DE69917051T2

DE69917051T2 - "flow-zytometrischer" vollblut- dendritzelle- immunfunctiontest

Info

Publication number: DE69917051T2
Application number: DE69917051T
Authority: DE
Inventors: Kerstin Willmann; F. John DUNNE
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1998-09-22
Filing date: 1999-09-21
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2019-09-22
Also published as: EP1116037B1; JP2002525606A; EP1116037A1; WO2000017657A1; WO2000017657A9; JP4450998B2; DE69917051D1; US6495333B1; ATE266204T1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf Untersuchungen der Funktion von Blutzellen und insbesondere auf Untersuchungen dendritischer Zellfunktion in Gesamtblut.
Hintergrund der Erfindung
Von dendritischen Zellen (DC), erstmals vor einem viertel Jahrhundert durch eine charakteristische "dendritische" Morphologie identifiziert, die in peripheren Lymphoidgeweben zu beobachten sind, Steinman et al., J. Exp. Med. 137: 1142–1162 (1973), ist nicht bekannt, dass sie eine morphologisch unterschiedliche und weit verbreitete Zellpopulation sind. Heutzutage werden diese unterschiedlichen Zellen insgesamt unterschieden durch eine gemeinsame Funktion: dendritische Zellen sind die potentesten Antigen präsentierenden Zellen (APC) des Säugerimmunsystems und scheinen als Einzige unter den zahlreichen Antigen präsentierenden Zellen in der Lage zu sein, eine primäre T-Lymphozytenantwort auszulösen.
Diese einzigartige Fähigkeit, eine T-Zell vermittelte Immunantwort immunologisch zu aktivieren – in Kombination mit einer starken Fähigkeit, Antigen aktivierten T-Zellen zu präsentieren – hat dendritische Zellen als mögliche Reagenzien für immunbasierte Therapien, ebenso wie als mögliche Ziele für den therapeutischen Eingriff bei der Behandlung zahlreicher immunvermittelter Erkrankungen ins Spiel gebracht.
Zum Beispiel beschreibt die WO 97/24438 Zusammensetzungen und Verfahren zur Co-Kultivierung dendritischer Zellen mit T-Lymphozyten und Proteinantigen in vitro, wodurch folglich die ex vivo antigenspezifische Aktivierung von T-Zellen angetrieben wird. Die aktivierten T-Zellen werden dann autolog verabreicht, um eine antigenspezifische Immunantwort in vivo zu bewirken. Ähnliche beschreibt WO 97/29183 ein Verfahren, T-Zellen in vitro zu aktivieren durch in Kontakt bringen der T-Lymphozyten mit DCs, die direkt ein Antigenprotein aus einem rekombinanten Konstrukt exprimieren. Wiederum sind die aktivierten T-Zellen für die autologe Infusion bestimmt. Die spezifische Anwendung von DC-angetriebener ex vivo T-Zell-Aktivierung bei der Behandlung von Prostatakrebs ist beschrieben und beansprucht im US-Patent 5,788,963. In noch einem anderen Ansatz beschreibt und beansprucht Nemazee, US-Patent Nr. 5,698,679, Immunglobulin-Fusionsproteine, die Antigenpeptide an zum Ziel genommene, Antigen präsentierende Zellen (APC), einschließlich dendritische Zellen, in vivo übermitteln.
Dendritische Zellen wurden auch für wichtig erachtet bei der Pathogenese und Pathophysiologie von AIDS. Von einem DC-Typ, den Langerhans-Zellen (LC), wird allgemein angenommen, dass er der mit HIV nach mukosalem Aussetzen an den Virus anfänglich infizierte Zelltyp ist. Von DCs wird angenommen, dass sie nicht nur während der anfänglichen Phase der HIV-Erkrankung tätig sind, sondern auch während der chronischen Phase, was die Infektion und Dezimierung von T-Lymphozyten erleichtert Zoeteweij et al., J. Biomed. Sci. 5(4): 253–259 (1998). DCs in Lymphoidschleimhaut können ein Schlüsselreservoir an viraler Nukleinsäure und Virionen während dem Verlauf der Erkrankung darstellen. Grouard et al, Curr. Opin. Immunol. 9(4): 563–567 (1997); Weissman et al., Clin. Microbiol. Rev. 1997 10(2): 358–367 (1997). In vitro-Verfahren für das Screening pharmazeutischer Kandidaten für Mittel, die die HIV-Infektion von DC aufheben, sind beschrieben und beansprucht in Steinman et al., US-Patent Nr. 5,627,025.
Trotz ihrer Wichtigkeit für die normale Säugerimmunantwort und bei der Immunopathologie waren DCs schwierig zu untersuchen und insbesondere schwierig in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen.
Die Schwierigkeit stammt zum Teil von der Seltenheit der dendritischen Zellen. Obwohl sie weit verbreitet sind, sind DCs dünn gesät, sogar in Lymphoidgeweben, und repräsentieren nicht mehr als ungefähr 0,3 bis 0,5% der kernhaltigen Zellen in menschlichem peripheren Blut.
Eine weitere Schwierigkeit ergibt sich aus dem Fehlen DC-spezifischer Zelloberflächenmarker, welche leicht die positive Immunselektion von DCs aus gemischten Zellpopulationen erlauben würden.
Ausgedehnte Anstrengungen, Oberflächenmarker zu identifizieren, die DCs definieren, waren nur zum Teil erfolgreich. Als ein Ergebnis werden DCs gegenwärtig mittels einer Palette an multiplen Markern identifiziert, wobei die Identifizierung primär auf dem Fehlen der Färbung mit Markern für andere Linien (das heißt als lin^–-Zellen) basiert. Das Ergebnis ist, dass typische DC-Immunaufreinigungsprotokolle wenigsten seinen Immunabreicherungsschritt benötigen, wobei Zellen zahlreicher nicht-dendritischer Blutlinien – Lymphozyten-, Monozyten-, Granulozyten- und NK-Linien beispielsweise – eliminiert werden, gekoppelt mit wenigstens einem Immunanreicherungsschritt. Der Immunanreicherungsschritt kann z. B. die Selektion für CD4⁺-Zellen einschließen (Blond Dendritic Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec #468-01, Auburn, CA) oder als Alternative oder zusätzlich die Selektion von HLA-DR-Expression, Ghanekar et al., J. Immunol. 157: 4028–4036 (1996).
Diese Reihenmanipulationen können jedoch wesentlich den DC-Zell-Phänotyp, ausgehend von jenem, der in vivo vorhanden ist, verändern. Zum Beispiel exprimieren lin^–HLA-DR⁺CD123⁺ dendritische Zellen in frischen Zubereitungen von mononukleären Tonsillarzellen niedrige Spiegel der T-Zellen co-stimulierenden Moleküle CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) und HLA-DQ. Sogar eine Übernacht-Kultur dieser Zellen in der Abwesenheit hinzugefügter Zytokine ist ausreichend, den reifen DC-Phänotyp mit der Heraufregulierung von CD86, CD80, HLA-DQ und HLA-DR zu induzieren. Olweus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23): 12551–12556 (1997). Die längerfristige Kultur von CD34⁺-dendritischen Zellvorläufern in der Anwesenheit von Zytokinen bewirkt wesentliche phänotypische Änderungen. Caux et al., J. Exp. Med. 184: 695, 1996; Olweus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23): 12551–12556 (1997).
Folglich besteht im Stand der Technik ein Bedarf für Verfahren, dendritische Zellen ohne vorhergehende Immunaufreinigung oder in vitro-Kultur zu untersuchen.
Die Knappheit, DC-spezifischer Zelloberflächenmarker legt weiter nahe, dass immunophänotypische Oberflächenmarker nur unvollständig dendritische Zelluntergruppen unterscheiden könnten, die jedoch nichtsdestotrotz funktionell verschieden sind. Zum Beispiel wurde von peripheren dendritischen Blutzellen gezeigt, dass sie in zwei Untergruppen fallen, die unterscheidbar sind durch die abweichende Expression von CD11c und CD123: eine Untergruppe ist CD11c⁺CD123^niedrig die andere CD11c^–CD123⁺. Olweus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23): 12551–12556 (1997). Die kritischen und grundverschiedenen Rollen, die dendritische Zellen in dem Immunsystem spielen, würden dafür sprechen, dass diese beiden Untergruppen jeweils wahrscheinlich eine Reihe an Zelltypen umfassen mit grundsätzlich unterschiedlicher funktioneller Aktivität.
Folglich besteht ein Bedarf im Stand der Technik für Verfahren, dendritische Zelluntergruppen zu unterscheiden, unter Verwendung von phänotypischen Kriterien, andere als oder zusätzlich zu der Expression von Zelloberflächenmarkern. Es besteht weiterhin ein Bedarf für Verfahren, DC in Untergruppen einzuteilen, basierend auf Kriterien, die direkter in Beziehung stehen mit der DC-Funktion.
Kürzlich haben zahlreiche Gruppen berichtet, das intrazelluläres Färben von Zellen unter Verwendung von zytokin-spezifischen Antikörpern die Durchfluss-Zytometrie-Analyse der Zytokinexpression in hochgereinigten Blutzelllinien, einschließlich gereinigten dendritischen Zellen, erlaubt. Picker et al., Blood 86(4): 1408–1419 (1995); Waldrop et al., J. Clin. Invest. 99: 1739–1750 (1997); Ghanekar et al., J. Immunol. 157: 4028–4036 (1996); de Saint-Vis et al., J. Immunol. 160: 1666–1676 (1998). Noch kürzlicher beschrieben Suni et al., J. Immunol. 212: 89–98 (1998), einen Test für die gleichzeitige Expression von intrazellulären Zytokinen und Zelloberflächenproteinen in Antigen stimulierten T-Lymphozyten ohne vorherige T-Zell-Aufreinigung. Ähnliche Untersuchungen sind beschrieben und beansprucht in den ebenfalls zu eigenen und ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen Nrn. 08/760,447 und 08/803,702.
Es besteht ein Bedarf im Stand der Technik für ein Verfahren, das intrazelluläre Zytokinuntersuchungen an das Messen der Zytokinproduktion durch ungereinigte DC-Zellen in Gesamtblut anpassen würde.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung löst diese und andere Probleme im Stand der Technik durch, gemäß einem ersten Aspekt, Bereitstellen eines Durchfluss-Zytometrie-Verfahrens zum Messen dendritischer Zellfunktion in Gesamtblut, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kontaktieren einer Gesamtblutprobe ohne vorausgehende in vitro-Kultur mit einem dendritischen Zellaktivator; (b) Kontaktieren der Probe mit einer Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern und wenigstens einem zytokin-spezifischen Antikörper; und dann (c) durchfluss-zytometrische Untersuchung der Probe auf das Binden des zytokin-spezifischen Antikörpers mittels wenigstens einer unterscheidbaren DC-Untergruppe.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird die Aktivierung in der Anwesenheit eines Inhibitors der Proteinsekretion durchgeführt und nach der Permeabilisierung der Zellen werden die Zytokine intrazellulär nachgewiesen. Folglich wird in einem besonders bevorzugten Ausführungsbeispiel der Kontaktierungsschritt mit dem dendritischen Zellaktivator in der Anwesenheit von Brefeldin A durchgeführt und der Antikörper kontaktierende Schritt selber umfasst die Schritte, in der Reihenfolge von: (b1) Hinzufügen einer Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern zu der Probe; (b2) Lysieren von Erythrozyten in der Probe; (b3) Permeabilisieren kernhaltiger Zellen in der Probe; und dann (b4) Hinzufügen von wenigstens einem zytokin-spezifischen Antikörper zu der Probe.
Die dendritische Zellen unterscheidenden Antikörper können eine Vielzahl an nicht für DC-Linien spezifischen Antikörpern einschließen. In solchen Fällen ist es besonders bevorzugt, dass jeder der nicht für DC-Linien spezifischen Antikörper mit dem identischen Fluorophor konjugiert werden kann. Wenn eine Vielzahl an nicht für DC-Linien spezifischen Antikörpern verwendet wird, schließen die dendritische Zellen unterscheidenden Antikörper weiter einen Antikörper ein, der spezifisch für HLA-DR ist.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden Untergruppen dendritischer Zellen unterscheidbar markiert. In diesem Ausführungsbeispiel schließen die dendritische Zellen unterscheidenden Antikörper wenigstens einen Antikörper ein, der differenziell an die Oberfläche der unterschiedlichen dendritischen Zelluntergruppen bindet. Besonders bevorzugt bei diesem Ausführungsbeispiel ist die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für CD11c oder CD123 ist.
Die Funktion von DCs kann durch ihre Zytokinexpressionsmuster und durch die dynamische Regulation von Differenzierungs-/Aktivierungsmarkern (CMRF-44, CMRF-56, CD83, CD25), von co-stimulierenden Molekülen (CD40, CD80, CD86) und von Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC Klasse II) charakterisiert werden. Folglich stellt die Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Durchfluss-Zytometrie-Verfahren für das Messen dendritischer Zellfunktion in Gesamtblut bereit, umfassend: (a) Kontaktieren einer Gesamtblutprobe mit einem dendritischen Zellaktivator; (b) Hinzufügen zu der Probe einer Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern und von wenigstens einem Antikörper, der spezifisch für einen dendritischen Zelloberflächenmarker ist, der kennzeichnend ist für die dendritische Zellaktivierung; und dann (c) durchflusszytometrisches Untersuchen dieser Probe für das Binden dieses Antikörpers, der spezifisch für den dendritischen Zelloberflächenaktivierungsmarker ist, durch wenigstens eine unterscheidbare DC-Untergruppe. Der dendritische Zelloberflächeaktivierungsmarker wird nützlicherweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Differenzierungs- /Aktivierungsmarkern (CMRF-44, CMRF-56, CD83, CD25), co-stimulierenden Molekülen (CD40, CD80, CD86) und Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplexen (MHC Klasse II).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die obigen und andere Ziele und Vorteile der Erfindung werden offensichtlich werden nach dem Berücksichtigen der folgenden detaillierten Beschreibung, im Zusammenhang gesehen mit den begleitenden Zeichnungen, in denen ähnliche Referenzzeichen sich durchgängig auf ähnliche Teile beziehen und in denen:
1 ein Flussdiagramm ist, das die Grundschritte in einer Durchfluss-Zytometrie-Gesamtblutuntersuchung der dendritischen Zellfunktion schematisch darstellt, wobei LPS als Beispiel dient für den dendritischen Zellaktivator;
2 eine Reihe an Dot-Plots darstellt, erzeugt während der Durchfluss-Zytometrie-Analyse von Gesamtblut, aktiviert mit LPS in der Anwesenheit von Brefeldin A. CD11c⁺-dendritische Zellen sind grün gefärbt und CD11c^–-dendritische Zellen sind rot gefärbt; nicht-dendritische Zellen erscheinen grau. Die Farben sind willkürlich gewählt und tragen keine Beziehung zu den für die Analyse verwendeten Fluorophoren;
3 eine Reihe an Dot-Plots darstellt, die während der Durchfluss-Zytometrie-Analyse von Gesamtblut, aktiviert mit PMA + I in der Anwesenheit von Brefeldin A, erzeugt wurden. CD11c⁺-dendritische Zellen sind grün gefärbt und CD11c^–-dendritische Zellen sind rot gefärbt; nicht-dendritische Zellen erscheinen grau. Die Farben sind willkürlich gewählt und tragen keine Beziehung zu den für die Analyse verwendeten Fluorophoren;
4 eine Reihe an Dot-Plots zeigt, erzeugt während der Durchfluss-Zytometrie-Analyse von Gesamtblut, inkubiert in der Anwesenheit von Brefeldin A, wobei der Aktivator fehlt (Ruhekontrolle). CD11c⁺-dendritische Zellen sind grün gefärbt und CD11c^–-dendritische Zellen sind rot gefärbt; nicht-dendritische Zellen erscheinen grau. Die Farben sind willkürlich gewählt und tragen keine Beziehung zu den für die Analyse verwendeten Fluorophoren;
5 die differenzielle Expression von TNFα, IL-8, CD80 und CD86 in CD11c⁺– dendritischen Zellen aus zwei Spendern darstellt, wobei jede alternativ mit LPS oder PMA+I aktiviert wurden;
6 eine Reihe an Histogrammen zeigen, die die Wirkungen von drei unterschiedlichen dendritischen Aktivatoren auf die Oberflächenexpression der identifizierten Marker auf peripheren dendritischen Blutzellen in Gesamtblut zusammenfassen;
7 einen Vergleich der Zytokinexpression zwischen Monozyten (graue Säulen) und CD11c⁺-DCs (schwarze Säulen) in aktiviertem Gesamtblut zeigt, wobei 7A mit LPS + Brefeldin A stimulierte Zellen und 7B mit PMA + I + Brefeldin A stimulierte Zellen zeigt; und
8 Kinetiken von TNFα, IL-1β, IL-6 und CD80 in LPS aktivierten CD11c⁺-DCs zeigt. Der Zeitverlauf der LPS-Inkubation war 0 bis 8 Stunden. Intrazelluläre Zytokin- und CD80-Expression wird als die mittlere PE-Fluoreszenzintensität (MFI) gemessen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Um die hierin beschriebene Erfindung vollständig zu verstehen, wird die folgende detaillierte Beschreibung dargelegt. In der Beschreibung werden die folgenden Begriffe verwendet:
Mit "Gesamtblut" wird eine flüssige Blutprobe, wie sie von einem Säuger entnommen wird und danach im Wesentlichen nicht fraktioniert wird, gemeint. Dies heißt, falls nach der Blutentnahme Fraktionierung durchgeführt wird, dass die Fraktionierung den Prozentsatz dendritischer Zellen auf nicht mehr als ungefähr 5%, vorzugsweise auf nicht mehr als ungefähr als 1 bis 4%, am bevorzugtesten auf nicht mehr als 1% der gesamten kernhaltigen Zellen angehoben hat;
Der Begriff "Antikörper" schließt alle Produkte ein, abgeleitet oder ableitbar aus Antikörpern oder aus Antikörpergenen, die nützlich sind als Marker bei den hierin beschriebenen Durchfluss-Zytometrie-Verfahren. "Antikörper" schließt folglich unter anderem ein: natürliche Antikörper, Antikörperfragmente, Antikörperderivate; und genetisch bearbeitete Antikörper, Antikörperfragmente und Antikörperderivate;
Der Begriff "dendritische Zellen unterscheidender Antikörper" schließt jeden Antikörper ein, der verwendet werden kann, allein oder in Kombination mit anderen Antikörpern, um die Identifizierung dendritischer Zellen zu erleichtern, und schließt folglich Antikörper ein, die spezifisch sind für Epitope, die durch Nicht-DC-Linien abgebildet werden, und schließt weiter Antikörper ein, die an Strukturen binden, die durch DC abgebildet werden, die sich als nützlich für die positive Immunidentifizierung erwiesen haben;
Der Begriff "Linien negativ", auch abgekürzt "lin^–" bezeichnet das Fehlen von Zelloberflächenmarkern, von denen bekannt ist, dass sie charakteristisch für nichtdendritische lymphopoetische oder hämatopoetische Zelllinien sind. Mit "Fehlen" ist ein Maß der Oberflächenexpression gemeint, wie gemessen in einem Immuntest, wie z. B. einer Durchfluss-Zytometrie-Untersuchung, das nicht signifikant unterschiedlich ist von dem Hintergrund;
Ein "dendritischer Zellaktivator" ist jede Substanz, die fähig ist, die Expression von Zytokinen, Chemokinen oder nachweisbaren Zelloberflächenproteinen durch dendritische Zellen zu induzieren oder herauf zu regulieren;
Alle übrigen Begriffe haben ihre gewöhnliche Bedeutung in dem Stand der Technik der Durchfluss-Zytometrie, wie dargelegt unter anderem in Ormerod (Herausgeber), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997); Jaroszeski et al. (Herausgeber), Flow Cytometry Protocols, Methods in Molecular Biology, Nr. 91, Humana Press (1997); und Practical Flow Cytometry, 3. Auflage, Wiley-Liss (1995).
Dendritische Zellen (DC) fangen, verarbeiten und präsentieren Antigen an naive und T-Gedächtniszellen und spielen folglich eine Weichenrolle bei der Säugerimmunantwort. Ein Verstehen der DC-Funktion ist kritisch für jedes detaillierte Verstehen der Säugerimmunfunktion. Dennoch scheiterten funktionelle Studien dendritischer Zellen in der Vergangenheit an der funktionellen Diversität der Zellen, die gesammelt so bezeichnet werden.
Zum Beispiel wurden Untersuchungen dendritischer Zellen aus peripherem Blut für zwei Jahrzehnte durchgeführt, ohne Bewusstsein der Tatsache, dass dendritische Zellen aus peripherem Blut in zwei sich gegenseitig ausschließende Untergruppen fallen, die unterscheidbar sind durch den Zelloberflächenimmunophänotyp. Thomas et al., J. Immunol. 153: 4016 (1994); O'Doherty et al., Immunology 82: 487–493 (1994); Olweus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23): 12551–12556 (1997). Beide Untergruppen exprimieren hohe Spiegel an HLA-DR und es fehlen ihnen Marker, die charakteristisch sind für die anderen Linien (CD3, CD14, CD19, CD20, CD16, CD56). Die Untergruppen werden voneinander unterschieden durch ihre abweichende Exprimierung von CD11c und CD123: eine Untergruppe ist CD11c⁺CD123^niedrig die andere CD11c^–CD123⁺. O'Doherty et al., Immunology 82: 487–493 (1994); Olweus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23): 12551– 12556 (1997); Willmann et al., "Peripheral Blood Dendritic Cells Revealed by Flow Cytometry" (Becton-Dickinson Anwendungsbemerkung 3) (1998).
Von den beiden DC-Untergruppen aus peripherem Blut, die zuerst durch zufällige Zelloberflächenunterscheidungen identifiziert wurden, wurde nun gezeigt, dass sie funktionell unterschiedlich sind. Es ist bekannt z. B., dass die CD11c⁺CD123^niedrig-DC-Untergruppe sich als potenter erwies bei der Stimulierung von T-Zellen in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) als die CD11c^–CD123⁺-Untergruppe. Und wie hierin neu gezeigt wird, spricht die CD11c⁺-Untergruppe alleine auf DC-Aktivatoren mit einer Heraufregulation der Zytokinproduktion und gesteigerter Oberflächenexpression an T-Zellen co-stimulierenden Molekülen an.
Die beiden Jahrzehnte, die zwischen der ersten Identifizierung von DC und der ersten Demonstration, dass peripheres Blut immunophänotypisch und funktionell unterscheidbare DC-Untergruppen enthält, liegt, sprechen für das Unzulänglichkeit des vollständigen Oberflächenphänotypisierens, um die funktionelle Verschiedenheit dendritischer Zellen zu fassen.
Die vorliegende Erfindung erlaubt es, dendritische Zellen aus peripherem Blut zu beschreiben und zu unterscheiden, basierend auf Unterschieden in ihren funktionellen Antworten auf DC-Aktivatoren. Die Erfindung möglicht weiter, dass diese funktionellen Antworten gemessen werden mit minimalem experimentellen Eingriff, was die bekannte phänotypische Plastizität dendritischer Zellen daran hindert, die Ergebnisse zu vereiteln.
1 zeigt schematisch das Grundverfahren der vorliegenden Erfindung. Eine Gesamtblutprobe wird zuerst mit einem DC-Aktivator inkubiert, LPS wird beispielhaft in der Figur angeführt.
Die Inkubation mit dem dendritischen Zellaktivator dient dazu, die differenzielle phänotypische Antwort auf die verschiedenen DC-Untergruppen, die in der Probe anwesend sind, anzutreiben; die Messung dieser Unterschiede erlaubt die Unterscheidung von DC-Untergruppen, die sich anderweitig als nicht voneinander unterscheidbar herausgestellt haben könnten. Verschiedene Aktivatoren erzeugen unterschiedliche Antwortgruppen, wodurch ermöglicht wird, dass noch feinere Unterscheidungen gezogen werden können. Obwohl sowohl 1 als auch die hierin beschriebenen Experimente die Erfindung beispielhaft ausführen, unter Verwendung von DC-Aktivatoren mit breiten und pleiotropen Wirkungen, wie z. B. LPS, werden sich Aktivatoren mit einer genauern Spezifizität ebenfalls als nützlich herausstellen.
Von der Inkubation mit einem dendritischen Zellaktivator wird besonders gezeigt, dass er die Produktion zahlreicher Zytokine durch dendritische Zellen aus peripherem Blut herauf reguliert, welche bei fehlender Stimulierung keine nachweisbaren Zytokine produzieren. Durch das Durchführen des Aktivierungsschrittes in der Anwesenheit von Brefeldin A ("BFA"), was den Golgi-Komplex zerlegt (Openshaw et al., J. Exp. Med. 182: 1357 (1995); Chardin und McCormick, Cell 97: 153 (1999)), wobei der Proteintransport durch den zellulären Sekretionsweg gehemmt wird, akkumulieren Zytokinproteine in den Zellen und können durchfluss-zytometrisch in einem späteren Schritt des Tests nachgewiesen werden. Ähnliche Ergebnisse würden gewonnen werden unter Verwendung von äquivalenten Inhibitoren der Sekretion, wie z. B. Monensin.
Nach der Inkubation in der Anwesenheit von Aktivator und BFA wird die Oberfläche der Zellen mit fluorophor-konjugierten Antikörpern gefärbt.
Dieser Oberflächenfärbungsschritt schließt als eine erste Antikörperklasse eine Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidende Antikörper ein. Ein dendritische Zellen unterscheidender Antikörper ist jeder Antikörper, der verwendet werden kann, alleine oder in Kombination mit anderen Antikörpern, um die Identifizierung dendritischer Zellen zu erleichtern. Folglich können die in diesem Schritt verwendeten Antikörper, (1) Antikörper einschließen, die bevorzugt nicht-dendritische Zellen binden, und (2) Antikörper einschließen, die dendritische Zelloberflächenstrukturen binden, die nützlich sind bei der Identifizierung von DC.
In Bezug auf die erste solche Kategorie kann ein Cocktail an linienspezifischen Antikörpern, markiert mit dem identischen Fluorophor, vorteilhafterweise verwendet werden. Ein solcher im Handel erhältlicher Cocktail ist der lin 1-FITC-Linien-Cocktail von Becton Dickinson Immunocytometry Systems (BDIS, San Jose, CA, Katalog-Nr. 340546), der eine Mischung aus Antikörpern, spezifisch für CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 und CD56, enthält, jeder mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) konjugiert. In Kombination färben die Antikörper in dem Cocktail Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und Neutrophile, jedoch nicht dendritische Zellen. Die DCs in der markierten Probe teilen sich deswegen auf in die FITC^–- oder die FITC^niedrig-Klasse. Der lin 1-Cocktail ist besonders vorteilhaft, dadurch, dass die Konzentration an Antikörpern und der Grad der Konjugation titriert wurde, um Fluoreszenzsignale mit äquivalenter Intensität von den Zellen der verschiedenen Nicht-DC-Linien bereitzustellen. die durch die Antikörper gebunden werden.
In Bezug auf die zweite Kategorie an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern gibt es bis jetzt keinen Zelloberflächenmarker, der alleine dendritische Zellen positiv identifiziert. Wenn eine solche DC-spezifische Oberflächenstruktur identifiziert wird, kann ein Antikörper dafür allein bei diesem Stadium des Protokolls verwendet werden. Derzeit macht jedoch die Verwendung von Antikörpern bei der zweiten Kategorie DC-unterscheidender Antikörper – Antikörper, die positiv an dendritische Zelloberflächenstrukturen binden – die zusätzliche Verwendung von DC-unterscheidenden Antikörpern der ersten Kategorie, das heißt jene, die nicht-dendritische Linien identifizieren, notwendig.
Umgekehrt können Antikörper der ersten Kategorie DC-unterscheidender Antikörper – jene, die vorzugsweise nicht-dendritische Zellen binden – derzeit nicht verwendet werden, ohne wenigstens einen Antikörper der zweiten Kategorie. Basophile sind lin^–CD123^hochCD11c⁺, aber HLA-DR^–; wenn Antikörper, die vorzugsweise nichtdendritische Zellen (Kategorie 1) binden, in diesem Test verwendet werden, muss auch ein Anti-HLA-DR-Antikörper verwendet werden.
Falls dendritische Zellen unterscheidende Antikörper sowohl der ersten als auch der zweiten Kategorie verwendet werden, werden die Antikörper in den beiden Kategorien vorzugsweise mit Fluorophoren markiert, die durchfluss-zytometrisch unterscheidbar sind.
Der Oberflächenfärbeschritt kann wahlweise auch, als eine zweite breite Klasse, Antikörper einschließen, die bekannte dendritische Zelluntergruppen unterscheiden. Folglich erweisen sich Antikörper, spezifisch für CD11c oder CD123 als besonders nützlich, da diese Antigene dafür bekannt sind, dass sie periphere Blut-DC-Untergruppen gegenseitig exklusiv definieren. Der verwendete Fluorophor sollte durchfluss-zytometrisch unterscheidbar sein. Folglich würde, wo Antikörper, die später bei der Untersuchung für intrazelluläres Färben verwendet werden, mit Phycoerythrin (PE) markiert sind, ein typisches Oberflächenfärbeschema z. B. lin 1 FITC, HLA-DR PerCP und CD11c APC einschließen (bei dieser Nomenklatur ist der Antikörper durch seine Spezifizität identifiziert, gefolgt von dem Fluorophor).
Nach dem Oberflächenfärben werden die roten Zellen in der Probe lysiert und die kernhaltigen Zellen werden dann permeabilisiert. Diese beiden Schritte können unter Verwendung von im Handel erhältlichen Reagenzien, wie z. B. FACS^® Permeabilizing Solution und FACS^® Lysing Solution (BDIS Katalog-Nrn. 340457 bzw. 349202), durchgeführt werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Nach der Permeabilisierung werden die Zellen intrazellulär gefärbt unter Verwendung fluorophor-konjugierter Antikörper, die für Zytokine spezifisch sind. Der mit den zytokinspezifischen Antikörpern konjugierte Fluorophor ist bevorzugt in einer Durchfluss-Zytometrie-Untersuchung unterscheidbar von irgendeinem jener Fluorophore, die für Oberflächenfärbung verwendet werden.
Nach dem intrazellulären Färben werden die Zellen gewaschen und dann unter Verwendung eines Durchfluss-Zytometers analysiert, vorzugsweise einem, der zur gleichzeitigen Exzitation und Detektion multipler Fluorophore in der Lage ist.
1 schematisiert nicht den Test für den Nachweis von Änderungen in der Oberflächenexpression dendritischer Zellaktivierungsmarker, welcher sich in gewisser Hinsicht von jenem unterscheidet, der verwendet wird, Änderungen in der Zytokinexpression nachzuweisen.
In solch einer Untersuchung wird die Aktivierung dendritischer Zellen in Gesamtblut in der Abwesenheit von Sekretionsinhibitor, wie z. B. Brefeldin A, durchgeführt. Dies schließt die gleichzeitige Messung der intrazellulären Zytokinexpression in irgendeiner solchen Probe aus.
Nach der Inkubation in der Anwesenheit von Aktivator wird die Oberfläche der Zellen mit fluorophor-konjugierten Antikörpern gefärbt. In diesem Schritt wird eine Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern verwendet, wahlweise mit Antikörpern, die bekannte dendritische Zelluntergruppen unterscheiden, wie oben beschrieben.
Zusätzlich wird jedoch eine dritte Klasse an Oberflächen färbenden Antikörpern verwendet. Dies sind Antikörper, die Oberflächenstrukturen erkennen, typischerweise Proteine, deren Expression durch die vorausgehende Inkubation mit dendritischem Zellaktivator verändert wird. Zum Beispiel ist von der Aktivierung dendritischer Zellen aus peripherem Blut bekannt, dass sie die Heraufregulierung der T-Zell-co-stimulierenden Moleküle CD80 (B7.1), CD86 (B7.2) und HLA-DQ bewirken. Olweus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12551–12556 (1997). Folglich kann der Schritt des Oberflächenfärbens, falls gewünscht, Antikörper, spezifisch für eines oder mehrere dieser Antigene, einschließen. Kürzliche Berichte identifizieren CD83 und CMRF-44 als Zelloberflächenmarker, die in hohen Spiegeln auf aktivierten oder kultivierten DCs von Blut und Lymphoidgewebe exprimieren; Antikörper, spezifisch für diese Marker, können auch vorteilhaft verwendet werden. Antikörper dieser Klasse sind, falls sie verwendet werden, typischerweise mit einem Fluorophor verbunden, der durchfluss-zytometrisch unterscheidbar ist von den oben beschriebenen Antikörpern. Folglich würde ein typisches Oberflächenfärbeschema z. B. lin 1 FITC, HLA-DR PerCP, CD11c APC und einen Antikörper, spezifisch für ein DC-Oberflächenaktivierungsantigen, markiert mit PE, einschließen.
Nach dem Oberflächenfärben werden die roten Zellen in der Probe lysiert und die Zellen werden gewaschen und dann unter Verwendung eines Durchfluss-Zytometrie-Gerätes analysiert, vorzugsweise einem, das zur gleichzeitigen Exzitation und Detektion multipler Fluorophore in der Lage ist.
Wie weiter in den experimentellen Beispielen hierin unten und in den 2 bis 8 ausgearbeitet, werden Gesamtblutproben von normalen Freiwilligen untersucht auf ihre dendritische Zellfunktion. Zubereitungen werden aktiviert mit entweder Lipopolysaccharid ("LPS"), Phorbol-12-Myristat-13-Acetat ("PMA"), mit Ionomycin ("I") (gemeinsam "PMA + I") oder CD40-Quervernetzung, jeweils für 4 Stunden bei 37°C. Substanzen, die als Aktivatoren versucht werden, die keine Zytokinproduktion auslösen – PHA, CD2/2R (BDIS Katalog-Nr. 340366), SEB (Staph. Enterotoxin B), CMV und Quervernetzung von CD49d – sind nicht berichtet. CD40-Quervernetzung bewirkte Änderungen in der Oberflächenantigenexpression, schlug jedoch fehl, Zytokinproduktion auszulösen. Tabelle 1 listet die Zytokine auf, die untersucht wurden in einem oder mehreren der Experimente, weiterhin klassifiziert gemäß dem DC-Aktivator, der in dem Experiment verwendet wurde. Ein Plus ("+") zeigt an, dass die Expression des jeweiligen Zytokins in einem oder mehreren Experimenten beurteilt wurde; ein Minus ("–") zeigt an, dass die Expression des jeweiligen Zytokins nicht untersucht worden war. Tabelle 1 berichtet nicht den Expressionsspiegel, der in Tabelle 2 folgt.
Tabelle 2 zeigt die funktionellen Antworten der CD11c⁺- und CD11c^–-Untergruppen dendritischer Zellen, stimuliert entweder mit LPS oder PMA + I und in Gesamtblut untersucht. Die Zytokinexpression wird als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI); die Änderung in der Oberflächenmolekülexpression wird als ein Verhältnis mittlerer Fluoreszenzintensitäten (MFI) aktivierter Proben gegen Kontrollproben gemessen.
Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten ziemlich überraschend, dass die CD11c^–CD123⁺-Untergruppe es nicht vermochte, irgendeine der untersuchten Zytokine zu produzieren, unabhängig davon, welcher DC-Aktivator verwendet wurde. Wenn sie auf Änderungen in der Oberflächenantigenexpression untersucht wurde, zeigte diese Untergruppe eine klare Heraufregulierung der CD25-Expression auf die PMA + I-Aktivierung; die Heraufregulierung von CD25 war die einzige unterscheidbare Antwort, die in CD11c^–CD123⁺-DCs von allen untersuchten Reizen beobachtet worden war.
In starkem Gegensatz dazu zeigten die CD11c⁺CD123^niedrig-DCs leicht messbare Änderungen in der Zytokinexpression, wenn sie mit LPS oder PMA + I stimuliert worden waren.
Mit der LPS-Stimulation produzierten CD11c⁺-Zellen hohe Spiegel an TNFα und IL-1β, geringere Spiegel an IL-6, IL-1RA und IL-8 und in Spuren IL-12 und IL-1a. Die Antwort auf LPS ist überraschend: die CD11c⁺CD123^niedrig-DCs sind CD14^–, und CD14 ist der Haupt-LPS-Rezeptor. Es scheint wahrscheinlich, dass LPS zusätzlich durch einen zweiten Rezeptor wirkt, vielleicht CD11c selber. In Übereinstimmung mit jener Hypothese vermochten die CD11c^–-CDs, denen sowohl CD14 als auch CD11c fehlt, es nicht, auf die LPS-Stimulation mit erhöhter intrazellulärer Zytokinexpression zu antworten. Weiterhin übereinstimmend mit dieser Hypothese, sprachen die CD14⁺CD11c⁺-Monozyten auf die LPS-Stimulation wesentlich stärker an, als es die CD14^–CD11c⁺-DCs tun (7A), ohne eine signifikant erhöhte Antwort auf PMA + I zu zeigen (7B).
8 zeigt weiterhin die Kinetiken der Antwort von CD11c⁺-DCs auf LPS. TNFα wird zuerst produziert, gefolgt von IL-1β und IL-6. CD80 wird stark herauf reguliert nach ungefähr 4 Stunden Aktivierung.
Auf die PMA + I-Aktivierung produzierten CD11c⁺-Zellen IL-8 und IL-1β, niedrige jedoch signifikante Spiegel an IL-1RA und TNFα, Spurenmengen von IL-1α, und IL-6 war nicht nachweisbar.
Folglich wurden Unterschiede in den Zytokinantworten der CD11c⁺-DC-Untergruppe auf zahlreiche Aktivatoren leicht beobachtet. Hervortretend bei diesen Unterschieden ist die Expression von einzig IL-6, wenn mit LPS stimuliert wurde, und die geänderte relative Expression von IL-8 und TNFα.
Die Aktivierung von CD11c⁺-DCs in Gesamtblut führte auch zu einer erhöhten Expression von begleitenden Molekülen. Die LPS-Aktivierung löste die Heraufregulierung von CD25, CD40, CD80, CD86, HLA-DR und HLA-DQ aus. Die T-Zellen co-stimulierenden Moleküle, insbesondere CD80, ergaben das stärkste Signal. PMA + I führte zu einer Heraufregulation von CD86, CD80, HLA-DQ und HLA-DR. Ein minimaler Anstieg von CD25 und CD40 wurde beobachtet.
Aktivierung über ein Quervernetzen von CD40 resultierte in erhöhten Spiegeln von CD86, CD80 und einer minimalen Heraufregulation von HLA-DR.
Diese Daten, wie sie weiter im Detail in den experimentellen Beispielen, die folgen, ausgeführt werden, zeigen, dass periphere Blut-DC-Untergruppen leicht unterschieden werden können in Gesamtblut durch ihre differenzielle Produktion von Zytokinen und/oder Zelloberflächenproteinen in Antwort auf DC-Aktivatoren.
Weiterhin, da die dendritischen Zellen, von denen beobachtet wurde, dass sie auf DC-Aktivatoren ansprechen, in eine Untergruppe fallen (CD11c⁺), von der bekannt ist, dass sie potenter ist bei der T-Zell-Aktivierung, als die Untergruppe (CD11c^–), die keine solche Antwort zeigt, zeigen die Daten ferner, dass die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung gemessenen Parameter – Zytokinproduktion und Heraufregulation von Oberflächenaktivierungsantigenen – direkt in Beziehung stehen mit der DC-Funktion.
Die Leichtigkeit, mit der die vorliegende Erfindung die Messung der DC-Funktion in Gesamtblut ermöglicht, ohne vorhergehende DC-Aufreinigung, war unerwartet, da die geringe Häufigkeit von DCs im Blut, gekoppelt mit der Tendenz aktivierter DCs, an Ausrüstung anzuhaften, früher nahelegte, dass zu wenige Ereignisse in einer Blutprobe einer klinisch relevanten Größe untersucht werden könnten.
Die Fähigkeit, DC-Funktionen in Gesamtblut zu messen, ohne vorausgehende DC-Aufreinigung, bietet signifikante Vorteile.
Von einem Verfahrensstandpunkt aus betrachtet, eliminieren die Verfahren der vorliegenden Erfindung den Zellverlust, der mit allen DC-Aufreinigungsschemata verbunden ist, wodurch die Empfindlichkeit erhöht und eine mögliche systematische Verzerrung reduziert wird. Weiterhin reduziert die minimale Störung, wie sie durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung bewirkt wird, die Möglichkeit phänotypischer Änderungen, die von einem experimentellen Eingriff resultieren. Und als eine Durchfluss-Zytometrie-Untersuchung ermöglichen die Verfahren der vorliegenden Erfindung, dass die DC-Funktion auf einer Zelle-für-Zelle-Basis bestimmt wird, an Stelle auf einer Massenbasis, was eine feine Unterscheidung erlaubt.
Vom Standpunkt der Daten, die durch diese Erfindung neu zugänglich gemacht werden, aus betrachtet, erlauben die Verfahren der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal die leichte und schnelle Bestimmung der DC-Funktion in Gesamtblut.
Wenn sie auf menschliche Patienten angewendet werden, erlauben die Verfahren der vorliegenden Erfindung folglich, dass die Messung der DC-Funktion zu der bestehenden Liste immunfunktioneller Assays hinzugefügt wird, und sie werden in klinischen Situationen Anwendung finden, in welchen solche existierenden Immunfunktionsuntersuchungen derzeit verwendet werden. Zum Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet werden, allein oder im Zusammenhang mit der quantitativen durchfluss-zytometrischen Bestimmung von CD4⁺-T-Lymphozytenspiegeln bei der klinischen Stadieneinteilung des Fortschreitens von AIDS. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, alleine oder im Zusammenhang mit bestehenden Untersuchungen, bei der Bestimmung der Immunfunktion in vererblichen, anstelle von erworbenen, Immunschwächesyndromen und bei der Bestimmung der Immunkompetenz nach therapeutischer Immunosuppression oder Immunablation. Am anderen Ende des klinischen Spektrums werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch vorteilhaft Verwendung finden, alleine oder gemeinsam mit bestehenden Untersuchungen, bei der klinischen Bestimmung verschiedener Formen von Immunüberempfindlichkeit, Allergien oder bei der klinischen Bestimmung von Autoimmunerkrankungen, wie z. B. multiple Sklerose, Rheumatoidarthritis, Sarkoidose oder Ähnlichen.
Durch Ermöglichen des Studiums der DC-Funktion in Gesamtblut erlauben die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch die leichte Bestimmung der Wirkungen, die im Blut zirkulierende Mittel auf die DC-Funktion haben könnten. Insbesondere erlaubt die Untersuchung die Bestimmung der spezifischen Wirkungen pharmazeutischer Mittel auf die DC-Funktion, die entweder absichtlich oder zufällig die DC-Funktion angreifen.
Folglich, wenn sie angewendet werden auf Messungen der DC-Funktion in experimentellen Säugern, ob gekreuzt, aus Inzucht oder transgen, ermöglichen es die Verfahren der vorliegenden Erfindung, dass pharmazeutische Mittel auf ihre in vivo-Wirkungen auf die DC-Funktion untersucht werden, wodurch die Selektion von Mitteln ermöglicht wird, die wünschenswerterweise immunmodulierende Wirkungen zeigen, oder wodurch die Selektion von Mitteln ermöglicht wird, denen spezifisch solche Wirkungen fehlen.
Wenn sie bei menschlichen Patienten angewendet werden, erlauben die Verfahren der vorliegenden Erfindung die leichte Bestimmung absichtlicher oder zufälliger Wirkungen von Arzneimitteln auf die DC-Funktion, die in dem Blut des Patienten zirkulieren, als eine Ergänzung zu bestehenden Immunfunktionsuntersuchungen. Zum Beispiel können die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um bei der Überwachung und Einstellung immunsupprimierender Mittel zu unterstützen. Die Verfahren erwiesen sich als besonders nützlich bei der Überwachung und Einstellung von immunsupprimierenden Mitteln, die die Funktion von Zytokinen, Chemokinen oder Wachstumsfaktoren aufheben, herabmodulieren oder anderweitig in diese eingreifen. Umgekehrt erwiesen sich die Verfahren der vorliegenden Erfindung auch als besonders nützlich bei der Überwachung der Wirkungen einer bestätigenden Zytokintherapie, wie z. B. Therapien, die die Applikation von Interferonen bei der Behandlung von multipler Sklerose, die Applikation von Wachstumsfaktoren nach der Myeloablation oder Ähnliches einbeziehen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um immunmodulierende Nebenwirkungen von Mitteln zu beobachten, die gegeben werden, um damit nicht in Beziehung stehende klinische Ziele zu bewirken.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind besonders gut angepasst an die experimentelle und klinische Bestimmung von Therapien, die DC-Zellen selber involvieren. Folglich finden die Verfahren der vorliegenden Erfindung bei der Gestaltung, Festlegung und beim Überwachen von Therapien Anwendung, bei denen autologe dendritische Zellen nach der in vitro-Manipulation verabreicht werden, von Therapien, bei denen dendritische Zellen zum Ziel genommen werden für die Ablation, entweder in vitro, um die Transplantation zu erleichtern, oder in vivo, um Immunsuppression oder Induktion von Toleranz zu bewirken, oder von Therapien, bei denen dendritische Zellen zum Ziel genommen werden, um die allgemeine oder spezifische Immunfunktion zu erhöhen.
Es wird verstanden werden, dass die dendritischen Zellen, die zirkulierend in dem peripheren Blut gefunden werden, in dem Moment, in dem Blut entnommen wird – jene, die in den Verfahren der vorliegenden Erfindung untersucht werden -, aus einem Zeitfenster in der Reifung einer oder mehrerer Zelllinien entnommen werden. Dies bedeutet für jede einzelne Linie, dass Zellen vorwiegend während bestimmten Phasen in dem Reifungsvorgang zirkulieren. Nichts ist hier in den Verfahren der vorliegenden Erfindung jedoch begrenzt auf bestimmte Phasen der DC-Reifung. Folglich können die Verfahren entsprechend angewendet werden auf CD34⁺-gebundene DC-Vorläufer, die spontan zirkulieren, oder auf CD34⁺-Vorläufer, die durch pharmakologischen Eingriff oder Ähnliches mobilisiert werden.
Die Erfindung kann besser verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die angeboten werden im Wege der Erläuterung und nicht im Wege der Beschränkung.
BEISPIEL 1
Materialien
Soweit nicht anderweitig spezifiziert, wurden die folgenden Reagenzien in den hierin vorgestellten Experimenten verwendet. Für die Annehmlichkeit werden Antikörper durch ihre Spezifitäten und das konjugierte Fluorophor identifiziert. Fluorophore sind Phycoerythrin (PE), Peridininchlorophyllprotein (PerCP), Allophycocyanin (APC), Fluorsceinisothiocyanat (FITC). Folglich wird ein Antikörper, markiert mit Phycoerythrin (PE), der spezifisch ist für TNFα, bezeichnet als "TNFα PE".
Antikörper
Die folgenden Antikörper wurden erhalten von Becton-Dickinson Immunocytometry Systems (BDIS, San Jose, CA): TNFα PE; I1-1α PE; IL-1RA PE; IL-1β PE; I1-2 PE; IL4 PE; IL-6 PE; IL-8 PE; IL-13 PE; IFN-γ PE; CD11c APC (5 μl/Test) (0,125 μg/Test); HLA-DR PerCP (10 μl/Test) (0,125 μg/Test); lin 1 FITC (Forschungscharge KW98/07 1.1) (20 μl/Test); CD40 PE (unkonjugierter mAb, erhalten von DNAX Research Institute, Palo Alto, CA; auf Bestellung konjugiert an PE bei BDIS, BDIS Forschungskonjugat PC#931) (10 μl/Test) (0,125 μg/Test); CD80 PE (20 μl/Test); CD25 PE (20 μl/Test); HLA-DQ PE (unkonjugierter mAb, erhalten von BDIS; auf Bestellung konjugiert an PE bei BDIS, BDIS Forschungskonjugat PC#1284) (0,5 μg/Test); IgG2a PE (Katalog-Nr. 340459, 25 μg/ml); IgG1 PE (Katalog-Nr. 340013, 50 μg/ml). CD83 PE (BDIS Forschungskonjugat, PC#1520; 50 μg/ml, verwendet in einer Konzentration von 20 μl pro 300 μl Gesamtblut), ist auch im Handel erhältlich von PharMingen (Katalog-Nr. 36935X).
Der lin 1-FITC-Linien-Cocktail ist auch im Handel erhältlich (BDIS, Katalog-Nr. 340546) und enthält eine titrierte Mischung von Antikörpern, spezifisch für CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 und CD56, alle markiert mit FITC. In Kombination färben die Antikörper Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile und Neutrophile.
Die folgenden Antikörper wurden von PharMingen (San Diego, CA) erhalten: IL-10 PE (IgG2a) (0,1 μg/Test); IL-12 PE (IgG1) (0,1 μg/Test); CD86 PE (Klon IT2.2; Katalog #33435X, IgG2b) (10 μl/Test).
Lysierende und permeabilisierende Mittel
FACS^® Permeabilizing Solution und FACS^® Lysing Solution wurden als 10-fache Stammlösungen von BDIS erhalten (Katalog-Nrn. 340457 bzw. 349202) und wurden verdünnt und in Übereinstimmung mit der Packungsbeilage verwendet.
Dendritische Zellaktivatoren
Chemische Aktivatoren wurden erhalten von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. Lipopolysaccharid ("LPS") (Sigma Katalog-Nr. L2654) wurde mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml in DMSO erzeugt und bei –20°C gelagert. Ionomycin ("I") (Katalog-Nr. I-0634) wurde mit einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Ethanol erzeugt und bei –20°C gelagert. Phorbol-12-Myristat-13-Acetat ("PMA") (Katalog-Nr. P-8139) wurde mit einer Konzentration von 0,1 mg/ml in DMSO erzeugt und bei –20°C gelagert.
CD40-Quervernetzung wurde durchgeführt unter Verwendung von Polystyrolkugeln (0,84 μm, Baxter), überzogen mit CD40-Antikörper (PharMingen, San Diego).
Sekretionsinhibitor
Brefeldin A ("BFA") (Katalog-Nr. B-7651) wurde mit einer Konzentration von 5 mg/ml in DMSO erzeugt und bei –20°C gelagert.
Waschpuffer
Waschpuffer bestand aus phosphatgepufferter Salzlösung ("DPBS") (erhalten als eine 10-fache Stammlösung von GibCoBRL (Grand Island, NY), dann verdünnt mit entmineralisiertem Wasser auf 1X), enthaltend 0,5% fötales Kälberserum (Sigma, St. Louis, MO) (fötales Kälberserum wurde hinzugefügt nach der Verdünnung der 10X PBS-Stammlösung auf 1X).
BEISPIEL 2
Protokolle für eine Gesamtblut-Durchfluss-Zytometrie-Untersuchung der Immunfunktion dendritischer Zellen
Wenn nicht anderweitig spezifiziert, wurden die folgenden Protokolle bei den hierin vorgestellten Experimenten verwendet.
Dendritische Zellaktivierung
Venöses Blut normaler Spender wurde gesammelt in Natriumheparin-VACUTAINER^®-Röhrchen. Für die Aktivierung mit LPS wurde das Blut mit 1 μg/ml LPS stimuliert. Für die Aktivierung mit PMA + I wurde das Gesamtblut zuerst 1 : 1 mit RPMI-Medium (Biowhittaker, Watersville, MD) verdünnt. PMA wurden dann auf eine Konzentration von 5 mg/ml und Ionomycin auf eine Konzentration von 1 μg/ml hinzugefügt. Für die Aktivierung durch CD40-Quervernetzung wurden 50 μl mit CD40 überzogene Polystyrolkugeln zu 1 ml Gesamtblut hinzugefügt. Alle Proben wurden für 4 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert.
Für den Nachweis intrazellulärer Zytokine wurde die Aktivierung wie oben durchgeführt in der zusätzlichen Anwesenheit von Brefeldin A (BFA) in einer Konzentration von 10 μg/ml. Kontroll-(ruhende)-Aliquoten wurden mit BFA alleine inkubiert.
Für den Nachweis von Änderungen in der Oberflächenantigenexpression wurden Proben mit DC-Aktivator wie oben inkubiert, ohne die weitere Zugabe von BFA. Kontroll-(Ruhe)-Aliquoten wurden mit weder BFA noch Aktivator inkubiert.
Immunfluoreszenzfärbung von intrazellulären Zytokinen
Vor dem Färben wurden mit PMA + I behandelte Blutproben auf das halbe Volumen durch Zentrifugation und Entfernen des Überstandes reduziert.
Die Zellzubereitung wurde bei Raumtemperatur (RT) gemacht und sämtliche Inkubationsschritte wurden im Dunkeln durchgeführt.
Für das Färben wurde 1 ml Probe (aktivierte Probe oder ruhende Blutkontrolle) zu einem Cocktail aus dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern (20 μl Liniencocktail 1-FITC, 10 μl HLA-DR PerCP, 5 μl CD11c APC; Reagenzienvolumina pro 50 μl Blut) in einem 50 ml-Polypropylenzentrifugenröhrchen hinzugefügt. Das Blut wurde in der Anwesenheit der fluorophor-konjugierten Antikörper für 15 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden 40 ml FACS^® Lysing Solution hinzugefügt und das Röhrchen wurde für weitere 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann gesammelt durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 500 × g und das Pellet wurde sanft für die weitere Verarbeitung aufgebrochen. Als Nächstes wurden 10 ml FACS^® Permeabilizing Solution hinzugefügt und die Zellen wurden für 10 Minuten inkubiert. Die Permeabilisierungsreaktion wurde gestoppt durch die Zugabe von 40 ml Puffer (DPBS 1X, 0,5% fötales Kälberserum). Die permeabilisierten Zellen wurden für 10 Minuten bei 500 × g pelletiert und in dem Überstand resuspendiert, der in dem Röhrchen nach dem Dekantieren verblieben war (ungefähres Volumen 500 μl).
Eine Aliquote aus 50 μl der extrazellulär gefärbten, lysierten und permeabilisierten Zellen (ausreichend für einen Test) zu einem Polypropylenfärberöhrchen hinzugefügt und für 30 Minuten in der Anwesenheit des zytokin-spezifischen mAb (siehe Materialien oben) inkubiert. Die Proben wurden dann mit Puffer gewaschen, in 250 μl Puffer resuspendiert und durchfluss-zytometrischer Datenerfassung ausgesetzt, sobald danach wie möglich. Falls die durchfluss-zytometrische Datenerfassung verschoben wurde, wurden die Proben bei 4°C bis zu einer Stunde aufbewahrt.
In Abhängigkeit von der Ausbeute, ergab eine 1 ml Probe an Gesamtblut ungefähr 7 bis 12 Untersuchungen für die Zytokinexpressionsbestimmung.
Immunofluoreszenzfärbung von Oberflächenantigenen
Vor dem Färben wurden PMA + I-behandelte Blutproben auf das halbe Volumen durch Zentrifugation und Entfernen des Überstandes reduziert.
Die Zellpräparation wurde bei Raumtemperatur (RT) gemacht und alle Inkubationsschritte wurden im Dunkeln durchgeführt.
Für das Färben wurden 150 μl Probe (aktivierte Probe oder ruhende Blutkontrolle) zu einem Cocktail aus monoklonalen Antikörpern in einem Färberöhrchen zugefügt. Der Cocktail schloss eine Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern (20 μl lin 1-FITC-Cocktail, 10 μl HLA-DR PerCP, 5 μl CD11c APC; Reagenzienvolumina pro 100 μl Blut) und einen der folgenden PE-konjugierten Antikörper, spezifisch für DC-Oberflächenaktivierungsantigene (20 μl CD25 PE, 0,125 μg CD40 PE, 20 μl CD80 PE, 10 μl CD86 PE, 0,5 μg HLA-DQ PE) ein. Blut und mAbs wurden für 15 Minuten bei RT im Dunkeln inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 3 ml FACS^® Lysing Solution hinzugefügt und das Röhrchen wurde für 10 Minuten bei RT inkubiert. Die lysierten Zellen wurden für 5 Minuten bei 500 × g zentrifugiert und anschließend mit 3 ml Puffer (DPBS 1X, 0,5% fötales Kälberserum) gewaschen. Das Zellpellet wurde in 250 μl Puffer resuspendiert und sofort in einem Durchfluss-Zytometer erfasst. Falls die Datenerfassung verschoben wurde, wurden die Zellen bei 4°C bis zu einer Stunde aufbewahrt.
Durchfluss-Zytometrie-Analyse
Die Proben, wie oben beschrieben, wurden auf einem FACSCalibur^TM-Duallaser-Durchfluss-Zytometer (BDIS, San Jose, CA) erfasst. Das Instrument war eingerichtet unter Verwendung automatisierter FACSComp^TM 4.0 Software und 4-Farb-Calibrite^TM-Perlen (BDIS, San Jose, CA). Ereignisse wurden auf einer FSC-Schwelle erfasst. Um die Größe der Datendateien im Listenmodus zu reduzieren, verwendete die Erfassung ein Livegate auf HLA-DR-positive Ereignisse in einer lin 1 FITC/HLA-DR PerCP-Zwei-Parameter-Verteilung.
BEISPIEL 3
Detektion der CD11c⁺-DC-Zytokinantwort in Gesamtblut
Gesamtblutproben wurden von gesunden Freiwilligen entnommen und mit entweder LPS oder PMA + I aktiviert, beides in der Anwesenheit von Brefeldin A, gemäß den Vorgängen, beschrieben in den Beispielen 1 und 2. Die Ergebnisse sind jeweils gezeigt in den 2 und 3.
Die 2A–2C zeigen die immunophänotypischen Oberflächencharakteristika von DCs aus peripherem Blut von einer einzelnen LPS-aktivierten Gesamtprobe. CD11c⁺-dendritische Zellen sind grün gefärbt, CD11c^–-DCs sind rot gefärbt und nicht-dendritische Zellen erscheinen grau. Die Farben sind zufällig gewählt für Zwecke der Verdeutlichung und tragen keine Beziehung zu den für die Analyse verwendeten Fluorophoren. 2A zeigt, dass beide dendritischen Zelluntergruppen lin 1 FITC^dunkel und HLA-DR^hell sind, in Übereinstimmung mit O'Doherty et al., Immunology 82: 487–493 (1994); Olweus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(23): 12551–12556 (1997), wobei 2B weiterhin zeigt, dass die beiden Untergruppen ähnliche Seitenstreuungs- und Vorwärtsstreuungseigenschaften haben. 2C zeigt die Unterscheidung der beiden Untergruppen, basierend auf unterschiedlichen Niveaus der CD11c^–Expression.
Die 2D–2J zeigen das Ergebnis von Untersuchungen für die Expression von IL-1RA (2D), TNFα (2E), IL-6 (2F), IL-8 (2G), IL-12 (2H), IL-1a (2I). 2J zeigt Ergebnisse unter Verwendung eines PE-konjugierten negativen Kontroll-Antikörpers mit angepasstem Isotyp.
Die 2D–2J zeigen, dass die CD11c^–(CD123⁺)-Untergruppe (rot) nicht ansprechend auf die LPS-Stimulation ist, zumindest wie belegt durch das Fehlen nachweisbarer Zytokinproduktion. Obwohl nicht direkt in diesen Figuren gezeigt, sind die Zytokinspiegel, die in den LPS-aktivierten CD11c^–-DCs gemessen wurden, nicht unterscheidbar von jenen, die in der Abwesenheit des Aktivators erzeugt wurden; wie gezeigt in 4, produziert weder die CD11c^–- noch die CD11c⁺-Untergruppe nachweisbare Spiegel von Zytokin bei Fehlen von DC-Aktivatoren.
Im Gegensatz dazu zeigt die CD11c⁺-Population ein viel höheres Maß der Zytokinproduktion mit hohen Spiegeln an TNFα und IL-1β, niedrigen Spiegeln an IL-6, IL-1RA und IL-8 und mit Spuren von IL-12 und IL-1a.
Die 3A bis 3C zeigen die immunophänotypischen Oberflächeneigenschaften von DCs aus peripherem Blut aus einer einzelnen Gesamtblutprobe, aktiviert mit PMA + I. CD11c⁺-dendritische Zellen sind grün gefärbt, CD11c^–-DCs sind rot gefärbt und nicht-dendritische Zellen erscheinen grau. Die Farben sind zufällig gewählt für Zwecke der Verdeutlichung und tragen keine Beziehung zu den für die Analyse verwendeten Fluorophoren.
3A zeigt, dass beide dendritische Zelluntergruppen lin 1 FITC^dunkel und HLA-DR^hell sind, wobei die 3B weiter zeigt, dass die beiden Untergruppen ähnliche Seitenstreuungs- und Vorwärtsstreuungseigenschaften haben. 3C zeigt die Unterscheidung der beiden Untergruppe, basierend auf unterschiedlichen Ausmaßen der CD11c-Expression.
Die 3D–3I zeigen das Ergebnis von Untersuchungen für die Expression von TNFα (3D), IL-1α (3E), IL-1β (3F), IL-1RA (3G) und IL-8 (3H). Die 3I zeigt Ergebnisse unter Verwendung eines PE-konjugierten negativen Kontroll-Antikörpers mit angepasstem Isotyp.
Die 3D–3I zeigen, dass die CD11c^–(CD123⁺)-Untergruppe (rot) nicht ansprechend ist auf die PMA + I-Stimulation, zumindest wie belegt durch das Fehlen einer nachweisbaren Zytokinproduktion. Obwohl es nicht direkt in diesen Figuren gezeigt ist, sind die Zytokinspiegel, die in LPS-aktivierten CD11c^–-DCs gemessen wurden, nicht unterscheidbar von jenen, die in Abwesenheit des Aktivators produziert wurden (vgl. 4).
Im Gegensatz dazu zeigt die CD11c⁺-Population ein viel höheres Maß der Zytokinproduktion, mit einer nachweisbaren Produktion von IL-1β, IL-1RA, TNFα und IL-8. 3E zeigt, dass CD11c⁺-Zellen Spurenmengen von IL-1α erzeugten.
Die Zytokinexpression von Monozyten wurde in einigen derselben Proben abgeschätzt. Monozyten wurden identifiziert, basierend auf ihren Streuungseigenschaften, ihrer hellen lin 1 FITC-, Anti-HLA-DR PerCP- und CD11c APC-Färbung. Wie gesehen werden kann, exprimieren Monozyten in LPS + BFA-stimulierten Proben Zytokine in höheren Spiegeln als CD11c⁺-DCs es tun. Nach der PMA + I + BFA-Aktivierung ist die Zytokinsekretion von CD11c⁺-DCs und Monozyten gleichwertig, jedoch viel niedriger im Vergleich zu LPS-aktivierten Proben. Die intrazelluläre Proteinsekretion wird abgeschätzt als mittlere PE-Fluoreszenzintensität (MFI).
BEISPIEL 4
Nachweis der CD11c⁺-DC-Oberflächenantisenexpression in Gesamtblut
Gesamtblutproben wurden von gesunden Freiwilligen entnommen und mit LPS-, PMA + I-oder durch CD40-Quervernetzung aktiviert in der Abwesenheit von Brefeldin A, gemäß den Vorgängen, die beschrieben sind in den Beispielen 1 und 2. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
Wie in den Histogrammen gezeigt, zeigte die CD11c^–-Untergruppe eine deutliche Heraufregulation der CD25-Expression nach der PMA + I-Aktivierung; eine Heraufregulation von CD25 war die einzige unterscheidbare Antwort, beobachtet in der CD11c^–-Untergruppe. Im Gegensatz dazu zeigte die CD11c⁺-Untergruppe die Heraufregulation von CD25, CD40, CD80, CD86, HLA-DR und HLA-DQ nach der LPS-Aktivierung. Die T-Zellen co-stimulierenden Moleküle, insbesondere CD80, ergaben das stärkste Signal. PMA + I führte zu einer Heraufregulation in CD11c⁺-Zellen von CD86, CD80, HLA-DQ und HLA-DR. Ein minimaler Anstieg von CD25 und CD40 wurde beobachtet. Die Aktivierung im Wege der Quervernetzung von CD40 resultierte in erhöhten Spiegeln von CD86, CD80 und in einer minimalen Heraufregulation von HLA-DR.
5 hebt die Unterschiede in dem Ansprechen von TNFα, IL-8, CD80 und CD86 auf die CD11c⁺-DC-Untergruppe aus peripherem Blut während der Aktivierung mit PMA + I im Vergleich zu LPS. Zwei Spender sind abgebildet. Die Expressionsmuster der Zytokine und co-stimulierenden Moleküle variieren zwischen unterschiedlichen Reizen und sind konsistent zwischen den Spendern. IL-8 und CD86 sind die dominanten Signale bei der PMA + I-Stimulation. In LPS-aktivierten Proben werden TNFα und CD80 zu einem größeren Ausmaß produziert.
BEISPIEL 5
Kinetische Zytokinuntersuchung
Gesamtblut wurde stimuliert mit 1 μg/ml LPS und inkubiert in Polypropylenröhrchen (12 × 75 mm) bei 37°C in einer befeuchteten Umgebung, enthaltend 5% CO₂. Aliquoten wurden bearbeitet, im Wesentlichen wie in den Beispielen 1 und 2 oben ausgeführt, jede Stunde von 0 bis 8 Stunden nach der Stimulation. Eine Stunde vor der Ernte jeder Probe wurde BFA hinzugefügt in einer Konzentration von 10 μg/ml. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
BEISPIEL 6
Modifizierte Protokolle für die Gesamtblut-Durchfluss-Zytometrie-Untersuchung der Immunfunktion dendritischer Zellen
Dieses Beispiel stellt Protokolle vor, die leicht modifiziert sind im Vergleich zu jenen, die in den Beispielen 1 und 2 dargestellt sind; die modifizierten Protokolle sind schneller, ermöglichen es Daten, von einer größeren Zellzahl zu ermitteln, wobei folglich die Statistik verbessert wird, und enthalten weniger Schritte der Aliquotenbildung.
DC-Oberflächenantigenexpression in Gesamtblut
Das Ansprechen von CD11c⁺-DCs auf die LPS-Stimulation, berichtet als die mittlere Fluoreszenzintensität (mittlere MFI), der Oberflächenexpression des co-stimulierenden Moleküls CD80 oder des DC-Aktivierungsmarkers CD83 wird gemessen wie folgt.
Materialien

– Lipopolysaccharid (LPS), von Sigma, Katalog #L2654, 0,5 mg/ml in DMSO, gelagert bei –70°C, Arbeitslösung ist eine [1 : 100]-Verdünnung in PBS (1x)
– DMSO [1 : 100] in PBS (1x) (Stimuluslösungsmittel)
– CD11c APC, von BDIS, Katalog #340544, verwende 15 μl/300 μl Gesamtblut (WB)
– Liniencocktail 1 (lin 1) FITC, von BDIS, Katalog #340546, 60 μl/300 μl WB
– Anti-menschliches HLA-DR PerCP, von BDIS, Katalog #347364, verwende 30 μl/300 μl WB
– CD80 PE, von BDIS, Katalog #340512, verwende 60 μl/300 μl WB
– CD83 PE, von BDIS (Auftragskonjugat), PC#1520, 50 μg/ml, verwende 20 μl/300 μl WB
– FACS^TM Lysing Solution 10x, von BDIS, Katalog #349202, Arbeitslösung ist eine [1 : 10]-Verdünnung in entmineralisiertem Wasser
– Waschpuffer PBS (1x), 0,5% BSA
– PBS (1x)

Stimulierungsprotokoll

– Füge 20 μl LPS-Arbeitslösung zu 1 ml menschlichem Gesamtblut hinzu (aktivierte Kontrolle).
– Füge 20 μl DMSO: PBS1x [1 : 100] zu 1 ml menschlichem Gesamtblut hinzu (Ruhekontrolle).
– Inkubiere die Röhrchen für 4 Stunden bei 37°C und 5% CO₂.

Färbeprotokoll
Führe alle Schritte in 12 × 75-Polypropylenröhrchen durch

– Füge 60 μl lin 1 FITC, 30 μl Anti-Hu HLA-DR PerCP, 15 μl CD11c APC und 20 μl CD83 PE oder 60 μl CD80 PE hinzu
– Füge 300 μl Gesamtblut (WB), erhalten aus dem Stimulierungsprotokoll, hinzu, verwirble
– Inkubiere für 15 Minuten bei RT im Dunklen
– Füge 3 ml FACS Lysing Solution (1x) hinzu, verschließe die Röhrchen und verwirble
– Inkubiere für 10 Minuten bei RT im Dunkeln
– Pelletiere (7 Minuten bei 1500 rpm, Sorvall-Tischzentrifuge)
– Aspiriere den Überstand und verwirble, um das Pellet aufzubrechen
– Füge 2 ml Waschpuffer hinzu und verwirble
– Pelletiere (7 Minuten bei 1500 rpm, Sorvall-Tischzentrifuge)
– Aspiriere den Überstand
– Resuspendiere die gefärbten Zellen in ungefähr 200 μl Waschpuffer
– Erfasse die Proben (das heißt führe Durchfluss-Zytometrie-Analyse durch) in ≤ 1 Stunde, lagere Proben vor der Erfassung bei 4°C

Bemerkung: Es ist notwendig, Proben in 12 × 75-Polystyrolröhrchen für die Erfassung zu übertragen. Polypropylenröhrchen passen gewöhnlich nicht in das Probeninjektionssystem des Durchfluss-Zytometers. Führe den Transfer unmittelbar vor der Erfassung durch.
Instrumenten- & Setup- & Erfassungskriterien

– FACSCalibur Durchfluss-Zytometer
– 4-Farb-Lyse/Wash (LW) bei der FACSComp Software-Einstellung
– Verwende eine FSC-Schwelle
– Ermittle die FCS-Datei durch Verwendung von anti-menschlicher HLA-DR PerCP positiven/lin 1 FITC dunklen Ereignissen. Verwende die gesamte Zellsuspension für die Ermittlung (ungefähr 4.000–7.000 Ereignisse):

Zell-Identifizierung
Streuung niedrig/lin 1 FITC niedrig/anti-menschliches HLA-DR PerCP hoch/ CD11c APC hoch
DC-Zytokinexpression in Gesamtblut
Das Ansprechen von CD11c⁺-DCs auf die LPS-Stimulation, berichtet als die mittlere Fluoreszenzintensität (mittlere MFI) der TNFα-Expression in der Anwesenheit des den Golgi-Transport unterbrechenden Mittels Brefeldin A (BFA), wird wie folgt gemessen. Die Zellen werden für 2 Stunden aktiviert.
Materialien

– Lipopolysaccharid (LPS), von Sigma, Katalog #L2654, 0,5 mg/ml in DMSO, gelagert bei –70°C, Arbeitslösung ist eine [1 : 100]-Verdünnung in PBS (1x)
– DMSO [1 : 100] in PBS (1x) (Stimuluslösungsmittel)
– Brefeldin A (BFA), von Sigma, Katalog #B-7651, Stammlösung 50 mg/ml in DMSO, gelagert bei –20°C, Arbeitslösung [1 : 100] in PBS (1x), verwende 20 μl/1 ml WB
– CD11c APC, von BDIS, Katalog #340544, verwende 30 μl/300 μl Gesamtblut (WB)
– Liniencocktail 1 (lin 1) FITC, von BDIS, Katalog #340546, 120 μl/300 μl WB
– Anti-menschliches HLA-DR PerCP, von BDIS, Katalog #347364, verwende 60 μl/300 μl WB
– Anti-menschliches TNFα PE, von BDIS, Katalog #340512, verwende 200 μl/Test
– FACS^TM Permeabilizing Solution 10x, von BDIS, Katalog #340457, Arbeitslösung ist eine [1 : 10]-Verdünnung in entmineralisiertem Wasser
– FACS^TM Lysing Solution 10x, von BDIS, Katalog #349202, Arbeitslösung ist eine [1 : 10]-Verdünnung in entmineralisiertem Wasser
– Waschpuffer PBS (1x), 0,5% BSA
– PBS (1x)

Stimulierungsprotokoll

– Füge 20 μl LPS-Arbeitslösung zu 1 ml menschlichem Gesamtblut hinzu (aktivierte Kontrolle).
– Füge 20 μl DMSO : PBS1x [1 : 100] zu 1 ml menschlichem Gesamtblut hinzu (Ruhekontrolle).
– Dann füge 20 μl BFA-Arbeitslösung zu beiden Kontrollröhrchen hinzu.
– Inkubiere die Röhrchen für 2 Stunden bei 37°C und 5% CO₂.

Färbeprotokoll (intrazellulär)

– Führe alle Schritte in 12 × 75-Polypropylenröhrchen durch
– Füge 120 μl lin 1 FITC, 60 μl anti-menschliches HLA-DR PerCP, 30 μl CD11c APC hinzu
– Füge 300 μl Gesamtblut (WB), erhalten aus dem Stimulierungsprotokoll, hinzu, verwirble
– Inkubiere für 15 Minuten bei RT im Dunklen
– Füge 3 ml FACS Lysing Solution (1x) hinzu, verschließe die Röhrchen und verwirble
– Inkubiere für 10 Minuten bei RT im Dunkeln
– Pelletiere (7 Minuten bei 1500 rpm, Sorvall-Tischzentrifuge)
– Aspiriere den Überstand und verwirble vorsichtig, um das Pellet aufzubrechen
– Resuspendiere in 1 ml FACS Permeabilizing Solution 1x
– Inkubiere bei RT für 10 Minuten im Dunkeln
– Füge 2 ml Waschpuffer hinzu, verschließe die Röhrchen und verwirble sanft
– Pelletiere (10 Minuten bei 1500 rpm, Sorvall-Tischzentrifuge)
– Dekantiere den Überstand
– Resuspendiere das permeabilisierte Zellpellet sanft in dem verbleibenden Überstand
– Füge 20 μl anti-menschliches TNFα-PE-Reagens für intrazelluläres Färben hinzu
– Inkubiere für 30 Minuten bei RT im Dunkeln
– Füge 2 ml Waschpuffer hinzu und verwirble sanft
– Pelletiere (10 Minuten bei 1500 rpm, Sorvall-Tischzentrifuge)
– Dekantiere den Überstand
– Resuspendiere gefärbte und permeabilisierte Zellen in 200 μl Waschpuffer
– Erfasse die Probe in ≤ 1 Stunde, lagere die Proben vor der Erfassung bei 4°C

Bemerkung: Es ist notwendig, die Proben in 12 × 75-Polystyrolröhrchen für die Erfassung zu übertragen. Polypropylenröhrchen passen gewöhnlich nicht zum Probeninjektionssystem des Durchfluss-Zytometers. Führe die Übertragung unmittelbar vor der Erfassung durch.
Instrumenten- & Setup- & Erfassungskriterien

– FACSCalibur Durchfluss-Zytometrie
– 4-Farb-Lyse/No Wash (LW) bei der FACSComp Software-Einstellung
– Verwende eine FSC-Schwelle
– Erfasse die FCS-Datei durch Verwendung von anti-menschlicher HLA-DR PerCP positiven/lin 1 FITC dunklen Ereignissen. Verwende die gesamte Zellsuspension für die Erfassung (ungefähr 4.000–7.000 Ereignisse).

Zell-Identifizierung
Streuung niedrig/lin 1 FITC niedrig/anti-menschliches HLA-DR PerCP hoch/ CD11c APC hoch

Claims

Ein Durchflusszytometrieverfahren zum Messen dendritischer Zellfunktionen in Gesamtblut, umfassend: (a) Kontaktieren einer Gesamtblutprobe ohne vorausgehende in-vitro-Kultur mit einem dendritischen Zellaktivator; (b) Hinzufügen zu dieser Probe einer Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern und wenigstens einen zytokinspezifischen Antikörper; (c) durchflusszytometrische Untersuchung dieser Probe auf das Binden dieses zytokinspezifischen Antikörpers mittels wenigstens einer unterscheidbaren DC-Untergruppe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin dieses Hinzufügen selber in der Reihenfolge umfasst: (b1) Hinzufügen zu dieser Probe einer Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern; (b2) Lysieren von Erythrozyten in dieser Probe; (b3) Permeabilisieren kernhaltiger Zellen in dieser Probe; und dann (b4) Hinzufügen zu dieser Probe von wenigstens einem zytokinspezifischen Antikörper.
Verfahren nach Anspruch 2, worin diese Probe mit Brefeldin A während diesem Schritt des Kontaktierens mit DC-Aktivator in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin diese dendritische Zellen unterscheidenden Antikörper eine Vielzahl an Antikörpern einschließen, von denen jeder spezifisch ist für eine nicht-dendritische Zelllinie.
Verfahren nach Anspruch 4, worin jeder dieser für eine nicht-dendritische Zelllinie spezifische Antikörper spezifisch ist für ein Unterschiedliches der Proteine, entnommen von der Gruppe, bestehend aus: CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 und CD56.
Verfahren nach Anspruch 5, worin jeder dieser für eine nicht-dendritische Zelllinie spezifische Antikörper mit dem identischen Fluorophor konjugiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin dieses Fluorophor FITC ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser dendritische zellunterscheidende Antikörper einen Antikörper spezifisch für HLA-DR einschließt.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser dendritische zellunterscheidende Antikörper einen Antikörper spezifisch für CD 4 einschließt.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser dendritische zellunterscheidende Antikörper wenigstens einen Antikörper einschließt, der differenziell an unterschiedliche Untergruppen dendritischer Zellen bindet.
Verfahren nach Anspruch 10, worin dieser differenzielle Antikörper spezifisch ist für CD11c.
Verfahren nach Anspruch 10, worin dieser differenzielle Antikörper spezifisch ist für CD123.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser zytokinspezifische Antikörper spezifisch ist für ein Interleukin.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser zytokinspezifische Antikörper spezifisch ist für einen Zytokinrezeptor.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser zytokinspezifische Antikörper spezifisch ist für TNF-α.
Verfahren nach Anspruch 3, worin dieser zytokinspezifische Antikörper spezifisch ist für ein Interferon.
Durchflusszytometrieverfahren zum Messen dendritischer Zellfunktion in Gesamtblut, umfassend: (a) in Kontakt bringen einer Gesamtblutprobe mit einem dendritischen Zellaktivator; (b) Hinzufügen zu dieser Probe einer Vielzahl an dendritische Zellen unterscheidenden Antikörpern und wenigstens eines Antikörpers, spezifisch für einen dendritischen Zelloberflächenmarker, kennzeichnend für Aktivierung; und dann (c) durchflusszytometrische Untersuchung dieser Probe auf das Binden dieses Antikörpers, spezifisch für diesen dendritischen Zelloberflächenaktivierungsmarker durch wenigstens eine unterscheidbare DC-Untergruppe.
Verfahren nach Anspruch 17, worin diese Oberflächenmarker, kennzeichnend für dendritische Zellaktivierung, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CD25, CD40, CD80, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56 und HLA-DQ.