Shuffling
wird dazu eingesetzt, verbesserte Hefestämme zu entwickeln. In anderen
Fällen
verbleiben die Fragmente als Komponenten der YACs über den
gesamten Shuffling-Prozess hinweg, und nach Aneignung der erwünschten
Eigenschaft werden die YACs in eine erwünschte Empfängerzelle überführt.
-
9. Verfahren zur Entwicklung
von Hefestämmen
-
Fragmente
werden in einen YAC-Vektor kloniert und die entstehende YAC-Bibliothek
wird in kompetente Hefezellen transformiert. YAC-enthaltende Transformanten
werden durch die Selektion für
einen positiven Selektionsmarker identifiziert, der auf dem YAC
vorliegt. Man lässt
die Zellen regenerieren und poolt sie anschließend. Anschließend werden
die Zellen zur Sporulation induziert, indem die Zellen aus einem
reichen Medium in ein Medium mit begrenztem Stickstoff und Kohlenstoff überführt werden.
Im Verlauf der Sporulation findet in den Stämmen eine Meiose statt. Anschließend werden
die Sporen zur Paarung induziert, und zwar durch Rücküberführung in
ein reiches Medium. Wahlweise werden die Asci lysiert, um die Sporen
freizusetzen, so dass die Sporen mit anderen Sporen, die von anderen
Asci herrühren,
paaren können.
Die Paarung resultiert in eine Rekombination zwischen den YACs,
die unterschiedliche Inserts tragen, und zwischen YACs und natürlichen
Hefechromosomen. Letzteres kann durch Bestrahlen der Sporen mit
ultraviolettem Licht gefördert werden.
Durch die Rekombination können
neue Phänotypen
entstehen, entweder als Ergebnis der Gen-Expression von Fragmenten auf den YACs
oder als Ergebnis der Rekombination mit den Wirtsgenen, oder beidem.
-
Nach
Induktion der Rekombination zwischen den YACs und den natürlichen
Hefechromosomen werden die YACs oftmals durch eine Selektion gegen
einen negativen Selektionsmarker auf den YACs eliminiert. So können bspw.
YACs, die den Marker URA3 enthalten, durch eine Vermehrung 5-Fluororotsäure enthaltendes
Medium herausselektiert werden. Jedes exogene oder geänderte genetische
Material, das verbleibt, ist innerhalb der natürli chen Hefechromosomen enthalten.
Wahlweise können
weitere Rekombinationsrunden zwischen natürlichen Hefechromosomen nach
der Eliminierung von YACs durchgeführt werden. Wahlweise kann
die gleiche oder eine unterschiedliche Bibliothek von YACs in die
Zellen transformiert werden, und die oben beschriebenen Schritte
wiederholt werden. Durch das rekursive Wiederholen dieses Verfahrens
wird die Diversität
der Population vor dem Screening erhöht.
-
Nach
der Eliminierung von YACs werden die Hefen hinsichtlich einer erwünschten
Eigenschaft gescreent oder ausgewählt. Die Eigenschaft kann eine
neue Eigenschaft sein, die durch die übertragenen Fragmente verliehen
wird, wie bspw. die Produktion eines Antibiotikums. Die Eigenschaft
kann auch eine verbesserte Eigenschaft der Hefe sein, wie bspw.
die verbesserte Fähigkeit
zur Expression oder Sekretion eines exogenen Proteins, eine verbesserte
Rekombinogenizität,
eine verbesserte Stabilität
gegenüber
Temperaturen oder Lösungsmitteln,
oder eine andere Eigenschaft, die für kommerzielle oder Forschungsstämme der
Hefe benötigt
wird.
-
Die
Hefestämme,
die die Selektion/das Screening überleben,
werden anschließend
einer weiteren Rekombinationsrunde unterzogen. Die Rekombination
kann ausschließlich
zwischen den Chromosomen der Hefe stattfinden, welche die Selektion/das
Screening überlebt
haben. Alternativ kann eine Fragment-Bibliothek in die Hefezellen eingeführt werden
und wie zuvor mit endogenen Hefechromosomen rekombiniert werden. Diese
Fragment-Bibliothek kann gleich oder unterschiedlich zu der Bibliothek
sein, die in den vorherigen Transformationsrunden verwendet wurde.
So könnten
bspw. die YACs eine Bibliothek genomi scher DNA enthalten, welche
aus einem Pool der verbesserten Stämme isoliert wurde, die in
den vorherigen Schritten gewonnen wurden. Die YACs werden wie zuvor
eliminiert, gefolgt von zusätzlichen
Rekombinations- und/oder Transformationsrunden mit weiteren YAC-Bibliotheken.
Auf die Rekombination folgt eine weitere Selektions-/Screening-Runde,
wie zuvor beschrieben. Weitere Rekombinations-/Screening-Runden
können – je nach
Notwendigkeit – durchgeführt werden,
und zwar so lange, bis ein Hefestamm sich dahingehend entwickelt
hat, die erwünschte
Eigenschaft erlangt zu haben.
-
Ein
beispielhaftes Schema zur Entwicklung von Hefe durch Einführen einer
YAC-Bibliothek ist in 10 gezeigt. Der erste Teil
der Figur zeigt eine Hefe mit einem endogenen diploiden Genom und
eine YAC-Fragment-Bibliothek, welche Varianten einer Sequenz darstellt.
Die Bibliothek wird in die Zellen transformiert, wodurch 100 bis
1000 Kolonien pro μg
DNA erhalten werden. Die meisten transformierten Hefezellen enthalten
nun ein einzelnes YAC neben den endogenen Chromosomen. Die Meiose
wird durch Wachstum auf Medium, das hinsichtlich Stickstoff und
Kohlenstoff begrenzt ist, induziert. Im Verlaufe der Meiose rekombinieren
die YACs mit anderen Chromosomen in der gleichen Zelle. Die haploiden
Sporen, die aus der Meiose gebildet werden, paaren und regenerieren
diploide Formen. Die diploiden Formen enthalten nun rekombinante Chromosomen,
von denen Teile aus endogenen Chromosomen stammen und andere Teile
aus den YACs. Wahlweise können
die YACs jetzt aus den Zellen durch Selektion gegenüber einem
negativen Selektionsmarker, der auf den YACs vorliegt, herausselektiert
werden. Unabhängig
davon, ob die YACs herausselektiert werden, werden die Zellen anschließend gescreent
oder hinsichtlich einer erwünschten Eigenschaft
selektiert. Die Zellen, die die Selektion/das Screening überleben,
werden mit einer anderen YAC-Bibliothek transformiert, um einen
weiteren Shuffling-Zyklus zu beginnen.
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10. Verfahren
zur Entwicklung von YACs für
den Transfer in einen Empfängerstamm
-
Diese
Verfahren basieren teilweise auf der Tatsache, dass verschiedene
YACs in der gleichen Hefezelle enthalten sein können, und dass bekannt ist,
dass eine YAC-YAC-Rekombination auftreten kann (Green & Olson, Science
250, 94–98
(1990)). Die Rekombination zwischen den YACs sorgt für ein Format,
mit welchem Familien homologer Gene, die auf Fragmenten mit einer
Größe > 20 kb vorliegen, in
vivo neu zusammengesetzt werden können. Die Ausgangspopulation
der DNA-Fragmente besitzt eine Sequenzähnlichkeit untereinander, jedoch
unterscheidet sie sich als Ergebnis, bspw. einer induzierten, allelischen
oder Speziesdiversität.
Oftmals kodieren DNA-Fragmente bekanntermaßen oder vermutetermaßen für verschiedene
Gene, die in einem gemeinsamen Weg wirken.
-
Die
Fragmente werden in ein YAC kloniert und in Hefe transformiert,
typischerweise mit einer positiven Selektion für die Transformanten. Die Transformanten
werden zur Sporulation induziert, wodurch die Chromosomen einer
Meiose unterzogen werden. Anschließend werden die Zellen gepaart.
Die meisten der resultierenden diploiden Zellen tragen jetzt zwei
YACs, von denen jedes ein unterschiedliches Insert aufweist. Diese werden
wiederum zur Sporulation induziert und gepaart. Die resultierenden
Zellen enthalten YACs der rekombinierten Sequenz. Die Zellen können anschließend hinsichtlich
der erwünschten
Eigen schaft gescreent oder selektiert werden. Typischerweise tritt
eine solche Selektion in dem Hefestamm auf, der für das Shuffling
eingesetzt wird. Wenn die neu zusammengesetzten Fragmente jedoch
nicht in der Hefe exprimiert werden, können die YACs isoliert und
in einen geeigneten Zelltypus transferiert werden, in welchem sie
für das
Screening exprimiert werden. Beispiele solcher Eigenschaften schließen die
Synthese oder den Abbau einer erwünschten Verbindung mit ein,
die erhöhte
Sekretion eines erwünschten
Genprodukts oder einen anderen detektierbaren Phänotyp.
-
Vorzugsweise
wird die YAC-Bibliothek in haploide a- und haploide α-Zellen transformiert. Diese
Zellen werden anschließend
zur Paarung miteinander induziert, d.h. sie werden gepoolt und durch
Wachstum auf reichem Medium zur Paarung induziert. Die diploiden
Zellen, von denen jede zwei YACs trägt, werden anschließend in
ein Sporulationsmedium übertragen.
Während
der Sporulation tritt in den Zellen eine Meiose auf, und homologe
Chromosomen rekombinieren. In diesem Fall werden die auf den YACs
vorliegenden Gene rekombinieren, wodurch deren Sequenzen diversifizieren.
Die resultierenden haploiden Acosporen werden anschließend durch
einen enzymatischen Abbau der Asci-Wände oder durch andere geeignete
Mittel von den Asci freigesetzt und die gepoolten, freigesetzten,
haploiden Ascosporen werden durch ein Transfer in reiches Medium zur
Paarung induziert. Dieses Verfahren wird mehrere Zyklen wiederholt,
um die Diversität
der DNA, die in die YACs kloniert wurde, zu erhöhen. Die resultierende Hefezellenpopulation,
die vorzugsweise im haploiden Stadium ist, wird anschließend hinsichtlich
der verbesserten Eigenschaften gescreent, oder aber die diversifizierte DNA
wird in eine andere Wirtszelle oder in einen anderen Wirtsorganismus
für das
Screenen überführt.
-
Die
Zellen, die die Selektion/das Screening überleben, werden weiteren,
aufeinander folgenden Zyklen an Poolen, Sporulation, Paarung und
Selektion/Screening unterzogen, bis der erwünschte Phänotyp beobachtet wird. Eine
Rekombination kann durch Übertragen
der Zellen aus reichem Medium in Medium leicht induziert werden,
welches in Kohlenstoff und Stickstoff begrenzt ist, um die Sporulation
zu induzieren, und anschließend
durch Rücküberführen der
Sporen in reiches Medium, um die Paarung zu induzieren. Die Asci
können
zur Stimulierung der Paarung der Sporen, die aus unterschiedlichen
Asci herrühren,
lysiert werden.
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Nachdem
die YACs dahingehend entwickelt wurden, eine erwünschte Eigenschaft zu kodieren,
können
sie in andere Zelltypen übertragen
werden. Der Transfer kann durch Protoplastenfusion oder durch Retransformation
mit isolierter DNA vollzogen werden. So wird bspw. der Transfer
von YACs aus Hefezellen in Säugetierzellen
diskutiert von Monaco & Larin,
Trends in Biotechnology 12, 280–286
(1994); Montoliu et al., Reprod. Fertil. Dev. 6, 577–84 (1994);
Lamb et al., Curr. Opin. Genet. Dev. 5, 342–8 (1995)).
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Ein
beispielhaftes Schema für
das Shuffling einer YAC-Fragment-Bibliothek in Hefe ist in 11 gezeigt. Eine Bibliothek an YAC-Fragmenten,
die genetische Varianten darstellt, wird in Hefe transformiert,
welche diploide endogene Chromosomen aufweist. Die transformierte
Hefe wird weiterhin diploide endogene Chromosomen besitzen, plus
einem einzelnen YAC. Die Hefe wird zur Meiose und zur Sporulation
induziert. Die Sporen enthalten haploide Genome und werden hinsichtlich
denjenigen selektiert, die ein YAC enthalten, und zwar unter Verwendung
des YAC-Selektionsmarkers. Die Sporen werden zur Paarung induziert
wodurch diploide Zellen hergestellt werden. Die diploiden Zellen
enthalten nun zwei YACs, welche unterschiedliche Inserts tragen,
ebenso wie diploide endogene Chromosomen. Die Zellen werden wiederum
zur Meiose induziert, und sporulieren. Während der Meiose tritt zwischen
den YAC-Inserts eine Rekombination auf und die rekombinanten YACs
werden in die Ascozyten abgetrennt. Einige Ascozyten enthalten daher
haploide endogene Chromosomen plus einem YAC-Chromosom mit einem
rekombinanten Insert. Die Ascozyten reifen zu Sporen, welche wiederum
paaren können,
wodurch diploide Zellen gebildet werden. Einige diploide Zellen
besitzen nun ein diploides Komplement der endogenen Chromosomen
plus zwei rekombinante YACs. Diese Zellen können anschließend weiteren
Meiose-, Sporulations- und Paarungszyklen unterzogen werden. In
jedem Zyklus tritt eine weitere Rekombination zwischen den YAC-Inserts
auf, und weitere rekombinante Formen der Inserts werden hergestellt.
Nach einem oder nach mehreren Rekombinationszyklen können die
Zellen hinsichtlich der Aneignung der erwünschten Eigenschaft getestet
werden. Weitere Rekombinationszyklen, gefolgt von einer Selektion,
können
anschließend
auf ähnliche
Weise durchgeführt
werden.
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11. In vivo-Shuffling
von Genen durch die rekursive Paarung von Hefezellen, die homologe
Gene in identischen Loci aufweisen
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Ein
Ziel des DNA-Shufflings ist es, die kombinatorischen Fähigkeiten
der sexuellen Rekombination nachzuahmen und zu erweitern. Das in
vitro-DNA-Shuffling führt
hierin zu einem Erfolg. Nichtsdestotrotz können durch Abändern des
Rekombinationsmechanismus und durch Abändern der Bedingungen, unter
welchen die Rekombination auftritt, natürliche in vitro-Rekombinationsverfahren
die intrinsische Information in einer DNA-Sequenz, welche es „entwickelbar" macht, gefährden.
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Mit
dem in vivo-Shuffling durch Anwenden der natürlichen Crossing-over-Mechanismen,
die während der
Meiose auftreten, kann eine inhärente
natürliche
Sequenzinformation erlangt werden, und es wird ein Mittel bereitgestellt,
neu zusammengesetzte Bibliotheken mit höherer Qualität zu schaffen.
Hierin ist ein Verfahren für
das in vivo-Shuffling von DNA beschrieben, bei welchem die natürlichen
Mechanismen der meiotischen Rekombination verwendet werden, und
mit welchem ein alternatives Verfahren für das DNA-Shuffling bereitgestellt
wird.
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Die
zugrunde liegende Strategie ist es, die neu zusammenzusetzenden
Gene in identische Loci innerhalb des haploiden Hefegenoms zu klonieren.
Die haploiden Zellen werden anschließend rekursiv zur Paarung und
zur Sporulierung induziert. Durch diesen Prozess werden die klonierten
Gene einer rekursiven Rekombination während den rekursiven Meiosezyklen
unterzogen. Die entstehenden neu zusammengesetzten Gene werden an schließend in
situ gescreent oder isoliert und unter unterschiedlichen Bedingungen
gescreent.
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Wenn
bspw. eine Familie von fünf
Lipase-Genen neu zusammengesetzt werden soll, wird mit dem nachfolgend
Beschriebenen ein Mittel hierfür
in vivo bereitgestellt.
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Der
offene Leserahmen jeder Lipase wird durch PCR derart amplifiziert,
dass jeder ORF von identischen 3'-
und 5'-Sequenzen
flankiert ist. Die 5'-flankierende
Sequenz ist mit einer Region innerhalb der 5'-kodierenden Sequenz des S. cerevisiae
ura-3-Gens identisch, und die 3'-flankierende
Sequenz ist mit einer Region innerhalb der 3'-kodierenden Sequenz des ura-3-Gens
identisch. Die flankierenden Sequenzen werden derart ausgewählt, dass
die homologe Rekombination des PCR-Produkts mit dem ura-3-Gen in
den Einbau des Lipase-Gens und die Unterbrechung des ura-3-ORF resultiert.
Sowohl S. cerevisiae a- und α-haploide
Zellen werden anschließend
mit jedem der durch die PCR-amplifizierten Lipase-ORFs transformiert,
und Zellen, die das Lipase-Gen in den ura-3-Locus eingebaut haben,
werden durch Wachstum auf 5-Fluorotsäure selektiert (5FOA ist für Zellen,
die funktionelles URA3 exprimieren, tödlich). Das Ergebnis sind zehn
Zelltypen, zwei unterschiedliche Paarungstypen, von denen jeder
eines der fünf
Lipase-Gene im unterbrochenen ura-3-Locus trägt. Diese Zellen werden anschließend vereinigt
und unter Bedingungen wachsen gelassen, unter welchen zwischen den
a- und α-Zellen
eine Paarung gefördert
wird, wie bspw. in einem reichen Medium.
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Die
Paarung resultiert in eine kombinatorische Mischung aus diploiden
Zellen mit allen 32 möglichen Kombinatio nen
der Lipase-Gene in den zwei ura-3-Loci. Die Zellen werden anschließend zur
Sporulierung induziert, und zwar durch Wachstum unter Kohlenstoff-
und Stickstoff-begrenzten Bedingungen. Während der Sporulation tritt
in den diploiden Zellen eine Meiose auf, wodurch vier (zwei a und
zwei α)
haploide Ascosporen gebildet werden, die in einem Ascus enthalten
sind. Während
der Meiose II des Sporulationsprozesses richten sich Schwesterchromatide
aneinander aus und überkreuzen
sich. Die Lipase-Gene, die in die uar-3-Loci kloniert wurden, richten
sich ebenfalls aus und rekombinieren. Daher werden die resultierenden
haploiden Ascussporen eine Bibliothek an Zellen darstellen, von
denen jede ein unterschiedliches, mögliches, chimäres Lipase-Gen
trägt,
von denen jedes ein einzigartiges Ergebnis der meiotischen Rekombination
der zwei Lipase-Gene in der ursprünglichen diploiden Zelle darstellt.
Die Wände
der Asci werden durch Behandlung mit Zymolase behandelt, um die
individuellen Ascussporen freizusetzen und eine Mischung dieser
zu ermöglichen.
Die Mischung wird anschließend
unter Bedingungen wachsen gelassen, die die Paarung der a- und α-haploiden
Zellen fördern.
Es ist wichtig, die einzelnen Ascussporen freizusetzen, da ansonsten
die Paarung zwischen den Ascussporen innerhalb eines Ascus auftritt.
Das Mischen der haploiden Zellen ermöglicht die Rekombination zwischen
mehr als zwei Lipase-Genen,
wodurch eine „pool-weise" Rekombination ermöglicht wird.
Durch die Paarung werden neue Kombinationen chimärer Gene ermöglicht,
die anschließend
nach der Sporulation einer Rekombination unterzogen werden können. Die
Zellen werden rekursiven Zyklen einer Sporulation, Ascussporenmischung
und Paarung unterzogen, bis durch die rekursive paarweise Rekombination
der fünf
Lipase-Gene eine hinreichende Diversität hergestellt wurde. Die einzelnen
chimären
Lipase-Gene können
entweder in den haploiden Hefezellen direkt gescreent werden, oder
aber in einen geeigneten Expressionswirt transferiert werden.
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Das
Verfahren ist oben für
Lipasen und für
Hefe beschrieben worden, jedoch kann jeder sexuelle Organismus,
in welchen Gene eingeschleust werden können, eingesetzt werden, und
selbstverständlich
könnte irgendein
anderes Gen anstelle der Lipasen eingesetzt werden. Dieses Verfahren
ist mit dem Verfahren des Gesamtgenom-Shufflings durch rekursives
paarweises Paaren analog. Jedoch ist die Diversität im Falle
des Gesamtgenoms über
das Wirtsgenom hinweg verteilt, und nicht auf spezifische Loci lokalisiert.
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12. Verwendung
von YACs zur Klonierung unverbundener Gene
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Das
Shuffling der YACs kann insbesondere dahingehend geändert werden,
um unverbundene, jedoch funktionell verwandte Gene von einer Spezies
auf die andere zu transferieren, insbesondere dort, wo solche Gene
nicht identifiziert wurden. Dies ist der Fall für mehrere, kommerziell wichtige,
Naturprodukte, wie bspw. Taxol. Der Transfer der Gene in den Stoffwechselweg
eines unterschiedlichen Organismus ist oftmals erwünscht, da
die Organismen, die solche Verbindungen natürlich produzieren, für eine Massenkultivierung
nicht geeignet sind.
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Cluster
solcher Gene können
dadurch isoliert werden, dass eine Gesamtgenom-DNA-Bibliothek aus einem
Organismus, der eine nützliche
Verbindung produziert, in eine YAC-Bibliothek kloniert wird. Die
YAC-Bibliothek wird anschließend
in Hefe transformiert. Die Hefe wird zur Sporulierung gebracht und derart
gepaart, dass zwischen den YACs und/oder zwischen den YACs und dem
natürlichen
Hefechromosom eine Rekombination auftritt. Anschließend wird
die Selektion/das Screening hinsichtlich der Expression der erwünschten Sammlung
an Genen durchgeführt.
Wenn die Gene für
einen Biosyntheseweg kodieren, kann die Expression durch das Auftreten
des Produktes des Weges detektiert werden. Die Produktion einzelner
Enzyme in dem Weg, oder von Zwischenverbindungen des letztendlichen
Expressionsproduktes oder die Fähigkeit
der Zellen, solche Zwischenprodukte zu verstoffwechseln, deutet
auf eine teilweise Erlangung des Syntheseweges hin. Die ursprüngliche
Bibliothek oder eine unterschiedliche Bibliothek kann in Zellen
eingeführt
werden, die die Selektion/das Screening überleben und es können weitere
Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden durchgeführt werden,
bis das Endprodukt des erwünschten
Stoffwechselwegs produziert wird.
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13. YAC-YAC-Shuffling
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Wenn
ein Phänotyp
von Interesse in einen einzigen Strang an genomischer DNA mit weniger
als zwei Megabasen in Länge
isoliert werden kann, kann er in ein YAC-kloniert und in S. cerevisiae
repliziert werden. Die Klonierung ähnlicher DNA-Stränge aus
verwandten Wirten in ein identisches YAC resultiert in einer Hefezellpopulation,
von denen jede ein YAC mit einem homologen Insert trägt, was
einen erwünschten
Phänotyp bewirkt.
Das rekursive Züchten
dieser Hefezellen ermöglicht
es, dass die homologen Regionen dieser YACs während der Meiose rekombinieren,
wodurch Gene, Wege und Cluster während
jedes Meiosezyklus rekombinieren können. Nach mehreren Paarungs-
und Abtrennungszyklen sind die YAC-Inserts hinreichend gut neu zusammenge setzt.
Diese neue, sehr diverse Hefebibliothek könnte dann hinsichtlich phänotypischen
Verbesserungen gescreent werden, die von dem Shuffling der YAC-Inserts
herrühren.
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14. YAC-Chromosomen-Shuffling
-
Eine „mitotische" Rekombination tritt
während
der Zellteilung auf und ist ein Ergebnis der Rekombination von Genen
während
der Replikation. Diese Art an Rekombination ist nicht auf eine Rekombination
zwischen Schwesterchromatiden beschränkt und kann durch Agenzien
verstärkt
werden, die die Rekombinationsmaschinerie induzieren, wie bspw.
Strangbruch-Chemikalien
und ultraviolette Strahlung. Da es oftmals schwierig ist, über eine
Spezies-Barriere hinweg direkt zu paaren, ist es möglich, die
Rekombination homologer Gene zu induzieren, die von unterschiedlichen
Spezies herrühren,
und zwar durch Bereitstellen der Ziel-Gene für einen erwünschten Wirtsorganismus in
Form einer YAC-Bibliothek. Die Gene, die in dieser Bibliothek vorliegen, werden
anschließend
eingeführt,
um mit homologen Genen auf dem Wirts-Chromosom durch verstärkte mitotische
Rekombination zu rekombinieren. Dieser Prozess wird rekursiv durchgeführt, um
eine Bibliothek diverser Organismen zu generieren, und anschließend hinsichtlich
denjenigen Organismen gescreent, die die erwünschten phänotypischen Verbesserungen
aufweisen. Die verbesserte Subpopulation wird anschließend rekursiv,
wie oben beschrieben, gepaart, wodurch neue Stämme identifiziert werden, bei
welchen sich verschiedene nützliche
genetische Änderungen
akkumuliert haben.
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15. Akkumulation verschiedener,
auf YACs vorliegenden, nützlicher
Genen
-
Die
Akkumulation verschiedener unverbundener Gene, die für die Erlangung
oder die Verbesserung eines vorgegebenen Phänotyps benötigt werden, kann durch das
Shuffling von YAC-Bibliotheken
erreicht werden. Genomische DNA aus Organismen mit den erwünschten
Phänotypen,
wie bspw. eine Ethanoltoleranz, Wärmetoleranz und die Fähigkeit,
Pentosezucker zu fermentieren, werden gepoolt, fragmentiert und
in mehrere unterschiedliche YAC-Vektoren kloniert, von denen jeder
einen unterschiedlichen Selektionsmarker trägt (his, ura, ade, etc.). S.
cerevisiae werden mit diesen Bibliotheken transformiert und hinsichtlich
deren Vorliegen selektiert (unter Verwendung selektiver Medien,
d.h. Uracil-Dropout-Medien für
die YAC, die den Ura3-Selektionsmarker
enthalten) und anschließend
danach gescreent, ob sie einen erwünschten Phänotyp erhalten oder diesen
verbessert haben. Die überlebenden
Zellen werden gepoolt, rekursiv gepaart und hinsichtlich der Akkumulation
verschiedener YACs selektiert (durch eine Vermehrung in einem Medium
mit verschiedenen Nährstoff-„Dropouts"). Zellen, die verschiedene
YACs mit nützlichen
genomischen Inserts erlangt haben, werden durch ein weiteres Screening
identifiziert. Optimierte Stämme
können
direkt verwendet werden, jedoch kann – auf Grund der Last, die ein
YAC für
eine Zelle sein kann – das
relevante YAC-Insert minimiert werden, subkloniert und in das Wirts-Chromosom
rekombiniert werden, um einen stabileren Produktionsstamm zu bilden.
-
16. Auswahl
des Wirts-SSF-Organismus
-
Eine
beispielhafte Verwendung für
die vorliegende Erfindung ist es, eine verbesserte Hefe für die Produktion
von Ethanol aus Lignocellulosebiomasse zu bilden. Genauer gesagt
ist ein Hefestamm mit verbesserter Ethanoltoleranz und Thermostabilität/Thermotoleranz
erwünscht.
Es werden zunächst
Eltern-Hefestämme identifiziert,
von denen bekannt ist, dass sie sich in einem „Simultaneous Saccharification
and Fermentation" (SSF)-Verfahren
gut verhalten. Diese Stämme
werden mit anderen Stämmen
kombiniert, von denen bekannt ist, dass sie eine Ethanoltoleranz
und/oder Thermostabilität
besitzen.
-
S.
cerevisiae ist für
die Entwicklung optimierter SSF-Verfahren äußerst zugänglich. Der Stamm besitzt inhärent mehrere
Merkmale für
diese Verwendung, einschließlich
der Fähigkeit,
eine Vielzahl von Zuckern, wie bspw. Sucrose, Glucose, Galactose,
Maltose und Maltotriose zu importieren und zu fermentieren. Ferner
hat die Hefe die Fähigkeit
zur Flockenbildung, wodurch die Hefebiomasse am Ende eines Fermentierungszyklus wiedergewonnen
werden kann, was deren Wiederverwendung in nachfolgenden Bioprozessen
ermöglicht. Dies
stellt eine wichtige Eigenschaft darin dar, dass es die Verwendung
von Nährstoffen
im Wachstumsmedium optimiert. Ferner ist S. cerevisiae auch für Labor-Manipulationen äußerst zugänglich,
ist genetisch hinreichend charakterisiert worden und besitzt einen
sexuellen Reproduktionszyklus. S. cerevisiae kann entweder unter aeroben
oder anaeroben Bedingungen gezüchtet
werden, im Gegensatz zu einigen anderen möglichen SSF-Organismen, die
strikte Anaerobia darstellen (bspw. Clostridium spp.), wodurch diese
sehr schwierig im Labor handzuhaben sind. S. cerevisiae wird ferner
auch als „im
Allgemeinen sicher" betrachtet
(„GRAS"), und ist auf Grund
seiner weit verbreiteten Verwendung zur Herstellung wichtiger Nahrungsmittel
für die
allgemeine Öffentlichkeit
(bspw. Bier, Wein, Brot, etc.) im Allgemeinen familiär und hinreichend
bekannt. S. cerevisiae wird gewöhnlich
in Fermentationsprozessen verwendet und die Bekanntheit seiner Handhabung
durch Fermentationsexperten erleichtert die Einführung neuer verbesserter Hefestämme in die
industrielle Umgebung.
-
S.
cerevisiae-Stämme,
die zuvor als besonders gute SSF-Organismen identifiziert wurden,
wie bspw. S. cerevisiae D5A (ATCC 200062)
(South CR und Lynd LR (1994) Appl. Biochem. Biotechnol. 45/46: 467–481; Ranatunga
TD et al. (1997), Biotechnol. Lett. 19: 1125–1127) können als Ausgangsmaterialien
verwendet werden. Darüber
hinaus werden andere industriell verwendete S. cerevisiae-Stämme wahlweise
als Wirtsstämme verwendet,
insbesondere diejenigen, die wünschenswerte
Fermentations-Merkmale zeigen, wie bspw. S. cerevisiae Y567 (ATCC
24858) (Sitton EC et al. (1979) Process Biochem. 14 (9): 7–10; Sitton
OC et al. (1981) Adv. Biotechnol. 2: 231–237; McMurrough I et al. (1971)
Folia Microbiol. 16: 346–349)
und S. cerevisiae ACA174 (ATCC 60868) (Benitez T et al. (1983) Appl.
Environ. Microbiol. 45: 1429–1436;
Chem. Eng. J. 50: B17–B22,
1992), von denen gezeigt werden konnte, dass sie wünschenswerte
Merkmale hinsichtlich einer Fermentierung im großen Maßstab besitzen.
-
17. Auswahl
der Ethanol-toleranten Stämme
-
Viele
Stämme
von S. cerevisiae konnten aus Umgebungen mit hohem Ethanolgehalt
isoliert werden, und haben in der Ethanol-reichen Umgebung durch
adaptive Evolution überlebt.
So haben bspw. Stämme
aus der Alterung von Sherry-Wein („Flor"-Stämme) hochfunktionelle
Mitochondrien entwickelt, um deren Überleben in einer Umgebung
mit hohem Ethanolgehalt zu ermöglichen.
Es konnte gezeigt werden, dass der Transfer dieser Wein-Hefe-Mitochondrien
auf andere Stämme
die Resistenz des Empfängers
gegenüber
hohen Ethanolkonzentrationen erhöht,
ebenso wie die Thermotoleranz (Jimenez, J. und Benitez, T. (1988),
Curr. Genet. 13: 461–469).
In der ATCC gibt es einige hinterlegte Florstämme, bspw. S. cerevisiae MY91
(ATCC 201301), MY138 (ATCC 201302), C5 (ATCC 201298), ET7 (ATCC
201299), LA6 (ATCC 201300), OSB21 (ATCC 201303), F23 (S. globosus
ATCC 90920). Ferner wurden auch mehrere Florstämme von S. uvarum und Torulaspora
pretoriensis hinterlegt. Andere Ethanol-tolerante Weinstämme schließen S. cerevisiae
ACA 174 (ATCC 60868), 15% Ethanol, und S. cerevisiae A54 (ATCC 90921)
mit ein, isoliert aus Wein, der 18% (v/v) Ethanol enthält, und
ferner NRCC 202036 (ATCC 46534), ebenfalls eine Weinhefe. Andere
S. cerevisiae-Ethanologene,
die darüber
hinaus eine verstärkte
Ethanoltoleranz zeigen, schließen
ATCC 24858, ATCC 24858, G 3706 (ATCC 42594), NRRL Y-265 (ATCC 60593)
und ATCC 24845-ATCC 24860 mit ein. Ein Stamm von S. pastorianus
(S. carlsbergensis ATCC 2345) besitzt eine hohe Ethanoltoleranz
(13% v/v). S. cerevisiae Sa28 (ATCC 26603), aus einer jamaikanischen
Rohzuckersaftprobe produziert hohe Level an Alkohol aus Melassen, ist
Zuckertolerant und produziert Alkohol aus Holzsäure-Hydrolyzat.
-
Mehrere
der aufgeführten
Stämme
können – ebenso
wie zusätzliche
Stämme – als Ausgangsmaterial für die Züchtung der
Ethanoltoleranz verwendet werden.
-
18. Auswahl von Temperatur-toleranten
Stämmen
-
Ein
paar wenige Temperatur-tolerante Stämme sind beschrieben worden,
einschließlich
des stark Flocken bildenden Stammes S. pastorianus SA23 (S. carlsbergensis
ATCC 26602), der bei erhöhten
Temperaturen Ethanol produziert, und S. cerevisiae Kyokai 7 (S.
sake, ATCC 26422), eine Sake-Hefe, die gegenüber einem kurzen Erhitzen und
oxidativem Stress tolerant ist. Ballesteros et al. ((1991) Appl.
Biochem. Biotechnol. 28/28: 307–315)
untersuchten 27 Hefestämme
hinsichtlich deren Fähigkeit
zu wachsen und Glukose in einem Temperaturbereich von 32 bis 45°C zu fermentieren,
einschließlich
Saccharomyces, Kluyveromyces und Candida spp. Von diesen erwies
sich als der thermotoleranteste Klon Kluyveromyces marxianus LG
und Kluyveromyces fragilis 2671 (Ballesteros et al. (1993) Appl.
Biochem. Biotechnol. 39/40: 201–211).
S. cerevisiae-pretoriensis FDHI erwies sich als etwas thermotolerant,
war jedoch nur wenig Ethanoltolerant. Die rekursive Rekombination
dieses Stammes mit anderen, die eine Ethanoltoleranz aufweisen,
kann dazu eingesetzt werden, dass die Nachkommenschaft die thermotoleranten
Merkmale des Stammes erlangt, wobei die Nachkommenschaft auch eine
Ethanoltoleranz zeigt.
-
Candida
acidothermophilum (Issatchenkia orientalis, ATCC 20381) stellt einen
guten SSF-Stamm dar, der ferner eine verbesserte Leistung in der
Ethanolproduktion aus lignozellulosischer Biomasse bei höheren SSF-Temperaturen
im Vergleich zu S. cerevisiae D5A zeigt
(Kadam, KL, Schmidt, SL (1997), Appl. Microbiol. Biotechnol. 48:
709–713).
Dieser Stamm kann auch einen genetischen Beitrag für einen
verbesserten SSF-Stamm leisten.
-
19. Shuffling
der Stämme
-
In
den Fällen,
in denen die Stämme
nahe verwandt miteinander sind, kann eine rekursive Paarungsstrategie
verfolgt werden. So werden bspw. eine Population von haploiden S.
cerevisiae (a und Alpha) mutagenisiert und hinsichtlich einer verbesserten
Ethanol- oder Thermotoleranz gescreent. Die verbesserten haploiden
Subpopulationen werden miteinander vermischt und als ein Pool gepaart,
und ferner zur Sporulierung induziert. Die resultierenden haploiden
Sporen werden durch Abbau der Asci-Wände freigesetzt und vermengt. Die
freigesetzten Sporen werden anschließend zur Paarung und zur rekursiven
Sporulation induziert. Dieser Prozess wird hinreichend oft wiederholt,
um alle möglichen
Mutantenkombinationen zu generieren. Die Population, die in ihrem
Gesamtgenom neu zusammengesetzt ist (haploid), wird anschließend für eine weitere
Ethanol- oder Hitzetoleranz gescreent.
-
Wenn
die Stämme
für eine
rekursive Paarung nicht hinreichend genug verwandt sind, können Formate,
basierend auf der Protoplastenfusion, eingesetzt werden. Eine rekursive
und pool-weise Protoplastenfusion kann
durchgeführt
werden, um chimäre
Populationen diverser Elternstämme
zu generieren. Der resultierende Pool der Nachkommenschaft wird
dahingehend selektiert und gescreent, um verbesserte Ethanol- und
hitzeresistente Stämme
zu identifizieren.
-
Alternativ
kann ein Shuffling-Format, basierend auf einem YAC-Gesamtgenom-Shuffling,
verwendet werden. Bei diesem Format werden YACs dazu eingesetzt,
große
chromosomale Fragmente zwischen Stämmen hin und her zu schleusen.
Wie bereits wei ter oben beschrieben, tritt eine Rekombination zwischen
YACs oder zwischen YACs und den Wirts-Chromosomen auf. Die genomische
DNA aus den Organismen mit den erwünschten Phänotypen wird gepoolt, fragmentiert
und in mehrere unterschiedliche YAC-Vektoren kloniert, von denen jeder einen
unterschiedlichen Selektionsmarker trägt (his, ura, ade, etc.). S.
cerevisiae wird mit diesen Bibliotheken transformiert und hinsichtlich
deren Vorliegen selektiert (unter Verwendung selektiver Medien, d.h.
Uracil-Dropout-Medien hinsichtlich der YAC, die den Ura3-Selektionsmarker
enthalten) und anschließend dahingehend
gescreent, ob sie einen erwünschten
Phänotyp
erlangt oder diesen verbessert haben. Die überlebenden Zellen werden gepoolt,
rekursiv gepaart (siehe oben) und anschließend für die Ansammlung verschiedener
YACs ausgewählt
(durch Vermehrung in einem Medium mit verschiedenen Nährstoff-Dropouts). Zellen,
die verschiedene YACs mit nützlichen
genomischen Inserts erlangen, werden durch ein weiteres Screening
identifiziert (siehe nachstehend).
-
20. Auswahl
der verbesserten Stämme
-
Nach
der Produktion großer
Bibliotheken an neuen Stämmen
durch Mutagenese und Rekombination ist eine erste Aufgabe nun, diese
Stämme,
die Verbesserungen in den erwünschten
Phänotypen
besitzen, zu isolieren. Die Identifizierung der Organismus-Bibliotheken
wird dort erleichtert, wo die erwünschten Schlüsselmerkmale
auswählbare
Phänotypen
sind. So hat bspw. Ethanol unterschiedliche Auswirkungen auf die
Wachstumsrate einer Hefepopulation, auf die Lebensfähigkeit
und auf die Fermentationsrate. Mit der Ethanolkonzentration steigt
die Inhibierung des Zellwachstums und der Lebensfähigkeit
an, jedoch wird die hohe Fermentationsfähigkeit nur bei höheren Ethanol konzentration
inhibiert. Aus diesen Gründen
ist die Auswahl von wachsenden Zellen in Ethanol ein durchführbarer
Ansatz, um Ethanol-t,olerante Stämme
zu isolieren. Anschließend können die
ausgewählten
Stämme
hinsichtlich deren fermentativer Fähigkeit, Ethanol zu produzieren,
analysiert werden. Vorausgesetzt, dass Wachstums- und Medium-Bedingungen
für alle
Stämme
die gleichen sind (Elternstämme
und Nachkommenschaft), muss eine Hierarchie der Ethanoltoleranz
konstruiert werden.
-
Einfache
Selektionsschemata für
die Identifizierung von Hitze-toleranten und Ethanol-toleranten Stämmen sind
verfügbar
und basieren in diesen Fällen
auf denjenigen, die zuvor entwickelt wurden, um möglicherweise
nützliche
SSF-Stämme
zu identifizieren. Die Selektion der Ethanoltoleranz wird durch
Aussetzen der Population gegenüber
Ethanol durchgeführt,
gefolgt von einem Ausplattieren der Population und einem Beobachten
des Wachstums. Die Kolonien, die dazu in der Lage sind, nach dem
Aussetzen gegenüber
Ethanol zu wachsen, können
einer höheren
Ethanolkonzentration ausgesetzt werden und der Zyklus wiederholt werden,
bis der toleranteste Stamm selektiert wird. Um zwischen Stämmen zu
unterscheiden, die eine vererbbare Ethanoltoleranz besitzen, und
Stämmen,
die sich dies vorübergehend
angeeignet haben, können
diese Zyklen mit Wachstumszyklen ohne Selektion (d.h. ohne Ethanol)
unterbrochen werden.
-
Alternativ
kann die vermengte Population direkt mit ansteigenden Ethanolkonzentrationen
gezüchtet werden
und der toleranteste Stamm wird angereichert (Aguilera und Benitez,
1986, Arch Microbiol 4: 337–444). Diese
Anreicherung könnte
bspw. in einem Chemostaten oder in einem Turbidostaten durchgeführt werden. Ähnliche
Auswahlverfahren können
für eine
Hitze toleranz entwickelt werden, bei welchem die Stämme durch deren
Fähigkeit
identifiziert werden, nach einer Hitzebehandlung zu wachsen, oder
aber direkt für
ein Wachstum bei erhöhten
Temperaturen (Ballesteros et al., 1991, Applied Biochem and Biotech,
28: 307–315).
Die durch diese Selektionen identifizierten besten Stämme werden
in nachfolgenden Screens hinsichtlich Ethanol, Hitzetoleranz oder
anderen Eigenschaften von Interesse gründlicher untersucht werden.
-
Organismen
mit einer erhöhten
Ethanoltoleranz können
ausgewählt
werden. Eine Population von natürlichen
S. cerevisiae-Isolaten wird mutagenisiert. Diese Population wird
anschließend
unter Fermentationsbedingungen mit einer niedrigen Anfangsethanolkonzentration
wachsen gelassen. Sobald die Kultur die Sättigung erreicht hat, wird
die Kultur mit frischem Medium mit einem etwas höheren Ethanolgehalt verdünnt. Dieser
Prozess der sukzessiven Verdünnung
in einem Medium mit ansteigenden Ethanolkonzentrationen wird so lange
fortgeführt,
bis eine Schwelle der Ethanoltoleranz erreicht ist. Die überlebende
mutierte Population mit der höchsten
Ethanoltoleranz wird gepoolt und deren Genome durch irgendein hierin
beschriebenes Verfahren rekombiniert. Die Anreicherung könnte auch
durch eine kontinuierliche Kultur in einem Chemostaten oder Turbidostaten
erreicht werden, in welchem die Temperatur oder die Ethanolkonzentrationen
progressiv erhöht werden.
Die resultierenden, neu zusammengesetzten Populationen werden anschließend wiederum
der Anreicherungsstrategie unterzogen, jedoch bei einer höheren Ethanolkonzentration
des Ausgangsmediums. Diese Strategie wird wahlweise für die Anreicherung
von Hitze-toleranten Zellen und für die Anreicherung von Zellen
angewandt, die eine kombinierte Hitze- und Ethanoltoleranz besitzen.
-
21. Screening
nach verbesserten Stämmen
-
Stämme, die
bei den anfänglichen
Selektionen eine Lebensfähigkeit
zeigen, werden hinsichtlich Verbesserungen in den erwünschten
Eigenschaften quantitativer untersucht, bevor sie mit anderen Stämmen wieder
neu zusammengesetzt werden.
-
Nachkommenschaften,
die aus der Mutagenese eines Stammes herrühren, oder diejenigen, die
hinsichtlich ihrer Ethanoltoleranz und/oder Hitzestabilität vorselektiert
wurden, können
auf nicht-selektivem Agar ausplattiert werden. Die Kolonien können mit
Hilfe eines Roboters auf Mikrotiterplatten überführt und wachsen gelassen werden.
Kulturen werden auf frische Mikrotiterplatten repliziert und die
Replikate werden unter den (der) geeigneten Stressbedingung(en)
inkubiert. Das Wachstum oder die Stoffwechselaktivität einzelner
Klone kann beobachtet und eingestuft werden. Indikatoren für die Lebensfähigkeit
können
von der Größe der wachsenden
Kolonien auf festem Medium, der Dichte der wachsenden Kulturen oder
der Farbänderung
eines Indikators für
die Stoffwechselaktivität
rangieren, welcher zu dem flüssigen
Medium hinzugefügt
wird. Stämme,
die die höchste
Lebensfähigkeit
zeigen, werden anschließend
vermischt und neu zusammengesetzt und die resultierende Nachkommenschaft
wird unter stringenteren Bedingungen neu gescreent.
-
22. Entwicklung eines
Ethanol-toleranten Stammes mit der Fähigkeit, Cellulose in Ethanol
umzuwandeln
-
Sobald
ein Hefestamm mit Hitzetoleranz und Ethanoltoleranz entwickelt worden
ist, wird für
den Abbau von Cellulose in monomere Zucker dadurch gesorgt, dass
in den Wirtsstamm ein effizienter Cellulose-Abbauweg eingeschleust
wird.
-
Zusätzliche
wünschenswerte
Charakteristika können
nützlich
sein, um die Produktion von Ethanol durch den Wirt zu verstärken. So
kann bspw. der Einschluss von heterologen Enzymen und Wegen, die
den Bereich des Substratzuckers vergrößern, durchgeführt werden.
Ein „Tuning" des Stammes kann
durch das Hinzufügen
verschiedener anderer Merkmale erreicht werden, oder aber die Wiederherstellung
bestimmter endogener Merkmale, die wünschenswert sind, die jedoch
während
der Rekombinationsschritte verloren gegangen sind.
-
23. Verleihen
von Cellulase-Aktivität
-
Eine
riesige Anzahl an Cellulasen und Cellulase-Abbausystemen sind für Pilze, Bakterien und Hefen beschrieben
worden (siehe die Übersichtsartikel
von Beguin, P. und Aubert, J-P (1994) FEMS Microbiol. Rev. 13: 25–58; Ohima,
K et al. (1997) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 14: 365–414). Ein
enzymatischer Weg, der für eine
effiziente Zuckerumwandlung von Cellulose notwendig ist, benötigt die
synergistische Wirkung von Endoglucanasen (Endo-1,4-β-D-glucanasen,
EC 3.2.1.4), Exocellobiohydrolasen (Exo-1,4-β-D-glucanasen, EX 3.2.1.91)
und β-Glucosidasen (Cellobiasen,
1,4-β-D-Glucanasen
EC 3.2.1.21) (9). Die heterologe Produktion
von Cellulaseenzymen in den Ethanol-toleranten Stämmen würde die
Zuckerumwandlung von Cellulose ermöglichen, wodurch monomere Zucker
entstehen, die durch den Organismus für die Ethanolproduktion verwendet
werden können.
Es gibt mehrere Vorteile für
die heterologe Expression eines funktionellen Cellulasewegs in den
Ethanol-toleranten Stämmen.
So würde
bspw. der SSF-Prozess die Notwendigkeit eines getrennten Bioprozessierungsschritts
für die
Zuckerumwandlung eliminieren und würde die Endprodukt-Inhibierung der
Cellulaseenzyme durch akkumulierte Zwischenverbindungen und Produktzucker
verbessern.
-
Natürlich vorkommende
Cellulasewege werden in die Ethanol-toleranten Stämme eingefügt, oder
es können
herkömmlich
verbesserte „Hybrid"-Cellulasewege ausgewählt werden,
wobei die koordinierte Wirkung der Cellulasen eingesetzt wird, die
aus unterschiedlichen natürlichen
Quellen gewonnen wurden, einschließlich aus thermophilen Stämmen.
-
Bisher
wurden mehrere Cellulasen aus Nicht-Saccharomyces hergestellt und erfolgreich
aus diesem Organismus sekretiert, einschließlich bakterieller, Pilz- und
Hefeenzyme, z.B. T. reesei CBH I ((Shoemaker (1994), in „The Cellulase
System of Trichoderma reesei: Trichoderma strain improvement and
Expression of Trichoderma cellulases in Yeast", Online, Pinner, UK, 593–600). Es
ist möglich,
direkte Stoffwechsel-Konstruktionstechniken
einzusetzen, um in Saccharomyces eine Cellulaseaktivität zu erzeugen.
Auch konnte die Hefe dazu gebracht werden, sich durch Protoplastenfusion
Elemente von Cellulose-Abbauwegen anzueignen (bspw. sind intergenerische
Hybride von Saccharomyces cerevisiae und Zygosaccharomyces fermentati,
eine Cellobiase-produzierende Hefe, gebildet worden (Pina A. et
al. (1986) Appl. Environ. Microbiol. 51: 995–1003). Im Allgemeinen könnte jedes
Cellulase-Komponentenenzym, das von einem nahe verwandten Hefeorganismus
abgeleitet ist, durch Protoplastenfusion übertragen werden. Cellobiasen,
die von einem etwas breiteren Bereich an Hefen produziert werden,
kön nen
durch Gesamtgenom-Shuffling in einem seiner vielen Formate zugänglich gemacht
werden (d.h. gesamt, fragmentiert, YAC-basierend).
-
Optimalerweise
sollten die zu verwendenden Cellulaseenzyme eine gute Synergie aufweisen,
ferner einen hinreichenden Expressions- und Sekretionslevel aus
dem Wirt, eine gute Spezifitäts-Aktivität (d.h.
die Resistenz gegenüber
abbauenden Faktoren und Enzymmodifizierungen des Wirtes) und eine
Stabilität
in der erwünschten
SSF-Umgebung. Ein Beispiel eines Hybrid-Celluloseabbauweges mit einer ausgezeichneten
Synergie schließt
die folgenden Enzyme mit ein: CBH I Exocellobiohydrolase aus Trichoderma
reesei, die Endoglucanase aus Acidothermus cellulolyticus E1 und
die Exocellulase aus Thermomonospera fusca E3 (Baker et al. (1998)
Appl. Biochem. Biotechnol. 70–72:
395–403).
-
Vorliegend
wird vorgeschlagen, dass diese Enzyme (oder deren verbesserte Mutanten)
für einen
Einsatz in dem SSF-Organismus
geeignet sind, zusammen mit einer Cellobiase (β-Glucosidase), z.B. diejenige von Candida
peltata. Andere mögliche
Cellulasesysteme, die in Frage kommen, sollten eine besonders gute Aktivität gegenüber kristalliner
Cellulose besitzen, wie bspw. das Cellulasesystem von T. reesei
(Teeri, TT, et al. (1998) Biochem. Soc. Trans. 26: 173–178), oder
sollte besonders gute Thermostabilitäts-Merkmale aufweisen (bspw.
Cellulasesysteme aus thermophilen Organismen, wie bspw. Thermomonospora
fusca (Zhang, S., et al. (1995) Biochem. 34: 3386–335).
-
Ein
rationaler Ansatz für
die Klonierung von Cellulasen in Ethanol-tolerante Hefewirtsstämme könnte eingesetzt werden.
So werden bspw. bekannte Cellulase-Gene in Expressionskassetten
kloniert, und zwar unter Verwendung von S. cerevisiae-Promotersequenzen,
und die resultierenden linearen DNA-Fragmente können in den Empfängerwirt
dadurch transformiert werden, dass kurze Hefesequenzen an den Termini
platziert werden, um eine Stellen-spezifische Integration in das
Genom zu fördern.
Dies ist gegenüber
einer Plasmid-Transformation bevorzugt, und zwar aus Gründen der
genetischen Stabilität
und Aufrechterhaltung der zu transformierenden DNA.
-
Wenn
ein gesamter Cellulose-Abbauweg eingeführt würde, so könnte eine Selektion in einem Agar-Platten-basierenden
Format angewandt werden, und eine große Anzahl an Klonen könnte innerhalb
kurzer Zeit hinsichtlich Cellulase-Aktivität untersucht werden. So könnte bspw.
die Selektion hinsichtlich einer Exocellulase dadurch ermöglicht werden,
dass ein lösliches
Oligocellulosesubstrat oder Carboxymethylcellulose (CMC) als einzige
Kohlenstoffquelle dem Wirt zur Verfügung gestellt wird, der andererseits
nicht dazu in der Lage wäre,
auf Agar, der diese Substanzen als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zu wachsen.
Klone, die die aktiven Cellulasewege produzieren, würden auf
Grund deren Fähigkeit,
Glucose zu produzieren, wachsen.
-
Wenn
die unterschiedlichen Cellulasen nacheinander eingeführt werden
würden,
wäre es
auf der anderen Seite nützlich,
zunächst
eine Cellubiase einzuführen,
wodurch eine Selektion unter Verwendung kommerziell erhältlicher
Cellobiose als einzige Kohlenstoffquelle ermöglicht wäre. Gegenwärtig sind mehrere Stämme an S.
cerevisiae, die dazu in der Lage sind, auf Cellubiose zu wachsen,
durch die Einführung
eines Cellubiase gens hergestellt worden (bspw. Rajoka MI, et al.
(1998) Fioia Microbiol. (Praha) 43: 129–135; Skory, CD, et al. (1996)
Curr. Genet. 30: 417–422;
D'Auria, S. et al.
(1996) Appl. Biochem. Biotechnol. 61: 157–166; Adam, AC, et al. (1995)
Yeast 11: 395–406;
Adam, AC, et al. (1991) Curr. Genet. 20: 5–8).
-
Eine
darauf folgende Transformation dieses Organismus mit der CBHI-Exocellulase
kann hinsichtlich Wachstum auf einem Cellulosesubstrat, wie bspw.
Carboxymethylcellulose (CMC), selektiert werden. Schlussendlich
wird durch das Hinzufügen
einer Endoglucanase ein Hefestamm generiert, der eine verbesserte
kristalline Abbaufähigkeit
besitzt.
-
24. Übertragen
der Pentosezuckerverwertung
-
Der
Einschluss von Pentosezucker-Verwertungswegen stellt einen wichtigen
Aspekt für
einen möglicherweise
nützlichen
SSF-Organismus dar. Die erfolgreiche Expression von Xylosezucker-Verwertungswegen für die Ethanolproduktion
konnte in Saccharomyces gezeigt werden (siehe bspw. Chen, ZD und
Ho, NWY (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 39/40: 135–147).
-
Es
wäre ferner
nützlich,
für die
Ethanolproduktion im Saccharomyces-Wirt eine Verwertung von L-Arabinose-Substraten
zu erreichen. Hefestämme,
die L-Arabinose verwerten, schließen einige Candida und Pichia
spp. mit ein (McMillan JD und Boynton BL (1994) Appl. Biochem. Biotechnol.
45–46:
569–584;
Dien BS, et al. (1996) Appl. Biochem. Biotechnol. 57–58: 233–242). Die
Gene, die für
eine Arabinosefermentierung in E. coli notwendig sind, könnten ebenfalls
durch sinnvolle Mittel eingeführt
wer den (wie bspw. zuvor in Z. mobilis durchgeführt wurde (Deanda K, et al.
(1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465–4470)).
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25. Übertragen
anderer nützlicher
Aktivitäten
-
Mehrere
andere Merkmale, die für
die Optimierung eines SSF-Stammes wichtig sind, konnten nachgewiesenermaßen auf
S. cerevisiae übertragen
werden. Wie die Hitzetoleranz, die Cellulase-Aktivität und die Verwertung
von Pentosezucker muss normalerweise Saccharomyces diese Merkmale
nicht zeigen (oder der besondere Stamm von Saccharomyces, der als
Wirt verwendet wird), und diese Merkmale können über genetische Verfahren hinzugefügt werden.
So wurde bspw. die Expression der menschlichen Muskel-Acylphosphatase
in S. cerevisiae vorgeschlagen, um die Ethanolproduktion zu steigern
(Rougei, G., et al. (1996) Biotechnol. App. Biochem. 23: 273–278).
-
Es
kann passieren, dass entwickelte, Stress-tolerante SSF-Stämme sich
einige unerwünschte
Mutationen im Verlauf der Evolutions-Strategie aneignen. Tatsächlich stellt
dies bei Stammverbesserungs-Strategien, die lediglich auf Mutagenesetechniken
basieren, ein erhebliches Problem dar, und kann zu äußerst instabilen
oder fragilen Produktionsstämmen
führen.
Es ist möglich,
einige dieser erwünschten
Merkmale durch sinnvolle Verfahren, wie bspw. die Klonierung von
spezifischen Genen, die ausgeschaltet wurden oder die in den vorherigen
Runden der Stammverbesserung negativ beeinflusst wurden, wieder
herzustellen. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Spezifität – das störende Gen
kann direkt angepeilt werden. Der Nachteil ist es, dass es zeitaufwändig und
wiederholungsintensiv ist, wenn mehrere Gene geschädigt wurden,
und dadurch werden lediglich Probleme angesprochen, die charakterisiert
wurden. Ein bevorzugter (und traditionellerer) Ansatz für die Entfernung
von unerwünschten/schädlichen
Mutationen ist es, den entwickelten Stamm zu einem erwünschten
Elternstamm (bspw. der ursprüngliche „Wirts"-SSF-Stamm) zurückzukreuzen.
Diese Strategie konnte im Verlaufe der Stammverbesserung erfolgreich
eingesetzt werden, wo diese Möglichkeit
gegeben war (d.h. für
Organismen, die sexuelle Reproduktionszyklen besitzen). Fehlte der
Vorteil eines sexuellen Prozesses, wurde dies durch andere Verfahren
erreicht, wie bspw. durch parasexuelle Rekombination oder Protoplastenfusion.
So wurde bspw. die Fähigkeit,
Flocken zu bilden, auf einen nicht-Flocken-bildenden Stamm von S. cerevisiae übertragen,
und zwar durch Protoplastenfusion mit einem Flocken-bildenden-kompetenten
S. cerevisiae-Stamm (Watari, J., et al. (1990) Agric. Biol. Chem.
54: 1667–1681).
-
N. IN VITRO-GESAMTGENOM-SHUFFLING
-
Das
Shuffling großer
DNA-Sequenzen, wie bspw. von eukaryotischen Chromosomen, ist durch
im Stand der Technik bekannte, in vitro-Shuffling-Verfahren schwierig.
Ein Verfahren zur Überwindung
dieser Einschränkungen
ist hierin beschrieben.
-
Die
Zellen verwandter eukaryotischer Spezies werden vorsichtig lysiert
und die intakten Chromosomen freigesetzt. Die freigesetzten Chromosomen
werden anschließend
durch FACS oder ähnliche
Verfahren (wie bspw. Pulsfeld-Elektrophorese) sortiert, wobei Chromosomen
mit einer ähnlichen
Größe zusammen
abgeschieden werden. Jede Größenfraktion
der sortierten Chromosomen stellt allgemein einen Pool analoger Chromosomen
dar, wie bspw. das Y-Chromosom verwandter Säugetiere. Das erste Ziel ist es,
intakte Chromosomen zu isolieren, die nicht irreversibel geschädigt wurden.
-
Die
Fragmentierung und der Wiederzusammenbau solch großer komplexer
DNA-Stücke,
unter Einsatz von DNA-Polymerasen, ist schwierig und durch diese
Verfahren würde
sehr wahrscheinlich ein unakzeptabler hoher Level an Zufallsmutationen
eingeführt.
Ein alternativer Ansatz, bei welchem Restriktionsenzyme und DNA-Ligasen
eingesetzt werden, stellt eine machbare und weniger destruktive
Lösung
dar. Eine chromosomale Fraktion wird mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen,
die lange DNA-Sequenzen
(~15–20
bp) erkennen, verdaut, wie bspw. die Intron- und Intein-kodierten Endonucleasen
(I-PpoI, I-CeuI, PI-PspI, PI-TliI, PI-SceI (VDE). Diese Enzyme schneiden
jeweils nur wenige Male innerhalb jedes Chromosoms, was zu einer kombinatorischen
Mischung großer
Fragmente führt,
von denen jedes einzelsträngige, überhängende Termini aufweist,
die zu anderen Stellen komplementär sind, die durch das gleiche
Enzym geschnitten wurden.
-
Der
Verdau wird ferner durch eine sehr kurze Inkubation mit einer einzelsträngigen Exonuclease
modifiziert. Die Polarität
der Nuclease wird unabhängig
von dem einzelsträngigen Überhang
ausgewählt,
der von dem ausgewählten
Restriktionsenzym abhängt.
5'-3'-Exonucleasen für 3'-Überhänge und 3'-5'-Exonucleasen für 5'-Überhänge. Dieser Verdau resultiert
in sehr lange Regionen von ssDNA-Überhängen an jedem ds-DNA-Terminus.
Das Ziel dieser Inkubation ist es, DNA-Regionen zu generieren, die
spezifische DNA-Regionen definieren, in denen eine Rekombination
stattfinden kann. Die Fragmente werden anschließend unter Bedingungen inkubiert,
unter welchen die Enden der Frag mente mit anderen Fragmenten ausgerichtet
werden, die homologe ssDNA-Termini besitzen. Oftmals werden die
zwei miteinander auszurichtenden Fragmente von unterschiedlichen
Chromosomen herrühren
und werden in Gegenwart der DNA-Lipase kovalent verbunden, wodurch
ein chimäres
Chromosom gebildet wird. Dadurch entsteht eine genetische Diversität, mit welcher
das Crossingover homologer Chromosomen nachgeahmt wird. Die vollständige Ligationsreaktion
wird eine kombinatorische Mischung aller möglicher Ligationen von Fragmenten
enthalten, die homologe Überhangtermini besitzen.
Eine Untereinheit dieser Population wird vollständig chimäre Chromosomen aufweisen.
-
Um
die neu zusammengesetzte Bibliothek zu screenen, werden die Chromosomen
in einen geeigneten Wirt überführt, und
zwar derart, dass die Chromosomen gesamt aufgenommen und exprimiert
werden können.
So können
bspw. YACs (yeast artificial chromosomes, künstliche Hefechromosomen) durch
Protoplastenfusion in eukaryotische Zellen eingeschleust werden.
Auf diese Weise könnte
die zusammengesetzte Bibliothek in Liposomen eingekapselt und mit
Protoplasten der geeigneten Wirtszelle fusioniert werden. Die resultierenden
Transformanten würden
vermehrt und hinsichtlich der erwünschten zellulären Verbesserungen
gescreent werden. Sobald die verbesserte Population identifiziert
wäre, würden die
Chromosomen isoliert, neu zusammengesetzt und rekursiv gescreent
werden.
-
O. GESAMTGENOM-SHUFFLING
NATÜRLICH
KOMPETENTER MIKROORGANISMEN
-
Die
natürliche
Kompetenz ist ein Phänomen,
das bei einigen mikrobiellen Spezies beobachtet wird, wobei einzelne Zellen
DNA aus der Umgebung aufnehmen und sie durch homologe Rekombination
in ihr Genom einbauen. Bacillus subtilis und Acetinetobacter spp.
sind bekanntermaßen
bei diesem Prozess besonders effizient. Ein Verfahren für das Gesamtgenom-Shuffling (WGS, whole
genome shuffling) dieser und analoger Organismen ist hierin beschrieben,
wobei dieser Prozess eingesetzt wird.
-
Ein
Ziel des Gesamtgenom-Shufflings ist die schnelle Anhäufung nützlicher
Mutationen aus einer Population von einzelnen Stämmen in einen überragenden
Stamm. Wenn die zu entwickelnden Organismen natürlich kompetent sind, wird
eine „split-pooled"-Strategie für die rekursive
Transformation natürlich
kompetenter Zellen mit DNA, die aus dem Pool herrührt, diesen
Prozess bewirken. Ein beispielhaftes Verfahren lautet wie folgt.
-
Eine
Population natürlich
kompetenter Organismen, die eine Vielzahl von nützlichen Merkmalen aufweist
(wie bspw. eine erhöhte
Proteinsekretion), wird identifiziert. Die Stämme werden gepoolt, und der
Pool wird anschließend
aufgeteilt. eine Hälfte
des Pools wird als gDNA-Quelle verwendet, wobei die andere Hälfte dazu
verwendet wird, einen Pool natürlich
kompetenter Zellen zu generieren.
-
Die
kompetenten Zellen werden in Gegenwart der gepoolten gDNA wachsen
gelassen, um eine DNA-Aufnahme und eine DNA-Rekombination zu ermöglichen.
Die Zellen des einen Genotyps nehmen gDNA aus Zellen eines unterschiedlichen
Typs auf und bauen diese ein, wodurch Zellen mit chimären Genomen
gebildet werden. Das Ergebnis ist eine Zellpopulation, die eine
kombina torische Mischung der genetischen Variationen darstellt,
die aus dem ursprünglichen
Pool herrühren.
Diese Zellen werden wieder gepoolt und mit der gleichen DNA-Quelle
wieder transformiert. Dieser Prozess wird wiederholt durchgeführt, um
die Diversität
der Genome der Zellen zu erhöhen,
die aus der Transformation herrühren.
Ist eine hinreichend große
Diversität einmal
generiert, so wird die Zellpopulation hinsichtlich neuer chimärer Organismen
gescreent, welche die erwünschten
Verbesserungen zeigen.
-
Dieses
Verfahren wird durch ein Erhöhen
der natürlichen
Kompetenz des Wirtsorganismus verstärkt. COMS ist ein Protein,
das, wenn es in B. subtilis exprimiert wird, die Effizienz der natürlichen
Kompetenz, die durch eine Transformation vermittelt wird, um mehr
als eine Größenordnung
verstärkt.
-
Es
konnte gezeigt werden, dass ca. 100% der Zellen, die das Plasmid
pCOMS tragen, genomische DNA-Fragmente in ihre Genome aufnehmen
und rekombinieren. Im Allgemeinen rekombinieren ungefähr 10% des
Genoms in jeder vorgegebenen transformierten Zelle. Diese Beobachtung
wurde wie folgt nachgewiesen.
-
Ein
B. subtilis-Stamm mit pCOMS, der für zwei Nährstoffmarker auxotroph war,
wurde mit genomischer DNA (gDNA) transformiert, die aus einem prototrophen
Stamm des gleichen Organismus isoliert wurde. 10% der Zellen, die
der DNA ausgesetzt wurden, waren hinsichtlich einem der zwei Nährstoffmarker
prototroph. Die durchschnittliche Größe des DNA-Stranges, der durch
B. subtilis aufgenommen wurde, betrug ungefähr 50 kb oder ~2% des Genoms.
Damit hatte eine von zehn Zellen jeweils einen Marker rekombiniert,
der in einem von 50 Molekülen
der aufge nommenen gDNA jeweils vorlag. Aus diesen Gründen nehmen
die meisten Zellen ungefähr
fünf 50
kb-Moleküle
oder 10% des Genoms auf und rekombinieren mit diesen. Dieses Verfahren
stellt ein wirksames Werkzeug zur schnellen und effizienten Rekombination
gesamter mikrobieller Genome dar.
-
In
Abwesenheit von pCOMS nehmen lediglich 0,3% der Zellen, die für eine natürliche Kompetenz
hergestellt wurden, einen spezifischen Marker auf und integrieren
diesen. Dies legt nahe, dass ungefähr 15% der Zellen tatsächlich einer
Rekombination mit einem einzelnen genomischen Fragment unterzogen
wurden. Daher produziert eine rekursive Transformationsstrategie,
wie oben beschrieben, eine neu zusammengesetzte Gesamtgenom-Bibliothek,
sogar in Abwesenheit von pCOMS. Jedoch werden in Abwesenheit von
pCOMS die komplexen Genome einen kleineren, aber immer noch Screening-fähigen Prozentsatz
der transformierten oder neu zusammengesetzten Population darstellen.
-
P. KONGRESSION
-
Eine
Kongression ist die Integration von zwei unabhängig verbundenen Markern in
eine Zelle. 0,3% natürlich
kompetenter B. subtilis-Zellen integrieren einen einzelnen Marker
(wie oben beschrieben). Von diesen haben ungefähr 10% einen zusätzlichen
Marker aufgenommen. Wenn daher hinsichtlich der Integration eines
spezifischen Markers selektiert oder gescreent wird, werden somit
10% der resultierenden Population einen anderen spezifischen Marker
integriert haben. Dies stellt einen Weg für die Anreicherung spezifischer Integrationsereignisse
dar.
-
Wenn
bspw. die Integration eines Gens kontrolliert wird, welches nicht
einfach gescreent oder selektiert werden kann, wird es bei 0,3%
der Zellpopulation existieren. Wenn die Population zunächst hinsichtlich eines
spezifischen Integrationsereignisses selektiert wird, wird die erwünschte Integration
in 10% der Population gefunden werden. Dies stellt eine signifikante
(ungefähr
30fache) Anreicherung für
das erwünschte
Ereignis dar. Diese Anreicherung wird als „Kongressionseffekt" bezeichnet. Der
Kongressionseffekt wird nicht durch das Vorliegen von pCOMS beeinflusst,
weshalb der „pCOMS-Effekt" einfach ist, um
den Prozentsatz natürlich kompetenter
Zellen, die wahrhaftig natürlich
kompetent sind, von ungefähr
15% in dessen Abwesenheit zu 100% in dessen Gegenwart zu steigern.
Alle kompetenten Zellen nehmen ungefähr die gleiche DNA-Menge oder
~10% des Bacillusgenoms immer noch auf.
-
Der
Kongressionseffekt kann in den folgenden Beispielen eingesetzt werden,
um das Gesamtgenom-Shuffling zu verstärken, ebenso wie die gezielte
Integration von zusammengesetzten Genen in das Chromosom.
-
Q. B. SUBTILIS-SHUFFLING
-
Eine
Population an B. subtilis-Zellen mit erwünschten Eigenschaften wird
identifiziert, gepoolt und wie oben beschrieben neu zusammengesetzt,
mit einer Ausnahme: ist die gepoolte Population einmal aufgeteilt, so
wird die eine Hälfte
der Population mit einem Antibiotikum-Selektionsmarker transformiert,
der von einer Sequenz flankiert ist, die dessen Integration und
die Unterbrechung eines spezifischen Nährstoffgens erzielt, wie bspw.
eines, das bei der Aminosäurebiosynthe se
beteiligt ist. Die Transformanten, die gegenüber dem Arzneimittel resistent
sind, sind hinsichtlich diesem Nährstoff
auxotroph. Die resistente Population wird gepoolt und unter Bedingungen
kultiviert, welche die Population natürlich kompetent machen (oder
wahlweise zuerst mit pCOMS transformiert).
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Die
kompetenten Zellen werden anschließend mit gDNA transformiert,
welche aus dem ursprünglichen
Pool isoliert wurde, und die prototrophen Zellen werden selektiert.
Die prototrophe Population wird einer Rekombination mit genomischen
Fragmenten unterzogen worden sein, welche für eine funktionelle Kopie des Nährstoffmarkers
kodieren, und werden daher hinsichtlich Zellen angereichert, welche
einer Rekombination an anderen genetischen Loci durch den Kongressionseffekt
unterzogen worden sind.
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R. GEZIELTES EINBAUEN
VON GENEN UND GEN-BIBLIOTHEKEN IN DAS CHROMOSOM
-
Es
ist nützlich,
Gene oder Gen-Bibliotheken direkt in eine spezifische Chromosomen-Location
einer Zelle effizient übertragen
zu können.
Wie oben dargestellt, werden die Zielzellen mit einem positiven
Selektionsmarker transformiert, der von Sequenzen flankiert ist,
die dessen homologe Rekombination in das Chromosomen erzielen. Die
selektierten Zellen, die den Marker tragen, werden natürlich kompetent
gemacht (mit oder ohne pCOMS, jedoch vorzugsweise Ersteres) und
werden mit einer Mischung von zwei Sets an DNA-Fragmenten transformiert.
Das erste Set enthält
ein Gen oder eine zusammengesetzte Gen-Bibliothek, von denen jedes mit einer
Sequenz flankiert ist, um dessen Integration in einen spezifischen
chromosomalen Locus zu bewirken. Das zweite Set enthält einen
positiven Selektionsmarker (unterschiedlich von dem ersten, der
in die Zellen integriert wurde), flankiert von Sequenzen, mit welchen
dessen Integration und der Austausch des ersten positiven Selektionsmarkers
erreicht werden kann. Unter optimalen Bedingungen ist die Mischung derart,
dass das Gen oder die Gen-Bibliothek in molarem Überschuss im Vergleich zum
positiven Selektionsmarker vorliegt. Anschließend werden die Transformanten
hinsichtlich Zellen selektiert, die den neuen positiven Marker enthalten.
Diese Zellen werden nach Zellen angereichert, die eine Kopie des
erwünschten
Gens oder Gen-Bibliothek durch den Kongressionseffekt eingebaut
haben, und können
direkt hinsichtlich Zellen gescreent werden, die das Gen oder Genvarianten
von Interesse tragen. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung von
PCR-Fragmenten < 10
kb durchgeführt,
und es wurde herausgefunden, dass unter Einsatz des Kongressionseffektes
eine Population angereichert werden kann, so dass 50% der Zellen
Kongreganten sind. Auf diese Weise enthielt eine von zwei Zellen
ein Gen oder eine Genvariante.
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Alternativ
kann dem Expressionswirt der erste positive Selektionsmarker fehlen
und die kompetenten Zellen werden mit einer Mischung der Zielgene
in einer begrenzten Menge des ersten positiven Selektionsmarkerfragments
transformiert. Zellen, die hinsichtlich des positiven Markers selektiert
wurden, werden hinsichtlich der erwünschten Eigenschaften in den
Zielgenen gescreent. Die verbesserten Gene werden durch PCR amplifiziert,
wiederum neu zusammengesetzt und anschließend in den ursprünglichen
Wirt zurücküberführt, wiederum
mit dem ersten positiven Selektionsmarker. Dieser Prozess wird rekursiv
so lange durchgeführt,
bis die erwünschte
Funktion der Gene er reicht ist. Mit diesem Verfahren wird vermieden,
dass ein primärer
Wirtsstamm konstruiert werden muss und zwei positive Marker benötigt werden.
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X. VERBESSERUNG ÜBEREXPRIMIERTER
GENE HINSICHTLICH EINES ERWÜNSCHTEN
PHÄNOTYPS
-
Die
Verbesserung einer zellulären
Eigenschaft oder eines Phänotyps
wird oftmals durch die Erhöhung der
Kopienanzahl oder durch die Erhöhung
der Expression von Genen verstärkt,
die bei der Expression dieser Eigenschaft beteiligt sind. Die Gene,
die auf die erwünschte
Eigenschaft einen solchen Effekt haben, können auch durch DNA-Shuffling
verbessert werden, damit sie einen ähnlichen Effekt besitzen. Eine
genomische DNA-Bibliothek wird hierzu in einen überexprimierenden Vektor kloniert
und in eine Zielzellpopulation derart transformiert, dass die genomischen
Fragmente in den Zellen, die hinsichtlich des Vorliegens des überexprimierenden
Vektors selektiert wurden, stark exprimiert werden. Die selektierten
Zellen werden anschließend hinsichtlich
der Verbesserung einer gewünschten
Eigenschaft gescreent. Der überexprimierende
Vektor wird aus den verbesserten Zellen isoliert und die klonierten
genomischen Fragmente neu zusammengesetzt. Das genomische Fragment,
das auf dem Vektor jedes verbesserten Isolats getragen wird, wird
unabhängig
von oder mit identifizierten homologen Genen (Familien-Shuffling)
neu zusammengesetzt. Die neu zusammengesetzten Bibliotheken werden
anschließend
in eine Zellpopulation zurücküberführt und
die selektierten Transformanten hinsichtlich weiterer Verbesserung
in der erwünschten
Eigenschaft neu gescreent. Dieses Shuffling/Screening-Verfahren
wird rekursiv durch Zyklen wiederholt, und zwar so lange, bis die erwünschte Eigenschaft
auf das erwünschte
Level optimiert worden ist.
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Wie
oben festgestellt, kann durch eine Gen-Dosierung eine erwünschte zelluläre Eigenschaft
stark verstärkt
werden. Ein Verfahren zur Erhöhung
der Gen-Kopienanzahl von unbekannten Genen ist die Verwendung eines
Verfahrens der Zufallsamplifizierung (siehe auch Mavingui et al.
(1997) Nature Biotech, 15: 564). Bei diesem Verfahren wird eine
genomische Bibliothek in einen Suizidvektor kloniert, der einen
Selektionsmarker enthält,
welcher auch bei einer höheren
Dosierung für
einen verstärkten
Phänotyp
sorgt. Ein Beispiel eines solchen Markers ist das Kanamycin-Resistenzgen.
Mit einer schrittweise erhöhten
Kopienanzahl wird die Resistenz zu schrittweise erhöhten Leveln
an Kanamycin erreicht. Die genomische Bibliothek wird durch irgendeines
von verschiedenen Verfahren in eine Zielzelle eingeschleust, einschließlich der
Transformation, Transduktion, Konjugation, etc. Die Zellen, die
den Vektor durch homologe Rekombination zwischen dem Vektor und chromosomalen
Kopien der klonierten Gene in das Chromosomen eingebaut haben, können dadurch
selektiert werden, dass sie die Expression des Selektionsmarkers
unter Bedingungen benötigen,
unter denen der Vektor nicht repliziert. Dieses Rekombinationsereignis
resultiert in die Duplizierung des klonierten DNA-Fragments im Wirts-Chromosom, wobei
eine Kopie des Vektors und des Selektionsmarkers die zwei Kopien
trennt. Die Population der überlebenden
Zellen wird hinsichtlich der Verbesserung einer erwünschten
zellulären
Eigenschaft gescreent, die aus dem Gen-Duplizierungsereignis herrührt. Weitere
Gen-Duplizierungsereignisse, die in zusätzliche Kopien des ursprünglich klonierten
DNA-Fragments resultieren, können
durch eine weitere Vermehrung der Zellen unter schrittweise stringenteren
Selektionsbedingungen erreicht werden, d.h. erhöhte Konzentrationen an Kanamycin.
In diesem Fall wird für
die Auswahl eine erhöhte
Kopienanzahl des Selektionsmarkers benötigt, was jedoch auch mit einer
erhöhten
Kopienanzahl des erwünschten
Genfragments einhergeht. Die überlebenden
Zellen werden hinsichtlich einer Verbesserung in dem erwünschten
Phänotyp
gescreent. Die resultierende Zellpopulation resultiert wahrscheinlich
in die Amplifizierung unterschiedlicher Gene, da oftmals viele Gene
einen vorgegebenen Phänotyp
bewirken. Um eine Bibliothek der möglichen Kombinationen dieser
Gene herzustellen, wird die ursprünglich ausgewählte Bibliothek,
die die phänotypischen
Verbesserungen zeigt, rekombiniert, und zwar unter Verwendung der
hierin beschriebenen Verfahren, d.h. bspw. Protoplastenfusion, aufgeteilte „split
pool"-Transduktion,
Transformation, Konjugation, etc.
-
Die
rekombinierten Zellen werden hinsichtlich der erhöhten Expression
des Selektionsmarkers selektiert. Die überlebenden Zellen werden hinsichtlich
Zellen angereichert, die zusätzliche
Kopien der Vektorsequenz durch homologe Rekombination eingebaut
haben, und diese Zellen werden hinsichtlich denjenigen angereichert,
die kombinierte Duplikationen unterschiedlicher Gene festsetzen.
In anderen Worten, die Duplizierung aus einer Zelle des verstärkten Phänotyps wird
mit der Duplizierung einer anderen Zelle des verstärkten Phänotyps kombiniert.
Diese überlebenden
Zellen werden hinsichtlich weiterer Verbesserungen in dem erwünschten
Phänotyp
gescreent. Dieses Verfahren wird rekursiv so lange wiederholt, bis
der erwünschte
Level der Phänotyp-Expression
erreicht ist.
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Alternativ
werden diejenigen Gene, die zuvor identifiziert wurden, oder von
denen angenommen wird, dass sie gut für eine erhöhte Kopienanzahl sind, in Tandem-Form
in geeignete Plasmidvektoren kloniert. Diese Vektoren werden anschließend transformiert
und in einem geeigneten Wirtsorganismus vermehrt. Die Plasmid-Plasmid-Rekombination
zwischen den klonierten Gen-fragmenten
resultiert in eine weitere Duplizierung der Gene. Die Auflösung des
Plasmid-Dupletts kann in einer ungleichen Verteilung der Gen-Kopienanzahl
resultieren, wobei einige Plasmide zusätzliche Genkopien und andere
Plasmide wenigere Genkopien aufweisen können. Die Zellen, die diese
Plasmidverteilung tragen, werden anschließend hinsichtlich einer Verbesserung des
Phänotyps
gescreent, der durch die Gen-Duplizierungen bewirkt wird.
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Zusammenfassend
dargestellt, ist ein Verfahren zur Selektion einer erhöhten Kopienanzahl
einer Nucleinsäuresequenz
durch das oben beschriebene Verfahren möglich. In dem Verfahren wird
eine genomische Bibliothek in einem Suizidvektor, wie oben beschrieben,
verwendet, der einen Dosierungs-empfindlichen Selektionsmarker trägt. Die
genomische Bibliothek wird in eine Population von Zielzellen transduziert.
Die Zielzellen werden in eine Population von Zielzellen selektiert,
und zwar mit ansteigenden Dosierungen des Selektionsmarkers unter
Bedingungen, unter welchen der Suizidvektor sich nicht episomal
repliziert. Eine Vielzahl von Zielzellen wird hinsichtlich des erwünschten
Phänotyps
selektiert, rekombiniert und wieder selektiert. Dieses Verfahren
wird rekursiv – wenn
erwünscht – so lange
wiederholt, bis der erwünschte
Phänotyp
erhalten wird.
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Y. STRATEGIEN ZUR VERBESSERUNG
DES GENOM-SHUFFLINGS DURCH TRANSFORMATION LINEARER DNA-FRAGMENTE
-
Wildtyp-Mitglieder
der Enterobacteriaceae (bspw. Escherichia coli) sind typischerweise
gegenüber
einem genetischen Austausch, der auf eine Transformation linearer
DNA-Moleküle folgt,
resistent. Dies ist zumindest teilweise auf die Exonuclease V (Exo
V)-Aktivität
des RecBCD-Holoenzyms zurückzuführen, welche lineare
DNA-Moleküle
nach einer Transformation schnell abbaut. Die Produktion von Exo
V wurde auf das RecD-Gen zurückgeführt, welches
für die
D-Untereinheit des Holoenzyms kodiert. Wie durch Russel et al. (1989),
Journal of Bacteriology 2609–2613
gezeigt wurde, kann die homologe Rekombination zwischen einem transformierten
linearen Donor-DNA-Molekül
und dem Chromosom des Empfängers
einfach in Stämmen
beobachtet werden, die eine Funktionsverlusts-Mutation in einer
RecD-Mutante tragen.
Die Verwendung von RecD-Stämmen
stellt ein einfaches Mittel für
das Genom-Shuffling der Enterobacteriaceae dar. So wird bspw. ein
bakterieller Stamm oder ein Set von verwandten Stämmen, die
eine RecD-Null-Mutation tragen (bspw. das E. coli recD1903::mini-Tet-Allel),
mutagenisiert und hinsichtlich der erwünschten Eigenschaften gescreent. Nach
Art des Split-Pool-Verfahrens könnte
die präparierte
chromosomale DNA aus einem Aliquot zur Transformation des zweiten
Aliquots verwendet werden (bspw. durch Elektroporation oder chemisch
induzierte Kompetenz). Die resultierenden Transformanten werden
anschließend
hinsichtlich der Verbesserung gescreent oder vor dem Screening rekursiv
transformiert.
-
Die
Verwendung von RecE/recT, wie oben beschrieben, kann die homologe
Rekombination linearer DNA-Fragmente verbessern.
-
Das
RecBCD-Holoenzym spielt bei der Initiierung der RecA-abhängigen homologen
Rekombination eine wichtige Rolle. Sobald das RecBCD-Enzym ein dsDNA-Ende
erkennt, wickelt es die DNA auf und baut diese asymmetrisch in 5'-3'-Richtung so lange
ab, bis es auf eine Chi (oder „X")-Stelle (Consensus 5'-GCTGGTGG-3') trifft, die die
Nucleaseaktivität
bremst. Dies resultiert in die Herstellung einer ssDNA, die nahe
der c-Stelle mit
einem 3'-ssDNA-Schwanz
endet, der für
die Beladung mit RecA bevorzugt ist und für den nachfolgenden Einbau
von dsDNA für
die homologe Rekombination. Dementsprechend kann das Vorprozessieren
von zu transformierenden Fragmenten mit einer 5'-3'-spezifischen
ssDNA-Exonuclease, wie bspw. eine Lamda (λ)-Exonuclease (bspw. erhältlich von
Boeringer Mannheim) vor der Transformation dazu dienen, die homologe
Rekombination in einem recD–-Stamm zu stimulieren,
und zwar durch Bereitstellen eines ssDNA-invasiven Endes für die Beladung
mit RecA und einem nachfolgenden Strangeinbau.
-
Das
Hinzufügen
von DNA-Sequenz-kodierenden Chi-Stellen
(Consensus 5'-GCTGGTGG-3') an DNA-Fragmente
kann sowohl der Verzögerung
der Exonuclease V-Aktivität
dienen als auch die homologe Rekombination stimulieren, wodurch
die Notwendigkeit für
eine recD-Mutation vermieden wird (siehe auch Kowalczykowski et
al. (1994) „Biochemistry
of homologous recombination in Escherichia coli", Microbiol. Rev. 58: 401–465, und
Jessen et al. (1998) „Modification
of bacterial artificial chromosomes through Chi-stimulated homologous
recombination and its appli cation in zebrafish transgenesis." Proc. Natl. Acad.
Sci. 95: 5121–5126).
-
Die
Chi-Stellen sind wahlweise in Linker eingeschlossen, die mit den
Enden der transformierenden Fragmente ligiert sind, oder aber die
in die externen Primer eingebaut sind, die zur Herstellung von zu
transformierenden DNA-Fragmenten verwendet werden. Die Verwendung
von Rekombinations-stimulatorischen Sequenzen, wie bspw. der Chi-Stelle,
stellt einen allgemein nützlichen
Ansatz für
die Entwicklung eines breiten Bereiches von Zelltypen durch die
Fragmenttransformation dar.
-
Verfahren
zur Inhibierung oder zur Mutation von Analogen zu Exo V oder anderen
Nucleasen (wie bspw. Exonuclease I (endA1), III (nth), IV (nfo),
VII und VIII von E. coli) sind ebenfalls nützlich. Die Inhibierung oder
die Eliminierung von Nucleasen oder die Modifizierung von Enden
von zu transformierenden DNA-Fragmenten, um sie gegenüber der
Exonucleaseaktivität
resistent zu machen, findet in der Entwicklung eines breiten Bereiches
von Zelltypen Anwendung.
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Z. SHUFFLING FÜR DIE OPTIMIERUNG
UNBEKANNTER WECHSELWIRKUNGEN
-
Viele
beschriebene Merkmale sind das Ergebnis komplexer Wechselwirkungen
verschiedener Gene oder Genprodukte. Die meisten solcher Wechselwirkungen
sind immer noch uncharakterisiert. Dementsprechend ist es oftmals
unklar, welche Gene optimiert werden müssen, um ein erwünschtes
Merkmal zu erreichen, auch wenn manche der Gene, die zu dem Merkmal
beitragen, bekannt sind.
-
Diese
fehlende Charakterisierung ist während
des DNA-Shufflings
kein Thema, durch welches Lösungen
produziert werden, mit denen das optimiert wird, wonach selektiert
wird. Ein anderer Ansatz, durch welchen nicht nur dieses Problem
gelöst
werden könnte,
sondern auch zukünftige
Raten-limitierende Faktoren beseitigen könnte, ist die Komplementierung
durch die Überexpression
unbekannter Genomsequenzen.
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Eine
Bibliothek genomischer DNA wird zunächst, wie oben beschrieben,
hergestellt. Diese wird in die zu optimierende Zelle transformiert
und die Transformanten werden hinsichtlich Erhöhungen in einer erwünschten
Eigenschaft gescreent. Die genomischen Fragmente, die zu einer verbesserten
Eigenschaft führen,
werden durch DNA-Shuffling entwickelt, um deren wirkungsvollen Effekt
weiter zu erhöhen.
Bei diesem Ansatz wird keine Sequenzinformation oder irgendein Wissen
oder eine Annahme über
die Natur des Proteins oder von Weg-Wechselwirkungen benötigt, oder
sogar, welche Schritte Raten-begrenzend sind; dieses Verfahren beruht
lediglich auf der Detektion des erwünschten Phänotyps. Diese Art der Zufallsklonierung
und der nachfolgenden Entwicklung durch DNA-Shuffling von positiv
wechselwirkenden Genomsequenzen ist ein äußerst wirkungsvolles und generisches
Werkzeug. Eine Verschiedenheit von Quellen für die genomische DNA wird verwendet,
ausgehend von isogenen Stämmen
bis zu weiter entfernt verwandten Spezies mit möglicherweise erwünschten
Eigenschaften. Darüber
hinaus ist die Technik auch bei jeder Zelle anwendbar, für welche die
molekularbiologischen Grundlagen der Transformation und Klonierungsvektoren
verfügbar
sind, und für jede
Eigenschaft, die untersucht werden kann (vorzugsweise in einem Hochdurchsatzformat).
Wenn die entwickelte DNA optimiert ist, kann diese alternativ durch
homologe Rekombination oder zufallsbedingt durch Phagen-vermittelte,
stellenspezifische Rekombination in das Chromosom zurücküberführt werden.
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AA. HOMOLOGE REKOMBINATION
INNERHALB DES CHROMOSOMS
-
Die
homologe Rekombination innerhalb des Chromosoms wird verwendet,
um die Einschränkungen einer
Plasmid-basierten Entwicklung und die Größen-Beschränkungen zu umgehen. Die Strategie
ist ähnlich zu
derjenigen, die weiter oben für
das Shuffling von Genen innerhalb deren chromosomalen Kontext beschrieben
wurde, mit der Ausnahme, dass kein in vitro-Shuffling auftritt.
Anstelle dessen wird der Elternstamm mit Mutagenen, wie bspw. ultraviolettem
Licht oder Nitrosoguanidin, behandelt, und die verbesserten Mutanten werden
selektiert. Die verbesserten Mutanten werden gepoolt und aufgeteilt.
Die eine Hälfte
des Pools wird verwendet, um genomische Zufallsfragmente für die Klonierung
in einen homologen Rekombinationsvektor herzustellen. Zusätzliche
genomische Fragmente werden wahlweise aus verwandten Spezies mit
erwünschten
Eigenschaften abgeleitet. Die klonierten genomischen Fragmente werden
in die Genome der verbleibenden anderen Hälfte des mutierten Pools rekombiniert
und Varianten mit verbesserten Eigenschaften werden selektiert.
Diese werden einer weiteren Mutagenese-, Selektions- und Rekombinationsrunde
unterzogen. Auch dieser Prozess ist wiederum hinsichtlich der Verbesserung
jedes Gesamtzellbiokatalysatoren, für welches ein Rekombinationsvektor
und ein Assay entwickelt werden kann, gänzlich generisch. Auch hier
sollte wiederum bemerkt werden, dass vor dem Screening eine Rekombination
rekursiv durchgeführt
werden kann.
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BB. VERFAHREN FÜR DIE REKURSIVE
SEQUENZ-REKOMBINATION
-
Einige
Formate und Beispiele für
die rekursive Sequenz-Rekombination, die manchmal als DNA-Shuffling
oder molekulare Züchtung
bezeichnet wird, sind durch die vorliegenden Erfinder und Mitarbeiter
in parallel anhängigen
Anmeldungen beschrieben worden, Anwaltsaktenzeichen 16528A-014612,
eingereicht am 25. März
1996, PCT/US95/02126, angemeldet am 17. Februar 1995 (veröffentlicht
als WO 95/22625); Stemmer, Science 270, 1510 (1995); Stemmer et
al., Gene, 164, 49–53
(1995); Stemmer, Bio/Technology, 13, 549–553 (1995); Stemmer, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747–10751
(1994); Stemmer, Nature 370, 389–391 (1994); Crameri et al.,
Nature Medicine, 2 (1); 1-, (1996) und Crameri et al., Nature Biotechnology
14, 315–319
(1996).
-
Wie
in den 16 und 17 gezeigt,
stellt das DNA-Shuffling
für die
Entwicklung neuer komplexer Funktionen die schnellste Technologie
dar. Wie in 16, Abschnitt (A) gezeigt,
wird mit der Rekombination beim DNA-Shuffling die Anhäufung vieler
verschiedener günstiger
Mutationen in wenigen Zyklen erreicht. Im Gegensatz dazu – auf Grund
der hohen Frequenz von schädigenden
Mutationen relativ zu den günstigen
Mutationen – müssen iterative
Punktmutationen jeweils eine günstige
Mutation aufbauen, was konsequenterweise viele Zyklen notwendig
macht, um den gleichen Punkt zu erreichen. Wie in 16,
Abschnitt B gezeigt, ist das DNA-Shuffling ein paralleler Prozess,
bei welchem viele verschiedene Probleme unabhängig voneinander gelöst werden
können
und anschließend
kombiniert werden, eher als eine einfache lineare Sequenz einer
Mutationsanhäufung.
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1. In vitro-Formate
-
Ein
Format für
das in vitro-Shuffling ist in 1 dargestellt.
Die Anfangssubstrate für
die Rekombination stellen einen Pool verwandter Sequenzen dar. Die
X's in 1,
Abschnitt A zeigen, wo sich die Sequenzen unterscheiden. Die Sequenzen
können
DNA oder RNA sein und können
verschiedene Längen
aufweisen, in Abhängigkeit
von der Größe des Gens
oder des Fragments, welches rekombiniert oder wieder zusammengebaut
werden soll. Bevorzugte Sequenzen reichen von 50 bp bis 50 kb.
-
Der
Pool verwandter Substrate wird in überlappende Fragmente umgewandelt,
d.h. von ungefähr
5 bp bis 5 kb oder mehr, wie in 1, Abschnitt
B gezeigt. Oftmals reicht die Größe der Fragmente
von ungefähr 10
bp bis 1000 bp, und manchmal reicht die Größe der DNA-Fragmente von ungefähr 100 bp
bis 500 bp. Die Konversion kann durch eine Vielzahl verschiedener
Verfahren bewirkt werden, wie bspw. DNAaseI- oder RNAse-Verdau,
Zufalls-Shearing oder partieller Restriktionsenzymverdau. Alternativ
kann die Umwandlung der Substrate in Fragmente durch eine unvollständige PCR-Amplifizierung
von Substraten oder durch eine PCR, ausgehend von einem einzelnen
Primer, bewirkt werden. Alternativ können geeignete einzelsträngige Fragmente
auf einem Nucleinsäuren-Synthetisierer
hergestellt werden. Die Konzentration der Nucleinsäurefragmente
einer bestimmten Länge
und Sequenz ist oftmals weniger als 0,1% oder 1%/Gewicht der Gesamtnucleinsäure. Die
Anzahl der unterschiedlichen spezifischen Nucleinsäurefragmente
in der Mischung beträgt
gewöhnlich
mindestens ungefähr
100, 500 oder 1000.
-
Die
gemischte Population der Nucleinsäurefragmente wird in eine zumindest
teilweise einzelsträngige Form
konvertiert. Die Konversion kann durch Erhitzen auf ungefähr 80°C bis 100°C, bevorzugter
von 90°C
auf 96°C
bewirkt werden, um einzelsträngige
Nucleinsäurefragmente
zu bilden, mit anschließendem
Wiederausrichten. Die Konversion kann auch durch eine Behandlung
mit einem Einzelstrang-DNA-bindenden Protein oder dem recA-Protein
erzielt werden. Einzelsträngige
Nucleinsäurefragmente
mit Regionen einer Sequenzidentität mit anderen einzelsträngigen Nucleinsäurefragmenten
können
anschließend
durch Abkühlen
auf 4°C bis
75°C, und
vorzugsweise von 40°C
auf 65°C
wieder aneinander ausgerichtet werden. Die Renaturierung kann durch
das Hinzufügen
von Polyethylenglykol (PEG), anderen volumen-ausschließenden Reagenzien oder
Salzen beschleunigt werden. Die Salzkonzentration beträgt vorzugsweise
von 0 mM bis 200 mM, bevorzugter beträgt die Salzkonzentration von
10 mM bis 100 mM. Das Salz kann dabei KCl oder NaCl sein. Die Konzentration
von PEG beträgt
vorzugsweise von 0% bis 20%, bevorzugter von 5% bis 10%. Die sich
ausrichtenden Fragmente können
aus unterschiedlichen Substraten stammen, wie in 1,
Abschnitt C gezeigt. Die ausgerichteten Nucleinsäurefragmente werden in Gegenwart
einer Nucleinsäurepolymerase,
wie bspw. Taq oder Klenow oder korrekturlesenden Polymerasen, wie
bspw. pfu oder pwo, und dNTPs (d.h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP),
inkubiert. Wenn die Regionen mit Sequenzidentität groß sind, kann die Taq-Polymerase mit einer
Annealing-Temperatur von zwischen 45 bis 65°C verwendet werden. Wenn die
Gebiete der Identität
klein sind, kann die Klenow-Polymerase mit einer Annealing-Temperatur
von zwischen 20 bis 30°C
verwendet werden (Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), siehe
oben). Die Polymerase kann vor dem Annealing zu den Zufallsnucleinsäurefragmenten
hinzugefügt
wer den, oder aber gleichzeitig mit dem Annealing oder nach dem Annealing.
-
Das
Verfahren der Denaturierung, Renaturierung und Inkubation in Gegenwart
der Polymerase von überlappenden
Fragmenten, um eine Sammlung von Polynucleotiden herzustellen, die
unterschiedliche Permutationen von Fragmenten tragen, wird manchmal
als in vitro-Shuffling der Nucleinsäure bezeichnet. Dieser Zyklus
wird für
eine erwünschte
Anzahl an Runden wiederholt. Bevorzugt ist es, wenn der Zyklus von
2 bis 100 Mal wiederholt wird, bevorzugter wird die Sequenz 10 bis
40 Mal wiederholt. Die resultierenden Nucleinsäuren sind eine Familie doppelsträngiger Polynucleotide
von ungefähr
50 bp bis ungefähr
100 kb, vorzugsweise von 500 bp bis 50 kb, wie in 1,
Abschnitt D gezeigt. Die Population stellt Varianten der Ausgangssubstrate
dar, die eine wesentliche Sequenzidentität hierzu zeigen, die jedoch
auch an mehreren Stellen unterschiedlich sind. Die Population hat
mehr Mitglieder als die Ausgangssubstrate. Die Population der Fragmente,
die von dem Shuffling herrühren,
wird zur Transformation der Wirtszellen eingesetzt, wahlweise nach
Klonierung in einen Vektor.
-
Bei
einer Variation des in vitro-Shufflings können Untersequenzen der Rekombinations-Substrate durch
Amplifizierung der vollständigen
Sequenzen unter Bedingungen hergestellt werden, unter welchen eine wesentliche
Fraktion, typischerweise mindestens 20% oder mehr, an unvollständig erweiterten
Amplifizierungsprodukten produziert wird. Die Amplifizierungsprodukte,
einschließlich
der unvollständig
erweiterten Amplifizierungsprodukte, werden denaturiert und mindestens
einem zusätzlichen
Re-Annealing- und Amplifikationszyklus unterzogen. Diese Variation,
bei welcher durch zumindest einen Zyklus des Re-Annealings und der Amplifizierung eine
wesentliche Fraktion unvollständig
erweiterter Produkte bereitgestellt wird, wird als „Stuttering" bezeichnet. In der
nachfolgenden Amplifizierungsrunde richten sich die unvollständig erweiterten
Produkte wieder aneinander aus und starten die Erweiterung an unterschiedlichen
Sequenz-bezogenen Template-Spezies.
-
Bei
einer weiteren Variation wird eine Mischung aus Fragmenten mit einem
oder mehreren Oligonucleotiden versehen. Die Oligonucleotide können derart
ausgebildet sein, dass sie vorcharakterisierte Mutationen einer
Wildtyp-Sequenz enthalten, oder stellen natürlich Variationen zwischen
Individuen oder Spezies dar. Die Oligonucleotide schließen ferner
eine hinreichende Sequenz- oder strukturelle Homologie mit ein,
die solche Mutationen oder Variationen flankiert, durch welche ein
Annealing mit den Wildtyp-Fragmenten ermöglicht wird. Einige Oligonucleotide
können
Zufallssequenzen sein. Die Annealing-Temperaturen können in Abhängigkeit der Homologielänge angepasst
werden.
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Bei
einer weiteren Variation tritt die Rekombination in zumindest einem
Zyklus durch ein „Template-Switching" (Wechsel des Templates)
auf, so dass, wenn ein DNA-Fragment, das von einem Template abgeleitet
ist, dieses an der homologen Position eines verwandten, jedoch unterschiedlichen
Templates den Vorgang startet. Das Template-Switching kann durch
die Hinzufügung
von recA, rad51, rad55, rad57 oder anderen Polymerasen (bspw. viralen
Polymerasen, reverse Transkriptase) zu der Amplifizierungs-Mischung
induziert werden. Das Template-Switching kann ferner durch Erhöhen der
DNA-Templatekonzentration erhöht
werden.
-
Bei
einer weiteren Variation kann zumindest ein Amplifizierungszyklus
unter Verwendung einer Kollektion an überlappenden einzelsträngigen DNA-Fragmenten
verwandter Sequenzen und unterschiedlicher Längen durchgeführt werden.
Die Fragmente können
unter Verwendung eines einzelsträngigen
DNA-Phagen, wie bspw.
M13, hergestellt werden. Jedes Fragment kann mit der Polynucleotid-Kettenverlängerung
eines zweiten Fragments aus der Kollektion hybridisieren und den
Vorgang starten, wodurch Sequenz-rekombinierte Polynucleotide gebildet
werden. Bei einer weiteren Variation können ssDNA-Fragmente mit variabler
Länge aus einem
einzelnen Primer durch Vent- oder anderen DNA-Polymerasen auf einem
ersten DNA-Template hergestellt werden. Die einzelsträngigen DNA-Fragmente
werden als Primer für
ein zweites, Kunkel-Typ-Template verwendet, welches aus Uracilenthaltender,
zirkulärer
ssDNA besteht. Dies resultiert in verschiedene Substitutionen des
ersten Templates in das zweite. Siehe Levichkin et al., Mol. Biology
29, 572–577
(1995).
-
2. In vivo-Formate
-
(a). Plasmid-Plasmid-Rekombination
-
Die
Ausgangssubstrate für
die Rekombination sind eine Sammlung an Polynucleotiden, die variante Formen
eines Gens umfassen. Die varianten Formen zeigen oftmals eine substantielle
Sequenzidentität
miteinander, die ausreichend ist, um zwischen den Substraten eine
homologe Rekombination zuzulassen. Die Diversität zwischen den Polynucleotiden
kann natürlich
sein (bspw. allelische oder Spezies-Varianten), induziert (bspw.
fehlerhafte PCR) oder das Ergebnis einer in vitro-Rekombination
sein. Die Diversität
kann auch von der Neusynthese von Genen herrühren, die für natürliche Proteine mit einer alternativen
und/oder gemischten Codon-Verwendung kodieren. Es sollte eine zumindest
hinreichende Diversität
zwischen den Substraten bestehen, so dass die Rekombination unterschiedlichere
Produkte als das Ausgangsmaterial produzieren kann. Es muss mindestens
zwei Substrate geben, die sich in mindestens zwei Positionen unterscheiden.
Jedoch wird üblicherweise
eine Bibliothek von Substraten mit 103 bis
108 Mitgliedern eingesetzt. Der Grad der
Diversität hängt von
der Länge
des zu rekombinierenden Substrats ab sowie von dem Ausmaß des zu
entwickelnden funktionellen Austausches. Eine Diversität mit zwischen
0,1 bis 50% der Positionen ist typisch. Die unterschiedlichen Substrate
werden in die Plasmide eingebaut. Die Plasmide sind oftmals Standardklonierungsvektoren,
d.h. bakterielle Multikopien-Plasmide. Bei einigen nachstehend noch
zu beschreibenden Verfahren schließen die Plasmide jedoch Mobilisierungsfunktionen
mit ein. Die Substrate können
in die gleichen oder unterschiedliche Plasmide eingebaut werden.
Oftmals werden mindestens zwei unterschiedliche Typen von Plasmiden
mit unterschiedlichen Typen von Selektionsmarkern verwendet, um
eine Selektion hinsichtlich Zellen zu ermöglichen, die mindestens zwei
Vektorentypen enthalten. Wenn unterschiedliche Plasmidtypen eingesetzt werden,
können
die unterschiedlichen Plasmide auch aus zwei unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppen stammen,
um eine stabile Koexistenz zweier unterschiedlicher Plasmide innerhalb
der Zelle zu ermöglichen. Nichtsdestotrotz
können
Plasmide aus der gleichen Inkompatibilitätsgruppe innerhalb der gleichen
Zelle hinreichend lange koexistieren, um eine homologe Rekombination
zu ermöglichen.
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Plasmide,
die unterschiedliche Substrate enthalten, werden anfangs durch irgendein
Transfektionsverfahren (bspw. chemische Transformation, natürliche Kompetenz,
Elektroporation, virale Transduktion oder Biolistika) in prokaryotische
oder eukaryotische Zellen eingeführt.
Oftmals sind die Plasmide mit einer Konzentration nahe oder bei
einem Sättigungsgrad
vorhanden (mit Bezug auf eine maximale Transfektionskapazität), um die
Wahrscheinlichkeit zu erhöhen,
dass mehr als ein Plasmid in die gleiche Zelle aufgenommen wird.
Die Plasmide, die die verschiedenen Substrate enthalten, können gleichzeitig
oder in verschiedenen Runden transfiziert werden. So können bspw.
bei dem letzteren Ansatz Zellen mit einem ersten Aliquot eines Plasmids transfiziert
werden, die Transfektanten anschließend selektiert und vermehrt
werden und anschließend
wiederum mit einem zweiten Aliquot des Plasmids transfiziert werden.
-
Nachdem
die Plasmide in die Zellen eingeführt worden sind, tritt eine
Rekombination zwischen den Substraten, die rekombinante Gene herstellen
sollen, innerhalb der Zellen auf, die viele verschiedene Plasmide
enthalten, und zwar durch bloße
Vermehrung in den Zellen. Zellen, die jedoch lediglich ein Plasmid
aufgenommen haben, sind zu einer Rekombination nicht in der Lage
und der mögliche
Beitrag der Substrate auf solchen Plasmiden für die Entwicklung wird nicht
vollständig
ausgenutzt (obwohl diese Plasmide zu einem gewissen Ausmaß beitragen
können,
wenn sie in Mutatorzellen vermehrt werden oder anderweitig Punktmutationen
akkumulieren (bspw. durch eine Behandlung mit ultravioletter Strahlung)).
Die Entwicklungsrate kann dadurch gesteigert werden, indem man alle
Substrate bei der Rekombination teilnehmen lässt. Dies kann dadurch erreicht
werden, dass die transfizierten Zellen einer Elektroporation unterzogen
werden. Die Bedingungen für
eine Elektroporation sind die gleichen wie diejenigen, die gewöhnlicherweise
für die
Einführung
exogener DNA in Zellen verwendet wird (bspw. 1000–2500 Volt,
400 μF und
eine 1–2
mM Pause). Unter diesen Bedingungen werden die Plasmide zwischen
den Zellen ausgetauscht, wodurch die Teilnahme aller Substrate an der
Rekombination ermöglicht
wird. Darüber
hinaus können
die Rekombinationsprodukte weiteren Rekombinationsrunden miteinander
oder mit dem Originalsubstrat unterzogen werden. Die Entwicklungsrate
kann ferner durch die Verwendung eines konjugativen Transfers erhöht werden.
Systeme für
den konjugativen Transfer sind bei vielen Bakterien bekannt (E.
coli, P. aeruginosa, S. pneumoniae und H. influenzae), und können auch für den Transfer
von DNA zwischen Bakterien und Hefen oder zwischen Bakterien und
Säugetierzellen
verwendet werden.
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Um
den konjugativen Transfer auszunutzen, werden die Substrate in Plasmide
kloniert, die MOB-Gene tragen, und ferner werden tra-Gene in cis
oder in trans für
die MOB-Gene bereitgestellt. Der Effekt des konjugativen Transfers
ist zu der Elektroporation darin sehr ähnlich, dass es Plasmiden ermöglicht wird,
sich zwischen Zellen zu bewegen, und die Rekombination zwischen
irgendeinem Substrat und den Produkten vorheriger Rekombinationen
wird ermöglicht,
und zwar lediglich durch Vermehrung der Kultur. Die Details davon,
wie der konjugative Transfer in diesen Vektoren ausgenutzt wird,
werden nachstehend detaillierter beschrieben. Die Entwicklungsrate
kann auch durch Fusionieren von Protoplasten von Zellen gesteigert
werden, um einen Austausch der Plasmide oder Chromosomen zu induzieren.
Eine Fusion kann durch chemische Agenzien induziert werden, wie
bspw. PEG oder Viren oder virale Proteine, wie bspw. dem Influenzavirus-Hämagglutinin, HSV-1
gB und gD. Die Entwicklungsrate kann ferner durch die Verwendung
von Mutator-Wirtszellen gesteigert werden (bspw. MutL, S, D. T,
H und Ataxia telangiectasia menschliche Zelllinien).
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Alternativ
können
die Plasmide zusammen vermehrt werden, um eine Rekombination zu
fördern,
und anschließend
isoliert, gepoolt und wieder in die Zellen eingeführt werden.
Die Kombination der Plasmide ist in jeder Zelle unterschiedlich,
und die Rekombination erhöht
die Sequenzdiversität
innerhalb der Population weiter. Dies wird wahlweise rekursiv so
lange durchgeführt,
bis der gewünschte
Grad der Diversität
erreicht ist. Anschließend
wird die Population gescreent und selektiert, und dieser Prozess
wird wahlweise mit irgendwelchen ausgewählten Zellen/Plasmiden wiederholt.
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Die
Zeitspanne, über
die die Zellen vermehrt werden und eine Rekombination ermöglicht wird,
variiert selbstverständlich
mit dem Zelltyp, ist jedoch im Allgemeinen nicht kritisch, da sogar
ein kleiner Grad an Rekombination die Diversität relativ zum Ausgangsmaterial
wesentlich erhöhen
kann. Die Zellen, die Plasmide tragen, welche rekombinierte Gene
enthalten, werden einem Screening oder einer Selektion hinsichtlich
einer erwünschten
Funktion unterzogen. Wenn bspw. das zu entwickelnde Substrat ein
Arzneimittelresistenz-Gen enthält,
wird hinsichtlich der Arzneimittelresistenz selektiert. Zellen,
die das Screening oder die Selektion überleben, werden einer oder
weiteren Screening-/Selektionsrunden unterzogen, gefolgt von einer
Rekombination, oder aber können
direkt einer zusätzlichen
Rekombinationsrunde unterzogen werden.
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Die
nächste
Rekombinationsrunde kann durch mehrere unterschiedliche Formate,
unabhängig
von der vorherigen Runde, erreicht werden. So kann bspw. eine weitere
Rekombinationsrunde einfach durch Wiederaufnahme der Elektroporation
oder des Konjugations-vermittelten interzellulären Transfers der Plasmide, wie
oben beschrieben, bewirkt werden. Alternativ kann ein frisches Substrat
oder Substrate, das gleiche oder unterschiedliche zu den vorherigen
Substraten, in die Zellen transfiziert werden, welche die Selektion/das Screening überlebt
haben. Wahlweise werden die neuen Substrate in Plasmidvektoren eingeschlossen,
die einen unterschiedlichen Selektionsmarker tragen und/oder die
aus einer unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppe stammen, im Vergleich
zu den ursprünglichen
Plasmiden. Als eine weitere Alternative können die Zellen, die die Selektion/das
Screening überleben,
in zwei Subpopulationen aufgeteilt werden, und Plasmid-DNA aus einer
Subpopulation kann in die andere transfiziert werden, wobei die
Substrate von den Plasmiden aus den zwei Subpopulationen einer weiteren
Rekombinationsrunde unterzogen werden. In einer der letzteren beiden
Optionen kann die Entwicklungsrate durch Einsatz einer DNA-Extraktion,
Elektroporation, Konjugation oder durch Einsatz von Mutatorzellen,
wie oben beschrieben, erhöht
werden. In noch einer weiteren Variation kann DNA aus Zellen, die
das Screening/die Selektion überleben,
extrahiert und einem in vitro-DNA-Shuffling unterzogen werden.
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Nach
der zweiten Rekombinationsrunde wird eine zweite Screening-/Selektionsrunde
durchgeführt, vorzugsweise
unter Bedingungen mit steigender Stringenz. Wenn gewünscht, können weitere
Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden unter Verwendung
der gleichen Strategie für
die zweite Runde durchgeführt
werden. Mit aufeinander folgenden Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden
entwickeln sich die überlebenden
rekombinierten Substrate in Richtung Aneignung eines erwünschten
Phänotyps.
Typischerweise unterscheidet sich bei diesen und anderen Verfahren
der rekursiven Rekombination das Endprodukt der Rekombination, welches
den erwünschten
Phänotyp
erlangt hat, von den Ausgangssubstraten bei 0,1% bis 25% der Positionen
und hat sich mit einer Rate entwickelt, die um eine Größenordnung
im Überschuss
liegt (bspw. durch mindestens das Zehnfache, Hundertfache, Tausendfache
oder Zehntausendfache) im Vergleich zu der Rate einer natürlich erlangten
Mutation von ungefähr
einer Mutation pro 10–9 Positionen pro Generation
(siehe Anderson & Hughes,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 906–907 (1996)). Wie bei anderen hierin
beschriebenen Techniken können
die Rekombinationsschritte rekursiv durchgeführt werden, um vor dem Screening
die Diversität
zu verstärken.
Darüber
hinaus kann der gesamte Prozess auf eine rekursive Art und Weise
durchgeführt
werden, um erwünschte
Organismen, Klone oder Nucleinsäuren
herzustellen.
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3. Virus-Plasmid-Rekombination
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Die
Strategie, die für
eine Plasmid-Plasmid-Rekombination verwendet wurde, kann auch für eine Virus-Plasmid-Rekombination – gewöhnlicherweise
eine Phagen-Plasmid-Rekombination – eingesetzt werden. Jedoch
sind einige zusätzliche
Anmerkungen, insbesondere für
die Verwendung von Viren, angebracht. Die Ausgangssubstrate für die Rekombination
werden sowohl in Plasmid- als auch in virale Vektoren kloniert.
Gewöhnlicherweise
ist es nicht kritisch, welche Substrate in den viralen Vektor und
welche in das Plasmid eingefügt
werden, obwohl gewöhnlicherweise
der virale Vektor Substrate enthalten sollte, die sich von denen
des Plasmids unterscheiden. Wie zuvor enthält das Plasmid (und das Virus)
typischerweise einen Selektionsmarker. Das Plasmid und die viralen
Vektoren können,
wie oben beschrieben, durch Transfektion in die Zellen eingeführt werden.
Das effizientere Verfahren ist es jedoch, die Zellen mit dem Plasmid
zu transformieren, die Transformanten anschließend auszuwählen und im Anschluss daran
die Transformanten mit einem Virus zu infizieren. Da die Effizienz
der Infektion vieler Viren beinahe 100% der Zellen ausmacht, enthalten
die meisten Zellen, die auf diese Weise transformiert und infiziert
wurden, sowohl ein Plasmid als auch ein Virus, die unterschiedliche
Substrate tragen.
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Zwischen
dem Plasmid und dem Virus findet eine homologe Rekombination statt,
wodurch sowohl rekombinierte Plasmide als auch rekombinante Viren
entstehen. Bei einigen Viren, wie bspw. ein filamentöser Phage,
in welchen intrazelluläre
DNA sowohl in doppelsträngigen
als auch in einzelsträngigen
Formen existiert, gilt, dass beide DNA-Arten bei der Rekombination
teilnehmen können.
Vorausgesetzt, dass das Virus nicht ein Virus ist, das die Zellen
schnell tötet,
kann die Rekombination durch Verwendung der Elektroporation oder
Konjugation verstärkt
werden, um Plasmide zwischen den Zellen zu übertragen. Die Rekombination
kann bei einigen Virustypen auch dadurch verstärkt werden, dass die Nachkommenschaft
des Virus aus einer Zelle andere Zellen reinfizieren kann. Bei anderen
Virustypen zeigen Virus-infizierte Zellen eine Resistenz gegenüber einer Superinfektion.
Jedoch kann eine solche Resistenz dadurch überwunden werden, dass mit
einer hohen Vielzahl und/oder unter Verwendung von Mutantenstämmen des
Virus infiziert wird, in welchem die Resistenz gegenüber einer
Superinfektion reduziert ist. Eine rekursive Infektion und Transformation
vor dem Screening kann zur Verstärkung
der Diversität
durchgeführt
werden.
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Das
Ergebnis der Infektion Plasmid-enthaltender Zellen mit einem Virus
hängt von
der Natur des Virus ab. Einige Viren, wie bspw. filamentöse Phagen,
existieren in der Zelle mit dem Plasmid stabil und schleusen ferner
Nachkommen des Phagens aus der Zelle aus. Andere Viren, wie bspw.
das Lambda-Virus,
die ein Cosmid-Genom besitzt, existieren in einer Zelle wie Plasmide,
ohne Virionen-Nachkommenschaften zu bilden. Andere Viren, wie bspw.
der T-Phage und lytische Lambda-Phage, werden mit dem Plasmid einer
Rekombination unterzogen, jedoch töten diese Viren letztendlich
die Wirtszelle und zerstören
die Plasmid-DNA. Bei Viren, die Zellen, ohne den Wirt zu töten, infizieren,
können
Zellen, die rekombinante Plasmide und Viren enthalten, unter Verwendung
des gleichen Ansatzes wie für
die Plasmid-Plasmid-Rekombination gescreent/selektiert werden. Viren-Nachkommenschaften,
die durch Zellen ausgeschleust werden, die die Selektion/das Screening überleben,
können
auch gesammelt und als Substrate für nachfolgende Rekombinationsrunden
verwendet werden. Bei Viren, die deren Wirtszellen töten, liegen
die rekombinanten Gene, die aus der Rekombination herrühren, lediglich
in der Viren-Nachkommenschaft vor. Wenn bei dem Screening oder dem
Auswahlassay die Expression rekombinanter Gene in einer Zelle notwendig
ist, sollten die rekombinanten Gene von der Virus-Nachkommenschaft
auf einen anderen Vektor, bspw. einem Plasmidvektor, übertragen
und anschließend
in die Zellen retransfiziert werden, bevor die Selektion/das Screening
durchgeführt
wird.
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Bei
filamentösen
Phagen liegen die Produkte der Rekombination sowohl in den Zellen
vor, die die Rekombination überleben,
als auch in den Phagen, die aus diesen Zellen ausgeschleust werden.
Die zweifache Quelle der Rekombinationsprodukte sorgt für zusätzliche
Optionen im Vergleich zu der Plasmid-Plasmid-Rekombination. So kann bspw.
DNA aus Phagenpartikeln zur Verwendung in einer in vitro-Rekombinationsrunde isoliert
werden. Alternativ kann die Phagen-Nachkommenschaft dazu verwendet
werden, Zellen, die eine vorherige Screening-/Selektionsrunde überlebt
haben, zu transfizieren oder zu infizieren, oder aber frische Zellen, die
mit frischen Substraten für
die Rekombination transfiziert worden sind.
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4. Virus-Virus-Rekombination
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Die
Prinzipien, die für
die Plasmid-Plasmid- und Plasmid-Virus-Rekombination beschrieben
wurden, können
mit wenigen Modifikationen auch für die Virus-Virus-Rekombination
angewandt werden. Die Ausgangssubstrate für die Rekombination werden
in einen viralen Vektor kloniert. Gewöhnlicherweise wird der gleiche
Vektor für
alle Substrate verwendet. Vorzugsweise ist das Virus ein Virus,
das – entweder
auf natürlichem
Weg oder als Ergebnis einer Mutation – Zellen nicht tötet. Nach
der Insertion können
einige der viralen Genome in vitro verpackt werden. Die verpackten
Viren werden dazu verwendet, Zellen mit einer hohen Vielzahl derart
zu infizieren, dass die Wahrscheinlichkeit hoch ist, dass eine Zelle
eine Vielzahl von Viren mit unterschiedlichen Substraten aufnimmt.
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Nach
der Anfangsinfektionsrunde hängen
die nachfolgenden Schritte von der Natur der Infektion ab, wie zuvor
in dem vorherigen Abschnitt diskutiert wurde. Wenn bspw. die Viren
Phagemidgenome, wie bspw. Lambda-Cosmide oder M13-, F1- oder Fd-Phagemide
besitzen, verhalten sich die Phagemide innerhalb der Zelle als Plasmide
und werden einfach durch Vermehrung der Zellen einer Rekombination
unterzogen. Die Rekombination und die Sequenzdiversität kann durch
Elektroporation der Zellen verstärkt
werden. Nach der Selektion/dem Screening können Cosmide, die die rekombinanten
Gene enthalten, aus den überlebenden
Zellen selektiert werden (bspw. durch Hitzeinduktion einer cos–-lysogenen
Wirtszelle), in vitro wiederverpackt werden und dazu eingesetzt
werden, frische Zellen mit einer hohen Vielzahl für eine weitere
Kombinationsrunde zu infizieren.
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Wenn
die Viren filamentöse
Phagen sind, wird die Rekombination der replizierenden DNA-Form
durch Vermehren der Kultur infizierter Zellen vollzogen. Durch eine
Selektion/ein Screening können
Kolonien von Zellen identifiziert werden, die virale Vektoren mit
rekombinanten Genen mit verbesserten Eigenschaften besitzen, zusammen
mit den Phagen, die aus solchen Zellen ausgeschleust werden. Die
sich anschließenden Möglichkeiten
sind im Wesentlichen die gleichen wie für die Plasmid-Virus-Rekombination.
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5. Chromosomen-Plasmid-Rekombination
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Dieses
Format kann dazu eingesetzt werden, sowohl chromosomale als auch
Plasmid-getragene Substrate zu entwickeln. Das Format ist insbesondere
in Situationen nützlich,
in denen viele chromosomale Gene zu einem Phänotyp beitragen, oder in denen
die exakte Lokalisierung der zu entwickelnden chromosomalen Gene
nicht bekannt ist. Die Ausgangssubstrate für die Rekombination werden
in einen Plasmidvektor kloniert. Wenn die zu entwickelnden chromosomalen
Gene bekannt sind, stellen die Substrate eine Familie an Sequenzen
dar, die einen hohen Grad an Sequenzidentität aufweisen, die sich jedoch
in gewisser Weise von den chromosomalen Genen unterscheiden. Wenn
die zu entwickelnden chromosomalen Gene nicht lokalisiert wurden, stellen
die Ausgangssubstrate gewöhnlicherweise
eine Bibliothek an DNA-Segmenten dar, von denen lediglich eine kleine
Anzahl eine Sequenzidentität
gegenüber
dem Gen oder den Genen zeigen, die entwickelt werden sollen. Eine
Divergenz zwischen Plasmidgetragenem Substrat und dem chromosomalen
Gen/Genen kann durch Mutagenese oder dadurch induziert werden, dass
die Plasmidgetragenen Substrate aus einer Spezies gewonnen werden,
die im Vergleich zu den Zellen, die das Chromosom tragen, unterschiedlich
ist.
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Die
Plasmide, die die Substrate für
die Rekombination tragen, werden in Zellen mit den zu entwickelnden
chromosomalen Genen transfiziert. Die Entwicklung kann einfach durch
Vermehren der Kultur vonstatten gehen und kann durch Transferieren
der Plasmide zwischen den Zellen durch Konjugation, Elektroporation oder
Protoplastenfusion beschleunigt werden. Die Entwicklung kann ferner
durch die Verwendung von Mutator-Wirtszellen
oder durch Ansäen
einer Kultur von Nicht-Mutator-Wirtszellen
beschleunigt werden, die mit den Mutator-Wirtszellen entwickelt werden, und durch
die Induktion des interzellulären
Transfers von Plasmiden durch Elektroporation, Konjugation oder
Protoplastenfusion. Alternativ kann eine rekursive Isolation und
Transformation eingesetzt werden. Die Mutator-Wirtszellen, die für das Ansäen eingesetzt
werden, enthalten vorzugsweise einen negativen Selektionsmarker,
um die Isolierung einer Reinkultur der Nicht-Mutatorzellen, die entwickelt
werden sollen, zu erleichtern. Mit einer Selektion/einem Screening
können
die Zellen identifiziert werden, die die Chromosomen und/oder Plasmide
tragen, die sich in Richtung Aneignung einer erwünschten Funktion entwickelt
haben.
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Daran
schließen
sich Rekombinations- und Selektions-/Screening-Runden an, und zwar
auf ähnliche Weise
wie diejenigen, die für
die Plasmid-Plasmid-Rekombination beschrieben wurden. So kann bspw.
eine weitere Rekombination dadurch bewirkt werden, dass die Zellen,
die die Rekombination überlebt
haben, in Kombination mit Elektroporation, konjugativem Transfer
der Plasmide oder Protoplastenfusion vermehrt werden. Alternativ
können
die Plasmide, die die zusätzlichen
Substrate für
die Rekombination tragen, in die überlebenden Zellen eingeführt werden.
Solche Plasmide sind vorzugsweise von einer unterschiedlichen Inkompatibilitätsgruppe
und tragen einen Selektionsmarker, der zu den ursprünglichen
Plasmiden unterschiedlich ist, um eine Selektion hinsichtlich Zellen
zu ermöglichen,
die mindestens zwei unterschiedliche Plasmide tragen. Als eine weitere
Alternative kann Plasmid- und/oder chromosomale DNA aus einer Subpopulation überlebender
Zellen isoliert und in eine zweite Subpopulation transfiziert werden.
Chromosomale DNA kann vor der Transfektion in einen Plasmidvektor
kloniert werden.
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6. Virus-Chromosomen-Rekombination
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Wie
bei den weiter oben beschriebenen Verfahren ist der Virus normalerweise
ein Virus, der die Zellen nicht tötet, und stellt oftmals ein
Phage oder ein Phagemid dar. Das Verfahren ist im Wesentlichen das
gleiche wie für
die Plasmid-Chromosomen-Rekombination.
Die Substrate für
die Rekombination werden in den Vektor kloniert. Vektoren, die die
Substrate mit einschließen,
können
anschließend
in die Zellen transfeziert oder in vitro verpackt und anschließend durch
eine Infektion in die Zellen eingeführt werden. Die viralen Genome
rekombinieren durch bloßes
Vermehren einer Kultur mit den Wirts-Chromosomen. Die Entwicklung
kann dadurch beschleunigt werden, dass ein interzellulärer Transfer
der viralen Genome durch Elektroporation oder durch Reinfektion
der Zellen mit Nachkommenschaft-Virionen
ermöglicht
wird. Durch Screening/Selektieren können Zellen mit Chromosomen
und/oder viralen Genomen identifiziert werden, die sich in Richtung
Aneignung einer erwünschten
Funktion entwickelt haben.
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Es
gibt mehrere Optionen für
nachfolgende Rekombinationsrunden. So können bspw. virale Genome zwischen
Zellen transferiert werden, die die Selektion/Rekombination überlebt
haben, und zwar durch rekursive Isolation und Transfektion sowie
Elektroporation. Alternativ können
Viren, die aus den Zellen, die die Selektion/das Screening überlebt
haben, gepoolt werden und zur Superinfektion der Zellen mit hoher
Vielzahl eingesetzt werden. Alternativ können frische Substrate zur
Rekombination in die Zellen eingeführt werden, entweder auf einem
Plasmid oder auf viralen Vektoren.
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CC. POOL-WEISE GESAMTGENOM-REKOMBINATION
-
Die
asexuelle Evolution ist ein langsamer und ineffizienter Prozess.
Die Populationen bewegen sich eher als Indivi duen als als eine Gruppe.
Eine diverse Population wird durch Mutagenese eines einzelnen Elternteils
hergestellt, was zu einer Verteilung von fitten und unfitten Individuen
führt.
In Abwesenheit eines sexuellen Zyklus bleibt jedes Stück genetischer
Information für
die überlebende
Population in den einzelnen Mutanten. Die Auswahl der Fittesten
resultiert in viele fitte Individuen, die verworfen werden, zusammen
mit der genetisch nützlichen
Information, die sie tragen. Die asexuelle Evolution macht einen
genetischen Ereignisschritt pro Zeit und ist daher durch den intrinsischen
Wert eines einzigen genetischen Ereignisses beschränkt. Die
sexuelle Evolution entwickelt sich schneller und effizienter. Die
Paarung innerhalb einer Population vereinigt die genetische Information
innerhalb der Population und resultiert in der Kombination nützlicher
Informationen. Die Kombination aus nützlichen genetischen Informationen
resultiert in eine Nachkommenschaft, die bedeutend fitter als ihre
Elternteile ist. Die sexuelle Entwicklung schreitet daher durch
vielfache genetische Ereignisse viel schneller fort. Diese Unterschiede
sind ferner in 17 dargestellt. Im Gegensatz
zur sexuellen Entwicklung ist das DNA-Shuffling die rekursive Mutagenese,
Rekombination und Selektion von DNA-Sequenzen (siehe auch 25).
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Eine
sexuelle Rekombination in der Natur bewirkt die paarweise Rekombination
und resultiert in eine Nachkommenschaft, die genetische Hybride
zweier Elternteile darstellt. Im Gegensatz dazu bewirkt das in vitro-DNA-Shuffling
die pool-weise Rekombination,
in welcher die Nachkommenschaft Hybride einer Vielzahl von Elternteilmolekülen sind.
Dies liegt darin, dass das DNA-Shuffling viele einzelne paarweise
Rekombinationsereignisse mit jedem thermalen Zyklus bewirkt. Nach
vielen Zyklen ist das Ergebnis eine repetitiv gezüchtete Population,
wobei die „Nachkommenschaft" das Fx (für X Zyklen
an Wiederneuanordnung) der ursprünglichen
Elternteilmoleküle
ist. Diese Nachkommenschaft sind potentielle Nachfahren vieler oder
aller der ursprünglichen
Elternteile. Das in 25 gezeigte Diagramm
zeigt eine Darstellung der möglichen
Anzahl an Mutationen, die ein Individuum durch aufeinander folgende,
paarweise und pool-weise Rekombination ansammeln kann.
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Die
pool-weise Rekombination ist ein wichtiges Merkmal des DNA-Shufflings,
da es ein Mittel zur Herstellung eines größeren Anteils an möglichen
Kombinationen der Mutationen aus einem einzelnen „Züchtungs"-Experiment bereitstellt.
Auf diese Weise kann das „genetische
Potential" einer
Population einfach durch Screenen der Nachkommenschaft eines einzelnen
DNA-Shuffling-Experiments
beurteilt werden.
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Wenn
bspw. eine Population aus 10 einzelnen mutanten Elternteilen besteht,
gibt es 210 = 1024 mögliche Kombinationen dieser
Mutationen, die sich auf eine Nachkommenschaft mit 0–10 Mutationen
belaufen. Von diesen 1024 Kombinationen werden lediglich 56 aus
einer einzelnen paarweisen Kreuzung resultieren (14) (d.h. diejenige, die 0, 1 und 2 Mutationen
tragen). In der Natur werden die multiparenteralen Kombinationen
schließlich
nach einer Vielzahl von zufälligen
sexuellen Paarungen entstehen, unter der Annahme, dass keine Selektion
stattfindet, um einige Mutationen aus der Population zu entfernen.
Auf diese Weise beeinflusst der sexuelle Zyklus den Zusammenbau
und das Sammeln aller nützlicher
Mutantenkombinationen, die innerhalb einer Population möglich sind.
Zu dem Zwecke einer gerichteten Evolution ist es wünschenswert, dass
die größte Anzahl
an Mutantenkombinationen in einem Screen oder einer Selektion erfasst
wird, so dass die beste Nachkommenschaft (d.h. gemäß den Auswahlkriterien,
die in dem Auswahlscreen verwendet werden) innerhalb kürzester
Zeit identifiziert werden kann.
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Eine
Herausforderung für
das in vivo- und Gesamtgenom-Shuffling ist es, Verfahren zur Auslösung der pool-weisen
Rekombination oder zu vielfachen repetitiven paarweisen Rekombinationsereignissen
auszudenken. Bei Kreuzungen mit einer einzelnen paarweisen Kreuzung
pro Zyklus vor dem Screening ist die Fähigkeit, das „genetische
Potential" der Ausgangspopulation
zu screenen, begrenzt. Aus diesen Gründen wäre die Rate der durch in vivo-
und Gesamtgenom-Shufflings vermittelten zellulären Evolution durch das Bewirken
einer pool-weisen Rekombination erleichtert. Nachstehend sind zwei
Strategien für
die pool-weise Rekombination beschrieben
(Protoplastenfusion und Transduktion).
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1. Protoplastenfusion:
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Das
durch die Protoplastenfusion (wie oben diskutiert) vermittelte Gesamtgenom-Shuffling
(WGS) stellt ein Format dar, welches direkt eine pool-weise Rekombination
bewirken kann. Das Shuffling ganzer Gene ist die rekursive Rekombination
gesamter Genome, und zwar in Form einer oder mehrerer Nucleinsäuremoleküle (Fragmente,
Chromosomen, Episome, etc.), aus einer Population eines Organismus,
was zu der Produktion neuer Organismen führt, die eine verteilte genetische
Information von mindestens zwei Ausgangspopulationen der Organismen
besitzen. Das Verfahren der Protoplastenfusion ist ferner in 26 dargestellt.
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Aus
der Fusion vielfacher Elternprotoplasten sind Nachkommenschaften
beobachtet worden (Hopwood & Wright,
1978), jedoch sind diese Nachkommenschaften selten (10–4–10–6).
Die niedrige Frequenz ist auf die Verteilung der fusionierten Zellen
zurückzuführen, die
aus zwei, drei, vier, etc. Elternteilen herrühren und aus der Ähnlichkeit
der vielfachen Rekombinationsereignisse (6 Crossovers bei vier Elternteilen-Kreuzungen),
die bei einer Nachkommenschaft mit verschiedenen Elternteilen entstehen
müsste.
Aus diesen Gründen ist
es nützlich,
die Nachkommenschaft mit vielen verschiedenen Elternteilen anzureichern.
Dies kann bspw. durch eine repetitive Fusion oder eine Anreicherung
hinsichtlich vielfach fusionierter Protoplasten erreicht werden.
Das Verfahren der pool-weisen Fusion und Rekombination ist ferner
in 27 dargestellt.
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2. Repetitive Fusion:
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Aus
identifizierten Elternzellen werden Protoplasten hergestellt, fusioniert
und regeneriert. Die Protoplasten der regenerierten Nachkommenschaft
werden anschließend – ohne ein
Screening oder eine Anreicherung – gebildet, fusioniert und
regeneriert. Dies kann vor dem Screening über zwei, drei oder mehrere
Zyklen hinweg durchgeführt
werden, um die Vertretung einer Nachkommenschaft mit vielen Elternteilen
zu erhöhen. Die
Anzahl der möglichen
Mutationen/Nachkommenschaft verdoppelt sich in jedem Zyklus. Wenn
bspw. eine Kreuzung hauptsächlich
eine Nachkommenschaft mit 0, 1 und 2 Mutationen verursacht, so wird
eine Züchtung dieser
Population mit sich selber eine Nach kommenschaft mit 0, 1, 2, 3
und 4 Mutationen produzieren (15),
die dritte Kreuzung auf acht, etc. Die Vertretung der Nachkommenschaft
mit vielen verschiedenen Elternteilen aus diesen nachfolgenden Kreuzungen
wird nicht so hoch wie die einzelne und doppelte Elternteil-Nachkommenschaft
sein, wird jedoch detektierbar sein und bedeutend höher als
von einer einzelnen Kreuzung. Die repetitive Fusion vor dem Screenen
ist analog zu vielen sexuellen Kreuzungen innerhalb einer Population,
und die einzelnen thermalen Zyklen des in vitro-DNA-Shufflings sind oben
stehend beschrieben. Ein Faktor, der den Wert dieses Ansatzes beeinflusst,
ist die Ausgangsgröße der parenteralen
Population. Wenn die Population wächst, wird es wahrscheinlicher,
dass eine Fusion mit vielen verschiedenen Elternteilen aus repetitiven
Fusionen entstehen wird. Wenn bspw. 4 Elternteile zweimal fusioniert
werden, werden die 4-Elternteil-Nachkommenschaften
bis zu ungefähr
0,2% der Gesamtnachkommenschaft ausmachen. Dies reicht für das Auffrischen
in einer Population von 3000 (95% Konfidenz) aus, jedoch ist eine
bessere Vertretung bevorzugt. Wenn 10 Elternteile zweimal fusioniert
werden, werden mehr als 20% der Nachkommenschaft die Nachkommen
von vier Elternteilen sein.
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3. Anreicherung hinsichtlich
vielfach fusionierter Protoplasten:
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Nach
der Fusion einer Population von Protoplasten werden die fusionierten
Zellen typischerweise in einem hypotonen Medium verdünnt, um
das fusionierende Agens herauszuverdünnen (bspw. 50% PEG). Die fusionierten
Zellen können über einen
kurzen Zeitraum hinweg wachsen gelassen werden, um die Zellwände zu regenerieren,
oder aber direkt getrennt und anschließend, basierend auf der Größe, getrennt
werden. Dies wird bspw. durch eine Zellsortierung durchgeführt, unter
Verwendung der Lichtdispersion als eine Größeneinschätzung, um die größten fusionierten
Zellen zu isolieren. Alternativ können die fusionierten Zellen
durch FACS auf Basis des DNA-Gehalts sortiert werden. Die großen fusionierten
Zellen oder diejenigen, die mehr DNA enthalten, resultieren aus
der Fusion vieler verschiedener Elternteile und teilen sich mit
größerer Wahrscheinlichkeit
in eine Nachkommenschaft mit vielen verschiedenen Elternteilen auf.
Die angereicherten fusionierten Zellen werden regeneriert und direkt
gescreent, oder aber die Nachkommenschaft wird rekursiv, wie weiter
oben beschrieben, fusioniert, um die Population hinsichtlich diverser
Mutantenkombinationen anzureichern.
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4. Transduktion:
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Die
Transduktion kann die pool-weise Rekombination theoretisch beeinflussen,
wenn die transduzierenden Phagenpartikel eher hauptsächlich wirtsgenomische
DNA als Phagen-DNA enthalten. Wenn die Phagen-DNA überrepräsentiert
ist, werden die meisten Zellen zumindest ein unerwünschtes
Phagengenom empfangen. Die Phagenpartikel, die aus einem Locked-in-Prophagen (siehe
oben) hergestellt wurden, sind für
diesen Zweck geeignet. Eine Zellpopulation wird mit einem geeigneten
transduzierenden Phagen infiziert, das Lysat gesammelt und dazu
verwendet, die gleiche Ausgangspopulation zu infizieren. Eine hohe
Vielzahl an Infektionen wird eingesetzt, um viele genomische Fragmente
in jede infizierte Zelle einzuschleusen, wodurch die Chance erhöht wird,
Rekombinanten zu produzieren, die Mutationen von mehr als zwei Elternteilgenomen
enthalten. Die resultierenden Transduktanten werden unter Bedingungen
gewonnen, unter welchen sich die Phagen nicht vermehren können, bspw.
in Gegenwart von Citrat. Diese Population wird anschließend direkt
gescreent oder wiederum mit Phagen infiziert, wobei die resultierenden
transduzierenden Partikel dazu eingesetzt werden, die erste Nachkommenschaft
zu transduzieren. Dies würde
die rekursive Protoplastenfusion, die mehrfache sexuelle Rekombination
sowie das in vitro-DNA-Shuffling nachahmen.
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HH. MULTI-ZYKLEN-REKOMBINATION
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Wie
weiter oben bemerkt, stellt die Protoplastenfusion ein effizientes
Mittel für
die Rekombination zweier mikrobieller Genome dar. Das Verfahren
resultiert reproduzierbar in ungefähr 10% einer nicht-selektierten Population,
die rekombinante chimäre
Organismen darstellt.
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Protoplasten
sind Zellen, bei welchen die Zellwände durch Behandlung in einem
hypotonen Medium mit Zellwandverdauenden Enzymen entfernt wurde.
Die Protoplastenfusion ist die induzierte Fusion der Membranen von
zwei oder mehrerer dieser Protoplasten mittels fusogener Agenzien,
wie bspw. Polyethylenglykol. Die Fusion resultiert in das Vermischen
von Cytoplasma und versammelt die Genome der fusionierten Zellen innerhalb
der gleichen Membran. Unter diesen Bedingungen ist die Rekombination
zwischen den Genomen häufig.
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Die
fusionierten Protoplasten werden regeneriert, und während der
Zellteilung teilen sich die einzelnen Genome in jeweils eine Tochterzelle
auf. Typischerweise besitzen 10% dieser Tochterzellen Genome, die
teilweise von mehr als einem der ursprünglichen parenteralen Protoplastengenome
stammen.
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Dieses
Ergebnis ist ähnlich
zu dem Crossing-over von Schwesterchromatiden in eukaryotischen
Zellen während
der Prophase der Meiose II. Der Prozentsatz an Tochterzellen, die
rekombinant sind, ist nach der Protoplastenfusion etwas niedriger.
Während
die Protoplastenfusion in eine effiziente Rekombination resultiert, tritt
die Rekombination hauptsächlich
zwischen zwei Zellen wie bei der sexuellen Rekombination auf.
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Um
effizient Bibliotheken ganzer zusammengesetzter Genome zu generieren,
werden Tochterzellen mit einer genetischen Information hergestellt,
die aus verschiedenen Elternteilen herrührt.
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Das
in vitro-DNA-Shuffling resultiert in die effiziente pool-weise Rekombination
verschiedener homologer DNA-Sequenzen.
Die Wiederneuanordnung vollständiger
Gene aus einem gemischten Pool kleiner Gen-Fragmente macht viele
Annealing- und Verlängerungszyklen
notwendig, nämlich
die thermalen Zyklen der Primer-losen PCR-Reaktion. Während jedes
thermalen Zyklus richten sich Fragmentpaare aneinander aus und werden
verlängert,
um eine kombinatorische Population größerer chimärer DNA-Fragmente zu bilden. Nach dem ersten
Zyklus der Wiederanordnung enthalten die chimären Fragmente Sequenzen, die
aus zwei unterschiedlichen parenteralen Genen herrühren. Dies
ist ähnlich
zu dem Ergebnis eines einzelnen sexuellen Zyklus innerhalb einer
Population, einer paarweisen Kreuzung oder einer Protoplastenfusion.
Während
des zweiten Zyklus können
diese chimären
Fragmente aneinander ausgerichtet werden, oder mit anderen kleinen Fragmenten,
was in Chimären
resultiert, die von bis zu vier unterschiedlichen parenteralen Sequenzen
herrühren.
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Dieser
zweite Zyklus ist analog zu der gesamten Nachkommenschaft aus einer
einzigen sexuellen Kreuzungs-Inzucht. Weitere Zyklen werden in Chimären resultieren,
die aus 8, 16, 32 etc. parenteralen Sequenzen herrühren und
die zu weiteren Inzuchten der Nachkommenschaftpopulation analog
sind. Die hohe Nützlichkeit
des in vitro-DNA-Shufflings liegt darin, dass eine große kombinatorische
Bibliothek aus einem einzelnen Pool von DNA-Fragmenten hergestellt
werden kann, welche durch diese rekursiven paarweisen „Paarungen" wieder zusammengebaut
sind. Wie oben beschrieben, resultieren in vivo-Shuffling-Strategien,
wie bspw. die Protoplastenfusion, in einer einzigen paarweisen Paarungsreaktion.
Daher werden, um den Grad der Diversität, der durch die in vitro-Verfahren
erhalten wird, herzustellen, in vivo-Verfahren rekursiv durchgeführt. Dies
bedeutet, dass ein Pool von Organismen rekombiniert und die Nachkommenschaft
gepoolt wird, und zwar ohne Selektion, und anschließend wiederum
rekombiniert wird. Dieses Verfahren wird über mehrere hinreichende Zyklen
wiederholt, was in eine Nachkommenschaft resultiert, die viele parenterale
Sequenzen besitzt.
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Nachstehend
beschrieben ist ein Verfahren, welches zur Neuzusammensetzung von
vier Stämmen von
Streptomyces coelicolor verwendet wird. Ausgehend von den ursprünglichen
vier Stämmen,
von denen jeder einen besonderen Nährstoffmarker enthält, waren
drei bis vier Runden einer rekursiven gepoolten Protoplastenfusion
hinreichend, um eine Population an neu zusammengesetzten Organismen
zu schaffen, die alle 16 möglichen
Kombinationen der vier Marker enthielten. Dies stellt eine 106-fache Verbesserung bei der Herstellung
der vier Elternnachkommenschaften dar, im Vergleich zu einer einzelnen
gepoolten Fusion der vier Stämme.
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Wie
in 31 gezeigt, werden die Protoplasten aus mehreren
Stämmen
von S. coelicolor hergestellt, gepoolt und fusioniert. Das Myzel
wird regeneriert und zur Sporulation gebracht. Die Sporen werden
gesammelt, anschließend
das Wachstum in Myzel zugelassen, Protoplasten geformt, gepoolt
und fusioniert, und der Prozess anschließend für drei bis vier Runden wiederholt.
Die resultierenden Sporen wurden dann einem Screening unterzogen.
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Das
zugrunde liegende Protokoll zur Herstellung einer neu zusammengesetzten
Gesamtgenom-Bibliothek aus vier S. coelicolor-Stämmen, von denen jeder einen
von vier unterschiedlichen Markern trägt, lautete wie folgt. Vier
Myzelkulturen, von denen jede einen Stamm mit einem von vier unterschiedlichen
Markern darstellte, wurden bis in die frühe stationäre Phase kultiviert. Das Myzel
aus jeder der Kulturen wurde durch Zentrifugation geerntet und gewaschen.
Die Protoplasten aus jeder Kultur wurden wie folgt hergestellt.
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Ungefähr 109 S. coelicolor-Sporen wurden in 50 ml YEME
mit 0,5% Glycin in einem 250-ml-Kolben beimpft. Die Sporen wurden
bei 30°C über 36 bis
40 Stunden in einem Rundschüttler
inkubiert. Das Myzel wurde unter Verwendung eines Mikroskops verifiziert.
Einige Stämme
benötigten
einen zusätzlichen
Wachstumstag. Die Kultur wurde in ein 50-ml-Röhrchen überführt und 10 Minuten bei 4000
rpm zentrifugiert. Das Myzel wurde zweimal mit 10,3% Sucrose gewaschen
und 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert (das Myzel kann nach dem
Waschen bei –80°C aufbewahrt
werden). Anschließend
wurden 5 ml Lysozym zu dem ~0,5 g schweren Myzel-Pellet hinzugefügt. Das
Pellet wurde suspendiert und 20 bis 60 Minuten bei 30°C unter vorsichtigem Rühren alle
10 Minuten inkubiert. Alle 20 Minuten wurde die Protoplastenbildung
durch ein Mikroskop kontrolliert. Sobald der Großteil Protoplasten darstellte,
wurde die Protoplastenbildung durch Hinzufügung von 10 ml P-Puffer gestoppt.
Die Protoplasten wurden durch Baumwolle gefiltert und 7 Minuten
bei Raumtemperatur bei 3000 rpm abzentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und die Protoplasten vorsichtig resuspendiert, indem
eine geeignete Menge an P-Puffer im Verhältnis zu der Pelletgröße (gewöhnlich etwa
500 μl)
hinzugefügt wurde.
In P-Puffer wurden
Zehnfach-Reihenverdünnungen
hergestellt, und die Protoplasten mit einer 10–2-Verdünnung ausgezählt. Die
Protoplasten wurden auf 1010 Protoplasten
pro ml eingestellt.
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Die
Protoplasten aus jeder Kultur wurden mikroskopisch quantifiziert.
108 Protoplasten aus jeder Kultur wurden
im gleichen Röhrchen
gemischt, gewaschen und anschließend durch das Hinzufügen von
50% PEG fusioniert. Die fusionierten Protoplasten wurden verdünnt und
im Regenerationsmedium ausplattiert, sowie anschließend so
lange inkubiert, bis die Kolonien sporulierten (vier Tage). Die
Sporen wurden geerntet und gewaschen. Diese Sporen stellen einen
Pool aller Rekombinanten und Elternteile aus der Fusion dar. Eine
Probe der gepoolten Sporen wurde dazu verwendet, eine einzelne Flüssigkultur
zu beimpfen. Die Kultur wurde bis zur frühen stationären Phase kultiviert, das Myzel
geerntet und die Protoplasten hergestellt. 108 Protoplasten aus
dieser „Myzel-Bibliothek" wurden anschließend mit
sich selber fusioniert, und zwar durch Hinzufügen von 50% PEG. Die Schritte
zur Protoplastenfusion/Regeneration/Ernten/Protoplastenherstellung
wurden zweimal wiederholt. Die Sporen, die aus der vierten Fusionsrunde
herrührten,
wurden als die „neu
zusammengesetzte Gesamtgenom-Bibliothek" betrachtet und diese wurden hinsichtlich
der Häufigkeit
der 16 möglichen
Kombinationen der vier Marker gescreent. Die Ergebnisse aus jeder
Fusionsrunde sind in 33 und in der nachstehenden
Tabelle gezeigt.
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Die
Ergebnisse des Shuffling-Verfahrens sind in 33 wiedergegeben.
Im Einzelnen wurde festgestellt, dass – wenn Rekombinationsrunden
vor einer Selektion hinzugefügt
werden – ein
bedeutender Anstieg in der Anzahl der Klone erzielt wurde, die alle
vier der relevanten Selektionsmarker eingebaut hatten, was darauf
hindeutet, dass die Population ansteigend divers wurde, und zwar
durch das rekursive Poolen und die Sporulation. Zusätzliche
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.
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Die
vier Stämme
der vier Elternteile-Shufflings waren jeweils auxotroph für drei und
prototroph für
eine von vier möglichen
Nährstoffmarkern:
Arginin (A), Cystein (C), Prolin (P) und/oder Uracil (U). Die Sporen
aus jeder Fusion wurden in jeder der 16 möglichen Kombinationen dieser
vier Nährstoffe
ausplattiert und der Prozentsatz der Population, die auf einem besonderen
Medium wuchs, wurde als das Verhältnis
dieser Kolonien von einer selektiven Platte berechnet, im Verhältnis zu
denjenigen, die auf einer Platte mit allen vier Nährstoffen
wachsen (alle Varianten wachsen auf dem Medium mit allen vier Nährstoffen,
so dass die Kolonien von dieser Platte die gesamte lebensfähige Population
darstellen). Die korrigierten Prozentsätze für jedes der Phänotypen
mit keinem, einem, zwei und drei Markern wurde durch Abziehen des
Prozentsatzes an Zellen bestimmt, welche zusätzliche Marker besitzen, die
auf dem Medium mit „unnötigen" Nährstoffen
wachsen könnten.
So wurde bspw. die Anzahl der Kolonien, die auf keinen zusätzlichen
Nährstoffen
(prototroph) wuchsen, von der Anzahl der Kolonien abgezogen, die
auf jeder Platte wuchsen, die Nährstoffe
benötigten.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele sollen lediglich darstellenden Zwecken dienen,
jedoch die vorliegende Erfindung nicht begrenzen. Im Wesentlichen äquivalente
Variationen der genauen hierin dargestellten Verfahren werden den
Fachleuten nach Durchsicht der vorliegenden Offenbarung klar sein.
Beispiele, die sich nicht auf die beanspruchte Erfindung beziehen,
sind lediglich zu Illustrationszwecken mit eingeschlossen.
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B. BEISPIEL 2: GESAMTORGANISMUSENTWICKLUNG
FÜR EINE
HYPER-REKOMBINATION
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Die
Möglichkeit
der Selektion eines E. coli-Stammes mit einem erhöhten Level
an Rekombination wurde aus Phänotypen
vom Wildtyp, ΔrecA-,
mutS-, und ΔrecA
mutS-Stämmen
angezeigt, gefolgt von einem Aussetzen gegenüber Mitomycin C, einem Inter-Strang-kreuzverbindenden
Agens der DNA.
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Das
Aussetzen von E. coli gegenüber
Mitomycin C verursacht eine Inter-Strang-Kreuzverbindung der DNA,
wodurch die DNA in der Replikation blockiert wird. Die Reparatur
der Inter-Strang-DNA-Kreuzverbindung in
E. coli wird durch einen RecA-abhängigen rekombinatorischen
Reparaturweg vollzogen (Friedberg et al., in: DNA Repair and Mutagenesis
(1995), Seiten 191–232).
Die Weiterverarbeitung der Kreuz-Verbindungen während der Reparatur resultiert
in gelegentliche Doppelstrang-DNA-Brüche, welche ebenfalls durch
eine RecA-abhängige
rekombinatorische Route repariert werden. Dementsprechend sind RecA–-Stämme einer
Mitomycin C-Aussetzung gegenüber
bedeutend empfindlicher als Wildtyp-Stämme. Tatsächlich wird Mitomycin C bei
einfachen Disk-Sensivitätsassays
verwendet, um zwischen RecA+- und RecA–-Stämmen zu
unterscheiden.
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Zusätzlich zu
dessen rekombinogenen Eigenschaften ist Mitomycin C auch ein Mutagen.
Das Aussetzen gegenüber
DNA-schädigenden
Substanzen, wie bspw. Mitomycin C, resultiert typischerweise in
die Induktion des E. coli-SOS-Regulons, welches Produkte mit einschließt, die
bei der Fehler-gebundenen Reparatur von DNA-Schädigungen beteiligt sind (Friedberg
et al., 1995, siehe oben, Seiten 465–522).
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Nach
der Phagen-P1-vermittelten verallgemeinerten Transduktion des Δ(recA–-srl)::Tn10-Allels
(ein nicht-funktionelles Allel) in Wildtyp- und mutS-E. coli wurden
Tetracyclinresistente Transduktanten hinsichtlich des recA–-Phänotyps gescreent,
und zwar unter Verwendung des Mitomycin C-Sensitivitätsassays. In LB-Überschichtungen
mit einem 1/4-Inch-Filter-Plättchen,
gesättigt
mit 10 μg
Mitomycin C wurde nach 48 Stunden bei 37°C beobachtet, dass das Wachstum
des Wildtyps und der mutS-Stämme
innerhalb einer Region mit einem Radius von ungefähr 10 mm
vom Zentrum des Plättchens
gehemmt war. Das DNA-Kreuzverbinden
bei hohen Mitomycin C-Leveln sättigt
deren rekombinatorische Reparatur, was zu einer tödlichen
Blockierung der DNA-Replikation führt. Beide Stämme entwickelten
innerhalb der Inhibierungszone gelegentlich Kolonie-bildende Einheiten,
obwohl die Frequenz der Kolonien im mutS-Stamm zehn- bis zwanzigfach
höher war. Dies
ist vermutlich auf die erhöhte
Rate der spontanen Mutation mit mutS-Hintergrund zurückzuführen. Ein
direkter Vergleich zeigte, dass die ΔrecA- und ΔrecA mutS-Stämme
bedeutend empfindlicher gegenüber
Mitomycin C waren, wobei das Wachstum in einer Region inhibiert
wurde, die sich über
15 mm vom Zentrum des Plättchens
erstreckte. Jedoch wurden im Gegensatz zu den recA–-Stämmen keine
Mitr-Individuen innerhalb der Region der
Wachstumsinhibierung beobachtet, nicht einmal in dem mutS-Hintergrund.
Das Auftreten von Mitr-Individuen bei recA+-Hintergründen, jedoch
nicht in ΔrecA-Hintergründen, deutete
an, dass Mitr von einem funktionellen recA-Protein
abhängig
ist, und legt nahe, dass Mitr aus einer
erhöhten
Fähigkeit
für eine
rekombinatorische Reparatur einer Mitomycin C-induzierten Schädigung resultieren
kann.
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Mutationen,
die zu einer erhöhten
Fähigkeit
für eine
RecA-vermittelte rekombinatorische Reparatur führen, können unterschiedlich, unerwartet,
unverbunden und potentiell synergistisch sein. Mit einem rekursiven
Protokoll, bei welchem die Selektion hinsichtlich Mitr und
das chromosomale Shuffling abwechseln, werden individuelle Zellen
mit einer bedeutend erhöhten
Fähigkeit
für die
Rekombination entwickelt.
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Das
rekursive Protokoll lautet wie folgt. Nach dem Aussetzen eines mutS-Stammes
gegenüber
Mitomycin C werden Mitr-Individuen gepoolt und kreuzgezüchtet (bspw.
durch ein Hfrvermitteltes chromosomales Shuffling oder durch eine
verallgemeinerte Split-Pool-Transduktion, oder durch Protoplastenfusion).
Allele, die in Mitr resultieren, und die
vermutlich in einer erhöhten
Fähigkeit
für eine
rekombinatorische Reparatur resultieren, werden in Abwesenheit einer
Fehlanpassungs-Reparatur
in der Population neu zusammengesetzt. Darüber hinaus kann die Fehler-basierte
Reparatur nach einer Exposition gegenüber Mitomycin C neue Mutationen
für die
nächste
Shuffling-Runde
einführen.
Das Verfahren wird unter Verwendung ansteigender, stringenter Aussetzungen
gegenüber
Mitomycin C wiederholt. Eine Anzahl paralleler Selektionen in der
ersten Runde als Mittel zur Herstellung einer Verschiedenheit von
Allelen. Wahlweise kann die Rekombinogenizität der Isolate hinsichtlich
einer Hyper-Rekombination unter Verwendung eines Plasmid × Plasmid-Assays
oder eines Chromosom × Chromosom-Assays
beobachtet werden (bspw. dasjenige von Konrad, J. Bacteriol. 130, 167–172 (1977)).
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C. BEISPIEL 3: GESAMTGENOM-SHUFFLING
VON STREPTOMYCES COELICOLOR ZUR VERBESSERUNG DER PRODUKTION VON γ-ACTINORHODIN
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Um
die Produktion des Sekundär-Metaboliten γ-Actinorhodin
von S. coelicolor zu verbessern, wird das Gesamtgenom dieses Organismus
entweder alleine oder mit dessen nahen Verwandten S. lividans neu
zusammengesetzt. Bei dem ersten nachstehend beschriebenen Verfahren
entsteht die genetische Diversität
aus Zufallsmutationen, die durch chemische oder physikalische Mittel
hergestellt werden. In dem zweiten Verfahren entsteht die genetische
Diversität
aus der natürlichen
Diversität,
die zwischen den Genomen von S. coelicolor und S. lividans besteht.
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Sporen-Suspensionen
von S. coelicolor werden in sterilem Wasser resuspendiert und einer
UV-Mutagenese derart unterzogen, dass 1% der Sporen überleben
(~600 „Energie"-Einheiten unter Verwendung eines Stratalinkers,
Stratagene), und die resultierenden Mutanten werden auf Sporulations-Agar „ausgewachsen". Einzelne Sporen
repräsentieren
einkernige Zellen, welche innerhalb ihres Genoms unterschiedliche
Mutationen tragen. Die Sporen werden gesammelt, gewaschen und auf
festem Medium ausplattiert, vorzugsweise auf Sojabohnen-Agar, R5,
oder einem anderen reichen Medium, das in sporulierende Kolonien
resultiert. Die Kolonien werden sichtbar gemacht und unter Verwendung
eines automatisierten Kolonienpickers zufällig gepickt, bspw. durch den
Q-bot (Genetix). Alternativ werden Kolonien, die größere oder
dunklere Höfe
aus blauem Pigment bilden, zusätzlich
oder vorzugsweise gepickt.
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Die
Kolonien werden auf 96-Well-Mikrotiterplatten mit 1/3 × YEME-Medium
(170 μl/Well)
angeimpft. Zwei sterile 3-mm-Glaskügelchen
werden in jedes Well hinzugefügt
und die Platten bei 150 bis 250 rpm bei 30°C in einem befeuchteten Inkubator
geschüttelt.
Die Platten werden bis zu 7 Tage inkubiert und die Zellüberstände hinsichtlich
der γ-Actinorhodin-Produktion
untersucht.
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Für die Untersuchung
werden 50 μl
des Überstands
zu 100 μl
an destilliertem Wasser in einer 96-Well-Polypropylen-Mikrotiterplatte
hinzugefügt,
und die Platte anschließend
bei 4000 rpm zentrifugiert, um das Myzel zu pelletieren. 50 μl des klaren Überstandes
wird entfernt und in eine Polystyren-96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden überführt, welche
150 μl 1
M KOH in jedem Well enthielt. Die resultierenden Platten werden
anschließend
in einem Mikrotiterplatten-Leser abgelesen, der die Absorption bei
654 nm der einzelnen Proben als Messung des Gehalts an γ-Actinorhodin
misst.
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Das
Myzel aus Kulturen, die γ-Actinorhodin
bei Leveln produzieren, die um einiges höher sind als diejenigen des
Wildtyps S. coelicolor, werden anschließend isoliert. Diese werden
auf festem Sporulationsmedium vermehrt und Sporenpräparate jeder
verbesserten Mutante werden hergestellt. Aus diesen Präparaten werden
Protoplasten jeder der verbesserten Mutanten hergestellt, gepoolt
und fusioniert (wie in Genetic Manipulation of Streptomyces – A laboratory
Manual, Hopwood, D. A., et al. beschrieben). Die fusionierten Protoplasten
werden regeneriert und zur Sporulation gebracht. Die Sporen werden
gesammelt und entweder auf festem Medium für ein weiteres Picken und Screening
ausplattiert oder, um die Vertretung einer Nachkommen schaft mit
verschiedenen Elternteilen zu erhöhen, werden zur Herstellung
von Protoplasten verwendet und wieder fusioniert (oder mehrere Male,
wie zuvor für
andere Verfahren beschrieben, um eine pool-weise Rekombination zu
bewirken), und zwar vor einem weiteren Picken und Screenen.
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Weiter
verbesserte Mutanten resultieren aus der Kombination von zwei oder
mehreren Mutationen, die einen additiven oder synergistischen Effekt
auf die γ-Actinorhodin-Produktion
haben. Weiter verbesserte Mutanten können wiederum durch pool-weise Protoplastenfusion
gepaart werden, oder sie können
einer Zufalls-Mutagenese unterzogen werden, um eine neue Population
an Zellen herzustellen, die gescreent und hinsichtlich weiterer
Verbesserung gepaart werden sollen.
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Als
eine Alternative für
die Zufalls-Mutagenese als Quelle der genetischen Diversität kann die
natürliche
Diversität
eingesetzt werden. In diesem Fall werden Protoplasten, hergestellt
aus dem Wildtyp S. coelicolor und S. lividans, fusioniert. Sporen
aus der regenerierten Nachkommenschaft dieser Paarung werden anschließend repetitiv
fusioniert und regeneriert, um eine zusätzliche Diversität zu bilden,
oder aber sie werden auf festem Medium getrennt, gepickt und hinsichtlich
der verstärkten
Produktion von γ-Actinorhodin
gescreent. Wie zuvor beschrieben, werden die verbesserten Subpopulationen
gepaart, um weiter verbesserte Familien-neu-zusammengesetzte Organismen
zu identifizieren.
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D. BEISPIEL 4: EIN ACTINORHODIN-ASSAY
MIT HOHEM DURCHSATZ
-
Zusätzliche
Details über
einen Actinorhodin-Assay mit hohem Durchsatz-Shuffling, das für die Selektion
von Myzel eingesetzt wird, sind in 32 dargestellt.
Kurz gesagt werden neu zusammengesetzte Zellen durch standardisierte
und automatisierte Verfahren unter Verwendung eines Q-bot-Robotsystems
gepickt und auf Standard-96-Well-Platten übertragen. Nach einer Inkubation
bei 30°C über 7 Tage
hinweg wird das resultierende Myzel zentrifugiert und eine Probe
des Zellüberstandes
entfernt und mit 0,1 M KOH in einer 96-Well-Platte vermengt und
die Absorption bei 654 nm abgelesen. Die besten positiven Klone
wurden ausgewählt
und in Schüttelflaschen
kultiviert.
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Ungefähr 109 Protoplasten wurden 7 Minuten lang bei
3000 rpm zentrifugiert. Wenn mehr als ein Stamm verwendet wurde,
so wurde eine gleiche Anzahl an Protoplasten von jedem Stamm verwendet.
Der Puffer wurde überwiegend
entfernt und das Pellet im verbleibenden Puffer (~25 μl Gesamtvolumen)
durch vorsichtiges Anschnipsen resuspendiert. 0,5 ml 50% PEG1000
wurde hinzugefügt
und mit den Protoplasten durch vorsichtiges, zweimaliges Ein- und
Auspipettieren gemischt. Anschließend wurde die Mischung 2 Minuten
lang inkubiert. 0,5 μl
P-Puffer wurde hinzugefügt
und vorsichtig gemischt. (Dies stellt die Fusion mit einer Verdünnung von
10–1 dar).
Eine zehnfache Reihenverdünnung
wurde in P-Puffer durchgeführt.
Nach 2 Minuten wurden die Verdünnungen
mit 10–1,
10–2 und
10–3 auf
R5-Platten mit jeweils 50 μl
ausplattiert, 2–3 Platten pro Verdünnung (pro
Platte wurden –20
3-mm-Glaskügelchen
eingesetzt, unter vorsichtigem Schütteln). Als eine erste Kontrolle
für die
Regeneration der Protoplasten wurde die gleiche Anzahl an Protoplasten
wie oben stehend verwendet, wobei P-Puffer zu einem Gesamtvolumen
von 1 ml hinzugefügt
wurde (dies stellt die Regeneration mit einer Verdünnung von
10–1 dar).
Die Mischung wurde in P-Puffer weiter verdünnt (10×). Die Verdünnungen wurden
mit 10–3,
10–4 und
10–5 auf
R5-Platten mit jeweils 50 μl
ausplattiert. Als eine zweite Kontrolle (für die Überprüfung des Hintergrunds eines
nicht-Protoplasten-bildenden Myzels) wurde die gleiche Anzahl an
Protoplasten verwendet, und zwar unter Verwendung von 0,1% SDS in
einem Gesamtvolumen von 1 ml (dies stellt den Hintergrund bei einer
Verdünnung
von 10–1 dar).
Nach einer weiteren zehnfachen Verdünnung in 0,1% SDS wurde die
Verdünnung
mit 10–1,
10–2 und
10–3 mit
jeweils 50 μl
auf R5-Platten ausplattiert. Die Platten wurden luftgetrocknet und
3 Tage lang bei 30°C
inkubiert.
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Die
Anzahl der Kolonien wurde auf jeder Platte ausgezählt (diejenigen,
die auszählbar
waren), unter Verwendung der Anzahl der regenerierten Protoplasten
als ein Wert von 100%, und unter Berechnung des Prozentsatzes des
Hintergrundes (gewöhnlicherweise
kleiner als 1) und die Überlebensrate
der Fusion (gewöhnlich
größer als
10). Die Fusionsplatten wurden 2 weitere Tage bei 30°C inkubiert,
bis alle Kolonien hinreichend sporulierten. Die Sporen wurden von
denjenigen Platten geerntet, die weniger als 5000 Kolonien aufwiesen. Die
Sporen wurden durch Baumwolle gefiltert und einmal mit Wasser gewaschen,
anschließend
in 20% Glycerol resuspendiert und ausgezählt. Diese Sporen wurden für weitere
Untersuchungen eingesetzt, mit ihnen weitere Kulturen angeimpft
oder einfach bei –20°C gelagert.
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E. BEISPIEL 4: GESAMTGENOM-SHUFFLING
VON RHODOCOCCUS HINSICHTLICH EINER ZWEIPHASEN-REAKTIONSKATALYSE
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Dieses
Beispiel stellt ein Beispiel dar, wie die hierin beschriebenen Techniken
auf Technologien angewandt werden können, mit welchen die generische
Verbesserung von Biotransformationen ermöglicht werden kann, die durch
ganze Zellen katalysiert werden. Rhodococcus wurde als Ausgangsziel
ausgewählt,
da diese Spezies ein Vertreter eines Systems ist, welches in der
Molekularbiologie elementar ist (da es für Ganzzell-Katalysatoren, die
im Allgemeinen durch Screening von Umweltisolaten selektiert werden,
gewöhnlich
ist), und da Rhodococcus ein Organismus ist, der Zweiphasenreaktionen
katalysieren kann.
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Das
Ziel des Gesamtgenom-Shufflings von Rhodococcus ist es, durch irgendeinen
ausgewählten
Weg einen Anstieg im Fluss zu erhalten. Die Substratspezifität des Weges
kann dahingehend geändert
werden, dass sie Moleküle
akzeptiert, die nicht gegenwärtig
verwendete Substrate sind. Jedes dieser Merkmale kann während des
Gesamtgenom-Shufflings ausgewählt
werden.
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Während des
Gesamtgenom-Shufflings werden Bibliotheken von neu zusammengesetzten
Enzymen und Wege hergestellt und in Rhodococcus transformiert und
anschließend
gescreent, vorzugsweise durch Assays mit hohem Durchsatz, zur Verbesserung
im Zielphänotyp,
bspw. durch Massenspektroskopie zur Messung des Produktes.
-
Wie
oben bemerkt, kann der chromosomale Kontext der Gene dramatische
Effekte auf deren Aktivitäten
haben. Die Klo nierung der Zielgene auf ein kleines Plasmid in Rhodococcus
kann die Gesamtstoffwechselwegs-Aktivität dramatisch reduzieren (um
einen fünf-
bis zehnfachen Faktor, oder noch höher). Aus diesen Gründen kann
der Ausgangspunkt für
das DNA-Shuffling eines Weges (auf einem Plasmid) zehnfach niedriger sein
als die Aktivität
des Wildtyp-Stammes. Im Gegensatz hierzu kann die Integration der
Gene in Zufallsstellen in das Rhodococcus-Chromosom zu einem signifikanten Anstieg
in der Aktivität
führen
(5- bis 10-fach). Ein ähnliches
Phänomen
wurde bei der kürzlich
vorgenommenen, gerichteten Evolution in E. coli beobachtet, und zwar
für ein
Arsen-Resistenzoperon (ursprünglich
von Staphylococcus aureus) durch DNA-Shuffling. Das Shuffling dieses
Plasmids produzierte Sequenzänderungen,
die zu einer effizienten Integration des Operons in das E. coli-Chromosom
führten.
Von dem insgesamt 50-fachen Anstieg in der Arsen-Resistenz, die durch die gerichtete
Evolution der drei Gen-Wege erreicht wurde, resultierte das etwa
10-fache aus dieser Integration in das Chromosom. Die Position innerhalb
des Chromosoms ist wahrscheinlich auch wichtig: so haben bspw. Sequenzen
nahe dem Replikationsursprung eine effektiv höhere Gen-Dosierung und besitzen
daher einen höheren
Expressionslevel.
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Um
unvorhersehbare chromosomale Positionseffekte vollständig zu
erforschen, und um diese in einer gerichteten Evolutionsstrategie,
bei welcher viele Mutationszyklen, Rekombinations- und Selektionszyklen
eingesetzt werden, einzubauen, werden die Gene in vitro manipuliert
und anschließend
in eine optimale Chromosomenposition transferiert. Die Rekombination
zwischen Plasmid und Chromosom vollzieht sich auf zwei unterschiedliche
Wege. Die Integration findet an einer Position statt, wo es eine
signifikante Sequenzhomologie zwischen Plas mid und Chromosom gibt,
das heißt,
durch homologe Rekombination. Die Integration findet auch dort statt,
wo es keine offensichtliche Sequenzidentität gibt, das heißt, durch
nicht-homologe Rekombination. Diese
zwei Rekombinationsmechanismen werden durch unterschiedliche zelluläre Maschinerien
beeinflusst und besitzen bei der gerichteten Evolution unterschiedliche
potentielle Anwendungen.
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Um
den Anstieg in der Aktivität
zu kombinieren, der aus der Gen-Duplikation und der chromosomalen Integration
des Zielweges mit der wirkungsvollen Technik des DNA-Shufflings
resultierte, werden in vitro Bibliotheken neu zusammengesetzter
Gene hergestellt, und durch homologe Rekombination anstelle der
Wildtyp-Gene in das Chromosom integriert. Anschließend werden
die Rekombinanten hinsichtlich der erhöhten Aktivität gescreent.
Der Prozess wird wahlweise rekursiv, wie hierin beschrieben, wiederholt.
Die besten Rhodococcus-Varianten werden gepoolt und der Pool in
zwei Teile aufgeteilt. Aus diesem Pool werden die Gene durch PCR
herauskloniert, neu zusammengesetzt und durch homologe Rekombination
wieder in die Chromosomen der anderen Hälfte des Pools integriert.
Die Rekombinanten werden wiederum gescreent und die Besten herausgenommen
und gepoolt, sowie der Prozess wahlweise wiederholt.
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Manchmal
gibt es komplexe Wechselwirkungen zwischen Enzymen, die die aufeinander
folgende Reaktionen in einem Stoffwechselweg katalysieren. Manchmal
kann das Vorliegen eines Enzyms die Aktivitäten anderer Enzyme in dem Weg
nachteilig beeinflussen. Dies kann das Ergebnis von Protein-Protein-Wechselwirkungen
sein, oder die Inhibierung eines Enzyms durch das Produkt eines
anderen, oder aber ein Ungleichgewicht von Primär- und Sekundär-Metabolismus.
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Dieses
Problem wird durch das DNA-Shuffling überwunden, durch welches Lösungen im
Zielgen-Cluster produziert werden, die zu Verbesserungen in dem
Merkmal führen,
das gescreent wird. Ein alternativer Ansatz, mit welchem nicht nur
dieses Problem gelöst
werden kann, sondern auch zukünftige
Ratenlimitierende Schritte, wie bspw. abnehmende Fähigkeit
und Substrattransporte, ist die Komplementierung durch die Überexpression
von anderen, bisher unbekannten genomischen Sequenzen.
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Zunächst wird
eine Bibliothek der genomischen DNA von Rhodococcus in einem Multikopien-Rhodococcus-Vektor,
wie bspw. pRC1 hergestellt. Dieser Vektor wird in Rhodococcus transformiert
und die Transformanten werden hinsichtlich Anstiege in dem erwünschten
Phänotyp
gescreent. Genomische Fragmente, die zu einer erhöhten Wegs-Aktivität führen, werden
durch DNA-Shuffling
entwickelt, um deren vorteilhaften Effekt auf die ausgewählte Eigenschaft
weiter zu erhöhen.
Bei diesem Ansatz werden keine Sequenzinformationen benötigt, oder
irgendein Wissen oder Annahmen über
die Natur des Proteins oder der Stoffwechselwegs-Wechselwirkungen,
oder sogar von irgendeinem Raten-limitierenden Schritt; der Ansatz
beruht lediglich auf der Detektion des erwünschten Phänotyps. Diese Art des Zufallsklonierens
und der nachfolgenden Entwicklung durch DNA-Shuffling positiv interagierender, genomischer
Sequenzen stellt ein äußerst wirkungsvolles
und generisches Werkzeug dar. Eine Vielzahl von Quellen genomischer
DNA werden eingesetzt, von isogenen Stämmen bis zu entfernter verwandten
Spezies mit möglicherweise
erwünschten
Eigenschaften. Darüber
hinaus ist die Technik prinzipiell auf jeden Mikroorganismus anwendbar,
für welchen
die Grundlagen der Molekularbiologie, der Transformation und der
Klonierungsvektor verfügbar
sind, und für
irgendeine Eigenschaft, die untersucht werden kann, vorzugsweise
in einem Hochdurchsatz-Format.
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Die
homologe Rekombination innerhalb des Chromosoms wird verwendet,
um die Beschränkungen der
Plasmid-Evolution und der Größenbeschränkung zu
umgehen, und wird wahlweise zur Änderung
des zentralen Metabolismus eingesetzt. Die Strategie ist ähnlich zu
derjenigen, die weiter oben für
das Shuffling von Genen innerhalb deren chromosomalen Kontext beschrieben
wurde, mit der Ausnahme, dass kein in vitro-Shuffling auftritt.
Anstelle hiervon wird der Elternstamm mit Mutagenen behandelt, wie
bspw. ultraviolettem Licht oder Nitrosoguanidin, und die verbesserten
Mutanten werden ausgewählt.
Die verbesserten Mutanten werden gepoolt und aufgeteilt. Die Hälfte des
Pools wird verwendet, um Zufalls-genomische Fragmente für die Klonierung
in einen homologen Rekombinationsvektor herzustellen. Zusätzliche
genomische Fragmente werden von verwandten Spezies mit erwünschten
Eigenschaften abgeleitet (in diesem Fall höhere Stoffwechselraten und
die Fähigkeit,
auf billigeren Kohlenstoffquellen zu wachsen). Die klonierten genomischen
Fragmente werden einer homologen Rekombination in die Genome der
verbleibenden Hälfte
des mutierten Pools unterzogen, und Varianten mit verbesserten Phänotypen
werden ausgewählt.
Diese werden einer weiteren Mutagenese-, Selektions- und Rekombinationsrunde
unterzogen. Dieser Prozess ist hinsichtlich der Verbesserung irgendeines
Gesamtzell-Biokatalysators,
für welchen
ein Rekombinationsvektor und ein Assay entwickelt werden können, gänzlich generisch.
Eine rekursive Rekombination kann durchgeführt werden, um die Diversität des Pools
an jedem Schritt in dem Verfahren zu steigern.
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Eine
effiziente homologe Rekombination ist für die Rekursivität der chromosomalen
Entwicklungsstrategien, die oben dargestellt wurden, wichtig. Eine
nicht-homologe Rekombination resultiert in eine nutzlose Integration
(nach der Selektion), gefolgt von einem Ausschluss (nach einer Gegenselektion)
des gesamten Plasmids. Alternativ, wenn keine Gegenselektion eingesetzt
wurde, integrieren immer mehr Kopien des Plasmids/der genomischen
Sequenzen, die sowohl instabil sind als auch einen zusätzlichen
Selektionsmarker für jeden
Zyklus benötigen.
Darüber
hinaus wird eine zusätzliche
nicht-homologe Rekombination an Zufallspositionen stattfinden und
kann – oder
auch nicht – zu
einer vorteilhaften Expression der integrierten Sequenz führen.
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F. BEISPIEL 5: ERHÖHEN DER
RATE DER HOMOLOGEN REKOMBINATION IN RHODOCOCCUS
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Ein
genetischer Ansatz wird verwendet, um die Rate der homologen Rekombination
in Rhodococcus zu steigern. Sowohl gezielte als auch nicht gezielte
Strategien werden eingesetzt, um Anstiege in der homologen Rekombination
zu entwickeln. Rhodococcus recA wird durch DNA-Shuffling entwickelt,
um dessen Fähigkeit
zu steigern, eine homologe Rekombination innerhalb des Chromosoms
zu fördern.
Das recA-Gen wurde ausgewählt,
da es Varianten von recA gibt, die bekanntermaßen in erhöhte Raten einer homologen Rekombination
in E. coli, wie weiter oben diskutiert, führen.
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Das
recA-Gen von Rhodococcus wird neu zusammengesetzt und in ein Plasmid
kloniert, das einen Selektionsmarker trägt, sowie eine unterbrochene
Kopie des Rhodococcus-Homologs des S. cerevisiae URA3-Gens (ein
Gen, das auch Sensitivität
gegenüber
dem Uracil-Vorläuferanalog
5-Fluorotsäure
verleiht). Die homologe Integration des Plasmids in das Chromosom
unterbricht den Uracil-Syntheseweg des Wirtes, was zu einem Stamm
führt,
der den Selektionsmarker trägt,
und der auch gegenüber
5-Fluorotsäure
resistent ist. Das neu zusammengesetzte recA-Gen wird integriert
und kann aus dem Chromosom amplifiziert, wiederum neu zusammengesetzt
und anschließend
in den Integrations-Selektionsvektor
kloniert werden. In jedem Zyklus sind die recA-Gene, die den höchsten Grad
an homologer Rekombination fördern,
diejenigen Gene, die als Integranten in dem Genom am besten repräsentiert
sind. Auf diese Weise wird ein Rhodococcus recA mit verstärkter Aktivität zur Förderung
der homologen Rekombination entwickelt.
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Viele
andere Gene sind bei mehreren unterschiedlichen homologen Rekombinationswegen
beteiligt, und Mutationen in einigen dieser Proteine können zu
Zellen mit einem erhöhten
Level an homologer Rekombination führen. So konnte bspw. für Mutationen
in der E. coli-DNA-Polymerase III kürzlich gezeigt werden, dass
die recA-unabhängige
homologe Rekombination gesteigert wird. Die Resistenz gegenüber DNA-kreuzverbindenden
Agenzien, wie bspw. Salpetersäure,
Mitomycin und Ultraviolett hängen
von der homologen Rekombination ab. Daher resultieren Anstiege in
der Aktivität
dieses Weges in einer erhöhten
Resis tenz gegenüber
diesen Agenzien. Rhodococcus-Zellen werden mutagenisiert und hinsichtlich
einer erhöhten
Toleranz gegenüber
DNA-kreuzverbindenden Agenzien selektiert. Diese Mutanten werden
hinsichtlich der Rate getestet, mit welcher ein Plasmid in das Chromosom
homolog integrieren wird. Aus diesen Mutanten werden genomische
Bibliotheken hergestellt, wie weiter oben beschrieben kombiniert
und dazu eingesetzt, einen Stamm mit noch höheren Leveln an homologer Rekombination
zu entwickeln.
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Die
oben stehende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der vorliegenden
Erfindung wurde lediglich zu Illustrations- und Beschreibungszwecken
dargestellt. Sie sollen weder erschöpfend sein noch die Erfindung
auf die Form begrenzen, die offenbart wurde, und viele Modifizierungen
und Variationen sind im Lichte der oben beschriebenen Lehre möglich. Solche
Modifizierungen und Variationen, die dem Fachmann offensichtlich
sein werden, sollen innerhalb des Rahmens dieser Erfindung liegen.