DE69927495T2

DE69927495T2 - Verfahren zur regulieren der hämatopoese mit hilfe von cpg-oligonukleotiden

Info

Publication number: DE69927495T2
Application number: DE69927495T
Authority: DE
Inventors: Hermann Wagner; Grayson Lipford
Original assignee: Coley Pharmaceutical GmbH; Coley Pharmaceutical Group inc
Current assignee: Coley Pharmaceutical GmbH
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-05-15
Also published as: IL139646A0; ATE305507T1; DE69927495D1; NZ508650A; EP1674574A1; WO1999058118A3; IL139646A; IL187987A0; US20040234512A1; US20040235777A1; AU760795B2; CA2328406A1; AU4528899A; EP1078053B1; US20070184465A1; JP2002514397A; US20040030118A1; US20040235778A1; EP1078053A2; WO1999058118A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Regulieren der Hämatopoese unter Verwendung von CpG-enthaltenden Oligonukleotiden. Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren zur Behandlung von Thrombozytopoese und Anämie durch Regulieren der Hämatopoese. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Regulierung der Umgestaltung des Immunsystems durch Verabreichen von CpG-Oligonukleotiden, um die Hämatopoese zu beeinflussen.
Hintergrund der Erfindung
Die Strahlen- oder chemotherapeutische Behandlung geht mit reversibler Thrombozytopoese, Anämie und Neutropenie einher. Die Verarmung von hämatopoetischen Vorläufern im Knochenmark (BM), die mit der Chemotherapie und Bestrahlung verbunden ist, führt zu hämorrhagischen und infektiösen Komplikationen. Eine schwerwiegende Suppression des hämatopoetischen Systems ist ein Hauptfaktor bei der Beschränkung der Anwendung der Chemotherapie und der Dosiseskalation. Eine Anzahl von hämatopoetischen Zytokinen befindet sich derzeit als Behandlungen in klinischen Studien, um derartige Komplikationen zu verhindern oder zu verringern.
Man geht davon aus, dass die hämatopoetische Entwicklung durch zwei Kategorien von Faktoren gesteuert wird. Eine Kategorie umfasst Kolonie-stimulierende Faktoren (CSFs), die die Ausbildung von Kolonien und die Proliferation von verschiedenen Zelllinien fördern. Weitere sind Potenziatoren, die die Reifung oder Differenzierung potenzieren. Beispielsweise umfassen nach Berichten Megakaryozyten-CSFs (Meg-CSFs) IL-3, den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) und den Stammzellenfaktor (SCF) und Megakaryozytenpotenziatoren (Meg-Pot) umfassen nach Berichten IL-6, IL-7, IL-11, Erythropoetin (EPO) und Leukämie-inhibitorischen Faktor (LIF). Die Plättchenproduktion ist ein Endphänomen bei der Entwicklung von Megakaryozyten in vivo. Es wurde berichtet, dass Thrombopoetin (TPO) sowohl Meg-CSF als auch Meg-Pot besitzt.
In den frühen Tagen der Interferon (IFN)-Forschung postulierten Isaacs et al., dass Fremd-DNA IFN induzieren würde. Rotem, Z et al. (1963) Nature 197: 564–566; Jensen, KE et al. (1963) Nature 200: 433–434. Später wurde entdeckt, dass synthetische doppelsträngige RNA in der Lage war, IFN zu induzieren und sowohl natürliche Killer (NK)-Zellen als auch Makrophagen zu aktivieren. Field, AK et al. (1967) Proc Natl Acad Sci USA 58: 1004–1010. Danach entdeckten Yamamoto, Tokunaga und Kollegen immunstimulatorische DNA durch eine Reihe von Studien, die ursprünglich darauf abstellten, durch Bazillus Calmette-Guerin (BCG) vermittelte Tumorresistenz in Mäusen zu analysieren. Es wurde gezeigt, dass eine aus BCG isolierte (als MY-1 bezeichnete) Fraktion in vivo eine Anti-Tumoraktivität aufwies, die NK-Zellenaktivität erhöhte und IFN-Freisetzung vom Typ I und Typ II aus murinen Milzzellen oder menschlichen Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL) in vitro auslöst. Tokunaga, T et al. (1984) J Natl Cancer Inst 72: 955–962; Yamamoto, S et al. (1988) Jpn J Cancer Res 79: 866–873; Mashiba, H et al. (1988) Jpn J Med Sci Biol 41: 197–202. Diese Aktivitäten konnten durch DNase-Vorbehandlung von MY-1, aber nicht durch RNase-Behandlung zerstört werden. Pisetsky und Mitarbeiter beobachteten unabhängig, dass normale Mäuse ebenso wie Menschen auf bakterielle DNA reagierten, aber nicht auf Vertebraten-DNA, indem sie anti-DNA-Antikörper produzierten. Messina, JP et al. (1991) J Immunol 147: 1759–1764. Sie realisierten, dass bakterielle DNA für murine B-Zellen mitogen war und postulierten, dass diese Aktivität aus „nicht-konservierten Strukturdeterminanten" resultierte. Die differenzielle stimulierende Fähigkeit bakterieller DNA gegenüber Vertebraten-DNA wurde auch für die Induktion von NK-Zellenaktivität von Yamamoto et al. gezeigt. Yamamoto, S et al. (1992) Microbiol Immunol 36: 983–997. HPLC-Analyse von BCG-Extrakten zeigte, dass die MY-1-Fraktion aus einem breiten Bereich von DNA-Fragmenten mit einem Peak bei 45 Basen zusammengesetzt war. Synthetische 45-mer Oligodesoxynukleotide (ODNs), die von BCG-cDNA-Sequenzen abgeleitet waren, waren hinsichtlich IFN-induzierender Fähigkeit und Erhöhen der NK-Zytotoxizität positiv. Tokunaga, T et al. (1992) Microbiol Immunol 36: 55–66.
Gleichzeitig beobachteten Forscher, die Antisense-ODN studierten, sequenzabhängige immunstimulatorische Wirkungen. Nachfolgend formulierten Krieg et al. einen Rahmen zum Verständnis der Mustererkennung von bakterieller oder synthetischer DNA. Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549. Unter Verwendung von sequenzspezifischer CpG-enthaltender ODN-vermittelter Mitogenität gegenüber B-Zellen als Test entdeckten sie, dass bestimmte CpG-Dinukleotide biologisch aktiv waren, insbesondere innerhalb DNA-Motiven, die eine 5'-Pu-Pu-CpG-Pyr-Pyr-3'-Basensequenz aufwiesen.
Bakterielle DNA, einige virale DNA und Invertebraten-DNA scheinen sich strukturell von Vertebraten-DNA zu unterscheiden. Bakterielle DNA weist die erwartete Frequenz von CpG-Dinukleotiden von 1:16 auf. Im Gegensatz dazu weist Säuger-DNA eine CpG-Suppression auf und weist nur ein Viertel von den durch zufallsmäßige Basennutzung vorhergesagten CpG auf. Bird, AP (1986) Nature 321: 209–213. Die Verwendung des 5'-Pu-Pu-CpG-Pyr-Pyr-3'-Motivs ist sogar verglichen mit dem Genom von Escherichia coli bei Säugetieren stärker unterdrückt. Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549. Weiterhin sind eukaryotische 5'-CpG-3'-Motive bevorzugterweise methyliert und eine sequenzspezifische Methylierung von 5'-CpG-3' beseitigt ihr stimulatorisches Potenzial. Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549; Bird, AP (1986) Nature 321: 209–213. Die Erkenntnis, dass diese Sequenzen in Vertebraten-DNA unterrepräsentiert sind, liefert eine Erklärung für mehrere biologische Beobachtungen im Zusammenhang mit Nicht-Selbsterkennungsmustern durch das Immunsystem.
CpG-DNA induzierte in vivo Immunantworten
Die Immunogenität von natürlichen und rekombinierten gereinigten, von Protein stammenden Antigenen ist gering, sofern sie nicht durch Adjuvanzien unterstützt wird. Infolge der offensichtlichen Erkennung von und Antwort auf Fremd-DNA durch das Immunsystem wurde früher das Potential von CpG-DNA untersucht, als Adjuvans zu dienen. Die Mäuse wurden subkutan mit Liposomen-eingekapseltem Ovalbumin (als Antigen verwendet) und CpG-ODN (als Adjuvans verwendet) unter Verwendung eines Protokolls gereizt, das von Lipford et al. beschrieben wurde. Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 3420–3426. Die Mäuse, denen man gleichzeitig CpG-ODN verabreichte, entwickelten eine starke peptidspezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Aktivität in den Drainagelymphknoten (LNs). Weiterhin war nicht nur die Antikörperantwort erhöht, sondern CpG-ODN schalteten das Isotypenmuster auf ein Th1-artiges Profil insoweit um, als dass Antigen-spezifisches IgG2a dominant wurde. Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 3420–3426. Dieses Muster einer starken CTL-Induktion und einer Verschiebung in dem Antikörperrepertoire hin zu Th1 ist auf andere Proteinantigene erweitert worden. Nachfolgend hat man festgestellt, dass die Verwendung von Liposomen als Antigenträger für CTL-Induktion nicht erforderlich war. Diese Beobachtung war unerwartet, da typischerweise lösliche Proteinantigene nicht in den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse I-Präsentationsweg eintreten können und deshalb gegenüber Vorläufer-CTL durch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) nicht präsentiert werden können.
Die Th1-Verschiebung von CpG-DNA, wenn sie mit Proteinantigen verabreicht wird, ist nun vollständig dokumentiert worden. Die internationale Veröffentlichung WO 98/18810 offenbart die Tatsache, dass die Nukleinsäuresequenzen, die immunstimulatorische CpG-Oligonukleotide enthalten, ein Th1-Immunaktivierungsmuster, Zytokinproduktion, lytische NK-Aktivität und B-Zellproliferation stimulieren. Derartige immunstimulatorische CpG-Oligonukleotide können geringfügig vor oder gleichzeitig mit einem Vakzin verabreicht werden, um Immunsystemmängel zu behandeln. Roman et al. zeigten die Dominanz von Antigen-spezifischer IgG2a-Induktion, wenn als das Adjuvans entweder CpG-ODN, Plasmid-DNA, die CpG-Motive enthält, oder bakterielle DNA verwendet wurde. Die Th1-fördernde Adjuvanzwirkung von CpG-ODN kann für das Umsteuern zu schützenden oder sogar heilenden Reaktionen in Th2-gesteuerten Störungen nützlich sein. Ein Modell ist die CpG-ODN-Modulation von Th2-gesteuerten Atemwegserkrankungen in einem murinen Asthmamodell, das mit Schistosoma mansoni-Eiern induziert wird. Atemwegs-Eosinophilie, Th2-Zytokininduktion, IgE-Produktion und bronchiale Hyperreaktivität wurden durch co-Verabreichung von CpG-ODN bei Eisensibilisierung verhindert. Zusätzlich waren Eisensibilisierte Mäuse, die am Tag 7 nach der Sensibilisierung mit CpG-ODN und Antigen behandelt waren, gegenüber Atemwegseosinophilie geschützt. Ähnliche Ergebnisse wurden in einem Infektionsmodell für das Umsteuern von Th2-Antworten auf Th1-Schutzantworten erhalten, gestützt durch unseren Nachweis, dass CpG-ODN BALB/c-Mäuse gegen tödliche Leishmania major-Infektionen schützten. Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 2340–2344; Zimmermann, S et al. (1998) J Immunol 160: 3627–3630. Nach L. major-Infektion entwickelten C57BL/6-Mäuse eine schützende Th1-gesteuerte Antwort, BALB/c-Mäuse entwickeln jedoch eine Th2-gesteuerte Antwort, die nicht schützender Natur ist. Bei diesem System von Th2-gesteuerter infektiöser Erkrankung heilt die Verabreichung von CpG-ODN mit Leishmania major infizierte BALB/c-Mäuse, wenn sie so spät wie 15 Tage nach der Infektion verabreicht wurden. Der Phänotyp der Antwort nach CpG-Intervention war Th1-ähnlich, obwohl die initiale Antwort auf eine Reizung mit L. major Th2-ähnlich war. CpG-ODN löste nach Infektion die Freisetzung von IL-12 in das Serum aus und IL-12 ist ein bekannter Induktor für Th1-Differenzierung. Die Welle von IL-12 ist vorübergehend, erreicht jedoch ihr Maximum nach 2–4 Std. und kehrt nach 24 Std. auf fast die Basislinie zurück. Die experimentelle Behandlung mit anti-IL-4 oder IL-12 nach Infektion mit L. major ist nur innerhalb der ersten 3 Tage wirksam; zu späteren Zeitpunkten versagen sogar Mehrfachinjektionen von IL-12 dabei, den Verlauf der Infektion zu beeinflussen. Da CpG-ODN wirksam NK-Zellen stimulieren, IFN-γ zu produzieren, und da es Belege dafür gibt, dass IFN-γ Th2-Antworten in vitro und in vivo umsteuern kann, stellte dies eine mögliche Erklärung dar. Der tatsächliche zelluläre und molekulare Mechanismus der kurativen Wirkungen sind jedoch noch kaum verstanden.
Induktion von Milzvergrößerung durch ODN
Milzvergrößerung ist ein gut bekanntes Phänomen, das mit der Verabreichung von Oligonukleotiden einhergeht. Branda et al. beobachteten, dass Mäuse eine massive Milzvergrößerung und polyklonale Hypergammaglobulinämie innerhalb von 2 Tagen nach intravenöser Injektion eines Phosphothioat-Oligomers zeigten, das Antisense zu einem Teil der rev-Region des HIV-1-Genoms ist. Branda, RF et al. (1993) Biochem Pharmacol 45: 2037–2043. Die histologische Untersuchung von Milzen von injizierten Tieren zeigte eine ausgeprägte Erhöhung einer gleichförmig erscheinenden Population kleiner Lymphozyten. Die Flusszytometrieanalyse zeigte, dass die antwortenden Zellen überwiegend B-Lymphozyten waren. Mojcik et al. beobachteten, dass in Mäusen die Injektion von Antisense zur Initiationsregion des env-Gens zu (i) erhöhten Zahlen an Milzzellen, insbesondere infolge einer Erhöhung der B-Zellen der Milz, (ii) zu einer erhöhten Klasse II-MHC-Expression auf B-Zellen, (iii) zu einer erhöhten RNA- und DNA-Synthese und (iv) zu erhöhten Zahlen von Immunglobulin (Ig)-bildenden Zellen führte. Mojcik, CF et al. (1993) Clin Immunol Immunopathol 67: 130–136. Sie folgerten, dass Produkte bestimmter endogener retroviraler Sequenzen die Lymphozytenaktivierung in vivo regulierten. Bei Bemühungen, die Wirksamkeit von NF-κB-p65-Oligonukleotiden in vivo zu testen, beobachteten McIntyre et al., dass Kontroll-p65-Sense-, aber nicht p65-Antisense-Oligonukleotide eine massive Milzvergrößerung bei Mäusen verursachte. McIntyre, KW et al. (1993) Antisense Res Dev 3: 309–322. In dieser Studie zeigten sie eine Sequenz-spezifische Stimulierung der Milzzellproliferation sowohl in vivo als auch in vitro durch Behandlung mit p65-Sense-Oligonukleotiden. Die durch diese Behandlung expandierten Zellen waren in erster Linie B-220⁺, sIg⁺-B-Zellen. Die Sekretion von Immunglobulinen durch die p65-Sense-Oligonukleotid-behandelten Milzzellen war ebenfalls erhöht. Zusätzlich zeigten die p65- Sense-behandelten Milzzellen, aber nicht mehrere andere Zellinien, eine Hochregulierung der NF-κB-ähnlichen Aktivität in den Zellextrakten, eine Wirkung, die nicht auf neuem Protein oder RNA-Synthese beruhte. Zhao et al. schlussfolgerten, dass Phosphothioat-ODN eine Milzvergrößerung infolge 8-Zellproliferation induzierten. Zhao, Q et al. (1996) Biochem Pharmacol 51: 173–182. In einer Nachfolgestudie stellten Zhao et al. fest, dass die Verabreichung des 27-mer-Phosphothioatoligonukleotids in Mäusen zu einer Milzvergrößerung und einer Erhöhung der IgM-Produktion 48 Std. nach Verabreichung führte. Zhao, Q et al. (1996) Biochem Pharmacol 52: 1537–1544.
Agrawal et al. evaluierten die toxikologischen Wirkungen von Phosphothioatoligodesoxynukleotiden (PS-oligo) in vivo. Agrawal, S et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7: 575–584. Oligodesoxynukleotide wurden intravenös an männliche und weibliche Ratten mit Dosierungen von 3, 10 und 30 mg/kg/Tag für 14 Tage verabreicht. Die Ratten wurden am Tag 15 getötet, Blutproben für die Hämatologie und die klinische Chemie gesammelt und Gewebe, einschließlich Lymphknoten, Milz, Leber und Nieren einer pathologischen Untersuchung unterzogen. Die Toxizitätsprofile von vier Oligodesoxynukleotiden waren sehr ähnlich, unterschieden sich jedoch in ihrer Größenordnung. Änderungen der hämatologischen Parameter umfassten Thrombozytopenie, Anämie und Neutropenie. Dosisabhängige Vergrößerungen von Milz, Leber und Niere wurden beobachtet. Pathologische Studien zeigten eine allgemeine Hyperplasie des retikuloendothelialen Systems in den untersuchten Geweben.
Krieg et al. berichteten, dass bakterielle DNA und synthetische Oligodesoxynukleotide, die unmethylierte CpG-Dinukleotide enthielten, murine B-Zellen induzierten, zu proliferieren und Immunglobulin in vitro und in vivo zu sekretieren. Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549. Diese Aktivierung wird durch stimulierende Signale verstärkt, die durch den Antigenrezeptor abgegeben werden. Eine optimale B-Zellaktivierung erfordert ein DNA-Motiv, bei dem ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist. Oligodesoxynukleotide, die dieses CpG-Motiv enthielten, induzierten mehr als 95% aller B-Zellen, in den Zellzyklus einzutreten. In einer Studie von Monteith et al. induzierte die Behandlung von Nagetieren mit Phosphothioat-Oligodesoxynukleotiden eine Form von Immunstimulierung, die durch Milzvergrößerung, lymphoider Hyperplasie, Hypergammaglobulinämie und gemischten mononukleären Zellinfiltraten in vielen Geweben gekennzeichnet war. Monteith, DK et al. (1997) Anticancer Drug Des 12: 421–432. Die Immunstimulierung wurde in Mäusen in in vivo und in vitro Studien unter Verwendung einer Übersicht von historischen Daten und spezifischen in vivo und in vitro Studien evaluiert. Alle Phosphothioat-Oligodesoxynukleotide, die bewertet wurden, induzierten eine Milzvergrößerung und die Proliferation von B-Lymphozyten. Milzvergrößerung und B-Lymphozytenproliferation erhöhten sich mit der Dosis oder Konzentration an Oligodesoxynukleotiden. Die Reihenfolge für die Wirksamkeit für B-Lymphozytenproliferation in vitro und Milzvergrößerung korrelierte gut mit den getesteten Oligodesoxynukleotiden. Die durch die Literatur bereitgestellten überwiegenden Beweise folgerten, dass das Phänomen der durch ODN induzierten Milzvergrößerung wahrscheinlich sequenzabhängig ist und durch B-Zellmitogenität erklärt wird.
Es wird davon ausgegangen, dass die hämatopoetische Entwicklung durch Koloniestimulierende Faktoren gesteuert wird, die die Koloniebildung und Proliferation von Zellen von verschiedenen primitiven Zelllinien fördern, und Potenziatoren, die die Reifung oder Differenzierung in verschiedene Blutzellen potenzieren. Im Allgemeinen wird die Beobachtung von Milzvergrößerung durch direkt ODN-B-Zell-Mitogenität in einer Sequenz-spezifischen Art und Weise erklärt.
Zytokin-Produktion und Hämatopoese
Wie oben beschrieben ist das durch CpG-ODN-Injektion induzierte Zytokinrepertoire Th1-mäßig und es existieren umfangreiche Belege, dass dies eine starke Th1-verschiebende Wirkung auf die nachfolgende Immunantwortentwicklung ausübt. Zhao et al. verabreichten ein 27-mer Phosphothioatoligonukleotid (Sequenz 5'-TCG TCG CTG TCT CCG CTT CTT CTT GCC-3' SEQ ID NO: 109) an Mäuse, von dem man zuvor gezeigt hat, dass es in Mäusen eine Milzvergrößerung und Hypergammaglobulinämie nach in vivo Verabreichung verursachte, und studierten das Muster und die Kinetik der Zytokinproduktion sowohl auf dem Niveau von Milz-mRNA als auch von Serumprotein. Zhao et al. (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7: 495–502. Nach i.p. Verabreichung von 50 mg Oligonukleotid/kg wurden signifikante Erhöhungen des Gehalts von Milz-mRNA für IL-6, IL-12, p40, IL-1β und IL-1Ra und des Serumtiters von IL-6, IL-12, MIP-1β und MCP-1 beobachtet. Im Gegensatz dazu wurden keine erheblichen Unterschiede hinsichtlich des Niveaus von Milz-mRNA für IL-2, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-15, IFN-γ oder MIF oder des Serumtiters von IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ oder GM-CSF nachgewiesen. Diese Studien zeigten ein distinktes Muster und distinkte Kinetiken der Zytokinproduktion nach Oligonukleotidverabreichung und zeigten weiter, dass die Zytokininduktion keine allgemeine Eigenschaft von Phosphothioat-Oligonukleotiden ist, sondern abhängt von der Sequenz und der Dosis der Oligonukleotide. Die Serumfreisetzung von IL-1, IL-6, IL-12 und TNF-α wurde auch von Lipford et al. bestätigt. Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 2340–2344.
Hendrzak und Brunda zeigten, dass die Verabreichung von IL-12 an Mäuse Thrombozytopenie, Milzvergrößerung und die Infiltration mononukleärer Zellen verursachte, was eine Erklärung für die Milzvergrößerung liefert. Hendrzak und Brunda (1995) Lab Invest 72: 619–637. Man hat gezeigt, dass IL-12 in Reaktion auf CpG-ODN freigesetzt wird und ein Induktor für IFN-γ ist. Die Kontrolle von intrazellulärer bakterieller Infektion erfordert IFN-γ sowohl für die Etablierung einer Th1-T-Zell-Antwort als auch für die Aktivierung von Makrophagen, um Bakterien abzutöten. Murray et al. beobachteten, dass die Exposition von Mäusen, die hinsichtlich IFN-γ defizient waren gegenüber einer Mykobakterieninfektion eine Immunantwort ergab, die durch einen Th2-T-Zell-Phänotyp, stark entwickeltes Bakterienwachstum und Tod gekennzeichnet war. Murray, PJ et al. (1998) Blood 91: 2914–2924. Sie berichteten, dass IFN-γ-defiziente Mäuse, die mit Mykobakterium infiziert waren, auch eine dramatische Umgestaltung des hämatopoetischen Systems erfuhren. Eine Proliferation myeloider Zellen schreitet unkontrolliert während des Verlaufs der mykobakteriellen Infektion voran, was zu einem Übergang zu einer extramedullären Hämatopoese führt. Die Milzarchitektur von infizierten IFN-γ-defekten Mäusen ist vollständig durch die Expansion von Makrophagen, Granulozyten und extramedullärem hämatopoetischen Gewebe ausgelöscht. Diese Merkmale gehen einher mit Milzvergrößerung, einer Erhöhung der Myeloidkolonie-bildenden Aktivität in der Milz und einer ausgeprägten Granulozytose des peripheren Blutes. Systemische Titer an Zytokinen sind erhöht, insbesondere IL-6 und Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (G-CSF). Diese Ergebnisse schlagen vor, dass zusätzlich zu seiner zentralen Rolle bei der zellulären Immunität IFN-γ ein Schlüsselzytokin bei der koordinierten Regulation von Immuneffektorzellen und Myelopoese ist. Mehrere Studien haben die in vitro Inhibierung von Kolonie-bildenden Einheiten durch IFN-γ beobachtet. Somit können gemäß dem Stand der Technik starke Th1-Antworten, wie sie durch eine IFN-γ-Freisetzung gekennzeichnet sind, für Hämatopoeseereignisse inhibitorisch sein.
Obwohl man geglaubt hat, dass IL-3/GM-CSF/IL-5 (Th0- und Th2-Zytokine), die von aktivieren T-Zellen hergestellt werden, eine Hauptrolle bei der Expansion von hämatopoetischen Zellen in Notfällen spielen, zeigen die Ergebnisse, dass die gesamte Funktion von IL-3/GM-CSF/IL-5 für Hämatopoese im Notfall ebenso wie im Gleichgewicht entbehrlich ist. Somit muss ein alternativer Mechanismus existieren, um in beiden Situationen Blutzellen zu produzieren. IL-13, ein kürzlich identifiziertes Th2-Zytokin, teilt einige, aber nicht alle IL-4-Funktionen, einschließlich Inhibierung von Monozyten- und Makrophagenaktivierung, Stimulierung von menschlichen B-Zellen und Induktion von Wachstum und Differenzierung von Mäuseknochenzellen in vitro. Lai et al. testeten die in vivo Wirkungen von rekombinantem Maus-IL-13 (rIL-13) aus stabil transfizierten, hoch exprimierenden BW5147-Thymomzellen. Lai, YH et al. (1996) J Immunol 156: 3166–3173. Nach Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie wurde rIL-13 in die Peritonealhöhle von BALB/c-Mäusen vermittels osmotischer Pumpe für 7 Tage verabreicht. Die Milzen von rIL-13-behandelten Mäusen waren verglichen mit Kontrollmilzen infolge erhöhter Zellularität signifikant vergrößert. Insbesondere wurden erhöhte Zahlen an unreifen Erythroblasten und Megakaryozyten in Milzschnitten nach rIL-13-Behandlung beobachtet. Milzzellen aus rIL-13-behandelten Mäusen zeigten in vitro ein stark erhöhtes Ansprechen auf rekombinante Formen von Maus-IL-3, Maus-Granulozyten-Makrophagen-CSF oder menschlichen CSF-1 und, in geringerem Umfang, auf Maus-IL-4 oder IL-13. Darüber hinaus zeigten mit rIL-13 behandelte Mäuse auch signifikante Anstiege an CPU-E, CFU-C und Erythroid-Burst-Kolonien in der Milz, was weiterhin die Anwesenheit von erhöhten Zahlen von hämatopoetischen Vorläufern anzeigt. Die hämatologische Analyse zeigte an, dass die Behandlung mit rIL-13 eine leichte Anämie und eine auffallende Monozytose induzierte. Schließlich produzierten Milzzellen von rIL-13-behandelten Mäusen nach LPS-Stimulierung signifikant mehr IL-6. Interessanterweise ging die durch Nippostrongylus brasiliensis-Infektion induzierte Th2-Antwort mit einer Erhöhung der hämatopoetischen Vorläuferfrequenzen in der Milz einher. Kollektiv zeigen diese Daten an, dass exogenes rIL-13 die extramedulläre Hämatopoese bei Mäusen induziert und schlagen vor, dass endogenes IL-13, ein Th2-Zytokin, zur Auffüllung von Effektorzellen während starker Th2-Antworten beitragen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Stand der Technik impliziert als Ganzes, dass Th2-gesteuerte Antworten stark für eine extramedulläre Hämatopoese prädisponieren. Die Injektion von CpG-ODN ist Th1-verschiebend und Th2-suppressiv. Zusätzlich wird IFN-γ, das Goldstandard-Th1-Zytokin, als für die Bildung von hämatopoetischen Kolonien suppressiv erachtet und man hat gezeigt, dass IL-13, ein Th2-Zytokin, Hämatopoese induziert. Der Stand der Technik würde daher dem Fachmann nicht nahelegen, dass das durch CpG-ODN-Injektion freigesetzte Zytokin-Repertoire zu Hämatopoese führen würde. Es ist im Gegenteil gezeigt worden, dass die Verabreichung von ODN zu Thrombozytopenie, Anämie und Neutropenie führt. Zusätzlich induziert die Verabreichung von IL-12, ein zentrales Zytokin bei CpG-ODN-Wirkungen, Thrombozytopenie. Das Phänomen der Milzvergrößerung ist mehrfach mit B-Zellmitogenität von ODN korreliert worden, was nahelegt, dass ODN Milzvergrößerung durch B-Zellaktivierung statt Hämatopoese induziert.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines CpG-Oligonukleotids mit wenigstens 8 Nukleotiden für die Herstellung eines Medikaments zur Induktion einer Antigen-spezifischen Immunantwort bereitgestellt, wobei das CpG-Oligonukleotid einem Lebewesen verabreicht werden soll und das Lebewesen wenigstens 3 Tage nach Verabreichung des CpG-Oligonukleotids an das Lebewesen einem Antigen exponiert werden soll, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu produzieren. Die Hämatopoese kann verwendet werden, um Immunsystemerkrankungen zu behandeln. Die Verwendung von CpG-Oligonukleotiden zum Induzieren einer Antigen-spezifischen Immunantwort basiert auf der Beobachtung, dass ein CpG-Oligonukleotid verwendet werden kann, um die Umgestaltung des Immunsystems durch Regulieren der Hämatopoese zu induzieren. Nachdem ein CpG-Oligonukleotid und ein Antigen zusammen an ein Lebewesen verabreicht worden sind, tritt eine anfängliche Immunreaktion auf. Man hat gemäß der Erfindung entdeckt, dass diese anfängliche Immunantwort schnell abnimmt und sich eine neue Immunantwort nach etwa 48 Stunden entwickelt. Unerwarteterweise wird, wenn ein Antigen 48 Stunden oder mehr nach der Verabreichung von CpG verabreicht wird, eine Antigen-spezifische Immunantwort gegen das Antigen angewachsen sein. Diese Immunantwort beruht auf der erneuten Bevölkerung von Lymphknoten und/oder der Milz mit geprägten Immunzellen.
Somit wird in einem Aspekt der Erfindung die Verwendung eines CpG-Oligonukleotids bereitgestellt für die Herstellung eines Medikaments zum Induzieren einer Antigen-spezifischen Immunantwort durch Verabreichen eines Oligonukleotids an ein Lebewesen mit einer Sequenz umfassend wenigstens die folgende Formel: 5' X₁CGX₂ 3' wobei das Oligonukleotid wenigstens 8 Nukleotide enthält, wobei C und G unmethyliert sind und wobei X₁ und X₂ Nukleotide sind, und Exponieren des Lebewesens gegenüber einem Antigen wenigstens 3 Tage nachdem das Oligonukleotid an das Lebewesen verabreicht worden ist, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu produzieren.
Das Lebewesen kann gegenüber dem Antigen wenigstens 48 Stunden nachdem das CpG-Oligonukleotid dem Lebewesen verabreicht worden ist, exponiert werden. Man hat festgestellt, dass die Umgestaltung des Immunsystems innerhalb von 48 Stunden nach CpG-Verabreichung zu erfolgen beginnt. Man hat auch entdeckt, dass die geprägten Immunzellen noch in der Lage sind, auf Antigen sogar 30 Tage nach CpG-Verabreichung zu antworten. In einer Ausführungsform wird das Antigen wenigstens 4 Tage nachdem das Oligonukleotid an ein Lebewesen verabreicht worden ist, verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform wird das Antigen wenigstens 7 Tage nachdem das Oligonukleotid an das Lebewesen verabreicht worden ist, verabreicht. In einer weiteren Ausführungsform wird das Antigen wenigstens 15 Tage nachdem das Oligonukleotid dem Lebewesen verabreicht worden ist, verabreicht. In noch einer weiteren Ausführungsform wird das Antigen wenigstens 30 Tage nachdem das Oligonukleotid an das Lebewesen verabreicht worden ist, verabreicht.
Das Antigen kann irgendeine Art von in der Technik bekanntem Antigen sein. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen das Antigen Zellen, Zellextrakte, Proteine, Peptide, Polysaccharide, Polysaccharidkonjugate, Lipide, Glycolipide, Kohlenhydrate, virale Extrakte, Viren, Bakterien, Pilze, Parasiten und Allergene sein. In anderen Ausführungsformen kann das Antigen eine Nukleinsäure sein, die ein Antigen codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen ein Allergen und das CpG-Oligonukleotid wird für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Allergie verwendet. In einer weiteren Ausführungsform ist das Antigen von einem Organismus gewonnen, der aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus infektiösen Bakterien, infektiösen Viren und infektiösen Pilzen, und das CpG-Oligonukleotid wird für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Infektionserkrankung verwendet.
Das Lebewesen wird gegenüber einem Antigen exponiert. Das Lebewesen kann dem Antigen aktiv ausgesetzt werden. In einer Ausführungsform, wenn das Lebewesen aktiv dem Antigen ausgesetzt wird, kann das Antigen zusammen mit einem kolloidalen Dispersionssystem verabreicht. Das kolloidale Dispersionssystem ist aus der Gruppe ausgewählt bestehend aus makromolekularen Komplexen, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und in einer weiteren Ausführungsform Lipid-basierten Systemen. Ein Lipid-basiertes System ist bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischten Mizellen und Liposomen. In einer weiteren Ausführungsform kann das Antigen zusammen mit einem Adjuvans verabreicht werden.
Das Lebewesen kann auch passiv gegenüber dem Antigen exponiert werden. In einer Ausführungsform ist das Lebewesen ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es Krebs entwickelt. In einer weiteren Ausführungsform besteht für das Lebewesen das Risiko, dass es eine allergische Reaktion entwickelt. In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Lebewesen ein asthmatisches Lebewesen.
Die Antigen-spezifische Immunantwort ist in einer weiteren Ausführungsform eine Immunantwort vom Th1-Typ.
Das Lebewesen ist ein Wirbeltier. Bevorzugterweise ist das Lebewesen ein Mensch. In einigen Ausführungsformen ist das Lebewesen jedoch ein nicht-menschliches Wirbeltier. In einer Ausführungsform ist das nicht menschliche Wirbeltier ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Hund, einer Katze, einem Pferd, einer Kuh, einem Schwein, einem Schaf, einer Ziege, einem Hühnchen, einem Primaten, einem Fisch, einer Ratte und einer Maus.
Hämatopoese kann durch Verabreichung eines CpG-Oligonukleotids an ein Lebewesen behandelt werden, das eine hämatopoetische Erkrankung zeigt oder für das das Risiko besteht, dass es eine hämatopoetische Erkrankung entwickelt. Eine hämatopoetische Erkrankung ist eine Erkrankung, die einen Verlust oder eine Verringerung der Anzahl von einer oder mehreren hämatopoetischen Zellen umfasst. Hämatopoetische Zellen umfassen Erythrozyten, Leukozyten und Plättchen.
Plättchenzahlen können in einem Lebewesen erhöht werden, das eine Thrombozytopenie aufweist, indem einem Lebewesen, das eine Thrombozytopenie aufweist, ein Oligonukleotid, das eine Sequenz aufweist, die die folgende Formel umfasst: 5' X₁CGX₂ 3', wobei das Oligonukleotid wenigstens 8 Nukleotide umfasst, wobei C und G unmethyliert sind und wobei X₁ und X₂ Nukleotide sind, in einer wirksamen Menge verabreicht wird, um die Plättchenzahlen in dem Lebewesen zu erhöhen. In einer Ausführungsform ist die Thrombozytopenie eine nicht durch Chemotherapie induzierte Thrombozytopenie.
Ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, eine Thrombozytopenie zu entwickeln, kann behandelt werden, indem einem Lebewesen, für das das Risiko besteht, eine Thrombozytopenie zu entwickeln, ein Oligonukleotid, das eine Sequenz aufweist, die wenigstens die folgende Formel enthält: 5' X₁CGX₂ 3', wobei das Oligonukleotid wenigstens 8 Nukleotide enthält, wobei C und G unmethyliert sind und wobei X₁ und X₂ Nukleotide sind, in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um eine Verringerung der Plättchenzahlen zu verhindern, die man üblicherweise unter Plättchen-verarmenden Bedingungen in dem Lebewesen erwarten würde, wenn das Lebewesen Plättchen-verarmenden Bedingungen ausgesetzt ist.
In einer Ausführungsform wird das Oligonukleotid in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Plättchenzahlen in dem Lebewesen um wenigstens 10.000 Plättchen pro Mikroliter zu erhöhen. In einer anderen Ausführungsform wird das Oligonukleotid in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Plättchenzahlen in dem Lebewesen um wenigstens 20.000 Plättchen pro Mikroliter zu erhöhen. In einer noch weiteren Ausführungsform wird das Oligonukleotid dem Lebewesen in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Plättchenzahlen in dem Lebewesen um 100 Prozent zu erhöhen.
Die Thrombozytopenie ist irgendeine Form von in der Technik bekannter Thrombozytopenie. In einer Ausführungsform ist die Thrombozytopenie eine Wirkstoff-induzierte Thrombozytopenie. Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist die Thrombozytopenie das Ergebnis einer Autoimmunkrankheit wie beispielsweise idiopathischer thrombozytopenischer Purpura. In einer noch weiteren Ausführungsform ist die Thrombozytopenie eine Thrombozytopenie, die sich aus einer unfallmäßigen Strahlenexposition ergibt. Die Thrombozytopenie ist in einer noch weiteren Ausführungsform eine Thrombozytopenie, die sich aus der therapeutischen Bestrahlungsexposition ergibt.
Anämie kann behandelt werden, indem einem Lebewesen, das unter einer Anämie leidet, ein Oligonukleotid mit einer Sequenz, die wenigstens die folgende Formel umfasst: 5' X₁CGX₂ 3', wobei das Oligonukleotid wenigstens 8 Nukleotide umfasst, wobei C und G unmethyliert sind und wobei X₁ und X₂ Nukleotide sind, in einer Menge verabreicht wird, die wirksam ist, um in dem Lebewesen Erythropoese zu induzieren.
In einer Ausführungsform wird das Oligonukleotid in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Erythroblastenzahlen in dem Lebewesen um wenigstens 10 Prozent zu erhöhen. In einer weiteren Ausführungsform wird das Oligonukleotid in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Erythroblastenzahlen in dem Lebewesen um wenigstens 20 Prozent zu erhöhen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird das Oligonukleotid dem Lebewesen in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um die Erythroblastenzahlen in dem Lebewesen um 100 Prozent zu erhöhen.
Die Anämie kann von einer jeden, in der Technik bekannten Art sein. In einer Ausführungsform ist die Anämie eine Wirkstoff-induzierte Anämie. In einer weiteren Ausführungsform ist die Anämie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer immunhämolytischen Erkrankung, genetischen Erkrankungen wie beispielsweise Hämoglobinopathie und erbliche hämolytische Anämie; unangemessene Produktion trotz angemessener Eisenspeicher; chronische Erkrankung wie beispielsweise Nierenversagen; chronische entzündliche Erkrankung wie beispielsweise rheumatoider Arthritis.
Das Lebewesen, das eine hämatopoetische Erkrankung hat oder für das das Risiko besteht, eine solche zu entwickeln, ist ein Wirbeltier. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lebewesen ein Mensch. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Lebewesen ein Hund. In noch weiteren Ausführungsformen ist das Lebewesen ein nicht menschliches Wirbeltier, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus einer Katze, einem Pferd, einer Kuh, einem Schwein, einem Schaf, einer Ziege, einem Hühnchen, einem Primaten, einem Fisch, einer Ratte und einer Maus.
In einem jeden der Aspekte der Erfindung, wie sie oben beschrieben sind, ist das CpG-Oligonukleotid in Oligonukleotid, das eine Sequenz aufweist, die wenigstens die folgende Formel umfasst: 5' X₁CGX₂ 3'.
Bei einigen Ausführungsformen weist das Oligonukleotid eine Länge von 8 bis 100 Nukleotiden auf. In einer weiteren Ausführungsform weist das Oligonukleotid eine Länge von 8 bis 30 Nukleotiden auf.
Bevorzugterweise ist das Oligonukleotid ein stabilisiertes Oligonukleotid. In einer Ausführungsform umfasst das Oligonukleotid eine Phosphatrückgratmodifikation, die eine Phosphothioat- oder Phosphodithioatmodifikation ist. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Phosphatrückgratmodifikation am 5'-Ende des Oligonukleotids. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Phosphatrückgratmodifikation am 3'-Ende des Oligonukleotids.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist das CpG-Oligonukleotid eine Sequenz auf, die wenigstens die folgende Formel enthält: 5' X₁X₂CGX₃X₄ 3', wobei X₁X₂ Nukleotide sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT und TpG; und X₃X₄ sind Nukleotide, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus: TpT, CpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA und CpA.
In einer weiteren Ausführungsform weist das CpG-Oligonukleotid eine Sequenz auf, die wenigstens die folgende Formel enthält: 5' TCNTX₁X₂CGX₃X₄ 3', wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nukleotide sind, und N eine Nukleinsäuresequenz ist, die aus etwa 0–25 Nukleotiden zusammengesetzt ist.
X₁X₂ sind Nukleotide, die aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus: GpT, GpG, GpA und ApA und X₃X₄ sind Nukleotide, die in einer weiteren Ausführungsform aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus: TpT und CpT.
Eine jede der Beschränkungen der Erfindung kann verschiedene Ausführungsformen der Erfindung umfassen. Es wird daher angenommen, dass eine jede der Beschränkungen der Erfindung, die irgendein Element oder Kombinationen von Elementen umfasst, in einem jeden Aspekt der Erfindung enthalten sein kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Kinetiken von erhöhtem Milzgewicht darstellt, das durch CpG-ODN induziert ist.
2 ist ein Diagramm, das die Änderungen des Phänotyps von Milzzellen nach Stimulierung mit CpG-ODN darstellt.
3 ist ein Diagramm, das die durch CpG-ODN-induzierten Änderungen der Milzzellzahl, Milz- und BM GM-CFU-Zahl darstellt.
4 ist ein Diagramm, das die Dosistitration von CpG-ODN darstellt.
5 ist ein Diagramm, das die erhöhte, durch CpG-ODN induzierte BFU-E-Zahl darstellt.
6 ist ein Diagramm, das die Bestimmung von Milz-Kolonie-bildenden Einheiten von normalen gegenüber CpG-ODN-induzierten Milzzellen darstellt (CFU-S-Test).
7 ist ein Diagramm, das darstellt, dass die erhöhte Anzahl von CM-CFU und erhöhte CTL-Funktion nach ODN-Injektion mit einer erhöhten Resistenz gegenüber lethaler Listeriose bei sublethal bestrahlten Mäusen korreliert.
8 ist ein Diagrammpaar, das Milzgewichte und Milzzellzahlen 5 Tage nach Verabreichung von 5-Fluoruracil an Mäuse mit oder ohne gleichzeitige Verabreichung von CpG-ODN darstellt.
9 ist ein Diagramm, das die Milz-T-Lymphozytenzahlen an den Tagen 4, 7 und 10 nach Verabreichung von 5-Fluoruracil an Mäusen mit oder ohne gleichzeitige Verabreichung von CpG-ODN darstellt.
10 ist ein Diagramm, das die Milz-B-Lymphozytenzahlen an den Tagen 4, 7 und 10 nach Verabreichung von 5-Fluoruracil an Mäuse mit oder ohne gleichzeitige Verabreichung von CpG-ODN darstellt.
11 ist ein Diagramm, das die Leukozytenzahlen an den Tagen 4, 7 und 10 nach Verabreichung von 5-Fluoruracil an Mäuse mit oder ohne gleichzeitige Verabreichung von CpG-ODN darstellt.
12 ist ein Diagramm, das die Erythrozytenzahlen an den Tagen 4, 7 und 10 nach Verabreichung von 5-Fluoruracil an Mäuse mit oder ohne gleichzeitige Verabreichung von CpG-ODN darstellt.
13 ist ein Diagramm, das die Plättchenzahlen an den Tagen 4, 7 und 10 nach Verabreichung von 5-Fluoruracil an Mäuse mit oder ohne gleichzeitige Verabreichung von CpG-ODN darstellt.
14 ist ein Diagramm, das die Induktion einer zytotoxischen T-Lymphozyten-(CTL)-Antwort auf spezifisches Antigen (Ovalbumin, OVA) 10 Tage nach Verabreichung von 5-Fluoruracil mit oder ohne gleichzeitige Verabreichung von CpG-ODN darstellt.
15 ist ein Diagrammpaar, das (links) die größere Milzpopulation von dendritischen Zellen 7 Tage nach der Verabreichung von CpG-ODN an Mäuse und (rechts) das verglichen mit Kontrollbehandlung mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) verstärkte Auswachsen von dendritischen Zellen aus Splenozyten in Kultur nach CpG-ODN darstellt.
16 ist ein Diagramm, das die verglichen mit PBS-vorbehandelten Mäusen erhöhte und verlängerte Induktion von Antikörper in Antwort auf verzögerte Antigenexposition in mit CpG-ODN vorbehandelten Mäusen zeigt.
17 ist ein Diagramm, das das verglichen mit PBS-vorbehandelten Mäusen kinetische Profil der CTL-Induktion in Reaktion auf verzögerte Antigenexposition bei mit CpG-ODN vorbehandelten Mäusen darstellt.
18 ist ein Diagramm, das das kinetische Profil der CTL-Induktion in Reaktion auf verzögerte Antigenexposition in mit CpG-ODN vorbehandelten Mäusen verglichen mit PBS-vorbehandelten Mäusen darstellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Hämatopoese bezeichnet die Erzeugung von Blutzellen. Das Verfahren der Erzeugung neuer Blutzellen wird durch die komplexe Wechselwirkung von Immunfaktoren wie beispielsweise Interleukin und CSF gesteuert. Unter Verwendung dieser Faktoren ist das Immunsystem in der Lage, den Umfang einer jeden Zellpopulation im Blut in Reaktion auf physiologische Änderungen zu regulieren.
Erythrozyten, Leukozyten und Plättchen sind wesentliche Zellen des hämatopoetischen Systems beim Menschen. Die primäre Funktion von Erythrozyten, die auch als rote Blutzellen bekannt sind, besteht im Transport von Hämoglobin, das wiederum Sauerstoff von den Lungen zu Geweben transportiert. Oxygeniertes Hämoglobin verleiht den Erythrozyten eine rote Farbe. Leukozyten, auch als myeloide Zellen bezeichnet, sind eine heterogene Gruppe von Zellen, die Immunantworten vermitteln und die Granulozyten, einschließlich Eosinophile, Basophile und Neutrophile; Monozyten; und T- und B-Lymphozyten einschließen. Man findet diese Zellen überwiegend im Blut, Knochenmark, lymphoiden Organen und Epithel. Leukozyten werden als weiße Blutzellen bezeichnet infolge des Fehlens von natürlichem Pigment, was den Zellen ein weißliches oder durchscheinendes Aussehen verlieht. Plättchen spielen eine Rolle bei der Hämostase oder bei der Regulierung des Blutens.
Viele Faktoren sind in der Lage, das hämatopoetische System zu beeinflussen, was einen Mangel oder Malignitäten spezieller Arten von Blutzellen verursachen kann. Erkrankungen des hämatopoetischen Systems variieren abhängig von dem die Erkrankung bedingenden Faktor ebenso wie von dem betroffenen Zelltyp.
Man hat entdeckt, dass CpG-enthaltende Oligonukleotide Hämatopoese regulieren können, um einen Verlust an Blutzellen in Reaktion auf physiologische Störungen zu inhibieren, die durch genetische Anomalitäten, Umweltfaktoren oder medizinische Therapien bedingt werden. Man hat auch festgestellt, dass Hämatopoese beeinflusst werden kann unter Verwendung von CpG-Oligonukleotiden, um eine Umgestaltung des Immunsystems zu induzieren, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu stimulieren.
Der Prozess des Umgestaltens des Immunsystems basiert auf der Erzeugung von Immunzellen in Reaktion auf einen Reiz bei der Vorbereitung für das Erzeugen einer starken Antigen-spezifischen Immunantwort. Der Reiz ist ein CpG-Oligonukleotid. Man hat entdeckt, dass wenn einem Lebewesen ein CpG-Oligonukleotid verabreicht wird, nach einer anfänglichen Verzögerung das Immunsystem des Lebewesens wieder bevölkert wird, um eine Population von Immunzellen zu produzieren, die geprägt sind, um eine Antigen-spezifische Antwort zu erzeugen. Diese erneuerte Population von Zellen verbleibt für eine lange Zeitspanne im Körper. Wenn die geprägten Zellen auf ein Antigen treffen, antworten die Zellen auf das Antigen, indem sie eine Antigen-spezifische Immunantwort produzieren. In der Tat ist das Antigen in der Lage, eine immunspezifische Antwort selbst bei Abwesenheit eines Adjuvans zu produzieren. Üblicherweise würde die Verabreichung von Antigen bei Abwesenheit eines Adjuvans keine spezifische Immunantwort produzieren.
Obwohl die Anmelder nicht durch einen speziellen Mechanismus beschränkt sind, geht man davon aus, dass wenn einem Lebewesen CpG verabreicht wird, CpG die zirkulierenden Immunzellen aktiviert, was sie veranlasst, zu reifen aktiven Immunzellen zu reifen. Wenn CpG zur gleichen Zeit oder geringfügig zuvor oder nach einem Antigen verabreicht wird, dann werden die zirkulierenden Immunzellen wahrscheinlich das Antigen kontaktieren und eine spezifische Immunantwort gegen das Antigen entwickeln. Nach einer Zeitspanne von etwa 24 Stunden werden die zirkulierenden Immunzellen nicht länger in der Lage sein, eine Antigen-spezifische Immunantwort aufzubauen, da die zirkulierenden Zellen bereits aktiviert worden und gereift sind. Man hat jedoch gemäß der Erfindung gefunden, dass etwa zwei Tage nach der Verabreichung von CpG das Immunsystem des Lebewesens erneut mit Immunzellen ausgestattet ist, die in der Lage sind, in Reaktion auf ein Antigen zu reifen und aktiviert zu werden. Wenn Antigen wenigstens zwei Tage nach CpG-Verabreichung gegeben wird, dann ist das Immunsystem in der Lage, eine Antigen-spezifische Immunantwort zu erzeugen, die sogar eine größere Größenordnung aufweisen kann als die Immunantwort, die in Reaktion auf gleichzeitige Verabreichung von Antigen und CpG erzeugt wird. Zwei Tage nach CpG-Verabreichung umfasst das umgestaltete Immunsystem eine Population von Zellen, die in der Lage sind, auf Antigen zu reagieren. Es ist gemäß der Erfindung gezeigt worden, dass diese Population von Zellen in der Lage ist, auf Antigen für längere Zeitspannen zu reagieren. Beispielsweise kann die Verabreichung eines Antigens nach Zeitspannen von mehr als 30 Tagen nach CpG-Verabreichung noch eine Antigen-spezifische Antwort produzieren.
Die Erfindung umfasst die Verwendung von CpG-Oligonukleotiden für die Herstellung eines Medikaments zum Erzeugen einer Antigen-spezifischen Immunantwort durch Verabreichen von CpG, um eine Immunumgestaltung zu induzieren, um sich für die Exposition gegenüber einem Antigen bereit zu machen. Das Lebewesen kann dem Antigen absichtlich nach zwei Tagen oder mehr gegenüber exponiert werden, nachdem CpG verabreicht worden ist, um eine Immunität gegenüber einem spezifischen Antigen zu entwickeln. Das Lebewesen kann einem Antigen auch passiv ausgesetzt sein, was bedingt, das sich eine spezifische Immunantwort gegen ein Antigen entwickelt, gegenüber dem das Lebewesen aus der Umwelt exponiert ist. Das Immunsystem kann somit so beeinflusst werden, dass es sich in einem aktiven Zustand befindet, bereit auf eindringende Substanzen wie beispielsweise Pathogene zu reagieren.
Die Verwendung von CpG-Oligonukleotiden für die Herstellung eines Medikamentes zum Induzieren einer Umgestaltung des Immunsystems gemäß der Erfindung ist eine Verwendung von CpG-Oligonukleotiden zur Herstellung eines Medikamentes zum Induzieren einer Antigen-spezifischen Immunantwort, durch Verabreichen eines Oligonukleotids an ein Lebewesen, das eine Sequenz aufweist, die wenigstens die folgende Formel umfasst: 5' X₁CGX₂ 3', wobei das Oligonukleotid wenigstens 8 Nukleotide umfasst, wobei C und G unmethyliert sind und wobei X₁ und X₂ Nukleotide sind, und Exponieren des Lebewesens gegenüber einem Antigen wenigstens 3 Tage nachdem das Oligonukleotid dem Lebewesen verabreicht worden ist, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu produzieren.
Ein „Antigen" ist, wie hierin verwendet, ein Molekül, das in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Antigene umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Zellen, Zellextrakte, Polysaccharide, Polysaccharidkonjugate, Lipide, Glycolipide, Kohlenhydrate, Peptide, Proteine, Viren und virale Extrakte. Der Begriff Antigen umfasst breit eine jegliche Art von Molekül, das von einem Wirtsimmunsystem als fremd erkannt wird. Antigene umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Krebsantigene, mikrobielle Antigene und Allergene.
Die CpG-Oligonukleotide der Erfindung sind nützlich bei der Behandlung von Krebs durch die Stimulierung einer Antigen-spezifischen Immunantwort gegen ein Antigen. Ein „Krebsantigen", wie hierin verwendet, ist eine Verbindung wie beispielsweise ein Peptid, das mit einer Tumor- oder Krebszelloberfläche verbunden ist und das in der Lage ist, eine Immunantwort hervorzurufen, wenn es auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle im Kontext eines MHC-Moleküls präsentiert wird. Krebsantigene können aus Krebszellen hergestellt werden, entweder durch Herstellen roher Extrakte von Krebszellen, wie, beispielsweise, beschrieben in Cohen et al., 1994, Cancer Research, 54: 1055, durch teilweises Reinigen der Antigene, durch rekombinante Technologie oder durch de novo Synthese bekannter Antigene. Krebsantigene umfassen Antigene, die rekombinant ein immunogener Teil eines Tumors oder Krebs oder ein ganzer Tumor oder Krebs sind. Derartige Antigene können isoliert oder rekombinant oder durch irgendwelche in der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Krebserkrankungen oder Tumoren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Gallengangkrebs; Gehirntumor; Brustkrebs; Gebärmutterhalskrebs; Choriokarzinom; Dickdarmkarzinom; Endometriumkarzinom; Speiseröhrenkrebs; Darmkrebs; intraepitheliale Neoplasmen; Lymphome; Leberkrebs; Lungenkrebs (z. B. kleinzelliger und nicht-kleinzelliger Lungenkrebs); Melanom; Neuroblastome; Mundhöhlenkrebs; Eierstockkrebs; Pankreaskrebs; Prostatakrebs; Mastdarmkrebs; Sarkome; Hautkrebs; Hodenkrebs; Schilddrüsenkrebs und Nierenkrebs, ebenso wie andere Karzinome und Sarkome.
Die CpG-Oligonukleotide der Erfindung sind auch für die Behandlung von Infektionskrankheiten nützlich. Eine Infektionskrankheit, wie hierin verwendet, ist eine Erkrankung, die aus der Anwesenheit eines Fremdorganismus in dem Körper entsteht. CpG wird verwendet, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu stimulieren, die eine T- oder B-Zellantwort gegen ein Antigen des Mikroorganismus aktivieren kann. Die CpG-Oligonukleotide werden unter Verwendung eines mikrobiellen Antigens in der gleichen Art und Weise verwendet wie oben für den Tumor beschrieben mit der Ausnahme, dass das Antigen für einen Mikroorganismus spezifisch ist. Ein „mikrobielles Antigen", wie hierin verwendet, ist ein Antigen eines Mikroorganismus und umfasst, ist aber nicht darauf beschränkt, infektiöse Viren, infektiöse Bakterien und infektiöse Pilze. Derartige Antigene umfassen den intakten Mikroorganismus ebenso wie natürliche Isolate und Fragmente oder Derivate davon und auch synthetische Verbindungen, die identisch oder ähnlich zu natürlichen Mikroorganismenantigenen sind. Eine Verbindung ist ähnlich zu einem natürlichen Mikroorganismusantigen, wenn es eine Immunantwort (humoral und/oder zellulär) gegen ein natürliches Mikroorganismusantigen induziert. Derartige Antigene werden routinemäßig in der Technik verwendet und sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt.
Beispiele für infektiöse Viren umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: Retroviridae (z. B. menschliche Immundefizienviren wie beispielsweise HIV-1 (auch als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV oder HIV-III bezeichnet; und andere Isolate wie beispielsweise HIV-LP; Picornaviridae (z. B. Polioviren, Hepatitis A-Virus; Enteroviren, menschliche Coxsackie-Viren, Rhinoviren, Echoviren); Calciviridae (z. B. Stämme, die Gastroenteritis verursachen); Togaviridae (z. B. Pferdeenzephalitisviren, Rubella-Viren); Flaviviridae (z. B. Dengue-Viren, Enzephalitisviren, Gelbfiebervirus); Coronaviridae (z. B. Coronaviren); Rhabdoviridae (z. B. vesikuläre Stomatitisviren, Tollwutviren); Filoviridae (z. B. Ebolaviren); Paramyxoviridae (z. B. Parainfluenza-Viren, Mumpsviren, Masernviren, Respiratory-syncytial-Virus; Orthomyxoviridae (z. B. Influenzaviren); Bunyaviridae (z. B. Hantaan-Viren, Bunya-Viren, Phleboviren und Nairo-Viren); Arena-viridae (hämorrhagische Fieberviren); Reoviridae (z. B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus); Parvovirida (Parvoviren); Papovaviridae (Papillomaviren, Polyomaviren); Adenoviridae (die meisten Adenoviren); Herpesviridae (Herpes-simplex-Virus (HSV) 1 und 2, Varizella-Zoster-Virus, Zytomegalievirus (CMV), Herpesvirus; Poxviridae (Variola-Viren, Vakzinia-Viren, Pockenviren); und Iridoviridae (z. B. afrikanischer Schweinefiebervirus); und nicht klassifizierte Viren (z. B. die ätiologischen Agenzien für spongiforme Enzephalopathien, das Agens von Delta-Hepatitis (von dem man annimmt, dass es ein defekter Satellit von Hepatitis B-Virus ist), die Agenzien für nicht-A-, nicht-B-Hepatitis (Klasse 1 = intern übertragen; Klasse 2 = parenteral übertragen (d. h. Hepatitis C); Norwalk- und verwandte Viren und Astroviren).
Beispiele für infektiöse Bakterien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: Helicobacter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (z. B. M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe-A-Streptokokken), Streptococcus agalactiae (Gruppe-B-Streptokokken), Streptococcus (Viridans-Gruppe), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobe sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogene Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia und Actinomyces israelli.
Beispiele für infektiöse Pilze umfassen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Andere infektiöse Organismen (d. h. Protisten) umfassen: Plasmodium wie beispielsweise Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale und Plasmodium vivax und Toxoplasma gondii.
Andere medizinisch relevante Mikroorganismen sind intensiv in der Literatur beschrieben worden, siehe z. B. C.G.A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Großbritannien 1983, dessen vollständiger Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Die CpG-Oligonukleotide der Erfindung sind auch bei der Behandlung von allergischen Erkrankungen nützlich. Die Verfahren werden in der gleichen Art und Weise wie oben für die Tumorimmuntherapie und Behandlung von Infektionserkrankungen durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Antigen für ein Allergen spezifisch ist. Derzeit werden allergische Erkrankungen im Allgemeinen durch die Injektion kleiner Dosen Antigen behandelt, gefolgt von der nachfolgenden erhöhten Dosierung des Antigens. Man glaubt, da s dieses Verfahren eine Gedächtnisimmunantwort produziert, um weitere allergische Reaktionen zu verhindern. Diese Verfahren sind jedoch mit dem Risiko von Nebenwirkungen wie beispielsweise einer allergischen Reaktion behaftet. Die Verfahren der Erfindung vermeiden diese Probleme.
Ein „Allergen" bezeichnet eine Substanz (Antigen), die eine allergische oder Asthmareaktion in einem empfindlichen Lebewesen induzieren kann. Die Liste von Allergenen ist enorm und kann Pollen, Insektengifte, Tierhautschuppe, Pilzsporen und pharmazeutische Wirkstoffe (z. B. Penicillin) umfassen. Beispiele für natürliche, Tier- und Pflanzenallergene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Proteine, die für die folgenden Genera spezifisch sind: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (z. B. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (z. B. Lolium perenne oder Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (z. B. Plantago lanceolata); Parietaria (z. B. Parietaria officinalis oder Parietaria judaica); Blattella (z. B. Blattella germanica); Apis (z. B. Apis multiflorum); Cupressus (z. B. Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica und Cupressus macrocarpa); Juniperus (z. B. Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis und Juniperus ashei); Thuya (z. B. Thuya orientalis); Chamaecyparis (z. B. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (z. B. Periplaneta americana); Agropyron (z. B. Agropyron repens); Secale (z. B. Secale cereale); Triticum (z. B. Triticum aestivum); Dactylis (z. B. Dactylis glomerata); Festuca (z. B. Festuca elatior); Poa (z. B. Poa pratensis oder Poa compressa); Avena (z. B. Avena sativa); Holcus (z. B. Holcus lanatus); Anthoxanthum (z. B. Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (z. B. Arrhenatherum elatius); Agrostis (z. B. Agrostis alba); Phleum (z. B. Phleum pratense); Phalaris (z. B. Phalaris arundinacea); Paspalum (z. B. Paspalum notatum); Sorghum (z. B. Sorghum halepensis); und Bromus (z. B. Bromus inermis).
Eine „Allergie" bezeichnet eine erworbene Überempfindlichkeit gegenüber einer Substanz (Allergen). Allergische Zustände umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Ekzem, Rhinitis allergica oder Koryza, Heuschnupfen, Bronchialasthma, Urtikaria (juckender Hautausschlag) und Lebensmittelallergien und andere atopische Zustände. Ein Lebewesen mit einer allergischen Reaktion ist ein Lebewesen, das eine Allergie aufweist oder für das das Risiko besteht, dass es eine Allergie entwickelt.
Allergien werden im Allgemeinen durch IgE-Antikörpererzeugung gegen harmlose Allergene verursacht. Die Zytokine, die durch unmethylierte CpG-Oligonukleotide induziert werden, sind überwiegend von einer Klasse, die als „Th1" bezeichnet wird, die am deutlichsten durch eine zelluläre Immunantwort gekennzeichnet ist und mit IL-12 und IFN-γ verbunden ist. Die andere Hauptart von Immunart wird als Th2-Immunantwort bezeichnet, die mehr mit einer Antikörperimmunantwort und mit der Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10 verbunden ist. Im Allgemeinen scheint es so, dass allergische Erkrankungen durch Immunantworten vom Th2-Typ und Autoimmunerkrankungen durch Th1-Immunantworten vermittelt sind. Auf der Grundlage der Fähigkeit der CpG-Oligonukleotide, die Immunantwort in einem Lebewesen von einer Th2-Antwort (die mit der Produktion von IgE-Antikörpern und Allergie verbunden ist) in eine Th1-Antwort (die vor allergischen Reaktionen schützt) zu verschieben, kann eine wirksame Dosis eines CpG-Oligonukleotids einem Lebewesen verabreicht werden, um eine Allergie zu behandeln oder zu verhindern.
CpG-Oligonukleotide können auch einen erheblichen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Asthma aufweisen. Th2-Zytokine, insbesondere IL-4 und IL-5, sind in den Atemwegen von asthmatischen Lebewesen erhöht. Diese Zytokine, insbesondere IL-4 und IL-5, sind in den Atemwegen von asthmatischen Lebewesen erhöht. Diese Zytokine fördern wichtige Aspekte der asthmatischen Entzündungsantwort, einschließlich IgE-Isotopenumschaltung, Eosinophilen-Chemotaxis und -Aktivierung und Mastzellenwachstum. Th1-Zytokine, insbesondere IFN-γ und IL-12, können die Ausbildung von Th2-Klonen und die Produktion von Th2-Zytokinen unterdrücken. „Asthma" bezeichnet eine Erkrankung des respiratorischen Systems, die durch Entzündung, Verengen der Atemwege und erhöhte Reaktivität der Atemwege gegenüber inhalierten Agenzien gekennzeichnet ist. Asthma ist häufig, obwohl nicht ausschließlich, mit atopischen oder allergischen Symptomen verbunden.
Man glaubt, dass das Antigen durch eine Antigen-präsentierende Zelle (APC), wie beispielsweise eine dendritische Zelle, in das erneut bevölkerte Immunsystem aufgenommen wird. Die APC verarbeiten und präsentieren dann das Antigen auf ihrer Zelloberfläche, um eine zytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antwort zu produzieren, indem mit T-Lymphozyten in Wechselwirkung getreten wird, oder eine Antikörperreaktion durch Wechselwirkung mit B-Lymphozyten zu produzieren. Bevorzugterweise wird das Antigen gegenüber Immunzellen 48 Stunden nach dem Hinzugeben von CpG exponiert. In einer bevorzugteren Ausführungsform sind die Immunzellen des Lebewesens dem Antigen 60 Stunden nach dem CpG ausgesetzt. In anderen Ausführungsformen sind die Immunzellen des Lebewesens dem Antigen wenigstens 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 oder 40 Tage nach dem CpG ausgesetzt.
Ein „Lebewesen" soll einen Menschen oder ein Wirbeltier bezeichnen, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, einen Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schwein, ein Schaf, eine Ziege, ein Hühnchen, einen Primaten, z. B. einen Affen, einen Fisch (Aquakulturarten), z. B. einen Lachs, eine Ratte und eine Maus.
Obwohl viele der oben beschriebenen Erkrankungen menschliche Erkrankungen betreffen, ist die Erfindung auch nützlich für die Behandlung von nicht-menschlichen Wirbeltieren. Nicht-menschliche Wirbeltiere sind auch in der Lage, Krebs, Infektionen, Allergien und Asthma zu entwickeln. Beispielsweise sind die CpG-Oligonukleotide der Erfindung zusätzlich zur Behandlung von menschlichen Infektionserkrankungen auch für die Behandlung von Infektionserkrankungen bei Tieren nützlich. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Behandeln", wenn er im Zusammenhang mit einer Infektionskrankheit verwendet wird, eine prophylaktische Behandlung, die die Widerstandskraft eines Lebewesens gegenüber einer Infektion mit einem Pathogen erhöht, oder, mit anderen Worten, die Wahrscheinlichkeit verringert, dass das Lebewesen mit dem Pathogen infiziert werden wird. Viele Vakzine für die Behandlung von nicht-menschlichen Wirbeltieren sind in Bennett, K. Compendium of Yeterinary Products, 3. Ausgabe North American Compendiums, Inc., 1995 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrachtet somit die Verwendung von CpG-Oligonukleotiden, um eine Antigen-spezifische Immunreaktion bei Menschen und nicht-menschlichen Tieren zu induzieren. Wie oben diskutiert, umfassen Antigene infektiöse Mikroben, wie beispielsweise Viren, Bakterien und Pilze und Fragmente davon, abgeleitet von natürlichen Quellen oder synthetisch. Infektiöse Viren von sowohl dem Menschen als auch nicht-menschlichen Wirbeltieren umfassen Retroviren, RNA-Viren und DNA-Viren. Diese Gruppe von Retroviren umfasst sowohl einfache Retroviren als auch komplexe Retroviren. Die einfachen Retroviren umfassen die Untergruppen der Retroviren vom B-Typ, Retroviren vom C-Typ und Retroviren vom D-Typ. Ein Beispiel für ein Retrovirus vom B-Typ ist das Mausbrusttumorvirus (MMTV). Die Retroviren vom C-Typ umfassen die Untergruppe A vom C-Typ (einschließlich Rous-Sarkom-Virus (RSV), Vogelleukämievirus (ALV) und Vogelmyeloblastosevirus (AMV)) und die Gruppe B vom C-Typ (einschließlich murinem Leukämievirus (MLV), Katzenleukämievirus (FeLV), murinem Sarkomvirus (MSV), Gibbonleukämievirus (GALV), Milznekrosevirus (SNV), Retikuloendotheliosevirus (RV) und Affensarkomvirus (SSV)). Retroviren vom D-Typ umfassen Mason-Pfizer-Affenvirus (MPMV) und Affenretrovirus vom Typ 1 (SRV-1). Die komplexen Retroviren umfassen die Untergruppen von Lentiviren, T-Zell-Leukämieviren und die Schaumviren. Lentiviren umfassen HIV-1, umfassen aber auch HIV-2, SIV, Visna-Virus, Katzenimmundefizienzvirus (FIV) und den Virus der infektiösen Anämie beim Pferd (EIAV). Die T-Zell-Leukämieviren umfassen HTLV-1, HTLV-II, Affen-T-Zell-Leukämievirus (STLV) und Rinderleukämievirus (BLV). Die Schaumviren umfassen menschliche Schaumviren (HFV), Affenschaumviren (SFV) und Rinderschaumviren (BFV). Die vorstehende Liste dient der Veranschaulichung und soll nicht beschränkend sein.
Beispiele für andere RNA-Viren, die Antigene in Wirbeltieren sind, umfassen, sind aber nicht auf die folgenden beschränkt: Mitglieder der Familie Reoviridae, einschließlich des Genus Orthoreovirus (mehrere Serotypen von Retroviren von sowohl Säugetieren als auch Vögeln), des Genus Orbivirus (Blauzungenvirus, Eugenangee-Virus, Kemerovo-Virus, Afrikanischer Pferdekrankheitsvirus und Coloradozeckenfiebervirus), des Genus Rotavirus (menschlicher Rotavirus, Nebraska-Kälberdiarrhövirus, muriner Rotavirus, Affenrotavirus, Rinder- oder Schafrotavirus, Vogelrotavirus); die Familie Picornaviridae, einschließlich des Genus Enterovirus (Poliovirus, Coxsackie-Virus-A und -B, enterische zytopathische Waisenviren des Menschen (ECHO), Hepatitis-A-Virus, Affenenteroviren, murine Enzephalomyelitis (ME)-Viren, Poliovirus muris, Rinderenteroviren, Schweineenteroviren, des Genus Cardiovirus (Enzephalomyocarditisvirus (EMC), Mengovirus), des Genus Rhinovirus (menschliche Rhinoviren einschließlich wenigstens 113 Subtypen; andere Rhinoviren), des Genus Aptovirus (Maul- und Klauenseuche (FMDV); die Familie Calciviridae, einschließlich der Virus des vesikulären Exanthem beim Schwein, San Miguel-Seelöwenvirus, Katzenpicornavirus und Norwalk-Virus; die Familie Togaviridae, einschließlich des Genus Alphavirus (Östlicher Pferdeenzephalitisvirus, Semliki-Forstvirus, Sindbis-Virus, Chikungunya-Virus, O'Nyong-Nyong-Virus, Ross-River-Virus, Venezuelanischer Pferdeenzephalitisvirus, Westlicher Pferdeenzephalitisvirus), des Genus Flavirius (Moskitoübertragenes Gelbfiebervirus, Dengue-Virus, Japanischer Enzephalitisvirus, St.-Louis-Enzephalitisvirus, Murray-Valley-Enzephalitisvirus, Westnilvirus, Kunjin-Virus, zentraleuropäischer Zeckenvirus, fernöstlicher Zeckenvirus, Kyasanur-Forstvirus, Louping-III-Virus, Powassan-Virus, Virus des hämorrhagischen Omsk-Fiebers), des Genus Rubivirus (Rubellavirus), des Genus Pestivirus (Virus der Schleimhauterkrankung, Wildschweincholeravirus, Border disease-Virus); die Familie Bunyaviridae, einschließlich des Genus Bunyavirus (Bunyamwera und verwandte Viren, Gruppe der kalifornischen Enzephalitisviren), des Genus Phlebovirus (sizilianischer Sandfliegenfiebervirus, Rift-Valley-Fiebervirus), des Genus Nairovirus (Virus des hämorrhagischen Krim-Kongo-Fiebers, Nairobi-Schafkrankheitsvirus) und des Genus Uukuvirus (Uukuniemi und verwandte Viren); die Familie Orthomyxoviridae, einschließlich des Genus Influenzavirus (Influenzavirus Typ A, viele menschliche Untertypen); Schweineinfluenzavirus und Vogel- und Pferdeinfluenzaviren; Influenza Typ B (viele menschliche Untertypen) und Influenza Typ C (möglicher separater Genus); die Familie Paramyxoviridae, einschließlich des Genus Paramyxovirus (Parainfluenzavirus Typ 1, Sendai-Virus, Hämadsorptionsvirus, Parainfluenzaviren der Typen 2 bis 5, Newcastle-Virus, Mumpsvirus), des Genus Morbillivirus (Masernvirus, Virus der subakuten sklerotisierenden Panenzephalitis, Staupevirus, Rinderpestvirus), des Genus Pneumovirus (Respiratory-syncytial-Virus (RSV), Respiratory-syncytial-Virus des Rindes und Pneumoniavirus von Mäusen); die Familie Rhabdoviridae, einschließlich des Genus Vesiculovirus (VSV), Chandipura-Virus, Flanders-Hart-Park-Virus), des Genus Lyssavirus (Tollwutvirus), Fisch-Rhabdoviren und zwei mutmaßliche Rhabdoviren (Marburg-Virus und Ebola-Virus); die Familie Arenaviridae, einschließlich des Lymphozytenchoriomeningitisvirus (LCM), Tacaribeviruskomplex und Lassavirus; die Familie Coronaviridae, einschließlich des Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), Hepatitisvirus der Maus, enterisches Coronavirus des Menschen und infektiöse Katzenperitonitis (Katzencoronavirus).
Beispielhafte DNA-Viren, die Antigene in Wirbeltieren sind, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: die Familie Poxviridae, einschließlich des Genus Orthopoxvirus (Variola major, Variola minor, Affenpockenvirus, Kuhpocken, Büffelpocken, Kaninchenpocken, Ektromelie), des Genus Leporipoxvirus (Myxom, Fibrom), des Genus Avipoxvirus (Geflügelpocken, andere Vogelpockenviren), des Genus Capripoxvirus (Schafpocken, Ziegenpocken), des Genus Suipoxvirus (Schweinepocken), des Genus Parapoxvirus (Virus der infektiösen pulstulösen Dermatitis, Pseudokuhpocken, Virus der papulären Stomatitis beim Rind); die Familie Iridoviridae (Afrikanisches Schweinefiebervirus, Froschviren 2 und 3, Lymphocystisvirus von Fischen); die Familie Herpesviridae, einschließlich der Alpha-Herpesviren (Herpes simplex Typen 1 und 2, Varizella-Zoster, Pferdeabortionsvirus, Pferdeherpesvirus 2 und 3, Pseudotollwutvirus, Virus der infektiösen Rinderkeratokonjunktivitis, Virus der infektiösen Rinderrhinotracheitis, Virus der Katzenrhinotracheitis, Virus der infektiösen Laryngotracheitis), der Beta-Herpesviren (menschlicher Zytomegalovirus und Zytomegaloviren des Schweins, von Affen und Nagetieren); der Gamma-Herpesviren (Epstein-Barr-Virus (EBV), Marek-Virus, Herpes saimiri, Herpesvirus ateles, Herpesvirus sylvilagus, Meerschweinchen-Herpesvirus, Lucke-Tumorvirus); die Familie Adenoviridae, einschließlich des Genus Mastadenovirus (menschliche Subgruppen A, B, C, D, E und ungruppiert; Affenadenoviren (wenigstens 23 Serotypen), infektiöse Hunde-Hepatitis und Adenoviren von Rindern, Schweinen, Schafen, Fröschen und vielen anderen Spezies, des Genus Aviadenovirus (Vogeladenoviren); und nicht-kultivierbare Adenoviren; die Familie Papoviridae, einschließlich des Genus Papillomavirus (menschliche Papillomaviren, Rinderpapillomaviren, Shope-Kaninchenpapillomavirus und verschiedene pathogene Papillomaviren von anderen Spezies), des Genus Polyomavirus (Polyomavirus, vakuolisierendes Agens des Affen (SV-40), vakuloisierendes Agens des Kaninchens (RKV), K-Virus, BK-Virus, JC-Virus und andere Polyomaviren von Primaten wie beispielsweise lymphotrope Papillomaviren); die Familie Parvoviridae einschließlich des Genus Adeno-assoziierte Viren, des Genus Parvovirus (Katzenpanleukämievirus, Rinderparvovirus, Hundeparvovirus, Virus der Erkrankung des Aleutennerzes, etc.). Schließlich können DNA-Viren Viren umfassen, die nicht in die obigen Familien passen, wie beispielsweise Viren der Kuru- und Creutzfeldt-Jakob-Erkrankung und das chronisch infektiöse neuropathische Agens (CHINA-Virus).
Sowohl Gram-negative als auch Gram-positive Bakterien dienen als Antigene in Vertebraten. Derartige Gram-positive Bakterien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf jene Bakterien, die oben diskutiert sind, ebenso wie Pasteurella-Arten, Staphylococcus-Arten und Streptococcus-Arten. Gram-negative Bakterien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Escherichia coli, Pseudomonas-Spezies und Salmonella-Spezies. Salmonella enteritidis ist ein wichtiger Pathogen in der kommerziellen Legeindustrie, da die Kolonisierung der Ovarien von Legehühnern zu mütterlicherseits übertragenen Salmonella in Speiseeiern führen kann.
Zusätzlich zur Verwendung von CpG-Oligonukleotiden, um eine Antigen-spezifische Immunantwort in Menschen zu induzieren, sind die CpG-Oligonukleotide der bevorzugten Ausführungsformen besonders gut geeignet für die Behandlung von Vögeln wie beispielsweise Hennen, Hühnchen, Truthähnen, Enten, Gänsen, Wachteln und Fasanen. Vögel sind Hauptziele für viele Arten von Infektionen, einschließlich AIDS oder Immundefizienzvirus.
Schlüpfende Vögel sind pathogenen Mikroorganismen kurz nach der Geburt ausgesetzt. Obwohl diese Vögel anfänglich gegen Pathogene durch von dem Muttertier übertragene Antikörper geschützt sind, ist dieser Schutz nur vorübergehend und das unreife Immunsystem des Vogels muss anfangen, den Vogel gegen die Pathogene zu schützen. Es ist oft wünschenswert, eine Infektion bei jungen Vögeln zu verhindern, wenn sie am empfindlichsten sind. Es ist auch wünschenswert, gegen eine Infektion bei älteren Vögeln zu schützen, insbesondere wenn die Vögel in geschlossenen Quartieren untergebracht sind, was zu einer schnellen Verbreitung einer Erkrankung führt. Es ist somit wünschenswert, CpG-Oligonukleotide der Erfindung an Vögel zu verabreichen, um die Antigen-spezifische Immunantwort zu erhöhen, wenn das Antigen vorhanden ist.
Ein Beispiel einer üblichen Infektion bei Hühnchen ist das Virus der infektiösen Hühnchenanämie (CIAV). CIAV wurde zuerst 1979 in Japan während einer Untersuchung einer Unterbrechung der Impfung gegen die Marek-Krankheit isoliert (Yuasa et al., 1979, Avian Dis. 23: 366–385). Seit dieser Zeit ist CIAV in der kommerziellen Geflügelindustrie in allen wesentlichen Geflügel-produzierenden Ländern nachgewiesen worden (van Bulow et al., 1991, S. 690–699) in Diseases of Poultry, 9. Ausgabe, Iowa State University Press).
Eine CIAV-Infektion führt zu einer klinischen Erkrankung, die durch Anämie, Hämorrhagie und Immunsuppression bei jungen empfindlichen Hühnchen gekennzeichnet ist. Atrophie des Thymus und des Knochenmarks und konsistente Läsionen von CIAV-infizierten Hühnchen sind ebenfalls charakteristisch für CIAV-Infektion. Lymphozytenverarmung im Thymus und gelegentlich in der Bursa fabricii führen zu einer Immunsuppression und einer erhöhten Empfindlichkeit gegenüber sekundären viralen, bakteriellen oder Pilzinfektionen, die dann den Verlauf der Erkrankung komplizieren. Die Immunsuppression kann eine schwerwiegende Erkrankung nach Infektion mit einem oder mehreren Viren aus der Gruppe des Marek-Virus (MDV), des Virus der infektiösen Bursaerkrankung, Retikuloendotheliosevirus, Adenovirus oder Reovirus verursachen. Es ist berichtet worden, dass die Pathogenese von MDV durch CIAV verstärkt wird (DeBoer et al., 1989, S. 28 in Proceedings of the 38^th Western Poultry Diseases Conference, Tempe, Ariz.). Weiter ist berichtet worden, dass CIAV die Anzeichen von infektiöser Bursaerkrankung verschlimmert (Rosenberger et al., 1989, Avian Dis. 33: 707–713). Hühnchen entwickeln eine Altersresistenz gegenüber experimentell induzierter Erkrankung infolge CAA. Dies ist im Wesentlichen im Alter von 2 Wochen abgeschlossen, aber ältere Vögel sind noch gegenüber einer Infektion empfindlich (Yuasa, N. et al., 1979 a.a.O.; Yuasa, N. et al., Avian Diseases 24, 202–209, 1980). Wenn jedoch Hühnchen dual mit CAA und einem immunsupprimierenden Agens (IBDV, MDV etc.) infiziert werden, ist eine Altersresistenz gegenüber der Erkrankung verzögert (Yuasa, N. et al., 1979 und 1980 a.a.O.; Bulow von V. et al., J. Veterinary Medicine 33, 93–116, 1986). Merkmale von CIAV, die die Übertragung der Erkrankung potenzieren, umfassen eine hohe Resistenz gegenüber Umgebungsinaktivierung und einige übliche Infektionsmittel. Der ökonomische Einfluss von CIAV-Infektion auf die Geflügelindustrie ist offensichtlich mit Blick auf die Tatsache, dass 10% bis 30% der infizierten Vögel bei Ausbruch der Erkrankung sterben.
Die Impfung von Vögeln wie anderen Wirbeltieren kann in einem jeden Alter durchgeführt werden. Normalerweise werden Impfungen vorgenommen bis zum Alter von 12 Wochen für einen lebenden Mikroorganismus und zwischen 14 und 18 Wochen für einen inaktivierten Mikroorganismus oder einen anderen Typ von Vakzin. Für die in ovo Vakzinierung kann die Vakzinierung in dem letzten Viertel der Embryonalentwicklung durchgeführt werden. Das Vakzin kann subkutan, durch Sprühen, oral, intraokular, intratracheal, nasal, in ovo oder durch andere hierin beschriebene Verfahren verabreicht werden. Die CpG-Oligonukleotide der Erfindung können an Vögel und andere nicht-menschliche Wirbeltiere verabreicht werden unter Verwendung von Routinevakzinierungsschemata und das Antigen wird nach einer geeigneten Zeitspanne wie hierin beschrieben verabreicht.
Rinder und Viehbestände sind für Infektionen ebenfalls empfindlich. Eine Erkrankung, die diese Tiere betrifft, kann schwerwiegende ökonomische Verluste, insbesondere bei Rindern, verursachen. Die Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um Viehbestände wie beispielsweise Kühe, Pferde, Schweine, Schafe und Ziegen vor Infektionen zu schützen.
Kühe können durch Rinderviren infiziert werden. Der Virus der viralen Rinderdiarrhö (BVDV) ist ein kleiner umhüllter positiv-strängiger RNA-Virus und wird, zusammen mit dem Wildschweincholeravirus (HOCV) und dem Schaf-Border-Erkrankungsvirus (BDV), in den Genus Pestivirus klassifiziert. Obwohl Pestiviren früher in der Familie der Togaviridae klassifiziert worden sind, haben einige Studien ihre Umklassifizierung innerhalb der Familie der Flaviviridae zusammen mit den Flavivirus- und Hepatitis C-Virus (HCV)-Gruppen nahegelegt (Francki, et al., 1991).
BVDV, das ein wichtiges Pathogen von Rindern ist, kann auf der Grundlage von Zellkulturanalysen in zytopathogene (CP) und nicht-zytopathogene (NCP)-Biotypen unterschieden werden. Der NCP-Biotyp ist weiter verbreitet, obwohl beide Biotypen in Rindern gefunden werden können. Wenn eine trächtige Kuh mit einem NCP-Stamm infiziert wird, kann die Kuh ein persistent infiziertes und spezifisch immuntolerantes Kalb gebären, das das Virus Zeit seines Lebens verbreitet. Das persistent infizierte Rind kann einer Schleimhauterkrankung erliegen und beide Biotypen können dann aus dem Tier isoliert werden. Klinische Manifestationen können Verwerfen, Teratogenese und Atemprobleme, Mukoseerkrankung und milde Diarrhö umfassen. Zusätzlich ist eine schwerwiegende Thrombozytopenie, verbunden mit Herdenepidemien, die zum Tod des Tieres führen können, beschrieben worden und mit dieser Krankheit verbundene Stämme scheinen virulenter als die klassischen BVDVs zu sein.
Pferdeherpesviren (EHV) umfassen eine Gruppe von antigenisch distinkten biologischen Agenzien, die eine Vielzahl von Infektionen bei Pferden verursachen, die von subklinischen bis tödlichen Erkrankungen reichen. Diese umfassen Pferdeherpesvirus-1 (EHV-1), das ein ubiquitäres Pathogen bei Pferden ist. EHV-1 ist mit Epidemien von Verwerfen, Atemwegserkrankungen und Erkrankungen des zentralen Nervensystems verbunden. Eine primäre Infektion des oberen Atemtraktes von jungen Pferden führt zu einer fiebrigen Erkrankung, die wenigstens 8 bis 10 Tage dauert. Immunologisch erfahrene Stuten können durch die Atemwege erneut infiziert werden, ohne dass die Erkrankung apparent wird, so dass ein Verwerfen üblicherweise ohne Warnung erfolgt. Das neurologische Syndrom ist mit Atemwegserkrankung oder Verwerfen verbunden und kann Tiere eines jeden Geschlechtes in einem jeden Alter betreffen, was zu einer fehlenden Koordination, Schwäche und posterioren Paralyse führt (Telford, E. A. R. et al., Virology 189, 304–316, 1992). Andere EHVs umfassen EHV-2 oder Pferdezytomegalievirus, EHV-3, den Virus des coitalen Exanthems beim Pferd und EHV-4, früher als EHV-1 Subtyp 2 klassifiziert.
Schafe und Ziegen können durch eine Vielzahl von gefährlichen Mikroorganismen einschließlich Visna-maedi infiziert werden.
Primaten wie beispielsweise Langschwanzaffen, Menschenaffen und Makaken können durch Affenimmundefizienzvirus infiziert werden. Man hat berichtet, dass inaktivierte Zellvirus- und ganze zellfreie Affenimmundefizienzvakzine bei Makaken einen Schutz verleihen (Stott et al. (1990) Lancet 36: 1538–1541; Desrosiers et al. PNAS USA (1989) 86: 6353–6357; Murphey-Corb et al. (1989) Science 246: 1293–1297; und Carlson et al. (1990) AIDS Res. Human Retroviruses 6: 1239–1246). Man hat berichtet, dass ein rekombinantes HIV gp120-Vakzin bei Schimpansen einen Schutz verleiht (Berman et al. (1990) Nature 345: 622–625).
Katzen, sowohl Hauskatzen als auch Wildkatzen, sind gegenüber einer Vielzahl von Mikroorganismen empfindlich. Beispielsweise ist die infektiöse Peritonitis bei Katzen eine Erkrankung, die sowohl bei Hauskatzen als auch bei Wildkatzen auftritt, wie beispielsweise Löwen, Leoparden, Geparden und Jaguaren. Wenn es erwünscht ist, Infektion mit diesen und anderen Arten von pathogenen Organismen bei Katzen zu vermeiden, können die CpG-Oligonukleotide verwendet werden, um Katzen zu impfen, um sie vor einer Infektion zu schützen.
Hauskatzen können mit verschiedenen Retroviren infiziert werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, des Katzenleukämievirus (FeLV), Katzensarkomavirus (FeSV), endogenen Oncornavirus vom Typ C (RD-114) und Synzytien bildenden Virus der Katze (FeSFV). Von diesen ist FeLV das signifikanteste Pathogen, was unterschiedliche Symptome verursacht, einschließlich lymphoretikuläre und myeloide Neoplasmen, Anämien, immunvermittelte Erkrankungen und ein Immundefizienzsyndrom, das ähnlich dem menschlichen erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS) ist. Kürzlich ist berichtet worden, dass eine spezielle replikationsdefiziente FeLV-Mutante, die als FeLV-AIDS bezeichnet wird, insbesondere mit immunsuppressiven Eigenschaften verbunden sei.
Die Entdeckung von T-lymphotropen Lentiviren der Katze (auch als Katzenimmundefizienz bezeichnet) wurde erstmalig von Pedersen et al. (1987) Science 235: 790–793 berichtet. Die Merkmale von FIV sind von Yamamoto et al. (1988) Leukemia, Dezemberbeilage 2: 2045–2155; Yamamoto et al. (1988) Am. J. Vet. Res. 49: 1246–1258; und Ackley et al. (1990) J. Virol. 64: 5652–5655 berichtet worden. Das Klonieren und die Sequenzanalyse von FIV ist von Olmsted et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2448–2452 und 86: 4355–4360 berichtet worden.
Infektiöse Katzenperitonitis (FIP) ist eine sporadische Erkrankung, die in unvorhersagbarer Weise bei Hauskatzen und wilden Feliden auftritt. Während FIP in erster Linie eine Erkrankung von Hauskatzen ist, ist sie bei Löwen, Berglöwen, Leoparden, Geparden und dem Jaguar diagnostiziert worden. Kleinere Wildkatzen, die von FIP befallen sind, umfassen den Luchs und den Caracal, die Sandkatze und die Pallaskatze. Bei Hauskatzen tritt die Erkrankung überwiegend bei jungen Tieren auf, obwohl Katzen eines jeglichen Alters empfindlich sind. Ein hauptsächliches Auftreten erfolgt im Alter von 6 bis 12 Monaten. Eine Verringerung der Inzidenz wird im Alter von 5 bis 13 Jahren festgestellt, gefolgt von einer erhöhten Inzidenz bei Katzen im Alter von 14 bis 15 Jahren.
Virale, bakterielle und parasitische Erkrankungen bei Flossenfischen, Schalentieren oder anderen aquatischen Lebensformen stellen ein erhebliches Problem für die Aquakulturindustrie dar. Infolge der hohen Dichte der Tiere in den Schlüpftanks oder in umschlossenen Meeresfarmbereichen können Infektionserkrankungen einen Großteil des Bestandes an, beispielsweise, Flossenfischen, Schalentieren oder anderen aquatischen Lebensformen auslöschen. Das Verhindern einer Erkrankung ist ein erwünschteres Heilmittel für diese Bedrohungen des Fisches als eine Intervention, wenn die Erkrankung einmal voranschreitet. Das Impfen von Fischen ist das einzige Präventivverfahren, das einen langfristigen Schutz durch Immunität verleihen kann. Nukleinsäure-basierte Vakzinierungen sind in US-Patent 5,780,448 beschrieben, das an Davis erteilt worden ist.
Das Immunsystem der Fische weist viele Merkmale auf, die dem Säugetierimmunsystem ähnlich sind, wie beispielsweise das Vorhandensein von B-Zellen, T-Zellen, Lymphokinen, Komplement und Immunglobulinen. Fische weisen Lymphozyten-Subklassen auf mit Aufgaben, die hinsichtlich vieler Aspekte ähnlich zu jenen von B- und T-Zellen von Säugetieren sind. Vakzine können oral oder durch Immersion oder Injektion verabreicht werden.
Aquakulturarten umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Flossenfische, Schalentiere und andere aquatische Tiere. Fische umfassen alle Wirbelfische, die Knochen- oder Knorpelfische sein können, wie beispielsweise Salmonide, Karpfen, Wels, Gelbschwanz, Seebrasse und Seebarsch. Salmonide sind eine Familie von Flossenfischen, die Forelle (einschließlich Regenbogenforelle), Lachs und Arktische Rotforelle umfassen. Beispiele für Schalentiere umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Muscheln, Hummer, Garnelen, Krabben und Austern. Andere kultivierte aquatische Tiere umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Aale, zehnarmige Tintenfische und achtarmige Tintenfische.
Polypeptide von viralen Aquakulturpathogenen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Glycoprotein (G) oder Nukleoprotein (IV) des Virus der viralen hämorrhagischen Septikhämie (VHSV); G- oder N-Proteine des infektiösen hämatopoietischen Nekrosevirus (IHNV); VP1, VP2, VP3 oder N-Strukturproteine des infektiösen Pankreasnekrosevirus (IPNV); G-Protein der Karpfenfrühlungsvirämie (SVC); und ein Membran-assoziiertes Protein, Tegumin oder Kapsidprotein oder Glycoprotein des Kanalwelsvirus (CCV).
Polypeptide von bakteriellen Pathogenen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf ein Eisenreguliertes Außenmembranprotein (IROMP), ein Außenmembranprotein (OMP) und ein A-Protein von Aeromonis sahnonicida, das Furunkulose verursacht, das p57-Protein von Renibacterium salmoninarum, das bakterielle Nierenerkrankung verursacht (BKD), Hauptoberflächen-assoziiertes Antigen (msa), ein Oberflächen-exprimiertes Zytotoxin (mpr), ein Oberflächen-exprimiertes Hämolysin (ish) und ein Flagellenantigen von Yersiniose; ein extrazelluläres Protein (ECP), ein Eisen-reguliertes Außenmembranprotein (IROMP) und ein Strukturprotein von Pasteurellose; ein OMP und ein Flagellenprotein von Vibrosis anguillarum und V. ordalii; ein Flagellenprotein, ein OMP-Protein, aroA und purA von Edwardselliosis ictaluri und E. tarda; und Oberflächenartigen von Ichthyophthirius; und ein Struktur- und regulatorisches Protein von Cytophaga columnari; und ein Struktur- und regulatorisches Protein von Rickettsia.
Polypeptide eines parasitischen Pathogens umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Oberflächenartigene von Ichthyophthirius.
Das Lebewesen wird gegenüber einem Antigen exponiert. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „exponiert" entweder den aktiven Schritt des Kontaktierens des Lebewesens mit einem Antigen oder die passive Exposition des Lebewesens gegenüber dem Antigen in vivo. Verfahren für die aktive Exposition eines Lebewesens gegenüber einem Antigen sind in der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen wird ein Antigen dem Lebewesen direkt durch irgendein Mittel wie beispielsweise intravenöse, intramuskuläre, orale, transdermale, mukosale, intranasale, intratracheale oder subkutane Verabreichung verabreicht. Das Antigen kann systemisch oder lokal verabreicht werden. Verfahren zum Verabreichen des Antigens und des CpG sind detaillierter unten beschrieben. Ein Lebewesen ist gegenüber einem Antigen passiv exponiert, wenn ein Antigen für die Exposition gegenüber den Immunzellen im Körper verfügbar wird. Ein Lebewesen kann passiv gegenüber einem Antigen exponiert werden durch beispielsweise den Eintritt eines fremden Pathogens in den Körper oder durch die Entwicklung einer Tumorzelle, die ein fremdes Antigen auf ihrer Oberfläche exprimiert, exponiert werden. Wenn ein Lebewesen passiv gegenüber einem Antigen exponiert wird, ist es bevorzugt, dass das CpG-Oligonukleotid ein Oligonukleotid mit einer Länge von 8–100 Nukleotiden ist und/oder ein Phosphat-modifiziertes Rückgrat aufweist. Es ist auch bevorzugt, dass das Oligonukleotid nicht zusammen mit einem ersten Antigen verabreicht wird.
Die Verwendungen der CpG-Oligonukleotide, bei denen ein Lebewesen passiv gegenüber einem Antigen exponiert wird, kann insbesondere von dem Timing der Verabreichung des CpG-Oligonukleotids abhängig sein. Beispielsweise kann bei einem Lebewesen, für das das Risiko besteht, einen Krebs oder eine allergische oder asthmatische Reaktion zu entwickeln, dem Lebewesen das CpG-Oligonukleotid regelmäßig verabreicht werden, wenn dieses Risiko am größten ist, d. h. während der Allergiesaison oder nach der Exposition gegenüber einem Krebs erzeugenden Agens.
Zusätzlich kann das CpG-Oligonukleotid Reisenden verabreicht werden, bevor sie in fremde Länder reisen, wo das Risiko besteht, dass sie gegenüber infektiösen Agenzien exponiert werden. In ähnlicher Weise kann das CpG-Oligonukleotid Soldaten oder Zivilisten verabreicht werden, für die das Risiko besteht, dass sie einem biologischen Krieg ausgesetzt werden.
Die Erfindung fasst somit die geplante Verabreichung von CpG-Oligonukleotiden ins Auge. Die Oligonukleotide können einem Lebewesen wöchentlich oder monatlich verabreicht werden. Wenn das Risiko besteht, dass ein Lebewesen gegenüber einem Antigen oder Antigenen exponiert wird, kann das CpG regelmäßig verabreicht werden, um ein geprägtes Immunsystem aufrechtzuerhalten, das das Antigen unmittelbar nach der Exposition erkennen und eine Antigen-spezifische Immunantwort produzieren wird. Ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es gegenüber einem Antigen exponiert wird, ist ein Lebewesen, für das eine Wahrscheinlichkeit besteht, dass es gegenüber einem Antigen exponiert wird oder eine Immunantwort zu dem Antigen entwickelt. Wenn das Antigen ein Allergen ist und das Lebewesen eine allergische Reaktion zu dem speziellen Antigen entwickelt und das Lebewesen gegenüber dem Antigen exponiert ist, d. h. während der Pollensaison, dann besteht für das Lebewesen ein Risiko, gegenüber dem Antigen exponiert zu sein. Wenn einem derartigen Lebewesen monatlich ein CpG-Oligonukleotid verabreicht wird, dann wird es einen geprägten Satz an Immunzellen aufrechterhalten, die in der Lage sind, das Antigen zu erkennen und damit zu reagieren.
Ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es einen Krebs entwickelt, kann ebenfalls unter Verwendung der CpG-Oligonukleotide der Erfindung durch passive oder aktive Exposition gegenüber dem Antigen nach CpG behandelt werden. Ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es Krebs entwickelt, ist ein solches, das eine hohe Wahrscheinlichkeit hat, einen Krebs zu entwickeln. Diese Lebewesen umfassen, beispielsweise, Lebewesen mit einer genetischen Anomalität, von deren Anwesenheit gezeigt worden ist, dass sie mit einer höheren Wahrscheinlichkeit korreliert, dass ein Krebs entwickelt wird, und Lebewesen, die gegenüber Krebs erzeugenden Agenzien wie beispielsweise Tabak, Asbest oder anderen chemischen Toxinen exponiert sind. Wenn ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es einen Krebs entwickelt, regelmäßig mit CpG behandelt wird, beispielsweise monatlich, wird das Lebewesen einen geprägten Satz an Immunzellen aufrechterhalten, die in der Lage sind, ein Antigen zu erkennen und eine Antigen-spezifische Immunantwort zu induzieren. Wenn ein Tumor anfängt, sich in dem Lebewesen zu bilden, wird das Lebewesen eine spezifische Immunantwort gegen ein oder mehrere der Tumorantigene entwickeln.
Dieser Aspekt der Erfindung ist besonders vorteilhaft, wenn das Antigen, gegenüber dem das Lebewesen exponiert ist, unbekannt ist. Beispielsweise ist es bei Soldaten, für die das Risiko besteht, dass sie einem biologischen Krieg ausgesetzt sind, im Allgemeinen nicht bekannt, gegenüber welcher biologischen Waffe der Soldat exponiert werden kann. Es kann sein, dass ein Lebewesen, das in fremde Länder reist, in ähnlicher Weise nicht weiß, mit welchen infektiösen Agenzien es in Kontakt gelangen kann. Indem ein Umbau des Immunsystems induziert wird, wird das Immunsystem geprägt, auf irgendein Antigen zu antworten.
Das Antigen kann dem Immunsystem eines Lebewesens alleine oder mit einem Träger verabreicht werden. Beispielsweise sind kolloidale Dispersionssysteme verwendet worden, um einem Lebewesen Antigen zu verabreichen. Wie hierin verwendet bezeichnet ein „kolloidales Dispersionssystem" ein natürliches oder synthetisches Molekül, das verschieden ist von den aus bakteriologischen und viralen Quellen abgeleiteten und das in der Lage ist, das Antigen in einem Lebewesen abzugeben und dort freizusetzen. Kolloidale Dispersionssysteme umfassen makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und Lipid-basierte Systeme einschließlich Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposomen. Ein bevorzugtes kolloidales System der Erfindung ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membrangefäße, die als Verabreichungsvektor in vivo oder in vitro nützlich sind. Man hat gezeigt, dass große unilamelläre Gefäße (LUV), deren Größe von 0,2–4,0 μ reicht, große Makromoleküle innerhalb des wässrigen Inneren einschließen können und diese Makromoleküle an Zellen in einer biologisch aktiven Form abgegeben werden können (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77 (1981)).
Lipidformulierungen für Transfektionen sind kommerziell erhältlich von QIAGEN, zum Beispiel als EFFECTENE^TM (ein nicht-liposomales Lipid mit einem speziellen DNA-kondensierenden Verstärker) und SUPER-FECT^TM (eine neue wirkende dendrimäre Technologie) ebenso wie Gibco BRL, beispielsweise LIPOFECTIN^TM und LIPOFECTACE^TM, die aus kationischen Lipiden ausgebildet sind wie beispielsweise N-[1-(2,3 dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB). Verfahren zur Herstellung von Liposomen sind in der Technik gut bekannt und sind in vielen Veröffentlichungen beschrieben worden. Liposomen sind in einem Übersichtsartikel von Gregoriadis, G., Trends in Biotechnology 3: 235–241 (1985) beschrieben, der hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Es wird ins Auge gefasst, dass das Antigen einem Lebewesen in einem Nukleinsäuremolekül verabreicht werden kann, das das Antigen codiert, so dass das Antigen in vivo exprimiert werden muss. Die Nukleinsäure, die das Antigen codiert, ist funktionsfähig mit einer Genexpressionssequenz verbunden, die die Expression der Antigennukleinsäure innerhalb einer eukaryotischen Zelle steuert. Die „Genexpressionssequenz" ist irgendeine regulatorische Nukleotidsequenz wie beispielsweise eine Promotersequenz oder Promotor-Verstärker-Kombinationen, die die wirksame Transkription und Translation der Antigennukleinsäure erleichtert, an die sie funktionsfähig gekoppelt ist. Die Genexpressionssequenz kann, beispielsweise, ein Säugetier- oder viraler Promotor sein, wie beispielsweise ein konstitutiver oder induzierbarer Promotor. Konstitutive Säugetierpromotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Promotoren für die folgenden Gene: Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), Adenosindesaminase, Pyruvatkinase, β-Actinpromotor und andere konstitutive Promotoren. Beispielhafte virale Promotoren, die in eukaryotischen Zellen konstitutiv funktionieren, umfassen, beispielsweise, Promotoren des Affenvirus, Papillomavirus, Adenovirus, menschlichen Immundefizienzvirus (HIV), Rous-Sarkom-Virus, Zytomegalievirus, die langen terminalen Wiederholungen (LTR) von Moloney-Leukämie-Virus und anderen Retroviren, und den Thymidinkinase-Promotor von Herpes-simplex-Virus. Andere konstitutive Promotoren sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Die Promotoren, die als Genexpressionssequenzen der Erfindung nützlich sind, umfassen auch induzierbare Promotoren. Induzierbare Promotoren werden in Gegenwart eines induzierenden Agens exprimiert. Beispielsweise wird der Metallothioneinpromotor induziert, um die Transkription und Translation in Gegenwart bestimmter Metallionen zu fördern. Andere induzierbare Promotoren sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Im Allgemeinen wird die Genexpressionssequenz, wie erforderlich, 5'-nicht-transkribierende und 5'-nicht-translatierende Sequenzen umfassen, die bei der Initiierung der Transkription bzw. Translation beteiligt sind, wie beispielsweise eine TATA-Box, Kappensequenz, CAAT-Sequenz und dergleichen. Insbesondere werden derartige 5'-nicht-transkribierende Sequenzen eine Promotorregion umfassen, die eine Promotorsequenz für die Transkriptionssteuerung der funktionsfähig verbundenen Antigennukleinsäure umfasst. Die Genexpressionssequenzen umfassen optional Enhancersequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen, wie erwünscht.
Die Antigennukleinsäure ist funktionsfähig mit der Genexpressionssequenz verbunden. Wie hierin verwendet sollen die Antigennukleinsäuresequenz und die Genexpressionssequenz „funktionsfähig miteinander verknüpft sein", wenn sie kovalent in einer solchen Art und Weise verbunden sind, dass die Expression oder Transkription und/oder Translation der Antigen-codierenden Sequenz unter den Einfluss oder die Kontrolle der Genexpressionssequenz gestellt sind. Zwei DNA-Sequenzen sollen funktionsfähig miteinander verbunden sein, wenn die Induktion eines Promotors in der 5'-Genexpressionssequenz zur Transkription der Antigensequenz führt und wenn die Art der Verbindung zwischen den zwei DNA-Sequenzen (1) nicht zu der Einführung einer Leserahmenverschiebungsmutation führt, (2) nicht die Fähigkeit der Promotorregion stört, die Transkription der Antigensequenz zu steuern, oder (3) nicht die Fähigkeit des korrespondierenden RNA-Transkriptes stört, in ein Protein translatiert zu werden. Eine Genexpressionssequenz würde somit funktionsfähig mit einer Antigennukleinsäuresequenz verbunden sein, wenn die Genexpressionssequenz in der Lage wäre, die Transkription der Antigennukleinsäuresequenz zu bewirken, so dass das sich ergebende Transkript in das erwünschte Protein oder Polypeptid translatiert wird.
Die Antigennukleinsäure der Erfindung kann dem Immunsystem alleine oder zusammen mit einem Vektor verabreicht werden. Im breitesten Sinne ist ein „Vektor" ein jegliches Vehikel, das in der Lage ist, den Transfer der Antigennukleinsäure zu den Zellen des Immunsystems und bevorzugterweise APCs zu erleichtern, so dass das Antigen auf der Oberfläche einer APC exprimiert und präsentiert werden kann. Bevorzugterweise transportiert der Vektor die Nukleinsäure zu den Immunzellen mit einem verringerten Abbau verglichen mit dem Umfang des Abbaus, der sich bei Abwesenheit des Vektors ergeben würde. Der Vektor umfasst optional die oben beschriebene Genexpressionssequenz, um die Expression der Antigennukleinsäure in APCs zu erhöhen. Im Allgemeinen umfassen die für die Erfindung nützlichen Vektoren, sind aber nicht darauf beschränkt, Plasmide, Phagemide, Viren und andere Vehikel, die aus viralen oder bakteriellen Quellen abgeleitet sind, die durch die Einführung oder den Einbau der Antigennukleinsäuresequenzen manipuliert worden sind. Virale Vektoren sind eine bevorzugte Art von Vektor und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Nukleinsäuresequenzen aus den folgenden Viren: Retrovirus, wie beispielsweise muriner Moloney-Leukämievirus, muriner Harvey-Sarkom-Virus, muriner Brusttumorvirus und Rous-Sarkom-Virus; Adenovirus, adeno-assoziierter Virus; Viren vom Typ SV40; Polyomaviren; Epstein-Barr-Viren; Papillomaviren; Herpesvirus; Vakziniavirus; Poliovirus; und RNA-Viren wie beispielsweise Rettrovirus. Man kann leicht andere Vektoren verwenden, die nicht erwähnt, aber den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Bevorzugte virale Vektoren basieren auf nicht-zytopathischen eukaryotischen Viren, bei denen nicht-essentielle Gene durch das interessierende Gen ersetzt worden sind. Nicht-zytopathische Viren umfassen Retroviren, deren Lebenszyklus reverse Transkription genomischer viraler RNA in DNA mit nachfolgender proviraler Integration in die zelluläre Wirts-DNA umfasst. Retroviren sind für gentherapeutische Versuche am Menschen zugelassen worden. Am nützlichsten sind jene Retroviren, die replikationsdefizient sind (d. h. in der Lage sind, die Synthese der erwünschten Proteine zu steuern, aber nicht in der Lage sind, infektiöse Partikel zu bilden). Derartige genetisch veränderte retrovirale Expressionsvektoren sind allgemein nützlich für die hoch effiziente Transduktion von Genen in vivo. Standardprotokolle zum Produzieren von replikationsdefizienten Retroviren (einschließlich der Schritte des Einbaus von exogenem genetischen Material in ein Plasmid, Transfektion einer Verpackungszelllinie mit Plasmid, Produktion von rekombinanten Retroviren durch die Verpackungszelllinie, Sammeln von viralen Partikeln aus dem Kulturmedium und Infizieren der Zielzellen mit viralen Partikeln, sind in Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York (1990) und Murry, E.J. Ed. "Methods in Molecular Biology," Band 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991) bereitgestellt.
Ein bevorzugter Virus für bestimmte Anwendungen ist der adeno-assoziierte Virus, ein doppelsträngiger DNA-Virus. Der adeno-asoziierte Virus kann so konstruiert sein, dass er replikationsdefizient und in der Lage ist, einen großen Bereich von Zelltypen und -arten zu infizieren. Er weist weitere Vorteile dergestalt auf, dass er beispielsweise eine Stabilität gegenüber Hitze und Lipidlösungsmitteln; hohe Transduktionsfrequenzen bei Zellen unterschiedlicher Zelllinien einschließlich hämopoetischer Zellen und eine fehlende Superinfektionsinhibierung aufweist, wodurch mehrere Transduktionsserien möglich sind. Es ist berichtet worden, dass der adeno-assoziierte Virus in menschliche zelluläre DNA in einer ortsspezifischen Art und Weise integrieren kann, wodurch die Möglichkeit der Insertionsmutagenese minimiert wird und die Variabilität der Charakteristik einer Expression eines eingeführten Gens durch retrovirale Infektion minimiert wird. Zusätzlich hat man Infektionen mit adeno-assoziiertem Virus vom Wildtyp in Gewebekultur für mehr als 100 Passagen bei Abwesenheit von Selektionsdruck verfolgt, was impliziert, dass die genomische Integration des adeno-assoziierten Virus ein vergleichsweise stabiles Ereignis ist. Der adeno-assoziierte Virus kann auch extrachromosomal funktionieren.
Andere Vektoren umfassen Plasmidvektoren. Plasmidvektoren sind umfänglich in der Technik beschrieben worden und sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Siehe z. B. Sanbrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. In den letzten wenigen Jahren hat man festgestellt, dass Plasmidvektoren besonders vorteilhaft für die Abgabe von Genen an Zellen in vivo sind infolge ihrer Fähigkeit, innerhalb eines Wirtsgenoms zu replizieren und darin zu integrieren.
Diese Plasmide, die einen Promotor aufweisen, der mit der Wirtszelle kompatibel ist, können jedoch ein Peptid von einem Gen exprimieren, das innerhalb des Plasmides funktionsfähig codiert ist. Einige üblicherweise verwendete Plasmide umfassen pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 und pBlueScript. Andere Plasmide sind den Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt. Zusätzlich können Plasmide anwendungsspezifisch konstruiert sein unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligationsreaktionen, um spezifische DNA-Fragmente zu entfernen und hinzuzufügen.
Man hat kürzlich gefunden, dass gentragende Plasmide an das Immunsystem unter Verwendung von Bakterien abgegeben werden können. Modifizierte Formen von Bakterien wie beispielsweise Salmonella können mit dem Plasmid transfiziert und als Verabreichungsvehikel verwendet werden. Die bakteriellen Verabreichungsvehikel können einem Wirtslebewesen oral oder durch andere Verabreichungsmittel verabreicht werden. Die Bakterien geben das Plasmid an Immunzellen, z. B. dendritische Zellen, ab, wahrscheinlich indem sie durch die Darmbarriere hindurchtreten. Ein hohes Ausmaß an Immunschutz ist unter Verwendung dieser Verfahrensweise etabliert worden.
Die CpG-Oligonukleotide der Erfindung sind das Immunsystem umgestaltende Nukleinsäuremoleküle. Ein „das Immunsystem umgestaltendes Nukleinsäuremolekül" bezeichnet ein Nukleinsäuremolekül, das eine unmethylierte Cytosin-Guanin-Dinukleotidsequenz enthält (d. h. „CpG-DNA" oder DNA, die ein 5'-Cytosin gefolgt von einem 3'-Guanosin enthält und durch eine Phosphatbindung verknüpft ist) und die erneute Bevölkerung mit Immunzellen stimuliert. Ein das Immunsystem umgestaltendes Nukleinsäuremolekül kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Im Allgemeinen sind doppelsträngige Moleküle in vivo stabil, wohingegen einzelsträngige Moleküle eine erhöhte Immunaktivität aufweisen.
Eine „Nukleinsäure" oder „Oligonukleotid" bedeutet mehrere Nukleotide (d. h. Moleküle, die einen Zucker (z. B. Ribose oder Desoxyribose) umfassen, der mit einer Phosphatgruppe und einer austauschbaren organischen Base verbunden ist, die entweder ein substituiertes Pyrimidin (z. B. Cytosin (C), Thymin (T) oder Uracil (U)) oder ein substituiertes Purin (z. B. Adenin (A) oder Guanin (G)) ist. Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe auf Oligoribonukleotide ebenso wie Oligodesoxyribonukleotide. Die Begriffe sollen auch Polynukleoside umfassen (d. h. ein Polynukleotid ohne das Phosphat) und irgendein anderes, eine organische Base enthaltendes Polymer. Nukleinsäuremoleküle können aus bestehenden Nukleinsäuresequellen (z. B. genomisch oder cDNA) erhalten werden, sind aber bevorzugterweise synthetisch (d. h. hergestellt durch Oligonukleotidsynthese). Das gesamte CpG-Oligonukleotid kann unmethyliert sein oder Teile können unmethyliert sein, aber wenigstens das 5' CG 3' muss unmethyliert sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein CpG-Oligonukleotid, das durch die folgende Formel dargestellt ist: 5'N₁X₁CGX₂N₂3' wobei wenigstens ein Nukleotid konstitutive CpGs trennt; X₁ Adenin, Guanin oder Thymin ist; X₂ Cytosin, Adenin oder Thymin ist; N irgendein Nukleotid ist und N₁ und N₂ Nukleinsäuresequenzen sind, die aus etwa 0–25 Ns zusammengesetzt sind.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein isoliertes CpG-Oligonukleotid bereit, das durch die Formel: 5'N₁X₁X₂CGX₃X₄N₂3' dargestellt ist, wobei wenigstens ein Nukleotid konsekutive CpGs trennt; X₁X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GpT, GpA, ApA und ApT; X₃X₄ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TpT, CpT, TpC und ApT; N irgendein Nukleotid ist und N₁ und N₂ Nukleinsäuresequenzen sind, die aus etwa 0–25 Ns zusammengesetzt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten N₁ und N₂ der Nukleinsäure kein CCGG-Quadmer oder mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das CpG-Oligonukleotid die Sequenz 5'TCN₁TX₁X₂CGX₃X₄3' auf.
Bevorzugterweise umfassen die CpG-Oligonukleotide der Erfindung X₁X₂, das aus der Gruppe ausgewählt sind bestehend aus GpT, GpG, GpA und ApA und X₃X₄ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TpT, CpT und TpC. Um die Aufnahme in Zellen zu erleichtern, weisen CpG-enthaltende Oligonukleotide bevorzugterweise eine Länge von 8 bis 30 Basen auf. Es sind jedoch Nukleinsäuren mit irgendeiner Größe von mehr als 8 Nukleotiden (sogar viele kb lang) in der Lage, eine Immunumgestaltung zu induzieren, wenn ausreichende immunstimulatorische Motive vorhanden sind, da größere Nukleinsäuren innerhalb von Zellen zu Oligonukleotiden abgebaut werden. Bevorzugte synthetische Oligonukleotide umfassen kein CCGG-Quadmer oder mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer an oder nahe dem 5'- und/oder 3'-Ende. Stabilisierte Oligonukleotide, wo das Oligonukleotid eine Phosphatrückgratmodifikation enthält, wie detaillierter unten diskutiert, sind ebenfalls bevorzugt. Die Modifikation kann, beispielsweise, eine Phosphothioat- oder Phosphodithioatmodifikation sein. Bevorzugterweise tritt die Phosphatrückgratmodifikation am 5'-Ende der Nukleinsäure auf, z. B. an den ersten zwei Nukleotiden des 5'-Endes des Oligonukleotids. Weiter kann die Phosphatrückgratmodifikation am 3'-Ende der Nukleinsäure auftreten, beispielsweise an den letzten fünf Nukleotiden des 3'-Endes der Nukleinsäure. Alternativ kann das Oligonukleotid vollständig oder teilweise modifiziert sein.
Bevorzugterweise weisen die CpG-Oligonukleotide eine Länge im Bereich zwischen 8 und 100 und bevorzugtererweise zwischen 8 und 30 Nukleotiden auf. Alternativ können die CpG-Oligonukleotide in Plasmiden im großen Maßstab hergestellt werden, die nach Verabreichung an ein Lebewesen in Oligonukleotide abgebaut werden.
Die CpG-Oligonukleotide können dem Lebewesen direkt oder zusammen mit einem Nukleinsäureabgabekomplex verabreicht werden. Ein „Nukleinsäureabgabekomplex" soll ein Nukleinsäuremolekül sein, das mit einem Zielmittel (z. B. ein Molekül, das zu einem Binden mit einer höheren Affinität an eine Zielzelle führt (z. B. Oberflächen von dendritischen Zellen oder erhöhte zelluläre Aufnahme durch Zielzellen) (z. B. ionisch oder kovalent daran gebunden; oder innerhalb dessen eingekapselt) verbunden ist. Beispiele für Nukleinsäureabgabekomplexe umfassen Nukleinsäuren, die assoziiert sind mit: einem Sterol (z. B. Cholesterol), einem Lipid (z. B. einem kationischen Lipid, Virosom oder Liposom) oder einem Zielzellen-spezifischen Bindungsagens (z. B. einem Liganden, der von dem Zielzellen-spezifischen Rezeptor erkannt wird). Bevorzugte Komplexe sollten in vivo ausreichend stabil sein, um ein erhebliches Entkoppeln vor der Internalisierung durch die Zielzelle zu verhindern. Der Komplex sollte jedoch unter geeigneten Bedingungen innerhalb der Zelle spaltbar sein, so dass die Nukleinsäure in einer funktionalen Form freigesetzt wird.
„Palindromsequenzen" soll eine umgekehrte Wiederholung bedeuten (d. h. eine Sequenz, wie beispielsweise ABCDEE'D'C'B'A', bei der A und A' Basen sind, die in der Lage sind, die üblichen Watson-Crick-Basenpaare auszubilden). In vivo können derartige Sequenzen doppelsträngige Strukturen ausbilden. In einer Ausführungsform enthält das CpG-Oligonukleotid eine Palindromsequenz. Eine Palindromsequenz, die in diesem Zusammenhang verwendet wird, bezeichnet ein Palindrom, bei dem das CpG Teil des Palindroms ist und bevorzugterweise die Mitte des Palindroms ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das CpG-Oligonukleotid frei von einem Palindrom. Ein CpG-Oligonukleotid, das frei von einem Palindrom ist, ist ein solches, bei dem das CpG-Dinukleotid nicht Teil eines Palindroms ist. Ein derartiges Oligonukleotid kann ein Palindrom enthalten, in dem CpG nicht Teil des Palindroms ist.
Ein „stabilisiertes Nukleinsäuremolekül" soll ein Nukleinsäuremolekül bezeichnen, das gegenüber in vivo Abbau (z. B. vermittels einer Exo- oder Endonuklease) vergleichsweise resistent ist. Stabilisierung kann eine Funktion der Länge oder der Sekundärstruktur sein. Unmethylierte CpG-Oligonukleotide, die zehn bis hunderte von kbs lang sind, sind gegenüber in vivo Abbau vergleichsweise resistent. Bei kürzeren CpG-Oligonukleotiden kann eine Sekundärstruktur stabilisieren und ihre Wirkung erhöhen. Beispielsweise wird, wenn das 3'-Ende eines Oligonukleotids eine Selbstkomplementarität zu einer stromaufwärts gelegenen Region aufweist, so dass sie sich zurückfalten und eine Art von Stammschleifenstruktur ausbilden kann, das Oligonukleotid stabilisiert werden und dadurch eine größere Aktivität aufweisen.
Bevorzugte stabilisierte Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung weisen ein modifiziertes Rückgrat auf. Es ist gezeigt worden, dass eine Modifikation des Oligonukleotidrückgrates eine verstärkte Aktivität der CpG-Oligonukleotide bereitstellt, wenn sie in vivo verabreicht werden. CpG-Konstrukte, die wenigstens zwei Phosphothioatverbindungen am 5'-Ende des Oligodesoxyribonukleotids in mehreren Phosphothioatverbindungen am 3'-Ende enthalten, bevorzugterweise 5, liefern eine maximale Aktivität und schützen das Oligodesoxyribonukleotid vor Abbau durch intrazelluläre Exo- und Endonukleasen. Andere modifizierte Oligodesoxyribonukleotide umfassen Phosphodiester-modifiziertes Oligodesoxyribonukleotid, Kombinationen aus Phosphodiester und Phosphothioat-Oligodesoxyribonukleotid, Methylphosphonat, Methylphosphothioat, Phosphodithioat und Kombinationen davon. Eine jede von diesen Kombinationen und ihre besondere Wirkungen auf Immunzellen ist detaillierter in der gleichzeitig anhängigen, veröffentlichten PCT-Anmeldung diskutiert, die die Priorität der US-Anmeldungen 08/738,652 und 08/960,774 beansprucht, die am 30. Oktober 1996 bzw. am 30. Oktober 1997 eingereicht worden sind, deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Man glaubt, dass diese modifizierten Oligonukleotide eine höhere stimulatorische Aktivität infolge erhöhter Nukleaseresistenz, erhöhter zellulärer Aufnahme, erhöhter Proteinbindung und/oder geänderter intrazellulärer Lokalisierung aufweisen.
Sowohl Phosphothioat- als auch Phosphodiesteroligonukleotide, die CpG-Motive enthalten, sind in APCs, wie beispielsweise dendritischen Zellen, aktiv. Bezüglich der erforderlichen Konzentration, um CpG-spezifische Wirkungen zu induzieren, sind jedoch die nukleaseresistenen Phosphothioatrückgrat-CpG-Oligonukleotide wirksamer (2 μg/ml für das Phosphothioat gegenüber insgesamt 90 μg/ml für Phosphodiester).
Andere stabilisierte Oligonukleotide umfassen: nicht-ionische DNA-Analoga, wie beispielsweise Alkyl- und Arylphosphate (bei denen der geladene Phosphonatsauerstoff durch eine Alkyl- oder Arylgruppe ersetzt ist), Phosphodiester und Alkylphosphotriester, bei denen der geladene Sauerstoffteil alkyliert ist. Man hat auch gezeigt, dass Oligonukleotide, die Diol, wie beispielsweise Tetraethylenglykol oder Hexaethylenglykol, an einem oder beiden Enden enthalten, im Wesentlichen resistent sind gegenüber Nukleaseabbau.
Die Nukleinsäuresequenzen der Erfindung, die zum Induzieren einer Immunumgestaltung nützlich sind, sind jene, die oben breit beschrieben sind. Beispielhafte Sequenzen umfassen, sind aber nicht auf die in Tabelle 1 gezeigten sowie die folgenden beschränkt: TCCATGTCGCTCCTGATGCT (SEQ ID NO: 47), TCCATGTCGTTCCTGATGCT (SEQ ID NO: 48), TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 53), TCGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID NO: 89); TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 90), TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 91), GCGTGCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID NO: 92), TGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 94), TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID NO: 96) TCGTCGTCGTCGTT (SEQ ID NO: 97), TCCTGTCGTTCCTTGTCGTT (SEQ ID NO: 79), TCCTGTCGTTTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 81), TCGTCGCTGTCTGCCCTTCTT (SEQ ID NO: 82), TCGTCGCTGTTGTCGTTTCTT (SEQ ID NO: 83), TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 90), TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO: 91) TGTCGTTGTCGTTGTCGTT (SEQ ID NO: 96), TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 100), GTCG(T/C)T (SEQ ID NO: 101) und TGTCG(T/C)T (SEQ ID NO: 102).
Die Fähigkeit eines speziellen CpG-Oligonukleotids, eine Umgestaltung des Immunsystems zu induzieren, kann in verschiedenen Immunzelltests getestet werden, die den Stimulierungsindex der Oligonukleotide bewerten. Bevorzugterweise beträgt der Stimulierungsindex des CpG-Oligonukleotids hinsichtlich B-Zellproliferation wenigstens etwa 5, bevorzugterweise wenigstens etwa 10, bevorzugtererweise wenigstens etwa 15 und am bevorzugtesten wenigstens etwa 20, wie durch den Einbau von ³H-Uridin in einer murinen B-Zellkultur bestimmt, die mit 20 μM ODN für 20 Std. bei 37°C kontaktiert und mit 1 μCi ³H-Uridin gepulst; und geerntet und 4 Std. später gezählt worden ist, wie detaillierter beschrieben in der gleichzeitig anhängigen veröffentlichten PCT-Patentanmeldung, die die Priorität der US-Anmeldungen 08/738,652 und 08/960,774, eingereicht am 30. Oktober 1996 bzw. 30. Oktober 1997, beansprucht. Für die in vivo Verwendung, beispielsweise um eine Umgestaltung des Immunsystems zu induzieren, ist es wichtig, dass das CpG-Otigonukleotid in der Lage ist, wirksam die Produktion von APCs wie beispielsweise dendritischen Zellen zu induzieren. Oligonukleotide, die dieses erreichen können, sind beispielsweise jene Oligonukleotide, die in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung beschrieben sind, die die Priorität der US-Anmeldungen 08/738,652 und 08/960,774, eingereicht am 30. Oktober 1996 bzw. 30. Oktober 1997, beanspruchen.
Die CpG-Oligonukleotide werden in einem Aspekt der Erfindung verwendet, um eine erneute Bevölkerung mit Immunzellen und bevorzugterweise APCs zu induzieren. Eine APC hat ihre in der Technik übliche Bedeutung und umfasst, beispielsweise, dendritische Zellen wie beispielsweise unreife dendritische Zellen und Vorläufer- und Progenitor-Dendritenzellen ebenso wie reife dendritische Zellen, die in der Lage sind, Antigen aufzunehmen und zu exprimieren. Eine derartige Population von APC oder dendritischen Zellen wird als geprägte Population von APCs oder dendritischen Zellen bezeichnet.
CpG-Oligonukleotide können einem Lebewesen alleine vor der Verabreichung eines Antigens verabreicht werden. Die Oligonukleotide können einem Lebewesen auch zusammen mit einem Antigen verabreicht werden, um eine unmittelbare Antigen-spezifische Antwort bereitzustellen. Ein zweites Antigen, das identisch oder verschieden von dem ersten Antigen sein kann, kann dann dem Lebewesen wenigstens zwei Tage nach der Verabreichung von CpG verabreicht werden. Der Begriff zusammen mit bezeichnet die Verabreichung des CpG-Oligonukleotids geringfügig vor oder nach oder zur gleichen Zeit wie das erste Antigen. Die Begriffe geringfügig vor und geringfügig nach bezeichnen einen Zeitraum von 24 Stunden und bevorzugterweise 12 Stunden.
Wenn das CpG-Oligonukleotid zusammen mit einem ersten Antigen verabreicht wird, wird das erste Antigen die Spezifität der unmittelbaren Immunantwort bestimmen. Das CpG-Oligonukleotid wirkt als ein wirksames „Gefahrensignal" und verursacht, dass das Immunsystem heftig auf neue Antigene in diesem Bereich antwortet. Diese Wirkweise rührt in erster Linie mutmaßlich von den stimulatorischen lokalen Wirkungen von CpG-Oligonukleotiden auf dendritische Zellen und andere, „professionelle" Antigen-präsentierende Zellen her, ebenso wie von den co-stimulatorischen Wirkungen auf B-Zellen. Diese Wirkung tritt unmittelbar nach der Verabreichung des CpG-Oligonukleotids ein und ist von dem Ereignis der erneuten Bevölkerung, das nach etwa zwei Tagen beobachtet wird, verschieden.
Bei der Anwendung in der Therapie kann eine wirksame Menge eines geeigneten CpG-Oligonukleotids alleine oder als ein Nukleinsäureabgabekomplex formuliert einem Lebewesen durch irgendeine Art verabreicht werden, die erlaubt, dass das Oligonukleotid durch die geeigneten Zielzellen (z. B. dendritische Zellen) aufgenommen wird. Bevorzugte Verabreichungswege umfassen, sind aber nicht beschränkt auf oral, transdermal (z. B. vermittels eines Pflasters), Injektion (subkutan, intravenös, parenteral, intraperitoneal, intrathecal etc.), intranasal, intratracheal und mukosal. Eine Injektion kann als Bolus oder als kontinuierliche Infusion gegeben werden.
Der Begriff „wirksame Menge" eines CpG-Oligonukleotids bezeichnet die Menge, die erforderlich oder ausreichend ist, um eine erwünschte biologische Wirkung zu realisieren. Zum Beispiel könnte eine wirksame Menge eines Oligonukleotids, das wenigstens ein nicht methyliertes CpG enthält, zur Behandlung einer Immunsystemdefizienz jene Menge sein, die erforderlich ist, um eine erneute Bevölkerung des Immunsystems zu bedingen, was zur Entwicklung einer Antigen-spezifischen Immunantwort nach Exposition gegenüber dem Antigen führt. Die wirksame Menge für irgendeine spezielle Anwendung kann abhängig von solchen Faktoren wie der zu behandelnden Krankheit oder dem zu behandelnden Zustand, dem speziellen verabreichten CpG-Oligonukleotid (z. B. die Anzahl von unmethylierten CpG-Motiven oder ihren Ort in der Nukleinsäure), der Größe des Lebewesens, der Schwere der Erkrankung oder des Zustandes variieren. Ein Fachmann auf dem Gebiet kann empirisch die wirksame Menge eines speziellen Oligonukleotids bestimmen, ohne dass es eines unmäßigen Experimentierens bedürfte.
Zusätzlich zur Induktion der Umgestaltung eines Immunsystems durch Regulieren von Hämatopoese induzieren die CpG-Oligonukleotide die Hämatopoese spezifischer Immunzellen, wie beispielsweise von Plättchen und Erythroblasten. Derartige Anwendungen der CpG-Oligonukleotide sind nützlich bei der Behandlung von Thrombozytopenie bzw. Anämie.
Thrombozytopenie ist eine Störung, die mit einem Mangel an Plättchen verbunden ist. Plättchen, die eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung spielen, werden durch zytoplasmatische Fragmentierung von Vorläuferstammzellen, Megakaryozyten, die in Knochenmark gefunden werden, abgeleitet. Nach der Bildung verlassen die Plättchen das Knochenmark und wandern durch die Milz und in das Blut, wobei etwa ein Drittel der Plättchen in der Milz abgesondert wird. Die Plättchen, die zum Blut transportiert werden, zirkulieren für etwa sieben bis zehn Tage. Plättchen sind normalerweise im menschlichen Blut in einer Konzentration von 150.000–400.000 pro Mikroliter vorhanden und spielen eine entscheidende Rolle bei der Hämostase oder der Regulation des Blutens. Wenn die Konzentration an Plättchen in einem Lebewesen unterhalb normal fällt, erhöht sich das Hämonhagierisiko in dem Lebewesen.
Wenn die Konzentration an zirkulierenden Plättchen fällt, wird normalerweise ein Rückkopplungsmechanismus initiiert, der zu einer erhöhten Produktion der Anzahl, Größe und Ploidie von Megakaryozyten führt. Dieser Mechanismus wiederum bedingt die Produktion und die Freisetzung von zusätzlichen Plättchen in den Blutkreislauf. Obwohl die Rückkopplungsregulation von Plättchenkonzentrationen üblicherweise ausreichend ist, um normale Konzentrationen an Plättchen im Kreislauf zu halten, sind mehrere physiologische Zustände in der Lage, eine ausgeprägte Störung der Konzentration der Plättchen zu bedingen. Derartige Zustände führen entweder zu Thrombozytopenie oder Thrombozytose (einem Zustand, der durch erhöhte Konzentrationen an Plättchen im Blut bedingt wird).
Wenigstens drei physiologische Zustände sind bekannt, die zu Thrombozytopenie führen: eine verringerte Produktion von Plättchen im Knochenmark; eine erhöhte Rückhaltung von Plättchen in der Milz; oder eine beschleunigte Zerstörung der Plättchen. Bei üblichen Therapien, um Thrombozytopenie erfolgreich zu behandeln, muss man zuerst identifizieren, welcher Mechanismus die Verringerung der Plättchenkonzentration bedingt und dann das Lebewesen behandeln, indem ein Wirkstoff verabreicht oder ein Verfahren eingeleitet wird, das die zugrundeliegende Ursache des Plättchenverlustes beseitigt.
Ein Plättchenverlust infolge verringerter Produktion im Knochenmark kann etabliert werden durch die Untersuchung eines Knochenmarkaspirates oder einer Biopsie, die eine verringerte Anzahl von Megakaryozyten zeigt. Eine verringerte Produktion des Knochenmarks kann aus Myelosuppression als Folge einer Gammabestrahlung, therapeutischen Exposition gegenüber Strahlung oder Behandlung mit zytotoxischen Wirkstoffen resultieren. Chemikalien, die Benzol oder Anthrazen enthalten und sogar einige üblicherweise verwendete Wirkstoffe, wie beispielsweise Chloramphenicol, Thiouracil und Barbiturat-Hypnotika, können Myelosuppression verursachen, was zu Thrombozytopenie führt. Zusätzlich können seltene Knochenmarkserkrankungen, wie beispielsweise kongenitale amegakaryozytische Hypoplasie und Thrombozytopenie mit fehlendem Strahl (TAR-Syndrom) selektiv die Megakaryozytenproduktion verringern, was zu Thrombozytopenie führt.
Sie Sequestration von Plättchen in der Milz kann eine Milzvergrößerung verursachen. Sequestration in der Milz kann oft bestimmt werden durch Palpation an der Bettkante, um die Größe der Milz abzuschätzen. Eine Vergrößerung der Milz oder Splenomegalie wird typischerweise durch portale Hypertension sekundär zu Lebererkrankung, Milzinfiltration mit Tumorzellen in myeloproliferativen oder lymphoproliferativen Erkrankungen, oder Makrophagen-Speichererkrankungen, wie beispielsweise Gaucher'scher Krankheit, verursacht. Milzentfernung wird oft verwendet, um die Plättchenzahlen im Falle von exzessiver Sequestration durch die Milz zu erhöhen.
Thrombozytopenie, die aus einer beschleunigten Zerstörung von Plättchen resultiert, ist im Allgemeinen die Folge von verringerten Plättchentitern im Blut, wenn eine gestörte Produktion im Knochenmark und Sequestration in der Milz ausgeschlossen sind. Die beschleunigte Zerstörung von Plättchen wird durch entweder eine immunologische oder nicht-immunologische Erkrankung verursacht. Immunologische Thrombozytopenie kann, beispielsweise, durch Autoimmunerkrankungen wie beispielsweise idiopathische thrombozytopeniasche Purpura (ITP), virale oder bakterielle Infektionen und Wirkstoffe verusacht werden. Nicht-immunologische Thrombozytopenie wird durch Vaskulitis, hämolytisches urämisches Syndrom, thrombotische thrombozytopeniasche Purpura (TTP), verstreute intravaskuläre Koagulation (DIC) und prosthetische Herzklappen verursacht. Chronische ITP wird oft mit hohen Dosen an Steroiden, intravenösen Gammaglobulinen, Milzentfernung und sogar immunsupprimierenden Wirkstoffen behandelt. Eine jede dieser therapeutischen Modalitäten liefert nur eine vorübergehende Erleichterung und ist mit schwerwiegenden Nebenwirkungen verbunden. Zusätzlich sprechen etwa 20 Prozent der chronischen ITP-Patienten nicht auf irgendeine der bekannten Behandlungen an.
Wie hierin verwendet ist „Thrombozytopenie" eine Störung, bei der die Plättchentiter in dem betroffenen Individuum unterhalb eines normalen Plättchenbereiches für das Individuum fallen.
Thrombozytopenie umfasst Infektions-induzierte Thrombozytopenie, Behandlungs-induzierte Thrombozytopenie und physiologisch induzierte Thrombozytopenie. Infektions-induzierte Thrombozytopenie ist eine Erkrankung, die durch eine niedrige Konzentration an Plättchen im peripheren Blut gekennzeichnet ist, die durch ein infektiöses Agens wie beispielsweise ein Bakterium oder einen Virus verursacht wird. Behandlungs-induzierte Thrombozytopenie ist eine Erkrankung, die durch eine geringe Konzentration an Plättchen im peripheren Blut gekennzeichnet ist, die durch therapeutische Behandlungen wie beispielsweise Gammabestrahlung, therapeutische Exposition gegenüber Bestrahlung, zytotoxische Wirkstoffe, Chemikalien, die Benzen oder Anthrazen enthalten, und sogar einige üblicherweise verwendete Wirkstoffe wie beispielsweise Chloramphenicol, Thiouracil und Barbiturathypnotika verursacht ist. Physiologisch-induzierte Thrombozytopenie ist eine Erkrankung, die durch eine geringe Konzentration an Plättchen im peripheren Blut gekennzeichnet ist, die durch irgendeinen Mechanismus verursacht ist, der verschieden ist von infektiösen Agenzien oder therapeutischen Behandlungen, die Thrombozytopenie verursachen. Faktoren, die physiologisch-induzierte Thrombozytopenie verursachen, umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, seltene Knochenmarkserkrankungen, wie beispielsweise kongenitale amegakaryozytische Hypoplasie und Thrombozytopenie mit fehlenden Strahlen (TAR-Syndrom), eine Vergrößerung der Milz oder Splenomegalie, die durch Lebervenenhochdruck verursacht wird, infolge einer Lebererkrankung oder Makrophagenspeichererkrankungen, wie beispielsweise Gaucher'sche Krankheit, Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise idiopathische thrombozytopenische Purpura (ITP), Vaskulitis, hämolytisches urämisches Syndrom, thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP), verstreute intravaskuläre Koagulation (DIC) und prosthetische Herzklappen.
Ein Lebewesen mit Thrombozytopenie ist ein Lebewesen, das irgendeine Art von Thrombozytopenie zeigt. In einigen Ausführungsformen ist das Lebewesen, das Thrombozytopenie zeigt, ein Lebewesen mit nicht-chemotherapeutisch induzierter Thrombozytopenie. Ein Lebewesen mit nicht-chemotherapeutischer Thrombozytopenie ist ein Lebewesen mit irgendeiner Art von Thrombozytopenie, das jedoch keine Chemotherapie erfährt. In anderen Ausführungsformen ist das Lebewesen ein Lebewesen mit chemotherapeutisch induzierter Thrombozytopenie, was irgendein Lebewesen mit Thrombozytopenie umfasst, das mit Chemotherapeutika behandelt wird.
Wie hierin verwendet ist „ein Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es Thrombozytopenie entwickelt", ein Lebewesen, das eine hohe Wahrscheinlichkeit aufweist, Thrombozytopenie zu erwerben oder zu entwickeln. Beispielsweise besteht für einen Patienten mit einem malignen Tumor, dem eine Chemotherapiebehandlung verschrieben worden ist, das Risiko, eine behandlungsinduzierte Thrombozytopenie zu entwickeln, und ein Lebewesen, das ein erhöhtes Risiko aufweist, dass es einem infektiösen Agens ausgesetzt wird, hat ein Risiko, eine Infektions-induzierte Thrombozytopenie zu entwickeln.
Die CpG-Oligonukleotide können bei der Herstellung eines Medikamentes verwendet werden zum Erhöhen der Plättchenzahlen in einem Lebewesen, das eine Thrombozytopenie aufweist, oder in einem Lebewesen, für das das Risiko besteht, dass es eine Thrombozytopenie entwickelt, durch Verabreichen eines Oligonukleotids an das Lebewesen, das eine Sequenz hat, die wenigstens die folgende Formel umfasst: 5' X₁CGX₂ 3' wobei das Oligonukleotid wenigstens 8 Nukleotide umfasst, worin C und G unmethyliert sind und X₁ und X₂ Nukleotide sind, in einer wirksamen Menge, um die Plättchenzahlen in dem Lebewesen zu erhöhen oder zu einer Menge zu erhöhen, die wirksam ist, um eine Verringerung der Plättchenzahlen zu verhindern, die man unter Plättchen-verarmenden Bedingungen üblicherweise in dem Lebewesen erwarten würde, wenn das Lebewesen Plättchen-verarmenden Bedingungen ausgesetzt ist. Eine Menge, die wirksam ist, um die Plättchenzahlen in dem Lebewesen zu erhöhen, ist eine Menge, die eine Erhöhung der Menge an zirkulierenden Plättchentitern verursacht. Die tatsächlich erreichten Titer an Plättchen werden variieren abhängig von vielen Variablen wie beispielsweise dem anfänglichen Status des Immunsystems in dem Lebewesen, d. h. ob das Lebewesen eine milde bis schwere Thrombozytopenie hat (z. B. sich ergebend aus einer Autoimmunerkrankung oder Sequestration durch die Milz). Allgemein werden die Plättchentiter eines Lebewesens, das eine schwere Thrombozytopenie hat, anfänglich sehr niedrig sein. Eine Erhöhung der Plättchenkonzentrationen eines derartigen Lebewesens, sogar Erhöhungen auf eine Konzentration, die noch unterhalb einer normalen Konzentration ist, kann für das Lebewesen vorteilhaft sein.
Die Plättchentiter eines Lebewesens, für das das Risiko besteht, dass es Thrombozytopenie entwickelt, sind andererseits im Allgemeinen innerhalb eines normalen Bereiches. Die Oligonukleotide verhindern, dass sich die Plättchentiter eines derartigen Lebewesens auf eine Konzentration verringern, die normalerweise auftreten würde, wenn das Lebewesen einem Zustand ausgesetzt ist, der Thrombozytopenie verursacht. Die Verabreichung des Oligonukleotids an das Lebewesen wird somit in einem medizinisch signifikanten Umfang die Verringerung der Plättchenzahl inhibieren, die ansonsten bei Abwesenheit einer Behandlung gemäß der Erfindung erfolgen würde, wodurch die Entwicklung von Thrombozytopenie in dem Umfang verhindert wird, wie sie normalerweise auftreten würde, wenn das Lebewesen dem Zustand ausgesetzt würde, der Thrombozytopenie verursacht. Bevorzugterweise ist die wirksame Menge eine solche, die verhindert, dass Plättchentiter unterhalb einer Konzentration von 50.000 Plättchen pro Mikroliter absinken.
Eine wirksame Menge eines Oligonukleotids zum Erhöhen von Plättchenkonzentrationen kann durch irgendwelche herkömmlichen Verfahren gemessen werden, die in der Technik zum Messen von Plättchenkonzentrationen oder zum Messen von Parametern bekannt sind, die mit den Plättchenkonzentrationen korrelieren. Die Plättchenzahl wird einfach bestimmt, indem eine Blutprobe erhalten wird und die Anzahl von Plättchen pro Mikroliter Blut gezählt wird. Plättchenkonzentrationen können auch mit der Blutungszeit korrelieren.
Wie in den Beispielen unten gezeigt weist, wenn ein Lebewesen einem Thrombozytopenie auslösenden Ereignis ausgesetzt ist und diesem ein CpG-Oligonucleotid verabreicht wird, das Lebewesen eine erhöhte Plättchenzahl verglichen mit einem Lebewesen auf, das einem Thrombozytopenie auslösenden Ereignis ausgesetzt, aber nicht mit einem CpG-Oligonukleotid behandelt ist. Die Antwort ist besonders signifikant in einer kurzen Zeitspanne, nachdem das Lebewesen dem auslösenden Ereignis ausgesetzt ist. Beispielsweise wird eine signifikante Erhöhung der Plättchenzahlen nach vier Tagen beobachtet.
Anämie ist eine Bluterkrankung, die mit einer Verringerung der Konzentration an roten Blutzellen oder Erythrozyten verbunden ist. Erythrozyten sind aus der gleichen undifferenzierten Vorläuferzelle im Knochenmark wie Plättchen abgeleitet, die als pluripotente Stammzelle bezeichnet wird. Die pluripotente Stammzelle kann eine Erythroid-Burst-bildende Einheit erzeugen, die wiederum eine Erythroidkolonie-bildende Einheit ausbilden kann. Diese Zellen differenzieren schließlich zu Erythroblasten, gefolgt von Erythrozyten.
Die CpG-Oligonukleotide können verwendet werden bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Anämie durch Verabreichen eines Oligonukleotids an ein Lebewesen, das Anämie hat, wobei das Oligonukleotid eine Sequenz aufweist einschließlich wenigstens der folgenden Formel: 5' X₁CGX₂ 3' wobei das Oligonukleotid wenigstens 8 Nukleotide enthält, wobei C und G unmethyliert sind und wobei X₁ und X₂ Nukleotide sind, in einer Menge, die wirksam ist, um Erythropoese in dem Lebewesen zu induzieren.
Die Menge an Erythroblasten in einem Lebewesen kann bestimmt werden durch Messen der Anzahl von Erythroblasten im Knochenmark oder durch Messen der Menge an Erythrozyten im peripheren Blut. Der Test, der das Messen von Erythrozyten im peripheren Blut umfasst, ist angenehmer und liefert eine vernünftige Korrelation mit der Anzahl von Erythroblasten.
„Anämie", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Erkrankung, bei der ein Verlust hinsichtlich der Anzahl von roten Blutzellen und/oder der Hämoglobin-Konzentration auftritt. Ein anämisches Lebewesen erfährt üblicherweise eine Verringerung der Blutzellmasse und eine entsprechende Verringerung der Sauerstoffträgerkapazität des Blutes. Viele Arten von zugrundeliegenden Erkrankungen verursachen Anämie. Diese werden intensiv im Detail in Harrisons, Principles of Internal Medicine; Ed. Isselbacher et al; 13. Auflage; McGraw-Hill Inc, New York, 1994, beschrieben. Anämie umfasst beispielsweise, ist aber nicht darauf beschränkt, Wirkstoff-induzierte Anämie, eine immunhämolytische Erkrankung, genetische Erkrankungen wie beispielsweise Hämoglobinopathie und erbliche hämolytische Anämie; inadäquate Produktion trotz adäquater Eisenvorräte, chronische Erkrankung wie beispielsweise Nierenversagen; chronische inflammatorische Erkrankung wie beispielsweise rheumatoide Arthritis.
Wie oben diskutiert umfasst ein Lebewesen einen Menschen und nicht-menschliche Wirbeltiere. Zusätzlich zur Behandlung von Thrombozytopenie und Anämie beim Menschen sind die CpG-Oligonukleotide nützlich für die Behandlung von nicht-menschlichen Plättchenerkrankungen und anderen Blutzellerkrankungen. Beispielsweise umfasst die üblichste immun-vermittelte Erkrankung des Hundes immun-vermittelte hämolytische Anämie und immun-vermittelte Thrombozytopenie (ITP). Beide Erkrankungen werden durch Antikörper ausgelöst, die rote Blutzellen bzw. Plättchen angreifen. Die Antikörper bedingen eine Zerstörung der Zellen, was zu einer Verarmung an roten Blutzellen oder Plättchen führt. Diese Erkrankungen können bei Hunden lebensbedrohlich sein. Die Erfindung fasst somit die Behandlung von immun-vermittelten hämolytischen Erkrankungen beim Hund durch die Verabreichung von CpG-Oligonukleotiden ins Auge.
Ein Verfahren zum Bewerten von Anämie bei Hunden besteht darin, die Blutzellzahlen zu bestimmen. Ein niedriger Hämatokrit (PCV), der mit einem einfachen Hämatokrit gemessen werden kann, zeigt eine Anämie an. Der normale Hämatokrit beträgt bei Hunden 40–59, und bei Katzen 29–50. Bei schweren Fällen von Anämie zeigt das Tier im Allgemeinen blasse Membranen in seinem Mund und erscheint schwach und müde. Anämien können entweder als regenerativ oder nicht-regenerativ klassifiziert werden. Bei regenerativer Anämie ist ein Tier in der Lage zu reagieren, indem neue Retikulozyten in den Kreislauf freigesetzt werden. Bei nicht-regenerativer Anämie finden sich keine oder sehr wenige unreife RBCs in der Probe und der Körper wird weiter rote Blutzellen verlieren, es werden aber keine neuen produziert. Die Erfindung ist nützlich bei der Behandlung beider Arten von Anämien, ist aber besonders nützlich bei der Behandlung von nicht-regenerativer Anämie.
Die tatsächliche Anzahl an RBCs in einer gegebenen Menge an Blut eines Tieres kann ebenfalls gemessen werden. Die Anzahl der roten Blutzellen wird als eine tatsächliche Anzahl von Zellen gemessen, die in einem Mikroliter (μl) gefunden wird. Obwohl ein jedes Labor seinen eigenen Satz an „normalen" Bereichen für eine RBC-Zahl hat, beträgt der Durchschnitt 5,6–8,7 × 10⁶ RBCs pro Mikroliter für Hunde und 6,1–11,9 × 10⁶/μl für Katzen. Die Anzahl von roten Blutzellen kann ebenfalls durch Quantifizieren der Menge an vorhandenem Hämoglobin bewertet werden. Die normale Hämoglobinkonzentration für einen Hund beträgt 14–20 Gramm/Deziliter und 9–15,6/dl für Katzen. Die normalen Hämatologiewerte für Hunde und Katzen sind in der folgenden Tabelle angegeben.
Pferde entwickeln hämatopoetische Erkrankungen wie beispielsweise Anämie. Ein anämischer Zustand, den Pferde entwickeln, ist eine Arbeits-induzierte Erhöhung der Anzahl von gefurchten oder genadelten roten Blutzellen wie in US-Patent 4,500,530 beschrieben. Die Spikulation von roten Blutzellen führt zur Zerstörung der Zellen, was zu Sportanämie führt. Die CpG-Oligonukleotide der Erfindung können verwendet werden, um diese Erkrankung bei arbeitenden Tieren zu behandeln oder zu verhindern. Beispielsweise kann man Pferden CpG vor oder nach einem Rennen verabreichen, um Anämie zu verhindern.
Das gemäß der Erfindung nützliche CpG-Oligonukleotid ist das oben beschriebene CpG-Oligonukleotid. Die Präparate der Erfindung werden in wirksamen Mengen verabreicht. Eine wirksame Menge eines Oligonukleotids ist die Menge, die alleine oder zusammen mit weiteren Dosen erwünschterweise Plättchen- oder Erythroblastenkonzentrationen modulieren wird, beispielsweise durch Erhöhen der zirkulierenden Konzentration an Plättchen oder Erythroblasten eines Lebewesens. Man glaubt, dass Dosen von 1 Nanogramm/Kilogramm bis 100 Milligramm/Kilogramm, abhängig von der Art der Verabreichung, wirksam sein werden. Man glaubt, dass der bevorzugte Bereich zwischen 0,1 und 10,0 mg/Dosis beträgt, insbesondere bei subkutaner Gabe. Bevorzugtererweise bewegt sich die Menge im Bereich von 0,5–1,0 mg/Dosis. Bevorzugterweise wird die wirksame Menge mehr als einmal verabreicht. Bevorzugterweise wird die wirksame Menge an einem jeden Tag bis zu jedem dreißigsten Tag verabreicht und bevorzugtererweise alle fünf bis fünfzehn Tage. Das Regime kann für bis zu sechs Monate bis zu einem Jahr oder sogar über das ganze Leben eines Lebewesens aufrechterhalten bleiben. In einer Ausführungsform wird die wirksame Menge einmal wöchentlich für bis zu zweiundfünfzig Wochen verabreicht; bevorzugtererweise für bis zu zweiunddreißig Wochen und noch bevorzugtererweise für vier bis vierzehn Wochen. Die absolute Menge wird von einer Vielzahl von Faktoren abhängen (einschließlich davon, ob die Verabreichung mit anderen Verfahren zur Behandlung von Thrombozytopenie oder Anämie erfolgt, der Anzahl von Dosen und individuellen Patientenparametern einschließlich Alter, physischem Zustand, Größe und Gewicht) und kann durch Routineexperimente bestimmt werden. Es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass eine maximale Dosis verwendet wird, d. h. die höchste sichere Dosis gemäß einem validen medizinischen Urteil.
In einer weiteren Ausführungsform wird nach einer Periode der Verabreichung des Oligonukleotids die Therapie für vier bis 52 Wochen ausgesetzt und danach erneut begonnen. Sogar noch bevorzugter wird die Therapie nach acht bis vierzehn Wochen wieder aufgenommen.
Die Formulierungen der Erfindung werden in pharmazeutisch akzeptablen Lösungen verabreicht, die routinemäßig pharmazeutisch akzeptable Konzentrationen an Salz, Puffern, Konservierungsmitteln, kompatiblen Trägern, Adjuvanzien oder optional anderen therapeutischen Bestandteilen enthalten können.
Die CpG-Oligonukleotide und Antigene können per se (nackt) oder in der Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes verabreicht werden. Wenn sie in der Medizin verwendet werden, sollten die Salze pharmazeutisch akzeptabel sein, nicht-pharmazeutisch akzeptable Salze können aber auch in geeigneter Weise verwendet werden, um pharmazeutisch akzeptable Salze davon herzustellen. Derartige Salze umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, jene, die aus den folgenden Säuren hergestellt sind: Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Maleinsäure, Essigsäure, Salizylsäure, p-Toluolsulfonsäure, Weinsäure, Essigsäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Naphthalen-2-Sulfonsäure und Benzensulfonsäure. Derartige Salze können auch als Alkalimetall- oder Erdalkalisalze, wie beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Kalziumsalze der Carboxylsäuregruppe hergestellt werden.
Geeignete Pufferagenzien umfassen: Essigsäure und ein Salz (1–2% W/V); Zitronensäure und ein Salz (1–3% W/V); Borsäure und ein Salz (0,5–2,5% W/V); und Phosphorsäure und ein Salz (0,8–2% W/V). Geeignete Konservierungsstoffe umfassen Benzalkoniumchlorid (0,003–0,03% W/V); Chlorbutanol (0,3–0,9% W/V); Parabene (0,01–0,25% W/V) und Thimerosal (0,004–0,02% W/V).
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten eine wirksame Menge eines CpG-Oligonukleotids und Antigene, die optional in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten sind. Der Begriff „pharmazeutisch akzeptabler Träger" bedeutet ein oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllmittel, Verdünnungsmittel oder Verkapselungssubstanzen, die für die Verabreichung an einen Menschen oder einen anderen Vertebraten geeignet sind. Der Begriff „Träger" bezeichnet einen organischen oder anorganischen Bestandteil, natürlich oder synthetisch, mit dem der aktive Bestandteil kombiniert ist, um die Anwendung zu erleichtern. Die Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzungen sind auch in der Lage, mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung und miteinander in einer Art und Weise vermengt zu werden, so dass es keine Wechselwirkung gibt, die die erwünschte pharmazeutische Wirksamkeit erheblich stören würde.
Zusammensetzungen, die für die parenterale Verabreichung geeignet sind, umfassen bequemerweise sterile wässrige Präparate, die mit dem Blut des Empfängers isotonisch sein können. Unter den akzeptablen Vehikeln und Lösungsmitteln sind Wasser, Ringer'sche Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Zusätzlich werden herkömmlicherweise sterile, fette Öle als ein Lösungsmittel oder Suspensionsmedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein jegliches mildes fettes Öl verwendet werden, einschließlich Mono- oder Diglyzeride. Zusätzlich finden Fettsäuren, wie beispielsweise Ölsäure Verwendung bei der Herstellung von zur Injektion geeigneten Präparaten. Trägerformulierungen, die für subkutane, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse etc. Verabreichungen geeignet sind, können in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, gefunden werden.
Die CpG-Oligonukleotide oder Antigene, die bei der Erfindung nützlich sind, können als Mischungen von mehr als einem CpG-Oligonukleotid oder Antigen abgegeben werden. Eine Mischung kann aus mehreren CpG-Oligonukleotiden oder Antigenen bestehen.
Eine Anzahl von Verabreichungsrouten ist verfügbar. Die spezielle, ausgewählte Art und Weise wird, natürlich, von dem speziellen, ausgewählten CpG-Oligonukleotid oder Antigen abhängen, dem speziell zu behandelnden Zustand und der für die therapeutische Wirksamkeit erforderlichen Dosierung. Die Verfahren zur Verabreichung können, allgemein gesprochen, durchgeführt werden unter Verwendung irgendeiner Art der Verabreichung, die medizinisch akzeptabel ist, was bedeutet, einer jeglichen Art und Weise, die ein wirksames Ausmaß einer Immunantwort produziert, ohne klinisch inakzeptable nachteilige Wirkungen zu verursachen. Bevorzugte Verabreichungsmodalitäten werden unten diskutiert.
Die Zusammensetzungen können in geeigneter Weise in Einheitsdosierungsform präsentiert sein und können durch irgendeines der auf dem Gebiet der Pharmazie gut bekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren umfassen den Schritt, die Verbindungen mit einem Träger in Verbindung zu bringen, der einen oder mehrere zusätzliche Bestandteile bildet. Im Allgemeinen werden die Zusammensetzungen hergestellt, indem die Verbindungen gleichförmig und eng mit einem flüssigen Träger, einem fein verteilten festen Träger oder beiden in Kontakt gebracht werden und dann, sofern erforderlich, das Produkt geformt wird.
Andere Abgabesysteme können zeitliche Freisetzung, verzögerte oder Depotabgabesysteme umfassen. Derartige Systeme können die wiederholten Verabreichungen der Verbindungen, entweder von CpG oder Antigen, vermeiden, was den Komfort für das Lebewesen und den Arzt erhöht. Viele Arten von Freisetzungsabgabesystemen sind verfügbar und den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Sie umfassen Polymer-basierte Systeme, wie beispielsweise Poly(Lactid-Glycolid), Copolyoxalate, Polycaprolactone, Polyesteramide, Polyorthoester, Polyhydroxybuttersäure und Polyanhydride. Mikrokapseln der vorstehenden Polymere, die Wirkstoffe enthalten, sind, beispielsweise, in US-Patent 5,075,109 beschrieben. Abgabesysteme umfassen auch die folgenden Nicht-Polymersysteme: Lipide, einschließlich Sterole wie beispielsweise Cholesterol, Cholesterolester und Fettsäuren oder neutrale Fette wie Mono-, Di- und Triglyzeride; Hydrogelfreisetzungssysteme; sylastische Systeme; Peptid-basierte Systeme; Wachsbeschichtungen; komprimierte Tabletten, die herkömmliche Binder und Bindemittel verwenden; teilweise verschmolzene Implantate; und dergleichen. Spezifische Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf (a) Erosionssysteme, bei denen ein Agens der Erfindung in einer Form innerhalb einer Matrix enthalten ist, wie jene, die in den US-Patenten 4,452,775, 4,675,189 und 5,736,152 beschrieben sind, und (b) Diffusionssysteme, bei denen ein aktiver Bestandteil mit einer gesteuerten Geschwindigkeit aus einem Polymer permeiert, wie beispielsweise in den US-Patenten 3,854,480, 5,133,974 und 5,407,686 beschrieben. Zusätzlich können Pumpen-basierte Apparate-Abgabesysteme verwendet werden, von denen einige für die Implantation ausgeführt sind.
Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele veranschaulicht werden, die in keinster Weise als weiter beschränkend verstanden werden sollen.
Beispiele:
Beispiel 1: CpG-Oligonukleotide induzieren Hämatopoese
Verfahren:
Mäuse. Weibliche C57BL/6, BALB/c, CBA/J, C3H/HeJ und SCID-Mäuse wurden von Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland), Charles River Wiga (Sulzfeld, Deutschland) oder Bomholtgard Breeding and Research Centre Ltd. (Ry, Dänemark) gekauft. Alle Tiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht und im Alter von 8–12 Wochen verwendet (Körpergewicht 18 bis 21 g).
Gewebe und Zellen. Oberschenkel und Milzen wurden aseptisch entfernt und in eiskaltem Maustonizitäts-PBS gesammelt. Einzelzellsuspensionen wurden hergestellt und Klumpen unter Verwendung eines Filters mit einer Porengröße von 100 μm entfernt (Falcon, Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland). Für die Abreicherung an B- (B220-positiven) und T-Zellen (CD4- oder CD8-positiven) Zellen wurden Milzzellen mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit den entsprechenden Antikörpern beschichtet waren, was eine Negativselektion des nicht-B- und nicht-T-Teils der Milz erlaubt (Dynal, Hamburg, Deutschland). Die Wirksamkeit wurde durch FACS-Analyse überprüft, was < 5% B220- und < 3% CD3-positive Zellen nach Abreicherung ergab.
Mikrobielle Reize und synthetische Oligonukleotide. Phosphothioat-stabilisierte Oligonukleotide (ODN) wurden durch TibMolBiol (Berlin, Deutschland) synthetisiert. ODN-Sequenzen 'CG1' (= ODN 1668, enthaltend ein 'CG-Motiv', das mit fetten Buchstaben markiert ist: 5'-TCC-ATG-ACG-TTC-CTG-ATG-CT) (SEQ ID NO. 24) und Kontroll-GC-ODN ('invertiertes CG' = ODN 1720: 5'-TCC-ATG-AGC-TTC-CTG-ATG-CT) (SEQ ID NO. 106) wurden von Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549 genommen. Ein zweites CpG-ODN 'CG2' (= ODN IL12p40: 5'-AGC-TAT-GAC-GTT-CCA-AGG) (SEQ ID NO. 107) und Kontroll-ODN 'nCG' ('nicht-CG' = ODN AP1, ohne CG-Motiv: 5'-GCT-TGA-TGA-CTC-AGC-CGG-AA) (SEQ ID NO. 108) wurden kürzlich beschrieben. Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 2340–2344. LPS von E. coli wurde von Sigma (München, Deutschland) gekauft. Listeria monocytogenes kam von ATCC (American Type Culture Collection Stamm 43251) und wurde in Gehirn-Herz-Infusion (Difco, Detroit, USA) in Über-Nacht-Kulturen angezogen. Die Anzahl von Bakterien wurde durch OD₆₀₀ bestimmt und durch Ausplattieren von Aliquots von 10 μl in einer seriellen 10-fach Verdünnung auf Columbia-Blutagar-Platten getestet und die Kolonie-bildenden Einheiten nach Über-Nacht-Inkubation bei 37°C gezählt.
Behandlung von Mäusen. CpG-ODN wurden intraperitoneal (i. p.) in Wasser zur Injektion mit geringem Endotoxin mit 1–50 nMol/Maus injiziert. LPS wurde zu 10 μg/Maus verwendet. Negativkontroll-Mäuse erhielten Injektionen mit nur Wasser zur Injektion. Sublethale Bestrahlung von Mäusen (4 Gy) wurden unter Verwendung eines ⁶⁰Co-Strahlers (Buckler, Braunschweig, Deutschland) durchgeführt. Für Induktion von Ovalbumin (OVA)-spezifischen T-Zellen wurden Liposomen hergestellt, die OVA enthielten, wie beschrieben. Lipford, GB et al. (1994) Vaccine 12: 73–80. Die Inokula enthielten Liposomeneingeschlossenes OVA mit QuilA als Adjuvans und wurden in die hintere Fußballen von C57BL/6-Mäusen injiziert und 4 Tage später wurden drainierende Lymphknoten geerntet. Die Lymphknotenzellen wurden für 4 Tage mit 10 U/ml rekombinantem (r)IL-2 kultiviert und CTL-Tests wie beschrieben durchgeführt. Lipford, GB et al. (1994) Vaccine 12: 73–80. Für Listeria-Infektion wurden 2,5–5 × 10⁵ Listeria/Maus intraperitoneal in einem Volumen von 300 μl Hirn-Herz-Infusion in sublethal bestrahlte Mäuse (4 Gy) am Tag 14 nach Bestrahlung inokuliert und das Überleben für die folgenden 30 Tage aufgezeichnet. ODN-geschützte Mäuse erhielten 10 nMol CpG-ODN (CG1) innerhalb von 30 Minuten nach Bestrahlung i. p., Kontrollmäuse wurden scheinbehandelt (Injektion mit Wasser zur Injektion). Ein jedes durchgeführte Experiment umfasste 3–10 Mäuse pro Gruppe pro Zeitpunkt.
Histopathologie. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach ODN-Injektion wurden Mäuse durch CO₂-Inhalation getötet. Ausgewählte Gewebe, einschließlich Milz, Leber, Lymphknoten und Knochenmark, wurden entfernt. Zur Bestimmung von Milzvergrößerung wurden Organe von Fett und benachbarten Geweben befreit und gewogen. Die Organ/Körpergewichtsverhältnisse wurden berechnet. Gewebe, die für die mikroskopische Bewertung verarbeitet wurden, wurden in 10% neutralem gepufferten Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, Schnitte (5 μm-Schnitte) auf Trägern aufgebracht und mit Hämatoxylin und Cosin (HE) gefärbt.
Zytokine. Ein gereinigtes Präparat von murinem (mu) rekombinanten (r) Kitliganden (hisKL) wurde freundlicherweise von Dr. R. Mailhammer (GSF-Forschungszentrum, München, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Es ist in E. coli exprimiert und durch Affinitätschromatographie wie beschrieben gereinigt worden. Marines rekombinantes Interleukin 3 (IL-3) wurde durch X63Ag8-653-Myelomzellen produziert, die mit retroviralen Vektoren transfiziert waren, die das Maus-IL-3-Gen tragen. In Kurzzeit-Proliferationstests mit Zytokin-abhängigen Indikatorzelllinien ergab eine Endkonzentration von 1% (V/V) X63Ag8-653 Überstand die gleiche Wirkung wie 10 ng/ml gereinigtes mu IL-3, das von Bachem Biochemica (Heidelberg, Deutschland) erhalten wurde. Muriner rekombinanter GM-CSF war ein freundliches Geschenk von Immunex (Seattle, WA, USA). Menschlicher r IL-6 wurde von Genzyme (Boston, MA, USA) erhalten.
Quantifizierung von GM-CFU. Einzelne Milzzellproben von Mäusen wurden auf GM-CFU durch Weichagarkolonietest wie früher beschrieben analysiert. Staber, FG et al. (1982) Nature 298: 79–82. Kurz gesagt wurde die erwünschte Menge an Milzzellen (Endkonzentration üblicherweise 3 × 10⁵ bis 1 × 10⁶ pro ml) zu der Agarmediummischung hinzugegeben und 1 ml wurde dreifach zu Kulturplatten mit 35 nun Durchmesser hinzugegeben (Greiner, Nürtingen, Deutschland). Vor dem Ausplattieren der Zellen war eine sättigende Menge eines vorgetesteten Cocktails aus Myeloidzellwachstum fördernden Zytokinen, einschließlich mu r hisKL, mu r IL-3 und r GM-CSF (50 μl/Platte) zu den Platten entsprechend Endkonzentrationen von 500 ng/ml his KL, 5 ng/ml IL-3 und 25 ng/ml GM-CSF hinzugegeben worden. Nach dem Gelieren des Agarmediums bei 4°C wurden die Kulturen für 7 Tage bei 37°C in vollständig befeuchteter Atmosphäre mit 10% CO₂ in Luft inkubiert. Zellaggregate, die wenigstens 50 Zellen enthielten, wurden als Kolonien bewertet.
BFU-E Tests. Eine kommerziell erhältliche (CellSystems Biotechnologie Vertrieb GmbH, Remagen, Deutschland) Kulturmediumzusammensetzung (MethoCult^TM HCC-3340) wurde verwendet, das 0,9% Methylzellulose in alpha-modifiziertem Eagle's-Medium enthielt. 30 fötales Rinderserum 1% BSA, 10^–4 M 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 3 Einheiten/ml r menschliches (hu) Erythropoetin. Zu diesem Medium (2,7 ml/Röhrchen) wurden 0,3 ml Zellsuspension hinzugegeben, die 13,2 × 10⁵ Milzzellen/ml enthielt. Das Kulturmedium wurde weiter mit 100 μl mu r hisKL (Stammslösung: 10 μg/ml), 100 μl mu r IL-3 (Stammlösung: 1 μg/ml) und 100 μl hu r IL-6 (Stammlösung: 100 ng/ml) ergänzt und vorsichtig mit einer mit einer 1,4 × 40 m Nadel versehenen Spritze gemischt. Dies führte zu einer Endkonzentration von 3 μg/ml hisKL, 3 ng/ml mu r IL-3, 3 ng/ml hu r IL-6 und 4 × 10⁵/ml Milzzellen, die in dreifachen Aliquots aus 1 ml pro Petrischale (Greiner, Nürtingen, Deutschland) ausplattiert wurden. Das Wachstum von Erythroidkolonien (< 50 Hämoglobinenthaltende Zellen) wurde nach einer Inkubationszeit von 9 Tagen bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 10% CO₂ in Luft enthielt, bewertet.
CFU-Tests am Tag 11. Milzkolonie-bildende Einheiten (CFU-S) wurden durch den makroskopischen Milzkolonietest von Till und McCulloch bewertet. Weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 12 Wochen wurden mit 8 Gy (¹³⁷Cs) bestrahlt, einer potentiell lethalen Dosis, von der man festgestellt hatte, dass sie nicht zu einer Bildung von endogenen makroskopischen Milzkolonien führte. Innerhalb einer Zeitspanne von 1 bis 4 Stunden wurden die bestrahlten Mäuse mit Diethylether betäubt und in den retroorbitalen Plexus 2,5 × 10⁵ Milzzellen/200 μl/Maus eingespritzt, die von individuellen normalen C57BL/6-Mäusen oder von Mäusen stammten, die am Tag 6 nach i. p. Behandlung mit 10 nMol/Maus CpG-ODN (5 Mäuse pro Gruppe, die mit CpG-ODN bzw. Vehikel behandelt wurden) getötet wurden. Eine jede Spendermilzsuspension wurde in 5 bestrahlte Mäuse injiziert. Elf Tage nach der Transplantation wurden die Empfängermäuse getötet und ihre Milzen ausgeschnitten und in Fixierungsmittel nach Bouin gegeben, um die Anzahl von makroskopisch sichtbaren Milzkolonien zu bestimmen.
Flusszytometrie. Zellen (5 × 10⁵–10⁶) wurden in PBS gewaschen, das 2% FCS enthielt, und für 10 Min. bei 4°C mit anti-FcγRII/III-Antikörper von PharMingen (Hamburg, Deutschland) inkubiert, um unspezifisches Binden der folgenden Antikörperreagenzien zu blockieren. Monoklonale Antikörper (mAb), die mit 5–20 μg ml verwendet wurden, einschließlich mAb gegen B220. CD3-Mac-1 und GR-1, FITC- und PE-markierte Antikörper wurden von PharMingen (Hamburg, Deutschland) gekauft. Isotypenkontrollen umfassten gereinigtes Ratten-IgG2a, Ratten-IgG2b und Hamster-IgG (alle Pharmingen). Zwischen allen Inkubationsschritten (30 Min., 4°C) wurden die Zellen mit PBS/FCS gewaschen. FACS-Analyse wurde auf einem Coulter Epics XL-Flusszytometer (Krefeld, Deutschland) durchgeführt, was 10.000 Ereignisse aufnahm. FACS-Daten wurden unter Verwendung von WinMDI 2.6 FACS-Software analysiert.
ERGEBNISSE
CpG-ODN verursachten transiente Milzvergrößerung. Mäuse, die i. p. mit ODN gereizt wurden, zeigen eine dramatische Milzvergrößerung (1). Kinetisch betrachtet erhöht sich das Milzgewicht auf einen Peak am Tag 6 und normalisierte sich danach. Wie in Tabelle 8 Spalte (a) detailliert dargelegt, induzierte die Injektion von CPG-ODN (CG1 oder CG2) eine Milzvergrößerung in signifikanter Art und Weise, wohingegen in Kontrolltieren, denen nicht-CpG-ODN injiziert wurde, die Milzen sich nicht signifikant von scheinbehandelten Tieren unterschieden. Somit wurde murine Splenomegalie in einer CpG-Motiv-abhängigen Art und Weise induziert und ergab ein Maximum am Tag 6 nach Injektion.
1 zeigt die Kinetiken eines erhöhten Milzgewichtes, das durch CpG-ODN induziert ist. CpG-ODN (CG1) wurde einmal i. p. am Tag 0 (10 nMol/Maus) injiziert. Die Milzen wurden am Tag 0, 4, 6 und 12 entfernt, von benachbarten Geweben befreit und gewogen. Das Organgewicht wird als Milzgewicht (mg/Gesamtkörpergewicht (g) (Mittelwerte für 5 C57BL/6-Mäuse pro Gruppe ± SD) dargestellt.
Es ist gezeigt worden, dass CpG-ODN B-Zellproliferation mit einem Maximum zwischen den Tagen 1–3 nach der Reizung induziert. McIntyre, KW et al. (1993) Antisense Res Dev 3: 309–322; Branda, RF et al. (1993) Biochem Pharmacol 45: 2037–2043. Wir wandten uns deshalb der Frage zu, ob die beobachtete Milzvergrößerung durch CpG-ODN-induzierte B-Zellmitogenität bedingt war. Die Zelloberflächenphänotypisierung von Milzzellen durch FACS-Analyse ergab, dass die absolute Häufigkeit von B220-positiven Zellen (als B-Zellmarker verwendet) nur marginal erhöht war (2). Die dramatischste beobachtete Wirkung war jedoch eine transiente, aber signifikante Erhöhung am Tag 6 in dem B220-CD3-doppelnegativen Kompartiment. Histologisch wurde eine erhöhte Anzahl großer unreifer Blasten und Erythroblasten mit einem Maximum am Tag 6 nachgewiesen, was eine erhöhte hämatopoetische Aktivität nahelegt.
2 zeigt Änderungen des Phänotyps von Milzzellen nach Stimulierung mit CpG-ODN. CpG-ODN (CGl) wurde einmalig i. p. am Tag 0 (10 nMol/Maus) injiziert. Die Milzen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entfernt und FACS-gefärbt auf B220/CD3 und GR-1/Mac-1 (Doppelfärbungen). Eine Erhöhung der absoluten Zellzahl wird als Faktor über Tag 0 der Kontrollmilzzellen (Mittelwerte von 3 einzelnen C57BL/6-Mäusen) dargestellt.
Milzvergrößerung ist mit extramedullärer Hämatopoese verbunden. Im Gegensatz zu Menschen zeigen Mäuse eine basale hämatopoetische Aktivität in der Milz. Morrison, SJ et al. (1995) Annu Rev Cell Dev Biol 11: 35–71. Um zu analysieren, ob CpG-ODN-induzierte Milzvergrößerung mit erhöhter hämatopoetischer Aktivität der Milz korreliert, maßen wir die Anzahl von Granulozyten-Makrophagen-Vorläuferzellen (GM-CFU) in Milzen von CpG-ODN-behandelten Mäusen. Es gab eine 7,4-fache Erhöhung der Anzahl von GM-CFU am Tag 6, was die Kinetiken der Gesamtmilzzellzahl wiedergibt (3A, 3B). Wir analysierten auch die Induktion von GM-CFU in Knochenmark von behandelten Mäusen. Es gab eine geringfügige Erhöhung der Anzahl von GM-CFU im Knochenmark (Tag 4), die der Erhöhung in der Milz am Tag 6 voranging, als ob eine Mobilisierung von vom Knochenmark abgeleiteten Vorläuferzellen zur Milz hin stattgefunden haben kann (3C). Zusätzlich reicherten wir durch immunmagnetische Trennung die B220/CD3-doppelnegative Zellfraktion von Milzen von Tag 6 von CpG- oder nicht-CpG-behandelten Mäusen an und testeten auf GM-CFU-Bildung. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen hinsichtlich Myeloidvorläuferzellen (3D) in hohem Maße angereichert waren. Die dramatische Erhöhung der Nicht-B-, Nicht-T-Zellfraktion am Tag 6 nach CpG-ODN-Injektion wurde somit von einer erhöhten Anzahl von GM-CFU innerhalb der Milz begleitet.
3 zeigt CpG-ODN-induzierte Veränderungen der Milzzellzahl, Anzahl von Milz- und BM GM-CFU. A: Kinetiken von CpG-ODN (CG1)-induzierten Veränderungen in Milzzellzahlen (Mittelwerte von 3 C57BL/6-Mäusen pro Zeitpunkt ± SD). B: Evaluierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen in den Milzen von CpG-ODN-behandelten Mäusen. Das Diagrammm zeigt die Anzahl von GM-CFU pro Milz pro Zeitpunkt (Mittelwerte von dreifachen Milzzellkulturen von 3 Mäusen ± SEM). C: Häufigkeit von GM-CFU in vereinigten Knochenmarkszellen von 3 Mäusen pro Zeitpunkt. D: Erhöhte Anzahl von GM-CFU in B220/CD3-doppelnegativer Milzzellfraktion. Milzzellen von 4 nicht-behandelten C57BL/6-Mäusen und 3 CpG-ODN (CG1)-injizierten Mäusen (± SEM) wurden am Tag 6 nach i. p. Injektion vereinigt. Ein Teil dieser Zellen wurde bezüglich B220⁺-, CD4⁺- und CD8⁺-Zellen abgereichert und sowohl nicht-abgereicherte als auch abgereicherte (d) Milzzellen wurden auf GM-CFU durch Softagarkolonietest analysiert.
Die Induktion von Milzhämatopoese war CpG-ODN-Dosis- und sequenzabhängig (4, siehe auch 3D, Tabelle 1b und 1c). Sequenzen, denen das 'CpG-Motiv' (nCG) fehlte, scheiterten daran, extramedulläre Hämatopoese zu induzieren, und CG-Inversion (GC-ODN) beseitige fast vollständig die hämatopoetische Wirkung des ODN CG1. Einmalige Injektion von CpG-ODN verglich sich auch gut mit der durch LPS ausgelösten, dokumentierten hämatopoetischen Aktivität (4). Apte, RN et al. (1976) J Cell Physiol 71–78; Apte, RN et al. (1976) Exp Hematol 4: 10–18; Staber, FG et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4322–4325. Zusätzlich zu den Granulozytenmakrophagenvorläufern war auch die Anzahl von reinen Erythroidvorläufern nach CpG-ODN-Injektion erhöht, wie durch die Anzahl von Burst-bildenden Einheiten (BFU-E) pro Milz bestimmt (5). Die Analyse von peripherem Blut über 12 Tage ergab keine signifikanten Veränderungen ausgenommen einer transienten Leukozytose an den Tagen 2–4. Die transiente Milzvergrößerung, die in ssDNA-injizierten Mäusen beobachtet wurde, war CpG-Motiv-abhängig und mit extramedullärer Hämatopoese verbunden.
4 zeigt eine Dosistitration von CpG-ODN. 3 BALB/c-Mäusen wurde CpG-ODN (CG1) mit verschiedenen Konzentrationen (1, 10 und 50 nMol/Maus, graue Balken) oder LPS (10 μg/Maus, schwarze Balken) injiziert, Lösungsmittel (Wasser zur Injektion, weiße Balken) und GC-ODN (dunkelgraue Balken) dienten als Negativkontrollen. Erhöhte Anzahlen von Milzzellen und GM-CFU pro Milz (Mittelwerte ± SEM), induziert von CpG-ODN, wurden am Tag 6 nach Injektion gemessen.
5 zeigt eine erhöhte Anzahl von durch CpG-ODN induzierten BFU-E. Milzzellen von Mäusen, die mit ODN CG1 behandelt waren (schwarze Balken) oder Lösungsmittelkontrolle (injizierbares Wasser, weiße Balken), wurden in einem Methylzellulose-basierten Kolonietest am Tag 6 nach Injektion ausplattiert und auf Wachstum von Hämoglobin-enthaltenden Erythroidkolonien nach einer Inkubationszeit von 9 Tagen in vitro bewertet (Mittelwerte von 5 C57BL/6-Mäusen ± SEM).
Erhöhte Anzahl von Milzvorläuferzellen ist messbar durch den Test auf Milzkoloniebildende Einheiten (CFU-S). Milzkolonie-bildende Einheiten (CFU-S)-Zellen waren in der Lage, in der Milz zu verbleiben und makroskopische Knoten 11 Tage nach adoptivem Transfer in den Knochenmark-abladierten Wirt auszubilden. Wie in 6 gezeigt wurde eine signifikant erhöhte Anzahl von CFU-S in Milzzellen entdeckt, die von CpG-ODN-vorbehandelten Mäusen entnommen waren. CFU-S wies viele Merkmale primitiver hämatopoetischer Stammzellen auf, wie beispielsweise extensive Proliferationsfähigkeit, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und die Fähigkeit zur Erzeugung von Milzkolonien, die Zellen von mehreren hämatopoetischen Linien enthalten, die das Tier vor einer tödlichen Bestrahlung retten können. Spangrude, GJ et al. (1988) Science 241: 58–62. Mit Blick auf diese Daten wurden Experimente konzipiert, um die Rekonstitution von lethal bestrahlten Mäusen durch adoptiven Transfer von CFU-S, die in Milzen von CpG-ODN-behandelten Mäusen enthalten sind, zu untersuchen.
6 zeigt eine Bestimmung von Milzkolonie-bildenden Einheiten von normalen gegenüber CpG-ODN-induzierten Milzzellen (CFU-S-Test). CpG-ODN (CG1)-induzierte Milzhämatopoese führt zu einer erhöhten Anzahl von makroskopisch sichtbaren Kolonien nach Injektion in lethal bestrahlte Mäuse. Das Diagramm zeigt die Anzahlen von makroskopischen Knoten pro Milz von nicht behandelten Mäusen nach tödlicher Bestrahlung (grauer Balken) verglichen mit lethal bestrahlten Mäusen nach Injektion von 2,5 × 10⁵ normalen Milzzellen (weißer Balken) und bestrahlten Mäusen, denen man Milzzellen von ODN-vorbehandelten Mäusen (Tag 6 nach ODN CG1, schwarzer Balken) injiziert hatte (Mittelwerte von 5 unabhängigen Experimenten unter Verwendung von 3–5 C57BL/6-Mäusen pro Milz ± SEM).
CpG-ODN-vermittelte radioprotektive Wirkungen bei Myelosuppression. Hämatopoetische Vorläuferzellen werden als vergleichsweise radioresistent betrachtet. Morrison, SJ et al. (1995) Annu Rev Cell Dev Biol 11: 35–71. Da CpG-DON extramedulläre Hämatopoese vermittels Mobilisierung von CFU-S zur Milz vermitteln, analysierten wir, ob CpG-ODN radioprotektive Wirkungen bei sublethal bestrahlten Mäusen vermitteln könnten. CpG-Reize von sublethal bestrahlten Mäusen (4 Gy) führten innerhalb von Tagen zu einer 4-fachen Erhöhung, führten innerhalb von 14 Tagen zu einer 4-fachen Erhöhung von Milz-GM-CFU (7A). Als nächstes wandten wir uns der Frage zu, ob CpG-ODN-gesteuerte Hämatopoese bei sublethal bestrahlten Mäusen eine schnellere Erholung des Immunsystems erlaubt. Zwei experimentelle Systeme wurden ausgewählt: eins, die Induktion von CTL-Antworten auf Proteinantigene (Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 2340–2344), und zwei, Resistenz gegenüber dem intrazellulären Pathogen Listeria monocytogenes (Endres, R et al. (1997) Immunity 7: 419–432). Mäuse wurden mit CpG-ODN innerhalb von 30 Minuten nach sublethaler Bestrahlung (4 Gy) behandelt, für 18 Tage zu erholen erlaubt und danach subkutan (s. c.) mit Ovalbumin (OVA) enthaltenden Liposomen plus QuilA als Adjuvans immunisiert. Nach 4 Tagen wurden Zellen von Drainagelymphknoten geerntet, für zusätzliche vier Tage kultiviert und auf OVA-spezifische CTL-Aktivität getestet. Wie detailliert in 7B dargelegt, zeigten Lymphozyten von CpG-ODN-behandelten bestrahlten Mäusen eine verstärkte CTL-Antwort verglichen mit nicht-behandelten bestrahlten Mäusen. Im Prinzip ähnliche Ergebnisse wurden bei einem Infektionsmodell unter Verwendung von L. monocytogenes-Infektion am Tag 14 erhalten. Insgesamt zeigen die in 7 angegebenen Daten eine Korrelation zwischen CpG-ODN-induzierter extramedullärer Hämatopoese und der Fähigkeit, zytotoxische T-Zellantworten oder Schutzimmunantworten gegenüber bakteriellen Infektionen aufzubauen. CpG-ODN kompensieren strahleninduzierten Schäden des lympho-hämatopoetischen Systems, indem die Regeneration von hämatopoetischen Vorläuferzellen beschleunigt wird.
7 zeigt, dass eine erhöhte Anzahl von CM-CFU und eine verstärkte CTL-Funktion nach ODN-Injektion mit einer erhöhten Resistenz gegenüber lethaler Listeriose bei sublethal bestrahlten Mäusen korreliert. A: Erhöhte Anzahl von GM-CFU pro 1 Million Zellen (linker Satz) und GM-CFU pro Milz (rechter Satz) am Tag 14 nach sublethaler Bestrahlung (4 Gy) und Injektion von CpG-ODN (CG1). Die Anzahl von Milz-GM-CFU von 3 Mäusen pro Gruppe (± SEM) mit (+) und ohne (–) ODN-Injektion wurde mit normalen Mäusen ohne Bestrahlung verglichen. B: OVA-spezifische primäre CTL-Antwort unter Verwendung von ODN CG1 als Adjuvans. CTL-Funktion von ODN-behandelten (Vierecke) und scheinbehandelten (Kreise) Mäusen, die am Tag 18 nach sublethaler Bestrahlung immunisiert wurden, wurden verglichen. Die Zielzellen waren EL4-Zellen (gestrichelte Linien) oder EL4-Zellen, die mit dem SIINFEKL-Peptid (durchgezogene Linien) gepulst waren und die spezifische Lyse wurde durch ⁵¹Cr-Freisetzung (Mittelwerte ± SD von drei Mäusen pro Gruppe) gemessen. C: Erhöhte Resistenz gegenüber Listerieninfektion bei sublethal bestrahlten Mäusen, die mit CG1 (geschlossene Kreise) behandelt waren, verglichen mit Bestrahlung alleine (offene Dreiecke). Die Mäuse wurden mit 5 × 10⁵ Listerien am Tag 14 nach Bestrahlung infiziert und das Überleben wurde für 30 Tage aufgezeichnet.
In diesem Beispiel wird die durch CpG-ODN induzierte extramedulläre Hämatopoese beschrieben und charakterisiert. Mäuse, die mit CpG-ODN gereizt wurden, entwickeln eine transiente Milzvergrößerung, die ihr Maximum am Tag 6 erreicht, was verbunden ist mit erhöhten Milzfrequenzen von B220/CD3-doppelnegativen Zellen. Innerhalb dieser Untergruppe wurden hämatopoetische Vorläuferzellen durch GM-CFU und BFU in vitro-Tests nachgewiesen. CpG-ODN verkürzt die Zeitspanne von strahleninduzierter Myelosuppression, indem die hämatopoetische Regeneration vermittels verstärkten CFU-S-Exports in die Milz verbessert wird. Als eine Folge davon entwickelte sich nach sublethaler Bestrahlung eine Erholung zytotoxischer T-Zellantworten und Resistenz gegenüber bakterieller Infektion zeitlich früher.
Bakterielle DNA und CpG-ODN aktivieren polyklonal B-Zellen und stimulieren APC, wie beispielsweise dendritische Zellen und Makrophagen. Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549; Sparwasser, T et al. (1997) Nature 386: 336–337; Sparwasser, T et al. (1997) Eur J Immunol 27: 1671–1679; Sparwasser, T et al. (1998) Eur J Immunol 28: 2045–2054; Stacey, KJ et al. (1996) J Immunol 157: 2116–2122; Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 3420–3426. CpG-ODN aktiviert DC und Makrophagen in vitro, um große Mengen an hämatopoetisch aktiven Zytokinen zu sekretieren, einschließlich IL-6, GM-CSF, IL-1, IL-2 und TNF-α. Sparwasser, T et al. (1997) Nature 386: 336–337; Sparwasser, T et al. (1997) Eur J Immunol 27: 1671–1679; Sparwasser, T et al. (1998) Eur J Immunol 28: 2045–2054; Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 3420–3426; Halpern, MD et al. (1996) Cell Immunol 167: 72–78; Chace, JH et al. (1997) Clin Immunol Immunopathol 84: 185–193; Roman, M et al. (1997) Nat Med 3: 849–854 31–33. Mit CpG-ODN gereizte Mäuse wiesen ebenfalls vorübergehend hohe Serumkonzentrationen dieser Zytokine auf. Sparwasser, T et al. (1997) Nature 386: 336–337; Lipford, GB et al. (1997) Eur J Immunol 27: 3420–3426. Bis heute ist unklar, was davon die extramedulläre Hämatopoese auslöst. Es ist möglich, dass CpG-ODN Stromazellen des Knochemarks adressieren, um hämatopoetisch aktive Zytokine freizusetzen.
Anfänglich nahmen wir an, dass die beobachtete Milzvergrößerung CpG-ODN-induzierte B-Zellmitogenität widerspiegeln würde, da die meisten Literaturstellen CpG-induzierte Milzvergrößerung B-Zellen zuschreiben. Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549; McIntyre, KW et al. (1993) Antisense Res Dev 3: 309–322; Branda, RF et al. (1993) Biochem Pharmacol 45: 2037–2043. Es war jedoch nur zwischen den Tagen 1–4 nach CpG-ODN-Reizung, dass proliferierende B220⁺-Zellen zu der relativen Erhöhung der Milzzellularität beitragen (2). Die Schlussfolgerung einer Nicht-B-, Nicht-T-Zellbeteiligung bei Milzvergrößerung wurde auch dadurch gestützt, dass eine Milzvergrößerung auch in SCID-Mäusen, denen B- und T-Zellen fehlen, beobachtet wurde. Am Tag 6 nach CpG-ODN-Reizung herrschten B220^–/CD3^–-Milzzellen vor (2) und die Histologie ergab reichlich große unreife Blastenzellen, was ein Anzeichen für extramedulläre Hämatopoese ist. In GM-CFU in vitro-Tests konnte die erhöhte hämatopoetische Aktivität zu der B220^–/CD3^–-Population definiert werden. In vitro-Kolonietests (4, 5, 6, Tabelle 8) zeigten eine starke Erhöhung der Zahlen von Granulozyten, Makrophagen und frühen Erythrozyten-Vorläuferzellen in der Milz. Im peripheren Blut der Mäuse dagegen waren die Veränderungen insoweit diskret, als dass Leukozytose und eine geringfügige Verringerung der Zahlen der Erythrozyten und Plättchen beobachtet wurde. Im Unterschied zu Menschen trägt die Milz bei Mäusen einen großen Teil zu der hämatopoetischen Aktivität bei.
Es ist bekannt, dass bakterielle Reize (LPS oder vollständiges Freud'sches Adjuvans, das Hitze-abgetötete Mykobakterien enthält) eine erhöhte Milzhämatopoese auslösen kann (Apte, RN et al. (1976) J Cell Physiol 71–78; Staber, FG et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 4322–4325; McNeill, TA (1970) Immunology 18: 61–72), möglicherweise vermittels von Makrophagen abgeleiteten hämatopoetischen Wachstumsfaktoren, die die Erzeugung und Mobilisierung von Blutzellen stimulieren, die erforderlich sind, um bakterielle Infektionen zu bekämpfen (Übersicht bei Morrison, SJ et al. (1995) Annu Rev Cell Dev Biol 11: 35–71). Hier zeigen wir, dass CpG-ODN, von denen bekannt ist, dass sie die immunstimulatorischen Wirkungen von bakterieller DNA nachahmen (Krieg, AM et al. (1995) Nature 374: 546–549), die Fähigkeit aufwiesen, Hämatopoese zu potenzieren. Weiterhin wurde gezeigt, dass CpG-ODN hämatopoetische Regeneration von Myelosuppression verstärkten, die durch sublethale Bestrahlung bedingt wurde. Beispielsweise zeigten bestrahlte und CpG-ODN-behandelte Mäuse erhöhte Zahlen von Milz-GM-CFU, erhöhte Antigen-spezifische CTL-Antworten und eine erhöhte Resistenz gegenüber Infektion mit Listeria monocytogenes (7). Die erhöhte Anzahl von Milz-GM-CFU zwei Wochen nach Injektion von CpG-ODN korrelierte mit einer erhöhten Immunsystemerholung bei myelosupprimierten Mäusen. Hämatopoetische Depression und nachfolgende Empfindlichkeit gegenüber potenziell lethalen opportunistischen Infektionen sind gut dokumentierte Phänomene nach Chemotherapie, Radiotherapie oder unfallmäßiger Strahlenexposition. Eine kostengünstige Linderung von Myelosuppression hätte einen hohen klinischen Wert. Unsere Daten zeigen an, dass CpG-ODN strahleninduzierte Myelosuppression durch Erhöhung der Hämatopoese lindern können, was zu einer beschleunigten Rekonstitution des Immunsystems führt.
Tabelle 8
Tabelle 8 zeigt ein erhöhtes Milzgewicht und die Anzahl von GM-CFU nach Injektion von CpG-ODN. a) Durch CpG-ODN erhöhtes Milzgewicht. CpG-ODN (CGl, CG2) induzierte eine erhebliche Milzvergrößerung bei Mäusen (Mittelwerte von 3 C57BL/6-Mäusen pro Gruppe ± SD, t-Test: p ≤ 0,05), wohingegen nicht-CpG-ODN (nCG) dies nicht machte. Umkehrung des CG-Dinukleotids (GC-ODN) beseitige fast vollständig die Wirkung von GC1. Ein Vergleich mit ODN-behandelten (10 nMol/Maus) und scheinbehandelten Mäusen (Injektion vermittels Wasser zur Injektion). b) Anzahl von GM-CFU pro Milz (Mittelwert von Dreifachwerten von 3 C57BL/6-Mäusen pro Gruppe ± SEM). c) Anzahl von GM-CFU pro 1 Million Zellen (Mittelwerte von Dreifachwerten von 3 Mäusen pro Gruppe ± SEM).
Beispiel 2: CpG-ODN-induzierte Blut- und Zellresistenz gegenüber 5-Fluoruracil (5-FU).
Zwei Gruppen von BALB/c-Mäusen, jeweils 9 Mäuse im Alter von 10 Wochen, erhielten intraperitoneal (i. p.) 150 mg/kg 5-FU in 200 μl steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS) am Tag 0 injiziert. Eine dritte Gruppe von BALB/c-Mäusen, 9 Mäuse im Alter von 10 Wochen, erhielten i. p. 200 μl sterile PBS alleine am Tag 0 injiziert. Vierundzwanzig Stunden später verabreichte man einer Gruppe von S-FU-behandelten Mäusen 3 mg/kg CpG-ODN (CG1) in 200 μl steriler PBS; die andere 5-FU-behandelte Gruppe und die PBS-behandelte Gruppe erhielten nur PBS. Dies führte zu drei experimentellen Gruppen: Scheinbehandlung (Mock), 5-FU-Behandlung (5-FU) und kombinierte Behandlung mit 5-FU plus CpG-ODN (5-FU + ODN). An den Tagen 4, 7 und 10 nach 5-FU-Behandlung wurden 3 Mäuse einer jeden Gruppe getötet und Tests durchgeführt, um Immunresistenz gegenüber Chemotherapiebehandlung zu bewerten.

1. Milzgewicht und Milzzellzahl. Die Milzen wurden an den Tagen 0, 4 und 10 entnommen, von Fett und benachbartem Gewebe befreit und dann gewogen. Dann wurden sie zerkleinert und für das Zellzählen dispergiert. Rote Blutzellen wurden durch NH₄Cl-Lyse vor der Zellzahlbestimmung entfernt. Wie in 8 gezeigt wogen Milzen von Tieren, die mit 5-FU plus CpG-ODN behandelt wurden, am Tag 4 und 10 mehr, gefolgt von 5-FU-Behandlung, als Milzen von Tieren, die nur 5-FU erhielten, und die Milzzellzahlen neigten dazu, höher zu sein und enger an Normalwerten zu sein bei Tieren, die eine kombinierte Behandlung erhielten als bei jenen, die nur 5-FU alleine erhielten.
2. Differenzielle Milzlymphozytenzahlen nach 5-FU mit und ohne CpG-ODN. Milzlymphozyten (5 × 10⁵ bis 1 × 10⁶) wurden in PBS gewaschen, die 2% fötales Kälberserum enthielt, und für 10 Minuten bei 4°C mit anti-FcγRII/III-Antikörpern inkubiert, um nicht-spezifisches Binden von FITC-markiertem anti-B220 oder anti-CD3 zu blockieren. Die Zellen wurden zwischen 30-minütigen Inkubationsschritten mit 1:1 PBS/FCS gewaschen. FACS-Analyse wurde durchgeführt unter Verwendung eines Coulter Epics XL-Flusszytometers, wobei 10.000 Ereignisse pro Datenpunkt aufgenommen wurden. Wie in 9 gezeigt waren T-Zellen am Tag 4 bei Tieren verringert, die nur mit 5-FU behandelt waren, und erholten sich am Tag 7 auf Normalwert. Tiere, die 5-FU plus CpG-ODN erhielten, wiesen normale Milz-T-Zellzahlen am Tag 4 und einen Trend zu höheren Werten als Kontrollmilz-T-Zellzahlen am Tag 7 und 10 auf. 10 zeigt, dass sich Milz-B-Zellzahlen tatsächlich sowohl in 5-FU- als auch 5-FU + ODN-Gruppen verglichen mit Kontrolle am Tag 4 verringerten. Tiere, die jedoch 5-FU plus CpG-ODN erhielten, erholten sich auf normale Milz-B-Zellzahlen am Tag 7, wohingegen Tiere, die nur 5-FU alleine erhielten, weiterhin eine geringere Milz-B-Zellzahl als die Kontrolle bis zum Tag 10 aufwiesen.
3. Zahl der peripheren weißen Blutzellen (WBC). Eine differenzielle Blutzellanalyse wurde an den Tagen 0, 4, 7 und 10 mittels eines automatischen Hämozytometers durchgeführt, das auf murine Zellen programmiert war. Wie in 11 gezeigt war die WBC am Tag 4 nach Behandlung mit 5-FU erheblich niedriger bei allen Tieren, die 5-FU erhielten, als bei scheinbehandelten Tieren. Tiere, die jedoch 5-FU plus CpG-ODN erhielten, hatten eine höhere WBC an einem jeden Tag, einschließlich Tag 4, als die Tiere, die mit 5-FU alleine behandelt wurden.
4. Zahl der peripheren roten Blutzellen (RBC). Mäuse, die mit 5-FU plus CpG-ODN behandelt wurden, hielten zu allen Zeitpunkten eine normale Zellzahl der roten Blutkörperchen aufrecht, wohingegen Tiere, die nur mit 5-FU behandelt wurden, eine erhebliche Verringerung der RBC bis zum Tag 10 verglichen mit der Kontrolle aufwiesen. Siehe 12.
5. Plättchenzahl. Die Plättchenzahlverringerung bei Tieren, die 5-FU plus ODN erhielten, war nicht so schwerwiegend wie bei Tieren, die mit 5-FU alleine behandelt wurden (siehe 13). Am Tag 7 und fortsetzend bis zum Tag 10 kehrte die Plättchenzahl zu oberhalb der Kontrolle bei sowohl der 5-FU- als auch der 5-FU + ODN-Gruppe zurück.
6. Funktionale Resistenz gegenüber 5-FU bei zytotoxischen T-Lymphozyten. Zwei Gruppen von C57BL/6-Mäusen mit einem Alter von 10 Wochen wurden intravenös 150 mg/kg 5-FU in 200 μl steriler PBS am Tag 0 injiziert; eine Kontrollgruppe mit ähnlichen Mäusen erhielt 200 μl sterile PBS alleine. Vierundzwanzig Stunden später verabreichte man Mäusen in einer der S-FU-behandelten Gruppe 3 mg/kg CpG-ODN (CGl) subkutan in 100 μl steriler PBS; die andere 5-FU-behandelte Gruppe und die PBS-behandelte Gruppe erhielten nur PBS. Dies führte zu drei experimentellen Gruppen: Scheinbehandlung (Kontrolle), 5-FU-Behandlung (5-FU) und kombinierte Behandlung mit 5-FU plus CpG-ODN (5-FU + ODN). Am Tag 10 nach FU-Behandlung verabreichte man Mäusen von einer jeden Gruppe ein Inokulum aus Ovalbumin (OVA), um die Entwicklung von zytolytischen T-Zellen zu induzieren. Am Tag 14, 4 Tage nach OVA-Verabreichung, wurden die Mäuse getötet und ein ⁵⁷Cr-Freisetzungs-CTL-Test gemäß Standardprotokoll durchgeführt. Yamamoto, S et al. (1992) Microbiol Immunol 36: 983–997. Wie in 14 gezeigt war die CTL-Antwort von Mäusen, die nur mit 5-FU behandelt waren, verglichen mit Kontrollen über den gesamten Bereich des getesteten Verhältnisses aus Effektor zu Zielzelle ausgeprägt verringert. Mäuse, die 5-FU plus CpG-ODN erhielten, zeigten im Vergleich eine viel stärkere CTL-Antwort als in der mit 5-FU alleine behandelten Gruppe. Eine Wirkung der Verabreichung von CpG-ODN zusammen mit 5-FU bestand somit darin, die Fähigkeit aufrechtzuerhalten, eine wirksame CTL-Antwort auf ein Niveau aufzubauen, das näher zu demjenigen ist, das bei unbehandelten Tieren beobachtet wurde, und ausgeprägt höher ist als das bei nur mit 5-FU behandelten Tieren.

Beispiel 3: Hämatopoetische Umgestaltung

1. Dendritische Zellen. Zwei Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden 3 mg/kg CpG-ODN (CG1) in 200 μl steriler PBS oder PBS alleine am Tag 0 verabreicht. Sieben Tage später wurden die Mäuse getötet und die Milzen wie in Beispiel 2 für die Analyse geerntet. Die solchermaßen erhaltenen Milzen wurden einer zusätzlichen Behandlung mit Kollagenase unterzogen, was höhere Gesamtzahlen an Milzzellen pro Milz als sie in Beispiel 2 erhalten wurden, ergab. Die Milzzellen wurden dann gezählt und aliquotiert; ein Aliquot von einer jeden Behandlungsgruppe wurde mit anti-CD11c und anti-CD11b für die FACS-Analyse gefärbt, um die in der Milz vorhandenen Gesamt-DC-Zahl zu quantifizieren. Wie in der linken Tafel von 15 gezeigt, war die Anzahl von CD11c/CD11b-doppelpositiven Milzzellen in den Milzen von mit CpG-ODN behandelten Tieren gegenüber der Kontrolle 7-fach erhöht. Aliquots von restlichen Teilen der Milzzellen, die am Tag 7 geerntet worden waren, wurden in Kultur für weitere 7 Tage in Anwesenheit von Wachstumsfaktoren vermehrt, von denen bekannt ist, dass sie das Wachstum von DC bevorzugen. Sparwasser, T et al. (1998) Eur J Immunol 28: 2045–2054. Lebensfähige Zellen in Kultur wurden dann gezählt und durch FACS wie oben analysiert, um die Population aus CD11c/CD11b-doppelpositiven Zellen (DCs) zu bestimmen, die in Kultur verblieben. Wie in der rechten Tafel von 15 gezeigt waren Milzzellen, die von Mäusen gewonnen waren, die mit CpG-ODN behandelt waren, und unter diesen Bedingungen vermehrt wurden, in hohem Maße angereichert an DCs, wohingegen Milzzellen, die von scheininjizierten Mäusen gewonnen waren, fast nicht auswuchsen (51 × 10⁶/Milz gegenüber 0,6 × 10⁶/Milz).
2. Wirkung von hämatopoetischem Umgestalten auf die Induktion von Antikörper gegen Antigen. Vier Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden 3 mg/kg CpG-ODN (CG1) in 200 μl steriler PBS injiziert; einer fünften Gruppe wurde PBS alleine injiziert. Die injizierten Mäuse wurden mit OVA gemäß einem festen Schema immunisiert, das 21 Tage dauerte, beginnend zu verschiedenen Zeitpunkten relativ zur Injektion von CpG-ODN oder PBS. Das Immunisierungsprotokoll bestand aus der Injektion von 100 μg OVA, gefolgt von einer Auffrischungsinjektion von OVA 14 Tage später. Nach zusätzlichen 7 Tagen der Ruhe wurden Serumproben gesammelt und durch IgG-Isotypen-spezifischen ELISA unter Verwendung von OVA-beschichteten Platten und Serienverdünnungen analysiert, um den mittleren Endpunkttiter für einen jeden getesteten Isotyp zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt, wo Tiere, die CpG-ODN erhielten und ihre erste Exposition gegenüber OVA am gleichen Tag erhielten, als Tag 0 gezeigt sind, und Tiere, die CpG-ODN 35 Tage vor ihrer ersten Exposition gegenüber OVA erhielten, mit Tag –35 bezeichnet sind. Tiere, die OVA-Immunisierung, aber keine DNA erhielten, dienten als Kontrollen. Die IgG2a-Antwort in der Tag 0-Gruppe ist um mehr als 3 Logs über normal erhöht, wobei eine verbleibende erhöhte IgG2a-Antwort gegenüber dem Antigen solange wie 35 Tage nach CpG-ODN-Verabreichung festgestellt wurde. Potenzierte und persistente Antworten waren auch für IgG1 und IgG2b evident.
3. Wirkung von hämatopoetischer Umgestaltung auf die Induktion von CTL-Antwort auf Antigen. Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden 3 mg/kg CpG-ODN (CG1) in 200 μl steriler PBS oder PBS alleine injiziert. Den injizierten Mäuse wurden dann nochmals 100 μg OVA zu verschiedenen Zeitpunkten nach CpG-ODN-Verabreichung injiziert. OVA-spezifische CTL-Tests wurden durchgeführt unter Verwendung von OVA-transfizierten EL4-Zellen als Ziele gemäß einem früher beschriebenen Verfahren. Sparwasser, T et al. (1998) Eur J Immunol 28: 2045–2054. Wie in 17 gezeigt, zeigte die CTL-Antwort ein biphasisches Muster: Nach einer anfänglichen 50%igen spezifischen Lyse, wenn Antigen und CpG-ODN gleichzeitig verabreicht wurden, gibt es ein ausgeprägtes Dämpfen des Ansprechverhaltens, wenn Antigen zuerst 24–48 Stunden nach CpG-ODN angetroffen wird, gefolgt von einem maximalen Ansprechverhalten (65 Prozent spezifische Lyse), das auftritt, wenn das erste Antigen 7 Tage nach CpG-ODN angetroffen wird. Das CTL-Ansprechverhalten verringert sich danach graduell, wenn sich der Abstand zwischen DNA-Injektion und initialer OVA-Exposition über 7 Tage hinaus verlängert, obwohl das Ansprechverhalten oberhalb der Kontrolle für ein Intervall von wenigstens 35 Tagen bleibt. Diese Ergebnisse sind auch in 18 dargestellt, die auch zeigt, dass es im Wesentlichen keine CTL-Antwort bei Tieren gibt, die keine CpG-DNA erhielten.

Tabelle 1 – Sequenzen
Die vorstehende schriftliche Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um den Fachmann in die Lage zu versetzen, die Erfindung auszuführen. Die vorliegende Erfindung ist in ihrem Umfang nicht durch die bereitgestellten Beispiele beschränkt, da die Beispiele lediglich eine einzelne Veranschaulichung eines Aspekts der Erfindung sein sollen und andere funktional äquivalente Ausführungsformen im Umfang der Erfindung enthalten sind.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung von CpG-Oligonucleotid mit mindestens 8 Nucleotiden für die Herstellung eines Medikaments für das Auslösen einer antigenspezifischen Immunantwort, wobei das CpG-Oligonucleotid einer Versuchsperson verabreicht werden soll und die Versuchsperson nach mindestens 3 Tagen auf die Verabreichung des CpG-Oligonucleotids der Versuchsperson hin einem Antigen gegenüber ausgesetzt werden soll unter Erzeugung einer antigenspezifischen Immunantwort.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen mindestens 4, 7, 15 oder 30 Tage nachdem das CpG-Oligonucleotid der Versuchsperson verabreicht werden soll verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen eine Nucleinsäure ist, die ein Antigen kodiert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Zellen, Zellextrakten, Proteinen, Polysacchariden, Polysaccharidkonjugaten, Lipiden, Glycolipiden, Kohlenhydrat, Virusextrakten, Viren, Bakterien, Pilzen, Parasiten und Allergenen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein Allergen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen aus einem ansteckenden Organismus deriviert ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ansteckenden Bakterien, ansteckenden Viren und ansteckenden Pilzen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Versuchsperson dem Antigen aktiv ausgesetzt werden soll.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Antigen in Verbindung mit einem kolloidalen Dispersionssystem abgegeben werden soll.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das kolloidale Dispersionssystem aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus makromolekularen Komplexen, Nanokapseln, Mikrosphären, Perlen und Systemen auf Lipidbasis.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das System auf Lipidbasis aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Öl-in-Wasser-Emulsionen, Mizellen, gemischten Mizellen und Liposomen.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei ein Adjuvans in Verbindung mit dem Antigen verabreicht werden soll.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Versuchsperson dem Antigen gegenüber passiv ausgesetzt werden soll.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Versuchsperson dem Risiko ausgesetzt wird, Krebs zu entwickeln.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Versuchsperson dem Risiko ausgesetzt wird, eine allergische Reaktion zu entwickeln.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Versuchsperson ein Asthmatiker ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das CpG-Oligonucleotid 8 bis 100 Nucleotide lang ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das CpG-Oligonucleotid eine Phosphatrückgratkettenmodifikation enthält, bei der es sich um eine Phosphorthioat- oder Phosphordithioatmodifikation handelt und wobei die Phosphatmodifikation bevorzugt am 5'-Ende des CpG-Oligonucleotids oder am 3'-Ende des CpG-Oligonucleotids stattfindet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das CpG-Oligonucleotid eine Sequenz aufweist, die mindestens folgende Formel enthält: 5'X₁X₂CGX₃X₄3' wobei X₁, X₂ Nucleotide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GpT, GpG, GpA und ApA; und X₃, X₄ Nucleotide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus TpT, CpT und TpC; oder wobei das CpG-Oligonucleotid eine Sequenz aufweist, die mindesten folgende Formel enthält: 5'TCNTX₁X₂CGX₃X₄3' wobei X₁, X₂, X₃ und X₄ Nucleotide sind, N eine Nucleinsäuresequenz ist bestehend aus ca. 0–25 Nucleotiden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das CpG-Oligonucleotid eine Sequenz aufweist, die mindestens folgende Formel enthält: 5'TCNTX₁X₂CGX₃X₄3' wobei X₁X₂ Nucleotide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: GpT, GpG, GpA und ApA und X₃, X₄ Nucleotide sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: TpT, CpT und TpC und wobei N eine Nucleinsäuresequenz ist bestehend aus ca. 0–25 Nucleotiden.