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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft neuartige redoxreversible Konjugate. Gegenstand
der Erfindung sind insbesondere Bipyridyl-komplexierte Osmium-Konjugate,
die zum Nachweisen und Quantifizieren biologisch relevanter Analyten
in einer Flüssigkeitsprobe
brauchbar sind.
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Hintergrund und Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Die
heute von praktischen Ärzten
bei der Behandlung ihres Patientenbestands angewandten therapeutischen
Verfahren erfordern genaue und zweckdienliche Methoden zur Überwachung
von Krankheitszuständen
am Patienten. Viele Bemühungen
richteten sich auf die Erforschung und Entwicklung von Methoden zur
Messung des Vorhandenseins und/oder der Konzentration biologisch
relevanter Substanzen, die auf einen klinischen Befund oder einen
Krankheitszustand hinweisen, insbesondere in Körperflüssigkeiten wie etwa Blut, Urin
oder Speichel. Diese Methoden wurden entwickelt, um die Existenz
oder Schwere einer Fülle
von Krankheitszuständen,
etwa Diabetes, Stoffwechselstörungen,
hormonale Störungen,
zu erfassen und das Vorhandensein und/oder die Konzentration ethischer
Arzneimittel oder illegaler Drogen zu überwachen. In neuerer Zeit
gab es bedeutende Fortschritte bei der Anwendung affinitätsbasierter
elektrochemischer Nachweis-/Meßtechniken,
die zumindest teilweise auf der Bildung eines Komplexes zwischen
der zu analysierenden chemischen Spezies (”Analyt”) und einer weiteren Spezies
beruhen, an die diese spezifisch bindet (”spezifischer Bindungspartner”). Bei
diesen Verfahren wird typischerweise ein markiertes Ligandanalogon
des Zielanalyten eingesetzt, wobei das Ligandanalogon so ausgewählt ist,
daß es
kompetitiv mit dem Analyt an den spezifischen Bindungspartner bindet.
Das Ligandanalogon ist markiert, so daß das Ausmaß der Bindung des markierten
Ligandanalogons an den spezifischen Bindungspartner gemessen und
mit dem Vorhandensein und/oder der Konzentration des Zielanalyts
in der biologischen Probe korreliert werden kann. Typische Assays
der obengenannten Art sind z. B. in
WO
86/02734 ,
WO 93/25907 ,
WO 94/14066 ,
WO 97/01097 ,
WO 97/32886 und
DE-A-43 44 646 beschrieben.
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Bei
diesen affinitätsbasierten
Techniken zum Analysieren einer Probe werden zahlreiche Markierungen
eingesetzt, darunter Enzymmarkierungen, Radioisotopenmarkierungen,
Fluoreszenzmarkierungen und Markierungen mit chemischen Spezies,
die eine elektrochemische Oxidation und/oder Reduktion eingehen. Bei
der Verwendung redoxreversibler Spezies – die bisweilen als Elektronenüberträger oder
Elektronenvermittler bezeichnet werden – als Markierungen für Ligandanaloga
hat sich gezeigt, daß praktisch
verwertbare und verläßliche Ergebnisse
bei affinitätsbasierten
elektrochemischen Assays erhalten werden. Die Anwendung elektrochemischer
Techniken zum Nachweisen und Quantifizieren von Konzentrationen
derartiger redoxreversibler Spezies (die mit den Analytkonzentrationen
korrelieren) ist jedoch nicht ohne Probleme. Elektrochemische Messungen
unterliegen vielen Einflüssen,
die die Genauigkeit der Messungen beeinträchtigen, darunter nicht nur
solchen, die mit Veränderungen
in der Elektrodenstruktur selbst und/oder Matrixeffekten in Zusammenhang
stehen, die sich aus der Variabilität der Flüssigkeitsproben ergeben, sondern
auch solchen, die sich aus Störungen
zwischen mehreren elektroaktiven Spezies ergeben, insbesondere wenn
Analysevorschriften den Nachweis oder die Quantifizierung mehrerer
elektroaktiver Spezies erfordern.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neuartige diffusionsfähige redoxreversible
Osmium-Bipyridyl-Konjugate, die in Immunsensoren brauchbar sind,
die entweder auf indirekten elektrochemischen Nachweistechniken
mit Verstärkung
oder auf der direkten elektrochemischen Messung nachweisfähiger Spezies
mit Elektroden mit Mikroanordnung unter bipotentiostatischer Kontrolle
beruhen. Ein Os-Bipyridyl-Komplex kann beispielsweise covalent an
ein Peptid gebunden sein, das die Aminosäuresequenz des Bindungsepitops
für einen Antikörper aufweist.
Wird das Os-Komplex/Peptid-Konjugat an einen Antikörper gebunden,
so hat das Konjugat keine elektrochemische Funktion mehr; es wird
als ”gehemmt” bezeichnet.
Ein in der Probe vorhandener Analyt wird typischerweise mit dem
Os-Bipyridyl-Komplex/Peptid-Konjugat um die begrenzte Anzahl Bindungsstellen
am Antikörper
konkurrieren. Ist mehr Analyt vorhanden, so wird mehr freies Os-Bipyridyl-Komplex/Peptid-Konjugat
in einem ungebundenen diffusionsfähigen Zustand verbleiben und
einen höheren
Strom an einer Sensorelektrode erzeugen, d. h., an einer der Arbeitselektroden,
wo gemessene Ereignisse (Oxidation oder Reduktion) stattfinden.
Ist im umgekehrten Fall weniger Analyt vorhanden, so wird mehr Indikator/Peptid-Konjugat
am Antikörper
gebunden, was zu weniger freiem Konjugat führt und eine niedrigere Stromstärke an den
Arbeitselektroden ergibt. Der an einer der Arbeitselektroden erfaßte Strom
ist daher von der Analytkonzentration abhängig.
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Häufig will
man mehr als eine Analytspezies in einer Flüssigkeitsprobe messen. Die
Messung mehrerer Spezies in einer Mischung wurde mit Photometrie
und Fluoreszenz durch Auswählen
geeigneter Wellenlängen
erreicht. Elektrochemische Messungen einer einzigen Spezies in einer
komplexen Mischung werden routinemäßig durchgeführt durch
Auswählen
eines Potentials, bei dem nur die gewünschte Spezies oxidiert oder
reduziert wird (Amperometrie), oder durch Abstufen oder Ändern des
Potentials über
einen Bereich, in dem nur die gewünschte Spezies ihre elektrochemischen
Eigenschaften ändert
(Wechselstrom- und Pulsverfahren). Diese Verfahren weisen Nachteile
auf, darunter mangelnde Empfindlichkeit und mangelnde Spezifität, Störung durch
Lade- und Matrixpolarisationströme
(Pulsverfahren) sowie Elektrodenverschmutzung, da keine geeignete Überspannung
angelegt werden kann. Zudem sind elektrochemische Messungen kompliziert
aufgrund der Störungen
zwischen der Vielzahl elektroaktiver Spezies, die in biologischen
Proben im allgemeinen noch vorhanden sind.
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Bekannt
sind Elektrodenstrukturen, die einen stationären Strom über Diffusionsrückführung erzeugen, darunter
Elektroden mit Interdigitalanordnung (IDA) (1 und 2)
und Parallelplattenanordnungen mit bipotentiostatischer Steuerung.
Sie werden verwendet, um reversible Spezies auf der Grundlage des
stationären Stroms
zu messen, der durch Kreislaufführung
der reversiblen Spezies erzielt wird. Ein reversibler Vermittler (redoxreversible
Spezies) wird auf den miteinander verzahnten Elektrodenfingern abwechselnd
oxidiert und reduziert. Der stationäre Strom ist zur Vermittlerkonzentration
proportional (3) und wird durch die Diffusion des
Vermittlers begrenzt. Ein stationärer Strom wird innerhalb von
Sekunden nach Anlegen des vorbestimmten Anoden- (positiveren) und
Kathodenpotentials (weniger positiv bzw. negativ) (6)
an die Mikroelektrodenanordnung erreicht. Die Steigung der Kurve
von IDA-Strom gegen Vermittlerkonzentration ist abhängig von den
IDA-Abmessungen,
und die Steigung nimmt mit engeren Elektrodenabständen zu
(7).
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Die
vorliegende Erfindung macht neuartige Osmium/Bipyridyl-Komplex-Konjugate
verfügbar,
die für ein
Verfahren zur Messung mehrerer Analytspezies in der gleichen Probe
und optimalerweise auf der gleichen Elektrodenstruktur brauchbar
sind und so die Genauigkeit der relativen Messungen verbessern.
Die vorliegenden Konjugate können
mit anderen elektroaktiven Konjugatspezies verwendet werden, die
eigenständige
Redoxpotentiale aufweisen, um so einen elektrochemi schen Biosensor
bereitzustellen, der verbesserte Genauigkeit ergibt. Die Analytkonzentration
kann aus den elektrometrischen Daten gemessen/berechnet werden,
die mit der gleichen Flüssigkeitsprobe
und der gleichen Elektrodenstruktur erhalten werden, so daß Störungen aufgrund
der Veränderlichkeit
der Probe oder der Elektrodenstruktur minimiert werden.
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Die
erfindungsgemäßen diffusionsfähigen Osmium-Konjugate
werden bei Analysen verwendet, die auf dem Prinzip der Diffusionsrückführung beruhen,
wobei eine diffusionsfähige
redoxreversible Spezies an nahegelegenen Elektroden (den Arbeitselektroden)
abwechselnd oxidiert und reduziert wird, um so einen meßbaren Strom
zu erzeugen. Da abwechselnde Oxidation und Reduktion zur Messung
erforderlich ist, werden nur elektroaktive Spezies gemessen, die
beim vorbestimmten Redoxpotential elektrochemisch reversibel sind,
so daß eine
Beeinflussung oder Störung
durch nichtreversible elektroaktive Spezies in der Probe oder andere
redoxreversible Spezies mit eigenständigem Redoxpotential (wenigstens
50 Millivolt unterschiedlich) beseitigt oder zumindest verringert
wird. Redoxreversible Spezies mit unterschiedlichen Oxidationspotentialen lassen
sich unabhängig
voneinander in einer Mischung messen durch Auswahl und bipotentiostatische
Steuerung der Oxidations- und Reduktionspotentiale für benachbarte
Elektrodenpaare, so daß nur
die fragliche Spezies an der Anode oxidiert und an der Kathode reduziert
wird. Sind die Arbeitselektroden so bemessen, daß eine Diffusionsrückführung der
redoxreversiblen Spezies bei den für diese Spezies gewählten geeigneten Oxidations-
und Reduktionspotentialen möglich
ist, so stellt sich schnell ein stationärer Strom durch die Probe und
die Elektrodenstruktur ein. Die Größe des Stroms an den Arbeitselektroden,
wo die meßbaren
Oxidations- und Reduktionsereignisse stattfinden, ist proportional
zur Konzentration der redoxreversiblen Spezies in der Probe. Werden
zwei oder mehr redoxreversible Spezies eingesetzt, so werden diese
so ausgewählt,
daß sich ihre
Redoxpotentiale um wenigstens 50 Millivolt, besonders bevorzugt
wenigstens 200 Millivolt voneinander unterscheiden, um Störungen zwischen
einer Spezies und einer anderen bei der Messung des jeweiligen stationären Stroms
zu minimieren. Die vorliegenden Osmium-Komplex-Konjugate haben eigenständige Redoxpotentiale,
so daß sie
auch in Gegenwart anderer elektroaktiver Konjugate ohne (oder mit
minimaler) Störung verwendet
werden können.
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Die
vorliegenden Konjugate können
bei allen Elektrodenstrukturen/systemen verwendet werden, bei denen
Diffusionsrückführung möglich ist,
um beim Anlegen vorher gewählter
Anoden- und Kathodenpotentiale, die für die komplexe Spezies spezifisch
sind, einen stationären
Strom zu erzielen. Zu den geeigneten Elektrodenstrukturen zählen Mikroelektroden
mit Interdigitalanordnung und Parallelplattenelektroden, die durch
Abstände
innerhalb der Diffusionsentfernung der jeweiligen redoxreversiblen
Spezies voneinander getrennt sind. Die Elektrodenstrukturen umfassen
typischerweise eine Bezugselektrode (z. B. Ag/AgCl), wenigstens
zwei Arbeitselektroden und gegebenenfalls eine Hilfselektrode zur
Stromregelung. Im Gebrauch wird ein programmierbarer Bipotentiostat
an die Elektrodenstruktur elektrisch angeschlossen, um die jeweiligen
Anoden- und Kathodenpotentiale anzulegen, die für die jeweiligen redoxreversiblen
Spezies spezifisch sind, die bei dem Verfahren/Biosensor verwendet
werden. Es wurden mehrere neuartige Osmium-Komplexe, darunter diejenigen
der vorliegenden Erfindung, zur Verwendung als Markierung entwickelt,
um ligandanaloge Konjugate mit ausreichenden Potentialdifferenzen
(wenigstens 50 Millivolt) herzustellen, so daß zwei Osmium-Komplexe (im Gegensatz
zu einem Osmium-Komplex und einer Ferrocen- oder einer anderen redoxreversiblen
Markierung) bei elektrochemischen Assays auf der Grundlage mehrerer
Konjugate verwendet werden können.
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Die
vorliegenden Osmium-Konjugate sind brauchbar für ein Verfahren zur Messung
der Konzentration eines oder mehrerer Analyten in einer Flüssigkeitsprobe.
Das Verfahren umfaßt
das Zusammenbringen eines Teils der Probe mit vorbestimmten Mengen
wenigstens einer ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies mit einem
Redoxpotential, das sich um wenigstens 50 Millivolt von dem einer
jeden anderen Spezies unterscheidet. Jede dieser Spezies umfaßt ein in
der Flüssigkeitsprobe
diffusionsfähiges
Konjugat aus einem Ligandanalogon eines Analyts in der Flüssigkeitsprobe
und einer redoxreversiblen Markierung. Die Flüssigkeitsprobe wird auch mit
einer vorbestimmten Menge wenigstens eines spezifischen Bindungspartners
für den
jeweiligen Analyt zusammengebracht. Das diffusionsfähige Konjugat
ist so ausgewählt,
daß es
mit dem spezifischen Bindungspartner um den Analyt konkurrieren
kann. Die Konzentration der diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies
in der Flüssigkeitsprobe
wird dann elektrochemisch bestimmt. Die Probe wird mit einer Elektrodenstruktur in
Berührung
gebracht, die eine Bezugselektrode und wenigstens eine erste und
zweite Arbeitselektrode umfaßt,
die so bemessen sind, daß wenigstens
eine der diffusionsfähigen
redoxreversiblen Spezies in der Probe durch Diffusion zurückgeführt werden
kann, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential
an der einen Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies
abhängiges
Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode angelegt wird. Typischerweise
wird ein erstes Kathodenpotential an die erste Arbeitselektrode
und ein erstes Anodenpotential an die zweite Arbeitselektrode angelegt,
so daß sich
aufgrund der Diffusionsrückführung der
ersten redoxreversiblen Spezies ein Stromfluß durch die Probe ohne wesentliche
Störung
durch die zweite redoxreversible Spezies einstellen kann. Der Stromfluß durch
eine oder mehrere der Elektroden beim ersten Anoden- und Kathodenpotential
wird gemessen. In ähnlicher
Weise wird der Stromfluß beim
Anlegen eines zweiten Anoden- und Kathodenpotentials an die mit
der Probe in Berührung
stehenden Elektroden gemessen und mit den gemessenen Stromflüssen für bekannte
Konzentrationen der jeweiligen redoxreversiblen Spezies korreliert,
wobei die Konzentrationen proportional zu den jeweiligen Analytkonzentrationen
sind.
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Die
Reagenskomponenten, umfassend die vorliegenden erfindungsgemäßen Bipyridyl/Osmium-Konjugate
und die spezifischen Bindungspartner, können in Form eines Testkits
zum Messen von Zielanalyt(en) in einer Flüssigkeitsprobe entweder als
getrennte Reagenzien oder mehrbevorzugt kombiniert als Multireagenszusammensetzung,
z. B. kombinierte redoxreversible Spezies, kombinierte spezifische
Bindungspartner oder kombinierte redoxreversible Spezies und spezifische
Bindungspartner bereitgestellt werden. Gegebenenfalls, jedoch bevorzugt,
enthält
das Kit eine Elektrodenstruktur, die so bemessen ist, daß Diffusionsredoxrückführung der
diffusionsfähigen
redoxreversiblen Spezies in der Flüssigkeitsprobe möglich ist.
Die Elektrodenstruktur umfaßt
Leiter zum Anschließen
der Struktur an einen Bipotentiostaten, der so programmiert ist,
daß er
je nach redoxreversibler Spezies ein Anoden- und Kathodenpotential
an die Elektrodenstruktur anlegt und den Stromfluß aufgrund
dieser Potentiale typischerweise an einer oder beiden Arbeitselektroden
abfühlt
und mißt.
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Diese
Erfindung beruht auf der Herstellung und Anwendung elektrochemisch
nachweisbarer Osmiumkomplexe und covalenter Konjugate dieser Komplexe
mit Oxidationspotentialen, die sich hinreichend von denen anderer
redoxreversibler Komplexe unterscheiden, so daß sie zusammen mit anderen
Osmium-Konjugaten
oder solchen anderer Metalle verwendet werden können. Somit werden neuartige
Osmium-markierte Ligandanaloga bereitgestellt, die an einen spezifischen
Bindungspartner eines biologisch relevanten Analyts binden können. Die
elektrochemisch nachweisbaren Osmium-Konjugate umfassen einen Tris(bipyridyl)osmium-Komplex,
der gekennzeichnet ist durch schnelle Vermittlungskinetik und niedriges
Redoxpotential (+150 mV gegen Ag/AgCl). Zu einer weiteren Gruppe
Osmiumkomplex-markierter, elektrochemisch nachweisbarer Konjugate,
die mit den vorliegenden Komplexen bei Multikonjugat-Analysenverfahren
verwendet werden können,
zählen
Bis(bipyridyl)imidazolyl-halogenoosmium-Komplexe, die wie die Tris(bipyridyl)osmium-Komplexe durch
schnelle Vermittlungskinetik gekennzeichnet sind, doch weisen die
Tris(bipyridyl)-Komplexe ein Redoxpotential auf, das sich hinreichend
von dem der Bis(bipyridyl)imidazolyl-halogenoosmium-Komplexe unterscheidet,
so daß sie
zusammen bei Analysen unter Verwendung von Mikroelektroden-Anordnungen
verwendet werden können,
um mehr als einen Analyt in einer Flüssigkeitsprobe mit Hilfe konzentrationsabhängiger Ströme zu messen,
die durch Diffusionsredoxrückführung verstärkt werden.
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Die
vorliegenden Osmium-Komplex-Konjugate können in Kombination mit einer
anderen konjugierten redoxreversiblen Spezies zur Messung sowohl
von glycosyliertem Hämoglobin
als auch Hämoglobin
in einer lysierten Blutprobe verwendet werden. Die eine redoxreversible
Spezies umfaßt
vorzugsweise einen Imidazol-Osmium-Komplex, der covalent an ein
Ligandanalogon von Hämoglobin
oder glycosyliertem Hämoglobin gebunden
ist, und die zweite redoxreversible Spezies umfaßt eine zweite redoxreversible
Markierung, die covalent an ein Ligandanalogon des anderen der beiden
Zielanalyte gebunden ist. Das Verfahren ermöglicht die Messung der Konzentration
sowohl von glycosyliertem Hämoglobin
(HbA1c) und der Konzentration von Gesamthämoglobin oder von unglycosyliertem
Hämoglobin
(HbA0), so daß es möglich ist, die Ergebnisse als
Verhältnis
der beiden Messungen zu berechnen (% HbA1c). Es ist von Vorteil,
sowohl HbA1c und Gesamthämoglobin
(oder HbA0) unter Anwendung des gleichen
Prinzips in nur einer Probe zu analysieren, insbesondere weil durch
die Verhält nisbildung
Fehler durch Umgebungseinflüsse
minimiert werden.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein vergrößerter Grundriß einer
Elektrode mit Interdigitalanordnung zur Messung eines reversiblen
Vermittlers.
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2 ist
eine Teilquerschnittansicht der Elektrode von 1,
die die Bedingungen des durch Diffusion des Vermittlers (M) begrenzten
stationären
Stroms erläutert.
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3 ist
eine graphische Darstellung der Dosis-Ansprech-Ströme
für ein
Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-Vermittler/Peptid-Konjugat.
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4 ist
eine graphische Darstellung des Stromflusses gegen die Konzentration
von glycosyliertem Hämoglobin
(HbA1c) in Blutproben unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Osmium-Konjugats
mit enzymverstärkter
Gleichstromamperometrie.
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5 ist
eine graphische Darstellung der Hemmung des Stromflusses aufgrund
freien Konjugats als Funktion der Antikörper-Konzentration (Cn), gemessen
mittels enzymverstärkter
Gleichstromamperometrie [C1 > C2 > C3].
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6 ist
eine graphische Darstellung des Stromflusses gegen die Zeit unter
Verwendung einer Elektrode mit Interdigitalanordnung.
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7 ist
eine graphische Darstellung des Einflusses der Abmessungen der Elektrodenstruktur
mit Interdigitalanordnung auf den Stromfluß als Funktion der Konzentration
eines Osmium-Konjugats (Os-DSG-A1c).
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8 ist
eine graphische Darstellung des Stromflusses als Funktion des angelegten
Potentials für eine
Flüssigkeitsprobe,
die äquimolare
Mengen (50 μM)
eines Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-Komplexes und eines
erfindungsgemäßen Tris(bipyridyl)osmium-Komplexes
enthält.
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9 ist
eine graphische Darstellung des Stromflusses gegen die Konzentration
eines Ferrocen/Biotin-Konjugats in Gegenwart wechselnder Mengen
eines Osmium-Komplex-Konjugats auf Elektroden mit Interdigitalanordnung
mit bipotentiostatischer Regelung.
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10 ist
eine graphische Darstellung des Einflusses der Konzentration eines
nichtmarkierten Konjugats (BSA-A1c) auf den Stromfluß in einer
Lösung,
die Osmium-markiertes Konjugat (Osmium-DSG-A1c) in Gegenwart dreier
verschiedener A1c-erkennender
Antikörper-Zusammensetzungen
enthält.
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11 zeigt
die Struktur eines Tris(bipyridyl)osmium-markierten Konjugats.
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12–14 sind ähnlich und
zeigen jeweils die chemische Struktur eines Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-markierten
Peptid-Konjugats.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
diffusionsfähige
redoxreversible Spezies dieser Erfindung ist ein in einer Flüssigkeitsprobe
diffusionsfähiges
Konjugat aus einem Ligandanalogon eines Analyts und einem redoxreversiblen
Bipyridyl-Osmium-Komplex. Der Begriff ”redoxreversibel” wie hierin
verwendet bezieht sich auf eine chemische Spezies, die reversible
Oxidation und Reduktion in einer Flüssigkeitsprobe eingehen kann.
Redoxreversible Markierungen sind in der Fachwelt bekannt, und dazu
zählen Ligandkomplexe
von Übergangsmetallionen,
zum Beispiel von Eisen (Ferrocen und Ferrocen-Derivate), Ruthenium
und Osmium. Das Konjugat wird hergestellt durch Verknüpfen des
Ligandanalogons mit der Markierung – entweder covalent durch difunktionelle
Verknüpfungsagenzien
oder durch Kombination covalenter Verknüpfungen mit in der Fachwelt
anerkannten spezifischen bindenden Einheiten (zum Beispiel Biotin-Avidin).
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein redoxreversibler
Osmiumkomplex der Formel
worin
R und R
1 gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes
2,2'-Bipyridyl,
5,5'-disubstituiertes
2,2'-Bipyridyl,
1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl
oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei der Substituent
jeweils eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist,
R
5 4-substituiertes 2,2'-Bipyridyl oder 4,4'-disubstituiertes 2,2'-Bipyridyl ist, wobei
der Substituent die Gruppe B-(L)
k-Q(CH
2)
i- ist und der
4'-Substituent eine
Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist;
R, R
1 und
R
5 über
ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert sind;
Q O, S oder NR
4 ist, worin R
4 Wasserstoff,
Methyl oder Ethyl ist;
-L- ein bivalenter Linker ist;
k
1 oder 0 ist;
i 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist;
B Wasserstoff
oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfaßt, der an einen spezifischen
Bindungspartner zu binden imstande ist;
d +2 oder +3 ist;
X
und Y Anionen sind, ausgewählt
aus den monovalenten Anionen Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat,
Perchlorat und Nitrat, und divalenten Anionen, z. B. Sulfat, Carbonat
oder Sulfit, wobei x und y unabhängig
voneinander 0, 1, 2 oder 3 sind, so daß die Nettoladung von X
xY
y –2 oder –3 ist.
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Ein
anderer redoxreversibler Osmium-Komplex, der bei den vorliegenden
Imidazol-Osmium-Konjugaten verwendet werden kann, ist eine Verbindung
der Formel
worin
R und R
1 gleich oder verschieden sind und 2,2'-Bipyridyl, 4,4'-disubstituiertes
2,2'-Bipyridyl,
5,5'-disubstituiertes
2,2'-Bipyridyl,
1,10-Phenanthrolinyl, 4,7-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl
oder 5,6-disubstituiertes 1,10-Phenanthrolinyl sind, wobei der Substituent
jeweils eine Methyl-, Ethyl- oder Phenyl-Gruppe ist,
R und
R
1 über
ihre Stickstoff-Atome an Os koordiniert sind;
q 1 oder 0 ist;
R
7 B-(L)
k-Q(CH
2)
i- ist;
R
2 Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist wenn
q 1 ist, und R
2 B-(L)
k-Q(CH
2)
i- ist wenn q 0
ist;
wobei in der Gruppe B-(L)
k-Q(CH
2)
i-
Q O, S
oder NR
4 ist, worin R
4 Wasserstoff,
Methyl oder Ethyl ist;
-L- ein bivalenter Linker ist;
k
1 oder 0 ist;
i 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist; und
B Wasserstoff
oder eine Gruppe ist, die einen Liganden umfaßt, der an einen spezifischen
Bindungspartner zu binden imstande ist;
Z Chlor oder Brom ist;
m
+1 oder +2 ist;
X ein monovalentes Anion ist, z. B. Chlorid,
Bromid, Iodid, Fluorid, Tetrafluoroborat, Perchlorat, Nitrat, oder
ein divalentes Anion, z. B. Sulfat, Carbonat oder Sulfat;
Y
ein monovalentes Anion ist, z. B. Chlorid, Bromid, Iodid, Fluorid,
Tetrafluoroborat, Perchlorat oder Nitrat; und
n 1 oder null
ist,
mit der Maßgabe,
daß, wenn
X ein divalentes Anion ist, n null ist, und wenn m 1 ist, n null
ist und X kein divalentes Anion ist.
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Redoxreversible
Konjugatspezies einer jeden dieser Formeln werden hergestellt aus
den entsprechenden Verbindungen, worin k 0 ist und B Wasserstoff
ist, durch Umsetzung dieser Verbindungen entweder mit einem heterofunktionellen
Vernetzer der Formel S-L'-T,
worin L' ein bivalenter
Linker ist und S und T unterschiedliche elektrophile Gruppen sind,
die mit einer nucleophilen Gruppe unter Bildung einer covalenten
Bindung reagieren können,
oder mit einem homofunktionellen Vernetzer der Formel S-L'-T, worin L' ein bivalenter Linker
ist und S und T gleiche elektrophile Gruppen sind, die mit einer
nucleophilen Gruppe unter Bildung einer covalenten Bindung reagieren
können.
Die resultierenden Produk te werden dann mit Ligandanaloga unter
den Bedingungen einer klassischen Kupplungsreaktion umgesetzt, um
die Konjugatspezies zu ergeben. Die Oxidationspotentiale der jeweiligen
vorstehend definierten Bis(bipyridyl)imidazolyl- und Tris(bipyridyl)osmium-Komplexe
sind derart, daß die
jeweiligen Komplexe bei der Durchführung des Verfahrens als reversible
Redoxmarkierungen für
die jeweilige redoxreversible Spezies verwendet werden können. 8 zeigt
ein Cyclovoltammogramm für
eine Flüssigkeitsprobe,
die äquimolare
Mengen (50 μM)
eines Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium-Komplexes und eines Tris(bipyridyl)osmium-Komplexes
enthält.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung ist der spezifische Bindungspartner für den jeweiligen
Analyt ein Antikörper,
und das Ligandanalogon wird so ausgewählt, daß es kompetitiv mit dem Analyt
an den Antikörper
bindet. Es gibt jedoch auch andere Beispiele für Wechselwirkungen von Ligand/spezifischer
Bindungspartner, die zur Entwicklung von Anwendungen für das vorliegende
Verfahren genutzt werden können.
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Beispiele
für Liganden
und spezifische Bindungspartner für diese Liganden sind nachstehend
aufgeführt.
Ligand | Spezifischer
Bindungspartner |
Antigen
(z. B. eine Arzneimittelsubstanz) | Spezifischer
Antikörper |
Antikörper | Antigen |
Hormon | Hormon-Rezeptor |
Hormon-Rezeptor | Hormon |
Polynucleotid | Komplementärer Polynucleotid-Strang |
Avidin | Biotin |
Biotin | Avidin |
Protein
A | Immunglobulin |
Immunglobulin | Protein
A |
Enzym | Enzymcofaktor
(Substrat) |
Enzymcofaktor
(Substrat) | Enzym |
Lektine | Spezifisches Kohlenhydrat |
Spezifisches
Kohlenhydrat für
Lektine | Lektine |
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Der
Begriff ”Antikörper” bezieht
sich auf (a) eine der verschiedenen Klassen oder Unterklassen der
Immunglobuline, z. B. IgG, IgM, die von irgendeinem der üblicherweise
verwendeten Tiere stammen, z. B. Schaf, Kaninchen, Ziege oder Maus;
(b) monoklonale Antikörper,
(c) intakte Moleküle
oder ”Fragmente” von Antikörpern, monoklonal
oder polyklonal, wobei die Fragmente solche sind, die die bindende
Region des Antikörpers enthalten,
d. h., Fragmente ohne den Fc-Teil (z. B. Fab, Fab', F(ab')2)
oder die sogenannten ”Halbmolekül”-Fragmente,
die durch reduktive Spaltung der Disulfid-Bindungen erhalten werden, die die Schwerketten-Komponenten
im intakten Antikörper
verbinden. Die Herstellung solcher Antikörper ist in der Fachwelt bekannt.
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Der
Begriff ”Antigen”, der zur
Beschreibung und Definition der vorliegenden Erfindung verwendet
wird, umfaßt
sowohl permanent antigene Spezies (zum Beispiel Proteine, Peptide,
Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren)
als auch Haptane, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht
werden können.
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Die
vorliegenden Osmium-markierten Konjugate sind allein oder in Kombination
mit anderen Konjugaten bei Verfahren zur Messung der Konzentration
eines oder mehrerer Analyte in einer Flüssigkeitsprobe brauchbar. Eines
der Verfahren ermöglicht
zwei oder mehr unabhängige
amperometrische Messungen der Probe auf nur einer Elektrodenstruktur.
Das Verfahren umfaßt:
das
Zusammenbringen eines Volumens der Flüssigkeitsprobe mit
- 1) vorbestimmten Mengen wenigstens einer ersten und zweiten
redoxreversiblen Spezies, wobei die jeweilige Spezies ein Redoxpotential
aufweist, das sich um wenigstens 50 Millivolt von dem der jeweiligen
anderen Spezies unterscheidet, wobei wenigstens eine Spezies ein
in der Flüssigkeitsprobe
diffusionsfähiges Konjugat
aus einem Ligandanalogon eines Analyts in der Flüssigkeitsprobe und einer redoxreversiblen Markierung
umfaßt
und das Konjugat zur kompetitiven Bindung mit einem spezifischen
Bindungspartner für den
Analyt imstande ist, und
- 2) eine vorbestimmte Menge wenigstens eines spezifischen Bindungspartners
für den
jeweiligen zu messenden Analyt; und
elektrochemische Bestimmung
der Konzentration der jeweiligen diffusionsfähigen redoxreversiblen Spezies in
der Flüssigkeitsprobe
durch
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Inberührungbringen
der Probe mit einer Elektrodenstruktur, umfassend eine Bezugselektrode
und wenigstens eine erste und zweite Arbeitselektrode, die so bemessen
sind, daß Diffusionsrückführung der
diffusionsfähigen
redoxreversiblen Spezies in der Probe möglich ist, wenn ein vorbestimmtes,
von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential an
der einen Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen
Spezies abhängiges
Anodenpotential an der zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei die
Diffusionsrückführung der
Spezies ausreichend ist, um einen meßbaren Strom durch die Probe
aufrechtzuerhalten,
Anlegen eines ersten Kathodenpotentials.
an die erste Arbeitselektrode und eines ersten Anodenpotentials
an die zweite Arbeitselektrode, wobei das erste Kathoden- und Anodenpotential
den jeweiligen Potentialen entspricht, die erforderlich sind, damit
sich ein Stromfluß durch
die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der ersten redoxreversiblen
Spezies ohne wesentliche Störung
durch die zweite redoxreversible Spezies einstellt,
Messen
des Stromflusses beim ersten Anoden- und Kathodenpotential,
Anlegen
eines zweiten Kathodenpotentials an die erste oder zweite Arbeitselektrode
und eines zweiten Anodenpotentials an die andere Arbeitselektrode,
wobei das zweite Kathoden- und
Anodenpotential den jeweiligen Potentialen entspricht, die erforderlich
sind, damit sich ein Stromfluß durch
die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der zweiten redoxreversiblen
Spezies ohne wesentliche Störung
durch die erste redoxreversible Spezies einstellt,
Messen des
Stromflusses beim zweiten Anoden- und Kathodenpotential, und
Korrelieren
des jeweiligen gemessenen Stromflusses mit dem für bekannte Konzentrationen
der jeweiligen diffusionsfähigen
redoxreversiblen Spezies, wobei diese Konzentrationen proportional
zu den jeweiligen Analyt-Konzentrationen sind.
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Dieses
Verfahren ist in sehr breitem Umfang anwendbar, kann aber insbesondere
zur Analyse von Arzneimitteln, Hormonen, darunter Peptid-Hormone
(z. B. thyreoideastimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon
(LH), follikelstimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolaktin)
oder Nichtpeptid-Hormone (z. B. Steroid-Hormone wie etwa Cortisol,
Estradiol, Progesteron und Testosteron oder Schilddrüsenhormone
wie etwa Thyroxin (T4) und Triiodthyronin), Proteinen (z. B. menschliches
Choriongonadotropin (hCG), carcinoembryonales Antigen (CEA) und
Alphafetoprotein (AFP)), Arzneimitteln (z. B. Digoxin), Zuckern,
Toxinen oder Vitaminen eingesetzt werden.
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Das
Verfahren läßt sich
mit Flüssigkeitsproben
durchführen,
die biologische Flüssigkeiten
wie etwa Speichel, Urin oder Blut umfassen, oder die Flüssigkeitsprobe
kann aus der Umwelt stammen. Die Flüssigkeitsproben können im
ursprünglichen
Zustand analysiert werden, sie können
aber auch verdünnt,
gepuffert oder anderweitig behandelt werden, um den Nachweis der
Zielanalyte zu optimieren. So können
zum Beispiel Blutproben lysiert und/oder anderweitig denaturiert
werden, um die Zellbestandteile löslich zu machen.
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Das
Verfahren läßt sich
unter Anwendung der verschiedensten Probenbearbeitungstechniken
durchführen.
So kann die Probe vor dem Inberührungbringen
mit der Elektrodenstruktur mit dem spezifischen Bindungspartner
für den
Zielanalyt, der redoxreversiblen Spezies oder mit beiden vorgemischt
werden, oder die Flüssigkeitsprobe
kann zum anschließenden
oder gleichzeitigen Inberührungbringen
mit der Elektrodenstruktur entweder unverdünnt oder vorbehandelt in ein
Gefäß gegeben
werden, das vorbestimmte Mengen an redoxreversibler Spezies und
spezifischem Bindungspartner enthält. Die Reihenfolge des Einbringens
der Komponenten in die Probe ist nicht kritisch; bei einer Ausführungsform
der Erfindung werden jedoch die vorbestimmten Mengen der spezifischen
Bindungspartner zunächst
der Probe zugesetzt und danach die vorbestimmten Mengen der redoxreversiblen
Spezies zugegeben. Die vorbestimmten Mengen der spezifischen Bindungspartner
können
auch mit den redoxreversiblen Spezies unter Bildung des jeweiligen
Komplexes vereinigt werden, ehe diese Komponenten mit der Flüssigkeitsprobe
vereinigt werden. In letzterem Fall wird die redoxreversible Spezies
durch den entsprechenden Analyt von ihrem jeweiligen spezifischen
Bindungspartner verdrängt,
um eine Konzentration an redoxreversibler Spezies zu ergeben, die
proportional zur Kon zentration des Analyts in der Flüssigkeitsprobe
ist. Die Reagenzien, d. h., die vorbestimmten Mengen des spezifischen
Bindungspartners des jeweiligen Analyts und die vorbestimmten Mengen
der entsprechenden redoxreversiblen Spezies können zum Beispiel in einem
Gefäß vorgelegt
und mit einem vorbestimmten Volumen der Flüssigkeitsprobe aufgefüllt werden.
Die Flüssigkeitsprobe
wird dem Gefäß zugesetzt,
und danach oder gleichzeitig wird die Flüssigkeitsprobe mit der Elektrodenstruktur
in Berührung
gebracht.
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Die
Elektrodenstruktur umfaßt
eine Bezugselektrode und wenigstens eine erste und zweite Arbeitselektrode,
die so bemessen sind, daß die
diffusionsfähige
redoxreversible Spezies in der Probe durch Diffusion zurückgeführt werden
kann, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathoden-
und Anodenpotential an die Arbeitselektroden angelegt wird. Der
Begriff ”Arbeitselektrode”, wie hierin
verwendet, bezieht sich auf eine Elektrode, an der gemessene Ereignisse
(d. h., Oxidation und/oder Reduktion) stattfinden und der resultierende
Stromfluß als
Indikator der Analyt-Konzentration gemessen werden kann. ”Anodenpotential” bezieht
sich auf das positivere Potential (das an der Anode anliegt) und ”Kathodenpotential” bezieht
sich auf das weniger positive bzw. negative Potential, das an der
Kathode anliegt (gegen eine Bezugselektrode). Die Elektrodenabmessungen,
die Diffusionsrückführung ermöglichen,
sind in der Fachwelt wohlbekannt, und typischerweise findet man
Anordnungen aus Mikroscheiben, Mikrolöchern oder Mikrobändern. In einer
Ausführungsform
liegen die Elektroden in Form einer miteinander verzahnten Anordnung
aus Mikrobandelektroden mit Mikron- oder Submikron-Abständen vor.
Kurze mittlere Diffusionswege und eine große Anzahl Elektroden sind für wirksame
Stromverstärkung
durch Rückführung der
redoxreversiblen Spezies wünschenswert.
Die Mikroelektrodenanordnungen lassen sich beispielsweise in Form
von Paaren miteinander verzahnter Dünnfilm-Metallelektroden mit Mikron-
oder Submikron-Geometrie auf einem Isolatorsubstrat wie z. B. oxidiertem
Silicium herstellen. Jeder der Elektrodenfinger (1)
weist von seinem benachbartem Finger einen Abstand im Bereich von
Nanometern bis wenigen Mikrometern (1–10 μm) auf. Die Mikroelektrodenanordnungen lassen
sich mittels Photolithographie, Elektronenstrahl-Lithographie und
sogenannter Abhebetechniken herstellen. So kann eine Elektrode mit
Interdigitalanordnung (IDA) mit Hilfe des folgenden allgemeinen
Verfahrens auf Glas, Silicium oder Polyamid abgeschieden werden:
- 1. Aufwachsen einer thermischen Oxidschicht
auf einem Silicium-Substrat;
- 2. Aufstäuben
einer 400 Å-Chrom-Keimschicht
und 2000 Å Gold;
- 3. Photoresist-Rotationsbeschichtung und Weicheinbrennen;
- 4. Belichtung und Entwicklung des Photoresists mit der IDA-Struktur;
- 5. Gold- und Chrom-Strukturierung mittels Ionenstrahlfräsen;
- 6. Abziehen des Photoresists; und
- 7. Schneiden der Elektroden in Stücke, indem zunächst mit
einer Schutzschicht überzogen,
in Streifen geschnitten, die Schutzschicht abgezogen und die Elektrodenoberfläche in einem
Sauerstoff-Plasma gereinigt wird.
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Die
Elektrodenstruktur kann auf der Innenfläche einer Kammer zur Aufnahme
der Flüssigkeitsprobe ausgebildet
werden, z. B. einer Küvette,
einer Kapillarfüllkammer
oder eines anderen probenaufnehmenden Gefäßes, worin die Elektrodenstruktur
mit der Flüssigkeit
in Berührung
gebracht werden kann. Alternativ kann die Elektrodenstruktur den
Teil einer Sonde zum Eintauchen in die Flüssigkeitsprobe bilden, nachdem
die Probe mit der vorbestimmten Menge der redoxreversiblen Spezies
und des spezifischen Bindungspartners in Berührung gebracht wurde. Die Elektrodenstruktur
ist mit Lei tern verbunden, mit denen das entsprechende Kathoden-
und Anodenpotential zur Durchführung
des vorliegenden Verfahrens angelegt werden kann. Anoden- und Kathodenpotential
werden relativ zu einer Bezugselektroden-Komponente der Elektrodenstruktur
unter Verwendung eines Bipotentiostaten angelegt. Die Elektrodenstruktur
kann gegebenenfalls eine Hilfselektrode zur Stromregelung enthalten.
Der Bipotentiostat wird verwendet, um ein erstes Kathodenpotential
an eine erste Arbeitselektrode und ein erstes Anodenpotential an
eine zweite Arbeitselektrode anzulegen, wobei das erste Kathoden-
und Anodenpotential den jeweiligen Potentialen entspricht, die für den Stromfluß durch
die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der ersten redoxreversiblen
Spezies erforderlich sind. Gegebenenfalls kann das Potential an
der einen Arbeitselektrode auf ein von der diffusionsfähigen Spezies
abhängiges
Anodenpotential eingestellt werden, und der Stromfluß wird gemessen,
während
das Potential der anderen Arbeitselektrode ein Potential durchläuft, das
dem vorbestimmten, von der diffusionsfähigen Spezies abhängigen Kathodenpotential
entspricht (oder umgekehrt).
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Das
für jede
reversible Redoxspezies geeignete Kathoden- und Anodenpotential kann leicht durch
empirische Messung bestimmt werden. Die bei der Durchführung dieser
Erfindung verwendeten mehrfach redoxreversiblen Spezies werden so
ausgewählt,
daß sich
die Redoxpotentiale um wenigstens 50 Millivolt, besonders bevorzugt
um wenigstens 100 Millivolt, besonders bevorzugt um wenigstens 200
Millivolt von den Potentialen jeder anderen im Verfahren verwendeten
redoxreversiblen Spezies unterscheiden. Durch den Unterschied bei
den Redoxpotentialen der verwendeten redoxreversiblen Spezies kann
jede Spezies ohne wesentliche Störung
durch eine zweite oder irgendeine andere redoxreversible Spezies
in der Flüssigkeitsprobe
nachgewiesen werden. Nach Anlegen des Anoden- und Kathodenpotentials
stellt sich rasch ein stationärer
Stromfluß an
jeder Arbeitselektrode ein. Der Stromfluß kann entweder an einer oder
an beiden Arbeitselektroden gemessen werden, und dieser ist proportional
der Konzentration der rückgeführten redoxreversiblen
Spezies.
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Das
zweite Kathoden- und Anodenpotential wird an die Arbeitselektroden
angelegt, wobei das zweite Potential denjenigen Potentialen entspricht,
die erforderlich sind, daß sich
Stromfluß durch
die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der zweiten redoxreversiblen
Spezies ohne wesentliche Störung
durch die erste redoxreversible Spezies einstellt, und der resultierende
stationäre
Stromfluß wird
gemessen. Dieser Schritt wird für
jede der im Verfahren verwendeten redoxreversiblen Spezies wiederholt.
Die gemessenen Stromflüsse werden
dann mit bekannten Konzentrationen der jeweiligen diffusionsfähigen redoxreversiblen
Spezies korreliert. Diese Konzentrationen sind direkt proportional
zu den jeweiligen Analytkonzentrationen.
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Die
Verfahrensschritte können
unter Verwendung eines programmierten Bipotentiostaten durchgeführt werden,
um die Potentiale an der Elektrodenstruktur bei Berührung mit
der Probe zu regeln. Der Bipotentiostat kann entweder Teil eines
Tisch- oder eines Hand-Meßgeräts sein,
des weiteren enthaltend Hilfsmittel zum Ablesen der Werte des stationären Stroms,
zum Speichern der Werte und zum Berechnen der Analyt-Konzentrationen
mit Hilfe eines Mikroprozessors, der zum Durchführen solcher Berechnungen programmiert
ist.
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Die
relativen Mengen der ersten und zweiten redoxreversiblen Spezies
und der jeweiligen spezifischen Bindungspartnern für die beim
Verfahren zu messenden Zielanalyten werden empirisch bestimmt. Sie richten
sich nach den Konzentrationsbereichen des Zielanalyten und der Bindungsstöchiometrie
des spezifischen Bindungspartners, der Bindungskonstanten, dem Analyt
und der entsprechenden redoxreversiblen Spezies. Die Menge des jeweiligen
Reagens, die für
den jeweiligen zu messenden Analyt geeignet ist, kann mit Hilfe
empirischer Verfahren bestimmt werden.
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Die
vorliegenden Osmium-Konjugate können
auch bei einem Verfahren zum Messen von zwei proteinhaltigen Analyten
in einer Flüssigkeitsprobe
verwendet werden, wobei die ligandanaloge Komponente der ersten
redoxreversiblen Spezies ein Peptid ist, umfassend ein Epitop eines
ersten Analyts, und die ligandanaloge Komponente einer zweiten redoxreversiblen
Spezies ein Peptid ist, umfassend ein Epitop eines zweiten Analyts.
Der eine bei dem Verfahren angewandte spezifische Bindungspartner
ist ein Antikörper,
der das Epitop des ersten Analyts erkennt, und der andere spezifische
Bindungspartner ist ein Antikörper,
der das Epitop des zweiten Analyts erkennt. Bei einer anderen Anwendung
dieses Verfahrens werden zwei unabhängige Messungen für nur einen
Analyten in einer Flüssigkeitsprobe
durchgeführt.
Bei dieser Ausführungsform
sind die entsprechenden ligandanalogen Komponenten der ersten und
zweiten redoxreversiblen Spezies verschiedene Ligandanaloga des
Zielanalyts. Ist der Zielanalyt eine proteinhaltige Verbindung,
so ist die ligandanaloge Komponente der ersten redoxreversiblen
Spezies ein Peptid, umfassend ein erstes Epitop des Analyts, und das
Ligandanalogon der zweiten redoxreversiblen Spezies ist ein Peptid,
umfassend ein zweites Epitop des Analyts, und die spezifischen Bindungspartner
sind ein erster und zweiter Antikörper, die jeweils das erste
und zweite Analyt-Epitop erkennen.
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Die
vorliegenden Osmium-Konjugate können
auch bei einer Vorrichtung zum Nachweisen und Quantifizieren eines
oder mehrerer Analyten in einer Flüssigkeitsprobe Verwendung finden.
Die Vorrichtung umfaßt:
wenigstens
zwei redoxreversible Spezies, die jeweils zur Diffusion in die Flüssigkeitsprobe
wenigstens in Gegenwart des jeweiligen vorbestimmten Analyten imstande
sind, wobei die redoxreversiblen Spezies jeweils Redoxpotentiale
aufweisen, die sich um wenigstens 50 Millivolt voneinander unterscheiden,
eine
Elektrodenstruktur für
die Berührung
mit der Flüssigkeitsprobe
in der Kammer, wobei die Elektrodenstruktur eine Bezugs- und eine
Arbeitselektrode umfaßt,
die so bemessen sind, daß die
Diffusionsrückführung einer diffusionsfähigen redoxreversiblen
Spezies in einer Flüssigkeitsprobe
bei Berührung
mit dem Elektrodensystem möglich
ist, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential
an die eine Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen
Spezies abhängiges
Anodenpotential an eine zweite Arbeitselektrode angelegt wird, wobei
die Diffusionsrückführung dieser
Spezies ausreichend ist, einen meßbaren Strom durch jede Arbeitselektrode
aufrechtzuerhalten,
und Leiter, die an die jeweiligen Elektroden
zum Anlegen des Anoden- und Kathodenpotentials und zur Führung des
Stroms durch die Elektroden angeschlossen sind.
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Die
Vorrichtung kann mit Hilfe von Verfahren und Techniken aufgebaut
werden, die in der Fachwelt zum Aufbau von Biosensoren mit elektrometrischen
Nachweistechniken bereits beschrieben wurden. Beispielsweise kann
die Vorrichtung eine Kammer umfassen, die eine Aufnahmeöffnung aufweist,
wobei die Kammer so bemessen ist, daß sie sich durch die Kapillarströmung bei
Berührung
der Flüssigkeitsprobe
mit der Probenaufnahmeöffnung
füllt.
Die Elektrodenstruktur kann auf einer Platte ausgebildet sein, die
eine Kammerwand definiert, so daß die Elektrodenstruktur mit
einer Flüssigkeitsprobe
in der Kammer in Berührung
kommt. Beispielsweise kann die Vorrichtung unter Verwendung allgemeiner
Verfahren und Ausgestaltungen konstruiert werden, die in
US-Patent Nr. 5 141 868 beschrieben
sind. Die Merkmale der vorliegenden Erfindung können auch in anderen elektrochemischen
Biosensoren oder Teststreifen enthalten sein, etwa den in den
US-Patenten Nr. 5 120 420 ,
5 437 999 ,
5 192 415 ,
5 264 103 und
5 575 895 beschriebenen. Die Vorrichtung
kann so konstruiert sein, daß sie
die vorbestimmten Mengen an redoxreversiblen Spezies und spezifischen
Bindungspartnern bereits enthält.
So kann zum Beispiel eine Mischung dieser Reagenzien auf eine Wand
der Probenkammer in der Vorrichtung beim Aufbau derselben aufbeschichtet
werden, so daß die
Flüssigkeitsprobe
mit der Reagenzienmischung in Berührung kommt, sobald diese in
die die Probe enthaltende Kammer eingefüllt wird. In einer Ausführungsform
ist die Vorrichtung zur Quantifizierung eines ersten und zweiten
Analyt in einer Flüssigkeitsprobe
aufgebaut. Die Vorrichtung enthält
zwei redoxreversible Spezies, eine erste redoxreversible Spezies,
umfassend ein Konjugat des Ligandanalogons des ersten Analyts, und
eine zweite redoxreversible Spezies, umfassend ein Konjugat des
Ligandanalogons des zweiten Analyts, und einen spezifischen Bindungspartner
für den
jeweiligen Analyt, so daß jedes
der Analyt-Analogon-Konjugate kompetitiv mit seinem entsprechenden
Analyt an einen spezifischen Bindungspartner binden kann.
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Bei
einer anderen Anwendung der vorliegenden Osmium-Konjugate werden
diese in Verbindung mit einer Vorrichtung verwendet, die des weiteren
einen Bipotentiostaten umfaßt,
der mit den Leitern zum Anlegen eines von der redoxreversiblen Spezies
abhängigen
Kathodenpotentials an eine erste Arbeitselektrode und eines von
der redoxreversiblen Spezies abhängiges
Anodenpotentials an eine zweite Arbeitselektrode elektrisch verbunden
ist. Der Biopotentiostat kann so programmiert werden, daß er eine
Folge von Potentialen an die jeweiligen Arbeitselektroden anlegt.
Insbesondere kann der Bipotentiostat so programmiert werden, daß er ein erstes
Kathodenpotential an eine erste Arbeitselektrode und ein erstes
Anodenpotential an eine zweite Arbeitselektrode anlegt, wobei die
ersten Anoden- und Kathodenpotentiale denjenigen Potentialen entsprechen,
die erforderlich sind, daß sich
ein Stromfluß durch
die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der ersten redoxreversiblen
Spezies einstellt. Der Bipotentiostat ist auch so programmiert,
daß er
ein zweites Kathodenpotential an die erste Arbeitselektrode und
ein zweites Potential an die zweite Anodenelektrode anlegt, wobei
die zweiten Kathoden- und Anodenpotentiale denjenigen Potentialen
entsprechen, die erforderlich sind, daß sich ein Stromfluß durch
die Probe aufgrund der Diffusionsrückführung der zweiten redoxreversiblen
Spezies einstellt. In einer alternativen Ausführungsform enthält die Vorrichtung
eine erste und zweite redoxreversible Spezies und wenigstens eine
erste und zweite Elektrodenstruktur für die Berührung mit der Flüssigkeitsprobe
in der Kammer, wobei jede der Elektrodenstrukturen eine Mikroanordnung
von Arbeitselektroden und Hilfsmittel zum Umschalten des Bipotentiostaten
zwischen der ersten und zweiten Elektrodenstruktur umfaßt. Bei
den bevorzugten Ausführungsformen
der Vorrichtung sind Hilfsmittel zum Messen des Stromflusses durch
die Probe beim ersten und zweiten Potential und vorzugsweise zum
Abspeichern der Werte dieser Ströme
in einem Register bereitgestellt, das mit einem Mikroprozessor verbunden
ist, der für
die Berechnung der Analyt-Konzentrationen auf der Grundlage dieser
Werte programmiert ist.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
wird das vorliegende Konjugat in einem Kit zur Messung der Konzentration
von einem oder mehreren Analyten in Flüssigkeitsproben verwendet.
Das Kit umfaßt:
wenigstens
zwei redoxreversible Spezies zur Berührung mit der Flüssigkeitsprobe,
die jeweils zur Diffusion in der Flüssigkeitsprobe wenigstens in
Gegenwart eines vorbestimmten Analyten imstande sind, wobei wenigstens
eine dieser Spezies ein Konjugat eines Ligandanalogons eines Analyten
und einer redoxreversiblen Markierung ist, wobei die redoxreversiblen
Spezies jeweils Redoxpotentiale aufweisen, die sich um wenigstens
50 Millivolt unterscheiden;
einen spezifischen Bindungspartner
für den
jeweiligen Analyt;
eine Elektrodenstruktur zur Berührung mit
der Flüssigkeitsprobe,
wobei die Elektrodenstruktur eine Bezugs- und eine Arbeitselektrode
umfaßt,
die so bemessen sind, daß die
Diffusionsrückführung diffusionsfähiger redoxreversibler
Spezies in der Flüssigkeitsprobe
möglich
ist, wenn ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen Spezies abhängiges Kathodenpotential
an die eine Arbeitselektrode und ein vorbestimmtes, von der redoxreversiblen
Spezies abhängiges
Anodenpotential an die zweiten Arbeitselektrode angelegt wird, wobei
die Diffusionsrückführung dieser
Spezies ausreichend ist, um einen meßbaren Strom durch die Probe
aufrechtzuerhalten; und
an den jeweiligen Elektroden angeschlossene
Leiter zum Anlegen des Anoden- und Kathodenpotentials und zum Führen des
von den Elektroden geleiteten Stroms.
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Bei
einer Ausführungsform
sind die vorliegenden redoxreversiblen Konjugat-Spezies mit anderen elektroaktiven
Spezies in Form einer neuartigen Zusammensetzung zur Berührung mit
der Flüssigkeitsprobe gemischt.
In einer weiteren Ausführungsform
ist die jeweilige redoxreversible Spezies und der jeweilige spezifische
Bindungspartner für
den jeweiligen Analyt in Form einer neuartigen Zusammensetzung zur
Berührung mit
der Flüssigkeitsprobe
gemischt. Vorzugsweise enthält
die redoxreversible Markierung wenigstens einer der redoxreversiblen
Spezies einen erfindungsgemäßen Osmium-Komplex.
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Herstellung der Os-Vermittler-Markierungen
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Es
konnte gezeigt werden, daß der
Os-Vermittler Bis(bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium ein ausgezeichneter
Elektronenvermittler für
viele Oxidoreduktase-Enzyme ist (
US-Patent
Nr. 5 589 326 ). Er weist eine schnelle Vermittlungskinetik
(etwa 500 mal schneller als Hexacyanoferrat(III) mit Glucoseoxidase)
und ein relativ niedriges Redoxpotential (+150 mV gegen Ag/AgCl)
auf. Zudem weist er eine sehr schnelle Elektronübertragungsrate an der Elektrodenoberfläche auf.
Was noch wichtiger ist, die organischen Liganden am Os-Vermittler
können
so funktionalisiert werden, daß sie
an andere Moleküle
ohne störende
Auswirkungen auf die Redoxeigenschaften des Os-Zentrums covalent
gebunden werden können.
Diese einmaligen Eigenschaften des Os-Vermittlers machen ihn zu
einem idealen elektrochemischen Indikator für Sensoren, die auf Immunaffinität beruhen.
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Os-Vermittler
mit diesen neuen Liganden wurden mit Hilfe desselben Verfahrens
hergestellt, das für die
Os-freien Vermittler verwendet wurde. Deren Synthese besteht aus
zwei Hauptverfahrensschritten, die nachstehend gezeigt sind. Die
Einzelheiten dieser Verfahrensschritte sind nachstehend beschrieben.
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Der
erste Verfahrensschritt beinhaltet die Synthese der Os-Zwischenstufe cis-Bis(2,2'-bipyridyl)dichloroosmium(II),
aus handelsüblichem
Osmium-Salz mit Hilfe des nachfolgenden Schemas. Das Zwischenprodukt
wird durch Umkristallisation im Eisbad isoliert.
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Der
zweite Verfahrensschritt beinhaltet die Reaktion der Os-Zwischenstufe
mit Histamin oder 4-Bipyridylessigsäure (oder einem substituierten
Bipyridin zur Herstellung des Tris(bipyridyl)-Komplexes), um Os-Vermittler
mit dem passenden Angriffspunkt herzustellen. Das gewünschte Produkt
wird dann durch Zugabe von Ammoniumtetrafluoroborat aus der Lösung ausgefällt.
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Diese
Os-Vermittler können
auch problemlos in die oxidierte Form, d. h. Os(III), unter Verwendung
von Nitrosoniumtetrafluoroborat überführt werden.
Dies ist jedoch nicht nötig,
da das Os bei den Konjugationsreaktionen unter alkalischen Bedingungen
stets in die reduzierte Form zurückfällt. Zudem
benötigt
man keine oxidierte Form Os(III) für den Nachweis auf dem Biosensor.
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A. Messungen mit lediglich gemischten
Vermittlern
-
- 1. Mikroelektroden mit Interdigitalanordnung
(IDA) werden mit photolithographischen Hilfsmitteln mit Hilfe von
in der Fachwelt anerkannten Verfahren hergestellt (siehe WO 97/34140 ; EP 0299 780 ; D. G. Sanderson und L.
B. Anderson, Analytical Chemistry, 57 (1985), 2388; Koichi Aoki
et. al., J. Electroanalytical Chemistry 256 (1988) 269; und D. Niwa
et al., J. Electroanalytical Chemistry, 167 (1989) 291). Andere
Hilfsmittel, die bei photolithographischen Verfahren Standard sind,
können
ebenfalls verwendet werden, um die gewünschten Leitermuster auf dem
Isolatorsubstrat zu erzeugen.
- 2. Reversible Vermittler werden aus jenen ausgewählt, die
hierin und in den Zitaten ( US-Patente
Nr. 4 945 045 und 5
589 3325 ) beschrieben sind. Vorzugsweise werden zwei verschiedene
Vermittler mit Potentialen ausgewählt, die sich um wenigstens
100 mV, mehrbevorzugt um wenigstens 200 mV unterscheiden. Zu den Beispielen
geeigneter Vermittler gehören
das Os(bipy)2ImCl dieser Erfindung und in US-Patent Nr. 5 589 326 und
Ferrocen, beschrieben in US-Patent
Nr. 4 945 045 und EP
0 142 301 . Mischungen dieser Vermittler werden in wäßriger Lösung hergestellt,
zum Beispiel in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Es können Konzentrationen
zwischen etwa 1 μM
und 1000 μM
bequem gemessen werden.
- 3. Die IDA werden an einen Bipotentiostaten angeschlossen – ein Instrument,
mit dem die Potentiale zweier getrennter Elektroden geregelt werden
können.
Eine Bezugselektrode wird ebenfalls bereitgestellt. Diese nichtpolarisierbare
Elektrode dient als Bezug für
die zwei angelegten Potentiale und kann auch als Gegenelektrode
dienen. Es kann jede nichtpolarisierbare Elektrode verwendet werden,
zum Beispiel Ag/AgCl, etwa die bei ABI/Abtech zu beziehenden. Zur
Regelung des Stromflusses durch die Arbeitselektroden kann auch
eine Hilfselektrode verwendet werden. Die Mischungen werden auf
die IDA gegeben, und die Bezugselektrode wird ebenfalls mit der
Mischung in Berührung
gebracht, oder die IDA wird zusammen mit der Bezugselektrode in
die Mischung eingetaucht.
-
4. Messung des Vermittlers 1 [Os(bipy)2ImCl]
-
Ein
Kathodenpotential wird an einen Satz von Fingern der IDA angelegt,
mit der der Vermittler 1 reduziert werden kann (ca.
50
mV gegen Ag/AgCl). Ein Anodenpotential wird an den anderen Satz
von IDA-Fingern angelegt, mit dem der Vermittler 1, nicht aber der
Vermittler 2 (oder irgendein anderer Vermittler) oxidiert werden
kann (ca. 250 mV gegen Ag/AgCl). Nach einer kurzen Zeit (ms bis
s) ist ein stationärer
Strom meßbar, der
nur von der Konzentration des Vermittlers 1 abhängt.
-
5. Messung des Vermittlers 2 (Ferrocen)
-
Ein
Kathodenpotential wird an einen Satz von Fingern der IDA angelegt,
mit der der Vermittler 2, nicht aber der Vermittler 1 reduziert
werden kann (ca. 250 mV gegen Ag/AgCl). Ein Anodenpotential wird
an den anderen Satz von Fingern der IDA angelegt, mit dem der Vermittler
2 oxidiert werden kann (ca. 550 mV gegen Ag/AgCl). Nach einer kurzen
Zeit (ms bis s) ist ein stationärer
Strom meßbar,
der nur von der Konzentration des Vermittlers 2 abhängt.
-
Assay
der spezifischen Bindung durch Messung mit gemischtem Vermittler
-
Spezifischer Assay von HbA1c in einer
Blutprobe
-
- 1. IDA werden wie in Absatz A oben bereitgestellt.
- 2. Konjugate der Vermittler 1 und 2 und Haptene oder spezifische
Bindungspartner werden mit Hilfe von in der Fachwelt anerkannten
Verfahren für
die covalente Kopplung unter Verwendung entweder eines homofunktionellen
oder eines heterofunktionellen Linkers verfügbar gemacht. Im einzelnen
wird ein synthetisches Peptid, das der N-terminalen Sequenz der β-Kette von
HbA1c entspricht, an den Osmium-Komplex ankonjugiert. Auf die gleiche
Weise wird ein synthetisches Peptid, das der N-terminalen Sequenz
von HbA0 entspricht, an einen zweiten Vermittler,
zum Beispiel Ferrocen, konjugiert.
- 3. Antikörper
für Analyte
(HbA1c und HbA0), die spezifisch mit den
in das Konjugat eingebrachten N-terminalen Peptiden reagieren, werden
mit Hilfe von Standard-Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper bereitgestellt.
In diesem Fall werden Schafe mit Träger-Proteinen immunisiert,
an die die synthetischen Peptid-Sequenzen für HbA1c und HbA0 konjugiert
sind. Nach Ablauf des entsprechenden Immunisierungsschemas wird
den Schafen Blut entnommen, und die Antikörper werden mittels Ionenaustausch-Chromatographie
aus dem Blut isoliert, gefolgt von Immunsorbens-Reinigung auf einer
Säule mit
dem gleichen N-terminalen Peptid, das einen anderen Linker aufweist.
- 4. Die geeignete Stöchiometrie
der Reaktion wurde unabhängig
für die
zwei Reaktionen mittels Standard-Verfahren zur Entwicklung von Immunassays
bestimmt. Eine Lösung,
die eine festgelegte Menge eines markierten Konjugats enthält, wurde
mit einer Lösung
mit veränderlichen
Mengen von Antikörpern
vermischt, und nach einer angemessenen Inkubationszeit wurde die
Menge des verbliebenen freien Konjugats auf der IDA unter Anwendung
des vorstehend beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Menge Antikörper, die
gerade ausreichend ist, um maximale Hemmung des Konjugats (ca. > 80%) zu erreichen,
wurde ausgewählt.
- 5. Reagens-Lösung
1 wurde so hergestellt, daß sie
eine Mischung der beiden Konjugate in angemessenen Konzentrationen
enthielt. Reagens-Lösung
2 wurde so hergestellt, daß sie
eine Mischung der beiden Antikörper
in den vorstehend bestimmten Mengen enthielt. Eine Blutprobe wurde
in einer Lösung
von 25 mM Citronensäure/0,5%
Brij-35 auf ca. das 20fache verdünnt.
Im Anschluß an
eine Inkubation für
30 Sekunden zur Lyse und Denaturierung von Hämoglobin wurden 33 μl 1 M Phosphat-Puffer
zu 66 μl
der verdünnten Probe
gegeben, um den pH wieder auf neutral zu bringen. Es wurden 30 μl der Antikörper-Lösung 2 zugesetzt
und die Mischung 30 s lang zum Inkubieren belassen. Dann wurden
30 μl der
Konjugat-Lösung
1 zugegeben, und die Mischung wurde auf der IDA gemessen. Die Konzentration
von HbA1c in der Probe wird mit dem für Vermittler 1 gemessenen Strom
und die Konzen tration von HbA0 wird mit
dem Strom von Vermittler 2 in Beziehung gesetzt. % HbA1c in der
Probe wird mit dem Verhältnis
der gemessenen Mengen von Vermittler 1 und Vermittler 2 in Beziehung
gesetzt.
-
Anwendung auf HbA1c-Assay
-
Hämoglobin
A1c ist ein spezifisches Glycohämoglobin,
bei dem die Glycosylierung am N-Terminus der β-Kette von Hämoglobin stattfindet. Der Antikörper bindet
spezifisch an HbA1c, das eine Eitop-Sequenz Gluc-Val-His-Leu-Thr
aufweist. Um die Konjugation zu anderen Molekülen zu erleichtern, wird eine
nichtnatürliche
Aminosäure
zur Sequenz gegeben, z. B. Cys, Lys, oder Lys-MH, um A1c-Peptide
zu erzeugen, darunter: 1) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys-MH; 2) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Lys;
3) Gluc-Val-His-Leu-Thr-Cys.
-
Beim
HbA1c-Assay ist das Messen sowohl der A1c-Konzentration als auch
der Gesamthämoglobin-Konzentration
erforderlich und die Ergebnisse werden als Verhältnis dieser beiden Messungen
(% HbA1c) angegeben. Es ist vorteilhaft, sowohl A1c als auch das
Gesamthämoglobin
unter Anwendung des gleichen Prinzips zu analysieren, weil durch
die Verhältnisbildung
Fehler durch Umgebungseinflüsse
minimiert werden. Somit wird der Antikörper dazu veranlaßt, spezifisch
an die Hämoglobine
mit unglycosyliertem N-Terminus zu binden, d. h. mit einer Epitop-Sequenz
Val-His-Leu-Thr. Auf die gleiche Weise wird eine nichtnatürliche Aminosäure an die
Sequenz angefügt,
um die Konjugation zu erleichtern. Die zur Messung des Gesamthämoglobins
verwendeten Peptide werden als A0-Peptide
bezeichnet. Zu den A0-Peptiden, die bei
der Herstellung von Os-Vermittler-Peptid-Konjugaten Verwendung finden,
gehören
Val-His-Leu-Thr-Cys und Val-His-Leu-Thr-Lys.
-
Chemie der Konjugation und
Konjugate
-
Es
gibt eine mannigfaltige Chemie der Konjugation, die zur Verknüpfung eines
Os-Vermittlers mit einem Peptid angewandt werden kann. Die folgenden
zwei Konjugationsprinzpien, die zur Herstellung von Os-Vermittler-Peptid-Konjugaten
eingesetzt wurden, werden im allgemeinen auch zur Herstellung der
Protein-Konjugate verwendet: 1) Bildung einer Amid-Bindung durch einen
reaktiven Ester mit einem primären
Amin; 2) Bildung einer Thioether-Bindung durch Maleinimid mit einer
Sulfhydryl-Gruppe. Die Amid-Bindung ist gegenüber einer Thioether-Bindung
bevorzugt, weil die Amid-Bindung im allgemeinen stabiler ist. Auf
der Grundlage der bevorzugten Konjugationschemie kann der Ligand
am Os-Vermittler entweder mit einer primären Amino-Gruppe oder mit einer
Carbonsäure-Gruppe
funktionalisiert werden. Man nimmt an, daß die beste Stelle für diese
funktionelle Gruppe die C-4- oder C-5-Position am Bipyridyl-Liganden
des Os-Vermittlers ist, doch kann die Funktionalisierung auch über das
nicht an Os komplexierte Bipyridylring-Stickstoffatom erfolgen.
Es wurden zwei verschiedene funktionalisierte Os-Vermittler wie
vorstehend beschrieben hergestellt.
-
Der
Os-Vermittler (a) wurde mit Histamin erzeugt, während der Os-Vermittler (b)
mit Bipyridylessigsäure
erzeugt wur de. Es wurde jedoch gefunden, daß der Imino-Stickstoff des
Bipyridyl-Rings die Aktivierung der Carbonsäure-Gruppe zum reaktiven Ester
(d. h. N-Hydroxysuccinimidester) mit Carbodiimid stört. Daher
ergibt die Verwendung von Carbonsäurefunktionalisierten Os-Vermittlern
bei der Synthese der Os-Vermittler-Peptid-Konjugate
weniger günstige
Ergebnisse.
-
Die
Amino-Gruppe am Histamin-Liganden des Os-Vermittlers reagiert bereitwillig
mit N-Hydroxysuccinimid(NHS)-Ester unter Bildung einer Amid-Bindung.
Zwei Typen von Vernetzern werden eingesetzt, um Os-Vermittler mit
Peptiden zu verknüpfen,
(a) heterofunktionelle Vernetzer, die einen NHS-Ester an einem Ende und am anderen Ende
eine Maleinimid- oder
Sulfhydryl-Gruppe aufweisen, und (b) homofunktionelle Vernetzer,
worin z. B. beide Enden NHS-Ester aufweisen.
-
Im
Fall eines heterofunktionellen Vernetzers wird dieser zunächst mit
dem Os-Vermittler mit Histamin-Ligand (Os-Histamin) in einem molaren Verhältnis von
1:1 umgesetzt. Ein besonderer Punkt muß hierbei beachtet werden.
Ein Os-Vermittler
in seiner oxidierten Form, d. h. Os(III), kann die Sulfhydryl-Gruppe
sofort unter Bildung einer Disulfid-Bindung oxidieren. Es ist wichtig, das
Os-Zentrum durch Zugabe einer kleinen Menge eines Reduktionsmittels
wie etwa Natriumdithionit während
des Konjugationsverfahrens in seiner reduzierten Form zu halten.
Der Reaktionsverlauf kann mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC
auf einer C18-Säule
verfolgt werden. Danach wird das Os-Vermittler-Vernetzer-Addukt über präparative
HPLC isoliert und die aufgefangene Fraktion anschließend gefriergetrocknet.
Schließlich
wird das Os-Vermittler-Vernetzer-Addukt mit dem geeigneten Peptid
unter Bildung des Os-Vermittler-Peptid-Konjugats umgesetzt. Wiederum
wird das Produkt durch Auffangen der entsprechenden Fraktion in
der präparativen
HPLC isoliert und die aufgefangene Fraktion gefriergetrocknet.
-
Zur
Synthese der Os-Vermittler-Peptide-Konjugate wurden zwei verschiedene
heterofunktionelle Vernetzer verwendet. SMCC(Succinimidyl-4-[N-maleinimidomethyl]cyclohexan-1-carboxylat)
wird für
cysteinhaltiges Peptid verwendet, während SATA (N-Succinimidyl-S-acetylthioacetat)
für Maleinimid-haltiges
Peptid Verwendung findet. Drei Os-Vermittler-Peptid-Konjugate (zwei mit
A1c-Peptid und eines mit A
0-Peptid) wurden
unter Verwendung von heterofunktionellen Vernetzern hergestellt,
und ihre Strukturen sind nachstehend gezeigt: (a) Os-SMMC-A1c; (b)
Os-SATA-A1c, und (c) Os-SATA-A
0.
-
Es
wurde jedoch gefunden, daß diese
Konjugate bei Lagerung als Lösungen
nicht stabil sind. Ergebnisse einer analytischen HPLC haben gezeigt,
daß sich
diese Konjugate zersetzen. Durch Massenspektroskopie wurde bestätigt, daß die Instabilität von der
Spaltung der Thioether-Bindung in diesen Konjugaten herrührt.
-
Um
Thioether-Bindung im Konjugat zu vermeiden, wurden homo-funktionelle, zwei
NHS-Ester enthaltende Vernetzer verwendet, anstatt die Konjugate
herzustellen. Als Vernetzer wurde DSG (Disuccinimidylglutarat) verwendet.
Um die Bildung von vernetztem Os-Vermittler, d. h. Os-Vernetzer-Os,
zu verhindern, wurde ein großer Überschuß an homofunktionellem
Vernetzer bei der Reaktion mit Os-Histamin in einem molaren Verhältnis von
4:1 verwendet. Unter dieser Bedingung bildete sich nur das gewünschte Produkt,
d. h. der Os-Vernetzer. Das Os-DSG-A1c-Konjugat wurde auf die gleiche
Weise unter Anwendung des bereits beschriebenen Verfahrens hergestellt.
-
Zur
Herstellung des analogen Os-DSG-A0-Konjugats
bedarf es eines Extraschritts, da das nichtglycosylierte N-terminale
Amin des HbA0-Peptids gegenüber NHS-Ester
ebenfalls reaktiv ist. In diesem Fall wird das N-terminale Amin
des HbA0-Peptids
zunächst
durch entweder eine basenempfindliche Fmoc- oder eine säureempfindliche
Boc-Gruppe geschützt. Nach
der Umsetzung mit dem Os-DSG-Addukt zwecks Bildung des Os-DSG-A0-Konjugats wird die Schutzgruppe dann unter
Verwendung geeigneter Schutzgruppenabspaltungsverfahren (Zugabe
von Base für
Fmoc oder Säure
für Boc)
entfernt. Die mittels Festphasen-Peptidsynthese hergestellten Peptide
weisen stets N-terminale Fmoc-Schutzgruppen auf. Die Schutzgruppen
werden normalerweise vor der Abspaltung der Peptide von den Harzperlen
abgetrennt, sie können
aber auch dort belassen werden, falls gewünscht. Die HbA0-Peptide
von Zymed weisen eine intakte Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus auf.
Unter Anwendung dieser Strategie wurde das Os-DSG-A0-Konjugat
erfolgreich synthetisiert.
-
Zahlreiche
Analyte können
nicht mit Hilfe enzymbasierter Sensoren analysiert werden. Für diese
bedarf es der Entwicklung von Affinitäts-Biosensoren oder Immunsensoren
auf der Grundlage der spezifischen Bindung von Antigenen an Antikörper. Der
Schlüssel
zum Nachweis dieses Bindungsvorgangs an elektrochemischen Sensoren
liegt in der Beigabe von Antigenen, die mit Redoxmarkierungen markiert
sind. Bis(2,2'-bipyridyl)imidazolyl-chloroosmium,
ebenfalls als Os-Vermittler bekannt, besitzt viele Eigenschaften,
die es zu einer ausgezeichneten Redoxmarkierung für diesen
Zweck machen. Zudem kann ein Angriffspunkt für die covalente Verknüpfung desselben
mit Antigenen angefügt
werden, ohne dessen Redoxeigenschaften zu beeinflussen.
-
Mehrere
Assayschemata können
bei Affinitätsbiosensoren
angewandt werden, darunter: i) Assay unter kompetitiver Bindung
(markiertes Antigen konkurriert um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen;
ii) Assay unter sequentieller Bindung (markiertes Antigen bindet
an im Überschuß vorhandene
Bindungsstellen); iii) heterogener Assay (mit Trennungsschritt zur
Trennung gebundener und freier markierter Antigene) und iv) homogener
Assay (kein Trennungsschritt). Zu den bei einem homogenen Assay
unter sequentieller Bindung beteiligten Schritten gehört die Bindung
des Analyten an einen Antikörper.
Das markierte Antigen (Analyt-Analogon) bindet an die verbliebenen
Bindungsstellen am Antikörper.
Schließlich
wird das übrig
gebliebene, freie markierte Antigen an der Elektrodenoberfläche nachgewiesen.
Der resultierende Strom ist eine Funktion der Menge des vorhandenen
Analyts.
-
Der
Nachweis von freien markierten Antigenen kann mit Hilfe von entweder
direkten Nachweisverfahren oder Nachweisverfahren mit Verstärkung erreicht
werden. Beim Direktnachweis ist die Anwendung fortgeschrittener
elektrochemischer Techniken erforderlich, etwa Wechselstrom-Voltammetrie,
Differenzpulsvoltammetrie, Rechteckwellen-Voltammetrie oder Wechselstrom-Impendanz,
um eine Empfindlichkeit von 5 μM
oder darunter zu erreichen. Bei den Nachweisverfahren mit Verstärkung wird
die Gleichstrom-Amperometrie mit Verstärkung über eine Reaktion mit Enzymen
oder chemischen Reduktionsmitteln angewandt, oder es werden Mikroelektroden
mit Interdigitalanordnung (IDA) verwendet. Das bevorzugte Nachweisverfahren
ist die Verstärkungs-Amperometrie
durch Kreislaufführung
der freien Os-Vermittler-Markierung unter Verwendung von IDA-Mikroelektroden.
Amperometrie mit Verstärkung
unter Verwendung von Gluc-DOR-Enzym kann jedoch ebenfalls angewandt
werden. Eine schnelle Vermittlungskinetik des Os-Vermittlers ist
sehr wünschenswert, weil
die Größe der Verstärkung von
der Geschwindigkeitskonstante der Vermittlung mit dem Enzym abhängt.
-
Allgemeines analytisches HPLC-Verfahren
für Osmium-Konjugate
-
Sämtliche
HPLC-Analysen wurden mit Hilfe eines HPLC-Systems vom Typ Beckman-System-Gold durchgeführt, das
aus einem 126-Pumpen-Modul und einem 168-Dioden-Array-Detektor-Modul
besteht. Als stationäre
Phase diente eine analytische Umkehrphasen-C18-Säule von Vydac. Andere Parameter
sind nachstehend aufgelistet.
Mobile
Phase: | A
= 0,1% TFA3 in H2O
B
= 0,1% TFA in CH3CN |
| |
Fließgeschwindigkeit: | 1
ml/min |
| |
Gradient: | 0–5 min:
10% B
5–45
min: 10% B => 50%
B mit 1%/min
45–50
min: 100% B |
| |
Detektor: | Kanal
A mit 384 nm
Kanal B mit 220 nm. |
- 3TFA = Trifluoressigsäure
-
Synthese von Bis(2,2'-bipyridyl)dichloroosmium
-
- 1. Ein Einliter-Einhalsrundkolben wird mit
19,335 g K2OsCl6 (0,04019
mol) und 13,295 g 2,2'-Dipyridyl (0,08512
mol) befüllt.
Es werden 400 ml DMF zugegeben, um alle Recktanten zu lösen.
- 2. Die Lösung
wird auf Rückfluß erhitzt
und danach der Rückfluß 1 Stunde
lang aufrechterhalten. Die Heizung wird abgeschaltet, und man läßt die Lösung bei
Umgebungsbedingungen auf 30–40°C abkühlen.
- 3. Die Reaktionsmischung wird unter Verwendung eines mittleren
Glasfrittenfilters filtriert. Der Kolben wird mit weiteren 20 ml
DMF ausgespült
und das Filter gewaschen.
- 4. Das Filtrat wird in ein Dreiliter-Becherglas überführt. Ein
weiteres Zweiliter-Becherglas wird mit 22,799 g NaS2O4 befüllt
und dieses in 2 1 deionisiertem Wasser gelöst. Diese Lösung wird tropfenweise mittels
Tropftrichter in das das Os/DMF-Filtrat enthaltende Becherglas gegeben,
wobei die Lösung
ständig
gerührt
wird.
- 5. Die Mischung wird dann in einem Eis-Bad für wenigstens 3 Stunden abgekühlt. Bei
Bedarf wird weiteres Eis zugegeben.
- 6. Die Mischung wird ”kalt” unter
Verwendung eines Keramikfilters mit Filterpapier filtriert. Der
Rückstand auf
dem Filter wird zweimal mit 50 ml Wasser und zweimal mit 50 ml Ether
gewaschen.
- 7. Das Produkt wird unter Hochvakuum bei 50°C über Nacht (wenigstens 15 Stunden
lang) getrocknet. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes
Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem Exsiccator bei Raumtemperatur.
Typische
Ausbeute = 16 g oder 70%.
-
Das
Produkt wird mittels UV-VIS-Spektroskopie und Elementaranalyse (EA)
analysiert.
UV-VIS: | Peak λ(nm) | ε(M–1cm–1) |
| 382 | 10,745 |
| 465 | 9,914 |
| 558 | 11,560 |
| 836 | 3,873 |
EA: | | C% | H% | N% | Cl% | Os% | H2O% |
| theoretisch: | 41,89 | 2,81 | 9,77 | 12,36 | 33,17 | 0 |
| tatsächlich: | 40,74 | 2,92 | 9,87 | 11,91 | | 0,41 |
-
Synthese von Bis(2,2'-bipyridyl)histamin-chloroosmium
-
- 1. Ein Zweiliter-Einhalsrundkolben wird mit
11,3959 g Os(bpy)2Cl2 (0,0198
mol) und 4,9836 g Histamin (0,0448 mol) befüllt. Um die Recktanten zu lösen, werden
500 ml Ethanol zugegeben. Danach werden 250 ml deionisiertes Wasser
zugegeben.
- 2. Die Lösung
wird auf Rückfluß erhitzt
und der Rückfluß 6 Stunden
lang aufrechterhalten. Anschließend läßt man die
Lösung
bei Umgebungsbedingungen auf Raumtemperatur abkühlen.
- 3. Mittels Einengen am Rotationsverdampfer wird sämtliches
Ethanol entfernt. Danach wird die Lösung in ein 500 ml-Becherglas gegeben.
2,136 g NH4BF4 werden
in 20 ml Wasser gelöst
und tropfenweise zur Os-Lösung
gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildet. Nach Abkühlen in
einem Eis-Bad für
30 min wird die Mischung mit Hilfe eines Keramikfilters mit Filterpapier
filtriert. Der Inhalt des Filters wird zweimal mit ~20
ml Wasser gewaschen.
- 4. Trocknung erfolgt bei 50°C
unter Hochvakuum über
Nacht (wenigstens 15 Stunden).
- 5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Lagerung
erfolgt in einem Exsiccator bei Raumtemperatur.
Typische Ausbeute
= 7,6 g oder 52%.
-
Das
Produkt wird mittels UV-VIS-Spektroskopie und HPLC analysiert.
UV-VIS: | Peak λ(nm) | ε(M–1cm–1) |
| 355 | 7,538 |
| 424 | 7,334 |
| 514 | 7,334 |
| 722 | 2,775 |
HPLC: | Elutionszeit
= 18,0 min
Reinheit nach HPLC im Bereich von 65–85% |
-
Herstellung des Addukts [Os(bpy)2(Histamin)Cl]/heterofunktioneller Vernetzer
-
- 1. 0,1167 g [Os(bpy)2(Histamin)Cl]BF4 (0,162 mmol) werden abgewogen und in ein
5 ml-Reacti-Vial überführt. 1,0
ml DMF werden zugegeben, um den Reaktant zu lösen. Danach werden 25 μl Triethylamin
zugegeben.
- 2. 0,0508 g SMCC (0,150 mmol) oder 0,0390 g SATA (0,168 mmol)
werden zugesetzt. Die Recktanten werden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur
gerührt.
Eine Probe wird in eine HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion
zu verfolgen.
- 3. Ist die Umsetzung vollständig,
wird die Lösung
mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die
Lösung
wird in eine präparative
HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
- 4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht gefriergetrocknet.
- 5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei 20°C.
Typische
Ausbeute = 40 mg oder 25%.
-
Das
Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.
| HPLC | ES/MS |
Os-SMCC: | Elutionszeit
= 32,1 min | m+/e = 434,2 |
Os-SATA: | Elutionszeit
= 27,5 min | m+/e = 382,8 |
-
Herstellung des Addukts (Os(bpy)2(Histamin)Cl]/homofunktioneller Vernetzer
-
- 1. 0,2042 g DSG (0,626 mmol) werden abgewogen
und in ein 5 ml-Reacti-Vial überführt. 0,75
ml DMF werden zugesetzt, um den Reaktant zu lösen.
- 2. 0,1023 g [Os(bpy)2(Histamin)Cl]BF4 (0,142 mmol) werden abgewogen und in separates
5 ml-Reacti-Vial gegeben. 1,0 ml DMF werden zugesetzt, um den Reaktant
zu lösen.
25 μl Triethylamin
werden zugegeben. Danach wird die DSG/DW-Lösung unter ständigem Rühren tropfenweise
mit der Os/DMF-Lösung
versetzt. Man läßt 2 Stunden
bei Raumtemperatur reagieren, worauf eine Probe in eine HPLC injiziert
wird, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
- 3. Ist die Umsetzung vollständig,
wird die Lösung
mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die
Lösung
wird in eine präparative
HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
- 4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht gefriergetrocknet.
- 5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C.
Typische
Ausbeute = 45 mg oder 35%.
-
Das
Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.
HPLC | ES/MS |
Os-DSG:
Elutionszeit = 27,1 min | m+/e = 429,2 und 859,6 |
-
Herstellung des Os-SATA-A1c-Konjugats
-
- 1. 40,5 mg Os-SATA (0,0529 mmol) werden abgewogen
und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. 1,0 ml PBS (pH 7,5) werden
zum Lösen
zugegeben. 20 mg Na2S2O4 werden zugegeben, um Os in seiner reduzierten
Form zu halten.
- 2. 1,0 ml Deacetylierungspuffer (PBS pH 7,5 + 0,5 M Hydroxylamin
und 25 mM EDTA) werden zugesetzt, um die Sulfhydryl-Schutzgruppe
abzuspalten. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert,
um zu bestimmen, ob die Abspaltung der Schutzgruppe vollständig ist,
wobei ein neuer Peak bei 25,8 min auftritt.
- 3. 45 mg HbA1c-MH-Peptid (0,0474 mmol) werden zugegeben und
man läßt eine
Stunde lang bei Raumtemperatur reagieren. Eine Probe wird in eine
analytische HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
- 4. Ist die Umsetzung vollständig,
wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5
ml verdünnt.
Die Lösung
wird in eine präparative
HPLC injiziert, um den Produkt-Peak aufzufangen.
- 5. Die aufgefangene Fraktion wurde über Nacht (wenigstens 15 Stunden)
gefriergetrocknet.
- 6. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C.
Typische
Ausbeute = 12 mg
-
Das
Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.
HPLC | ES/MS |
Os-SATA-A1c:
Elutionszeit = 27,6 min | m+/e = 559,1 und 838,5 |
-
Herstellung des Os-SMCC-A1c-Konjugats
-
- 1. 39,0 mg Os-SMCC (0,0452 mmol) werden abgewogen
und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. 1,0 ml PBS (pH 6,0) werden
zum Lösen
zugegeben.
- 2. 30,0 mg HbA1c-Cys-Peptid (0,0450 mmol) werden zugesetzt.
Man läßt 2 Stunden
lang bei Raumtemperatur reagieren. Eine Probe wird in eine analytische
HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
- 3. Ist die Umsetzung vollständig,
wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5
ml verdünnt
Die Lösung
wird in eine präparative
HPLC injiziert, um den Produkt-Peak aufzufangen.
- 4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden)
gefriergetrocknet.
- 5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C.
Typische
Ausbeute = 12 mg
-
Das
Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.
HPLC | ES/MS |
Os-SMCC-A1c:
Elutionszeit = 27,6 min | m+/e = 480,5 und 534,4 |
-
Herstellung des Os-SMCC-A0-Konjugats
-
- 1. 37,0 mg Os-SMCC (0,0426 mmol) werden abgewogen
und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. Zum Lösen werden 1,0 ml PBS (pH =
6,0) zugegeben.
- 2. 24,3 mg HbA0-Cys-Peptid (0,0425 mmol)
werden zugesetzt. Man läßt die bei
Raumtemperatur 2 Stunden lang reagieren. Eine Probe wird in eine
analytische HPLC injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
- 3. Ist die Umsetzung vollständig,
wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5
ml verdünnt.
Die Lösung
wird in eine präparative
HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
- 4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden)
gefriergetrocknet.
- 5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C.
Typische
Ausbeute = 15 mg
-
Das
Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.
HPLC | ES/MS |
Os-SMCC-A0: Elutionszeit = 27,9 min | m+/e = 360,7 und 720,5 |
-
Herstellung des Os-DSG-A1c-Konjugats
-
- 1. 32,0 mg Os-DSG (0,037 mmol) werden abgewogen
und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. Zum Lösen werden 0,75 ml DMF zugegeben.
25 μl Triethylamin
werden zugesetzt.
- 2. 26,5 mg HbA1c-Lys-Peptid (0,0349 mmol) werden zugegeben.
Man läßt bei Raumtemperatur
2 Stunden lang reagieren. Eine Probe wird in eine analytische HPLC
injiziert, um den Fortgang der Reaktion zu verfolgen.
- 3. Ist die Umsetzung vollständig,
wird die Mischung mit 0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5
ml verdünnt.
Die Lösung
wird in eine präparative
HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
- 4. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden)
gefriergetrocknet.
- 5. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C.
Typische
Ausbeute = 16 mg
-
Das
Produkt wird durch HPLC und ES/MS analysiert.
HPLC | ES/MS |
Os-DSG-A1c:
Elutionszeit = 23,5 min | m+/e = 501,8 und 752,8 |
-
Herstellung des Os-DSG-A0-Konjugats
-
- 1. 52,0 mg Os-DSG (0,0605 mmol) werden abgewogen
und in ein 5 ml-Reacti-Vial mit Rührstäbchen überführt. Zum Lösen werden 1,0 ml DMF zugegeben.
25 μl Triethylamin
werden zugesetzt.
- 2. 49,1 mg Fmoc-HbA0-Peptid (0,0606
mmol) werden zugegeben. Man läßt bei Raumtemperatur
2 Stunden reagieren. Eine Probe wird in eine analytische HPLC injiziert,
um den Fortgang der Reaktion anhand des Auftretens eines Peaks bei
40,3 min für
Os-DSG-A0(Fmoc) zu verfolgen.
- 3. Bei vollständiger
Reaktion werden weitere 100 μl
Triethylamin injiziert. Nach einer Stunde wird eine Probe in eine
analytische HPLC injiziert, um festzustellen, ob die Fmoc-Schutzgruppe
vollständig
abgespalten wurde, wobei der Peak bei 40,3 min verschwindet.
- 4. Ist die Abspaltung von Fmoc vollständig, wird die Mischung mit
0,1% TFA-Puffer auf ein Endvolumen von 4,5 ml verdünnt. Die
Lösung
wird in eine präparative
HPLC injiziert und der Produkt-Peak aufgefangen.
- 5. Die aufgefangene Fraktion wird über Nacht (wenigstens 15 Stunden)
gefriergetrocknet.
- 6. Das Produkt wird abgewogen und in ein braunes Fläschchen überführt. Die
Lagerung erfolgt in einem wasserfrei gemachten Beutel bei –20°C.
Typische
Ausbeute = 16 mg
-
Das
Produkt wird mittels HPLC und ES/MS analysiert.
HPLC | ES/MS |
Os-DSG-A0: Elutionszeit = 23,2 min | m+/e = 447,4 und 670,3 |
-
Synthese von Bis(4,4'-dimethyl-2,2'-bipyridyl)-4-methyl-4'-carboxylpropyl-2,2'-bipyridyl-Osmium
-
[Os(dm-bpy)2(mcp-bpy)]Cl2
-
Kaliumhexachloroosmium
wurde mit 4,4'-Dimethyl-2,2'-dipyridyl im Molverhältnis 1:2
durch Rückflußerhitzen
in DMF umgesetzt. Der Kaliumchlorid-Niederschlag wurde abfiltriert
und der Dimethylbipyridyldichloroosmium-Komplex wurde unter Verwendung
von überschüssigem Natriumdithionit
von der Oxidationsstufe +3 auf die Oxidationsstufe +2 reduziert.
Das Produkt wurde aus einer DMF/Wasser-Mischung bei 0° umkristallisiert
und mittels Filtration gewonnen.
-
4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridyl-dichloroosmium
wurde mit 4-Methyl-4-carboxylpropyl-2,2'-dipyridyl durch Rückflußerhitzen in Ethylenglycol
umgesetzt. Das Lösungsmittel
wurde am Rotationsverdampfer abgezogen. Das Produkt wurde in DMF
gelöst
und in Ethylether ausgefällt.
Das Produkt wurde in einem Vakuumofen über Nacht getrocknet.
-
Analytische
Daten: Produkt und Zwischenprodukt wurden mittels HPLC und Massenspektroskopie
auf Reinheit und Identität
der Verbindung analysiert.
-
Os(dm-bpy)2Cl2: Theoretisches
MG = 629,6, MS zeigte 8 Isotopen-Peaks mit dem häufigsten Peak bei 630. Die
HPLC-Elutionszeit
lag bei 29,94 min mit einer Reinheit von 90%+.
-
Os(dm-bpy)2(mcp-bpy): MS bestätigte das MG mit 814,5 und
HPLC zeigte eine Reinheit größer als 85%.
-
Synthese des Biotin-Os-Komplexkonjugats
-
Biotin-[Os(dm-bpy)2(mcp-bpy)]Cl2
-
Die
Carboxyl-Gruppe wurde durch Umsetzen des obigen Os-Komplexes mit Dicyclohexylcarbodiimid in
Gegenwart von N-Hydroxysuccinimid aktiviert. Der Os-Komplex mit
dem aktiven Ester wurde durch präparative
HPLC-Verfahren isoliert und dann mit aminhaltigem Biotin umgesetzt,
um das Endkonjugat zu bilden.
-
Experiment
zum unabhängigen
Messen der Konzentration zweier elektroaktiver Konjugat-Spezies.
-
Os(bipy)HisCl-DSG-HbA1c
wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt.
-
Ferrocen-AMCHA-DADOO-Biotin
wurde aus Ferrocenmonocarbonsäure,
dem Vernetzer Aminomethylcyclohexansäure, dem Kettenverlängerer 1,8-Diamino-3,6-dioxooctan
und Biotin wie anderweitig beschrieben hergestellt.
-
Mischungen
der beiden Konjugate wurden hergestellt, um die Fähigkeit
des erfindungsgemäßen Verfahrens
zu bewerten, die Konzentration der Konjugate unabhängig zu
messen und Korrekturen für
Abweichungen bei den Reagenzienmengen, dem Ansprechen der Elektroden
und den Umgebungsbedingungen vorzunehmen.
-
Teil 1: Ansprechen auf einfache gemischte
Konjugate
-
Die
folgende Lösungsmatrix
wurde in 10 mM Phosphat-Puffer mit 150 mM NaCl und 0,5% Brij-35,
einem nichtionischen Tensid, hergestellt.
Os-DSG-HbA1c | Ferrocen-Biotin | Os-DSG-HbA1c | Ferrocen-Biotin |
μM/l | μM/l | μM/l | μM/l |
0 | 0 | 0 | 12,5 |
6,25 | 0 | 6,25 | 12,5 |
12,5 | 0 | 12,5 | 12,5 |
25 | 0 | 25 | 12,5 |
Os-DSG-HbA1c | Ferrocen-Biotin | Os-DSG-HbA1c | Ferrocen-Biotin |
μM/l | μM/l | μM/l | μM/l |
0 | 25 | 0 | 50 |
6,25 | 25 | 6,25 | 50 |
12,5 | 25 | 12,5 | 50 |
25 | 25 | 25 | 50 |
-
Eine
Mikroelektrode mit Interdigitalanordnung (IDA) wurde gemäß den beschriebenen
Verfahren hergestellt. Zusätzlich
zur IDA wies der Chip eine Silber/Silberchlorid-Elektrode auf der
Oberfläche
auf, die als Bezugselektrode und als Gegenelektrode fungierte. Diese
Elektrode wurde mit dem gleichen lithographischen Verfahren hergestellt
und dann mit Silber und Silberchlorid gemäß den Standardtechniken elektrolytisch
beschichtet. Die IDA wurde an einen Bipotentiostaten angeschlossen,
mit dem das Potential relativ zur Bezugselektrode geregelt und der
Strom an den jeweiligen IDA gemessen werden kann. Aliquote der Lösungen wurden
so auf die Oberfläche
des Chips gegeben, daß die
IDA und die Bezugselektrode bedeckt waren.
-
Messungen
wurden durchgeführt,
indem zunächst
ein Potential von
100
mV (gegen Ag/AgCl) an eine Elektrode der IDA und 200 mV an die andere
Elektrode für
eine Zeitdauer von 30 Sekunden angelegt wurde. Jetzt wurde der Strom
an jeder Elektrode gemessen. Dann wurde ein Potential von 200 mV
an die eine Elektrode und 550 mV an die andere angelegt. Nach 30
Sekunden wurde wieder der Strom gemessen. Siehe
9 zur
Zusammenfassung der Ergebnisse, die eindeutig zeigen, daß die Konzentrationen
der beiden Vermittler mit diesem Verfahren unabhängig voneinander gemessen werden
können.
-
Teil 2. Konzentrationscovarianz von Doppel-Vermittlern
auf IDA.
-
In
diesem Experiment wurde gezeigt, daß durch Herstellung einer Mischung
mit bekannten Konzentrationen der zwei verschiedenen Vermittler
und Messen verschiedener Verdünnungen
dieser Mischung mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens das Verhältnis der
Konzentrationen der Vermittler konstant bleibt (Anwendung als innerer
Standard).
-
Es
wurden die beiden gleichen Vermittler-Konjugate wie in Teil 1 (Os-DSG-A1c
und Fc-Bi) verwendet.
-
Aus
einer Lösung,
enthaltend 40 μM
des jeweiligen Konjugats, wurden Lösungen hergestellt, die 27 μM, 32 μM und 36 μM des jeweiligen
Konjugats im gleichen Puffer (PBS/Brij) enthielten.
-
Die
Lösungen
wurden wie im vorhergehenden Beispiel gemessen. Jede Lösung wurde
auf 5 verschiedenen IDA-Elektroden gemessen. Die Ergebnisse sind
für jede
Lösung
einzeln und für
alle Lösungen über alle Elektroden
zusammengefaßt
dargestellt als Mittelwerte, Standardabweichungen (S. D.) und Variationskoeffizienten
(% C. V.).
Einzelkonzentrationen | | Os-DSG-A1c | Fc-Bi | Os/Fc |
28 μM | Mittelwert | 156 | 85 | 1,84 |
| S.
D. | 17,5 | 13,2 | 0,08 |
| %
C. V. | 11,2 | 15,5 | 4,4 |
32 μM | Mittelwert | 165 | 88 | 1,88 |
| S.
D. | 11 | 7,2 | 0,04 |
| %
C. V. | 6,7 | 8,2 | 2,0 |
36 μM | Mittelwert | 189 | 102 | 1,85 |
| S.
D. | 12,5 | 6,9 | 0,04 |
| %
C. V. | 6,6 | 6,7 | 2,3 |
40 μM | Mittelwert | 208 | 110 | 1,90 |
| S.
D. | 9,5 | 5,5 | 0,06 |
| %
C. V. | 4,6 | 5,0 | 3,4 |
Zusammengefaßte Konzentrationen | Mittelwert | 182 | 97 | 1,87 |
| S.
D. | 24,4 | 13,2 | 0,06 |
| %
C. V. | 13,4 | 13,5 | 3,4 |
-
Dieses
Beispiel zeigt klar, daß der
Bezugselementeffekt des Messens zweier Konjugate oder Vermittler
und Berechnens des Verhältnisses
erheblich bessere Genauigkeit der Messung ergibt, und zwar nicht
nur innerhalb der jeweiligen Lösung (Ausgleich
der Schwankungen zwischen Elektroden), sondern auch über alle Lösungen (Ausgleich
der Schwankungen bei Probenverdünnung
oder
menge).
-
Teil 3. Temperaturausgleich
-
Es
sollte die Effektivität
des Verfahrens beim Ausgleich von Umgebungseinflüssen wie etwa Temperaturschwankungen
auf die Genauigkeit oder die Messung aufgezeigt werden.
-
Die
beiden gleichen Konjugate wurden wie zuvor als 40 μM-Lösungen hergestellt. Sie wurden
wie zuvor auf IDA-Elektroden
gemessen, und vor der Messung entweder auf Raumtemperatur oder auf
einer geheizten Metallplatte auf 35
40°C erwärmt. Vor
dem Aufbringen auf die Elektroden wurden die Lösungen ebenfalls auf 37°C erwärmt.
| Raumtemperatur
(23°C) | Erwärmt (35–40°C) | Ansprechverhältnis Warm/RT |
Os-DSG-A1c | 261 | 387 | 1,45 |
Fc-Bi | 179 | 268 | 1,5 |
Verhältnis Os/Fc | 1,46 | 1,44 | 0,99 |
-
Wie
anhand der Ergebnisse gezeigt, nehmen die gemessenen Werte im Fall
der erwärmten
Proben um nahezu 50% zu, was zu einem großen Meßfehler führen würde. Die Anwendung des inneren
Standards und die Verhältnisberechnung
beseitigen jedoch die Temperaturabhängigkeit des Ergebnisses.
-
Immunassay-Nachweis
von HbA1c mit Osmium-Vermittler-Konjugaten.
-
Ziel
aller Diabetikertherapien ist es, einen nahezu normalen Glucosespiegel
im Blut aufrechtzuerhalten. Blut-Glucose-Kits
für Zuhause,
die die aktuellen Glucosewerte überwachen,
sind verfügbar
und für
Diabetiker wertvoll, um die tägliche
Insulindosis und die Eßgewohnheiten
anzupassen. Da die Tests leider nur ein Zeitpunktergebnis messen,
erfahren die Patienten nicht die gesamte Effektivität ihrer
Aktionen zur Aufrechterhaltung der Blutzuckerkontrolle. Die Messung
des glycosylierten Hämoglobins
wird inzwischen als Index für die
mittleren Blutzuckerkonzentrationen über die vorangegangenen 6–8 Wochen
allgemein anerkannt und stellt somit ein Maß für die Effektivität der Diabetiker-Gesamttherapie über Zeiträume stabiler
Kontrolle bereit. Da die Überwachung
des glycosylierten Hämoglobins
bei einem Diabetiker zu einer verbesserten Blutzuckerkontrolle führen kann,
empfiehlt die ADA routinemäßige Messungen
von vier mal pro Jahr bis zu einmal pro Monat für die weniger stabilen Typ-I-Diabetiker.
-
Mehrere
Techniken sind zur Messung des glycosylierten Hämoglobins verfügbar. Dazu
gehören
Immunassays für
HbA1c (TinaQuant, BMC; DCA2000, Ames; und Unimate, Roche), Ionenaustausch
(Variant, BioRad; Eagle Diagnostics), und Affinitätschromatographie
(ColumnMate, Helena; GlyHb, Pierce).
-
Ein
Ziel dieses Projekts ist die Entwicklung eines einfach anzuwendenden
Einmalstreifens für
den elektrochemischen Nachweis von HbA1c für die Anwendung sowohl in der
Arztpraxis als auch für
Zuhause.
-
Der
wichtigste Parameter zur Bewertung des Zustands des Patienten ist
das Verhältnis
von HbA1c zu HbA0, und somit ist die Messung
des Werts sowohl des glycosylierten (HbA1c) als auch des nichtglycosylierten (HbA0) Zustands für die Berechnung des Verhältnisses
erforderlich. Hierzu werden zwei getrennte Messungen benötigt. Vorzugsweise
wird die gleiche Technik zur Messung sowohl des glycosylierten als
auch des nichtglycosylierten Anteils angewandt, um so etwaige, durch
die Probe und die Umgebung bedingte Störungen zu vermeiden.
-
Die
Messung von HbA1c mittels elektrochemischem Immunassay wird nachfolgend
beschrieben. Messungen von HbA0 mit elektrochemischen
Immunassays werden unter Verwendung derselben Verfahren wie für HbA1c
durchgeführt,
wobei die Konzentrationen von HbA0 bedeutend
höher liegen.
Eine Alternative zu den A0-Messungen mit
Hilfe der Immunaffinität
könnte
sein, das Gesamthämoglobin
direkt mittels Biamperometrie oder Differenzpulsvoltammetrie zu
messen. Dies kann problemlos durchgeführt werden, da Hämoglobin bereitwillig
durch [Os(bpy)2(im)Cl]2+Cl2 oxidiert wird.
-
Das
N-terminale Valin der β-Kette
des Hämoglobin
A ist die Stelle der Glycosylierung in HbA1c und dient als Erkennungsstelle
für den
Antikörper.
Das N-terminale Valin ist in Vollblut für die Bindung des Antikörpers nicht
zugänglich.
Der Zugang wird durch Lyse der roten Zellen unter Freisetzung des
Hämoglobins
erreicht, gefolgt von einer Konformationsänderung (Denaturierung oder
Entknäuelung),
wobei das HbA1c-Epitop in geeigneter Weise freigelegt wird. Verdünnung der
Probe kann Teil des Lyse-/Denaturierungsverfahrens sein oder kann
nach der Denaturierung erforderlich sein, um die Probe für den Antikörper vorzubereiten
(Einstellung des pH, usw.) oder um die Probe in einen für den elektrochemischen
Immunassay geeigneten Bereich zu bringen. Bei einer Ausführungsform
wird eine festgelegte Menge Antikörper mit der vorbereiteten
Probe inkubiert und bindet an das HbA1c-Epitop der Probe. Der freie
Antikörper
und der an die Probe gebundene Antikörper werden dann mit dem Osmium-Peptid-Konjugat
(A1c oder A0) vereint, um dem verbliebenen
ungebundenen Antikörper
die Bindung an die Vermittler-Markierung zu ermöglichen. Ist der Vermittler
an den Antikörper
(ein Makromolekül)
gebunden, kann er nicht frei diffundieren, um mit der Elektrode
zu interagieren, und somit ist der erzeugte Strom bedeutend geringer.
Die verbliebene ungebundene Vermittler-Markierung ist daher proportional
zur Konzentration von HbA1c in der Probe. Der ungebundene Vermittler
kann elektrochemisch entweder durch ein Enzym-Verstärkungsverfahren
oder direkt unter Verwendung einer Elektrode mit Interdigitalanordnung
mit bipotentiostatischer Regelung gemessen werden.
-
Das
Ansprechen eines elektrochemischen HbA1c-Immunassays wurde auf Gold-Elektroden
mit Enzym-Verstärkung
im biamperometrischen Modus gezeigt. Die experimentellen Bedingungen
wurden nicht durchgehend optimiert und die Assaykomponenten wurden
in Mikrozentrifugenröhrchen
vorgemischt und danach auf die 4,95 mm
2 großen E-Zellen
pipettiert. Die experimentellen Bedingungen für diesen Test sind in Tabelle
1 gezeigt. Tabelle 2 zeigt die Dosis-Ansprech-Daten für Proben
mit niedrigem, mittlerem und hohem HbA1c.
4 zeigt
die Dosiswirkung mit zwei zusätzlichen
Punkten LL und HH, welche einer niederkonzentrierten und einer hochkonzentrierten
Probe entsprechen. Die höheren
Ströme
für LL
können
möglicherweise durch
eine Verminderung der Blut-Proteine (wegen der Verdünnung) erklärt werden,
was zu einer Minderung der Elektrodenverschmutzung führt. Tabelle 1. Dosis-Ansprech-Bedingungen
Probenherstellung
(Denaturierung) | Reagenzien | Elektrochemische
Messungen |
1.
20 μl lysiertes
Blut für
L-, M-, H-Proben (zuvor eingefrorenes Vollblut)
2. 18 μl L (LL)
und 22 μl
H (für
HH)
3. 480 μl
1,5 M LiSCN mit 0,1% Tween
4. Mischen und Denaturierenlassen
für 10
Minuten (Vortex) | 1.
50 μl 12,5 μM PAB IS < A1c > in PEST
2. 50 μl denaturiertes
Blut
3. 20 μl
40 μM Os-DSG-A1c in DI H2O
4. 20 μl 1M Glucose in DI H2O
5. 20 μl Glucdor/PQQ (1,7 mg/ml/0,17
mg/ml) | 1.
VXI Waveform E-450 mV für
60 s
2. Goldelektroden WE = 1,5 × 3,3 mm einsetzen
3.
20 μl Reagens
aufbringen
4. Biamperometrischen Meßmodus starten
5. Daten
nach 60 s abrufen |
Tabelle 2: Dosis-Ansprech-Daten von Blut
| Strom nach
60 s (nA) | Getrennter
Denaturierungsschritt | Alle Daten |
g/l | #1 | #2 | #3 | #4 | Mittel | SD | CV | Mittel | SD | CV |
6,49 | 76,28 | 78,34 | 84,79 | 78,47 | 79,47 | 3,69 | 4,64 | 81,54 | 4,67 | 5,73 |
6,49 | 80,30 | 82,97 | 86,82 | 83,48 | 83,48 | 2,69 | 3,22 | | | |
6,49 | 83,25 | 85,49 | 90,05 | 86,67 | 86,67 | 2,94 | 3,40 | | | |
6,49 | 76,66 | 71,72 | 78,24 | 76,56 | 76,55 | 1,44 | 1,88 | | | |
12,34 | 95,61 | 95,05 | 93,06 | 94,02 | 94,44 | 1,13 | 1,20 | 98,31 | 4,19 | 4,26 |
12,34 | 98,59 | 106,29 | 103,81 | 102,08 | 102,08 | 3,60 | 3,53 | | | |
12,34 | 95,80 | 103,14 | 99,90 | 99,32 | 99,32 | 3,06 | 3,08 | | | |
12,34 | 93,16 | 96,2 | 103,10 | 97,41 | 97,41 | 4,16 | 4,27 | | | |
18,20 | 100,06 | 110,83 | 119,08 | 112,52 | 112,52 | 9,29 | 8,26 | 113,48 | 5,08 | 4,48 |
18,20 | 115,43 | 116,93 | 116,77 | 116,26 | 116,26 | 0,71 | 0,61 | | | |
18,20 | 116,12 | 109,72 | 112,07 | 112,21 | 112,21 | 2,78 | 2,48 | | | |
18,20 | 118,13 | 112,16 | 109,8 | 112,93 | 112,93 | 3,61 | 3,20 | | | |
| Berechnetes
HbA1c (g/dl) | Getrennter
Denaturierungsschritt | Alle Daten |
g/l | #1 | #2 | #3 | #4 | Mittel | SD | CV | Mittel | SD | CV |
6,49 | 4,46 | 5,22 | 7,58 | 5,26 | 5,63 | 1,35 | 24,00 | 6,39 | 1,71 | 26,80 |
6,49 | 5,94 | 6,91 | 8,33 | 7,23 | 7,10 | 0,99 | 13,87 | | | |
6,49 | 7,02 | 7,84 | 9,51 | 8,72 | 8,27 | 1,08 | 13,05 | | | |
6,49 | 4,60 | 3,89 | 5,18 | 4,56 | 4,56 | 0,53 | 11,58 | | | |
12,34 | 11,55 | 11,34 | 10,61 | 10,97 | 11,12 | 0,41 | 3,72 | 12,54 | 1,54 | 12,25 |
12,34 | 12,64 | 15,46 | 14,56 | 13,03 | 13,92 | 1,32 | 9,48 | | | |
12,34 | 11,62 | 14,31 | 13,12 | 12,58 | 12,91 | 1,12 | 8,70 | | | |
12,34 | 10,65 | 11,77 | 14,29 | 12,12 | 12,21 | 1,53 | 12,50 | | | |
18,20 | 13,18 | 17,13 | 20,15 | 20,54 | 17,75 | 3,41 | 19,19 | 18,10 | 1,86 | 10,29 |
18,20 | 18,82 | 19,37 | 19,31 | 19,00 | 19,12 | 0,26 | 1,36 | | | |
18,20 | 19,07 | 16,72 | 17,58 | 17,16 | 17,63 | 1,02 | 5,78 | | | |
18,20 | 19,81 | 17,62 | 16,75 | 17,42 | 17,90 | 1,32 | 7,40 | | | |
n = 16.
4 Denaturierungen für
jede HbA1c-Probe mal jeweils 4 Wiederholungen.
Y = 2,82x +
62,54; s. Datei 443051A.xls |
-
Blutlyse
ist notwendig, um das Hämoglobin
freizusetzen, worauf die Denaturierung folgt, um das HbA1c-Epitop
freizulegen. Lyse kann leicht über
Tenside, osmotische Effekte der Verdünnung mit Wasser und direkt
durch zahlreiche Denaturierungsmittel erzielt werden. Es konnte
gezeigt werden, daß Blut,
das durch einen Gefrier/Auftau-Zyklus lysiert wurde, die biamperometrische
Messung nicht signifikant stört
(”Ausgangswert” mit und
ohne lysiertes Blut war fast identisch). Umgekehrt konnte gezeigt
werden, daß Denaturierung
des lysierten Bluts mit einer Vielzahl bekannter Denaturierungsmittel
zur Freilegung des HbA1c-Epitops das elektrochemische Ansprechen
deutlich unterdrückt,
so daß die
Messung einer HbA1c-Dosiswirkung behindert wird. Nur mit LiSCN und
Citronensäure
aus der Liste der überprüften Denaturierungsmittel
in Tabelle 3 konnte das A1c-Epitop freigelegt und die Protein-verschmutzung
ausreichend minimiert werden, um die HbA1c-Dosiswirkung zu messen.
-
Die
Denaturierung der Probe zur Antikörper-Erkennung ohne schwerwiegende
Verschmutzung der Elektrodenoberfldche ist für die erfolgreiche Entwicklung
eines HbA1c-Immunassays wichtig. Obwohl fast ausschließlich LiSCN
verwendet wurde, um die Machbarkeit aufzuzeigen, weist es viele
Einschränkungen
auf, die seinem Einmalgebrauch im Wege stehen. Citronensäure, ein
Feststoff bei RT, könnte
dagegen Vorteile als Denaturierungsmittel bieten, falls sie auf
einem Streifen getrocknet und mit einem Verdünnungsmittel versetzt werden
kann, um den pH auf neutral einzustellen. Denaturierung des Bluts
mit Säuren
oder Basen, gefolgt von einer abschließenden pH-Einstellung mit einem
gepufferten Verdünnungsmittel,
ist ein Bereich, der es wert wäre,
weiter untersucht zu werden. Ein Problem, auf das man bereits anfänglich gestoßen ist,
war die Niederschlagsbildung beim Einstellen des pH zurück auf neutral,
was unter Verwendung eines anderen Puffers oder durch Tensidzugabe
behoben werden kann. Tabelle 3. Blut-Denaturierungsmittel
Verfahren | Anmerkungen |
KSCN | • Anfangsuntersuchung
zeigte keine Dosiswirkung mit Blut, das durch KSCN denaturiert wurde.
• KSCN hat
eine größere negative
Wirkung auf das elektrochemische Ansprechen als LiSCN.
• Literatur
zeigt, daß LiSCN
wirksamer ist als KSCN (Anstrengungen auf LiSCN konzentriert). |
DCA2000-Puffer | • Denaturierung
von Blut nicht sichtbar bei den höheren Blutkonzentrationen,
die für
diesen Assay benötigt
werden. Höhere
Konzentrationen von LiSCN nachstehend gezeigt. |
LiSCN | • Verfahren
beim DCA2000-HbA1c-Immunassay von Ames angewandt. |
Citronen-,
Schwefel-, Salz- & Perchlorsäure | • Blut-HbA1c-Dosiswirkung
(hoch/niedrig) wurde mit Citronensäure beobachtet und ist vergleichbar
mit Ansprechen bei LiSCN.
• Anzeichen
der Blut-Denaturierung waren insgesamt sichtbar: ”Lösung schlug nach
braun um”.
Citronensäure
ist bevorzugt.
• Einstellung
des pH auf neutral nach Denaturierung zeigte das Problem der Niederschlagsbildung.
Enzymvermittelte Wirkungen mit Gluc-Dor bei pH 5,7 reduzieren die
Wirkung um 50% gegenüber
pH 7–8.
• Blut-Denaturierungsverfahren
mit Citronensäure
ist in Figur 5 gezeigt. |
Pepsin/Citronensäure | • Beim HbA1c-Immunassay
von Roche wird Pepsin/Citronensäure
zur Hämolyse
und zum proteolytischen Abbau von Hämoglobin zu Glycoproteinen
verwendet, die für
den Antikörper
zugänglich
sind.
• Denaturierung
war sichtbar durch den Farbumschlag zu einer bräunlich-roten Lösung.
• Hämoglobin-A1c
Dosiswirkung (hoch/niedrig) wurde erreicht, vergleichbar mit den
LiSCN- und Citronensäure-Denaturierungsmitteln.
Das Verfahren war identisch mit demjenigen der vorstehend verwendeten
Citronensäure,
mit der Ausnahme, daß Pepsin
zur Säure
gegeben wurde. Ergebnisse waren identisch mit denjenigen der Citronensäure. |
TTAB
(Tetradecyltrimethylammoniumbromid) | • Verfahren
zur Denaturierung, das im HbA1c-Turbidimetrie-Immunassay von TinaQuant
Verwendung findet.
• Anzeichen
für die
Denaturierung: ”Lösung schlug
nach grün
um”.
• Die enzymvermittelten
(Glucdor/PQQ/Glucose) biamperometrischen Messungen wurden durch
TTAB-Konzentrationen von 0,0125–0.2%
weitgehend unterdrückt.
Ausgangswerte waren 16–50
nA gegenüber
140 nA ohne TTAB. |
NaOH | • Anzeichen
der Denaturierung: ”Lösung schlug
nach braun um”.
• NaOH beeinflußt die enzymvermittelte
Elektrochemie nicht nachteilig. Sogar bei hohem pH verändern sich
die Ausgangswerte nicht, obwohl pH-Änderung wahrscheinlich
erforderlich sein wird, um diese in einen optimalen Bereich für den Antikörper zu
bringen.
• Mit
NaOH denaturiertes Blut unterdrückt
den Ausgangswert wahrscheinlich wegen Protein-Verunreinigung.
• Bei Absenkung
des pH auf neutral geringe Neigung zur Niederschlagsbildung. |
Tabelle 4. Effektives Blut-Denaturierungsverfahren
für 2%
Blut
LiSCN
(Ein Schritt) | LiSCN
(Zwei Schritte) | Citronensäure (2 Schritte) |
40 μl 6 M LiSCN
20 μl 5% Tween
in PBS
20 μl
Blut
Mischen (Vortex) und 10 min lang denaturieren lassen.
Mit 920 μl
DI H2O verdünnen. | 960 μl 1,5 M LiSCN
20 μl 5% Tween
in PBS
20 μl
Blut
Mischen (Vortex) und 10 min lang denaturieren lassen. | 200 μl 0,2 M Citronensäure
20 μl 5% Tween
in PBS
20 μl
Blut
Mischen (Vortex) und 10 min lang denaturieren lassen.
Mit 760 μl
8X PBS (0.1% Tween) verdünnen. |
Denaturierungszeit
wurde nicht optimiert. Die begrenzten Daten weisen auf längere Zeiten
für bessere
Genauigkeit bei diesem Verfahren. | Denaturierungszeit
wurde nicht optimiert. Die Daten zeigen, daß kürzere Zeiten geeignet sein könnten. | Es
wurden keine optimierten Studien durchgeführt. |
- PBS = 10 mM Phosphat-Puffer, 2,7 mM KCl,
137 mM NaCl pH = 7,4 Höhere
Tensid-Konzentration (5% Tween) vermindert oder beseitigt Niederschlagsbildung.
-
Durch
die Elektrodenverschmutzung, verursacht durch denaturierte, an der
Elektrodenoberfläche
adsorbierte Blutproteine, kann der Elektrontransfer behindert und
somit die Empfindlichkeit der Elektrode verringert werden. Die Verschmutzung
der Elektrode oder die Passivierung tritt mehr oder weniger sofort
nach der Berührung
der Probe mit der Oberfläche
ein, so daß der
erste Ansatz die Minimierung der Schwere der Denaturierung in der
Probe sein sollte. Hydrophobe Oberflächeneigenschaften begünstigen
die Haftfähigkeit
der Proteine, und somit kann die Verschmutzung mit Elektrodenoberflächen mit
höheren
Oberflächenenergien
minimiert werden. Dies erklärt,
warum Elektroden aus Gold mit denaturiertem Blut weniger Verschmutzung
zeigen als solche aus Palladium. Eine Minderung der Proteinverschmutzung
kann durch Verändern
oder Schützen
der Elektrodenoberfläche
erreicht werden. Abwandlungen, die die Oberfläche hydrophiler machen, sollten den
Verschmutzungsgrad mindern und können
durch Behandlung mit einem Argon- oder Sauerstoff-Plasma oder einer
Corona-Entladung erzielt werden. Gewöhnlich kann das Problem mit
gezielt ausgewählten Überzügen teilweise
umgangen werden, die die Proteine am Erreichen der Elektrodenoberfläche hindern
können
und auf diesem Gebiet zur Reduzierung der Verschmutzung angewandt
werden. Leider wird bei deren Verwendung üblicherweise eine dramatische
Abnahme des Ansprechens beobachtet, die größer ist als diejenige mit den denaturierten
Blut-Proteinen. Hydrophile Überzüge wie etwa
PEO wurden auch überprüft und zeigten
einige Verbesserungen, wiesen aber ähnliche Probleme hinsichtlich
geringerer Stärke
und Genauigkeit auf, dadurch verursacht, daß die Reagenzien zur Diffusion
durch die Polymere gezwungen werden. Mit Hilfe von Reagenzien, die
auf den Elektroden verteilt und getrocknet werden, könnte das
Ausmaß der
Protein-Verschmutzung bei weniger negativen Auswirkungen vermindert
werden.
-
Dosis-Ansprechen
auf Vermittler-Konzentration, Hemmung mit Antikörper und Umkehrung mit einem BSA-A1c-Polyhaptan
wurden überprüft und sind
in Tabelle 5 zusammengefaßt.
Das Os-DSG-A1c ist
in lyophilisierter Form und nach Gefrieren in Lösung (40 und 80 μM) bei –20°C stabil. Tabelle 5. Osmium-Vermittler-Markierungen
Vermittlermarkierung | Konzentrationswirkung | Hemmung
mit Antikörper | Umkehrung | Anmerkungen |
Os-SMCC-A1c | Linear | PAB
IS (≤ 92%)
PAB
DE (≤ 97%)
MAB
(≤ 50%) | Ja
mit BSA-A1c-Polyhaptan | %-Hemmungswerte
reichen von 16% bis 97%, abhängig vom
Alter der Os-SMCC-Stammlösung. Zerfällt in Lösung. |
Os-SATA-A1c | Linear | PAB
IS (≤ 44%) | Ja
mit BSA-A1c-Polyhaptan | Stabilität ähnlich wie
SMCC. |
Os-DSG-A1c | Linear | PAB
IS (≤ 91%)
PAB
DE (≤ 87%)
MAB
(≤ 78%) | Ja
mit BSA-A1c-Polyhaptan | Stabiler
als das Konjugat mit SATA und SMCC-Vernetzer, zerfällt aber
in Lösung. |
Os-SATA-A0 | Linear | Ja
mit Schaf-B < HbA0 > (≤ 84%) Nein mit Kaninchen-Antikörpern von
Zymed | Nein
mit A0HB-Peptid
#1 | A0-Konjugat stellte sich als instabil in Lösung heraus. Konjugat
wurde nicht lyophylisiert. |
-
Polyklonale,
DE(Ionenaustausch)-gereinigte Schaf-Antikörper werden im TinaQuant-HbA1c-Assay verwendet.
IS(Immunsorbent)-Antikörper
werden unter Verwendung eines Standard-IS-Reinigung-Verfahrens hergestellt. Auch
Proben monoklonaler Antikörper
wurden zur Prüfung
gewonnen. Die Hemmungskurven wurden in Lösung aufgenommen, wobei das
Mischen stets in Mikrozentrifugenröhrchen erfolgte. Assays wurden gemessen
durch Aufbringen von 20 μl
auf 6 mm2 Palladium-Elektroden mit den Bedingungen,
die in Tabelle 5 gezeigt sind. Die Hemmungskurven mit den drei Hämoglobin-A1c-Antikörpern (PAB
IS, PAB DE und MAB) wurden erzeugt durch Fixieren von Os-DSG-A1c mit 5 μl und Verändern der
Antikörper-Konzentration.
Sowohl PAB IS als auch MAB zeigten die erwartete stöchiometrische
Beziehung für
die Hemmung mit dem Osmium-Peptid-Konjugat,
was auf die effiziente und schnelle Bindung des Antikörpers an
das A1c-Peptid hinweist. Der polyklonale IS und der monoklonale
zeigen beide steile Hemmungskurven, wobei die Maximaländerung nahe
bei 5 μM
erreicht wird. Zusätzliche
Antikörper
oberhalb 5 μM
zeigten eine geringe Wirkung auf die Zunahme der Hemmung. Die schlechter
gereinigten PAB-DEAntikörper
ergaben einen viel kleineren Anstieg und benötigten wie erwartet mehr als
das Dreifache der Menge, um in die Nähe der maximalen Hemmung zu
gelangen. 6 zeigt die Hemmungskurven für jeden
der getesteten HbA1c-Antikörper.
Aus den Hemmungskurven konnten wir vernünftige Antikörper-Konzentrationen
für maximale
Umkehrung mit A1c-Proben auswählen.
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Hemmungskurven
wurden auch für
die Os-SMCC-A1c-(Max. = 97%) und OS-SATA-A1c-(Max. = 44%)-Vermittler-Markierung
aufgenommen. Die Stabilität
der Vermittler-Markierung wurde auch durch Verfolgen der Hemmungswerte über die
Zeit bewertet. Sämtliche
Vermittler-Markierungen zeigten etwas Zersetzung bei Lagerung in
verdünnten
Lösungen
(40 μM)
bei Raumtemperatur. Bei
20°C gefrorene
Proben scheinen stabil zu sein.
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Zum
Aufzeigen der Hemmungsumkehr wurden Antikörper-Konzentrationen von 4 μM sowohl
für PAB IS
als auch für
MAB sowie 15 μM
für PAB
DE aus den vorstehend gezeigten Hemmungskurven ausgewählt. Die
Umkehrungskurven wurden anschließend unter Verwendung einer
Verdünnungsreihe
von BSA-A1c-Polyhaptan mit einer ~1:1 A1c:BSA
erzeugt. Das ESA-A1c fungiert als Probe und bindet an den Antikörper. 10 zeigt
die Umkehrungskurven für
die drei Antikörper.
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Obwohl
bei diesen Machbarkeitsstudien für
einen HbA1c-Immunassay ein enzymvermitteltes Verstärkungsverfahren
angewandt wurde (Glucdor/PQQ/Glucose wurde verwendet, um den reduzierten
Vermittler nach Oxidation an der Elektrodenoberfläche zu regenerieren,
wodurch sich ein höherer
diffusionskontrollierter Strom ergab, gegeben durch die Cottrell-Gleichung),
werden sie als Hinweis auf Ergebnisse erachtet, die bei Verwendung
der erfindungsgemäßen IDA-Elektroden
mit bipotentiostatischer Regelung erreichbar sind.