DE69908120T2

DE69908120T2 - Optisches rastermikroskop mit grossem blickfeld und hoher rastergeschwindigkeit

Info

Publication number: DE69908120T2
Application number: DE69908120T
Authority: DE
Inventors: W. James OVERBECK
Original assignee: Genetic Microsystems Inc
Current assignee: Affymetrix Inc
Priority date: 1998-03-20
Filing date: 1999-03-19
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2019-03-20
Also published as: EP1073926B1; US7312919B2; AU3105199A; EP1073926A1; US20020154396A1; US6335824B1; EP1073926A4; ATE241156T1; US6185030B1; JP2002507763A; CA2324354A1; WO1999047964A1; DE69908120D1

Description

Bei der Mikroskopie für die Wissenschaft der Lebewesen ist es erwünscht, große Gebiete bei hoher Auflösung und annehmbaren Kosten abzutasten.
In der Histologie ist es erwünscht, große Gebiete von Objektträgern abzutasten und zu speichern, die Gewebeproben, Zellkulturen, Anordnungen von diagnostischen Reaktionsmitteln, die Blut ausgesetzt sind, usw. tragen. Typische Objektträger haben ein Betrachtungsgebiet von 2,5 × 7,5 cm.
In der biotechnologischen Forschung ist es erwünscht, eine Mikroskopie mit großem Blickfeld von Gewebekulturen, DNA-Arrays auf Objektträgern, DNA-Chips, aus der Elektrophorese abgesonderte Gelproben usw. durchzuführen.
Ein solches Abtasten erfolgt, um Abbildungen von Objekten zu erzeugen, fluoreszente Emissionen abzutasten oder um große Gebiete oder einzelne, über große Gebiete verteilte Stellen zu beleuchten, zu messen, zu verändern oder in anderer Weise zu behandeln.
Es ist normalerweise erwünscht, die Mikroskopieaufgaben mit so hoher Geschwindigkeit wie möglich, verträglich mit der von dem Objekt empfangenen Lichtmenge, auszuführen.
Das Kombinieren der Mikroskopie. mit großem Blickfeld mit der Hochgeschwindigkeitsmikroskopie kann Telepathologie über Telefonleitungen und Satellit, eine wirksamere Bewertung von Hybri disierungs-Arrays, das optische Vermessen von Restriktionsenzym-Karten, usw. ermöglichen.
Ein besonders wichtiges Potential für die Hochgeschwindigkeits-Mikroskopie mit großem Blickfeld ist das Projekt des menschlichen Genoms. Bis zum Jahr 2005 ist es das Ziel, das gesamte menschliche Genom von etwa 3 Milliarden Nukleotiden, von denen in den ersten fünf Jahren des Projektes nur wenige Millionen sequenziert wurden, zu sequenzieren. Die hierin angeführten Prinzipien, stellen einen Weg zur Verfügung, diese Forschungsarbeiten zu beschleunigen.
Die Hochgeschwindigkeitsabtastung mit großem Blickfeld, verfügbar gemacht in einem Niedrigkosten-System, kann zur Erhöhung der Effektivität von Investitionsausrüstungen und Arbeitskräften nicht nur in den Wissenschaften der Lebewesen und in der biotechnologischen Forschung beitragen, sondern auch in der Halbleiterindustrie und in anderen Technologien, in denen Mikroskopie anwendbar ist.
In dem US-Patent Nr. 5,459,325 offenbaren Hueton u. a. eine Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenz-Abtastvorrichtung. Die Abtastvorrichtung hat die meisten ihrer optischen Komponenten, einschließlich einer Lichtstrahlquelle, eines Detektors und verschiedener Filter, Linsen und Reflektoren, in einer festen Position, entfernt von dem Abtastkopf. Der leichte Abtastkopf enthält einen einzelnen Reflektor und eine Linsenkombination, die sich schnell entlang einer Achse hin- und herbewegt, um einen Bereich des Weges eines gebündelten Anregungsstrahls zu verlängern und zu verkürzen. Der Abtastkopf tastet durch die Hin- und Herbewegung ab, um eine Abtastlinie auf einer Probe unter gleichen Winkeln zu bilden. Die Fluoreszenzemission kann durch die Linse des Abtastkopfes aufgefangen und, allgemein entlang dem Strahlengang des Anregungsstrahls, zu einem Detektor zurück gerichtet werden. Eine andere Ausführung der Abtastvorrichtung ordnet die Lichtquelle in Miniaturform direkt an dem Abtastkopf an. Die Probe kann in einer Achse senkrecht zu der Abtastlinie translatorisch bewegt werden, um die Fluorenszenzemission von einem zweidimensionalen Bereich der Probe zu stimulieren. Die Ausgestaltung der optischen Baugruppe gestattet derzeitig Abtastgeschwindigkeiten bis zu etwa 2,54 Meter/Sekunde (100 Inches pro Sekunde).
In dem US-Patent 5,216,247 offenbaren Wang. u. a. ein optisches Abtastsystem mit kreisbogenförmigen Abtastwegen. Ein optisches Abtastverfahren wird beschrieben, in dem eine Vorrichtung im wesentlichen ein optisches Rotationssystem S und eine Arbeitsebene W umfaßt, die in einer vorbestimmten Richtung zugeführt wird. Das optische System erzeugt das Bild eines ortsfesten Punktes A an dem Punkt B auf der Arbeitsebene W. Der abgebildete Punkt wird entlang eines Kreisbogens abgetastet, indem das optische System um die Drehachse gedreht wird. In einer bevorzugten Vorrichtung liegt der Punkt A etwa auf der Drehachse und der Punkt B beabstandet von der Drehachse. Der Kreisbogen, der durch das Abtasten des Punktes B erzeugt wird, liegt in der Arbeitsebene annähernd senkrecht zu der Drehachse. Ein zweidimensionales Abtasten wird durch das Drehen des optischen Systems um die Drehachse und die Translation der Arbeitsebene in eine vorbestimmte Richtung, die mit der Drehung des optischen Systems synchronisiert ist, durchgeführt. Wenn der Strahlungsstrahl E von dem Punkt A zu dem Punkt B fortschreitet, dient die Vorrichtung zum Einschreiben von Informationen (z. B. Lithographie) und die Arbeitsebene ist ein Aufzeichnungsmedium. Wenn der Strahlungsstrahl E von der Arbeitsebene zu dem Punkt A fortschreitet, dient die Vorrichtung zum Auslesen von Informationen oder zur Erfassung von Mustern, wobei ein Punktdetektor rechts hinter dem Punkt A positioniert ist. Das optische Abtastverfahren kann im sichtbaren, UV-, Infrarot-Wellenband oder im Bereich weicher Röntgenstrahlung angewendet werden. Es stellt gleichzeitig ein großes Blickfeld, eine hohe Auflösung und eine sehr hohe Datenrate zur Verfügung.
In US-Patent 5,610,754 offenbaren Gheen u. a. ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Photolithographie durch Dreh-Abtasten.
Ein Photolithographie-Verfahren kopiert durch ein Rotations-Abbildungssystem eine Musterebene auf eine Arbeitsebene. In einem gegebenen Fall bildet das Abbildungssystem einen kleinen Bereich der Musterebene auf der Arbeitsebene ab. Das Abbildungssystem dreht sich um eine feste Achse senkrecht zu der Musterebene und kopiert bei jedem Durchgang einen bogenförmigen Bereich von der Musterebene auf die Arbeitsebene. Die synchronisierte Translation der Musterebene und der Arbeitsebene in Verbindung mit der Drehung des Abbildungssystems erlaubt es, die gesamte Musterebene auf die Arbeitsebene zu kopieren. Das Photolithographie-Verfahren kann über ein grofles Blickfeld bei hoher Schreibgeschwindigkeit eine hohe Auflösung erreichen und es kann ein Autofokus-System aufweisen, um Veränderungen in der Ebenheit der Arbeitsebene zu berücksichtigen. Dieses Photolithographie-Verfahren kann in sichtbaren, Ultraviolett-, Infrarot- oder Röntgenstrahl-Wellenbändern angewendet werden.
In dem US-Patent 5,224,088 offenbart Atiya eine optische Abtastvorrichtung mit hoher Auflösung. Die optische Abtastvorrichtung besteht aus einer Linse mit hoher numerischer Apertur, die am Ende eines flexiblen Auslegers montiert ist. Die Linse tastet entlang einer gekrümmten Linie ab, wenn sich der Ausleger biegt. Damit der Strahlengang der Linsenposition folgen kann, ist an dem Ausleger an einer Stelle, die bei etwa 20% der Auslegerlänge, gemessen von dem festen Montagepunkt, liegt, ein Spiegel angebracht. Wenn sich der Ausleger biegt, beträgt der Winkel an dieser Stelle der Hälfte des Winkels am Auslegerende. Da der Spiegel diesen Winkel verdoppelt, wenn er den Eingangsstrahl reflektiert, folgt der Eingangsstrahl der Linse und bleibt am Ende des Auslegers parallel zu dieser. Dieser Typ einer Abtastvorrichtung ist insbesondere in einer resonanten Betriebsweise geeignet, da die Auslegerform eine geringe Eigendämpfung aufweist.
In dem US-Patent 4,861,144 offenbart Russel ein optisches System, das zur Verfügung gestellt wird, um eine Bildfeldkorrekturvorrichtung zu bilden. Das System weist einen durch einen Motor angetriebenen Drehträger auf. Eine Vielzahl von Fokussierlinsen ist über den Umfang um die Drehachse des Trägers beabstandet vorgesehen. Wenn sich der Träger dreht, bewegt sich jede Fokussierlinse aufeinanderfolgend in einem gekrümmten Weg über ein Aufzeichnungsmedium. Der Träger ist weiterhin mit einem pyramidenförmigen Verteilungsspiegel versehen, der eine Anzahl von reflektierenden Oberflächen aufweist. Jede reflektierende Oberfläche des Verteilungsspiegels ist einer der fokussierenden Linsen zugeordnet. Der pyramidenförmige Verteilungsspiegel ist auf der Mitte des Trägers montiert und empfängt einen optischen Strahl an einer seiner reflektierenden Oberflächen. Der optische Strahl wird zu der reflektierenden Oberfläche geleitet, die der fokussierenden Linse, welche sich über das Aufzeichnungsmedium in einer Ebene bewegt, welche die Drehachse des Trägers einschließt, zugeordnet ist. Der optische Strahl wird ebenfalls unter einem Winkel zu der Drehachse zu der reflektierenden Oberfläche geleitet. Eine Bildfeldkorrekturlinse empfängt den reflektierten Strahl von der reflektierenden Oberfläche und bricht den optischen Strahl, so dass er nach dem Austreten aus der Bildfeldkorrekturlinse einem Weg folgt, der während der gesamten Bewegung der fokussierenden Linse über das Aufzeichnungsmedium mit einer radialen Linie übereinstimmt, die sich von der Drehachse des Trägers zu der optischen Achse der fokussierenden Linse erstreckt. Ein Verfahren zum Ausrichten eines optischen Strahls, der auf die optische Achse einer fokussierenden Linse auftrifft, ist ebenfalls vorgesehen.
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Hochgeschwindigkeits-Rastermikroskop mit großem Blickfeld und ein Verfahren der Hochgeschwindigkeits-Rastermikroskopie mit großem Blickfeld zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch das Rastermikroskop, welches die Merkmale des Anspruchs 1 oder des Anspruchs 25 aufweist und durch das Verfahren von Anspruch 26 erfüllt.
Gemäß einer der vorliegenden Varianten ist zu erkennen, dass die Mikroskopie mit großem Blickfeld sowie die Hochgeschwindigkeits- Mikroskopie praktisch durch Einbeziehen einer Mikroobjektivlinse in eine Abtaststrukur mit geringem Trägheitsmoment mit begrenzter Rotation realisiert werden kann. Wenn X-, Y-Rasterformate erwünscht sind, werden die von den Abtastbögen erfassten Daten zu gleichmäßig beabstandeten Datenpunkten in einem X-, Y-Rasterformat interpoliert. Durch dieses System können Bilder aus sowohl Makro- als auch Mikroskopie-Perspektiven in sehr effektiver Weise gebildet, manipuliert, gezoomt und analysiert werden. "Mikrolinse", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Linsenanordnungen, die weniger als 2 g wiegen und ein einzelnes Linsenelement mit einem Gewicht enthalten, das wesentlich geringer als 1 g ist. "Mikroobjektiv", wie hierin verwendet, bezieht sich auf bewegbare Mikrolinsen, die entweder das Objektiv oder den ersten Teil eines Multielement-Objektivs bilden, in welchem die anderen Elemente ortsfest sind.
Eher kontra-intuitiv ist ermittelt worden, dass ein "in seiner Klasse führendes" Mikroskop mit großem Blickfeld oder ein Hochgeschwindigkeits-Mikroskop durch Verwendung einer Antriebsvorrichtung mit begrenzter Rotation oder eines Galvanometers, das eine aspärische Abtast-Mikroobjektivlinse mit extrem kleinen Blickfeld trägt, gebildet werden kann.
Mikrolinsen und insbesondere asphärische Mikrolinsen weisen ein grundlegendes Merkmal auf, durch welches sie sich von herkömmlichen Mikroskopobjektiven unterscheiden. Sie sind in der Lage, sich nur auf einen sehr kleinen Punkt zu fokussieren, während kommerzielle Mikroskopobjektive mit hoher Vergrößerung, die Technologien mit begrenzter Rotation verwenden, normalerweise auf einen Bereich von mehr als 100 Mikrometer fokussieren.
Wenn es auch für die drehend oszillierende Struktur möglich ist, welche die Mikrolinse trägt, ihre eigene Lichtquelle zu tragen, bleiben in den hier bevorzugten Fällen die Lichtquelle und die Detektoranordnungen ortsfest und stehen mit dem rotierenden Objektiv durch eine Periskopanordnung in Verbindung, die ein Paar Reflektoren auf der sich drehenden Struktur mit geringem Trägheitsmoment aufweist.
Die Rotations-Mikrolinse kann Abbildungsfehler-Wirkungen durch Betrieb auf der Achse und durch Verwendung eines einzigen optischen Linsenelements oder von sehr wenigen optischen Linsenelementen in der Rotationsanordnung vermeiden. Chromatische Abbildungsfehler werden bei Verwendung von solchen Mikrolinsen durch Manipulation der verschiedenen Wellenlängen in dem ortsfesten Teil der optischen Wegstrecke vermieden. Die Lichtstrahlen verschiedener Wellenlängen werden dazu gebracht, sich an verschiedenen Punkten in der optischen Wegstrecke in einer kompensierenden Beziehung zu fokussieren, die vorbestimmt ist, um die Charakteristik der chromatischen Abbildungsfehler der Mikrolinse zu kompensieren.
Bei Anwendungen der neuen Technologien auf die Fluoreszenzmikroskopie ist eine Mikroobjektivlinse, die für das Abtasten mit begrenzter Rotation montiert ist und eine große numerische Apertur aufweist, wirksam, um die Fluoreszenzwellenlänge mit geringer Intensität in einer kosteneffektiven Weise zu sammeln.
Wenn auch verschiedene Typen der Beleuchtung bei Mikroskopen verwendet werden können, welche die behandelten Prinzipien verwenden, ist es vorteilhaft, Laserbeleuchtung für die Transmissions- und Reflexionsmikroskopie und in Fluoreszenz-Leseeinrichtungen zu verwenden. Die neuen Technologien sind in einigen Fällen mit einem einzigen Farblaser vorteilhaft. Mit mehreren Lasern, die zwei oder drei oder mehr Farben erzeugen, ist es möglich mehrere Durchläufe über das Objekt auszuführen, z. B. einen für jede Farbe. Vorteilhaft ist jedoch, wenn die Untersuchung aller Farben gleichzeitig durchgeführt wird, um die gesamte chromatische Untersuchung in einem Durchgang auszuführen.
Die Grundidee ist, eine winzige Linse mit geringer Masse, vorzugsweise eine asphärische Linse, die in einer Anordnung mit begrenzter Rotation und geringem Trägheitsmoment für eine sich auf der Achse drehende Abtaststruktur zu verwenden, in der verschiedene Linsen verwendet werden können. Wenn auch eine handelsübliche Glaslinse, die für die Faseroptik-Kommunikation mit Hilfe einer Gel-Formtechnologie, entwickelt von Corning, hergestellt ist vorgeschlagen wurde, können für die vorliegenden praktischen Fälle die Rotationslinsen aus Akryl- oder Styrenharz unter Verwendung gut bekannter Linsenausgestaltungen sowie Formtechnologien und Schleif-, Bearbeitungs- und Poliertechniken usw. gebildet sein.
Für viele interessierende Systeme beträgt ein effektives Blickfeld für das Rastermikroskopsystem mit begrenzter Rotation wenigstens 1 cm² und vorzugsweise 2,5 × 7,5 cm² (1 × 3 Inch) oder für große Mikroskopobjektträger oder Ähnliches 7, 5 × 10 cm² (3 × 4 Inch) oder größer.
Die dem mikroskopischen Bedarf angepasste Auflösung kann leicht erreicht werden. In einigen dermatologischen Anwendungen kann sich zum Beispiel jemand dafür interessieren, Zellen mit Abmessungen von 5 oder 50 Mikrometern zu betrachten. In diesem Fall ist eine Mikrolinse mit einer Auflösung von 1 Mikrometer oder größer erwünscht.
Für die meisten praktischen Anwendungen des Hochgeschwindigkeits-Abtastens mit großem Blickfeld und begrenzter Rotation, bei denen eine große Menge von erfasster Strahlung vorhanden ist, ist die numerische Apertur (NA) des Abtastobjektivlinsenelements nicht kleiner als etwa 0,5.
Bei Fluoreszenzanwendungen sind die erfassten Lichtstärken geringer und es gelten andere Betrachtungsweisen als bei der Abbildung. NA-Werte über 0,6 und so groß wie 0,7 oder 0,8 und sogar 0,9 nahe dem theoretischen Limit in Luft sind erreichbar und von wesentlichem Vorteil. Die Beleuchtungspunktgröße bei Fluoreszenzerfassung ist in den bevorzugten Ausführungen relativ groß, zwischen 1 und 15 Mikrometer, und die Energiesammlungsfähigkeit der Linse, bezogen auf die numerische Apertur, ist wichtig. Eine aspärische Linse mit begrenzter Drehung mit einer NA von 0,8 ist gegenüber einer Linse mit einer numerischen Apertur von 0,5 dreimal so vorteilhaft hinsichtlich der Lichtsammlung. Somit sind, wenn auch große Beleuchtungspunktgrößen bei der Fluoreszenzmikroskopie mit begrenzter Rotation zur Anwendung kommen, die asphärischen Mikrolinsen mit großer numerischer Apertur besonders in Niedrigkostenanwendungen mit relativ hoher Geschwindigkeit von beträchtlicher Bedeutung.
Eine andere hier vorgestellte Variante ist die Verwendung eines ortsfesten Periskops mit der Dreh-Abtaststruktur, das sich bis dicht über das Objekt erstreckt, um Licht von der ortsfesten Quelle zu einem ortsfesten Spiegel entlang der Drehachse zu einem Reflektor auf der Drehanordnung und dann zu der sich drehenden Objektivlinse zu leiten.
Für viele Anwendungen ist es vorteilhaft, das Objekt kontinuierlich unter dem Abtastkopf mit begrenzter Rotation zu bewegen. Eine andere hierin angeführte Variante bezieht sich auf die Verringerung der Abtastüberlappungsineffektivitäten in einem solchen System durch Einführung von Kompensationsbewegungen des Strahls relativ zu der sich drehenden Linse. Wenn eine Objektivlinse in einem kreisförmigen Bogen hin- und herbewegt wird und das Objekt darunter relativ kontinuierlich translatorisch bewegt wird (durch Translation des Objekts oder Translation der Achse der Drehstruktur), erscheint ein allgemein dreieckiges, gekrümmtes Muster auf dem Objekt und das Objekt wird nicht gleichmäßig abgetastet, wenn das Bild sowohl in Abtastungen im Uhrzeigersinn (cw) als auch entgegen dem Uhrzeigersinn (ccw) erfasst wird. Wenn zum Beispiel die gleichmäßige Lichtpunktgröße so ist, dass sich der Lichtpunkt in der Mitte des Abtastbogens, ausgerichtet mit der Translationsrichtung, den Weg des Lichtpunkts bei der nachfolgenden Abtastung berührt, überlappen sich die Abtastungen beträchtlich in Richtung zu den Scheitelpunkten des gekrümmten, dreieckförmigen Wellenmusters, während in den divergenten Bereichen des Musters Objektbereiche von den Erfassungsbögen ausgelassen werden. Es wird eine Kompensationsbewegung für den Licht weg in dem Drehsystem eingeführt, um zu bewirken, dass die aufeinanderfolgenden Abtastwege einen im Wesentlichen gleichmäßigen Abstand über ihre gesamte nützliche Länge aufweisen. Das wird durch radiale Bewegung des Strahls relativ zu der Objektivlinse erreicht, wenn diese sich dreht, wobei die Objektivlinse ausgewählt ist, ein Blickfeld von mindestens der doppelten Größe des Lichtpunkts oder mehr aufzuweisen, so dass der Strahl über den gesamten Kompensationsverlauf auf der Linse verbleibt. So wird zum Beispiel für einen fokussierten Lichtpunkt mit einem Durchmesser von 5 Mikrometern eine Objektivlinse mit einem minimalen Blickfeld von 10 Mikrometern, plus jeden Betrag, der das Ausrichten erleichtert, verwendet.
Eine einfache Vorrichtung zum Erzielen der Kompensationsbewegung ist ein schwingender Schwenkspiegel, der in dem stationären Strahlengang zu der Drehstruktur angeordnet ist. Ein piezo-elektrisches Kristall setzt den Spiegel in Synchronisation mit den Drehschwingungen des Arms in Schwingungen. Das bewirkt, dass der Strahl radial auf der Linse schwingt, während sich der Arm dreht. Anstelle eines piezo-elektrischen Schwenkspiegels können andere reflektierende Vorrichtungen in Schwingungen versetzt werden oder die Kompensationsbewegung kann in den Strahlenweg durch andere Einrichtungen eingeführt werden, zum Beispiel durch akustisch-optische Deflektoren, Drehkurbeln oder andere durch Motoren angetriebene sich bewegende Verbindungen.
Das Schwenkmerkmal kann in verschiedenen anderen Wegen verwendet werden, zum Beispiel um Mehrfachabtastungen des Objekts zu ermöglichen, während das Objekt relativ zu der Achse des Abtastarms unbeweglich ist.
Eine andere hierin angeführte Variante ist ein effektives Interpolationsschema und ein Algorithmus, der die abgetasteten Bogendatenwerte entlang den bogenförmigen Abtastlinien in gleichmäßig beabstandete Funkte eines Rasterformats umwandelt.
Die spezifischen Konstruktionsmerkmale der gegenwärtig bevorzugten Ausführungen sind ebenfalls einzigartig und stellen Beiträge zur Mikroskoptechnik dar. Wenn auch Spiegel mit geringer Masse in dem Bewegungssystem verwendet werden, ist zu erkennen, dass andere Reflektoren, wie zum Beispiel Prismen und andere mechanische und elektronische Systeme unter Verwendung der hier vorgestellten Konzepte verwendet werden können.
Neben biologischen Anwendungen und Anwendungen in der Wissenschaft der Lebewesen, finden bestimmte der Konzepte in der Silizium-Vorrichtungs-Industrie Anwendung, zum Beispiel um die Beziehungen von Merkmalen einer elektronischen Vorrichtung zu inspizieren, wie zum Beispiel die Inspektion der Koplanarität von Merkmalen auf einem Halbleiterchip, wie zum Beispiel eine Kugelgitteranordnung, die verwendet wird, um elektrische Verbindungen zu dem Chip herzustellen.
Durch Kombinieren einer konfokalen Anordnung mit der begrenzten Drehung des beschriebenen Mikroskops ermöglicht die sehr geringe Tiefe des erreichten Feldes die Überprüfung, dass alle Zweige einer Silizium-Vorrichtung koplanar sind, wobei alle Daten für den gesamten Chip schnell in einer Erfassung (eine Abtastfolge mit großem Blickfeld) erfasst werden. Gleichermaßen kann eine dreidimensionale Abbildung der Merkmale der Silizium-Vorrichtungen, von lebenden Zellen oder anderen Objekten durchgeführt werden.
Gemäß einer Variante ist in einem Rastermikroskop mit großem Blickfeld und begrenzter Rotation für die Überprüfung einer Oberfläche eines Objekts eine Abtastanordnung vorgesehen, die eine oszillierende Drehträgerstruktur, die mit einem Antrieb versehen ist und so aufgebaut ist, dass sie sich in einer periodischen Bewegung über das zu betrachtende Objekt auf einem vorgegebenen Abtastweg in einem Abtastbereich von wenigstens 1 mm bewegt, eine Mikroobjektivlinse aufweist, die an der oszillierenden Drehträgerstruktur angebracht ist, wobei die Mikroobjektivlinse dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein Gewicht von weniger als etwa 2 Gramm hat, die Linse auf der Drehträgerstruktur mit ihrer Achse senkrecht zu der Oberfläche des Objekts für das im Wesentlichen auf der Achse Abtasten über den bogenförmigen Abtastbereich montiert ist und der Antrieb für die Trägerstruktur angepasst ist, diese oszillierend zu bewegen, um eine Abtastung des Objekts auf der Achse zu bewirken.
Die bevorzugten Ausfühxungen dieses Aspektes weisen eines oder mehrere der folgenden Merkmale aufzuweisen.
Ein Reflexionssystem ist an der Drehträgerstruktur angebracht, um einen Lichtweg zu definieren, der mit der Mikrolinse entlang der Linsenachse in Verbindung steht, wobei das Reflexionssystem aufgebaut ist, um diesen Strahlengang in optischer Verbindung mit einem ortsfesten optischen System über einen Lichtweg von festgelegter Länge über den Bewegungsbereich der oszillierenden Drehträgerstruktur aufrechtzuerhalten.
Die Mikroobjektivlinse ist eine assphärische Linse.
Die Mikroobjektivlinse bildet das gesamte Objektiv des Mikroskops oder es wirkt mit ortsfesten optischen Elementen zusammen, um das Objektiv des Mikroskops zu bilden.
Die oszillierende Anordnung hat ein Trägheitsmoment von weniger als 25 g cm².
Die ortsfeste Optik erzeugt wenigstens zwei Strahlen verschiedener Wellenlänge und ein Vereinigungssystem ist aufgebaut, um die Strahlen in einem einzigen beleuchtenden Strahl zu vereinigen, der auf die Mikroobjektivlinse gerichtet ist. Vorzugsweise ist, wenn die Mikroobjektivlinse einen charakteristischen chromatischen Abbildungsfehler aufweist, wenigstens eine Vorrichtung in den Weg von wenigstens einem der Strahlen einbezogen, um zu bewirken, dass Strahlen einer Wellenlänge sich an einem Punkt fokussieren, der von dem Brennpunkt der Strahlen anderer Wellenlänge unterschiedlich ist, wobei die verschiedenen Fokussier kennwerte in Beziehung auf die chromatische Abbildungsfehlercharakteristik der Objektivlinse vorbestimmt sind, um durch die Objektivlinse einen Brennpunkt der jeweiligen Wellenlängen an demselben Punkt des Objektes zu ermöglichen.
Eine andere Variante ist ein Rastermikroskopsystem mit großem Blickfeld und begrenzter Rotation, welches die beschriebene, sich drehende Mikrolinsenanordnung, kombiniert mit einem Translationssystem zur Erzeugung einer relativen linearen Bewegung über einen Translationsbereich eines abzutastenden Objekts relativ zu der Drehträgerstruktur aufweist, wobei die Richtung der Translation im Wesentlichen senkrecht zu dem Mittelbereich des begrenzten Drehabtastwegs liegt.
Bevorzugte Ausführungen dieses Objekts weisen eines oder mehrere der folgenden Merkmale auf.:
Das Mikroskopsystem ist so aufgebaut und angepasst, um ein Bildgebiet von wenigstens 1 cm² der untersuchten Oberfläche aufzuzeichnen, wobei die numerische Apertur der Linse, ihr Blickfeld, der Abtastbereich und der Translationsbereich in Kooperation so ausgewählt sind, um für eine gegebene Wellenlänge wenigstens eine Million Bildelemente pro cm² des abgetasteten Gebiets zu erzeugen.
Das Rastermikroskop mit großem Blickfeld ist aufgebaut, um Bilder in einer Transmissions- oder Reflexionsbetriebsweise zu erzeugen, wobei die numerische Apertur der Mikroobjektivlinse wenigstens etwa 0,5 beträgt.
Vorzugsweise ist das Blickfeld der Mikroobjektivlinse kleiner als 25 Mikrometer und in vielen Fällen kleiner als etwa 10 Mikrometer. Das Rastermikroskop mit großem Blickfeld ist aufgebaut, um Fluoreszenz zu erfassen, die durch einen durch die Mikroobjektivlinse laufenden Lichtpunkt stimuliert wird, wobei die numerische Apertur des Abtastobjektivlinse größer ist als 0,6 und vorzugsweise das Blickfeld der Mikroobjektivlinse kleiner ist, als etwa 25 Mikrometer.
Das Mikroskopsystem ist als ein Transmissionsmikroskop aufgebaut, wobei die ortsfeste Optik wenigstens eine ortsfeste Lichtquelle aufweist, die dazu ausgestaltet ist, um Licht für die Mikroobjektivlinse bereitzustellen, um einen Punkt auf dem betrachteten Objekt zu beleuchten, und ein Detektorsystem ist auf der gegenüberliegenden Seite des betrachteten Objekts angeordnet.
Das Mikroskopsystem ist als ein Reflexionsmikroskop aufgebaut, wobei die ortsfeste Optik wenigstens eine ortsfeste Lichtquelle aufweist, die dazu ausgestaltet ist, um Licht für die Mikroobjektivlinse bereitzustellen, um einen Punkt auf dem betrachteten Objekt zu beleuchten, und ein Detektorsystem ist angeordnet, um über die Mikroobjektivlinse Licht zu empfangen, das von dem Bereich reflektiert wird, der durch die Objektivlinse beleuchtet wird.
Das Mikroskopsystem ist aufgebaut, um als ein Fluoreszenzabtaster zu funktionieren, wobei die ortsfeste Optik wenigstens eine ortsfeste Lichtquelle aufweist, die dazu ausgestaltet ist, um Licht für die rotierende Mikroobjektivlinse mit einer Wellenlänge bereitzustellen, die vorbestimmt ist, um ein möglicherweise in dem Objekt vorhandenes Fluorophor zu erregen, um einen Punkt auf dem abgetasteten Objekt zu beleuchten, und ein Detektorsystem ist angeordnet, um über die Mikroobjektivlinse fluoreszierendes Licht von dem Fluorophor einer anderen Wellenlänge aufzunehmen, als die, welche von dem durch die Mikroobjektivlinse beleuchteten Bereich ausgestrahlt wird.
Das Mikroskopsystem ist aufgebaut, um zu erfassendes Licht auf eine Lochblende abzubilden, die einem Detektor vorangeht, um als ein Konfokalmikroskop zu dienen. Vorzugsweise weist die Objek tivlinse bei dieser Anordnung eine numerische Apertur auf, die größer als 0,6 ist.
Das Mikroskop als ein Fluoreszenzabtaster ist so aufgebaut und angeordnet, dass die Mikroobjektivlinse einen beleuchtenden Punkt mit einem Durchmesser zwischen etwa 1 bis 50 Mikrometer auf das Objekt projiziert, wobei die Mikroobjektivlinse eine numerische Apertur von etwa 0,6 oder größer für das Sammeln einer fluoreszenten Strahlung mit relativ geringer Intensität aufweist.
Die Drehachse der Drehträgerstruktur des Rastermikroskops ist ortsfest und das Translationssystem zum Bewirken der relativen linearen Bewegung weist eine Linearstufe auf, die so aufgebaut ist, um das zu betrachtende Objekt unter der oszillierenden Drehstruktur zu bewegen.
Das Rastermikroskop hat eine ortsfeste Optik, die einen Reflektor, der auf der Drehachse der Drehstruktur angeordnet ist, und einen Reflektor an der Drehstruktur aufweist, der auf der Drehachse angeordnet ist, wobei die beiden Reflektoren über den Bereich der Drehung der oszillierenden Drehstruktur in einem Strahlengang zwischen der ortsfesten Optik und der abtastenden Objektivlinse angeordnet sind. Vorzugsweise weist die ortsfeste Optik einen Detektor auf, um Licht zu erfassen, das durch die rotierende Mikroobjektivlinse von dem abgetasteten Objekt gesammelt wird.
Vorzugsweise weist die ortsfeste Optik wenigstens eine ortsfeste Lichtquelle auf, die dazu ausgestaltet ist, um Licht für die Mikroobjektivlinse bereitzustellen, um einen Punkt auf dem betrachteten Objekt zu beleuchten.
Das Rastermikroskopsystem weist eine ortsfeste Optik auf, die eine strahlengangablenkende Einrichtung enthält, die aufgebaut ist, um den Bereich der Mikroobjektivlinse, der im Strahlengang liegt, zu variieren. In bestimmten bevorzugten Ausführungen ist dieses Merkmal mit einem Translationssystem in der Weise kombiniert, dass die strahlengangablenkende Einrichtung die Relation der aufeinanderfolgenden Abtastwege auf dem abgetasteten Objekt einstellt. Vorzugsweise wird in Systemen, in welchen das Objekt sowohl bei einer Drehung der oszillierenden Drehträgerstruktur im Uhrzeigersinn als auch entgegen dem Uhrzeigersinn abgetastet wird, die Einstellung in dem Sinne durchgeführt, um den Abstand zwischen den Mittenlinien aufeinanderfolgender Abtastwege entlang der Länge des Abtastweges gleichmäßiger zu machen.
Die strahlengangablenkende Einrichtung für ein Mikroskopsystem ist ein Schwenkreflektor, der synchron mit der oszillierenden Drehträgerstruktur angetrieben wird, wobei diese Einrichtung vorzugsweise ein Schwenkspiegel ist.
Die strahlengangablenkende Einrichtung ist ein akustisch-optischer oder elektro-optischer Deflektor, der synchron mit der oszillierenden Drehträgerstruktur angetrieben wird.
Das Rastermikroskop mit großem Blickfeld weist einen Positionsdetektor zum Erfassen der Position der oszillierenden Anordnung und ein Datensammlungssystem auf, das Daten an ausgewählten Positionen, die von dem Positionsdetektor bestimmt werden, sammelt. Vorzugsweise weist ein Steuersystem für die Antriebseinrichtung einen Servoregelkreis auf, welcher den Positionsdetektor einschließt. Weiterhin ist der Positionsdetektor vorzugsweise auch direkt mit der oszillierenden Drehträgerstruktur verbunden, um seine Position direkt zu bestimmen und vorzugsweise ist die Antriebseinrichtung ein Elektromotor, der durch einen Servoregelkreis geregelt wird, welcher durch die direkt bestimmte Position der oszillierenden Drehträgerstruktur geregelt wird.
Die Mikroobjektivlinse des Rastermikroskops mit großem Blickfeld ist von dem Drehzentrum der Trägerstruktur mehr als 1 cm beabstandet und das Trägheitsmoment der Drehstruktur, ausschließlich des Rotors des Antriebs, liegt in der Größenordnung von etwa 25 g·cm², zum Beispiel von 30 g·cm². vorzugsweise erzeugt die Oszillationsfrequenz der oszillierenden Drehstruktur, kombiniert mit einem Translationssystem, mehr als 10 Abtastlinienerfassungen pro Sekunde. Vorzugsweise beträgt der radiale Abstand 2,5 cm oder mehr.
Das Rastermikroskop hat die Form eines Transmissions- oder Reflexionsmikroskops, in welchem der Antrieb für die oszillierende Drehstruktur mit einer Frequenz in der Größenordnung von 50 Hz oder mehr oszilliert.
Das Rastermikroskop mit großem Blickfeld weist ein Datensammlungs-Steuersystem auf, welches das Sammeln der Daten während der Abtastbewegung zeitlich steuert, um die Datensammlungspunkte mit den Zeilen eines vorbestimmten rechtwinkligen Rastergitters auszurichten. Vorzugsweise wandelt das Datensystem die Daten in das Rastergitter um, indem für jeden Punkt auf dem Gitter der wert jeder der beiden Datenpunkte in der Rasterzeile an jeder Seite des Rasterpunktes Bemittelt wird, wobei die Werte mit ihren jeweiligen Abständen von dem fraglichen Gitterpunkt gewichtet werden.
Gemäß einer andere Variante weist ein Rastermikroskop mit begrenzter Rotation zum Untersuchen eines Objekts in Kombination auf: eine assphärische Mikroobjektivlinse, die entweder als ganzes Objektiv oder als bewegliches Element einer Multielement-Objektivlinse dient, und die ein Blickfeld, das kleiner ist als etwa 20 Mikrometer, und eine numerische Apertur aufweist, die größer als 0,5 ist, einen die Linse tragenden Arm, der angebracht und angetrieben ist, sich in einem Bogen in einer oszillierenden Bewegung um eine Achse zu drehen, die senkrecht zu der allgemeinen Ebene des zu untersuchenden Objekts liegt, wobei die Mikroobjektivlinse an dem Arm in einer Position angebracht ist, die von der Drehachse des Arms beabstandet ist, so dass die Mikroobjektivlinse durch die Drehung des Arms in einem Bogen abtastet, wobei die Achse der Mikroobjektivlinse senkrecht zu der zu untersuchenden Oberfläche liegt, die Drehachse stationär angeordnet ist, einen Translationsmechanismus, der angeordnet ist, die zu untersuchende Oberfläche unter der sich drehenden Mikroobjektivlinse translatorisch zu bewegen, und eine Lichtquelle, die an einem ortsfesten Träger angebracht ist und mit den optischen Elementen verbunden ist, die einen Strahlengang für das Licht von der Lichtquelle zu der Mikroobjektivlinse und somit zu einem Fleck auf der zu untersuchenden Oberfläche bilden.
Die bevorzugten Ausführungen dieses Aspektes weisen eines oder mehrere der folgenden Merkmale auf: Das Rastermikroskop weist eine Lichtquelle auf, die an einem ortsfesten Träger angebracht ist und mit optischen Elementen verbunden ist, die einen Strahlengang für das Licht von der Lichtquelle zu der Mikroobjektivlinse und somit zu einem Fleck auf der zu untersuchenden Oberfläche bilden.
Das Rastermikroskop hat die Form eines Transmissionsmikroskops, wobei das Licht, das von einem Fleck durch die Mikroobjektivlinse und das Objekt fällt, den Detektor erreicht.
In anderen Formen des Rastermikroskops fällt das Licht von einem Fleck durch die Mikroobjektivlinse zu dem Objekt und kehrt durch die Mikroobjektivlinse zu einem Detektor zurück. In bestimmten Fällen ist ein solches Rastermikroskop aufgebaut, um fluoreszierendes Licht von dem Objekt abzutasten.
Das Rastermikroskop weist ein Steuersystem zum Bewirken einer koordinierten Drehung und Translation des Objekts auf, wobei das Mikroskop so aufgebaut ist, um Daten von Abtastwegen aufzunehmen, die während der Drehung des Arms im Uhrzeigersinn und entgegen dem Uhrzeigersinn erzeugt werden, wobei das Steuersystem ein Kompensationssystem umfasst, das die Beziehung zwischen der Bewegung der Mikroobjektivlinse und der Translation des Objekts in einer Weise variiert, die tendentiell dazu führt, den Abstand zwischen den Mittenlinien aufeinanderfolgender Abtastlinien im Wesentlichen gleichmäßig zu machen. Vorzugsweise variiert das Kompensationssystem die Position des von einer ortsfesten Lichtquelle herrührenden Strahlengangs auf der Mikroobjektivlinse und vorzugsweise weist das Kompensationssystem einen Schwenksspiegel auf.
In jedem der vorher beschriebenen Mikroskopsysteme, das einen Tisch zur Aufnahme des Objekts verwendet, ist der Tisch vorzugsweise mit drei einstellbaren Hebeeinrichtungen verbunden, um den Tisch zum Fokussieren anzuheben, abzusenken und zu kippen und ein Steuersystem ist dazu aufgebaut, um eine vorabtastung des Objekts durchzuführen, bei der Daten betreffend der Orientierung gespeichert werden und ein Steuersystem, das auf die gespeicherten Daten reagiert, wirkt dazu, die Hebeeinrichtungen bei fortlaufender Abtastung zu betätigen, um das Objekt im Brennpunkt zu halten.
In den vorher beschriebenen Mikroskopsystemen, in denen die Mikroobjektivlinse der bewegbare Teil einer Multi-Element-Objektivlinse ist und die anderen optischen Elemente ortsfest sind, wirken alle optischen Elemente zusammen, um in einer Weise zusammenzuwirken, die der einer herkömmlichen Multi-Element-Objektivlinse gleicht. Die ortsfesten optischen Elemente können mit der bewegbaren Mikroobjektivlinse zusammenwirken, um das Sammeln der Energie und die Übertragung zu dem Lichtsensor zu optimieren.
Eine andere Variante umfasst allgemein eine Schwenkspiegelkonstruktion mit einem Spiegel, der an einem Biegeelement angebracht ist, und ein Piezo-Kristallelement ist mit dem Spiegel in der weise verbunden, um eine Auslenkung des Spiegels an seinem Biegeelement zu bewirken. Der Schwenkspiegel wird vorzugsweise in den verschiedenen beschriebenen Rastermikroskopen und Verfahren verwendet.
Eine andere Variante umfasst allgemein ein Verfahren zum Abtasten eines Objekts in einer Weise, dass ein Abbildung gebildet wird, indem eine Linse mit einer Masse von weniger als etwa 2 Gramm in einer Abtastbewegung bewegt wird, direkt die Position der Linse erfasst wird, während Licht von dem Objekt gesammelt wird und die erfassten Daten basierend auf den Positionen, die direkt zur Zeit des Abnehmens der Daten erfasst sind, ausgewertet werden.
Eine andere Variante umfasst allgemein ein Verfahren zum Abtasten eines Objekts, welches das Drehen einer Linse auf einem Arm in Abtastbögen über einem Objekt verwendet, das sich relativ zu der Achse translatorisch bewegt, einschließlich des Auslenkens des Strahlengangs relativ zu der Linse in einer Kompensationsbewegung, die tendentiell dazu führt, den Abstand zwischen benachbarten Abtastlinien auf einem sich vorwärtsbewegenden Objekt im Wesentlichen gleichmäßig zu machen.
Eine andere Variante umfasst allgemein ein Rastermikroskop mit einer Mikroobjektivlinse, die angebracht ist, um sich in einer Abtastbewegung über ein Objekt zu bewegen, einer ortsfesten Optik, die wenigstens zwei Strahlen unterschiedlicher Wellenlänge erzeugt und mit einem Vereinigungssystem, das dazu aufgebaut ist, um die Strahlen in einen einzelnen beleuchtenden Strahl zu vereinigen, der auf die Mikroobjektivlinse gerichtet ist, wobei die Mikroobjektivlinse eine charakteristische chromatische Aberration hat und eine Einrichtung in dem Strahlengang von wenigstens einem der Strahlen liegt, um zu bewirken, dass Strahlen einer Wellenlänge auf einem Punkt fokussiert werden, der von dem Brennpunkt der anderen Wellenlänge verschieden ist, wobei die unterschiedlichen Fokussierungseigenschaften der Wellenlängen vorherbestimmt in Beziehung mit den chromatischen Eigenschaften der Mikroobjektivlinse sind, um die Fokussierung der betreffenden Wellenlängen durch die Mikroobjektivlinse auf das Objekt zu ermöglichen.
In bestimmten bevorzugten Ausführungen wirken ortsfeste optische Elemente mit der Mikroobjektivlinse zusammen, die auf dem drehbaren, oszillierenden Arm angeordnet ist, um ein effektives Objektiv des Systems zu bilden.
Eine andere Variante umfasst allgemein ein Dreh-Abtastsystem, das eine bogenförmige Abtastbewegung erzeugt und das eine Datensammlungssteuerung umfasst, die dazu ausgelegt ist, um die Datensammlung während der bogenförmigen Abtastbewegung zeitlich zu steuern, um die Datensammlungspunkte mit Zeilen eines vorgegebenen Rastergitters auszurichten, auf das die Daten konvertiert werden. Vorzugsweise weist dieses System ein Datenkonversionssystem auf, das dazu ausgelegt ist, um die Daten auf das Rastergitter zu konvertieren, indem für jeden Rasterpunkt der Wert jeder der beiden Datenpunkte in der Zeile auf jeder Seite des Rasterpunktes Bemittelt wird, wobei die Werte mit ihren jeweiligen Abständen von dem fraglichen Rasterpunkt Bemittelt werden.
Andere Merkmale der Erfindung sind aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungen zu erkennen.
Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Ansicht einer asphärischen Mikrolinse eines hierin bevorzugten Typs in einem äußerst stark vergrößertem Maßstab;
2 ist eine Draufsicht, welche die Bewegung eines Arms mit geringem Trägheitsmoment und begrenzter Rotation; der die Linse von 1 trägt, bei einer Abtastbewegung und einer linearen Bewegung eines Mikroskopobjektträgers darunter darstellt. Die Bewegung des Strahls auf der Linse bei Verwendung von Schwenkkompensation ist ebenfalls angezeigt.
3 ist eine schematische Ansicht eines Rastermikroskops mit großem Blickfeld und hoher Transmissionsgeschwindigkeit, das die Dreh-Oszillation der Mikroobjektivlinse von 1 unter Verwendung des oszillierenden Arms und der Translationsbewegung eines Objekts, wie es in 2 dargestellt ist, verwendet. Die oszillierende Anordnung ist mit einem Positionssensor kombiniert, welcher dazu dient, die Datensammlungspunkte präzise zu lokalisieren und der in einem Servoregelkreis für den Antrieb wirkt.
4 ist ein stark vergrößerter Aufriss eines Teils von 3, welcher die Seite des Abtastarms, welche die asphärische Mikrolinse trägt und die Spiegel darstellt, die das Licht zu der Linse liefern. 4A ist eine Draufsicht auf den Arm, die Linse und die Spiegel und 4B zeigt eine Endansicht dieses Arms und des Spiegels, welcher das Licht zu dem Arm liefert.
5 zeigt drei Laser, die Licht zu dem oszillierenden Arm von 3 liefern und zeigt, wie die Lichtstrahlen von den Lasern kombiniert werden, um die Bedingungen zu kompensieren, bei welchen die Mikrolinse eine andere Brennweite für jede der drei Laserwellenlängen aufweist.
6 zeigt Datenpunkte, abgenommen in gleichmäßigen, bogenförmigen Intervallen während aufeinanderfolgender Abtastungen durch das System von 3 im Fall einer Schrittbewegung des Objekts.
7 zeigt, wie die karthesischen Datenpunkte von den Photosensoren in Abtastbögen angeordnet werden und zeigt die gewünschten gleichmäßig beabstandeten Punkte auf einem rechtwinkligen Rastergitter, auf das die Daten zu konvertieren sind, während 7A ein alternatives Datensammlungsschema für die Verwendung mit einem speziellen Hochgeschwindigkeits-Interpolationsalgorithmus darstellt, durch den die Datenwerte interpoliert werden, um die Daten im Rasterformat zusammenzustellen.
8, 8A und 8B sind Vorder-, Seiten- und Draufsichten eines der drei gleichen Hebestiftmechanismen, welche zusammenwirken, um den Mikroskopobjektträger in dem Mikroskop von 3 zu fokussieren.
9 ist ein elektrisches Blockschaltbild des Systems, das für die Sammlung und das Verarbeiten der Signale verwendet wird.
9A ist eine Dreieckwelle, welche den Winkelverlauf der Drehstruktur von 3 über die Zeit, gesteuert durch die Steuerungen von 9, darstellt, während 9B die Form der Abtastungen auf einem sich kontinuierlich bewegenden Objekt unter Verwendung der Abtastrate von 9A ohne Schwenkspiegel zeigt.
10 ist eine vergrößerte Perspektivansicht eines Schwenkspiegels.
10A ist eine Wellenform des Winkelverlaufs des Schwenkspiegels auf derselben Zeitbasis wie 9A, für das Erzeugen einer Kompensationsbewegung des Strahls, während 10B, ähnlich wie 9B, zeigt, wie der Schwenkspiegel von 10 gleichmäßiger beabstandete Abtastbögen auf dem sich kontinuierlich bewegenden Objekt erzeugt.
11 ist eine Ansicht ähnlich wie die von 3 und zeigt einen anderen Periskopaufbau und den Schwenkspiegel in dem Strahlengang in einem Reflexionsmikroskop.
12 zeigt eine konfokale Konfiguration einer Fluoreszenz-Abtasteinrichtung.
13 zeigt symbolisch eine konfokale Konfiguration einer Fluoreszenz-Abtasteinrichtung, wobei die Objektivlinse ein Abtastelement und ein ortsfestes Element umfasst.
Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten Ausführungen
In den verschiedenen Figuren sind Elemente, die gleiche Funktionen ausführen mit gleichen Bezugszahlen gekennzeichnet.
In 1 ist mit starker Vergrößerung ein Beispiel einer asphärischen Mikrolinse 18 dargestellt, die bei den vorher beschriebenen Technologien nützlich ist. Ein spezielles Beispiel hat einen Durchmesser D von 4 mm, eine Länge 1 von 1,2 mm, eine Masse von nur 0,205 g und eine Brennweite von 2,72 mm. Diese spezielle Linse ist in einem Stück aus Glas hergestellt. Sie erzeugt einen beugungsbegrenzten Beleuchtungspunkt mit einem Durchmesser von etwa 1/2 Mikrometer von allen Lasern, die zu verwenden sind (z. B. rot, blau und grün) in Verbindung mit einer Strahlkonditionierung, welche die chromatische Aberration korrrigiert, wie es in Bezug auf 5 nachfolgend beschrieben wird. Diese spezielle Linse ist für die Transmissionsmikroskopie von Gewebe für telepathologische Anwendungen mit einer Auflösung von 1 Mikrometer ausgewählt.
Bezug auf 2 nehmend sind die lineare Bewegung eines Mikroskopobjektträgers 2 und die Bewegung der begrenzten Rotation eines oszillierenden Arms 19, der die Linse 18 trägt, dargestellt. Der Arm dreht sich um die Achse A mit einem Winkelbereich der Drehung in der Größenordnung von 60 Grad.
Die Winkelposition der Mikroobjektivlinse ist von einem Wandler oder Sensor bekannt, der mit dem oszillierenden System in Verbindung steht. In bestimmten Ausführungen ist ein Winkelpositionswandler in dem Motor mit begrenzter Rotation integriert, wie es in 3 dargestellt ist. Der Wandler ist in 12, direkt mit dem oszillierenden Arm verbunden, dargestellt, um direkt die momentane Position zu bestimmen.
Die 3, 11 und 12 stellen schematisch die Dreh-Oszillationsstrukturen 19 dar, die eine Mikrolinse 18 tragen. Die Drehstruktur 19 weist eine äußerst geringe Masse auf und ist angebracht, um auf der Achse A zu rotieren. Sie trägt zwei Drehspiegel, den Spiegel 15, der sich auf der Achse des Dreharms befindet und den Linsenbeleuchtungsspiegel 17, der mit der Objektivlinse 18 auf Achse ist. Die ortsfeste Optik weist einen finalen ortsfesten Spiegel 21 auf, der mit dem auf der Achse befindlichen Spiegel in Ausrichtung gehalten wird, der sich mit dem Abtastarm dreht, um ein Periskop zu bilden. Wie in Verbindung mit 10 erläutert wird, ersetzt vorteilhafterweise ein Schwenkspiegel 89 den Spiegel 21, wie es dargestellt ist.
In den Ausführungen von 3, 11 und 12 ist das translatorisch zu bewegende Objekt ein Mikroskopobjektträger, der in Y-Richtung durch einen geeigneten Objekttisch 11 weiterbewegt wird, während die Drehachse A ortsfest ist. Die Ausfführung von 3 ist ein Transmissionsmikroskop, von 11 ein Reflexionsmikroskop und von 12 eine Fluoreszenz-Abtasteinrichtung. Alle diese Ausführungen verwenden vorzugsweise asphärische Linsenkonstruktionen und vorzugsweise eine einzelne Mikrolinse als Objektivlinse.
Es ist jedoch so zu verstehen, dass je nach Anwendung zwei oder mehr Mikrolinsenelemente kombiniert werden können, um eine sich bewegende Objektivlinse zu bilden, die jedoch den Nachteil eines erhöhten Trägheitsmomentes aufweist.
Es ist jedoch weiterhin so zu verstehen, dass je nach Anwendung. zusätzliche Linsen oder optische Elemente kombiniert werden können, um die Objektivlinse des Systems zu bilden, wobei einsolches optisches Element oder viele dieser Elemente, eine Mikrolinse oder Mikrolinsen, innerhalb des Dreharms angebracht werden können. Die anderen optischen Elemente, die das Objektiv bilden, können ortsfest sein und können sich in der Nähe des sich bewegenden Elements befinden. 13 zeigt einen schematischen Aufbau dieses Konzepts, in dem das Element 18b ein ortsfestes Linsenelement des Objektivs ist.
Das Transmissionsmikroskop von 3 ist für die Verwendung als eine Gewebe-Abtasteinrichtung für die Telepathologie geeignet.
3 zeigt den abzutastenden Mikroskopobjektträger 2 und eine oszillierende Abtasteinrichtung 3, welche einen Motor mit begrenzter Rotation 4 aufweist. Der Tragarm 5 hält die Abtasteinrichtung 3, die wiederum auf der Grundplatte 6 angeordnet ist. Sowohl der Tragarm 5 als auch die Grundplatte 6 sind aus wärmeleitendem Material hergestellt, um als Wärmeableiter zu dienen, um die Wärme zu zerstreuen, die von dem Motor 4 der Abtasteinrichtung erzeugt wird. Eine andere Grundplatte 7 wird zum Ausführen der Fokussierung vertikal bewegt und durch drei Fokussiermechanismen 8 an drei Punkten in Stativ-Konfiguration (nur zwei Punkte sind dargestellt) gekippt. Auf der Grundplatte 7 befindet sich eine Integrationskugel 9, welche drei Photosenso- ren (nur einer ist dargestellt) enthält, um Licht zu erfassen, das durch den Mikroskopobjektträger 2 übertragen wird. Weiterhin befindet sich eine eindimensionale Translationsstufe 11 auf der Grundplatte 7, welche den Mikroskopobjektträger 2 während des Abtastens fortschreitend in Y-Richtung bewegt.
Die Photosensoren 10 sind in einigen Fällen vorgesehen. Es ist jedoch so zu verstehen, dass andere Photosensoren geeignet sein können, um die Anforderungen der speziellen Aufgabe zu erfüllen. So können zum Beispiel Photovervielfacher, PIN-Dioden, Lawinenphotodioden und andere Photosensoren verwendet werden.
Zwischen dem Mikroskopobjektträger 2 und dem oszillierenden Arm 19 befindet sich der Lichtwegarm 14. Er liefert Laserlicht von dem ortsfesten Laser 24 zu dem Drehmittelpunkt des oszillierenden Arms 19, der mit dem Spiegel 21 endet, welcher den Strahl axial nach oben in Richtung auf den Spiegel 15 auf der Achse A richtet, die sich mit dem Arm 19 dreht. Das Laserlicht wird, nachdem es sich entlang der Achse A nach oben bewegt hat, durch den Spiegel 15 radial nach außen entlang dem oszillierenden Arm 19 in dem horizontalen Weg 16 reflektiert. An dem äußeren Ende des Arms 19 wird das Licht an dem Spiegel 17 reflektiert, um sich vertikal nach unten durch die Objektivlinse 18 entlang der Achse A' zu bewegen, welche parallel zu der Drehachse A, senkrecht zu der Drehebene des Arms 19 über das Objekt verläuft. Das Licht fällt durch den Mikroskopobjektträger 2 und dieses Licht, das nicht absorbiert wird, gelangt in die Integrationskugel 9.
Die oszillierende Anordnung ist durch ein sehr geringes Trägheitsmoment kleiner als 50 g·cm², vorzugsweise in einer Größenordnung von 25 g·cm², und etwa 10 g·cm² in der bevorzugten Ausführung gekennzeichnet, und sie weist eine Masse von weniger als 25 Gramm auf. Das Trägheitsmoment und die Masse beziehen sich auf die oszillierende Struktur des Arms 19, der Spiegel 15 und 17, die er trägt, und auf die Objektivlinse 18 und schließt nicht das Trägheitsmoment des Rotors des Motors mit begrenzter Rotation ein. In den meisten Fällen kann die höchste Leistung erhalten werden, wenn das Trägheitsmoment des Motors mit begrenzter Rotation etwa dasselbe ist, wie das der Last, die oszilliert und der Rotor wird so gewählt, dass er ein Trägheitsmoment aufweist, das allgemein dicht bei 10 g·cm² liegt, obwohl Rotoren Trägheitsmomente zwischen etwa 5 und 30 g·cm² oder sogar in einigen Fällen noch größer aufweisen und dabei zufriedenstellend funktionieren.
Die geringste Trägheit der oszillierenden Anordnung in der gegenwärtig bevorzugten Ausführung wird größtenteils durch die Mikrolinse 18 ermöglicht, die ein einzelnes, kleines Element ist und ein Gewicht in der Größenordnung von 0,2 Gramm aufweist. Der Abstand von der Drehachse A des Arms 19 zu der Linse 18 beträgt in der vorliegenden Ausführung etwa 25 Millimeter. Der Arm ist aus einen halben Millimeter dicken Aluminiumprofilen hergestellt, wodurch seine Masse minimiert wird.
während für Gewebeabtastanwendungen die Linse 18 eine numerische Apertur zwischen 0,5 und 0,6 haben kann, werden größere numerische Aperturen leicht durch das außergewöhnliche Abtast-Mikrolinsenobjektiv erreicht. Das ist sehr wichtig, wenn das Mikroskop für andere Anwendungen bestimmt ist. Wenn zum Beispiel größere Lichtpunkte mit Laserstrahlen kleinen Durchmessers als Eingang zu der Linse verwendet werden, ist eine Mikrolinse mit großer numerischer Apertur größer als 0,6 besonders bei der Sammlung von fluoreszentem Licht effizient, das von Proben ausgestrahlt wird, und wobei dieses Licht entlang der ursprünglichen Richtung des einfallenden Laserstrahls zu einem Strahlteiler zurückgesendet wird. Das wird später im Zusammenhang mit 12 beschrieben.
Gleichermaßen kann, um eine große numerische Apertur zu erhalten, das zusammengesetzte Objektiv, das durch eine sich bewegende Mikroobjektivlinse und die ortsfesten Elemente gebildet wird, wie es durch das ortsfeste Linsenelement 18b in 13 symbolisiert ist, verwendet werden.
4, eine vergrößerte Ansicht von Teilen der 3, zeigt vorwiegend die oszillierende Armanordnung. In einer symmetrischen Ausgestaltung hat das Gegengewicht 20 etwa die gleiche Masse wie die asphärische Mikrolinse 18 und das Gegengewicht 20a hat die gleiche Masse wie der Spiegel 17, wobei beide Gegengewichte im gleichen Abstand an der entgegengesetzten Seite der Drehachse der Elemente 17 und 18, zu denen sie das Gegengewicht bilden, angeordnet sind. In asymmetrischen Ausgestaltungen können die Massen der Gegengewichte unterschiedlich sein, wobei unterschiedliche Abstände gewählt werden, um den ausbalancierten Zustand zu erreichen oder es können andere Ausbalanciertechniken verwendet werden.
Wie in 4A und 4B dargestellt ist, liefert der ortsfeste Arm 14, der sich über den Mikroskopobjektträger erstreckt, Licht zu dem ortsfesten Spiegel 21 an dem Drehmittelpunkt A des oszillierenden Arms. Das Licht wird entlang der Drehachse A zu dem Spiegel 15 an der Drehanordnung nach oben reflektiert. Das Licht pflanzt sich entlang dem Weg 16 zu dem Spiegel 17 fort, welcher den Strahl entlang der Achse A' zu der Mikrolinse 18 nach unten richtet. Die Draufsicht 4A stellt die Mikrolinse 18 in einer Ansicht von oben dar.
Zur Vollständigkeit sich weiter auf 4A und 4B beziehend, ist der Lichtweg 23, bevor er durch den Spiegel 21 reflektiert wird, in dem ortsfesten, optischen Auslegerarm 14 horizontal und nahezu in einem rechten Winkel zu dem Weg 16 gerichtet.
Es ist somit zu erkennen, dass die Länge des Lichtweges von dem Laser 24 zu der Linse 18 über den Abtastbereich konstant ist. Das ermöglicht die Verwendung von einfachen Ausrichtungstechniken.
Weiter auf 3 Bezug nehmend, wirken nach der Übertragung des Lichts von der Mikrolinse durch den Mikroskopobjektträger drei Photosensoren 10, welche die verschiedenen Lichtfarben in der Integrationskugel 9 sammeln. Vor jedem Photosensor 10 ist ein Filter 51 angeordnet, um zu sichern, dass nur die gewünschte Wellenlänge den jeweiligen Photosensor 10 erreicht.
Der Arm 19 und seine Anordnung können mit einem Motor einer optischen Abtasteinrichtung angetrieben werden, wie zum Beispiel mit dem Modell M3 von der General Scanning Inc. oder mit dem Modell 6880 von der Cambridge Technology Inc. Der Antrieb kann auch mit einem sich bewegenden Wicklungsmotor erfolgen, der dem Antrieb gleicht, der bei rotierenden Plattenspeichersystemen verwendet wird.
Kurz auf 12 Bezug nehmend, ist dort eine vereinfachte Modifikation des Antriebssystems von 3 dargestellt, in welcher die Antriebsmaschine ein herkömmlicher rotierender Gleichstrom-Elektromotor ist, wie zum Beispiel ein sich bewegender Magnet-Schrittmotor der Marke Portescap, zum Beispiel das Modell 26 BC-4C-101. Wenn auch aus Gründen der Einfachheit ein billiger Elektromotor verwendet wird, können in anderen Ausführungen, ein Drehmomentenmotor, wie er von Aeroflex oder WSL-MTI hergestellt wird, ein Galvanometer oder eine resonante Struktur verwendet werden. In allen diesen Fällen wird die Positionsinformation für das Datensammlungssystem und die Servorsteuerung von der momentanen Position der Drehanordnung abgeleitet. Wie in 12 dargestellt ist, ist der Wandler direkt an dem Dreharm 19 befestigt, so dass selbst irgendwelche Variationen infolge der Lager oder Auslenkung der Welle die Genauigkeit der Positionsinformation nicht beeinträchtigen.
Kompensation der chromatischen Aberration
Bezug auf die schematische Darstellung von 5 nehmend, sind ein Rot ausstrahlender Laser 24, ein Grün ausstrahlender Laser 25 und ein Blau ausstrahlender Laser 26 jeweils mit einer einstellbaren Strahlen-Aufweitungsvorrichtung 27, der herkömmlich aus zwei Linsen besteht, verbunden. Alle diese Komponenten sind Bestandteil der ortfesten optischen Anordnung.
Die Mikroobjektivlinse 18, welche in den bevorzugten Ausführungen eine asphärische Linse ist, kann verschiedene Brennweiten für jede der einbezogenen 3 Laser-Wellenlängen aufweisen. Bezug auf die schematische Darstellung von 5 nehmend, ist, um alle Wellenlängen auf dieselbe Höhe auf dem Mikroskopobjektträger zu fokussieren, der Rotlaserstrahl angepasst, zu konvergieren, wenn er die Mikrolinse 18 erreicht, der Grünlaserstrahl ist vollkommen kollimiert (parallel gerichtet) und der Blaulaserstrahl ist angepasst, zu divergieren, wenn er die Mikrolinse erreicht. Das erfolgt durch entsprechendes Defokussieren der Rot- und Blaustrahl-Aufweitungsvorrichtungen 27 von 5. Als ein Ergebnis der differierenden Wirkungen der einzelnen Objektivlinse 18 auf das Licht der differierenden Farben, fokussieren sich die Lichtstrahlen aller Farben in derselben Höhe auf dem abgetasteten Objekt.
Es können auch andere Techniken zum kompensierenden Defokussieren, um entgegenwirkenden Defokussierungseigenschaften der Mikrolinse 18 entgegenzuwirken, verwendet werden. So kann zum Beispiel eine konditionierende Kompositlinse, die aus zwei oder mehr Gläsern besteht, einen kollimierten chromatischen Strahl transformieren, um jeweilige Wellenlängen für das Auftreffen auf eine Mikrolinse, die eine entgegengesetzte chromatische Aberra tion aufweist, zu defokussieren. Einige dieser Linsen könnten die ortsfeste Linse 18b sein, die in 13 dargestellt ist.
Datentransformation
2, 6, 7 und 7A stellen die bogenförmigen Abtastspuren S auf dem Mikroskopobjektträger dar. Für Zwecke der Beschreibung ist der abgebildete Fall ein Fall, in dem der Mikroskopobjektträger während jeder Abtastung ortsfest ist. (In bestimmten bevorzugten Fällen bewegt sich der Objektträger kontinuierlich, wobei jedoch das zu erläuternde Prinzip dasselbe bleibt).
Die durch einen Photosensordetektor, der mit den Systemen von 3, 11 und 12 verbunden ist, durchgeführten Messungen, sind durch Kreuze in den vergrößerten Ansichten der 7 und 7A dargestellt.
Die Software des Systems verfolgt die Winkelposition der Objektivlinse und das System ordnet, unter Bezugnahme auf die 2 und 6 die Beziehung: Yi = Y + C B R (1 – cos θ) Xi = R sin θ verwendend, die erfassten Werte jedem Punkt der Auflösung, konvertiert von polaren zu kartesischen Koordinaten, zu.
Somit zeigen die Kreuze der 7 und 7A den Ort jedes Datenpunktes, der aktuell durch einen Photosensor gemessen ist. Die O's in 7 und 7A zeigen die gleichmäßig beabstandeten Orte auf einem rechtwinkligen Gitter im Rasterformat zum Erzeugen von Abbildungen auf herkömmlichen Monitoren und zur Datenübertragung. Alle üblicherweise zur Verfügung stehenden Bildanzeigeeinrichtungen, z. B. hochauflösende Fernsehbildschirme, haben rechtwinklige Felder von Orten, an welchen Licht ausgestrahlt wird. Diese Einrichtungen können mit den Mikroskopen der 3, 11 und 12 durch Umwandlung der Eingabedaten, um einem rechtwinkligen Rasterfeld anstatt einer Reihe von Bögen zu entsprechen, verwendet werden.
Zu diesem Zweck berechnet ein Interpolationsalgorithmus die Transmissionswerte für die O's unter Verwendung der Transmissionswerte, die den naheliegenden Kreuzen für jeden Punkt O entsprechen.
Bevorzugte Ausführungen für die Systeme gemäß 3, 11 und 12 verwenden eine Antrieb mit begrenzter Rotation, der bewirkt, dass aufeinanderfolgend Bögen über den Mikroskopobjektträger mit einer konstanten Winkelrate abgetastet werden. wenn er abtastet, digitalisiert ein Analog-Digital-Wandler die Intensitätswerte des von dem Mikroskopobjektträger aufgenommenen Lichtes.
Ein Weg der Transformation der Daten in ein Rasterformat wird unter Bezugnahme auf die mit 1 bis 10 nummerierten Orte in 7 erläutert. Das Ergebnis der Transformation beinhaltet zum Beispiel einen Transmissionswert für den Ort an dem mit 1 nummerierten Punkt O. Dieser Wert ist ein gewichteter Mittelwert der gemessenen Werte an den nahegelegenen Orten, wie zum Beispiel den Orten 2 bis 10.
Die Literatur beschreibt viele anwendbare Verfahren, um das auszuführen, einschließlich der Fourier-Transformationen, Elementarwellen-Transformationen, usw. Ein einfaches Verfahren ist eine gewichtete Mittelwertbildung der Transmissionswerte an vier Orten 2 bis 5, wobei die Wichtungsfaktoren abnehmen, je größer der Abstand des Datenpunktes vom Rasterpunkt ist, für den der Wert interpoliert ist. Dieses Verfahren schließt das Berücksichtigen vorher gespeicherter Wichtungsfaktoren ein, die auf dem Abstand vom Ort 1 zu jedem der vier ursprünglichen Datenorte basieren, indem vier Multiplikationen ausgeführt und die vier sich ergebenden Produkte summiert werden. Die Wichtungsfaktoren können vorher berechnet werden und sind von einem Speicher zu greifbar, da im Voraus aus den Abtaststeuerungen bekannt ist, wo sich alle O's und Kreuze befinden.
Wenn es erwünscht ist, äußerst schnell zu arbeiten, wie zum Beispiel in der Telepathologie, kann die Zeit, die für die vier Multiplikationen erforderlich ist, beim gegenwärtigen Stand der Billigcomputer ein Problem darstellen, da es zum Beispiel erwünscht ist, Daten für ein O etwa einmal jede 175 Nanosekunden zu transformieren. (Bei dieser Rate kann der Prozess der Datentransformation mit dem Prozess der Datenerfassung mit dem beschriebenen System Schritt halten).
Eine weitere hierin dargestellte Variante ist eine Technik, das Durchführen von vier Multiplikationen auf eine oder auf zwei zu verringern, indem die Daten nicht in gleichmäßigen Intervallen entlang der Abtastspur S erfasst werden, sondern in denselben gleichmäßigen Intervallen in der X-Koordinate, welche die Orte der O-Punkte in dem gewünschten rechtwinkligen Rastermuster beschreibt. 7A zeigt, dass in diesem Fall der Transmissionswert für den Ort 11 ein gewichteter Mittelwert der Transmissionen an den Orten 12 und 13 sein kann. Wenn die gemessene Transmission an dem Ort 12 r(m – 1, n) ist, ist die gemessene Transmission an dem Ort 13 f(j, n) = (b × r(m – 1, n) + a × r(m, n))/(a + b). Der Buchstabe r steht für die Ursprungsdaten, der Buchstabe m nummeriert die bogenförmigen Abtastlinien, der Buchstabe j nummeriert die geradlinigen horizontalen Zeilen und der Buchstabe n nummeriert die Spalten, die sich in Bewegungsrichtung des Mikroskopobjektträgers erstrecken. Auf diese Weise erfolgt eine schnelle Interpolation auf Rasterformat auf einem einfachen Weg.
Wenn auch das System unter Bezugnahme auf ein Abtasten mit konstanter Drehrate erläutert wurde, können auch Abtastraten verwendet werden, die sich in einer vorhersagbaren Weise verändern. Dieselben Prinzipien, wie sie beschrieben sind, sind bei dem Steuerungssystem nützlich, das noch geeignet angepasst ist, um die Abtastungen an den Kreuzungspunkten des Rastergitters vorzunehmen.
Einstellung des Brennpunktes
Da der Ort der Oberflächen der zu untersuchenden Objekte hinsichtlich der Brennebene variieren kann, kann die präzise Einstellung des Brennpunktes wichtig sein, um eine Hochgeschwindigkeitsmikroskopie mit großem Blickfeld und hoher Auflösung durchzuführen. So schreibt zum Beispiel der Industriestandard ISO 8037-1-1986E für Mikroskopobjektträger vor, dass die Toleranz ihrer Dicke 300 Mikrometer beträgt. Das entspricht etwa zwei Größenordnungen größer, als die Feldtiefe eines Mikroskops mit einer Auflösung von einem Mikrometer, das in 3 beschrieben ist. Die obere Fläche des Objektträgers kann in die eine oder in eine andere Richtung gekippt werden. Der Objektträger kann auch in seiner Längsrichtung geneigt werden. Die beschriebenen Mikroskope weisen vorteilhafterweise die Fähigkeit der dynamischen Fokussierung auf, wofür ein steuerbarer Hebemechanismus für den Brennpunkt verwendet wird. Einer der drei Fokussierungsmechanismen, der in den Ausführungen der 3, 11 und 12 verwendet wird, ist in 8, 8A und 8B dargestellt. Der Fokussierungsmechanismus 8 bewegt die Grundplatte 7 vertikal. Das Vorliegen von drei dieser Mechanismen, die in Dreieckform beabstandet sind, ermöglicht es, die Platte 7 zum Fokussieren anzuheben, abzusenken oder zu kippen. Jeder Mechanismus 8 wird durch ein lineares Betätigungselement 143 angetrieben, welches eine Welle 44 vorschiebt. Das innen angeordnete Betätigungselement gleicht einem Schrittmotor mit 96 Schritten pro Umdrehung. Die Welle 44 treibt den langen Arm eines Hebels 45 an, welcher eine Verringerung mit einem Faktor 20 in der Bewegung der Welle ausführt, d. h. für jeden Schritt von 3 Mikrometern (1/8 mil) des linearen Betätigungselements 143 bewegt sich die Grundplatte 7 nur 1/160 von einem Tausendstel Inch.
Der Hebel 45 dreht sich um einen Drehpunkt 46. Die Drehung und Verbindung mit den beiden Enden des Hebels ist mit drei Biegefedern 47 vorgesehen. Die Biegefedern 47 werden ständig durch Tellerfederscheiben 48 unter Spannung gehalten, um das Spiel in dem linearen Betätigungselement 143 zu minimieren. Die Grundplatte 7 ist durch drei dicke Biegeelemente 49 so eingespannt, dass sie sich nur vertikal relativ zu der Maschinengrundplatte 6 bewegen kann und nicht seitlich, wobei je eine mit jedem Fokussierungsmechanismus 8 verbunden ist.
Die Komponenten, die sich in Reaktion auf die Betätigung des Fokussierungsmechanismus 8 vertikal bewegen, bewegen den Mikroskopobjektträger 2. Die Platte 50, welche den Mikroskopobjektträger 2 hält, verbindet den Mikroskopobjektträger mit dem Objekttisch 11, der von der Grundplatte 7 getragen wird.
Im Fall des Transmissionsmikroskops von 3 wird auch die Integrationskugel 9 vertikal bewegt und bewegt sich somit mit dem Mikroskopobjektträger. In dieser Ausführung bewegen sich der oszillierende Arm 19 und der Motor 4 nicht relativ zu der Maschinengrundplatte 6.
Somit ist der Mikroskopobjektträger unter Computersteuerung in einer Anzahl von Freiheitsgraden bewegbar, um den Punkt auf der untersuchten Probe in der Brennebene des Rastermikroskops anzuordnen. Bei der Abtastbewegung muß in den dargestellten Ausführungen keine Kompensation für eine Drehbewegung um die x-Achse vorgesehen sein, da die schmalste Abmessung des Mikroskopobjektträgers relativ starr und gleichförmig ist.
In den dargestellten Ausführungen wird die Brennpunktkorrektur durch die Photosensoren 10 erfasst, welche die Modulation des Lichts durch die Gewebeabtastwerte oder durch Bezugspunkte erfassen. Wenn sich die Gewebeprobe dem perfekten Brennpunkt annähert, erhöht sich die Amplitude der Hochfrequenzkomponenten in dem Signal der Photosensoren relativ zu der Amplitude der Niederfrequenzkomponenten und der beste Brennpunkt ist als die Höhe des Mikroskopobjektträgers definiert, bei welcher das Verhältnis der Hochfrequenzkomponenten zu den Niederfrequenzkomponenten maximiert ist.
Eine Vorabtastung des Mikroskopobjektträgers ermöglicht die Bestimmung der Höhe des besten Brennpunkts auf dem Mikroskopobjektträger. Das ermöglicht das Erfassen, ob der Objektträger gekippt oder geneigt ist. Diese Information wird in dem Computerspeicher gespeichert und während des Fortschritts der nachfolgenden "Untersuchungs"-Abtastung mit Feinauflösung kann darauf zugegriffen werden.
Während der Untersuchungsabtastung wird der Mikroskopobjektträger auf seiner Halterung in genau derselben Position gehalten, die er bei der Vorabtastung eingenommen hatte. Wenn die Untersuchungsabtastung erfolgt, folgt der Fokussierungsmechanismus kontinuierlich der Oberfläche des Mikroskopobjektträgers gemäß den gespeicherten Daten.
Für das Durchführen der Vorabtastung werden die Positionen der Einstellmechanismen des Mikroskopobjektträgers geschwenkt und ein geeignetes Computerprogramm analysiert die Daten der aufeinanderfolgenden Messungen, die von den Photosensoren ausgeführt werden, um zu ermitteln, in welchem Ausmaß der Datenstrom Hochfrequenz-, Mittelfrequenz- oder Niederfrequenzkomponenten enthält.
Das Computerprogramm analysiert die Vorabtastungsdaten hinsichtlich des Gesamthöhenfehlers infolge von Stampf-, Roll- oder Nickbewegungen und bestimmt die Gesamtkippkorrektur. Die Betätigungselemente sind demgemäß eingestellt, um die Gesamtkippbewegung vor der Untersuchungsabtastung zu korrigieren.
Daher ist es in den beschriebenen Ausführungen bevorzugt, dass einige Einstellungen dynamisch ausgeführt werden und einige nicht. In der vorliegenden Diskussion bedeutet Rollen eine Drehung um die lange Y-Achse des Mikroskopobjektträgers in Rich tung, in welcher er sich vorwärtsbewegt und Stampfen ist die Drehung um die kurze Achse des Objektträgers. Während der Untersuchungsabtastung, wenn sich der lineare Objekttisch 11 schrittweise bewegt, während der Mikroskopobjektträger wiederholt abgetastet wird, wird die Position des Mikroskopobjektträgers kontinuierlich durch den Fokussierungsmechanismus 8 auf der Basis der gespeicherten Vorabtastungsdaten für die Stampf- und Nickbewegungen eingestellt.
In anderen bevorzugten Ausführungen werden automatische Fokussierungstechniken verwendet, wie sie in dem US-Patent 6,262 838, eingereicht am 15. Mai 1998 beschrieben sind.
Steuersystem
9 stellt ein elektrisches Gesamt-Blockschaltbild des Steuersystems für das Mikroskop von 3 dar (mit kleineren Veränderungen ist dasselbe System, wie aus der weiteren Diskussion offensichtlich ist, auch für die Ausführungen der 11 und 12 nützlich).
Die Hauptleiterplatte 64 eines Personalcomputers 60 hält eine digitale Signalprozessor-Leiterplatte 65, welche das Signal von Photosensoren verarbeitet und eine Echtzeit-Steuercomputer-Leiterplatte 66, welche das Galvanometer oder einen anderen Antrieb, die Schrittmotoren und andere Sensoren und Betätigungselemente in dem System steuert. Die Elektronik 67, 76 für den Antrieb des Motors mit begrenzter Rotation 4, die Elektronik 68, 77 für den Antrieb des Schrittmotors 13 und des linearen Betätigungselements 93 sind ebenso dargestellt, wie die Elektronik 69, 78 für sonstige Funktionen. Die Hauptleiterplatte 64 des Personalcomputers enthält auch die Schaltungsanordnungen und Anschlüsse für die unterstützenden Standard-Computerperipherie-Einrichtungen, nämlich einen Monitor 70, eine Tastatur 71, eine Maus 72, eine Festplatte 73 und ein Diskettenlaufwerk 74. Weiterhin sind sechs Photosensoren-Verstärkerschaltungen 75 für die drei Lichtfarben, sowohl direkt von den emittierenden Lasern abgetastet als auch nach der Bestrahlung des untersuchten Objekts dargestellt. Der Block 67 erzeugt eine Dreieckwelle für das Antreiben des Motors mit begrenzter Drehung. Sein Signal gelangt zu einer Servo-Steuer-Leiterplatte 76, welche Strom zu dem Motor mit beschränkter Rotation liefert und ein Rückkopplungssignal von dem Winkelpositionswandler verarbeitet. Die Steuereinrichtung für den Schrittmotor 143 und die linearen Betätigungselemente 43, bezeichnet als Block 68, führen Niedrigpegelsignale einem Leistungsverstärker 77 zu, der die Leistungssignale zum Antreiben dieser verschiedenen Motoren und Betätigungselemente zur Verfügung stellt. Gleichermaßen liefert der noch verbleibende Block 69 Niedrigpegelsignale zu einer Leiterplatte für höhere Leistungen. Reservesteckplätze sind für zusätzliche Fähigkeiten, wie zum Beispiel eine Ethernet-Kommunikationsverbindung vorgesehen.
Betrieb des Transmissionsmikroskops
Nachfolgend wird ein typischer Betrieb der gegenwärtig bevorzugten Ausführung des Gewebeabtast-Transmissionsmikroskops der 3 bis 9 beschrieben.
Eine Scheibe des Gewebes wird auf dem Mikroskopobjektträger 2 in herkömmlicher Weise angeordnet. Der Anwender platziert den Objektträger in der Scheibenhalteeinrichtung (nicht dargestellt). Durch Drücken eines Knopfes bewegt die Maschine den Objektträger automatisch in Richtung auf den oszillierenden Dreharm 19. Zuerst wird der Objektträger abgetastet. Während sich der Objektträger unter dem oszillierenden Arm 19 hindurchbewegt, wird er nicht nur linear durch den Schrittmotor 13 bewegt, sondern die Fokussierungs-Betätigungselemente werden vertikal in einer Schwenkaktion bewegt, um die Höhe des Objektträgers zu ermitteln, welche an den jeweiligen Punkten über den Objektträger den besten Brennpunkt ergibt. Währenddessen senden die Photosensoren ihre Signale zu der in 9 beschriebenen Elektronik und das Computerprogramm veranlasst eine Überprüfung des Ausgangs. Für jede Höhe des Mikroskopobjektträgers berechnet die Software grundsätzlich die Größe der Veränderungen in dem übertragenen Licht von einer Abtastung zur anderen. Wenn diese Veränderurgen sich an ihrem Maximum befinden, ist das der beste Brennpunkt und diese Daten werden aufgezeichnet.
Die Ursprungsdatenpunkte werden im Speicher mit einer sehr hohen Geschwindigkeit angeordnet und die Software greift mit einer geringeren Geschwindigkeit auf sie zu oder entnimmt in einigen Fällen periodische Abtastwerte. Die Vorabtastungstransmission durch den Objektträger wird auf dem Monitor für den Operator angezeigt und die Bereiche des Mikroskopobjektträgers, die interessierendes Material enthalten, hauptsächlich absorbierendes Material, werden auf dem Monitor angezeigt. Dem Operator wird es. durch die Steuerungen ermöglicht, Teile von dem, was er sieht, für die Untersuchung zu spezifizieren. Nachdem die schnelle Vorabtastung durchgeführt ist, werden der beste Brennpunkt, der aus den erfassten Daten ermittelt wurde, und eine relativ rohe Version des Bildes, basierend auf den Vorabtastungsdaten, dem Operator angezeigt, der die Bereich des Bildes auswählt, die abzutasten sind. In Reaktion darauf bewegt sich der Mikroskop-Objektträger schnell, um den ausgewählten Bereich darzustellen und danach bewegt er sich für die mikroskopische Untersuchung des Objektträgers durch eine Feinabtastbewegung langsam vorwärts. Das erfolgt in Vorschubschritten von nur etwa 3,5/10 eines Mikrometers pro Abtastung des oszillierenden Arms, der etwa 30% Überlappung zwischen benachbarten Punkten mit einem Durchmesser von 1/2 Mikrometer zur Verfügung stellt. Es sollte bemerkt werden, dass eine Auflösung von einem Mikrometer eine Pixelgröße von 1/2 Mikrometer erfordert, um Unbestimmtheiten zu berücksichtigen, die durch das Nyquist-Kriterium definiert sind. Der oszillierende Arm oszilliert in 50 Zyklen pro Sekunde in einem Dreieckwellenmuster und liefert 100 Abtastungen pro Sekunde, wobei sich der Objektträger 3,5/10 eines Mikrometers pro Abtastung bewegt, so dass sich der Objektträger mit einer Geschwindigkeit von 35 Mikrometern pro Sekunde bewegt. Um 1 cm Länge des Objektträgers zu untersuchen, werden unter diesen Bedingungen weniger als 5 Minuten benötigt. Nachdem die gewünschte Abtastung abgeschlossen ist, kehrt der Objektträger zu erneuten Bewegung in seine Ausgangsposition zurück.
Die während der Feinabtastung gesammelten Daten (das erfasste Laserlicht, dividiert durch einen Wert, der das einfallende Laserlicht für jeden Auflösungspunkt darstellt) haben die bogenförmige Art und Weise des Datensammlungspunkts durch Interpolation in das Rasterformat eliminiert. Dann werden die Daten auf eine Festplatte oder eine magnetisch-optische Schreib-Lese-Platte gebracht oder über eine Breitband-Kommunikationsverbindung, die eine Satellitenverbindung zu einem Arzt auf der anderen Seite der Welt sein kann, oder über eine Datenleitung zu einem anderen Ort in demselben Krankenhaus oder in derselben Einrichtung oder zu einer permanenten medizinischen Aufzeichnung für einen Patienten gesendet.
Die Elektronik von 9 treibt in der bevorzugten Ausführung den Motor 4 mit begrenzter Auslenkung mit einer konstanten Winkelgeschwindigkeit an, wobei die Daten an den Auslenkungen teilnehmen. Die abgetasteten Daten können auf verschiedenen Wegen entnommen werden, zum Beispiel mit einer Indexbewegung des Objekts zwischen den Abtastungen, dem Entnehmen von Daten nur bei Bewegungen der Anordnung mit begrenzter Drehung im Uhrzeigersinn oder entgegen dem Uhrzeigersinn. 9A, eine Dreieckwellenform, stellt die konstante Winkelauslenkung der Anordnung sowohl bei Auslenkungen für die Datenerfassung sowohl im Uhrzeigersinn als auch entgegen dem Uhrzeigersinn dar.
Korrektur der Abtastbewegung
Zum Erreichen einer schnellen, genauen Abtastung wird es bevorzugt, das Objekt mit einer konstanten Geschwindigkeit vorwärtszubewegen, wobei die Daten sowohl bei Drehungen im Uhrzeigersinn (cw) als auch entgegen dem Uhrzeigersinn (ccw) entnommen werden.
Mit festgelegtem Lichtweg zu der Linse 18 und bei Vorwärtsbewegung des Mikroskopobjektträgers mit einer festgelegten Geschwindigkeit, bilden die Abtastungen über das Mikroskopobjekt in Bewegungen im Uhrzeigersinn und entgegen dem Uhrzeigersinn all-gemein ein gekrümmtes Dreieckmuster auf dem Objektträger als Ergebnis der kombinierten Dreh- und Oszillationsbewegung und der kontinuierlichen linearen Translation (9B). Der Abstand zwischen benachbarten Abtastwegen ist entlang den Abtastbögen nicht gleichmäßig. Das führt zu Unzulänglichkeiten in Bezug auf die Notwendigkeit einer bedeutenden Überlappung der Abtastung in einigen Bereichen, um wenigstens die Oberflächen des Objektivs in anderen Bereichen zu überdecken.
Eine andere hier dargestellte Variante ist eine Bewegungskompensationsaktion, welche die Wirksamkeit für diesen Fall erhöht.
In der vorliegenden Ausführung ist das Kompensationssystem dazu ausgestaltet, den Lichtweg in Relation zu der rotierenden Linse in radialer Richtung des Haltearms 19 (siehe 2) in Koordination mit der Drehoszillation gemäß dem in 10A dargestelltem Auslenkungsmuster zu verschieben. Das bewirkt, dass aufeinanderfolgende Abtastwege enger parallel verlaufen, als in 10B dargestellt ist.
Aus der Betrachtung der 9A und 10A ist ersichtlich, dass, wenn der Abtastarm am Ende seiner Bewegungsbahn die Richtung verändert und einen Scheitelpunkt durchläuft, der Strahl in Bezug auf die lineare Bewegung des Ziels verzögert wird und wenn das Objektiv wieder in den Abtastbereich eintritt, wird der Strahl beschleunigt. Das wird erreicht, wenn der Schwenkspiegel einer Bewegung folgt, die durch 10A definiert ist, während der Schwenkarm mit dem Objektiv angetrieben wird, wie es in 9A dargestellt ist. Auch während der Abtastung selbst kompensiert die weitere Auslenkung des Spiegels die trigonometrische Funktion, die auf den Auslenkungswinkel des Arms 10 bezogen ist.
In dem hier bevorzugten Fall ist der Schwenkspiegel 89, 10, dem Transmissionsmikroskopsystem von 3 anstelle des Spiegels 21 hinzugefügt (ein Reflexionsmikroskopsystem, das ebenfalls den Schwenkspiegel 89 anstelle des Spiegels 21 verwendet, ist in 11 dargestellt und eine Fluoreszenzabtasteinrichtung, die einen Schwenkspiegel 89 verwendet, ist in 12 dargestellt).
Die Ungleichmäßigkeit des Abtastabstands wird durch Bewegen der reflektierenden Oberfläche des Schwenkspiegels 89 über einen sehr kleinen Winkel, zum Beispiel etwa 10^–4 Radiant, beträchtlich verbessert.
Wie in 10 dargestellt ist, weist der bevorzugte Schwenkspiegel 89 einen kleinen Spiegel 90 auf, der eine Fläche von etwa 1 cm2 hat und etwa 1 mm dick ist. Eine Kante des Spiegels ist durch ein Biegeelement 91 mit einer fest angeordneten Haltestruktur 92 in Form eines Gelenks verbunden. An dem anderen Ende des Spiegels befindet sich ein piezoelektrisches Betätigungselement 93, wie zum Beispiel ein solches von der Firma Nippon Electrical Company mit der Bezeichnung AE203DS08, ein schnelles, billiges Betätigungselement, welches einen Bewegungsbereich von 10 Mikrometern hat, wenn 100 Volt an die Leitungen 97 angelegt werden, um dem Piezo-Kristall-Betätigungselement 93 einen gesteuerten Strom zuzuführen. Da zum Beispiel der Abstand zwischen benachbarten Abtastungen 3,5/10 eines Mikrometers an dem Mikroskopobjektträger sein kann, ist der Schwenkspiegel mit einem Schwenkbereich von 3,5/10 eines Mikrometers versehen, wie er bei dem Mikroskopobjektträger gemessen wird, um den Abstand zwischen den Abtastungen gleichmäßiger zu machen. Die erforderliche Winkeldrehung des Laserstrahls selbst, um das zu erreichen, beträgt 3,5/10 eines Mikrometers dividiert durch die Brennweite der Mikrolinse, welche in dem Beispiel 1,2 mm beträgt. Das ergibt einen Winkelbereich des Laserstrahls von etwa 1 × 10⁴. Der Spiegel dreht sich nur um die Hälfte dieses Bereiches oder etwa 4/10 × 10^–4 Radiant. Die Spannung, um das zu erreichen, liegt in der Größenordnung von 10 Volt, angelegt an das piezo-elektrische Betätigungselement. Die Resonanzfrequenz dieses Betätigungselements liegt in der Größenordnung von 100 Kilohertz, so dass der Spiegel in der Lage ist, so schnell bewegt zu werden, wie es durch die Bewegung des Abtastarms 19 erforderlich ist. Ein Steuersystem ist demgemäß dazu ausgestaltet, den Schwenkspiegel 89 synchron mit der Rbtastwellenform von 9A anzutreiben, z. B. gemäß der in 10A dargestellten Wellenform, um einen kompensierten Abtastweg zu erzeugen, wie er in 10B dargestellt ist.
Transmissionsmikroskop mit Korrektur der Abtastbewegung
Eine bevorzugte Ausführung, die den Schwenkspiegel einschließt, ist die Hochgeschwindigkeits-Gewebeabtasteeinrichtung von 3, modifiziert, um den Schwenkspiegel 89 einzubeziehen. Das System tastet Gewebeproben auf Mikroskopobjektträgern sehr schnell ab. Der Schlüssel zu dieser Fähigkeit ist das Mikrolinsenobjektiv, welches eine 20 mm breite Gewebeprobe mit einer Rate von 100 Abtastungen pro Sekunde abtastet. Rotes, grünes und blaues Laserlicht fällt durch die Abtastobjektivlinse, durch die Gewebeprobe und in die Integrationskugel. In der Integrationskugel wird der Anteil von Licht jeder Farbe, der durch die Probe übertragen wird, gemessen.
Die Mikroobjektivlinse 18 als eine asphärische Oberfläche, gebildet aus einem Glasstück, erzeugt einen Fleck mit begrenzter Diffraktion bei allen drei Laserwellenlängen mit einem Durchmesser von etwa 1/2 Mikrometer. Die Gewebeprobe ist daher in der vollständigen Farbe bei einer Auflösung von 1 Mikrometer abgebildet. Die Linse kann in dieser spezifischen Ausführung eine numerische Apertur (NA) von 0, 55 und eine Masse von nur 0, 205 Gramm aufweisen.
Die hohe Abtastgeschwindigkeit, z. B. von 6,7 Metern pro Sekunde ergibt eine Messung der Transmission von jedem Bereich mit einem Durchmesser von 1/2 Mikrometer (Pixel) in 0,08 Mikrosekunden. Die Photosensorenverstärker und die Analog-Digital-Wandler, welche jedes Pixel verarbeiten, sind für diese hohe Geschwindigkeit ausgelegt.
Die Linse tastet die Gewebeprobe in einem Bogen ab, da sie sich in oszillierender Weise um die Achse A dreht, welche sich, z. B. 25,4 mm von der Linse 18 befindet.
Unter Verwendung des Positionsdetektors 43 der oszillierenden Struktur liest das elektronische System die aktuelle Position zu jedem Zeitpunkt der Datensammlung ab. Das Positionssignal wird als eine Servosteuerung zurückgeleitet (nicht dargestellt), um den Motor gemäß einer erwünschten Bewegungsbahn zu steuern.
Andere Anwendungen des Schwenkmerkmals
Das Schwenk- oder bewegbare System kann auch dabei von Vorteil sein, zu ermöglichen, ein ortsfestes Objekt entlang mehreren gleichmäßig verlaufenden Bögen durch einen Arm abzutasten, der sich in einem konstanten Radius um eine feste Achse relativ zu dem Objekt bewegt. Ein gesteuerter Zuwachs der Einstellung des Schwenkspiegels zwischen den Abtastüberstreichungen kann den effektiven Radius der Abtastlinie auf dem Objekt verändern, so dass zwei oder mehr Linien für eine vorgegebene feste Position zwischen dem Drehmittelpunkt des Arms und des Objekts erzeugt werden können.
Reflexionsmikroskop Die Techniken, die in Bezug auf ein Transmissionsmikroskop beschrieben wurden, sind auch leicht auf ein Mikroskop anwendbar, welches Energie von der beleuchteten Seite aufnimmt, z. B. ein Mikroskop, das auf Reflexion oder Fluoreszenz basiert.
Die Abtastanordnung des Reflexionsmikroskops von 11 ist der des Mikroskops von 3 gleich, mit der Ausnahme, dass der Schwenkspiegel 89 (oder in einem Beispiel ohne Schwenkbewegung, ein Spiegel 21) über dem Rotor 19 angeordnet ist und ein Periskop über eine Hohlwellenkupplung erzeugt wird.
Um das reflektierte Licht zu erfassen, sind hier dem System von 3 ein Strahlteiler 94 in dem Lichtweg, durch den 50% des einfallenden Laserlichts fallen, ein Interferenzfilter 99 und ein optisches Element 102 hinzugefügt, um das Licht auf einen Sensor 95, wie zum Beispiel einen Photovervielfacher zu richten.
Die Reflexionsgeometrie kann in solchen Anwendungen, wie in der Biologie verwendet werden, wo die Probe zu dick ist, um signifikantes Licht zu übertragen oder wo es unzweckmäßig oder nicht möglich ist, eine sehr dünne Probe herzustellen, wie in der Metallurgie oder in der Computerchipindustrie.
Direkte Positionsinformation für den die Linse tragenden Arm
Die Ausführung von 12 unterscheidet sich von der von 3 und 11 darin, dass der Winkelpositionsdetektor direkt mit dem sich bewegenden Arm 19 verbunden ist, und nicht mit dem Motor 4.
Ein Vorteil dieses Aufbaus ist der, dass die Position des oszillierenden Arms selbst zu jedem Zeitpunkt der Datensammlung bestimmt wird. Die exakte Position wird somit als Bezug für den Datenaufbau und die Servosteuerung eines billigen Rotationsmotors verwendet.
Ein Vorteil dieser Ausführung ist der, dass die Bandbreite des gesamten Systems für eine gegebene Geschwindigkeitsleistung recht klein sein kann, weil Unzulänglickeiten in der Dynamik keine Folgen haben, da die Rekonstruktion durch direktes Messen der Winkelposition, die von dem Positionssensor stammt, durchgeführt wird, wobei der momentane Abstand von der Achse A zu dem Strahl an der Objektivlinse 18 bekannt ist. (Dieser Abstand ist im Fall eines festen Reflektors konstant oder variiert im Fall der Verwendung des Schwenkspiegels, ist jedoch zu jeder Zeit bekannt). Die Bandbreite des Positionssignals kann durch einen Abtastalgorithmus verringert werden, der eine geeignete Anzahl von Punkten, je nach der geforderten Genauigkeit, abtastet, zwischen denen jede momentane Position extrapoliert wird.
Fluoreszenzerfassung
Eine Anwendung von großer Bedeutung ist die Erfassung von fluoreszentem Licht, das durch einem dem Gewebe zugeführten Laserstrahl stimuliert wird, wie es auch durch das System von 12 dargestellt wird.
Zum Beispiel erfolgt das Erfassen der Fluoreszenz unter Verwendung der herkömmlichen FITC-Kennzeichnung durch Beleuchtung des Objekts mit Licht von etwa 494 nm und Sammeln der fluoreszierenden Strahlung geringer Intensität von etwa 518 nm, wobei das ausgestrahlte Licht von dem Anregungslicht mit Filtern getrennt ist. Zu diesem Zweck wird ein dicroischer Strahlteiler 94 in den Laserstrahl eingesetzt (12). Der dicroische Strahlteiler ist ausgewählt, um vorzugsweise das einfallende Laserlicht zu übertragen und die geringfügig längere fluoreszierende Wellenlänge zu reflektieren. Ein Hauptvorteil dieses Systems ist die hohe numerische Apertur, z. B. NA = 0,68 der Objektivlinse 18 auf der Achse mit oder ohne ihre zugehörige ortsfeste Linse oder Linsen 18b, dargestellt in 13. Ein kleiner Teil der Linse kann verwendet werden, um die anregende Beleuchtung durch Abweichen vom Brennpunkt zu liefern, um einen großen Fleckdurchmesser zu erzeugen. Die hohe numerische Apertur stellt dann eine ausgezeichnete Sammlung von fluoreszentem Licht bereit, das durch den beleuchteten Fleck in alle Richtungen gesendet wird.
Die Intensität des fluoreszierenden Lichts in den Fluoreszenzmikroskopen kann zehn Größenordnungen unter der Intensität des einfallenden Laserlichts liegen. Die Miniaturlinse sammelt nicht nur das weit gestreute fluoreszente Licht. Sie wandelt infolge ihrer hohen numerischen Apertur das fluoreszente Licht auch zu einem nahezu parallelen Strahl um. Das allein erleichtert den Durchgang des Strahls durch den rotierenden Arm und über den dicroischen Spiegel (in einigen Fällen in Verbindung mit einer weiteren ortsfesten Kollimationslinse 18b (13)) zu dem ortsfesten Erfassungsgebiet. Ein oder mehrere Interferenzfilter 99 sind vor dem Photovervielfacherdetektor 95 vorgesehen, um äußerst schwache Pegel des fluoreszenten Lichts zu erfassen.
Es gibt viele verschiedene Arten von fluoreszenten Objekten, für die eine große Anzahl von Bildelementen erwünscht ist. Bei der Restriktionsabbildung werden die DNA-Moleküle zu nahezu einer geraden Linie gestreckt und durch Enzyme angegriffen, welche die Moleküle an verschiedenen Punkten aufbrechen und eine lange Linie molekularer Struktur mit darin befindlichen Unterbrechungen darstellen. Die DNA-Enden können dazu gebracht werden, dass sie fluoreszieren und durch Besichtigen kann man die Länge jedes nicht unterbrochenen Segments erkennen, wobei diese Längen dabei nützlich sind, die Segmente zu identifizieren. Es wird zum Beispiel Bezug auf die Human Genome News von Juli/August 1996 genommen, die hierin durch die Bezugnahme einbezogen wird. Eine Diskussion der Technik und eine Photographie eines speziellen Chromosoms, das gestreckt und in Stücke geteilt ist, ist dargestellt, wobei jedes Stück fluoresziert. Die Abtastfähigkeit eines großen Bereichs des vorliegenden praktischen Systems mit seiner großen Anzahl von Bildelementen ist in diesem Fall sehr nützlich. wenn das gestreckte DNA-Stück erzeugt wird, erkennt der Wissenschaftler nicht präzise, wo es auf dem Objektträger angeordnet ist. Einen Flüssigkeitsmenge wird abgelagert und verarbeitet, um einen Bereich in der Größe von 1 cm2 zu erzeugen, der ein Dutzend oder mehr DNA-Moleküle an zufälligen Orten enthalten kann. Das Auffinden der DNA-Moleküle ist nicht einfach. Das Abtasten eines großen Bereichs unter Verwendung der vorliegenden Variante kann in einer ausgezeichneten Weise nicht nur die Moleküle auffinden, sondern ist auch in der Lage, jedes Molekül insgesamt oder wenigstens eine große Länge davon dem Wissenschaftler dazustellen, ohne dass es erforderlich ist, getrennte kleine Bilder gemäß den bekannten Technologien zusammenzufügen. Da Fehler beim Zusammenfügen mehrerer kleiner Bilder auftreten können, kann man nicht sicher sein, dass die unterbrochenen DNA-Segmente richtig identifiziert wurden, so dass redundante Abtastungen erforderlich sind, um die Ergebnisse zu bestätigen. Das große Blickfeld und die große Anzahl von Bildelementen in dem Bild, die mit den vorliegenden Techniken erreicht werden können, sind für das schnelle Auffinden der DNA wichtig und erhöhen die Sicherheit des Wissenschaftlers, den Abtastprozess beschleunigen zu können.
Eine andere Anwendung der Fluoreszenz hat mit den Techniken für die DNA-Sequenzierung zu tun, die regelmäßige, rechtwinklige Felder oder Orte ergibt, an denen Hybridisierungsreaktionen zwischen einem bekannten DNA-Fragment und einer unbekannten DNA auftreten, wie sie durch Affymetrix erzeugt werden. Das sind Anwendungen, in welchen die abzutastenden Bereiche sehr groß sein können, weil es beabsichtigt ist, viele verschiedene mögliche Reaktionen zu haben, die über einen Mikroskopobjektträger verteilt sind. Die Fähigkeit, schwache Fluoreszenz zu erfassen, ist in diesem Fall wichtig, weil die fluoreszierenden Volumen an den Orten auf solchen DNA-Chips, die Reaktionsprodukte enthalten, sehr gering sind. Somit wird die Verwendung von Hybridisierungsreaktionen, die durch Fluoreszenz erfasst werden, durch das vorliegende System erleichtert.
In anderen Zusammenhängen sind die Fluoreszenzmikroskopprinzipien nützlich, um natürliche Fluoreszenz ohne Verwendung einer stimulierenden Strahlung zu erfassen. Die konfokale Adaption, die noch beschrieben wird, kann die Effektivität einer solchen Technik verbessern.
Konfokales Mikroskop
12 zeigt auch das allgemeine System der 3 und 11, um als konfokales Mikroskop mit begrenzter Drehung zu dienen. Zusätzlich zu den vorher dargestellten Komponenten, wird, um ein konfokales Mikroskop zu erhalten, das konditionierende optische Element 102, das eine andere asphärische Linse oder eine Linse anderer Ausgestaltung sein kann, in Verbindung mit einer Lochblende 103 verwendet, die in der Brennebene der Linse 102 vorgesehen ist. Der Zweck der Lochblende und der Linse ist im Wesentlichen, zu erreichen, das nur Licht an der Lochblende fokussiert wird, das von der Brennebene ausgeht. Licht, das von anderen Höhen oder Stellen ausgeht, ist an der Lochblende außerhalb des Brennpunkts und es fällt nur ein kleiner Teil davon durch die Lochblende. Das nicht erwünschte Licht ist z. B. gestreutes Laserlicht aus Strahlübergabestellen oder Umgebungslicht. Der Photovervielfacher 95 folgt der Lochblende. Somit wird die Lichtmenge, die von der Fluoreszenzquelle gesammelt wird, in Bezug auf Licht von anderen Quellen maximiert.
Beispiele für Fähigkeiten und Anwendungen von Mikrolinsen-Abtasteinrichtungen mit begrenzter Rotation
Ein Hauptmerkmal der vorher beschriebenen Systeme ist die Fähigkeit, eine sehr große Anzahl von Bildelementen zu erzeugen. Im Fall eines Mikroskopobjektträgers mit den Abmessungen 25 mm × 75 mm mit einer Lichtfleckgröße von 1 Mikrometer werden 25000 × 75000 Bildelemente definiert. Das gilt für übertragenes Laserlicht, reflektiertes Laserlicht, fluoreszentes Licht oder für eine optische Aufgabe, die nichts mit dem Sammeln von Bildern zu tun hat, zum Beispiel die Mikrobearbeitung eines Merkmals in der Oberfläche eines kundenspezifischen integrierten Schaltkreises oder einer Photomaske usw.
Bei der Mikrobearbeitung ist das Rastermikroskop nützlich, um z. B. auf einer Photomaske eine Dichte von 1 Million Bildpunkten pro cm² zu erzeugen. Eine andere Anwendung ist das Konfigurieren kundenspezifischer integrierter Schaltkreise durch selektive Abtragung einer leitenden Schicht, z. B. Aluminium, die funktionale Elemente verbindet. Das System dampft selektiv Verbindungen auf, so dass ein gewünschtes Netzwerk von Elementen verbleibt, um eine Schaltung zu definieren, wie zum Beispiel bei der Reparatur von Speichern. Die Mikroskopanordnung, welche Laserenergie liefert, ist auch nützlich, um die veränderte Fläche abzutasten. Eine Verwendung dieses Merkmals ist die Halbleiter-Lasermarkierung oder das Laserabgleichen und die Speicherreparatur, bei der die Notwendigkeit besteht, die Lage des Werkstücks relativ zu dem optischen System zu bestimmen. Eine andere Verwendung ist die zerstörungsfreie Kantenabtastung.
Bestimmte Grundvarianten, die beschrieben wurden, können für andere Antriebsanordnungen, als die beschrieben verwendet werden. Zahlreiche andere Ausführungen sind möglich und zu erwarten, die eine oder mehrere der beschriebenen Varianten verwenden.
Was beansprucht wird ist:

Claims

Optisches Rastemikroskop mit großem Blickfeld und begrenzter Rotation zur Untersuchung einer Oberfläche eines Objekts (2), mit: einer Abtastanordnung mit einer starren, oszillierenden Drehträgerstruktur (19), die mit einem Antrieb (3, 4) verbunden ist und so aufgebaut ist, um sich in einer periodischen Bewegung über das zu betrachtende Objekt in einem vorgegebenen bogenförmigen Abtastweg (S) über einen Abtastbereich von wenigstens 1 mm zu bewegen, wobei die starre, oszillierende Trägerstruktur eine im wesentlichen konstante optische Wegstrecke dadurch bereitstellt, einer Mikroobjektivlinse (18), die an der oszillierenden Drehträgerstruktur angebracht ist, welche eine Drehachse (A) senkrecht zu der Oberfläche des Objekts hat, um über den ganzen bogenförmigen Abtastbereich auf der Achse abzutasten, und wobei der Antrieb für die Trägerstruktur dazu angepasst ist, um die Trägerstruktur oszillierend zu bewegen, um eine Abtastung des Objekts auf der Achse zu bewirken.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, das weiter eine ortsfeste Optik (18b, 21, 27, 89, 94, 99), die wenigstens zwei Strahlen mit verschiedenen Wellenlängen erzeugt, und ein Vereinigungssystem umfasst, das dazu aufgebaut ist, um die Strahlen in einen einzigen beleuchtenden Strahl zu vereinigen, der auf die Mikroobjektivlinse gerichtet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 1 oder 2, das weiter ein Translationssystem (13) aufweist, um eine lineare Relativbewegung über einen Translationsbereich des abzutastenden Objekts relativ zu der Drehträgerstruktur zu erzeugen, wobei die Richtung der Translation im Wesentlichen senkrecht zum Mittelbereich des begrenzten Drehabtastwegs liegt.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, das so aufgebaut und angepasst ist, um ein Bildgebiet von wenigstens 1 cm² der untersuchten Oberfläche aufzuzeichnen, wobei die numerische Apertur der Linse, ihr Blickfeld, der Abtastbereich und der Translationsbereich in Kooperation so ausgeäwhlt sind, um für eine gegebene Wellenlänge wenigstens eine Million Bildelemente pro cm² des abgetasteten Gebiets zu erzeugen.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, das so aufgebaut ist, um Fluoreszenz zu erfassen, die durch einen durch die Mikroobjektivlinse laufenden Lichtpunkt stimuliert wird.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, 4 oder 5, das als Transmissionsmikroskop aufgebaut ist, mit wenigstens einer ortsfesten Lichtquelle (24, 25, 26), die dazu ausgestaltet ist, um Licht für die Mikroobjektivlinse bereitzustellen, um einen Punkt auf dem betrachteten Objekt zu beleuchten, und mit einem Detektorsystem (95), das auf der gegenüberliegenden Seite des betrachteten Objekts angeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, 4 oder 5, das als Reflexionsmikroskop aufgebaut ist, mit wenigstens einer ortsfesten Lichtquelle (24, 25, 26), die dazu ausgestaltet ist, Licht für die Mikroobjektivlinse bereitzustellen, um einen Punkt auf dem betrachteten Objekt zu beleuchten, und mit einem Detektorsystem (95), das dazu ausgestaltet ist, von dem durch die Mikroobjektivlinse beleuchteten Fleck reflektiertes Licht über die Mikroobjektivlinse zu empfangen.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, 4, 5, 6 oder 7, das aufgebaut ist, um zu erfassendes Licht auf eine Lochblende (103) abzubilden, die einem Detektor vorangeht, um ein Konfokalmikroskop zu bilden.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, bei dem die Drehachse der Drehträgerstruktur ortsfest ist, und das Translationssystem zum Bewirken der relativen linearen Bewegung eine Linearstufe (11) aufweist, die so aufgebaut ist, um das zu betrachtende Objekt unter der oszillierenden Drehstruktur zu bewegen.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, mit einer ortsfesten Optik, die einen Reflektor, der auf der Drehachse der Drehstruktur angeordnet ist und einen Reflektor an der Drehstruktur aufweist, der auf der Drehachse angeordnet ist, wobei die beiden Reflektoren über den Bereich der Drehung der oszillierenden Drehstruktur in einem Strahlengang zwischen der ortsfesten Optik und der abtastenden Objektivlinse angeordnet sind.
Rastermikroskop nach Anspruch 10, wobei die ortsfeste Optik (27) wenigstens zwei Strahlen mit verschiedenen Wellenlängen erzeugt und ein Vereinigungssystem vorhanden ist, das dazu aufgebaut ist, um die Strahlen in einen einzelnen beleuchtenden Strahl gerichtet auf die Mikroobjektivlinse zu vereinigen, wobei die Mikroobjektivlinse eine charakteristische chromatische Aberration hat, und eine Einrichtung vorhanden ist, die in dem Strahlengang von wenigstens einem der Strahlen liegt, um Strahlen einer Wellenlänge auf einen Punkt zu fokussieren, der von dem Brennpunkt der anderen Wellenlänge verschieden ist, wobei die unterschiedlichen Fokussierungseigenschaften der beiden Wellenlängen vorherbestimmt in Beziehung mit den chromatischen Eigenschaften der Mikroobjektivlinse sind, um die Fokussierung der betreffenden Wel- lenlängen durch die Mikroobjektivlinse auf das Objekt zu ermöglichen.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9, mit einer ortsfesten Optik, die eine strahlengangablenkende Einrichtung enthält, die aufgebaut ist, um den Bereich der Mikroobjektivlinse, der im Strahlengang liegt, zu variieren.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12, mit einem Positionsdetektor (43) zum Erfassen der Position der oszillierenden Anordnung und mit einem Datensammlungssystem, das Daten an ausgewählten Positionen, die von dem Positionsdetektor bestimmt werden, sammelt.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13 , wobei der radiale Abstand der Mikroobjektivlinse von dem Drehzentrum der Trägerstruktur mehr als 1 cm beträgt und das Trägheitsmoment der Drehstruktur, aussschließlich des Rotos des Antriebs, weniger als etwa 50 g·cm² beträgt.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13, wobei die Mikroobjektivlinse eine asphärische Mikroobjektivlinse mit einem Blickfeld von weniger als etwa 20 Mikrometer und einer numerischen Apertur von mehr als 0,5 aufweist.
Rastermikroskop nach Anspruch 15 mit einem Steuersystem zum Bewirken einer koordinierten Drehung und Translation des Objekts, wobei das Mikroskop so aufgebaut ist, um Daten aufzunehmen, die während Drehung des Arms im Uhrzeigersinn und entgegen dem Uhrzeigersinn erzeugt werden, wobei das Steuersystem ein Kompensationssystem umfasst, das die Beziehung zwischen der Bewegung der Mikroobjektivlinse und der Translation des Objekts, in einer Weise variiert, die tendenziell dazu führt, den Abstand zwischen den Mittenlinien aufeinanderfolgender Abtastwege im Wesentlichen gleichmäßiger zu machen.
Rastermikroskop nach Anspruch 16, wobei das Kompensationssystem die Position des von einer ortsfesten Lichtquelle herrührenden Strahlengangs auf der Objektivlinse variiert.
Rastermikroskop nach Anspruch 17, wobei das Kompensationssystem einen Schwenkspiegel (89) aufweist.
Rastermikroskop nach Anspruch 15, 16, 17 oder 18 mit einem Tisch (50) zur Aufnahme des Objekts, wobei der Tisch einstellbar ist, um das Objekt zum Fokussieren anzuheben, abzusenken und zu kippen, und mit einem Steuersystem, das dazu aufgebaut ist, um eine Vorababtastung des Objekts durchzuführen, bei der Daten betreffend der Orientierung gespeichert werden, und einem Steuersystem, das auf die gespeicherten Daten reagiert und dazu wirkt, die Hebeeinrichtungen bei fortlaufender Abtastung zu betätigen, um das Objekt im Brennpunkt zu halten.
Rastermikroskop nach Anspruch 1, das dazu aufgebaut ist, um optische Daten über eine bogenförmige Abtastbewegung zu sammeln, und das eine Datensammlungssteuerung umfasst, die dazu ausgelegt ist, um die Datensammlung während der bogenförmigen Abtastbewegung zeitlich zu steuern, um die Datensammlungspunkte mit Spalten eines vorgegebenen orthogonalen Abtastrasters auszurichten, auf das die Daten konvertiert werden.
Rastermikroskop nach Anspruch 20, mit einem Datenkonversionssystem, das dazu ausgelegt ist, um die Daten auf das Abtastraster zu konvertieren, indem für jeden Rasterpunkt die Werte von Datenpunkten nahe des Rasterpunkts gemittelt werden, wobei die Werte mit ihren jeweiligen Abständen von dem fraglichen Rasterpunkt gewichtet werden.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, wobei der Antrieb und das Translationssystem dazu aufgebaut und ausgelegt sind, das Objekt in Form eines Objektträgers abzutasten.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, wobei der Antrieb und das Translationssystem dazu aufgebaut und ausgelegt sind, um das Objekt in Form eines DNA-Chips abzutasten.
Rastermikroskop nach Anspruch 3, wobei der Antrieb und das Translationssystem dazu aufgebaut und ausgelegt sind, um das Objekt in Form eines Hybridisierungs-Arrays abzutasten.
Rastermikroskop, das dazu aufgebaut ist, um optische Daten über bogenförmige Abtastwege auf der Oberfläche des zu untersuchenden Objekts zu sammeln, mit einer Mikroobjektiylinse (18), die dazu ausgelegt ist, entlang eines bogenförmigen Wegs über die Oberfläche gedreht zu werden, wobei die Drehachse im Wesentlichen senkrecht zu der Oberfläche steht, und mit einer Datensammlungs-Steuerungseinrichtung zur zeitlichen Steuerung der Datensammlung während der bogenförmigen Abtastbewegung, um die Datensammlungspunkte mit denen eines vorgegebenen orthogonalen Abtastrasters auszurichten, auf das die Daten zu konvertieren sind.
Rastermikroskop nach Anspruch 25, wobei die Mikroobjektivlinse eine asphärische Linse ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 25 oder 26, das dazu aufgebaut ist, um Fluoreszenz zu erfassen, die durch einen Lichtfleck, der durch die Mikroobjektivlinse fällt, stimuliert wird.
Rastermikroskop nach Anspruch 25, 26 oder 27, das als Reflexionsmikroskop aufgebaut ist, mit wenigstens einer ortsfesten Lichtquelle, die dazu ausgelegt ist, um Licht für die Mikroobjektivlinse bereitzustellen, um einen Fleck auf dem betrachteten Objekt zu beleuchten, und mit einem Detektorsystem, das dazu ausgestaltet ist, von dem durch die Mikroobjektivlinse beleuchteten Fleck reflektiertes Licht über die Mikroobjektivlinse zu empfangen.
Rastermikroskop nach Anspruch 28, das dazu aufgebaut ist, zu detektierendes Licht auf eine Lochblende abzubilden, die dem Detektor vorangeht, um ein Konfokalmikroskop zu bilden.
Rastermikroskop nach Anspruch 28 oder 29, mit einem Positionsdetektor zum Erfassen der Position der Mikroobjektivlinse, wobei das Datenerfassungssystem Daten an von dem Positionsdetektor gelieferten Positionen sammelt.
Rastermikroskop nach Anspruch 27, das weiter ein Translationssystem aufweist, um eine lineare Relativbewegung über einen Translationsbereich des abzutastenden Objekts relativ zu einer Drehstruktur zu erzeugen, die die Mikroobjektivlinse trägt, welche von einem Antrieb bewegt wird, wobei die Richtung der Translation im Wesentlichen senkrecht zum Mittelbereich des begrenzten Drehabtastwegs liegt.
Rastermikroskop nach Anspruch 31, wobei der Antrieb und das Translationssystem dazu aufgebaut und dazu ausgestaltet sind, um das Objekt in Form eines Objektträgers abzutasten.
Rastermikroskop nach Anspruch 31, wobei der Antrieb und das Translationssystem dazu aufgebaut und ausgelegt sind, um das Objekt in Form eines DNA-Chips abzutasten.
Rastermikroskop nach Anspruch 31, wobei der Antrieb und das Translationssystem dazu aufgebaut und ausgelegt sind, um das Objekt in Form eines Hybridisierungs-Arrays abzutasten.
Verfahren zur Rasteruntersuchung einer Oberfläche eines Objekts durch ein Rastermikroskop mit großem Blickfeld und mit begrenzter Drehabtastung, wobei: die Oberfläche des Objekts abgetastet wird, indem eine Mikroobjektivlinse in einem vorgegebenen bogenförmigen Abtastweg über einen Abtastbereich von wenigstens 1 mm periodisch bewegt wird, indem eine starre Drehträgerstruktur, die die Mikroobjektivlinse (18) trägt, oszillierend bewegt wird, wobei die Drehachse der Drehträgerstruktur senkrecht zur Oberfläche des Objekts steht, um im wesentlichen eine Abtastung auf der Achse über den bogenförmigen Abtastbereich zu erzielen, wobei der Strahlengang des Lichts von der Mikroobjektivlinse (18) durch die Drehträgerstruktur über den Abtastbereich konstant ist.
Rasteruntersuchungsverfahren nach Anspruch 35, bei dem Fluoreszenz erfasst wird, die durch einen Lichtfleck, der durch die Mikroobjektivlinse fällt, stimuliert wird.
Rasteruntersuchungsverfahren nach Anspruch 35, bei dem Licht von wenigstens einer ortsfesten Lichtquelle auf die Mikroob- jektivlinse geworfen wird, ein Fleck auf dem betrachteten Objekt beleuchtet wird und durch ein Detektorsystem Licht durch die Mikroobjektivlinse empfangen wird, das von dem durch die Objektivlinse beleuchteten Fleck reflektiert wird.
Rasteruntersuchungsverfahren nach Anspruch 35, bei dem durch ein Translationssystem eine lineare Relativbewegung über einen Translationsbereich des abgetasteten Objekts relativ zu der Drehstruktur, die die durch einen Antrieb bewegte Mikroobjektivlinse trägt, erzeugt wird, wobei die Richtung der Translation im wesentlichen senkrecht zum Mittelbereich des begrenzten Drehabtastweges liegt.
Rasteruntersuchungsverfahren nach Anspruch 35, bei dem das Objekt in Form eines Objektträgers abgetastet wird.
Rasteruntersuchungsverfahren nach Anspruch 35, bei dem das Objekt in Form eines DNA-Chips abgetastet wird.
Rasteruntersuchungsverfahren nach Anspruch 35, bei dem das Objekt in Form eines Hybridisierungs-Arrays abgetastet wird.