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Die
Erfindung bezieht sich auf die Verwendung gewisser Peptide bei der
Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen für die Behandlung und/oder Vorbeugung
von mit Helicobacter pylori verbundenen Störungen und auf Verfahren für die Behandlung
solcher Störungen
bei Patienten, die dessen bedürfen.
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Die
Helicobacter pylori (H. pylori)-Infektion ist verbunden mit etlichen
gutartigen und bösartigen menschlichen
Erkrankungen [C. P. Dooley et al., N. Engl. J. Med. (1989), 321:
1562–1566;
J. Carrick et al., Gut (1989); 30: 790–797; A. Nomura et al., N. Engl.
J. Med. (1991), 325: 1132–1136
[siehe Kommentare]; A. Nomura et al., Ann. Intern. Med. (1994), 120:
977–981
[siehe Kommentare]; E. Zucca et al., N. Engl. J. Med. (1998), 338:
804–810].
Die symptomatische Infektion ist jedoch nur die Spitze des Eisberges,
die Mehrheit der infizierten Individuen verbleibt ohne Symptome.
Weiterhin kann die Infektion, falls sie unbehandelt bleibt, für Jahrzehnte
anhalten [W. L. Peterson und W. V. Harford (1991), 86: 671–675], was
eine erfolgreiche Wirt-Parasiten-Beziehung
darstellt. Diese günstige
Wechselwirkung wird widergespiegelt in einer hohen Prävalenz der
Infektion, die sich im Bereich zwischen 50% in entwickelten Ländern und
bis zu 90% in Entwicklungsländern
bewegt [D. Y. Graham et al., Dig. Dis. Sci. (1991), 36: 1084–1088; D.
N. Taylor und M. J. Blaser, Epidemiol. Rev. (1991), 13: 42–59].
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H.
pylori hält
sich in der Schleimschicht der menschlichen Magenschleimhaut auf.
Wegen dem extrem niedrigen pH-Wert ist der Magen eine unwirtliche
Umgebung für
die meisten anderen Mikroorganismen. Die Fähigkeit von H. pylori, im Magen
zu florieren, wurde Schutzmechanismen, wie seiner Herstellung von
Urease, zugeschrieben, wodurch das Bakterium vor der Magensäure durch
Schaffung einer basischen Mikroumgebung geschützt wird [D. N. Taylor und
M. J. Blaser, Epidemiol. Rev. (1991), 13: 42–59]. Es wurde nun jedoch geltend
gemacht, dass H. pylori einen Weg entwickelt haben könnte, einen Wachstumsvorteil
in dieser besonderen Nische des Magens zu ziehen, möglicherweise
durch Ausnutzen eines Magenfaktors. Ein logischer Kandidat würde einer
sein, der durch die H. pylori-Infektion herauf reguliert wird.
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Ein
solcher Faktor ist das Magenhormon Gastrin. Gastrin wird als ein
Prohormon durch innerhalb des Magenantrums lokalisierte G-Zellen
hergestellt. Das Prohormon wird später zu kürzeren Peptiden verarbeitet,
von denen das häufigste
17 Aminosäuren
lang ist und als Gastrin 17 (G17) bezeichnet wird [K. A. Eaton et
al., Infect. Immun. (1991), 59: 2470–2475]. Die Gastrin zugeschriebene
Hauptrolle innerhalb des Magengewebes ist die Regulation der Säuresekretion.
Nach der Infektion werden die Gastrinspiegel als fortwährend erhöht gefunden
und die normale physiologische negative Rückkopplungskontrolle der Sekretion
ist verloren. Weiterhin werden die Gastrinspiegel nach der H. pylori-Ausrottung
reduziert und die normale Rückkopplungskontrolle
der Gastrinsekretion wird wieder hergestellt [D. Y. Graham et al.,
Am. J. Gastroenterol. (1990), 85: 394–398; E. El-Omar et al., Gut
(1993), 34: 1060–1065
[siehe Kommentare]; J. W. Konturek et al., Gut (1995), 37: 482–487).
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Das
Interesse an den Änderungen
der Gastrinsekretion und -kontrolle wurde auf seine Rolle bei der
Säureproduktion
und die resultierende Peptidpathologie gerichtet. Die vorliegende
Arbeit wurde jedoch auf mögliche
Wechselwirkungen zwischen Gastrin und H. pylori konzentriert.
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Wie
nachfolgend gesehen werden wird, stimuliert Gastrin positiv das
Wachstum von H. pylori, eine Erkenntnis, welche weiter die erfolgreiche
Anpassung von H. pylori an den menschlichen Wirt beispielhaft erläutert und
die Basis für
die vorliegende Erfindung bereitstellt.
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Die
Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Peptides, welches
ein synthetisches Analogen von Gastrin oder einem Gastrinfragment
ist, und welches die wachstumsfördernde
Wirkung von Gastrin auf H. pylori hemmt, bei der Zubereitung einer
pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von mit H.
pylori assoziierten Störungen. Bei
der Verwendung gemäß der Erfindung
kann diese Verbindung ein synthetisches Analogon von G17 sein, wobei
es vorzugsweise die folgende Aminosäuresequenz umfasst: Trp-Met-Asp-PheNH2.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1A bis 1B:
Wachstumskinetiken von H. pylori in der Anwesenheit von Gastrin
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Die
Bakterien wurden in flüssigen
Medien wachsen gelassen unter Verwendung von mikroaerophilen Bedingungen
mit steigenden Gastrinkonzentrationen. Die Wachstumsrate wurde beurteilt
durch die optische Dichte (OD). T bezeichnet die Zeit in Stunden.
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1(A) zeigt eine repräsentative Wachstumskurve eines
Isolates über
48 Stunden.
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1(B) zeigt die kumulierten Wachstumsdaten
von 5 unterschiedlichen klinischen Isolaten mit (3,7 pM) oder ohne
Gastrin. Das Wachstum wird bei 0 h und 48 h verglichen (gezeigt
als ein Mittelwert mit SEM).
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2A bis 2F:
Die Gastrin-Wachstumsstimulierung ist bakterien- und peptidspezifisch
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Wachstumskinetische
Analyse unterschiedlicher Bakterien mit Gastrin:
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2A:
wachstumskinetische Analyse von C. jejuni mit Gastrin;
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2B:
wachstumskinetische Analyse von E. coli mit Gastrin;
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2C:
wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit dem gastrischen Peptid
Somatostatin;
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2D:
wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit EGF.
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2E:
wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit dem menschlichen Gastrinrezeptoragonisten
Pentagastrin;
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2F:
wachstumskinetische Analyse von H. pylori mit dem menschlichen Gastrinrezeptoragonisten
CCK-8.
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Die
Bakterien wurden wachsen gelassen unter Verwendung von flüssigen Medien
und die Wachstumsrate wurde beurteilt durch die optische Dichte
(OD). T bezeichnet die Zeit in Stunden. Mit Ausnahme der aeroben
Bedingungen, die für
das Wachstum von E. coli verwendet wurden, waren sämtliche
Wachstumsbedingungen identisch. Ein Experiment ist repräsentativ
für drei
(jedes durchgeführt mit
einem unterschiedlichen Isolat).
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3: Gastrinaufnahmeuntersuchung
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H.
pylori-(H. P.)-, E. coli-(E. C.)-, S. pneumonia-(S. P.)- und C.
jejuni-(C. J.)-Bakterien wurden für 45 Minuten mit 125I-markiertem
Gastrin inkubiert. Die Inkubation geschah bei 4°C oder 37°C. Nach der anfänglichen
Inkubation wurde Proteinase K (P. K.) für 30 Minuten hinzugefügt, wonach
die Bakterien gewaschen und geblottet wurden. Ein Experiment ist
repräsentativ
für zwei.
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4: Konkurrenz
unterschiedlicher Peptide um die 125I-markierte
Gastrinaufnahme durch H. pylori
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Bakterien
wurden in der Anwesenheit von 500 nmol/l 125I-markiertem
Gastrin und steigenden Konzentrationen von entweder unmarkiertem
Gastrin (G), CCK-8 (CCK), Pentagastrin (Pen), Somatostatin (Som)
oder EGF für
45 Minuten inkubiert. Die Bakterien wurden gewaschen und die in
den Bakterienpellets verbleibende Radioaktivität wurde bestimmt. Ein Experiment
ist repräsentativ
für drei.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
H. pylori-Infektion ist verbunden mit Zwölffingerdarmgeschwür, Magengeschwür, Magenadenokarzinom
und B-Zell-Lymphom. Es wurde auch in Verbindung gebracht mit kardiovaskulären Erkrankungen,
insbesondere Atherosklerose und Ischämie, da von ihr gezeigt wurde,
dass die Infektion häufiger
ist in Patienten, die an diesen Erkrankungen leiden. Das Bakterium
hält sich
innerhalb der Magenschleimhaut auf, eine einzigartige Nische, die
unwirtlich ist für
andere Mikroorganismen. Gastrin, ein Magenhormon, wird fortdauernd
nach der H. pylori-Infektion erhöht.
Es wurde nun herausgefunden, dass menschliches Gastrin das H. pylori-Wachstum
in einem spezifischen, dosisabhängigen
Mechanismus stimuliert, was einen neuen Ansatz für die Behandlung von H. pylori-Infektionen
nahe legt.
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Wie
in den folgenden Beispielen gezeigt, stimuliert das menschliche
Hormon Gastrin das H. pylori-Wachstum signifikant in einer dosisabhängigen Weise.
Diese Wirkung war reproduzierbar in sämtlichen untersuchten bakteriellen
Isolaten. Die Wachstumsstimulation geschah bei physiologischen Gastrinkonzentrationen,
wie sie im Blut und im Lumen des Magens gefunden werden [C. R. Mueller
et al., Surgery (1991), 110: 1116–1124; K. Yamashita et al., Gastroenterology
(1998), 115: 1123–1130].
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Die
Aufnahme von Gastrin durch H. pylori und die stimulierende Wachstumswirkung
waren hochspezifisch und wurden nicht nachgewiesen mit Kontrollbakterien
oder durch andere Peptide, die im Magenantrum oder -lumen vorhanden
waren. Weiterhin legte die kalte Ligandeninhibition nahe, dass die Wirkung über eine
spezifische Gastrinbindungsstelle vermittelt wurde. Gastrin, CCK-8
und Pentagastrin haben eine strukturelle Ähnlichkeit und aktivieren menschliche
Gastrin/CCKB-Rezeptoren. In den vorliegenden Experimenten konkurrierten
sowohl CCK-8 als auch Pentagastrin mit Gastrin um die Bindung an
H. pylori, stimulierten jedoch nicht das bakterielle Wachstum. Die
Konkurrenz durch strukturelle verwandte Verbindungen unterstützt die
Annahme, dass eine spezifische Bindungsstelle bei der Gastrinaufnahme
durch H. pylori involviert ist. Die Tatsache, dass die biologische
Aktivität
nur mit Gastrin erhalten werden konnte, wiederholt die spezifische
Wechselwirkung von H. pylori mit diesem Hormon.
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In
Anbetracht der vorliegenden Ergebnisse könnte die Wirt-Parasiten-Wechselwirkung
zwischen dem menschlichen Wirt und H. pylori angesehen werden, als
ob sie entwickelt wurde, um Gastrin durch das Bakterium auszunützen. H.
pylori kolonisiert bevorzugt das gastrische Antrum, die anatomische Örtlichkeit
von Gastrin produzierenden G-Zellen [E. Gayerdorffer et al., Gastroenterology
(1992), 102: 1575–1582].
Zusätzlich
resultiert die Infektion in Hypergastrinämie und einem Verlust der negativen Rückkopplungskontrolle
auf die Gastrinsekretion, was möglicherweise
zu der fortdauernden Aussetzung der Bakterien an hohe Spiegel von
Gastrin führt.
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Das
histologische Kennzeichen der H. pylori-Infektion ist die chronische
Antrumentzündung.
Als ein Ergebnis dieser Entzündung
wurden erhöhte Spiegel
entzündungsfördernder
Cytokine dokumentiert [J. E. Crabtree et al., Gut (1991), 32: 1473–1477; R.
Karttunen et al., Gut (1995), 36: 341–345; L. A. Noach et al., Scand.
J. Gastroenterol. (1994), 29: 425–429; J. E. Crabtree et al.,
Scand. J. Immunol. (1993), 37: 65–70]. Unter Verwendung von
in vitro-Kulturen wurde gezeigt, dass endokrine Zellen Gastrin in
Antwort auf die Stimulierung mit solchen entzündlichen Cytokinen produzieren
können
[F. S. Lehmann et al., Am. J. Physiol. (1996), 270: 783–788; N.
Weigert et al., Gastroenterology (1996), 110: 147–154; I.
L. Beales et al., Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. (1997), 9: 773–777; J.
L. Wallace et al., Am. J. Physiol. (1991), 261: G559–564]. Folglich kann
H. pylori tatsächlich
von der Immunantwort des Wirtes profitieren, welche die Heraufregulation
eines bakteriellen Wachstumsfaktors in Gang setzt.
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Modelle,
basierend auf Eigenschaften von H. pylori und der Wirt-Parasiten-Wechselwirkung, wurden
vorgeschlagen. Lee schlug vor, dass die außergewöhnlich geringe Größe des H.
pylori-Genoms und die geringe Anzahl regulatorischer Gene anzeigen könnten, dass
das Bakterium gut an ein hochspezifisches einzelnes Habitat angepasst
ist [A. Lee, N. Engl. J. Med. (1998), 338: 832–833]. Die Erkenntnis, dass
H. pylori Gastrin, ein Magenhormon, verwendet, steht in Übereinstimmung
mit diesem Vorschlag. Weiterhin führte die Chronizität und Dauerhaftigkeit der
H. pylori-Infektion in dem menschlichen Wirt Blaser dazu, vorzuschlagen,
dass die Interaktion zwischen Bakterium und Wirt wechselseitig reguliert wird.
Solch eine Regulation lässt
auf eine gleichzeitige Entwicklung schließen [M. J. Blaser, J. Clin.
Invest. (1997), 100: 759–762).
Eine erhöhte
Gastrinsekretion als eine Folge der Infektion und die mögliche Ausnutzung
von Gastrin durch das Bakterium passt zu diesem Konzept.
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Die
Therapie der peptischen Ulcuserkrankung vor der Entdeckung der zentralen
Rolle von H. pylori wurde auf Mittel basiert, die in der Lage sind, Magensäure zu reduzieren.
Basierend auf der Metaanalyse vielfacher Wege, die darauf zielten,
peptische Ulci zu heilen, wurde gezeigt, dass es keinen Vorteil
gibt, den pH-Wert über
3 für mehr
als 18 Stunden täglich
anzuheben. Immer noch werden zahlreiche Gruppen an Mitteln verwendet,
um die Magensäure
zu reduzieren. Die wichtigsten dieser Mittel sind die H2-Rezeptorantagonisten
und die Protonenpumpeninhibitoren. H2-Rezeptorantagonisten wirken durch
Hemmen der Histamin-H2-Rezeptoren auf den Belegzellen. Protonenpumpeninhibitoren
wirken durch die Inhibition der H+K+-ATPase der Belegzellen, die verantwortlich
ist für
die Säuresekretion
aus den Zellen.
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Gegenwärtige Therapien
der H. pylori-Infektionen bestehen gewöhnlich aus Kombinationen von zwei
antibiotischen Mitteln gemeinsam mit einem begleitenden Mittel,
das gewöhnlich
entweder ein Protonenpumpeninhibitor oder Wismut ist. Die Antibiotikaresistenz
von H. pylori ist weit verbreitet, mit steigender Prävalenz [S.
L. Hazell, Eur. J. Clin. Infect. Dis. (1999), 18: 83–86]. Die
mit H. pylori verbundene Infektion ist ein eher gewöhnliches
Phänomen,
was in einer massiven Verwendung von Antibiotika resultiert, welche
manchmal auch symptomatischen Trägern
verschrieben werden. Diese massive Verwendung kann die Option der
Behandlung dieser Erkrankung durch gegenwärtig erhältliche Arzneimittel ausschöpfen und
die Resistenz des Bakteriums kann später das Ausmaß des Erfolges
der Therapie der H. pylori-Infektion angreifen, ebenso wie andere
infektiöse
Agenzien, die resistent werden können,
als eine Sekundärwirkung
der übermäßigen Verwendung
von Antibiotika.
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Die
vorliegenden Erkenntnisse legen nahe, dass Gastrin der Faktor sein
könnte,
auf dem H. pylori gedeiht, und bei seinem Fehlen wird das Bakterium
nicht in der Lage sein, in dem Magenantrum zu überleben. Der durch Gastrin
für H.
pylori bereitgestellte Wachstumsvorteil kann der Grund für die Fähigkeit
dieses Bakteriums sein, in diesem unwirtlichen Habitat zu florieren.
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Es
ist diese neu entdeckte Beziehung zwischen Gastrin und H. pylori,
die die Basis für
alternative, nicht auf Antibiotika basierende verbesserte Therapien
zahlreicher Erkrankungen, die mit der H. pylori-Infektion verbunden
sind, insbesondere jene des Gastrointestinaltraktes, bereitstellt.
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Folglich
bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines Peptides, das
ein synthetisches Analogon von Gastrin ist oder eines Fragmentes
von Gastrin ist, und welches den wachstumsverstärkenden Effekt von Gastrin
auf H. pylori inhibiert, in einer pharmazeutischen Zusammensetzung
für die
Behandlung und/oder Vorbeugung von mit H. pylori verbundenen Störungen.
Wahlweise umfassen die Zusammensetzungen weiterhin pharmazeutisch
annehmbare Träger,
Hilfsmittel oder Verdünnungsmittel.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung kann besonders geeignet sein für die Behandlung und/oder
Vorbeugung von mit H. pylori assoziierten gastrointestinalen Störungen,
besonders mit H. pylori assoziierten peptischen Magen- und/oder
Zwölffingerdarmerkrankungen.
Zusätzlich
können
die Zusammensetzungen für
die Behandlung von Gastritis, Duodenitis, nicht ulcerativer Dyspepsie,
Lymphom des schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebes, für die Vorbeugung
von Magenkarzinom und bei der Behandlung atherosklerotischer kardiovaskulärer Erkrankungen
verwendet werden.
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Der
aktive Bestandteil in den pharmazeutischen Zusammensetzungen ist
in der Lage, die Gastrinaufnahme durch H. pylori zu inhibieren und
kann ein kompetitiver Inhibitor der Gastrinaufnahme durch H. pylori
oder ein Antagonist des menschlichen oder des Gastrinrezeptors von
H. pylori sein.
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Bevorzugte
Peptide sind synthetische Analoga von Gastrin oder eines Fragmentes
von Gastrin, umfassend eine Aminosäuresequenz, entsprechend dem
C-Terminus von Gastrin oder einem Gastrinfragment, vorzugsweise
G17. Solche bevorzugten Peptide umfassen die Aminosäuresequenz: Trp-Met-Asp-PheNH2. Besondere Beispiele synthetischer Peptide,
die als das aktive Prinzip in den Zusammensetzungen verwendet werden
können,
sind Pentagastrin oder Cholecystokinin (CCK)-8.
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Pentagastrin
ist ein synthetisches Gastrinanalogon, das die biologische Wirkung
von Gastrin ausübt.
Die hauptsächliche
klinische Verwendung dieser Verbindung war die Stimulation der Säuresekretion
in einem diagnostischen Test, der benötigt wurde für den Ausschluss
von Achlorhydrie (die Säurestimulation
geschieht innerhalb von 10 Minuten und erreicht ihren Gipfel innerhalb
von 20 bis 30 Minuten). Pentagastrin ersetzte die Verwendung von Histamin
in solchen Untersuchungen, da es mildere Nebenwirkungen hat.
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Synthetische
Peptide, die in der Erfindung verwendet werden, können in
der Form eines Dimeres, eines Multimeres oder in einer erzwungenen Konformation
vorliegen, wobei die erzwungene Konformation erhalten wird durch
innere Brücken,
kurz reichende Zyklisierungen, Ausdehnungen oder durch andere chemische
Modifikation.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen sind nützlich für die Behandlung und/oder Vorbeugung
von mit H. pylori assoziierten Störungen in einem Patienten,
der einer solchen Behandlung bedarf, durch die Applikation einer
therapeutisch wirksamen Menge des Peptides an diesen Patienten, welches
den wachstumserhöhenden
Effekt von Gastrin auf H. pylori inhibiert.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen Salze,
vorzugsweise in physiologischer Konzentration, wie z. B. PBS (phosphatgepufferte
Salzlösung)
oder Natriumchlorid (0,9% w/v), und ein Puffermittel, wie z. B.
Phosphatpuffer in der obigen PBS, enthalten. Die Zubereitung pharmazeutischer
Zusammensetzungen ist im Stand der Technik wohl bekannt, siehe z.
B. die US-Patente mit den Nrn. 5,736,519, 5,733,877, 5,554,378, 5,439,688,
5,418,219, 5,354,900, 5,298,246, 5,164,372, 4,900,549, 4,755,383,
4,639,435, 4,457,917 und 4,064,236. Der aktive Bestandteil der pharmazeutischen
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, das heißt das Peptid
oder pharmakologisch annehmbare Salze davon, wird vorzugsweise mit
einem Auszugsmittel, einem Trägermittel,
einem Verdünnungsmittel
und wahlweise einem Konservierungsmittel oder mit pharmazeutisch annehmbaren
Vehikeln, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, siehe z. B.
die obigen US-Patente, vermischt. Beispiele von Auszugsmitteln schließen Glukose,
Mannitol, Inositol, Suchrose, Lactose, Fructose, Stärke, Maisstärke, mikrokristalline
Zellulose, Hydroxypropylzellulose, Hydroxypropylmethylzellulose und
Polyvinylpyrrolidon ein. Wahlweise kann auch ein Verdickungsmittel
hinzugefügt
werden, wie ein natürlicher
Gummi, ein Zellulosederivat oder ein Acryl- oder Vinylpolymer.
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Die
pharmazeutische Zusammensetzung wird in fester, flüssiger oder
halbfester Form bereitgestellt. Eine feste Zubereitung kann durch
Vermischen der obigen Bestandteile zubereitet werden, um eine puderige
Zubereitung bereitzustellen. Alternativ wird die pharmazeutische
Zusammensetzung als eine lyophilisierte Zubereitung bereitgestellt.
Die flüssige Zubereitung
wird bevorzugt als eine wässrige
Lösung,
wässrige
Suspension, ölige
Suspension oder als eine Mikrokapsel-Zusammensetzung bereitgestellt.
Eine halbfeste Zusammensetzung wird bevorzugt als ein wässriges
oder öliges
Gel oder Unguentum bereitgestellt. Ungefähr 0,001 bis 60% w/v, vorzugsweise
ungefähr
0,05 bis 25% w/v des aktiven Mittels wird in der Zusammensetzung
bereitgestellt.
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Eine
feste Zusammensetzung kann zubereitet werden durch Vermischen eines
Auszugsmittels mit einer Lösung
des aktiven Mittels, das in der Zusammensetzung der Erfindung umfasst
ist, schrittweises Hinzufügen
einer kleinen Menge an Wasser und durch Verkneten der Mischung.
Nach dem Trocknen, vorzugsweise im Vakuum, wird die Mischung pulverisiert.
Eine flüssige
Zusammensetzung kann zubereitet werden durch Auflösen, Suspendieren oder
Emulgieren der aktiven Verbindung in Wasser, einer Pufferlösung oder Ähnlichem.
Eine ölige
Suspension kann zubereitet werden durch Suspendieren oder Emulgieren
der aktiven Verbindung in einer ölhaltigen
Basis wie Sesamöl,
Olivenöl,
Maiskeimöl, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Lanolin,
Provaseline, Paraffin, Isopar, Silikonöl, Fettsäuren von 6 bis 30 Kohlenstoffatomen
oder den entsprechenden Glycerol- oder Alkoholestern. Puffer schließen Sorensen-Puffer
[Ergeb. Physiol (1912), 12: 393], Clark-Lubs-Puffer [J. Bact. (1917),
2(1): 109 und 191], MacIlvaine-Puffer [J. Biol. Chem. (1921), 49:
183], Michaelis-Puffer (Die Wasserstoffionenkonzentration, S. 186,
1914) und Kolthoff-Puffer [Biochem. Z. (1926), 179: 419] ein.
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Eine
Zusammensetzung kann zubereitet werden als ein wässriges Gel, z. B. für die transnasale
Applikation. Eine wässrige
Gelbasis wird aufgelöst und
dispergiert in wässriger
Lösung,
enthaltend einen Puffer und dieses aktive Mittel, und die Lösung wird
erwärmt
oder abgekühlt,
um ein stabiles Gel zu ergeben.
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Vorzugsweise
wird die Zusammensetzung durch die intravenöse, intramuskuläre oder
subkutane Applikation verabreicht. Von der oralen Applikation wird
erwartet, dass sie weniger wirksam ist, besonders da die wirksame
Verbindung ein Peptid ist, weil das Peptid verdaut werden könnte, bevor
es aufgenommen wird. Selbstverständlich
wird diese Überlegung
weniger auf ein aktives Peptid zutreffen, das modifiziert wird,
z. B. indem es ein cyclisches Peptid ist, indem es nicht natürlich vorkommende
Aminosäuren
wie D-Aminosäuren enthält, oder
durch eine andere Modifikation, die die Resistenz des Peptides auf
den Bioabbau verstärkt.
Die Zersetzung im Verdauungstrakt kann reduziert werden durch die
Verwendung gewisser Zusammensetzungen, z. B. durch Einschließen des
Peptides in Mikrokapseln, wie Liposomen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können auch
an andere Schleimhäute
verabreicht werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung wird dann
in der Form eines Zäpfchens,
Nasensprays oder einer Sublingualtablette bereitgestellt. Die Dosis des
Peptides kann von dem zu behandelnden Zustand, dem Alter des Patienten,
dem Körpergewicht und
dem Applikationsweg abhängen
und wird durch den begleitenden Arzt bestimmt werden. Die Dosen des
Peptides bewegen sich im Bereich von 0,1 μg/kg bis 100 mg/kg oder höher, vorzugsweise
von 0,5 μg/kg
bis 5 mg/kg, bevorzugter von 0,1 μg/kg
bis 1 mg/kg, am bevorzugtesten bei ungefähr 100 μg/kg.
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Die
Aufnahme des Peptides kann erleichtert werden durch eine Anzahl
an Methoden. Zum Beispiel kann ein nichttoxisches Derivat der Choleratoxin-B-Untereinheit
oder der strukturell verwandten Untereinheit B des hitzelabilen
Enterotoxins des enterotoxischen E. coli zu der Zusammensetzung
hinzugefügt
werden, siehe US-Patent 5,554,378.
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Alternativ
kann die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung ein bioabbaubares
Polymer, ausgewählt
aus Poly-1,4-butylensuccinat, Poly-2,3-butylensuccinat, Poly-1,4-butylenfumarat und Poly-2,3-butylensuccinat,
umfassen, wobei das Peptid als das Pamoat, Tannat, Stearat oder
Palmitat davon eingeschlossen wird. Solche Zusammensetzungen sind
z. B. im US-Patent 5,439,688 beschrieben.
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Weiterhin
kann eine Zusammensetzung eine Fettemulsion sein. Die Fettemulsion
kann zubereitet werden durch Hinzufügen von ungefähr 0,1 bis
2,4 w/w eines Emulgierungsmittels wie z. B. einem Phospholipid,
einer Emulgierungshilfe, einem Stabilisator zu einem Fett oder Öl, durch
mechanisches Mischen, unterstützt
von Erhitzen und/oder der Entfernung von Lösungsmitteln, durch Hinzufügen von
Wasser und isotonischem Agens und wahlweise durch Anpassen durch
Hinzufügen
des pH-Mittels, isotonischen Mittels. Die Mischung wird dann homogenisiert.
Vorzugsweise enthalten solche fetten Emulsionen ein Mittel zum Anpassen
der elektrischen Ladung, wie saure Phospholipide, Fettsäuren, Gallensäuren und Salze
davon. Saure Phospholipide schließen Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol,
Phosphatidylinositol und Phosphatidinsäure ein. Gallensäuren schließen Deoxycholinsäure und
Taurocholinsäure
ein. Die Zubereitung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen
ist in
US 5,733,877 beschrieben.
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Die
Erfindung wird nun detaillierter in den folgenden Beispielen beschrieben
werden, die lediglich erläuternd
sind und nicht in irgendeinem Sinne den Schutzumfang der Erfindung
limitieren.
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Beispiele
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Materialien und Methoden
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Bakterielle
Kulturen und Wachstumsanalysen
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Bakterien
wurden aus klinischen Isolaten erhalten, die als Teil der Routineaufarbeitung
für den
H. pylori-Nachweis kultiviert wurden. Es wurden für die Studie
keine Bakterien besonders gewonnen. Die Wachstumskurvenanalysen
wurden durchgeführt
unter Verwendung von fünf
unterschiedlichen Isolaten. Die endoskopische Diagnose schloss sowohl
peptische Pathologien als auch normal erscheinende Mukosa ein. Nach
der Endoskopie wurden die Biopsien in balancierter Salzlösung für nicht
länger
als eine Stunde aufbewahrt. Anschließend wurden die Biopsieproben
zerkleinert und auf Schokoladen- oder Colombia-Agarplatten ausgestrichen.
Um mikroaerophile Bedingungen zu erzeugen, wurden die Bakterien bei
37°C in
versiegelten Gefäßen wachsen
gelassen unter Verwendung von Kits, die anaerobes Gas erzeugen (Oxoid,
BR- 38). Die Bakterien
wurden erneut unter ähnlichen
Bedingungen alle 2–4
Tage ausgestrichen. Für
die Experimente wurden Bakterien in Hirn-Herz-Infusion oder flüssige Brucella-Nährlösungsmedien
(Gibco) übertragen,
welche mit 10% Kälberserum
ergänzt
wurden (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). Jede Probe
wurde mit 0,02 OD 600 beimpft, was 1,6 × 103 CFU/100 μL entspricht. Gastrin
oder Kontrollpeptide wurden in unterschiedlichen Konzentrationen
hinzugefügt,
wie angezeigt.
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Das
H. pylori-Wachstum macht mikroaerophile Bedingungen notwendig. Die
wiederholte Probennahme aus demselben Röhrchen würde in der Unterbrechung solcher
Bedingungen resultieren. Um dieses Problem zu überwinden, wurden vielfache Proben
bei der Anzahl der beurteilten Zeitpunkte in jedem Experiment verwendet.
Jede Probe enthielt identische Bakterienzahlen und Gastrinkonzentrationen.
Eine unterschiedliche Probe wurde zu jedem Zeitpunkt beurteilt.
Das Wachstum wurde durch OD-Werte beurteilt.
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Sämtliche
Bakterien wurden aus klinischen Isolaten erhalten. Wachstumskinetische
Experimente mit C. jejuni wurden bei ähnlichen Bedingungen wie oben
für H.
pylori beschrieben durchgeführt. Wachstumskinetische
Experimente mit E. coli wurden unter ähnlichen Bedingungen wie den
obigen durchgeführt,
jedoch in einer aeroben Umgebung.
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Gastrin und
Kontrollpeptide
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Gastrin
17, Cholecystokinin (CCK)-8 (Fragment 26–33), Pentagastrin, Somatostatin
14 und epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) wurden von Sigma (St. Louis,
MO) erhalten. Lyophilisierte Peptide wurden in einer Stammlösung, die
Essigsäure
und Wasser in einem Verhältnis
von 1 : 1 enthielt, auf eine Konzentration von 1 mg/ml aufgelöst, wie vorgeschlagen
durch den Hersteller, und mit sterilem entmineralisiertem Wasser
auf die angezeigten Konzentrationen verdünnt.
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Radioaktive
Gastrinaufnahme
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Um
die markierte Gastrinaufnahme zu beurteilen, wurden Bakterienpellets
in 200 μl
Brucella-Nährlösung, enthaltend
500 nmol/l 125I-markiertes Gastrin (IncStar
Pharmatrade) resuspendiert. Die Inkubation wurde entweder bei 4°C oder bei
37°C für 45 Minuten
durchgeführt.
Die Bakterien wurden dreimal in PBS gewaschen, resuspendiert und
für 30
Minuten in Brucella-Nährlösung, enthaltend
Proteinase K (Promega), in einer Konzentration von 25 ng/ml inkubiert.
Anschließend
wurden die Bakterien gewaschen, in 100 μl BPS resuspendiert, von denen
10 μl auf
Mikrozellulosefilter geblottet wurden, und Autoradiographie für 7 Tage
durchgeführt
wurde. Aufgenommenes 125I wurde unter Verwendung
eines Gammazählers
quantifiziert.
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Kalte Inhibitionsuntersuchung
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Für die kalte
Inhibitionsuntersuchung wurden Bakterienpellets in 200 μl Brucella-Nährlösung, enthalten 500 nmol/l 125I-markiertes Gastrin resuspendiert. Nicht
markiertes Gastrin in steigenden Konzentrationen (1250–5000 nmol/l)
wurde anschließend hinzugefügt. Die
Bakterien wurden für
45 Minuten bei 37°C
inkubiert, wonach sie ausgedehnt mit PBS gewaschen wurden. Der Einbau
von 125I-markiertem Gastrin wurde unter
Verwendung eines Gammazählgerätes bestimmt.
Als Kontrollen wurden Bakterien mit 125I-markiertem
Gastrin (500 nmol/l) in der Anwesenheit von CCK-8, Pentagastrin,
Somatostatin oder EGF in den angezeigten Konzentrationen inkubiert.
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Ergebnisse
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Um
die Wirkung von G17 auf das Wachstum von H. pylori abzuschätzen wurden
die Bakterien mit steigenden Gastrinkonzentrationen wachsen gelassen.
Die Zugabe von Gastrin zu den Wachstumsmedien hatte eine dosisabhängige Wirkung
auf die Wachstumskurve. Gastrin verkürzte die Anlaufphase, erhöhte die
Wachstumsrate in der logarithmischen Phase und steigerte die Endzelldichte
in der stationären
Phase (1A). 1B zeigt
das Wachstum von fünf
unterschiedlichen klinischen Isolaten in der Anwesenheit von Gastrin
zum Zeitpunkt 0 und 48 h. Wie gezeigt, wurde eine ähnliche
Wirkung von Gastrin für
alle fünf
Isolate festgestellt.
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Um
die Spezifität
der Gastrinwirkung zu untersuchen, wurden wachstumskinetische Studien
unter Verwendung eines langsam wachsenden mikroaeorophilen Darmbakteriums
und einem gram-negativen aeroben Darmbakterium durchgeführt. Wie
in 2A–B gezeigt, hatte Gastrin keine Wirkung
auf das Wachstum von Campylobacter jejuni oder Escherichia coli.
Um zu untersuchen, ob andere Peptide auch eine positive Wirkung
auf das Wachstum haben könnten, ähnlich wie
Gastrin auf H. pylori, wurde H. pylori in der Anwesenheit von Somatostatin, das
im Magenantrum produziert wird, und EGF, einem Wachstumsfaktorpeptid,
das in dem Magenlumen gefunden wird, wachsen gelassen. Zusätzlich wurden,
da in Menschen die Gastrin- und CCKB-Rezeptoren homolog sind, die
Gastrin/CCKB-Rezeptoragonisten CCK-8 und Pentagastrin, die eine
strukturelle Homologie zu Gastrin haben, hinsichtlich ihrer Wirkung
auf das Wachstum von H. pylori untersucht. Wie in den 2C–F gezeigt, hatte keines der Peptide eine
Wirkung auf das Wachstum von H. pylori, wodurch gezeigt wird, dass
die positive Wachstumswirkung von Gastrin spezifisch war.
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Um
zu wissen, ob die Aufnahme von Gastrin durch H. pylori spezifisch
war und ob Gastrin durch H. pylori aufgenommen oder an die äußere Oberfläche gebunden
worden war, wurden H. pylori und Kontrollbakterien mit 125I-markiertem
Gastrin bei 4°C oder
bei 37°C
inkubiert. Nach dieser anfänglichen
Inkubation wurden die Bakterien mit Proteinase K co-inkubiert, um
Oberflächenproteine
zu verdauen. Der markierte Gastrineinbau wurde beurteilt durch Autoradiographie
und CPM-Bestimmung. Wie in 3 gezeigt,
war die Aufnahme von Gastrin durch die Bakterien spezifisch für H. pylori,
da keine Markierung mit Kontrollbakterien festgestellt wurde. Weiterhin
baute nur H. pylori, inkubiert bei 37°C, das 125I-markierte
Gastrin ein. Solch eine Temperaturabhängigkeit legt nahe, dass ein
energieabhängiger Mechanismus
für die
Aufnahme von Gastrin verantwortlich ist. Ferner wurde keine Reduktion
bei den radioaktiven Zählungen
nach der Co-Inkubation mit Proteinase K festgestellt (vor der Proteinase-K-Inkubation – 311 CPM,
nach der Inkubation mit Proteinase K – 385 CPM), was nahe legt,
dass das Gastrin in das Bakterium eintrat und folglich vor der Proteinase-K-Verdauung
geschützt
war.
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Um
zu untersuchen, ob Gastrin in das Bakterium durch einen nicht spezifischen
Mechanismus oder durch eine Wechselwirkung mit einer spezifischen
Bindungsstelle eintrat, wurde die Aufnahme von markiertem Gastrin
konkurriert unter Verwendung von nicht markiertem Gastrin und von
Kontrollpeptiden. Wie in 4 gezeigt, konnte die Aufnahme von
markiertem Gastrin durch H. pylori mit einem Überschuss an unmarkiertem Gastrin
inhibiert werden. Ähnlich
zu unmarkiertem Gastrin hemmte die Co-Inkubation der Bakterien in
der Anwesenheit von CCK-8 und Pentagastrin die Aufnahme von markiertem
Gastrin in einer dosisabhängigen
Weise. Im Gegensatz dazu wurde keine Inhibition der Gastrinaufnahme
gezeigt durch EGF oder Somatostatin.
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Die
kalte Ligandenkonkurrenz oder Inhibition der Gastrinaufnahme durch
Peptide, die bekannt sind dafür,
dass sie geteilte Rezeptoren in Menschen aktivieren, das Temperaturprofil
der Gastrinbindung und der Schutz gegen die Proteinase-K-Verdauung, alles
dies legt die innere Lokalisierung eines möglichen Rezeptors oder Kanals
mit spezifischer struktureller Begrenzung nahe.