DE69918389T2

DE69918389T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Erkennung von Molekülbindungsreaktionen

Info

Publication number: DE69918389T2
Application number: DE69918389T
Authority: DE
Inventors: John Hefti
Original assignee: MDS Inc
Current assignee: Nordion Inc
Priority date: 1998-02-02
Filing date: 1999-02-01
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2019-02-02
Also published as: AU2490699A; EP0991938B1; GB9923039D0; CN1292087A; IL137260A0; KR20010040559A; US6368795B1; WO1999039190A1; GB2342176A; NO20003911D0; CA2318191A1; CA2318191C; EP0991938A1; DE69918389D1; NO20003911L; JP2002502028A; JP2005308761A; AU745416B2; GB2342176B; ATE270429T1

Description

Praktisch jedes Gebiet der biomedizinischen Wissenschaften benötigt ein System zur Analyse chemischer und biochemischer Reaktionen und zur Bestimmung des Vorhandenseins und der Menge bestimmter Analyten. Dieser Bedarf reicht von der Grundlagenforschung im Labor, wo biochemische Verläufe dargestellt und ihre Funktionen mit den Krankheitsprozessen korreliert werden, bis zur klinischen Diagnose, bei der Patienten routinemäßig auf die Werte klinisch relevanter Analyten überwacht werden. Andere Bereiche umfassen die pharmazeutische Forschung, militärische Anwendungen sowie Anwendungen in der Veterinärkunde, auf dem Lebensmittelsektor und im Umweltschutz. In all diesen Fällen müssen die Anwesenheit und die Menge eines spezifischen Analyten oder einer Analytengruppe bestimmt werden.
Für Analysen in den Bereichen der Chemie, Biochemie, Biotechnologie, Molekularbiologie und in zahlreichen anderen Bereichen ist es häufig nützlich, eine oder mehrere molekularen Strukturen aufzufinden und die Bindung zwischen den Strukturen zu messen. Die interessierenden molekularen Strukturen enthalten u. a. Zellen, Antikörper, Antigene, Metaboliten, Proteine, Drogen (Medikamente), kleine Moleküle, Enzyme, Nukleinsäuren sowie andere Liganden und Analyten. In der Medizin ist es z. B. sehr nützlich die Existenz zellularer Bestandteile wie Rezeptoren oder Zytokine oder Antikörper und Antigene zu bestimmen, die als Marker für verschiedene Krankheitsprozesse dienen, die natürlich in physiologischen Fluiden existieren oder in das System eingeführt worden sind. Außerdem sind die DNS- und RNS-Analyse sehr nützlich in der Diagnostik, bei genetischen Tests und in der Forschung, in der Landwirtschaft und in der pharmazeutischen Entwicklung. Durch die raschen Fortschritte in der Molekularzellbiologie und in der Kenntnis normaler und kranker Systeme besteht ein zunehmender Bedarf an Detektionsverfahren, bei denen keine Indikatoren wie Fluorophore oder Radioisotope erforderlich sind, die quantitativ und qualitativ spezifisch für das interessierende Molekül hochempfindlich und relativ einfach zu implementieren sind.
Im Laufe der Jahre sind zahlreichen Verfahren entwickelt worden, um die Anforderungen auf diesen Gebieten zu erfüllen, z. B. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA) (enzymgekoppelte Immunoassays), Radio-Immunoassays (RIA), zahlreiche Fluoreszenzanalysen, Massenspektroskopie, kalorimetrische Analysen, Gelelektrophorese sowie eine große Zahl Spezialanalysen. Die meisten dieser Analysetechniken erfordern besondere Vorbereitungen, insbesondere die Bindung eines Indikators oder die extreme Reinigung und Verstärkung der zu testenden Probe. Um ein Bindungsereignis zwischen einem Liganden und einem Antiliganden erkennen zu können, ist ein detektierbares Signal erforderlich, das das Vorhandensein oder die Erweiterung der Bindung betrifft. Normalerweise wird das Signal von einem Indikator geliefert, der entweder mit dem interessierenden Liganden oder Antiliganden konjugiert ist. Physikalische oder chemische Effekte, die detektierbare Signale erzeugen und für die geeignete Indikatoren vorhanden sind, umfassen Radioaktivität, Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Phosphoreszenz und enzymatische Aktivität, um nur einige wenige zu nennen. Der Indikator kann dann durch Spektrometrie, Radiometrie oder optische Verfolgungsverfahren erkannt werden. In vielen Fällen ist es leider schwierig oder sogar unmöglich, eines oder alle der für eine bestimmte Analyse erforderlichen Moleküle zu markieren. Außerdem kann das Vorhandensein eines Indikators die Erkennung zwischen zwei Molekülen aus zahlreichen Gründen einschließlich sterischer Effekte zunichte machen. Ferner wird mit keiner dieser Vorgehensweisen zu Markierung die exakte Art des Bindungsereignisses bestimmt; so ist z. B. die Bindung der aktiven Seite an einen Rezeptor nicht zu unterscheiden von der Binder der nicht aktiven Seite wie der allosterischen Bindung, und somit liefern die derzeitigen Detektionsmethoden keine funktionalen Informationen. Ein Verfahren zur Erkennung von Bindungsereignissen, dass sowohl die Notwendigkeit eines Indikators beseitigt als auch funktionale Informationen liefert, würde deshalb die oben genannten Ansätze deutlich verbessern.
Andere Ansätze zur Untersuchung biochemischer Systeme verwenden verschiedene Arten dielektrischer Messungen, um bestimmte Klassen biologischer Systeme wie Gewebeproben und Zellularsysteme zu charakterisieren. In den 50-er Jahren des vergangenen Jahrhunderts wurden Experimente zur Messung der dielektrischen Eigenschaften biologischer Gewebe unter Anwendung von damals bekannten Standardtechniken zur Messung dielektrischer Eigenschaften von Materialien durchgeführt. Seit damals enthalten verschiedene Ansätze zur Ausführung dieser Messungen Frequenzbereichsmessungen und Zeitbereichstechniken wie die dielektrische Zeitbereichs-Spektroskopie. Bei diesen Ansätzen wurden die Experimente im Allgemeinen unter Verwendung verschiedener Typen koaxialer Übertragungsleitungen oder anderer Übertragungsleitungen und Strukturen, die typischerweise bei der dielektrischen Charakterisierung von Materialen eingesetzt werden, durchgeführt. Dies beinhaltete Studien zur Bewertung des Nutzens und der Relevanz der dielektrischen Eigenschaften eines weiten Bereichs biologischer Systeme: Das Interesse erstreckte sich von Vollgewebeproben, die verschiedenen Organen von Säugetierspezies entnommen wurden, zu zellularen und subzellularen Systemen einschließlich Zellmembran und Organellen Effekten. In der jüngsten Vergangenheit wurden Versuche unternommen, die oben genannten Techniken zu miniaturisieren (sie z. B. U. S.-Patente Nr. 5,653,939; 5,627,322 und 5,846,708), um Änderungen der dielektrischen Eigenschaften molekularer Systeme besser erkennen zu können. Typischerweise wird dabei die biologische Probe – wobei es sich um Gewebe, Zellularsysteme oder Molekularsysteme handeln kann – in der elektrischen Schaltungstopologie als Nebenschluss- oder Reihenelement verwendet. Diese Konfiguration hat mehrere Nachteile einschließlich einiger erheblicher Einschränkungen der in der Detektionsstrategie nutzbaren Frequenzen und eine schwerwiegende Einschränkung der Empfindlichkeit bei der Erkennung molekularer Systeme.
Im Allgemeinen bestehen bei den meisten Analysesystemen Einschränkungen in den Bereichen der Spezifität und Empfindlichkeit. Zellulare Teilchen und unspezifische Bindungen verursachen oft eine rauschbehaftete Analyse und machen die Extraktion sinnvoller Informationen schwierig oder unmöglich. Wie oben erwähnt sind manche Systeme zu kompliziert, um alle interessierenden Analyten mit Indikatoren zu versehen oder um eine genaue optische Messung durchzuführen. Wie ferner oben erwähnt liefern die meisten dieser Detektionstechnologien keine Informationen über die funktionale Art des Bindungsereignisses. Deshalb wäre eine praktikable und wirtschaftliche universelle Methode, die ohne Indikator das Vorhandensein von Analyten oder das Ausmaß, die Funktion und den Typ der Bindungsereignisse, die in einem gegebenen System tatsächlich stattfinden, in Echtzeit direkt überwachen kann, ein bedeutender Durchbruch.
Genauer gesagt benötigt die biomedizinische Industrie eine verbesserte Technologie auf einer allgemeinen Plattform, die eine sehr weite Anwendbarkeit auf verschiedene physiologische Systeme auf Wasserbasis oder anderer Fluidbasis hat, wie Nukleinsäurebindung, Protein-/Protein-Wechselwirkungen, Bindung kleiner Moleküle sowie andere Verbindungen von Interesse. Idealerweise sollte die Analyse keine hoch spezifischen Nukleinsäurestränge wie spezifische Antikörper und exakt komplementäre Nukleinsäurestränge erfordern; sie sollte in nativen Umgebungen wie Vollblut, zytosolischen Gemischen sowie anderen natürlich vorkommenden Systemen funktionieren; sie sollte durch Messen der nativen Eigenschaften der Moleküle funktionieren und keine zusätzlichen Indikatoren oder Tracer erfordern, um das Bindungsereignis tatsächlich zu überwachen; bei manchen Anwendungen sollte sie in der Lage sein, bestimmte gewünschte Informationen über die Art des Bindungsereignisses zu liefern, z. B. ob eine gegebene Verbindung als Agonist oder Antagonist auf einen bestimmten Arzneimittelrezeptor wirkt oder nicht, und nicht einfach als Marker wirken, um anzuzeigen, ob das Bindungsereignis stattgefunden hat oder nicht. Für zahlreiche Anwendungen sollte sie in hohem Maße miniaturisierbar und gleichartig sein, so dass komplexe biochemische Wege abgebildet werden können, oder extrem klein, wobei zahlreiche Mengen kombinatorischer Verbindungen in Drogensichtungsprotokollen verwendet werden können. Bei zahlreichen Anwendungen sollte sie außerdem in der Lage sein, eine komplexe Reihe Reaktionen in Echtzeit zu überwachen, so dass genaue Kinetik- und Affinitätsinformationen nahezu sofort erhalten werden können. Vielleicht am wichtigsten für die meisten kommerziellen Anwendungen ist, dass sie preisgünstig und einfach anzuwenden sind, wenige Schritte zur Probenvorbereitung, kostengünstige Elektronik- und Einmalkomponenten wie Oberflächen-Chips für Bio- Analysen, die nach einer Analyse entsorgt werden, enthalten und an einen weiten Bereich von Analyseanwendungen gut anpassbar sind.
Es ist zu beachten, dass andere Branchen ähnliche Anforderungen hinsichtlich Detektion, Identifizierung oder zusätzliche Analysen haben. Wenn auch in den meisten Anwendungen mit biologischen Moleküle gearbeitet wird, kann praktisch jedes Molekül erkannt werden, wenn ein spezifischer Bindungspartner verfügbar ist oder wenn sich das Molekül selbst wie unten beschrieben an die Oberfläche anhaften kann.
Die vorliegende Erfindung erfüllt zahlreiche der oben dargelegten Anforderungen sowie weitere Bedürfnisse.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Systeme und Verfahren zur Erkennung molekularer Bindungsereignisse und anderer Umgebungseffekte bereit, indem sie sich die einzigartigen dielektrischen Eigenschaften der gebundenen molekularen Struktur oder der Strukturen und die lokale Umgebung zu Nutze macht, sowie zur Identifizierung des Vorhandenseins und der Konzentrationen molekularer Spezies und der physikalischen Eigenschaften der lokalen Umgebung in einem bestimmten biologischen System.
Ein Aspekt der Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Untersuchen von Wechselwirkungen eines Analyten mit seiner Umgebung unter Verwendung eines modulierten Signals bereit, um die Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei das Verfahren umfasst:
Inkontaktbringen einer ersten wässrigen Umgebung (157), die den Analyten und wahlweise zusätzliche Komponenten enthält, mit einer Bio-Analyse-Vorrichtung (150), umfassend:

(1) einen Signalweg, wobei der Signalweg umfasst: (a) einen Wellenleiter oder (b) eine Übertragungsleitung (120), ein Grundelement (130) und ein dielektrisches Material (158), das zwischen der Übertragungsleitung und dem Grundelement angeordnet ist, wobei der Signalweg so gestaltet ist, dass elektromagnetische Signale mit einer oder mehreren Frequenzen im Bereich von 10 MHz bis 1000 GHz übertragen werden, und
(2) eine molekulare Bindungsschicht (56), die elektromagnetisch mit dem Signalweg gekoppelt ist, wodurch nach dem Kontaktieren der Analyt mit der molekularen Bindungsschicht in Wechselwirkung tritt;

Bei einer Ausführungsform der Erfindung dient das Verfahren zum Detektieren eines molekularen Bindungsereignisses und enthält die Schritte der Bereitstellung eines Signalwegs und einer molekularen Bindungsschicht, die entlang dem Signalweg ausgebildet ist. Ein Testsignal wird den Signalweg entlang übertragen und koppelt sich an die molekulare Bindungsschicht. Als Reaktion auf die Kopplung gibt das Signal eine Antwort, die sowohl für das molekulare Bindungsereignis als auch für die molekulare Bindungsschicht selbst bezeichnend ist.
Bei einer zweiten Ausführungsform der Erfindung dient das Verfahren zur Bestimmung der Klassifizierung eines unbekannten Liganden. Das Verfahren weist den Schritt der Bereitstellung eines Signalwegs, der mit einer ersten molekularen Bindungsschicht mit N entsprechenden Antiliganden zur Bindung an N entsprechende Liganden-Substrukturen gekoppelt ist. Danach wird eine Lösung, die eine Anzahl unbekannter Liganden enthält, auf die molekulare Bindungsschicht aufgebracht. Als Reaktion wird eine zweite molekulare Bindungsschicht entlang dem Signalweg gebildet, wobei die zweite molekulare Bindungsschicht N Liganden enthält. N ent sprechende Testsignale werden an die N entsprechenden Liganden übertragen. N bekannte Signalantworten, die eine bekannte Liganden-Klassifizierung definieren, werden bereitgestellt. Zuletzt koppelt sich jedes der Testsignale an die N Ligand-/Antiligand-Komplexe und gibt als Reaktion N entsprechende gemessene Antworten, die für das Vorhandensein jeder der N Substrukturen bezeichnend sind, so dass dann, wenn eine vorgegebene Anzahl der N bekannten Signalantworten mit einem vordefinierten Bereich mit den N gemessenen Antworten korreliert, bestimmt wird, dass sich der Ligand innerhalb der bekannten Klassifizierung befindet.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Untersuchen der Wechselwirkung zwischen einem Analyten und seiner Umgebung bereit, umfassend:
einen Signalweg, wobei der Signalweg (a) einen Wellenleiter oder (b) eine Übertragungsleitung (120), ein Grundelement (130) und eine dielektrische Schicht (158) aufweist, die zwischen der Übertragungsleitung und dem Grundelement angeordnet ist, wobei der Signalweg so gestaltet ist, dass elektromagnetische Signale mit einer oder mehreren Frequenzen im Bereich von 10 MHz bis 1000 GHz übertragen werden;
eine molekulare Bindungsschicht (156), die elektromagnetisch mit dem Signalweg gekoppelt ist;
eine Signalquelle (110) zum Übertragen eines ersten Testsignals im Bereich von 10 MHz bis 1000 GHz entlang dem Signalweg, wodurch das Testsignal elektromagnetisch mit der molekularen Bindungsschicht gekoppelt wird; und
einen Detektor (160) zum Detektieren eines ersten modulierten Signals, das während der Wechselwirkung des ersten Testsignals mit der molekularen Bindungsschicht erhalten wird.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung kann die Vorrichtung (gemäß Anspruch 25) unter Verwendung eines Testsignals zum Detektieren einer oder mehrerer zur molekularen Bindungsschicht gehörigen Eigenschaften, wie das Vorhandensein eines Liganden, verwendet werden. Die Vorrichtung enthält einen Signalweg mit einem ersten Anschluss und einem zweiten Anschluss zur Übertragung des Testsignals sowie mit einer kontinuierlichen leitfähigen Zone dazwischen. Die molekulare Bindungs schicht kann einen Liganden enthalten, der mit dem Signalweg gekoppelt ist. Die Bio-Analyse-Vorrichtung kann ferner eine mit der molekularen Bindungsschicht gekoppelte Lösung enthalten, die den Liganden zur molekularen Bindungsschicht transportieren kann.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein System zum Detektieren eines molekularen Bindungsereignisses präsentiert. Das System enthält eine Signalquelle zum Absetzen eines Testsignals, eine mit der Signalquelle gekoppelte Vorrichtung gemäß Anspruch 27 und einen zweiten mit der Vorrichtung gekoppelten Detektor. Die Vorrichtung enthält einen Signalweg und eine erste molekulare Bindungsschicht, die einen Liganden oder Antiliganden enthalten kann, und die mit einer Lösung und dem Signalweg gekoppelt sein kann. Das Testsignal wandert den Signalweg entlang, der in der gesamten Zone der molekularen Bindungsschicht kontinuierlich ist, koppelt sich an die molekulare Bindungsschicht an und weist als Reaktion eine Signalantwort auf, die das Vorhandensein des molekularen Bindungsereignisses angibt.
Die Art und die Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der nachfolgenden Zeichnungen und der detaillierten Beschreibung noch deutlicher.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A zeigt eine Ausführungsform des Bio-Analyse-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung.
1B zeigt eine zweite Ausführungsform des Bio-Analyse-Systems gemäß der vorliegenden Erfindung.
1C ist eine Schnittansicht des in 1B dargestellten Bio-Analyse-Systems.
1D zeigt eine Ausführungsform einer molekularen Bindungsschicht gemäß der vorliegenden Erfindung.
1E zeigt eine Ausführungsform einer molekularen Bindungsschicht mit mehreren räumlich getrennten Antiliganden gemäß der vorliegenden Erfindung.
1F zeigt eine Ausführungsform einer molekularen Bindungsschicht mit mehreren Klassen Antiliganden gemäß der vorliegenden Erfindung.
1G zeigt eine eine oder mehrere Zellen aufweisende molekulare Bindungsschicht gemäß der vorliegenden Erfindung.
1H zeigt eine molekulare Bindungsschicht mit Zellmembranen und zu Membranen gehörigen Strukturen gemäß der vorliegenden Erfindung.
2A zeigt eine Ausführungsform der Bio-Analyse-Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
2B zeigt eine zweite Ausführungsform der Bio-Analyse-Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
3 zeigt eine Ausführungsform der Oberflächen-Bindungschemie, die entlang der leitfähigen Schicht der bioelektrischen Grenzfläche vorliegt.
4A zeigt eine Ausführungsform eines Ersatzschaltungsmodells für die in 2A dargestellte bioelektrische Grenzflächenstruktur.
4B zeigt eine Ausführungsform einer Schaltung entsprechend des in 4A dargestellten Ersatzschaltungsmodells.
4C zeigt eine Ausführungsform eines Ersatzschaltungsmodells für die in 2B dargestellte bioelektrische Grenzflächenstruktur.
4D zeigt eine Ausführungsform einer Schaltung entsprechend des in 4C dargestellten Ersatzschaltungsmodells.
5A–5G zeigen spezifische Ausführungsformen der in einer Zweileiter-Schaltungstopologie gemäß der vorliegenden Erfindung implementierten bioelektrischen Grenzfläche.
6A zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Detektieren molekularer Bindungsereignisse gemäß der vorliegenden Erfindung.
6B zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Detektieren sekundärer molekularer Bindungsereignisse und molekularer Bindungsereignisse höherer Ordnung gemäß der vorliegenden Erfindung.
6C zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Messen dielektrischer Änderungen der molekularen Bindungsschicht gemäß der vorliegenden Erfindung.
6D zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Identifizieren eines Liganden in einer unbekannten Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung.
6E zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Identifizieren der Klasse eines Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung.
6F zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Quantifizieren der Ligandenkonzentration einer Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung.
6G zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Bereitstellen einer Selbstdiagnosefunktion der Bio-Analyse-Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung.
7A zeigt eine Ausführungsform eines Computersystems zur Ausführung eines Software-Programms, das zur Durchführung jedes der in den 6A bis 6G dargestellten Verfahrens konzipiert ist.
7B zeigt ein vereinfachtes Systemblockdiagramm eines typischen Computersystems, das zur Ausführung eines das beschriebene Verfahren enthaltenden Software-Programms verwendet wird.
8A zeigt eine Ausführungsform eines Frequenzmesssystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
8B zeigt einen ersten gemessenen Frequenzgang, der zum Detektieren oder Identifizieren einer molekularen Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung herangezogen werden kann.
8C zeigt einen zweiten gemessenen Frequenzgang, der zum Detektieren oder Identifizieren einer molekularen Struktur gemäß der vorliegenden Erfindung herangezogen werden kann.
9 zeigt eine zweite Ausführungsform eines Frequenzmesssystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
10 zeigt eine Ausführungsform eines Zeitbereichsmesssystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
11 zeigt eines Ausführungsform eines Messsystems für die dielektrische Relaxation gemäß der vorliegenden Erfindung.
12A–12B zeigen die Messungen des Rückführungsverlustes bzw. des Übertragungsverlustes der primären Bindung von Urease an eine ITO-Oberfläche.
12C und 12D zeigen die Messungen des Übertragungsverlustes der primären Bindungseffekte von Kollagenase und Lysozym.
12E zeigt die Übertragungsverlustantwort von gebundenem und nicht gebundenem Dextran.
12F zeigt die Antwort von nicht an Glucose und an Glucose gebundenem ConA.
12G zeigt den Übertragungsverlust von Biotin/Avidin relativ zur Avidinantwort.
12H zeigt die Ergebnisse einer Wettbewerbstitration zwischen Dextran und Glucose.
12I den Rückführungsverlust von ConA in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration bei Resonanz.
12J zeigt den Übertragungsverlust von DNS-/Polysin-Komplexen relativ zur Polysin-Antwort.
12K zeigt die Änderung der Übertragungsverlustantwort in Abhängigkeit vom pH-Wert für eine Reihe Puffer bei 100 MHz, 1 GHz und 10 GHz.
12L zeigt die Änderung der Übertragungsverlustantwort in Abhängigkeit von der Ionenkonzentration für eine Reihe Puffer bei 100 MHz, 1 GHz und 10 GHz.
12M zeigt die Übertragungsverlustantwort für bei 1 GHz untersuchten 10 Vollblutproben, die eine Anzeige der Detektionsfähigkeit in einer komplexen Umgebung liefert.
12N zeigt das Ergebnis der Avidinbindung, die die Quadrapolmomentdetektion angibt.
BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Inhaltsverzeichnis

I. Begriffsbestimmungen
II. Einführung A. Bio-Analyse-System B. Chemie des Systems
III. Die Bio-Analyse-Vorrichtung A. Aufbau der Vorrichtung B. Chemie der Bindungsoberfläche C. Bioelektrische Grenzfläche D. Spezifische Ausführungsformen
IV. Messmethodik A. Allgemeine Übersicht B. Detektieren molekularer Bindungsereignisse C. Detektieren von Änderungen der dielektrischen Eigenschaften D. Identifizieren molekularer Bindungsereignisse E. Identifizieren von Klassen gebundener molekularer Strukturen F. Quantifizieren von Konzentrationen G. Selbstkalibrierung der Bio-Analyse-Vorrichtung
V. Messsysteme A. Frequenzmesssystem B. Zeitbereichsmesssystem C. Messsystem für die dielektrische Relaxation
VI. Beispiele
VII. Anwendungen

I. Begriffsbestimmungen
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe biologische "Bindungspartner" oder "Ligand/Antiligand" oder "Ligand-/Antiligandkomplex" auf Moleküle, die andere Moleküle spezifisch erkennen (z. B. binden), um einen Bindungskomplex wie Antikörper-Antigen, Lektin-Kohlenwasserstoff, Nukleinsäure-Nukleinsäure, Biotin-Avidin etc. zu bilden. Biologische Bindungspartner brauchen nicht auf Paare einzelner Moleküle beschränkt zu sein. So kann beispielsweise ein einzelner Ligand durch die koordinierte Wirkung von zwei oder mehr "Antiliganden" gebunden werden.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe "Ligand" oder "Analyt" oder "Marker" auf jedes Molekül, das erkannt wird. Es wird durch seine Wechselwirkung mit einem Antiliganden erkannt, der den Liganden spezifisch oder unspezifisch bindet, oder durch die charakteristischen dielektrischen Eigenschaften des Liganden. Der Ligand wird allgemein als jedes Molekül definiert, für das ein anderes Molekül (d. h. ein Antiligand) vorhanden ist, das mit dem Liganden aufgrund der Erkennung eines Teils des Liganden eine spezifische oder unspezifische Bindung eingeht. Der Antiligand kann z. B. ein Antikörper sein und der Ligand ein Molekül wie ein Antigen, das eine spezifische Bindung mit dem Antikörper eingeht. In dem Fall, in dem der Antikörper an der Oberfläche gebunden und der Antikörper das erkannte Molekül ist, wird im Rahmen dieses Dokuments der Antikörper der Ligand und das Antigen der Antiligand. Der Ligand kann auch aus Zellen, Zellmembranen, Organellen und synthetischen Analogen derselben bestehen.
Geeignete Liganden für die Verwirklichung dieser Erfindung sind u. a. Antikörper (die einen Antikörper-/Epitop-Komplex bilden), Antigene, Nukleinsäuren (z. B. natürliche oder synthetische DNS, RNS, gDNS, cDNS, mRNS, tRNs etc.), Lektine, Zucker (die z. B. einen Lektin-/Zuckerkomplex bilden), Glykoproteine, Rezeptoren und ihre verwandten Liganden (z. B. Wachstumsfaktoren und ihre zugehörigen Rezeptoren, Zytokine und ihre zugehörigen Rezeptoren, signalisierende Rezeptoren etc.), kleine Moleküle wie Arneimittelkandidaten (entweder aus natürlichen Produkten oder aus synthetischen Analogen, die in kombinatorischen Bibliotheken entwickelt und gespeichert werden), Metaboliten, Arzneimittel, die Abusus unterliegen und ihre metabolischen Nebenprodukte, Kofaktoren wie Vitamine und andere natürlich und synthetisch vorkommende Verbindungen, Sauerstoff und andere Gase in physiologischen Fluiden, Zellen, zellularen Bestandteilen, Zellmembranen und zugehörigen Strukturen, andere natürliche Produkte in pflanzlichen und tierischen Quellen, andere teilweise oder vollständig synthetische Produkte und dgl.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Antiligand" auf ein Molekül, das ein anderes Molekül (d. h. einen Liganden) spezifisch oder unspezifisch bindet. Der Antiligand wird außerdem durch seine Wechselwirkung mit einem Liganden, mit dem er eine spezifische Bindung eingeht, oder durch seine eigenen dielektrischen Eigenschaften erkannt. Wie hierin verwendet wird der Antiligand normalerweise entweder allein oder als Element eines immobilisierten Bindungspaares auf der Oberfläche an der Oberfläche immobilisiert. Bei manchen Ausführungsformen kann der Antiligand aus den Molekülen im Signalweg oder auf der leitfähigen Oberfläche bestehen. Alternativ kann nach der Bindung eines Antiliganden an einen Liganden der resultierende Antiligand-/Ligandkomplex zum Zwecke der anschließenden Bindung als ein Antilgand betrachtet werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "spezifisch binden" in Zusammenhang mit einem Protein, Polypeptid, Nukleinsäure oder einem Rezeptor oder anderen hierin beschriebenen Bindungspartnern auf eine Bindungsreaktion, die ein Determinativum des verwandten interessierenden Liganden in einer heterogenen Population aus Proteinen und/oder anderen biologischen Substanzen ist. Unter vorgegebenen Bedingungen (z. B. Immunoassay-Bedingungen im Fall eines Antikörpers) geht der vorgegebene Ligand oder Antikörper mit seinem jeweiligen "Ziel" (z. B. geht ein Hormon eine spezifische Bindung mit seinem Rezeptor ein) eine Bindung ein und nicht in nennenswerter Menge mit anderen Proteinen in der Probe oder mit anderen Proteinen, mit denen der Ligand oder Antikörper in einem Organismus oder in einer aus einem Organismus abgeleiteten Probe in Kontakt kommen kann. In ähnlicher Weise können Nukleinsäuren unter vorgewählten Bedingungen aneinander hybridisieren.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe "getrennt", "gereinigt" oder "biologisch rein" auf Material, das größtenteils oder im Wesentlichen frei ist von Komponenten, die in seinem nativen Zustand zusammen mit ihm vorkommen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Nukleinsäure" auf ein Deoxyribonukleotid- oder Ribonukleotidpolymer in entweder Ein- oder Doppelstrangform, und sofern nicht anderweitig eingeschränkt, umfasst er bekannte Analoge natürlicher Nukleotide, die in ähnlicher Weise wirken können wie natürlich vorkommende Nukleotide.
Die Begriffe "Polypeptide", "Peptide" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer von Aminosäureresten. Die Begriffe gelten für Aminosäurenpolymere, bei denen ein oder mehrere Aminosäurenreste künstliche chemische Analoge einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure sind, sowie für natürlich vorkommende Aminosäurenpolymere.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Antikörper" auf ein Protein, das aus einem oder mehreren Polypeptiden besteht, die im Wesentlichen durch Immunoglobulingene oder Fragmente von Immunoglobulingenen codiert sind. Die erkannten Immunoglobulingene enthalten die Kappa-, Lambda-, Alpha-, Gamma-, Delta-, Epsilon- und My-Gene für die konstante Region sowie unzählige Immunoglobulingene für die variable Region. Leichte Ketten werden entweder als Kappa oder Lambda klassifiziert. Schwere Ketten werden als Gamma, My, Alpha, Delta oder Epsilon klassifiziert, wodurch wiederum die Immunoglobulinklassen IgG, IgM, IgA, IgD bzw. IgE definiert werden.
Von einer typischen Immunoglobulin(Antikörper)-Struktureinheit ist bekannt, dass sie ein Tetramer enthält. Jedes Tetramer besteht aus zwei identischen Paaren Polypeptideketten, wobei jedes Paar eine "leichte" (ca. 25 kD) und eine "schwere" Kette (ca. 50 – 70 kD) hat. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, die in erster Linie für die Antigenerkennung verantwortlich sind. Die Begriffe 'variable leichte (variable light) (VL)' und 'variable schwere (variable heavy (VH)' Kette beziehen sich auf diese leichten bzw. schweren Ketten.
Antikörper existieren als intakte Immunoglobuline oder als eine Anzahl gut charakterisierter Fragmente, die durch Aufschluss mit verschiedenen Peptidasen erzeugt werden. So schließt z. B. Pepsin einen Antikörper unter den Disulfidbrücken in der beweglichen Region auf, um F(ab)'₂ zu erzeugen, ein Dimer von Fab, das selbst eine durch eine Disulfidbindung mit VH-CH1 verbundene leichte Kette ist. Das F(ab)'₂ kann unter milden Bedingungen reduziert werden, um die Disulfidbrücke in der beweglichen Region zu lösen, wodurch das F(ab)'₂-Dimer zu einem Fab'-Monomer gewandelt wird. Das Fab'-Monomer ist im Wesentlichen ein Fab mit einem Teil der beweglichen Region (hinsichtlich einer ausführlicheren Beschreibung anderer Antikörperfragmente siehe Fundamental Immunology, W. E. Paul, Hrsg. Raven Press, N. Y. (1993)). Obwohl verschiedene Antikörperfragmente durch den Aufschluss eines intakten Antikörpers definiert werden, liegt es für den Fachmann auf der Hand, dass solche Fab'-Fragmente entweder chemisch oder durch Anwendung der rekombinanten DNS-Methodik de novo synthetisiert werden können. Der hierin verwendete Begriff 'Antikörper' schließt also auch Antikörperfragmente ein, die entweder durch eine Modifikation von Voll-Antikörpern erzeugt oder de novo durch Anwendung der rekombinanten DNS-Methodik synthetisiert werden. Bevorzugte Antikörper sind u. a. Antikörper aus einer Kette, bevorzugter Einketten-Fv-(scFv)-Antikörper, in denen eine variable schwere und eine variable leichte Kette miteinander verbunden sind (direkt oder über eine Peptidbrücke), um ein kontinuierliches Polypeptid zu bilden.
Eine einzelne Kette Fv ("scFv" oder "scFv") Polypeptid ist ein gleichwertig verknüpftes VH::VL-Heterodimer, das aus einer Nukleinsäure mit VH- und VL-Codierungssequenzen, die entweder direkt verbunden oder durch eine Peptidcodierende Brücke verbunden sind, ausgedrückt werden kann. Huston et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883. Eine Anzahl Strukturen zum Wandeln der natürlich aggregierten – aber chemisch getrennten leichten und schweren Polypeptidketten von einer Antikörper-V-Region zu einem scFv-Molekül faltet sich zu einer dreidimensionalen Struktur, die im Wesentlichen identisch mit der Antigenbindungsstelle ist. Siehe z. B. die U.S.-Patente Nr. 5,091,513; 5,123,405 und 4,956,778.
Eine "Antigenbindungsstelle" oder ein "Bindungsabschnitt" ist ein Teil eines Immunoglobulinmoleküls, das an der Antigenbindung beteiligt ist. Die Antigenbindungsstelle wird durch Aminosäurereste der N-terminalen variablen ("V") Regionen der schweren ("H") und leichten ("L") Ketten gebildet. Drei stark divergente Strecken innerhalb der V-Regionen der schweren und leichten Ketten werden als "hypervariable" Regionen bezeichnet, die zwischen besser geschützten flankierenden Strecken liegen, die als "Rahmenregionen" oder "FR" (framework regions) bekannt sind. Der Begriff "FR" bezieht sich also auf Aminosäuresequenzen, die natürlich zwischen und neben hypervariablen Regionen in Immunoglobulinen vorkommen. In einem Antikörpermolekül sind die drei hypervariablen Regionen einer leichten Kette und die drei hypervariablen Regionen einer schweren Kette relativ zueinander im dreidimensionalen Raum so angeordnet, dass sie eine Antigenbindungs-"Oberfläche" bilden. Diese Oberfläche vermittelt die Erkennung und Bindung des Zielantigens. Die drei hypervariablen Regionen jeder der schweren und leichten Ketten werden als "Komplementärbestimmungsregionen" oder "CDR's" (complementarity determining regions) bezeichnet und werden z. B. von Kabat et al. in Sequences of proteins of immunological interest, 4. Auflage, U.S. Dept. Health and Human Services, Public Health Services, Bethesda, MD (1987) charakterisiert.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Begriffe "immunologische Bindung" und "immunologische Bindungseigenschaften" auf die nicht gleichwertigen Wechselwirkungen des Typs, der zwischen einem Immunoglobulinmolekül und einem Antigen vorkommt, für das das Immunoglobulin spezifisch ist. Wie hierin verwendet ist eine biologische Probe eine Probe eines biologischen Gewebes oder Fluids, die im gesunden und/oder pathologischen Zustand auf den (die) interessierenden Analyten zu analysieren ist. Solche Proben sind u. a. Sputum amniotisches Fluid, Blut, Blutzellen z. B. weiße Zellen), Gewebeproben oder Kanülen-Biopsie-proben, Urin, peritoneales Fluid und pleurales Fluid oder Zellen davon. Biologische Proben können auch Schnitte von Geweben umfassen wie tiefgefrorene für histologische Zwecke entnommene Schnitte. Obwohl die Probe typischerweise einem menschlichen Patienten entnommen wird, können die Analysen auch zur Erkennung des (der) interessierenden Analyten in Proben von jedem Säugetier wie Hunden, Katzen, Schafen, Rindern und Schweinen angewendet werden. Die Probe kann wie erforderlich durch Verdünnung in einer geeigneten Pufferlösung vorbehandelt oder, falls gewünscht, konzentriert werden. Aus einer Anzahl wässriger Standard-Pufferlösungen mit einem Puffer aus verschiedenen Puffern wie Phosphat, Tris oder dgl., vorzugsweise mit einem physiologischen pH-Wert kann jede Pufferlösung verwendet werden.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Signalweg" auf ein Übertragungsmedium entlang der bioelektrischen Grenzfläche, das in der Lage ist, ein elektromagnetisches Signal mit jeder brauchbaren Frequenz einschließlich eines statischen Gleichspannungsfeldes zu führen. Eine nicht erschöpfende Liste von Signalwegen enthält leitfähige und dielektrische Wellenleiterstrukturen, Mehrtachleiter-Übertragungsmedien wie elektromagnetische Transversal-(transverse electromagnetic – TEM)-Übertragungsleitungen, Übertragungsleitungen mit drei oder mehr leitfähigen Elementen, die TE-, TM- oder TEM-Moden-Übertragung unterstützen wie Vierpol- oder Achtpolleitungen, gekoppelte Wellenleiter, Hohlraumresonatorstrukturen, die gekoppelt sein können oder nicht, andere nicht modale Struktren wie Drähte, gedruckte Schaltungen und andere verteilte Schaltungen sowie leitfähige Strukturen mit punktförmig verteilter Impedanz und dgl. Die Struktur des Signalweges kann die Signalebene, die Grundebene oder eine Kombination aus beiden Strukturen aufweisen. Typischerweise ist der Signalweg in einer Richtung ausgebildet, die nicht senkrecht zur Oberfläche der molekularen Bindungsschicht (molecular binding layer – MBL) verläuft. Bei Ausführungsformen, in denen der Signalweg aus einer leitfähigen Schicht oder Region besteht, erstreckt sich die leitfähige Region kontinuierlich über diesen Bereich. Bei Ausführungsformen mit einem nicht metallischen Signalweg d. h. mit einem dielektrischen Wellenleiter ist der Signalweg als der Weg definiert, der den geringsten Signalverlust oder eine Leitfähigkeit von über 3 mhos/m hat.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "molekulare Bindungsschicht" bzw. "MBL" auf eine Schicht mit mindestens einer molekularen Struktur (d. h. mit einem Analyten, Antiliganden oder einem Liganden-/Antiligandenpaar etc.), die mit dem Signalweg entlang der bioelektrischen Grenzfläche gekoppelt ist. Die molekulare Bindungsschicht kann aus einem oder mehreren Liganden, Antiliganden, Ligand-/Antiligandkomplexen, Kopplungsgruppen, Matrizen aus Polymeren und anderen Materialien oder anderen hierin beschriebenen molekularen Strukturen bestehen. Die molekulare Bindungsschicht kann ferner extrem divers sein und eine oder mehrere Komponenten einschließlich Matrixschichten und/oder Isolierschichten enthalten, die eine oder mehrere Verknüpfungsgruppen haben können. Die MBL ist mit dem Sig nalweg entweder über eine direkte oder indirekte physische Verbindung oder über eine elektromagnetische Kopplung gekoppelt, wenn der Ligand physisch vom Signalweg getrennt ist. Die MBL kann aus einer derivatisierten Oberfläche bestehen wie aus Thiol-Kopplungsgruppen, die Biotip-Metalleinheiten enthalten und dgl., die sämtlich der Standardpraxis im Stand der Technik entsprechen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Bindungsereignis" auf eine Wechselwirkung oder ein Zusammenwirken zwischen mindestens zwei molekularen Strukturen wie einem Liganden oder Antiliganden. Die Wechselwirkung kann auftreten, wenn zwei molekulare Strukturen in direktem oder indirektem physischen Kontakt stehen oder wenn die beiden Strukturen physisch getrennt, aber miteinander elektromagnetisch gekoppelt sind. Beispiele für interessierende Bindungsereignisse im medizinischen Zusammenhang sind u. a. Ligand/Rezeptor, Antigen/Antikörper, Enzym/Substrat, DNS/DNS, DNS/RNS, RNS/RNS, Nukleinsäure-Fehlpaarungen, komplementäre Nukleinsäuren und Nukleinsäure/Proteine. Alternativ kann der Begriff "Bindungsereignis" ein einzelnes Molekül oder eine einzelne molekulare Struktur betreffen wie hierin beschrieben, etwa einen Liganden oder einen Ligand-/Antiligandkomplex, die an den Signalweg gebunden ist. In diesem Fall ist der Signalweg die zweite molekulare Struktur.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Ligand-/Antiligandkomplex" auf den an den Antiliganden gebundenen Liganden. Die Bindung kann spezifisch oder unspezifisch sein und die Bindungen sind typischerweise gleichwertige Bindungen, Wasserstoffbindungen, immunologische Bindungen, Van der Waals-Kräfte oder andere Bindungstypen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Kopplung" auf den Energietransfer zwischen zwei Strukturen, entweder über eine direkte oder indirekte physische Verbindung oder über jede Form von Signalkopplung wie elektrostatische oder elektromagnetische Kopplung.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Testsignal" auf ein sich mit jeder brauchbaren Frequenz innerhalb des elektromagnetischen Spektrums ausbreitendes Signal. Die Frequenz des Testsignals liegt beispielsweise bei oder über 1 MHz, z. B. 5 MHz, 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 100 MHz, 500 MHz, 1 GHz, 5 GHz, 10 GHz, 30 GHz, 50 GHz, 100 GHz, 500 GHz, 1000 GHz und dazwischenliegende Frequenzen.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Enzym" auf ein Protein, das als Katalysator fungiert, um die Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion in anderen Verbindungen oder "Substraten" zu reduzieren, aber nicht das Endprodukt der Reaktion ist.
Wie hierin verwendet enthält der Begriff "Lösung" ein Material, in dem sich ein Ligand befindet. Eine nicht abschließende Liste von Lösungen umfasst Materialien in festem, flüssigem oder gasförmigem Zustand. Feste Lösungen können natürlich vorkommende oder synthetische Moleküle, einschließlich Carbohydrate, Proteine, Oligonukleotide, oder andererseits jedes organische polymere Material so wie Nylon, Rayon, Dacryon, Polypropylen, Teflon, Neopren, Delrin oder dergleichen umfassen. Flüssige Lösungen umfassen wässrige, organische oder andere primäre Komponenten, Gele, Gase oder Emulsionen. Beispielhafte Lösungen sind u. a. Zellulosen, Dextranderivate, eine wässrige Lösung von d-PBS, Tris-Puffer, deionisiertes Wasser, Blut, physiologischer Puffer, Zerebrospinalflüssigkeit, Urin, Speichel, Wasser, organische Lösungsmittel. Die Lösung im vorliegenden Zusammenhang betrifft ein Material, in dem der Ligand und/oder Antiligand auf die Bindungsoberfläche aufgebracht wird. Die Lösung enthält die zu analysierende Probe.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Kopplungsgruppe" bzw. "Koppler" auf chemische Strukturen, die zum Anhaften zweier beliebiger Komponenten an die Bio-Analyse-Vorrichtung verwendet werden. Die Kopplungsgruppen haben also einen ersten Abschnitt, der sich an eine Komponente bindet wie die leitfähige Oberfläche, und einen zweiten Bindungsabschnitt, der sich an eine andere Komponente wie die Matrix oder den Antiliganden bindet.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Bio-Analyse-Vorrichtung" auf eine Struktur, in der die molekulare Bindungsschicht ausgebildet wird. Die Bio-Analyse-Vorrichtung kann aus einer Oberfläche, einem vertieften Bereich oder einem hermetisch abgedichteten Gehäuse bestehen, die sämtlich jede beliebige Größe oder Form haben können.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Bio-Analyse-System" auf die oben beschriebene Bio-Analyse-Vorrichtung in Zusammenhang mit den erforderlichen Komponenten, um die Bio-Analyse-Vorrichtung elektromagnetisch zu untersuchen und zu detektieren. Diese Komponenten enthalten u. a. den (die) Signalweg(e), (ein) Substrat(e), elektronische Geräte wie Signalgeneratoren, Oszilloskope und Vektoranalysatoren, die zum Untersuchen und Detektieren von Signalen von der Bio-Analyse-Vorrichtung erforderlich sind, Mikrochips und Mikroprozessoren, die elektromagnetische Signale abtasten und detektieren sowie Daten analysieren können und dgl.
Wie hierin verwendet beziehen sich die Betriffe "resonant" oder "Resonanz" allgemein auf eine sich rasch ändernde dielektrische Antwort in Abhängigkeit von der Frequenz.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "bioelektrische Grenzfläche" auf eine Grenzflächenstruktur zwischen einem Signalweg für die Übertragung eines Testsignals und einer molekularen Bindungsschicht.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff "Matrix" oder "Bindungsmatrix" auf eine Materialschicht auf dem Bioanalyse-Chip, die als Abstandshalter oder zur Vergrößerung der vertügbaren Oberfläche zum Binden oder zum Optimieren der Ausrichtung der Moleküle zur besseren Bindung dient, oder um jede andere Bindungseigenschaft zu verstärken, um die Bio-Analyse-Vorrichtung zu optimieren. Die Matrixschicht kann aus Kohlehydraten wie Dextran, Polyaminosäuren, vernetzten und nicht vernetzten Proteinen und dgl. bestehen.
II. Einführung
A. Das Bio-Analyse-System
Die vorliegende Erfindung macht sich die Beobachtung zunutze, dass eine sehr große Anzahl Moleküle auf Basis der unverwechselbaren dielektrischen Eigenschaften, die die meisten Moleküle aufweisen, unterschieden werden kann. Diese unterscheidbaren dielektrischen Eigenschaften können beobachtet werden, indem ein Signal mit der gebundenen molekularen Struktur gekoppelt wird. Die unverwechselbaren dielektrischen Eigenschaften modulieren das Signal, wodurch es eine unverwechselbare Signalantwort erhält. Die unverwechselbare Signalantwort kann dann zur Erkennung und Identifizierung der Liganden und anderer Moleküle, die die molekulare Bindungsschicht bilden, verwendet werden.
1A zeigt eine Ausführungsform eines Bio-Analysesystems 100 gemäß der vorliegenden Erfindung. Das System 100 ist in einer Zweileiter-, Signalebene-, Grundebene-Schaltungstopologie dargestellt, die in einer Vielzahl Architekturen verwirklicht werden kann, einschließlich punktförmiger oder verteilter Elementschaltungen in Mikrostreifen-, Streifenleitungssystemen, koplanaren Wellenleiter- oder Koaxialsystemen. Außerdem ist es für den Fachmann klar, dass das System auf einfache Weise zu einem Einleiter-Wellenleitersystem oder einem Drei- oder Mehrleitersystem modifiziert werden kann.
Wie dargestellt enthält das System 100 eine Signalquelle 110, Übertragungsleitungen 120, eine Grundebene 130, eine Bio-Analyse-Vorrichtung 150 und einen Signaldetektor 160. Die dargestellte Ausführungsform zeigt zwei Übertragungsleitungen, obwohl bei alternativen Ausführungsformen eine einzige Übertragungsleitung mit der Bio-Analyse-Vorrichtung gekoppelt werden kann, oder in weiteren alternativen Ausführungsformen drei oder mehr Übertragungsleitungen mit der Bio-Analyse-Vorrichtung gekoppelt werden können. Die Übertragungsleitungen 120 bestehen aus einem Material, das die Übertragung eines Signals über die gewünschte Betriebsfrequenz unterstützen kann. Die Übertragungsleitungen 120 sind als eine leitfähige Schicht z. B. Gold verwirklicht, die auf einem Substrat wie Aluminiumoxid, Diamant, Saphir, Polyimid oder Glas mittels herkömmlicher photolithographischer oder Halbleiterbearbeitungstechniken abgeschieden wird.
Das System 100 enthält ferner die mit den Übertragungsleitungen 120 gekoppelte Bio-Analyse-Vorrichtung 150. Die Bio-Analyse-Vorrichtung 150 enthält ein Aufnahmesubstrat 151, auf dem eine leitfähige Schicht 153 aufgebracht ist. Die leitfähige Schicht 153 bildet eine Grenzfläche zur Unterstützung der Übertragung eines Testsignals. Das Aufnahmesubstrat 151 kann aus jedem isolierenden Material wie Glas, Aluminiumoxid, Diamant, Saphir, Silizium, Galliumarsenid oder anderen in der Halbleiterverarbeitung verwendeten isolierenden Materialien bestehen.
Eine molekulare Bindungsschicht (MBL) 156 ist mit einem oder mehreren Bereichen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 gekoppelt. Für den Elektronik-Fachmann liegt es auf der Hand, dass die Kopplung entweder über eine direkte Verbindung zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 und der MBL 156 wie dargestellt oder alternativ über Signalkopplung erfolgen kann, die später beschrieben wird.
Die MBL 156 besteht vor allem aus einem oder mehreren Liganden, obwohl auch andere Moleküle und Strukturen enthalten sein können, wie hierin beschrieben wird. Die MBL 156 kann aus nur einer gebundenen Ligandenkombination bestehen, z. B. im Fall der primären Bindung, oder sie kann in den Fällen, in denen sekundäre oder Bindungsereignisse höherer Ordnung stattfinden, aus zwei, drei, vier, fünf oder mehr gebundenen Ligandenkombinationen bestehen. Mehrere Ligandenkombinationen können an verschiedenen Bindungsoberflächen 155 über die gesamte Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 vorliegen.
Bei der dargestellten Ausführungsform befindet sich das dielektrische Substrat 158 zwischen der Lösung 157 und der Grundebene 159. Bei der dargestellten Ausführungsform befinden sich die dielektrische Schicht 158 und die Grundebene 159 innerhalb der Bio-Analyse-Vorrichtung 150, obwohl eine oder beide bei alternativen Ausführungsformen auch extern angeordnet sein können. Außerdem kann die Anordnung aus der MBL 156 und der Lösung 157 alternativ umgekehrt vorgesehen und in Richtung der Grundebene oder auch in die Nähe der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 verschoben werden.
Das System 100 enthält eine Signalquelle 110, die das Testsignal auf die Übertragungsleitung 120 und in Richtung der Bio-Analyse-Vorrichtung 150 absetzt. Ein Signaldetektor 160 ist entlang dem Übertragungsweg positioniert, um das resultierende Signal (entweder reflektiert oder übertragen oder beides) zu erfassen. Wenn das Signal entlang der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 der Bio-Analyse-Vorrichtung 150 wandert, modulieren die dielektrischen Eigenschaften der MBL 156 das Testsignal. Das modulierte Signal kann dann regeneriert und zur Erkennung und Identifizierung der innerhalb der Bio-Analyse-Vorrichtung ablaufenden molekularen Bindungsereignisse herangezogen werden, wie später beschrieben wird.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung sind Detektion und Identifizierung eines Liganden, Antiligand-/Ligandkomplexes oder einer anderen hierin beschriebenen molekularen Struktur möglich, wenn diese physisch von der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 getrennt sind. Bei dieser Ausführungsform ist der Ligand von der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 getrennt, aber elektrisch oder elektromagnetisch mit dieser gekoppelt. Die Kopplung zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 und dem in Suspension befindlichen Liganden ändert die Antwort des entlang der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 wandernden Testsignals, wodurch ein Mittel zu seiner Erkennung und/oder Identifizierung bereitgestellt wird. Die maximale Trennung zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 und dem suspendierten Liganden wird von Faktoren wie der effektiven Dielektrizitätskonstante des Mediums zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 153 und dem Liganden, dem gesamten Kopplungsbereich, der Empfindlichkeit des Signaldetektors, der Konzentration der Liganden in der Lösung und der gewünschten Detektionszeit bestimmt. Die Trennabstände liegen typischer weise in der Größenordnung von 10^-1 m, 10^-2 m, 10^-3 m, 10^-4 m, 10^-5 m, 10^-6 m, 10^-7 m, 10^-8 m, 10^-9 m, 10^-10 m oder dazwischen.
Bei manchen Ausführungsformen wie bei zellbasierten Analysen kann die MBL über die Lösung elektromagnetisch mit dem Signalweg gekoppelt werden. Somit können Zellen und insbesondere Zellmembranen sowie membranbasierte Strukturen an das Signal ankoppeln.
1B zeigt eine zweite Ausführungsform des Bio-Analysesystems, das eine Anordnung aus Mikrostreifen-Resonanzkreisen 170 aufweist. Jeder Resonanzkreis 170 besteht aus einer Übertragungsleitung 172, die in einer offenen Blindleitung 176 endet. Für den Fachmann auf dem Gebiet des Schaltungsdesign versteht es sich, dass andere resonante Strukturen in punktförmiger Element-, verteilter Element- oder in einer Kombination aus beiden Schaltungstopologien verwendet werden können.
1C zeigt eine Schnittansicht eines Resonanzkreises 170. Die offene Blindleitung 176 bildet die bioelektrische Grenzfläche des Resonanzkreises 170 und ist der in 1A dargestellten bioelektrischen Grenzfläche sehr ähnlich. Insbesondere besteht die offene Blindleitung 176 aus einer Grenzflächen-Übertragungsleitung 176a, die auf einer dielektrischen Schicht 176b oberhalb der Grundebene 176c aufgebracht ist.
Bei dieser Ausführungsform ist die MBL 176d über eine direkte Verbindung mit der Übertragungsleitung 176a gekoppelt. Die MBL 176d kann entlang der Grenzflächen-Übertragungsleitung auf spezifische oder unspezifische Weise binden. Wie oben kann die betreffende molekulare Struktur an der Grenzflächen-Übertragungsleitung 176a hängen, aber mit dieser elektrisch oder elektromagnetisch gekoppelt sein, um Detektions- und Identifizierungsinformationen hinsichtlich eines Bindungsereignisses bereitrustellen.
Die Abmessungen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 176a werden von Aspekten wie der gewünschten Messzeit (ein größerer Bereich resultiert in einer schnelleren Detektionszeit), der gewünschten Resonanzfrequenz f_res, bestimmten Impedanzabstimmungsbedingungen, um eine höhere Leistung zu erzielen oder um Unterbrechungen zu verursachen, die die Bindungsereignisse herausstellen, und dem Prozess, nach dem die gesamte Anordnung hergestellt wird, beeinflusst. Wird beispielsweise herkömmliche Mikrowellen-Photolithographie angewendet, kann die Bindungsoberfläche bei Verwendung einer relativ dicken dielektrischen Schicht wie Aluminiumoxid, Diamant, Saphir, Duriod oder ein anderes herkömmliches Substratmaterial zwischen 10^-1 m² und 10^-6 m² betragen. Wird alternativ Halbleiterverarbeitung angewendet, kann die Bindungsoberfläche unter Verwendung einer relativ dünnen dielektrischen Schicht aus Silizium oder Galliumarsenid zwischen 10^-6 m² und 10^-12 m² betragen.
Unter Verwendung herkömmlicher Mikrowellen-Design-Techniken oder CAD-Werkzeuge wie Microwave Spice^TM, EEsof Touchstone^TM und Libra^TM können die Länge und Impedanz der Übertragungsleitung 172, die Abmessungen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 176a sowie die Dicke und die Dielektrizitätskonstante der dielektrischen Schicht 176b so gewählt werden, dass die Resonanzstruktur eine Resonanzsignalantwort am gewünschten Resonanzfrequenzpunkt f_res liefert. Der gewünschte Resonanzfrequenzpunkt f_res liegt typischerweise im Frequenzbereich, über den die interessierenden Moleküle eine dramatische Änderung ihrer dielektrischen Eigenschaften aufweisen, deren Messung ihre Detektion ermöglicht. Alternativ kann der Resonanzpunkt f_res als Mittelpunkt das gewünschten Testfrequenzbereichs definiert werden, um den weitesten Bereich der Signaldetektion zu ermöglichen. Bei der dargestellten Ausführungsform enthält die Resonanzfrequenz f_res 10 MHz, 20 MHz, 45 MHz, 100 MHz, 500 MHz, 1 GHz, 5 GHz, 10 GHz, 30 GHz, 50 GHz, 100 GHz, 500 GHz oder 1000 GHz oder dazwischen liegende Frequenzen.
Während der Messung wird die Lösung 176e über eine oder mehrere der offenen Blindleitungen 176 aufgebracht. Eine MBL 176d bildet sich, wenn sich ein oder mehr Moleküle in der Lösung an die Grenzflächen-Übertragungsleitung 176a binden. In diesem Fall verhalten sich die MBL 176d und die Lösung elektrisch als ein parasitärer Kreis, der später beschrieben wird, durch den der Resonanzfrequenzpunkt f_res über oder unter seinen ursprünglichen Resonanzfrequenzpunkt verschoben wird. Diese Resonanzverschiebung kann erkannt werden und dient als Anzeige für das Stattfinden eines molekularen Bindungsereignisses. Die Signalantwort kann auch über ein weites Spektrum abgefragt werden, um die Identität der gebunden molekularen Struktur zu bestätigen, wie nachstehend beschrieben wird. Jeder Resonanzkreis 170 kann so hergestellt werden, dass er verschiedene molekulare Strukturen bindet und jeder Resonanzkreis 170 kann adressierbar gemacht werden, wodurch gleichzeitig eine große Anzahl molekularer Strukturen innerhalb derselben Lösung detektiert und identifiziert werden kann. Bei einer alternativen Ausführungsform kann jeder Resonanzkreis 170 so konzipiert werden, dass er eine bestimmte Resonanzfrequenz aufweist, wobei in diesem Fall alle Resonanzkreise 170 über ein kontinuierliches Frequenzspektrum abgefragt werden können, um eine molekulare Bindung zu bestimmen.
B. Chemie des Systems
Die chemischen Vorgänge des Systems laufen im Allgemeinen innerhalb der Bio-Analyse-Vorrichtung und insbesondere entlang der leitfähigen Schicht (Grenzflächen-Übertragungsleitung in den 1A bis 1C) ab. Die leitfähige Schicht besteht aus Materialien, die ein leitfähige Morphologie haben, um die Übertragung des hochfrequenten Testsignals unterstützen zu können. Die leitfähige Oberfläche besteht aus Materialien mit geeigneter Leitfähigkeit über den gewünschten Testfrequenzbereich sowie mit guten molekularen Bindungseigenschaften wie oben beschrieben. Solche Materialien sind u. a. Gold, Indiumzinnoxid (ITO), Kupfer, Silber, Zink, Zinn, Antimon, Gallium, Kadmium, Chrom, Mangan, Kobalt, Iridium, Platin, Quecksilber, Titan, Aluminium, Blei, Eisen, Wolfram, Nickel, Tantal, Rhenium, Osmium, Thallium oder deren Legierungen. Die leitfähige Schicht kann auch aus Halbleitermaterialien mit entweder kristalliner oder amorpher Struktur bestehen, einschließlich chemisch dotiertem oder reinem Kohlenstoff, Silizium, Germanium, Galliumarsenid, Indium-Gallium-Arsenid oder dgl. Das leitfähige Material kann auch aus Polymeren bestehen, insbesondere solchen, die leitfähig sind wie Polyacetylen, Polythiophen und dgl. Die leitfähige Schicht kann je nach Erfordernis der Anwendung dick oder mehrere molekulare Schichten tief sein. Die leitfähige Schicht kann aus einer aufgedampften dünnen Metallschicht oder einer epitaxialen Schicht aus Galliumarsenid oder anderen Halbleitermaterialien bestehen, die durch Halbleiterbearbeitungstechniken leitfähig gemacht werden. Außerdem kann die leitfähige Schicht durch einen hinreichend bekannten Prozess derivatisiert werden; siehe z. B. Kumar et al. "Patterned Self-Assembled Monolayer and Mesoscale Phenomena", Accounts of Chemical Research, 28:219-226 (1995).
Die leitfähige Schicht wird außerdem aus Materialien mit einer solchen Morphologie hergestellt, die leitfähig ist, um die molekulare Bindung zu erleichtern. Liganden können direkt, indirekt durch andere molekulare Strukturen oder durch beide Konfigurationen Bindungen mit der leitfähigen Schicht eingehen. Der Bereich der Moleküle, die sich an die leitfähige Schicht binden können umfasst u. a. Proteine, Nukleinsäuren, kleine Moleküle, Saccharide, Lipide und andere interessierende Moleküle. An den chemischen Vorgängen kann nur eine einzige an der Oberfläche anhaftende Molekülspezies, eine ganze Reihe verschiedener an der Oberfläche anhaftender Spezies oder mehrere Bindungsereignisse zwischen Spezies direkt an der Oberfläche anliegender Spezies und interessierenden Liganden in der Lösung beteiligt sein.
Die am Anhaften eines Liganden an der leitfähigen Schicht beteiligte typische Chemie hängt im Allgemeinen von der Art des Liganden und jedem Antiliganden, an den sich dieser bindet, und von ihren Funktionen in der Analyse ab. Eine Liste möglicher Typen Wechselwirkungen, die an der Oberfläche stattfinden können enthält, ist aber nicht beschränkt auf: Wechselwirkungen Protein/Protein, Wechselwirkungen DNS/Protein, Wechselwirkungen RNS/Protein, Hybridisierung von Nukleinsäuren einschließlich einer Analyse des Basenpaars auf Fehlpaarung, Wechselwirkungen RNS/RNS, tRNA-Wechselwirkungen, Enzym-/Substratsysteme, Wechselwirkungen Antigen/Antikörper, Wechselwirkungen kleines Molekül/Protein, Wechselwirkungen Arzneimittel/Rezeptor, Wechselwirkungen Membran/Rezeptor, Konformationsänderungen bei Festphasen-Liganden, Wechselwirkungen Protein/Saccharid und Wechselwirkungen Lipid/Protein.
Die tatsächliche Oberflächenchemie kann bei einer der Ausführungsformen als primäre und sekundäre Bindung beschrieben werden. Zusätzliche Schichten mit molekularer Bindung können ebenfalls vorkommen. Die primäre Bindung betrifft das Anhaften eines Antiliganden an der leitfähigen Oberfläche, das durch die Hilfe eines Kopplungsmoleküls erfolgen kann. Die sekundäre Bindung betrifft die Bindung eines Liganden an einem Antiliganden, der ein anderes Molekül in der MBL sein, kann, oder direkt an der leitfähigen Oberfläche selbst. Typischerweise ist an der Bindung eine Flüssigphasen-Ligandenbindung an einem immobilisierten Festphasen-Liganden beteiligt. Eine primäre Bindung könnte beispielsweise das Anhaften eines spezifischen Antikörpers an der leitfähigen Schicht der Bio-Analyse-Vorrichtung sein, und eine sekundäre Bindung würde die Bindung eines spezifischen Antigens in einer Probenlösung an den Antikörper bedeuten. Alternativ kann die sekundäre Bindung das direkte Anhaften eines Proteins an der leitfähigen Oberfläche sein, z. B. wenn der Amin-Terminus eines Proteins direkt an einer leitfähigen Goldschicht anhaftet.
Die oben genannte Bindung resultiert in der Bildung einer molekularen Bindungsschicht (MBL) 180 entlang eines oder mehrerer Bereiche der leitfähigen Schicht, von der eine Ausführungsform in 1D dargestellt ist. Bei dieser Ausführungsform besteht die MBL 180 wahlweise aus einer ersten Kopplungsgruppe 181, einem Isolator 182, einer zweiten Kopplungsgruppe 183, einer Matrix 184, einer dritten Kopplungsgruppe 185, einer Antiligandschicht 186 und einer Ligandschicht 187.
Die erste Kopplungsgruppe 181 sorgt für das Anhaften der Isolierschicht 182 an der leitfähigen Schicht (nicht dargestellt). Die erste Kopplungsgruppe 181 besteht aus Molekülen wie Thiolen, Aminen, Amiden oder Metallen wie Chrom oder Titan. Die Isolierschicht 182 stellt eine Sperrschicht zwischen der leitfähigen Schicht und der MBL 180 und einer Lösung (nicht dargestellt) bereit. Die Isolierschicht 182 kann eine hermetisch dichte Sperrschicht bereitstellen, um eine strukturelle Verschlechterung der leitfähigen Schicht durch die Einwirkung der MBL und/oder der Lösung zu verhindern. Alternativ oder zusätzlich kann die Isolierschicht 182 aus einem elektrisch nicht leitfähigen Material bestehen, um den Fluss von Gleichstrom oder niederfrequenter Energie von der leitfähigen Schicht zur MBL und/oder Lösung zu verhindern, wodurch die Messung gestört werden würde. Die Isolierschicht kann Polyimid, Aluminiumoxid, Diamant, Saphir, nicht leitfähige Polymere, isolierende Halbleitermaterial wie Siliziumdioxid oder Galliumarsenid oder andere Materialien enthalten, die eine hermetische Abdichtung und/oder elektrisch isolierende Eigenschaften bereitstellen. Die Isolierschicht kann auch aus Luft oder einer anderen gasförmigen Substanz bestehen, wobei in diesem Fall auf die Kopplungsgruppe 181 verzichtet werden kann.
Die zweite Kopplungsgruppe 183 sorgt für das Anhaften der Isolierschicht 182 an der Matrix 184 und besteht aus den gleichen oder ähnlichen Molekülen wie die erste Kopplungsgruppe 181. Die Matrixschicht 184 kann aus einer Polymerschicht bestehen, aber wahlweise auch eine Kohlenhydrat-, Protein-, Polyaminosäureschicht oder dgl. sein. Die dritte Kopplungsgruppe 185 besteht aus Molekülen, die sich zum Anhaften der Matrixschicht am Antiliganden 186 eignen, und kann aus den gleichen oder ähnlichen Molekülen wie die erste und/oder zweite Kopplungsgruppe 181 bzw. 183 bestehen.
Der Antiligand 186 dient zum spezifischen oder unspezifischen Binden des Liganden 187 in der Lösung und/oder zum Messen der physikalischen Eigenschaften der Lösung, von denen einige z. B. die Temperatur, der pH-Wert, die ionische Stärke sind und dgl. Der Antiligand besteht aus einem Molekül oder einer molekularen Struktur, die sich spezifisch oder unspezifisch an den Liganden 187 bindet. In dem Fall z. B., in dem der Ligand ein Antigen ist, besteht der Antiligand 186 aus einem Antikörper. Der Ligand 187 besteht aus einem Molekül oder einer Struktur, die sich spezifisch oder unspezifisch an den Antiliganden 186 bindet.
Im Allgemeinen reicht die MBL für eine messbare Wechselwirkung wie hierin beschrieben mit einem elektromagnetischen Testsignal auf dem zugehörigen Signalweg aus. Somit kann im Wesentlichen jede MBL-Zusammensetzung, die variierende dielektrische Eigenschaften aufweist, analysiert werden. Bei den meisten Ausführungs formen liegt die Dicke der MBL im Bereich zwischen ca. 1 – 5 Å und 1 cm. Für einfache molekulare Bindungsereignisse liegt der Bereich im Allgemeinen zwischen ca. 10 Å und 10.000 Å, typischerweise zwischen 100 Å und 5000 Å oder zwischen 500 Å und 1000 Å. Bei größeren Wechselwirkungen (z.B. zellular) liegt die MBL zwischen 1 μm und 100 μm, vorzugsweise zwischen 5 μm und 50 μm. Durch Isolatoren, Matrizen und dgl. steigt diese Größe erheblich an.
Die Ausführungsform von 1D soll nicht alle möglichen MBL-Konfigurationen erschöpfend darstellen. Für den Fachmann versteht es sich, dass eine weite Vielfalt Kombinationen zur Bildung der MBL konzipiert werden kann, wie von den speziellen Anwendungen vorgeschrieben. So sind z. B. die erste, zweite und dritte Kopplungsgruppe 181, 183, 185, die Isolierschicht 182 und die Matrixschicht 186 nicht implementiert, und die MBL besteht aus dem Antiliganden 168 und dem Liganden 187. Als weitere Alternative kann auf die erste Kopplungsgruppe 182 und die Isolierschicht 182 verzichtet werden. Weitere alternative Ausführungsformen, bei denen eine oder mehr der beschriebenen Schichten entfallen oder zusätzliche Schichten hinzugefügt werden, sind für den Fachmann offensichtlich.
Die MBL kann außerdem aus heterogenen Molekülen bestehen, die je nach dem betreffenden Matrixformat räumlich gruppiert oder beliebig geschichtet oder verteilt sein können. So zeigt z. B. 1E eine Draufsicht einer MBL 180 mit vier verschiedenen Antiliganden 190, 191, 192 und 193, die räumlich getrennt sind. 1F zeigt eine MBL 180, in der vier verschiedene Antiliganden 190, 191, 192 und 193 über die gesamte MBL beliebig verteilt sind. 1G einer anderen Ausführungsform zeigt eine Schnittansicht, in der die MBL 180 Zellen 194 in einer Lösung 157 enthält, die mit dem Signalweg 153 gekoppelt ist. Bei einer anderen Ausführungsform befindet sich eine Zellmembran 195 mit membrangebundenen Strukturen (nicht dargestellt) in der mit dem Signalweg 153 gekoppelten Lösung 157. Die Schichten können z. B. Kopplungsgruppen, Matrizen, Antiliganden, Liganden und eine oder mehrere Isolierschichten enthalten. Bei manchen Ausführungsformen kann eine oder mehrere Membranen verwendet werden, wie z. B. solche, die den Ionentransport, die Größe oder La dungswahl steuern oder das Anhaften des Antiliganden oder einer anderen molekularen Struktur unterstützen.
In elektrischer Hinsicht weist die MBL unverwechselbare dielektrische Eigenschaften auf, die zum Teil auf die Struktur- und Konformationseigenschaften und deren Änderungen der gebundenen Moleküle sowohl isoliert als auch bei Vorhandensein von Umgebungsänderungen wie Bindungsereignisse, Änderungen des pH-Wertes, der ionischen Stärke und dgl. zurückzuführen sind. Die dielektrischen Eigenschaften der gebundenen molekularen Strukturen zusammen mit den lokalen Strukturen des lösenden Mediums (der Lösung) können auch auf Änderungen der intramolekularen und intermolekularen Bindungen aufgrund primärer Bindung oder Bindung höherer Ordnung und die Verschiebung des lösenden Mediums in der Nähe der leitfähigen Schicht zurückzuführen sein.
Sobald eine leitfähige Schicht bereitgestellt worden ist, wird der Fachmann auf die bekannte Fachliteratur für Biologie und Chemie zurückgreifen, um ein System zu wählen, mit dem er arbeiten kann. Eine allgemeine Einführung in biologische Systeme ist zu finden bei: Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al. Hrsg., Current Protocols, einem Gemeinschaftsunternehmen zwischen Greene Publishing Associated, Inc. und John Wiley & Sons, Inc. (ergänzt bis 1997) (Ausubel); Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, 4. Ausgabe, The Benjamin/Cummings Publishing CO., Menlo Park, CA; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2. Ausgabe, Garland Publishing, NY; The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rathway, NJ. Produktinformationen von Herstellern biologischer Reagenzien und experimenteller Ausrüstung bieten ebenfalls nützliche Informationen für die Analyse biologischer Systeme. Zu solchen Herstellern zählen z. B. SIGMA Chemical Company (St. Louis, MO), R&D-Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Aldrich Chemical Company (Wilwaukee, WI), GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz, Applied Biosystems (Foster City, CA) sowie zahlreiche andere gewerbliche Quellen, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind.
Biologische Proben können den Patienten unter Anwendung hinreichend bekannter Techniken wie Venenpunktion, Lumbalpunktion sowie aus Fluidproben wie Speichel oder Urin oder Gewebebiopsie und dgl. entnommen werden. Wird das biologische Material von nicht menschlichen Wesen wie kommerziell bedeutendem Vieh entnommen, lassen sich Blut- und Gewebeproben am einfachsten aus Vieh-Verarbeitungsbetrieben gewinnen. Auf ähnliche Weise kann bei der Erfindung verwendetes pflanzliches Material gut aus landwirtschaftlichen oder gartenbaulichen Quellen und anderen Quellen natürlicher Produkte gewonnen werden. Alternativ kann eine biologische Probe aus einer Zelle oder Blutbank kommen, wo Gewebe und/oder Blut gelagert werden, oder aus einer in vitro-Quelle wie einer Zellkultur. Techniken zum Anlegen von Zellkulturen zur Verwendung als Quelle für biologische Materialien sind dem Fachmann hinreichend bekannt. Bei Freshney, Culture of Animal Cells, a Manual of Basis Technique, 3. Ausgabe, Wiley-Liss, NY (1994) findet sich eine allgemeine Einführung in die Zellkultur.
Die vorliegende Erfindung kann mittels einer Reihe Ausführungsformen verwirklicht werden. Einige werden nachstehend detailliert beschrieben, weitere Ausführungsformen und Anwendungen finden sich am Abschnitt "Anwendungen".
Bei einer Ausführungsform wird die Erfindung zur Erkennung der Bindung einer molekularen Struktur an einen Signalweg angewendet. Bei dieser Ausführungsform wird ein Signal entlang dem Signalweg übertragen. Während seiner Übertragung koppelt es sich an die gebundene Struktur und wird moduliert. Die Analyse der modulierten Antwort zeigt die Bindung an.
Bei einer anderen Ausführungsform kann die Erfindung zum Identifizieren sekundärer Bindungen angewendet werden. Eine primäre Bindung kann beispielsweise ein Anhaften eines Antikörpers an der leitfähigen Oberfläche sein. Eine sekundäre Bindung könnte die Messung der Bindung zwischen dem immobilisierten Antikörper und seinem Antigen in der Lösung beeinhalten. Nachdem die primäre Bindung erkannt worden ist wie im vorigen Absatz beschrieben, wird die den Antikörper enthaltende Lösung zur Bio-Analyse-Vorrichtung hinzugefügt und die Antwort erneut gemessen. Die Antwort wird mit der Antwort der primären Bindung verglichen. Eine Änderung würde darauf hinweisen, dass ein Bindungsereignis stattgefunden hat.
Bei einem Aspekt kann die vorliegende Erfindung zum Identifizieren von Antiliganden z. B. Proteinen in der primären Bindungsphase angewendet werden. In der Kalibrierungsphase können die Antworten einer großen Anzahl bekannter Proteine bestimmt und gespeichert werden. Nach dem Anhaften eines unbekannten Proteins an die Analyse-Oberfläche könnten die dielektrischen Eigenschaften des Systems gemessen und die dielektrischen Eigenschaften des Signals zum Identifizieren des Proteins an der Oberfläche herangezogen werden. Da die Fingerabdruck-Antwort jedes Proteins gespeichert wird, kann die unbekannte Antwort mit den gespeicherten Antworten verglichen und die Mustererkennung zum Identifizieren des unbekannten Proteins verwendet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform kann die Erfindung in einem Matrix-Format angewendet werden. Die Vorrichtung hat mehrere adressierbare Stellen, wobei an jeder ein spezifischer Antiligand gebunden ist. Nach der Zufuhr von Lösung zur Vorrichtung werden die Bindungsantworten jeder Stelle gemessen und charakterisiert. Eine Vorrichtung dieses Typs kann zum Messen und/oder Identifizieren der Anwesenheit spezifischer Nukleinsäuresequenzen in einer Probe verwendet werden. An jeder der adressierbaren Stellen haftet eine unverwechselbare Nukleinsäuresequenz als der Antiligand. Nach dem Aussetzen an die Probe gehen komplementäre Sequenzen eine Bindung mit den entsprechenden Stellen ein. Die Antwort an jeder Stelle gibt an, ob eine Sequenz eine Bindung eingegangen ist. Eine solche Messung gibt auch an, ob die gebundene Sequenz eine perfekte Paarung mit der Antiligandensequenz ist, oder ob eine oder mehrere Fehlpaarungen vorliegen. Diese Ausführungsform kann auch zum Identifizieren von Proteinen und Proteinklassen angewendet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform kann die Erfindung zum Erzeugen einer Standard- oder Titrationskurve eingesetzt werden, die anschließend zur Bestimmung der unbekannten Konzentration eines bestimmten Analyten oder Liganden verwendet werden würde. Ein Antikörper beispielsweise könnte an der Vorrichtung anhaften. Die Vorrichtung könnte mehreren verschiedenen Konzentrationen des Liganden ausgesetzt und die Antwort für jede Konzentration gemessen werden. Eine solche Kurve ist dem Fachmann auch als Dosis-Antwort-Kurve bekannt. Eine unbekannte Probe kann der Vorrichtung ausgesetzt und die Antwort gemessen werden. Ihre Antwort kann mit der Standardkurve verglichen werden, um die Konzentration des Liganden in der unbekannten Probe zu bestimmen.
Bei einer anderen Ausführungsform kann die Erfindung zur internen Selbstkalibrierung auf Verluste aufgrund von Alterung und anderen Stabilitätsaspekten angewendet werden. Beispielsweise bei Antikörper-/Antigensystemen gestattet die Erfindung die Messung der Menge der aktiven Antikörpers an der Oberfläche durch Messen der primären Antwort, bevor die unbekannte Probe der Vorrichtung ausgesetzt wird. Der Wert der primären Antwort dient zum Einstellen der sekundären Antwort der Antigenbindung durch eine Konstante, die der Menge aktiver auf der Vorrichtung verbleibender Antikörper entspricht.
III. Die Bio-Analyse-Vorrichtung
A. Aufbau der Vorrichtung
Hinsichtlich ihrer Struktur enthält die Bio-Analyse-Vorrichtung einen Signalweg und eine bioelektrische Grenzfläche. Der Signalweg kann aus einem einzigen Eingangs- /Ausgangsanschluss, einem Eingangssignal-Anschlussweg und einem Ausgangssignal-Anschlussweg oder mehreren Eingangs- und/oder Ausgangssignal-Anschlusswegen bestehen. Der (die) Signalwege) kann (können) als eine Reihe verschiedener Architekturen verwirklicht werden, wie z. B. mit einer Übertragungsleitung oder einer Wellenleiterstruktur, die die Übertragung des Testsignals über den gewünschten Frequenzbereich unterstützt. Hinsichtlich möglicher Ausführungsformen siehe R. E. Collins Foundations for Microwave Engineering, McGraw-Hill Publishing Co., 1966; und S. March, Microwave Transmission Lines und Their Physical Realizations, Les Besser and Associates, Inc., 1986. Außerdem kann die Bio-Analyse-Vorrichtung in vielfältigen verschiedenen Konfigurationen verwirklicht werden. Zu den möglichen Konfigurationen zählen u. a. große bis miniaturisierte Strukturen mittels herkömmlicher Techniken, herkömmlichem Ätzen und Photolithographie oder Halbleiterbearbeitungstechniken.
2A zeigt eine Ausführungsform der Bio-Analyse-Vorrichtung im Schnitt. Die Bio-Analyse-Vorrichtung 230 besteht aus einer Deckplatte 231, Kontaktanschlüssen 237 und einer Bodenplatte 239. Die Deckplatte 231 enthält eine untere Oberfläche mit einer darauf aufgebrachten Grenzflächen-Übertragungsleitung 233. Das dielektrische Substrat 240 und die Grundebene 250 befinden sich außerhalb der Bio-Analyse-Vorrichtung. Die Deckplatte 231 und/oder das dielektrische Substrat 240 bestehen aus einem isolierenden Material wie Glas, das vorzugsweise für herkömmliche Photolithographie oder Gold-Sputtern, Ätzen oder Bearbeitung durch chemische Abscheidung aus der Dampfphase (chemical vapor deposition – CVD) geeignet ist. Andere Materialien wie Aluminiumoxid, Silizium, Galliumarsenid oder andere Isoliermaterialien können wahlweise verwendet werden.
Wie in 2A dargestellt steht die untere Oberfläche der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 in Kontakt mit der molekularen Bindungsschicht (MBL) 234. Wie dargestellt kann die MBL aus gebundenen molekularen Strukturen verschiedener Schichten oder Typen sowie aus molekularen Strukturen bestehen, die in der Lösung vorhanden sind. Bei alternativen Ausführungsformen kann sich die MBL 234 über kleine oder große Abschnitte der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 erstrecken und aus verschiedenen gebundenen molekularen Strukturen bestehe wie dargestellt. Die MBL kann nur aus Antiligand-/Ligandstrukturen oder aus vielfältigen Zwischenstrukturen von Kopplungsgruppe, Matrix und Isolierschichten bestehen, wie in 1D dargestellt ist. Sofern vorgesehen kann die Isolierschicht 182 (1D) aus Luft, Polyimid, Aluminiumoxid, Diamant, Saphir oder isolierendem Halbleitermaterial wie Siliziumdioxid oder Galliumarsenid oder zusätzlich zu anderen herkömmlichen Isoliermaterialien aus einem nicht leitfähigen Material bestehen. Die Dicke und die Dielektrizitätskonstante der Isolierschicht werden so gewählt, dass die MBL 234 und die Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 während der Signalübertragung eng gekoppelt sind. Die Dicke der Isolierschicht 182 kann 10^-1 m, 10^-2 m, 10^-3 m, 10^-4 m, 10^-5 m, 10^-6 m, 10^-7 m, 10^-8 m, 10^-9 m, 10^-10 m oder weniger betragen oder einen Wert dazwischen haben, was vom Ausmaß der erforderlichen Kopplung, der Dielektrizitätskonstante der Isolierschicht und der gesamten Kopplungsfläche abhängt. Die Kopplung kann durch eine Reihe verschiedener Konfigurationen einschließlich quer und versetzt gekoppelter Konfigurationen in Mehrschicht-, Koplanar- oder Wellenleiterschaltungstopologien verwirklicht werden. Die Implementierung einer Isolierschicht kann zur hermetischen Abdichtung der Grenzflächen-Übertragungsleitung gegenüber dem Lösungsmedium vorteilhaft sein und/oder um zu verhindern, dass Gleichstrom oder niederfrequenter Strom in die Lösung fließt, wodurch darin stattfindende molekulare Bindungsereignisse möglicherweise unterbrochen werden könnten.
Die Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 besteht aus einem Material, das die Signalübertragung unterstützen kann und das in der Lage ist, die MBL 234 zu binden. Das Material variiert je nach Aufbau der MBL, kann aber u. a. Gold, Indiumzinnoxid (ITO), Kupfer, Silber, Zink, Zinn, Antimon, Gallium, Kadmium, Chrom, Mangan, Kobalt, Iridium, Platin, Quecksilber, Titan, Aluminium, Blei, Eisen, Wolfram, Nickel, Tantal, Rhenium, Osmium, Thallium oder deren Legierungen sein. Wahlweise kann die Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 eine oder mehrere molekulare Strukturen (Antiliganden) (die einen Teil der MBL 234 bilden) enthalten, um Bindungen mit einem oder mehreren Zielmolekülen (Liganden) zu bilden. Das die Grenzflächen-Übertragungsleitung aufweisende Material kann auch so gewählt werden, dass es das Anhaften von Kopplungsgruppen sowie die Signalübertragung fördert. Andere Materialien, die zur Bildung der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 verwendet werden können, sind dem Fachmann hinreichend bekannt.
Die Liganden können mittels einer Lösung 260 wie z. B. der phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (d-PBS) von Dulbecco zur MBL 234 transportiert werden. Das Protein, die Nukleinsäure oder ein anderer interessierender Ligand kann mittels einer Vielzahl Techniken wie durch Dochtwirkung, Pipettieren, Tauchen, Tröpfeln, direkten Kontakt oder durch Kapillarwirkung aufgebracht werden.
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist die Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 so ausgelegt, dass sie einen niedrigen Signalverlust hat und hinsichtlich der Impedanz mit den externen Übertragungsleitungen 270 eng übereinstimmt. Ein niedriger Signalverlust wird erzielt, indem die Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 aus einem leitfähigen Material beispielsweise Gold, Kupfer, Aluminium, Indiumzinnoxid (ITO) oder anderen oben beschriebenen leitfähigen Materialien hergestellt wird. Eine enge Impedanzübereinstimmung wird erzielt, indem die Breite der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 bei etwa der Breite der externen Übertragungsleitungen 270 in Abhängigkeit von den relativen dielektrischen Eigenschaften des Substrats, der Lösung und der MBL festgelegt wird. Der Signaldurchgang zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 und den externen Übertragungsleitungen 270 wird über Kontaktanschlüsse 237 bereitgestellt. Wie oben erläutert können die MBL 234 und das Lösungsmedium 260 in der Nähe der Grundebene 250 angeordnet werden oder alternativ auch in der Nähe der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233.
Zusätzliche analoge und/oder digitale Schaltungen in punktförmiger Elementform, verteilter Form oder in einer Kombination aus beiden können an den Eingangs- und/oder Ausgangsanschlüssen der Bio-Analyse-Vorrichtung vorgesehen werden. Am Eingangsanschluss können beispielsweise Impedanzabgleichschaltungen und/oder Pufferverstärkerschaltungen vorgesehen werden. Alternativ oder zusätzlich können Impedanzabgleichschaltungen und ein oder mehrere Ausgangsverstärker implementiert werden, um das Ausgangssignal weiter zu verstärken. Für den Elektronikfachmann ist klar, dass in alternativen Ausführungsformen auch andere Typen Aufbereitungsschaltungen verwendet werden können.
2B zeigt eine zweite Ausführungsform der Bio-Analyse-Vorrichtung. Bei dieser Ausführungsform nimmt die Lösung einen Raum oberhalb der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 ein, die auf der oberen Oberfläche der Bodenplatte 239 ausgebildet ist. Die Oberseite der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 bildet die Bindungsoberfläche, an der die MBL 234 haftet. Die dielektrische Schicht 240 ist zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233 und der Grundebene 250 positioniert. Kontaktanschlüsse 237 stellen einen Signalweg zu den externen Übertragungsleitungen 270 bereit. Die Grenzflächen-Übertragungsleitung, die Deckplatte, die Bodenplatte, die Kontaktanschlüsse und die dielektrische Schicht können aus den Materialien und mit den Prozessen wie oben beschrieben hergestellt werden. Die MBL kann auch wie oben für 1D beschrieben oder in Variationen davon konfiguriert werden. Ferner können die MBL 234 und das Lösungsmedium 260 in der Nähe der Grundebene 250 angeordnet werden oder alternativ auch in der Nähe der Grenzflächen-Übertragungsleitung 233.
Weitere strukturelle Ausführungsformen enthalten Bio-Analyse-Vorrichtungen mit Mehrelement-Übertragungsleitungen, Wellenleitern und Hohlraumresonatoren, bei denen die MBL an einer oder mehreren der Leitungen oder Hohlraumelementen auf eine solche Weise haften kann, dass die Detektionsspezifität und die Empfindlichkeit verbessert werden. Beispiele für solche Strukturen sind u. a. parallel angeordnete Signalkombinierer, Hohlraumresonatoren oder Wellenleiter, denen entlang die gebundene MBL an einem Element die Signalübertragungseigenschaften im Vergleich zu einem anderen parallelen Element ohne die gebundene Struktur ändert und so die Modeneigenschaften des kombinierten Signals verändert, was in gut erkennbaren Ausgangseigenschaften resultiert. Diese letztgenannten Effekte machen sich hinreichend bekannte Techniken zur Messung der Frequenz, der Frequenzstabilität und sehr kleiner Frequenzänderungen mit ultrahoher Präzision zunutze.
B. Chemie der Bindungsoberfläche
3 zeigt eine Ausführungsform der chemischen Vorgänge der Bindungsoberfläche, die entlang der leitfähigen Schicht der bioelektrischen Grenzfläche ablaufen. Die bio elektrische Grenzfläche enthält ein Substrat 320, eine leitfähige Schicht 220, eine MBL 340 und eine Lösung 350. Das Substrat 320 kann aus jeder der hierin beschrieben dielektrischen Schicht- oder Substratmaterialien bestehen, einschließlich Aluminiumoxid, Diamant, Saphir, Glas und dgl. und kann für die leitfähige Schicht 230 eine tragende Auflagerung bieten. Bei einer alternativen Ausführungsform entfällt das Substrat 320 und die tragende Auflagerung wird über eine Isolierschicht 342 bereitgestellt.
Die leitfähige Schicht 330 besteht aus einem Material mit einer Morphologie, die die Signalübertragung über die gewünschten Frequenzen und die Bindung der MBL 340 fördert wie oben beschrieben. Bei einer Zweileiter-Schaltungstopologie kann die leitfähige Schicht 330 die Signalebene und die Grundebene aufweisen. In jedem Fall ist jedoch eine zweite leitfähige Schicht (entweder die Signalebene oder die Grundebene; nicht dargestellt) entweder unterhalb dem Substrat 230 (Anordnung nach 2B) angeordnet, oder mindestens eine Substratschicht wird aus der Lösung 350 entfernt (umgekehrte Anordnung von 2A). Alternativ können leitfähige Schichten an beiden dieser Ebenen angeordnet werden.
Die Lösung 350 ist mit der MBL 340 gekoppelt, um den Fluss von Liganden zur MBL 340 zu gestatten. Der Ligandenfluss von der Lösung 350 zur MBL 340 kann gerichtet oder nicht gerichtet sein. Die Lösung besteht aus einem beliebigen Transportmedium wie Gase, Materialien in Flüssig- oder Festphase, von denen z. B. einige wässriges d-PBS, Tris-Puffer, Phosphatpuffer und dgl. sind.
Die MBL ist entlang der bioelektrischen Grenzfläche zwischen zumindest einem Teil der Lösung und dem Signalweg so positioniert, dass sich die MBL entlang diesem Teil näher am Signalweg als an der Lösung befindet. Bei der Ausführungsform von 3 ist die MBL 340 zwischen der Lösung 350 und der leitfähigen Schicht 330 näher an letzterer positioniert. Bei einer Ausführungsform (in 2A dargestellt) befindet sich die Lösung zwischen der Signal- und der Grundebene. Bei einer zweiten Ausfüh rungsform (in 2B dargestellt) befindet sich die Lösung außerhalb der Region der Signal-Grundebene.
Die typische Chemie bei der Bindung der MBL an die leitfähige Oberfläche hängt im Allgemeinen von der Art und dem Inhalt der MBL sowie ihrer Funktion in der Analyse ab. Die MBL kann aus einem Liganden, einem Ligand-/Antiligandkomplex oder anderen hierin beschriebenen molekularen Strukturen bestehen. Der Ligand ist typischerweise funktional intakt, befindet sich so nah wie möglich an der Oberfläche und die Oberflächendichte des Antiliganden ist hinreichend hoch, um den größten dielektrischen Effekt zu bieten, aber nicht so hoch, dass sie die Bindungsfunktion beeinträchtigt, wie etwa durch sterische Behinderung oder durch die physische Blockierung der aktiven Bindungsstelle des immobilisierten Antiliganden durch benachbarte Moleküle.
Liganden können sich spezifisch oder unspezifisch entweder direkt mit der leitfähigen Schicht 320 oder über Zwischenstrukturen binden wie in 3 dargestellt. Werden spezifisch gebundene Liganden gewünscht, wird wahlweise eine Kopplungsgruppe verwendet, um die Bindung zu vereinfachen, z. B. um alle Proteine so zu binden, dass die leitfähige Schicht 320 der Lösung ausgesetzt ist. Um eine dicht gepackte Bindungsschicht sicherzustellen, können Thiolgruppen, Fab oder Proteine wie Protein A verwendet werden, um die Bindung von Antikörpern oder anderen Antiliganden entlang der leitfähigen Schicht 320 zu vereinfachen. Diese und ähnliche Substanzen können auf mehrere Arten auf die leitfähige Schicht 320 aufgebracht werden, u. a. durch Photolithographie, Halbleiterbearbeitung oder jede andere herkömmliche Auftragstechnik.
Außerdem können manche Liganden und Antiliganden zu Bindungen auf mehrere Arten in der Lage sein. Diese Liganden haben einen statistisch vorherrschenden Bindungsmodus oder können so manipuliert werden, dass sie Bindungen in ortsspezifischer Weise eingehen. Manche Antiliganden binden die Oberfläche optional in einer ortsspezifischen Weise. Ein Oligonukleotid kann beispielsweise an einen Terminus gebunden sein. Im Allgemeinen haftet der Antiligand auf eine solche Weise, dass die Funktion des Antiliganden nicht beeinträchtigt wird, z. B. vorzugsweise bei Konzentrationen, die die Oberflächendenaturierung minimieren.
Die Konzentration des Antiliganden an der Bindungsoberfläche variiert in Abhängigkeit vom jeweiligen Analyten. Typische Konzentrationen für Proteine sind z. B. 10⁷/cm², 10⁸/cm², 10⁹/cm², 10¹⁰/cm², 10¹¹/cm², 10¹²/cm², 10¹³/cm², 10¹⁴/cm², 10¹⁵/cm² oder Konzentrationen dazwischen. Typische Konzentrationen für Nukleinsäuren sind 10⁷/cm², 10⁸/cm², 10⁹/cm², 10¹⁰/cm², 10¹¹/cm², 10¹²/cm², 10¹³/cm², 10¹⁴/cm², 10¹⁵/cm², 10¹⁶/cm², 10¹⁷/cm², 10¹⁸/cm², 10¹⁹/cm², 10²⁰/cm² oder Konzentrationen dazwischen. Typische Konzentrationen für Analyten in Vollblut betragen 55 M, 25 M, 10 M, 1 M, 0,5 M, 10^-1 M, 10^-2 M, 10^-3 M, 10^-4 M, 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M, 10^-12 M, 10^-13 M, 10^-14 M, 10^-15 M, 10^-16 M, 10^-17 M, 10^-18 M oder Konzentrationen dazwischen.
An der MBL sollte eine ausreichende Menge Ligand haften, um die Übertragung eines Signals über die bioelektrische Grenzfläche zu ändern. Die Menge der an der Bindungsoberfläche anhaftenden Liganden kann 1, 10, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ oder mehr Liganden betragen oder jede Menge dazwischen, je nach Oberfläche der leitfähigen Schicht. Die Liganden brauchen nicht in vordefinierten Regionen entlang der leitfähigen Schicht aufgebracht zu werden, da die Signalantworten von den inhärenten dielektrischen Eigenschaften der MBL gegenüber der Anordnung auf der Bio-Analyse-Vorrichtung oder dem Chip bestimmt werden. Die MBL hat im Allgemeinen eine Oberflächendichte für kleinere Moleküle im Bereich von 10¹⁰ cm² bei 10²⁴ cm², typischerweise von 10¹⁵ cm² bei 10²⁰ cm². Die Dicke des Liganden kann nur eine Schicht betragen, aber 2, 3, 4, 5, 10 oder mehr Schichten werden wahlweise verwendet.
Sobald ein Ligand an die leitfähige Schicht gebunden ist, kommt die Chemie und/oder die strukturelle Biologie des Systems zum Tragen. Die dielektrischen Eigenschaften des Liganden ergeben eine Signalantwort, die charakteristisch für die gebundene(n) Strukturen) ist, wodurch die Detektion von Bindungsereignissen sowie von anderen interessierenden Eigenschaften in der Struktur ermöglicht wird. Die durch das Bindungsereignis bereitgestellte unverwechselbare Antwort hängt vom immobilisierten Antiliganden, seinem Zielliganden und der Neuanordnung der nahen Lösungsmoleküle (wie Wasser und freie Ionen) ab. Der Bereich der Moleküle, die sich an die Oberfläche binden können, enthält u. a. Proteine, Nukleinsäuren, kleine Moleküle, Saccharide, Lipide und andere Moleküle von Interesse.
Die Moleküle der MBL befinden sich typischerweise in einer Lösung, bei der es sich um eine wässrige Lösung aus Wasser, d-PBS, Tris, Blut, physiologischen Puffer, Zerebrospinalflüssigkeit, Urin, Schweiß, Speichel, anderen Körpersekreten, organischen Lösungsmitteln und dgl. handeln kann. Andere Lösungen können Gase, Emulsionen, Gele sowie organische und anorganische Verbindungen enthalten.
Die sekundäre Bindungsreaktion tritt an der MBL der Bio-Analyse-Vorrichtung auf. Ein Ligand in einer Lösung wird so über die Bio-Analyse-Vorrichtung transportiert, dass er mit dem Antiliganden der Bindungsschicht in Kontakt kommt. Die Konzentration des Liganden in der Lösung variiert und kann 10^-1 M, 10^-2 M, 10^-3 M, 10^-4 M, 10^-5 M, 10^-6 M, 10^-7 M, 10^-8 M, 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M, 10^-12 M, 10^-13 M, 10^-14 M, 10^-15 M, 10^-16 M, 10^-17 M, 10^-18 M, 10^-19 M, 10^-20 M betragen. Wenn eine Wechselwirkung wie eine Bindung zwischen dem Liganden und dem Antiliganden stattfindet, wird der Ligand dann optional Teil der Bindungsschicht, was durch die chemischen Gleichgewichtseigenschaften des Bindungsereignisses vorgegeben ist.
Die MBL enthält die gebundenen Liganden und kann auch Lösungsmoleküle enthalten. Bei den gebundenen Liganden kann es sich um beliebige Moleküle, einschließlich Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Nukleinsäuren und alle anderen hierin besprochenen Moleküle handeln. Die MBL kann ferner eine Kopplungsgruppe enthalten, um die Bindung des Antiliganden an der Bindungsoberflächenschicht zu unterstützen.
Außerdem ändert die Wechselwirkung des Antiliganden mit dem Liganden die charakteristische dielektrische Antwort der Bindungsschicht, wenn nur der Antiligand anhaftet. Ist z. B. der Antiligand A derjenige Antiligand, der die Bindungsschicht bildet, gibt die dielektrische Antwort eines entlang der Übertragungsleitung übertragenen Testsignals die charakteristischen Eigenschaften der Struktur des Antiliganden A wieder. Wenn der Ligand B mit dem Antiliganden A eine Bindung eingeht, ändern sich die Struktur und/oder die dielektrischen Eigenschaften der Bindungsschicht aufgrund der Bindung von A an B. Die Struktur von A kann sich ändern, wenn B sich an A bindet, wodurch eine andere Signalantwort bereitgestellt wird. Die Signaländerung aufgrund der Bindungswechselwirkung ist für die Bindung an A an B charakteristisch. Das Vorliegen einer Bindungswechselwirkung kann deshalb aus einer Signaländerung bestimmt werden.
Ferner können Informationen über den Typ der Bindung oder strukturelle und/oder Konformationsänderungen bei der Bindung erhalten werden, indem festgestellt wird, welche Teile der Signalantwort sich aufgrund der Wechselwirkung geändert haben. Der Ligand B wird optional bei der Bindung an den Antiliganden A durch die Signaländerung erkannt und identifiziert. Die Bindung des Liganden B an den Antiliganden A induziert eine Konformationsänderung oder andere Änderungen in der molekularen Struktur oder der umgebenden Lösung beim Antiliganden A und seiner Umgebung. Diese Änderungen ändern die dielektrischen Eigenschaften der MBL, wodurch die Signalantwort des über den Signalweg übertragenen Testsignals geändert wird. Die Änderung des Testsignals kann dazu dienen, das Bindungsereignis des Liganden B zu erkennen, und die Besonderheiten der Änderung können zum Identifizieren des Liganden B herangezogen werden. Insofern die Beziehung zwischen Struktur und Funktion des Moleküls bekannt ist, z. B. im Fall von Enzymen, Antikörpern, Rezeptoren und dgl., kann die Funktion des gebundenen Liganden aus seiner spektralen Identifizierung abgeleitet werden.
Bei einer Ausführungsform wird ein Antiligandtyp auf die Bindungsoberfläche aufgebracht, um eine MBL zu bilden und ein Ligand wird über die MBL aufgebracht, um ein Bindungsereignis zwischen den beiden Molekülen zu erkennen. Bei einer anderen Ausführungsform kann der Antiligand ein Gemisch sein und der über die Bindungs schicht aufgebrachte Ligand ein bekannter Analyt oder Antikörper. Durch die Detektion spezifischer Änderungen der Signalantwort kann der betreffende Ligand, der mit dem Antiliganden in Wechselwirkung steht, aufgrund von Konformations- und anderen Änderungen, die im Liganden oder Antiliganden induziert werden und der daraus resultierenden spektralen Empfindlichkeit bestimmt werden. Eine derartige Ausführungsform erfordert nicht die räumliche Trennung jedes der spezifischen Antiliganden, sondern leitet das gewünschte Maß an Spezifität eher aus der spektralen Empfindlichkeit ab, so dass eine gegebene Bindungswechselwirkung eher durch die Beobachtung der elektromagnetischen Antwort als durch Feststellen, an welchem Teil der Analyse des Bindungsereignis stattgefunden hat, bestimmt wird.
Bei einer anderen Ausführungsform kann der Antiligand ein bekanntes Molekül auf der Bindungsschicht sein und der Ligand wird als Gemisch aus Unbekannten z. B. als Vollblutprobe über der Bio-Analyse-Vorrichtung aufgebracht. In diesem Fall wird das Vorhandensein eines bestimmten Liganden wie eines Antikörpers im Blut durch das Vorhandensein oder Fehlen einer bestimmten Spitze oder eines bestimmten Signals im Spektrum erkannt, das aus dem Durchgang des Signals durch die Bio-Analyse-Vorrichtung resultiert. Alternativ kann es aufgrund der Änderungen im Spektrum des Antiliganden oder Liganden bei Bindung des Liganden erkannt werden. Eine derartige Ausführungsform erhöht die Spezifität der Detektion gegenüber der der Bindungschemie allein, da das Signal Informationen über die Art des Bindungsereignisses enthält. Somit kann eine spezifische Bindung von einer unspezifischen Bindung unterschieden werden und die Gesamt-Spezifität der Detektion kann gegenüber der Spezifität nur der Chemie deutlich verbessert werden.
Das durch die Verwendung der Bio-Analyse-Vorrichtung gebildete Detektionssystem stellt eine Detektionssystem mit hohem Durchsatz bereit, da die Detektion optional in Echtzeit erfolgt und zahlreiche Proben rasch analysiert werden können. Die Antwortperiode wird optional auf einer Nanosekunden-Zeitskala überwacht. Sobald die Moleküle aneinander gebunden sind, findet die Detektion statt. Zur Messung niedriger Konzentrationen oder von Bindungsereignissen zwischen Molekülen mit geringer Bin dungsaffinität ist optional eine längere Zeitdauer erforderlich. Die tatsächliche Zeitdauer wird optional durch Diffusionsraten begrenzt. Abgesehen von diesen potentiellen Einschränkungen können tausende Verbindungen optional sehr rasch vom System verarbeitet werden, z. B. in einer Stunde. Unter Anwendung von Chip-Fab-Technologien ist beispielsweise ein 10.000-Kanal-Gerät (unter Nutzung der sich entwickelnden Mikrofluidik-Technologien) möglich, und bei kleinen Volumina und somit kurzen Diffusionszeiten sowie mit kinetischen Messungen, die nur den Beginn der Reaktion messen, werden optional 10 Millionen Proben pro Stunde gemessen. Bei bekannten Konzentrationen wird die Bindungsaffinität optional allein aus der Kinetik berechnet und somit kann die Vorrichtung mit einer sehr schnellen Zeitskala abgetastet und die Affinität aus der Neigung der kinetischen Kurve berechnet und/oder geschätzt werden. Angaben zu Kinetik und Affinitäten finden sich in jedem Standardwerk über Biochemie oder Chemie, z. B. in Mathews und van Holde, Biochemistry, Benjamin Cummings, New York, 1990.
C. Bioelektrische Grenzfläche
Die bioelektrische Grenzfläche ist eine Struktur, entlang der die MBL und der Signalweg ausgebildet sind. Wie oben beschrieben kann der Signalweg aus einer leitfähigen oder dielektrischen Wellenleiterstruktur, einer Zweileiterstruktur wie eine herkömmliche Signal-/Grundebenen-Struktur oder Drei- oder Mehrleiterstrukturen bestehen, wie sie im Stand der Technik bekannt sind. Im Allgemeinen ist die Dicke der leitfähigen Region des Signalweges so ausgelegt, dass ein minimaler Signalverlust gegeben ist. So liegt z. B. die typische Dicke einer Übertragungsleitung aus Gold in der Größenordnung von 0,1 bis 1000 μm, vorzugsweise zwischen ca. 1 – 10 μm.
Der Signalweg wird entlang einer Richtung ausgeformt, die nicht senkrecht zur MBL verläuft. Bei einer Ausführungsform wird das Testsignal parallel zu einer Tangente an die Oberfläche, auf der die MBL ausgeformt ist, übertragen. Bei anderen Ausführungsformen kann das Testsignal unter einem Winkel von ±1°, ±2°, ±3°, ±4°, ±5°, ±10°, ±15°, ±20°, ±30°, ±40°, ±45°, ±50°, ±60°, ±70°, ±80° oder ±85° relativ zur MBL-Bindungsoberfläche oder unter beliebigen Werten dazwischen übertragen wer den. Bei einer ersten Ausführungsform besteht der Signalweg aus einer Übertragungsleitung in Zweileiterstruktur und die Richtung des Signalwegs wird durch den Poynting-Vektor definiert, was auf dem Gebiet der Elektromagnetik hinreichend bekannt ist. Bei einer zweiten Ausführungsform kann die Übertragungsleitung aus einer leitfähigen Region oder Schicht bestehen, die sich kontinuierlich entlang der bioelektrischen Grenzflächenregion erstreckt. Bei einer dritten Ausführungsform kann der Signalweg als der Weg definiert werden, der den geringsten Signalverlust entlang der bioelektrischen Grenzfläche über den gewünschten Betriebsfrequenzbereich hat. Bei einer vierten Ausführungsform kann der Signalweg als mit einer Wechselstrom-Leitfähigkeit von über 3 mhos/m definiert werden, d. h. mit einer Leitfähigkeit größer als die eine physiologischen Kochsalzlösung, die typischerweise über 5 mhos/m, aber im Idealfall im Bereich von 100 bis 1000 mhos/m und darüber beträgt.
Die Funktionsweise der bioelektrischen Grenzfläche wird anhand der Entwicklung eines Ersatzschaltungsmodells für die Grenzfläche näher erläutert. Die präsentierten Ersatzschaltungsmodelle sind in Zweileiter-Schaltungstopologie dargestellt, obwohl es für den Fachmall auf dem Gebiet des Schaltungsdesign auf der Hand liegt, dass jedes Modell in Einleiter-Wellenleitertopologien, Resonanzkreistopologien sowie in Schaltungstopologien mit drei oder mehr Leitern implementiert werden kann.
4A zeigt eine Ausführungsform eines Ersatzschaltungsmodells 420 für die in 2A dargestellte bioelektrische Grenzflächenstruktur. Für den Fachmann auf dem Gebiet des Schaltungsdesign liegt es auf der Hand, dass das dargestellte Schaltungsmodell nicht ausschließlich ist und dass andere Ersatzschaltungsmodelle von der bioelektrischen Grenzfläche gemäß 2A abgeleitet werden können.
Das dargestellte Ersatzschaltungsmodell enthält Reihenblöcke 422a, 424a und 426a, die die elektrischen Reiheneffekte der Grenzflächen-Übertragungsleitung 232, der MBL 234 bzw. der Lösung 260, die sämtlich in 2A dargestellt sind, modellieren. Die Grenzflächen-Übertragungsleitung, die BML und die Lösungs-Schaltungsblöcke 422a, 424a und 426a sind parallel gekoppelt, da die Grenzflächen- Übertragungsleitung, die MBL und die Lösung jeweils einen möglichen Signalweg in Längsrichtung entlang der Grenzfläche bereitstellen. Bei einer alternativen Ausführungsform, in der sich die MBL und die Lösung in der Nähe der Grundebene befinden, ist die Anordnung der Grenzflächen-Übertragungsleitung und der Grundebenen des Ersatzschaltungsmodells 420 umgekehrt. Bei den Ausführungsformen, in denen sich sowohl die MBL als auch die Lösung in der Nähe sowohl der Grenzflächen-Übertragungsleitung als auch der Grundebene befinden, stellt 2A die obere Hälfte der Ersatzschaltung dar, deren untere Hälfte (Grundebene) identisch ist, wenn die gleiche Lösung und MBL verwendet werden.
Das Ersatzschaltungsmodell 420 enthält ferner Nebenschluss-Schaltungsblöcke 422b, 424b und 426b, die jeweils die elektrischen Nebenschlusseffekte der in 2A dargestellten dielektrischen Schicht 240, der MBL 234 und der Lösung 260 modellieren. Die Reihenausrichtung der Nebenschluss-Blöcke 422b, 424b und 426b resultiert aus der physischen Anordnung jedes dieser Elemente, die in Reihe von der Grenzflächen-Übertragungsleitung über die MBL, die Lösung und die dielektrische Schicht zur Grundebene vorgesehen und in 2A dargestellt ist.
4B zeigt eine Ausführungsform einer Schaltung 430, die dem Ersatzschaltungsmodell von 4A entspricht. Dem Fachmann auf dem Gebiet des Schaltungsdesign ist selbstverständlich klar, dass andere Schaltungskonfigurationen möglich sind. Die Reihenschaltungsblöcke 422a, 424a und 426a bestehen jeweils aus einem Widerstand und einem in Reihe geschalteten Induktor. Die Nebenschluss-Schaltungsblöcke 422b, 424b und 426b bestehen jeweils aus einem Widerstand und einem parallel geschalteten Kondensator. Reihenwiderstände R_T, R_M, R_S modellieren jeweils den spezifischen Widerstand der Grenzflächen-Übertragungsleitung, der MBL und der Lösung. Nebenschlusswiderstände R_M', R_S', R_d modellieren jeweils den spezifischen Widerstand der MBL, der Lösung und der dielektrischen Schicht. Reihenindukturen L_T, L_M, L_S modellieren jeweils die Induktanz der Grenzflächen-Übertragungsleitung, der MBL und der Lösung. Nebenschlusskondensatoren C_M, C_S, C_d modellieren jeweils die Kapazitäten der MBL 234, der Lösung 260 und der dielektrischen Schicht 240. In ihrer Gesamtheit definieren die oben genannten Widerstände, Induktoren und Kondensatoren die Schaltung 430, die das Eingangssignal V_i in das Ausgangssignal V_o umwandelt.
Die dielektrischen Eigenschaften der MBL bestimmen weitgehend die Werte der Schaltungselemente entsprechend jeder dieser Schichten. Bei der in 4B dargestellten Ausführungsform definiert z. B. vor allem die Empfindlichkeit der MBL den Wert des Nebenschluss-Kondensators C_M. Ferner bestimmen die dispersiven Eigenschaften der MBL weitgehend den Wert des Nebenschluss-Widerstands R_M'. Die Werte von C_M und R_M' definieren die Signalantwort der bioelektrischen Grenzfläche in einem signifikanten Ausmaß. Die Signalantwort der bioelektrischen Grenzfläche ist also in hohem Maße charakteristisch für die dielektrischen Eigenschaften der MBL und kann dazu verwendet werden, molekulare Bindungsereignisse zu erkennen und zu identifizieren, wie nachstehend beschrieben wird.
Bei Ausführungsformen, bei denen die Lösung 260 eine wässrige Lösung ist, sind die damit einhergehenden dielektrischen Eigenschaften nachteilig für die Signalübertragung entlang der Grenzflächen-Übertragungsleitung. Speziell Wasser und andere ausgeprägt wässrige Lösungen wie Vollblut weisen einen relativ hohen Widerstand R_S und einen relativ niedrigen Widerstand R_S sowie adsorptive Eigenschaften bezüglich elektromagnetischer Strahlung in bestimmten Bereichen des Spektrums auf. Die Größe dieser Parameter resultiert in einem sehr hohen Signalverlust entlang der Grenzflächen-Übertragungsleitung. Die Lage der MBL zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung und der Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung dient zur Isolierung gegenüber dem Signal und der Lösung oder der Modulierung der Kopplung mit dem Signal und der Lösung, wodurch der Signalverlust moduliert wird und andere Parameter der Signalübertragung geändert werden.
4C zeigt eine Ausführungsform eines Ersatzschaltungsmodells 450 für die in 2B dargestellte bioelektrische Grenzflächenstruktur. Für den Fachmann auf dem Gebiet des Schaltungsdesign liegt es auf der Hand, dass das dargestellte Schaltungs modell nicht ausschließlich ist und dass andere Ersatzschaltungsmodelle von der bioelektrischen Grenzfläche gemäß 2B abgeleitet werden können.
Das dargestellte Ersatzschaltungsmodell 450 enthält Reihen- und Nebenschluss-Schaltungsblöcke 452a und 452b, die die Grenzflächen-Übertragungsleitung elektrisch modellieren. Das Ersatzschaltungsmodell 450 enthält auch einen MBL-Schaltungsblock 454, der in Reihe mit einem Lösungs-Schaltungsblock 456 gekoppelt ist, der die MBL und die Lösung elektrisch modelliert. Wie oben erläutert definiert die Ausrichtung der Reihen- und Nebenschluss-Schaltungsblöcke 452a und 452b eine herkömmliche Grenzflächen-Übertragungsleitungsstruktur. Außerdem resultiert die Reihenausrichtung der MBL- und Lösungs-Schaltungsblöcke 454 und 456 aus den von der Grenzflächen-Übertragungsleitung durch die MBL und in die Lösung verlaufenden Signalfeldlinien, deren Anordnung in 2B dargestellt ist. Alternative Schaltungsmodelle können wie oben beschrieben für Bio-Analyse-Vorrichtungen mit einer MBL und einer Lösung nahe der Grundebene alternativ oder zusätzlich zu ihrer Lage nahe der Grenzflächen-Übertragungsleitung abgeleitet werden.
4D zeigt eine Ausführungsform einer Schaltung 470, die dem Ersatzschaltungsmodell von 4C entspricht. Dem Fachmann auf dem Gebiet des Schaltungsdesign ist selbstverständlich klar, dass andere Schaltungskonfigurationen möglich sind. Die Reihen- und Nebenschlussschaltungsblöcke 452a und 452b repräsentieren zusammen das herkömmliche Modell für den Grenzflächen-Übertragungsleitung. Der MBL-Schaltungsblock 454 ist zwischen der Grenzflächen-Übertragungsleitung und dem Lösungs-Schaltungsblock gekoppelt und besteht bei einer Ausführungsform aus jeweils einem in Reihe geschalteten Kondensator C_M, Widerstand R_M und Induktor L_M. In ihrer Gesamtheit definieren die oben genannten Widerstände, Induktoren und Kondensatoren die Schaltung 470, die das Eingangssignal V_i in das Ausgangssignal V_o umwandelt.
Wie oben erläutert beeinflussen die dielektrischen Eigenschaften der MBL und der Lösung die Werte jedes der elektrischen Elemente. Insbesondere bestimmen die Empfindlichkeit und andere dielektrische Eigenschaften der MBL deutlich den Wert von C_M; die Dielektrizitätskonstante, andere dielektrische Eigenschaften und die Oberflächenmorphologie der MBL bestimmen deutlich den Wert von L_M; und die dispersiven Eigenschaften sowie die Leitfähigkeit und andere dielektrische Eigenschaften bestimmen deutlich den Wert von R_M. Die Signalantwort der bioelektrischen Grenzfläche ist also in hohem Maße charakteristisch für die dielektrischen Eigenschaften der MBL und kann zur Detektion und Identifizierung molekularer Bindungsereignisse herangezogen werden, was später beschrieben wird.
D. Spezifische Ausführungsformen
Die 5A bis 5G zeigen spezifische Ausführungsformen der bioelektrischen Grenzfläche, die in einer Zweileiter-Schaltungstopologie implementiert ist. Für den Fachmann auf dem Gebiet des Schaltungsdesign versteht es sich, dass jede davon in einer Einleiter-Wellenleitertopologie sowie in Drei- oder Mehrleiter-Schaltungstopologien implementiert werden kann.
Jede der Ausführungsformen besteht aus einer Signalebene 520, einer dielektrischen Schicht 530 und einer Grundebene 550. Eine MBL 515 und eine Lösung 510 sind entweder mit der Signalebene 520, mit der Grundebene 550 oder mit beiden gekoppelt. Bei jeder der Ausführungsformen kann die MBL 520 entweder in direktem Kontakt mit der Grenzflächen-Übertragungsleitung 530 stehen oder mit dieser gekoppelt sein. Wenn die Signalebene 520 die MBL 515 direkt berührt, besteht sie aus einem Material, das in der Lage ist, sowohl die Signalübertragung als auch das Anhaften von Liganden wie Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Enzyme und dgl. zu unterstützen. Solche Materialien sind u. a. Gold, ITO, Kupfer, Silber, Zink, Zinn, Antimon, Gallium, Kadmium, Chrom, Mangan, Kobalt, Iridium, Platin, Quecksilber, Titan, Aluminium, Blei, Eisen, Wolfram, Nickel, Tantal, Rhenium, Osmium, Thallium oder deren Legierungen. Für den Fachmann versteht es sich, dass auch andere Materialien verwendet werden können.
Die dielektrische Schicht 530 kann aus Luft, Polyimid, Teflon, Webmaterialien wie Duriod^TM, Aluminiumoxid, Diamant, Saphir oder isolierendem Halbleitermaterial wie Siliziumdioxid oder Galliumarsenid oder anderen Isoliermaterialien bestehen. Die Dicke und die Dielektrizitätskonstante der dielektrischen Schicht 530 werden so gewählt, dass die gewünschte Impedanz der Übertragungsleitung bereitgestellt wird, wie im Stand der Technik bekannt ist. Die Lösung 510 kann aus einem beliebigen Transportmedium wie der phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (d-PBS) von Dulbecco bestehen, das die betreffende molekulare Struktur bereitstellt. Das Protein, die Nukleinsäure oder ein anderer interessierender Ligand kann mittels einer Vielzahl Techniken wie durch Dochtwirkung, Pipettieren, Tauchen, Tröpfeln, direkten Kontakt oder durch Kapillarwirkung zur bioelektrischen Grenzfläche hinzugefügt werden.
Die 5A und 5B zeigen Schnittansichten der Grenzfläche, die in Mikrostreifen-Schaltungstechnologie verwirklicht ist, und bei der die Lösung 510 und die MBL 515 oberhalb bzw. unterhalb der Grenzflächen-Übertragungsleitung 530 positioniert sind. Die 5C und 5D zeigen Schnittansichten der Grenzfläche, wobei die Lösung 510 und die MBL 515 oberhalb bzw. unterhalb der Grundebene 550 positioniert sind.
5E zeigt eine Schnittansicht der in koplananer Wellenleitertopologie verwirklichten Grenzfläche. Bei dieser Ausführungsform sind die Lösung 510 und die MBL 515 oberhalb der Grenzflächen-Übertragungsleitung 530 positioniert. Alternativ können die Lösung 510 und die MBL 515 unterhalb der Grenzflächen-Übertragungsleitung 530 oder oberhalb oder unterhalb einer oder beider koplanarer Grundebenen 550 positioniert sein. 5F zeigt eine Schnittansicht der in Streifenleitungs-Schaltungstopologie verwirklichten Grenzfläche. Bei dieser Konfiguration sind die Lösung 510 und die MBL 515 oberhalb der Grenzflächen-Übertragungsleitung 530 positioniert. Bei anderen Ausführungsformen können diese Schichten alternativ oder zusätzlich unterhalb der Grenzflächen-Übertragungsleitung 530 oder oberhalb oder unterhalb einer oder beider Grundebenen 550 angeordnet werden.
5G zeigt eine Ausführungsform der bioelektrischen Grenzfläche, die in koaxialer Schaltungstopologie verwirklicht ist. Ein erster Isolator 530a mit einem Hohlraum 570 umschließt teilweise einen Grenzflächen-Mittelleiter 530. Die MBL 515 ist in der Nähe des unbedeckten Abschnitts des Grenzflächen-Mittelleiters 530 positioniert. Ein zweiter Isolator 530b ist zwischen dem äußeren Leiter 550 und dem ersten Isolator 530a vorgesehen und umschließt den äußeren Leiter 550, wodurch der Hohlraum 570 gebildet wird, in dem sich die Lösung 510 befindet. Die Radien und Dielektrizitätskonstanten des ersten und zweiten Isolators 530a und 530b können gleiche oder verschiedene Werte haben und jeder wird so gewählt, dass die gewünschte Leitungsimpedanz und die erforderliche Messempfindlichkeit über den Frequenzbereich des Testsignals bereitgestellt werden. Bei einer alternativen Ausführungsform befindet sich die MBL 515 in der Nähe des äußeren Leiters 550. Bei dieser Ausführungsform enthält der zweite Isolator 530b einen Hohlraum, damit sich die MBL in der Nähe des äußeren Leiters bilden kann, und der erste Isolator umschließt den Mittelleiter 320 vollständig. Ferner können sich die MBL 515 und die Lösung wahlweise außerhalb des äußeren Leiters 550 befinden.
Die bioelektrische Grenzfläche kann je nach Anwendung in vielfältigen Formen hergestellt werden, z. B. als Quadrate, Ellipsoide, Rechtecke, Dreiecke, Kreise oder Teile davon oder mit unregelmäßigen geometrischen Formen wie solchen, die in die Bohrung einer hypodermatischen Nadel passen. Die Größe der bioelektrischen Grenzfläche variiert je nach Anwendung und liegt in der Größenordnung von 10 m², 1 m², 10^-1 m², 10^-2 m², 10^-3 m², 10^-4 m², 10^-5 m², 10^-6 m², 10^-7 m², 10^-8 m², 10^-9 m², 10^-10 m²,10^-11 m², 10^-11 m², 10^-12 m² oder dazwischen. Die bioelektrische Grenzfläche kann so hergestellt werden, dass sie sogar in die kleine Bohrung einer Nadel passt. Die Grenzfläche kann alternativ modifiziert werden, um andere diagnostische Anwendungen wie Proteomik-Chips aufzunehmen. Größe und Form der bioelektrischen Grenzfläche müssen nur die Bedingung erfüllen, dass die Signalübertragung und die molekulare Bindung an ihr entlang stattfinden können.
IV. Messmethodik
A. Allgemeine Übersicht
Die Messmethodik der vorliegenden Erfindung macht sich die Beobachtung zunutze, dass eine große Anzahl Moleküle auf Basis ihrer unverwechselbaren dielektrischen Eigenschaften, zu denen Dispersionseffekte, Resonanzeffekte und Effekte auf die diese Moleküle umgebende Lösung zählen. Wenn sich bei der vorliegenden Erfindung ein Testsignal mit der MBL koppelt, findet eine Wechselwirkung der MBL mit der Energie des Testsignals statt, was in einer unverwechselbaren Signalantwort resultiert. Die unverwechselbare Signalantwort kann zur Erkennung und Identifizierung der die MBL bildenden Moleküle verwendet werden.
Der Fachmann weiß, dass die meisten Moleküle Änderungen der dielektrischen Eigenschaften über unterschiedliche Frequenzen aufweisen. Ein Molekül kann beispielsweise eine dramatische Änderung seiner dielektrischen Eigenschaften in Abhängigkeit der Frequenz in einer oder mehreren Regionen des elektromagnetischen Spektrums aufweisen. Das Frequenzband, über das das Molekül eine dramatische dielektrische Änderung aufweist, wird häufig als Dispersionsregime des Moleküls bezeichnet. Über diese Regime ändern sich die Dielektrizitätskonstante, die absolute Dielektrizitätskonstante, die Dipol- und/oder Mehrpol-Momente und die Empfindlichkeit des Moleküls in Abhängigkeit von der Frequenz dramatisch. Diese Größen sind häufig komplex mit realen und imaginären Anteilen, um sowohl die Größe als auch die Phasenänderungen in der Signalantwort zu berücksichtigen. Die Dispersionsregime erstrecken sich über verschiedene Frequenzen, einschließlich Hochfrequenz, Mikrowellen-, Millimeterwellen-, ferne Infrarot- und Infrarotfrequenzen.
Die dielektrischen Eigenschaften des Moleküls können durch Koppeln eines Testsignals mit dem Molekül und Beobachten des resultierenden Signals ermittelt werden. Wenn das Testsignal das Molekül bei einer Frequenz innerhalb des Dispersionsregimes des Moleküls anregt, insbesondere bei einer Resonanzfrequenz, findet eine starke Wechselwirkung des Moleküls mit dem Signal statt und das resultierende Signal weist dramatische Änderungen seiner gemessenen Amplitude und Phase auf, wodurch eine unverwechselbare Signalantwort erzeugt wird. Diese Antwort kann zum Erkennen und Identifizieren der gebundenen molekularen Struktur verwendet werden. Da außerdem die meisten Moleküle verschiedene Dispersionseigenschaften über das gleiche oder verschiedene Frequenzbänder aufweisen, erzeugt ein jedes eine eindeutige Signalantwort, die zum Erkennen und Identifizieren der molekularen Struktur verwendet werden kann.
Detektion und Identifizierung molekularer Bindungsereignisse können durch Erfassen und Messen der dielektrischen Eigenschaften auf molekularem Niveau erfolgen. Die dielektrischen Eigenschaften auf molekularem Niveau können durch die Multipolmomente des Moleküls definiert werden, deren Potentialenergie als infinite Reihe dargestellt werden, wie sie im Stand der Technik bekannt ist:
Die infinite Reihe besteht aus mehreren Termen, von denen ein jeder in unterschiedlichem Ausmaß die dielektrischen Eigenschaften bei Vorhandensein eines elektrischen, magnetischen oder elektromagnetischen Feldes beschreibt. Der erste Term wird als Monopolmoment bezeichnet und repräsentiert die skalare Größe der elektrostatischen Potentialenergie aus der Gesamtladung des Moleküls. Der zweite Term oder das "Dipolmoment" ist eine Vektorgröße und besteht aus drei Freiheitsgraden. Der dritte Term oder das "Quadropolment" ist ein Rang-2-Tensor und beschreibt die Antwort des Moleküls über neun Freiheitsgrade. Im Allgemeinen ist der N. Term ein Tensor mit Rang N-1 mit 3^N-1 Freiheitsgraden, obwohl die Gesamtzahl der Freiheitsgrade durch Symmetrien verringert werden kann. Es dürfte auf der Hand liegen, dass Momente höherer Ordnung mehr Details über die dielektrischen Eigenschaften des Moleküls bereitstellen und somit mehr über die unverwechselbare dielektrische Signatur des Moleküls preisgeben. Der Gradient des Potentials im elektrischen Feld resultiert in E = –∇Φ(x) Die Feldstärke der Momente höherer Ordnung fällt in Abhängigkeit von der Entfernung rasch ab, so dass ihre Beteiligung schwer zu messen ist. Beispielsweise fällt das Feld aufgrund des Dipolmoments als r^-3 und das Feld aufgrund des Quadropolmoments als r^-4 ab. Dieser Ansatz erfordert also eine enge Nachbarschaft zwischen den Bindungsmolekülen und dem Signalweg sowie einen geringen Signalverlust dazwischen. Da es häufig vorkommt, dass die Detektion molekularer Bindungsereignisse in stark signalabsorbierenden Lösungen wie Vollblutproben oder ionischen Lösungen erfolgt, wird der Signalverlust zwischen den Bindungsereignissen und dem Signalweg ziemlich hoch und die Detektion von Momenten höherer Ordnung ist sehr schwierig.
Außerdem ist jeder Multipolterm mit dem elektrischen Feld auf eine andere Weise gekoppelt. Dies lässt sich zunächst anhand der Energie eines gegebenen elektrostatischen Feldes zeigen: W = ∫p(x)Φ(x)d3x
Die Erweiterung des elektrostatischen Potentials in einer Taylor-Reihe ergibt
Ferner gilt für das externe Feld ∇·E = 0, so dass erhalten wird
Durch Wiedereinsetzen in die obige Gleichung für die Energie ergibt sich
Dies zeigt die Art der Wechselwirkung jedes Multipolterms mit dem abfragenden Feld: Die Gesamtladung q mit dem Potential, der Dipol p mit dem elektrischen Feld, der Quadropol Q_ij mit dem Gradienten des elektrischen Feldes usw. Dies zeigt die zweite Schwierigkeit bei der Detektion der Multipolmomente höherer Ordnung: In einer Massenprobe ist es schwierig, ausreichende Feldgradienten zur Kopplung mit Momenten höherer Ordnung zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung überwindet die oben genannten Hindernisse, indem sie die beschriebene bioelektrische Grenzfläche implementiert. Die Grenzfläche enthält eine MBL, die entlang dem Signalweg gekoppelt ist. Die MBL besteht aus einer sehr dünnen und (unter dielektrischen Gesichtspunkten) äußerst inhomogenen Schicht, so dass sie die erforderliche Nähe zur elektromagnetischen Abtaststruktur sowie ausreichende Feldgradienten zur Kopplung mit Multipolmomenten höherer Ordnung bereitstellt. Diese Eigenschaften ermöglichen die Detektion von Momenten höherer Ordnung, die eine deutlich verbesserte Sicht der dielektrischen Eigenschaften des Moleküls bieten. Die Positionierung der MBL in der Nähe der Signal- und/oder Grundebenen dient dazu, das darauf übertragene Signal zu trennen, so dass es nicht in der Lösung absorbiert wird, wodurch der Signalverlust verringert wird und höhere Testfrequenzen möglich werden, um die Bindungsereignisse genau zu erkennen und identifizieren. Auf diese Weise ermöglicht die vorliegenden Erfindung ein höheres Maß der Regenerierung der Signalantwort, einschließlich der Anteile vom Dipol- und anderen Multipolmomenten höherer Ordnung des Moleküls.
Unter Verwendung der beschriebenen Bio-Analyse-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung können zahlreiche zur MBL gehörige Eigenschaften erfasst werden. 6A zeigt eine Ausführungsform dieses Verfahrens. Zunächst wird in Schritt 602 eine MBL gebildet und entlang eines Abschnitts eines Signalwegs gekoppelt. Wie beschrieben kann die MBL aus einem Liganden, einem Antiligand-/Ligandkomplex etc. bestehen und kann in direktem oder indirektem physischen Kontakt mit dem Signalweg stehen oder elektromagnetisch mit diesem gekoppelt sein. Der Signalweg kann bei einer Zweileiter-Übertragungstopologie aus der Signal- oder Grundebene bestehen.
Dann wird in Schritt 604 ein Testsignal über den Signalweg übertragen. Das Testsignal kann jedes zeitlich variierende Signal bei jeder Frequenz zwischen 10 MHz und 1000 GHz sein, z. B. mit einer Signalfrequenz von 10 MHz oder mit einem Frequenzbereich von 45 MHz bis 20 GHz. Danach koppelt sich das Testsignal in Schritt 606 an die MBL und als Antwort auf die Kopplung erzeugt es eine Signalantwort. Die Signalantwort wird dann regeneriert und liefert Informationen über eine oder mehrere Eigenschaften der molekularen Bindungsschicht.
Die Bio-Analyse-Vorrichtung kann zur Bereitstellung von Informationen über zahlreiche Eigenschaften der MBL verwendet werden, z. B. zur Detektion und Identifizierung molekularer Bindungsereignisse, Ligandenkonzentrationen, Änderungen der dielektrischen Eigenschaften der MBL, Klassifizierung der erkannten Bindungsereignisse und dgl. Außerdem enthält die Bio-Analyse-Vorrichtung eine Selbstkalibrierungsfunktion, die für die Qualitätskontrolle und Gütesicherung am Einsatzort nützlich ist. Jedes dieser Verfahren und jede dieser Funktionen wird nachstehend detailliert beschrieben. Auf Basis der beschriebenen Verfahren und Strukturen werden sich für den Fachmann Modifikationen und zusätzliche Anwendungen ergeben.
Die Fähigkeit, molekulare Dipol-, Quadrupol- und Multipolmomente höherer Ordnung im gelösten Zustand zu erfassen und zu messen, stellt aus einer Reihe von Gründen einen deutlichen Fortschritt in der Technik dar. Erstens haben zahlreiche Moleküle, die in der Biomedizin von Interesse sind wie Proteine, sehr verschiedene Strukturen und deshalb verschiedene Multipolmomente. Durch die Identifizierung der Multipolmomente eines gegebenen Moleküls werden also unverwechselbare Eigenschaften dieses Moleküls erkennbar, was wiederum die Identifizierung dieses Moleküls gestat tet. Zweitens sind Struktur und Funktion in zahlreichen Molekülen von biomedizinischer Relevanz wie Proteine eng verwandt. Die Fähigkeit, Eigenschaften eine gegebenen Moleküls zu erkennen, die direkt mit der Funktion des Moleküls in Beziehung stehen, bedeutet also, dass die Funktionalität für ganze Aktivitätsbereiche überwacht werden kann. Drittens spielt die lokale physiologische Umgebung oft eine wichtige Rolle in Struktur und Funktion eines gegebenen Moleküls, so dass die Möglichkeit, die oben beschriebenen physikalischen Eigenschaften zu erkennen, bedeutet, dass Moleküle als Monitore und Sonden verwendet werden können, um Änderungen in einem gegebenen System zu messen. Mit der Fähigkeit, komplexe und informative Eigenschaften über molekulare und zellulare System in ein detektierbares elektronisches Datenformat zu übersetzen, ergeben sich in den hierin erörterten Gebieten völlig neue Möglichkeiten.
B. Detektieren molekularer Bindungsereignisse
Die hierin beschriebene Bio-Analyse-Vorrichtung ermöglicht die Detektion molekularer Bindungsereignisse, die entlang dem Signalweg stattfinden. Detektierbare Bindungsereignisse enthalten primäre, sekundäre Bindungsereignisse und solche höherer Ordnung. In einer bioelektrischen Zweileiter-Grenzfläche ohne vorher bestehende MBL z. B. werden die Moleküle der leitfähigen Schicht die Antiliganden zum Binden der Liganden bilden, wobei die Liganden die MBL bilden. Bei einer anderen Ausführungsform sind sowohl Antiligand als auch Ligand in der MBL enthalten. Bei dieser Ausführungsform haftet die MBL am Signalweg über Kopplungsgruppen, Matrix-Moleküle, Isolierschichten oder Kombinationen daraus wie in 1D dargestellt.
6A zeigt eine Ausführungsform dieses Prozesses. Zuerst wird in Schritt 602 ein Signalweg aus einem Material gebildet, das die Übertragung eines Signals über die gewünschte Betriebsfrequenz unterstützen kann. Der Signalweg kann aus einem Weg mit einem Anschluss, einem Weg mit zwei Anschlüssen oder einem Weg mir mehreren Anschlüssen innerhalb einer der hierin beschriebenen Bio-Analyse-Vorrichtungen bestehen. Außerdem kann der Signalweg als Übertragungsleitung, Hohlraumresonator oder Wellenleiterstruktur verwirklicht werden.
Danach wird in Schritt 604 eine Lösung bereitgestellt, die das betreffende Molekül oder die betreffende molekulare Struktur enthält. Ein Schritt 606 wird eine aus dem Liganden bestehende MBL aus der Lösung gebildet und zwischen zumindest einem Abschnitt des Signalwegs und der Lösung gekoppelt. Dann wird in Schritt 608 ein Testsignal entlang dem Signalweg übertragen. Alternativ kann das Testsignal während des Aufbringens der Lösung abgesetzt werden, um in Echtzeit die als Ergebnis der Bindungsereignisse auftretende Signalantwort zu beobachten. In Schritt 610 wandert das Signal über die MBL, koppelt sich an diese und entwickelt ein Signal, das das Vorhandensein des Liganden anzeigt. In den Schritten 612 und 614 wird dann das Testsignal regeneriert, dessen Antwort die Detektion des Liganden anzeigt.
Die dielektrischen Eigenschaften der MBL können dazu beitragen, eine beliebige Anzahl Signalantworten zu induzieren, von denen eine jede für eine molekulare Bindung repräsentativ sein kann. So können sich beispielsweise die dispersiven Eigenschaften der MBL über die Frequenz dramatisch ändern. In diesem Fall weist die Testsignalantwort große Änderungen der Amplitude und/oder der Phasenantwort über die Frequenz auf, wenn molekulare Bindungsereignisse entlang der Bindungsoberfläche stattfinden, wodurch ein Mittel zur Detektion molekularer Bindungsereignisse entlang der Bindungsoberfläche bereitgestellt wird.
Bei einer anderen Ausführungsform ändern sich die dielektrischen Relaxationseigenschaften der MBL in Abhängigkeit von der Impulsperiode des Eingangssignals. In diesem Fall zeigt die Testsignalantwort eine Änderung der absorbierten Leistung an oder eine Änderung eines anderen Parameters des Testsignals wie Phase oder Amplitude bei oder nahe einer bestimmten Impulsperiode. Durch die Beobachtung einer Änderung der absorbierten Leistung oder anderer Parameter können Bindungsereignisse entlang der Bindungsoberfläche detektiert werden. Andere Größen wie charakteristische Impedanzen, Ausbreitungsgeschwindigkeit, Amplitude, Phase, Dispersion, Verlust, absolute Dielektrizitätskonstante, Empfindlichkeit, Frequenz und Dielektrizitätskonstante sind ebenfalls mögliche Indikatoren für molekulare Bindungsereignisse.
Das oben beschriebene Verfahren kann zur Detektion einer primären Bindung eines Antiliganden oder Liganden direkt oder indirekt entlang der Bindungsoberfläche angewendet werden. In ähnlicher Weise kann der Prozess von 6A auch zur Detektion einer sekundären Bindung eines Liganden an einen Antiliganden angewendet werden. Das Verfahren nach 6A ist nicht auf die Detektion primärer oder sekundärer Bindungsereignisse begrenzt, die entlang des Signalwegs stattfinden. In der Tat können tertiäre Bindungsereignisse oder Bindungsereignisse höherer Ordnung, die entweder entlang dem Signalweg oder in Lösung suspendiert stattfinden, ebenfalls mit diesem Verfahren detektiert werden.
6B zeigt einen zweiten Prozess zum Detektieren sekundärer Bindungsereignisse und Bindungsereignisse höherer Ordnung, die entlang dem Signalweg stattfinden. Zunächst werden in Schritt 620 das primäre Bindungsereignis detektiert und die Signalantwort gemessen, wovon eine Ausführungsform mit den Schritten 602 bis 612 dargestellt ist. Anschließend wird in Schritt 622 die Signalantwort auf das primäre Bindungsereignis gespeichert und als Messbasis-Antwort verwendet. Danach wird in Schritt 624 eine zweite molekulare Lösung der Bio-Analyse-Vorrichtung so hinzugegeben, dass sie über der Bindungsoberfläche zirkulieren kann. In Schritt 626 werden dann die Schritte 608 bis 612 gemäß 6A wiederholt, um eine zweite Signalantwort zu erhalten. Dann werden in Schritt 628 die zweite Signalantwort und die Messbasis-Antwort verglichen. Ein geringe oder keine Änderung weist darauf hin, dass die beiden Signalantworten sehr eng beieinander liegen, was bedeutet, dass die strukturellen und dielektrischen Eigenschaften der MBL durch die Zugabe der Moleküle in die neue Lösung nicht verändert worden sind. In diesem Fall hat eine sekundäre Bindung nicht in nennenswertem Ausmaß stattgefunden (Schritt 630). Wenn der Vergleich eine Änderung außerhalb eines vorgegebenen Bereichs ergibt, sind die Struktur und/oder die dielektrischen Eigenschaften der MBL geändert worden, was auf sekundäre Bindungsereignisse hinweist (Schritt 632). Größen, die zur Angabe sekundärer Bindungsereignisse verwendet werden können, sind die gleichen wie die obigen Größen, z. B. Amplitude, Phase, Frequenz, Dispersion, Verlust, absolute Die lektrizitätskonstante, Empfindlichkeit, Impedanz, Ausbreitungsgeschwindigkeit, Dielektrizitätskonstante sowie andere Faktoren. Tertiäre Bindungsereignisse oder Bindungsereignisse höherer Ordnung können unter Anwendung dieser Vorgehensweise detektiert werden.
Ein alternatives Verfahren zum Detektieren sekundärer Bindungsereignisse oder Bindungsereignisse höherer Ordnung erfordert keine Vorkenntnis des spezifischen primären Bindungsereignisses. Bei dieser Ausführungsform ist die Bio-Analyse-Vorrichtung in der Analyse-Entwicklungsphase so ausgelegt, dass sie mit bekannten Parametern arbeitet, so dass immer dann, wenn eine vordefinierte Änderung eines dieser Parameter erkannt wird, z. B. am Einsatzort, Gewissheit besteht, dass das (die) Bindungsereignisse) stattgefunden hat (haben). Bei dieser Ausführungsform ist die vorherige Messung eine primären Bindungsereignisses nicht erforderlich, da die erstmalige Charakterisierung bereits entweder zum Zeitpunkt der Herstellung oder der Auslegung vorgenommen worden ist.
Sekundäre Bindungsereignisse können auch durch Detektion von Änderungen der Struktur des primär gebundenen Moleküls erzielt werden. Wenn ein Molekül gebunden wird, unterliegt es gegenüber seinem ungebundenen Zustand Konformationsänderungen und anderen Änderungen seiner molekularen Struktur. Diese Änderungen beeinflussen die dielektrischen Eigenschaften der Primärbindung des Moleküls und induzieren Änderungen in der umgebenden Lösung, die mittels der Schritte 620 bis 628 gemäß der oben beschriebenen 6B detektiert werden können. Größen, die zur Angabe einer Änderung der dielektrischen Eigenschaften des Moleküls mit primärer Bindung überwacht werden können, enthalten die obigen Größen, z. B. Amplitude, Phase, Frequenz, Dispersion, Verlust, absolute Dielektrizitätskonstante, Empfindlichkeit, Impedanz, Ausbreitungsgeschwindigkeit, Dielektrizitätskonstante sowie andere Faktoren.
C. Detektieren von Änderungen der dielektrischen Eigenschaften der molekularen Bindungsschicht
Die hierin beschriebene Bio-Analyse-Vorrichtung kann auch zur Messung der dielektrischen Änderungen der MBL aufgrund von Änderungen der Temperatur, des pH-Wertes, der ionischen Stärke und dg. verwendet werden.
6C zeigt eine beispielhafte Ausführungsform des Prozesses. Der Prozess ist dem offenbarten Verfahren zum Identifizieren von Bindungsereignissen sehr ähnlich mit der Ausnahme, dass das Verfahren die Detektion und Quantifizierung von Änderungen der dielektrischen Eigenschaften der MBL ermöglicht.
Der Prozess beginnt mit Schritt 641, in dem eine Lösung mit einer dielektrischen Anfangseigenschaft zur Bio-Analyse-Vorrichtung zugegeben, die Signalantwort gemessen und aufgezeichnet wird. Bei einer Ausführungsform wird dieser Schritt gemäß den Schritten 602 bis 612 ausgeführt. Nach einer vorgegebenen Zeit oder Betriebsdauer erfolgt eine zweite Messung und die zweite Signalantwort wird aufgezeichnet (Schritt 642), wieder in einer Ausführungsform gemäß den Schritten 602 bis 612. In Schritt 643 werden dann das erste und zweite Signal verglichen, um zu bestimmen, ob die beiden Signale innerhalb eine vordefinierten Bereichs korrelieren. Wenn dies der Fall ist, wird davon ausgegangen, dass die Eigenschaften der Lösung keinerlei dielektrischen Änderungen erfahren haben (Schritt 644).
Wenn die Signalantworten nicht innerhalb eines vordefinierten Bereichs korrelieren, wird davon ausgegangen, dass eine oder mehrere dielektrische Eigenschaften der Lösung eine Änderung erfahren haben (Schritt 645). Wahlweise kann die Änderung der dielektrischen Eigenschaften auf die folgende Weise quantifiziert werden. In Schritt 646 wird das zweite Signal gespeichert und mit einer bekannten Signalantwort korreliert. Die am besten korrelierende Antwort identifiziert die dielektrische Eigenschaft der Lösung und die erste Signalantwort kann mit dem Anfangswert der dielektrischen Eigenschaft korreliert werden, wobei die Differenz daraus zur Bestimmung des Betrags, um den sich die identifizierte dielektrische Eigenschaft geändert hat, herangezogen werden kann (Schritt 647).
D. Identifizieren gebundener molekularer Strukturen
Mit den beschriebenen Bio-Analyse-Vorrichtungen ist es möglich, einen bekannten Liganden zu charakterisieren und ihn dann in einer Lösung aus unbekannten Liganden zu identifizieren. 6D zeigt eine Ausführungsform dieses Prozesses. Zunächst werden in Schritt 652 eine große Anzahl molekularer Strukturen gemessen und ihre Antworten gespeichert, wobei eines oder mehrere der nachstehend beschriebenen Messsysteme verwendet werden. Bei einer Ausführungsform erfolgt dieser Schritt gemäß den Schritten 602 bis 612. Jede gespeicherte Antwort kann einem einzigen in der Lösung vorliegenden Liganden oder mehreren in derselben Lösung vorliegenden Liganden entsprechen. Anschließend wird in Schritt 654 die Messung einer unbekannten Lösung vorgenommen. Bei einer Ausführungsform erfolgt dieser Schritt gemäß den Schritten 602 bis 612. Danach wird in Schritt 656 die Signalantwort der Lösung mit den gespeicherten Signalantworten verglichen, um das Ausmaß der Korrelation mit diesen zu bestimmen. In Schritt 658 wird die unbekannte molekulare Struktur identifiziert, indem die gespeicherte Antwort gewählt wird, die am besten mit der unbekannten Antwort korreliert. Der Vergleich kann unter Verwendung eines oder mehrerer Datenpunkte zur Bestimmung der Korrelation zwischen einer oder mehreren gespeicherten Antworten durchgeführt werden und kann die Anwendung von Mustererkennungs-Software oder ähnlichen Mitteln zur Bestimmung der Korrelation beinhalten. Der Prozess kann zur Identifizierung gebundener primärer, sekundärer molekularer Strukturen oder molekularer Strukturen höherer Ordnung angewendet werden.
E. Identifizieren von Klassen gebundener molekularer Strukturen
Es ist auch möglich, bekannte molekulare Substrukturen wie Bereiche oder andere strukturelle Homologien zu charakterisieren, die gleichartigen Klassen Proteinen oder Sequenzhomologien in Nukleinsäuren gemeinsam sind. Bei einer Ausführungsform wird der Prozess wie in 6D dargestellt fortgesetzt, mit der Ausnahme, dass in Schritt 652 N molekulare Substrukturen gemessen und ihre Antworten gespeichert werden. Jede gespeicherte Signalantwort kann einer oder mehreren Substrukturen entsprechen. Der Prozess wird gemäß den Schritten 654, 656 und 658 fortgesetzt, bis eine ausreichende Anzahl oder Strukturen erkannt und charakterisiert worden sind, um die unbekannte Verbindung zu identifizieren. Sobald eine ausreichende Anzahl Korrelationen vorliegt, ist es möglich, die unbekannte molekulare Substruktur zu klassifizieren.
6E zeigt einen anderen Prozess, durch den unbekannte Liganden klassifiziert werden können. Der Prozess identifiziert den unbekannten Liganden durch die Detektion einer Bindung an strukturelle Muster der unbekannten Verbindung. Zunächst wird in Schritt 660 eine Bio-Analyse-Vorrichtung bereitgestellt, die mehrere adressierbare Matrizen hat, von denen eine jede einen Antiliganden für eine spezifische Liganden-Substruktur aufweist. Danach wird in Schritt 662 das Vorhandensein bestimmter Substrukturen anhand der Bindung einer jeden an ihren jeweiligen Antiliganden erkannt, gefolgt von der Charakterisierung. Bei einer Ausführungsform erfolgt dieser Schritt gemäß den Schritten 602 bis 612. Anschließend wird in Schritt 664 jedes der Bindungsereignisse durch die Identifizierung von Eigenschaften wie Affinität, Kinetik und spektrale Empfindlichkeit charakterisiert. In Schritt 666 erfolgt dann die Korrelation zwischen den bekannten und den unbekannten Antworten. Wenn jede der unbekannten Antworten mit den bekannten Antworten korreliert, wird der Ligand als derjenige Ligand identifiziert, der der bekannten Antwort entspricht. Wenn die Substrukturen sowohl korrelierte als auch unkorrelierte Antworten aufweisen, können die korrelierten Antworten verwendet werden, um eine allgemeinere Klassifizierung des unbekannten Liganden zu erstellen. Dieser Prozess kann zur Identifizierung jeder molekularen Struktur z. B. Proteine verwendet werden, die in derselben Klasse vorliegen oder wiederkehrende Homologien haben.
Es ist auch möglich, dass eine intensive Spektralanalyse einer gegebenen unbekannten Verbindung Erkenntnisse über Struktur und Funktion liefert, da Vergleiche mit bekannten Strukturen vorgenommen werden können und eine Extrapolation zu einer gewissen Klassifizierung führt.
A. Spezifische gegenüber unspezifische Bindung:
Die spezifische Ligandenbindung unterscheidet sich von der unspezifischen Bindung durch den spektralen Fingerabdruck des Bindungsereignisses. Ein gegebenes Bindungsereignis z. B. eine Antikörperbindung an einem Antigen kann zuerst in einer gereinigten Lösung, die nur den interessierenden Liganden und den für den Liganden spezifischen Antiliganden auf der MBL enthält, charakterisiert werden. Dann wird eine umfassende Spektraluntersuchung durchgeführt, um zu bestimmen, wann die stärksten Antworten im Spektrum auftreten. Die Analyse wird dann in den Lösungen wiederholt, die typischerweise bei den speziellen Anwendungen vorliegen, z. B. Vollblut, um zu bestimmen, welche Einflüsse eine unspezifische Bindung auf die Antwort hat. Dann werden verschiedene Punkte ermittelt, die bestimmend für eine spezifische Bindung sind, und eine eigene Punktemenge wird ermittelt, die bestimmend für eine unspezifische Bindung ist, und eine Untermenge dieser Frequenzpunkte wird dann für die tatsächliche Analyseanwendung gewählt. Durch Vergleich der Antworten aufgrund einer spezifischen Bindung mit denen aufgrund einer unspezifischen Bindung kann das Ausmaß der spezifischen Bindung bestimmt werden.
B. Charakterisierung eines gegebenen Liganden:
Es ist häufig wünschenswert, bestimmten Eigenschaften eines gegebenen Moleküls zu bestimmen. Beispiele sind u. a. die Bestimmung der Klasse, zu der ein Protein gehört, oder welcher Typ Polymorphismus ein gegebenes Gen oder eine andere Nukleinsäuresequenz ist. Dies kann auf mehrere Arten durchgeführt werden. Proteine werden häufig durch Anzahl und Typen struktureller Homologien oder bestimmte Substrukturen, die sich in denselben oder ähnlichen Proteinklassen finden, klassifiziert. So haben z. B. G-Proteine, die üblicherweise in Zellmembranen vorliegen und die Signalwandlungswege zwischen der außerzellularen Umgebung und der intrazellularen Umgebung herbeiführen, stets eine Struktur, die die Zellmembran sieben Mal durchquert. Eine derartige Struktur ist praktisch definitiv für ein G-Protein. Andere Proteinklassen haben ähnliche strukturelle Homologien und deshalb ist jedes Verfahren, das eine Proteinklasse von einer anderen auf Basis dieser Homologien unterscheiden kann, auf den Gebieten der biomedizinischen Forschung von enormem Nutzen. Unter der Voraussetzung, dass die dielektrischen Eigenschaften eines gegebenen Moleküls vollständig durch die Geometrie der Ladungsverteilung dieses Moleküls bestimmt werden, und ferner vorausgesetzt, dass die meisten Proteine eine eindeutige Struktur oder Geometrie haben, kann jedes Protein durch Messen seiner dielektrischen Eigenschaften eindeutig bestimmt werden. Somit kann eine einfache dielektrische Signatur wie die, die von der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, dazu dienen, eine gegebenes Protein eindeutig zu identifizieren und ferner die Klassifizierung des Proteins in eine zuvor bekannte Proteinklasse zu ermöglichen. Die Methodik der Klassifizierung kann weiter verfeinert werden, indem eine Gruppe Antiliganden auf der Bio-Analyse-Vorrichtung verwendet wird, die für bestimmte Substrukturen eines gegebenen Proteins spezifisch sind. So kann beispielsweise eine Gruppe Antikörper, die spezifisch für bestimmte Substrukturen wie Bereiche sind, zur Bestimmung der Anwesenheit oder des Fehlens dieser Substrukturen genutzt werden. Jedes gegebene Protein kann also durch Bestimmen sowohl der Anwesenheit oder des Fehlens bestimmter Substrukturen als auch der dielektrischen Eigenschaften des Proteins selbst charakterisiert werden. Weitere Verfeinerungen dieser Klassifizierungsstrategie können die Erfassung der Temperatur, des pH-Wertes, der ionischen Stärke sowie anderer Umgebungseinflüsse auf die oben genannten Eigenschaften enthalten.
Nukleinsäuren können auch durch Befolgen eines ähnlichen Paradigmas charakterisiert werden. Es kann z. B. bekannt sein, dass ein gegebenes Gen eine bestimmte Basenpaarsequenz hat. So finden sich z. B. in dem Gen, das für einen Chloridionentransportkanal in zahlreichen Zellmembranen codiert, gemeinsame Einbasenpaarmutationen oder -änderungen. Solche Änderungen führen zu einer Krankheit, die beim Menschen als zystische Fibrose bezeichnet wird. Die Charakterisierung einer gegebenen Nukleinsäuresequenz hinsichtlich geringfügiger Änderungen ist also von enormer Bedeutung. Solche Abweichungen werden häufig als Polymorphismen bezeichnet und solche Polymorphismen werden derzeit durch Bilden komplementärer Stränge für jeden bekannten Polymorphismus detektiert. Da jedes gegebene Gen eine Form aus hunderten oder sogar tausenden Polymorphismen annehmen kann, ist es häufig eine beschwerliche Aufgabe, komplementäre Stränge für jeden Polymorphismus zu erzeugten. Unter Anwendung der hierin beschriebenen Erfindung können nicht komplementäre Bindung oder Hybridisierung erkannt und unterschieden werden, indem zahlreiche der gleichen physikalischen Eigenschaften wie sie im vorigen Absatz beschrieben wurden gemessen werden: Die dielektrischen Eigenschaften des Hybridisierungsereignisses können charakterisiert und mit bekannten Daten korreliert werden, wodurch der – entweder vollständig oder unvollständig – stattgefundene Hybridisierungstyp bestimmt wird. Mit einem Antiliganden aus einer gegebenen Nukleinsäuresequenz können also hunderte verschiedener Polymorphismen (als Liganden) durch die Charakterisierung des Bindungsereignisses erkannt werden. Für den Fachmann versteht es sich, dass weitere Verfeinerungen möglich sind, z. B. eine Modifizierung der stringenten Bedingungen, um den Hybridisierungsprozess zu verändern, oder eine Temperaturänderung zur Bestimmung des Schmelzpunktes, der als weiterer Indikator für die Art des Hybridisierungsprozesses dient.
Auf ähnliche Weise können Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Rezeptor charakterisiert werden, um zu bestimmen, ob ein gegebenes Bindungsereignis darin resultiert, dass der Rezeptor ein- oder ausgeschaltet wird oder eine andere Form eines allosterischen Effektes stattfindet. So kann beispielsweise ein gegebener Rezeptor als Antiligand verwendet werden und ein bekannter Agonist als der erste Ligand. Die Wechselwirkung wird dann gemäß der dielektrischen Antwort charakterisiert, und diese Antwort wird gespeichert. Anschließend werden Verbindungen, die auf Arzneimittelkandidaten untersucht werden, bezüglich ihrer Bindungseigenschaften mit dem Rezeptor beobachtet. Von einem Molekül, das eine Bindung eingeht und eine ähnliche dielektrische Antwort erzeugt, ist dann bekannt, dass es einen ähnlichen Effekt auf den Rezeptor wie der bekannte Agonist hat, und ist deshalb mit einer sehr viel höheren Wahrscheinlichkeit ein Agonist. Dieses Paradigma kann zur Charakterisierung praktisch jeden Typs eines Zielrezeptor-Bindungsereignisses von Interesse angewendet werden und stellt eine deutliche Verbesserung gegenüber derzeitigen Detektionsstrategien dar, die nur bestimmen, ob ein Bindungsereignis stattgefunden hat oder nicht. Für den Fachmann liegt es auf der Hand, dass es sehr viel mehr Klassen Bindungsereignisse gibt, bei denen die vorliegenden Erfindung angewendet werden kann.
Beispiele für Substrukturen, die beim obigen Verfahren verwendet werden können, sind u. a.: Sekundäre und tertiäre Proteinstrukturen wie Alpha-Helizes, Beta-Sheets, Dreifch-Helizes, Bereiche, Fassstrukturen, Beta-Wicklungen und verschiedene Symmetriegruppen, die in quaternären Strukturen wie C₂-Symmetrie, C₃-Symmetrie, C₄-Symmetrie, D₂-Symmetrie, kubischer Symmetrie und Ikosaedral-Symmetrie vorhanden sind. [G. Rose (1979), Hierarchic Organization of Domains in Globular Proteins, J. Mol. Biol. 134:447-470] Substrukturen von Nukleinsäuren, die analysiert werden können, enthalten: Sequenzhomologien und Sequenzpolymorphismen, A-, B- und Z-Formen der DNS, Ein- und Doppelstrangformen, superdrehende Formen, Nodoc-Schleifen, D-Schleifen und TψC-Schleifen in der tRNS sowie in verschiedenen Klassen tRNS-Molekülen. [W. Saenger (1984) Principles of Nucleic Acid Structure. Springer-Verlag, New York; und P. Schimmel, D. Soll und J. Abelson (Hrsg.) (1979) Transfer RNA. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.]
F. Quantifizieren von Konzentrationen
Die hierin beschriebene Bio-Analyse-Vorrichtung kann auch zur Quantifizierung von Ligandenkonzentrationen verwendet werden. 6F zeigt eine Ausführungsform dieses Prozesses. Für den Fall, dass die Vorrichtung nicht vorkalibriert ist (Schritt 679) werden zunächst in Schritt 670 Antiliganden mit geeigneten Bindungseigenschaften wie Bindungsaffinität oder Kinetik für den gemessenen Analyten gewählt. Diese Eigenschaften werden so gewählt, dass die Gleichgewichtskonstante des Antiliganden nahe der Mitte seiner linearen Betriebsregion liegt. Bei Anwendungen, in denen der Konzentrationsbereich für die Verwendung eines einzigen Antiliganden zu weit ist, können mehrere Antiliganden mit verschiedenen Affinitäten und/oder linearen Betriebsbereichen verwendet werden, wodurch ein Wert der Konzentration über einen wesentlich weiteren Bereich erzielt wird.
Danach werden in den Schritten 672 und 674 die Antiliganden auf die Bio-Analyse-Vorrichtung oder den Chip aufgebracht und die Vorrichtung wird mit dem Messsystem verbunden. In Schritt 674 wird entschieden, ob die Antwort eine Charakterisierung hinsichtlich der maximalen Spezifität erfordert. Ist dies der Fall, wird eine Spektralanalyse durchgeführt, bei der die Frequenzen, wo die Analytbindung die maximale Bindung hat, (Schritt 675a), die Regionen, in denen die unspezifische Bindung den maximalen Effekt hat (Schritt 675b), bestimmt werden und die unverwechselbare Antwort aufgrund der Analytbindung bestimmt wird (Schritt 675c). Die Vorrichtung wird kalibriert, wenn keine Charakterisierung erforderlich ist, oder falls doch, nach deren Abschluss. Dieser Schritt wird bei einer Ausführungsform durchgeführt, indem Liganden bekannter Konzentration zur Bio-Analyse-Vorrichtung hinzugefügt werden und die resultierende Antwort gemessen wird (Schritt 676a). Sind mehr Datenpunkte für den Kalibrierungsschritt (Schritt 676b) erforderlich, dann kann wahlweise eine Probe mit einer anderen Konzentration gewählt (Schritt 676c) und die Antwort gegen diese Konzentration gemessen werden (Schritt 676a). Bei einer Ausführungsform kann die Messung gemäß den Schritten 602 bis 612 erfolgen. Anschließend wird in Schritt 677 ein Extrapolationsalgorithmus erzeugt, indem die Kalibrierpunkte aus der vorigen Antwort aufgezeichnet werden. Danach wird in Schritt 678 eine Probe mit unbekannter Ligandenkonzentration gemessen. Dieser Schritt wird bei einer Ausführungsform durchgeführt, indem die unbekannte Probe zur Bio-Analyse-Vorrichtung gegeben, die Antwort mit dem Titrationsalgorithmus korreliert und daraus die Ligandenkonzentration bestimmt wird.
In dem Fall, in dem eine gegebene Bio-Analyse-Vorrichtung entweder vorkalibriert oder auslegungsbedingt kalibriert ist, besteht der einzig erforderliche Schritt im Aufbringen des Liganden oder Analyten auf der Oberfläche und im Messen der Antwort. Eine solche Bio-Analyse-Vorrichtung kann auf zahlreiche verschiedene Arten verwirklicht werden. So können beispielsweise einige Schaltungsparameter wie Impedanz oder charakteristische Frequenz eines Resonanzkreises so ausgelegt werden, dass sie sich auf eine vorgegebene Weise ändern, wenn das Bindungsereignis stattfindet, und der Betrag, um den sich der Parameter ändert, kann ferner mit einer Dosis-Antwort ausgelegt werden. Die Messung des Schaltungsparameters wird also durch die Analyse über einen geeigneten Algorithmus unmittelbar einen quantitativen Wert für die Konzentration eines gegebenen Analyten oder Liganden liefern.
G. Selbstkalibrierung der Bio-Analyse-Vorrichtung
Die beschriebenen Bio-Analyse-Vorrichtungen besitzen eine Selbstdiagnosefähigkeit und damit die Möglichkeit der Qualitätskontrolle und Gütesicherung am Einsatzort. Bei einer gegebenen speziellen Anwendung fungiert ein bestimmter Antiligand (primäre Bindungsspezies) als Antiligand für einen Liganden (sekundäre Bindungsspezies) von Interesse in der Lösung. Die primäre Bindungsspezies kann bei der Herstellung und die sekundäre Bindungsspezies am Einsatzort angebracht werden. Variationen bei der Herstellung – speziell beim Anbringen der primären Spezies – verursachen daher Variationen der Fähigkeit der Vorrichtung, ihren spezifischen Liganden zu binden. Die Menge des gebundenen Liganden ist jedoch direkt proportional zur Menge des gebunden Antiliganden, so dass eine Quotientenmessung der beiden möglich ist.
6G zeigt eine Ausführungsform des Prozesses. Zunächst wird in Schritt 680 eine molekulare Bindungsoberfläche entlang dem Signalweg durch Binden des entsprechenden Antikörpers bei verschiedenen Konzentrationen gebildet und die resultierende Antwort für jede dieser Konzentrationen charakterisiert, was einen Wert "x" für jede Konzentration ergibt. Danach wird in Schritt 682 eine ähnliche Titrationskurve für den Liganden erzeugt, indem die Antikörper-/Ligandbindungskonzentrationsantwort für mehrere verschiedene Konzentrationen des Liganden gemessen wird, und eine Ligand-Titrationskurve wird vorbestimmt. Danach wird in Schritt 684 ein Skalierungsfaktor A anhand des Verhältnisses der Antworten der Antikörperbindung zur Ligandbindung erzeugt. Am Einsatzort wird die unkalibrierte Analyse dann zuerst untersucht (Schritt 686), um die Menge des gebundenen Antikörpers "x" und den daraus resultierenden Skalierungsfaktor "y" zu bestimmen. Der Ligand wird dann in die Analyse eingebracht und die Antwort wird gemessen (Schritt 689) und die Antwort sowie die vorbestimmte Titrationskurve werden mit dem Skalierungsfaktor "y" skaliert (Schritt 690), um die unbekannte Konzentration zu bestimmen.
Der Prozess von 6F kann auch modifiziert werden, um die Quantifizierung der Ligandenmenge in der Lösung zu ermöglichen. In der Modifikation enthält die Bindungsoberfläche der Bio-Analyse-Vorrichtung Antiliganden mit einer vorgegebenen Affinität und Ligandenspezifität. Die Lösung wird anschließend auf die Vorrichtung aufgebracht und die Antwort gemessen. Die Signalantwort verhält sich proportional zur Menge des gebundenen Liganden. Somit kann eine Titration jedes gegebenen Liganden durchgeführt werden, indem ein Antiligand mit einem geeigneten linearen Betriebsbereich – der Bereich, in dem die Gleichgewichtskonstante innerhalb einiger logarithmischer Einheiten des gewünschten zu detektierenden Konzentrationsbereichs liegt – gewählt wird. Die gleiche Quotientenanalyse wie oben beschrieben kann für den Erhalt einer robusten und quantitativen Analyse mit interner Steuerung und Kalibrierung, die zur Sicherstellung der Zuverlässigkeit erforderlich sind, angewendet werden.
Jedes der beschriebenen Verfahren kann auf vielerlei verschiedene Arten (d. h. software- oder hardwaremäßig oder in einer Kombination aus beiden) und in einer Vielzahl Systemen verwirklicht werden. Bei einer Ausführungsform kann das beschriebene Verfahren als ein Software-Programm implementiert werden.
7A zeigt ein Beispiel eines Computersystems 710 zur Abwicklung eines Software-Programms, das zur Ausführung jedes der beschriebenen Verfahren konzipiert ist. Das Computersystem 710 enthält einen Monitor 714, einen Bildschirm 712, ein Gehäuse 718 und eine Tastatur 734. Eine Maus (nicht dargestellt), ein Lichtgriffel oder andere E/A-Schnittstellen wie virtuelle Realitätsschnittstellen können ebenfalls enthalten sein, um E/A-Befehle bereitzustellen. Das Gehäuse 718 enthält ein CD-ROM-Laufwerk 716, ein Festplattenlaufwerk (nicht dargestellt) oder andere Speichermedien, die zum Speichern und Abrufen digitaler Daten und Software-Programme, die die vorliegende Erfindung enthalten, verwendet werden können und dergleichen mehr. Obwohl die CD-ROM 716 als herausnehmbares Medium dargestellt ist, können andere physisch herausnehmbare Medien, einschließlich Disketten, Magnetband und Flash-Speicher verwendet werden. Das Gehäuse 718 enthält außerdem bekannte Computerbauelemente (nicht dargestellt) wie einen Prozessor, einen Speicher und dgl.
7B ist ein vereinfachtes Systemblockdiagramm eines typischen Computersystems 710, das zur Abwicklung eines Software-Programms mit dem gewünschten Verfahren verwendet wird. Wie in 7A dargestellt enthält das Computersystem 710 den Monitor 714, der wahlweise interaktiv mit der E/A-Steuerung 724 arbeitet. Das Computersystem 710 enthält ferner Untersysteme wie einen Systemspeicher 726, einen Zentralprozessor 728, einen Lautsprecher 730, eine herausnehmbare Festplatte 732, die Tastatur 734, eine stationäre Festplatte 736 und eine Netzschnittstelle 738. Andere zur Verwendung mit dem beschriebenen Verfahren geeignete Computersysteme können mehr oder weniger Untersysteme enthalten. so könnte beispielsweise ein anderes Computersystem mehr als einen Prozessor 728 (d. h. ein Mehrprozessorsystem sein) zur Verarbeitung der digitalen Daten enthalten. Pfeile wie 740 repräsentieren die Systembusarchitektur des Computersystems 710. Diese Pfeile 740 zeigen jedoch nur beispielhaft jede Verbindungsstruktur, die zur Kopplung der Untersysteme dient. So könnte z. B. ein lokaler Bus zur Verbindung des Zentralprozessors 728 mit dem Systemspeicher 726 verwendet werden. Das in 7B dargestellten Computersystem 710 ist nur ein Beispiel eines zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung geeigneten Computersystems. Andere Konfigurationen der Untersysteme, die sich zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung eignen, ergeben sich ohne weiteres für den Durchschnittsfachmann.
V. Messsysteme
Zur Durchführung der oben beschriebenen Verfahren können verschiedene Messsysteme verwendet werden. Die 8 bis 10 zeigen drei Beispiele möglicher Messsysteme: ein Frequenzbereichs-Testsystem, eine Zeitbereichs-Testsystem und ein Messsystem für die dielektrische Relaxation.
A. Frequenzmesssystem
8A zeigt eine Ausführungsform eines Frequenzmesssystems gemäß der vorliegenden Erfindung. Das System 800 enthält eine mit dem Eingang 852 der Bio-Analyse-Vorrichtung gekoppelte Signalquelle 810 und einen mit dem Ausgang 858 der Bio-Analyse-Vorrichtung gekoppelten Signaldetektor. Wahlweise kann eine zusätzliche Signalquelle mit dem Ausgang 858 der Bio-Analyse-Vorrichtung und ein zusätzlicher Signaldetektor mit dem Eingang 852 der Testschaltung gekoppelt werden, um eine vollständige Zwei-Anschluss-Messfunktion bereitzustellen. Das System kann zu einem Ein-Anschluss-Testsystem modifiziert werden, bei dem ein Signaldetektor mit dem Signalweg gekoppelt ist, um ein reflektiertes Signal zu empfangen. Bei einer spezifischen Ausführungsform besteht das oben genannten Frequenzmesssystem aus einem Netzanalysator, z. B. Modell Nr. 8510C von der Hewlett-Packard Company. Wahlweise können andere Hochfrequenz-Messsysteme wie skalare Netzanalysatoren, die Signalinformationen auf Basis übertragener und reflektierter Signale liefern, verwendet werden.
Die Messungen werden gemäß den oben genannten Methoden durchgeführt. Zunächst wird ein Eintrittssignal 860 zur Testschaltung abgesetzt und die übertragenen und/oder reflektierten Signale 870 bzw. 890 werden dann regeneriert. Die resultierenden Signalantworten nehmen die Form eindeutiger Frequenzgänge oder "spektraler Fingerabdrücke" an, von denen die 8B und 8C zwei Beispiele zeigen. 8B zeigt einen Typ Frequenzgang, bei dem Resonanz bei der Frequenz f_res auftritt. Hier unterliegt die Antwort 870 einem steilen Abfall und Anstieg, was darauf hinweist, dass bei dieser Frequenz wenig oder keine Signalenergie den Ausgangsanschluss erreicht. Die Resonanz wird durch die dielektrische Eigenschaft und Impedanz der MBL verursacht, wobei sich die Frequenz von f_start zu f_stop ändert. Unterschiedliche Liganden gehen an verschiedenen Frequenzpunkten in Resonanz. Außerdem können manche Liganden mehrere Resonanzfrequenzpunkte über das gemessene Band f_start bis f_stop aufweisen. Sobald ein Ligand dahingehend charakterisiert worden ist, dass er einen oder mehrere eindeutige Resonanzpunkte hat, können diese Daten zur Identifizierung der Anwesenheit des Liganden in einer unbekannten Lösung verwendet werden. Diese Charakterisierung kann anhand empirischer Daten oder mittels theoretischer Berechnungen von Mehrpolmomenten und Resonanzfrequenzen bestätigt werden. Wird ferner das Vorliegen sekundärer Bindungsereignisse detektiert, können diese Daten durch eine Änderung eines oder mehrerer eindeutiger Resonanzpunkte angeben, wann sich ein Analyt an einen Liganden gebunden hat.
8C zeigt einen anderen Typ Frequenzgang, der zum Detektieren oder Identifizieren einer molekularen Struktur verwendet werden kann. In diesem Fall zeigt der Frequenzgang eine allgemein monoton ansteigende oder abfallende Tendenz mit einem gewissen Ausmaß an Amplitudenschwankung. Die Steigung des Frequenzgangs und/oder die Amplitudenschwankung kann zum Detektieren und/oder eindeutigen Charakterisieren des gebundenen Moleküls herangezogen werden. Die Resonanzfrequenzpunkte, Steigung, Tendenz und Änderung der Phase des Testsignals können also in der beschriebenen Weise zur eindeutigen Identifizierung des molekularen Bindungsereignisses verwendet werden. Der Frequenzgang kann am Eingangsanschluss 852, am Ausgangsanschluss 858 oder an beiden Anschlüssen gemessen werden, um die gebundene molekulare Struktur eindeutig zu identifizieren.
9 zeigt eine zweite beispielhafte Ausführungsform eines Frequenzmesssystems gemäß der vorliegenden Erfindung. Die zu testende Bio-Analyse-Vorrichtung 920 besteht aus einer koaxialen Topologie (in 5G dargestellt) mit einem mittleren Leiter 921, einem ersten Isolator 922 mit einem Hohlraum 922a, einem zweiten Isolator 923 und einem äußeren Leiter 924. Die Lösung 926 befindet sich im Hohlraum 922a. Natürlich können auch Vorrichtungen mit anderen Schaltungstopologien getestet werden.
Sobald die Lösung 926 in den Hohlraum 922a eingebracht worden ist, bilden die Moleküle in der Lösung 926 eine MBL 921a in der Nähe des mittleren Leiters 921. Während der Messung setzt eine Signalquelle 910 ein Eingangstestsignal 912 zum mittleren Leiter 921 ab. Die MBL 921a moduliert das Eingangstestsignal 912 und das reflektierte Testsignal 932 stellt eine unverwechselbare Signalantwort bereit, die zum Identifizieren des Liganden verwendet werden kann. Die koaxiale Konfiguration mit einem Anschluss kann beispielsweise als eine subkutane Nadelstruktur verwirklicht werden.
B. Zeitbereichsmesssystem
10 zeigt eine Ausführungsform eines Zeitbereichsmesssystems 1000 gemäß der vorliegenden Erfindung. Das System enthält eine Impulsquelle 1002 und einen Detektor 1004, die mit dem Eingang 1022 einer Testschaltung gekoppelt sind. Bei einer alternativen Ausführungsform können eine zusätzliche Impulsquelle und ein zusätzlicher Detektor mit dem Ausgangsanschluss 1028 gekoppelt werden, um eine vollständige Zwei-Anschluss-Messfunktion bereitzustellen. Ferner kann das System ein Ein-Anschluss-Testsystem aufweisen, bei dem ein Signaldetektor mit dem Signalweg gekoppelt ist, um ein reflektiertes Signal zu empfangen. Bei einer spezifischen Ausführungsform besteht das Zeitbereichsmesssystem aus einem Zeitbereichs-Reflektometer wie Modell 11801 von der Tektronix Corporation. Wahlweise können andere Hochfrequenz-Messsysteme wie Netzanalysatoren mit einem Zeitbereichs-Messmodus, die Signalinformationen auf Basis übertragener und reflektierter Signale liefern, verwendet werden.
Bei dem Zeitbereichsmesssystem besteht das Eingangstestsignal 1060 aus drei Zeitbereichsimpulsen, deren reflektierte Anteile über der Zeit angezeigt werden können. Bei der vorliegenden Ausführungsform wird ein Eingangsimpuls 1060 in Richtung des Abschnitts der Übertragungsleitung abgesetzt, der eng mit der Analysenoberfläche gekoppelt ist. Aufgrund der dielektrischen Eigenschaft der MBL wird ein Anteil des Eingangsimpulses 1060 zum Detektor 1004 reflektiert. Der reflektierte Impuls 1070 weist eine eindeutige Form und/oder Zeitverzögerung auf, die für die dielektrischen Eigenschaften der MBL charakteristisch ist bzw. sind, wie ihrerseits in hohem Maße durch die dielektrischen Eigenschaften des Liganden, des Antiliganden und der umgebenden Lösung definiert werden. Somit können die Impulsform und die Verzögerung des reflektierten Impulses 1070 zur Charakterisierung und Identifizierung des Liganden verwendet werden. Das Zeitbereichsmesssystem kann getrennt und zusammen mit dem Hochfrequenz-Messsystem zur Identifizierung eines oder mehrerer unbekannter Liganden verwendet werden.
C. Messsystem für die dielektrische Relaxation
Wie im Stand der Technik bekannt ist, ist die dielektrische Relaxationsfrequenz eines Liganden die Rate, mit der sich die dielektrischen Eigenschaften auf molekularer Ebene ändern, wenn ein elektrisches Feld an das Molekül angelegt wird. Wie im Falle der dielektrischen Eigenschaften des Liganden wird die dielektrische Relaxationsfrequenz vor allem durch die Struktur und die Bindungsgeometrien definiert, die für jedes Molekül unverwechselbar sind. Ist die dielektrische Relaxationsfrequenz eine Liganden also einmal gemessen, kann sie zu seiner Identifizierung verwendet werden.
Die dielektrische Relaxationsfrequenz kann quantifiziert werden, indem die Rate, mit der der Ligand Leistung über der Frequenz absorbiert, gemessen wird. 11 zeigt eine Ausführungsform eines Systems 1100 zur Durchführung dieser Messung. Das Messsystem 1100 ähnelt dem in 10 dargestellten Zeitbereichsmesssystem 1000 und enthält eine Impulsquelle 1102 und einen Detektor 1104, die mit dem Eingang 1122 der Testanordnung gekoppelt sind. Eine zusätzliche Impulsquelle und ein zusätzlicher Detektor können mit dem Ausgangsanschluss 1128 gekoppelt werden, um eine vollständige Zwei-Anschluss-Messfunktion bereitzustellen. Bei einer spezifischen Ausführungsform besteht das Zeitbereichsmesssystem aus einem Zeitbereichs-Reflektometer wie Modell 11801 von der Tektronix Corporation. Wahlweise können andere Hochfrequenz-Messsysteme wie Netzanalysatoren mit einem Zeitbereichs-Messmodus, die Signalinformationen auf Basis übertragener und reflektierter Signale liefern, verwendet werden.
Das Eingangstestsignal 1160 besteht aus mehreren Impulsgruppen, von denen eine jede zwei oder mehr Eingangsimpulse und verschiedene Impulsintervalle hat. Die Impulsgruppen 1162 und 1164 werden zu dem Abschnitt der Übertragungsleitung abgesetzt, der eng mit der Bindungsoberfläche gekoppelt ist. Wenn eine Impulsgruppe 1162 ein Intervall hat, das im Wesentlichen der dielektrischen Relaxationsperiode (dem reziproken Wert der Relaxationsfrequenz) entspricht, absorbiert die MBL sukzessive weniger Energie in den folgenden Impulsen. Die Abnahme der Signalabsorption kann in der reflektierten Antwort 1170 am Eingangsanschluss 1122 oder am Ausgangsanschluss 1128 gemessen werden. Als alternative Messgröße kann die restliche Signalleistung entweder am Eingangsanschluss 1122 oder am Ausgangsanschluss 1128 gemessen werden.
Die Änderungsrate der Signalsabsorption und das Impulsintervall, bei dem die Änderung stattfindet, können dann aufgetragen und zum Charakterisieren und Identifizieren des (der) unbekannten Moleküls (Moleküle) verwendet werden. Diese Systemcharakterisierung kann unabhängig oder zusammen mit den oben beschriebenen Zeit- und/oder Frequenzbereichs-Testsystemen angewendet werden.
Dem Fachmann ist durchaus klar, dass alle der obigen Systeme durch die Anwendung von Technologien wie der Microwave Monolithic Integrated Circuits (MMIC – monolithische integrierte Mikrowellenschaltungen) und dgl. auf Chip-Größe herunter skaliert werden können. Solche miniaturisierten Systeme lassen sich in einfacher Weise zu äußerst parallel arbeitenden Systemen erweitern, die in der Lage sind, hunderte, tausende oder zehntausende Verbindungen gleichzeitig zu detektieren und zu messen. Diese Systeme können so konfiguriert werden, dass sie "Logikgatter" hervorbringen, die durch das Bindungsereignis selbst geschaltet werden, z. B. durch Ändern einer charakteristischen Impedanz und somit der Übertragungs- und/oder Reflexionskoeffizienten oder durch Ändern der Bandpasseigenschaften einer derartigen Schaltung und dies als das Ein-/Aus-Gatter verwenden.
VI. Beispiele
A. Beispiel 1: Detektion einer Ligandenbindung an der Oberfläche
Die primäre Bindung von Unease an eine ITO-Oberfläche wurde in der Bio-Analyse-Vorrichtung nachgewiesen wie in 2A dargestellt. Die Bindungsoberfläche der Bio- Analyse-Vorrichtung wies eine mit ITO mit chemischer Abscheidung aus der Dampfphase (chemical vapor deposition – CVD) behandelte Glasabdeckung auf. Die ITO-Übertragungsleitung wurde sorgfältig untersucht, um sicherzustellen, dass sie keine Mikrorisse oder Brüche enthielt. Die Übertragungsleitung wurde mit einem Tektronix 11801 Signalanalysator mit einem TDR-Modul gemessen, wobei eine Breitband-Referenzimpedanz von 32 Ω bestimmt wurde. Die Leitungslänge betrug etwa 2,6 ns, für die Bindungsoberfläche wurde eine Impedanz von 34 Ω und eine Länge von ca. 200 ps bestimmt. Der Abstand zwischen der oberen und unteren Platte betrug 10 mil und die Kammer hatte eine Länge von 1/2 Zoll. Es wurden keine Seitenwände verwendet; statt dessen hielt die Kapillarwirkung der oberen und unteren Platte die Lösung in ihrer Position.
Danach wurde die Bio-Analyse-Vorrichtung mit einer d-PBS-Lösung gefüllt. Bei gefüllter Bio-Analyse-Vorrichtung wurden S-Parameter-Messungen des Messbasis-Übertragungsverlustes (S₂₁) und den Rückführungsverlustes (S₁₁) über einen Testfrequenzbereich von 45 MHz bis 1 GHz durchgeführt. Die Messungen wurden durchgeführt und mittels eines Netzanalysators Modell Nr. HP 8510B von der Hewlett-Packard Company gespeichert. Danach wurde Unease in einem Volumenüberschuss von 10 : 1 hinzugegeben. Die S-Parameter-Messungen des Übertragungs- und Rückführungsverlustes wurden wiederholt und mit den Messbasis-Messungen verglichen.
Die nachstehende Tabelle 1 zeigt diese Werte für 100 MHz und 1 GHz und die Rückführungs- und Übertragungsverlust-Messantworten sind in den 12A und 12B dargestellt. Die Daten zeigen darauf hin, dass die Bio-Analyse-Testvorrichtung eine Änderung des Rückführungsverlustes (S₁₁) von -0,5 dB bzw. -0,42 dB bei 100 MHz und 1 GHz zwischen der mit d-PBS gefüllten Chip und dem mit d-PBS + Protein gefüllten Vorrichtung aufwiesen. Die Vorrichtung wies eine Änderung des Übertragungsverlustes (S₂₁) von +0,325 dB und +0,450 dB bei 100 MHz bzw. 1 GHz auf.
Um zu bestimmen, ob die Signalantworten auf einen Masseneffekt (Proteine in Lösung) oder auf die Bindung von Proteinen an die Bindungsoberfläche zurückzuführen sind, wurde jede Antwort aufgezeichnet und die Proteinlösung mit d-PBS in einem Volumenüberschuss von 25 : 1 (2 ml d-PBS zu 0,075 ml Kammergröße) gespült. Die Bio-Analyse-Vorrichtung wurde dann von 45 MHz bis 1 GHz wie oben beschrieben erneut gemessen.
Wie der Vergleich der beiden letzten Spalten von Tabelle 1 zeigt, hatte das Ausspülen des Proteins aus der Bio-Analyse-Vorrichtung einen minimalen Effekt auf die Messungen des Rückführungs- und Übertragungsverlustes. Dies zeigt, dass der gemessen Effekt in der Tat auf die die Bindungsoberfläche bindende Unease in der Bio-Analyse-Vorrichtung zurückzuführen ist. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass der Austausch der Lösung mit dem Liganden gegen eine identische Lösung ohne den Liganden eine sehr geringe oder keine Änderung der Antwort verursachte.
Tabelle 1 Effekt der primären Bindung von Unease
B. Beispiel 2: Identifizierung von Kollagenase und Lysozym durch primäre Bindung
Unter Verwendung einer Bio-Analyse-Vorrichtung ähnlich der vom obigen Beispiel 1, die auf ähnliche Weise vorbereitet und charakterisiert worden war, haben wir eine Reihe Experimente durchgeführt, um die unterschiedlichen Antworten verschiedener Proteine über den Frequenzbereich von 1 bis 10 GHz zu untersuchen. Dieselbe Vorrichtung wurde für jedes Experiment verwendet (um geringfügige Herstellungsdifferenzen zwischen den jeweiligen Vorrichtungen zu verhindern), aber vor dem Aufbringen jedes der Proteine gründlich mit SDS gewaschen. Die 12C und 12D zeigen die Übertragungsverlustmessungen der primären Bindungseffekte von Kollagenase- bzw. Lysozymproben über den Testfrequenzbereich von 1 GHz bis 10 GHz. In beiden Fällen wies die Signalantwort ein Muster aus Spitzen und Tälern auf, das zur eindeutigen Detektion und Identifizierung des Liganden herangezogen werden kann. Insbesondere zeigte der Frequenzgang der Kollagenaseprobe eine starke positive Spitze in der Nähe von 5 GHz. Die Antwort der Lysozymprobe zeigte einen relativ flachen Frequenzgang in der Nähe von 5 GHz und eine starke positive Spitze nahe 8 GHz. Bei jedem der anderen zahlreichen untersuchten Proteinen war die Antwort jedes Proteins eindeutig, so dass ein unbekanntes Protein in der Gruppe leicht identifizierbar war. Natürlich können weitere Spektralpunkte ebenfalls verglichen und analysiert werden, um diese und andere molekulare Substanzen zu unterscheiden. Die Antworten können gespeichert und später abgerufen werden, um unbekannte Proben zu identifizieren. Außerdem können die weniger ausgeprägten Spitzen kollektiv untersucht werden, um Muster für bestimmten Liganden zu bestimmen.
C. Beispiel 3: Detektion sekundärer Bindungen: Concanavalin A an Dextran
Diese Anwendung stellt ein Beispiel für die Detektion einer sekundären Bindung bereit, wobei eine Bio-Analyse-Vorrichtung ähnlich der vom obigen Beispiel 1, die auf ähnliche Weise vorbereitet und charakterisiert worden war, verwendet wurde. Concanavalin A (ConA) ist ein Glucose bindendes Protein, das in Jackbohnen (Canavalia ensiformis) vorkommt, und als Primärbindungsligand verwendet wurde. Das hier verwendete ConA wurde von der Sigma Chemical Company beschafft. Dextran, ein Glukose-Polysaccharid, wurde dann als Ligand zur Bindung von ConA verwendet, wobei Glukose als Verdrängungsmittel zur Umkehr der Dextranbindung diente, um Spezifität nachzuweisen. (Dextran und Glukose wurden ebenfalls von der Sigma Chemical Company beschafft).
Die Übertragungsleitung war die gleiche wie bei Beispiel 1 erörtert mit einer nominal 32 Ω Referenzimpedanz und einem ITO-Abdeckglas mit einem Gleichstrom-Widerstand von 80 Ω und einer nominalen TDR-Impedanz von 34 Ω. Eine Konzentration aus ca. 15 μM ConA-Lösung wurde direkt in die Bio-Analyse-Vorrichtung eingebracht und das Erreichen des Gleichgewichtszustands abgewartet.
Verdampfungsverluste führten nicht zur Austrocknung der Kammer, was durch eine Sichtkontrolle festgestellt wurde. Nachdem das System gespült und stabilisiert worden war, wurde Dextran hinzugegeben, um das ConA zu binden. Nach der Detektion einer Signaländerung wurde die Kammer mit 10 mg/ml d-PBS gespült und die Signalantwort ein zweites Mal gemessen. Dieser Effekt ist in 12E bei 1 GHz dargestellt. Die ungebundene Antwort wurde als Messbasis-Antwort verwendet. Wie zu ersehen ist, erscheint die gebundene Antwort um 0,25 dB weniger verlustbehaftet als die ungebundene Antwort. Die Bindungsspezifität wurde bestätigt, indem das gebundene Dextran mit Glukose verdrängt wurde, gefolgt von einer d-PBS-Spülung, um die Glukose freizusetzen. Mit dem letztgenannten Schritt kehrte das Signal zur Messbasis zurück, die vor dem Zugeben des Dextran erhalten worden war, womit die Spezifität des Bindungsereignisses nachgewiesen worden ist.
D. Beispiel 4: Detektion der Bindung kleiner Moleküle
Unter Verwendung einer Bio-Analyse-Vorrichtung ähnlich der vom obigen Beispiel 1, die auf ähnliche Weise vorbereitet und charakterisiert worden war, wurden der Bio-Analyse-Testaufbau und der Netzanalysator verwendet, um nachzuweisen, dass kleine sich an große Moleküle bindende Moleküle ebenfalls mit der vorliegenden Erfindung erkannt werden können. Zur Untersuchung der Bio-Analyse-Vorrichtung bei höheren Frequenzen wurde die Vorrichtung wiederholgenau und sorgfältig in einen Faraday'schen Käfig gesetzt, um sie gegen äußere Einflüsse zu schützen. Dadurch konnte die Vorrichtung bei Frequenzen bis zu 20 GHz untersucht werden. Zunächst wurde ConA zur Bio-Analyse-Vorrichtung zugegeben, das sich an die bioelektrische Grenzfläche band. Eine Messung des Übertragungsverlustes wurde vorgenommen, die gespeichert und als Messbasisantwort 1252 verwendet wurde, wie in 12F dargestellt.
Danach wurde Glukose mit einer Konzentration von 10 mg/ml zur Bio-Analyse-Vorrichtung zugegeben, um den ConA-Antiliganden zu binden. Eine Messung des Übertragungsverlustes wurde vorgenommen und relativ zur Messbasis-Antwort 1252 aufgetragen, um die Änderung der Signalantwort aufgrund der Bindung kleiner Moleküle zu bestimmen.
Wie aus 12F zu ersehen ist, ist die Bindungsantwort 1254, die der Bindung von Glukose an ConA entspricht, von der Messbasismessung 1252 unterscheidbar. Insbesondere weist die Bindungsantwort 1254 zwei große Spitzen zwischen 16 und 20 GHz auf, die bei der Messbasis-Antwort 1252 nicht festzustellen sind. Die Differenz der gemessenen Signalantworten 1252 und 1254 stellt eine Basis für die Erkennung bereit, wann sich Glukose an den ConA-Antiliganden gebunden hat. Anschließend erfolgte eine Spülung nur mit dem d-PBS-Puffer und die Antwort wurde umgekehrt, als sich die gebundene Glukose vom ConA löste. Ein getrenntes Experiment, bei dem der Effekt von Glukose auf dem nackten Chip (d. h. kein ConA als Antiligand) untersucht wurde, zeigte, dass Glukose allein wenn überhaupt nur einen geringen Einfluss auf die Antwort auf die elektromagnetische Abfrage im oben genannten Frequenzspektrum hat, womit nachgewiesen wurde, dass das Ergebnis einzig auf den Effekt der Bindung von Glukose an ConA zurückzuführen ist.
Das Experiment wurde für die Bindung von Biotin an Avidin wiederholt. Avidin wurde zur Bio-Analyse-Vorrichtung als Antiligand zugegeben und eine Messung des Übertragungsverlustes wurde vorgenommen, gespeichert und als Messbasis-Antwort 1262 verwendet. Danach wurde Biotin mit einer Konzentration von 1 μM zugegeben und eine Messung des Übertragungsverlustes relativ zur Basismessung vorgenommen. Die Ergebnisse sind in 12G dargestellt.
Die Bindungsantwort 1264 entsprechend dem an Avidin gebundenen Biotin zeigt zwischen 14 und 16 GHz einen vollständigen Nullwert und eine große Spitze in der Nähe von 20 GHz. Die Differenz zwischen der Messbasis-Antwort (für ungebundenes Avidin) und der Bindungsantwort (für gebundenes Avidin) ist dramatisch und kann zur Detektion des gebundenen Avidinmoleküls verwendet werden.
E. Beispiel 5: Quantifizierungstitrationen
Diese Experimente zeigen, dass die Größe der Signaländerung bei einer Bindung eines Liganden an einem Antiliganden von der Anzahl der belegten Stellen abhängt. Das Testsystem, in dem eine Bio-Analyse-Vorrichtung ähnlich der von Beispiel 1 oben, die in ähnlicher Weise vorbereitet und charakterisiert worden war, verwendet wurde, wurde mit sich an ConA bindendem Dextran eingesetzt, wobei Glukose als Verdrängungsinhibitor diente. Eine Reihe Verdünnungen wurde um die Bindungskonstante von ConA erzeugt. Dextran als Antiligand band sich zu einer 100%-igen Bindung an ConA. Eine Reihe Verdrängungs-Glukosekonzentrationen wurde zur Verdrängung des Dextran verwendet, so dass die Konzentration des Dextran auf der molekularen Bindungsoberfläche entsprechend verringert wurde.
Die Standardkonfiguration der Übertragungsleitung wie oben erläutert wurde verwendet. ConA ging mit der molekularen Bindungsschicht eine Bindung ein und das System wurde stabilisiert. Die Bio-Analyse-Vorrichtung wurde dann mit d-PBS gespült und Daten bei 1 GHz erfasst. Die Ergebnisse dieser Verdrängungstitration sind in 12H dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, wie sich das Signal ändert, wenn die Konzentration der Glukose von 0 auf 15 mg/ml erhöht wird. Das Signal des ConA ändert sich, wenn das Dextran freigesetzt und die Glukose gebunden wird (wodurch eigentlich die Avidität des Dextran gemessen wird). Die Spezifität wurde auch durch Glukoseumkehr des Dextranbindungseffekts nachgewiesen.
Tabelle 2 zeigt die Größe der Änderung des Übertragungsverlustes in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration für einige ausgewählte Konzentrationen.
Tabelle 2
Eine einfache Glukosetitration wurde auch im Resonanzpunkt im Spektrum von ConA durchgeführt. 12I zeigt die Änderung des Rückführungsverlustes in Abhängigkeit von der Glukosekonzentration in diesem Resonanzpunkt, womit zwei Effekte nachgewiesen werden: Erstens hat die Glukose als Ligand einen Dosis-Antworteffekt, der auf dem Effekt basiert, den sie auf den Antiliganden hat (der in diesem Fall ConA ist). Zweitens gibt es Regionen im Spektrum, die eine wesentlich empfindlichere Antwort auf das Ligand-/Antiligand-Bindungsereignis aufweisen als andere Regionen.
Aufeinanderfolgende Verdünnungen der Dextranlösung, bei der die Konzentration bis unter ein Picomolar (10^-15 Molar) gesenkt wurde, zeigten selbst bei diesen niedrigen Konzentrationen eine deutliche Signalantwort, die darauf hinweist, dass eine Bindung stattgefunden hat. Die für die Signalerfassung erforderliche Zeit betrug zwischen einigen Minuten bis zu zehn Minuten, aber die Antwort war charakteristisch für die Detektion von Dextran bei höheren Konzentrationen.
F. Beispiel 6: Detektion von Nukleinsäuren
Zum Nachweis der Fähigkeit, Nukleinsäuren zu erkennen, wurde eine Bio-Analyse-Vorrichtung mit Polylysin als auf einer Goldoberfläche anhaftender Antiligand hergestellt. Unter Verwendung einer Bio-Analyse-Vorrichtung ähnlich der von Beispiel 1 oben mit Ausnahme der Goldoberfläche, die auf ähnliche Weise vorbereitet und charakterisiert worden war, wurde eine hochkonzentrierte Lösung (ca. 20 μ) aus Kalbsthymus-DNS in einem d-PBS-Puffer angesetzt. Das Polylysin wurde auf die Bio-Analyse-Vorrichtung aufgebracht und die Übertragungsverlustantwort gemessen. Die Antwort wurde auf ihre Stabilität über der Zeit geprüft und gespeichert. Die Kammer wurde dann mit dem Puffer gespült, die Antwort erneut auf Änderungen durch die Spülung und Stabilität geprüft und die Antwort als Messbasis-Antwort gespeichert.
Danach wurde eine die DNS enthaltene Lösung in die Bio-Analyse-Vorrichtung gegeben und die Änderung der Antwort gemessen, indem die resultierende Antwort von der Messbasis-Antwort subtrahiert und auf Stabilität geprüft wurde. Die Bio-Analyse-Vorrichtung wurde mit dem Puffer gespült, um die DNS aus der Menge zu entfernen, wodurch nur die DNS-/Polylysin-Komplexe an der Oberfläche der Bio-Analyse-Vorrichtung verblieben. Die resultierende Änderung ist in 12J dargestellt.
G. Beispiel 7: Die Einflüsse des pH-Wertes und des Salzgehaltes
Die Effekte des pH-Wertes und des Salzgehaltes im Signal wurden in zwei verschiedenen Experimenten gemessen. Um den pH-Einfluss zu untersuchen, wurde eine Reihe Puffer mit pH-Werten von 3,94 bis 9,80 gemessen. Die Leitfähigkeit bei 60 Hz für jeden Puffer wurde gemessen, um die Änderung durch freie Ionen zu korrigieren. Anschließend wurden Übertragungsverlustantworten bei 100 MHz, 1 GHz und 10 GHz gemessen. Die Ergebnisse sind in 12K dargestellt.
Ein ähnliches Experiment wurde zur Bestimmung der Effekte der Änderung der Ionenkonzentration in einer Lösung durchgeführt. Es wurden mehrere Lösungen angesetzt, beginnend mit einer einfachen d-PBS-Lösung, der verschiedene Mengen Natriumchlorid zugegeben wurden. Dann wurde die Leitfähigkeit bei 60 Hz gemessen und aufgezeichnet, und die Proben wurden der Reihe nach in die Bio-Analyse-Vorrichtung gegeben; die Übertragungsantwort wurde bei 100 MHz, 1 GHz und 10 GHz gemessen. Diese Ergebnisse sind in 12L aufgetragen.
Wie beide Graphen zeigen, resultieren bestimmte Umgebungsänderungen in Änderungen der gemessenen Parameter.
H. Beispiel 8: Detektion in Vollblut
Die Detektion von Troponin-I (TN-I) in unbehandeltem Vollblut erfolgte, um die Detektionsfähigkeit in gestörten Umgebungen zu überprüfen. Das unbehandelte menschliche Blut wurde mit Natriumcitrat behandelt, um eine Gerinnung zu verhindern. Ein Anti-TN-I-Antikörper, der dem Epitop von TN-I entspricht, wurde zu Kalib rierungszwecken verwendet. Die Grenzflächen-Übertragungsleitung der Bio-Analyse-Vorrichtung wurde mit Anti-TN-I Ab (Antiligand) beschichtet. Eine Blutprobe wurde auf eine 10 ng/ml Konzentration des TN-I gespikt und eine zweite identische Blutprobe blieb als Kontrollprobe ungespikt.
Das Experiment bestand aus folgenden Schritten: Antiligand Anti-TN-I Ab an die Vorrichtung anhaften; dann zuerst die ungespikte Probe über die Kammer führen; mehrmaliges Spülen der Probenkammer, um das Austauschrauschen zu bestimmen; dann gespikte Probe, die mehrmals ausgetauscht wurde, um einen Rauschboden zu bestimmen. In jedem Fall wurde die Änderung des Übertragungsverlustes gemessen. Das Experiment wurde zur Kontrolle anschließend wiederholt, um zu bestimmen, ob irgendwelche anderen Eigenschaften der beiden Blutproben (als identisch angenommen mit Ausnahme des TN-I-Spike) für die Änderung verantwortlich waren. Die folgende Tabelle zeigt das Ergebnis dieses Experiments für ein Testsignal bei 1 GHz.
In einer zweiten Testreihe wurden zehn verschiedene Blutproben aus einem klinischen Labor beschafft, die mit Ausnahme des Gerinnungshemmers Heparin unbehandelt waren. Eine der Proben wurde in zwei Teile geteilt, wovon einer mit dem Antiliganden TN-I gespikt wurde wie im vorigen Absatz beschrieben. Die Bio-Analyse-Vorrichtung wurde dann mit dem Antikörper Anti-TN-I auf der Oberfläche vorbereitet. Die Proben wurden dann der Reihe nach durch die Bio-Analyse-Vorrichtung geschickt, wobei die gespikte Probe als letzte aufbewahrt wurde. Die Antworten jeder dieser Proben bei 1 GHz wie im vorigen Experiment wurden gemessen und sind in 12M dargestellt. Die gespikte Probe war deutlich gegenüber dem Rest der (ungespikten) Proben zu unterscheiden.
I. Beispiel 9: Detektion des Vierpolmoments eines Moleküls
Der Effekt der Bindung von Avidin an eine Goldoberfläche wurde untersucht, um die Detektierbarkeit des Vierpolmoments eines Moleküls zu bestimmen. Avidin ist ein Tetramer mit einem sehr kleinen Dipolmoment in ungebundenen Zustand, was durch die Symmetrie des Moleküls im ungebundenen Zustand bedingt ist. 12N zeigt das Ergebnis der Avidinbindung mit den im Graphen dargestellten charakteristischen Spitzen. Es ist zu beachten, dass diese Spitzen deutlich kleiner sind als die Spitzen, die sich aufgrund der Biotinbindung ergeben, wie sie in 12G dargestellt sind.
VII. Anwendungen
Die Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung können in verschiedenen Anwendungen eingesetzt werden, die hierin beschrieben werden.
Die vorliegende Erfindung könnte zur Quantifizierung des Ausmaßes der Bindung zwischen einem Liganden und einem Antiliganden und somit zur Bestimmung des Effektes anderer Moleküle auf die Aktivität eines Enzyms verwendet werden. So könnten beispielsweise andere Moleküle in der Lösung das Ausmaß der Bindung verringern oder erhöhen und auf diese Weise könnte die Identität von Enzyminhibitoren oder -inducern bestimmt werden.
Das Vorhandensein infektiöser Pathogene (Viren, Bakterien, Pilze oder dgl.) oder Karzinotumore kann getestet werden, indem die Bindung eines Antiliganden am Pathogen, der Tumorzelle oder einem Bestandteil des Pathogens oder des Tumors wie einem Protein, einer Zellmembran, einem Zellextrakt, Tumormarker wie CEA oder PSA, anderen antigenen Epitopen oder dgl. überwacht wird. Die Erfindung ist beispielsweise in der Lage, das Pathogen oder den Tumor zu erkennen, indem die Bindung pathogener oder Tumormarker im Blut des Patienten mit einem Antikörper auf der Bio-Analyse-Vorrichtung detektiert wird. Außerdem ist die Bindung eines Antikörpers aus dem Blut eines Patienten an ein virales Protein wie ein HIV-Protein ein üblicher Test, um den Patienten hinsichtlich des Vorliegen des Virus zu überwachen. Ein weiteres allgemein übliches Beispiel ist die Quantifizierung von Prostate Specific Anti gen (prostataspezifischem Antigen – PSA) im Blut des Patienten als Marker für den Fortgang von Prostatakrebs.
Außerdem können Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Rezeptor einschließlich sowohl Membran – als auch Nichtmembran-Rezeptoren und Konformationsänderungen des Rezeptors als Ergebnis der Arzneimittelbindung mit der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Bei einem anderen Aspekt kann die Erfindung zur Lieferung von Informationen über Lipidwechselwirkungen wie Lipo-Proteinbindung an Lipide und liposomale Wechselwirkungen mit Lipiden verwendet werden.
Bei weiteren Ausführungsformen kann die Technologie der Erfindung dazu verwendet werden, Gen-Chips für die Untersuchung von Nukleinsäureproben und proteomische Chips für die Katalogisierung und Beschreibung von Proteinen bereitzustellen. Derartige Chips können sich die einzigartige Fähigkeit der Erfindung zunutze machen, indem sie gleichzeitig Affinität, Kinetik und die unverwechselbaren dielektrischen Signaturen jedes Bindungsereignisses messen und diese Messungen an einer Mehrzahl adressierbarer Messstellen auf dem Chip ausführen. Die genaue Art der Adressierung hängt von den Anwendungen ab, aber die allgemeine Strategie ist wie folgt: Definieren eines Vektorraums durch die Variablen K_eg, k_A und ω = (ω1, ω2, ω3, ...), wobei diese Variablen die Gleichgewichtskonstante, die kinetische Konstante und eine Basismenge von N Frequenzen repräsentieren, bei denen die dielektrischen Eigenschaften untersucht werden. Ein Raum mit N+2 Dimensionen wird so definiert, in den jedes Bindungsereignis abgebildet werden kann. Anschließend wird eine Gruppe Referenzmoleküle gewählt, die ein Spektrum interessierender Bindungsereignisse repräsentiert, z. B. eine Gruppe Oligonukleotide mit verschiedenen Nukleinsäuresequenzen oder eine Auswahl Antikörper, die spezifisch für Proteinbereiche oder andere Substrukturen von Proteinen sind, und an die adressierbaren Punkte des Chip angebracht. Eine bestimmte Spezies Moleküle oder Gruppe Spezies wird in den Chip eingebracht und jede Adresse wird dann auf den Wert jedes der Punkte im oben definierten Vektorraum (oder einer geeigneten Untermenge desselben ) geprüft. Jede Spezies kann dann durch eine Adresse im Vektorraum repräsentiert werden. Die Komplexität des Systems hängt von der Größe des Vektorraums und der Gesamtzahl verschiedener immobilisierter Liganden auf der Oberfläche ab.
Als Beispiel für das oben Gesagte sei ein einfaches System betrachtet, das aus zwei verschiedenen Nukleinsäuresträngen besteht, die bei vier verschiedenen Frequenzen analysiert werden; weiterhin kann jede dieser Frequenzen in zehn verschiedene Amplituden analysiert werden. Ein solches System hätte 100 Millionen mögliche Adressen (10⁴ für den ersten Polymorphismus und 10⁴ für den zweiten Polymorphismus). Eine in das System eingeführte Unbekannte wird durch eine eindeutige Adresse der Form [[1, 5, 3, 7)(4, 8, 6, 7)] repräsentiert, wobei die ersten vier Zahlen die spektrale Antwort des ersten Strangs bei den vier gewählten Frequenzen und die zweiten vier Zahlen die spektrale Antwort des zweiten Strangs bei den vier gewählten Frequenzen repräsentieren. Somit können mit nur zwei Strängen und vier Frequenzen 100 Millionen eindeutige Adressen erzeugt werden.
"Smart Needle" IV-Analysen, die eine Miniatur-Bio-Analyse-Vorrichtung in der Bohrung einer Nadel bereitstellen, können die Technologie der vorliegenden Erfindung ebenfalls nutzen. Diese Ausführungsform kann zur Bereitstellung kostengünstiger und sicherer medizinischer Diagnosegeräte für den Einsatz in Notaufnahmen und anderen Versorgungsstellen und dgl. verwendet werden. Anwendungsbeispiele sind u. a.: Diagnostizieren akuter Zustände wie Herzanfälle, infektiöse Erkrankungen wie bakterielle Meningitis, Group B Step-Infektionen in der neonatalen/perinatalen Umgebung, Koagulopathien, fötale und neonatale Oxigenation in Intensivstationen, Diagnostizieren chronischer Zustände in Versorgungsstellen wie medizinische Dienste und Außenstellen.
Eine Bio-Analyse-Vorrichtung mit einer Mehrzahl biologischer Bindungsparameter gestattet die gleichzeitige Analyse einer Mehrzahl Analyten in einer Probe. Außerdem bietet die Messung der Bindung eines einzigen Analyten an eine Reihe verschiedener Spezies biologischer Bindungspartner eine Kontrolle für eine unspezifische Bindung. Ein Vergleich des Bindungsausmaßes verschiedener Analyten ein einer Testprobe gestattet die Evaluierung der relativen Zunahme oder Abnahme der verschiedenen Analyten.
Die Bio-Analyse-Vorrichtung dieser Erfindung kann zur Erkennung praktisch jedes Analyten in vivo oder ex vivo verwendet werden. Während bei einer bevorzugten Ausführungsform der Analyt ein biologisches Molekül sein kann, braucht diese nicht diesbezüglich eingeschränkt zu sein, sofern ein spezifischer Bindungspartner verfügbar ist oder eine andere Eigenschaft des Analyten in einer der hierin beschriebenen Ausführungsformen gemessen werden kann. Geeignete Analyten umfassen praktisch jeden in biologischen Materialien oder daraus verarbeiteten Materialien vorkommenden Analyten. Praktisch jeder Analyt, der in einer vorzugsweise wässrigen Lösung suspendiert oder gelöst werden kann, kann mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung detektiert werden. Beispiele für Analyten von Interesse sind u. a.: 1) Antikörper wie Antikörper zu HIV; 2) Helicobacter pylori, Hepatitis (z. B. Hepatitis A, B und C), Masern, Mumps und Röteln; Missbrauchsdrogen und ihre metabolischen Nebenprodukte wie Kotinin, Kokain, Benzoylecgonin, Benzodiazepin, Tetrahydrocannabinol, Nikotin, Ethanol; 3) therapeutische Arzneimittel einschl. Theophyllin, Phenytoin, Acetaminophen, Lithium, Diazepam, Nortryptylin, Secobarbital, Phenobarbitol und dgl.; 4) Hormone und Wachstumsfaktoren wie Testeron, Estradiol, 17-Hydroxyprogesteron, Progesteron, Thyroxin, Thyreoidea stimulierendes Hormon, Follikel stimulierendes Hormon, luteinisierendes Hormon, transformierender Wachstumsfaktor Alpha, epidermaler Wachstumsfaktor, insulinartiger Wachstumsfaktor I und II, Release Inhibiting Wachstumsfaktor und Sexualhormone, die Globulin binden; sowie 5) andere Analyten einschließlich Glukose, Cholesterin, Koffein, Corticosterid bindendes Globulin, DHEA bindendes Glycoprotein und dgl.
Wie oben angegeben sind geeignete Analyten u. a. Proteine, Glycoproteine, Antigene, Antikörper, Nukleinsäuren, Zucker, Kohlehydrate, Lektine und dgl. Es können jedoch auch größere multimolekulare Einheiten wie Zellen, Zellmembrane und andere zellulare Bestandteile mit den Methoden dieser Erfindung detektiert und/oder quantifiziert werden. So können z. B. Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Pilze, Algen etc.) mit charakteristischen Oberflächen-Markern (z. B. Rezeptoren, Lektine etc.) detektiert und/oder quantifiziert werden (z. B, in einer biologischen Probe von einem Tier oder einer Pflanze). Ähnliches gilt für Zelltypen (z. B. Zellen, die für ein bestimmtes Gewebe charakteristisch sind) mit charakteristischen Markern (z. B. Tumorzellen, die IL-13-Rezeptor hervorheben (siehe z. B. U.S.-Patent 5,614,191)). Somit können Zellen, die auf bestimmte Pathologien, bestimmte Zustände der Differenzierung (oder deren Fehlen) oder bestimmte Gewebetypen hinweisen, detektiert und/oder quantifiziert werden.
Konjugation des biologischen Bindungspartner- (Ligand oder Antiligand)-Effektormoleküls mit der "Chip"-Oberfläche Bei einer Ausführungsform wird der biologische Bindungspartner (Ligand oder Antiligand) chemisch mit der darunter liegenden Oberfläche konjugiert (z. B. mit der bioelektrischen Grenzfläche). Mittel zur chemischen Konjugation von Molekülen sind dem Fachmann hinreichend bekannt (siehe z. B. Kapitel 4 in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch und Lennox, Hrsg. John Wiley & Sons, Inc., N. Y. (1995), in dem die Konjugation von Antikörpern an Antikrebsmedikamente, Indikatoren einschl. Radio-Indikatoren, Enzymen und dgl. beschrieben wird).
Die Vorgehensweise, mit der ein Bindungspartner (z. B. Protein, Antikörper, Glycoprotein, Nukleinsäure, Lektin, Zucker, Kohlenhydrat etc.) an eine Oberfläche gebunden wird, ist entsprechend der chemischen Struktur des Bindungspartners verschieden. Polypeptide enthalten typischerweise vielfältige funktionale Gruppen, z. B. Karbonsäure (COOH) oder freie Amino- (-NH₂)-Gruppen, die zur Reaktion mit einer geeigneten funktionalen Gruppe auf der Oberflächen oder mit Kopplungsgruppen, an die sie gebunden sind, vorliegen. Ähnlich enthalten andere biologische Moleküle z. B. Nukleinsäuren, Zucker, Kohlenhydrate sämtlich vielfältige funktionale Gruppen (z. B. OH, NH₂, COOOH, -S etc.), die geeignete Kopplungspunkte sind.
Alternativ kann das Zielmolekül und/oder das Effektormolekül derivatisiert werden, um zusätzliche reaktive funktionale Gruppen freizusetzen oder zu binden. Die Deriva tisierung kann das Anhaften jedes beliebigen Moleküls aus einer Reihe Kopplungsmoleküle beinhalten, wie sie von der Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, erhältlich sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein "Koppler" ein Molekül, das zur Verbindung des biologischen Bindungspartners (z. B. Ligand oder Antiligand) mit der darunter liegenden (z. B. Gerät oder Vorrichtung) Oberfläche verwendet werden kann. Der Koppler ist in der Lage, gleichwertige Bindungen sowohl mit dem biologischen Bindungspartner als auch mit der darunter liegenden Oberfläche zu bilden. Geeignete Koppler sind dem Fachmann hinreichend bekannt und enthalten u. a. Kohlenstoffkoppler mit geraden oder verzweigten Ketten, heterozyklische Kohlenstoffkoppler oder Peptidekoppler.
Ein bifunktionaler Koppler mit einer funktionalen Gruppe, die mit einer Gruppe auf der Oberfläche reagiert, und einer anderen Gruppe, die mit dem Bindungspartner reagiert, kann zur Bildung der gewünschten Konjugation verwendet werden. Alternativ kann die Derivatisierung eine chemische Behandlung des Bindungspartners und/oder des Substrats beinhalten. Beispielsweise kann ein Siliziumdioxid- oder Glassubstrat silanisiert werden, um eine funktionale Gruppe zu erzeugen. In ähnlicher Weise kann ein Protein oder Glycoprotein derivatisiert werden, z. B. durch Glycolspaltung eines Zuckeranteils, der am Proteinantikörper mit Perjodat haftet, um freie Aldehydgruppen zu erzeugen. Die freien Aldehydgruppen am Antikörper oder Protein oder Glycoprotein können mit freien Amino- oder Hydrazingruppen an der Oberfläche umgesetzt werden, um den Bindungspartner damit zu binden (siehe U.S.-Patent Nr. 4,671,958). Verfahren zur Erzeugung freier Sulfhydrylgruppen an Polypeptid wie Antikörper oder Antikörperfragmente sind ebenfalls bekannt (siehe U.S.-Patent Nr. 4,659,839).
Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren und Kopplungsmoleküle zum Anhaften verschiedener biologischer Moleküle an verschiedene Metall-, Glas-, Kunststoffsubstrate etc. hinreichend bekannt. Siehe z. B. Europäische Patentanmeldung Nr. 188,256; U.S.-Patente Nr. 4,671,958; 4,659,839; 4,414,148; 4,699,784; 4,680,338; 4,569,789 und 4,589,071 sowie Borlinghaus et al. (1987) Cancer Res 47:4071-4075. Verfahren zur Konjugation von Antikörpern, Proteinen und Glycoproteinen finden sich in großer Zahl in der Immunotoxin-Literatur wie z. B. in "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe et al., Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, S. 168 – 190 (1982) Waldmann, Science, 252:1657 (1991), U.S.-Patente Nr. 4,545,985 und 4,894,443.
Verwendung von Nukleinsäure-Bindungspartnern
Wenn der Bindungspartner eine Nukleinsäure ist (z. B. DNS; RNS, Peptid, Nukleinsäure etc.) wird eine spezifische Bindung vorzugsweise unter "stringenten" Bedingungen erzielt, wobei die Hybridisierung umso spezifischer ist, je stringenter die Bedingungen sind.
Die Wahl stringenter Bedingungen für jede beliebige Strang-/Zielkombination ist für den Durchschnittsfachmann eine Routineaufgabe. Außerdem kann die Stringenz empirisch bestimmt werden, indem die Stringenz der Bedingungen allmählich verstärkt wird (z. B. Erhöhen der Salzkonzentration, der Temperatur etc.), bis das gewünschte Maß an Spezifität erreicht worden ist.
"Ausgangspunkte" für stringente Bedingungen sind hinreichend bekannt. So hybridisieren z. B. die gewünschten Nukleinsäuren zu komplementären Nukleinsäuresträngen unter den Hybridisierungs- und Waschbedingungen von 50%-igem Formamid bei 42°C. Andere stringente Hybridisierungsbedingungen können ebenfalls gewählt werden. Im Allgemeinen werden die stringenten Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) der spezifischen Sequenz bei einer definierten ionischen Stärke und einem definierten pH liegen. Der T_m ist die Temperatur (bei definierter ionischer Stärke und definiertem pH), bei dem 50% der Zielsequenz zu einem perfekt gepaartem Strang hybridisieren. Stringente Bedingungen sind typischerweise solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens 0,02 M bei pH 7 und die Temperatur mindestens 60°C beträgt. Da andere Faktoren die Strin genz der Hybridisierung erheblich beeinflussen können, zu denen u. a. die Basenzusammensetzung und die Größe der komplementären Stränge, das Vorhandensein organischer Lösungsmittel und das Ausmaß der Basenfehlpaarung zählt, ist die Kombination von Parametern wichtiger als das absolute Maß eines einzelnen. Eine ausführliche Anleitung zur Hybridisierung von Nukleinsäuren findet sich in Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology Current Protocols, einem Gemeinschaftsunternehmen zwischen Greene Publishing Associated, Inc. und John Wiley & Sons, Inc. (ergänzt bis 1998).
Oligonukleotide zur Verwendung als Bindungspartner werden chemisch synthetisiert z. B. nach dem Phosphoramidit-Triester-Verfahren aus der festen Phase, das zuerst von Beaucage, S. L. und Carruthers, M. H., 1981, Tetrahedron Lett., 22 (20):1859-1862 beschrieben wurde, wobei ein automatischer Synthesizer verwendet wurde, wie er von Needham-VanDevanter, D. R. et al., 1984, Nucleic Acid Res., 12:6159-6168 beschrieben wird. Die Reinigung der Oligonukleotide erfolgt entweder durch native Acrylamidgel-Elektrophorese oder durch Anionenaustausch HPLC wie in Pearson, J. D. und Regnier, F. E. (1983), J. Chrom. 255:137-149, beschrieben. Die Sequenz des synthetischen Oligonukleotids kann mittels des chemischen Degradationsverfahrens von Maxam, A. M. und Gilbert, W. (1980) in Methods Enzymol. 65:499-560 variiert werden.
Die Bio-Analyse-Vorrichtung hat einen weiten Anwendungsbereich einschließlich beispielsweise die Untersuchung einer großen Anzahl Moleküle auf biologische Aktivität oder die Untersuchung biologischer Proben auf die vorhandene oder fehlende Konzentration einer bestimmten Komponente oder bestimmter Komponenten. Bei der Untersuchung auf biologische Aktivität z. B. wird die Bindungsschicht einem oder mehreren Rezeptoren ausgesetzt wie Antikörpern oder Vollzellen. Durch die Detektion einer Wechselwirkung zwischen Antiligand und Ligand der Bindungsschicht können Vorhandensein und Konzentration bestimmt werden. Ein besonderer Vorteil dieser Technik besteht darin, dass keine Indikatoren erforderlich sind, um diese Wechselwirkung zu erkennen. Die inhärenten Eigenschaften der einzelnen Moleküle dienen zur Detektion ihres Vorhandenseins und ihrer Menge, ihres Fehlens oder der Wechselwirkung mit anderen Molekülen.
Andere mögliche Anwendungen für die Bio-Analyse-Vorrichtung oder den Chip betreffen die Diagnostik, wobei verschiedene Antikörper für bestimmte Rezeptoren verwendet werden würden, um die Bindungsschicht zu bilden, und Blut z. B. auf Immunerkrankungen untersucht werden würde. Die Bio-Analyse-Vorrichtung wird wahlweise so hergestellt, dass sie in die Bohrung einer hypodermischen Nadel passt. Es wäre nur eine winzige Blutprobe erforderlich, um eine Bindung an einen zuvor aufgebrachten Antiliganden auf der Bindungsschicht zu detektieren. Eine Bio-Analyse-Vorrichtung kann zur Messung eines weiten Bereichs klinisch relevanter Analyten, von Pathogenen wie Viren oder Bakterien zu metabolischen Aktivitäten wie Glukosekonzentration oder Lipidpegel bis zu den üblichen Tests für Leberenzyme, Elektrolyte, Gerinnungsfaktoren, spezifischen Antikörpern wie ANA (bei rheumatologischen Erkrankungen verwendet) und allergischen Reaktionen auf Antikörper, Oxigenation von arteriellem Blut, Missbrauchsdrogen und dgl. hergestellt werden.
Die in dieser Funktion verwendete Bio-Analyse-Vorrichtung bestünde aus kostengünstigen Einmal-Chips, da diese leicht herzustellen und nicht auf die Halbleiterverarbeitung beschränkt sind. Die Chips werden beispielsweise optional auf kostengünstigen Materialien wie Kunststoff- oder Glassubstrate hergestellt. Die Chips werden dann wahlweise in eine Vorrichtung eingesetzt wie nachstehend beschrieben, und ein Signal wird durch die Bio-Analyse-Vorrichtung übertragen, um die Bindungswechselwirkungen aufgrund der Liganden im Blut zu detektieren. In der Tat könnten zahlreiche verschiedene Formen und Größen der Bio-Analyse-Vorrichtungen mit verschiedenen Bindungsschichten für die zahllosen biologischen und chemischen Anwendungen hergestellt werden, für die Detektion ohne Indikator nützlich wäre.
Unbekannte und nicht charakterisierte Proteine können klassifiziert und/oder identifiziert werden, indem die Bindung an strukturelle Muster des unbekannten Proteins detektiert wird. So haben beispielsweise Proteine in derselben oder in einer ähnlichen Klasse strukturelle Homologien; d. h. Substrukturen wie Bereiche, die sich innerhalb einer gegebenen Proteinklasse wiederholen. Durch die Herstellung eines Chip mit mehreren adressierbaren Matrizen, von denen eine jede einen Antiliganden für eine spezifische Substruktur hat, könnte eine unbekannte molekulare Spezies wie folgt klassifiziert und/der identifiziert werden: Das Vorhandensein bestimmter Substrukturen wird durch die Bindung einer jeden an ihren jeweiligen Antiliganden erkannt. Jedes dieser Substruktur-Bindungsereignisse wird dann durch Eigenschaften wie Affinität, Kinetik und spektrale Empfindlichkeit charakterisiert. Dann erfolgt die Korrelation zwischen der unbekannten molekularen Spezies und den von bekannten Proteinen erhaltenen Daten. In dem Fall, in dem keine exakte Übereinstimmung gefunden wird, können zahlreiche der strukturellen Details der unbekannten Verbindung in vergleichbarer Weise zusammengefügt werden wie dies bei der Kernresonanz(NMR)-Spektroskopie für organische Moleküle geschieht.
Bei einer anderen Ausführungsform kann diese Technik zur Entwicklung von Genchips für die Detektion von Nukleinsäuren angewendet werden. Genchips sind Matrizen aus Nukleinsäuren, die zur Detektion komplementärer Nukleinsäuren in einer Probe verwendet werden. Das Vorhandensein der komplementären DNS, wie durch die Bindung an ein bestimmtes DNS-Molekül auf dem Genchip gemessen, ist das gewünschte Ergebnis. Falls diese komplementäre Bindung nicht stattfindet, kann eine partielle Hybridisierung erkannt und charakterisiert werden, indem physikalische Größen wie Affinität, Schmelzpunkt oder andere Stringenzbedingungen gemessen und die direkte spektrale Empfindlichkeit des Signals und die Korrelation mit zuvor gemessenen Daten bestimmt werden. Auf diese Weise kann ein einziger Antiligand in Form einer Nukleinsäuresequenz einen ganzen Bereich Polymorphismen detektieren, ohne dass eine eigene Sequenz für jeden Polymorphismus erforderlich ist. So könnten z. B. mit einem Chip mit einigen wenigen hundert verschiedenen Nukleinsäuresequenzen zehntausende verschiedener Polymorphismen detektiert werden.
Genchips können zur Identifizierung von Drogenzielen, zur bakteriellen Identifizierung, Typisierung von Genen und andere diagnostische Aufgaben eingesetzt werden.
Die Technik erfordert das Anhaften der erforderlichen Nukleinsäuren, typischerweise als Stränge, an das Substrat und ein Verfahren zur Messung der Bindung komplementärer Nukleinsäuren an diesem Substrat. Normalerweise benötigen die Nukleinsäuren der Probe einen Indikator, was am häufigsten durch einen fluoreszierenden Strang erfolgt. Mit dieser Technologie wird die Notwendigkeit eines Indikators für die Proben-DNS überflüssig und die damit zusammenhängenden Probleme werden beseitigt. Genchips können für spezielle Bedürfnisse bei der Drogen-Zielidentifizierung, der molekularen Diagnostik und der Detektion und Identifizierung biologischer Kampfstoffe entwickelt werden. Andere Vorrichtungstypen, die hergestellt werden könnten Immunoassay-Vorrichtungen, Arzneimittel-Entdeckungsvorrichtungen und Toxiditäts-Testvorrichtungen, analytische Vorrichtungen und dgl.
Die hierin beschriebene Erfindung kann auch bei zahlreichen Aspekten in der Entwicklung neuer Arzneimittel eingesetzt werden, vom erstmaligen Untersuchungsprozess bis hinzur Patiententypisierung und therapeutischen Überwachung. In den Anfangsstadien der Arzneimittelentdeckung kann die Erfindung zur Vereinfachung der Zielidentifizierung, Validierung und der Prüfung mit hohem Durchsatz (high throughput screening) angewendet werden. Der Zielrezeptor kann der Antiligand auf der Bio-Analyse-Vorrichtung sein und durch die Charakterisierung der Aktionen bekannter Agonisten, Antagonisten oder allosterischer Effektoren könnten erste Ziele für die Prüfung mit hohem Durchsatz rasch identifiziert und validiert werden. Im HTS-Prozess werden hunderttausende Verbindungen getestet, um zu bestimmen, welche sich an das Ziel binden kann. Die hierin beschriebene Erfindung kann miniaturisiert werden, so dass äußerst gleichartige Prüfplattformen verwirklicht werden können, die in der Lage sind, hunderte oder tausende Verbindungen gleichzeitig zu prüfen und gleichzeitig den Effekt der Bindung (z. B. Agonist oder Antagonist), Affinität, Kinetik etc. zu bestimmen. Außerdem benötigen solche Miniatursysteme sehr geringe Verbindungsmengen, wodurch deutlich Kosten bei der Beschaffung dieser Verbindungen aus kombinatorischen Bibliotheken eingespart werden. Das durch die Verwendung der Bio-Analyse-Vorrichtung gebildete Detektionssystem stellt ein Detektionssystem mit hohem Durchsatz bereit, da die Detektion wahlweise in Echtzeit geschieht und zahlreiche Proben rasch analysiert werden können. Die Antwortperiode wird wahlweise auf einer Nanosekunden-Zeitskala überwacht. Sobald die Moleküle aneinander gebunden sind, findet die Detektion statt. Für die Messung niedriger Konzentrationen oder von Bindungsereignissen zwischen Molekülen mit geringer Bindungsaffinität ist evtl. mehr Zeit erforderlich. Die tatsächliche Zeit wird durch die Diffusionsraten begrenzt. Abgesehen von diesen potentiellen Einschränkungen durchlaufen tausende Verbindungen sehr rasch das System, z. B. innerhalb einer Stunde. Unter Anwendung von Chip-Herstellungstechnologien ist beispielsweise eine Vorrichtung mit 10.000 Kanälen (bei Nutzung der neuen Mikrofluidiktechnologien) möglich und bei kleinen Volumina und somit kurzen Diffusionszeiten sowie mit kinetischen Messungen, die nur den Beginn der Reaktion messen, werden optional 10 Millionen Proben pro Stunde gemessen. Bei bekannten Konzentrationen wird die Bindungsaffinität optional allein aus der Kinetik berechnet und somit kann die Vorrichtung mit einer sehr schnellen Zeitskala abgetastet und die Affinität aus der Neigung der kinetischen Kurve berechnet und/oder geschätzt werden. Angaben zu Kinetik und Affnitäten finden sich in jedem Standardwerk über Biochemie oder Chemie, z. B. in Mathews und van Holde, Biochemistry, Benjamin Cummings, New York, 1990.
Die Erfindung lässt sich auf einfache Weise in zellbasierte Analysen erweitern, da die Detektion eventuell keine Reinigung und Verstärkung der Probe erfordert. Bei diesen Anwendungsklassen können zellulare System auf verschiedene Änderungen entweder durch die Detektion externer Ausdrücke oder durch Lysieren der Zelle zum Freisetzen zytosolischer Bestandteile und Detektion des Vorhandenseins eines oder mehrerer interessierender Analyten überwacht werden.
Die Erfindung kann auch für "Labor-auf-einem-Chip"-Anwendungen ausgeführt werden. Aufgrund der einfachen Miniaturisierung können sehr kleine Chips mit tausenden oder zehntausenden darin enthaltener adressierbarer Bio-Analyse-Vorrichtungen verwirklicht werden. Der Detektor kann als eine Art "Logikgatter" verwirklicht werden, bei dem das Vorhandensein eines bestimmten Liganden oder Analysen den Effekt hat, dass das Gatter entsprechend der jeweiligen Anwendung entweder ein- oder ausgeschaltet wird. Ein solches Gatter kann auf beliebig viele Arten verwirklicht werden, die das Bindungsereignis in ein elektrisches Signal wandeln, das einem von zwei möglichen Zuständen entsprechend Aus oder Ein, 1 oder 0 und dgl. zugeordnet werden kann. Die beiden Zustände könnten verschiedene Frequenzen eines Hohlraumresonators oder Wellenleiters entsprechend gebunden und ungebunden oder Amplitudenänderungen einer Übertragungsleitung oder eines Wellenleiters, die gebunden oder ungebunden entsprechen, oder Änderungen des Bandpass einer bestimmten Schaltung sein oder dgl.
Oben wurde zwar eine vollständige Beschreibung möglicher Ausführungsformen der Erfindung gegeben, es können jedoch verschiedene Alternativen, Modifikationen und Entsprechungen verwendet werden. Für den Fachmann liegt es beispielsweise auf der Hand, dass der Signalweg der obigen Bio-Analyse-Vorrichtung nicht auf eine Übertragungsleitung beschränkt ist. Andere Übertragungsmedien wie leitfähige oder dielektrische Wellenleiter können wahlweise verwendet werden.

Claims

Verfahren zum Untersuchen von Wechselwirkungen eines Analyts mit seiner Umgebung unter Verwendung eines modulierten Signals, um die Wechselwirkungen zu untersuchen, wobei das Verfahren umfasst: das in Verbindung Setzen einer ersten wässrigen Umgebung (157), die den Analyt und wahlweise zusätzliche Komponenten enthält, mit einer Bio-Analyse-Vorrichtung (150), umfassend: (1) einen Signalweg, wobei der Signalweg umfasst: (a) einen Wellenleiter oder (b) eine Übertragungsleitung (120), ein Grundelement (130) und ein dielektrisches Material (158), das zwischen der Übertragungsleitung und dem Grundelement angeordnet ist, wobei der Signalweg so gestaltet ist, dass elektromagnetische Signale bei einer oder mehreren Frequenzen ein einem Bereich von 10 MHz bis 1000 GHz übertragen werden, und (2) eine Molekularbindungsschicht (156), die elektromagnetisch an den Signalweg gekoppelt ist, wodurch nach dem Kontaktieren der Analyt mit der Molekularbindungsschicht wechselwirkt; das Übertragen eines ersten Eingangssignals im Bereich von 10 MHz bis 1000 GHz entlang des Signalwegs, wodurch das Eingangssignal elektromagnetisch an die Molekularbindungsschicht gekoppelt wird; das Detektieren des modulierten Signals, das während der Wechselwirkung des ersten Eingangssignals mit der Molekularbindungsschicht nach dem Kontakt der Molekularbindungsschicht mit der ersten wässrigen Umgebung erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das modulierte Signal unter Bezug auf ein oder mehr Vergleichssignale kalibriert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Wechselwirkung das Binden des Analyts an ein Molekül in der Molekularbindungsschicht umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wechselwirkung eine Wechselwirkung zwischen dem Analyt und Wasser in der wässrigen Umgebung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wechselwirkung eine Konformationsänderung in einem Protein als Ergebnis einer Änderung in der wässrigen Umgebung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Molekularbindungsschicht die Übertragungsleitung unmittelbar und physikalisch kontaktiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Übertragungsleitung eine Oberfläche hat, die derivatisiert ist, und die Molekularbindungsschicht kovalent an die derivatisierte Oberfläche gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Molekularbindungsschicht von der Übertragungsleitung beabstandet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Molekularbindungsschicht einen Antiliganden umfasst, der für den Analyt spezifisch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die erste wässrige Umgebung mit der Molekularbindungsschicht in Verbindung gesetzt wird, während mehrere Eingangssignale entlang der Übertragungsleitung übertragen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die erste wässrige Umgebung eine Probe einer Körperflüssigkeit umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei das Molekül eine Testverbindung ist und der Analyt ein Zielrezeptor ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei der Analyt ein erstes Nukleinsäuremolekül mit einer ersten Sequenz ist und das Molekül ein zweites Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz ist, die genau komplementär zu der ersten Sequenz ist oder eine Fehlpaarung in ihrer Sequenz aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 11, wobei der Analyt ein erstes Protein ist und das Molekül ein zweites Protein ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Grundelement eine Grundebene (130) parallel zur Übertragungsleitung an der Molekularbindungsschicht umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Molekularbindungsschicht zwischen der Übertragungsleitung und der Grundebene angeordnet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Eingangssignal bei einer Frequenz von 100 MHz bis 1000 GHz arbeitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Eingangssignal bei einer Frequenz von 1 GHz bis 1000 GHz arbeitet.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 18, wobei das Eingangssignal bei einer Frequenz größer als 10 MHz und kleiner als 100 GHz arbeitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei das Eingangssignal bei einer Frequenz größer als 45 MHz und kleiner als 20 GHz arbeitet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei das Eingangssignal einen Bereich von Frequenzen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei der Signalweg einen Resonanzkreis umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 22, weiter umfassend: das Aussetzen der Molekularbindungsschicht einer zweiten Lösung, die ein zweites Molekül enthält oder vermutlich enthält, das an das Molekül oder den Analyt bindet; und das Übertragen eines zweiten Testsignals entlang des Signalwegs, wodurch das zweite Testsignal an die Molekularbindungsschicht gekoppelt wird und eine zweite Signalantwort zeigt, die auf das Binden des zweiten Moleküls hinweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, das so angepasst ist, dass die Klassifikation eines unbekannten Liganden ermittelt wird, umfassend: das Bereitstellen eines Signalwegs, der an eine erste Molekularbindungsschicht gekoppelt ist, wobei die Molekularbindungsschicht N jeweilige Antiliganden zum Binden an N jeweilige Ligand-Unterstrukturen umfasst; das Aufbringen einer Lösung, die einen oder mehrere unbekannte Liganden enthält, über der Molekularbindungsschicht; das Bilden, als Antwort darauf, einer zweiten Molekularbindungsschicht entlang des Signalswegs, wobei die zweite Molekularbindungsschicht die N Antiliganden und jeden der unbekannten Liganden umfasst, die an einen der N Antiliganden gebunden haben; das Weiterleiten einer Vielzahl von Testsignalen an die zweite Molekularbindungsschicht, wobei jedes der Testsignale an mindestens einen der N Antiliganden koppelt, der an einen der Ligand-Unterstrukturen bindet und als Antwort darauf eine gemessene Antwort zeigt, die auf das Vorhandensein einer Bindung des Antiliganden an die Unterstruktur hinweist; und das Bereitstellen von bekannten Signalantworten zum Vergleich mit der gemessenen Antwort, wobei die bekannten Antworten eine bekannte Klassifikation von Liganden definieren, wobei der unbekannte Ligand innerhalb der bekannten Klassifikation klassifiziert wird, wenn eine vorbestimmte Zahl der bekannten Signalantworten innerhalb eines vorher bestimmten Bereichs mit den gemessenen Reaktionen korreliert.
Vorrichtung zum Untersuchen der Wechselwirkung eines Analyts mit seiner Umgebung, umfassend: einen Signalweg, wobei der Signalweg umfasst: (a) einen Wellenleiter oder (b) eine Übertragungsleitung (120), ein Grundelement (130) und eine dielektrische Schicht (158), die zwischen der Übertragungsleitung und dem Grundelement angeordnet ist, wobei der Signalweg so gestaltet ist, dass elektromagnetische Signale bei einer oder mehreren Frequenzen in einem Bereich von 10 MHz bis 1000 GHz übertragen werden; eine Molekularbindungsschicht (156), die elektromagnetisch an den Signalweg gekoppelt ist; eine Signalquelle (110) zum Übertragen eines ersten Testsignals im Bereich von 10 MHz bis 1000 GHz entlang des Signalwegs, wodurch das Testsignal elektromagnetisch an die Molekularbindungsschicht gekoppelt wird; und einen Detektor (160) zum Detektieren eines ersten modulierten Signals, das während der Wechselwirkung des ersten Testsignals mit der Molekularbindungsschicht erhalten wird.
Vorrichtung nach Anspruch 25, weiter umfassend Mittel zum Vergleichen des ersten modulierten Signals mit einem Vergleichssignal.
Vorrichtung nach Anspruch 26, weiter umfassend eine Rückhaltestruktur zum Zurückhalten einer Lösung entlang der Molekularbindungsschicht.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 27 mit einem Eingangssignalanschluss und einem Ausgangssignalanschluss, die denselben physikalischen Anschluss umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 27 mit einem Eingangssignalanschluss und einem Ausgangssignalanschluss, die zwei physikalisch getrennte Anschlüsse umfassen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 25 bis 29, wobei das Testsignal umfasst: entweder (a) ein frequenzvariables Signal, wobei die Signalantwort eine Übertragungsverlust-S2l-Frequenzantwort des Testsignals umfasst; oder (b) ein frequenzvariables Signal, wobei die Signalantwort eine Rückführungsverlust-S11-Frequenzantwort des Testsignals umfasst; oder (c) ein frequenzvariables Signal, das eine Resonanzantwort ist; oder (d) ein frequenzvariables Signal, das eine nicht-resonante Antwort ist; oder (e) eine reine Frequenz oder ein frequenzvariables Signal, wobei die Signalantwort eine Verschiebung in einer oder mehreren der Frequenzen umfasst; oder (f) eine Zeitbereichswellenform und die Signalantwort eine übertragene Zeitbereichsantwort umfasst; oder (g) eine Zeitbereichswellenform und die Signalantwort eine reflektierte Zeitbereichswellenform umfasst; oder (h) eine Zeitbereichswellenform mit variierenden Pulsintervallen und die Signalantwort eine reflektierte Zeitbereichswellenform umfasst.
Computerprogrammelement umfassend Computerprogrammcode, damit ein Computer die Schritte des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24 durchführt.
Computerprogrammelement nach Anspruch 31, das auf einem computerlesbaren Medium verkörpert ist.