DE69917258T2

DE69917258T2 - Methode und vorrichtung zum elektrochemischen immunoassay mehrerer analyten

Info

Publication number: DE69917258T2
Application number: DE69917258T
Authority: DE
Inventors: B. Harvey BUCK; D. Zhi DENG; R. Eric DIEBOLD
Original assignee: Roche Diagnostics Corp
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2019-05-29
Also published as: AU4215999A; DE69902662D1; US6294062B1; DE69902662T2; AU4217899A; AU4215799A; WO1999063346A1; US20020090632A1; EP1084133A1; CA2333732C; ES2220066T3; USRE40198E1; WO1999062919A1; US6262264B1; EP1084133B1; ATE266868T1; ATE222915T1; CA2333875A1; CA2333686A1; CA2333686C

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Detektieren und Quantifizieren von biologisch signifikanten Analyten in einer Flüssigprobe. Genauer gesagt, ist diese Erfindung auf einen Biosensor und ein Verfahren zur Verwendung desselben für elektrochemische Immunoassays von mehreren Analytenspezies in einer einzelnen Flüssigprobe gerichtet.
Hintergrund und Zusammenfassung der Erfindung
Heute durch medizinische Praktiker bei der Behandlung ihrer Patientenpopulation verwendete therapeutische Protokolle erfordern genaue und bequeme Verfahren zum Überwachen von Patientenkrankheitszuständen. Es ist viel Aufwand in der Forschung und Entwicklung von Verfahren zum Messen der Anwesenheit und/oder der Konzentration von biologisch signifikanten Substanzen gerichtet worden, die für eine klinische Bedingung und einen Krankheitszustand indikativ sind, insbesondere in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Urin oder Speichel. Solche Verfahren sind entwickelt worden, um die Existenz oder Schwere einer breiten Vielzahl von Krankheitszuständen, wie etwa Diabetes, metabolischen Störungen, hormonellen Störungen und zum Überwachen der Anwesenheit oder Konzentration von rezeptpflichtigen oder illegalen Drogen festzustellen. Jüngst sind signifikante Fortschritte bei der Verwendung von Affinitäts-basierten elektrochemischen Detektions-/Messtechniken gemacht worden, die sich zumindest teilweise auf die Bildung eines Komplexes zwischen der untersuchten chemischen Spezies (dem "Analyten") und einer anderen Spezies stützen, an welche sie spezifisch bindet (ein "spezifischer Bindungspartner"). Solche Verfahren verwenden typischerweise einen markierten Ligandanalog des Zielanalyten, wobei der Ligandanalog so ausgewählt ist, dass er kompetitiv mit dem Analyten am spezifischen Bindungspartner bindet. Der Ligandanalog ist markiert, so dass das Ausmaß an Bindung des markierten Ligandanalogen mit dem spezifischen Bindungspartner gemessen werden kann und mit der Anwesenheit und/oder Konzentration des Zielanalyten in der biologischen Probe korreliert werden kann.
Zahlreiche Kennzeichen (Labels) sind bei solchen Affinitäts-basierten Probenanalysetechniken verwendet worden, einschließlich Enzymmarkierung, Radioisotopenmarkierung, Fluoreszenzmarkierung und Markierung mit chemischen Spezies, die elektrochemischer Oxidation und/oder Reduktion unterworfen sind. Die Verwendung von Redox-reversiblen Spezies, die manchmal als Elektronenübertragungsagenzien oder Elektronenmediatoren bezeichnet werden, als Markierungen für Ligand-Analoge, haben sich als praktische und verlässliche Resultate in Affinitäts-basierten elektrochemischen Analysen bereitstellend erwiesen. Jedoch ist die Verwendung von elektrochemischen Techniken bei Detektieren und Quantifizieren von Konzentrationen solcher redoxreversibler Spezies (korrelierend mit Analytkonzentrationen) nicht ohne Probleme. Elektrochemische Messungen unterliegen vielen Einflüssen, welche die Genauigkeit der Messungen beeinträchtigen, einschließlich solcher, die auf Veränderungen der Elektrodenstruktur selbst und/oder Matrixeffekte beziehen, die sich von der Variabilität der Flüssigproben herleiten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Immunosensoren, die auf direkter elektrochemischer Messung detektierbarer Spezies mit Mikrofeldelektroden und bipotentiostatischer Steuerung basieren. Ein elektrochemisches Kennzeichen, beispielsweise ein Os-Mediator, wird kovalent an einem Peptid angelagert, das die Aminosäuresequenz des Bindeepitops für den Antikörper aufweist. Wenn Indikator-/Peptidkonjugat am Antikörper gebunden ist, funktioniert der Indikator nicht elektrochemisch oder wird als "gehemmt" bezeichnet. Das in der Probe vorliegende Analyt kompetiert mit dem Indikator/Peptidkonjugat um die begrenzte Anzahl von Bindungsstellen auf dem Antikörper. Wenn mehr Analyt vorhanden ist, bleibt mehr freies Indikator/Peptidkonjugat übrig, was einen höheren Strom an einer Sensorelektrode erzeugt, d.h. an einer der Arbeitselektroden, wo die gemessenen Ereignisse (Oxidation oder Reduktion) stattfinden. Im entgegengesetzten Fall, wenn weniger Analyt vorhanden ist, wird mehr Indikatorpeptidkonjugat am Antikörper gebunden, was zu weniger freiem Konjugat führt und niedrigere Strompegel an den Arbeitselektroden erzeugt. Daher ist der an irgendeiner der Arbeitselektroden detektierte Strom eine Funktion der Analytkonzentration.
Es wird häufig gewünscht, mehr als eine Analytspezies in einer Flüssigprobe zu messen. Die Messung von mehreren Spezies in einer Mischung ist mit Fotometrie und Fluoreszenz über eine Auswahl der geeigneten Wellenlängen erreicht worden. Die elektrochemischen Messungen einer einzelnen Spezies in einer komplexen Mischung werden üblicherweise durch Auswählen eines Potentials vorgenommen, bei dem nur die gewünschte Spezies oxidiert oder reduziert wird (Amperometrie) oder durch Abstufen oder Variieren des Potentials über einen Bereich, in dem nur die gewünschte Spezies ihre elektrochemischen Eigenschaften verändert (Wechselstrom- und Pulsverfahren). Diese Verfahren leiden unter Nachteilen, einschließlich eines Mangels an Sensitivität und eines Mangels an Spezifizität, Interferenz durch Aufladen und Matrixpolarisierungsströme (Pulsverfahren) und Elektrodenkorrosion aufgrund der Unfähigkeit, eine adäquate Überspannung anzulegen. Darüber hinaus werden elektrochemische Messungen durch die Interferenz zwischen der Mehrzahl von elektroaktiven Spezies, die üblicherweise in biologischen Proben vorhanden sind, verkompliziert.
Elektrodenstrukturen, die einen Gleichgewichtszustandsstrom über Diffusionsrückkopplung erzeugen, einschließlich verzahnten Feldelektroden (IDAs, interdigitated array) (1 und 2) und paralleler Plattenanordnungen mit bipotentiostatischer Steuerung sind bekannt. Sie sind verwendet worden, um reversible Spezies, basierend auf dem durch Zyklisieren der reversiblen Spezies erzielten Gleichgewichtszustand zu messen. Ein reversibler Mediator (eine redoxreversible Spezies) wird abwechselnd an den verzahnten Elektrodenfingern oxidiert und reduziert. Der Gleichgewichtszustandsstrom ist proportional zur Mediatorkonzentration (3) und durch die Mediatordiffusion begrenzt. Ein Gleichgewichtszustand wird innerhalb von Sekunden nach Anlegen der vorgegebenen Anoden (positiveren) und Kathoden (weniger positiven oder negativen) Potentiale (6) an dem Mikroelektrodenfeld erreicht. Die Steigung eines Plots des IDA-Stroms gegenüber der Mediatorkonzentration hängt von den IDA-Abmessungen ab und die Steigung wächst bei engeren Elektrodenabständen (7).
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Messen von mehreren Analytenspezies in derselben Probe und optimalerweise auf derselben Elektrodenstruktur bereit, womit die Genauigkeit der relativen Messungen verbessert wird. Diese Erfindung stellt auch einen elektrochemischen Biosensor mit der Fähigkeit zum Bereitstellen verbesserter Genauigkeit durch die Verwendung von Selbstkompensation bereit. Die Analytkonzentration kann aus den an derselben Flüssigprobe mit derselben Elektrodenstruktur (den Arbeitselektroden) erhaltenen elektrometrischen Daten gemessen/berechnet werden, wodurch Störeffekte aufgrund der Variabilität der Proben- oder Elektrodenstruktur minimiert werden.
Die verschiedenen Ausführungsformen dieser Erfindung verwenden das Prinzip des Diffusionsrecyclens, wo eine diffundierbare redoxreversible Spezies abwechselnd an nahestehenden Elektroden oxidert und reduziert wird, wodurch ein messbarer Strom erzeugt wird. Da für die Messung abwechselnd Oxidation und Reduktion benötigt werden, werden nur elektroaktive Spezies, die elektrochemisch reversibel sind, gemessen, wodurch der Einfluss oder die Interferenz nicht reversibler elektroaktiver Spezies in der Probe eliminiert oder zumindest vermindert wird. Redoxreversible Spezies mit verschiedenen Oxidationspotentialen können in einer Mischung voneinander unabhängig gemessen werden, indem die Oxidations- und Reduktionspotentiale für benachbarte Elektrodenpaare so ausgewählt und biopotentiostatisch gesteuert werden, dass nur die interessierende Spezies an der Anode (der Elektrode mit dem positiveren Potential) oxidiert und an der Kathode (der Elektrode mit dem weniger positiven oder negativen Potential) reduziert wird. Wenn die Arbeitselektroden (die Anoden/Kathodenfelder) dafür dimensioniert sind, Diffusions-Recycling der redoxreversiblen Spezies bei den ausgewählten Oxidations- und Reduktionspotentialen, welche für diese Spezies geeignet sind, zu gestatten, wird rasch ein Gleichgewichtsstrom an den Arbeitselektroden, wo die messbaren oxidativen und reduktiven Ereignisse stattfinden, durch die Probe und die Elektrodenstruktur begründet. Die Größe des Stroms ist proportional zur Konzentration der diffundierbaren redoxreversiblen Spezies in der Probe. Wenn zwei oder mehr redoxreversible Spezies verwendet werden, werden sie so ausgewählt, dass sie Redoxpotentiale aufweisen, die sich um mindestens 50 mV, am bevorzugtesten um zumindest 200 mV voneinander unterscheiden, um die Interferenz zwischen einer Spezies und der anderen bei Messungen der entsprechenden Gleichgewichtsströme zu minimieren.
Jegliche Elektrodenstruktur, die ein diffusionales Recyclen zum Erreichen eines Gleichgewichtsstroms in Reaktion auf das Anlegen von vorbestimmten Speziesspezifischen anodischen und kathodischen Potentiale gestattet, kann zum Ausführen der Erfindung eingesetzt werden. Geeignete Elektrodenstrukturen beinhalten verzahnte Feldmikroelektroden und Parallelplattenelektroden, die um Abstände innerhalb des Diffusionsabstandes der jeweiligen redoxreversiblen Spezies voneinander getrennt sind. Die Elektrodenstrukturen beinhalten typischerweise eine Referenzelektrode (z.B. Ag/AgCl), zumindest zwei Arbeitselektroden (eine am positiven Potential und eine andere an einem weniger positiven oder negativen Potential relativ zur Referenzelektrode) und optional eine Hilfselektrode zur Stromsteuerung. Bei Verwendung wird ein programmierbarer Potentiostat in elektrischer Verbindung mit der Elektrodenstruktur zum Anlegen der entsprechenden anodischen und kathodischen Potentiale, die spezifisch für jede der jeweiligen redoxreversiblen Spezies sind, die im Verfahren/Biosensor eingesetzt werden, platziert. Mehrere neuartige Osmiumkomplexe sind zur Verwendung als Kennzeichen zum Präparieren von Ligandanalogkonjugaten entwickelt worden, die Potentialdifferenzen aufweisen, die hinreichend sind, um die Verwendung von zwei Osmiumkomplexen bei dieser Erfindung zu gestatten (im Gegensatz zu einem Osmiumkomplex und einem Ferrocen oder einem anderen redoxreversiblen Kennzeichen).
Dementsprechend stellt eine Ausführungsform der Erfindung eine Vorrichtung zum Detektieren oder Quantifizieren eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe bereit. Die Vorrichtung umfasst zumindest zwei redoxreversible Spezies mit entsprechenden Redoxpotentialen, die sich um zumindest 50 mV unterscheiden, und einer Elektrodenstruktur zum Kontakt mit der Flüssigprobe. Bei einer Ausführungsform umfasst die Vorrichtung weiterhin eine Kammer zum Enthalten der Flüssigprobe, die optional für eine kapillare Füllung dimensioniert ist. Die Elektrodenstruktur beinhaltet eine Referenzelektrode und eine Anode oder eine Kathode (Arbeitselektroden), die dimensioniert sind, ein diffusionales Recyclen der redoxreversiblen Spezies in der Probe zu gestatten, wenn ein redoxreversibel-Spezies-abhängiges Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode und ein redoxreversibel-Spezies-abhängiges Anodenpotential an einer zweiten Elektrode angelegt wird, um einen messbaren Strom durch die Probe zu ermöglichen und zu erhalten. Die Vorrichtung beinhaltet auch Leiter, die mit entsprechenden Elektroden zum Anlegen von Potentialen und zum Tragen von zwischen der Probe und den jeweiligen Elektroden geleiteten Strom verbunden sind.
Die Vorrichtung gemäß dieser Erfindung wird typischerweise in Kombination mit einem Messgerät verwendet, welches eine Stromquelle, beispielsweise eine Batterie, einen Mikroprozessor, ein Register zum Speichern gemessener Stromwerte und eine Anzeige zum Darstellen der berechneten Analytkonzentrationen, basierend auf gemessenen Stromwerten, enthält. Die Konstruktion und Konfiguration solcher Messgeräte sind im Stand der Technik bekannt. Messgeräte zur Verwendung gemäß der vorliegenden Vorrichtung umfassen weiterhin einen Bipotentiostaten unter Steuerung eines Mikroprozessors oder getrennt programmierbar, um vorgegebene Potentiale an den Vorrichtungskomponenten-Mikroelektrodenfeldern während der Flüssigprobenanalyse anzulegen. Verbesserungen der Messgerätkonstruktion und dem Design für Biosensorsysteme sind in US-Patent Nrn. 4,999,632; 5,243,516; 5,366,609; 5,352,351; 5,405,511; und 5,48,271 beschrieben.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Messen der Konzentration eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe bereitgestellt. Das Verfahren beinhaltet das Kontaktieren eines Teils der Probe mit vorgegebenen Mengen zumindest einer ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies mit einem Redoxpotential, das sich um zumindest 50 mV von dem jeder anderen Spezies unterscheidet. Jede entsprechende Spezies umfasst ein Flüssigproben-diffundierbares Konjugat eines Ligandenanalogs eines Analyten in der Flüssigprobe und ein redoxreversibles Kennzeichen. Die Flüssigprobe wird auch mit einer vorgegebenen Menge zumindest eines spezifischen Bindungspartners für jeden zu messenden Analyten kontaktiert. Das diffundierbare Konjugat wird so ausgewählt, dass es zur kompetitiven Bindung mit dem spezifischen Bindungspartner für den Analyten in der Lage ist.
Die Konzentration an diffundierbarer redoxreversibler Spezies in der Flüssigprobe wird dann elektrochemisch bestimmt. Die Probe wird mit einer Elektrodenstruktur kontaktiert, einschließlich einer Referenzelektrode und zumindest ersten und zweiten Arbeitselektroden, die dafür dimensioniert ist, ein Diffusionsrecyclen zumindest einer der diffundierbaren redoxreversiblen Spezies in der Probe zu gestatten, wenn ein vorgegebenes redoxreversibel-Spezies-abhängiges Probenpotential an einer Arbeitselektrode angelegt wird und ein vorgegebenes redoxreversibel-Spezies-abhängiges Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode angelegt wird. Typischerweise wird ein erstes Kathodenpotential an der ersten Arbeitselektrode angelegt und ein erstes Anodenpotential wird an der zweiten Arbeitselektrode angelegt, um einen Stromfluss durch die Probe aufgrund des diffusionalen Recyclen der ersten redoxreversiblen Spezies ohne signifikante Interferenz mit der zweiten redoxreversiblen Spezies herzustellen. Es wird der Stromfluss durch eine oder mehrere der Elektroden an den ersten anodischen und kathodischen Potentialen gemessen. In ähnlicher Weise wird der Stromfluss in Reaktion auf das Anlegen von zweiten kathodischen und anodischen Potentialen an Elektroden in Kontakt mit der Probe gemessen und mit gemessenen Stromflüssen für bekannte Konzentrationen der jeweiligen redoxreversiblen Spezies korreliert, wobei die Konzentrationen proportional zu den entsprechenden Analytkonzentrationen bei einem vorgegebenen redoxreversibel-Spezies-abhängigen Potential (Anode oder Kathode) sind. Alternativ kann das Potential einer der Arbeitselektroden konstant gehalten werden und der Stromfluss wird überwacht, während das Potential der anderen Arbeitselektrode variiert wird und durch das andere redoxreversibel-Spezies-abhängige Potential durchläuft.
Die Reagenskomponenten der Erfindung, einschließlich der redoxreversiblen Spezies und der spezifischen Bindungspartner, kann in Form eines Testkits zum Messen der angepeilten Analyt(e) in einer Flüssigprobe bereitgestellt werden, entweder als getrennte Reagenzien oder bevorzugterweise als eine Multireagens-Zusammensetzung kombiniert, z.B. eine kombinierte redoxreversible Spezies, kombinierte spezifische Bindungspartner oder kombinierte redoxreversible Spezies und spezifische Bindungspartner. Das Kit beinhaltet optional, aber vorzugsweise eine Elektrodenstruktur, die so dimensioniert ist, dass sie ein Diffusionsredoxrecycling der diffundierbaren redoxreversiblen Spezies in der Flüssigprobe gestattet. Die Elektrodenstruktur enthält Leiter zum Verbinden des Strukturbipotentiostats, das zum Anlegen von redoxreversibel-Spezies-abhängigen anodischen und kathodischen Potentialen an der Elektrodenstruktur und zum Wahrnehmen und Messen von Stromfluss, typischerweise an einer oder an beiden Arbeitselektroden, die auf solche angelegten Potentiale reagieren, programmiert ist.
Auch wird hierin die Herstellung und Verwendung von elektrochemisch detektierbaren Osmiumkomplexen und kovalenten Konjugaten der Komplexe beschrieben, die Oxidationspotential aufweisen, die sich hinreichend unterscheiden, um ihre gemeinsame Verwendung im entsprechenden Verfahren und Vorrichtungsausführungsformen der Erfindung zu ermöglichen. Es werden Osmium-markierte Ligandenanaloge, die zum Binden an einem spezifischen Bindungspartner eines biologisch signifikanten Analyten in der Lage sind, hergestellt. Eine Gruppe elektrochemisch detektierbarer Konjugate umfasst einen Bis(bipyridyl)imidazolylchlorosmium-Komplex, der durch schnelle Mediationskinetiken und niedriges Redoxpotential (+ 150 mV gegenüber Ag/AgCl) charakterisiert ist. Eine andere Gruppe von Osmiumkomplex-markierten elektrisch-chemisch detektierbaren Konjugaten beinhaltet Tris(bipyridyl)osmium-Komplexe, welche, wie die Bis(bipyridyl)imidazolylchlorosmium-Komplexe durch schnelle Mediationskinetik charakterisiert sind, aber die Tris(bipyridyl)-Komplexe haben ein Redoxpotential, das sich hinreichend von den Bis(pyridyl)imidazolylchlorosmium-Komplexen unterscheidet, um ihre gemeinsame Verwendung in den verschiedenen Ausführungsformen dieser Erfindung zu gestatten, um die Verwendung von Mikroelektrodenfeldern zum Messen von mehr als einem Analyten in einer einzelnen Flüssigprobe durch Konzentrations-abhängige Ströme zu ermöglichen, die durch diffusionales Redoxrecycling verstärkt sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zumindest ein Osmiumkomplexkonjugat in Kombination mit einer anderen konjugierten redoxreversiblen Spezies für die Messung sowohl glycosylierten Hämoglobins als auch Hämoglobins in einer lysierten Blutprobe verwendet. Eine redoxreversible Spezies umfasst vorzugsweise einen kovalent an einem Ligandenanalog entweder von Hämoglobin oder glycosyliertem Hämoglobin angebundenen Komplex und die zweite redoxreversible Spezies umfasst eine zweite redoxreversible Markierung, die kovalent an einem Ligandenanalog des anderen der zwei Zielanalyte gebunden ist. Das Verfahren gestattet die Messung der Konzentration sowohl des glycosylierten Hämoglobins (HbAlc) als auch der Konzentration entweder des Gesamthämoglobins oder des unglycosylierten Hämoglobins (HbA₀), wodurch die Berechnung der Ergebnisse als Verhältnis der zwei Messungen (% HbAlc) ermöglicht wird. Es ist vorteilhaft, sowohl HbAlc als auch das Gesamthämoglobin (oder HbA₀) unter Verwendung desselben Prinzips in einer einzelnen Probe zu bestimmen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine vergrößerte Aufsicht auf eine verzahnte Feldelektrode für reversible Mediatormessungen gemäß der vorliegenden Erfindung.
2 ist eine Teilquerschnittsansicht der Elektrode von 1, welche die Bedingungen der durch Diffusion von reversiblem Mediator (M) begrenzten Gleichgewichtsstroms illustriert, der an den verzahnten Elektrodenfingern abwechselnd oxidiert und reduziert wird.
3 ist eine grafische Darstellung von Dosisantwortströmen für einen Bis(bipyridyl)imidazolylchlorosmium-Mediator in einem Peptidkonjugat dieses Mediators.
4 ist eine grafische Darstellung des Stromflusses gegenüber der Konzentration eines glycosylierten Hämoglobins (HbAlc) in Blutproben unter Verwendung eines Osmiumkonjugats und von enzymverstärkter Gleichstromamperometrie.
5 ist eine grafische Darstellung der Hemmung des Stromflusses aufgrund von freiem Konjugat als Funktion der Antikörperkonzentration (C_n), gemessen unter Verwendung von Enzym-amplifizierter Gleichstromamperometrie [C₁>C₂>C₃].
6 ist eine grafische Darstellung von Stromfluss mit der Zeit unter Verwendung einer verzahnten Feldelektrode.
7 ist eine grafische Darstellung des Effekts der Abmessungen der verzahnten Feldelektrodenstruktur auf den Stromfluss als eine Funktion der Konzentration an einem Osmiumkonjugat (Os-DSG-Alc).
8 ist eine grafische Darstellung von Stromfluss als Funktion des angelegten Potentials für eine Flüssigprobe, die ein Äquimolares (50 μmol) eines Bis (biphyridyl)-imidazolylchlorosmiumkomplexes und eines Tris(bipyridyl)osmiumkomplexes enthält.
9 ist eine grafische Darstellung von Stromfluss gegenüber der Konzentration eines Ferrocenbiotinkonjugats in Anwesenheit verschiedener Mengen eines Osmiumkomplexkonjugats an verzahnten Feldelektroden mit bipotentiostatischer Steuerung.
10 ist eine grafische Darstellung des Effekts der Konzentration eines unmarkierten Konjugats (BSA-Alc) auf den Stromfluss in einer mit einem Osmiummarkierten Konjugat (Osmium-DSG-Alc) enthaltenden Lösung in Anwesenheit dreier getrennter Alc-erkennender Antikörperzusammensetzungen.
11 illustriert die Struktur eines Tris(bipyridyl)osmium-markierten Konjugats zur Verwendung gemäß der Erfindung.
12 bis 14 sind ähnlich, und jede zeigt die chemische Struktur eines Bis(bipyridyl)imidazolylchlorosmium-markierten Peptidkonjugats zur Verwendung gemäß dieser Erfindung.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Messen der Konzentration eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe. Das Verfahren ermöglicht zwei oder mehr unabhängige amperometrische Messungen der Probe an einer einzelnen Elektrodenstruktur. Das Verfahren umfasst:
Kontaktieren eines Volumens der Flüssigprobe mit

1) vorgegebenen Mengen zumindest einer ersten und zweiten Redox-reversiblen Spezies, wobei jede jeweilige Spezies ein Redox-Potential aufweist, das sich um mindestens 50 Millivolt von dem der anderen Spezies unterscheidet, zumindest eine Spezies ein Flüssigproben-diffundierbares Konjugat eines Liganden-Analogs eines Analyten in der Flüssigprobe und ein Redox-reversiblen Kennzeichen umfasst, wobei das Konjugat zur kompetitiven Bindung mit einem spezifischen Bindungspartner für den Analyten fähig ist, und
2) einer vorgegebenen Menge zumindest eines spezifischen Bindungspartners für jeden zu messende Analyten, und

Das Verfahren der Erfindung hat eine sehr breite Anwendbarkeit, kann jedoch insbesondere verwendet werden, um zu bestimmen: Medikamente, Hormone, einschließlich Peptidhormonen (z.B. Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin) oder Nichtpeptidhormone (z.B. Steroidhormone, wie etwa Cortison, Estradiol, Progesteron und Testosteron, oder Thyroidhormone, wie etwa Thyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteine (z.B. humanes Gonadotropin (hCG), Karcinoembryonisches Antigen (CEA) und alpha-Fötoprotein (AFP)), Medikamente (z.B. Digoxin), Zucker, Toxine oder Vitamine.
Das Verfahren kann an Flüssigproben durchgeführt werden, die biologische Fluide wie etwa Speichel, Urin oder Blut umfassen oder die Flüssigprobe kann aus Umweltquellen gewonnen werden. Die Flüssigproben können "als solche" analysiert werden oder sie können verdünnt, gepuffert oder anders prozessiert sein, um die Detektion der ins Auge gefassten Analyt(e) zu optimieren. Daher können beispielsweise Blutproben lysiert und/oder anders denaturiert werden, um zelluläre Komponenten löslich zu machen.
Das Verfahren kann unter Verwendung von sehr unterschiedlichen Probenhandhabungstechniken durchgeführt werden. So kann die Probe mit einem oder beiden der spezifischen Bindungspartner für den ins Auge gefassten Analyten und der redoxreversiblen Spezies vor dem Kontaktieren der Probe mit der Elektrodenstruktur vorgemischt werden oder die Flüssigprobe kann sauber oder vorprozessiert einem Gefäß zugeführt werden, das vorgegebene Mengen der redoxreversiblen Spezies und des spezifischen Bindungspartners für den nachfolgenden oder gleichzeitigen Kontakt der Elektrodenstruktur enthält. Die Reihenfolge der Einführung der Komponenten in die Probe ist nicht kritisch; jedoch werden bei einer Ausführungsform der Erfindung zuerst die vorgegebenen Mengen der spezifischen Bindungspartner der Probe zugegeben und danach werden die vorgegebenen Mengen der redoxreversiblen Spezies zugegeben. Es ist auch möglich, die vorgegebenen Mengen der spezifischen Bindungspartner mit den redoxreversiblen Spezies zu kombinieren, um die entsprechenden Komplexe vor dem Kombinieren dieser Komponenten mit der Flüssigprobe zu bilden. In diesem letzteren Fall wird die redoxreversible Spezies von ihrem jeweiligen spezifischen Bindungspartner durch den korrespondierenden Analyten verdrängt, um eine Konzentration der redoxreversiblen Spezies bereitzustellen, die proportional zur Konzentration des Analyten in der Flüssigprobe ist. Die Reagenzien, d.h. die vorgegebenen Mengen des spezifischen Bindungspartners jedes Analyten und die vorgegebenen Mengen der entsprechenden redoxreversiblen Spezies können beispielsweise in einem Gefäß zum Aufnehmen eines vorgegebenen Volumens der Flüssigprobe eingebracht werden. Die Flüssigprobe wird dem Gefäß hinzugefügt und danach oder gleichzeitig wird die Flüssigprobe mit der Elektrodenstruktur kontaktiert.
Die Elektrodenstruktur beinhaltet eine Referenzelektrode und zumindest erste und zweite Arbeitselektroden, die dafür dimensioniert sind, ein Diffusionsrecyclen der diffundierten redoxreversiblen Spezies in der Probe zu gestatten, wenn ein vorgegebenes redoxreversibles spezifisch abhängiges Kathoden- und Anodenpotential an den Arbeitselektroden angelegt wird. Der Ausdruck "Arbeitselektrode", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Elektrode, wo gemessene Ereignisse (d.h. Oxydation und/oder Reduktion) stattfinden und der sich ergebende Stromfluss kann als ein Indikator der Analytenkonzentration gemessen werden. "Anodenpotential" bezieht sich auf das positivere Potential (das an der Anode anliegt) und "Kathodenpotential" bezieht sich auf das weniger positive oder negative Potential, das an der Kathode anliegt (gegenüber einer Referenzelektrode). Elektroden, die dafür dimensioniert sind, ein Diffusionsrecyclen zu gestatten, sind im Stand der Technik bekannt und liegen typischerweise in der Form von Feldern von Mikroscheiben, Mikrolöchern oder Mikrobändern vor. Bei einer Ausführungsform haben die Elektroden die Form einer verzahnten Anordnung von Mikrobandelektroden mit Mikron- oder Submikronabständen. Eine kurze durchschnittliche Diffusionslänge und eine große Anzahl von Elektroden sind für eine effektive Stromverstärkung durch Recyclen von reversibler Redoxspezies wünschenswert. Das Mikroelektrodenfeld kann beispielsweise als ein Paar von verzahnten Dünnfilmmetallelektroden in Mikron- und Submikrongeometrie hergestellt werden, die auf einem Isolatorsubstrat, beispielsweise oxidiertem Silizium, angeordnet sind. Jeder der Elektrodenfinger (1) ist von seinem benachbarten Finger im Nanometer- oder niedrigen Mikrometer (1-10 μm)-Bereich beabstandet. Mikroelektrodenfelder können unter Verwendung von Photolithographie, Elektronenstrahllithographie und einer sogenannten Lift-Up-Technik hergestellt werden. Daher kann ein verzahntes Elektrodenfeld (IDA, interdigitated electrode array) auf Glas, Silizium oder Polyamid unter Verwendung der folgenden allgemeinen Vorgehensweisen abgelagert werden:

1. Wachstum einer thermischen Oxidschicht auf einem Siliziumsubstrat;
2. Zerstäuben einer 400 Angström Chromiumsaatschicht, 2000 Angström Gold;
3. Rotationsbeschichten und Weichverbacken von Photolack;
4. Belichten und Entwickeln des Photolacks mit dem IDA-Muster;
5. Gold und Chrom Bemustern durch ein Ionenstrahl-Bearbeiten;
6. Abziehen des Photolacks; und
7. Schneiden von Elektroden in die Chips durch zuerst Beschichten mit einer Schutzschicht, Schneiden in Streifen, Abziehen der Schutzschicht und Reinigen von Elektrodenoberflächen im Sauerstoffplasma.

Die Elektrode kann auf einer inneren Oberfläche einer Kammer zum Aufnehmen der Flüssigprobe, z.B. einer Küvette, einer kapillaren Füllkammer und eines anderen Proben-aufnehmenden Gefäßes, ausgebildet werden, in dem die Elektrodenstruktur mit der Flüssigprobe kontaktiert werden kann. Alternativ kann die Elektrodenstruktur Teil einer Sonde zum Eintauchen in die Flüssigprobe bilden, nachdem die Probe mit den vorgegebenen Mengen der redoxreversiblen Spezies und der spezifischen Bindungspartner kontaktiert worden ist. Die Elektrodenstruktur steht mit Leitern in Kontakt, welche das Anlegen der jeweiligen Kathoden- und Anodenpotentiale zum Ausführen der vorliegenden Methode ermöglichen. Die Anoden- und Kathodenpotentiale werden relativ zu einer Referenzelektrodenkomponente der Elektrodenstruktur unter Verwendung eines Bipotentiostaten angelegt. Die Elektrodenstruktur kann optional eine Hilfselektrode zur Stromsteuerung beinhalten. Der Bipotentiostat wird verwendet, um ein erstes Kathodenpotential an einer ersten Arbeitselektrode und ein erstes Anodenpotential an einer zweiten Arbeitselektrode anzulegen, wobei die ersten Kathoden- und Anodenpotentiale solchen jeweiligen Potentialen entsprechen, die zum Etablieren eines Stromflusses durch die Probe aufgrund von Diffusionsrecyclen der ersten redoxreversiblen Spezies notwendig sind. Optional kann das Potential an einer Arbeitselektrode auf ein erstes diffundierbares, Spezies-abhängiges Anodenpotential eingestellt werden, und der Stromfluss wird gemessen, wenn das Potential der anderen Arbeitselektrode ein dem vorgegebenen diffundierbaren Spezies-abhängigen Kathodenpotential entsprechendes Potential (oder vice versa) überstreicht.
Die für jede reversible Redoxspezies geeigneten Kathoden- und Anodenpotentiale können einfach durch empirische Messung bestimmt werden. Die zur Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung verwendeten mehrfachredoxreversiblen Spezies sind so ausgewählt, dass sie Redoxpotentiale aufweisen, die sich um mindestens 50 mV, bevorzugterweise um zumindest 100 mV, bevorzugterweise um zumindest 200 mV, von denen jeder anderer redoxreversiblen Spezies unterscheiden, die im Verfahren verwendet werden. Die Differenz an Redoxpotentialen der verwendeten redoxreversiblen Spezies gestattet es jeder Spezies, ohne signifikante Interferenz durch die zweite oder irgendeine andere redoxreversible Spezies in der Flüssigprobe bestimmt zu werden. Ein Gleichgewichtsstromfluss wird rasch an jeder der Arbeitselektroden nach Anlegen der Anoden- und Kathodenpotentiale etabliert. Der Stromfluss kann an jeder der beiden Arbeitselektroden gemessen werden und ist proportional zur Konzentration der rezyklierenden redoxreversiblen Spezies.
Zweite Kathoden- und Anodenpotentiale werden an den Arbeitselektroden angelegt, bei denen die besagten zweiten Potentiale den jeweiligen Potentialen entsprechen, die notwendig sind, um einen Stromfluss durch die Probe aufgrund von Diffusionsrecycling der zweiten redoxreversiblen Spezies ohne signifikante Interferenz durch die erste redoxreversible Spezies zu etablieren und der sich ergebende Gleichgewichtsstromfluss wird gemessen. Dieser Schritt wird für jede im Verfahren verwendete redoxreversible Spezies wiederholt. Die gemessenen Stromflüsse werden dann mit bekannten Konzentrationen der jeweiligen diffundierbaren redoxreversiblen Spezies korreliert. Jene Konzentrationen sind proportional zu den entsprechenden Analytenkonzentrationen.
Die Verfahrensschritte können unter Verwendung eines programmierten Bipotentiostaten durchgeführt werden, um die Potentiale auf der Elektrodenstruktur in Kontakt mit der Probe zu steuern. Der Bipotentiostat kann entweder in einem Tisch- oder Handmessgerät beinhaltet sein, das weiter Mittel zum Lesen der Werte für den Gleichgewichtsstrom, Speichern dieser Werte und Kalkulieren von Analytkonzentrationen unter Verwendung eines zum Durchführen solcher Kalkulationen programmierten Mikroprozessors enthalten.
Die im Verfahren verwendeten redoxreversiblen Spezies umfassen ein Flüssigproben-diffundierbares Konjugat eines Ligandenanalogs eines Analyten in der Flüssigprobe und ein redoxreversibles Kennzeichen. Der Begriff "Ligandenanalog" , wie zum Definieren der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich auf eine chemische Spezies, die zum Komplexieren mit demselben spezifischen Bindungspartner wie der gemessene Analyt in der Lage ist und den Analyten selbst beinhalten kann, vorausgesetzt, dass das Molekulargewicht des Konjugats weniger als etwa 50.000, bevorzugtererweise weniger als etwa 10.000 Dalton beträgt. An bevorzugtesten ist das Molekulargewicht des Konjugats des Ligandenanalogs und des redoxreversiblen Kennzeichens zwischen etwa 500 und etwa 5000 Dalton. Niedermolekulargewichtige redoxreversible Spezies sind am wünschenswertesten im Hinblick auf die beim Ausführen der vorliegenden Erfindung verwendete diffusionsbasierte elektrochemische Detektionstechnik.
Der Ausdruck "redoxreversibles Kennzeichen", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine chemische Spezies, die zur reversiblen Oxidation und Reduktion in einer Flüssigprobe in der Lage ist. Sie kann in Form einer organischen Einheit, beispielsweise einer chemischen Gruppe, umfassend ein Nitrosoanilin, ein Catechol, Hydrochinon oder eine Aminophenolgruppe, vorliegen. Alternativ kann das redoxreversible Kennzeichen eine anorganische oder organometallische Spezies sein, die zum Durchlaufen reversibler Oxidation und Reduktion in einer Flüssigprobe in der Lage ist. Solche Spezies können beispielsweise komplette Moleküle, Teile von Molekülen, Atome, Ionen oder genauer gesagt Ionenkomplexe sein. Die redoxreversiblen Kennzeichen sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten Ligandenkomplexe der Übergangsmetallionen, beispielsweise Eisen (Ferrocen und Ferrocenderivate), Ruthenium und Osmium.
Die relative Mengen der ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies und der entsprechenden spezifischen Bindungspartner für die ins Auge gefassten zu messenden Analyte im Verfahren können empirisch bestimmt werden. Sie sind von den Konzentrationsbereichen des ins Auge gefassten Analyten abhängig und von der Bindungsstöchiometrie des spezifischen Bindungspartners, die Bindungskonstante, dem Analyten und der entsprechenden redoxreversiblen Spezies. Die Mengen jedes für jeden gemessenen Analyten geeigneten Reagens können durch empirische Verfahren bestimmt werden.
Die redoxreversible Spezies umfasst typischerweise ein Konjugat eines Ligandenanalogs eines Analyten in einer Flüssigprobe und ein redoxreversible Kennzeichen. Das Konjugat wird durch Verknüpfen des Ligandenanalogs mit dem Kennzeichen entweder kovalent durch bifunktionale Verknüpfungsagenzien oder durch Kombination von kovalenten Bindungen und vorbekannten spezifischen Bindungsentitäten (beispielsweise Biotin-Avidin) hergestellt.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung ist der spezifische Bindungspartner für den Analyten ein Antikörper und das Ligandanalog ist so ausgewählt, dass es kompetitiv mit dem Analyten an dem Antikörper bindet. Es gibt jedoch andere Beispiele Liganden-spezifischer Bindungspartnerinteraktionen, die beim Entwickeln von Anwendungen des vorliegenden Verfahrens eingesetzt werden können. Beispiele von Liganden und spezifischen Bindungspartnern für die Liganden sind unten aufgelistet:

Liand	spezifischer Bindungspartner
Antigen (z.B. Medikamentensubstanz)	spezifischer Antikörper
Antikörper	Antigen
Hormon	Hormonrezeptor
Hormonrezeptor	Hormon
Polynucleotid	komplementärer Polynucleotidstrang
Avidin	Biotin
Biotin	Avidin
Protein A	Immunoglobulin
Immunoglobulin	Protein A
Enzym	Enzymkofaktor (Substrat)
Enzymkofaktor (Substrat)	Enzym
Lectine	spezifische Kohlenhydrate
spezifische Kohlenhydrate von Lectinen	Lectine

Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich (a) auf jede der verschiedenen Klassen oder Unterklassen von Immunglobulinen, z.B. IgG, IgM, die aus irgendeinem der konventionell verwendeten Tiere, z.B. Schafe, Kaninchen, Ziegen oder Mäusen, erhalten werden; (b) auf monoklonale Antikörper; (c) auf intakte Moleküle oder "Fragmente" von Antikörpern, monoklonal oder polyklonal, wobei die Fragmente solche sind, welche die Bindungsregion des Antikörpers enthalten, d.h. Fragmente, denen der Fc-Teil (z.B. Fab, Fab', F(ab')₂) fehlt oder den sogenannten "Halbmolekül"-Fragmenten, die durch reduktive Spaltung der die schweren Kettenkomponenten im intakten Antikörper verbindenden Disulfidbindungen erhalten werden. Die Herstellung solcher Antikörper ist im Stand der Technik bekannt.
Der Ausdruck "Antigen", der zum Beschreiben und Definieren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, beinhaltet sowohl permanent antigene Spezies (beispielsweise Proteine, Peptide, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente, Medikamentsubstanzen und Viren) und Haptane, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zum Messen von zwei proteinigen Analyten in einer Flüssigprobe bereitgestellt, wobei die Ligandanalogkomponente der ersten redoxreversiblen Spezies ein Peptid ist, welches ein Epitop eines ersten Analyten umfasst und die ligandenanaloge Komponente einer zweiten redoxreversiblen Spezies ein Peptid ist, das ein Epitop eines zweiten Analyten umfasst. Ein spezifischer Bindungspartner, der im Verfahren verwendet wird, ist ein Antikörper, der das Epitop des ersten Analyten erkennt und der andere spezifische Bindungspartner ist ein Antikörper, der das Epitop des zweiten Analyten erkennt. Bei einer anderen Anwendung des vorliegenden Verfahrens werden zwei unabhängige Messungen an einem einzelnen Analyten in einer Flüssigprobe durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform sind die jeweilige Ligandanalogkomponente der ersten und der zweiten redoxreversiblen Spezies unterschiedliche Ligandanaloge des angepeilten Analyten. Wenn der ins Auge gefasste Analyt eine Proteinkomponente ist, ist die Ligandanalogkomponente der ersten redoxreversiblen Spezies ein Peptid, welches ein erstes Epitop des Analyten umfasst und ist der Ligandanalog der zweiten redoxreversiblen Spezies ein Peptid, welches ein zweites Epitop des Analyten umfasst und die spezifischen Bindungspartner sind erste und zweite Antikörper, die beide jeweilige erste und zweite Analytepitope erkennen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist zumindest eine der redoxreversiblen Markierungen ein Osmiumkomplex. Bei einer anderen Ausführungsform sind beide redoxreversiblen Markierungen Osmiumkomplexe, die jede eine oxidierende Potentialdifferenz von zumindest 50, bevorzugtererweise zumindest 200 mV aufweisen. Für die redoxreversiblen Osmiumkomplexe zur Verwendung in der Erfindung illustrativ sind Komplexe der Formel
wobei
R und R₁ gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei jeder Substituent eine Methyl-, Ethyl-, oder Phenylgruppe ist,
R und R₁ über ihre Stickstoff-Atome mit Os koordiniert sind;
q 1 oder 0 ist;
R₇- gleich B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist;
R₂ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, wenn q gleich 1, und R₂ B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist, wenn q gleich 0 ist
wobei in der Gruppe B-(L)_k-Q(CH₂)_i-
Q gleich O, S oder NR₄ ist, wobei R₄ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
-L- ein divalenter Linker ist;
k gleich 1 oder 0 ist;
i gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, und
B Wasserstoff oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfasst, der zum Binden an einen spezifischen Bindungspartner in der Lage ist;
Z Chlor oder Brom ist
m gleich +1 oder +2 ist;
X ein mono- oder divalentes Anion ist, z.B. Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluorborat, Perchlorat, Nitrat, Sulfat, Carbonat oder Sulfit;
Y ein monovalentes Anion ist, z.B. Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluorborat, Perchlorat oder Nitrat; und
n gleich 1 oder Null ist, vorbehaltlich, dass, wenn X ein divalentes Anion ist, n Null ist, und wenn m gleich
1 ist, n gleich Null ist und X kein divalentes Anion.
Ein anderer redoxreversibler Osmiumkomplex zur Verwendung im vorliegenden Verfahren ist eine Verbindung der Formel
wobei
R und R₁ gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei jeder Substituent eine Methyl-, Ethyl-, oder Phenylgruppe ist,
R₅ 4-substituiertes 2,2'-Bipyridyl oder 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl ist, wobei der Substituent die Gruppe B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist und der 4'-Substituent eine Methyl, Ethyl oder eine Phenyl-Gruppe ist,
R, R₁ und R₅ über ihre Stickstoff-Atome mit Os koordiniert sind;
Q gleich O, S oder NR₄ ist, wobei R₄ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,
-L- ein divalenter Linker ist;
k gleich 1 oder 0 ist;
i gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, und
B Wasserstoff oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfasst, der zum Binden an einen spezifischen Bindungspartner in der Lage ist;
d gleich +1 oder +2 ist;
X und Y Anionen sind, die ausgewählt sind aus monovalenten Anionen, z.B. Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluorborat, Perchlorat und Nitrat und divalentem Anionen, z.B. Sulfat, Carbonat oder Sulfit, wobei x und y unabhängig 0, 1, 2 oder 3 sind, so dass die Nettoladung von X_xY_y gleich -2 oder -3 ist.
Redoxreversible Konjugatspezies jeder jener Formeln werden aus den entsprechenden Verbindungen hergestellt, wobei K 0 und B Wasserstoff ist, durch Reagieren solcher Verbindungen entweder mit einem heterofunktionellen Quervernetzer der Formel S-L'-T, wobei L' ein divalenter Linker und S und T unterschiedliche elektrophile Gruppen sind, die zum Reagieren mit einer nukleophilen Gruppe zum Ausbilden einer kovalenten Bindung in der Lage sind, oder mit einem homofunktionalen Querverbinder der Formel S-L'-T, wobei L' ein divalenter Linker und S und T dieselben elektrophilen Gruppen sind, die zum Reagieren mit einer nukleophilen Gruppe zum Ausbilden einer kovalenten Bindung in der Lage sind. Die sich ergebenden Produkte werden dann mit Ligandenanalogen unter Verwendung klassischer Kupplungsreaktionsbedingungen reagiert, um die Konjugatspezies zu erzeugen. Die oxidierenden Potentiale der entsprechenden oben definierten Bis(bipyridyl)- und Tris(bipyridyl)osmium-Komplexe sind so, dass die jeweiligen komplexer als reversible Redoxkennzeichen für die entsprechenden redoxreversiblen Spezies beim Durchführen des Verfahrens verwendet werden können. 8 illustriert ein zyklisches Voltammogramm für eine Flüssigprobe, die äquimolare (50 μM) Mengen eines Bis(bipyridyl)imidazolylchlorosmium-Komplexes und eines Tris(bipyridyl)osmium-Komplexes enthält.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Detektieren und Quantifizieren eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe bereitgestellt. Die Vorrichtung umfasst
zumindest zwei Redox-reversible Spezies, die alle zur Diffusion in der Flüssigprobe fähig sind, zumindest in Anwesenheit eines entsprechenden vorgegebenen Analyten, wobei die Redox-reversiblen Spezies jeweils Redox-Potentiale aufweisen, die sich um zumindest 50 Millivolt unterscheiden,
eine Elektrodenstruktur zum Kontakt mit der Flüssigprobe, wobei die Elektrodenstruktur eine Referenzelektrode und Arbeitselektroden beinhaltet, die dafür dimensioniert sind, ein Diffusions-Recyclen einer diffundierbaren Redoxreversiblen Spezies in der Flüssigprobe in Kontakt mit der Elektrodenstruktur zu gestatten, wenn ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode angelegt wird und ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Anodenpotential an einer zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei das Diffusions-Recyclen der Spezies hinreichend ist, um einen messbaren Strom durch jede Arbeitselektrode zu unterhalten, und
Leiter, die mit den jeweiligen Elektroden zum Anlegen des Anodenpotentials und des Kathodenpotentials verbunden sind, und zum Leiten des von der Elektrode geleiteten Stroms.
Die Vorrichtung kann unter Verwendung von Prozeduren und Techniken konstruiert sein, die zuvor im Stand der Technik zur Konstruktion von Biosensoren beschrieben worden sind, welche elektrometrische Detektionstechniken einsetzen. So kann beispielsweise die Vorrichtung eine Kammer beinhalten, die eine Zufuhröffnung hat und die Kammer ist so definiert, dass sie sich durch Kapillarfluss füllt, wenn die Flüssigprobe mit der Probenaufnahmeöffnung in Kontakt kommt. Die Elektrodenstruktur kann auf einer Platte ausgebildet sein, welche eine Wand der Kammer definiert, so dass die Elektrodenstruktur eine Flüssigprobe in der Kammer kontaktiert. Somit kann beispielsweise die Vorrichtung unter Verwendung der allgemeinen Prozeduren und Entwürfe konstruiert sein, die im US-Patent Nr. 5,141,868 beschrieben sind. Die Merkmale der vorliegenden Erfindung können auch entweder in andere elektrochemische Biosensoren oder Teststreifen inkorporiert werden, wie etwa solche, die in US-Patent Nrn. 5,120,420; 5,437,999; 5,192,415; 5,264,103; und 5,575,895 offenbart sind. Die Vorrichtung kann dafür entworfen sein, die vorgegebene Menge der redoxreversiblen Spezies und der spezifischen Bindungspartner zu beinhalten. Beispielsweise kann eine Mischung solcher Reagenzien auf eine Wand der Probenkammer in der Vorrichtung während der Vorrichtungskonstruktion aufgebracht werden, so dass die Flüssigprobe mit der Reagenzienmischung in Kontakt kommt, wenn sie der Kammer zur Aufnahme der Probe zugeführt wird. Bei einer Ausführungsform ist die Vorrichtung zum Quantifizieren eines ersten Analyts und eines zweiten Analyts in der Flüssigprobe entworfen. Die Vorrichtung umfasst zwei redoxreversible Spezies, eine erste redoxreversible Spezies, welche ein Konjugat eines Ligandenanalogs des ersten Analyten umfasst, und eine zweite redoxreversible Spezies, welche ein Konjugat eines Ligandenanalogs des zweiten Analyten umfasst und ein spezifischer Bindungspartner für jeden Analyten, so dass jedes der Analytanalogkonjugate zum kompetitiven Binden mit seinem entsprechenden Analyten in einem spezifischen Bindungspartner in der Lage ist.
Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Vorrichtung weiterhin einen Bipotentiostaten in elektrischer Verbindung mit den Leitern zum Anlegen eines redoxreversiblen Spezies-abhängigen Kathodenpotentials an einer Arbeitselektrode und eines redoxreversiblen Spezies-abhängigen Anodenpotentials an einer zweiten Arbeitselektrode. Der Bipotentiostat kann programmiert werden, eine Sequenz von Potentialen an den entsprechenden Arbeitselektroden anzulegen. Genauer gesagt, kann der Bipotentiostat programmiert werden, ein erstes Kathodenpotential an einer ersten Arbeitselektrode und ein erstes Anodenpotential an einer zweiten Arbeitselektrode anzulegen, wobei die ersten Anoden- und Kathodenpotentiale solchen Potentialen entsprechen, die notwendig sind, um einen Stromfluss zur Probe aufgrund von Diffusionsrecylcen der ersten redoxreversiblen Spezies zu etablieren. Der Bipotentiostat ist ebenfalls dazu programmiert, ein zweites Kathodenpotential an der ersten Arbeitselektrode und ein zweites Potential an der zweiten anodischen Elektrode anzulegen, wobei die zweiten kathodischen und anodischen Potentiale solchen Potentialen entsprechen, die zum Etablieren eines Stromflusses durch die Probe aufgrund des diffusionalen Recyclens der zweiten redoxreversiblen Spezies notwendig ist. Bei einer alternativen Ausführungsform beinhaltet die Vorrichtung erste und zweite redoxreversible Spezies und zumindest erste und zweite Elektrodenstrukturen zum Kontakt mit der Flüssigprobe in der Kammer, wobei jede der Elektrodenstrukturen ein Mikrofeld als Elektroden und Mittel zum Umschalten des Bipotentiostaten zwischen den ersten und den zweiten Elektrodenstrukturen umfasst. Bei bevorzugten Vorrichtungsausführungsformen werden Mittel zum Messen von Stromfluss durch die Probe an jedem der ersten und zweiten Potentiale und vorzugsweise zum Speichern von Werten für die Stromflüsse in einem mit einem Mikroprozessor gekoppelten Register vorgesehen, der zum Kalkulieren von Analytkonzentrationen auf Basis der Werte programmiert ist.
Bei noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Kit zum Messen der Konzentration eines oder mehrerer Analyte in Flüssigprobe bereitgestellt. Das Kit umfasst
zumindest zwei Redox-reversible Spezies zum Kontakt mit der Flüssigprobe, die alle zur Diffusion in der Flüssigprobe fähig sind, zumindest in Anwesenheit eines vorgegebenen Analyten, wobei zumindest eine Spezies ein Konjugat eines Liganden-Analogs eines Analyten und ein Redox-reversibles Kennzeichen umfasst, wobei die Redox-reversiblen Spezies jeweils Redox-Potentiale aufweisen, die um zumindest 50 Millivolt differieren,
einen spezifischen Bindungspartner für jeden Analyten;
eine Elektrodenstruktur zum Kontakt mit der Flüssigprobe, wobei die Elektrodenstruktur eine Referenzelektrode und Arbeitselektroden beinhaltet, die dafür dimensioniert sind, ein Diffusions-Recyclen von diffundierbaren Redoxreversiblen Spezies in der Flüssigprobe zu gestatten, wenn ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode angelegt wird und ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei das Diffusions-Recyclen der Spezies hinreichend bedeutet, um einen messbaren Strom durch die Probe zu unterhalten, und
Leiter, die mit den jeweiligen Elektroden zum Anlegen des Anodenpotentials und des Kathodenpotentials verbunden sind, und zum Tragen des von der Elektrode geleiteten Stroms.
Bei einer Ausführungsform werden die redoxreversiblen Spezies als eine neue Zusammensetzung für einen Kontakt mit der Flüssigprobe gemischt. Bei einer anderen Ausführungsform werden jede der redoxreversiblen Spezies und der spezifische Bindungspartner für jeden Analyten als eine neue Zusammensetzung zum Kontakt mit der Flüssigprobe gemischt. Vorzugsweise umfasst das redoxreversible Kennzeichen zumindest einer redoxreversiblen Spezies einen Osmiumkomplex.
Herstellung von Os-Mediator-Kennzeichen
Es ist gezeigt worden, dass der Os-Mediator Bis(bipyridyl)imidazolylchlorosmium ein exzellenter Elektronenmediator für viele Oxido-Reduktaseenzyme ist (US-Patent Nr. 5,589,326). Er hat schnelle Mediationskinetiken (etwa 500 Mal schneller als Ferricyanid mit Glucoseoxidase) und ein relativ niedriges Redoxpotential (+ 150 mV gegenüber Ag/AgCl). Auch weist es eine sehr schnelle Elektronentransferrate an der Elektrodenoberfläche auf. Noch wichtiger ist, dass die organischen Liganden an Os-Mediatoren funktionalisiert werden können, so dass er kovalent mit anderen Molekülen verbunden werden kann, ohne nachteilige Effekte auf die Redoxeigenschaften des Os-Zentrums. Diese einmaligen Eigenschaften des Os-Mediators machen ihn zu einem idealen elektrochemischen Indikator für auf Immunoaffinität basierten Sensoren.
Os-Mediatoren mit diesem neuen Liganden wurden unter Verwendung desselben Verfahrens, die für Os-freie Mediatoren verwendet werden, synthetisiert. Ihre Synthese besteht aus zwei hauptsächlichen Prozessschritten, wie unten ausgeführt. Details dieser Prozessschritte sind unten beschrieben.
Der erste Prozessschritt involviert die Synthese eines Os-Intermediats, cis-Bis(2,2'-bipyridyl)dichlorosmium(II) aus kommerziell erhältlichem Osmiumsalz unter Verwendung des folgenden Schemas. Das Zwischenprodukt wird durch Rekristallisierung in einem Eisbad isoliert.
Der zweite Prozessschritt involviert die Reaktion zwischen dem Os-Intermediat und Histamin oder 4-Imidazolessigsäure (oder einem substituierten Bipyridin für die Herstellung des Tris(bipyridyl)-Komplexes), um Os-Mediatoren mit dem geeigneten "Griff" herzustellen. Das gewünschte Produkt wird dann aus der Lösung durch Hinzufügen von Ammoniumtetrafluorborat präzipitiert.
Diese Os-Mediatoren können auch leicht in die oxidierte Form überführt werden, d.h. Os(III), unter Verwendung von Nitrosoniumtetrafluorborat. Jedoch ist dies unnötig, da das Os ohnedies bei alkalischen Bedingungen während Konjugationsreaktionen zur reduzierten Form zurückkehrt. Und eine oxidierte Form von Os(III) für die Detektion auf dem Biosensor ist nicht notwendig.
A. Einfache Mischmediatorenmessung

1. Verzahnte Feldmikroelektroden (IDA) werden mittels photolithographischer Mittel durch im Stand der Technik wahrgenommene Verfahren hergestellt (siehe W 97/34140; EP 0 299 780 ; D. G. Sanderson und LB. Anderson, Analytical Chemistry, 57 (1985), 2388; Koichi Aoki et al., J. Electroanalytical Chemistry, 256, 91988) 269; und D. Niwa et al., J. Electroanalytical Chemistry, 167 (1989) 291. Andere Mittel, die Standard bei lithographischer Bearbeitung sind, können ebenfalls verwendet werden, um die gewünschten Muster eines Leiters auf dem Isolatorsubstrat zu erzeugen.
2. Reversible Mediatoren werden aus den hier beschriebenen und solchen Referenzen beschriebenen (siehe US-Patent Nrn. 4,945,045 und 5,589,325) ausgewählt. Vorzugsweise werden zwei verschiedene Mediatoren mit Potentialen ausgewählt, die sich um zumindest 100 mV, bevorzugtererweise um zumindest 200 mV unterscheiden. Beispiele geeigneter Mediatoren beinhalten das hier und im US-Patent Nr. 5,589,326 beschriebene Os(bipy)ImCl und Ferrocen, das in US-Patent Nr. 4,945,045 und EP 0 142 301 beschrieben ist. Mischungen dieser Mediatoren werden in wässriger Lösung, beispielsweise in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt. Konzentrationen zwischen 1 μM und 1000 μM können bequem gemessen werden.
3. Die IDA wird mit einem Bipotentiostaten verbunden, einem Instrument, das zum Steuern des Potentials zweier getrennter Elektroden in der Lage ist. Auch wird eine Referenzelektrode vorgesehen. Diese nicht-polarisierbare Elektrode dient als die Referenz für die zwei angelegten Potentiale und kann auch als Gegenelektrode dienen. Jegliche nicht-polarisierbare Elektrode kann verwendet werden, beispielsweise Ag/AgCl, wie sie von ABI/Abtech erhältlich ist. Es kann auch eine Hilfselektrode zum Steuern des Stromflusses durch die Arbeitselektroden verwendet werden. Die Mischungen werden auf der IDA Elektrode platziert und die Referenzelektrode wird ebenfalls mit der Mischung kontaktiert, oder die IDA kann gemeinsam mit der Referenzelektrode in die Mischung eingetaucht werden.
4. Zum Messen von Mediator 1 (Os/bipy)21mCl) An einen Satz von Fingern der IDA, die zur Reduktion von Mediator 1 in der Lage ist, wird ein Kathodenpotential angelegt (ca. –50 mV gegenüber Ag/AgCl). Am anderen Satz von Fingern der IDA, der zum Oxidieren von Mediator 1, aber nicht Mediator 2 (oder jeglichen anderen Mediatoren) in der Lage ist, wird ein Anodenpotential angelegt (ca. 250 mV gegenüber Ag/AgCl). Nach einer kurzen Zeit (ms bis s) ist ein Gleichgewichtsstrom messbar, der nur von der Konzentration des Mediators 1 abhängt.
5. Zum Messen von Mediator 2 (Ferrocen) An einem Satz von Fingern der IDA wird ein Kathodenpotential angelegt, das zum Reduzieren von Mediator 2, aber nicht Mediator 1, in der Lage ist (ca. 250 mV gegenüber Ag/AgCl). Am anderen Satz von Fingern der IDA wird ein Anodenpotential angelegt, das zum Oxidieren von Mediator 2 in der Lage ist (ca. 550 mV gegenüber Ag/AgCl). Nach einer kurzen Zeit (ms bis s) ist ein Gleichgewichtsstrom messbar, der nur von der Konzentration von Mediator 2 abhängt.

Spezifisches Bindungsassay mit gemischter Mediatormessung Spezifisches Assay von HbAlc in einer Blutprobe

1. IDA-Elektroden werden wie in Abschnitt A oben bereitgestellt.
2. Konjugate der Mediatoren 1 und 2 und Haptene oder spezifische Bindungselemente werden unter Verwendung von im Stand der Technik wahrgenommenen Verfahren zum kovalenten Koppeln, die entweder einen homofunktionalen oder heterofunktionalen Linker verwenden, bereitgestellt. Spezifisch wird ein einer N-terminalen Sequenz der beta-Kette von HbAlc entsprechendes synthetisches Peptid mit dem Osmiumkomplex konjugiert. Ähnlich wird ein der N-terminalen Sequenz von HbA0 entsprechendes synthetisches Peptid mit einem zweiten Mediator, beispielsweise Ferrocen, konjugiert.
3. Antikörper für die Analyten (HbAlc und HbA0), die spezifisch mit den endterminalen Peptiden, die in die Konjugate inkorporiert worden sind, reagieren, werden mittels Standardverfahren zum Herstellen polyklonaler Antikörper bereitgestellt. In diesem Fall wurden Schafe mit Trägerproteinen immunisiert, an welche die synthetischen Peptidsequenzen für HbAlc und HbA0 konjugiert waren. Einem geeigneten Immunisierungsplan folgend wurde den Schafen Blut abgenommen und der Antikörper auf dem Blut über Ionenaustauschchromatographie isoliert, gefolgt von einer Immunoabsorbens-Reinigung auf einer Säule desselben N-terminalen Peptids mit einem anderen Linker.
4. Eine geeignete Stöchiometrie der Reaktion wurde für die zwei Reaktionen unabhängig voneinander durch Standardmethoden für Immunoassayentwicklung bestimmt. Eine, eine feste Menge von markiertem Konjugat enthaltende Lösung wurde mit einer Lösung mit verschiedenen Mengen an Antikörper gemischt und einer geeigneten Inkubationszeit folgend wurde die Menge an verbleibendem freien Konjugat an der IDA-Elektrode unter Verwendung des oben beschriebenen Vorgehens gemessen. Die Menge an Antikörper, die gerade hinreichend war, um die maximale Hemmung des Konjugats zu erzielen (ca. >80%) wurde ausgewählt.
5. Reagenslösung 1 wurde hergestellt, welche eine Mischung der zwei Konjugate in den geeigneten Konzentrationen enthält. Die Reagenslösung 2 wurde hergestellt, die eine Mischung der zwei Antikörper in den oben bestimmten Mengen enthält. Eine Blutprobe wurde ca. 20-fach in einer Lösung von 25 mM Citronensäure/0,5 Brij-35 verdünnt. Nach einer 30-Sekunden-Inkubation, die Dialyse und Denaturierung des Hämoglobins gestattet, wurde zu 66 μl dieser verdünnten Probe 33 μl 1 M Phosphatpuffer zugefügt, um den pH wieder auf neutral einzustellen. 30 μl der Antikörperlösung 2 wurden zugefügt und es wurde der Mischung gestattet, für 30 s zu inkubieren. Dann wurden 30 μl der Konjugatlösung 1 hinzugefügt und die Mischung auf der IDA-Elektrode gemessen. Die Konzentration von HbAlc in der Probe ist bezogen auf den von Mediator 1 gemessenen Strom und die Konzentration von HbA0 ist bezogen auf den von Mediator 2 gemessenen Strom. Die % HbAlc in der Probe sind auf das Verhältnis der gemessenen Mengen von Mediator 1 und Mediator 2 bezogen.

Anwendung auf das HbAlc-Assay
Hämoglobin Alc ist ein spezifisches Glycohämoglobin, bei dem die Glycosylierung am N-Terminus der Hämoglobin β-Kette stattfindet. Der Antikörper bindet spezifisch an HbAlc, hat eine Epitopsequenz von Gluc-Val-His-Leu-Thr. Um die Konjugation an anderen Molekülen zu ermöglichen, ist der Sequenz eine nicht native Aminosäure hinzugefügt worden, z.B. Cys, Lys oder Lys-MH, um Alc-Peptide zu erzeugen, die enthalten: 1) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys-MH; 2) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys; 2) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Cys.
Das HbAlc-Assay erfordert das Messen sowohl der Alc-Konzentration als auch der Gesamthämoglobin-Konzentration und stellt die Ergebnisse als ein Verhältnis dieser zwei Messungen dar (% HbAlc). Es ist vorteilhaft, sowohl Alc als auch Gesamthämoglobin unter Verwendung desselben Prinzips zu analysieren, weil das in-Verhältnis-Setzen Beeinflussungen aufgrund von Umgebungseffekten minimieren würde. Daher ist ein Antikörper gezogen worden, der spezifisch an Hämoglobin mit unglycosyliertem N-Terminus bindet, d.h. mit einer Epitopsequenz von Val-His-Leu-Thr. Ähnlich ist eine nicht-native Aminosäure der Sequenz hinzugefügt worden, um eine Konjugation zu ermöglichen. Das für die Gesamthämoglobinmessung verwendete Peptid wird als A0-Peptid bezeichnet. A0-Peptide, die bei der Herstellung der Os-Mediator-Peptidkonjugate verwendet worden sind, beinhalten Val-His-Leu-Thr-Cys und Val-His-Leu-Thr-Lys.
Konjugationschemie und Konjugate
Es gibt viele Arten von Konjugationschemie, die eingesetzt werden können, um den Os-Mediator mit dem Peptid zu verbinden. Die folgenden zwei Konjugations-Chemien, die für die Herstellung von Os-Mediator-Peptid-Konjugaten eingesetzt werden, sind auch üblicherweise zum Herstellen von Proteinkonjugaten verwendet wrden: 1) Bildung einer Amidbindung durch reaktiven Ester mit primärem Amin; 2) Bildung einer Thioetherbindung durch Maleimid mit einer Sulfhydrylgruppe. Die Amidbindung wird gegenüber der Thioetherbindung bevorzugt, weil die Amidbindung im allgemeinen stabiler ist. Basierend auf der bevorzugten Konjugations-Chemie kann der Ligand auf dem Os-Mediator entweder mit einer primären Amingruppe oder einer Carbonsäuregruppe funktionalisiert werden. Es wird angenommen, dass der beste Ort für die funktionalen Gruppen die C-4- oder C-5-Positionen auf dem Imidazolliganden des Os-Mediators ist, jedoch kann die Funktionalisierung auch durch das Nicht-Os-komplexierte Imidazolring-Stickstoffatom ausgeführt werden. Zwei verschiedene funktionalisierte Os-Mediatoren wurden wie oben beschrieben synthetisiert.
Der Os-Mediator (a) wurde mit Histamin gebildet, während der Os-Mediator (b) mit Imidazolessigsäure gebildet wurde. Es wurde jedoch gefunden, dass der Iminostickstoff des Imidazolrings mit der Aktivierung d er Carbonsäuregruppe zu reaktivem Ester (d.h. N-Hydroxysuccinimidester) unter Verwendung von Carbodiimid interferiert. Somit ergab die Verwendung von Carbonsäurefunktionalisiertem Os-Mediator bei der Synthese von Os-Mediator-Peptidkonjugaten wesentlich ungünstigere Ergebnisse.
Die Amingruppe auf dem Histaminliganden des Os-Mediators reagiert leicht mit dem N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester, um eine Amidbindung auszubilden. Zwei Arten von Querverbindern (Crosslinkern) sind verwendet worden, um den Os-Mediator an Peptiden anzubinden, (a) ein heterofunktionaler Querverbinder mit einem NHS-Ester an einem Ende, wobei das andere Ende eine Maleimid- oder eine Sulfhydrylgruppe aufweist; und (b) ein homofunktionaler Querverbinder, bei dem z.B. beide Enden NHS-Ester aufweisen.
Im Falle des heterofunktionalen Querverbinders wird zuerst der Querverbinder mit dem OS-Mediator mit einem Histaminliganden (Os-Histamin) bei einem 1:1 Molarverhältnis reagiert. Ein spezieller Punkt sollte hier angemerkt werden. D er Os-Mediator in oxidierter Form, d.h. Os(III), kann unmittelbar eine Sulfhydrylgruppe oxidieren, um eine Disulfidbindung zu bilden. Es ist wichtig, das Os-Zentrum durch Hinzufügen einer kleinen Menge eines Reduktionsmittel, wie etwa Natriumdithionit, während des Konjugationsprozesses in reduzierter Form zu Formeln Beschreibung Seite 34:
halten. Der Reaktionsfortschritt kann durch analytische Umkehrphasen-HPLC auf einer C18-Säule überwacht werden. Dann wird das Os-Mediator-Querverbinderaddukt über präparative HPLC isoliert und die gesammelte Fraktion wird nachfolgend gefriergetrocknet. Schließlich wird der OS-Mediator-Querverbinder mit dem geeigneten Peptid reagiert, um OS-Mediatorpeptidkonjugat zu bilden. Wiederum wird das Produkt durch Sammeln der geeigneten Fraktion in präparativer HPLC isoliert und die gesammelte Fraktion wird dann gefriergetrocknet.
Zwei verschiedene heterofunktionale Querverbinder sind für die Synthese von Os-Mediator-Peptidkonjugaten verwendet worden. SMCC (Succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat) wird für ein Cystein-enthaltendes Peptid verwendet, während SATA (N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat) für ein Maleimid-enthaltendes Peptid verwendet wird. Drei Os-Mediator-Peptidkonjugate (zwei mit Alc-Peptid und eines mit AO-Peptid) sind unter Verwendung heterofunktionaler Querverbinder hergestellt worden und ihre Struktur wird unten gezeigt: (a) Os-SMMC-Alc; (b) Os-SATA-Alc und (c) Os-SATA-AO.
Jedoch ist gefunden worden, dass diese Kojugate nicht stabil waren, wenn sie als Lösungen gelagert wurden. Analytische HPLC-Ergebnisse zeigten an, dass die Konjugate sich zersetzen. Eine Massenspektroskopie bestätigte, dass die Instabilität auf das Aufspalten der in diesen Konjugaten vorhandenen Thioetherbindung zurückgeht.
Formeln Beschreibung Seite 36:
Um eine Thioetherbindung im Konjugat zu vermeiden, wurde stattdessen ein homofunktionaler Querverbinder, der zwei NHS-Ester enthielt, verwendet, um die Konjugate herzustellen.
Der verwendete Querverbinder war DSG (Disuccinimidylglutarat). Um die Bildung von quervernetztem Os-Mediator, d.h. Os-Querverbinder-Os, zu verhindern, wurde ein großer Überschuss von homofunktionalem Querverbinder bei der Reaktion mit Os-Histamin unter einem 4:1 Molarverhältnis verwendet. Unter dieser Bedingung wurde nur das gewünschte Produkt, d.h. der Os-Querverbinder, gebildet. In ähnlicher Weise wurde das Os-DSG-Alc-Konjugat unter Verwendung der früher beschriebenen Prozedur hergestellt.
Die Herstellung von analogem Os-DSG-A₀-Konjugat erfordert einen Zusatzschritt, da das unglycosylierte N-terminale Amin des HbA₀-Peptids auch gegenüber NHS-Ester reaktiv ist. In diesem Fall wird das N-terminale Amin von HbA₀-Peptid zuerst entweder durch eine basenlabile Fmoc¹- oder eine säurelabile Boc²-Gruppe geschützt (Anmerkungen: ¹ Fmoc = Fluorenylmethyloxycarbonat; ²Boc = t-Butyloxycarbonyl). Nach Reagieren mit dem Os-DSG-Addukt, um das Os-DSG-A₀-Konjugat zu bilden, wird die Schutzgruppe dann unter Verwendung eines geeigneten Schutzaufhebungsverfahrens gespalten (durch Hinzufügen von Base bei Fmoc oder Säure bei Boc). Die durch Festphasenpeptidsynthese hergestellten Peptide haben bereits N-terminale Fmoc-Schutzgruppen. Die Schutzgruppen werden üblicherweise vor dem Abspalten des Peptids von den Harzperlen entfernt, können jedoch auch daran belassen werden, falls gewünscht. Das HbA₀-
Peptid von Zymed hat eine intakte Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus. Unter Verwendung dieser Strategie wurde das Os-DSG-A₀-Konjugat erfolgreich synthetisiert.
Viele Analyte können nicht unter Verwendung Enzym-basierter Sensoren gemessen werden. Sie erfordern die Entwicklung von Affinitätsbiosensoren oder Immunosensoren, die auf dem selektiven Binden von Antigenen an Antikörpern basieren. Der Schlüssel zur Detektion dieses Bindeereignisses an elektrochemischen Sensoren ist es, mit Redoxkennzeichen markiertes Antigenen einzuschließen. Bis(2,2'-bipyridyl)imidazolylchlorosmium, auch als Os-Mediator bekannt, besitzt viele Eigenschaften, die es zu einem exzellenten Redoxkennzeichen für diesen Zweck machen. Zusätzlich kann ein "Griff" hinzugefügt werden, um es kovalent mit Antigenen zu verbinden, ohne seine Redoxeigenschaften zu beeinträchtigen.
Verschiedene Messschemata können bei Affinitätsbiosensoren verwendet werden, einschließlich i) kompetitiven Bindungsassays (das markierte Antigen kompetiert um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen); ii) sequentiellen Bindungsassays (das markierte Antigen bindet an überschüssigen Bindungsstellen); iii) heterogenem Assay (verwendet einen Trennschritt, um gebundene und freie markierte Antigene zu trennen); und iv) homogenem Assay (kein Trennschritt). Die in einem homogenen sequenziellen Bindeassay involvierten Schritte beinhalten das Binden des Analyts an einen Antikörper. Das markierte Antigen (Analytanalog) bindet an den verbleibenden Bindestellen auf dem Antikörper. Schließlich wird das übriggebliebene freie markierte Antigen an der Elektrodenoberfläche detektiert. Der sich ergebende Strom ist eine Funktion der Menge des vorhandenen Analyten.
Die Bestimmung von freien markierten Antigenen kann unter Verwendung entweder von direkten Bestimmungs- oder von amplifizierten Bestimmungsverfahren erzielt werden. Direkte Bestimmung erfordert die Verwendung von fortschrittlichen elektrochemischen Techniken wie etwa Wechselstromvoltametrie, differenzielle Pulsvoltametrie, Rechteckwellenvoltametrie oder Wechselstromimpedanz, um eine Sensitivität von 5 μmol oder kleiner zu erreichen. Amplifizierte Bestimmungsverfahren verwenden Gleichstromamperometrie mit einer Amplifikation durch die Reaktion mit Enzym oder chemischen Reduktionsmitteln oder durch Verwendung verzahnter Feldmikroelektroden (IDA). Das bevorzugte Bestimmungsverfahren ist eine amplifizierte Amperometrie mittels Zyklieren von freiem Os-Mediatorkennzeichen durch Verwendung von IDA-Mikroelektroden sinngemäß dieser Erfindung.
Generelles analytisches HPLC-Verfahren für Osmiumkonjugate
Alle HPLC-Analysen wurden unter Verwendung eines Beckman-System-Gold-HPLC-Systems durchgeführt, das aus einem 126-Pumpenmodul und einem 168-Diodenfelddetektormodul besteht. Die stationäre Phase ist eine analytische Umkehrphasen-C18- Vydac-Analysensäule. Andere Parameter sind unten aufgeführt.
Mobile Phase: A = 0,1% TFA³ in H₂O
B = 0,1 % TFA in CH₃CN
Anmerkung:
³TFA = Trifluorassigsäure
Flussrate: 1 ml/min
Gradient: 0-5 min: 10 % B
5-45 min: 10% B → 50% B bei 1 %/min
45-50 min: 100% B
Detektor: Kanal A bei 384 nm
Kanal B bei 220 nm.
Synthese von Bis(2,2'-Bipyridyl)dichlorosmium

1. Beladen eines 1 l Einhals-RB-Kolben mit 19,335 g K₂OsCl₆ (0,04019 mol) und 13,295 g 2,2'-Dipyridyl (0,08512 mol). Hinzufügen von 400 ml DMF, um alle Reagenzien zu lösen.
2. Erhitze die Lösung bis zum Rückfluss und dann halte den Rückfluss für 1 h aufrecht. Dann Abschalten der Heizung und Abkühlenlassen der Lösung auf 30-40°C bei Umgebung.
3. Filtern der Reaktionsmischung unter Verwendung eines mittelgradigen Glasfrittenfilters. Spülen des Kolbens mit zusätzlichen 20 ml DMF und Waschen des Filters.
4. Überführen des Filtrats in ein 31-Becherglas. Befüllen eines anderen 2l-Becherglas mit 22,799 g NaS204 und Auflösen in 2 l deionisiertem Wasser. Hinzufügen dieser Lösung zu dem das Os/DMS-Filtrat enthaltenden Becherglas tropfenweise unter Verwendung eines Tropftrichters. Die Lösung soll die ganze Zeit gerührt werden.
5. Dann Kühlen der Mischung in einem Eisbad für zumindest 3 h. Hinzufügen von Eis nach Bedarf.
6. "Kaltes" Filtern der Mischung unter Verwendung eines Keramikfilters mit Filterpapier. Waschen des Inhalts auf dem Filter mit 50 ml, zweifaches Wässern und 2 × 50 ml Ether.
7. Trocknen des Produkts unter einem Hochvakuum bei 50°C über Nacht (zumindest 15 h). Wiegen des Produkts und Überführen in eine braune Flasche. Bei Raumtemperatur in einen Desikkator lagern.

Typische Ausbeute = 16 g oder 70 % Das Produkt wird durch UV-VIS Spektroskopie und Elementaranalyse analysiert.
Synthese von Bis(2,2'-bipyridyl)histaminchlorosmium

1. Beladen eines 2l-Einhals-RB-Kolben mit 11,3959 g Os(bpy)₂Cl₂ (0,0198 mol) und 4,9836 g Histamin (0,0448 mol). Hinzufügen von 500 ml Ethanol, um die Reaktanten zu lasen. Dann Hinzufügen von 250 ml deionisiertem Wasser.
2. Erhitzen der Lösung bis zum Rückfluss und Halten auf Rückfluss für 6 h. Abkühlen lassen der Lösung auf Raumtemperatur bei Umgebung.
3. Entfernen des gesamten Ethanols unter Verwendung von Rotationsverdampfung. Dann Überführen der Lösung in ein 500 ml-Becherglas. Auflösen von 2,136 g NH₄BF₄ in 20 ml Wasser. Tropfenweises Hinzufügen zu der Os-Lösung. Präzipitieren der Formen. Kühlen in einem Eisbad für 30 min. Filtern der Mischung unter Verwendung eines Keramikfilter mit Filterpapier. Waschen des Inhalts auf Filter mit ungefähr 20 ml Wasser zweimal.
4. Trocknen unter einem Hochvakuum bei 50°C über Nacht (zumindest 15 h).
5. Wiegen des Produktes und Überführen in eine braune Flasche. Bei Raumtemperatur in einem Desikkator lagern. Typische Ausbeute = 7,6 g oder 52%.

Das Produkt wird durch UV-VIS Spektroskopie und HPLC analysiert.
HPLC: Elutionszeit = 18 min
Reinheit als HPLC-Bereich von 65-85%.
Herstellung von [Os(bpy)₂(histamin)Cl]-heterofunktionalem Querverbinderaddukt

1. Einwiegen von 0,1167 g [Os(bpy)₂(histamin)Cl]BF₄ (0,162 mmol) und Überführen in ein 5 ml Reacti-Vial. Hinzufügen von 1,0 ml DMF, um den Reaktanten zu lösen. Hinzufügen von 25 μl Triethylamin.
2. Hinzufügen von 0,0508 g SMCC (0,150 mmol) oder 0,0390 g SATA (0,168 mmol). Rühren der Reaktanten bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Einspritzen einer Probe in eine HPLC, um den Reaktionsfortschritt zu überwachen.
3. Falls die Reaktion vollständig ist, Verdünnen der Lösung mit 0,1 % TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml. Einspritzen in eine präparative HPLC und Sammeln der Produktspitze.
4. Trockengefrieren der gesammelten Fraktion über Nacht.
5. Wiegen des Produkts und Überführen in eine braune Flasche. Lagern in einem Trockenbeutel bei –20°C. Typische Ausbeute = 40 mg oder 25 %.

Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
Herstellung von [Os(bpy)₂(histamin)C₁]-homofunktionalen Querverbinderaddukt

1. Einwiegen von 0,2042 g DSG (0,626 mmol) und Überführen in eine 5 ml Reacti-Vial. Hinzufügen von 0,75 ml DMF, um den Reaktanten zu lösen.
2. Einwiegen von 0,1023 g [Os(bpy)₂)(histamin)Cl]BF₄ (0,142 mmol) und Überführen in ein getrenntes 5 ml Reacti-Vial. Hinzufügen von 1,0 ml DMF, um den Reaktanten zu lösen. Hinzufügen von 25 μl Triethylamin. Dann Hinzufügen von Os/DMF-Lösung tropfenweise zur DSGIDW-Lösung unter konstantem Rühren. Nach Reagierenlassen für 2 h bei Raumtemperatur, Einspritzen einer Probe in die HPLC und Überwachen des Reaktionsfortschritts.
3. Falls die Reaktion vollständig ist, Verdünnen der Lösung in 0,1 % TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml. Einspritzen in eine präparative HPLC und Sammeln der Produktspitze.
4. Gefriertrocknen der gesammelten Fraktion über Nacht.
5. Wiegen des Produktes und Überführen in eine braune Flasche. Bei –20°C in einem Trockenbeutel lagern. Typische Ausbeute = 45 mg oder 35%

Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
Herstellung von Os-SATA-Alc-Konjugat

1. Einwiegen von 40,5 mg Os-SATA (0,0529 mmol) und Überführen in ein 5 ml Reacti-Vial mit einem Rührstab. Hinzufügen von 1,0 ml PBS (pH = 7,5) zum Lösen. Hinzufügen von 20 mg iVa₂S₂O₄, um Os in seiner reduzierten Form zu erhalten.
2. Hinzufügen von 1,0 ml Deacetylierungspuffer (PBS pH 7,5 + 0,5 M Hydroxylamin und 25 mM EDTA), um den Schutz der Sulhydrylgruppe aufzuheben. Einspritzen einer Probe in eine analytische HPLC, um festzustellen, ob die Schutzaufhebung vollständig ist, durch Auftauchen einer neuen Spitze bei 25,8 min.
3. Hinzufügen von 45 mg HbAlc-MH-Peptid (0,0474 mmol) und Reagierenlassen bei Raumtemperatur für 1 h. Einspritzen einer Probe in eine analytische HPLC, um den Reaktionsfortgang zu überwachen.
4. Falls die Reaktion vollständig ist, Verdünnen der Mischung mit 0,1 % TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml. Einspritzen in eine präparative HPLC, um die Produktspitze zu sammeln.
5. Gefriertrocknen der gesammelten Fraktion über Nacht (zumindest 15 h).
6. Wiegen des Produkts und Überführen in eine braune Flasche. Bei –20° C in einem Trockenbeutel lagern. Typische Ausbeute = 12 mg

Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
Herstellung von Os-SMCC-Alc-Konjugat

1. Einwiegen von 39,0 mg Os-SMCC (0,0452 mmol) und Überführen in ein 5 ml Reacti-Vial mit Rührstab. Hinzufügen von 1,0 ml PBS (pH 6,0) zum Lösen.
2. Hinzufügen von 30,0 mg Hblc-Cys-Peptid (0,0450 mmol). Fortschreitenlassen der Reaktion bei Raumtemperatur für 2 h. Einspritzen einer Probe in eine analytische HPLC, um den Reaktionsfortschritt zu überwachen.
3. Falls die Reaktion abgeschlossen ist, Verdünnen der Mischung mit 0,1 % TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml. Einspritzen in eine präparative HPLC, um die Produktspitze zu sammeln.
4. Gefriertrocknen der gesammelten Fraktion über Nacht (zumindest 15 h).
5. Wiegen des Produktes und Überführen in eine braune Flasche. In einem Trockenbeutel bei –20°C lagern. Typische Ausbeute = 12 mg.

Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
Herstellung von Os-SMCC-A₀-Konjugat

1. Einwiegen von 37,0 mg Os-SMCC (0,0426 mmol) und Überführen in ein 5 ml Reacti-Vial mit Rührstab. Hinzufügen von 1,0 ml PBS (pH = 6,0) zum Lösen.
2. Hinzufügen von 24,3 mg HbA₀-Cys-Peptid (0,0425 mmol). Fortschreitenlassen der Reaktion bei Raumtemperatur für 2 h. Einspritzen einer Probe in eine analytische HPLC, um den Reaktionsfortschritt zu überwachen.
3. Falls die Reaktion vollständig ist, Verdünnen der Mischung mit 0,1 % TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml. Einspritzen in eine präparative HPLC und Sammeln der Produktspitze.
4. Gefriertrocknen der gesammelten Fraktion über Nacht (zumindest 15 h).
5. Wiegen des Produktes und Überführen in eine braune Flasche. Bei –20°C in einem Trockenbeutel lagern. Typische Ausbeute = 15 mg.

Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
Herstellung von Os-DSG-Alc-Konjugat

1. Einwiegen von 32,0 mg Os-DSG (0,037 mmol) und Überführen in ein 5 ml Reacti-Vial mit Rührstab. Hinzufügen von 0,75 ml DMF zum Lösen. Hinzufügen von 25 μl Triethylamin.
2. Hinzufügen von 26,5 mg HbAlc-Lys-Peptid (0,0349 mmol). Fortschreitenlassen der Reaktion bei Raumtemperatur für 2 h. Einspritzen einer Probe in eine analytische BPLC, um den Reaktionsfortschritt zu überwachen.
3. Falls die Reaktion vollständig ist, Verdünnen der Mischung mit 0,1 % TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml. Einspritzen in eine präparative HPLC und Sammeln der Produktspitze.
4. Gefriertrocknen der gesammelten Fraktion über Nacht (zumindest 15 h).
5. Wiegen des Produkts und Überführen in eine braune Flasche. Bei –20°C in einem Trockenbeutel lagern. Typische Ausbeute = 16 mg.

Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
Herstellung von Os-DSG-A₀-Konjugat

1. Einwiegen von 52,0 mg Os-DSG (0,0605 mmol) und Überführen in ein 5 ml Reacti-Vial mit Rührstab. Hinzufügen von 1,0 ml DMF zum Lösen. Hinzufügen von 25 μl Triethylamin.
2. Hinzufügen von 49,1 mg Fmoc-HbA₀-Peptid (0,0606 mmol). Fortschreitenlassen der Reaktion bei Raumtemperatur für 2 h. Einspritzen der Probe in eine analytische HPLC, um den Reaktionsfortschritt durch das Auftauchen einer Spitze bei 40,3 min für Os-DSG-A₀-(Fmoc) zu überwachen.
3. Falls die Reaktion vollständig ist, Einspritzen von zusätzlichen 100 μl Triethylamin. Nach 1 h Einspritzen einer Probe in eine analytische HPLC, um zu bestimmen, ob die gesamte Fmoc-Schutzgruppe entfernt ist, durch Verschwinden der Spitze bei 40,3 min.
4. Falls Entfernung von Fmoc vollständig ist, Verdünnen der Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml. Einspritzen in eine präparative HPLC, um die Produktspitze zu sammeln.
5. Gefriertrocknen der gesammelten Fraktion über Nacht (zumindest 15 h).
6. Wiegen des Produkts und Überführen in eine braune Flasche. Bei –20°C in einem Trockenbeutel lagern. Typische Ausbeute = 16 mg.

Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
Synthese von Bis(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)-4-Methyl-4'-Carboxylpropyl-2,2'-Bipyridylosmium[Os(dm-bpy)2(mcp-bpy)]Cl2
Kaliumhexachlorosmium wurde mit 4,4'-Dimethyl-2,2'-Dipyridyl bei 1:2 Molarverhältnis durch Refluxen in DMF reagiert. Das Kaliumchloridpräzipitat wurde gefiltert und der Dimethyl-bipyridyldichlorosmiumkomplex wurde von +3 Oxidationszustand auf +2 Oxidationszustand reduziert, wobei eine Übermenge Natriumdithionit verwendet wurde. Das Produkt wurde in einer DMF/Wassermischung bei 0° rekristallisiert und durch Filtration wiedergewonnen.
4,4'-Dimethyl-2,2'-Bipyridyldichlorosmium wurde mit 4-Methyl-4'-Carboxylpropyl-2,2'-dipyridyl durch Refluxen in Ethylenglykol reagiert. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfung entfernt. Das Produkt wurde in DMF gelöst und in Ethylether präzipitiert. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet.
Analytisches: Produkt und Zwischenprodukt wurden durch HPLC und Massenspektroskopie auf Reinheit und Identität der Verbindung analysiert.
Os(dm-bpy)₂Cl₂: Theoretisches MG = 629,6, MS zeigte 8 Isotopenspitzen mit der prominentesten Spitze bei 630. Die HPLC-Elutionszeit bei 29,94 min mit einer Reinheit von 90%+.
Os(dm-bpy)₂(mcp-bpy): MS bestätigte das Molekulargewicht bei 814,5 und HPLC zeigte eine Reinheit größer als 85%.
Synthese von Biotin-Os-Komplex-Konjugaten Biotin-Os(dm-bpy)₂(mcp-bpy)]Cl₂
Die Carboxylgruppe wurde durch Reagieren des obigen Os-Komplexes mit Dicyclohexylcarbodiimid in der Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Der aktive Ester-Os-Komplex wurde unter Verwendung eines präparativen HPLC- Verfahrens isoliert und dann mit Amin-enthaltendem Biotin reagiert, um das endgültige Konjugat zu bilden.
Experiment, um die Konzentration von zwei elektroaktiven Konjugatspezies unabhängig voneinander zu messen.
Os(bipy)HisCl-DSG-HbAlc wurde wie oben beschrieben hergestellt.
Ferrocen-AMCHA-DADOO-Bioton wurde aus Ferrocenmonocarbonsäure, dem Querverbinder Aminomethylcyclohexansäure, dem Kettenverlängerer 1,8-Diamino-3,6-DiOxoOctan und Biotin hergestellt, wie anderswo beschrieben.
Mischungen der zwei Konjugate wurden hergestellt, um die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu evaluieren, die Konzentration der Konjugate unabhängig voneinander zu messen und Korrekturen für Variationen bei den Reagenzienmengen, der Elektrodenantwort und den Umgebungsbedingungen zu machen.
Teil 1: Einfache Mischkonjugatantwort
Die folgende Matrix von Lösungen wurde in 10 mM Phosphatpuffer mit 150 mM NaCl und 0,5 % Brij-35, einem nichtionischen Tensid, hergestellt.
Eine verzahnte Feldmikroelektrode (IDA) wurde gemäß den beschriebenen Vorgehensweisen hergestellt. Zusätzlich zu der IDA hat der Chip eine Silber/Silberchlorid-Elektrode auf der Oberfläche, um als Referenzelektrode und Gegenelektrode zu funktionieren. Diese Elektrode wurde mit demselben lithographischen Verfahren hergestellt und dann mit Silber und Silberchlorid gemäß Standardtechniken elektroplattiert. Die IDA wurde mit einem Bipotentiostaten verbunden, der zum Steuern des Potentials relativ zur Referenz und Messung des Stroms an jeder der Elektroden der IDA in der Lage ist. Aliquots der Lösung wurden auf der Oberfläche der Chips platziert, so dass die IDA und Referenzelektroden bedeckt waren.
Die Messungen wurden durch zuerst Anlegen von –100 mV (gegenüber Ag/AgCl) an eine Elektrode der IDA und 200 mV an die andere Elektrode für einen Zeitraum von 30 s durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wurde an jeder Elektrode der Strom gemessen. Dann wurden 200 mV an einer Elektrode und 550 mV an der anderen angelegt. Nach 30 s wurde der Strom wieder gemessen. Siehe 9 für eine Zusammenfassung der Ergebnisse, die klar demonstrieren, dass die Konzentrationen der zwei Mediatoren mit diesem Verfahren voneinander unabhängig gemessen werden können.
Teil 2: Konzentrations-Kovarianz von dualen Mediatoren auf IDA-Elektroden
Bei diesem Experiment wurde gezeigt, dass durch Herstellen einer Mischung bekannter Konzentrationen von zwei verschiedenen Mediatoren und Messen verschiedener Verdünnungen dieser Mischung durch das erfindungsgemäße Verfahren das Verhältnis der Konzentrationen des Mediators konstant bleibt (interne Standardanwendung).
Dieselben zwei Mediatorkonjugate wie in Teil 1 wurden verwendet. (Os-DSG-Alc und Fc-Bi).
Aus einer Lösung, die 40 μM jedes Konjugats enthielt, wurden Lösungen, die 27 μm; 32 μM und 36 μM jedes Konjugats enthielten, in demselben Puffer (PBS/Brij) hergestellt.
Die Lösungen wurden wie im vorherigen Beispiel gemessen. Jede Lösung wurde an fünf verschiedenen IDA-Elektroden gemessen. Die Ergebnisse sind als Mittel, Standardabweichungen und Variationskoeffizient für jede Lösung getrennt aufgeführt und für alle Lösungen, die über alle Elektroden gepoolt sind.
Dieses Beispiel zeigt klar, dass der interne Standardeffekt des Messens zweiter Konjugate von Mediatoren und Berechnen des Verhältnisses eine signifikant verbesserte Messpräzision ergibt, nicht nur innerhalb jeder Lösung (Kompensation für die Variation zwischen Elektroden), sondern auch über alle Lösungen (Kompensation für die Variation in Probenverdünnung oder Menge).
Teil 3: Temperaturkompensation
Es war erwünscht, die Effektivität des Verfahrens beim Kompensieren von Umgebungseinflüssen, etwa einer Temperaturveränderung, auf die Genauigkeit der Messung zu zeigen.
Dieselben zwei Konjugate wurden in Lösung bei 40 μM hergestellt wie zuvor. Sie wurden wie zuvor auf IDA-Elektroden gemessen, entweder bei Raumtemperatur oder auf einer erhitzten Metallplatte vor der Messung auf 35-40°C aufgewärmt. Die Lösungen wurden auch vor dem Anwenden der Elektroden auf 37°C erwärmt.
Wie durch die Ergebnisse gezeigt, steigen die Messwerte im Falle der erwärmten Proben um fast 50%, was zu einem großen Messfehler führen würde. Jedoch eliminiert die Verwendung des internen Standards und der Verhältnisberechnung effektiv die Temperaturabhängigkeit des Ergebnisses.
Immunoassaydetektion von HbAlc mit Osmium-Mediatorkonjugaten
Das Ziel aller Diabetestherapien ist es, einen normalen Glucosespiegel im Blut aufrechtzuerhalten. Heim-Blutglucosekits sind erhältlich, um die aktuellen Glucosewerte zu überwachen und sie sind für Diabetiker wertvoll, um die täglichen Insulindosen und Essgewohnheiten einzustellen. Da diese Tests nur einen Punkt in der Zeit als Ergebnis messen, erzählt er ihnen unglücklicherweise nicht die Gesamteffektivität ihrer Aktionen beim Aufrechterhalten der glykämischen Kontrolle. Die Messung von glycosyliertem Hämoglobin wird nun weitgehend als ein Index der mittleren Blutglucosekonzentration über die letzten 6-8 Wochen akzeptiert und stellt daher ein Maß der Effektivität einer Gesamttherapie eines Diabetikers während Perioden stabiler Kontrolle bereit. Da die Überwachung von glycosyliertem Hämoglobin eines Diabetikers zu einer verbesserten glykämischen Kontrolle führen kann, empfiehlt die ADA Routinemessungen von 4 Mal pro Jahr bis zu 1 Mal pro Monat für weniger stabile Typ I-Diabetiker.
Verschiedene Technologien sind für die Messung von glycosyliertem Hämoglobin erhältlich. Sie beinhalten Immunoassays für HbAlc (TinaQuant, BMC; DCA2000, Ames; und Unimate, Roche), Ionenaustausch (Variant, BioRad; Eagle Diagnostics) und Affinitätschromatographie (ColumnMate, Helena; GlyHb, Pierce).
Eine Aufgabe dieses Projektes ist es, einen einfach zu verwendenden Wegwerfstreifen für die elektrochemische Detektierung von HbAlc zur Verwendung sowohl in Arztpraxen als auch zu Hause zu entwickeln.
Der signifikanteste Parameter zum Bestimmen des Patientenzustands ist das Verhältnis von HbAlc zu HbA₀ und damit ist die Messung sowohl von glycosylierten (HbAlc-) als auch nicht-glycosylierten (HbA0-) Werten notwendig, um das Verhältnis zu berechnen. Dies erfordert zwei getrennte Messungen. Es wird bevorzugt, dieselbe Technologie zu verwenden, um sowohl die glycosylierten als auch die nicht-glycosylierten Fraktionen zu messen, wodurch einige Proben- und Umgebungsinterferenzen beseitigt werden. Die Messung von HbAlc über ein elektrochemisches Immunoassay wird unten beschrieben. Elektrochemische HbAO-Immunoassaymessungen werden unter Verwendung derselben Verfahren wie für HbAlc ausgeführt. Die Konzentrationen von HbA₀ sind signifikant höher. Eine Alternative zur A₀-Messung unter Verwendung von Immunoaffinität würde sein, das Gesamthämoglobin direkt unter Verwendung von Biamperometrie oder differenzieller Pulsvoltametrie zu messen. Dies kann leicht erreicht werden, da Hämoglobin einfach durch [Os(bpy)₂(im)Cl]²+Cl₂ oxidiert wird.
Das N-terminale Valin der β-Kette von Hämoglobin A ist der Ort der Glycosylierung von HbAlc und dient als Erkennungsstelle für den Antikörper. Im Gesamtblut ist das N-terminale Valin nicht für die Bindung durch den Antikörper zugänglich. Der Zugang wird durch Lysieren der roten Zellen gewonnen, um das Hämoglobin freizusetzen, gefolgt von einer Konformationsänderung (Denaturierung oder Auffaltung), um das HbAlc-Epitop adäquat zu exponieren. Die Verdünnung der Probe kann als Teil des Lysierungs/Denaturierungsprozesses auftreten oder kann nach der Denaturierung nötig sein, um die Probe für den Antikörper vorzubereiten (pH einstellen, anders) oder die Probe in einen Bereich zu bringen, der für einen elektrochemischen Immunassay geeignet ist. Bei einer Ausführungsform wird eine feste Menge an Antikörper mit der vorbereiteten Probe inkubiert und er bindet an die HbAlc-Epitope der Probe. Der freie Antikörper und die Antikörper-gebundene Probe wird dann mit dem Osmiumpeptidkonjugat (Alc oder A₀) kombiniert, um dem verbleibenden ungebundenen Antikörper zu gestatten, an das Mediatorkennzeichen zu binden. Wenn der Mediator an dem Antikörper (einem Makromolekül) gebunden ist, kann er nicht frei diffundieren, um mit der Elektrode zu interagieren und somit sind die erzeugten Ströme signifikant vermindert. Das verbleibende ungebundene Mediatorkennzeichen ist daher proportional zur Konzentration von HbAlc in der Probe. Der ungebundene Mediator kann elektrochemisch gemessen werden, vorzugsweise unter Verwendung einer verzahnten Feldelektrode mit bipotentiostatischer Steuerung.
Blutlyse, gefolgt von der Denaturierung zum Exponieren des HbAlc-Epitops, ist für das Freisetzen des Hämoglobins notwendig. Die Lyse kann einfach über Tenside, osmotische Effekte der Verdünnung mit Wasser und direkt durch viele Denaturierungsmittel erreicht werden. Das durch einen Gefrier-/Tau-Zyklus lysierte Blut interferierte, wie gezeigt werden konnte, nicht signifikant mit der biamperometrischen Messung ("offene Rate" mit oder ohne lysiertes Blut war praktisch identisch). Im Gegensatz dazu hat das Denaturieren des lysierten Bluts mit einer Vielzahl bekannter Denaturierungsmittel zum Exponieren des HbAlc-Epitops eine signifikante Unterdrückung der elektrochemischen Antwort gezeigt, was die Messung einer HbAlc-Dosisantwort hemmt. Einzig LiSCN und Citronensäure au der in Tabelle 1 gezeigten Liste evaluierter Denaturierungsmittel waren in der Lage, das Alc-Epitop zu exponieren und die Proteinkorrosion hinreichend zu minimieren, um eine HbAlc-Dosisantwort zu messen.
Ein Denaturieren der Probe für eine Antikörpererkennung ohne ernsthafte Korrosion der Elektrodenoberfläche ist für eine erfolgreiche Entwicklung eines HbAlc-Immunoassays wichtig. Obwohl LiSCN fast ausschließlich verwendet worden ist, um die Messbarkeit zu zeigen, hat es viele Beschränkungen, die seine Verwendung im Wegwerfartikel behindern würden. Citronensäure, ein Feststoff bei Raumtemperatur, kann als Denaturierungsmittel viele Vorteile bieten, falls es auf einem Streifen getrocknet werden könnte, gefolgt von einem Verdünnungsmittel, um den pH auf neutral einzustellen. Saure oder basische Blutdenaturierung, gefolgt von einer letzten pH-Einstellung mit einem gepufferten Verdünnungsmittel, ist ein Bereich, der eine weitere Evaluierung wert ist. Ein Problem, das anfangs auftrat, war die Präzipitation beim Einstellen des pHs zurück nach neutral, welches durch Verwenden eines anderen Puffers oder mit der Zugabe von Tensiden überwunden werden kann. Tabelle 1. Blutdenaturierungsmittel

Tabelle 2. Effektive Blut-denaturierende Prozedur für 2% Blut
PBS = 10 mM Phosphatpuffer, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl pHG = 7,4
Erhöhter Tensidpegel (5% Tween) vermindert oder eliminiert das Präzipitat.
Eine durch an der Elektrodenoberfläche absorbierender denaturierter Blutproteine verursachte Elektrodenkorrosion kann den Elektronentransfer beeinträchtigen und damit die Elektrodensensitivität mindern. Das Elektrodenkorrosion oder die Passivierung tritt mehr oder weniger unmittelbar nach dem Probenkontakt mit der Oberfläche auf, und daher sollte das Minimieren der Schwere der Denaturierung in der Probe der erste Ansatz sein. Oberflächenbedingungen, die hydrophob sind, werden die Adhäsion des Proteins favorisieren und daher kann ein Korrosion bei Elektrodenoberflächen höherer Oberflächenenergien minimiert werden. Dies erklärt, warum Gold-Elektroden bei denaturiertem Blut weniger Korrosion zeigen als Palladium. Die Verminderung der Proteinkorrosion kann durch Wechseln oder Schützen der Elektrodenoberfläche erzielt werden. Modifikationen, die die Oberfläche hydrophiler machen, sollten das Ausmaß der Korrosion vermindern und können durch Argon- oder Sauerstoffplasmabehandlung oder Coronabehandlung erzielt werden. Selektive Beschichtungen, welche die Proteine am Erreichen der Elektrodenoberfläche hindern könnten, können üblicherweise teilweise das Problem umgehen, und sind im Gebiet eingesetzt worden, um Korrosion zu verringern. Unglücklicherweise werden dramatische Senkungen der Antworten, größer als normalerweise bei den denaturierten Blutproteinen, gesehen, bei ihrer Verwendung bemerkt. Hydrophile Beschichtungen wie etwa PEO wurden auch evaluiert und zeigten eine gewisse Verbesserung, weisen jedoch ähnliche Probleme verringerter Größenordnung und Präzision auf, die dadurch verursacht sind, dass Reagenzien dazu gezwungen werden, durch die Polymere zu diffundieren. Auf den Elektroden verteilte und getrocknete Reagenzien können dabei helfen, die Größenordnung der Proteinkorrosion bei geringeren negativen Effekten zu vermindern.
Die Mediator-Konzentrationsdosisantwort, Inhibition mit Antikörper und Umkehrung mit einem BSA-Alc-Polyhaptan wurden evaluiert und sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Das Os-DSG-Alc ist in einer lyophilisierten Form und wenn in Lösung bei –20°C (40 und 80 μM) eingefroren stabil. Tabelle 3. Osmiummediator-Kennzeichen
Ein polyklonaler DE (Ionenaustausch)-gereinigter Schafsantikörper wird beim TinaQuant HbAlc-Assay verwendet. Ein IS (Immunosorbent)-Antikörper wird unter Verwendung von Standard-IS-Reinigungsmethodik hergestellt. Auch wurden Proben eines monoklonalen Antikörpers zur Evaluierung erhalten. Hemmungskurven wurden in Lösung durchgeführt, wobei das gesamte Mischen in Mikrozentrifugationsröhrchen stattfand. Die Assays wurden durch Aufbringen von 20 μl auf 6 mm² Palladiumelektroden mit den in Tabelle 3 gezeigten Bedingungen gemessen. Die Hemmungskurven bei den drei Hämoglobin Alc-Antikörpern (PAK IS, PAK DE und MAK) wurden durch Fixieren von OS-DSG-Alc bei 5 μM und Variieren der Antikörperkonzentration erzeugt. Sowohl PAK IS als auch MAK zeigten die erwartete stöchiometrische Beziehung zur Hemmung mit dem Osmiumpeptid-Konjugat, was effizientes und schnelles Binden des Antikörpers an Alc-Peptid anzeigt. Sowohl der polyklonale IS als auch der monoklonale zeigen steife Hemmkurven mit einer Maximaländerung, die nahe an 5 μM erreicht wird. Zusätzlicher Antikörper über 5 μM zeigte einen geringen Effekt auf das Steigern der Hemmung. Der weniger aufgereinigte PAK DE-Antikörper hatte eine wesentlich kleinere Steigung und erforderte wie erwartet mehr als 3-fache Menge, um in die Nähe der Maximalhemmung zu kommen. 6 zeigt die Hemmkurven für jeden der getesteten HBAlc-Antikörper. Anhand der Hemmkurven waren wir in der Lage, sinnvolle Konzentrationen von Antikörper für maximale Umkehr bei Alc-Proben auszuwählen.
Es wurden auch Hemmkurven für die Os-SMCC-Alc (Max = 97%) und OS-SATA-Alc (Max = 44 %) Mediatorkennzeichen durchgeführt. Die Stabilität der Mediatorkennzeichen wurden auch durch Überwachen der % Inhibierungswerte über die Zeit evaluiert. Alle Mediatorkennzeichen zeigten eine gewisse Degradierung, wenn sie in verdünnten Lösungen (40 μM) bei Raumtemperatur gelagert wurden. Bei –20°C eingefrorene Proben erscheinen stabil.
Zum Demonstrieren der Hemmumkehr wurden Antikörperkonzentrationen von 4 μM sowohl für PAK IS als auch MAK und 15 μM für PAK DE aus den oben gezeigten Hemmkurven ausgewählt. Dann wurden Umkehrkurven unter Verwendung einer Serie von Verdünnungen von BAS-Alc-Polyhaptan mit ungefähr 1:1 für Alc:BSA erzeugt. Das BSA-Alc dient als unsere Probe und bindet am Antikörper. 10 zeigt die Reversionskurven für die drei Antikörper.
Während diese Machbarkeitsstudien für einen HbAlc-Immunoassay eine Enzymvermittelte Amplifikationsmethode verwendeten (Glucdor(PQQ/Glucose wurde verwendet, um reduzierten Mediator nach Oxidierung an der Elektrodenoberfläche zu regenerieren, was einen höheren Diffusions-gesteuerten Strom , der durch die Cottrell-Gleichung gegeben ist, bereitstellt), wird angenommen, dass sie für bei der Verwendung von IDA-Elektroden mit bipotentiostatischer Steuerung erzielbare Ergebnisse indikativ ist, wird am meisten zum Messen von Mediator-markierten Konjugaten gemäß dieser Erfindung bevorzugt.

Claims

Verfahren zum Messen der Konzentration eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe, wobei das Verfahren umfasst: Kontaktieren eines Volumens der Flüssigprobe mit 1) vorgegebenen Mengen zumindest einer ersten und zweiten Redox-reversiblen Spezies, wobei jede jeweilige Spezies ein Redox-Potential aufweist, das sich um mindestens 50 Millivolt von dem der anderen Spezies unterscheidet, zumindest eine Spezies ein Flüssigproben-diffundierbares Konjugat eines Liganden-Analogs eines Analyten in der Flüssigprobe und ein Redox-reversiblen Kennzeichen umfasst, wobei das Konjugat zur kompetitiven Bindung mit einem spezifischen Bindungspartner für den Analyten fähig ist, und 2) einer vorgegebenen Menge zumindest eines spezifischen Bindungspartners für jeden zu messende Analyten, und Elektrochemisches Bestimmen der Konzentration jeder der diffundierbaren Redoxreversiblen Spezies in der Flüssigprobe durch Kontaktieren der Probe mit einer Elektrodenstruktur, die eine Referenzelektrode und zumindest erste und zweite Arbeitselektroden enthält, die dafür dimensioniert sind, Diffusions-Recyclen der diffundierbaren Redox-reversiblen Spezies in der Probe zu gestatten, wenn ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode angelegt wird und ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Anodenpotential an einer zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei das Diffusions-Recyclen der Spezies ausreichend ist, um einen messbaren Strom durch die Probe zu unterhalten, Anlegen eines ersten Kathodenpotentials an der ersten Arbeitselektrode und eines ersten Anodenpotentials an der zweiten Arbeitselektrode, wobei die ersten Kathoden- und Anodenpotentiale denjenigen jeweiligen Potentialen entsprechen, die nötig sind, um einen Stromfluss durch die Probe aufgrund des Diffusions-Recyclen der ersten Redox-reversiblen Spezies ohne signifikante Interferenz von der zweiten Redox-reversiblen Spezies aufzubauen; Messen des Stromflusses an den ersten Anoden- und Kathodenpotentialen, Anlegen eines zweiten Kathodenpotentials an der ersten oder zweiten Arbeitselektrode und eines zweiten Anodenpotentials an der anderen Arbeitselektrode, wobei die zweiten Kathoden- und Anodenpotentiale denjenigen jeweiligen Potentialen entsprechen, die nötig sind, um einen Stromfluss durch die Probe aufgrund des Diffusions-Recyclen der zweiten Redox-reversiblen Spezies ohne signifikante Interferenz von der ersten Redox-reversiblen Spezies aufzubauen; Messen des Stromflusses an den zweiten Anoden- und Kathodenpotentialen, Korrelieren der jeweils gemessenen Stromflüsse mit denen für bekannte Konzentrationen der jeweiligen diffundierbaren Redox-reversiblen Spezies.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Anoden- und Kathodenpotentiale an den Arbeitselektroden unter Verwendung eines Bipotentiostaten angelegt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Redox-reversible Kennzeichen ein Metallionenkomplex ist, der ausgewählt ist aus Ferrocen- und Stickstoff-koordinierten Komplexen von Übergangsmetallionen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Redox-reversible Kennzeichen eine Redox-reversible organische Gruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Messen der Konzentration zweier Analyte in einer Flüssigprobe, wobei die jeweiligen Redox-Potentiale der ersten und zweiten Redoxreversiblen Spezies sich um zumindest 100 Millivolt unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Messen der Konzentration eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe, wobei der Stromfluss gemessen wird, während zumindest eines der Anoden- oder Kathodenpotentiale auf dem vorgegebenen Wert gehalten wird und das Potential des anderen durch seinen vorgegebenen Wert gefahren wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Messen zweier eiweißartiger Analyte in einer Flüssigprobe, wobei die Ligandenanalog-Komponente der ersten Redox-reversiblen Spezies ein Peptid ist, das ein Epitop eines ersten Analyten umfasst und die Ligandenanalog-Komponente einer zweiten Redox-reversiblen Spezies ein Peptid ist, das ein Epitop eines zweiten Analyten umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein spezifischer Bindungspartner ein Antikörper ist, der das Epitop des ersten Analyten erkennt und der andere spezifische Bindungspartner ein Antikörper ist, der das Epitop des zweiten Analyten erkennt.
Verfahren nach Anspruch 1 zum Messen eines Analyten in einer Flüssigprobe, wobei die jeweilige Ligandenanalog-Komponente der ersten und zweiten Redoxreversiblen Spezies unterschiedliche Ligandenanaloge eines einzigen Analyten sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Ligandenanalog-Komponente der ersten Redox-reversiblen Spezies ein Peptid ist, das ein erstes Epitop des Analyten umfasst und die Ligandenanalog-Komponente der zweiten Redox-reversiblen Spezies ein Peptid ist, das ein zweites Epitop des Analyten umfasst und die spezifischen Bindungspartner erste und zweite Antikörper sind, die alle die jeweiligen ersten und zweiten Epitope erkennen.
Vorrichtung zum Feststellen oder Quantifizieren eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe, wobei die Vorrichtung umfasst: zumindest zwei Redox-reversible Spezies, die alle zur Diffusion in der Flüssigprobe fähig sind, zumindest in Anwesenheit eines entsprechenden vorgegebenen Analyten, wobei die Redox-reversiblen Spezies jeweils Redox-Potentiale aufweisen, die sich um zumindest 50 Millivolt unterscheiden, eine Elektrodenstruktur zum Kontakt mit der Flüssigprobe, wobei die Elektrodenstruktur eine Referenzelektrode und Arbeitselektroden beinhaltet, die dafür dimensioniert sind, ein Diffusions-Recyclen einer diffundierbaren Redoxreversiblen Spezies in der Flüssigprobe in Kontakt mit der Elektrodenstruktur zu gestatten, wenn ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode angelegt wird und ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Anodenpotential an einer zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei das Diffusions-Recyclen der Spezies hinreichend ist, um einen messbaren Strom durch jede Arbeitselektrode zu unterhalten, und Leiter, die mit den jeweiligen Elektroden zum Anlegen des Anodenpotentials und des Kathodenpotentials verbunden sind, und zum Leiten des von der Elektrode geleiteten Stroms.
Vorrichtung nach Anspruch 11, weiterhin umfassend eine Probenkammer, wobei die Kammer einen Probenaufnahmedurchlass aufweist und so dimensioniert ist, dass sie sich durch Kapillarfluss füllt, wenn die Flüssigprobe in Kontakt mit dem Probenaufnahmedurchlass gebracht wird.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Elektrodenstruktur Mikrofeldelektroden umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Anordnungen von Mikroscheiben, Mikrobändern und Mikrolöchern besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Elektrodenstruktur verzahnte Mikrofeldelektroden umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Redox-reversiblen Spezies zum Kontakt mit der Flüssigprobe lokalisiert sind, wenn sie der Kammer zugeführt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei zumindest eine Redox-reversiblen Spezies einen Osmium-Komplex enthält.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei zumindest eine der Redox-reversiblen Spezies Ferrocen oder ein Redox-reversibles Derivat davon umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei zwei Redox-reversiblen Spezies zum Kontakt mit der Flüssigprobe positioniert sind, wenn sie der Kammer zugeführt wird und jede Spezies ein Osmium-Komplex ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, enthaltend zumindest eine Redox-reversible Spezies, die Ferrocen oder ein Redox-reversibles Derivat davon umfasst und eine Redox-reversible Spezies, die einen Osmium-Komplex umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei zumindest eine der Redox-reversiblen Spezies eine elektrochemisch bestimmbare Verbindung der Formel
ist, wobei R und R₁ gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei jeder Substituent eine Methyl-, Ethyl-, oder Phenylgruppe ist, R und R₁ über ihre Stickstoff-Atome mit Os koordiniert sind; q 1 oder 0 ist; R₇- gleich B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist; R₂ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, wenn q gleich 1, und R₂B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist, wenn q gleich 0 ist wobei in der Gruppe B-(L)_k-Q(CH₂)_i- Q gleich 0, S oder NR₄ ist, wobei R₄ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, -L- ein divalenter Linker ist; k gleich 1 oder 0 ist; i gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, und B Wasserstoff oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfasst, der zum Binden an einen spezifischen Bindungspartner in der Lage ist; Z Chlor oder Brom ist m gleich +1 oder +2 ist; X ein mono- oder divalentes Anion ist; Y ein monovalentes Anion ist; und n gleich 1 oder Null ist, vorbehaltlich, dass, wenn X ein divalentes Anion ist, n Null ist, und wenn m gleich 1 ist, n gleich Null ist und X kein divalentes Anion.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei zumindest eine der Redox-reversiblen Spezies eine elektrochemisch detektierbare Verbindung der Formel
ist, wobei R und R₁ gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei jeder Substituent eine Methyl-, Ethyl-, oder Phenylgruppe ist, R₅ 4-substituiertes 2,2'-Bipyridyl oder 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl ist, wobei der Substituent die Gruppe B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist und der 4'-Substituent eine Methyl, Ethyl oder eine Phenyl-Gruppe ist, R, R₁ und R₅ über ihre Stickstoff-Atome mit Os koordiniert sind; Q gleich O, S oder NR₄ ist, wobei R₄ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, -L- ein divalenter Linker ist; k gleich 1 oder 0 ist; i gleich 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, und B Wasserstoff oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfasst, der zum Binden an einen spezifischen Bindungspartner in der Lage ist; d gleich +1 oder +2 ist; X und Y Anionen sind, die ausgewählt sind aus monovalenten Anionen und divalentem Anionen-Sulfat, Carbonat oder Sulfit, wobei x und y unabhängig 0, 1, 2 oder 3 sind, so dass die Nettoladung von X_xY_y gleich -2 oder -3 ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Redox-reversible Spezies jeweils Redoxpotentiale aufweisen, die sich um zumindest 100 Millivolt unterscheiden.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Redox-reversible Spezies jeweils Redoxpotentiale aufweisen, die sich um zumindest 200 Millivolt unterscheiden.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die Vorrichtung zumindest zwei Elektrodenstrukturen umfasst, die jede in der Form von Mikrofeldelektroden sind, die dafür dimensioniert sind, ein Diffusions-Recyclen einer diffundierbaren Redoxreversiblen Spezies zu ermöglichen.
Vorrichtung nach Anspruch 11 zum Quantifizieren eines ersten Analyten und eines zweiten Analyten in einer Flüssigprobe, wobei die Vorrichtung zwei Redoxreversible Spezies umfasst, wobei eine erste Redox-reversible Spezies ein Konjugat eines Liganden-Analogs des ersten Analyten umfasst und eine zweite Redoxreversible Spezies ein Konjugat eines Liganden-Analogs des zweiten Analyten umfasst und jedes der Analyten-Analog-Konjugate zum mit seinem jeweiligen Analyten kompetitiven Binden an einen spezifischen Bindungspartner in der Lage ist.
Vorrichtung nach Anspruch 25, weiterhin umfassend einen Bindungspartner, der sowohl für den ersten Analyten als auch das Redox-reversible Konjugat des Liganden-Analogs des ersten Analyten spezifisch ist und einen Bindungspartner, der sowohl für den zweiten Analyten als auch für das Redox-reversible Konjugat des Liganden-Analogs des zweiten Analyten spezifisch ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11, weiterhin umfassend einen Bipotentiostaten in elektrischer Verbindung mit den Leitern zum Anlegen eines Redox-reversiblen Spezies-abhängigen Kathodenpotentials an eine Arbeitselektrode und eines Redoxreversiblen Spezies-abhängigen Anodenpotentials an eine zweite Arbeitselektrode.
Vorrichtung nach Anspruch 27 zum Quantifizieren eines oder mehrerer Analyten in einer Flüssigprobe, wobei die Vorrichtung erste und zweite Redox-reversible Spezies enthält, wobei der Bipotentiostat programmierbar ist und er darauf programmiert ist, ein erstes Kathodenpotential an einer ersten Arbeitselektrode und ein erstes Anodenpotential an einer zweiten Arbeitselektrode anzulegen, wobei die ersten Anoden- und Kathodenpotentiale jenen Potentialen entsprechen, die nötig sind, einen Stromfluss durch die Probe aufgrund des Diffusions-Recyclens der ersten Redox-reversiblen Spezies aufzubauen, und wobei der Bipotentiostat darauf programmiert ist, ein zweites Kathodenpotential an der ersten Arbeitselektrode und ein zweites Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode anzulegen, wobei die zweiten Anoden- und Kathodenpotentiale jenen Potentialen entsprechen, die nötig sind, um einen Stromfluss durch die Probe aufgrund des Diffusions-Recyclens der zweiten Redox-reversiblen Spezies aufzubauen, und Mittel zum Messen des Stromflusses durch die Probe an jedem der ersten und zweiten Potentiale.
Vorrichtung nach Anspruch 27 zum Quantifizieren eines oder mehrerer Analyten in einer Ligandenprobe, wobei die Vorrichtung erste und zweite Redox-reversible Spezies enthält, und zumindest erste und zweite Elektrodenstrukturen zum Kontakt mit den Redox-reversiblen Spezies in der Kammer, wobei jede der Elektrodenstrukturen ein Mikrofeld von Arbeitselektroden umfasst, und einen Schalter zum Ändern der elektrischen Verbindung des Bipotentiostaten zwischen den ersten und zweiten Elektrodenstrukturen.
Vorrichtung nach Anspruch 29, wobei der Bipotentiostat programmierbar ist und dafür programmiert ist, ein erstes Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode der ersten Elektrodenstruktur und ein ersten Anodenpotential an einer zweiten Arbeitselektrode der ersten Elektrodenstruktur anzulegen, wobei die ersten Anoden- und Kathodenpotentiale jenen entsprechen, die nötig sind, um einen Stromfluss durch die Probe aufgrund von Diffusions-Recycling der ersten Redox-reversiblen Spezies aufzubauen, und wobei der Bipatentiostat dafür programmiert ist, ein zweites Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode der zweiten Elektrodenstruktur und ein zweites Anodenpotential an einer zweiten Elektrode der zweiten Elektrodenstruktur anzulegen, wobei die zweiten Kathoden- und Anodenpotentiale jenen Potentialen entsprechen, die nötig sind, um einen Stromfluss durch die Probe aufgrund von Diffusions-Recycling der zweiten Redox-reversiblen Spezies aufzubauen, und Mittel zum Messen des Stromflusses durch die Probe an jeder Elektrodenstruktur.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei die ersten und zweiten reversiblen Spezies jede ein Konjugat verschiedener Liganden-Analoge eines Analyten umfassen, wobei jedes der Konjugate zum mit dem Analyten kompetitiven Binden an einen von zwei unabhängigen spezifischen Bindungspartners für den Analyten in der Lage ist.
Vorrichtung nach Anspruch 11 zum Quantifizieren von glykosyliertem Hämoglobin, wobei zumindest eine der zwei Redox-reversiblen Spezies ein Konjugat der Formel Gluc-Val-His-Leu-Thr--L--M₁ umfasst, wobei M₁ ein Redox-reversibles Kennzeichen, L ein Linker und Gluc-Val-His-Leu-Thr-die N-terminale Sequenz der β-Kette von Hämoglobin Alc ist.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei das Redox-reversible Kennzeichen ein Metallionenkomplex ist.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei M₁ ein Osmium-Ionenkomplex oder Ferrocen ist.
Vorrichtung nach Anspruch 32, wobei die andere reversible Redox-Spezies ein Redox-reversibles Konjugat der Formel Val-His-Leu-Thr--L--M₂ umfasst, wobei M₁ ein Redox-reversibles Kennzeichen und L ein Linker ist.
Vorrichtung nach Anspruch 35, wobei das Redox-reversible Kennzeichen ein Metallionenkomplex ist.
Vorrichtung nach Anspruch 35, wobei sich die Redox-Potentiale von M₁ und M₂ um zumindest 100 Millivolt unterscheiden.
Vorrichtung nach Anspruch 35, wobei sich die Redox-Potentiale von M₁ und M₂ um zumindest 200 Millivolt unterscheiden.
Vorrichtung nach Anspruch 35, weiterhin umfassend einen spezifischen Bindungspartner sowohl für Hämoglobin Alc als auch das Redox-reversible Konjugat Gluc-Val-His-Leu-Thr--L--M₁.
Vorrichtung nach Anspruch 35, weiterhin umfassend einen spezifischen Bindungspartner sowohl für Hämoglobin als auch das Redox-reversible Konjugat Val-His-Leu-Thr--L--M₂.
Kit zum Messen der Konzentration eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigprobe, wobei das Kit umfasst: zumindest zwei Redox-reversible Spezies zum Kontakt mit der Flüssigprobe, die alle zur Diffusion in der Flüssigprobe fähig sind, zumindest in Anwesenheit eines vorgegebenen Analyten, wobei zumindest eine Spezies ein Konjugat eines Liganden-Analogs eines Analyten und ein Redox-reversibles Kennzeichen umfasst, wobei die Redox-reversiblen Spezies jeweils Redox-Potentiale aufweisen, die um zumindest 50 Millivolt differieren, einen spezifischen Bindungspartner für jeden Analyten; eine Elektrodenstruktur zum Kontakt mit der Flüssigprobe, wobei die Elektrodenstruktur eine Referenzelektrode und Arbeitselektroden beinhaltet, die dafür dimensioniert sind, ein Diffusions-Recyclen von diffundierbaren Redoxreversiblen Spezies in der Flüssigprobe zu gestatten, wenn ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Kathodenpotential an einer Arbeitselektrode angelegt wird und ein vorgegebenes Redox-reversibles Spezies-abhängiges Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei das Diffusions-Recyclen der Spezies hinreichend bedeutet, um einen messbaren Strom durch die Probe zu unterhalten, und Leiter, die mit den jeweiligen Elektroden zum Anlegen des Anodenpotentials und des Kathodenpotentials verbunden sind, und zum Tragen des von der Elektrode geleiteten Stroms.
Kit nach Anspruch 41, wobei die Elektrodenstruktur Mikrofeldelektroden umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Anordnungen von Mikroscheiben, Mikrobändern und Mikrolöchern besteht.
Kit nach Anspruch 41, wobei die Elektrodenstruktur verzahnte Mikrofeldelektroden umfasst.
Kit nach Anspruch 41, wobei die Redox-reversiblen Spezies zum Kontakt mit der Flüssigprobe als eine Zusammensetzung gemischt sind.
Kit nach Anspruch 41, wobei das Redox-reversible Kennzeichen von zumindest einer Redox-reversiblen Spezies einen Osmium-Komplex umfasst.
Kit nach Anspruch 41, wobei die Redox-reversiblen Spezies jeweils Redox-Potentiale aufweisen, die sich um zumindest 100 Millivolt unterscheiden.
Kit nach Anspruch 41, wobei die Redox-reversiblen Spezies jeweils Redox-Potentiale aufweisen, die sich um zumindest 200 Millivolt unterscheiden.