-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Mitglieder der in Säugetieren
vorkommenden Zytokinrezeptor-Familie von Proteinen (mit Einschluss
von und ohne Limitierung auf Rezeptorproteine des Menschen und der
Maus), Fragmente davon sowie rekombinante Polynukleotide und Zellen,
die für
die Expression solcher Proteine brauchbar sind.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Verschiedene
regulatorische Proteine, die als Hämatopoetine bekannt sind und
bei der Entwicklung und Proliferation der verschiedenen Populationen
von hämatopoetischen
Blutzellen eine Rolle spielen, sind bereits identifiziert worden.
Die meisten Hämatopoetine
zeigen bestimmte biologische Aktivitäten, indem sie mit einem Rezeptor
auf der Oberfläche
von Zielzellen (target cells) in Wechselwirkung treten. Zytokinrezeptoren
bestehen üblicherweise
aus ein, zwei oder drei Ketten. Viele Zytokinrezeptoren und einige
Zytokine, wie z.B. IL-12 p40, sind Mitglieder der Superfamilie der
Hämatopoetin-Rezeptoren
von Proteinen. Die Identifizierung von neuen Mitgliedern der Großfamilie
der Hämatopoetin-Rezeptoren kann bei
der Hämatopoese,
bei der Regulierung von Immunantworten und bei der Identifizierung
von anderen Mitgliedern der Hämatopoetin-Superfamilie,
mit Einschluss von Zytokinen und Rezeptoren, von Nutzen sein. Der
Eintrag in die EMBL Datenbank Nr. HSAC2303 vom 26. Juni 1991, Zugangsnummer
(accession number) AC 002303, betrifft eine genomische DNS-Sequenz
aus einem BAC Klon, der DNS vom humanen Chromosom 16 enthält.
-
Es
wäre wünschenswert,
die DNS- und die Proteinsequenzen von bislang unbekannten Mitgliedern der
Superfamilie von Hämatopoetin-Rezeptoren
zu identifizieren und zu bestimmen.
-
Kurzbeschreibung der Erfindung
-
Nach
der vorliegenden Erfindung werden Polynukleotide offenbart, die
für die
Kette des MU-1 Hämatopoetin-Superfamilie
Rezeptors kodieren, mit Einschluss von denjenigen und ohne Limitierung
auf diejenigen, die in der Maus und im Menschen vorkommen.
-
In
bestimmten Ausführungsformen
stellt die Erfindung ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung, das eine
Nukleotidsequenz enthält,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus:
- (a) der
Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:1;
- (b) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:1 vom Nukleotid 238 bis zum Nukleotid 852;
- (c) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:1 vom Nukleotid 301 bis zum Nukleotid 852;
- (d) der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
NO:1 vom Nukleotid 301 bis zum Nukleotid 945
oder vom Nukleotid
238 bis zum Nukleotid 945;
- (e) einer Nukleotidsequenz, die von der Sequenz der Nukleotidsequenz,
die in einem der Anspruchsteile (a) bis (d) spezifiziert ist, infolge
der Degeneration des genetischen Codes abweicht; und
- (f) einer Nukleotidsequenz, die für ein Spezies-Homologes der
Sequenz gemäß SEQ ID
NO:2 kodiert, wobei besagte Nukleotidsequenz für ein Protein kodiert, welches
die biologische Aktivität
des MU-1 Proteins, wie in SEQ ID NO:2 dargestellt, in einem Test
betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon
und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen
oder Thymozyten besitzt.
-
Die
Nukleotidsequenz kann mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell
(operably linked) verbunden sein.
-
Die
Erfindung stellt auch ein isoliertes Polynukleotid zur Verfügung, das
eine Nukleotidsequenz enthält,
die für
ein Peptid oder Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz enthält, die
ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus:
- (a) der
Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2;
- (b) der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 von den Aminosäuren
22 bis 538;
- (c) der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 von den Aminosäuren
22 bis 236;
- (d) der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 von den Aminosäuren
1 bis 236; und
- (e) Fragmenten der Sequenzen gemäß (a) bis (d), die die biologische
Aktivität
des MU-1 Proteins gemäß (a) bis
(d) in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon
und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen
oder Thymozyten besitzen.
-
Wirtszellen,
vorteilhaft Säugetierzellen,
die mit den Polynukleotiden transformiert sind, werden ebenfalls
zur Verfügung
gestellt.
-
Bei
anderen Ausführungsformen
der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines MU Proteins zur
Verfügung
gestellt. Das Verfahren umfasst:
- (a) die Kultivierung
einer Wirtszelle nach der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten
Kulturmedium; und
- (b) die Reinigung des humanen MU-1 Proteins aus der Kultur.
-
Weiterhin
werden Proteine zur Verfügung
gestellt, die nach diesem Verfahren hergestellt wurden.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein isoliertes MU-1 Protein zur
Verfügung,
das eine Aminosäuresequenz
enthält,
die ausgewählt
ist aus der Gruppe, bestehend aus:
- (a) der
Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2;
- (b) der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 von den Aminosäuren
22 bis 538;
- (c) der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 von den Aminosäuren
22 bis 236;
- (d) der Aminosäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO:2 von den Aminosäuren
1 bis 236;
- (e) Fragmenten der Sequenzen gemäß (a) bis (d), die die biologische
Aktivität
des MU-1 Proteins gemäß (a) bis
(d) in einem Test betreffend die Produktion von Maus- oder menschlichem γ-Interferon
und/oder betreffend die Proliferation von Milzzellen, Lymphknotenzellen
oder Thymozyten besitzen; und
- (f) einer Aminosäuresequenz,
die durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, welche die Fähigkeit
besitzt, unter hoch stringenten Bedingungen von 0.1 × SSC bei
65°C mit
einer Nukleotidsequenz, die in einem der Ansprüche 1(a) bis (c) spezifiziert
ist,
oder mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 vom Nukleotid
301 bis zum Nukleotid 945 zu hybridisieren.
-
Bei
anderen bevorzugten Ausführungsformen
ist die spezifizierte Aminosäuresequenz
ein Teil eines Fusionsproteins (mit einer weiteren, nicht von MU-1
abgeleiteten Aminosäuresequenz).
Bevorzugte Fusionsproteine enthalten ein Antikörper-Fragment, beispielsweise
ein Fc-Fragment.
-
Auch
pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Protein nach der vorliegenden
Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff
enthalten, werden zur Verfügung
gestellt.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt weiterhin Zusammensetzungen zur Verfügung, die
einen Antikörper enthalten,
der spezifisch mit einem Protein nach der vorliegenden Erfindung
reagiert.
-
Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen
-
Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben zum ersten Mal Polynukleotide
identifiziert und zur Verfügung
gestellt, die für
DIE Kette des MU-1 Hämatopoetin-Superfamilie
Rezeptors (in der Folge als „MU-1" oder „MU-1 Protein" bezeichnet) kodieren,
mit Einschluss von und ohne Limitierung auf Polynukleotide, die
für humanes
MU-1 kodieren.
-
Eine
Aminosäureregion
des humanen IL5 Rezeptors mit 70 Aminosäuren (LMTNAFISIIDDLSKYDVQVRAAVSSMCREAGLWSEWSQPIYVGNDEHKPLREWFV
IVIMATICFILLIL; SEQ ID NO:3) wurde verwendet, um die EST Datenbank
GenBank zu durchsuchen, wobei der TBLASTN Algorithmus verwendet
wurde. Eine Sequenz innerhalb des genomischen BAC Klons AC002303,
der von dem humanen Chromosom 16p12 stammte, wurde als homolog zu
dieser Region identifiziert, was die Vermutung nahe legte, dass
dieses Segment für
ein Gen für
einen neuen Hämatopoetin-Rezeptor
kodieren könnte.
-
Eine Überprüfung des
offenen Leserasters innerhalb von 1.000 bp vom Nukleotid 40.886
ergab ein offenes Raster von 270 bp, das bei Verwendung im einer
BLAST Suche von GenPept ausschließlich Mitglieder der Zytokinrezeptor-Familie
identifizierte. Ein Stopcodon am Ende dieses Leserasters wurde als
Anzeichen für einen Übergang über eine
Grenze zwischen einem Exon und einem Intron interpretiert.
-
Es
wurde dann untersucht, ob RNA von einem Gen transscribiert wurde,
das innerhalb dieses BAC Klons vom Chromosom 16p12 vorhanden war.
PCR Primer wurden auf der Grundlage des größten ORF Segments synthetisiert,
das eine Peptidsequenz enthielt, die in der Cytokinrezeptor-Familie
konserviert ist. Die Primer GAGTCCGAGGAGAAAGCTGATCTCA (5p) (SEQ
ID NO:4) und GAAAGATGACCGGGTCACTCCATT (3p) (SEQ ID NO:5) wurden
in PCRs verwendet, um Phagenbibliotheken von verschiedenen humanen
Geweben (Clontech) zu durchsuchen. PCR Produkte der erwarteten Größe von 164
bp, die spezifisch mit einem mit 32-P markierten Oligonukleotid
mit der Sequenz ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ ID NO:6) hybridisierten,
wurden in Phagen aus Lunge, Niere, Plazenta und Herz gefunden. Bei
Verwendung des Oligonukleotids ACTCGAGCTATGAGCTGCAGGTGCGGGCA (SEQ
ID NO:7) wurde ein cDNA Klon mit voller Länge NN14-1b (MU-1) identifiziert,
gereinigt und sequenziert. Die DNS Sequenz und die vorhergesagte
Aminosäuresequenz
sind in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 dargestellt. Der offene Leseraster
kodiert für
ein neues Mitglied der Familie der Hämatopoetinrezeptoren. Es verfügt über eine
Leader-Sequenz sowie über
konservierte Cysteinpaare, PP, WSXWS (SEQ ID NO:8), das heißt Merkmale,
die für
die Familie charakteristisch sind, ebenso wie über eine Transmembran-Domäne und eine
extensive cytoplasmische Domäne.
Die nachfolgende ASTA Abgleichung dieser Sequenz mit GenPept ergab
sehr große
Homologie mit dem humanen IL-2Rb. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz
der Rezeptorkette schließt
eine mutmaßliche
Signalsequenz aus den Aminosäuren
1 bis 21 ein. Es wird angenommen, dass das reife (mature) MU-1 die
Sequenz der Aminosäuren
24 bis 538 der SEQ ID NO:2 hat. Eine Transmembran-Domäne findet
sich bei den Aminosäuren
237 bis 254.
-
Die
cDNA von MU-1 Wurde am 10. März
1998 bei der American Type Culture Collection hinterlegt und hat
die Zugangsnummer.
-
Alle
Formen von MU-1 Proteinen mit weniger als der vollen Länge sind
in die Erfindung einbezogen und werden zusammen mit den reifen Formen
mit voller Länge
als „MU-1" oder aber „MU-1 Proteine" bezeichnet. MU-1
Proteine mit weniger als der vollen Länge können hergestellt werden, indem
man ein entsprechendes Fragment des Polynukleotids exprimiert, das
für das
MU-1 Protein mit der vollen Länge
kodiert (SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6). Diese entsprechenden Polynukleotid-Fragmente
sind auch ein Teil der vorliegenden Erfindung. Modifizierte Polynukleotide,
wie zuvor beschrieben, können
nach Standardverfahren der Molekularbiologie hergestellt werden,
mit Einschluss der Konstruktion von Deletions-Mutanten und selektionsspezifischer
Methoden zur Mutagenese, oder durch die Polymerasekettenreaktion
unter Verwendung von geeigneten Polynukleotid-Primern.
-
Für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung hat ein Protein die „biologische Aktivität einer
Kette der Superfamilie der Hämatopoetin-Rezeptoren", wenn es eine oder
mehrere Aktivitäten
des entsprechenden reifen MU-1 Proteins zeigt.
-
MU-1
oder aktive Fragmente davon (MU-1 Proteine) können mit Trägermolekülen, wie z.B. Immunoglobulinen,
fusioniert werden. Beispielsweise können lösliche Formen des MU-1 mittels
Verbindungssequenzen („linker") mit dem Fc-Teil
eines Immunglobulins fusioniert werden. Andere Fusionsproteine,
wie z.B. diejenigen mit GST, Lex-A oder MBP, können ebenfalls verwendet werden.
-
Die
vorliegende Erfindung schließt
auch allelische Varianten der unter SEQ ID NO:1 aufgeführten Nukleotidsequenz
ein, das heißt
natürlich
vorkommende alternative Formen des isolierten Polynukleotids gemäß SEQ ID
NO:1, die auch für
MU-1 Proteine kodieren, insbesondere für diejenigen Proteine, die
eine biologische Aktivität
von MU-1 aufweisen. Ebenfalls einbezogen in die vorliegende Erfindung
sind isolierte Polynukleotide, die unter hoch stringenten Bedingungen
(z.B. 0,1 × SSC
bei 65°C)
mit der unter SEQ ID NO:1 aufgeführten Polynukleotidsequenz
hybridisieren. Isolierte Polynukleotide, welche für MU-1 Proteine
kodieren, aber infolge der Degeneration des genetischen Codes von
der unter SEQ ID NO:1 aufgeführten
Nukleotidsequenz abweichen, sind ebenfalls in die vorliegende Erfindung
einbezogen. Weiterhin sind auch Variationen der Nukleotidsequenz
gemäß SEQ ID
NO:1, die durch Punktmutationen oder durch induzierte Modifikationen
verursacht sind, in die Erfindung einbezogen.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt auch Polynukleotide zur Verfügung, die
für Homologe
des humanen MU-1 in anderen, tierischen Spezies, insbesondere in
anderen Säugetierspezies
kodieren. Homologe in diesen Spezies können identifiziert und isoliert
werden, indem man Sonden (grobes) oder Primer aus den murinen oder
humanen Sequenzen herstellt, die hierin offenbart sind, und damit
eine Bibliothek der betreffenden Spezies durchsucht, z.B. eine Bibliothek,
die aus PBMCs, Thyrnus oder Hoden der betreffenden Spezies gewonnen
wurden.
-
Die
isolierten Polynukleotide nach der Erfindung können mit einer Expressionskontrollsequenz,
wie z.B. den Expressionsvektoren MT2 oder pED, die von Kaufman et
al. in Nucleic Acid Res. 19, 4485-4490 (1991) beschrieben wurden,
funktionell verbunden (operably linked) werden, um das betreffende
MU-1 Protein rekombinant herzustellen. Viele geeignete Expressionskontrollsequenzen
sind in der Technik bekannt. Allgemeine Methoden zur Expression
von rekombinanten Proteinen sind ebenfalls bekannt und beispielhaft
von Kaufman in Methods in Enzymology 185, 537-566 (1990) beschrieben.
Im Sinne dieser Erfindung bedeutet „funktionell verbunden" („operably
linked") enzymatisch
oder chemisch unter Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen
dem isolierten Polynukleotid nach der Erfindung und der Expressionskontrollsequenz
auf eine solche Weise verbunden (ligated), dass das MU-1 Protein
in einer Wirtszelle, die mit diesem Konstrukt aus Polynukleotid
und Kontrollsequenz transformiert (transfiziert) wurde, exprimiert
wird.
-
Eine
Anzahl von Zelltypen können
als Wirtszellen für
die Expression von MU-1 Proteinen dienen. Jeder Zelltyp, in dem
funktionale MU-1 Proteine exprimiert werden können, kann verwendet werden.
Zu den geeigneten Säugetierwirtszellen
zählen
z.B. COS-Zellen von Affen, ovariale Zellen von chinesischen Hamstern (CHO
Zellen), humane Nieren-293 Zellen, humane Epidermial-431 Zellen,
humane Colo205 Zellen, CV-1 Zellen, andere transformierte Zelllinien
von Primaten, normale diploide Zellen, aus in vitro Kulturen von
primärem Gewebe
oder primären
Explantaten gewonnene Zelllinien, HeLa Zellen, L-Zellen der Maus,
BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1, PC12, M1x oder C2C12
Zellen.
-
Die
MU-1 Proteine können
auch hergestellt werden, indem man die isolierten Polynukleotide
nach der Erfindung wirksam mit geeigneten Kontrollsequenzen in einem
oder mehreren Insektenexpressionsvektoren verbindet und ein Insektenexpressionssystem
benutzt. Materialien und Methoden für die Verwendung von Expressionssystemen
auf Basis von Baculovirus/Insekten-Zellen sind im Handel erhältlich in
Form eines Kits, z.B. von Invitrogen, San Diego, California, U.S.A.
(das MaxBac® Kit),
und solche Methoden sind in der Technik gut bekannt und z.B. beschrieben
in Summers und Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin
No. 1555 (1987). Lösliche
Formen von MU-1 Proteinen können
auch in Insektenzellen unter Verwendung von geeigneten isolierten
Polynucleotiden, wie zuvor beschrieben, hergestellt werden.
-
Alternativ
können
die MU-1 Proteine in niederen Eukaryoten, wie z.B. Hefe, oder in
Prokaryoten, wie z.B. Bakterien, hergestellt werden. Zu den geeigneten
Hefestämmen
zählen
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Stämme von
Kluyveromyces, Candida oder beliebige andere Hefestämme mit
der Fähigkeit,
heterologe Proteine zu exprimieren. Zu den geeigneten Bakterienstämmen zählen Escherichia
coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium oder andere Bakterienstämme, die
heterologe Proteine zu exprimieren vermögen.
-
Die
Expression in Bakterien kann zur Bildung von Einschlusskörpern (inclusion
bodies) führen,
die das rekombinante Protein enthalten. Somit kann eine Umfaltung
des rekombinanten Proteins erforderlich sein, um aktives oder aktiveres
Material zu gewinnen. Verschiedene Methoden zur Gewinnung von richtig
gefalteten heterologen Proteinen aus bakteriellen Einschlusskörpern sind
in der Technik bekannt. Bei diesen Methoden macht man im allgemeinen
das Protein aus den Einschlusskörpern
löslich
und denaturiert dann das Protein vollständig unter Verwendung eines
chaotropen Agens. Wenn Cysteinmoleküle in der primären Aminosäuresequenz
des Proteins vorhanden sind, ist es oft erforderlich, die Umfaltung
in einer Umgebung vorzunehmen, die die korrekte Bildung von Disulfidbrücken ermöglicht (d.h.
in einem Redoxsystem). Allgemeine Methoden zur Umfaltung sind in Kohno,
Meth. Enzym., 185, 187-195 (1990) offenbart.
EP 0 433 225 und die gleichzeitig anhängige Anmeldung
USSN 08/163,877 beschreiben andere geeignete Methoden.
-
Die
MU-1 Proteine nach der Erfindung können auch als ein Produkt transgener
Tiere exprimiert werden, z.B. als eine Komponente in der Milch von
transgenen Kühen,
Ziegen, Schweinen oder Schafen, die durch somatische Zellen oder
Keimzellen charakterisiert sind, die Polynukleotidsequenzen enthalten,
die für
ein MU-1 Protein kodieren.
-
Die
MU-1 Proteine nach der Erfindung können hergestellt werden, indem
man transformierte Wirtszellen unter Bedingungen kultiviert, die
erforderlich sind, damit das gewünschte
Protein exprimiert wird. Das entstandene, exprimierte Protein kann
dann aus dem Kulturmedium oder aus Zellextrakten isoliert und gereinigt werden.
Lösliche
Formen der MU-1 Proteine nach der Erfindung können aus den konditionierten
Medien gewonnen und gereinigt werden. An Membranen gebundene Formen
der MU-1 Proteine nach der Erfindung können gereinigt werden, indem
man aus den exprimierenden Zellen die gesamte Membranfraktion abtrennt
und die Membranen mit einem nicht ionischen Detergens, wie z.B.
Triton X-100, extrahiert.
-
Die
MU-1 Proteine können
unter Verwendung von Methoden gereinigt werden, die dem Fachmann
geläufig
sind. Beispielsweise können
die MU-1 Proteine nach der Erfindung unter Verwendung eines im Handel erhältlichen
Proteinkonzentrationsfilters, wie z.B. eines Amicon oder Millipore
Pellicon Ultrafiltrationsapparats, konzentriert werden. Nach der
Konzentrationsstufe kann das Konzentrat einer Reinigungsmatrix zugeführt werden,
z.B. einem Gelfiltrationsmedium. Alternativ kann man ein Anionenaustauschharz
verwenden, z.B. eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden
Diethylaminoethyl- (DEAE) oder Polyethylenimin-(PEI)Gruppen. Die
Matrix kann aus Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder anderen
Materialien bestehen, die üblicherweise
für die
Reinigung von Proteinen verwendet werden. Alternativ kann auch ein
Kationenaustauschharz benutzt werden. Zu den geeigneten Kationenaustauschharzen
zählen
verschiedene unlösliche
Matrices, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen enthalten.
Sulfopropylgruppen werden bevorzugt (z.B. Säulen aus S-Sepharose®).
Die Reinigung der MU-1 Proteine aus Kulturüberständen kann auch eine oder mehrere Stufen
mit Säulen
aus solchen Affinitätsharzen
wie Concanavalin A-Agarose, Heparin-Toyopearl® oder
Cibacrom Blau 3GA Sepharose® einschließen; oder
durch hydrophobe Interaktionschromatographie unter Verwendung solcher
Harze, die z.B. Phenylether-, Butylether- oder Propylethergruppen
enthalten, oder durch Immunoaffinitätschromatographie erfolgen.
Schließlich
kann man auch mit einer oder mehreren Stufen einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
mit Phasenumkehr (RP-HPLC) arbeiten, um die MU-1 Proteine weiter
zu reinigen, wobei man hydrophobe RP-HPLC Medien einsetzt, z.B.
ein Siliziumdioxid-Gel mit anhängenden
Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen. Weiterhin kann man nach
gut bekannten Methoden Affinitätssäulen mit
Antikörpern
gegen das jeweilige MU-1 Protein zur Reinigung von MU-1 Proteinen
verwenden. Einige oder alle der zuvor beschriebenen Reinigungsstufen,
in verschiedenen Kombinationen oder mit anderen bekannten Methoden,
können
ebenfalls verwendet werden, um ein im wesentlichen reines isoliertes
rekombinantes Protein herzustellen. Vorteilhaft wird das isolierte
MU-1 Protein so weit gereinigt, dass es im wesentlichen frei von anderen
aus Säugetieren
stammenden Proteinen ist.
-
Die
MU-1 Proteine nach der Erfindung können auch verwendet werden,
um Stoffe zu suchen, die an MU-1 binden können. Bindungstests unter Verwendung
eines gewünschten
bindenden Proteins, immobilisiert oder nicht, sind in der Technik
gut bekannt und können
für diesen
Zweck eingesetzt werden, wobei das MU-1 Protein nach der Erfindung
verwendet wird. Suchtests auf der Basis von gereinigten Zellen oder
von Proteinen (ohne Zellen) können
verwendet werden, um solche Stoffe zu identifizieren. Beispielsweise
kann ein MU-1 Protein in gereinigter Form auf einem Trägerstoff
immobilisiert werden, und die Bindung von potentiellen Liganden an
das gereinigte MU-1 Protein kann gemessen werden.
-
MU-1
Proteine, aus Zellen gereinigt oder rekombinant hergestellt, können auf
einen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff aufgebracht und in
dieser Form als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet werden.
Solche Zusammensetzungen können,
neben dem MU-1 Protein
oder einem Inhibitor und einem Trägerstoff, verschiedene Verdünnungsmittel,
Füllstoffe,
Puffermaterialien, Salze, Stabilisatoren, Solubilisierungsmittel
sowie andere Materialien enthalten, wie in der Technik gut bekannt
ist. Die Bezeichnung „pharmazeutisch
akzeptabel" bezieht
sich auf ein nicht toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen
Aktivität des
aktiven Wirkstoffs (oder der aktiven Wirkstoffe) nicht beeinträchtigt.
Die Eigenschaften des Trägerstoffs hängen von
der An der geplanten Anwendung ab.
-
Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der Erfindung können auch
Zytokine, Lymphokine oder andere hämatopoetische Faktoren enthalten,
wie z.B. M-CSF, GM-CSF, Il-1,
IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12,
IL-14, IL-15, G-CSF, Stammzellenfaktor und Erythropoetin. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
auch gegen ein Zytokin gerichtete Antikörper enthalten. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
auch thrombolytische oder antithrombolytische Faktoren aufweisen,
wie z.B. Plasminogenaktivator und Faktor VIII. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
weiterhin andere entzündungshemmende
Stoffe enthalten. Solche zusätzlichen
Faktoren und bzw. oder Stoffe können
in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um einen
synergistischen Effekt mit dem darin enthaltenen isolierten MU-1
Protein zu erzeugen oder um Nebenwirkungen zu minimieren, die durch
das isolierte MU-1 Protein verursacht werden könnten. Umgekehrt kann ein isoliertes
MU-1 Protein in Formulierungen eines bestimmten Zytokins, Lymphokins
oder anderen hämatopoetischen
Faktors, thrombolytischen oder antithrombolytischen Stoffes oder
entzündungshemmenden
Stoffes enthalten sein, um Nebenwirkungen des Zytokins, Lymphokins
oder anderen hämatopoetischen
Faktors, des thrombolytischen oder antithrombolytischen Stoffes
oder des entzündungshemmenden
Stoffes zu minimieren.
-
Die
pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung kann die Form
eines Liposoms haben, in dem das isolierte MU-1 Protein, zusätzlich zu
anderen pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoffen, mit amphipatischen
Stoffen, wie z.B. Lipiden, kombiniert ist, die in Gesamtform (aggregated
form) als Micellen, unlösliche
Monoschichten, flüssige
Kristalle oder lamellare Schichten existieren. Zu den geeigneten
Lipiden für
liposomale Formulieren zählen,
wenn auch nicht ausschließlich,
Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide,
Saponin, Gallensäure
und ähnliche
Stoffe. Die Herstellung solcher liposomaler Formulierungen ist dem
Fachmann bekannt und ist z.B. offenbart im U.S. Patent Nr. 4,235,871,
U.S. Patent Nr. 4,501,728, U.S. Patent Nr. 4,837,028 und U.S. Patent
Nr. 4,737,323.
-
Im
Sinne dieser Erfindung bedeutet die Bezeichnung „therapeutisch wirksame Menge" die Gesamtmenge
jeder aktiven Komponente der pharmazeutischen Zusammensetzung oder
Methode, die ausreicht, um einen signifikanten Nutzen für den Patienten
zu erreichen, d.h. eine Milderung von Symptomen, eine Heilung von
seiner Krankheit oder eine Beschleunigung der Heilung. Wenn nur
der Wirkstoff allein dem Patienten zugeführt wird, bezieht sich die
Bezeichnung auf den Wirkstoff allein. Wenn sich die Bezeichnung
auf eine Kombination bezieht, betrifft sie die vereinigten Mengen
der Wirkstoffe, die den therapeutischen Effekt bewirken, unabhängig davon,
ob die Wirkstoffe in Kombination, nacheinander oder gleichzeitig
zugeführt
werden.
-
Bei
der Ausübung
des Behandlungsverfahrens oder der Verwendung nach der vorliegenden
Erfindung wird einem Säugetier
eine therapeutisch wirksame Menge eines MU-1 Proteins zugeführt. Das
isolierte MU-1 Protein kann nach dem Verfahren der Erfindung entweder
allein oder in Kombination mit anderen Therapien, wie z.B. einer
Behandlung mit Zytokinen, Lymphokinen oder anderen hämatopoetischen
Faktoren, zugeführt werden.
Wenn das MU-1 Protein zusammen mit einem oder mehreren Cytokin(en),
Lymphokin(en) oder anderen hämatopoetischen
Faktor(en) eingesetzt wird, kann es entweder gleichzeitig mit dem
oder den Cytokin(en), Lymphokin(en) oder anderen hämatopoetischen
Faktor(en) oder thrombolytischen oder antithrombolytischen Faktor(en)
zugeführt
werden, oder diese Komponenten können
nacheinander (sequentiell) zugeführt werden.
Wenn sie sequentiell zugeführt
werden, muss der behandelnde Arzt entscheiden, in welcher Reihenfolge
das MU-1 Protein in Verbindung mit dem oder den Zytokin(en), Lymphokin(en)
oder anderen hämatopoetischen
Faktor(en) oder thrombolytischen oder antithrombolytischen Faktor(en)
eingesetzt wird.
-
Die
Verabreichung von MU-1 Protein, das in der pharmazeutischen Zusammensetzung
verwendet wird, oder die Ausübung
der Methode nach der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedene
konventionelle Art und Weise erfolgen, z.B. durch orales Einnehmen
oder Inhalieren, durch die Haut (cutaneous), subkutane oder intravenöse Injektion.
Die intravenöse
Verabreichung an den Patienten wird bevorzugt.
-
Wenn
eine therapeutisch wirksame Menge an MU-1 Protein oral verabfolgt
wird, liegt das MU-1 Protein in Form einer Tablette, Kapsel, eines
Pulvers, einer Lösung
oder eines Elixiers vor. Bei Verabreichung in Tablettenform kann
die pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung zusätzlich einen
festen Trägerstoff,
wie z.B. Gelatine, oder ein Adjuvans enthalten. Die Tablette, Kapsel
und das Pulver enthalten von etwa 5 bis etwa 95% MU-1 Protein und
vorteilhaft von etwa 25 bis etwa 90% MU-1 Protein. Wenn das MU-1 Protein
in flüssiger
Form verabreicht wird, kann ein flüssiger Trägerstoff, wie z.B. Wasser,
Petroleum, Öle
tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, wie z.B. Erdnussöl, Mineralöl, Sojabohnenöl oder Sesamöl oder ein
synthetisches Öl,
zugesetzt werden. Die flüssige
Form der pharmazeutischen Zusammensetzung kann weiterhin physiologische
Kochsalzlösung,
die Lösung
von Dextrose oder eines anderen Zuckers oder ein Glykol, wie z.B. Ethylenglykol,
Propylenglykol oder Polyethylenglykol, enthalten. Wenn die pharmazeutische
Zusammensetzung in flüssiger
Form verabfolgt wird, enthält
sie von etwa 0,5 bis 90 Gewichtsprozent MU-1 Protein, vorteilhaft
von etwa 1 bis etwa 50% MU-1 Protein.
-
Wenn
eine therapeutisch wirksame Menge eines MU-1 Proteins durch intravenöse, kutane
oder subkutane Injektion verabfolgt wird, liegt das MU-1 Protein
in Form einer von pyrogenen Stoffen freien, parenteral akzeptablen
wässrigen
Lösung
vor. Die Herstellung solcher parenteral akzeptabler Proteinlösungen gehört hinsichtlich
des pH, isotonischer Eigenschaften, Stabilität usw. zum Stand der Technik.
Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung zur intravenösen, kutanen
oder subkutanen Injektion sollte neben dem MU-1 Protein ein Isotonie
erzeugendes Mittel, wie z.B. Sodium Chloride Injection, Ringer's Injection, Dextrose
Injection, Dextrose and Sodium Chloride Injection Lactated Ringer's Injection oder
andere in der Technik bekannte Mittel enthalten. Pharmazeutische
Zusammensetzungen nach der Erfindung können auch Stabilisatoren, Konservierungsstoffe,
Puffer, oder andere dem Fachmann bekannte Stoffe enthalten.
-
Die
Menge des in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenen MU-1
Proteins hängt
von der Art und der Schwere der zu behandelnden Krankheit ab sowie
von der Art der vorhergehenden Behandlungen, denen der Patient unterzogen
wurde. Letzten Endes wird der behandelnde Arzt über die Menge an MU-1 Protein
entscheiden, mit der der Patient individuell behandelt wird. Zu
Anfang wird der behandelnde Arzt niedrige Dosen MU-1 Protein verabfolgen
und die Reaktion des Patienten beobachten. Dann können größere Dosen MU-1
Protein verabfolgt werden, bis der optimale therapeutische Effekt
für den
Patienten erreicht ist. Zu diesem Zeitpunkt wird die Dosierung im
allgemeinen nicht mehr erhöht.
Es wird erwogen, dass die verschiedenen pharmazeutischen Zusammensetzungen,
die für
die Ausübung
der Methode nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, von
etwa 0,1 μg
bis etwa 100 mg MU-1 Protein je kg Körpergewicht enthalten sollten.
-
Die
Dauer der intravenösen
Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen nach
der vorliegenden Erfindung variiert in Abhängigkeit von der Schwere der
zu behandelnden Erkrankung, dem Befinden und der potentiell überempfindlichen
Reaktion jedes einzelnen Patienten. Es wird erwogen, dass die Dauer
jeder Anwendung des MU-1 Proteins im Bereich von 12 bis 24 Stunden
kontinuierlicher intravenöser
Verabfolgung liegt. Letzten Endes wird der behandelnde Arzt über die
angemessene Dauer der intravenösen
Therapie unter Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung nach
der vorliegenden Erfindung entscheiden.
-
Es
wird erwartet, dass die Polynukleotide und Proteine nach der vorliegenden
Erfindung sich für
eine oder mehrere der in der Folge identifizierten Verwendungen
oder biologischen Aktivitäten
(einschließlich
der mit den hierin zitierten Assays verbundenen Aktivitäten) eignen.
Verwendungen oder Aktivitäten,
wie sie für
die Proteine nach der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden
bzw. werden, können
durch Verabfolgung oder Verwendung dieser Proteine oder durch Verabfolgung
oder Verwendung der Polynukleotide, die für diese Proteine kodieren,
realisiert werden (beispielsweise bei Gentherapien oder Vektoren,
die sich für
die Einführung von
DNS eignen).
-
Zytokin-Aktivität und Aktivität bei der
Proliferation/Differenzierung von Zellen
-
Die
Proteine nach der vorliegenden Erfindung können Zytokin-Aktivität, Aktivität bei der
Proliferation (entweder induzierend oder inhibierend) oder Differenzierung
(wiederum induzierend oder inhibierend) von Zellen zeigen oder können die
Produktion von anderen Zytokinen in bestimmten Zellpopulationen
induzieren. Viele bis heute entdeckte Proteinfaktoren, einschließlich aller
bekannten Zytokine, haben Aktivität in einem oder mehreren Faktor-abhängigen Zellproliferations-Assays
gezeigt, und daher dienen diese Assays als ein gut geeignetes Mittel,
um Zytokin-Aktivität
festzustellen. Die Aktivität
eines Proteins nach der vorliegenden Erfindung wird bestimmt unter
Verwendung eines der mehrerer routinemäßig verwendeter Faktor-abhängiger Zellproliferations-Assays
für Zelllinien,
zu denen, ohne Limitierung hierauf, 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/B11, BaF3,
MC9/G, M+ (preB M+), 2E8, RBS, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2, TF-1,
Mo7e und CMK gehören.
-
Die
Aktivität
eines Proteins nach der vorliegenden Erfindung kann neben anderen
Verfahren nach den folgenden Methoden bestimmt werden:
Zu den
Assays für
T-Zell- oder Thymocytenproliferation zählen ohne Beschränkung hierauf,
die in den folgenden Referenzen beschriebenen Assays: Current Protocols
in Immunology, Herausgeber J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies,
E.M. Shevach, W. Strober, Verlag Greene Publishing Associates sowie
Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte
Function 3.1 bis 3.19; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans);
weiterhin Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli
et al., J. Immunol. 145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cellular
Immunology 133:327-341, 1991; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783,
1882; und Bowman et al., J. Immunol. 152:1756-1761, 1994.
-
Zu
den Assays für
die Produktion von Zytokinen und/oder die Proliferation von Milzzellen,
Lymphknotenzellen oder Thymocyten zählen, ohne Beschränkung hierauf,
die Assays, die beschrieben werden in: Polyklonal Stimulation of
T-Cells, Kruisbeek A.M. und Shevach E.M. in Current Protocols in
Immunology, Herausgeber J.E. Coligan et al., Band 1 pp. 3.12.1 bis
3.12.14, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; und Measurement of
Mouse and Human Interferon-?, Schreiber R.D. in Current Protocols
in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.8.1
bis 6.8.8, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
-
Zu
den Assays für
die Proliferation und Differenzierung von hämatopoetischen und lymphopoetischen Zellen
gehören,
ohne Beschränkung
hierauf, die in den folgenden Referenzen beschriebenen Assays: Measurement
of Human and Murine Interleukin-2 and Interleukin-4, Bottomly, K,
Davis, L.S. und Lipsky, P.E. in Current Protocols in Immunology,
Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.3.1 bis 6.3.12, John
Wiley and Sons, Toronto, 1991; de Vries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211,
1991; Moreau et al., Nature 336:690-692, 1988; Greenberger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2931-2938, 1983; Measurement of
Mouse and Human Interleukin-6, Nordan, R. in Current Protocols in
Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.6.1 bis
6.6.5, John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Smith et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 83:1857-1861, 1986; Measurement of Human Interleukin-11,
Bennett, F., Giannetti, J., Clark, S.C. und Turner, K.J. in Current Protocols
in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan et al., Band 1 pp. 6.15.1,
John Wiley and Sons, Toronto, 1991; Measurement of Mouse and Human
Interleukin-9, Ciarletta, A., Gianotti, J., Clark, S.C. und Turner,
K.J. in Current Protocols in Immunology, Herausgeber T.E. Coligan
et al., Band 1 pp. 6.13.1, John Wiley and Sons, Toronto, 1991.
-
Zu
den Assays für
die Reaktion von T-Zellklonen auf Antigene (die u.a. Proteine, die
die Wechselwirkungen von APC mit T-Zellen beeinflussen, ebenso wie
direkte T-Zelleneffekte identifizieren, indem sie die Proliferation
und die Produktion von Zytokinen messen) gehören, ohne Beschränkung hierauf,
die Assays, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology,
herausgegeben von J. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies,
E.M. Shevach, W. Strober, Verlag Greene Publishing Associates sowie
Wiley-Interscience (Kapitel 3, In Vitro Assays for Mouse Lymphocyte
Function; Kapitel 6, Cytokines and their Cellular Receptors; Kapitel 7,
Immunologic Studies in Humans); Weinberger et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 77:6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur. J. Immun.
11:405-411, 1981; Takai et al. J. Immunol. 137:3494-3500, 1986;
Takai et al., J. Immunol. 140, 508-512, 1988.
-
Die Immunantwort stimulierende
oder suppressive Aktivität
-
Ein
Protein nach der gegenwärtigen
Erfindung kann auch eine immunstimulierende oder immunsuppressive
Aktivität
aufweisen, einschließlich
von, aber nicht beschränkt
auf diejenigen Aktivitäten,
für die
hierin Assays beschrieben sind. Ein Protein kann für die Behandlung
von verschiedenen Immundefekten oder krankheiten brauchbar sein
(mit Einschluss von schweren kombinierten Immundefekten (SCID)),
z.B. für
die Regulierung (hoch oder herunter) des Wachstums und Proliferation
von T- und/oder B-Lymphozyten, und ebenso die zytolytische Aktivität von NK-Zellen
und anderen Zellpopulationen bewirken. Diese Immundefekte können angeboren
sein oder durch virale (z.B. mittels HIV), bakterielle oder durch
Pilze verursachte Infektionen oder aber durch Autoimmunkrankheiten
ausgelöst
werden. Genauer gesagt können
ansteckende Krankheiten, die durch Viren, Bakterien oder Pilze oder
auf andere Weise ausgelöst
wurden, durch Verwendung eines Proteins nach der vorliegenden Erfindung
behandelbar sein. Dazu zählen
Infektionen durch HIV, Hepatitisviren, Herpesviren, Mycobakterien,
Leishmania pp., Malaria pp. und verschiedene durch Pilze verursachte
Infektionen, wie z.B. Candidiasis. Natürlich kann ein Protein nach
der vorliegenden Erfindung in dieser Beziehung auch nützlich sein,
wenn eine allgemeine Stärkung
des Immunsystems erwünscht
ist, das heißt
bei der Behandlung von Krebs.
-
Zu
den Autoimmunkrankheiten, die unter Verwendung eines Proteins nach
der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, gehören z.B. Bindegewebekrankheiten,
multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide
Arthritis, autoimmune Lungenentzündung,
Guillain-Barre Syndrom, autoimmune Thyroiditis, Insulin-abhängiger Diabetes
mellitus, Myasthenia gravis, Graft-versus-Host Krankheit und autoimmune
entzündliche
Augenkrankheiten. Ein solches Protein nach der vorliegenden Erfindung
kann auch für
die Behandlung von allergischen Reaktionen und Zuständen nützlich sein,
z.B. von Asthma (insbesondere von allergischem Asthma) oder anderen
mit der Atmung zusammenhängenden
Problemen. Auch in anderen Situationen, in denen eine Unterdrückung des
Immunsystems erwünscht
ist (z.B. bei Organtransplantationen), kann ein Patient mit einem
Protein nach der vorliegenden Erfindung behandelbar sein.
-
Die
MU-1 DNS ist auch der chromosomale Ort für Morbus Crohn. Infolgedessen
können
Proteine nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Morbus
Crohn und andere entzündliche
Krankheiten der Eingeweide zu behandeln.
-
Eine
Verwendung der Proteine nach der Erfindung kann auch möglich sein,
wenn man die Immunantwort auf verschiedene Weise regulieren will.
Man kann sie heruntenegeln, indem man eine bereits im Aufbau befindliche
Immunantwort inhibiert oder blockiert. Oder man kann die Induzierung
einer Immunantwort von vornherein verhindern. Die Funktionen von
aktivierten T-Zellen können
inhibiert werden, indem man die Immunantwort der T-Zellen unterdrückt oder
indem man spezifische Toleranzen in T-Zellen induziert, oder auf
beiderlei Art und Weise. Die Unterdrückung der Immunantwort von
T-Zellen ist ganz allgemein ein aktiver, nicht Antigen-spezifischer
Prozess, der eine kontinuierliche Einwirkung des unterdrückenden
Agens auf die T-Zellen erfordert. Eine Toleranz, bei der ein Ausbleiben
der Immunantwort oder eine Anergie in T-Zellen induziert wird, ist
von einer Immunosuppresseion dadurch unterscheidbar, dass sie ganz
allgemein Antigen-spezifisch ist und andauert, nachdem die Einwirkung
des die Toleranz bewirkenden Agens beendet ist. Das Vorliegen von
Toleranz kann dadurch demonstriert werden, dass in Abwesenheit des
die Toleranz bewirkenden Agens bei erneuter Einwirkung eines spezifischen
Antigens die Immunantwort der T-Zellen ausbleibt.
-
Das
Herunterregeln oder Ausschalten einer oder mehrerer Antigen-Funktionen
(einschließlich
von, aber nicht beschränkt
auf B-Lymphozyten-Antigenfunktionen (wie z.B. B7)), beispielsweise
die Verhinderung der Synthese von großen Mengen an Lymphokinen durch
aktivierte T-Zellen, wird bei Transplantationen von Gewebe, Haut
und Organen und bei Graft-versus-Host Krankheit (GVHD) nützlich sein.
Beispielsweise sollte die Blockierung der T-Zellenfunktion dazu
führen,
dass bei Gewebetransplantationen weniger Gewebe zerstört wird.
Typischerweise wird bei Gewebetransplantationen die Abstoßung des
transplantierten Gewebes dadurch initiiert, dass die T-Zellen es
als fremd erkennen, worauf eine Immunreaktion folgt, die das Transplantat
zerstört.
Die Verabreichung eines Moleküls
vor der Transplantation, das die Wechselwirkung eines Antigens von B-Lymphozyten
mit seinem oder seinen natürlichen
Liganden auf Immunzellen (wie z.B. die lösliche, monomere Form eines
Peptids mit B7-2 Aktivität,
allein oder in Verbindung mit einer monomeren Form eines Peptids mit
einer Aktivität
eines anderen B-Lymphozyten Antigens (wie z.B. B7-3) oder ein blockierender
Antikörper) inhibiert
oder blockiert, kann dazu führen,
dass das Molekül
an den oder die natürlichen
Liganden auf den Immunzellen bindet, ohne das entsprechende co-stimulierende
Signal zu transmittieren. Die so bewirkte Blockierung der B-Lymphozyten-Antigenfunktion
verhindert die Synthese von Zytokinen durch Immunzellen, wie z.B. T-Zellen,
und unterdrückt
somit die Immunantwort. Darüber
hinaus kann das Ausbleiben einer Co-stimulation dazu ausreichen,
die T-Zellen zu anergisieren (anergize), wodurch in einem Subjekt
Toleranz induziert wird. Die Induktion von Langzeittoleranz durch
B-Lym-phocyten-Antigene blockierende Reagenzien kann es unnötig machen,
diese blockierenden Reagenzien wiederholt zu verabfolgen. Es kann
auch erforderlich sein, die Funktion einer Kombination mehrerer
B-Lymphozyten-Antigene zu blockieren, um eine ausreichende Immunosuppression-
oder -toleranz in einem Patienten zu erreichen.
-
Die
Wirksamkeit eines bestimmten blockierenden Reagenz für die Verhinderung
der Abstoßung
eines transplantierten Organs oder von GVHD kann durch Verwendung
eines Tiermodells abgeschätzt
werden, das Vorhersagen für
die Wirksamkeit in Menschen gestattet. Beispiele für zweckentsprechende
Systeme, die verwendet werden können,
schließen
allogenische Herztransplantate in Ratten und xenogenische Transplantate von
Pankreasinselzellen in Mäusen
ein. Beide Modelle sind verwendet worden, um die immunsuppressiven Wirkungen
von CTLA4Ig Fusionsproteinen in vivo zu untersuchen, wie von Lenschow
et al. in Science 257: 789-792 (1992) und Turka et al. in Proc.
Natl. Acad. Sc. U.S.A., 11102-11105 (1992) beschrieben wurde. Weiterhin
können
Maus-Modelle von GVHD (siehe Paul als Herausgeber von Fundamental
Immunology, Raven Press, New York, 1989, Seiten 846-847) verwendet
werden, um die Wirkung der Blockierung der B-Lymphozyten-Antigenfunktion auf die
Entwicklung dieser Krankheit in vivo zu bestimmen.
-
Die
Blockierung der Antigenfunktion kann auch für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen
therapeutisch brauchbar sein. Viele Autoimmunkrankheiten sind das
Ergebnis einer nicht normalen Aktivierung von T-Zellen, die gegen
körpereigenes
Gewebe reaktiv sind und die die Produktion von Zytokinen und Autoantikörpern fördern, die
in die Pathologie dieser Krankheiten involviert sind. Symptome dieser
Krankheiten können
gemildert oder beseitigt werden, wenn man die Aktivierung von autoreaktiven
T-Zellen verhindert. Reagenzien, die die Co-Stimulation von T-Zellen
durch Unterbrechung der Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung von B-Lymphozyten-Antigenen
blockieren, können
verabfolgt werden, um die Aktivierung von T-Zellen zu inhibieren
und die Produktion von Autoantikörpern
oder von von T-Zellen abgeleiteten Zytokinen zu verhindern, die
in dieses Krankheitsgeschehen involviert sein können. Weiterhin können blockierende
Reagenzien eine Antigen-spezifische Toleranz von autoreaktiven T-Zellen
inhibieren, wodurch eine langfristige Erleichterung für den Patienten
erreicht werden könnte.
Die Wirksamkeit von blockierenden Reagenzien für die Verhinderung oder Milderung
von Autoimmunerkrankungen kann durch Verwendung einer Reihe von
gut charakterisierten Tiermodellen für humane Autoimmunkrankheiten
bestimmt werden. Zu den Modellen zählen experimentelle autoimmune
Autoencephalitis der Maus, systemischer Lupus erythematodes in MKLpr/lpr
Mäusen
oder NZB Hybridmäusen,
autoimmune Kollagenarthritis der Maus, Diabetes mellitus in NOD
Mäusen
oder BB Ratten und experimentelle Myasthenia gravis der Maus (siehe
Paul als Herausgeber von Fundamental Immunology, Raven Press, New
York, 1989, Seiten 840-856).
-
Die
Hochregelung einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer B-Lymphocyten-Antigenfunktion)
als ein Mittel zur Hochregelung von Immunantworten kann ebenfalls
in der Therapie nützlich
sein. Die Hochregelung von Immunantworten kann in der Form geschehen,
dass eine bestehende Immunantwort verstärkt oder eine neue, anfängliche
Immunantwort hervorgerufen wird. Beispielsweise kann die Verstärkung einer
Immunantwort durch Stimulierung der B-Lymphozyten-Antigenfunktion
im Fall von Viruserkrankungen nützlich
sein. Weiterhin könnten
systemische virale Krankheiten, wie z.B. Influenza, gewöhnliche
Erkältungen
und Enzephalitis, durch Verabfolgung von stimulierenden Formen von
B-Lymphozyten-Antigenen
systemisch gemildert werden.
-
Alternativ
können
antivirale Immunantworten in einem infizierten Patienten verstärkt werden,
indem man dem Patienten T-Zellen entnimmt, die T-Zellen in vitro
mit viralen Antigen-gepulsten APCs, die entweder ein Peptid nach
der vorliegenden Erfindung exprimieren, oder zusammen mit einer
stimulierenden Form eines löslichen
Peptids nach der vorliegenden Erfindung co-stimuliert und die in
vitro aktivierten T-Zellen in den Patienten zurückführt. Ein anderes Verfahren
zur Verstärkung
von antiviralen Immunantworten würde
darin bestehen, dass man infizierte Zellen aus einem Patienten isoliert,
sie mit einer Nukleinsäure
transfiziert, die für ein
Protein nach der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben,
kodiert, so dass die Zellen das Protein ganz oder zum Teil auf ihrer
Oberfläche
exprimieren, und die transfizierten Zellen in den Patienten zurückführt. Die
infizierten Zellen würden
dann in der Lage sein, ein co-stimulierendes Signal an T-Zellen
zu geben und diese dadurch in vivo zu aktivieren.
-
Bei
einer anderen Anwendung kann die Hochregelung oder Verstärkung einer
Antigenfunktion (vorzugsweise einer B-Lymphozyten-Antigenfunktion)
nützlich
bei der Induzierung einer Tumorimmunität sein. Tumorzellen (wie z.B.
Sarkom-, Melanom-, Lymphom-, Leukämie-, Neuroblastom- oder Karzinomzellen),
die mit einer Nukleinsäure
transfiziert sind, die für
mindesteins ein Protein nach der vorliegenden Erfindung kodiert, können einem
Patienten verabfolgt werden, um eine Tumor-spezifische Toleranz
dieses Patienten zu überwinden.
Die Tumorzelle kann so transfiziert werden, dass sie eine Kombination
von Peptiden exprimiert, wenn dies gewünscht wird. Beispielsweise
können
von einem Patienten entnommene Tumorzellen ex vivo mit einem Expressionsvektor
transfiziert werden, der die Expression eines Peptids mit B7-2-artiger
Aktivität
allein oder in Kombination mit einem Peptid mit B7-1-artiger Aktivität und/oder
B7-3-artiger Aktivität
bewirkt. Die transfizierten Tumorzellen werden in den Patienten
zurückgeführt, um
die Expression der Peptide auf der Oberfläche der Zelle zu bewirken.
Alternativ können
Techniken der Gentherapie angewandt werden, um Tumorzellen zur Transfizierung
in vivo zu ermitteln.
-
Die
Anwesenheit eines Peptids nach der vorliegenden Erfindung mit der
Aktivität
eines oder mehrerer B-Lymphozyten-Antigene auf der Oberfläche der
Tumorzelle ergibt das nötige
costimulierende Signal an T-Zellen, um eine durch T-Zellen vermittelte
Immunantwort gegen die Tumorzellen zu induzieren. Weiterhin können Tumorzellen,
denen MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Moleküle fehlen oder die nicht genügende Mengen
an MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Moleküle reexprimieren, mit Nukleinsäure transfiziert
werden, die ganz oder teilweise (z.B. beschränkt auf die cytoplasmatische
Domäne)
für ein
MHC Klasse I-a-Kettenprotein
und ein β2-Microglobulin-Protein oder für ein MHC
Klasse IIa-Kettenprotein und ein MHC Klasse II β-Kettenprotein kodieren, wodurch
MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Proteine auf der Zelloberfläche exprimiert
werden. Die Expression der geeigneten MHC der Klassen I oder II
in Verbindung mit einem Peptid mit der Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens (wie z.B. B7-1,
B7-2 oder B7-3) induziert eine durch T-Zellen vermittelte Immunantwort
gegen die transfizierte Tumorzelle. Wahlweise kann ein Gen, das
für ein
Antisensekonstrukt kodiert, welches die Expression eines mit MHC
der Klasse II assoziierten Proteins blockiert, wie z.B. die invariante
(invariant) Kette, ebenfalls mit einer DNS co-transfiziert werden,
die für
ein Peptid codiert, das die Aktivität eines B-Lymnphozyten-Antigens zeigt, um die
Präsentation
von Tumor-assoziierten Antigenen zu fördern und eine Tumor-spezifische
Immunität
zu induzieren. Die Induzierung einer durch T- Zellen vermittelten Immunantwort in
einem menschlichen Patienten kann somit ausreichend sein, um die
Tumor-spezifische Toleranz des Patienten zu überwinden.
-
Die
Aktivität
eines Proteins nach der Erfindung kann, neben anderen Verfahren,
mittels der folgenden Methoden bestimmt werden:
Zu den geeigneten
Assays für
Zytotoxizität
gegen Thymus- und Milzzellen zählen,
wenn auch nicht ausschließlich,
diejenigen, die beschriebenen sind in Current Protocols in Immunology,
Herausgeber T.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach,
W. Strober, Verlag Greene Publishing Associates und Wiley Interscience
(Kapitel 3, InVitro Assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1 bis
3.19; Kapitel 7, Immunologic Studies in Humans); Herrmann et al.,
Proc. Natl. Acad, Sci. U.S.A. 78: 2488-2492; Hemnan et al., J. Immunol. 128:1968.1974,
1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al.,
J.Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512,
1988; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2488-2492, 1981;
Herrman et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol.
135: 1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986;
Bowmanet et al., J. Virology 61:1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512,
1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991
und Brown et al., J. Immunology 153:3079-3092, 1994.
-
Zu
den Assays für
von T-Zellen abhängige
Immunglobulinantworten und Isotypwechsel (isotype switching) (wodurch
u.a. Proteine identifiziert werden, die von T-Zellen abhängige Antikörperantworten
modulieren und die Th1/Th2-Profile beeinflussen) gehören, ohne
Beschränkung
darauf, diejenigen, die beschrieben wurden von Maliszewski, J. Immunol.
144:3028-3033, 1990; und Assays für die Funktion von B-Zellen:
In vitro Antibody Production, Mond J.J. und Brunswick, M. in Current
Protocols in Immunology, Herausgeber J.E. Coligan et al., Band 1,
Seiten 3.8.1 bis 3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto, 1994.
-
Zu
den gemischten Lymphozytenreaktions (MLR)-Assays (welche u.a. Proteine
identifizieren, die vorwiegend Th1- und CTL-Antworten generieren)
zählen,
aber nicht ausschließlich,
diejenigen, die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology,
herausgegeben von L. E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M.
Shevach, W.
-
Strober,
Verlag Greene Publishing Associates und Wiley-Interscience (Kapitel
3, In Vitro Assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Kapitel
7, Immunology Studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500,
1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; und Bertagnolli et al., J.
Immunol. 149:3778-3783, 1992.
-
Von
dendritischen Zellen abhängige
Assays identifizieren u.a. Proteine, die von dendritischen Zellen exprimiert
werden und naive (naive) T-Zellen aktivieren. Zu diesen Assays gehören, ohne
Beschränkung
hierauf, diejenigen, die beschrieben sind in: Guery et al., J. Immunol.
134:536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine
173:549-559, 1991; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079,
1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260,
1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang
et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of
Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal
of Clinical Investigation 94:797-807,
1994; und Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640,
1990.
-
Zu
den Assays für
das Überleben
oder die Apoptose von Lymphocyten (die u.a. Proteine identifizieren, welche
die Homöostase
von Lymphozyten regulieren) zählen,
ohne Beschränkung
hierauf, diejenigen, die beschrieben sind in: Darzynkiewicz et al.,
Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993;
Gorczyca et al., Cancer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al.,
Cell 66:233-243, 1991; Zacharuk, Journal of Immunology 145:4037-4045,
1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al.,
International Journal of Onkology 1:639-648, 1992.
-
Assays
für Proteine,
die die frühen
Stadien der Reifung und Entwicklung von T-Zellen beeinflussen, schließen ein,
sind jedoch nicht beschränkt
auf diejenigen, die beschrieben sind in: Anica et al., Blood 84:111-117,
1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et
al., Blood 85:2770-2778, q995; und Toki et al., Proc. Natl. Acad.
Schi. USA 88:7548-7551, 1991.
-
Hämatopoese regulierende Aktivität
-
Proteine
nach der vorliegenden Erfindung können für die Regulierung von Hämatopoese
und daher für
die Behandlung von myeloiden oder lymphoiden Zelldefekten nützlich sein.
Selbst marginale biologische Aktivitäten zur Unterstützung von
Kolonie-bildenden Zellen oder von Faktor-abhängigen Zelllinien sind ein
Anzeichen für
eine Beteiligung an der Regulierung von Hämatopoese, z.B. durch Unterstützung des
Wachstums und der Vermehrung von erythroiden Vorläuferzellen,
allein oder in Verbindung mit anderen Zytokinen, wodurch z.B. eine
Brauchbarkeit für
die Behandlung von verschiedenen Anämien oder zur Verwendung in
Verbindung mit Strahlen- oder Chemotherapie zur Stimulierung der
Produktion von erythroiden Vorläufern und/oder
erythroiden Zellen angezeigt wird; durch Unterstützung des Wachstums und der
Vermehrung von myeloiden Zellen, wie z.B. Granulocyten und Monocyten
oder Makrophagen (d.h. eine traditionelle CSF Aktivität), was
z.B. in Verbindung mit einer Chemotherapie nützlich ist, um eine nachfolgende
Myelosuppression zu verhindern oder zu behandeln; durch Unterstützung des
Wachstums und der Vermehrung von Megakaryocyten und dementsprechend
von Blutplättchen,
was die Verhinderung oder Behandlung verschiedener Blutplättchenkrankheiten,
wie z.B. Thrombozytopenie, erlaubt, oder allgemein zur Verwendung
an Stelle von oder zusätzlich
zu Blutplättchentransfusionen;
und/oder durch Unterstützung
des Wachstums und der Vermehrung von hämatopoetischen Stammzellen,
die zu jeder und allen der zuvor erwähnten hämatopoetischen Zellen zu reifen
vermögen
und daher bei verschiedenen Stammzellenkrankheiten (wie z.B. bei
Krankheiten, die üblicherweise
durch eine Transplantation behandelt werden, einschließlich von,
aber nicht beschränkt
auf aplastische Anämie
und paroxysmale nächtliche
Hämoglobinurie)
therapeutische Verwendung finden können, ebenso wie bei der Wiederauffüllung des
Vorrats an Stammzellen nach Strahlungs- und/oder Chemotherapie,
entweder in vivo oder ex vivo (d.h. in Verbindung mit Knochenmarktransplantation
oder Transplantation von peripheren Vorläuferzellen (homologen oder
heterologen)) als normale Zellen oder genetisch veränderte Zellen
zur Gentherapie.
-
Die
Aktivität
eines Proteins nach der Erfindung kann u.a. mittels der folgenden
Methoden gemessen werden:
Geeignete Assays für die Proliferation
und Differenzierung von verschiedenen hämatopoetischen Zellen sind zuvor
zitiert worden.
-
Zu
den Assays für
die Differenzierung von embryonalen Stammzellen (die u.a. Proteine
identifizieren, welche die embryonale Differenzierungshämatopoese
beeinflussen) zählen,
jedoch nicht ausschließlich,
diejenigen, die beschrieben sind in: Johansson et al., Cellular
Biology, 15:141-151, 1995; Keller et al., Molecular and Cellular
Biology 13:473-486, 1993; und McClanahan et al., Blood 81: 2903-2915,
1993.
-
Zu
den Assays für
das Überleben
und die Differenzierung von Stammzellen (die u.a. Proteine identifizieren,
welche die Lymphocyten-Hämatopoese
regulieren) zählen,
ohne Beschränkung
hierauf diejenigen, welche beschrieben sind in: Methylcellulose
Colony Forming Assays, Freshney, M.G. in Culture of Hematopoietic
Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten 265-268, Wiley-Liss,
Inc., New York, N.Y., 1994; Hirayama et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89:5907-5911, 1992; Primitive hematopoietic colony forming cells with
high proliferative potential, McNiece, I.K. und Briddell, R.A.,
in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et
al., Band Seiten 23-39, Wiley-Liss, Inc. Newe York, N.Y. 1994; Neben
et al., Experimental Hematology 22:353-359, 1994; Cobblestone area
forming cell assay, Ploemacher, R.E. in Culture of Hematopoietic
Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten 1-21, Wiley-Liss,
Inc., New York, N.Y., 1994; Long-term bone marrow cultures in the
presence of stromal cells, Spooncer, E., Dexter, M. und Allen, T.
in Culture of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et
al., Band Seiten 163-179, Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y., 1994;
Long-term culture initiating cell assay, Sutherland, H.J. in Culture
of Hematopoietic Cells, Herausgeber R.I. Freshney et al., Band Seiten
139-162, Wiley-Liss,
Inc., New York, N.Y., 1994.
-
Verwendbarkeit und Nutzen
in der Forschung
-
Durch
die vorliegende Erfindung verfügbar
gewordene Polynukleotide können
in der Forschung für verschiedene
Zwecke eingesetzt werden. Die Polynukleotide können verwendet werden, um rekombinante Proteine
zur Analyse, Chrakterisierung oder therapeutischen Verwendung zu
exprimieren; als Marker in Geweben, in denen das entsprechende Protein
bevorzugt exprimiert wird (entweder der Konstitution entsprechend
oder in einem bestimmten Stadium der Differenzierung oder Entwicklung
des Gewebes oder im Krankheitsfall); als Molekulargewichtsmarker
auf Southern Gelen; als Marker oder Anhängsel (tags) von Chromosomen
(wenn diese markiert sind), um Chromosomen zu identifizieren oder
um zugehörige
(related) Genpositionen zu kartieren; zum Vergleich mit endogenen
DNS-Sequenzen von Patienten, um potentielle genetische Krankheiten
zu identifizieren; als Sonden zur Hybridisierung mit und somit zur
Entdeckung von neuen, verwandten DNS-Sequenzen; als Informationsquelle
für die
Konstruktion von Primern für
genetische Fingerabdrücke;
als Sonden zum Aussondern von bekannten Sequenzen bei einem Verfahren
zur Entdeckung neuer Polynukleotide; zur Selektion und Herstellung
von Oligomeren zur Anbringung auf einem „Genchip" oder anderem Träger, einschließlich zur
Untersuchung von Expressionsmustern; und als Antigen zur Generierung
von Anti-DNS-Antikörpern oder
um eine andere Immunantwort hervorzurufen. Wenn das Polynukleotid
für ein
Protein kodiert, das erwiesenermaßen oder möglicherweise an ein anderes
Protein bindet (beispielsweise in einer Wechselwirlung zwischen
Rezeptor und Ligand), kann das Polynukleotid auch in dem Wechselwirkungsfallen-Assay
(interaction trap assay) eingesetzt werden, der von Gyuris et al.
in Cell 75:791-803, 1993 beschrieben wurde und Polynukleotide zu
identifizieren gestattet, die für
das andere Protein kodieren, an das das Protein bindet, oder um
Inhibitoren für
die Bindung zu identifizieren.
-
Die
Proteine, die durch die vorliegende Erfindung verfügbar geworden
sind, können
in ähnlicher
Weise in einem Assay zur Bestimmung von biologischer Aktivität verwendet
werden, einschließlich
der biologischen Aktivitäten
eines Satzes (panel) von mehreren Proteinen zur Durchmusterung mit
hohem Durchsatz. Die Proteine können
weiterhin verwendet werden, um Antikörper zu generieren oder eine
andere Immunantwort hervorzurufen; als Reagenz (mit Einschluss des
markierten Reagenz) in einem Assay zur Bestimmung des Gehalts an
dem Protein in biologischen Flüssigkeiten;
als Marker für
Gewebe, in denen das entsprechende Protein bevorzugt exprimiert
wird (entweder der Konstitution entsprechend oder in einem bestimmten
Stadium der Differenzierung oder Entwicklung oder im Krankheitsfall);
und natürlich
um entsprechende Rezeptoren und Liganden zu isolieren. Wenn das
Protein erwiesenermaßen
oder potentiell an ein anderes Protein bindet (wie z.B. bei einer
Wechselwirkung von Rezeptor und Ligand), kann das Protein verwendet
werden, um das andere Protein zu identifizieren, an das es bindet,
oder um Inhibitoren für
die Wechselwirkung zu identifizieren. Proteine, die an dieser Bindungswechselwirkung
teilnehmen, können
auch verwendet werden, um Peptid- oder Small-Molecule-Inhibitoren
oder Agonisten der Bindungswechselwirkung zu suchen.
-
Jede
oder alle dieser Verwendungen in der Forschung kann bzw. können bis
zum Reagenz oder Kit für
den kommerziellen Einsatz als Forschungswerkzeuge entwickelt werden.
-
Verfahren
zur Nutzung der zuvor aufgeführten
Verwendungen sind dem Fachmann gut bekannt. Zu den Druckschriften,
die solche Verfahren offenbaren, zählen, ohne Beschränkung hierauf, „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, herausgegeben
von Sambrook, J., E.F. Fritsch und T. Maniatis, 1989; und „Methods
in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press,
herausgegeben von Berger, S.L. und A.R. Kimmel, 1987.
-
Verwendungen auf dem Gebiet
der Nahrungsmittel
-
Polynukleotide
und Proteine nach der vorliegenden Erfindung können auch als Quellen für Nahrungsmittel
oder Nahrungsergänzungsprodukte
Verwendung finden. Zu diesen Verwendungen zählen, jedoch nicht ausschließlich, die
Verwendung als zusätzliches
Protein oder zusätzliche
Aminosäure
oder als Quelle für
Kohlenstoff, Stickstoff oder Kohlenhydrate. In solchen Fällen können die
Proteine oder Polynukleotide nach der Erfindung der Nahrung für einen
bestimmten Organismus zugesetzt oder als getrennte feste oder flüssige Zubereitung
verabreicht werden, wie z.B. in Form von Pulver, Pillen, Lösungen,
Suspensionen oder Kapseln. Im Falle von Mikroorganismen können die
Proteine oder Polynukleotide nach der Erfindung dem Medium zugesetzt
werden, in dem oder auf dem der Mikroorganismus kultiviert wird.
-
MU-1
Proteine nach der Erfindung können
auch verwendet werden, um Tiere zu immunisieren, um polyklonale
und monoklonale Antikörper
herzustellen, die mit dem MU-1 Protein spezifisch reagieren und
die die Bindung von Liganden an Rezeptoren inhibieren können. Solche
Antikörper
können
erhalten werden, indem man als Immunogen das gesamte MU-1 oder Fragmente
davon als Antigen benutzt. Kleinere Fragmente von MU-1 können auch
verwendet werden, um Tiere zu immunisieren. Die als Immunogen eingesetzten
Peptide können
zusätzlich
einen Cysteinrest am Carboxy-Terminus aufweisen und sind mit einem
Hapten konjugiert, z.B. mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH). Weitere Peptidimmunogene
können
erzeugt werden, indem man Tyrosinmoleküle durch sulfatierte Tyrosinmoleküle ersetzt.
Methoden zur Synthese solcher Peptide sind in der Technik gut bekannt
und z.B. beschrieben von R.P. Merryfield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154,
1963; und J.L. Krstenansky et al., FEBS Lett. 211:10, 1987.
-
Neutralisierende
oder nicht neutralisierende Antikörper (vorzugsweise monoklonale
Antikörper),
die an MU-1 Proteine binden, können
auch brauchbare Therapeutika für
Tumore sein und auch zur Behandlung der zuvor beschriebenen Zustände dienen.
Diese neutralisierenden monoklonalen Antikörper können in der Lage sein, die
Bindung von Liganden an die MU-1-Rezeptorenkette zu blockieren.
-
-
-
-
-
-