DE69925624T2

DE69925624T2 - Nukleinsäure-markierungsverbindungen

Info

Publication number: DE69925624T2
Application number: DE69925624T
Authority: DE
Inventors: H. Glenn MCGALL; D. Anthony BARONE
Original assignee: Affymetrix Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-20
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2019-07-21
Also published as: US6596856B2; US7179905B2; US20040002595A1; US20010018514A1; EP1124838B1; AU5203599A; ATE296833T1; US20010044531A1; US20050164268A1; US6844433B2; JP2002521495A; EP1589025A2; WO2000006771A3; US7491818B2; US20030232979A1; EP1589025A3; CA2339016A1; WO2000006771A2; WO2000006771A9; EP1124838A2

Description

Diese Erfindung wurde mit Regierungsunterstützung nach Vertrag 70NANB5H1031 durchgeführt, der durch das Advanced Technology Program des National Institute of Standards and Technology (NIST) gewährt wurde. Die Regierung besitzt gewisse Rechte an dieser Erfindung.
GEBIET DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Nucleinsäure markierende Verbindungen. Insbesondere, liefert die Erfindung heterocyclische Derivate, die einen nachweisbaren Anteil enthalten. Die Erfindung liefert auch Verfahren zur Herstellung solcher heterocyclischen Derivate. Sie liefert weiters Methoden zur Anlagerung der heterocyclischen Derivate an eine Nucleinsäure.
STAND DER TECHNIK
Die Genexpression in erkrankten und gesunden Personen ist oft unterschiedlich charakterisierbar. Die Fähigkeit, die Genexpression in solchen Fällen zu überwachen, stellt Medizinern ein leistungsfähiges Diagnosewerkzeug bereit. Diese Form von Diagnose ist besonders wichtig im Bereich der Onkologie, wo man glaubt, dass die Überexpression eines Oncogens oder die Unterexpression eines Tumorsuppressorgens zur Tumorentstehung führt. Siehe Mikkelson et al., J. Cell. Biochem. 1991, 46, 3-8.
Man kann die Genexpression indirekt überwachen, zum Beispiel durch Messen einer Nucleinsäure (z.B. mRNA), die das Transkriptionsprodukt eines anvisierten Gens ist. Die Nucleinsäure wird chemisch oder biochemisch mit einem nachweisbaren Anteil markiert und wird dann mit einer lokal vorhandenen Nucleinsäuresonde bekannter Sequenz hybridisieren gelassen. Der Nachweis einer markierten Nucleinsäure an der Sondenposition zeigt an, dass das anvisierte Gen exprimiert wurde. Siehe Internationale Anmeldungsveröffentlichungen Nr. WO 97/27317, WO 92/10588 und WO 97/10365.
Die Markierung der Nucleinsäure wird normalerweise durch kovalente Bindung einer nachweisbaren Gruppe (Markierung) entweder an eine innere oder eine endständige Position vorgenommen. Wissenschafter haben über eine Reihe von nachweisbaren Nucleotidanaloga berichtet, die enzymatisch in Oligo- oder Polynucleotide eingebaut wurden. Langer et al., zum Beispiel offenbarten Analoga von dUTP und UTP, die einen kovalent gebundenen Biotinanteil enthalten. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78, 6633-6637. Die unten gezeigten Analoga besitzen einen Allylamin-Verbindungsarm, der an der C-5-Position des Pyrimidinrings befestigt ist. Die dUTP- und UTP-Analoga, bei denen RH oder OH ist, wurden in ein Polynucleotid integriert.
Petrie et al. offenbarten ein dATP-Analog, 3-[5-[(N-Biotinyl-6-aminocaproyl}amino]pentyl]-1-(2-deoxy-β-D-erythropentofuranosyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amin-5'triphosphat. Bioconjugate Chem. 1991, 2, 441-446. Das unten gezeigte Analog wird an der 3'-Position mit einem Verbindungsarm modifiziert, der an einen Biotinanteil angelagert ist. Petrie et al. berichteten, dass die Verbindung, bei der R Biotin ist, in DNA durch Nick-Translation integriert wurde.
Prober et al. offenbarten einen Satz von vier Didesoxynucleotiden, von denen jedes einen Succinylfluoresceinfarbstoff enthielt. Science 1987, 238, 336-341. Die Didesoxynucleotide, von denen eines unten gezeigt ist, wurden enzymatisch durch eine matrizengerichtete Verlängerung eines Starters in ein Oligonucleotid integriert. Die Verbindungen sorgten für eine DNA-Sequenzierungsmethode auf der Basis der Gelmigration.
Herrlein et al. offenbarten modifizierte Nucleosidtriphosphatasen der vier DNA-Basen. Helv. Chim. Acta 1994, 77, 586-596. Die Verbindungen, von denen eine unten gezeigt wird, enthalten eine 3'-Aminogruppe, die radioaktive oder fluoreszierende Anteile enthält. Herrlein et al. beschrieben weiters die Verwendung der Nucleosidanaloga als DNA-Kettenterminatoren.
Cech et al. offenbarten 3'-aminofunktionalisierte Nucleosidtriphosphate. Collect. Czech Chem. Commun.1996, 61, S297-S300. Die Verbindungen, von denen eine unten gezeigt wird, enthalten ein Fluorescein, das an der 3'-Position über einen Aminolinker befestigt ist. Cech et al. schlugen die Verwendung der beschriebenen funktionalisierten Nucleoside als Terminatoren für die DNA-Sequenzierung vor.
Pochet et al. (Nucleosides and Nucleotides (1997), 16 (7-9), 1749-1752) offenbaren eine Verbindung dY^Pr, und Le Bec et al. (Nucleosides and Nucleotides (1997), 16 (7-9), 1301-1302) offenbaren Verbindungen dY^Me, dY^MeTP, dY^Pr und dY^PTTP. Diese Verbindungen sind als Verbindungen zur Markierung von Nucleinsäuren ungeeignet.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Entwicklung einer neuartigen Nucleinsäure markierenden Verbindung, die wirksam in eine Nucleinsäure integriert ist, um eine leicht nachweisbare Zusammensetzung zu liefern, wäre von großem Nutzen für die genetischen Analyseverfahren. Sie würde zum Beispiel bei der Überwachung der Genexpression und dem Nachweis und der Untersuchung von Mutationen und Polymorphismus helfen. Eine solche Verbindung sollte sich für die enzymatische Integration in eine Nucleinsäure eignen. Weiters sollte die Nucleinsäure, an die die Markierungsverbindung angelagert werden soll, ihre Fähigkeit behalten, sich an die Sonde anzulagern, wie zum Beispiel eine komplementäre Nucleinsäure.
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäure markierende Verbindungen bereit, die enzymatisch in eine Nucleinsäure integriert werden können. Die Nucleinsäuren, an die die Verbindungen angelagert werden, behalten ihre Fähigkeit, sich an eine komplementäre Nucleinsäuresequenz zu binden.
Die Nucleinsäure markierenden Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen folgende Struktur:
wobei A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung der Nucleinsäure markierenden Verbindung an eine Nucleinsäure ermöglicht; X O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander H, Alkyl oder Aryl sind; Y H, N₃, F, OR₉, SR₉ oder NHR₉ ist, wobei R₉ H, Alkyl oder Aryl ist; Z H, N₃, F oder OR₁₀ ist, wobei R₁₀H, Alkyl oder Aryl ist; L Amidoalkyl ist; Q eine nachweisbare chemische Gruppe ist, und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl von 0 bis ungefähr 3 ist.
In einer anderen Ausführungsform ist A H oder H₄O₉P₃-; ist X O; ist Y H oder OR₉, wobei R₉H oder Aryl ist; ist Z H, N₃, F oder OR₁₀, wobei R₁₀H, Alkyl oder Aryl ist; ist L -C(O)NH(CH₂)_nNH-, wobei n eine ganze Zahl von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist; ist Q Biotin oder ein Carboxyfluorescein, und ist M -CO(CH₂)₅NH-, wobei m 1 oder 0 ist.
In einer anderen Ausführungsform ist Y H oder OH; ist Z H oder OH; ist L -C(O)NH(CH₂)₄NH-; ist Q Biotin oder ein Carboxyfluorescein, und ist M -CO(CH₂)₅NH-, wobei m 1 oder 0 ist.
In einer anderen Ausführungsform ist Y H oder OH; ist Z H oder OH; ist L -C(O)NH(CH₂)₄NH-; ist Q 5-Carboxyfluorescein, und ist m 0.
In einer anderen Ausführungsform ist A H oder H₄O₉P₃-; ist Y H; ist Z H; ist L -C(O)NH(CH₂)₄NH-; ist Q Biotin, und ist M -COC(CH₂)₅NH-, wobei m 1 ist. Vorzugsweise ist A H₄O₉P₃-; ist Y H; ist Z H; ist L -C(O)NH(CH₂)₄NH-; ist Q Biotin, und ist M -COC(CH₂)₅NH-, wobei m 1 ist.
In einer anderen Ausführungsform ist A H₄O₉P₃-; ist Y H; ist Z H; ist L -C(O)NH(CH₂)₄NH-; ist Q 5-Carboxyfluorescein, und ist m 0. Vorzugsweise ist A H₄O₉P₃-; ist Y H; ist Z H; ist L -C(O)NH(CH₂)₄NH-; ist Q 5-Carboxyfluorescein, und ist m 0.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Nucleinsäurederivat bereit, das durch Kopplung einer Nucleinsäuren markierenden Verbindung der Erfindung mit einer Nucleinsäure hergestellt wird.
In einer Ausführungsform besitzt die Nucleinsäure markierende Verbindung, die bei der Kopplung verwendet wird, die folgende Struktur:
wobei A H oder H₄O₉P₃- ist; X O ist; Y H oder OR₉ ist, wobei R₉H, Alkyl oder Aryl ist; Z H, N₃, F oder OR₁₀ ist, wobei R₁₀H, Alkyl oder Aryl ist; L -C(O)NH(CH₂)_nNH- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist; Q Biotin oder ein Carboxyfluorescein ist und M -C(O)NH(CH₂)₅NH- ist, wobei m 1 oder 0 ist. Vorzugsweise enthält das Hybridisierungsprodukt aus diesem Nucleinsäurederivat das an eine komplementäre Sonde gebundene Nucleinsäurederivat. In einer Ausführungsform wird die Sonde an einem Glaschip befestigt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Methode zur Synthetisierung einer markierten Nucleinsäure bereit, die das Anlagern einer Nucleinsäure markierenden Verbindung der Erfindung an eine Nucleinsäure umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiters eine Methode zum Nachweis einer Nucleinsäure bereit, die das Inkubieren eines Nucleinsäurederivats der Erfindung mit einer Sonde umfasst. In einer Ausführungsform besitzt die Nucleinsäure markierende Verbindung, die an die Nucleinsäure angelagert wird, die folgende Struktur:
wobei A H oder H₄O₉P₃- ist; X O ist; Y H oder OR₉ ist, wobei R₉H, Alkyl oder Aryl ist; Z H, N₃, F oder OR₁₀ ist, wobei R₁₀H, Alkyl oder Aryl ist; L -C(O)NH(CH₂)_nNH- ist, wobei n eine ganze Zahl ist, die im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 liegt; Q Biotin oder ein Carboxyfluorescein ist, und M -CO(CH₂)₅NH- ist; wobei m 1 oder 0 ist.
Das Verfahren des Nucleinsäurenachweises unter Verwendung des Nucleinsäurederivats ist mit der Inkubation des Derivats mit einer Sonde verbunden.
In einer Ausführungsform wird die Sonde an einem Glaschip befestigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen nicht einschränkenden Satz von Matrizenanteilen.
2 zeigt einen nicht einschränkenden Satz von heterocyclischen Gruppen: 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 1,3-Diazol (Imidazol), 1,2,4-Triazin-3-on, 1,2,4-Triazin-3,5-dion und 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on.
3 zeigt einen Syntheseweg zu fluorescein- und biotinmarkierten 1-(2,3-Didesoxy-D-glyceropentofuranosyl)imidazol-4-carboxamid-Nucleotiden.
4 zeigt einen Syntheseweg zu C3-markierten 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin-β-D-Ribofuranosidtriphosphaten.
5 zeigt einen Syntheseweg fluorescein- und biotinmarkierten N6-Didesoxypyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Nucleotiden.
6 zeigt einen Syntheseweg zu N4-markierten 1,2,4-Triazin-3-on-β-D-Ribofuranosidtriphosphaten.
7 zeigt einen Syntheseweg zu fluorescein- und biotinmarkierten C5-markierten 1,2,4-Triazin-3,5-dion-Ribosidtriphosphaten.
8 zeigt einen Syntheseweg zu fluorescein- und biotinmarkierten C5-markierten 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on-Ribosidtriphosphaten.
9 zeigt grafische Vergleiche von beobachteten Hybridisierungsfluoreszentintensitäten unter Verwendung von Fluorescein-ddITP und Fluorescein-ddATP.
10 zeigt einen grafischen Vergleich von beobachteten Hybridisierungsfluoreszentintensitäten unter Verwendung von Biotin-(M₂)-ddAPTP (wobei M = Aminocaproyl) und Biotin-N6-ddATP.
11 zeigt grafische Vergleiche von beobachteten Hybridisierungsfluoreszentintensitäten unter Verwendung von Biotin-M-ddITP (wobei M = Aminocaproyl) und Biotin-N6-ddATP.
12 zeigt einen grafischen Vergleich der Genauigkeit der Gesamtneusequenzierung (Basenzuordnung) unter Verwendung von Fluorescein-ddITP- und Fluorescein-N6-ddATPmarkierten Targets.
13 zeigt einen grafischen Vergleich der Genauigkeit der Gesamtneusequenzierung unter Verwendung von Biotin-M-ddITP (wobei M = Aminocaproyl) und Biotin-N6-ddATP.
14 zeigt einen grafischen Vergleich der Genauigkeit der Gesamtneusequenzierung unter Verwendung von Biotin-(M₂)-ddAPPTP (wobei M = Aminocaproyl) und Biotin-N6-ddATP.
OPTIMALE METHODE ZUR REALISIERUNG DER ERFINDUNG
Definitionen
„Alkyl" bezieht sich auf eine gerade Kette, verzweigte oder zyklische chemische Gruppe, die nur Kohlenstoff und Wasserstoff enthält. Alkylgruppen sind, ohne Beschränkung darauf, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Cyclopentyl und 2-Methylbutyl. Alkylgruppen sind unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Substituenten (z.B. Halogen, Alkoxy, Amino) substituiert.
„Aryl" bezieht sich auf eine einwertige, ungesättigte aromatische carbocyclische Gruppe. Arylgruppen sind, ohne Beschränkung darauf, Phenyl, Naphthyl, Anthryl und Biphenyl. Aryl-gruppen sind unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Substituenten (z.B. Halogen, Alkoxy, Amino) substituiert.
„Amidoalkyl" bezieht sich auf eine chemische Gruppe, die die Struktur -C(O)NR₃R₄- besitzt, wobei R₃ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist und R₄ Alkyl oder Aryl ist. Vorzugsweise ist die Amidoalkylgruppe von der Struktur -C(O)NH(CH₂)_nR₅-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist und R₅O, NR₆ oder C(O) ist und wobei R₆ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist. Es ist noch mehr bevorzugt, wenn die Amidoalkylgruppe von der Struktur – C(O)NH(CH₂)_nN(H)- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 6 ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Amidoalkylgruppe von der Struktur -C(O)NH(CH₂)₄N(H)- ist.
„Alkynylalkyl" bezieht sich auf eine chemische Gruppe, die die Struktur -C≡C-R₄- besitzt, wobei R₄ Alkyl oder Aryl ist. Vorzugsweise ist die Alkynylalkylgruppe von der Struktur -C≡C-(CH₂)_nR₅-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10 ist und R₅ O, NR₆ oder C(O) ist, wobei R₆ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist. Es ist noch mehr bevorzugt, wenn die Alkynylalkylgruppe von der Struktur -C≡C-(CH₂)_nN(H)- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 4 ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Alkynylalkylgruppe von der Struktur -C≡C-CH₂N(H)- ist.
„Alkenylalkyl" bezieht sich auf eine chemische Gruppe, die die Struktur -CH=CH-R₄- besitzt, wobei R₄ Alkyl oder Aryl ist. Vorzugsweise ist die Alkenylalkylgruppe von der Struktur -CH=CH-(CH₂)_nR₅-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10 ist und R₅O, NR₆ oder C(O) ist, wobei R₆ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist. Es ist noch mehr bevorzugt, wenn die Alkenylalkylgruppe von der Struktur -CH=CH-(CH₂)_nN(H)- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 4 ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Alkenylalkylgruppe von der Struktur -CH=CH-CH₂N(H)- ist.
„Funktionalisiertes Alkyl" bezieht sich auf eine chemische Gruppe von der Struktur -(CH₂)_nR₇-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 10 und R₇O, S, NH oder C(O) ist. Vorzugsweise ist die funktionalisierte Alkylgruppe von der Struktur -(CH₂)_nC(O)-, wo bei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 4 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die funktionalisierte Alkylgruppe von der Struktur -CH₂C(O)- ist.
„Alkoxy" bezieht sich auf eine chemische Gruppe von der Struktur -O(CH₂)_nR₈-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 10 ist und R₈O, S, NH oder C(O) ist. Vorzugsweise ist die Alkoxygruppe von der Struktur -O(CH₂)_nC(O)-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 4 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Alkoxygruppe von der Struktur – OCH₂CH₂C(O)- ist.
„Thio" bezieht sich auf eine chemische Gruppe von der Struktur -S(CH₂)_nR₈-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 10 ist und R₈O, S, NH oder C(O) ist. Vorzugsweise ist die Thiogruppe von der Struktur -S(CH₂)_nC(O)-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 4 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Thiogruppe von der Struktur -SCH₂CH₂C(O)- ist.
„Aminoalkyl" bezieht sich auf eine chemische Gruppe mit einer an einer Alkylgruppe angelagerten Aminogruppe. Vorzugsweise besitzt ein Aminoalkyl die Struktur -NH(CH₂)_nNH-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn sie die Struktur -NH(CH₂)_nNH- besitzt, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 4 ist. Es ist am meisten bevorzugt, wenn die Aminoalkylgruppe die Struktur -NH(CH₂)₄NH- besitzt.
„Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Polymer, das 2 oder mehr Nucleotide aufweist und ein-, doppel- und dreisträngige Polymere einschließt. „Nucleotid" bezieht sich sowohl auf die natürlich vorkommenden als auch die nicht natürlich vorkommenden Verbindungen und weist eine heterocyclische Base, einen Zucker und eine Verbindungsgruppe, vorzugsweise einen Phosphatester auf. Zum Beispiel können strukturelle Gruppen zur Ribosyl- oder Desoxyribosyleinheit des Nucleotids hinzugefügt werden, wie zum Beispiel eine Methyl- oder Allylgruppe an der 2'-O-Position oder eine Fluorgruppe, die die 2'-O-Gruppe ersetzt. Die Verbindungsgruppe, wie zum Beispiel ein Phosphodiester, der Nucleinsäure kann substituiert oder modifiziert werden, zum Beispiel mit Methylphosphonaten oder O-Methylphosphaten. Basen und Zucker können ebenfalls modifiziert werden, wie im Fachgebiet bekannt ist. „Nucleinsäure" umfasst für die Zwecke dieser Offenlegung auch „Peptidnucleinsäuren", bei denen native oder modifizierte Nucleinsäurebasen einer Polyamidhauptkette angelagert sind.
„Sonde" bezieht sich auf eine Nucleinsäure, die zum Auffinden einer Zielnucleinsäure durch Hybridisierung verwendet werden kann. Vorzugsweise ist die Sonde komplementär zur Zielnucleinsäure über die gesamte Länge der Sonde, die Hybridisierung kann aber auch bei Vorliegen von einer oder mehreren fehlenden Übereinstimmungen bei Basen zwischen Sonde und Target auftreten.
Nucleinsäure-Markierungsverbindungen
Die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen folgende allgemeine Struktur: A-O-CH₂-T-H_c-L-(M)_m-Q wobei A Wasserstoff oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung einer Nucleinsäure-Markierungsverbindung an eine Nucleinsäure ermöglicht; T ein Matrizenanteil ist; H_c eine heterocyclische Gruppe ist; L ein Linkeranteil ist; Q ein nachweisbarer Anteil ist und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 5 ist.
Die Gruppe A ist entweder Wasserstoff oder eine funktionelle Gruppe, die die Anlagerung einer Nucleinsäure-Markierungsverbindung an eine Nucleinsäure ermöglicht. Nicht einschränkende Beispiele solcher Gruppen enthalten folgendes: Monophosphat; Diphosphat; Triphosphat (H₄O₉P); Phosphoramidit ((R₂N)(R'O)P), wobei R lineares, verzweigtes oder zyklisches Alkyl ist und R' eine Schutzgruppe ist, wie zum Beispiel 2-Cyanoethyl, und H-Phosphonat (HP(O)O-HNR₃), wobei R lineares, verzweigtes oder zyklisches Alkyl ist.
Der Matrizenanteil (T) ist kovalent an eine Methylengruppe (CH₂) an einer Stelle und eine heterocyclische Gruppe (H_c) an einer anderen Position angelagert. Ein nicht einschränkender Satz von Matrizenanteilen der Erfindung wird in 1 gezeigt, zusammen mit Vergleichsbeispielen, die nicht als Ausführungsformen der Erfindung gezeigt werden, sondern als Beispiele, die für das Verständnis der Erfindung nützlich sind, wobei die Substituenten folgendermaßen festgelegt sind: X ist O, S, NR₁ oder CHR₂; Y ist H, N₃, F, OR₁, SR₁ oder NHR₁; Z ist H, N₃, F oder OR₁; W ist O, S oder CH₂; D ist O oder S; und G ist O, NH oder CH₂. Die Substituenten R₁ und R₂ sind unabhängig voneinander und sind H, Alkyl oder Aryl.
Die heterocyclische Gruppe (H_c) ist ein zyklischer Teil, der sowohl Kohlenstoff als auch ein Heteroatom enthält. Ein nicht einschränkendes Beispiel einer heterocyclischen Gruppe, die von der vorliegenden Erfindung als Möglichkeit erwogen wird, 1,3-Diazol (Imidazol), wird zu sammen mit Vergleichsbeispielen, die nicht als Ausführungsformen der Erfindung gezeigt werden, sondern als Beispiele, die für das Verständnis der Erfindung nützlich sind, 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, 1,2,4-Triazin-3-on, 1,2,4-Triazin-3,5-dion und 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, in 2 gezeigt.
Der Verbindungsanteil (L) der Nucleinsäure-Markierungsverbindung ist kovalent an den Heterozyklus (H_c) an einer endständigen Position gebunden. Er ist an den nachweisbaren Anteil (Q) an einer anderen endständigen Position gebunden, entweder direkt oder über eine Verbindungsgruppe (M). Er besitzt eine Struktur, die sterisch und elektronisch für die Integration in eine Nucleinsäure geeignet ist. Nicht einschränkende Beispiele von Verbindungsanteilen sind u.a. Amidoalkylgruppen in der vorliegenden Erfindung und Alkynylalkylgruppen, Alkenylalkylgruppen, funktionalisierte Alkylgruppen, Alkoxygruppen, Thiogruppen und Aminoalkylgruppen, in Vergleichsbeispielen, die nicht als Ausführungsformen der Erfindung gezeigt werden, sondern als Beispiele, die für das Verständnis der Erfindung nützlich sind.
Amidoalkylgruppen sind von der Struktur -C(O)NR₃R₄-, wobei R₃ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist und R₄ Alkyl oder Aryl ist. Die Amidoalkylgruppe ist vorzugsweise von der Struktur -C(O)NH(CH₂)_nR₅-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist und R₅O, NR₆ oder C(O) ist und wobei R₆ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Amidoalkylgruppe von der Struktur -C(O)NH(CH₂)_nN(H)- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 6 ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Amidoalkylgruppe von der Struktur -C(O)NH(CH₂)₄N(H)- ist.
Alkynylalkylgruppen sind von der Struktur -C≡C-R₄-, wobei R₄ Alkyl oder Aryl ist. Vorzugsweise ist die Alkynylalkylgruppe von der Struktur -C≡C-(CH₂)_nR₅-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10 ist und R₅O, NR₆ oder C(O) ist, wobei R₆ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Alkynylalkylgruppe von der Struktur -C≡C-(CH₂)_nN(H)- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 4 ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Alkynylalkylgruppe von der Struktur -C≡C-CH₂N(H)- ist.
Alkenylalkylgruppen sind von der Struktur -CH=CH-R₄-, wobei R₄ Alkyl oder Aryl ist. Vorzugsweise ist die Alkenylalkylgruppe von der Struktur -CH=CH-(CH₂)_nR₅-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 10 ist und R_SO, NR₆ oder C(O) ist, wobei R₆ Wasserstoff Alkyl oder Aryl ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Alkenylalkylgruppe von der Struktur -CH=CH-(CH₂)_nN- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 4 ist. Am meisten bevorzugt ist es, wenn die Alkenylalkylgruppe von der Struktur -CH=CH-CH₂N- ist.
Funktionalisierte Alkylgruppen sind von der Struktur -(CH₂)_nR₇-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 10 und R₇O, S, NH oder C(O) ist. Vorzugsweise ist die funktionalisierte Alkylgruppe von der Struktur -(CH₂)_nC(O)-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 4 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die funktionalisierte Alkylgruppe von der Struktur -CH₂C(O)- ist.
Alkoxygruppen besitzen die Struktur -O(CH₂)_nR_8–, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 10 und R₈O, S, NH oder C(O) ist. Vorzugsweise besitzt die Alkoxygruppe die Struktur -O(CH₂)_nC(O)-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 4 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Alkoxygruppe die Struktur -OCH₂CH₂C(O)- besitzt.
Thiogruppen besitzen die Struktur -S(CH₂)_nR₈-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 10 und R₈O, S, NH oder C(O) ist. Vorzugsweise besitzt die Thiogruppe die Struktur -S(CH₂)_nC(O)-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von 2 bis ungefähr 4 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn die Thiogruppe die Struktur -SCH₂CH₂C(O)- besitzt.
Aminoalkylgruppen enthalten eine Aminogruppe, die an eine Alkylgruppe angelagert ist. Vorzugsweise besitzen die Aminoalkylgruppen die Struktur -NH(CH₂)_nNH-, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn sie die Struktur -NH(CH₂)_nNH- besitzen, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 4 ist. Es ist am meisten bevorzugt, wenn die Aminoalkylgruppe von der Struktur -NH(CH₂)₄NH- ist.
Der nachweisbare Anteil (Q ist eine nachweisbare chemische Gruppe, die ein Signal liefert. Das Signal kann mit geeigneten Mitteln, einschließlich spektroskopischen, photochemischen, biochemischen, immunchemischen, elektrischen, optischen oder chemischen Mitteln, nachgewiesen werden. In bestimmten Fällen ist das Signal mit 2 oder mehr Mitteln nachweisbar.
Der nachweisbare Anteil liefert das Signal entweder direkt oder indirekt. Ein direktes Signal wird erzeugt, wenn die Markierungsgruppe spontan ein Signal emittiert oder ein Signal bei Einwirkung eines geeigneten Stimulus erzeugt. Radioaktive Markierungen, wie zum Beispiel ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²P, und magnetische Teilchen, wie zum Beispiel Dynabeads^TM, sind nicht einschränkende Beispiele von Gruppen, die direkt und spontan ein Signal abgeben. Markierungsgruppen, die ein Signal direkt bei Anwesenheit einer Anregung abgeben, umfassen die nicht ein schränkenden Beispiele: kolloidales Gold (Durchmesser 40-80 nm), das grünes Licht mit großer Wirksamkeit streut; fluoreszierende Markierungen, wie zum Beispiel Fluorescein, Texas-Rot, Rhodamin und grünes fluoreszierendes Protein (Molecular Probes, Eugene, Oregon), die Licht absorbieren und nachfolgend emittieren; chemolumineszente oder biolumineszente Markierungen, wie zum Beispiel Luminol, Lophin, Akridinsalze und Luziferine, die als Folge einer chemischen oder biologischen Reaktion elektronisch angeregt werden und anschließend Licht abgeben; Spin-Markierungen, wie zum Beispiel freie Vanadium-, Kupfer-, Eisern-, Mangan- oder Nitroxidradikale, die durch Elektronenspinresonanz (ESR)-Spektroskopie nachgewiesen werden; Farbstoffe, wie zum Beispiel Chinolinfarbstoffe, Triarylmethanfarbstoffe und Akridinfarbstoffe, die spezifische Lichtwellenlängen absorbieren, sowie gefärbte Glas- oder Kunststoffperlen (z.B. aus Polystyrol, Polypropylen, Latex, usw.). Siehe US-Patente Nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241.
Ein nachweisbarer Anteil liefert ein indirektes Signal, wenn er in Wechselwirkung mit einer zweiten Verbindung tritt, die ein Signal spontan abgibt oder bei der Einwirkung eines geeigneten Stimulus ein Signal erzeugt. Biotin zum Beispiel erzeugt ein Signal durch Bildung eines Konjugats mit Streptavidin, das dann nachgewiesen wird. Siehe Hybridization With Nuclei Acid Probes. In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology; Tijssen, P., Hrsg.; Elsevier: New York, 1993; Bd. 24. Ein Enzym, wie zum Beispiel Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase, die an einen Antikörper in einem Markierungsantikörper-Antikörper, so wie in einem ELISA-Assay angelagert ist, erzeugt ebenfalls ein indirektes Signal.
Ein bevorzugter nachweisbarer Anteil ist eine Fluoreszenzgruppe. Fluoreszenzgruppen erzeugen normalerweise ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis, woraus eine erhöhte Auflösung und Empfindlichkeit im Nachweisverfahren resultiert. Die Fluoreszenzgruppe absorbiert vorzugsweise Licht mit einer Wellenlänge von mehr als ungefähr 300 nm, stärker bevorzugt oberhalb ungefähr 350 nm und am meisten bevorzugt oberhalb ungefähr 400 nm. Die Wellenlänge des von der Floureszenzgruppe emitierten Lichtes liegt vorzugsweise oberhalb etwas 310 nm, mehr bevorzugt oberhalb etwa 360 nm und am meisten bevorzugt oberhalb etwa 410 nm.
Der fluoreszierende nachweisbare Anteil wird aus einer Reihe von Strukturklassen ausgewählt, zu denen die folgenden nicht einschränkenden Beispiele gehören: 1- und 2-Aminonaphthalin, p,p'-Diaminostilbene, Pyrene, quaternäre Phenanthridinsalze, 9-Aminoakridine, p,p'-Diaminobenzophenonimine, Anthracene, Oxacarbocyanin, Macrocyanin, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bisbenzoxazol, bis-p-Oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, bis-3-Aminopyridinsalze, Hellebrigenin, Tetrazyklin, Sterophenol, Benzimidazoylphenylalanin, 2-oxo-3-Chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, Phenoxazin, Salicylat, Strophantidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin, Xanthenfarbstoffe (z.B. Fluorescein und Rhodaminfarbstoffe); Cyaninfarbstoffe; 4,4-Difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-Farbstoffe und fluoreszierende Proteine (z.B. grünes fluoreszierendes Protein, Phycobiliprotein).
Eine Reihe von fluoreszierenden Verbindungen sind zur Aufnahme in die vorliegende Erfindung geeignet. Nicht einschränkende Beispiele für solche Verbindungen sind die folgenden: Dansylchlorid; Fluoresceine, wie zum Beispiel 3,6-Dihydroxy-9-phenylxanthhydrol; Rhodaminisothiocyanat; N-Phenyl-1-amino-8-sulfonatnaphthalin; N-Phenyl-2-amino-6-sulfonatnaphthalin; 4-Acetamido-4-isothiocyanatstilben-2,2'-disulfonsäure; Pyren-3-sulfonsäure; 2-Toluidinnaphthalin-6-sulfonat; N-Phenyl, N-Methyl-2-aminonaphthalin-6-sulfonat; Ethidiumbromid; Stebrin; Auromin-0,2-(9'-anthroyl)palmitat; Dansylphosphatidylethanolamin; N,N'-Dioctadecyloxacarbocyanin; N,N'-Dihexyloxacarbocyanin; Merocyanin; 4-(3'-Pyrenyl)butyrat; d-3-Aminodesoxyequilenin; 12-(9'-Anthroyl)stearat; 2-Methylanthracen; 9-Vinylanthracen; 2,2'(Vinylen-p-phenylen)bisbenzoxazol; p-bis-[2-(4-Methyl-5-phenyloxazolyl]benzen; 6-Dimethylamino-1,2-benzophenzin; Retinol; bis-(3'-Aminopyridin)-1,10-decandiyldüodid; Sulfonaphthylhydrazon von Hellibrienin; Chlortetracyclin; N-(7-Dimethylamino-4-methyl-2-oxo-3-chromenyl)maleimid; N-[p-(2-benzimidazolyl)phenyl]maleimid; N-(4-flouroanthyl)maleimid; bis(Homovanillinsäure); Resazarin; 4-Chlor-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol; Merocyanin 540; Resorufin; Bengalrosa und 2,4-Diphenyl-3(2H)-furanon. Der fluoreszierende nachweisbare Anteil ist vorzugsweise ein Fluorescein- oder Rhodaminfarbstoff.
Ein weiterer bevorzugter nachweisbarer Anteil ist kolloidales Gold. Das kolloidale Goldteilchen ist normalerweise 40 bis 80 nm im Durchmesser. Das kolloidale Gold kann an eine Markierungsverbindung in einer Reihe von Arten angelagert sein. In einer Ausführungsform endet der Verbindungsanteil der Nucleinsäure-Markierungsverbindung in einer Thiolgruppe (-SH), und die Thiolgruppe ist an das kolloidale Gold direkt durch eine semipolare Bindung gebunden. Siehe Mirkin et al. Nature 1996, 382, 607-609. In einer anderen Ausführungsform ist sie indirekt gebunden, zum Beispiel durch die Wechselwirkung zwischen kolloidalen Goldkonjugaten von Antibiotin und einer biotinylierten Markierungsverbindung. Der Nachweis der goldmarkierten Verbindung kann durch die Verwendung einer Silberverstärkungsmethode verbessert werden. Siehe Danscher et al., J. Histotech. 1993, 16, 201-207.
Die Verbindungsgruppe (M)_m kann dazu dienen, die Linkergruppe (L) an den nachweisbaren Anteil (Q) kovalent anzulagern. Sie kann eine beliebige geeignete Struktur besitzen, die die Funktion der Markierungsverbindung nicht stört. Nicht einschränkende Beispiele für M-Gruppen sind folgende: -CO(CH₂)₅NH-, -CO-, -CO(NH)- und -CO(CH₂)₅NHCO(CH₂)₅NH-, wobei m eine ganze Zahl von 0 bis ungefähr 5, vorzugsweise von 0 bis ungefähr 3 ist.
In einer Ausführungsform besitzt die Nucleinsäure-Markierungsverbindung der vorliegenden Erfindung die folgende allgemeine Struktur:
wobei L ein Linkeranteil ist, Q ein nachweisbarer Anteil ist, X O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, Y H, N₃, F, OR₁, SR₁ oder NHR₁ ist, Z H, N₃, F oder OR₁ ist, H_c eine heterocyclische Gruppe ist, A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung der Nucleinsäuremarkierung an eine Nucleinsäure ermöglicht, und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 3 ist. Die Substituenten R₁ und R₂ sind unabhängig voneinander und sind H, Alkyl oder Aryl.
Die Nucleinsäure-Markierungsverbindung der vorliegenden Erfindung besitzt folgende Struktur:
wobei A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung einer Nucleinsäure-Markierungsverbindung an eine Nucleinsäure zuläßt,
X O, S, NR₁, oder CHR₂ ist, wobei R₁ und R₂ unabhängig voneinander H, Alkyl oder Aryl ist;
Y H, N₃, F, OR₉, SR₉ oder NHR₉ ist, wobei R₉H, Alkyl oder Aryl ist,
Z H, N₃ F oder OR₁₀ ist, wobei R₁₀H, Alkyl oder Aryl ist;
L Amidoalkyl ist; Q eine erkennbare chemische Gruppe ist;
M eine Verbindungsgruppe ist; worin m eine ganze Zahl von O bis etwa 3 ist.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist eine Nucleinsäure-Markierungsverbindung folgende Struktur auf:
wobei Y Wasserstoff oder Hydroxyl ist, Z Wasserstoff oder Hydroxyl ist, R₃ Wasserstoff oder Alkyl ist, R₄-(CH₂)_nNH- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist, Q Biotin oder Carboxyfluorescein ist, A Wasserstoff oder H₄O₉P₃- ist; und M – CO(CH₂)₅NH- oder -CO- ist, wobei m 1 oder O ist. Vorzugsweise sind Y und Z Wasserstoff; R₃ ist Wasserstoff; R₄ ist -(CH₂)₄NH-; A ist H₄O₉P₃-; und Q ist Biotin, wobei M -CO(CH₂)₅NHist und m 1 ist, oder 5- oder 6-Carboxyfluorescein, wobei m 0 ist.
In einem Vergleichsbeispiel, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird, ist die heterocyclische Gruppe (H_c) ein C₃-substituiertes 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin, und die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen besitzen die folgende Struktur:
wobei L ein Linkeranteil ist, Q ein nachweisbarer Anteil ist, X O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, Y H, N₃, F, OR₁, SR₁ oder NHR₁ ist, Z H, N₃, F oder OR₁ ist, A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung der Nucleinsäuremarkierung an eine Nucleinsäure ermöglicht, und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 3 ist. Die Substituenten R₁ und R₂ sind unabhängig voneinander und sind H, Alkyl oder Aryl.
Die heterocyclische Gruppe (H_c) des Vergleichsbeispiels kann ein C3-substituiertes 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin sein, und die Linkergruppe ist ein Alkynylalkyl:
wobei Y Wasserstoff oder Hydroxyl ist, Z Wasserstoff oder Hydroxyl ist, n eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis ungefähr 10 ist, R₅O oder NH ist, A Wasserstoff oder H₄O₉P₃- ist, und Q Biotin oder Carboxyfluorescein ist, M -CO(CH₂)₅NH- ist, wobei m 1 oder 0 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn Y und Z Wasserstoff sind, n 4 ist, A H₄O₉P₃- ist und Q Biotin oder 5-oder 6-Carboxyfluorescein ist, wobei m 1 ist.
In einem weiteren Vergleichsbeispiel, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird, ist die heterocy clische Gruppe (H_c) ein C4-substituiertes Pyrazolo[3,4-d]pyrimidin, und die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen besitzen die folgende Struktur:
wobei L ein Linkeranteil ist, Q ein nachweisbarer Anteil ist, X O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, Y H, N₃, F, OR₁, SR₁ oder NHR₁ ist, Z H, N₃, F oder OR₁ ist, A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung der Nucleinsäuremarkierung an eine Nucleinsäure ermöglicht, und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 3 ist. Die Substituenten R₁ und R₂ sind unabhängig voneinander und sind H, Alkyl oder Aryl.
Die heterocyclische Gruppe (H_c) des Vergleichsbeispiels kann ein N4-substituiertes 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin sein, und die Linkergruppe ist ein Aminoalkyl:
wobei Y Wasserstoff oder Hydroxyl ist, Z Wasserstoff oder Hydroxyl ist, n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist, A Wasserstoff oder H₄O₉P₃- ist, Q Biotin oder Carboxyfluorescein ist, M -CO(CH₂)₅NH- oder -CO(CH₂)₅NHCO(CH₂)₅NH-ist, wobei m 1 oder 0 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn Y und Z Wasserstoff sind, n 4 ist, A H₄O₉P₃- ist und Q Biotin oder 5- oder 6-Carboxyfluorescein ist, wobei m 0 ist.
In einem weiteren Vergleichsbeispiel, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird, ist die heterocyclische Gruppe (H_c) ein 1,2,4-Triazin-3-on, und die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen besitzen die folgende Struktur:
wobei L ein Linkeranteil ist, Q ein nachweisbarer Anteil ist, X O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, Y H, N₃, F, OR₁, SR₁ oder NHR₁ ist, Z H, N₃, F oder OR₁ ist, A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung der Nucleinsäuremarkierung an eine Nucleinsäure ermöglicht, und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 3 ist. Die Substituenten R₁ und R₂ sind unabhängig voneinander und sind H, Alkyl oder Aryl.
Die heterocyclische Gruppe (H_c) des Vergleichsbeispiels kann ein 1,2,4-Triazin-3-on sein, und die Linkergruppe ist ein Aminoalkyl:
wobei Y Wasserstoff oder Hydroxyl ist, Z Wasserstoff oder Hydroxyl ist, n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist, A Wasserstoff oder H₄O₉P₃- ist, Q Biotin oder Carboxyfluorescein ist, M -CO(CH₂)₅NH- oder -CO(CH₂)₅NHCO(CH₂)₅NH- ist, wobei m 1 oder 0 ist. Es ist mehr bevorzugt, wenn Y und Z Hydroxyl sind, n 4 ist, A H₄O₉P₃- ist und Q Biotin oder 5- oder 6-Carboxyfluorescein ist, wobei M -CO(CH₂)₅NH- ist und m 1 ist.
In einem weiteren Vergleichsbeispiel, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird, ist die heterocyclische Gruppe (H_c) ein 1,2,4-Triazin-3,5-dion, und die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen besitzen die folgende Struktur:
wobei L ein Linkeranteil ist, Q ein nachweisbarer Anteil ist, X O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, Y H, N₃, F, OR₁, SR₁ oder NHR₁ ist, Z H, N₃, F oder OR₁ ist, A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung der Nucleinsäuremarkierung an eine Nucleinsäure ermöglicht, und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 3 ist. Die Substituenten R₁ und R₂ sind unabhängig voneinander und sind H, Alkyl oder Aryl.
Die heterocyclische Gruppe (H_c) des Vergleichsbeispiels kann ein 1,2,4-Triazin-3,5-dion sein, und die Linkergruppe ist ein Alkenylalkyl:
wobei Y Wasserstoff oder Hydroxyl ist, Z Wasserstoff oder Hydroxyl ist, n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10 ist, R₅NR₆ ist, wobei R₆ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist, A Wasserstoff oder H₄O₉P₃- ist, Q Biotin oder Carboxyfluorescein ist, M -CO(CH₂)₅NH- oder -CO(CH₂)₅NHCO(CH₂)₅NH- ist, wobei m 1 oder 0 ist.
In einem weiteren Vergleichsbeispiel, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird, ist die heterocyclische Gruppe (H_c) ein 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on, und die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen besitzen die folgende Struktur:
wobei L ein Linkeranteil ist, Q ein nachweisbarer Anteil ist, X O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, Y H, N₃, F, OR₁, SR₁ oder NHR₁ ist, Z H, N₃, F oder OR₁ ist, A H oder eine funktionelle Gruppe ist, die die Anlagerung der Nucleinsäuremarkierung an eine Nucleinsäure ermöglicht, und M eine Verbindungsgruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 3 ist. Die Substituenten R₁ und R₂ sind unabhängig voneinander und sind H, Alkyl oder Aryl.
Die heterocyclische Gruppe (H_c) des Vergleichsbeispiels kann ein 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on sein, und die Linkergruppe ist ein Alkenylalkyl:
wobei Y Wasserstoff oder Hydroxyl ist, Z Wasserstoff oder Hydroxyl ist, n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 10 ist, R₅NR₆ ist, wobei R₆ Wasserstoff, Alkyl oder Aryl ist, A Wasserstoff oder H₄O₉P₃- ist, Q Biotin oder Carboxyfluorescein ist, M -CO(CH₂)₅NH- oder -CO(CH₂)₅NHCO(CH₂)₅NH- ist, wobei m 1 oder 0 ist.
Synthese von Nucleinsäure-Markierungsverbindungen
3 zeigt einen Syntheseweg für die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen 8a und 8b der Erfindung, bei denen die heterocyclische Gruppe (H_c) ein Imidazol und der Linkeranteil (L) ein Amidoalkyl ist. Das silylgeschützte Imidazol (2) wurde zu Pentofuranose (1) hinzugefügt, was eine Mischung von Carboethoxyimidazolddesoxyribosid-Isomeren (3a-3d) lieferte. Die Isomere wurden getrennt, um gereinigtes 3c zu erhalten. Die Carboethoxygruppe von 3c wurde bei Behandlung mit einem Diamin in ein Aminocarboxamid (4) umgewandelt. Das endständige Amin von 4 wurde geschützt, was das trifluoracetylierte Produkt 5 ergab. Die Silylschutzgruppe von 5 wurde entfernt, was den primären Alkohol 6 lieferte. Verbindung 6 wurde in ein 5'-Triphosphatumgewandelt, um 7 zu erhalten. Die Trifluoracetyl-Schutzgruppe von 7 wurde entfernt, und das ungeschützte Amin wurde mit Biotin-NH(CH₂)₅CO-NHS oder 5-Carboxyfluorescein-NHS umgesetzt, was die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen 8a bzw. 8b ergab.
4 zeigt einen Syntheseweg zu einem Vergleichsbeispiel, C3-markierten 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin β-D-ribofuranosid-Triphosphaten, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird. Ein geschützter Propargylamin-Linker wurde zu Nucleosid (9) unter Palladiumkatalyse hinzugefügt, was das gekoppelte Produkt (10) ergab. Der primäre Alkohol des alkynsubstituierten Nucleosids (10) wurde phosphoryliert, was das 5'-Triphosphat 11 ergab. Dann wurde der Schutz für das geschützte Amin von Triphosphat 11 entfernt, und das resultierende primäre Amin wurde mit einem reaktiven Biotin- oder Fluoresceinderivat behandelt, was die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen 12a bzw. 12b lieferte.
5 zeigt einen Syntheseweg zu einem Vergleichsbeispiel, Pyrazolopyrimidin-Nucleotide, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird. Ein Chlorpyrazolopyrimidin (13) wurde zu Pentofuranose 1 zugesetzt, was das Addukt 14 als Mischung von Anomeren lieferte. Ein Diamin wurde zu Verbindung 14 zugesetzt, was eine Mischung von primären Aminen (15) ergab. Die primären Amine (15) wurden geschützt und chromatographisch getrennt, was das reine β-Anomer 16 lieferte. Die Silylgruppe von 16 wurde entfernt, und der resultierende primäre Alkohol wurde phosphoryliert, um Triphosphat 17 zu erhalten. Die Trifluoracetylgruppe von 17 wurde entfernt, und das ungeschützte Amin wurde mit einem reaktiven Biotin- oder Carboxyfluoresceinderivat behandelt, was die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen 18a-18d ergab.
6 zeigt einen Syntheseweg zu einem Vergleichsbeispiel, N4-markierte 1,2,4-Triazin-3-on β-D-ribofuranosid-Triphosphate, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird. 1,2,4-Triazin-3,5-dion-Ribonucleosid 19 wurde bei Behandlung mit Triazol und Phosphortrichlorid in das Triazolnucleosid 20 umgewandelt. Das Hinzufügen eines Diamins zu 20 lieferte das Aminoalkylnucleosid 21. Das primäre Amin von 21 wurde geschützt, was Trifluoracetamid 22 ergab. Der primäre Alkohol von 22 wurde phosphoryliert, und der Schutz für das geschützte Amin wurde entfernt und dieses mit einem reaktiven Biotin- oder Carboxyfluoresceinderivat umgesetzt, was die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen 23a bzw. 23b ergab.
7 zeigt einen Syntheseweg zu einem Vergleichsbeispiel, CS-markierte 1,2,4-Triazin-3,5-dion-Ribosidphosphate, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird. Aldehyd 24 wird mit Ylid 25 umgesetzt, was das phthalimidgeschützte Allylamin 26 ergibt. Verbindung 26 wird an Pentofuranose 27 angelagert, was Nucleosid 28 liefert. Die Phthalimidgruppe von 28 wird bei Behandlung mit Hydrazin entfernt, was das primäre Amin 29 ergibt. Amin 29 wird als Amid 30 geschützt. Amid 30 wird phosphoryliert, der Schutz wird entfernt, und es wird mit einem reaktiven Derivat von Biotin oder Carboxyfluorescein behandelt, wobei sich die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen 31a bzw. 31b ergeben.
8 zeigt einen Syntheseweg zu einem Vergleichsbeispiel, CS-markierte 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on-Ribosidtriphosphate, das nicht als Ausführungsform der Erfindung, sondern als Beispiel zum besseren Verständnis der Erfindung dargestellt wird. Verbindung 28 wird bei Behandlung mit einem Chlorierungsmittel und Ammoniak in die Amino-1,3,6-triazinverbindung 32 umgewandelt. Die Phthalimidgruppe von 32 wird bei Behandlung mit Hydrazin entfernt, und das resultierende primäre Amin wird geschützt, um 33 zu erhalten. Verbindung 33 wird phosphoryliert, sein Schutz wird entfernt, und sie wird einem reaktiven Derivat von Biotin oder Carboxyfluorescein behandelt, was die Nucleinsäure-Markierungsverbindungen 34a bzw. 34b ergibt.
Nucleinsäuremarkierung
Nucleinsäuren können aus einer biologischen Probe isoliert oder auf einer festen Unterlage oder zum Beispiel in Lösung nach Verfahren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, synthetisiert werden. Wie hierin verwendet, gibt es keine Beschränkung bei der Länge oder Quelle der beim Markierungsprozess verwendeten Nucleinsäure. Beispielhafte Verfahren der Nucleinsäureisolierung und -reinigung werden in Theory and Nucleic Acid Preparation. In Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Hybridization With Nucleic Acid Probes; P. Tijssen, Hrsg., Part I, Elsevier: N.Y., 1993, beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren zur Isolierung umfasst eine saure Guanidium-Phenol-Chloroform-Extraktion, gefolgt von Oligo dT-Säulenchromatographie oder (dT)n-Magnetperleneinsatz. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Bd. 1-3; und Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al. Hrsg., Greene Publishing and Wiley Interscience: N.Y., 1987.
In bestimmten Fällen wird die Menge an Nucleinsäure durch Amplifikation erhöht. Geeignete Amplifikationsverfahren umfassen, ohne Beschränkung darauf, die folgenden Beispiele: Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Innfis et al. PCR Protocols. A Guide to Methods and Application, Academic Press: San Diego, 1990); Ligase-Kettenreaktion (LCR) (Wu und Wallace. Genomics 1989, 4, 560; Landgren et al. Science 1988, 241, 1077; und Barringer et al. Gene 1990, 89, 117); Transkriptionsamplifikation (Kwoh et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 1173) und selbsterhaltende Sequenzreplikation (Guatelli et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 1874).
Die Nucleinsäure-Markierungsverbindung kann mit einer Reihe von Verfahren in eine Nucleinsäure integriert werden. Zum Beispiel kann sie direkt an eine Original-Nucleinsäureprobe (z.B. MRNA, polyA mRNA, cDNA) oder an ein Amplifikationsprodukt angelagert werden. Verfahren zur Anlagerung einer Markierungsverbindung an eine Nucleinsäure umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Nick-Translation, 3-End-Markierung, Ligation, in vivo-Transkription (IVT) oder Zufallspriming. Wenn die Nucleinsäure eine RNA ist, wird ein markiertes Riboligonucleotid ligiert, zum Beispiel unter Verwendung einer RNA-Ligase, wie zum Beispiel T4-RNA-Ligase. In The Enzymes, Uhlenbeck and Greensport, Hrsg., bd. XV, Teil B, S. 31-58, und Sambrook et al., S. 5.66-5.69. Mit der terminalen Transferase können Desoxy-, Didesoxy- oder Ribonucleosidtriphosphate (dNTPs, ddNTPs oder NPTs) hinzugefügt werden, zum Beispiel wenn die Nucleinsäure einsträngige DNA ist.
Die Markierungsverbindung kann auch im Inneren einer Nucleinsäure integriert werden. Zum Beispiel liefert PCR in Gegenwart einer Markierungsverbindung ein intern markiertes Amplifikationsprodukt. Siehe z.B. Yu et al., Nucleic Acids Research 1994, 22, 3226-3232. In ähnli cher Weise kann IVT in Gegenwart einer Markierungsverbindung eine intern markierte Nucleinsäure liefern.
Sondenhybridisierung
Die Nucleinsäure, der die Markierungsverbindung angelagert wird, kann nach der Hybridisierung mit einer Nucleinsäuresonde nachgewiesen werden. Alternativ kann die Sonde markiert werden, je nach dem vom Nutzer bevorzugten experimentellen Schema. Die Sonde ist eine Nucleinsäure oder eine modifizierte Nucleinsäure, die entweder an einen festen Träger aufgeheftet ist, oder sich in Lösung befindet. Sie ist komplementär in der Struktur zur markierten Nucleinsäure, mit der sie hybridisiert. Der feste Träger ist aus einem beliebigen geeigneten Material, einschließlich Kugeln auf Polystyrolbasis und Glaschips. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Sonden- oder Ziel-Nucleinsäure an einen Glaschip angeheftet, wie zum Beispiel ein GeneChip^®-Produkt (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA). Siehe International Publication No. WO 97/10365, WO 97/29212, WO 97/27317, WO 95/11995, WO 90/15070 und die US-Patente Nr. 5,744,305 und 5,445,934, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Da die Sondenhybridisierung oft ein Schritt beim Nachweis einer Nucleinsäure ist, muss die Nucleinsäure-Markierungsverbindung eine Struktur besitzen, die diesen Prozess nicht wesentlich stört. Die sterische und elektronische Natur der Markierungsverbindung ist daher mit der Anlagerung der befestigten Nucleinsäure an eine Komplementärstruktur verträglich.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung, jedoch nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung angeführt. Es muss bemerkt werden, dass die Beispiele 2 bis 6 Vergleichsbeispiele bereitstellen, die nicht als Ausführungsformen der Erfindung, sondern als Beispiele vorgestellt werden, die für das Verstehen der Erfindung nützlich sind.
Allgemeine Experimentelle Details
Reagenzien wurden von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, USA) in der höchsten verfügbaren Reinheit gekauft. Alle aufgeführten Lösungsmittel waren wasserfrei. Zwischenprodukte wurden durch ¹H-NMR und Massenspektrometrie charakterisiert.
Beispiel 1
Synthese von fluorescein- und biotinmarkierten 1-(2,3-Didesoxy-β-D-glyceropentofuranosyl)imidazol-4-caboxamid-Nucleotiden.
1-O-Acetyl-S-O-(t-butyldimethylsilyl)-2,3-didesoxy-D-glyceropentofuranose 1 (9,4 g, 34,2 mmol) (siehe Duelholm, K., Penderson, E.B., Synthesis, 1992, 1) und 1-Trimethylsilyl-4-carboethoxyimidazol 2 (6,3 g, 34,2 mmol) (siehe Pochet, S., et al. Biorg. Med. Chem. Lett. 1995, 5, 1679) wurden in 100 ml trockenem DCM unter Ar kombiniert, und Trimethylsilyltriflat-Katalysator (6,2 ml, 34,2 mmol) wurde bei 0 °C hinzugefügt. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt und dann 3x mit 100 ml gesättigter wässriger NaHC0₃-Lösung, 1x mit gesättigter wässriger NaCl-Lösung gewaschen, mit NaSO₄ getrocknet und verdampft, was 14 g einer Rohmischung von vier Carboethoxyimidazoldidesoxyribosid-Isomeren (3a-d) lieferte; dies entspricht den α- und β-Anomeren der N1- und N3-Alkylierungsprodukte. Die isomeren Produkte wurden gereinigt und durch Flash-Chromatographie getrennt (Silicagel, EtOAc-Hexan), Gesamtausbeute 52 %. Das β-N1-Isomer (2,2 g, 18 % Ausbeute) wurde durch chemische Verschiebung in ¹H-NMR und NOE-Daten identifiziert (siehe Pochet et al., Biorg. Med. Chem, Lett., 1995, 5, 1679). Gereinigtes 3c (0,5 g, 1,4 mmol) wurde mit einem 20fachen Überschuss von 1,4-Diaminobutan (3,0 ml, 30 mmol) 4 Stunden lang auf 145 °C erhitzt, und dann wurde die sich ergebende Mischung mit 50 ml EtOAc verdünnt, 3x mit Wasser, 1x mit Salzlösung gewaschen und mit NaSO₄ getrocknet und verdampft, was 500 mg (95 %) des Imidazol-4-(4-aminobutyl)carboxamiddidesoxyribosids als farbloses Öl ergab. Nach gemeinsamer Verdampfung mit Toluol wurde 4 (393 mg, 0,75 mmol) mit Trifluoracetylimidazol (94 μl, 0,83 mmol) in 5 ml trockenem THF bei 0 °C kombiniert und 10 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der ölige Rückstand wurde in 50 ml EtOAc aufgenommen, 2x mit gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung, 1x mit gesättigter wässriger NaCl-Lösung extrahiert, mit NaSO₄ getrocknet und verdampft, was 475 mg (99 %) des N-TFA-geschützten Nucleosids 5 als farbloses Öl ergab. Die TBDMS-Gruppe wurde durch Zusetzen von Triethylamintrihydrofluorid (2,3 ml, 14,4 mmol) im Überschuss in 20 ml trockenem THF entfernt und über Nacht gerührt. Das THF wurde im Vakuum verdampft, der Rückstand wurde in 50ml EtOA_c aufgenommen und die Lösung wurde gründlich in einer 1:1 Mischung aus gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung und Kochsalzlösung gewaschen, bis sie neutral war, dann mit NaSO₄ getrocknet und verdampft, was 340 mg (96 %) von 5 als blassgelbes Öl ergab. Die NMR- und MS-Daten waren in Übereinstimmung mit der zugewiesenen Struktur.
Nucleosid 6 wurde in ein 5'-Triphosphat umgewandelt, sein Schutz wurde entfernt, und es wurde mit Biotin-NH(CH₂)₅CO-NHS oder 5-Carboxyfluorescein-NHS umgesetzt und entsprechend den an anderer Stelle (siehe EP0252683) angeführten Verfahren gereinigt, was die markierten Nucleoside 8a, b mit > 95 %iger Reinheit durch HPLC, 31P-NMR ergab.
Beispiel 2
Synthese von C3-markierten 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin-β-D-Ribofuranosidtriphosphaten.
Die Synthese von 3-Iod-4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidinribofuranosid (9) wurde entsprechend der Beschreibung in H.B. Cottam, et al., J. Med. Chem. 36:3424, ausgeführt. Unter Verwendung der geeigneten Desoxyfuranosid-Vorläufer wurden die 2'-Desoxy- und 2',3'-Didesoxynucleoside nach analogen Verfahren hergestellt. Siehe z.B. U. Neidballa und Vorbruggen 1974, J. Org. Chem. 39:3654; K. Duehom und E.B. Pederson 1992, Synthesis 1991:1). Al-ternativ werden sie durch Desoxigenierung von Ribofuranosid 9 entsprechend den bewährten Verfahren hergestellt. Siehe M.J. Robins et al. 1983 J. Am. Chem. Soc. 103:4059, und C.K. Chu et al. 1989 J. Org. Chem. 54:2217.
Ein geschützter Propargylamin-Linker wurde dem 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin-Nucleosid (9) über durch organisches Palladium vermittelte Substitution der 3-Position des 4-Aminopryrol[3,4-d]pyrimidinribosid hinzugefügt, wobei das von Hobbs (J. Org. Chem. 54:3420; Science 238:336) beschriebene Verfahren verwendet wurde. Kupferiodid (38 mg, 0,2 mmol), Triethylamin (560 μl, 4,0 mmol), N-Trifluoracetyl-3-aminopropyn (700 μl, 6,0 mmol) und 3-Iod-4-aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin-β-D-ribofuranosid (9) (H.B. Cottam et al., 1993, J. Med. Chem. 36:3424) (786 mg, 2,0 mmol) wurden in 5 ml trockenem THF unter Argonatmosphäre kombiniert. Der gerührten Mischung wurde tetrakis(Triphenylphosphin)palladium(0) (232 mg, 0,2 mmol) zugesetzt. Die Lösung wurde innerhalb von 10 Minuten homogen und wurde weitere 4 Stunden lang im Dunkeln gerührt, danach wurde die Reaktionslösung mit 20 ml MeOH-DCM (1:1) verdünnt, 3,3 g von DOW AG-1 Anionenaustauschharz (Bicarbonatform) hinzugefügt, und das Rühren wurde weitere 15 Minuten fortgesetzt. Das Harz wurde durch Filtrieren entfernt und mit MeOH-DCM (1:1) gewaschen, die zusammengeführten Filtrate wurden bis zur Trokkenheit verdampft. Der Rückstand wurde in 4 ml heißem MeOH aufgelöst, dann wurden 15 ml DCM hinzugefügt, und die Mischung wurde warm gehalten, um eine homogene Lösung zu behalten, während sie auf eine 5 cm × 25 cm Silicagel-Säule aufgebracht wurde, die in 1:9 MeOH- DCM gepackt worden war. Das Produkt (R_f ~0,4; 6:3:1:1 DCM-EtOAc-MeOH-HOAc) wurde mit einem 10-15-20 % MeOH-DCM Stufengradienten eluiert. Der resultierende blassgelbe Feststoff wurde 3x mit 2,5 ml eiskaltem Acetonitril, dann 2x mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet, wobei 630 mg (75 %) von 4-Amino-3-(N-trifluoracetyl-3-aminopropynyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-β-D-ribofuranosid (10) erhalten wurde. Die Identität des Produktes wurde durch ¹H-NMR, Massenspektrometrie und Elementaranalyse bestätigt.
Das Nucleosid wurde in ein 5'-Triphosphat (11) umgewandelt, sein Schutz entfernt und mit Oxysuccinimidyl-(N-biotinoyl-6-amino)hexanoat oder Oxysuccinimidyl-(N-(fluorescein-5-carboxyl)-6-amino)hexanoat umgesetzt und nach den an anderer Stelle (EP0252683) angeführten Verfahren gereinigt, wobei sich die biotin- und fluoresceinmarkierten Nucleotide (12a, 12b) mit > 95 %iger Reinheit ergaben.
Beispiel 3
Synthese von Fluorescein- und Biotin-N6-didesoxypyrazolo[3,4-d]pyrtmidin-Nucleotiden.
1-O-Acetyl-5-O (t-butyldimethylsilyl)-2,3-didesoxy-D-glyceropentofurranose (1) und 1-Trimethylsilyl-4-chlorpyrazolo[3,4-d]pyrimidin (13) wurden entsprechend den in der Literatur angegebenen Verfahren synthetisiert. Duelholm, K.L., Penderson, E.B., Synthesis 1992, 1-22, und Robins, R.K., J. Amer. Chem. Soc. 1995, 78, 784-790. Zu 2,3 g (8,3 mmol) von 1 und 1,9 g (8,3 mmol, 1 Äquiv.) von 13 in 40 ml trockenem DCM bei 0 °C unter Argon wurde langsam über 5 Minuten 1,5 ml (8,3 mmol, 1 Äquiv.) von Trimethylsilyltriflat hinzugefügt. Nach 30 Minuten wurden 4,2 ml (41,5 mmol, 5 Äquiv.) von 1,2-Diaminobutan schnell hinzugefügt, und die Reaktionslösung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft; der Rückstand wurde in 50 ml Ethylacetat aufgelöst und mit 50 ml gesättigter wässriger NAHCO₃-Lösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet, gefiltert und das Lösungsmittel verdampft, was 4,2 g eines gelben Schaums ergab. Der Schaum wurde in 100 ml Diethylether aufgelöst, und 100 ml Hexane wurde hinzugefügt, um das Produkt als Öl auszufällen. Das Lösungsmittel wurde dekantiert, und das Öl wurde unter Hochvakuum getrocknet, was 3,4 g von 15 als blassgelben Schaum ergab. Die HPLC-, UV- und MS-Daten waren in Übereinstimmung mit einer 2:1-Mischung der α und β-Anomere.
Der Rohmischung der Isomere (3,4 g, 8,1 mmol, ≈50 % rein) in 140 ml von trockenem THF bei 0 °C unter Argon wurde langsam 1,0 ml von 1-Trifluoracetylimidazol (8,9 mmol, 1,1 Äquiv.) hinzugefügt. Der Reaktion folgte RP-HPLC. Weitere 5 % des Acylierungsmittels wurden hinzugefügt, um das Ausgangsmaterial vollständig in die Mischung von TFA-geschützten Anomeren umzuwandeln. Bergerson, R.G., McManis, J.S., J. Org. Chem. 1998, 53, 3108-3111. Die Reaktionslösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, und dann wurde das Lösungsmittel auf ungefähr 25 ml Volumen verdampft und mit 100 ml Ethylacetat verdünnt. Die Lösung wurde zweimal mit 25 ml von 1 %iger wässriger NaHCO₃-Lösung extrahiert, einmal mit Kochsalzlösung, dann über Na₂SO₄ getrocknet und verdampft, was 3,4 g eines gelben Schaums lieferte. Das Rohmaterial wurde durch Flash-Chromatogaphie auf Silicagel in EtOAc-Hexanen gereinigt, was 1,3 g des α-Anomers und 0,7 g des β-Anomers von 16 ergab (50 % Gesamtausbeute). Die ¹H-NMR- und MS-Daten waren in Übereinstimmung mit der zugewiesenen Struktur und Stereochemie.
Zu 1,3 g (2,5 mmol) von 16 (α-Anomer) in 50 ml trockenem THF unter Argon wurden 1 ml (13,6 mmol) von Triethylamin und 6,1 ml (37,5 mmol, 15 Äquiv.) von Triethylamintrihydrofluorid hinzugefügt. Nach 16stündigem Rühren wurde das Lösungsmittel verdampft, und das restliche Triethylamintrihydrofluorid wurde unter Hochvakuum entfernt. Pirrung, M.C. et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 1345-1346. Der Rückstand wurde in 100 ml Ethylacetat aufgelöst und mit 4 × 100 ml gesättigte wässrige NaHCO₃-Lösung, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, dann über Na₂SOa getrocknet und verdampft, was 850 mg (95 %) eines weißen Schaums ergab. Die ¹H-NMR-, UV- und MS-Daten waren in Übereinstimmung mit der zugewiesenen Struktur des desilylierten Nucleotids, welches im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Das Nucleosid wurde mittels des Eckstein'schen Phosphorylierungsverfahrens (Ludwig, J.L., Eckstein, F., J. Org. Chem. 1989, 54, 631-635) in das Triphosphat umgewandelt, es folgte die HPLC-Reinigung auf einer ResourceQ-Anionen-Austauschsäule (Puffer A sind 20 mM Tri pH 8, 20 % CH₃CN und Puffer B sind 20 mM Tris pH 8, 1 M NaCl, 20 % CH₃CN). Die ³¹P-NMR-, UV- und MS-Daten waren in Übereinstimmung mit der Struktur des Triphosphats. Die Trifluoracetyl-Schutzgruppe wurde durch Behandlung mit überschüssigem NH₄OH bei 55 °C, 1 Stunde, gefolgt von der Verdampfung bis zur Trockenheit, entfernt. Die massenspektralen Daten waren in Übereinstimmung mit dem Aminobutylnucleotid 17. Ohne weitere Reinigung wurde das Nucleotid entweder mit Biotin-NHS-Estern oder mit 5-Carboxyfluorescein-NHS behandelt, wie an anderer Stelle (EP0252683) beschrieben, wobei sich die markierten Nucleotide 18a-18d bildeten, die durch HPLC wie beschrieben ( EP0252683 ) gereinigt wurden, nur dass im Fall von 18a der Puffer 20 mM Natriumphosphat pH 6 war. Die ³¹P-NMR- und UV-Daten waren in Übereinstimmung mit der Struktur der markierten Analoga.
Beispiel 4
Synthese von N4-markierten 1,2,4-Triazin-3-on-β-D-Ribofuranosidtriphosphaten.
Einer Lösung von 1,2,4-Triazol (6,7 g, 97 mmol) in 30 ml trockenem ACN wurde POCl₃ (2,1 ml, 22 mmol) langsam unter Rühren unter Argon hinzugefügt. Nach 30 Minuten wurde die Lösung auf 0 °C gekühlt, und eine Lösung von Triethylamin (21 ml, 150 mmol) und 2',3',5'-Tri-O-acetyl-azauridin (19, 4,14 g, 11 mmol(von der Aldrich Chemical Company erhältlich)) in 10 ml ACN wurde hinzugefügt. Nach Rühren über eine weitere Stunde bei Raumtemperatur wurde die resultierende Lösung von aktiviertem Nucleosid tropfenweise in eine gerührte Lösung von 1,4-Diaminobutan (46 g, 524 mmol) in 20 ml MeOH übertragen. Die Lösungsmittel wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde von Wasser aufgenommen, mit Essigsäure neutralisiert und wieder bis zur Trockenheit verdampft. Der Rohrückstand wurde durch Chromatographie auf Silicagel (95:5 MeOH-NH₄OH) gereinigt, gefolgt von der präparativen Umkehrphasen-HPLC, die 150 mg (0,45 mmol, 3 %) des Aminobutylnucleosids (21) lieferte. Dieses wurde direkt in das TFA-geschützte Nucleosid (22) durch Reaktion mit 1-Trifluoracetylimidazol (300 μl, 1,8 mmol) in 3 ml ACN bei 0 °C über 2 Stunden, Verdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch Flash-Chromatographie (1:9 MeOH-DCM) umgewandelt. Ausbeute 175 mg (0,42 mmol, 93 %). Die Identität des Produktes wurde durch ¹H-NMR und Massenspektrometrie bestätigt.
Das Nucleosid wurde in ein 5'-Triphosphat umgewandelt, sein Schutz entfernt, und mit Oxysuccinimidyl-(N-biotinoyl-6-amino)hexanoat oder Oxysuccinimidyl-(N-(fluorescein-5-carboxyl)-6-amino)hexanoat umgewandelt und nach an anderer Stelle (EP0252683) beschriebenen Verfahren gereinigt, was die biotin- und fluoresceinmarkierten Nucleotide (23a, 23b) mit > 95 %iger Reinheit ergab.
Beispiel 5
Synthese von Biotin- und Fluorescein-C5-markierten 1,2,4-Triazin-3,5-dion-Ribosidtriphosphaten.
5-Formyl-6-azauracil (24) wird nach den in der Literatur angeführten Verfahren hergestellt. Siehe Scopes, D.I.C. 1986, J. Chem. Med., 29, 809-816, und darin zitierte Literaturstellen.
Verbindung 24 wird mit dem Phosphoniumylid von 25 umgesetzt, das durch Behandlung von 25 mit katalytischem t-Butoxid gebildet wird, um das phthalimidoyl-geschützte Allylamin 26 zu erhalten. Das geschützte Allylamin 26 wird ribosyliert, das β-Anomer 28 bei Reaktion von 26 mit β-D-Pentofuranosid 27 (von Aldrich erhältlich) entsprechend dem Verfahren von Scopes et al. 1986, J. Chem. Med., 29, 809-816, zu erhalten. Der Schutz von β-Ribonucleosid 28 wird mit einem wasserfreien Hydrazin in THF entfernt, wobei sich Allylamin 29 bildet. Die Reaktion des primären Amins 29 mit Trifluoracetylimidazol in THF liefert das geschützte Amin 30.
Nucleosid 30 wird in ein 5'-Triphosphat umgewandelt, dessen Schutz entfernt wird, und das mit Oxysuccinimidyl-(N-biotinoyl-6-amino)hexanoat oder Oxysuccinimidyl-(N-(fluorescein-5-carboxyl)-6-amino)hexanoat umgesetzt und nach den an anderer Stelle (EP0252683) angeführten Verfahren gereinigt wurde, wobei sich die biotin- und fluoresceinmarkierten Nucleotide 31a bzw. 31b ergaben.
Beispiel 6
Synthese von Biotin- und Fluorescein-C5-markierten 5-Amino-1,2,4-triazin-3-on-Ribosidtriphosphaten.
β-Ribonucleosid 28, oben beschrieben, wird mit SOCl₂ oder POC1₃ behandelt und anschließend mit Ammoniak umgesetzt, um das 4-Amino-1,3,6-triazin-Nucleosid 32 zu erhalten. Die Phthalimidgruppe von 32 wird bei Reaktion mit Hydrazin entfernt, und das resultierende primäre Amin wird geschützt, um das Nucleosid 33 zu erhalten. Nucleosid 33 wird in ein 5'-Triphosphat umgewandelt, dessen Schutz entfernt wird, und das mit Oxysuccinimidyl-(Nbiotinoyl-6-amino)hexanoat oder Oxysuccinimidyl-(N-(fluorescein-5-carboxyl)-6-amino)hexanoat umgesetzt und nach den an anderer Stelle (EP0252683) angeführten Verfahren gereinigt wird, wobei sich die biotin- und fluoresceinmarkierten Nucleotide 34a bzw. 34b ergeben.
Beispiel 7
Verfahren zur HPLC-Analyse des enzymatischen Einbaus von modifizierten Nucleotiden.
Reaktionsbedingungen
TdT

3 μM dT₁₆-Matrize
15(30) μM NTP
40 Einh. TdT (Promega)
1X Puffer, pH 7,5 (Promega)
Verfahren: Inkubation 1 h bei 37 °C, dann für 10 min bei 70 °C, gefolgt von der Hinzufügung von EDTA (2 mM Endkonzentration) in einem Volumen von 50 μl.

HPLC-Analyse
Materialien und Reagenzien
s4,6 mm × 250 mm Nucleopac PA-100 Ionenaustauschersäule (Dionex) Puffer A: 20 mM NaOH (oder 20 mM Tris pH 8, im Fall des TdT-Einbaus von Nucleotidtriphosphaten, die nicht farbstoffmarkiert sind).
Puffer B: 20 mM NaOH, 1M NaCl (oder 20 mM Tris pH 8, 1M NaCl, im Fall des TdT-Einbaus von Nucleotidtriphosphaten, die nicht farbstoffinarkiert sind).
Allgemeines Verfahren
Verdünne die Reaktionslösung mit 50 μl Puffer A. Trage μl 50 dieser Probe auf die HPLC-Säule auf und fraktioniere mittels eines Gradienten von 5 bis 100 % Puffer B über 30 Minuten bei einer Strömungsrate von 1 ml/min. Stelle Peaks gleichzeitig bei 260 nm Extinktion und das Extinktionsmaximum des Farbstoffs (oder das Fluoreszenzemissionsmaximum des Farbstoffs) fest.
Die Integrationseffizienz wird als der Teil des Oligonucleotids, der markiert ist, ausgedrückt. Diese Zahl wird durch Dividieren der bei 260 nm Extinktion gemessenen Peakfläche des markierten Oligonucleotids durch die Summe der Peakflächen des unmarkierten und markierten Oligonucleotids bestimmt. (Die Retentionszeit des fluoresceinmarkierten dT_l6 ist in der Größenordnung 2 bis 3 min länger als die des unmarkierten dT₁₆). Der Fehler bei dieser Art von Analyse beträgt etwa 10 %. Die prozentuale Markierungseffizienz für 4 Arten von Nucleinsäure-Markierungsverbindungen, einschließlich der Vergleichsbeispiele, wird unten in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Beispiel 8
Hybridisierungsuntersuchungen von markierten Imidazolcarboxamid („ITP") und 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidin- („APPTP"-) Nucleotiden.
Das Verhalten des markierten Imidazolcarboxamids der Erfindung und des Vergleichsbeispiels, 4-Aminopyrazol[3,4-d]pyrimidin-Nucleotide, wurde in einer p53-Analyse unter Verwendung von Standard-GeneChip^®-Produktprotokollen (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Kalifornien) bewertet, die zum Beispiel im Detail auf dem Beipackzettel zur GeneChip^®-p53-Analysepackung beschrieben werden. Die bei diesen Experimenten verwendete Probe-DNA war das Plasmid „p53mut248". Das markierte Nucleotidanalog wurde statt des üblichen Markierungsagens (Fluorescein-N6-ddATP oder Biotin-M-N6-ddATP (wobei M = Aminocaproyl), von NEN, Teile-Nr. NEL-503 bzw. NEL-508) eingesetzt. Markierungsreaktionen wurden sowohl mit der Standardmenge von TdT-Enzym, die im Analyseprotokoll (25 U) angegeben wird, als auch mit 100 U des Enzyms. Nach der Markierung wurden die fluoresceinmarkierten Targets auf die Assays hybridisiert und direkt gescannt. Bei Experimenten, die biotinmarkierte Targets verwenden, wurden die GeneChip^®-Chips nach beschriebenen Verfahren (Science 280:1077-182(1998)) in einem Posthybridisierungsschritt mit Phycoerythrin-Streptavidin-Konjugat (PE-SA) vor dem Scannen gefärbt.
9 zeigt Vergleiche der beobachteten Hybridisierungs-Fluoreszenzintensitäten für die 1300 Basen, die im Teil „Unit-2" des Chips zugeordnet werden. Im unteren Diagramm werden die Intensitäten für die fluorescein-ddITP (8b)-markierten Targets über denen für die mit Standard-Fluorescein-N6-ddATP markierten Targets (Kontrolle) aufgetragen, beide bei 25 U TdT. Die beobachtete Steigung von 0,75 zeigt an, dass die Markierungseffizienz von 8b etwa 75 % der von Fluorescein-N6-ddATP unter diesen Bedingungen beträgt. Im oberen Diagramm wird derselbe Vergleich angestellt, außer dass bei der 8b-Markierungsreaktion 100 U TdT verwendet wurden. Die Steigung von ≈1,1 zeigt die gleichwertige oder leicht bessere Markierung als bei der Standard- Fluorescein-N6-ddATP/25 U-Kontrollreaktion an.
10 zeigt Vergleiche der beobachteten Hybridisierungs-Fluoreszenzintensitäten für die 1300 Basen, die im Teil „Unit-2" des Chips zugeordnet werden. Die Intensitäten für das Vergleichsbeispiel, mit Biotin-(M)₂-ddAPPTP (18c, M = Aminocaproyl-Linker, in 10 als Biotin-N4-ddAPPTP bezeichnet) markierte Targets (nach PE-SA-Färbung), werden über denen für die Targets mit Markierung durch Standard-Biotin-N6-ddATP (Kontrolle) dargestellt, beide bei 25 U TdT. Der beobachtete Anstieg von ≈0,3 zeigt an, dass die Markierungseffizienz bei Biotin(M)₂-ddAPPTP (18c) etwa 30 % von der von Biotin-M-N6-ddATP unter diesen Bedingungen betrug.
11 zeigt Vergleiche der beobachteten Hybridisierungs-Fluoreszenzintensitäten für die 1300 Basen, die im Teil „Unit-2" des Chips zugeordnet werden. Im unteren Diagramm sind die Intensitäten für die mit Biotin-M-ddITP (8a, M=Aminocaproyl; in 11 als Bio-ddITP bezeichnet) markierten Targets über denen für die mit Standard-Biotin-M-N6-ddATP markierten Kontrolltargets aufgetragen, beide bei 25 U TdT. Die beobachtete Steigung von ≈0,4 zeigt an, dass die Markierungseffizienz bei 8a etwa 40 % der von Biotin-M-N6-ddATP unter diesen Bedingungen beträgt. Im oberen Diagramm wird derselbe Vergleich angestellt, außer dass 100 U TdT bei der Markierungsreaktion von 8a verwendet wurden. Der Anstieg von =1,1 zeigt die gleichwertige oder leicht bessere Markierung im Vergleich zur Standard-Biotin-M-N6-ddATP/25 U-Kontrollreaktion an.
12 zeigt einen Vergleich der Gesamtgenauigkeit der Resequenzierung (Basenzuordnung) für beide Stränge, die mit Fluorescein-ddITP-markierten Targets sowohl bei 25 U als auch 100 U TdT erhalten wurden, sowie die mit Standard-Fluorescein-N6-ddATP/25 U TdT markierten „Kontrolltargets". 13 zeigt einen ähnlichen Vergleich für die Targets, die mit Biotin-M-ddITP markiert sind (8a, in 13 als Biotin-ddITP bezeichnet), und die Biotin-M-N6-ddATP-„Kontrolle", nach PE-SA-Färbung. 14 zeigt einen Vergleich der Resequenzierungsgenauigkeit bei Verwendung von Biotin-(M)₂-ddAPPTP/100 U TdT und Biotin-M-N6-ddATP/25 U TdT. Diese Daten zeigen, dass das markierte Imidazolcarboxamid der Erfindung und 4-Aminopyrazolo[3,4-d]pyrimidindidesoxynucleotid-Analoga zur Markierung von DNA-Targets bei Assays auf der Basis der Hybridisierung verwendet werden können und eine Leistungsfähigkeit aufweisen, die der des markierten Standard-N6-ddATP-Reagens gleichwertig ist.
Beispiel 9
Das Verhalten der biotinmarkierten Imidazolcarboxamid- und 4-Aminopyratol[3,4-d]pyrimidin-Nucleotide ("Biotin-M-ITP" (8a) der Erfindung und "Biotin-(M)₂-APPTP" (18c) Vergleichsbeispiel) wurde unter Verwendung eines GeneChip^®-Chiparrays, das die Polymorphie eines einzelnen Nucleotids genotypisiert, bewertet. Es wurden bei diesen Experimenten publizierte Protokolle (D.G. Wang et al., 1998, Science 280:1077-1082) verwendet, außer für die folgenden Variationen: 1) Die Markierungsreaktionen wurden sowohl mit der Standardmenge an TdT-Enzym im veröffentlichten Protokoll (15 U) als auch mit der dreifachen Enzymmenge (45 U) durchgeführt; 2) Verwendung des markierten Nucleotidanalog für das Standardmarkierungsreagenz (Biotin-N6-ddATP, von NEN: Teile-Nr. NEL-508); 3). Das markierte Nucleotidanalog wurde entweder bei der zweifachen Konzentration der im veröffentlichten Protokoll angegebenen Standardkonzentration (25 μM) oder beim sechsfachen Wert (75 μM) verwendet. Nach der Markierung wurden biotinmarkierte Targets auf die Arrays hybridisiert, mit Phycoerythrin-Streptavidin-Konjugat (PE-SA) gefärbt, und das Array wurde entsprechend dem veröffentlichten Verfahren gescannt und analysiert.
Die Daten werden in Tabelle 2 unten angeführt. Wie durch die mittleren Intensitäten des beobachteten Hybridisierungssignals (über das ganze Array gemittelt) angegeben, war die Markierungseffizienz mit Biotin-M-ITP (8a) bei 25 μM so gut wie bei Biotin-N6-ddATP 12,5 μM, und bei Verwendung von 8a bei 75 μM (Punkte 1-3, 7, 8) wurde eine sogar noch höhere Intensität erreicht. Im Vergleich zur Kontrolle lieferte dieses Analog eine gleichwertige oder bessere Assayleistung, ausgedrückt als Verhältnis der richtigen Basenzuordnungen. Etwas geringere mittlere Signalintensitäten wurden mit dem Vergleichsbeispiel, Biotin-(M)₂-APPTP (18c), erreicht, was die geringere Integrationseffizienz dieses Analog widerspiegelt, jedoch kann eine gleichwertige Assayleistung mit diesem Analog immer noch unter Verwendung etwas höherer Enzym- und Nucleotidkonzentrationen erreicht werden (Punkte 3-6).
Tabelle 2. Vergleich der Polymorphie-Chipdaten

Claims

Nucleinsäure-Markierungsverbindung mit folgender Struktur:
wobei A, H oder eine funktionelle Gruppe ist, die das Anlagern der Nucleinsäure-Markierungsverbindung an eine Nucleinsäure ermöglicht; X, O, S, NR₁ oder CHR₂ ist, wobei R₂ und R₂ unabhängig voneinander H, Alkyl oder Aryl sind; Y, H, N₃, F, OR₉, SR₉ oder NHR₉ ist, wobei R₉, H, Alkyl oder Aryl ist; Z, H, N₃, F oder OR₁₀ ist, wobei R₁₀, H, Alkyl oder Aryl ist; L, Amidoalkyl ist; Q eine nachweisbare chemische Gruppe ist; und M eine verbindende Gruppe ist, wobei m eine ganze Zahl im Bereich von 0 bis ungefähr 3 ist.
Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 1, wobei A, H oder H₄O₉P₃- ist; X, O ist; Y, H oder OR₉ ist, wobei R₉, H, Alkyl oder Aryl ist; Z, H, N₃, F oder OR₁₀ ist, wobei R₁₀, H, Alkyl oder Aryl ist; L -C(O)NH(CH₂)_nNH- ist, wobei n eine ganze Zahl im Bereich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 ist; Q, Biotin oder ein Carboxyfluorescein ist; und M, -CO(CH₂)₅NH- ist, wobei m gleich 1 oder 0 ist.
Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 2, wobei Y, H oder OH ist; Z, H oder OH ist; L, -C(O)NH(CH₂)₄NH- ist; Q, Biotin ist; und M, -CO(CH₂)₅NH- ist, wobei m gleich 1 ist.
Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 2, wobei Y, H oder OH ist; Z, H oder OH ist; L, -C(O)NH(CH₂)₄NH- ist; Q, 5-Carboxyfluorescein ist; und m 0 ist.
Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 2, wobei A, H oder H₄O₉P₃ ist; Y, H ist; Z, H ist; L, -C(O)NH(CH₂)₄NH- ist; Q, Biotin ist; und M, -CO(CH₂)₅NH- ist, wobei m gleich 1 ist.
Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 5, wobei A, H₄O₉P3- ist; Y, H ist; Z, H ist; L, -C(O)NH(CH₂)₄NH- ist; Q, Biotin ist; und M, -CO(CH₂)₅NH- ist, wobei m gleich 1 ist.
Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 2, wobei A, H₄O₉P₃- ist; Y, H ist; Z, H ist; L, -C(O)NH(CH₂)₄NH- ist; Q, 5-Carboxyfluorescein ist; und m gleich 0 ist.
Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 7, wobei A, H₄O₉P₃- ist; Y, H ist; Z, H ist; L, -C(O)NH(CH₂)₄NH- ist; Q, 5-Carboxyfluorescein ist; und m gleich 0 ist.
Nucleinsäurederivat, das durch Koppeln einer Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 2 mit einer Nucleinsäure hergestellt ist.
Hybridisierungsprodukt, wobei das Hybridisierungsprodukt das Nucleinsäurederivat nach Anspruch 9, das an eine komplementäre Sonde gebunden ist, aufweist.
Hybridisierungsprodukt nach Anspruch 10, wobei die Sonde an einen Glas-Chip angelagert ist.
Verfahren zum Synthetisieren einer markierten Nucleinsäure, wobei eine Nucleinsäure-Markierungsverbindung nach Anspruch 2 an eine Nucleinsäure angelagert wird.
Verfahren zum Nachweisen einer Nucleinsäure, wobei ein Nucleinsäurederivat nach Anspruch 9 mit einer Sonde inkubiert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Sonde an einen Glas-Chip angelagert wird.