DE69902662T2

DE69902662T2 - Redox-reversibele bipyridyl-osmiumkomplex-konjugate

Info

Publication number: DE69902662T2
Application number: DE69902662T
Authority: DE
Inventors: B. Harvey BUCK; D. Zhi DENG
Original assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2009-10-08
Anticipated expiration: 2019-05-29
Also published as: US6294062B1; DE69902265D1; US6262264B1; ATE221076T1; CA2333875A1; CA2333686C; EP1084409B1; ES2182530T3; AU4217899A; AU4215799A; DE69917258D1; ATE222915T1; CA2333875C; CA2333686A1; DE69902265T2; DE69902662D1; EP1084133A1; EP1084133B1; US20020090632A1; ES2179660T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neuartige redoxreversible Konjugate. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Bipyridyl-komplexierte Osmium-Konjugate, die zum Nachweisen und Quantifizieren biologisch relevanter Analyten in einer Flüssigkeitsprobe brauchbar sind.
Hintergrund und Kurzbeschreibung der Erfindung
Die heute von praktischen Ärzten bei der Behandlung ihres Patientenbestands angewandten therapeutischen Verfahren erfordern genaue und zweckdienliche Methoden zur Überwachung von Krankheitszuständen am Patienten. Viele Bemühungen richteten sich auf die Erforschung und Entwicklung von Methoden zur Messung des Vorhandenseins und/oder der Konzentration biologisch relevanter Substanzen, die auf einen klinischen Befund oder einen Krankheitszustand hinweisen, insbesondere in Körperflüssigkeiten wie etwa Blut, Urin oder Speichel. Diese Methoden wurden entwickelt, um die Existenz oder Schwere einer Fülle von Krankheitszuständen, etwa Diabetes, Stoffwechselstörungen, hormonale Störungen, zu erfassen und das Vorhandensein und/oder die Konzentration ethischer Arzneimittel oder illegaler Drogen zu überwachen. In neuerer Zeit gab es bedeutende Fortschritte bei der Anwendung affinitätsbasierter elektrochemischer Nachweis-/Meßtechniken, die zumindest teilweise auf der Bildung eines Komplexes zwischen der zu analysierenden chemischen Spezies (”Analyt”) und einer weiteren Spezies beruhen, an die diese spezifisch bindet (”spezifischer Bindungspartner”). Bei diesen Verfahren wird typischerweise ein markiertes Ligandanalogon des Zielanalyten eingesetzt, wobei das Ligandanalogon so ausgewählt ist, daß es kompetitiv mit dem Analyt an den spezifischen Bindungspartner bindet. Das Ligandanalogon ist markiert, so daß das Ausmaß der Bindung des markierten Ligandanalogons an den spezifischen Bindungspartner gemessen und mit dem Vorhandensein und/oder der Konzentration des Zielanalyts in der biologischen Probe korreliert werden kann. Typische Assays der obengenannten Art sind z. B. in WO 86/02734 , WO 93/25907 , WO 94/14066 , WO 97/01097 , WO 97/32886 und DE-A-43 44 646 beschrieben.
Bei diesen affinitätsbasierten Techniken zum Analysieren einer Probe werden zahlreiche Markierungen eingesetzt, darunter Enzymmarkierungen, Radioisotopenmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen und Markierungen mit chemischen Spezies, die eine elektrochemische Oxidation und/oder Reduktion eingehen. Bei der Verwendung redoxreversibler Spezies – die bisweilen als Elektronenüberträger oder Elektronenvermittler bezeichnet werden – als Markierungen für Ligandanaloga hat sich gezeigt, daß praktisch verwertbare und verläßliche Ergebnisse bei affinitätsbasierten elektrochemischen Assays erhalten werden. Die Anwendung elektrochemischer Techniken zum Nachweisen und Quantifizieren von Konzentrationen derartiger redoxreversibler Spezies (die mit den Analytkonzentrationen korrelieren) ist jedoch nicht ohne Probleme. Elektrochemische Messungen unterliegen vielen Einflüssen, die die Genauigkeit der Messungen beeinträchtigen, darunter nicht nur solchen, die mit Veränderungen in der Elektrodenstruktur selbst und/oder Matrixeffekten in Zusammenhang stehen, die sich aus der Variabilität der Flüssigkeitsproben ergeben, sondern auch solchen, die sich aus Störungen zwischen mehreren elektroaktiven Spezies ergeben, insbesondere wenn Analysevorschriften den Nachweis oder die Quantifizierung mehrerer elektroaktiver Spezies erfordern.
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige diffusionsfähige redoxreversible Osmium-Bipyridyl-Konjugate, die in Immunsensoren brauchbar sind, die entweder auf indirekten elektrochemischen Nachweistechniken mit Verstärkung oder auf der direkten elektrochemischen Messung nachweisfähiger Spezies mit Elektroden mit Mikroanordnung unter bipotentiostatischer Kontrolle beruhen. Ein Os-Bipyridyl-Komplex kann beispielsweise covalent an ein Peptid gebunden sein, das die Aminosäuresequenz des Bindungsepitops für einen Antikörper aufweist. Wird das Os-Komplex/Peptid-Konjugat an einen Antikörper gebunden, so hat das Konjugat keine elektrochemische Funktion mehr; es wird als ”gehemmt” bezeichnet. Ein in der Probe vorhandener Analyt wird typischerweise mit dem Os-Bipyridyl-Komplex/Peptid-Konjugat um die begrenzte Anzahl Bindungsstellen am Antikörper konkurrieren. Ist mehr Analyt vorhanden, so wird mehr freies Os-Bipyridyl-Komplex/Peptid-Konjugat in einem ungebundenen diffusionsfähigen Zustand verbleiben und einen höheren Strom an einer Sensorelektrode erzeugen, d. h., an einer der Arbeitselektroden, wo gemessene Ereignisse (Oxidation oder Reduktion) stattfinden. Ist im umgekehrten Fall weniger Analyt vorhanden, so wird mehr Indikator/Peptid-Konjugat am Antikörper gebunden, was zu weniger freiem Konjugat führt und eine niedrigere Stromstärke an den Arbeitselektroden ergibt. Der an einer der Arbeitselektroden erfaßte Strom ist daher von der Analytkonzentration abhängig.
Häufig will man mehr als eine Analytspezies in einer Flüssigkeitsprobe messen. Die Messung mehrerer Spezies in einer Mischung wurde mit Photometrie und Fluoreszenz durch Auswählen geeigneter Wellenlängen erreicht. Elektrochemische Messungen einer einzigen Spezies in einer komplexen Mischung werden routinemäßig durchgeführt durch Auswählen eines Potentials, bei dem nur die gewünschte Spezies oxidiert oder reduziert wird (Amperometrie), oder durch Abstufen oder Ändern des Potentials über einen Bereich, in dem nur die gewünschte Spezies ihre elektrochemischen Eigenschaften ändert (Wechselstrom- und Pulsverfahren). Diese Verfahren weisen Nachteile auf, darunter mangelnde Empfindlichkeit und mangelnde Spezifität, Störung durch Lade- und Matrixpolarisationströme (Pulsverfahren) sowie Elektrodenverschmutzung, da keine geeignete Überspannung angelegt werden kann. Zudem sind elektrochemische Messungen kompliziert aufgrund der Störungen zwischen der Vielzahl elektroaktiver Spezies, die in biologischen Proben im allgemeinen noch vorhanden sind.
Bekannt sind Elektrodenstrukturen, die einen stationären Strom über Diffusionsrückführung erzeugen, darunter Elektroden mit Interdigitalanordnung (IDA) (1 und 2) und Parallelplattenanordnungen mit bipotentiostatischer Steuerung. Sie werden verwendet, um reversible Spezies auf der Grundlage des stationären Stroms zu messen, der durch Kreislaufführung der reversiblen Spezies erzielt wird. Ein reversibler Vermittler (redoxreversible Spezies) wird auf den miteinander verzahnten Elektrodenfingern abwechselnd oxidiert und reduziert. Der stationäre Strom ist zur Vermittlerkonzentration proportional (3) und wird durch die Diffusion des Vermittlers begrenzt. Ein stationärer Strom wird innerhalb von Sekunden nach Anlegen des vorbestimmten Anoden- (positiveren) und Kathodenpotentials (weniger positiv bzw. negativ) (6) an die Mikroelektrodenanordnung erreicht. Die Steigung der Kurve von IDA-Strom gegen Vermittlerkonzentration ist abhängig von den IDA-Abmessungen, und die Steigung nimmt mit engeren Elektrodenabständen zu (7).
Die vorliegende Erfindung macht neuartige Osmium/Bipyridyl-Komplex-Konjugate verfügbar, die für ein Verfahren zur Messung mehrerer Analytspezies in der gleichen Probe und optimalerweise auf der gleichen Elektrodenstruktur brauchbar sind und so die Genauigkeit der relativen Messungen verbessern. Die vorliegenden Konjugate können mit anderen elektroaktiven Konjugatspezies verwendet werden, die eigenständige Redoxpotentiale aufweisen, um so einen elektrochemi schen Biosensor bereitzustellen, der verbesserte Genauigkeit ergibt. Die Analytkonzentration kann aus den elektrometrischen Daten gemessen/berechnet werden, die mit der gleichen Flüssigkeitsprobe und der gleichen Elektrodenstruktur erhalten werden, so daß Störungen aufgrund der Veränderlichkeit der Probe oder der Elektrodenstruktur minimiert werden.
Die erfindungsgemäßen diffusionsfähigen Osmium-Konjugate werden bei Analysen verwendet, die auf dem Prinzip der Diffusionsrückführung beruhen, wobei eine diffusionsfähige redoxreversible Spezies an nahegelegenen Elektroden (den Arbeitselektroden) abwechselnd oxidiert und reduziert wird, um so einen meßbaren Strom zu erzeugen. Da abwechselnde Oxidation und Reduktion zur Messung erforderlich ist, werden nur elektroaktive Spezies gemessen, die beim vorbestimmten Redoxpotential elektrochemisch reversibel sind, so daß eine Beeinflussung oder Störung durch nichtreversible elektroaktive Spezies in der Probe oder andere redoxreversible Spezies mit eigenständigem Redoxpotential (wenigstens 50 Millivolt unterschiedlich) beseitigt oder zumindest verringert wird. Redoxreversible Spezies mit unterschiedlichen Oxidationspotentialen lassen sich unabhängig voneinander in einer Mischung messen durch Auswahl und bipotentiostatische Steuerung der Oxidations- und Reduktionspotentiale für benachbarte Elektrodenpaare, so daß nur die fragliche Spezies an der Anode oxidiert und an der Kathode reduziert wird. Sind die Arbeitselektroden so bemessen, daß eine Diffusionsrückführung der redoxreversiblen Spezies bei den für diese Spezies gewählten geeigneten Oxidations- und Reduktionspotentialen möglich ist, so stellt sich schnell ein stationärer Strom durch die Probe und die Elektrodenstruktur ein. Die Größe des Stroms an den Arbeitselektroden, wo die meßbaren Oxidations- und Reduktionsereignisse stattfinden, ist proportional zur Konzentration der redoxreversiblen Spezies in der Probe. Werden zwei oder mehr redoxreversible Spezies eingesetzt, so werden diese so ausgewählt, daß sich ihre Redoxpotentiale um wenigstens 50 Millivolt, besonders bevorzugt wenigstens 200 Millivolt voneinander unterscheiden, um Störungen zwischen einer Spezies und einer anderen bei der Messung des jeweiligen stationären Stroms zu minimieren. Die vorliegenden Osmium-Komplex-Konjugate haben eigenständige Redoxpotentiale, so daß sie auch in Gegenwart anderer elektroaktiver Konjugate ohne (oder mit minimaler) Störung verwendet werden können.
Die vorliegenden Konjugate können bei allen Elektrodenstrukturen/systemen verwendet werden, bei denen Diffusionsrückführung möglich ist, um beim Anlegen vorher gewählter Anoden- und Kathodenpotentiale, die für die komplexe Spezies spezifisch sind, einen stationären Strom zu erzielen. Zu den geeigneten Elektrodenstrukturen zählen Mikroelektroden mit Interdigitalanordnung und Parallelplattenelektroden, die durch Abstände innerhalb der Diffusionsentfernung der jeweiligen redoxreversiblen Spezies voneinander getrennt sind. Die Elektrodenstrukturen umfassen typischerweise eine Bezugselektrode (z. B. Ag/AgCl), wenigstens zwei Arbeitselektroden und gegebenenfalls eine Hilfselektrode zur Stromregelung. Im Gebrauch wird ein programmierbarer Bipotentiostat an die Elektrodenstruktur elektrisch angeschlossen, um die jeweiligen Anoden- und Kathodenpotentiale anzulegen, die für die jeweiligen redoxreversiblen Spezies spezifisch sind, die bei dem Verfahren/Biosensor verwendet werden. Es wurden mehrere neuartige Osmium-Komplexe, darunter diejenigen der vorliegenden Erfindung, zur Verwendung als Markierung entwickelt, um ligandanaloge Konjugate mit ausreichenden Potentialdifferenzen (wenigstens 50 Millivolt) herzustellen, so daß zwei Osmium-Komplexe (im Gegensatz zu einem Osmium-Komplex und einer Ferrocen- oder einer anderen redoxreversiblen Markierung) bei elektrochemischen Assays auf der Grundlage mehrerer Konjugate verwendet werden können.
Die vorliegenden Osmium-Konjugate sind brauchbar für ein Verfahren zur Messung der Konzentration eines oder mehrerer Analyten in einer Flüssigkeitsprobe. Das Verfahren umfaßt das Zusammenbringen eines Teils der Probe mit vorbestimmten Mengen wenigstens einer ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies mit einem Redoxpotential, das sich um wenigstens 50 Millivolt von dem einer jeden anderen Spezies unterscheidet. Jede dieser Spezies umfaßt ein in der Flüssigkeitsprobe diffusionsfähiges Konjugat aus einem Ligandanalogon eines Analyts in der Flüssigkeitsprobe und einer redoxreversiblen Markierung. Die Flüssigkeitsprobe wird auch mit einer vorbestimmten Menge wenigstens eines spezifischen Bindungspartners für den jeweiligen Analyt zusammengebracht. Das diffusionsfähige Konjugat ist so ausgewählt, daß es mit dem spezifischen Bindungspartner um den Analyt konkurrieren kann. Die Konzentration der diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies in der Flüssigkeitsprobe wird dann elektrochemisch bestimmt. Die Probe wird mit einer Elektrodenstruktur in Berührung gebracht, die eine Bezugselektrode und wenigstens eine erste und zweite Arbeitselektrode umfaßt, die so bemessen sind, daß wenigstens eine der diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies in der Probe durch Diffusion zurückgeführt werden kann, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential an der einen Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode angelegt wird. Typischerweise wird ein erstes Kathodenpotential an die erste Arbeitselektrode und ein erstes Anodenpotential an die zweite Arbeitselektrode angelegt, so daß sich aufgrund der Diffusionsrückführung der ersten redoxreversiblen Spezies ein Stromfluß durch die Probe ohne wesentliche Störung durch die zweite redoxreversible Spezies einstellen kann. Der Stromfluß durch eine oder mehrere der Elektroden beim ersten Anoden- und Kathodenpotential wird gemessen. In ähnlicher Weise wird der Stromfluß beim Anlegen eines zweiten Anoden- und Kathodenpotentials an die mit der Probe in Berührung stehenden Elektroden gemessen und mit den gemessenen Stromflüssen für bekannte Konzentrationen der jeweiligen redoxreversiblen Spezies korreliert, wobei die Konzentrationen proportional zu den jeweiligen Analytkonzentrationen sind.
Die Reagenskomponenten, umfassend die vorliegenden erfindungsgemäßen Bipyridyl/Osmium-Konjugate und die spezifischen Bindungspartner, können in Form eines Testkits zum Messen von Zielanalyt(en) in einer Flüssigkeitsprobe entweder als getrennte Reagenzien oder mehrbevorzugt kombiniert als Multireagenszusammensetzung, z. B. kombinierte redoxreversible Spezies, kombinierte spezifische Bindungspartner oder kombinierte redoxreversible Spezies und spezifische Bindungspartner bereitgestellt werden. Gegebenenfalls, jedoch bevorzugt, enthält das Kit eine Elektrodenstruktur, die so bemessen ist, daß Diffusionsredoxrückführung der diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies in der Flüssigkeitsprobe möglich ist. Die Elektrodenstruktur umfaßt Leiter zum Anschließen der Struktur an einen Bipotentiostaten, der so programmiert ist, daß er je nach redoxreversibler Spezies ein Anoden- und Kathodenpotential an die Elektrodenstruktur anlegt und den Stromfluß aufgrund dieser Potentiale typischerweise an einer oder beiden Arbeitselektroden abfühlt und mißt.
Diese Erfindung beruht auf der Herstellung und Anwendung elektrochemisch nachweisbarer Osmiumkomplexe und covalenter Konjugate dieser Komplexe mit Oxidationspotentialen, die sich hinreichend von denen anderer redoxreversibler Komplexe unterscheiden, so daß sie zusammen mit anderen Osmium-Konjugaten oder solchen anderer Metalle verwendet werden können. Somit werden neuartige Osmium-markierte Ligandanaloga bereitgestellt, die an einen spezifischen Bindungspartner eines biologisch relevanten Analyts binden können. Die elektrochemisch nachweisbaren Osmium-Konjugate umfassen einen Tris(bipyridyl)osmium-Komplex, der gekennzeichnet ist durch schnelle Vermittlungskinetik und niedriges Redoxpotential (+150 mV gegen Ag/AgCl). Zu einer weiteren Gruppe Osmiumkomplex-markierter, elektrochemisch nachweisbarer Konjugate, die mit den vorliegenden Komplexen bei Multikonjugat-Analysenverfahren verwendet werden können, zählen Bis(bipyridyl)imidazolyl-halogenoosmium-Komplexe, die wie die Tris(bipyridyl)osmium-Komplexe durch schnelle Vermittlungskinetik gekennzeichnet sind, doch weisen die Tris(bipyridyl)-Komplexe ein Redoxpotential auf, das sich hinreichend von dem der Bis(bipyridyl)imidazolyl-halogenoosmium-Komplexe unterscheidet, so daß sie zusammen bei Analysen unter Verwendung von Mikroelektroden-Anordnungen verwendet werden können, um mehr als einen Analyt in einer Flüssigkeitsprobe mit Hilfe konzentrationsabhängiger Ströme zu messen, die durch Diffusionsredoxrückführung verstärkt werden.
Die vorliegenden Osmium-Komplex-Konjugate können in Kombination mit einer anderen konjugierten redoxreversiblen Spezies zur Messung sowohl von glycosyliertem Hämoglobin als auch Hämoglobin in einer lysierten Blutprobe verwendet werden. Die eine redoxreversible Spezies umfaßt vorzugsweise einen Imidazol-Osmium-Komplex, der covalent an ein Ligandanalogon von Hämoglobin oder glycosyliertem Hämoglobin gebunden ist, und die zweite redoxreversible Spezies umfaßt eine zweite redoxreversible Markierung, die covalent an ein Ligandanalogon des anderen der beiden Zielanalyte gebunden ist. Das Verfahren ermöglicht die Messung der Konzentration sowohl von glycosyliertem Hämoglobin (HbA1c) und der Konzentration von Gesamthämoglobin oder von unglycosyliertem Hämoglobin (HbA₀), so daß es möglich ist, die Ergebnisse als Verhältnis der beiden Messungen zu berechnen (% HbA1c). Es ist von Vorteil, sowohl HbA1c und Gesamthämoglobin (oder HbA₀) unter Anwendung des gleichen Prinzips in nur einer Probe zu analysieren, insbesondere weil durch die Verhält nisbildung Fehler durch Umgebungseinflüsse minimiert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein vergrößerter Grundriß einer Elektrode mit Interdigitalanordnung zur Messung eines reversiblen Vermittlers.
2 ist eine Teilquerschnittansicht der Elektrode von 1, die die Bedingungen des durch Diffusion des Vermittlers (M) begrenzten stationären Stroms erläutert.
3 ist eine graphische Darstellung der Dosis-Ansprech-Ströme für ein Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-Vermittler/Peptid-Konjugat.
4 ist eine graphische Darstellung des Stromflusses gegen die Konzentration von glycosyliertem Hämoglobin (HbA1c) in Blutproben unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Osmium-Konjugats mit enzymverstärkter Gleichstromamperometrie.
5 ist eine graphische Darstellung der Hemmung des Stromflusses aufgrund freien Konjugats als Funktion der Antikörper-Konzentration (Cn), gemessen mittels enzymverstärkter Gleichstromamperometrie [C₁ > C₂ > C₃].
6 ist eine graphische Darstellung des Stromflusses gegen die Zeit unter Verwendung einer Elektrode mit Interdigitalanordnung.
7 ist eine graphische Darstellung des Einflusses der Abmessungen der Elektrodenstruktur mit Interdigitalanordnung auf den Stromfluß als Funktion der Konzentration eines Osmium-Konjugats (Os-DSG-A1c).
8 ist eine graphische Darstellung des Stromflusses als Funktion des angelegten Potentials für eine Flüssigkeitsprobe, die äquimolare Mengen (50 μM) eines Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-Komplexes und eines erfindungsgemäßen Tris(bipyridyl)osmium-Komplexes enthält.
9 ist eine graphische Darstellung des Stromflusses gegen die Konzentration eines Ferrocen/Biotin-Konjugats in Gegenwart wechselnder Mengen eines Osmium-Komplex-Konjugats auf Elektroden mit Interdigitalanordnung mit bipotentiostatischer Regelung.
10 ist eine graphische Darstellung des Einflusses der Konzentration eines nichtmarkierten Konjugats (BSA-A1c) auf den Stromfluß in einer Lösung, die Osmium-markiertes Konjugat (Osmium-DSG-A1c) in Gegenwart dreier verschiedener A1c-erkennender Antikörper-Zusammensetzungen enthält.
11 zeigt die Struktur eines Tris(bipyridyl)osmium-markierten Konjugats.
12–14 sind ähnlich und zeigen jeweils die chemische Struktur eines Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-markierten Peptid-Konjugats.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die diffusionsfähige redoxreversible Spezies dieser Erfindung ist ein in einer Flüssigkeitsprobe diffusionsfähiges Konjugat aus einem Ligandanalogon eines Analyts und einem redoxreversiblen Bipyridyl-Osmium-Komplex. Der Begriff ”redoxreversibel” wie hierin verwendet bezieht sich auf eine chemische Spezies, die reversible Oxidation und Reduktion in einer Flüssigkeitsprobe eingehen kann. Redoxreversible Markierungen sind in der Fachwelt bekannt, und dazu zählen Ligandkomplexe von Übergangsmetallionen, zum Beispiel von Eisen (Ferrocen und Ferrocen-Derivate), Ruthenium und Osmium. Das Konjugat wird hergestellt durch Verknüpfen des Ligandanalogons mit der Markierung – entweder covalent durch difunktionelle Verknüpfungsagenzien oder durch Kombination covalenter Verknüpfungen mit in der Fachwelt anerkannten spezifischen bindenden Einheiten (zum Beispiel Biotin-Avidin).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein redoxreversibler Osmiumkomplex der Formel
worin
R und R₁ gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei der Substituent jeweils eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist,
R₅ 4-substituiertes 2,2'-Bipyridyl oder 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl ist, wobei der Substituent die Gruppe B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist und der 4'-Substituent eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist;
R, R₁ und R₅ über ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert sind;
Q O, S oder NR₄ ist, worin R₄ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist;
-L- ein bivalenter Linker ist;
k 1 oder 0 ist;
i 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist;
B Wasserstoff oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfaßt, der an einen spezifischen Bindungspartner zu binden imstande ist;
d +2 oder +3 ist;
X und Y Anionen sind, ausgewählt aus den monovalenten Anionen Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat und Nitrat, und divalenten Anionen, z. B. Sulfat, Carbonat oder Sulfit, wobei x und y unabhängig voneinander 0, 1, 2 oder 3 sind, so daß die Nettoladung von X_xY_y –2 oder –3 ist.
Ein anderer redoxreversibler Osmium-Komplex, der bei den vorliegenden Imidazol-Osmium-Konjugaten verwendet werden kann, ist eine Verbindung der Formel
worin
R und R₁ gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei der Substituent jeweils eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist,
R und R₁ über ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert sind;
q 1 oder 0 ist;
R₇ B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist;
R₂ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist wenn q 1 ist, und R₂ B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist wenn q 0 ist;
wobei in der Gruppe B-(L)_k-Q(CH₂)_i-
Q O, S oder NR₄ ist, worin R₄ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist;
-L- ein bivalenter Linker ist;
k 1 oder 0 ist;
i 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist; und
B Wasserstoff oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfaßt, der an einen spezifischen Bindungspartner zu binden imstande ist;
Z Chlor oder Brom ist;
m +1 oder +2 ist;
X ein monovalentes Anion ist, z. B. Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat, Nitrat, oder ein divalentes Anion, z. B. Sulfat, Carbonat oder Sulfat;
Y ein monovalentes Anion ist, z. B. Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat oder Nitrat; und
n 1 oder null ist,
mit der Maßgabe, daß, wenn X ein divalentes Anion ist, n null ist, und wenn m 1 ist, n null ist und X kein divalentes Anion ist.
Redoxreversible Konjugatspezies einer jeden dieser Formeln werden hergestellt aus den entsprechenden Verbindungen, worin k 0 ist und B Wasserstoff ist, durch Umsetzung dieser Verbindungen entweder mit einem heterofunktionellen Vernetzer der Formel S-L'-T, worin L' ein bivalenter Linker ist und S und T unterschiedliche elektrophile Gruppen sind, die mit einer nucleophilen Gruppe unter Bildung einer covalenten Bindung reagieren können, oder mit einem homofunktionellen Vernetzer der Formel S-L'-T, worin L' ein bivalenter Linker ist und S und T gleiche elektrophile Gruppen sind, die mit einer nucleophilen Gruppe unter Bildung einer covalenten Bindung reagieren können. Die resultierenden Produk te werden dann mit Ligandanaloga unter den Bedingungen einer klassischen Kupplungsreaktion umgesetzt, um die Konjugatspezies zu ergeben. Die Oxidationspotentiale der jeweiligen vorstehend definierten Bis(bipyridyl)imidazolyl- und Tris(bipyridyl)osmium-Komplexe sind derart, daß die jeweiligen Komplexe bei der Durchführung des Verfahrens als reversible Redoxmarkierungen für die jeweilige redoxreversible Spezies verwendet werden können. 8 zeigt ein Cyclovoltammogramm für eine Flüssigkeitsprobe, die äquimolare Mengen (50 μM) eines Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-Komplexes und eines Tris(bipyridyl)osmium-Komplexes enthält.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist der spezifische Bindungspartner für den jeweiligen Analyt ein Antikörper, und das Ligandanalogon wird so ausgewählt, daß es kompetitiv mit dem Analyt an den Antikörper bindet. Es gibt jedoch auch andere Beispiele für Wechselwirkungen von Ligand/spezifischer Bindungspartner, die zur Entwicklung von Anwendungen für das vorliegende Verfahren genutzt werden können.

Beispiele für Liganden und spezifische Bindungspartner für diese Liganden sind nachstehend aufgeführt.

Ligand	Spezifischer Bindungspartner
Antigen (z. B. eine Arzneimittelsubstanz)	Spezifischer Antikörper
Antikörper	Antigen
Hormon	Hormon-Rezeptor
Hormon-Rezeptor	Hormon
Polynucleotid	Komplementärer Polynucleotid-Strang
Avidin	Biotin
Biotin	Avidin
Protein A	Immunglobulin
Immunglobulin	Protein A
Enzym	Enzymcofaktor (Substrat)
Enzymcofaktor (Substrat)	Enzym
Lektine	Spezifisches Kohlenhydrat
Spezifisches Kohlenhydrat für Lektine	Lektine

Der Begriff ”Antikörper” bezieht sich auf (a) eine der verschiedenen Klassen oder Unterklassen der Immunglobuline, z. B. IgG, IgM, die von irgendeinem der üblicherweise verwendeten Tiere stammen, z. B. Schaf, Kaninchen, Ziege oder Maus; (b) monoklonale Antikörper, (c) intakte Moleküle oder ”Fragmente” von Antikörpern, monoklonal oder polyklonal, wobei die Fragmente solche sind, die die bindende Region des Antikörpers enthalten, d. h., Fragmente ohne den Fc-Teil (z. B. Fab, Fab', F(ab')₂) oder die sogenannten ”Halbmolekül”-Fragmente, die durch reduktive Spaltung der Disulfid-Bindungen erhalten werden, die die Schwerketten-Komponenten im intakten Antikörper verbinden. Die Herstellung solcher Antikörper ist in der Fachwelt bekannt.
Der Begriff ”Antigen”, der zur Beschreibung und Definition der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt sowohl permanent antigene Spezies (zum Beispiel Proteine, Peptide, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) als auch Haptane, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können.
Die vorliegenden Osmium-markierten Konjugate sind allein oder in Kombination mit anderen Konjugaten bei Verfahren zur Messung der Konzentration eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigkeitsprobe brauchbar. Eines der Verfahren ermöglicht zwei oder mehr unabhängige amperometrische Messungen der Probe auf nur einer Elektrodenstruktur. Das Verfahren umfaßt:
das Zusammenbringen eines Volumens der Flüssigkeitsprobe mit

1) vorbestimmten Mengen wenigstens einer ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies, wobei die jeweilige Spezies ein Redoxpotential aufweist, das sich um wenigstens 50 Millivolt von dem der jeweiligen anderen Spezies unterscheidet, wobei wenigstens eine Spezies ein in der Flüssigkeitsprobe diffusionsfähiges Konjugat aus einem Ligandanalogon eines Analyts in der Flüssigkeitsprobe und einer redoxreversiblen Markierung umfaßt und das Konjugat zur kompetitiven Bindung mit einem spezifischen Bindungspartner für den Analyt imstande ist, und
2) eine vorbestimmte Menge wenigstens eines spezifischen Bindungspartners für den jeweiligen zu messenden Analyt; und

Inberührungbringen der Probe mit einer Elektrodenstruktur, umfassend eine Bezugselektrode und wenigstens eine erste und zweite Arbeitselektrode, die so bemessen sind, daß Diffusionsrückführung der diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies in der Probe möglich ist, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential an der einen Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei die Diffusionsrückführung der Spezies ausreichend ist, um einen meßbaren Strom durch die Probe aufrechtzuerhalten,
Anlegen eines ersten Kathodenpotentials. an die erste Arbeitselektrode und eines ersten Anodenpotentials an die zweite Arbeitselektrode, wobei das erste Kathoden- und Anodenpotential den jeweiligen Potentialen entspricht, die erforderlich sind, damit sich ein Stromfluß durch die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der ersten redoxreversiblen Spezies ohne wesentliche Störung durch die zweite redoxreversible Spezies einstellt,
Messen des Stromflusses beim ersten Anoden- und Kathodenpotential,
Anlegen eines zweiten Kathodenpotentials an die erste oder zweite Arbeitselektrode und eines zweiten Anodenpotentials an die andere Arbeitselektrode, wobei das zweite Kathoden- und Anodenpotential den jeweiligen Potentialen entspricht, die erforderlich sind, damit sich ein Stromfluß durch die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der zweiten redoxreversiblen Spezies ohne wesentliche Störung durch die erste redoxreversible Spezies einstellt,
Messen des Stromflusses beim zweiten Anoden- und Kathodenpotential, und
Korrelieren des jeweiligen gemessenen Stromflusses mit dem für bekannte Konzentrationen der jeweiligen diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies, wobei diese Konzentrationen proportional zu den jeweiligen Analyt-Konzentrationen sind.
Dieses Verfahren ist in sehr breitem Umfang anwendbar, kann aber insbesondere zur Analyse von Arzneimitteln, Hormonen, darunter Peptid-Hormone (z. B. thyreoideastimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), follikelstimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolaktin) oder Nichtpeptid-Hormone (z. B. Steroid-Hormone wie etwa Cortisol, Estradiol, Progesteron und Testosteron oder Schilddrüsenhormone wie etwa Thyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteinen (z. B. menschliches Choriongonadotropin (hCG), carcinoembryonales Antigen (CEA) und Alphafetoprotein (AFP)), Arzneimitteln (z. B. Digoxin), Zuckern, Toxinen oder Vitaminen eingesetzt werden.
Das Verfahren läßt sich mit Flüssigkeitsproben durchführen, die biologische Flüssigkeiten wie etwa Speichel, Urin oder Blut umfassen, oder die Flüssigkeitsprobe kann aus der Umwelt stammen. Die Flüssigkeitsproben können im ursprünglichen Zustand analysiert werden, sie können aber auch verdünnt, gepuffert oder anderweitig behandelt werden, um den Nachweis der Zielanalyte zu optimieren. So können zum Beispiel Blutproben lysiert und/oder anderweitig denaturiert werden, um die Zellbestandteile löslich zu machen.
Das Verfahren läßt sich unter Anwendung der verschiedensten Probenbearbeitungstechniken durchführen. So kann die Probe vor dem Inberührungbringen mit der Elektrodenstruktur mit dem spezifischen Bindungspartner für den Zielanalyt, der redoxreversiblen Spezies oder mit beiden vorgemischt werden, oder die Flüssigkeitsprobe kann zum anschließenden oder gleichzeitigen Inberührungbringen mit der Elektrodenstruktur entweder unverdünnt oder vorbehandelt in ein Gefäß gegeben werden, das vorbestimmte Mengen an redoxreversibler Spezies und spezifischem Bindungspartner enthält. Die Reihenfolge des Einbringens der Komponenten in die Probe ist nicht kritisch; bei einer Ausführungsform der Erfindung werden jedoch die vorbestimmten Mengen der spezifischen Bindungspartner zunächst der Probe zugesetzt und danach die vorbestimmten Mengen der redoxreversiblen Spezies zugegeben. Die vorbestimmten Mengen der spezifischen Bindungspartner können auch mit den redoxreversiblen Spezies unter Bildung des jeweiligen Komplexes vereinigt werden, ehe diese Komponenten mit der Flüssigkeitsprobe vereinigt werden. In letzterem Fall wird die redoxreversible Spezies durch den entsprechenden Analyt von ihrem jeweiligen spezifischen Bindungspartner verdrängt, um eine Konzentration an redoxreversibler Spezies zu ergeben, die proportional zur Kon zentration des Analyts in der Flüssigkeitsprobe ist. Die Reagenzien, d. h., die vorbestimmten Mengen des spezifischen Bindungspartners des jeweiligen Analyts und die vorbestimmten Mengen der entsprechenden redoxreversiblen Spezies können zum Beispiel in einem Gefäß vorgelegt und mit einem vorbestimmten Volumen der Flüssigkeitsprobe aufgefüllt werden. Die Flüssigkeitsprobe wird dem Gefäß zugesetzt, und danach oder gleichzeitig wird die Flüssigkeitsprobe mit der Elektrodenstruktur in Berührung gebracht.
Die Elektrodenstruktur umfaßt eine Bezugselektrode und wenigstens eine erste und zweite Arbeitselektrode, die so bemessen sind, daß die diffusionsfähige redoxreversible Spezies in der Probe durch Diffusion zurückgeführt werden kann, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathoden- und Anodenpotential an die Arbeitselektroden angelegt wird. Der Begriff ”Arbeitselektrode”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Elektrode, an der gemessene Ereignisse (d. h., Oxidation und/oder Reduktion) stattfinden und der resultierende Stromfluß als Indikator der Analyt-Konzentration gemessen werden kann. ”Anodenpotential” bezieht sich auf das positivere Potential (das an der Anode anliegt) und ”Kathodenpotential” bezieht sich auf das weniger positive bzw. negative Potential, das an der Kathode anliegt (gegen eine Bezugselektrode). Die Elektrodenabmessungen, die Diffusionsrückführung ermöglichen, sind in der Fachwelt wohlbekannt, und typischerweise findet man Anordnungen aus Mikroscheiben, Mikrolöchern oder Mikrobändern. In einer Ausführungsform liegen die Elektroden in Form einer miteinander verzahnten Anordnung aus Mikrobandelektroden mit Mikron- oder Submikron-Abständen vor. Kurze mittlere Diffusionswege und eine große Anzahl Elektroden sind für wirksame Stromverstärkung durch Rückführung der redoxreversiblen Spezies wünschenswert. Die Mikroelektrodenanordnungen lassen sich beispielsweise in Form von Paaren miteinander verzahnter Dünnfilm-Metallelektroden mit Mikron- oder Submikron-Geometrie auf einem Isolatorsubstrat wie z. B. oxidiertem Silicium herstellen. Jeder der Elektrodenfinger (1) weist von seinem benachbartem Finger einen Abstand im Bereich von Nanometern bis wenigen Mikrometern (1–10 μm) auf. Die Mikroelektrodenanordnungen lassen sich mittels Photolithographie, Elektronenstrahl-Lithographie und sogenannter Abhebetechniken herstellen. So kann eine Elektrode mit Interdigitalanordnung (IDA) mit Hilfe des folgenden allgemeinen Verfahrens auf Glas, Silicium oder Polyamid abgeschieden werden:

1. Aufwachsen einer thermischen Oxidschicht auf einem Silicium-Substrat;
2. Aufstäuben einer 400 Å-Chrom-Keimschicht und 2000 Å Gold;
3. Photoresist-Rotationsbeschichtung und Weicheinbrennen;
4. Belichtung und Entwicklung des Photoresists mit der IDA-Struktur;
5. Gold- und Chrom-Strukturierung mittels Ionenstrahlfräsen;
6. Abziehen des Photoresists; und
7. Schneiden der Elektroden in Stücke, indem zunächst mit einer Schutzschicht überzogen, in Streifen geschnitten, die Schutzschicht abgezogen und die Elektrodenoberfläche in einem Sauerstoff-Plasma gereinigt wird.

Die Elektrodenstruktur kann auf der Innenfläche einer Kammer zur Aufnahme der Flüssigkeitsprobe ausgebildet werden, z. B. einer Küvette, einer Kapillarfüllkammer oder eines anderen probenaufnehmenden Gefäßes, worin die Elektrodenstruktur mit der Flüssigkeit in Berührung gebracht werden kann. Alternativ kann die Elektrodenstruktur den Teil einer Sonde zum Eintauchen in die Flüssigkeitsprobe bilden, nachdem die Probe mit der vorbestimmten Menge der redoxreversiblen Spezies und des spezifischen Bindungspartners in Berührung gebracht wurde. Die Elektrodenstruktur ist mit Lei tern verbunden, mit denen das entsprechende Kathoden- und Anodenpotential zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens angelegt werden kann. Anoden- und Kathodenpotential werden relativ zu einer Bezugselektroden-Komponente der Elektrodenstruktur unter Verwendung eines Bipotentiostaten angelegt. Die Elektrodenstruktur kann gegebenenfalls eine Hilfselektrode zur Stromregelung enthalten. Der Bipotentiostat wird verwendet, um ein erstes Kathodenpotential an eine erste Arbeitselektrode und ein erstes Anodenpotential an eine zweite Arbeitselektrode anzulegen, wobei das erste Kathoden- und Anodenpotential den jeweiligen Potentialen entspricht, die für den Stromfluß durch die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der ersten redoxreversiblen Spezies erforderlich sind. Gegebenenfalls kann das Potential an der einen Arbeitselektrode auf ein von der diffusionsfähigen Spezies abhängiges Anodenpotential eingestellt werden, und der Stromfluß wird gemessen, während das Potential der anderen Arbeitselektrode ein Potential durchläuft, das dem vorbestimmten, von der diffusionsfähigen Spezies abhängigen Kathodenpotential entspricht (oder umgekehrt).
Das für jede reversible Redoxspezies geeignete Kathoden- und Anodenpotential kann leicht durch empirische Messung bestimmt werden. Die bei der Durchführung dieser Erfindung verwendeten mehrfach redoxreversiblen Spezies werden so ausgewählt, daß sich die Redoxpotentiale um wenigstens 50 Millivolt, besonders bevorzugt um wenigstens 100 Millivolt, besonders bevorzugt um wenigstens 200 Millivolt von den Potentialen jeder anderen im Verfahren verwendeten redoxreversiblen Spezies unterscheiden. Durch den Unterschied bei den Redoxpotentialen der verwendeten redoxreversiblen Spezies kann jede Spezies ohne wesentliche Störung durch eine zweite oder irgendeine andere redoxreversible Spezies in der Flüssigkeitsprobe nachgewiesen werden. Nach Anlegen des Anoden- und Kathodenpotentials stellt sich rasch ein stationärer Stromfluß an jeder Arbeitselektrode ein. Der Stromfluß kann entweder an einer oder an beiden Arbeitselektroden gemessen werden, und dieser ist proportional der Konzentration der rückgeführten redoxreversiblen Spezies.
Das zweite Kathoden- und Anodenpotential wird an die Arbeitselektroden angelegt, wobei das zweite Potential denjenigen Potentialen entspricht, die erforderlich sind, daß sich Stromfluß durch die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der zweiten redoxreversiblen Spezies ohne wesentliche Störung durch die erste redoxreversible Spezies einstellt, und der resultierende stationäre Stromfluß wird gemessen. Dieser Schritt wird für jede der im Verfahren verwendeten redoxreversiblen Spezies wiederholt. Die gemessenen Stromflüsse werden dann mit bekannten Konzentrationen der jeweiligen diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies korreliert. Diese Konzentrationen sind direkt proportional zu den jeweiligen Analytkonzentrationen.
Die Verfahrensschritte können unter Verwendung eines programmierten Bipotentiostaten durchgeführt werden, um die Potentiale an der Elektrodenstruktur bei Berührung mit der Probe zu regeln. Der Bipotentiostat kann entweder Teil eines Tisch- oder eines Hand-Meßgeräts sein, des weiteren enthaltend Hilfsmittel zum Ablesen der Werte des stationären Stroms, zum Speichern der Werte und zum Berechnen der Analyt-Konzentrationen mit Hilfe eines Mikroprozessors, der zum Durchführen solcher Berechnungen programmiert ist.
Die relativen Mengen der ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies und der jeweiligen spezifischen Bindungspartnern für die beim Verfahren zu messenden Zielanalyten werden empirisch bestimmt. Sie richten sich nach den Konzentrationsbereichen des Zielanalyten und der Bindungsstöchiometrie des spezifischen Bindungspartners, der Bindungskonstanten, dem Analyt und der entsprechenden redoxreversiblen Spezies. Die Menge des jeweiligen Reagens, die für den jeweiligen zu messenden Analyt geeignet ist, kann mit Hilfe empirischer Verfahren bestimmt werden.
Die vorliegenden Osmium-Konjugate können auch bei einem Verfahren zum Messen von zwei proteinhaltigen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe verwendet werden, wobei die ligandanaloge Komponente der ersten redoxreversiblen Spezies ein Peptid ist, umfassend ein Epitop eines ersten Analyts, und die ligandanaloge Komponente einer zweiten redoxreversiblen Spezies ein Peptid ist, umfassend ein Epitop eines zweiten Analyts. Der eine bei dem Verfahren angewandte spezifische Bindungspartner ist ein Antikörper, der das Epitop des ersten Analyts erkennt, und der andere spezifische Bindungspartner ist ein Antikörper, der das Epitop des zweiten Analyts erkennt. Bei einer anderen Anwendung dieses Verfahrens werden zwei unabhängige Messungen für nur einen Analyten in einer Flüssigkeitsprobe durchgeführt. Bei dieser Ausführungsform sind die entsprechenden ligandanalogen Komponenten der ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies verschiedene Ligandanaloga des Zielanalyts. Ist der Zielanalyt eine proteinhaltige Verbindung, so ist die ligandanaloge Komponente der ersten redoxreversiblen Spezies ein Peptid, umfassend ein erstes Epitop des Analyts, und das Ligandanalogon der zweiten redoxreversiblen Spezies ist ein Peptid, umfassend ein zweites Epitop des Analyts, und die spezifischen Bindungspartner sind ein erster und zweiter Antikörper, die jeweils das erste und zweite Analyt-Epitop erkennen.
Die vorliegenden Osmium-Konjugate können auch bei einer Vorrichtung zum Nachweisen und Quantifizieren eines oder mehrerer Analyten in einer Flüssigkeitsprobe Verwendung finden. Die Vorrichtung umfaßt:
wenigstens zwei redoxreversible Spezies, die jeweils zur Diffusion in die Flüssigkeitsprobe wenigstens in Gegenwart des jeweiligen vorbestimmten Analyten imstande sind, wobei die redoxreversiblen Spezies jeweils Redoxpotentiale aufweisen, die sich um wenigstens 50 Millivolt voneinander unterscheiden,
eine Elektrodenstruktur für die Berührung mit der Flüssigkeitsprobe in der Kammer, wobei die Elektrodenstruktur eine Bezugs- und eine Arbeitselektrode umfaßt, die so bemessen sind, daß die Diffusionsrückführung einer diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies in einer Flüssigkeitsprobe bei Berührung mit dem Elektrodensystem möglich ist, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential an die eine Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Anodenpotential an eine zweite Arbeitselektrode angelegt wird, wobei die Diffusionsrückführung dieser Spezies ausreichend ist, einen meßbaren Strom durch jede Arbeitselektrode aufrechtzuerhalten,
und Leiter, die an die jeweiligen Elektroden zum Anlegen des Anoden- und Kathodenpotentials und zur Führung des Stroms durch die Elektroden angeschlossen sind.
Die Vorrichtung kann mit Hilfe von Verfahren und Techniken aufgebaut werden, die in der Fachwelt zum Aufbau von Biosensoren mit elektrometrischen Nachweistechniken bereits beschrieben wurden. Beispielsweise kann die Vorrichtung eine Kammer umfassen, die eine Aufnahmeöffnung aufweist, wobei die Kammer so bemessen ist, daß sie sich durch die Kapillarströmung bei Berührung der Flüssigkeitsprobe mit der Probenaufnahmeöffnung füllt. Die Elektrodenstruktur kann auf einer Platte ausgebildet sein, die eine Kammerwand definiert, so daß die Elektrodenstruktur mit einer Flüssigkeitsprobe in der Kammer in Berührung kommt. Beispielsweise kann die Vorrichtung unter Verwendung allgemeiner Verfahren und Ausgestaltungen konstruiert werden, die in US-Patent Nr. 5 141 868 beschrieben sind. Die Merkmale der vorliegenden Erfindung können auch in anderen elektrochemischen Biosensoren oder Teststreifen enthalten sein, etwa den in den US-Patenten Nr. 5 120 420 , 5 437 999 , 5 192 415 , 5 264 103 und 5 575 895 beschriebenen. Die Vorrichtung kann so konstruiert sein, daß sie die vorbestimmten Mengen an redoxreversiblen Spezies und spezifischen Bindungspartnern bereits enthält. So kann zum Beispiel eine Mischung dieser Reagenzien auf eine Wand der Probenkammer in der Vorrichtung beim Aufbau derselben aufbeschichtet werden, so daß die Flüssigkeitsprobe mit der Reagenzienmischung in Berührung kommt, sobald diese in die die Probe enthaltende Kammer eingefüllt wird. In einer Ausführungsform ist die Vorrichtung zur Quantifizierung eines ersten und zweiten Analyt in einer Flüssigkeitsprobe aufgebaut. Die Vorrichtung enthält zwei redoxreversible Spezies, eine erste redoxreversible Spezies, umfassend ein Konjugat des Ligandanalogons des ersten Analyts, und eine zweite redoxreversible Spezies, umfassend ein Konjugat des Ligandanalogons des zweiten Analyts, und einen spezifischen Bindungspartner für den jeweiligen Analyt, so daß jedes der Analyt-Analogon-Konjugate kompetitiv mit seinem entsprechenden Analyt an einen spezifischen Bindungspartner binden kann.
Bei einer anderen Anwendung der vorliegenden Osmium-Konjugate werden diese in Verbindung mit einer Vorrichtung verwendet, die des weiteren einen Bipotentiostaten umfaßt, der mit den Leitern zum Anlegen eines von der redoxreversiblen Spezies abhängigen Kathodenpotentials an eine erste Arbeitselektrode und eines von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Anodenpotentials an eine zweite Arbeitselektrode elektrisch verbunden ist. Der Biopotentiostat kann so programmiert werden, daß er eine Folge von Potentialen an die jeweiligen Arbeitselektroden anlegt. Insbesondere kann der Bipotentiostat so programmiert werden, daß er ein erstes Kathodenpotential an eine erste Arbeitselektrode und ein erstes Anodenpotential an eine zweite Arbeitselektrode anlegt, wobei die ersten Anoden- und Kathodenpotentiale denjenigen Potentialen entsprechen, die erforderlich sind, daß sich ein Stromfluß durch die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der ersten redoxreversiblen Spezies einstellt. Der Bipotentiostat ist auch so programmiert, daß er ein zweites Kathodenpotential an die erste Arbeitselektrode und ein zweites Potential an die zweite Anodenelektrode anlegt, wobei die zweiten Kathoden- und Anodenpotentiale denjenigen Potentialen entsprechen, die erforderlich sind, daß sich ein Stromfluß durch die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der zweiten redoxreversiblen Spezies einstellt. In einer alternativen Ausführungsform enthält die Vorrichtung eine erste und zweite redoxreversible Spezies und wenigstens eine erste und zweite Elektrodenstruktur für die Berührung mit der Flüssigkeitsprobe in der Kammer, wobei jede der Elektrodenstrukturen eine Mikroanordnung von Arbeitselektroden und Hilfsmittel zum Umschalten des Bipotentiostaten zwischen der ersten und zweiten Elektrodenstruktur umfaßt. Bei den bevorzugten Ausführungsformen der Vorrichtung sind Hilfsmittel zum Messen des Stromflusses durch die Probe beim ersten und zweiten Potential und vorzugsweise zum Abspeichern der Werte dieser Ströme in einem Register bereitgestellt, das mit einem Mikroprozessor verbunden ist, der für die Berechnung der Analyt-Konzentrationen auf der Grundlage dieser Werte programmiert ist.
Bei einer anderen Ausführungsform wird das vorliegende Konjugat in einem Kit zur Messung der Konzentration von einem oder mehreren Analyten in Flüssigkeitsproben verwendet. Das Kit umfaßt:
wenigstens zwei redoxreversible Spezies zur Berührung mit der Flüssigkeitsprobe, die jeweils zur Diffusion in der Flüssigkeitsprobe wenigstens in Gegenwart eines vorbestimmten Analyten imstande sind, wobei wenigstens eine dieser Spezies ein Konjugat eines Ligandanalogons eines Analyten und einer redoxreversiblen Markierung ist, wobei die redoxreversiblen Spezies jeweils Redoxpotentiale aufweisen, die sich um wenigstens 50 Millivolt unterscheiden;
einen spezifischen Bindungspartner für den jeweiligen Analyt;
eine Elektrodenstruktur zur Berührung mit der Flüssigkeitsprobe, wobei die Elektrodenstruktur eine Bezugs- und eine Arbeitselektrode umfaßt, die so bemessen sind, daß die Diffusionsrückführung diffusionsfähiger redoxreversibler Spezies in der Flüssigkeitsprobe möglich ist, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential an die eine Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Anodenpotential an die zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei die Diffusionsrückführung dieser Spezies ausreichend ist, um einen meßbaren Strom durch die Probe aufrechtzuerhalten; und
an den jeweiligen Elektroden angeschlossene Leiter zum Anlegen des Anoden- und Kathodenpotentials und zum Führen des von den Elektroden geleiteten Stroms.
Bei einer Ausführungsform sind die vorliegenden redoxreversiblen Konjugat-Spezies mit anderen elektroaktiven Spezies in Form einer neuartigen Zusammensetzung zur Berührung mit der Flüssigkeitsprobe gemischt. In einer weiteren Ausführungsform ist die jeweilige redoxreversible Spezies und der jeweilige spezifische Bindungspartner für den jeweiligen Analyt in Form einer neuartigen Zusammensetzung zur Berührung mit der Flüssigkeitsprobe gemischt. Vorzugsweise enthält die redoxreversible Markierung wenigstens einer der redoxreversiblen Spezies einen erfindungsgemäßen Osmium-Komplex.
Herstellung der Os-Vermittler-Markierungen
Es konnte gezeigt werden, daß der Os-Vermittler Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium ein ausgezeichneter Elektronenvermittler für viele Oxidoreduktase-Enzyme ist ( US-Patent Nr. 5 589 326 ). Er weist eine schnelle Vermittlungskinetik (etwa 500 mal schneller als Hexacyanoferrat(III) mit Glucoseoxidase) und ein relativ niedriges Redoxpotential (+150 mV gegen Ag/AgCl) auf. Zudem weist er eine sehr schnelle Elektronübertragungsrate an der Elektrodenoberfläche auf. Was noch wichtiger ist, die organischen Liganden am Os-Vermittler können so funktionalisiert werden, daß sie an andere Moleküle ohne störende Auswirkungen auf die Redoxeigenschaften des Os-Zentrums covalent gebunden werden können. Diese einmaligen Eigenschaften des Os-Vermittlers machen ihn zu einem idealen elektrochemischen Indikator für Sensoren, die auf Immunaffinität beruhen.
Os-Vermittler mit diesen neuen Liganden wurden mit Hilfe desselben Verfahrens hergestellt, das für die Os-freien Vermittler verwendet wurde. Deren Synthese besteht aus zwei Hauptverfahrensschritten, die nachstehend gezeigt sind. Die Einzelheiten dieser Verfahrensschritte sind nachstehend beschrieben.
Der erste Verfahrensschritt beinhaltet die Synthese der Os-Zwischenstufe cis-Bis(2,2'-bipyridyl)dichloroosmium(II), aus handelsüblichem Osmium-Salz mit Hilfe des nachfolgenden Schemas. Das Zwischenprodukt wird durch Umkristallisation im Eisbad isoliert.
Der zweite Verfahrensschritt beinhaltet die Reaktion der Os-Zwischenstufe mit Histamin oder 4-Bipyridylessigsäure (oder einem substituierten Bipyridin zur Herstellung des Tris(bipyridyl)-Komplexes), um Os-Vermittler mit dem passenden Angriffspunkt herzustellen. Das gewünschte Produkt wird dann durch Zugabe von Ammoniumtetrafluoroborat aus der Lösung ausgefällt.
Diese Os-Vermittler können auch problemlos in die oxidierte Form, d. h. Os(III), unter Verwendung von Nitrosoniumtetrafluoroborat überführt werden. Dies ist jedoch nicht nötig, da das Os bei den Konjugationsreaktionen unter alkalischen Bedingungen stets in die reduzierte Form zurückfällt. Zudem benötigt man keine oxidierte Form Os(III) für den Nachweis auf dem Biosensor.
A. Messungen mit lediglich gemischten Vermittlern

1. Mikroelektroden mit Interdigitalanordnung (IDA) werden mit photolithographischen Hilfsmitteln mit Hilfe von in der Fachwelt anerkannten Verfahren hergestellt (siehe WO 97/34140 ; EP 0299 780 ; D. G. Sanderson und L. B. Anderson, Analytical Chemistry, 57 (1985), 2388; Koichi Aoki et. al., J. Electroanalytical Chemistry 256 (1988) 269; und D. Niwa et al., J. Electroanalytical Chemistry, 167 (1989) 291). Andere Hilfsmittel, die bei photolithographischen Verfahren Standard sind, können ebenfalls verwendet werden, um die gewünschten Leitermuster auf dem Isolatorsubstrat zu erzeugen.
2. Reversible Vermittler werden aus jenen ausgewählt, die hierin und in den Zitaten ( US-Patente Nr. 4 945 045 und 5 589 3325 ) beschrieben sind. Vorzugsweise werden zwei verschiedene Vermittler mit Potentialen ausgewählt, die sich um wenigstens 100 mV, mehrbevorzugt um wenigstens 200 mV unterscheiden. Zu den Beispielen geeigneter Vermittler gehören das Os(bipy)₂ImCl dieser Erfindung und in US-Patent Nr. 5 589 326 und Ferrocen, beschrieben in US-Patent Nr. 4 945 045 und EP 0 142 301 . Mischungen dieser Vermittler werden in wäßriger Lösung hergestellt, zum Beispiel in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Es können Konzentrationen zwischen etwa 1 μM und 1000 μM bequem gemessen werden.
3. Die IDA werden an einen Bipotentiostaten angeschlossen – ein Instrument, mit dem die Potentiale zweier getrennter Elektroden geregelt werden können. Eine Bezugselektrode wird ebenfalls bereitgestellt. Diese nichtpolarisierbare Elektrode dient als Bezug für die zwei angelegten Potentiale und kann auch als Gegenelektrode dienen. Es kann jede nichtpolarisierbare Elektrode verwendet werden, zum Beispiel Ag/AgCl, etwa die bei ABI/Abtech zu beziehenden. Zur Regelung des Stromflusses durch die Arbeitselektroden kann auch eine Hilfselektrode verwendet werden. Die Mischungen werden auf die IDA gegeben, und die Bezugselektrode wird ebenfalls mit der Mischung in Berührung gebracht, oder die IDA wird zusammen mit der Bezugselektrode in die Mischung eingetaucht.

4. Messung des Vermittlers 1 [Os(bipy)₂ImCl]
Ein Kathodenpotential wird an einen Satz von Fingern der IDA angelegt, mit der der Vermittler 1 reduziert werden kann (ca.
50 mV gegen Ag/AgCl). Ein Anodenpotential wird an den anderen Satz von IDA-Fingern angelegt, mit dem der Vermittler 1, nicht aber der Vermittler 2 (oder irgendein anderer Vermittler) oxidiert werden kann (ca. 250 mV gegen Ag/AgCl). Nach einer kurzen Zeit (ms bis s) ist ein stationärer Strom meßbar, der nur von der Konzentration des Vermittlers 1 abhängt.
5. Messung des Vermittlers 2 (Ferrocen)
Ein Kathodenpotential wird an einen Satz von Fingern der IDA angelegt, mit der der Vermittler 2, nicht aber der Vermittler 1 reduziert werden kann (ca. 250 mV gegen Ag/AgCl). Ein Anodenpotential wird an den anderen Satz von Fingern der IDA angelegt, mit dem der Vermittler 2 oxidiert werden kann (ca. 550 mV gegen Ag/AgCl). Nach einer kurzen Zeit (ms bis s) ist ein stationärer Strom meßbar, der nur von der Konzentration des Vermittlers 2 abhängt.
Assay der spezifischen Bindung durch Messung mit gemischtem Vermittler
Spezifischer Assay von HbA1c in einer Blutprobe

1. IDA werden wie in Absatz A oben bereitgestellt.
2. Konjugate der Vermittler 1 und 2 und Haptene oder spezifische Bindungspartner werden mit Hilfe von in der Fachwelt anerkannten Verfahren für die covalente Kopplung unter Verwendung entweder eines homofunktionellen oder eines heterofunktionellen Linkers verfügbar gemacht. Im einzelnen wird ein synthetisches Peptid, das der N-terminalen Sequenz der β-Kette von HbA1c entspricht, an den Osmium-Komplex ankonjugiert. Auf die gleiche Weise wird ein synthetisches Peptid, das der N-terminalen Sequenz von HbA₀ entspricht, an einen zweiten Vermittler, zum Beispiel Ferrocen, konjugiert.
3. Antikörper für Analyte (HbA1c und HbA₀), die spezifisch mit den in das Konjugat eingebrachten N-terminalen Peptiden reagieren, werden mit Hilfe von Standard-Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper bereitgestellt. In diesem Fall werden Schafe mit Träger-Proteinen immunisiert, an die die synthetischen Peptid-Sequenzen für HbA1c und HbA₀ konjugiert sind. Nach Ablauf des entsprechenden Immunisierungsschemas wird den Schafen Blut entnommen, und die Antikörper werden mittels Ionenaustausch-Chromatographie aus dem Blut isoliert, gefolgt von Immunsorbens-Reinigung auf einer Säule mit dem gleichen N-terminalen Peptid, das einen anderen Linker aufweist.
4. Die geeignete Stöchiometrie der Reaktion wurde unabhängig für die zwei Reaktionen mittels Standard-Verfahren zur Entwicklung von Immunassays bestimmt. Eine Lösung, die eine festgelegte Menge eines markierten Konjugats enthält, wurde mit einer Lösung mit veränderlichen Mengen von Antikörpern vermischt, und nach einer angemessenen Inkubationszeit wurde die Menge des verbliebenen freien Konjugats auf der IDA unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Menge Antikörper, die gerade ausreichend ist, um maximale Hemmung des Konjugats (ca. > 80%) zu erreichen, wurde ausgewählt.
5. Reagens-Lösung 1 wurde so hergestellt, daß sie eine Mischung der beiden Konjugate in angemessenen Konzentrationen enthielt. Reagens-Lösung 2 wurde so hergestellt, daß sie eine Mischung der beiden Antikörper in den vorstehend bestimmten Mengen enthielt. Eine Blutprobe wurde in einer Lösung von 25 mM Citronensäure/0,5% Brij-35 auf ca. das 20fache verdünnt. Im Anschluß an eine Inkubation für 30 Sekunden zur Lyse und Denaturierung von Hämoglobin wurden 33 μl 1 M Phosphat-Puffer zu 66 μl der verdünnten Probe gegeben, um den pH wieder auf neutral zu bringen. Es wurden 30 μl der Antikörper-Lösung 2 zugesetzt und die Mischung 30 s lang zum Inkubieren belassen. Dann wurden 30 μl der Konjugat-Lösung 1 zugegeben, und die Mischung wurde auf der IDA gemessen. Die Konzentration von HbA1c in der Probe wird mit dem für Vermittler 1 gemessenen Strom und die Konzen tration von HbA₀ wird mit dem Strom von Vermittler 2 in Beziehung gesetzt. % HbA1c in der Probe wird mit dem Verhältnis der gemessenen Mengen von Vermittler 1 und Vermittler 2 in Beziehung gesetzt.

Anwendung auf HbA1c-Assay
Hämoglobin A1c ist ein spezifisches Glycohämoglobin, bei dem die Glycosylierung am N-Terminus der β-Kette von Hämoglobin stattfindet. Der Antikörper bindet spezifisch an HbA1c, das eine Eitop-Sequenz Gluc-Val-His-Leu-Thr aufweist. Um die Konjugation zu anderen Molekülen zu erleichtern, wird eine nichtnatürliche Aminosäure zur Sequenz gegeben, z. B. Cys, Lys, oder Lys-MH, um A1c-Peptide zu erzeugen, darunter: 1) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys-MH; 2) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys; 3) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Cys.
Beim HbA1c-Assay ist das Messen sowohl der A1c-Konzentration als auch der Gesamthämoglobin-Konzentration erforderlich und die Ergebnisse werden als Verhältnis dieser beiden Messungen (% HbA1c) angegeben. Es ist vorteilhaft, sowohl A1c als auch das Gesamthämoglobin unter Anwendung des gleichen Prinzips zu analysieren, weil durch die Verhältnisbildung Fehler durch Umgebungseinflüsse minimiert werden. Somit wird der Antikörper dazu veranlaßt, spezifisch an die Hämoglobine mit unglycosyliertem N-Terminus zu binden, d. h. mit einer Epitop-Sequenz Val-His-Leu-Thr. Auf die gleiche Weise wird eine nichtnatürliche Aminosäure an die Sequenz angefügt, um die Konjugation zu erleichtern. Die zur Messung des Gesamthämoglobins verwendeten Peptide werden als A₀-Peptide bezeichnet. Zu den A₀-Peptiden, die bei der Herstellung von Os-Vermittler-Peptid-Konjugaten Verwendung finden, gehören Val-His-Leu-Thr-Cys und Val-His-Leu-Thr-Lys.
Chemie der Konjugation und Konjugate
Es gibt eine mannigfaltige Chemie der Konjugation, die zur Verknüpfung eines Os-Vermittlers mit einem Peptid angewandt werden kann. Die folgenden zwei Konjugationsprinzpien, die zur Herstellung von Os-Vermittler-Peptid-Konjugaten eingesetzt wurden, werden im allgemeinen auch zur Herstellung der Protein-Konjugate verwendet: 1) Bildung einer Amid-Bindung durch einen reaktiven Ester mit einem primären Amin; 2) Bildung einer Thioether-Bindung durch Maleinimid mit einer Sulfhydryl-Gruppe. Die Amid-Bindung ist gegenüber einer Thioether-Bindung bevorzugt, weil die Amid-Bindung im allgemeinen stabiler ist. Auf der Grundlage der bevorzugten Konjugationschemie kann der Ligand am Os-Vermittler entweder mit einer primären Amino-Gruppe oder mit einer Carbonsäure-Gruppe funktionalisiert werden. Man nimmt an, daß die beste Stelle für diese funktionelle Gruppe die C-4- oder C-5-Position am Bipyridyl-Liganden des Os-Vermittlers ist, doch kann die Funktionalisierung auch über das nicht an Os komplexierte Bipyridylring-Stickstoffatom erfolgen. Es wurden zwei verschiedene funktionalisierte Os-Vermittler wie vorstehend beschrieben hergestellt.
Der Os-Vermittler (a) wurde mit Histamin erzeugt, während der Os-Vermittler (b) mit Bipyridylessigsäure erzeugt wur de. Es wurde jedoch gefunden, daß der Imino-Stickstoff des Bipyridyl-Rings die Aktivierung der Carbonsäure-Gruppe zum reaktiven Ester (d. h. N-Hydroxysuccinimidester) mit Carbodiimid stört. Daher ergibt die Verwendung von Carbonsäurefunktionalisierten Os-Vermittlern bei der Synthese der Os-Vermittler-Peptid-Konjugate weniger günstige Ergebnisse.
Die Amino-Gruppe am Histamin-Liganden des Os-Vermittlers reagiert bereitwillig mit N-Hydroxysuccinimid(NHS)-Ester unter Bildung einer Amid-Bindung. Zwei Typen von Vernetzern werden eingesetzt, um Os-Vermittler mit Peptiden zu verknüpfen, (a) heterofunktionelle Vernetzer, die einen NHS-Ester an einem Ende und am anderen Ende eine Maleinimid- oder Sulfhydryl-Gruppe aufweisen, und (b) homofunktionelle Vernetzer, worin z. B. beide Enden NHS-Ester aufweisen.
Im Fall eines heterofunktionellen Vernetzers wird dieser zunächst mit dem Os-Vermittler mit Histamin-Ligand (Os-Histamin) in einem molaren Verhältnis von 1:1 umgesetzt. Ein besonderer Punkt muß hierbei beachtet werden. Ein Os-Vermittler in seiner oxidierten Form, d. h. Os(III), kann die Sulfhydryl-Gruppe sofort unter Bildung einer Disulfid-Bindung oxidieren. Es ist wichtig, das Os-Zentrum durch Zugabe einer kleinen Menge eines Reduktionsmittels wie etwa Natriumdithionit während des Konjugationsverfahrens in seiner reduzierten Form zu halten. Der Reaktionsverlauf kann mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC auf einer C18-Säule verfolgt werden. Danach wird das Os-Vermittler-Vernetzer-Addukt über präparative HPLC isoliert und die aufgefangene Fraktion anschließend gefriergetrocknet. Schließlich wird das Os-Vermittler-Vernetzer-Addukt mit dem geeigneten Peptid unter Bildung des Os-Vermittler-Peptid-Konjugats umgesetzt. Wiederum wird das Produkt durch Auffangen der entsprechenden Fraktion in der präparativen HPLC isoliert und die aufgefangene Fraktion gefriergetrocknet.
Zur Synthese der Os-Vermittler-Peptide-Konjugate wurden zwei verschiedene heterofunktionelle Vernetzer verwendet. SMCC(Succinimidyl-4-[N-maleinimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat) wird für cysteinhaltiges Peptid verwendet, während SATA (N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat) für Maleinimid-haltiges Peptid Verwendung findet. Drei Os-Vermittler-Peptid-Konjugate (zwei mit A1c-Peptid und eines mit A₀-Peptid) wurden unter Verwendung von heterofunktionellen Vernetzern hergestellt, und ihre Strukturen sind nachstehend gezeigt: (a) Os-SMMC-A1c; (b) Os-SATA-A1c, und (c) Os-SATA-A₀.
Es wurde jedoch gefunden, daß diese Konjugate bei Lagerung als Lösungen nicht stabil sind. Ergebnisse einer analytischen HPLC haben gezeigt, daß sich diese Konjugate zersetzen. Durch Massenspektroskopie wurde bestätigt, daß die Instabilität von der Spaltung der Thioether-Bindung in diesen Konjugaten herrührt.
Um Thioether-Bindung im Konjugat zu vermeiden, wurden homo-funktionelle, zwei NHS-Ester enthaltende Vernetzer verwendet, anstatt die Konjugate herzustellen. Als Vernetzer wurde DSG (Disuccinimidylglutarat) verwendet. Um die Bildung von vernetztem Os-Vermittler, d. h. Os-Vernetzer-Os, zu verhindern, wurde ein großer Überschuß an homofunktionellem Vernetzer bei der Reaktion mit Os-Histamin in einem molaren Verhältnis von 4:1 verwendet. Unter dieser Bedingung bildete sich nur das gewünschte Produkt, d. h. der Os-Vernetzer. Das Os-DSG-A1c-Konjugat wurde auf die gleiche Weise unter Anwendung des bereits beschriebenen Verfahrens hergestellt.
Zur Herstellung des analogen Os-DSG-A₀-Konjugats bedarf es eines Extraschritts, da das nichtglycosylierte N-terminale Amin des HbA₀-Peptids gegenüber NHS-Ester ebenfalls reaktiv ist. In diesem Fall wird das N-terminale Amin des HbA₀-Peptids zunächst durch entweder eine basenempfindliche Fmoc- oder eine säureempfindliche Boc-Gruppe geschützt. Nach der Umsetzung mit dem Os-DSG-Addukt zwecks Bildung des Os-DSG-A₀-Konjugats wird die Schutzgruppe dann unter Verwendung geeigneter Schutzgruppenabspaltungsverfahren (Zugabe von Base für Fmoc oder Säure für Boc) entfernt. Die mittels Festphasen-Peptidsynthese hergestellten Peptide weisen stets N-terminale Fmoc-Schutzgruppen auf. Die Schutzgruppen werden normalerweise vor der Abspaltung der Peptide von den Harzperlen abgetrennt, sie können aber auch dort belassen werden, falls gewünscht. Die HbA₀-Peptide von Zymed weisen eine intakte Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus auf. Unter Anwendung dieser Strategie wurde das Os-DSG-A₀-Konjugat erfolgreich synthetisiert.
Zahlreiche Analyte können nicht mit Hilfe enzymbasierter Sensoren analysiert werden. Für diese bedarf es der Entwicklung von Affinitäts-Biosensoren oder Immunsensoren auf der Grundlage der spezifischen Bindung von Antigenen an Antikörper. Der Schlüssel zum Nachweis dieses Bindungsvorgangs an elektrochemischen Sensoren liegt in der Beigabe von Antigenen, die mit Redoxmarkierungen markiert sind. Bis(2,2'-bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium, ebenfalls als Os-Vermittler bekannt, besitzt viele Eigenschaften, die es zu einer ausgezeichneten Redoxmarkierung für diesen Zweck machen. Zudem kann ein Angriffspunkt für die covalente Verknüpfung desselben mit Antigenen angefügt werden, ohne dessen Redoxeigenschaften zu beeinflussen.
Mehrere Assayschemata können bei Affinitätsbiosensoren angewandt werden, darunter: i) Assay unter kompetitiver Bindung (markiertes Antigen konkurriert um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen; ii) Assay unter sequentieller Bindung (markiertes Antigen bindet an im Überschuß vorhandene Bindungsstellen); iii) heterogener Assay (mit Trennungsschritt zur Trennung gebundener und freier markierter Antigene) und iv) homogener Assay (kein Trennungsschritt). Zu den bei einem homogenen Assay unter sequentieller Bindung beteiligten Schritten gehört die Bindung des Analyten an einen Antikörper. Das markierte Antigen (Analyt-Analogon) bindet an die verbliebenen Bindungsstellen am Antikörper. Schließlich wird das übrig gebliebene, freie markierte Antigen an der Elektrodenoberfläche nachgewiesen. Der resultierende Strom ist eine Funktion der Menge des vorhandenen Analyts.
Der Nachweis von freien markierten Antigenen kann mit Hilfe von entweder direkten Nachweisverfahren oder Nachweisverfahren mit Verstärkung erreicht werden. Beim Direktnachweis ist die Anwendung fortgeschrittener elektrochemischer Techniken erforderlich, etwa Wechselstrom-Voltammetrie, Differenzpulsvoltammetrie, Rechteckwellen-Voltammetrie oder Wechselstrom-Impendanz, um eine Empfindlichkeit von 5 μM oder darunter zu erreichen. Bei den Nachweisverfahren mit Verstärkung wird die Gleichstrom-Amperometrie mit Verstärkung über eine Reaktion mit Enzymen oder chemischen Reduktionsmitteln angewandt, oder es werden Mikroelektroden mit Interdigitalanordnung (IDA) verwendet. Das bevorzugte Nachweisverfahren ist die Verstärkungs-Amperometrie durch Kreislaufführung der freien Os-Vermittler-Markierung unter Verwendung von IDA-Mikroelektroden. Amperometrie mit Verstärkung unter Verwendung von Gluc-DOR-Enzym kann jedoch ebenfalls angewandt werden. Eine schnelle Vermittlungskinetik des Os-Vermittlers ist sehr wünschenswert, weil die Größe der Verstärkung von der Geschwindigkeitskonstante der Vermittlung mit dem Enzym abhängt.
Allgemeines analytisches HPLC-Verfahren für Osmium-Konjugate

Sämtliche HPLC-Analysen wurden mit Hilfe eines HPLC-Systems vom Typ Beckman-System-Gold durchgeführt, das aus einem 126-Pumpen-Modul und einem 168-Dioden-Array-Detektor-Modul besteht. Als stationäre Phase diente eine analytische Umkehrphasen-C18-Säule von Vydac. Andere Parameter sind nachstehend aufgelistet.

Mobile Phase:	A = 0,1% TFA³ in H₂O B = 0,1% TFA in CH₃CN

Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min

Gradient:	0–5 min: 10% B 5–45 min: 10% B => 50% B mit 1%/min 45–50 min: 100% B

Detektor:	Kanal A mit 384 nm Kanal B mit 220 nm.

³TFA = Trifluoressigsäure

Synthese von Bis(2,2'-bipyridyl)dichloroosmium

1. Ein Einliter-Einhalsrundkolben wird mit 19,335 g K₂OsCl₆ (0,04019 mol) und 13,295 g 2,2'-Dipyridyl (0,08512 mol) befüllt. Es werden 400 ml DMF zugegeben, um alle Recktanten zu lösen.
2. Die Lösung wird auf Rückfluß erhitzt und danach der Rückfluß 1 Stunde lang aufrechterhalten. Die Heizung wird abgeschaltet, und man läßt die Lösung bei Umgebungsbedingungen auf 30–40°C abkühlen.
3. Die Reaktionsmischung wird unter Verwendung eines mittleren Glasfrittenfilters filtriert. Der Kolben wird mit weiteren 20 ml DMF ausgespült und das Filter gewaschen.
4. Das Filtrat wird in ein Dreiliter-Becherglas überführt. Ein weiteres Zweiliter-Becherglas wird mit 22,799 g NaS₂O₄ befüllt und dieses in 2 1 deionisiertem Wasser gelöst. Diese Lösung wird tropfenweise mittels Tropftrichter in das das Os/DMF-Filtrat enthaltende Becherglas gegeben, wobei die Lösung ständig gerührt wird.
5. Die Mischung wird dann in einem Eis-Bad für wenigstens 3 Stunden abgekühlt. Bei Bedarf wird weiteres Eis zugegeben.
6. Die Mischung wird ”kalt” unter Verwendung eines Keramikfilters mit Filterpapier filtriert. Der Rückstand auf dem Filter wird zweimal mit 50 ml Wasser und zweimal mit 50 ml Ether gewaschen.
7. Das Produkt wird unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht (wenigstens 15 Stunden lang) getrocknet. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem Exsiccator bei Raumtemperatur. Typische Ausbeute = 16 g oder 70%.

Das Produkt wird mittels UV-VIS-Spektroskopie und Elementaranalyse (EA) analysiert.

UV-VIS: Peak λ(nm) ε(M^–1cm^–1)

382 10,745

465 9,914

558 11,560

836 3,873

EA: C% H% N% Cl% Os% H₂O%

theoretisch: 41,89 2,81 9,77 12,36 33,17 0

tatsächlich: 40,74 2,92 9,87 11,91 0,41
Synthese von Bis(2,2'-bipyridyl)histamin-chloroosmium

1. Ein Zweiliter-Einhalsrundkolben wird mit 11,3959 g Os(bpy)₂Cl₂ (0,0198 mol) und 4,9836 g Histamin (0,0448 mol) befüllt. Um die Recktanten zu lösen, werden 500 ml Ethanol zugegeben. Danach werden 250 ml deionisiertes Wasser zugegeben.
2. Die Lösung wird auf Rückfluß erhitzt und der Rückfluß 6 Stunden lang aufrechterhalten. Anschließend läßt man die Lösung bei Umgebungsbedingungen auf Raumtemperatur abkühlen.
3. Mittels Einengen am Rotationsverdampfer wird sämtliches Ethanol entfernt. Danach wird die Lösung in ein 500 ml-Becherglas gegeben. 2,136 g NH₄BF₄ werden in 20 ml Wasser gelöst und tropfenweise zur Os-Lösung gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildet. Nach Abkühlen in einem Eis-Bad für 30 min wird die Mischung mit Hilfe eines Keramikfilters mit Filterpapier filtriert. Der Inhalt des Filters wird zweimal mit ^~20 ml Wasser gewaschen.
4. Trocknung erfolgt bei 50°C unter Hochvakuum über Nacht (wenigstens 15 Stunden).
5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Lagerung erfolgt in einem Exsiccator bei Raumtemperatur. Typische Ausbeute = 7,6 g oder 52%.

Das Produkt wird mittels UV-VIS-Spektroskopie und HPLC analysiert.

UV-VIS: Peak λ(nm) ε(M^–1cm^–1)

355 7,538

424 7,334

514 7,334

722 2,775

HPLC: Elutionszeit = 18,0 min Reinheit nach HPLC im Bereich von 65–85%
Herstellung des Addukts [Os(bpy)₂(Histamin)Cl]/heterofunktioneller Vernetzer

1. 0,1167 g [Os(bpy)₂(Histamin)Cl]BF₄ (0,162 mmol) werden abgewogen und in ein 5 ml-Reacti-Vial überführt. 1,0 ml DMF werden zugegeben, um den Reaktant zu lösen. Danach werden 25 μl Triethylamin zugegeben.
2. 0,0508 g SMCC (0,150 mmol) oder 0,0390 g SATA (0,168 mmol) werden zugesetzt. Die Recktanten werden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Probe wird in eine HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
3. Ist die Umsetzung vollständig, wird die Lösung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die Lösung wird in eine präparative HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht gefriergetrocknet.
5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei
20°C. Typische Ausbeute = 40 mg oder 25%.

Das Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.

HPLC ES/MS

Os-SMCC: Elutionszeit = 32,1 min m⁺/e = 434,2

Os-SATA: Elutionszeit = 27,5 min m⁺/e = 382,8
Herstellung des Addukts (Os(bpy)₂(Histamin)Cl]/homofunktioneller Vernetzer

1. 0,2042 g DSG (0,626 mmol) werden abgewogen und in ein 5 ml-Reacti-Vial überführt. 0,75 ml DMF werden zugesetzt, um den Reaktant zu lösen.
2. 0,1023 g [Os(bpy)₂(Histamin)Cl]BF₄ (0,142 mmol) werden abgewogen und in separates 5 ml-Reacti-Vial gegeben. 1,0 ml DMF werden zugesetzt, um den Reaktant zu lösen. 25 μl Triethylamin werden zugegeben. Danach wird die DSG/DW-Lösung unter ständigem Rühren tropfenweise mit der Os/DMF-Lösung versetzt. Man läßt 2 Stunden bei Raumtemperatur reagieren, worauf eine Probe in eine HPLC injiziert wird, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
3. Ist die Umsetzung vollständig, wird die Lösung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die Lösung wird in eine präparative HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht gefriergetrocknet.
5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C. Typische Ausbeute = 45 mg oder 35%.

Das Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.

HPLC ES/MS

Os-DSG: Elutionszeit = 27,1 min m⁺/e = 429,2 und 859,6
Herstellung des Os-SATA-A1c-Konjugats

1. 40,5 mg Os-SATA (0,0529 mmol) werden abgewogen und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. 1,0 ml PBS (pH 7,5) werden zum Lösen zugegeben. 20 mg Na₂S₂O₄ werden zugegeben, um Os in seiner reduzierten Form zu halten.
2. 1,0 ml Deacetylierungspuffer (PBS pH 7,5 + 0,5 M Hydroxylamin und 25 mM EDTA) werden zugesetzt, um die Sulfhydryl-Schutzgruppe abzuspalten. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert, um zu bestimmen, ob die Abspaltung der Schutzgruppe vollständig ist, wobei ein neuer Peak bei 25,8 min auftritt.
3. 45 mg HbA1c-MH-Peptid (0,0474 mmol) werden zugegeben und man läßt eine Stunde lang bei Raumtemperatur reagieren. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
4. Ist die Umsetzung vollständig, wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die Lösung wird in eine präparative HPLC injiziert, um den Produkt-Peak aufzufangen.
5. Die aufgefangene Fraktion wurde über Nacht (wenigstens 15 Stunden) gefriergetrocknet.
6. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C. Typische Ausbeute = 12 mg

Das Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.

HPLC ES/MS

Os-SATA-A1c: Elutionszeit = 27,6 min m⁺/e = 559,1 und 838,5
Herstellung des Os-SMCC-A1c-Konjugats

1. 39,0 mg Os-SMCC (0,0452 mmol) werden abgewogen und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. 1,0 ml PBS (pH 6,0) werden zum Lösen zugegeben.
2. 30,0 mg HbA1c-Cys-Peptid (0,0450 mmol) werden zugesetzt. Man läßt 2 Stunden lang bei Raumtemperatur reagieren. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
3. Ist die Umsetzung vollständig, wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt Die Lösung wird in eine präparative HPLC injiziert, um den Produkt-Peak aufzufangen.
4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden) gefriergetrocknet.
5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C. Typische Ausbeute = 12 mg

Das Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.

HPLC ES/MS

Os-SMCC-A1c: Elutionszeit = 27,6 min m⁺/e = 480,5 und 534,4
Herstellung des Os-SMCC-A₀-Konjugats

1. 37,0 mg Os-SMCC (0,0426 mmol) werden abgewogen und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. Zum Lösen werden 1,0 ml PBS (pH = 6,0) zugegeben.
2. 24,3 mg HbA₀-Cys-Peptid (0,0425 mmol) werden zugesetzt. Man läßt die bei Raumtemperatur 2 Stunden lang reagieren. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
3. Ist die Umsetzung vollständig, wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die Lösung wird in eine präparative HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden) gefriergetrocknet.
5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C. Typische Ausbeute = 15 mg

Das Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.

HPLC ES/MS

Os-SMCC-A₀: Elutionszeit = 27,9 min m⁺/e = 360,7 und 720,5
Herstellung des Os-DSG-A1c-Konjugats

1. 32,0 mg Os-DSG (0,037 mmol) werden abgewogen und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. Zum Lösen werden 0,75 ml DMF zugegeben. 25 μl Triethylamin werden zugesetzt.
2. 26,5 mg HbA1c-Lys-Peptid (0,0349 mmol) werden zugegeben. Man läßt bei Raumtemperatur 2 Stunden lang reagieren. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
3. Ist die Umsetzung vollständig, wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die Lösung wird in eine präparative HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden) gefriergetrocknet.
5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C. Typische Ausbeute = 16 mg

Das Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.

HPLC ES/MS

Os-DSG-A1c: Elutionszeit = 23,5 min m⁺/e = 501,8 und 752,8
Herstellung des Os-DSG-A₀-Konjugats

1. 52,0 mg Os-DSG (0,0605 mmol) werden abgewogen und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. Zum Lösen werden 1,0 ml DMF zugegeben. 25 μl Triethylamin werden zugesetzt.
2. 49,1 mg Fmoc-HbA₀-Peptid (0,0606 mmol) werden zugegeben. Man läßt bei Raumtemperatur 2 Stunden reagieren. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion anhand des Auftretens eines Peaks bei 40,3 min für Os-DSG-A₀(Fmoc) zu verfolgen.
3. Bei vollständiger Reaktion werden weitere 100 μl Triethylamin injiziert. Nach einer Stunde wird eine Probe in eine analytische HPLC injiziert, um festzustellen, ob die Fmoc-Schutzgruppe vollständig abgespalten wurde, wobei der Peak bei 40,3 min verschwindet.
4. Ist die Abspaltung von Fmoc vollständig, wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die Lösung wird in eine präparative HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
5. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden) gefriergetrocknet.
6. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C. Typische Ausbeute = 16 mg

Das Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.

HPLC ES/MS

Os-DSG-A₀: Elutionszeit = 23,2 min m⁺/e = 447,4 und 670,3
Synthese von Bis(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)-4-methyl-4'-carboxylpropyl-2,2'-bipyridyl-Osmium
[Os(dm-bpy)₂(mcp-bpy)]Cl₂
Kaliumhexachloroosmium wurde mit 4,4'-Dimethyl-2,2'-dipyridyl im Molverhältnis 1:2 durch Rückflußerhitzen in DMF umgesetzt. Der Kaliumchlorid-Niederschlag wurde abfiltriert und der Dimethylbipyridyldichloroosmium-Komplex wurde unter Verwendung von überschüssigem Natriumdithionit von der Oxidationsstufe +3 auf die Oxidationsstufe +2 reduziert. Das Produkt wurde aus einer DMF/Wasser-Mischung bei 0° umkristallisiert und mittels Filtration gewonnen.
4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl-dichloroosmium wurde mit 4-Methyl-4-carboxylpropyl-2,2'-dipyridyl durch Rückflußerhitzen in Ethylenglycol umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer abgezogen. Das Produkt wurde in DMF gelöst und in Ethylether ausgefällt. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet.
Analytische Daten: Produkt und Zwischenprodukt wurden mittels HPLC und Massenspektroskopie auf Reinheit und Identität der Verbindung analysiert.
Os(dm-bpy)₂Cl₂: Theoretisches MG = 629,6, MS zeigte 8 Isotopen-Peaks mit dem häufigsten Peak bei 630. Die HPLC-Elutionszeit lag bei 29,94 min mit einer Reinheit von 90%+.
Os(dm-bpy)₂(mcp-bpy): MS bestätigte das MG mit 814,5 und HPLC zeigte eine Reinheit größer als 85%.
Synthese des Biotin-Os-Komplexkonjugats
Biotin-[Os(dm-bpy)₂(mcp-bpy)]Cl₂
Die Carboxyl-Gruppe wurde durch Umsetzen des obigen Os-Komplexes mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Der Os-Komplex mit dem aktiven Ester wurde durch präparative HPLC-Verfahren isoliert und dann mit aminhaltigem Biotin umgesetzt, um das Endkonjugat zu bilden.
Experiment zum unabhängigen Messen der Konzentration zweier elektroaktiver Konjugat-Spezies.
Os(bipy)HisCl-DSG-HbA1c wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt.
Ferrocen-AMCHA-DADOO-Biotin wurde aus Ferrocenmonocarbonsäure, dem Vernetzer Aminomethylcyclohexansäure, dem Kettenverlängerer 1,8-Diamino-3,6-dioxooctan und Biotin wie anderweitig beschrieben hergestellt.
Mischungen der beiden Konjugate wurden hergestellt, um die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu bewerten, die Konzentration der Konjugate unabhängig zu messen und Korrekturen für Abweichungen bei den Reagenzienmengen, dem Ansprechen der Elektroden und den Umgebungsbedingungen vorzunehmen.
Teil 1: Ansprechen auf einfache gemischte Konjugate
Die folgende Lösungsmatrix wurde in 10 mM Phosphat-Puffer mit 150 mM NaCl und 0,5% Brij-35, einem nichtionischen Tensid, hergestellt.

Os-DSG-HbA1c Ferrocen-Biotin Os-DSG-HbA1c Ferrocen-Biotin

μM/l μM/l μM/l μM/l

0 0 0 12,5

6,25 0 6,25 12,5

12,5 0 12,5 12,5

25 0 25 12,5

Os-DSG-HbA1c Ferrocen-Biotin Os-DSG-HbA1c Ferrocen-Biotin

μM/l μM/l μM/l μM/l

0 25 0 50

6,25 25 6,25 50

12,5 25 12,5 50

25 25 25 50
Eine Mikroelektrode mit Interdigitalanordnung (IDA) wurde gemäß den beschriebenen Verfahren hergestellt. Zusätzlich zur IDA wies der Chip eine Silber/Silberchlorid-Elektrode auf der Oberfläche auf, die als Bezugselektrode und als Gegenelektrode fungierte. Diese Elektrode wurde mit dem gleichen lithographischen Verfahren hergestellt und dann mit Silber und Silberchlorid gemäß den Standardtechniken elektrolytisch beschichtet. Die IDA wurde an einen Bipotentiostaten angeschlossen, mit dem das Potential relativ zur Bezugselektrode geregelt und der Strom an den jeweiligen IDA gemessen werden kann. Aliquote der Lösungen wurden so auf die Oberfläche des Chips gegeben, daß die IDA und die Bezugselektrode bedeckt waren.
Messungen wurden durchgeführt, indem zunächst ein Potential von
100 mV (gegen Ag/AgCl) an eine Elektrode der IDA und 200 mV an die andere Elektrode für eine Zeitdauer von 30 Sekunden angelegt wurde. Jetzt wurde der Strom an jeder Elektrode gemessen. Dann wurde ein Potential von 200 mV an die eine Elektrode und 550 mV an die andere angelegt. Nach 30 Sekunden wurde wieder der Strom gemessen. Siehe 9 zur Zusammenfassung der Ergebnisse, die eindeutig zeigen, daß die Konzentrationen der beiden Vermittler mit diesem Verfahren unabhängig voneinander gemessen werden können.
Teil 2. Konzentrationscovarianz von Doppel-Vermittlern auf IDA.
In diesem Experiment wurde gezeigt, daß durch Herstellung einer Mischung mit bekannten Konzentrationen der zwei verschiedenen Vermittler und Messen verschiedener Verdünnungen dieser Mischung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens das Verhältnis der Konzentrationen der Vermittler konstant bleibt (Anwendung als innerer Standard).
Es wurden die beiden gleichen Vermittler-Konjugate wie in Teil 1 (Os-DSG-A1c und Fc-Bi) verwendet.
Aus einer Lösung, enthaltend 40 μM des jeweiligen Konjugats, wurden Lösungen hergestellt, die 27 μM, 32 μM und 36 μM des jeweiligen Konjugats im gleichen Puffer (PBS/Brij) enthielten.

Die Lösungen wurden wie im vorhergehenden Beispiel gemessen. Jede Lösung wurde auf 5 verschiedenen IDA-Elektroden gemessen. Die Ergebnisse sind für jede Lösung einzeln und für alle Lösungen über alle Elektroden zusammengefaßt dargestellt als Mittelwerte, Standardabweichungen (S. D.) und Variationskoeffizienten (% C. V.).

Einzelkonzentrationen		Os-DSG-A1c	Fc-Bi	Os/Fc
28 μM	Mittelwert	156	85	1,84
	S. D.	17,5	13,2	0,08
	% C. V.	11,2	15,5	4,4
32 μM	Mittelwert	165	88	1,88
	S. D.	11	7,2	0,04
	% C. V.	6,7	8,2	2,0
36 μM	Mittelwert	189	102	1,85
	S. D.	12,5	6,9	0,04
	% C. V.	6,6	6,7	2,3
40 μM	Mittelwert	208	110	1,90
	S. D.	9,5	5,5	0,06
	% C. V.	4,6	5,0	3,4
Zusammengefaßte Konzentrationen	Mittelwert	182	97	1,87
	S. D.	24,4	13,2	0,06
	% C. V.	13,4	13,5	3,4

Dieses Beispiel zeigt klar, daß der Bezugselementeffekt des Messens zweier Konjugate oder Vermittler und Berechnens des Verhältnisses erheblich bessere Genauigkeit der Messung ergibt, und zwar nicht nur innerhalb der jeweiligen Lösung (Ausgleich der Schwankungen zwischen Elektroden), sondern auch über alle Lösungen (Ausgleich der Schwankungen bei Probenverdünnung oder
menge).
Teil 3. Temperaturausgleich
Es sollte die Effektivität des Verfahrens beim Ausgleich von Umgebungseinflüssen wie etwa Temperaturschwankungen auf die Genauigkeit oder die Messung aufgezeigt werden.
Die beiden gleichen Konjugate wurden wie zuvor als 40 μM-Lösungen hergestellt. Sie wurden wie zuvor auf IDA-Elektroden gemessen, und vor der Messung entweder auf Raumtemperatur oder auf einer geheizten Metallplatte auf 35
40°C erwärmt. Vor dem Aufbringen auf die Elektroden wurden die Lösungen ebenfalls auf 37°C erwärmt.

Raumtemperatur (23°C) Erwärmt (35–40°C) Ansprechverhältnis Warm/RT

Os-DSG-A1c 261 387 1,45

Fc-Bi 179 268 1,5

Verhältnis Os/Fc 1,46 1,44 0,99
Wie anhand der Ergebnisse gezeigt, nehmen die gemessenen Werte im Fall der erwärmten Proben um nahezu 50% zu, was zu einem großen Meßfehler führen würde. Die Anwendung des inneren Standards und die Verhältnisberechnung beseitigen jedoch die Temperaturabhängigkeit des Ergebnisses.
Immunassay-Nachweis von HbA1c mit Osmium-Vermittler-Konjugaten.
Ziel aller Diabetikertherapien ist es, einen nahezu normalen Glucosespiegel im Blut aufrechtzuerhalten. Blut-Glucose-Kits für Zuhause, die die aktuellen Glucosewerte überwachen, sind verfügbar und für Diabetiker wertvoll, um die tägliche Insulindosis und die Eßgewohnheiten anzupassen. Da die Tests leider nur ein Zeitpunktergebnis messen, erfahren die Patienten nicht die gesamte Effektivität ihrer Aktionen zur Aufrechterhaltung der Blutzuckerkontrolle. Die Messung des glycosylierten Hämoglobins wird inzwischen als Index für die mittleren Blutzuckerkonzentrationen über die vorangegangenen 6–8 Wochen allgemein anerkannt und stellt somit ein Maß für die Effektivität der Diabetiker-Gesamttherapie über Zeiträume stabiler Kontrolle bereit. Da die Überwachung des glycosylierten Hämoglobins bei einem Diabetiker zu einer verbesserten Blutzuckerkontrolle führen kann, empfiehlt die ADA routinemäßige Messungen von vier mal pro Jahr bis zu einmal pro Monat für die weniger stabilen Typ-I-Diabetiker.
Mehrere Techniken sind zur Messung des glycosylierten Hämoglobins verfügbar. Dazu gehören Immunassays für HbA1c (TinaQuant, BMC; DCA2000, Ames; und Unimate, Roche), Ionenaustausch (Variant, BioRad; Eagle Diagnostics), und Affinitätschromatographie (ColumnMate, Helena; GlyHb, Pierce).
Ein Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung eines einfach anzuwendenden Einmalstreifens für den elektrochemischen Nachweis von HbA1c für die Anwendung sowohl in der Arztpraxis als auch für Zuhause.
Der wichtigste Parameter zur Bewertung des Zustands des Patienten ist das Verhältnis von HbA1c zu HbA₀, und somit ist die Messung des Werts sowohl des glycosylierten (HbA1c) als auch des nichtglycosylierten (HbA₀) Zustands für die Berechnung des Verhältnisses erforderlich. Hierzu werden zwei getrennte Messungen benötigt. Vorzugsweise wird die gleiche Technik zur Messung sowohl des glycosylierten als auch des nichtglycosylierten Anteils angewandt, um so etwaige, durch die Probe und die Umgebung bedingte Störungen zu vermeiden.
Die Messung von HbA1c mittels elektrochemischem Immunassay wird nachfolgend beschrieben. Messungen von HbA₀ mit elektrochemischen Immunassays werden unter Verwendung derselben Verfahren wie für HbA1c durchgeführt, wobei die Konzentrationen von HbA₀ bedeutend höher liegen. Eine Alternative zu den A₀-Messungen mit Hilfe der Immunaffinität könnte sein, das Gesamthämoglobin direkt mittels Biamperometrie oder Differenzpulsvoltammetrie zu messen. Dies kann problemlos durchgeführt werden, da Hämoglobin bereitwillig durch [Os(bpy)₂(im)Cl]²⁺Cl₂ oxidiert wird.
Das N-terminale Valin der β-Kette des Hämoglobin A ist die Stelle der Glycosylierung in HbA1c und dient als Erkennungsstelle für den Antikörper. Das N-terminale Valin ist in Vollblut für die Bindung des Antikörpers nicht zugänglich. Der Zugang wird durch Lyse der roten Zellen unter Freisetzung des Hämoglobins erreicht, gefolgt von einer Konformationsänderung (Denaturierung oder Entknäuelung), wobei das HbA1c-Epitop in geeigneter Weise freigelegt wird. Verdünnung der Probe kann Teil des Lyse-/Denaturierungsverfahrens sein oder kann nach der Denaturierung erforderlich sein, um die Probe für den Antikörper vorzubereiten (Einstellung des pH, usw.) oder um die Probe in einen für den elektrochemischen Immunassay geeigneten Bereich zu bringen. Bei einer Ausführungsform wird eine festgelegte Menge Antikörper mit der vorbereiteten Probe inkubiert und bindet an das HbA1c-Epitop der Probe. Der freie Antikörper und der an die Probe gebundene Antikörper werden dann mit dem Osmium-Peptid-Konjugat (A1c oder A₀) vereint, um dem verbliebenen ungebundenen Antikörper die Bindung an die Vermittler-Markierung zu ermöglichen. Ist der Vermittler an den Antikörper (ein Makromolekül) gebunden, kann er nicht frei diffundieren, um mit der Elektrode zu interagieren, und somit ist der erzeugte Strom bedeutend geringer. Die verbliebene ungebundene Vermittler-Markierung ist daher proportional zur Konzentration von HbA1c in der Probe. Der ungebundene Vermittler kann elektrochemisch entweder durch ein Enzym-Verstärkungsverfahren oder direkt unter Verwendung einer Elektrode mit Interdigitalanordnung mit bipotentiostatischer Regelung gemessen werden.

Das Ansprechen eines elektrochemischen HbA1c-Immunassays wurde auf Gold-Elektroden mit Enzym-Verstärkung im biamperometrischen Modus gezeigt. Die experimentellen Bedingungen wurden nicht durchgehend optimiert und die Assaykomponenten wurden in Mikrozentrifugenröhrchen vorgemischt und danach auf die 4,95 mm² großen E-Zellen pipettiert. Die experimentellen Bedingungen für diesen Test sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 2 zeigt die Dosis-Ansprech-Daten für Proben mit niedrigem, mittlerem und hohem HbA1c. 4 zeigt die Dosiswirkung mit zwei zusätzlichen Punkten LL und HH, welche einer niederkonzentrierten und einer hochkonzentrierten Probe entsprechen. Die höheren Ströme für LL können möglicherweise durch eine Verminderung der Blut-Proteine (wegen der Verdünnung) erklärt werden, was zu einer Minderung der Elektrodenverschmutzung führt. Tabelle 1. Dosis-Ansprech-Bedingungen

Probenherstellung (Denaturierung)	Reagenzien	Elektrochemische Messungen
1. 20 μl lysiertes Blut für L-, M-, H-Proben (zuvor eingefrorenes Vollblut) 2. 18 μl L (LL) und 22 μl H (für HH) 3. 480 μl 1,5 M LiSCN mit 0,1% Tween 4. Mischen und Denaturierenlassen für 10 Minuten (Vortex)	1. 50 μl 12,5 μM PAB IS < A1c > in PEST 2. 50 μl denaturiertes Blut 3. 20 μl 40 μM Os-DSG-A1c in DI H₂O 4. 20 μl 1M Glucose in DI H₂O 5. 20 μl Glucdor/PQQ (1,7 mg/ml/0,17 mg/ml)	1. VXI Waveform E-450 mV für 60 s 2. Goldelektroden WE = 1,5 × 3,3 mm einsetzen 3. 20 μl Reagens aufbringen 4. Biamperometrischen Meßmodus starten 5. Daten nach 60 s abrufen

Tabelle 2: Dosis-Ansprech-Daten von Blut

	Strom nach 60 s (nA)				Getrennter Denaturierungsschritt			Alle Daten
g/l	#1	#2	#3	#4	Mittel	SD	CV	Mittel	SD	CV
6,49	76,28	78,34	84,79	78,47	79,47	3,69	4,64	81,54	4,67	5,73
6,49	80,30	82,97	86,82	83,48	83,48	2,69	3,22
6,49	83,25	85,49	90,05	86,67	86,67	2,94	3,40
6,49	76,66	71,72	78,24	76,56	76,55	1,44	1,88
12,34	95,61	95,05	93,06	94,02	94,44	1,13	1,20	98,31	4,19	4,26
12,34	98,59	106,29	103,81	102,08	102,08	3,60	3,53
12,34	95,80	103,14	99,90	99,32	99,32	3,06	3,08
12,34	93,16	96,2	103,10	97,41	97,41	4,16	4,27
18,20	100,06	110,83	119,08	112,52	112,52	9,29	8,26	113,48	5,08	4,48
18,20	115,43	116,93	116,77	116,26	116,26	0,71	0,61
18,20	116,12	109,72	112,07	112,21	112,21	2,78	2,48
18,20	118,13	112,16	109,8	112,93	112,93	3,61	3,20

	Berechnetes HbA1c (g/dl)				Getrennter Denaturierungsschritt			Alle Daten
g/l	#1	#2	#3	#4	Mittel	SD	CV	Mittel	SD	CV
6,49	4,46	5,22	7,58	5,26	5,63	1,35	24,00	6,39	1,71	26,80
6,49	5,94	6,91	8,33	7,23	7,10	0,99	13,87
6,49	7,02	7,84	9,51	8,72	8,27	1,08	13,05
6,49	4,60	3,89	5,18	4,56	4,56	0,53	11,58
12,34	11,55	11,34	10,61	10,97	11,12	0,41	3,72	12,54	1,54	12,25
12,34	12,64	15,46	14,56	13,03	13,92	1,32	9,48
12,34	11,62	14,31	13,12	12,58	12,91	1,12	8,70
12,34	10,65	11,77	14,29	12,12	12,21	1,53	12,50
18,20	13,18	17,13	20,15	20,54	17,75	3,41	19,19	18,10	1,86	10,29
18,20	18,82	19,37	19,31	19,00	19,12	0,26	1,36
18,20	19,07	16,72	17,58	17,16	17,63	1,02	5,78
18,20	19,81	17,62	16,75	17,42	17,90	1,32	7,40
n = 16. 4 Denaturierungen für jede HbA1c-Probe mal jeweils 4 Wiederholungen. Y = 2,82x + 62,54; s. Datei 443051A.xls

Blutlyse ist notwendig, um das Hämoglobin freizusetzen, worauf die Denaturierung folgt, um das HbA1c-Epitop freizulegen. Lyse kann leicht über Tenside, osmotische Effekte der Verdünnung mit Wasser und direkt durch zahlreiche Denaturierungsmittel erzielt werden. Es konnte gezeigt werden, daß Blut, das durch einen Gefrier/Auftau-Zyklus lysiert wurde, die biamperometrische Messung nicht signifikant stört (”Ausgangswert” mit und ohne lysiertes Blut war fast identisch). Umgekehrt konnte gezeigt werden, daß Denaturierung des lysierten Bluts mit einer Vielzahl bekannter Denaturierungsmittel zur Freilegung des HbA1c-Epitops das elektrochemische Ansprechen deutlich unterdrückt, so daß die Messung einer HbA1c-Dosiswirkung behindert wird. Nur mit LiSCN und Citronensäure aus der Liste der überprüften Denaturierungsmittel in Tabelle 3 konnte das A1c-Epitop freigelegt und die Protein-verschmutzung ausreichend minimiert werden, um die HbA1c-Dosiswirkung zu messen.

Die Denaturierung der Probe zur Antikörper-Erkennung ohne schwerwiegende Verschmutzung der Elektrodenoberfldche ist für die erfolgreiche Entwicklung eines HbA1c-Immunassays wichtig. Obwohl fast ausschließlich LiSCN verwendet wurde, um die Machbarkeit aufzuzeigen, weist es viele Einschränkungen auf, die seinem Einmalgebrauch im Wege stehen. Citronensäure, ein Feststoff bei RT, könnte dagegen Vorteile als Denaturierungsmittel bieten, falls sie auf einem Streifen getrocknet und mit einem Verdünnungsmittel versetzt werden kann, um den pH auf neutral einzustellen. Denaturierung des Bluts mit Säuren oder Basen, gefolgt von einer abschließenden pH-Einstellung mit einem gepufferten Verdünnungsmittel, ist ein Bereich, der es wert wäre, weiter untersucht zu werden. Ein Problem, auf das man bereits anfänglich gestoßen ist, war die Niederschlagsbildung beim Einstellen des pH zurück auf neutral, was unter Verwendung eines anderen Puffers oder durch Tensidzugabe behoben werden kann. Tabelle 3. Blut-Denaturierungsmittel

Verfahren	Anmerkungen
KSCN	• Anfangsuntersuchung zeigte keine Dosiswirkung mit Blut, das durch KSCN denaturiert wurde. • KSCN hat eine größere negative Wirkung auf das elektrochemische Ansprechen als LiSCN. • Literatur zeigt, daß LiSCN wirksamer ist als KSCN (Anstrengungen auf LiSCN konzentriert).
DCA2000-Puffer	• Denaturierung von Blut nicht sichtbar bei den höheren Blutkonzentrationen, die für diesen Assay benötigt werden. Höhere Konzentrationen von LiSCN nachstehend gezeigt.
LiSCN	• Verfahren beim DCA2000-HbA1c-Immunassay von Ames angewandt.
Citronen-, Schwefel-, Salz- & Perchlorsäure	• Blut-HbA1c-Dosiswirkung (hoch/niedrig) wurde mit Citronensäure beobachtet und ist vergleichbar mit Ansprechen bei LiSCN. • Anzeichen der Blut-Denaturierung waren insgesamt sichtbar: ”Lösung schlug nach braun um”. Citronensäure ist bevorzugt. • Einstellung des pH auf neutral nach Denaturierung zeigte das Problem der Niederschlagsbildung. Enzymvermittelte Wirkungen mit Gluc-Dor bei pH 5,7 reduzieren die Wirkung um 50% gegenüber pH 7–8. • Blut-Denaturierungsverfahren mit Citronensäure ist in Figur 5 gezeigt.
Pepsin/Citronensäure	• Beim HbA1c-Immunassay von Roche wird Pepsin/Citronensäure zur Hämolyse und zum proteolytischen Abbau von Hämoglobin zu Glycoproteinen verwendet, die für den Antikörper zugänglich sind. • Denaturierung war sichtbar durch den Farbumschlag zu einer bräunlich-roten Lösung. • Hämoglobin-A1c Dosiswirkung (hoch/niedrig) wurde erreicht, vergleichbar mit den LiSCN- und Citronensäure-Denaturierungsmitteln. Das Verfahren war identisch mit demjenigen der vorstehend verwendeten Citronensäure, mit der Ausnahme, daß Pepsin zur Säure gegeben wurde. Ergebnisse waren identisch mit denjenigen der Citronensäure.
TTAB (Tetradecyltrimethylammoniumbromid)	• Verfahren zur Denaturierung, das im HbA1c-Turbidimetrie-Immunassay von TinaQuant Verwendung findet. • Anzeichen für die Denaturierung: ”Lösung schlug nach grün um”. • Die enzymvermittelten (Glucdor/PQQ/Glucose) biamperometrischen Messungen wurden durch TTAB-Konzentrationen von 0,0125–0.2% weitgehend unterdrückt. Ausgangswerte waren 16–50 nA gegenüber 140 nA ohne TTAB.
NaOH	• Anzeichen der Denaturierung: ”Lösung schlug nach braun um”. • NaOH beeinflußt die enzymvermittelte Elektrochemie nicht nachteilig. Sogar bei hohem pH verändern sich die Ausgangswerte nicht, obwohl pH-Änderung wahrscheinlich erforderlich sein wird, um diese in einen optimalen Bereich für den Antikörper zu bringen. • Mit NaOH denaturiertes Blut unterdrückt den Ausgangswert wahrscheinlich wegen Protein-Verunreinigung. • Bei Absenkung des pH auf neutral geringe Neigung zur Niederschlagsbildung.

Tabelle 4. Effektives Blut-Denaturierungsverfahren für 2% Blut

LiSCN (Ein Schritt)	LiSCN (Zwei Schritte)	Citronensäure (2 Schritte)
40 μl 6 M LiSCN 20 μl 5% Tween in PBS 20 μl Blut Mischen (Vortex) und 10 min lang denaturieren lassen. Mit 920 μl DI H₂O verdünnen.	960 μl 1,5 M LiSCN 20 μl 5% Tween in PBS 20 μl Blut Mischen (Vortex) und 10 min lang denaturieren lassen.	200 μl 0,2 M Citronensäure 20 μl 5% Tween in PBS 20 μl Blut Mischen (Vortex) und 10 min lang denaturieren lassen. Mit 760 μl 8X PBS (0.1% Tween) verdünnen.
Denaturierungszeit wurde nicht optimiert. Die begrenzten Daten weisen auf längere Zeiten für bessere Genauigkeit bei diesem Verfahren.	Denaturierungszeit wurde nicht optimiert. Die Daten zeigen, daß kürzere Zeiten geeignet sein könnten.	Es wurden keine optimierten Studien durchgeführt.

PBS = 10 mM Phosphat-Puffer, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl pH = 7,4 Höhere Tensid-Konzentration (5% Tween) vermindert oder beseitigt Niederschlagsbildung.

Durch die Elektrodenverschmutzung, verursacht durch denaturierte, an der Elektrodenoberfläche adsorbierte Blutproteine, kann der Elektrontransfer behindert und somit die Empfindlichkeit der Elektrode verringert werden. Die Verschmutzung der Elektrode oder die Passivierung tritt mehr oder weniger sofort nach der Berührung der Probe mit der Oberfläche ein, so daß der erste Ansatz die Minimierung der Schwere der Denaturierung in der Probe sein sollte. Hydrophobe Oberflächeneigenschaften begünstigen die Haftfähigkeit der Proteine, und somit kann die Verschmutzung mit Elektrodenoberflächen mit höheren Oberflächenenergien minimiert werden. Dies erklärt, warum Elektroden aus Gold mit denaturiertem Blut weniger Verschmutzung zeigen als solche aus Palladium. Eine Minderung der Proteinverschmutzung kann durch Verändern oder Schützen der Elektrodenoberfläche erreicht werden. Abwandlungen, die die Oberfläche hydrophiler machen, sollten den Verschmutzungsgrad mindern und können durch Behandlung mit einem Argon- oder Sauerstoff-Plasma oder einer Corona-Entladung erzielt werden. Gewöhnlich kann das Problem mit gezielt ausgewählten Überzügen teilweise umgangen werden, die die Proteine am Erreichen der Elektrodenoberfläche hindern können und auf diesem Gebiet zur Reduzierung der Verschmutzung angewandt werden. Leider wird bei deren Verwendung üblicherweise eine dramatische Abnahme des Ansprechens beobachtet, die größer ist als diejenige mit den denaturierten Blut-Proteinen. Hydrophile Überzüge wie etwa PEO wurden auch überprüft und zeigten einige Verbesserungen, wiesen aber ähnliche Probleme hinsichtlich geringerer Stärke und Genauigkeit auf, dadurch verursacht, daß die Reagenzien zur Diffusion durch die Polymere gezwungen werden. Mit Hilfe von Reagenzien, die auf den Elektroden verteilt und getrocknet werden, könnte das Ausmaß der Protein-Verschmutzung bei weniger negativen Auswirkungen vermindert werden.

Dosis-Ansprechen auf Vermittler-Konzentration, Hemmung mit Antikörper und Umkehrung mit einem BSA-A1c-Polyhaptan wurden überprüft und sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Das Os-DSG-A1c ist in lyophilisierter Form und nach Gefrieren in Lösung (40 und 80 μM) bei –20°C stabil. Tabelle 5. Osmium-Vermittler-Markierungen

Vermittlermarkierung	Konzentrationswirkung	Hemmung mit Antikörper	Umkehrung	Anmerkungen
Os-SMCC-A1c	Linear	PAB IS (≤ 92%) PAB DE (≤ 97%) MAB (≤ 50%)	Ja mit BSA-A1c-Polyhaptan	%-Hemmungswerte reichen von 16% bis 97%, abhängig vom Alter der Os-SMCC-Stammlösung. Zerfällt in Lösung.
Os-SATA-A1c	Linear	PAB IS (≤ 44%)	Ja mit BSA-A1c-Polyhaptan	Stabilität ähnlich wie SMCC.
Os-DSG-A1c	Linear	PAB IS (≤ 91%) PAB DE (≤ 87%) MAB (≤ 78%)	Ja mit BSA-A1c-Polyhaptan	Stabiler als das Konjugat mit SATA und SMCC-Vernetzer, zerfällt aber in Lösung.
Os-SATA-A₀	Linear	Ja mit Schaf-B < HbA₀ > (≤ 84%) Nein mit Kaninchen-Antikörpern von Zymed	Nein mit A₀HB-Peptid #1	A₀-Konjugat stellte sich als instabil in Lösung heraus. Konjugat wurde nicht lyophylisiert.

Polyklonale, DE(Ionenaustausch)-gereinigte Schaf-Antikörper werden im TinaQuant-HbA1c-Assay verwendet. IS(Immunsorbent)-Antikörper werden unter Verwendung eines Standard-IS-Reinigung-Verfahrens hergestellt. Auch Proben monoklonaler Antikörper wurden zur Prüfung gewonnen. Die Hemmungskurven wurden in Lösung aufgenommen, wobei das Mischen stets in Mikrozentrifugenröhrchen erfolgte. Assays wurden gemessen durch Aufbringen von 20 μl auf 6 mm² Palladium-Elektroden mit den Bedingungen, die in Tabelle 5 gezeigt sind. Die Hemmungskurven mit den drei Hämoglobin-A1c-Antikörpern (PAB IS, PAB DE und MAB) wurden erzeugt durch Fixieren von Os-DSG-A1c mit 5 μl und Verändern der Antikörper-Konzentration. Sowohl PAB IS als auch MAB zeigten die erwartete stöchiometrische Beziehung für die Hemmung mit dem Osmium-Peptid-Konjugat, was auf die effiziente und schnelle Bindung des Antikörpers an das A1c-Peptid hinweist. Der polyklonale IS und der monoklonale zeigen beide steile Hemmungskurven, wobei die Maximaländerung nahe bei 5 μM erreicht wird. Zusätzliche Antikörper oberhalb 5 μM zeigten eine geringe Wirkung auf die Zunahme der Hemmung. Die schlechter gereinigten PAB-DEAntikörper ergaben einen viel kleineren Anstieg und benötigten wie erwartet mehr als das Dreifache der Menge, um in die Nähe der maximalen Hemmung zu gelangen. 6 zeigt die Hemmungskurven für jeden der getesteten HbA1c-Antikörper. Aus den Hemmungskurven konnten wir vernünftige Antikörper-Konzentrationen für maximale Umkehrung mit A1c-Proben auswählen.
Hemmungskurven wurden auch für die Os-SMCC-A1c-(Max. = 97%) und OS-SATA-A1c-(Max. = 44%)-Vermittler-Markierung aufgenommen. Die Stabilität der Vermittler-Markierung wurde auch durch Verfolgen der Hemmungswerte über die Zeit bewertet. Sämtliche Vermittler-Markierungen zeigten etwas Zersetzung bei Lagerung in verdünnten Lösungen (40 μM) bei Raumtemperatur. Bei
20°C gefrorene Proben scheinen stabil zu sein.
Zum Aufzeigen der Hemmungsumkehr wurden Antikörper-Konzentrationen von 4 μM sowohl für PAB IS als auch für MAB sowie 15 μM für PAB DE aus den vorstehend gezeigten Hemmungskurven ausgewählt. Die Umkehrungskurven wurden anschließend unter Verwendung einer Verdünnungsreihe von BSA-A1c-Polyhaptan mit einer ^~1:1 A1c:BSA erzeugt. Das ESA-A1c fungiert als Probe und bindet an den Antikörper. 10 zeigt die Umkehrungskurven für die drei Antikörper.
Obwohl bei diesen Machbarkeitsstudien für einen HbA1c-Immunassay ein enzymvermitteltes Verstärkungsverfahren angewandt wurde (Glucdor/PQQ/Glucose wurde verwendet, um den reduzierten Vermittler nach Oxidation an der Elektrodenoberfläche zu regenerieren, wodurch sich ein höherer diffusionskontrollierter Strom ergab, gegeben durch die Cottrell-Gleichung), werden sie als Hinweis auf Ergebnisse erachtet, die bei Verwendung der erfindungsgemäßen IDA-Elektroden mit bipotentiostatischer Regelung erreichbar sind.

Claims

Elektrochemisch nachweisbare Verbindung der Formel
worin R und R₁ gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl, 1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei der Substituent jeweils eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist, R₅ 4-substituiertes 2,2'-Bipyridyl oder 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl ist, wobei der Substituent die Gruppe B-(L)_k-Q(CH₂)_i- ist, und der 4'-Substituent eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist; R, R₁ und R₅ über ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert sind; Q O, S oder NR₄ ist, worin R₄ Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist; -L- ein bivalenter Linker ist; k 1 oder 0 ist; i 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist; B Wasserstoff oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfaßt, der an einen spezifischen Bindungspartner binden kann; d +2 oder +3 ist; X und Y Anionen sind, ausgewählt aus den monovalenten Anionen Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat und Nitrat und den bivalenten Anionen Sulfat, Carbonat oder Sulfit, wobei X und Y unabhängig voneinander 0, 1, 2 oder 3 sind, so daß die Nettoladung von X_xY_y –2 oder –3 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, worin R und R₁ jeweils 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl oder 5,5'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl sind.
Nachweisbare Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin -L- der bivalente Rest eines heterofunktionellen Vernetzers der Formel S-L'-T ist, worin L' ein bivalenter Linker ist und S und T unterschiedliche elektrophile Gruppen sind, die mit einer nucleophilen Gruppe unter Bildung einer covalenten Bindung reagieren können.
Nachweisbare Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin -L- der bivalente Rest eines homofunktionellen Vernetzers der Formel S-L'-T ist, worin L' ein bivalenter Linker ist und S und T gleiche elektrophile Gruppen sind, die mit einer nucleophilen Gruppe unter Bildung einer covalenten Bindung reagieren können.
Nachweisbare Verbindung nach Anspruch 3, wobei B ein Epitop umfaßt, das von einem Antikörper erkannt werden kann, der imstande ist, spezifisch an eine biologisch relevante Verbindung zu binden, so daß der Antikörper imstande ist, kompetitiv mit der biologisch relevanten Verbindung spezifisch an die Verbindung zu binden.
Nachweisbare Verbindung nach Anspruch 4, wobei B ein Epitop umfaßt, das von einem Antikörper erkannt werden kann, der imstande ist, spezifisch an eine biologisch relevante Verbindung zu binden, so daß der Antikörper imstande ist, kompetitiv mit der biologisch relevanten Verbindung spezifisch an die Verbindung zu binden.
Nachweisbare Verbindung nach Anspruch 6, wobei B ein glycosyliertes Peptid der Formel Gluc-Val-His-Leu-Thr- umfaßt und die Verbindung kompetitiv mit glycosyliertem Hämoglobin an einen Antikörper bindet, dessen Epitop das glycosylierte N-terminale Ende der β-Kette von HbA1c enthält.
Nachweisbare Verbindung nach Anspruch 6, wobei B ein Peptid der Formel Val-His-Leu-Thr- umfaßt.
Verfahren zur Messung der Konzentration eines Analyten in einer Probe einer Flüssigkeit, umfassend: Zusammenbringen der Probe mit vorbestimmten Mengen (1) eines spezifischen Bindungspartners für den Analyten und (2) einer nachweisbaren Verbindung nach Anspruch 1, wobei B einen Liganden umfaßt, der so ausgewählt ist, daß die nachweisbare Verbindung kompetitiv mit dem Analyten an das bindende Agens bindet; und elektrochemische Bestimmung der Konzentration der nachweisbaren Verbindung nach Anspruch 1, die nicht an das spezifische bindende Agens gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Flüssigkeitsprobe verdünntes Blut ist, der Analyt glycosyliertes Hämoglo bin ist und die Gruppe B in der Verbindung nach Anspruch 1 ein glycosyliertes Peptid der Formel Gluc-Val-His-Leu-Thr- umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, des weiteren umfassend den Schritt des Bestimmens der Konzentration von Gesamthämoglobin oder nichtglycosyliertem Hämoglobin in der Flüssigkeitsprobe und Berechnen des Konzentrationsverhältnisses von glycosyliertem Hämoglobin zu nichtglycosyliertem Hämoglobin.
Verfahren nach Anspruch 9, 10 oder 11, wobei die Konzentration an nichtgebundener Verbindung nach Anspruch 1 durch Gleichstromvoltammetrie unter Verwendung einer Elektrode mit Mikrointerdigitalanordnung bestimmt wird.