-
Die
Erfindung betrifft die Erzeugung einer schützenden CD8+ T-Zell-Immunantwort
gegen Hepatitis B- oder C-Antigene unter Verwendung verschiedener
Initialisierungs- und Verstärkungszusammensetzungen
als Quellen für
CD8+ T-Zell-Epitope.
-
Einleitung
-
Ein
allgemeines Problem in der Impfungslehre war das Unvermögen, hohe
Mengen an CD8 T-Zellen durch Immunisierung zu erzeugen. Dies hat
die Entwicklung von Impfstoffen gegen mehrere Krankheiten, einschließlich Malaria,
verhindert.
-
Plasmodium
falciparum-Malaria verursachte hunderte Millionen Malariainfektionen
jedes Jahr und ist für
1–2 Millionen
Todesfälle
jährlich
verantwortlich. Die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen
Malaria ist somit ein Hauptanliegen des globalen öffentlichen
Gesundheitswesens. Ein beträchtlicher
Anteil der immunologischen Forschung über die letzten 20 Jahre führte zur
Identifizierung sowohl von Kandidaten für Impfstoffantigene aus dem
Parasiten als auch von immunologischen Mechanismen bei dem Wirt,
die wahrscheinlich gegen Infektion und Erkrankung schützen. Trotz
dieses Fortschritts gibt es jedoch nach wie vor kein Mittel zur
Impfung gegen Malariainfektion, von dem gezeigt wurde, daß es in
Feldversuchen wirksam ist.
-
Ein
Hauptproblem war die Identifizierung eines Mittels zur Induzierung
einer ausreichend starken Immunantwort in geimpften Individuen zum
Schutz gegen Infektion und Erkrankung. Obwohl viele Malariaantigene
bekannt sind, die für
eine Impfung gegen Malaria geeignet sein könnten, bestand das Problem
daher darin, wie solche Antigene oder Fragmente davon, bekannt als
Epitope, welche von Zellen des Immunsystems erkannt werden, in einer
Weise verabreicht werden können,
die eine ausreichend starke Immunantwort eines bestimmten Typs induzieren.
-
Es
ist seit vielen Jahren bekannt, daß es möglich ist, Individuen zu schützen, indem
man sie mit sehr hohen Dosen von bestrahlten Malariasporozoiten,
die durch Bisse von infizierten Moskitos gegeben werden, immunisiert.
Obwohl dies eine völlig
impraktikable Methode zur Massenimpfung ist, lieferte sie ein Modell
zum Analysieren der Immunantworten, welche eine schützende Immunität gegen
Sporozoiteninfektion vermitteln könnten (Nardin und Nussenzweig,
1993).
-
Ein
beträchtlicher
Forschungsaufwand über
das letzte Jahrzehnt oder länger
hat gezeigt, daß eine
wesentliche schützende
Immunantwort gegen das frühe
prä-erythrozytische
Stadium von P. falciparum-Malaria durch T-Lymphozyten vom CD8+ ve-Typ
(CD8+ T-Zellen) vermittelt wird. Von diesen Zellen wurde gezeigt,
daß sie
in Mausmodellen mit Malariainfektion einen Schutz direkt vermitteln
(Nardin und Nussenzweig, 1993). Solche T-Zellen wurden auch in Individuen
identifiziert, die auf natürliche
Weise Malaria ausgesetzt waren, und in Freiwilligen, die mit bestrahlten
Sporozoiten immunisiert worden waren (Hill et al., 1991; Aidoo et
al., 1995; Wizel et al., 1995). Es gibt viele indirekte Beweise,
daß solche
CD8+ T-Zellen gegen Malariainfektion und -Erkrankung im Menschen
schützen
(Lalvani et al., 1994).
-
CD8+
T-Zellen können
auf mehr als eine Art und Weise funktionieren. Die am besten bekannte
Funktion ist das Töten
oder die Lyse von Zielzellen, die ein Peptidantigen im Kontext eines
MHC Klasse I-Moleküls tragen.
Daher werden diese Zellen häufig
als zytotoxische T-Lymphozyten
(CTL) bezeichnet. Jedoch ist eine weitere Funktion, die vielleicht
von größerer schützender
Relevanz bei Malariainfektionen ist, die Fähigkeit von CD8+ T-Zellen,
Interferon Gamma (IFN-γ)
auszuscheiden. Daher sind Tests der lytischen Aktivität und der IFN-γ-Freisetzung beide
von Wert beim Messen einer CD8+ T-Zell-Immunantwort. Bei Malaria
können
diese CD8+ ve-Zellen durch Töten
des Parasiten im frühen
intrahepatischen Stadium einer Malariainfektion schützen, bevor
irgendwelche Symptome einer Erkrankung erzeugt werden (Seguin et
al., 1994).
-
Die
Ursache für
tödliche
Malaria beim Menschen, P. falciparum, infiziert eine beschränkte Anzahl
an Wirtsspezies: Menschen, Schimpansen und einige Spezies von Neuweltaffen.
Das beste nichtmenschliche Modell für Malaria ist der Schimpanse,
weil diese Spezies eng mit dem Menschen verwandt ist und eine Leberstadiuminfektion übereinstimmend
beobachtet wird, anders als in den Affenwirten (Thomas et al., 1994). Aufgrund
der Kosten und der begrenzten Verfügbarkeit von Schimpansen werden
die meisten Laborstudien von Malaria in Mäusen durchgeführt, wobei
man die Nagermalariaspezies P. berghei oder P. yoelii verwendet. Diese
zwei letztgenannten Modelle sind gut untersucht, und es wurde in
beiden gezeigt, daß CD8+
veLymphozyten eine Schlüsselrolle
bei der schützenden
Immunität
gegen eine Sporozoitenexposition spielen.
-
Frühere Untersuchungen
haben eine große
Vielfalt an Mitteln zur Induzierung von CD8+ T-Zell-Antworten gegen
Malaria aufgedeckt. Einige von diesen haben ein gewisses Maß an CD8+
T-Zell-Antwort und teilweisen Schutz gegen Malariainfektion in den
Nagermodellen gezeigt (z. B. Li et al., 1993; Sedegah et al., 1994;
Lanar et al., 1996). Jedoch wurde ein wirksames Mittel zur Immunisierung
mit Untereinheitenimpfstoffen durch die Induzierung ausreichend
hoher Mengen an CD8+ T-Lymphozyten zum wirksamen Schutz gegen Malariasporozoiteninfektion
zuvor nicht demonstriert.
-
In
jüngeren
Jahren wurden verbesserte Immunantworten, die auf potentielle Impfstoffe
hervorgerufen werden, gesucht, indem man die Vektoren, die zur Auslieferung
des Antigens verwendet wurden, variierte. Es gibt Anzeichen dafür, daß in einigen
Fällen
Antikörperreaktionen
verbessert werden, indem man zwei verschiedene Vektoren verwendet,
die aufeinanderfolgend als Initialisierer und Verstärker verabreicht
werden. Eine Vielzahl an Kombinationen von Initialisierer und Verstärker wurde
in verschiedenen möglichen
Impfstoffschemas getestet.
-
Leong
et al. (Vaccines, 1995, 327–331)
beschreiben die Immunisierung von Mäusen zuerst mit DNA, welche
das Influenza-Hämagglutinin-Antigen
(HA) exprimiert, und anschließend
mit einem rekombinanten Geflügelpockenvektor,
der HA exprimiert. Eine erhöhte
Antikörperreaktion
wurde nach einer Verstärkung
erhalten.
-
Richmond
et al. (Virology, 1997, 230: 265–274) beschreiben Versuche,
neutralisierende Antikörper
gegen HIV-1 env zu richten, wobei sie DNA-Initialisierung und Verstärkung durch
rekombinantes Vacciniavirus verwenden. Mit diesem Initialisierer-Verstärker-Schema
wurden nur niedrige Mengen an Antikörperreaktionen beobachtet,
und die Ergebnisse wurden als enttäuschend eingestuft.
-
Fuller
et al. (Vaccine, 1997, 15: 924–926,
und Immunol. Cell Biol., 1997, 75: 389–396) beschreiben eine Erhöhung von
Antikörperreaktionen
auf DNA-Immunisierung von Makaken unter Verwendung einer Verstärkerimmunisierung
mit replizierenden, rekombinanten Vacciniaviren. Dies wurde jedoch
nicht in eine erhöhte
schützende
Wirkung als eine stärkere
Verminderung in der viralen Belastung umgesetzt, und man beobachtete
eine Abschwächung
des CD4 T-Zell-Verlustes
in den mit DNA initiierten und verstärkten Tieren.
-
Hodge
et al. (Vaccine, 1997, 15: 759–768)
beschreiben die Induktion von lymphoproliferativen T-Zell-Antworten
in einem Mausmodell für
Krebs unter Verwendung von humanem karzinoembryonischem Antigen
(CEA), das in einem rekombinanten Geflügelpockenvirus (ALVAC) exprimiert
wird. Die Autoren initiierten eine Immunantwort mit CEA-rekombinanten,
replikationskompetenten Vacciniaviren vom Wyeth- oder WR-Stamm und
verstärkten
die Antwort mit CEA-rekombinantem ALVAC. Dies führte zu einem Anstieg der T-Zell-Proliferation,
aber es resultierte nicht in einer erhöhten schützenden Wirksamkeit, verglichen
mit drei rekombinanten Wildtyp-Immunisierungen (100% Schutz), drei
rekombinanten ALVAC-CEA-Immunisierungen (70% Schutz) oder WR-Initialisierung,
gefolgt von zwei ALVAC-CEA-Immunisierungen (63% Schutz).
-
Somit
haben einige Studien heterologer Initialisierungs-Verstärkungs-Kombination
eine gewisse Erhöhung
von Antikörper-
und lymphoproliferativen Antworten gefunden, aber keinen signifikanten
Effekt auf eine Schutzwirkung in einem Tiermodell. CD8 T-Zellen
wurden in diesen Studien nicht gemessen. Die begrenzte Erhöhung der
Antikörperantwort
spiegelt wahrscheinlich einfach die Tatsache wider, daß Antikörper gegen
das initialisierende Immunogen häufig
die Immunogenizität
einer zweiten Immunisierung mit dem gleichen Immunogen herabsetzen,
wogegen ein Verstärken
mit einem anderen Träger
dieses Problem zum Teil überwindet. Man
würde nicht
erwarten, daß dieser
Mechanismus durch die Reihenfolge der Immunisierung wesentlich beeinflußt wird.
-
Anzeichen
dafür,
daß ein
heterologes Initialisierungs-Verstärkungs-Immunisierungsschema
CD8 T-Zell-Antworten beeinflussen könnte, wurden von Li et al.
(1993) geliefert. Sie beschreiben teilweise schützende Wirksamkeit, die in
Mäusen
gegen Malariasporozoiten-Exposition durch Verabreichung von zwei
lebenden viralen Vektoren induziert wurde, nämlich einem rekombinanten,
replizierenden Influenzavirus, gefolgt von einem rekombinanten,
replizierenden Vacciniavirus, der ein Malariaepitop codiert. Eine
Umkehrung der Reihenfolge der Immunisierung führte zu einem Verlust der gesamten
schützenden
Wirkung, und die Autoren schlugen vor, daß dies mit einer Infektion
von Leberzellen durch Vaccinia in Verbindung stehen könnte, was zu
einer Lokalisierung von CTLs in der Leber zum Schutz gegen die hepatozytischen
Stadien von Malariaparasiten führt.
-
Rodrigues
et al. (J. Immunol. 1994, 4636–4648)
beschreiben eine Immunisierung von Mäusen mit wiederholten Dosen
eines rekombinanten Influenzavirus, der ein immunodominantes B-Zell-Epitop
des Malaria-Circumsporozoiten-Proteins (CS) exprimiert, gefolgt
von einem rekombinanten Vacciniavirus-Verstärker. Die Verwendung eines
Wildtyp-Vaccinia-Stammes und eines abgeschwächten, aber replikationskompetenten Vacciniastammes
in dem Verstärker
lieferte sehr ähnliche
Niveaus von teilweisem Schutz. Jedoch war der abgeschwächte, aber
replikationskompetente Stamm etwas weniger immunogen für eine Initialisierung
von CD8 T-Zellen als der Wildtyp-Vaccinia-Stamm.
-
Murata
et al. (Cell. Immunol. 1996, 173: 96–107) berichteten von erhöhten CD8
T-Zell-Antworten
nach Initialisierung mit replizierenden, rekombinanten Influenzaviren
und Verstärkung
mit einem replizierenden Stamm von Vacciniavirus und schlugen vor,
daß der
Teilschutz, der in den zwei früheren
Studien beobachtet wurde, dieser erhöhten CD8 T-Zell-Induktion zuzuschreiben
war.
-
Carrol
et al., Vaccine, Band 15, Nr. 4, S. 387–394, 1997, offenbaren, daß MVA als
Verstärkungsvektor verwendet
werden kann.
-
Somit
liefern diese drei Studien zusammen Anzeichen dafür, daß eine Verstärker-Immunisierung mit einem
replizierenden, rekombinanten Vacciniavirus nach einer Initialisierung
mit einem replizierenden, rekombinanten Influenzavirus CD8 T-Zell-Induktion
bis zu einem gewissen Maße
erhöhen
kann. Jedoch gibt es zwei Einschränkungen dieser Erkenntnisse
hinsichtlich ihrer potentiellen Brauchbarkeit. Erstens war die induzierte Immunogenizität gerade
ausreichend, um teilweisen Schutz gegen Malaria zu erzielen, und
sogar dieser war abhängig
von einer hochgradig immunogenen initialisierenden Immunisierung
mit einem ungewöhnlichen
replizierenden, rekombinanten Influenzavirus. Zweitens, aufgrund
der potentiellen und dokumentierten Nebenwirkungen der Verwendung
dieser replizierenden Viren als Immunogene sind diese rekombinanten
Vektoren für
eine allgemeine Verwendung als Impfstoffe am Menschen nicht geeignet.
-
Modifizierter
Vacciniavirus Ankara (MVA) ist ein Vacciniavirusstamm, welcher in
den meisten Zelltypen, einschließlich normalen menschlichen
Geweben, nicht repliziert. MVA wurde durch aufeinanderfolgende Passage > 500 mal in Hühnchenembryofibroblasten
(CEF) von Material erhalten, das aus einer Pockenläsion an
einem Pferd in Ankara, Türkei,
erhalten wurde (Mayr et al., 1975). Es wurde gezeigt, daß es bezüglich Replikation
beeinträchtigt,
jedoch in der Lage ist, schützende
Immunität
gegen veterinäre
Pockenvirusinfektionen zu induzieren (Mayr, 1976). MVA wurde als
ein humanes Vaccin in den Endstadien der Pockenausrottungskampagne
verwendet, wobei es auf intrakutanen, subkutanen und intramuskulären Wegen > 120.000 Patienten
in Süddeutschland
verabreicht wurde. Es wurden keine signifikanten Nebenwirkungen
registriert, trotz der bewußten
Ausrichtung der Impfung auf Hochrisikogruppen, wie solchen mit Ekzemen (Mayr
et al., 1978; Stickt et al., 1974; Mahnel et al., 1994). Die Sicherheit
von MVA spiegelt die Avirulenz des Virus in Tiermodellen wider,
einschließlich
in bestrahlten Mäusen
und nach intrakranieller Verabreichung an neonatale Mäuse. Die nicht
stattfindende Replikation von MVA wurde mit der Produktion von proliferativen
weißen
Plaques auf Hühnerchorioallantoismembran,
abortiver Infektion von nicht-Vogelzellen und dem Vorhandensein
von sechs genomischen Deletionen, die insgesamt etwa 30 kb ausmachen,
in Korrelation gebracht (Meyer et al., 1991). Die Avirulenz von
MVA wurde teilweise Deletionen zugeschrieben, welche Wirtsbereichgene
K1L und C7L beeinflussen, obwohl begrenzte virale Replikation nach
wie vor auf menschlichen TK-143-Zellen
und CV-1-Zellen von der afrikanischen grünen Meerkatze stattfindet (Altenburger
et al., 1989). Wiederherstellung des K1L-Gens stellt den MVA-Wirtsbereich
nur teilweise wieder her (Sutter et al., 1994). Die Wirtsbereichsbeschränkung scheint
während
der Reifung des Viruspartikels stattzufinden, wobei in menschlichen
HeLa-Zellen in der Elektronenmikroskopie nur unreife Virionen beobachtet
werden (Sutter et al., 1992). Die späte Blockierung der viralen
Replikation verhindert nicht eine wirksame Expression von rekombinanten
Genen in MVA. Rekombinante MVA, welche Influenza-Nukleoprotein,
Influenza-Hämagglutinin
und SIV-Proteine exprimieren, haben sich als immunogen erwiesen
und liefern in variierendem Maße
Schutz in Tiermodellen, obwohl dies nie CD8+ T-Lymphozyten alleine
zugeschrieben wurde (Sutter et al., 1994; Hirsch et al., 1995; Hirsch
et al., 1996). Rekombinantes MVA wird aufgrund dieser Eigenschaften
bezüglich
Sicherheit und Immunogenizität
als ein vielversprechender Kandidat eines menschlichen Impfstoffs
angesehen (bloss et al., 1995). Rekombinantes MVA, welches DNA enthält, die
fremde Antigene codiert, ist in der
US
5 185 146 (Altenburger) beschrieben.
-
Pockenviren
haben Strategien zur Umgehung der Immunantwort des Wirtes entwickelt,
welche die Produktion von ausgeschiedenen Proteinen umfassen, die
als lösliche
Rezeptoren für
Tumornekrosefaktor, IL-1β,
Interferon (IFN)-α/β und IFN-γ funktionieren,
welche normalerweise eine Sequenzähnlichkeit zu der extrazellulären Domäne von zellulären Zytokinrezeptoren
besitzen (Symons et al., 1995; Alcami et al., 1995; Alcami et al.,
1992). Der zuletzt beschriebene Rezeptor dieser Art ist ein Chemokinrezeptor
(Graham et al., 1997). Im allgemeinen hemmen oder unterminieren
diese viralen Rezeptoren eine geeignete Wirtsimmunantwort, und deren
Gegenwart geht mit erhöhter
Pathogenizität
einher. Der IL-1β-Rezeptor
bildet eine Ausnahme: Seine Gegenwart vermindert die Fieberreaktion
des Wirts und erhöht
die Überlebensfähigkeit
des Wirts in Anbetracht einer Infektion (Alcami et al., 1996). Wir
haben entdeckt, daß MVA
funktionale Zytokinrezeptoren für Interferon-γ, Interferon-αβ, Tumornekrosefaktor
und CC-Chemokine fehlen, aber es verfügt über den potentiell vorteilhaften
IL-1β-Rezeptor.
MVA ist der einzige bekannte Stamm von Vaccinia, der dieses Zytokinrezeptorprofil
besitzt, was ihn theoretisch sicherer und immunogener macht als
andere Pockenviren. Ein weiterer, bezüglich Replikation beeinträchtigter
und sicherer Stamm von Vaccinia, bekannt als NYVAC, ist ausführlich in Tartaglia
et al. (Virology, 1992, 188: 217–232) beschrieben.
-
Es
wurde schon lange erkannt, daß lebende
Viren einige attraktive Eigenschaften als rekombinante Impfstoffvektoren
besitzen, einschließlich
einer hohen Kapazität
für fremde
Antigene und ziemlich gute Immunogenizität für zelluläre Immunantworten (Ellis, 1988,
New technologies for making vaccines. In: Vaccines, Ed.: Plotkin
S. A. und Mortimer E. A., W. B. Saunders, Philadelphia, S. 568;
Woodrow G. C., 1977, in: New Generation Vaccines, 2. Aufl., Ed.:
Levine, M. M., Woodrow, G. C., Kaper, J. B., Cobon, G., S. 33).
Dies führte
zu Versuchen, die Virulenz von solchen lebenden Vektoren auf verschiedene
Weisen abzuschwächen,
einschließlich
einer Reduzierung ihrer Replikationskapazität (Tartaglia J. et al., 1992,
Virology, 188: 217–232). Solch
eine Reduzierung in der Replikation reduziert jedoch die Menge an
Antigen, das von dem Virus produziert wird, und dabei würde man
erwarten, daß die
Impfstoffimmunogenizität
vermindert würde.
Tatsächlich wurde
früher
gezeigt, daß eine
Abschwächung
von Vacciniastämmen
zu einigen wesentlichen Verringerungen der Antikörperreaktionen führt (Lee
M. S. et al., 1992, J. Virology, 66: 2617–2630). Gleichermaßen wurde
herausgefunden, daß der
nichtreplizierende Geflügelpockenvektor
für eine
Antikörperproduktion
weniger immunogen und weniger schützend ist als ein replizierender
Wildtyp-Vaccinia-Stamm in einer Tollwutstudie (Taylor J. et al.,
1991, Vaccine, 9: 190–193).
-
Es
wurde nun herausgefunden, daß nichtreplizierende
und bezüglich
Replikation beeinträchtigte Stämme des
Pockenvirus Vektoren liefern, welche auf eine initialisierte CTL-Antwort
eine äußerst gute
Verstärkungswirkung
liefern. Bemerkenswerterweise ist dieser Effekt signifikant stärker als
eine Verstärkungswirkung durch
Wildtyp-Pockenviren. Der Effekt wird mit Malaria- und anderen Antigenen,
wie viralen und Tumorantigenen, beobachtet und ist schützend, wie
es in Expositionsexperimenten in Mäusen und nichtmenschlichen
Primaten gezeigt wurde. Man beobachtete mit dem neuen Immunisierungsschema
eher vollständigen
als teilweisen Schutz vor Sporozoitenexposition.
-
Es
ist ein Ziel dieser Erfindung, ein wirksames Mittel zur Immunisierung
gegen Hepatitis B oder C zu identifizieren.
-
Wir
beschreiben hierin ein neues Verfahren zur Immunisierung, das sehr
hohe Mengen an CD8+ T-Zellen erzeugte und von dem herausgefunden
wurde, daß es
in der Lage ist, noch nie dagewesenen vollständigen Schutz gegen P. berghei-Sporozoitenexposition
zu induzieren. Der gleiche Ansatz wurde in höheren Primaten getestet, und
es wurde herausgefunden, daß er
in diesen Spezies ebenfalls hochgradig immunogen war und teilweisen
Schutz gegen P. falciparum-Exposition
induzierte. Induktion von schützenden
Immunantworten wurde auch in zwei zusätzlichen Mausmodellen von viraler
Infektion und Krebs demonstriert.
-
Wir
zeigen weiterhin, daß das
neue Immunisierungsschema, welches hierin beschrieben wird, auch bei
der Erzeugung von starken CD8+ T-Zell-Antworten gegen HIV-Epitope
wirkungsvoll ist. Ein beachtliches Indiz zeigt, daß man erwarten
kann, daß die
Erzeugung solcher CD8+ T-Zell-Antworten
für eine
prophylaktische oder therapeutische Immunisierung gegen diese virale
Infektion und Erkrankung wertvoll ist (Gallimore et al., 1995; Ada,
1996). Wir demonstrieren, daß starke
CD8+ T-Zell-Antworten gegen Epitope sowohl von HIV als auch Malaria
unter Verwendung eines Epitopstranges mit Sequenzen von beiden dieser
Mikroorganismen erzeugt werden können.
Der Erfolg bei der Erzeugung erhöhter
Immunogenizität
gegen sowohl HIV- als auch Malariaepitope und auch gegen Influenza-
und Tumorepitope zeigt, daß dieses
neue Immunisierungsschema allgemein gegen viele infektiöse Pathogene
und auch bei nichtinfektiösen
Krankheiten, wo die Erzeugung einer starken CD8+ T-Zell-Antwort
wertvoll sein kann, wirksam kein kann.
-
Eine
Erkenntnis ist die sehr hohe Wirksamkeit von nichtreplizierenden
Mitteln sowohl bei der Initialisierung als auch insbesondere bei
der Verstärkung
einer CD8+ T-Zell-Antwort. Früher
wurde herausgefunden, daß im
allgemeinen die Immunogenizität
von CD8+ T-Zell-Induktion durch lebende replizierende virale Vektoren
höher war
als von nichtreplizierenden Mitteln oder bezüglich Replikation beeinträchtigten
Vektoren. Wie man es erwarten würde,
liegt dies an der größeren Menge
an Antigenen, die von Mitteln produziert werden, die in dem Wirt
replizieren können.
Hierin finden wir jedoch, daß die
größte Immunogenizität und schützende Wirksamkeit überraschenderweise
mit nichtreplizierenden Vektoren beobachtet wird. Die letztgenannten
haben dahingehend einen zusätzlichen
Vorteil für
die Impfung, daß sie
im allgemeinen für
die Anwendung im Menschen sicherer sind als replizierende Vektoren.
-
Die
vorliegende Erfindung liefert unter einem Aspekt ein Kit, welches
umfaßt:
- (i) eine Initialisierungszusammensetzung mit
einem DNA-Plasmid, das eine Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope aus einem
Zielantigen von Hepatitis B oder Hepatitis C codiert, zusammen mit
einem pharmazeutisch verträglichen
Träger,
und
- (ii) eine Verstärkungszusammensetzung
mit einem Modified Virus Ankara (MVA)-Vektor, der eine Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope
aus einem Zielantigen von Hepatitis B oder Hepatitis C codiert,
einschließlich
mindestens einem CD8+ T-Zell-Epitop,
welches das gleiche wie ein CD8+ T-Zell-Epitop der Initialisierungszusammensetzung
ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger,
für die Verwendung
als therapeutischer oder prophylaktischer Impfstoff.
-
In
einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung die Verwendung eines
MVA-Vektors, der eine Quelle für CD8+
T-Zell-Epitope aus einem Zielantigen von Hepatitis B oder Hepatitis
C codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung einer
anders initialisierten CD8+ T-Zell-Immunantwort.
-
Vorzugsweise
ist die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in (i) in dem Verfahren gemäß der Erfindung ein nichtviraler
Vektor oder ein nichtreplizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter
viraler Vektor, der ein anderer ist als ein MVA-Vektor, obwohl auch
replizierende virale Vektoren verwendet werden können.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope
in der Initialisierungszusammensetzung eine Nukleinsäure, welche
DNA oder RNA sein kann, insbesondere ein rekombinantes DNA-Plasmid.
Die DNA oder RNA kann verpackt sein, z. B. in einem Lysosom, oder
sie kann in freier Form vorliegen.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in
der Initialisierungszusammensetzung ein Peptid, ein Polypeptid,
ein Protein, ein Polyprotein oder ein Teilchen, das zwei oder mehr
CD8+ T-Zell-Epitope umfaßt,
die in einem rekombinanten Strang von CD8+ T-Zell-Epitopen oder
in einem Zielantigen vorliegen. Polyproteine umfassen zwei oder
mehr miteinander verbundene Proteine, welche die gleichen oder vorzugsweise
verschiedene sein können.
Besonders bevorzugt ist in dieser Ausführungsform ein rekombinantes
Proteinteilchen, wie ein Ty-Virus-ähnliches Teilchen (VIP) (Burns
et al., Molec. Biotechnol. 1994, 1: 137–145).
-
Die
Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in der Verstärkungszusammensetzung
ist ein MVA-Vektor
(modifiziertes Virus Ankara).
-
Pockenvirengenome
können
eine große
Menge an heterologer genetischer Information tragen. Andere Anforderungen
an virale Vektoren für
die Verwendung in Impfstoffen umfassen gute Immunogenizität und Sicherheit.
MVA ist ein bezüglich
Replikation beeinträchtigter
Vacciniastamm mit einem guten Sicherheitsnachweis. In den meisten
Zelltypen und in normalen menschlichen Geweben repliziert MVA nicht;
begrenzte Replikation von MVA beobachtet man in ein paar transformierten
Zelltypen, wie BHK21-Zellen. Es wurde nun anhand der hierin beschriebenen
Ergebnisse gezeigt, daß rekombinantes
MVA überraschenderweise
und signifikant besser ist als herkömmliche rekombinante Vacciniavektoren
bei der Erzeugung einer schützenden CD8+
T-Zell-Antwort, wenn es in einer verstärkenden Zusammensetzung nach
einer Initialisierung mit einem DNA-Plasmid, einem rekombinanten
Ty-VIP oder einem rekombinanten Adenovirus verabreicht wird.
-
MVA,
welches einen eingefügten
Epitopstrang (MVA-HM, welches in den Beispielen beschrieben ist) enthält, wurde
bei der europäischen
Sammlung für
Tierzellkulturen, CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK, unter
der Hinterlegungsnr. V97060511 am 5. Juni 1997 hinterlegt.
-
Der
Begriff "nichtreplizierend" oder "bezüglich Replikation
beeinträchtig", wie er hierin verwendet
wird, bedeutet nicht fähig
zur Replikation in einem signifikanten Ausmaß in der Mehrzahl normaler
Säugerzellen oder
normaler menschlicher Zellen. Viren, die nichtreplizierend oder
bezüglich
Replikation beeinträchtigt
sind, können
auf natürliche
Weise (d. h. sie können
als solche aus der Natur isoliert worden sein) oder auf künstliche Weise,
z. B. durch Züchtung
in vitro oder durch genetische Manipulation, z. B. Entfernung eines
Gens, welches für
die Replikation kritisch ist, so geworden sein. Es wird im allgemeinen
einen oder ein paar Zelltypen geben, in denen die Viren gezüchtet werden
können,
wie CEF-Zellen für
MVA.
-
Replikation
eines Virus wird im allgemeinen auf zwei Weisen gemessen: 1) DNA-Synthese und 2) Virentiter.
Genauer bedeutet der Ausdruck "nichtreplizierend
oder bezüglich
Replikation beeinträchtigt", wie er hierin verwendet
wird und wie er auf Pockenviren zutrifft, Viren, welche eines oder
beide der nachfolgenden Kriterien erfüllen:
- 1)
Aufweisen einer 1 log (10-fachen) Verminderung der DNA-Synthese,
verglichen mit dem Kopenhagen-Stamm von Vacciniavirus, in MRC-5-Zellen
(einer menschlichen Zellinie);
- 2) Aufweisen einer 2 log Verminderung des Virentiters in HeLa-Zellen
(einer menschlichen Zellinie), verglichen mit dem Kopenhagen-Stamm
von Vacciniavirus.
-
Beispiele
für Pockenviren,
welche unter diese Definition fallen, sind MVA, NYVAC und Geflügelpockenviren,
wogegen ein Virus, welches aus der Definition herausfällt, der
abgeschwächte
Vacciniastamm M7 ist.
-
Alternative
bevorzugte virale Vektoren für
die Verwendung in der Initialisierungszusammensetzung gemäß der Erfindung
umfassen eine Vielzahl verschiedener Viren, die genetisch deaktiviert
wurden, so daß sie nichtreplizierend
oder bezüglich
Replikation beeinträchtigt
sind. Solche Viren umfassen z. B. nichtreplizierende Adenoviren,
wie E1-Deletionsmutanten. Genetische Inaktivierung von Viren zur
Herstellung von nichtreplizierenden oder bezüglich Replikation beeinträchtigten
Vektoren ist in weitem Maße
in der Literatur beschrieben worden (z. B. McLean et al., 1994).
-
Andere
geeignete virale Vektoren zur Verwendung in der Initialisierungszusammensetzung
sind Vektoren, die auf Herpesvirus und auf venezolanischem pferdeähnlichem
Enzephalitisvirus (VEE) basieren (Davies et al., 1996). Geeignete
bakterielle Vektoren zur Initialisierung umfassen rekombinante BCG
und rekombinante Salmonella und Salmonella, die mit Plasmid-DNA transformiert
sind (Darji A. et al., 1997, Cell 91: 765–775).
-
Alternative
geeignete nichtvirale Vektoren zur Verwendung in der Initialisierungszusammensetzung umfassen
Peptide mit Lipidanhang, bekannt als Lipopeptide, Peptide, die mit
Trägerproteinen
wie KLH entweder als Fusionsproteine oder durch chemische Verbindung
miteinander verbunden sind, ganze Antigene mit Adjuvans und andere ähnliche
Systeme. Adjuvanzien, wie QS21 oder SBAS2 (Stoute J. A. et al.,
1997, N. Engl. J. Medicine 226: 86–91), können mit Proteinen, Peptiden
oder Nukleinsäuren
zur Verstärkung
der Induktion von T-Zell-Antworten verwendet werden. Diese Systeme
werden manchmal eher als "Immunogene" und nicht als "Vektoren" bezeichnet, aber
sie sind hierin in dem Sinne Vektoren, daß sie die relevanten CD8+ T-Zell-Epitope tragen.
-
Die
CD8+ T-Zell-Epitope, die entweder in den Initialisierungs- und Verstärkungszusammensetzungen vorhanden
sind oder von diesen codiert werden, können in einer Vielzahl verschiedener
Formen bereitgestellt werden, wie als ein rekombinanter Strang aus
einem oder zwei oder mehr Epitopen oder in dem Kontext des nativen
Zielantigens oder einer Kombination von beidem davon. CD8+ T-Zell-Epitope
wurden für
viele verschiedene Krankheiten identifiziert und können in
der Literatur gefunden werden. Es ist möglich, Epitopstränge zur
Erzeugung einer CD8+ T-Zell-Antwort gegen jedes ausgewählte Antigen,
das diese Epitope enthält,
zu entwerfen. Vorteilhafterweise sind die Epitope in einem Strang
aus mehreren Epitopen ohne störende
Se quenzen miteinander verbunden, so daß unnötiges Nukleinsäure- und/oder
Aminosäurematerial
vermieden wird. Zusätzlich
zu den CD8+ T-Zell-Epitopen kann es bevorzugt sein, eines oder mehrere
Epitope einzubinden, die von T-Helferzellen erkannt werden, um die
von dem Epitopstrang erzeugte Immunantwort zu verstärken. Besonders
geeignete T-Helferzellepitope sind solche, die in Individuen von
verschiedenen HLA-Typen aktiv sind, z. B. T-Helferepitope von Tetanus
(gegen welche die meisten Individuen bereits initialisiert sein
werden). In den hierin beschriebenen Beispielen wird eine geeignete
Kombination aus drei T-Helferepitopen verwendet. Es kann auch nützlich sein,
B-Zell-Epitope zur Stimulierung von B-Zell-Antworten und Antikörperproduktion
einzuschließen.
-
Die
beschriebenen Initialisierungs- und Verstärkungszusammensetzungen können vorteilhafterweise ein
Adjuvans umfassen. Insbesondere kann eine Initialisierungszusammensetzung,
die einen DNA-Plasmidvektor enthält,
auch Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF)
oder ein Plasmid, welches diesen codiert, für eine Wirkung als ein Adjuvans
enthalten; vorteilhafte Wirkungen sieht man bei Verwendung von GM-CSF
in Polypeptidform.
-
Die
hierin beschriebenen Zusammensetzungen können als therapeutische oder
prophylaktische Impfstoffe verwendet werden. Ob prophylaktische
oder therapeutische Immunisierung geeigneter ist, wird üblicherweise
von der Art der Krankheit abhängen.
Zum Beispiel wird erwartet, daß man
gegen Krebs eher therapeutisch immunisiert als bevor man ihn diagnostiziert
hat, wogegen Anti-Malaria-Impfstoffe bevorzugt, jedoch nicht notwendigerweise
als ein Prophylaktikum verwendet werden.
-
Die
Zusammensetzungen gemäß der Erfindung
können über eine
Vielzahl verschiedener Wege verabreicht werden. Bestimmte Wege können für bestimmte
Zusammensetzungen bevorzugt sein, da sie zur Erzeugung einer wirksameren
Antwort führen
oder da es unwahrscheinlicher ist, daß sie Nebenwirkungen hervorrufen
oder da sie für
die Verabreichung einfacher sind. Es wurde gezeigt, daß die vorliegende
Erfindung mit einer Genpistolenverabreichung, entweder auf Goldperlen
oder als ein Pulver, wirksam ist.
-
Unter
weiteren Gesichtspunkten beschreiben wir folgendes:
- – ein
Verfahren zum Erzeugen einer schützenden
CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen ein Pathogen oder einen Tumor, wobei
das Verfahren das Verabreichen wenigstens einer Dosis eines rekombinanten
DNA-Plasmids, welches wenigstens ein CD8+ T-Zell-Epitop oder Antigen
des Pathogens oder des Krebses codiert, gefolgt von wenigstens einer
Dosis eines nichtreplizierenden oder bezüglich Replikation beeinträchtigten rekombinanten
Pockenvirus, welcher das gleiche Epitop oder Antigen codiert, umfaßt;
- – ein
Verfahren zum Erzeugen einer schützenden
CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen ein Pathogen oder einen Tumor, wobei
das Verfahren das Verabreichen wenigstens einer Dosis eines rekombinanten
Proteins oder Teilchens, welches wenigstens ein Epitop oder Antigen
des Pathogens oder des Krebses umfaßt, gefolgt von wenigstens
einer Dosis eines rekombinanten MVA-Vektors, welcher das gleiche
Epitop oder Antigen codiert, umfaßt;
- – die
Verwendung eines rekombinanten, nichtreplizierenden oder bezüglich Replikation
beeinträchtigten Pockenvirusvektors
bei der Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung einer CD8+ T-Zell-Immunantwort;
- – die
Verwendung eines MVA-Vektors bei der Herstellung eines Medikaments
zur Verstärkung
einer CD8+ T-Zell-Immunantwort;
- – ein
Medikament zur Verstärkung
einer initialisierten CD8+ T-Zell-Antwort gegen wenigstens ein Zielantigen
oder Epitop, welches eine Quelle für ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope
des Zielantigens umfaßt, wobei
die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope ein nichtreplizierender oder ein bezüglich Replikation
beeinträchtigter
rekombinanter Pockenvirusvektor ist, zusammen mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger;
und
- – die
hierin beschriebenen Initialisierungs- und/oder Verstärkungszusammensetzungen
in partikulärer
Form und geeignet zur Verabreichung mittels einer Genpistole und
Verfahren zur Immunisierung, welche die Verabreichung der Zusammensetzung
mittels einer Genpistole umfassen.
-
Folgendes
wird ebenfalls beschrieben: die hierin beschriebenen Epitopstränge, einschließlich Epitopsträngen, welche
die in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführten Aminosäuresequenzen
umfassen; rekombinante DNA-Plasmide, welche die Epitopstränge codieren;
rekombinante Ty-VLPs, welche die Epitopstränge umfassen; ein rekombinantes
DNA-Plasmid oder ein nichtreplizierendes oder bezüglich Replikation
beeinträchtigtes
rekombinantes Pockenvirus, welches das P. falciparum-Antigen TRAP
codiert; und ein rekombinantes Polypeptid, welches ein vollständiges oder
im wesentlichen vollständiges
Proteinantigen, wie TRAP, und einen Strang aus zwei oder mehr Epitopen
in Folge, wie CTL-Epitope von Malaria, umfaßt. Beispielformulierungen
und Immunisierungsprotokolle Formulierung
1
Initialisierungszusammensetzung: | DNA-Plasmid
1 mg/ml in PBS |
Verstärkungszusammensetzung: | rekombinantes
MVA, 108 ffu in PBS |
Protokoll: | Verabreichung
von zwei Dosen mit 1 mg Initialisierungszusammensetzung im. nach
0 und 3 Wochen, gefolgt von zwei Dosen Verstärker intradermal nach 6 und
9 Wochen. |
Formulierung
2
Initialisierungszusammensetzung: | Ty-VLP
500 μg in
PBS |
Verstärkungszusammensetzung: | MVA,
108 ffu in PBS |
Protokoll: | Verabreichung
von zwei Dosen Initialisierungszusammensetzung im. nach 0 und 3
Wochen, anschließend
zwei Dosen Verstärker
nach 6 und 9 Wochen. Zur Tumorbehandlung wird MVA iv. als einer
der wirksamsten Wege gegeben. |
Formulierung
3
Initialisierungszusammensetzung: | Protein
500 μg +
Adjuvans (QS-21) |
Verstärkungszusammensetzung: | rekombinantes
MVA, 108 ffu in PBS |
Protokoll: | Verabreichung
von zwei Dosen Initialisierungszusammensetzung nach 0 und 3 Wochen
und zwei Dosen Verstärker
id. nach 6 und 9 Wochen. |
Formulierung
4
Initialisierungszusammensetzung: | Adenovirusvektor,
109 pfu in PBS |
Verstärkungszusammensetzung: | rekombinantes
MVA, 108 ffu in PBS |
Protokoll: | Verabreichung
von einer oder zwei Dosen Initialisierungszusammensetzung intradermal
nach 0 und 3 Wochen und von zwei Dosen Verstärker id. nach 6 und 9 Wochen. |
-
Die
oben genannten Dosen und Protokolle können zur Optimierung des Schutzes
variiert werden. Dosen können
z. B. eher mit einem Abstand von 1 bis 8 Wochen als mit einem Abstand
von 2 Wochen gegeben werden.
-
Die
Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen beschrieben.
-
BEISPIELE
-
Beispiel 1
-
Materialien und Methoden
-
Erzeugung der Epitopstränge.
-
Der
Malariaepitopstrang wurde aus einer Reihe von Kassetten aufgebaut,
von denen jede drei Epitope codierte, wie es in Tabelle 1 gezeigt
ist, mit Restriktionsenzymschnittstellen an jedem Ende der Kassette.
Jede Kassette wurde aus vier synthetischen Oligonukleotiden aufgebaut,
welche aneinander annealt, in einen Klonierungsvektor ligiert und
anschließend
zur Überprüfung, daß keine
Fehler eingebracht worden waren, sequenziert wurden. Einzelne Kassetten
wurden anschließend
nach Erfordernis miteinander verbunden. Die BamHI-Stelle an dem
3'-Ende von Kassette
C wurde mit der BglII-Stelle am 5'-Ende von Kassette A verbunden, wobei
beide Restriktionsenzymschnittstellen zerstört und ein zwei Aminosäuren langer
Abstandshalter (GS) zwischen den zwei Kassetten codiert wurde. Die
Kassetten B, D und H wurden anschließend auf die gleiche Art und
Weise mit dem Strang verbunden. Es wurde auf die gleiche Weise auch
ein längerer
Strang aufgebaut, der CABDHFE enthielt. Tabelle
1. CTL-Epitope des Malaria-(M-)Stranges
-
Tabelle
1 Sequenzen, die in dem Malariaepitopstrang enthalten sind. Jede
Kassette besteht aus den oben gezeigten Epitopen in der dargestellten
Reihenfolge ohne eine zusätzliche
Sequenz zwischen Epitopen innerhalb einer Kassette. Eine BglII-Schnittstelle
wurde an dem 5'-Ende und eine BamHI-Schnittstelle
an dem 3'-Ende hinzugefügt, so daß zwischen
Kassetten in einem Epitopstrang die BamHI-BglII-Verbindung GS codiert.
Alle Epitope stammen von P. falciparum-Antigenen, ausgenommen pb9
(P. berghei), BCG (M. tuberculosis) und TT (Tetanus). Die Aminosäure- und
DNA-Sequenzen, die in der Tabelle gezeigt sind, haben in der Reihenfolge,
in der sie erscheinen, die SEQ ID NO. 1 bis 40.
-
1 zeigt
das zur Expression von Ty-VLP verwendete Konstrukt mit der Malariaepitopkassette
CABDHFE. CTL-Epitope stammen von P. falciparum STARP (Threonin-
und Asparagin-reiches Sporozoitprotein) (st), LSA-1 (Leberstadiumantigen
1) (1s), CSP (Circumsporozoitprotein) (cp), TRAP (mit Thrombospondin
verwandtes Haftprotein) (tr), LSA-3 (Leberstadiumantigen 3) (la)
und Exp-1 (exportiertes Protein 1) (ex). Helferepitope stammen von
dem P. falciparum CS-Protein,
dem M. tuberculosis 38kD-Antigen und von Tetanus-Toxoid. NANP ist
das Antikörperepitop
von CS, und AM ist das Haftmotiv von P. falciparum TRAP (Muller
et al., 1993). Die Länge
des vollständigen
Stranges beträgt
229 Aminosäuren,
wie es in der Legende von Tabelle 1 gezeigt ist, mit der folgenden
Aminosäuresequenz:
-
Der
HIV-Epitopstrang wurde auch durch Annealen von Oligonukleotiden
synthetisiert. Am Ende wurden die HIV- und Malariaepitopstränge durch
Verbinden der BamHI-Schnittstelle am 3'-Ende
der HIV-Epitope mit der BglII-Schnittstelle am 5'-Ende der Kassetten CAB unter Bildung
des HM-Strangs verbunden (Tabelle 2). Tabelle
2. CTL-Epitope des HIV/SIV-Epitopstrangs
-
Tabelle
2 Sequenzen von Epitopen von HIV oder SIV, die in dem H-Epitopstrang
enthalten sind und zusammengesetzt wurden, wie es in 2 gezeigt
ist. Die Aminosäuren
in der Tabelle haben die SEQ ID NO. 62 bis 64 in der Reihenfolge,
in der sie erscheinen.
-
2 zeigt
eine schematische Übersicht
der H-, M- und HM-Proteine. Die Balkenmuster auf den schematischen
Darstellungen der Polyepitopproteine zeigen den Ursprung der Sequenz
(siehe Tabellen 1 und 2). Die Positionen einzelner Epitope und deren
MHC-Beschränkungen
sind über
und unter den Proteinen angegeben. Pb ist das einzige Epitop, das
von dem Protein von P. berghei abgeleitet ist. Alle anderen Epitope
in dem M-Protein stammen von Proteinen von P. falciparum: cs-Circumsporozoitprotein,
st-STARP, ls-LSA-1 und tr-TRAP; BCG-38kDa-Protein von M. tuberculosis;
TT-Tetanustoxin.
-
Für den Anti-Tumor-Impfstoff
wurde ein CTL-Epitope enthaltender Epitopstrang erzeugt, ähnlich dem Malaria-
und HIV-Epitopstrang. In diesem Tumorepitopstrang wurden veröffentlichte
Maus-CTL-Epitope miteinander verbunden, um den Tumorepitopstrang
mit der folgenden Aminosäuresequenz
zu erzeugen: MLPYLGWLVF-AQHPNAELL-KHYLFRNL-SPSYVYHQFIPNPLLGLD [SEQ
ID NO: 65]. Hierin gezeigte CTL-Epitope wurden miteinander verbunden.
Die erste Aminosäure
Methionin wurde zur Initiierung der Translation eingebracht.
-
Ty-Virus-artige Partikel (VLPs).
-
Der
Epitopstrang, der die Kassette CABDH enthielt, wurde zur Herstellung
einer C-terminalen
Fusion im Leserahmen mit dem TyA-Protein in einen Hefe-Expressionsvektor
eingebracht. Wenn TyA oder TyA-Fusionsproteine in Hefe von diesem
Vektor exprimiert werden, bildet das Protein spontan virusartige
Partikel, welche aus dem Zytoplasma der Hefe mittels Sucrose-Gradientenzentrifugation
gereinigt werden können.
Rekombinante Ty-VLPs wurden auf diese Art und Weise hergestellt
und gegen PBS dialysiert, um die Sucrose vor einer Injektion zu
entfernen (siehe Layton et al., 1996).
-
Adenoviren
-
Bezüglich Replikation
defektes, rekombinantes Adenovirus mit einer Deletion der E1-Gene wurde in dieser
Studie verwendet (McGrory et al., 1988). Das Adenovirus exprimierte
E. coli-β-Galaktosidase
unter der Kontrolle eines CMV-IE-Promotors. Für Immunisierungen wurden 107 pfu Virus intradermal in das Ohrläppchen verabreicht.
-
Peptide
-
Peptide
wurden von Research Genetics (USA) bezogen, zu 10 mg/ml in DMSO
(Sigma) gelöst
und weiter auf 1 mg/ml in PBS verdünnt. Peptide, die CTL-Epitope
enthielten, welche in den hierin beschriebenen Experimenten verwendet
wurden, sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3. Sequenz von CTL-Peptidepitopen
Sequenz | Antigen | MHC-Beschränkung |
LPYLGWLFV | P1A-Tumor-Antigen | Ld |
SYIPSAEKI | P.
berghei CSP | Kd |
RGPGRAFVTI | HIV
gag | Dd |
TPHPARIGL | E.
coli β-Galaktosidase | Ld |
TYQRTRALV | Influenza-A-Virus
NP | Kd |
SDYEGRLI | Influenza-A-Virus
NP | Kk |
ASNENMETM | Influenza-A-Virus
NP | Db |
INVAFNRFL | P.
falciparum TRAP | Kb |
-
Die
Aminosäuresequenzen
in Tabelle 3 haben die SEQ ID NO: 66 bis 73 in der Reihenfolge,
in welcher sie in der Tabelle erscheinen.
-
Plasmid-DNA-Konstrukte
-
Eine
Anzahl verschiedener Vektoren wurde zur Herstellung von DNA-Impfstoffen
verwendet. Das Plasmid pTH enthält
den CMV-IE-Promotor mit Intron A, gefolgt von einem Polylinker,
um die Einbringung von Antigen codierenden Sequenzen zu erlauben,
und die Rinderwachstumshormon-Transkriptionsterminierungssequenz.
Das Plasmid trägt
das Ampicillin-Resistenzgen und ist zur Replikation in E. coli,
aber nicht in Säugerzellen
in der Lage. Dieses wurde zur Herstellung von DNA-Impfstoffen verwendet,
welche jeweils die folgenden Antigene exprimieren: P. berghei TRAP,
P. berghei CS, P. falciparum TRAP, P. falciparum LSA-1 (nur 278
Aminosäuren
des C-Terminus), den die Kassetten CABDH enthaltenden Epitopstrang
und den HM-Epitopstrang (HIV-Epitope,
gefolgt von Kassetten CAB). Das Plasmid pSG2 ist ähnlich wie
pTH mit Ausnahme des Antibiotika-Resistenzgens. In pSG2 wurde das
Ampicillin-Resistenzgen von pTH durch ein Kanamycin-Resistenzgen ersetzt
pSG2 wurde zur Herstellung von DNA- Impfstoffen verwendet, welche die folgenden
Antigene exprimieren: P. berghei PbCSP, einen Maus-Tumor-Epitopstrang,
den Epitopstrang, der Kassetten CABDH enthält, und den HM-Epitopstrang. Das
Plasmid V1J-NP exprimiert Influenza-Nukleoprotein unter der Kontrolle
eines CMV-IE-Promotors. Die Plasmide CMV-TRAP und CMV-LSA-1 sind ähnlich wie
pTH.TRAP und pTH.LSA-1, enthalten aber nicht Intron A des CMV-Promotors.
Die Plasmide RSV.TRAP und RSV.LSA-1 enthalten den RSV-Promotor,
die SV40-Transkriptionsterminierungssequenz und sind tetracyclinresistent.
Zur Induktion von β-galaktosidasespezifischem
CTL-Plasmid wurde pcDNA3/His/LacZ (Invitrogen) verwendet. Alle DNA-Impfstoffe
wurden aus dem E. coli-Stamm DH5α unter
Verwendung von Qiagen-Plasmidreinigungssäulen hergestellt.
-
Erzeugung von rekombinanten Vacciniaviren
-
Rekombinante
MVAs wurden hergestellt, indem zuerst die Antigensequenz in einen
Transportervektor mit einem viralen Promotor, wie das Plasmid pSC11,
kloniert wurde (Chakrabarti et al., 1985; Morrison et al., 1989).
P. berghei CS und P. falciparum TRAP, Influenza-Nukleoprotein und der HM- und Maus-Tumorepitop-Polyepitopstrang
wurden jeweils unter Verwendung des P7.5-Promotors (Mackett et al.,
1984) exprimiert, und P. berghei TRAP wurde unter Verwendung des
starken synthetischen Promotors (SSP; Carroll et al., 1995) exprimiert.
Die Transportervektoren pSC11 oder pMCO3 wurden dann verwendet,
um Zellen, die mit Wildtyp-MVA
infiziert waren, zu transformieren, so daß virale Sequenzen den Promotor
flankierten, wobei Antigen codierende Sequenz und Markergen mit
dem MVA rekombinieren und Rekombinanten produzieren konnten. Rekombinante
Viren exprimieren das Markergen (β-Glucoronidase
oder β-Galaktosidase), welches
eine Identifizierung von Plaques, die rekombinantes Virus enthalten,
erlaubt. Rekombinante wurden vor einer Verwendung in Immunisierungen
wiederholt plaquegereinigt. Die Rekombinante NYVAC-PbCSP-Vaccinia
wurde früher
beschrieben (Lanar et al., 1996). Der Wildtyp- oder Western Reserve-(WR-)Strang
von rekombinantem Vaccinia, welche PbCSP codieren, wurde früher beschrieben
(Satchidanandam et al., 1991).
-
Zellen und Kulturmedium
-
Mauszellen
und mit Epstein-Barr-Virus transformierte Schimpansen- und Makaken-B-Zellen (BCL) wurden
in RPMI kultiviert, welches mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum
(FCS) versetzt war. Splenozyten wurden mit den angegebenen Peptiden
(Endkonzentration: 1 μg/ml)
in MEM-Medium mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50 μM 2-Mercaptoethanol und
10 mM Hepes, pH 7,2 (Gibco, UK) restimuliert.
-
Tiere
-
Mäuse der
angegebenen Stämme
im Alter von 6–8
Wochen wurden von Harlan Olac (Shaws Farm, Blackthorn, UK) bezogen.
Schimpansen H1 und H2 wurden am biomedizinischen Primatenforschungszentrum in
Rijswick, Niederlande, untersucht. Makaken wurden an der Universität von Oxford
untersucht.
-
Immunisierungen
-
Plasmid-DNA-Immunisierungen
von Mäusen
wurden durch intramuskuläre
Immunisierung der DNA in den Musculus tibialis unter Betäubung durchgeführt. Der
Mäusemuskel
wurde in manchen Fällen
5–9 Tage
vor der Immunisierung mit 50 μl
1 mM Kardiotoxin (Latoxan, Frankreich) vorbehandelt, wie von Davis
et al. (1993) beschrieben, aber es wurde nicht gefunden, daß das Vorhandensein
oder Fehlen solch einer Vorbehandlung irgendeine signifikante Auswirkung
auf die Immunogenizität
oder die schützende
Wirkung hat. MVA-Immunisierung von Mäusen wurde entweder durch intramuskuläre (im.),
intravenöse
(in die seitliche Schwanzvene) (iv.), intradermale (id.), intraperitoneale
(ip.) oder subkutane (sc.) Immunisierung durchgeführt. Plasmid-DNA- und MVA-Immunisierung
der Schimpansen H1 und H2 wurde unter Betäubung durch intramuskuläre Immunisierung
von Beinmuskeln durchgeführt.
Für diese
Schimpansenimmunisierungen wurde die Plasmid-DNA gemeinsam mit 15 μg humanem
GM-CSF als ein Adjuvans verabreicht. Verabreichung von rekombinantem
MVA an die Schimpansen wurde durch intramuskuläre Immunisierung unter tierärztlicher
Aufsicht durchgeführt.
Rekombinantes humanes GM-CSF wurde von Sandoz (Camberley, UK) bezogen.
Für Plasmid-DNA-Immunisierungen
unter Verwendung einer Genpistole wurde DNA auf Goldpartikel präzipitiert.
Für intradermale
Verabreichung wurden zwei verschiedene Typen von Genpistolen verwenden,
die Acell- und die Oxford Bioscience-Vorrichtung (PowderJect Pharmaceuticals,
Oxford, UK).
-
ELISPOT-Tests
-
CD8+
T-Zellen wurden in den Milzen von immunisierten Mäusen ohne
in vitro Restimulierung unter Verwendung der angegebenen Peptidepitope
und des ELISPOT-Tests, wie von Miyahara et al. (1993) beschrieben,
quantifiziert. Kurz gesagt wurden Nitrozelluloseplatten mit 96 Reaktionsräumen (Miliscreen
MAHR, Millipore, Redford, UK) mit 15 μg/ml des monoklonalen Anti-Maus-Interferon-γ-Antikorpers
R4 (EACC) in 50 μl phosphatgepufferter
Kochsalzlösung
(PBS) beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden
die Reaktionsräume
einmal mit PBS gewaschen und für
eine Stunde bei Raumtemperatur mit 100 μl RPMI mit 10% FCS blockiert.
Splenozyten von immunisierten Mäusen
wurden auf 1 × 107 Zellen/ml resuspendiert und in Duplikaten
in die mit Antikörper
beschichteten Reaktionsräume
gegeben und der Reihe nach verdünnt.
Peptide wurden in jedem Reaktionsraum bis zu einer Endkonzentration
von 1 μg/ml
hinzugefügt.
Zusätzliche
Reaktionsräume
ohne Peptid wurden als eine Kontrolle für die Peptidabhängigkeit
von Interferon-γ-Abscheidung
verwendet. Nach Inkubation bei 37°C
in 5% CO2 für 12–18 Stunden wurden die Platten
sechsmal mit PBS und Wasser gewaschen. Die Reaktionsräume wurden
dann für
3 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 1 μg/ml biotinyliertem monoklonalem
Anti-Maus-lnterferon-γ-Antikorper
XMG1.2 (Pharmingen, CA, USA) in PBS inkubiert.
-
Nach
weiteren Waschschritten mit PBS wurde eine 1 μg/ml Lösung von Streptavidin-alkalische
Phosphatase-Polymer (Sigma) für
2 Stunden bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Punkte wurden durch
Zugabe von 50 μl
alkalische Phosphatase-Konjugat-Substrat-Lösung (Biorad, Hercules, CA,
USA) entwickelt. Nach dem Erscheinen von Punkten wurde die Reaktion
durch Waschen mit Wasser gestoppt. Die Anzahl an Punkten wurde mit
Hilfe eines Stereomikroskops bestimmt.
-
ELISPOT-Tests
an den Schimpansen-Peripherblutlymphozyten wurden unter Verwendung
einer sehr ähnlichen
Methode durchgeführt,
wobei der Test und die Reagenzien verwendet wurden, die zur Detektion
von humanen CD8 T-Zellen entwickelt wurden (Mabtech, Stockholm).
-
CTL-Tests
-
CTL-Tests
wurden unter Verwendung von mit Chrom markierten Zielzellen, wie
angegeben, und mit kultivierten Maus-Milzzellen als Effektorzellen
durchgeführt,
wie von Allsopp et al. (1996) beschrieben. CTL-Tests unter Verwendung
von Schimpansen- oder Makaken-Zellen wurden durchgeführt, wie
es für
die Detektion von humanem CTL von Hill et al. (1992) beschrieben
ist, wobei EBV-transformierte autologe Schimpansen- oder Makaken-B-Zellinien
als Zielzellen verwendet wurden.
-
P. berghei-Exposition
-
Mäuse wurden
2000 (BALB/c) oder 200 (C57BL/6) Sporozoiten des Stammes P. berghei
ANKA in 200 μl
RPMI durch intravenöse
Inokulierung, wie beschrieben (Lanar et al., 1996) ausgesetzt. Diese
Sporozoiten wurden aus den Speicheldrüsen von Anopheles stephensi-Moskitos,
die bei 18°C
für 20–25 Tage
nach Verfüttern
an infizierte Mäuse
gehalten wurden, präpariert.
Malariainfektion im Blutstadium, welche ein Versagen der Immunisierung
anzeigte, wurde durch Beobachten des Erscheinens von Ringformen
von P. berghei in Giemsa-gefärbten
Blutausstrichen, die 5–12
Tage nach der Exposition genommen wurden, festgestellt.
-
P. falciparum-Exposition
-
Die
Schimpansen wurden 20.000 P. falciparum-Sporozoiten des NF54-Stammes,
der aus den Speicheldrüsen
von Anopheles gambiae-Moskitos präpariert worden waren, durch
intravenöse
Inokulierung unter Betäubung
ausgesetzt. Blutproben von diesen Schimpansen wurden täglich ab
dem Tag 5 nach der Exposition durch Mikroskopie und Parasitenkultur
untersucht, um das Auftreten geringer Mengen an P. falciparum-Parasiten
in dem peripheren Blut festzustellen.
-
P815-Tumor-Expositionen
-
Mäuse wurden
1 × 105 P815-Zellen in 200 μl PBS durch intravenöse Inokulierung
ausgesetzt. Das Überleben
der Tiere wurde überwacht.
-
Influenzavirus-Expositionen
-
Mäuse wurden
100 hämagglutinierenden
Einheiten (HA) von Influenzavirus A/PR/8/34 durch intranasale Inokulierung
ausgesetzt. Nach der Exposition wurden die Tiere täglich gewogen
und ihr Überleben
beobachtet.
-
Bestimmung
von peptidspezifischem CTL unter Verwendung von Tetrameren Tetramere
Komplexe, bestehend aus schwerer Kette von Mamu-A*01 und β2-Mikroglobulin wurden
hergestellt, wie es von Ogg et al. (1998) beschrieben ist. DNA,
welche den führungslosen
extrazellulären
Abschnitt der schweren Kette von Mamu-A*01-MHC-Klasse I codiert,
wurde mittels PCR von cDNA vervielfältigt unter Verwendung des
5'-Primers MamuNdeI:
5'-CCT GAC TCA GAC CAT
ATG GGC TCT CAC TCC ATG [SEQ ID NO: 74] und des 3'-Primers: 5'-GTG ATA AGC TTA
ACG ATG ATT CCA CAC CAT TTT CTG TGC ATC CAG AAT ATG ATG CAG GGA
TCC CTC CCA TCT CAG GGT GAG GGG C [SEQ ID NO: 75]. Der erstgenannte
Primer enthielt eine NdeI-Restriktionsschnittstelle, der letztgenannte
umfaßte
eine HindIII-Schnittstelle
und codierte das Substratpeptid für das Biotinylierungsenzym
BirA. PCR-Produkte wurden mit NdeI und HindIII verdaut und in die
gleichen Schnittstellen des Polylinkers des bakteriellen Expressionsvektors
pGMT7 ligiert. Das Rhesusaffengen, welches ein führungsloses β2-Mikroglobulin codiert,
wurde mittels PCR von einem cDNA-Klon vervielfältigt unter Verwendung der
Primer B2MBACK: 5'-TCA
GAC CAT ATG TCT CGC TCC GTG GCC [SEQ ID NO: 76] und B2MFOR: 5'-TCA GAC AAG CTT
TTA CAT GTC TCG ATC CCA C [SEQ ID NO: 77] und in gleicher Weise
in die NdeI- und HindIII-Schnittstellen von pGMT7 kloniert. Beide
Ketten wurden in dem E. coli-Stamm BL-21 exprimiert, von Einschlußkörpern gereinigt,
in der Gegenwart des Peptids CTPYDINQM [SEQ ID NO: 54] erneut gefaltet, unter
Verwendung des BirA-Enzyms (Avidity) biotinyliert und mit FPLC-
und MonoQ-Ionenaustauschersäulen gereinigt.
Die Menge an biotinylierten, erneut gefalteten MHC-Peptidkomplexen
wurde in einem ELISA-Test abgeschätzt, wobei monomere Komplexe
zuerst durch konformationssensitiven monoklonalen Antikörper W6/32
eingefangen und durch mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiertem
Streptavidin (Sigma), gefolgt von kolorimetrischem Substrat für AP, detektiert
wurden. Die Bildung von tetrameren Komplexen wurde durch Zugabe
von mit Phycoerythrin (PE) konjugiertem Streptavidin (ExtrAvidin;
Sigma) zu den erneut gefalteten, biotinylierten Monomeren in einem
molaren Verhältnis
von MHC-Peptid:PE-Streptavidin
von 4:1 induziert. Die Komplexe wurden in der Dunkelheit bei 4°C gelagert.
Diese Tetramere wurden dazu verwendet, die Häufigkeit von Mamu-A*01/gag-spezifischen
CD8+ T-Zellen in Peripherblutlymphozyten (PBL) von immunisierten
Makaken zu analysieren.
-
BEISPIEL 2
-
Immunogenizitätsstudien in Mäusen
-
Frühere Studien
der Induktion von CTL gegen Epitope in dem Circumsporozoit-(CS-)Protein
von Plasmodium berghei und Plasmodium yoelii haben variable Niveaus
an CTL- Induktion
bei verschiedenen Auslieferungssystemen gezeigt. Es wurde von teilweisem
Schutz mit Plasmid-DNA (Sedegah et al., 1994), Influenzavirus, verstärkt durch
replizierenden Vacciniavirus (Li et al., 1991), Adenovirus (Rodrigues
et al., 1997) und Teilchenauslieferungssystemen (Schodel et al.,
1994) berichtet. Intramuskuläre
Immunisierung von Mäusen mit
50 μg eines
Plasmids, welche das CS-Protein codiert, produzierte moderate Mengen
an CD8+-Zellen und CTL-Aktivität
in den Milzen dieser Mäuse
nach einer einzelnen Injektion (3, 4).
-
Zum
Vergleich wurden Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 5) intravenös mit 106 ffu/pfu rekombinanten Vacciniaviren verschiedener
Stämme
(WR, NYVAC und MVA), welche alle P. berghei CSP exprimieren, injiziert.
Die Häufigkeit
peptidspezifischer CD8+ T-Zellen wurde 10 Tage später in einem
ELISPOT-Test gemessen. MVA.PbCSP induzierte 181 ± 48, NYVAC 221 ± 27 und
WR 94 ± 19
(Mittelwert ± Standardabweichung) peptidspezifische
CD8+ T-Zellen pro 1 Million Splenozyten. Diese Ergebnisse zeigen,
daß bezüglich Replikation
beeinträchtigte
Vacciniaviren gegenüber
replizierenden Stämmen
in der Initialisierung einer CD8+ T-Zell-Antwort überraschenderweise
besser sind. Wir versuchten anschließend, diese moderaten CD8+ T-Zell-Antworten, die durch
Induzieren entweder mit Plasmid-DNA oder mit MVA unter Verwendung
homologer oder heterologer Vektoren induziert wurde, zu verstärken. Es
wurde eine niedrige Menge an CD8+ T-Zellen nach zwei Immunisierungen
mit CS-rekombinantem DNA-Impfstoff alleine, dem rekombinanten MVA-Impfstoff alleine
oder dem rekombinanten MVA, gefolgt von rekombinanter DNA, beobachtet
(3). Eine viel höhere Menge an CD8+ T-Zellen
wurde durch Verstärken
der durch DNA initialisierten Immunantwort mit rekombinantem MVA
beobachtet. In einem zweiten Experiment unter Verwendung von zehn
Mäusen
pro Gruppe wurde die erhöhte
Immunogenizität
der DNA/MVA-Abfolge bestätigt:
DNA/MVA 856 ± 201;
MVA/DNA 168 ± 72; MVA/MVA
345 ± 90;
DNA/DNA 92 ± 46.
Daher lieferte die Abfolge einer ersten Immunisierung mit einem
rekombinanten Plasmid, welches das CS-Protein codiert, gefolgt von
einer zweiten Immunisierung mit dem rekombinanten MVA-Virus die
höchsten
Niveaus an CD8+ T-Lymphozyten-Antwort
nach der Immunisierung.
-
3 zeigt
Malaria-CD8 T-Zell-ELISPOT-Daten nach verschiedenen Immunisierungsschemas.
Ergebnisse sind als die Anzahl peptidspezifischer T-Zellen pro 1
Million Splenozyten wiedergegeben. Mäuse wurden entweder mit der
PbCSP-Plasmid-DNA oder dem PbCSP-MVA-Virus oder Kombinationen der zwei, wie
es auf der X-Achse gezeigt ist, in Intervallen von zwei Wochen immunisiert,
und die Anzahl an Splenozyten, die für das pb9-Malariaepitop spezifisch
waren, wurde zwei Wochen nach der letzten Immunisierung untersucht.
Jeder Punkt repräsentiert
die Anzahl an punktbildenden Zellen (SFCs), die in einer einzelnen
Maus gemessen wurden. Die höchste
Menge an CD8+ T-Zellen wurde durch Initialisieren mit der Plasmid-DNA
und Verstärkung
mit dem rekombinanten MVA-Virus induziert. Dies war immunogener
als die umgekehrte Reihenfolge der Immunisierung (MVA/DNA), als
zwei DNA-Immunisierungen (DNA/DNA) oder als zwei MVA-Immunisierungen
(MVA/MVA). Es war auch immunogener als die gleichzeitig verabreichten
DNA- und MVA-Immunisierungen (DNA + MVA 2w), als eine DNA-Immunisierung
(DNA 4w) oder eine MVA-Immunisierung, die zu dem früheren oder
späteren
Zeitpunkt verabreicht wurde (MVA 2w und MVA 4w).
-
4 zeigt,
daß Malaria-CD8
T-Zell-ELISPOT und CTL-Mengen durch eine Immunisierung mit rekombinantem
MVA nach Initialisierung mit einer Plasmid-DNA, welche das gleiche
Antigen codiert, erheblich verstärkt
werden. A und C. CD8+ T-Zell-Antworten wurden in BALB/c-Mäusen unter Verwendung des γ-Interferon-ELISPOT-Tests
auf frischen Splenozyten, die für
18 Stunden mit dem Kd-beschränkten Peptid
SYIPSAEKI [SEQ ID NO: 67] aus P. berghei CSP und dem Ld-beschränkten Peptid
TPHPARIGL [SEQ ID NO: 69] aus E. coli β-Galaktosidase inkubiert worden
waren, gemessen. Es sei angemerkt, daß die ELISPOT-Werte auf einem logarithmischen
Maßstab
angegeben sind. B und D. Splenozyten aus den gleichen Mäusen wurden
auch in herkömmlichen 51Cr-Freisetzungstests bei einem Effektor:Ziel-Verhältnis von
100:1 nach sechs Tagen in vitro-Restimulierung mit den gleichen
Peptiden (1 μg/ml)
untersucht.
-
Die
Mäuse wurden
mit Plasmid-DNA immunisiert, welche entweder P. berghei CSP und
TRAP, PbCSP alleine, die Malariaepitopkassette, welche das P. berghei
CTL-Epitop (markiert mit pTH.M) enthielt, oder β-Galaktosidase exprimiert. ELISPOT-
und CTL-Mengen, die in Mäusen
23 Tage nach einer DNA-Immunisierung gemessen wurden, sind in A
bzw. B gezeigt. Die gleichen Tests wurden mit Tieren durchgeführt, die
zusätzlich 1 × 107 ffu rekombinantes MVA, welches das (die)
gleiche(n) Antigen(e) zwei Wochen nach der ersten Immunisierung
exprimierten, erhielten. Die ELISPOT- und CTL-Mengen in diesen Tieren
sind in C bzw. D gezeigt. Jeder Balken repräsentiert Daten von einem einzelnen
Tier.
-
Es
wurden auch Untersuchungen der Immunogenizität des Epitopstrangs HM durchgeführt, welcher sowohl
HIV- als auch Malariaepitope in Tandemanordnung enthält. Unter
Verwendung dieses Epitopstrangs wurden wiederum die höchsten Mengen
an CD8+ T-Zellen und CTL in der Milz erzeugt, wenn eine Immunisierung
mit DNA-Impfstoff, gefolgt von einer Immunisierung mit einem rekombinanten
MVA-Impfstoff angewendet wurde (Tabelle 4,
5). Tabelle
4 – Immunogenizität verschiedener
DNA/MVA-Kombinationen, bestimmt durch ELISPOT-Tests
Immunisierung
1 | Immunisierung
2 | HIV-Epitop | Malaria-Epitop |
DNA-HM | DNA-HM | 56 ± 26 | 4 ± 4 |
MVA-HM | MVA-HM | 786 ± 334 | 238 ± 106 |
MVA-HM | DNA-HM | 306 ± 78 | 58 ± 18 |
DNA-HM | MVA-HM | 1000 ± 487 | 748 ± 446 |
Keine | DNA-HM | 70 ± 60 | 100 ± 10 |
Keine | MVA-HM | 422 ± 128 | 212 ± 94 |
-
Tabelle
4 zeigt die Ergebnisse von ELISPOT-Tests, die durchgeführt wurden,
um die Mengen an spezifischen CD8+ T-Zellen auf HIV- und Malariaepitope
nach verschiedenen Immu nisierungsschemas mit Plasmid-DNA und MVA,
wie es angegeben ist, zu messen. Die Zahlen bedeuten punktbildende
Zellen pro 1 Million Splenozyten. Der HM-Epitopstrang ist in 2 erläutert. In
allen Fällen
wurden BALB/c-Mäuse
verwendet. Das Malariaepitop war pb9, wie in den
-
2 und 3.
Das HIV-Epitop war RGPGRAFVTI [SEQ ID NO: 51]. Die Immunisierungsdosen
betrugen 50 μg
Plasmid-DNA oder 107 fokusbildende Einheiten
(ffu) rekombinantes MVA. Alle Immunisierungen wurden intramuskulär durchgeführt. Das
Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug in allen Fällen von
14–21
Tagen.
-
5 zeigt
die CTL-Antworten, die in BALB/c-Mäusen auf Malaria- und HIV-Epitope
nach verschiedenen Immunisierungsschemas, welche Plasmid-DNA und
rekombinantes MVA verwendeten, induziert wurden. Mäuse wurden
intramuskulär
immunisiert, wie es in der Legende zu Tabelle 3 und unter Methoden
beschrieben ist. Hohe Mengen an CTL (> 30% spezifische Lyse bei Effektor/Ziel-Verhältnissen
von 25:1) wurden sowohl für das
Malaria- als auch das HIV-Epitop nur nach Initialisierung mit Plasmid-DNA
und Verstärkung
mit dem rekombinanten MVA beobachtet. Das in diesem Experiment verwendete
Antigen ist der HIV-Malaria-Epitopstrang. Das rekombinante MVA ist
als MVA.HM bezeichnet und die Plasmid-DNA, welche diesen Epitopstrang
exprimiert, ist als pTH.HM bezeichnet. Ausmaße an spezifischer Lyse bei
verschiedenen Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen
sind gezeigt. Diese wurden nach 5 Tagen in vitro-Restimulierung
von Splenozyten mit den zwei Peptiden pb9 und RGPGRAFVTI [SEQ ID
NO: 51] bestimmt.
-
Ein
Vergleich vieler Auslieferungssysteme für die Induktion von CTL wurde
von Allsopp et al. (1996) beschrieben. Rekombinante Ty-Virus-artige
Teilchen (TyVLPs) und Malariapeptide mit Lipidschwanz lieferten beide
eine gute CTL-Induktion, aber Ty-VLPs waren dahingehend besser,
daß sie
nur eine einzelne immunisierende Dosis für eine gute CTL-Induktion benötigten.
Jedoch konnten, wie es hierin gezeigt ist, sogar zwei Dosen Ty-Partikel
keinen signifikanten Schutz gegen eine Sporozoitenexposition induzieren
(Tabelle 7, Zeile 1). Immunisierung mit einem rekombinanten, modifizierten
Vaccinia-Ankara-Virus, welches das Circumsporozoitenprotein von
P. berghei codierte, erzeugte auch gute Mengen an CTL. Jedoch erzielt
man ein viel höheres Niveau
an CD8+ T-Zell-Antwort durch eine erste Immunisierung mit dem Ty-VLP,
gefolgt von einer zweiten Immunisierung mit dem MVA-CS-Impfstoff
(Tabelle 5). Tabelle
5 – Immunogenizität verschiedener
Ty-VLP/MVA-Kombinationen, bestimmt durch ELISPOT- und CTL-Tests
Immunisierung
1 | Immunisierung
2 | ELISPOT
Nr. | %
spezifische Lyse |
Ty-CABDH | Ty-CABDH | 75 | 15 |
MVA.PbSCP | MVA.PbCSP | 38 | 35 |
Ty-CABDH | MVA.PbCSP | 225 | 42 |
Ty-CABDH | MVA.
HM | 1930 | nd |
-
Tabelle
5: Ergebnisse von ELISPOT- und CTL-Tests, durchgeführt zur
Messung der Mengen an spezifischen CD8+ T-Zellen auf das Malariaepitop
pb9 gemäß verschiedenen
Immunisierungsschemas mit Ty-VLPs und rekombinantem MVA-Virus, wie
angegeben. Die CTL- und ELISPOT-Daten stammen aus verschiedenen
Experimenten. Die ELISPOT-Mengen (Punkte pro 1 Million Splenozyten)
werden an nicht-restimulierten Zellen und die CTL-Aktivität, angegeben
als spezifische Lyse bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 40:1,
an Zellen, die mit pb9-Peptid in vitro für 5–7 Tage restimuliert wurden,
gemessen. Beide repräsentieren Mittelwertmengen
von drei Mäusen.
In allen Fällen
wurden BALB/c-Mäuse
verwendet. Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg für Ty-VLP oder 107 ffu
(focibildende Einheiten) rekombinantes MVA. Alle Immunisierungen wurden
intramuskulär
durchgeführt.
Das Intervall zwischen Immunisierungen 1 und 2 betrug 14–21 Tage. MVA.HM
umfaßt
die Kassetten CAB.
-
Initialisierung einer Immunantwort mit
DNA, verabreicht mittels einer Genpistole, und Verstärkung mit
rekombinantem MVA
-
Immunogenizität und Exposition
-
Die
Verwendung einer Genpistole zur intradermalen Verabreichung von
Plasmid-DNA und die Initialisierung einer Immunantwort dabei, welche
mit rekombinantem MVA verstärkt
werden konnte, wurde untersucht. Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden
nach dem folgenden Schema immunisiert:
- I) Drei
Genpistolen-Immunisierungen mit pTH.PbCSP (4 mg pro Immunisierung)
in Intervallen von zwei Wochen;
- II) zwei Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von MVA iv. zwei
Wochen später;
- III) eine intramuskuläre
DNA-Immunisierung, gefolgt von MVA iv. zwei Wochen später.
-
Die
Immunogenizität
der drei Immunisierungsschemas wurde unter Verwendung des ELISPOT-Tests analysiert.
Die höchste
Häufigkeit
spezifischer T-Zellen wurde mit zwei Genpistolen-Immunisierungen,
gefolgt von einer Verstärkung
mit MVA iv., und mit der intramuskulären DNA-Injektion, gefolgt
von einer Verstärkung mit
MVA iv., beobachtet (6).
-
6 zeigt
die Ergebnisse von ELISPOT-Tests, durchgeführt zur Messung der Mengen
an spezifischen CD8+ T-Zellen auf das Malariaepitop pb9 nach verschiedenen
Immunisierungsschemas. Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 3) wurden immunisiert,
wie es angegeben ist (g. g. = Genpistole). Die Zeit zwischen allen Immunisierungen
betrug 14 Tage. ELISPOT-Tests wurden zwei Wochen nach der letzten
Immunisierung durchgeführt.
-
CTL-Induktion auf das gleiche Antigen
in verschiedenen Mäusestämmen
-
Um
die Frage anzusprechen, ob die oben in BALB/c-Mäusen beschriebene Verstärkungswirkung
mit zwei CTL-Epitopen SYIPSAEKI [SEQ ID NO: 67], abgeleitet von
P. berghei CSP, und RGPGRAFVTI [SEQ ID NO: 68], abgeleitet von HIV,
ein universelles Phänomen
ist, wurden zwei Sätze
von Experimenten durchgeführt.
CTL-Antworten auf das Influenza-Nukleoprotein
wurden in fünf
Inzucht-Mausstämmen
untersucht. In einem ersten Experiment wurden drei veröffentlichte
Maus-CTL-Epitope, abgeleitet von dem Influenza-Nukleoprotein, untersucht
(siehe Tabelle 3). Es wurden Mäuse
von drei verschiedenen H-2-Haplotypen, BALB/c und DBA/2 (H-2d), C57BL/6 und 129 (H-2b),
CBA/J (H-2k) verwendet. Ein Satz von Tieren
wurde zweimal in Intervallen von zwei Wochen mit dem Plasmid V1J-NP,
welches das Influenza-Nukleoprotein
codiert, immunisiert. Ein weiterer Satz identischer Tiere wurde
mit V1J-NP initialisiert und zwei Wochen später intravenös mit 106 ffu von MVA.NP, welches das Influenzavirus
NP exprimiert, verstärkt.
Die Mengen an CTL in einzelnen Mäusen wurden
in einem 51Cr-Freisetzungstest mit durch Peptid restimulierten
Splenozyten bestimmt. Wie es in 7 gezeigt
ist, induzierte das Immunisierungsschema der DNA-Initialisierung/MVA-Verstärkung höhere Niveaus an
Lyse in allen der analysierten Mäusestämme und
ist gegenüber
zwei DNA-Injektionen besser.
-
7 zeigt
die CTL-Antworten gegen Influenza NP in verschiedenen Mäusestämmen. Mäuse von
verschiedenen Stämmen
wurden zweimal im Abstand von zwei Wochen mit einem DNA-Impfstoff
V1J-NP, welcher das Influenza-Nukleoprotein codiert, immunisiert
(offene Kreise) oder mit dem gleichen DNA-Impfstoff initialisiert
und zwei Wochen später
mit rekombinantem MVA, welches Influenzavirus-Nukleoprotein exprimiert, verstärkt (ausgefüllte Kreise).
Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Splenozyten mit
den jeweiligen Peptiden in vitro restimuliert (Tabelle 3). Die CTL-Aktivität wurde
in einem Standard 51Cr-Freisetzungstest
mit MHC Klasse I-kompatiblen Zielzellen bestimmt.
-
HCTL-Induktion auf verschiedene Antigene
in verschiedenen Mäusestämmen
-
Die
Wirkung von MVA-Verstärkung
auf mit Plasmid-DNA initialisierte Immunantworten wurde unter Verwendung
verschiedener Antigene und verschiedener Inzucht-Mäusestämme weiter
untersucht. Mäuse
verschiedener Stämme
wurden mit verschiedenen Antigenen unter Verwendung von zwei DNA-Immunisierungen immunisiert
und mit DNA/MVA-Immunisierungen verglichen. Die verwendeten Antigene
waren E. coli-Galaktosidase, der Malaria/HIV-Epitopstrang, ein Maus-Tumor-Epitopstrang
und P. falciparum-TRAP. Verglichen mit zwei DNA-Immunisierungen, induzierte das Schema
DNA-Initialisierung/MVA-Verstärkung
höhere
Niveaus an CTL in sämtlichen
der getesteten verschiedenen Mausstämme und Antigenkombinationen
(8).
-
8 zeigt
CTL-Antworten gegen verschiedene Antigene, welche in verschiedenen
Inzucht-Mausstämmen
induziert wurden. Mäuse
wurden mit zwei DNA-Impfstoffimmunisierungen im Abstand von zwei
Wochen immunisiert (offene Kreise) oder mit einem DNA-Impfstoff
initialisiert und zwei Wochen später
mit einem rekombinanten MVA, welches das gleiche Antigen exprimierte,
verstärkt
(ausgefüllte
Kreise). Die Stämme
und Antigene waren: C57BL/6; P. falcipa rum-TRAP in A. DBA/2; E.
coli-β-Galaktosidase
in B. BALB/c; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen Malariapeptid (pb9)
in C. DBA/2; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen pb9 in D. BALB/c; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen
HIV-Peptid in E. DBA/2; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen
HIV-Peptid in F. BALB/c; Tumorepitopstrang-CTL-Aktivität gegen
von P1A abgeleitetes Peptid in G. DBA/2; Tumorepitopstrang-CTL-Aktivität gegen
von P1A abgeleitetes Peptid in H. Sequenzen der Peptidepitope sind
in Tabelle 3 gezeigt. Jede Kurve zeigt die Daten für eine einzelne
Maus.
-
Sporozoiten können wirksam eine Immunantwort
initialisieren, die durch MVA verstärkbar ist
-
Menschen,
die in bezüglich
Malaria endemischen Gebieten leben, sind kontinuierlich Sporozoitinokulierungen
ausgesetzt. Malariaspezifisches CTL findet man in diesen natürlich exponierten
Individuen in niedrigen Mengen. Um die Frage anzusprechen, ob niedrige
Mengen an sporozoitinduzierten CTL-Antworten durch MVA verstärkt werden
können,
wurden BALB/c-Mäuse mit
(zur Verhinderung einer Malariainfektion) bestrahlten P. berghei-Sporozoiten
immunisiert und mit MVA verstärkt.
Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Splenozyten
restimuliert und auf lytische Aktivität getestet. Zwei Injektionen
mit 50 oder 300 + 500 Sporozoiten induzierten sehr niedrige oder
nicht detektierbare Niveaus an Lyse. Verstärkung mit MVA induzierte hohe
Mengen an peptidspezifischem CTL. MVA alleine induzierte nur mäßige Niveaus
an Lyse (9).
-
9 zeigt,
daß sporozoiteninduzierte
CTL-Antworten durch MVA erheblich verstärkt werden. Mäuse wurden
mit zwei geringen Dosen (50 + 50) an bestrahlten Sporozoiten in
A immunisiert, zwei hohen Dosen (300 + 500) an Sporozoiten in B;
die Mäuse
wurden mit MVA.PbCSP verstärkt
nach Sporozoiteninitialisierung mit geringer Dosis in D; Sporozoiteninitialisierung
mit hoher Dosis in E. CTL-Antworten nach Immunisierung mit MVA.PbCSP
sind in C gezeigt.
-
Rekombinante Adenoviren als Initialisierungsmittel
-
Das
Initialisierung-Verstärkung-Immunisierungsschema
wurde beispielhaft dargestellt, wobei Plasmid-DNA und rekombinantes
Ty-VLP als Initialisierungsmittel verwendet wurden. Hier wird ein
Beispiel angegeben, bei dem nichtreplizierende Adenoviren als das
Initialisierungsmittel verwendet werden. Es wurde bezüglich Replikation
beeinträchtigtes,
rekombinantes Adenovirus verwendet, welches E. coli-β-Galaktosidase (Adeno-GAL)
exprimiert. Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden
mit Plasmid-DNA immunisiert, gefolgt von MVA, oder mit Adenovirus,
gefolgt von MVA. Alle verwendeten Antigen-Verabreichungsschemas
codierten E. coli-β-Galaktosidase.
Initialisierung einer CTL-Antwort mit Plasmid-DNA oder Adenovirus
und Verstärkung
mit MVA induziert ähnliche
Niveaus an CTL (10).
-
10 zeigt
CTL-Antworten, die durch Plasmid-DNA oder rekombinantes Adenovirus
initialisiert und mit MVA verstärkt
wurden. Gruppen von BALB/c-Mäusen
(n = 3) wurden mit Plasmid-DNA A oder rekombinantem Adenovirus,
welches β-Galaktosidase
exprimiert, B, initialisiert. Plasmid-DNA wurde intramuskulär verabreicht,
MVA intravenös
und Adenovirus intradermal. Splenozyten wurden mit dem Peptid TPHPARIGL
[SEQ ID NO: 69] zwei Wochen nach der letzten Immunisierung restimuliert.
CTL-Aktivität
wurde mit peptidgepulsten P815-Zellen getestet.
-
Immunogenizität des DNA-Initialisierung/Vaccinia-Verstärkung-Schemas
hängt von
der Replikationskompetenz des verwendeten Vaccinia-Virusstammes
ab
-
Die
Initialisierungs-Verstärkungs-Strategie
wurde unter Verwendung verschiedener Stämme rekombinanter Vacciniaviren
getestet, um zu bestimmen, ob die verschiedenen Stämme mit
Stämmen,
die in ihrer Replikationskompetenz voneinander abweichen, sich bezüglich ihrer
Fähigkeit
unterscheiden, eine DNA-initialisierte CTL-Antwort zu verstärken. Verstärkung mit
bezüglich
Replikation beeinträchtigten
rekombinanten Vacciniaviren, wie MVA und NYVAC, führten zu
der Induktion stärkerer
CTL-Antworten im Vergleich zu CTL-Antworten nach einer Verstärkung mit
der gleichen Dosis von replikationskompetentem WR-Vacciniavirus (11).
-
11 zeigt
CTL-Antworten in BALB/c-Mäusen,
die mit Plasmid-DNA initialisiert wurden, gefolgt von Verstärkung mit
verschiedenen rekombinanten Vacciniaviren. Tiere wurden mit 50 μg/Maus pTH.PbCSP
im. initialisiert und zwei Wochen später mit verschiedenen Stämmen rekombinanter
Vacciniaviren (106 pfu pro Maus iv.), welche
PbCSP exprimieren, verstärkt.
Die verschiedenen rekombinanten Vacciniavirusstämme waren MVA in A, NYVAC in
B und WR in C. Die Überlegenheit
von bezüglich
Replikation beeinträchtigen
Vacciniastämmen
gegenüber
replizierenden Stämmen
wurde in einem weiteren Experiment gefunden. Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 6) wurden mit 50 μg/Tier pSG2.PbCSP
(im.) initialisiert und 10 Tage später iv. mit 106 ffu/pfu
rekombinantem MVA, NYVAC und WR, welche PbCSP exprimierten, verstärkt. Die
Häufigkeiten
peptidspezifischer CD8+ T-Zellen wurden unter Verwendung. des ELISPOT-Tests
bestimmt. Die Häufigkeiten
waren: MVA 1103 ± 438,
NYVAC 826 ± 249
und WR 468 ± 135.
Somit wurde sowohl unter Verwendung der CTL-Tests als auch der ELISPOT-Tests
als ein Maß für CD8 T-Zell-Immunogenizität eine überraschende,
erheblich höhere
Immunogenizität
der bezüglich
Replikation beeinträchtigten
Vacciniastämme
im Vergleich zu dem replikationskompetenten Stamm beobachtet.
-
Die Verwendung rekombinanter Kanarienvogel-
oder Geflügelpockenviren
zur Verstärkung
von CD8+ T-Zell-Antworten
-
Rekombinantes
Kanarienvogelpockenvirus (rCPV) oder Geflügelpockenvirus (rFVP) werden
unter Verwendung zuvor beschriebener Transportervektoren hergestellt
(Taylor et al., Virology, 1992, 187: 321–328 und Taylor et al., Vaccine,
1988, 6: 504–508).
Die Strategie für
diese Transportervektoren besteht darin, das Gen einzusetzen, welches
das interessierende Protein codiert und welchem ein vacciniaspezifischer
Promotor zwischen zwei flankierenden Bereichen vorangestellt ist,
welche Sequenzen umfassen, die von dem CPV- oder FPV-Genom abgeleitet
sind. Diese flankierenden Sequenzen sind so ausgewählt, daß eine Insertion
in wesentliche virale Gene verhindert wird. Rekombinantes CPV oder
FPV wird durch in vivo-Rekombination in permissiven Vogelzellinien,
d. h. primären
Hühnerembryofibroblasten,
erzeugt. Jede Proteinsequenz von Antigenen oder Epitopsträngen kann
unter Verwendung von Geflügelpocken-
oder Kanarienvogelpockenvirus exprimiert werden. Rekombinantes CPV
oder FPV ist gekennzeichnet durch Expression des interessierenden Proteins
unter Verwendung antigenspezifischer Antikörper oder unter Einschluß eines
Antikörperepitops
in das rekombinante Gen. Rekombinante Viren werden auf primären CEF
gezüchtet.
Eine Immunantwort wird unter Verwendung von Plasmid-DNA initialisiert,
wie es in Material und Methoden beschrieben ist. Diese durch Plasmid-DNA
initialisierte Immunantwort wird verstärkt, wobei 10 ffu/pfu rCPV
oder rFPV, die intravenös,
intradermal oder intramuskulär
inokuliert werden, verwendet werden. CD8+ T-Zell-Antworten werden
erfaßt,
und Expositionen werden durchgeführt,
wie es hierin beschrieben ist.
-
BEISPIEL 3
-
Malariaexpositionsstudien in Mäusen
-
Zur
Untersuchung der Schutzwirkung der induzierten Niveaus an CD8+ T-Zell-Antwort
wurden immunisierte BALB/c- oder C576L/6-Mäuse durch intravenöse Injektion
2000 oder 200 P. berghei-Sporozoiten ausgesetzt. Dies führt zur
Infektion von Leberzellen durch die Sporozoiten. Jedoch werden bei
Vorhandensein einer ausreichend starken T-Lymphozyten-Antwort gegen
den intrahepatischen Parasiten keine überlebensfähigen Parasiten die Leber verlassen,
und es werden keine Parasiten im Blutstadium feststellbar sein.
Blutfilme von exponierten Mäusen
wurden daher 5–12
Tage nach der Exposition durch Mikroskopie auf Parasiten untersucht.
-
BALB/c-Mäuse, die
zweimal mit einem Gemisch aus zwei Plasmid-DNAs immunisiert worden
waren, welche das CS-Protein bzw. das TRAP-Antigen von P. berghei
codierten, waren nicht gegen Sporozoitenexposition geschützt. Mäuse, die
zweimal mit einem Gemisch aus rekombinanten MVA-Viren immunisiert
worden waren, welche die gleichen zwei Antigene codierten, waren
nicht gegen eine Sporozoitenexposition geschützt. Mäuse, die zuerst mit den zwei
rekombinanten MVAs und zum zweiten mit den zwei rekombinanten Plasmiden immunisiert
worden waren, waren ebenfalls nicht gegen Sporozoitenexposition
geschützt.
Jedoch waren alle 15 Mäuse,
die zuerst mit den zwei Plasmid-DNAs und zum zweiten mit den zwei
rekombinanten MVA-Viren immunisiert worden waren, vollständig resistent
gegen Sporozoitenexposition (Tabelle 6A und B).
-
Zur
Untersuchung, ob der beobachtete Schutz auf eine Immunantwort gegen
das CS-Antigen oder
gegen TRAP oder gegen beides zurückzuführen war,
wurden Gruppen von Mäusen
anschließend
mit jedem Antigen separat immunisiert (Tabelle 6B). Alle 10 Mäuse, die
zuerst mit der CS-Plasmid-DNA und zum zweiten mit dem CS-MVA-Virus
immunisiert worden waren, waren vollständig gegen Sporozoitenexposition
geschützt. Vierzehn
von 16 Mäusen,
die zuerst mit dem TRAP-Plasmid-DNA-Impfstoff und zum zweiten mit
dem TRAP-MVA-Virus immunisiert worden waren, waren gegen Sporozoitenexposition
geschützt.
Daher ist das CS-Antigen alleine vollständig schützend, wenn das oben genannte
Immunisierungsschema angewendet wird, und das TRAP-Antigen hat bei
dem gleichen Schema eine erhebliche Schutzwirkung.
-
Die
gute Korrelation zwischen dem induzierten Niveau an CD8+ T-Lymphozyten-Antwort
und dem Ausmaß an
beobachtetem Schutz legt in erheblichem Maße nahe, daß die CD8+-Antwort für den beobachteten Schutz verantwortlich
ist. In früheren
angenommenen Transferexperimenten wurde gezeigt, daß CD8+ T-Lymphozyten-Klone
gegen das Haupt-CD8+ T-Zell-Epitop
in dem P. berghei-CS-Protein gegen Sporozoitenexposition schützen kann.
Zur Bestimmung, ob der induzierte Schutz tatsächlich durch CD8+ T-Zellen
gegen dieses Epitop vermittelt worden war, verwendeten wir anschließend eine
Plasmid-DNA und ein rekombinantes MVA, welche nur diese neun Aminosäuren lange
Sequenz von P. berghei als einen Teil eines Stranges von Epitopen
codierten (Tabelle 6B). (Alle anderen Epitope stammten von anderen
Mikroorganismen als P. berghei.) Immunisierung von 10 Mäusen zuerst
mit einem Plasmid, welches solch einen Epitopstrang codierte, und zum
zweiten mit einem rekombinanten MVA, welches auch einen Epitopstrang
mit dem P. berghei-CTL-Epitop codierte, führte zu vollständigem Schutz
vor Sporozoitenexposition (Tabelle 6B). Daher muß die induzierte schützende Immunantwort
die CTL-Antwort sein, welche auf diese Nonamer-Peptidsequenz gerichtet
ist. Tabelle
6 – Ergebnisse
von Mäuseexpositionsexperimenten
unter Verwendung verschiedener Kombinationen von DNA- und MVA-Impfstoff
Immunisierung
1 | Immunisierung
2 | Anz.
infizierte/Anz. exponierte | %
Schutz |
A. verwendete
Antigene: PbCSP + PbTRAP |
DNA | DNA | 5/5 | 0% |
MVA | MVA | 9/10 | 10% |
DNA | MVA | 0/5 | 100% |
MVA | DNA | 5/5 | 0% |
Mit β-Galaktosidase
immunisierte Kontrollmäuse |
DNA | DNA | 5/5 | 0% |
MVA | MVA | 5/5 | 0% |
DNA | MVA | 5/5 | 0% |
MVA | DNA | 5/5 | 0% |
B. |
DNA
(CSP + TRAP) | MVA
(CSP + TRAP) | 0/10 | 100% |
DNA
(CSP) | MVA
(CSP) | 0/10 | 100% |
DNA
(TRAP | MVA
(TRAP) | 2/16 | 88% |
DNA
(Epitop) | MVA
(Epitop) | 0/11 | 100% |
DNA
(beta-gal) | MVA
(beta-gal) | 6/7 | 14% |
keine | keine | 9/10 | 10% |
-
Tabelle
6 Ergebnisse von zwei Expositionsexperimenten (A und B) unter Verwendung
verschiedener Immunisierungsschemas mit Plasmid-DNA und MVA, wie
angegeben. In allen Fällen
wurden BALB/c-Mäuse verwendet.
Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg Plasmid-DNA oder 106 ffu rekombinantes MVA. Das Intervall zwischen
den Immunisierungen 1 und 2 betrug in allen Fällen 14–21 Tage. Expositionen wurden
18–29 Tage
nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion von 2000 P. berghei
Sporozoiten durchgeführt,
und Blutfilme wurden 5, 8 und 10 nach der Exposition untersucht.
CSP und TRAP bedeuten das gesamte P. berghei-Antigen, und "Epitop" bedeutet die in
Tabelle 1 gezeigten Kassetten von Epitopen, welche nur ein einzelnes P.
berghei-Kd-beschränktes Nonamer-CTL-Epitop enthalten.
Man beachte, daß Immunisierung
in Experiment B mit dem Epitopstrang alleine 100% Schutz liefert.
-
Mäuse, die
zweimal mit pb9 codierenden rekombinanten Ty-VLPs immunisiert wurden,
waren vollständig
empfänglich
für eine
Infektion. In gleicher Weise waren Mäuse, die zweimal mit dem das
vollständige CS-Protein
codierenden rekombinanten MVA immunisiert wurden, vollständig empfänglich für eine Infektion. Jedoch
zeigten die Mäuse,
die einmal mit dem Ty-VLP und anschließend einmal mit dem rekombinanten
MVA immunisiert wurden, eine 85%-ige Verringerung des Auftretens
von Malaria, wenn mit das CS-Protein der vollen Länge exprimierendem
MVA verstärkt
wurde, und 95%, wenn zur Verstärkung
das MVA verwendet wurde, welches den HM-Epitopstrang exprimiert,
der pb9 umfaßt
(Tabelle 7). Tabelle
7 – Ergebnisse
von Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener Immunisierungsschemas
mit Ty-VLPs und MVA
Immunisierung
1 | Immunisierung
2 | Anz.
infizierte/Anz. exponierte | %
Schutz |
Ty-CABDHFE | Ty-CABDHFE | 7/8 | 13% |
Ty-CABDH | MVA.PbCSP | 2/13 | 85% |
Ty-CABDHFE | MVA-NP | 5/5 | 0% |
MVA.PbCSP | MVA.PbCSP | 6/6 | 0% |
MVA.HM | Ty-CABDHFE | 14/14 | 0% |
Ty-CABDHFE | MVA.HM | 1/21 | 95% |
keine | MVA.HM | 8/8 | 0% |
keine | keine | 11/12 | 9% |
-
Tabelle
7 Ergebnisse von Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener
Immunisierungsschemas mit Ty-VLPs und MVA, wie angegeben. In allen
Fällen
wurden BALB/c-Mäuse verwendet.
Immunisierungen wurden mit 50 μg
Ty-VIP oder 107 ffu rekombinantem MVA, welche
intravenös
verabreicht wurden, durchgeführt.
Das Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug in allen
Fällen
14–21
Tage. Expositionen wurden 18–29
Tage nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion von 2000
P. berghei-Sporozoiten durchgeführt,
und Blutfilme wurden 5, 8 und 10 Tage nach der Exposition untersucht.
CSP bedeutet das gesamte P. berghei-Antigen. Ty-VLPs trug die Epitopkassetten
CABDH oder CABDHFE, wie es in Tabelle 1 beschrieben ist. MVA.HM
umfaßt
die Kassetten CAB.
-
Zur
Bestimmung, ob die erhöhte
Immunogenizität
und Schutzwirkung, die bei Verstärkung
mit einem rekombinanten MVA beobachtet wurden, für diesen bestimmten Vacciniavirusstamm
einzigartig ist oder von anderen rekombinanten Vaccinias geteilt
wird, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Mäuse wurden mit dem DNA-Impfstoff,
welcher P. berghei-CS-Protein codiert, immunisiert und verstärkt mit
entweder (i) rekombinantem MVA, welches dieses Antigen codiert;
(ii) rekombinantem Wildtyp-Vacciniavirus (Western Reverse-Stamm),
welches das gleiche Antigen codiert (Satchidanandam et al., 1991),
oder (iii) rekombinantem NYVAC-(COPAK)Virus (Lanar et al., 1996),
welches das gleiche Malariaantigen codiert. Das höchste Ausmaß an Schutz
wurde bei Verstärkung
mit der MVA-Rekombinanten beobachtet, 80% (Tabelle 8). Ein sehr
niedriges Niveau an Schutz (10%) wurde durch Verstärkung mit
dem rekombinanten Wildtyp-Vacciniavirus beobachtet, und ein signifikantes
Niveau an Schutz von 60% durch Verstärkung mit der NYVAC-Rekombinanten.
Daher induziert das Initialisierungs-Verstärkungs-Schema, welches wir
beschreiben, eine Schutzwirkung mit jedem nichtreplizierenden Vacciniavirusstamm.
-
Sowohl
die MVA-Rekombinante als auch NYVAC waren signifikant (P < 0,05 für beide)
besser als die Rekombinante des WR-Stammes. Tabelle
8 – Ergebnisse
der Expositionsdaten für
DNA, verstärkt
mit verschiedenen Vacciniastamm-Rekombinanten
Immunisierung
1 | Immunisierung
2 | Anz.
infiziert/Anz. exponiert | %
Schutz |
CNA-beta
gal. | MVA.NP | 8/8 | 0% |
DNA-CSP | MVA-CSP | 2/10 | 80% |
DNA-CSP | WR-CSP | 9/10 | 10% |
DNA-CSP | NYVAC-CSP | 4/10 | 60% |
-
Tabelle
8 Ergebnisse eines Expositionsexperimentes unter Verwendung verschiedener
Immunisierungsschemas mit Plasmid-DNA und verschiedenen Vaccinia-Rekombinanten,
wie angegeben. In allen Fallen wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierungsdosen
betrugen 50 μg
Plasmid-DNA oder 106 ffu/pfu rekombinantes
MVA oder 104 ffu/pfu rekombinantes Wildtyp-(WR-)Vaccinia oder
106 ffu/pfu rekombinantes NYVAC. Weil der
WR-Stamm in dem Wirt repliziert und die anderen Stämme nicht,
wurde in diesem Experiment eine geringere Dosis an WR verwendet.
Das Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug 23 Tage. Expositionen
wurden 28 Tage nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion
von 2000 P. berghei-Sporozoiten
durchgeführt,
und Blutfilme wurden 7, 9 und 11 Tage nach der Exposition untersucht.
PbCSP bedeutet das gesamte P. berghei-Antigen und NP das Nukleoproteinantigen
von Influenzavirus (das als ein Kontrollantigen verwendet wurde).
Die erste Immunisierung der Mäuse
der Gruppe A erfolgte mit dem Plasmid-DNA-Vektor, welcher β-Galaktosidase,
aber kein Malariaantigen exprimierte.
-
In
einem weiteren Experiment, das in Tabelle 8 gezeigt ist, wurden
Mäuse mit
dem P. berghei-CS-Protein codierenden DNA-Impfstoff immunisiert
und verstärkt
mit entweder (i) rekombinantem MVA, welches dieses Antigen codiert;
(ii) rekombinantem WR-Vacciniavirus, welches das gleiche Antigen
codiert, oder (iii) rekombinantem NYVAC-(COPAK)Virus, welches das
gleiche Malariaantigen codiert, alle mit 10
6 ffu/pfu.
Ein hohes und statistisch signifikantes Ausmaß an Schutz wurde bei Verstärkung mit
rekombinantem NYVAC (80%) oder rekombinantem MVA (66%) beobachtet.
Ein niedriges und nicht signifikantes Ausmaß an Schutz (26%) wurde bei
Verstärkung
mit dem rekombinanten WR-Vacciniavirus beobachtet (Tabelle 9). MVA-
und NYVAC-Verstärkung lieferten
jeweils signifikant mehr Schutz als WR-Verstärkung (P = 0,03 bzw. P = 0,001).
Diese Daten unterstreichen erneut, daß nichtreplizierende Pockenvirenstämme bessere
Verstärkungsmittel
zur Induktion hoher Niveaus an Schutz sind. Tabelle 9 – Einfluß verschiedener rekombinanter
Vacciniastämme
auf den Schutz
Immunisierung
1 DANN | Immunisierung
2 | Anz.
infiziert/Anz. exponiert | %
Schutz |
CSP | MVA.PbCSP | 5/15 | 66 |
CSP | NYVAC.PbCSP | 2/15 | 80 |
CSP | WR.PbCSP | 11/15 | 26 |
β-Galaktosidase | MVA.NP | 8/8 | 0 |
-
Tabelle
9 Ergebnisse von Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener
Immunisierungsschemas mit Plasmid-DNA und bezüglich Replikation inkompetenten
Vaccinia-Rekombinanten
zur Verstärkungsimmunisierung.
In allen Fällen
wurden BALB/c-Mäuse
verwendet. Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg Plasmid-DNA oder 106 ffu/pfu rekombinantes MVA oder rekombinantes
Wildtyp-(WR-)Vaccinia oder rekombinantes NYVAC. Das Intervall zwischen
den Immunisierungen 1 und 2 betrug 23 Tage. Expositionen wurden
28 Tage nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion von 2000
P. berghei-Sporozoiten durchgeführt,
und Blutfilme wurden 7, 9 und 11 Tage nach der Exposition untersucht.
PbCSP bedeutet das gesamte P. berghei-Antigen und NP das Nukleoproteinantigen
von Influenzavirus (das als ein Kontrollantigen verwendet wurde).
Die Kontrollimmunisierung erfolgte mit einem Plasmid-DNA-Vektor,
welcher β-Galaktosidase
exprimierte, gefolgt von MVA.NP.
-
Alternative Wege zur Verstärkung von
Immunantworten mit rekombinantem MVA
-
Intravenöse Injektion
von rekombinantem MVA ist kein bevorzugter Weg zur Immunisierung
von Menschen und in Massenimmunisierungen nicht durchführbar. Daher
wurden verschiedene Wege der MVA-Verstärkung hinsichtlich ihrer Immunogenizität und Schutzwirkung
getestet.
-
Mäuse wurden
im. mit Plasmid-DNA initialisiert. Zwei Wochen später wurden
sie mit MVA verstärkt, welches über die
folgenden Wege verabreicht wurde: intravenös (iv.), subkutan (sc.), intraperitoneal
(ip.), intramuskulär
(im.) und intradermal (id.). Zwei Wochen nach dieser Verstärkung wurden
peptidspezifische CD8+ T-Zellen in einem ELISPOT-Test bestimmt.
Die effektivsten Wege, welche die höchsten Mengen induzierten, waren
iv. und id. Inokulierung von MVA. Die anderen Wege lieferten mäßige bis
schlechte Antworten (12).
-
12 zeigt
Häufigkeiten
von peptidspezifischen CD8+ T-Zellen nach verschiedenen Wegen der MVA-Verstärkung. Ergebnisse
sind als die Anzahl punktbildender Zellen (SFC) pro 1 Million Splenozyten
gezeigt. Mäuse
wurden mit Plasmid-DNA initialisiert und zwei Wochen später mit
MVA über
die angegebenen Wege verstärkt.
Die Anzahl an Splenozyten, die für
das Peptid SYIPSAEKI [SEQ ID NO: 67] spezifisch waren, wurde in
INF-γ-ELISPOT-Tests
zwei Wochen nach der letzten Immunisierung bestimmt. Jeder Balken
repräsentiert
den Mittelwert an SFCs von drei einzeln untersuchten Mäusen.
-
Verstärkung über den
iv. Weg wurde mit dem id. und im. Weg in einem Expositionsexperiment
verglichen. Der id. Weg lieferte hohe Ausmaße an Schutz (80% Schutz).
In der Gruppe von Tieren, die über
den im. Weg verstärkt
wurden, waren 50% der Tiere geschützt. Vollständiger Schutz wurde mit iv.
verabreichter MVA-Verstärkung
erzielt (Tabelle 10). Tabelle 10 – Einfluß des Weges der MVA-Verabreichung
auf die Schutzwirkung
Immunisierung
1 DANN | Immunisierung
2 MVA | Anz.
infiziert/Anz. exponiert | %
Schutz |
CSP | CSP
iv. | *0/20 | 100 |
CSP | CSP
id. | 2/10 | 80 |
CSP | CSP
im. | 5/10 | 50 |
Epitop | Epitop
iv. | 1/10 | 90 |
NP | NP
iv. | 10/10 | 0 |
- * kumulierte Daten aus zwei unabhängigen Experimenten
-
Tabelle
10 Ergebnisse aus Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener
Wege der MVA-Verstärkungsimmunisierung.
Tiere wurden durch intramuskuläre
Injektion von Plasmid-DNA
initialisiert und zwei Wochen später
mit dem angegebenen rekombinanten MVA (106 ffu/Maus),
welches über
die angegebenen Wege verabreicht wurde, verstärkt. Die Mäuse wurden 16 Tage nach der
letzten Immunisierung 2000 P. berghei-Sporozoiten ausgesetzt und
am Tag 8 und 10 nach der Exposition hinsichtlich Parasitenbefall
im Blutstadium durchmustert. Epitop bedeutet den Polypeptidstrang
HM.
-
Alternative Wege der DNA-Initialisierung:
Verwendung einer Genpistole zur Initialisierung peptidspezifischer CD8+
T-Zellen
-
Genpistolenverabreichung
wird ausführlich
z. B. bei Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 1993, 12: 791–797, und
bei Degano et al., Vaccine, 1998, 16: 394–398, beschrieben.
-
Die
bisher beschriebenen Maus-Malaria-Expositionsexperimente unter Verwendung
von Plasmid-DNA zur Initialisierung einer Immunantwort verwendeten
intramuskuläre
Injektion von Plasmid-DNA. Intradermale Verabreichung von Plasmid-DNA
unter Verwendung einer biolistischen Vorrichtung ist ein weiterer Weg
zur Initialisierung spezifischer CTL-Antworten. Plasmid-DNA wird auf Goldpartikel
aufgebracht und intradermal mit einer Genpistole verabreicht. Gruppen
von Mäusen
(n = 10) wurden dreimal in Intervallen von zwei Wochen mit der Genpistole
alleine (4 μg//Immunisierung)
immunisiert, zweimal mit der Genpistole, gefolgt von einer intravenösen MVA.PbCSP-Verstärkung immunisiert
oder intramuskulär
mit 50 μg
pTH.PbCSP immunisiert und zwei Wochen später mit MVA.PbCSP intravenös verstärkt. Zwei
Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere 2000 Sporozoiten
ausgesetzt, um die Schutzwirkung jedes Immunisierungsschemas zu untersuchen.
In der Gruppe, welche die intravenöse MVA-Verstärkung nach
zwei Genpistolen-Immunisierungen erhielten, entwickelte eines von
zehn Tieren Parasitenbefall im Blutstadium (90% Schutz). Vollständiger Schutz
wurde bei intramuskulärer
DNA-Initialisierung, gefolgt von iv. MVA-Verstärkung, beobachtet. Sieben von
10 Tieren, welche dreimal mit der Genpistole immunisiert wurden,
waren infiziert (30% Schutz) (Tabelle 11).
Immunisierung
1 DNA | Immunisierung
2 | Immunisierung
3 | Anz.
infiziert/Anz. exponiert | %
Schutz |
Genpistole
DNA | Genpistole
DNA | Genpistole
DNA | 7/10 | 30 |
Genpistole
DNA | Genpistole
DNA | MVA.PbCSP | 1/10 | 90 |
- | DNA
im. | MVA.PbCSP | 0/10 | 100 |
Natürlich | | | 10/10 | 0 |
-
Tabelle
11 Ergebnisse von Expositionsexperimenten, welche verschiedene Wege
der DNA-Initialisierung
vergleichen (intradermal mittels Genpistole gegenüber intramuskulärer Nadelinjektion).
Gruppen von BALB/c-Mäusen
(n = 10) wurden immunisiert, wie es angegeben ist. Jede Genpistolen-Immunisierung
verabreichte 4 μg
Plasmid-DNA intraepidermal. Für
im. Immunisierungen wurden 50 μg
Plasmid-DNA injiziert. 20 Tage nach der letzten Immunisierung wurden
die Mäuse
exponiert, wie es zuvor beschrieben ist.
-
Hochgradig empfängliche C57BL/6-Mäuse werden
geschützt
-
C57BL/6-Mäuse sind
sehr empfänglich
für P.
berghei-Sporozoitenexposition. C57BL/6-Mäuse
wurden unter Anwendung des DNA-MVA-Initialisierungs-Verstärkungs-Schemas
mit beiden präerythrozytischen
Antigenen PbCSP und PbTRAP immunisiert und entweder 200 oder 1000
infektiösen
Sporozoiten pro Maus ausgesetzt. (200 Sporozoiten entsprechen mehr
als der zweifachen Dosis, die zur Induktion einer Infektion in diesem
Stamm erforderlich ist.) Alle 10 Mäuse, die 200 Sporozoiten ausgesetzt
waren, zeigten sterile Immunität. Sogar
in der Gruppe, die 1000 Sporozoiten ausgesetzt waren, waren 60%
der Mäuse
geschützt
(Tabelle 12). Sämtliche
der natürlichen
C57BL/6-Mäuse
waren nach der Exposition infiziert. Tabelle
12 – Schutz
von C57BL/6-Mäusen
vor Sporozoitenexposition
| Anz.
infizierter Tiere/Anz. exponierter | %
Schutz |
1000
Sporozoiten | | |
DNA,
gefolgt von MVA | 4/10 | 60 |
Natürlich | 5/5 | 0 |
200
Sporozoiten | | |
DNA,
gefolgt von MVA | 0/10 | 100 |
Natürlich | 5/5 | 0 |
-
Tabelle
12 Ergebnisse eines Expositionsexperiments unter Verwendung von
C57BL/6-Mäusen. Tiere wurden
mit PbCSP und PbTRAP unter Verwendung der DNA, gefolgt von MVA in
einem Initialisierungs-Verstärkungs-Schema
immunisiert. Vierzehn Tage später
wurden die Mäuse
P. berghei-Sporozoiten ausgesetzt, wie es angegeben ist.
-
BEISPIEL 4
-
Schutzwirkung des DNA-Initialisierungs-/MVA-Verstärkungs-Schemas
in zwei weiteren Krankheitsmodellen in Mäusen
-
Nach
den Immunogenizitätsstudien
wurde die Schutzwirkung des DNA-Initialisierungs-MVA-Verstärkungs-Schemas in zwei zusätzlichen
Maus-Expositionsmodellen getestet. Die zwei Expositionsmodelle waren das
P815-Tumormodell und das Influenza A-Virus-Expositionsmodell. In
beiden Modellsystemen wurde gezeigt, daß CTL Schutz vermittelt.
-
P815-Tumorexpositionen:
-
Gruppen
(n = 10) von DBA/2-Mäusen
wurden mit einer Kombination aus DNA, gefolgt von MVA, welche einen
Tumorepitopstrang oder den HM-Epitopstrang exprimierten, immunisiert.
Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse intravenös 105 P815-Zellen ausgesetzt. Nach dieser Exposition
wurden die Mäuse
regelmäßig hinsichtlich
der Entwicklung von mit Tumor in Verbindung stehenden Anzeichen und
hinsichtlich Überleben
kontrolliert.
-
13 zeigt
die Überlebensrate
der zwei Gruppen von Mäusen.
Sechzig Tage nach der Exposition waren acht von zehn Mäusen in
der Gruppe, die mit dem Tumorepitopstrang immunisiert worden war,
am Leben. In der Gruppe, die mit dem HM-Epitopstrang immunisiert
worden war, überlebten
nur zwei Tiere. Dieses Ergebnis ist statistisch signifikant: 2/10
vs. 8/10 chi2 = 2,2. P = 0,007. Das Einsetzen
des Sterbens in den Gruppen von Tieren, die mit dem Tumorepitopstrang
immunisiert worden waren, ist im Vergleich zu den Gruppen, die mit
dem HM-Epitopstrang immunisiert worden waren, verzögert.
-
Influenzavirus-Expositionen:
-
Gruppen
von BALB/c-Mäusen
wurden mit drei Genpistolen-Immunisierungen mit Plasmid-DNA, zwei intramuskulären Plasmid-DNA-Injektionen,
einer im. DNA-Injektion, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv., oder
zwei Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv.
immunisiert. Plasmid-DNA und rekombinantes MVA exprimierten das
Influenzavirus-Nukleoprotein. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung
wurden die Mäuse
intranasal 100 HA von Influenza-A/PR/8/34-Virus ausgesetzt. Die
Tiere wurden nach der Exposition täglich hinsichtlich des Überlebens
kontrolliert.
-
Vollständiger Schutz
wurde in den folgenden Gruppen von Tieren beobachtet:
- • zwei
DNA-Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv.,
- • eine
im. DNA-Injektion, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv.,
- • zwei
im. DNA-Injektionen.
-
In
der Gruppe von Tieren, die dreimal mit der Genpistole immunisiert
worden waren, überlebten
71% der Tiere (5/7), und dieser Unterschied gegenüber der
Kontrollgruppe war statistisch nicht signifikant (P > 0,05). In der natürlichen
Gruppe überlebten
25% der Tiere (14), und diese Gruppe unterschied
sich signifikant (P < 0,05)
von den zwei vollständig
geschützten
Gruppen.
-
14 zeigt
Ergebnisse eines Influenzavirus-Expositionsexperiments. BALB/c-Mäuse wurden
immunisiert, wie es angegeben ist. GG = Genpistolen-Immunisierungen,
im. = intramuskuläre
Injektion, iv. = intravenöse
Injektion. Das Überleben
der Tiere wurde täglich
nach der Exposition kontrolliert.
-
In
einem zweiten Experiment wurden Gruppen von zehn BALB/c-Mäusen mit
MVA.NP iv. alleine, dreimal mit der Genpistole, zweimal mit der
Genpistole, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv. und zwei im. Injektionen
von V1J-NP, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung immunisiert. Zwei Wochen
nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse 100 HA-Einheiten Influenza-A/PR/8/34-Virus
ausgesetzt.
-
Vollständiger und
statistisch signifikanter Schutz wurde in den folgenden Gruppen
von Tieren beobachtet:
- • zwei Genpistolen-Immunisierungen,
gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung,
- • zwei
im. Injektionen von V1J-NP, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung.
-
In
der Gruppe, die einmal MVA.NP iv. erhielt, überlebten 30% (3 von 10) der
Tiere. In der Gruppe, die mit einem DNA-Impfstoff immunisiert worden
war, der mittels der Genpistole dreimal verabreicht worden war, waren
70% der Tiere geschützt,
aber dieser Schutz unterschied sich nicht signifikant von den natürlichen
Kontrollen. In diesem Expositionsexperiment überlebten 40% (4 von 10) der
natürlichen
Tiere die Exposition.
-
BEISPIEL 5
-
Immunogenizitätsstudien in nicht-menschlichen
Primaten
-
Immunogenizität und Schutzwirkung
des Initialisierungs-Verstärkungs-Schemas
in nichtmenschlichen Primaten
-
Um
zu zeigen, daß die
starke Immunogenizität
des DNA-Initialisierungs-/MVA-Verstärkungs-Schemas,
das in Mäusen
beobachtet wird, zu starker Immunogenizität in Primaten führt, wurde
das Schema in Makaken getestet. Der Impfstoff bestand aus einem
Strang von CTL-Epitopen,
die von HIV- und SIV-Sequenzen abgeleitet waren (2),
in Plasmid-DNA oder MVA, bezeichnet als DNA.H bzw. MVA.H. Die Verwendung
definierter CTL-Epitope in einem Polyepitopstrang erlaubt eine Untersuchung
hinsichtlich SIV-spezifischen CTL in Makaken. Aufgrund der MHC Klasse
I-Beschränkung
der antigenen Peptide wurden Makaken hinsichtlich ihres MHC Klasse
I-Haplotyps durchmustert und bezüglich
Mamu-A*01 positive Tiere wurden für die beschriebenen Experimente
ausgewählt.
-
Drei
Tiere (CYD, DI und DORIS) wurden nach diesem Immunisierungsschema
immunisiert:
Woche
0 | DNA
(8 μg, id.,
Genpistole) |
Woche
8 | DNA
(8 μg, id.,
Genpistole) |
Woche
17 | MVA
(5 × 108 pfu, id.) |
Woche | 22
MVA (5 × 108 pfu, id.) |
-
Blut
von jedem Tier wurde in den Wochen 0, 2, 5, 8, 10, 11, 17, 18, 19,
21, 22, 23, 24 und 25 des Experimentes abgenommen. Die Tiere wurden
hinsichtlich Induktion von CTL unter Anwendung von zwei verschiedenen
Methoden kontrolliert. PBMC, isoliert aus jeder Blutentnahme, wurden
in vitro mit einem Peptid, welches in dem Epitopstrang codiert wurde,
restimuliert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, autologe Peptid-beladene
Zielzellen in einem Chromfreisetzungs-Zytotoxizitätstest zu erkennen, getestet.
Zusätzlich
wurden frisch isolierte PBMC hinsichtlich antigenspezifischer CD8+
T-Zellen unter Verwendung von Tetrameren gefärbt.
-
Nach
zwei Genpistolen-Immunisierungen wurden unter Verwendung von Tetramerfärbung sehr
niedrige Mengen an CTL festgestellt (15). Zwei
Wochen nach der ersten MVA-Verstärkung entwickelten
alle drei Tiere peptidspezifische CTL, was durch Tetramerfärbung festgestellt
wurde (15). Dies wurde durch die Feststellung
mäßiger CTL-Antworten
nach in vitro-Restimulierung widergespiegelt (16,
Woche 19). Die zweite Verstärkung
mit MVA.H induzierte sehr hohe Mengen an antigenspezifischen CD8+
T-Zellen (15) und auch sehr hohe Mengen
an peptidspezifischen zytotoxischen T-Zellen (16,
Woche 23).
-
15 zeigt
eine Detektion von SIV-spezifischen, MHC Klasse I-beschränkten CD8+
T-Zellen unter Verwendung
von Tetrameren. Drei bezüglich
Mamu-A*01 positive Makaken wurden mit Plasmid-DNA (Genpistole) immunisiert,
gefolgt von MVA-Verstärkung,
wie es angegeben ist. Häufigkeiten
von bezüglich
Mamu-A*A01/CD8 doppelt positiven T-Zellen wurden nach FACS-Analyse identifiziert.
Jeder Balken repräsentiert den
Prozentsatz an CD8+ T-Zellen, die für das Mamu-A*01/gag-Epitop
spezifisch sind, bei dem angegebenen Zeitpunkt. Ein Prozent CD8
T-Zellen entspricht
etwa 5000/106 Peripherblutlymphozyten. Somit
sind die Mengen an epitopspezifischen CD8 T-Zellen in dem Peripherblut
dieser Makaken wenigstens so hoch wie die Mengen, die man in den
Milzen immunisierter und geschützter
Mäuse in
den Malariauntersuchungen beobachtet.
-
16 zeigt
eine CTL-Induktion in Makaken nach einer DNA/MVA-Immunisierung.
TBMC von drei verschiedenen Makaken (CYD, DI und DORIS) wurden in
den Wochen 18, 19 und 23 isoliert und mit dem Peptid CTPYDINQM [SEQ
ID NO: 54] in vitro restimuliert. Nach zwei Restimulierungen mit
dem Peptid CTPYDINQM [SEQ ID NO: 54] wurden die Kulturen hinsichtlich
ihrer lytischen Aktivität
auf peptidgepulste, autologe Zielzellen getestet. Es wurde starke
CTL-Aktivität beobachtet.
-
BEISPIEL 6
-
Immunogenizitäts- und Expositionsuntersuchungen
in Schimpansen
-
Um
zu zeigen, daß ein ähnliches
Schema einer anfänglichen
Immunisierung mit Plasmid-DNA
und einer anschließenden
Immunisierung mit rekombinantem MVA in höheren Primaten gegen Plasmodium
falciparum-Malaria wirksam sein kann, wurde eine Immunisierungs-
und Ex positionsuntersuchung mit zwei Schimpansen durchgeführt. Schimpanse
H1 erhielt eine anfängliche
Immunisierung mit 500 μg
eines Plasmids, das Plasmodium falciparum TRAP von dem CMV-Promotor
ohne Intron A exprimiert, CMV-TRAP. Schimpanse H2 erhielt die gleiche
Dosis CMV-LSA-1, welches den C-terminalen Abschnitt des LSA-1-Gens
von P. falciparum exprimiert. Beide Schimpansen erhielten drei weitere
Immunisierungen über
die nächsten
zwei Monate, jedoch mit drei Plasmiden bei jeder Immunisierung.
H1 erhielt CMV-TRAP, wie zuvor, plus pTH-TRAP, welches TRAP unter Verwendung
des CMV-Promotors mit Intron A exprimiert, was zu einem höheren Expressionsniveau führt. H1
erhielt auch RSV-LSA-1, welches den C-terminalen Abschnitt von LSA-1
unter dem RSV-Promotor exprimiert. H2 erhielt CMV-LSA-1, pTH-LSA-1
und RSV-TRAP bei den zweiten, dritten und vierten Immunisierungen.
Die Dosis betrug immer 500 μg
von jedem Plasmid.
-
Es
wurde anschließend
entdeckt, daß die
RSV-Plasmide die darin enthaltenen Antigene nicht exprimierten,
so daß H1
nur mit Plasmiden immunisiert wurde, die TRAP exprimierten, und
H2 mit Plasmiden, die LSA-1 exprimierten.
-
Zwischen
und nach diesen DNA-Immunisierungen wurden Tests auf zelluläre Immunantworten
zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, wobei der letzte Test
drei Monate nach der vierten DNA-Immunisierung durchgeführt wurde,
jedoch waren weder in ELISPOT-Tests noch in CTL-Tests hinsichtlich
CD8+ T-Zellen malariaspezifische T-Zellen feststellbar.
-
Beide
Tiere wurden anschließend
mit drei Dosen von 108 ffu eines rekombinanten
MVA-Virus, welches das
P. falciparum-TRAP-Antigen codierte, über einen Zeitraum von 6 Wochen
immunisiert. Unmittelbar vor und auch nach der dritten Immunisierung
mit rekombinantem MVA waren T-Zell-Antworten auf das TRAP-Antigen in
beiden Schimpansen unter Verwendung eines ELISPOT-Tests auf gesamtes
TRAP-Protein, gebunden an Latexperlen, feststellbar. Dieser Test
detektiert sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zell-Antworten. Hinsichtlich spezifischer
CD8+ T-Zell-Antworten
wurde mit einer Reihe von kurzen, 8–11 Aminosäuren langen Peptiden in beiden
immunisierten Schimpansen gesucht. Diese Analyse hinsichtlich CD8+
T-Zell-Antworten zeigte, daß CD8+
T-Zellen nur in dem Schimpansen H1 feststellbar waren. Das Zielepitop
dieser CD8+ T-Lymphozyten war
ein 11 Aminosäuren
langes Peptid von TRAP, tr57, mit der Sequenz KTASCGVWDEW [SEQ ID
NO: 78]. Diese CD8+ T-Zellen von H1 besaßen lytische Aktivität gegen
autologe Zielzellen, die mit dem tr57-Peptid gepulst waren, und
gegen autologe Zielzellen, die mit dem rekombinanten PbTRAP-MVA-Virus
infiziert waren. Eine hohe Vorläuferhäufigkeit
dieser spezifischen CD8+ T-Zellen von etwa 1 pro 500 Lymphozyten
wurde in dem Peripherblut dieses Schimpansen H1 unter Verwendung
eines ELISPOT-Tests zwei Monate nach der letzten MVA-Immunisierung
festgestellt. Es wurde keine spezifische CD8+ T-Zell-Antwort in
dem Schimpansen H2, welcher nicht mit einer TRAP exprimierenden
Plasmid-DNA initialisiert worden war, deutlich festgestellt.
-
Zwei
Monate nach der dritten PbTRAP-MVA-Immunisierung wurde eine Exposition
von H1 und H2 mit 20.000 Sporozoiten durchgeführt, einer Anzahl, von der
zuvor gefunden worden war, daß sie
7 Tage nach einer Exposition in Schimpansen eine zuverlässig feststellbare
Infektion im Blutstadium lieferte (Thomas et al., 1994 und unveröffentlichte
Daten). Die Exposition wurde mit dem NF54-Stamm von Plasmodium falciparum
durchgeführt.
Dies ist wichtig, weil die TRAP-Sequenz in der Plasmid-DNA und in
dem rekombinanten MVA von dem T9/96-Stamm von P. falciparum stammt,
welche zahlreiche Aminosäureunterschiede
gegenüber
der NF54-TRAP-Allele
aufweist (Robson et al., 1990). Daher wurde diese Sporozoitenexposition
eher mit einem heterologen als einem homologen Parasitenstamm durchgeführt. In
dem Schimpansen H1 waren Parasiten in Peripherblut erwartungsgemäß 7 Tage
nach der Sporozoitenexposition unter Verwendung von in vitro-Parasitenkulturdetektion
feststellbar. In H1 war jedoch das Auftreten von Parasiten im Blutstadium
in einer Kultur von den Tag 7-Blutproben um drei Tage verzögert, was
mit einer gewissen schützenden
Immunwirkung gegen die Leberstadiuminfektion in Einklang ist. In
Untersuchungen früherer
Malariaimpfstoff-Kandidaten in Menschen wurde angenommen, daß eine Verzögerung des
Auftretens von Parasiten im Peripherblut einer erheblichen Verminderung
der Parasitendichte in der Leber entspricht (Davis et al., 1989).
Somit zeigte der Schimpanse H1, der zuerst mit P. falciparum-TRAP-Plasmid-DNA
und anschließend
mit dem gleichen Antigen, welches von einem rekombinanten MVA-Virus
exprimiert wurde, eine starke CD8+ T-Lymphozyten-Antwort und Anzeichen für einen
gewissen Schutz gegen Exposition an heterologe Sporozoiten.
-
DISKUSSION
-
Diese
Beispiele zeigen ein neues Schema zur Immunisierung gegen Malaria
von einer menschlichen Malariainfektion, welches hohe Mengen an
schützenden
CD8+ T-Zellen in Nagermodellen induziert. Es wird auch ein beispielloser
vollständiger
Schutz gegen Sporozoitenexposition unter Verwendung von Untereinheitenimpfstoffen
demonstriert (36 von 36 Mäusen
wurden gemäß Tabelle
6 unter Verwendung von DNA-Initialisierung und MVA-Verstärkung mit
den das CS-Epitop enthaltenden Impfstoffen geschützt). Induktion von schützenden
Immunantworten unter Verwendung des DNA-lInitialisierungs-/MVA-Verstärkungs-Schemas
wurde in zwei zusätzlichen
Mausmodellen eines Modells viraler Infektion mit Influenza A und
Krebs (P815-Tumormodell)
gezeigt. Wichtiger für
Impfstoffe für
eine Verwendung im Menschen ist dieses Immunisierungsschema auch
hochgradig immunogen für
CD8+ T-Zellen in Primaten. Starke SIV-gag-spezifische CTL wurden in 3 von 3
Makaken mit Plasmid-DNA und MVA exprimierenden Epitopsträngen induziert.
Die induzierten Mengen sind vergleichbar mit denjenigen, die man
in SIV-infizierten Tieren findet. Die Daten aus den Schimpansenstudien zeigen,
daß das
gleiche Immunisierungsschema eine starke CD8+ T-Lymphozyten-Antwort
gegen P. falciparum in höheren
Primaten induzieren kann mit Anzeichen für einen Schutz gegen P. falciparum-Sporozoitenexposition.
-
Von
Ty-VLPs wurde zuvor berichtet, daß sie gute Mengen an CD8+ T-Zell-Antworten
gegen die P. berghei-Nagermalaria induzieren (Allsopp et al., 1995),
aber alleine dieses Kon strukt ist nicht schützend. Es wurde nun herausgefunden,
daß eine
anschließende
Immunisierung mit rekombinantem MVA die CD8+ T-Zell-Antwort sehr
erheblich verstärkt
und ein hohes Maß an
Schutz erzeugt (Tabelle 7).
-
Rekombinante
MVA-Viren wurden zuvor nicht hinsichtlich ihrer Wirksamkeit als
Malariaimpfstoffe untersucht. Rekombinantes MVA alleine war nicht
signifikant schützend
und auch nicht Initialisierung mit rekombinantem MVA, gefolgt von
einer zweiten Immunisierung mit rekombinanter Plasmid-DNA. Jedoch
lieferte eine zweite Immunisierung mit dem rekombinanten MVA nach
einer anfänglichen
Immunisierung entweder mit Ty-VLPs oder mit Plasmid-DNA beeindruckende
Niveaus an Schutz. Nichtrekombinantes MVA-Virus wurde in sicherer
Weise zur Impfung tausender Menschen gegen Pocken verwendet und
scheint ein ausgezeichnetes Sicherheitsprofil zu besitzen. Die molekulare
Grundlage für
die erhöhte
Sicherheit und Immunogenizität
dieses Stammes von Vacciniavirus wird durch ausführliche molekulare Studien
beleuchtet (Meyer et al., 1991; Sutter et al., 1994).
-
Plasmid-DNA
wurde zuvor als ein Malariaimpfstoff gegen die P. yoelii-Nagermalaria
getestet. Hohe Niveaus, aber keinen vollständigen Schutz findet man in
einigen Stämmen,
aber in anderen Mausstämmen
wurde sogar nach mehreren Immunisierungen geringer oder kein Schutz
beobachtet (Doolan et al., 1996). Obwohl Plasmid-DNA als eine Methode
zur Immunisierung gegen P. falciparum vorgeschlagen wurde, wurde
zuvor kein Erfolg erzielt. Der hierin gelieferte Beweis ist der
erste Beweis, der zeigt, daß Plasmid-DNA
in einem Immunisierungsschema zur Induktion schützender Immunität gegen
den menschlichen Malariaparasiten P. falciparum verwendet werden
kann.
-
Ein
zu dem hierin gezeigten Schema ähnliches
Immunisierungsschema kann erwarten lassen, daß es brauchbare schützende Immunität gegen
P. falciparum im Menschen induziert. Es sollte angemerkt werden, daß fünf der Impfstoffkonstrukte,
die in diesen Untersuchungen zur Induktion schützender Immunität in Nagern oder
Schimpansen verwendet wurden, P. falciparum-Sequenzen enthalten und daher zur Immunisierung
des Menschen gegen P. falciparum verwendet werden könnten. Diese
sind: 1. Der P. falciparum-TRAP-Plasmid-DNA-Impfstoff. 2. Das rekombinante
P. falciparum-TRAF-MVA-Virus. 3. Das Ty-VLP, welches einen Epitopstrang
einer Anzahl von P. falciparum-Epitopen sowie das einzelne P. berghei-CTL-Epitop
codiert. 4. Die Plasmid-DNA, welche den gleichen Epitopstrang wie
3. codiert. 5. Das rekombinante MVA, welches den längeren HM-Epitopstrang
codiert, der viele der Malariaepitope in 3 und 4 umfaßt. In ähnlicher
Weise könnten
die Plasmid-DNAs und MVA, welche HIV-Epitope für menschliche Klasse I-Moleküle codieren,
entweder in der prophylaktischen oder therapeutischen Immunisierung
gegen HIV-Infektion verwendet werden.
-
Diese
Untersuchungen haben ein klares Anzeichen dafür geliefert, daß ein neues
sequentielles Immunisierungsschema, welches ein nichtreplizierendes
oder ein bezüglich
Replikation beeinträchtigtes
Pockenvirus als eine Verstärkung
einsetzt, in der Lage ist, eine starke schützende CD8+ T-Zell-Antwort
gegen den Malariaparasiten zu induzieren. Die Beispiele zeigen deutlich
eine überraschende
und erhebliche Verbesserung von CD8+ T-Zell-Antworten und des Schutzes,
verglichen mit replizierenden Stämmen
von Pockenviren. Da es keinen Grund gibt anzunehmen, daß die Immunogenizität von CD8+
T-Zell-Epitopen von dem Malariaparasiten sich wesentlich von CD8+
T-Zell-Epitopen in anderen Antigenen unterscheiden sollten, wird
erwartet, daß das
hierin beschriebene Immunisierungsschema sich als wirkungsvoll bei
der Erzeugung wertvoller CD8+ T-Zell-Antworten gegen andere Krankheiten
erweisen wird. Die kritische Stufe in diesem Immunisierungsschema
ist die Verwendung nichtreplizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter
rekombinanter Pockenviren zur Verstärkung einer vorher existierenden
CTL-Antwort. Wir
haben gezeigt, daß CTL-Antworten
unter Verwendung verschiedener Antigenauslieferungssysteme, wie
einem DNA-Impfstoff id. und im., einem rekombinanten Ty-VLP, einem
rekombinanten Adenovirus und bestrahlter Sporozoiten, initiiert
werden können.
Dies wird durch die Daten gestützt,
die bezüglich
der Erzeugung einer CD8+ T-Zell-Antwort gegen HIV, Influenzavirus
und Tumore präsentiert
werden. Unter mehreren bekannten Beispielen anderer Krankheiten,
gegen welche eine CD8+ T-Zell-Immunantwort wichtig ist, sind die
folgenden: Infektion und Erkrankung, verursacht durch die Viren
HIV, Herpes simplex, Herpes zoster, Hepatitis C, Hepatitis B, Influenza,
Epstein-Barr-Virus, Masern, Dengue und HTLV-1; durch die Bakterien
Mycobacterium tuberculosis und Listeria sp.; und durch die Protozoenparasiten
Toxoplasma und Trypanosoma. Induktion von schützenden CTL-Antworten gegen
Influenza A-Virus wurde in 14 gezeigt.
Darüber
hinaus wird erwartet, daß das
hierin beschriebene Immunisierungsschema bei einer Immunisierung
gegen Formen von Krebs, bei denen CD8+ T-Zell-Antworten eine schützende Rolle
spielen, wertvoll sind. Die Induktion schützender CTL-Antworten unter
Verwendung des DNA-Induktions-MVA-Verstärkungs-Schemas gegen Tumore
ist in 12 gezeigt. Spezielle Beispiele
im Menschen umfassen Melanome, Brustkrebs und Lungenkrebs.
-
Literatur
-
- 1. Nardin EH & Nussenzweig RS. T cell responses
to pre-erythrocytic stages of malaria: role in protection and vaccine
development against pre-erythrocytic stages. Annual Review of Immunology
(1993) 11: 687–727.
- 2. Hill AVS, Allsopp, CEM, Kwiatkowski D, Anstey NM, Twumasi
P, Rowe PA, Bennett S, Brewster D, McMichael AJ, Greenwood BM. (1991)
Common West African HLA antigens are associated with protection
from severe malaria. Nature 352: 595–600
- 3. Aidoo M, Lalvani A, Allsopp CEM, et al. Identification of
conserved antigenic components for a cytotoxic T lymphocyte-inducing
vaccine against malaria. The Lancet. (1995) 345: 1003–1007.
- 4. Wizel B, Houghten RA, Parker KC, Coligan JE, Church P, Gordon
DM, Ballou WR, Hoffman SL. Irradiated sporozoite vaccine induces
HLA B8-restricted cytotoxic T lymphocyte responses against two overlapping
epitopes of the Plasmodium falciparum sporozoite surface protein
2. J. Exp Med. (1995) 182: 1435–45.
- 5. Lalvani A, Aidoo M, Allsopp CE, Plebanski M, Whittle HC,
Hill AV. An HLA-based approach to the design of a CTL-inducing vaccine
against Plasmodium falciparum. Research in Immunology (1994) 145:
461–8.
- 6. Seguin MC, Klotz FW, Schneider I, Weir JP, Goodbary M, Slayter
M, Raney JJ, Aniagoiu JU, Green SJ. Induction of nitric oxide synthase
protects against malaria in mice exposed to irradiated Plasmodium
berghei infected mosquitoes: involvement of interferon gamma and
CD8+ T cells. J. Exp. Med. (1994) 180: 353–8.
- 7. Thomas AW, Slierendregt B, Mons B, Druilhe P. Chimpanzees
and supporting models in the study of malaria pre-erythrocytic stages.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz. (1994) 89 Erg. 2: 111–4.
- 8. Sedegah M, Hedstrom R, Hobart P, Hoffman SL. Protection against
malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite
protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91: 9866–70
- 9. Li S, Rodrigues M, Rodriguez D, Rodriguez JR, Esteban M,
Palese P, Nussenzweig RS, Zavala F. Priming with recombinant influenza
virus followed by administration of recombinant vaccinia virus induces
CD8+ T-cell-mediated protective immunity against malaria. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. (1993) 90: 5214–8.
- 10. Lanar DE, Tine JA, de-Taisne C, Seguin MC, Cox WI, Winslow
JP, Ware LA, Kauffman EB, Gordon D, Ballou WR, Paoletti E, Sadoff
JC. Attenuated vaccinia virus-circumsporozoite protein recombinants
confer protection against rodent malaria. Infection and Immunity
(1996) 64: 1666–71.
- 11. Ogg GS, Jin X, Bonhoeffer S, Dunbar PR, Nowak MA, Monard
S, Segal JP, Cao Y, Rowland-Jones
SL, Cerundolo et al. Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T
lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science (1998) 279: 2103–6
- 12. Ada G. Do cytotoxic T lymphocytes clear some HIV/SIV infections?
Journal of Medical Primatology (1996) 25: 158–62.
- 13. Gallimore A, Cranage M, Cook N, Almond N, Bootman J, Rud
E, Silvera P, Dennis M, Corcoran T, Stott J et al. Early suppression
of SIV replication by CD8+ nef-specific cytotoxic T cells in vaccinated
macaques. Nature Medicine (1995) 1: 1167–73.
- 14. Mayr A, Hochstein-Mintzel V, Stickl H. Infection (1975)
33: 6–14.
- 15. Mayr A, Zentralbl Veterinarmed B (1976) 23: 417–30.
- 16. Mayr A, Stickl H., Muller HK, Danner K, Singer H. Zentralbl
Bakteriol B. (1978) 167: 375–90.
- 17. Stickl H, Hochstein-Mintzel V, Mayr A, Huber HC, Schafer
H, Holzner A. Dtsch Med Wochenschr. (1974) 99: 23866–922.
- 18. Mahnel H, Mayr A. Berl Munch Tierarztl Wochenschr (1994)
107: 253–6.
- 19. Meyer H, Sutter G, Mayr A. J Gen Virol. (1991) 72: 1031–8.
- 20. Altenburger W, Suter CP, Altenburger J. Arch Virol. (1989)
105: 15–27.
- 21. Sutter G, Ramsey-Ewing A, Rosales R, Moss B. J. Virol. (1994)
68: 4109–16.
- 22. Sutter G, Moss B. Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89: 10847–51.
- 23. Sutter GW, Wyatt LS, Foley PL, Bennink JR, Moss B. Vaccine
(1994). 12: 1032–40.
- 24. Hirsch VM, Goldstein S, Channock R, et al. Channock R. Hsg.
Vaccines 95. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1995) 195–200.
- 25. Hirsch VM, Fuerst TR, Sutter G, et al. J. Virol. (1996)
70: 3741–52.
- 26. Moss B, Carroll MW, Wyatt L, et al. In: Anonymous, Hsg.
Vaccines: Novel strategies in design and production. Plenum Press
(1995).
- 27. Symons JA, Alcami A, Smith GL. Cell. (1995) 81: 551–60.
- 28. Alcami A, Smith GL. J. Virol. (1995) 69: 4633–9.
- 29. Alcami A, Smith GL. Cell. (1992) 71: 153–67.
- 30. Graham KA et al. Virology (1997) 229: 12–24.
- 31. Alcami A, Smith GL. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:
11029–34.
- 32. Blanchard TJ, Rowland-Jones S, Gotch F, McMichael AJ, Smith
GL. Lancet (1997) 348: 1741
- 33. McLean CS, Erturk M, Jennings R, Challanain DN, Minson AC,
Duncan I, Boursnell ME, Inglis SC. J. Infect. Dis. (1994) 170(5):
1100–9.
- 34. Davis NL, Brown KW, Johnston RE, J. Virol. (1996) 70(6):
3781–7.
- 35. Layton GT, Harris SJ, Myhan J, West D, Gotch F, Hill-Perkins
M, Cole JS, Meyers N, Wood row S, French TJ, Adams SE, Kingsman
AJ. Induction of single and dual cytotoxic T-lymphocyte responses
to viral proteins in mice using recombinant hybrid Ty-virus-like
particles. Immunology (1996) 87: 171–8.
- 36. McGrory-WJ; Bautista-DS; Graham-FL A simple technique for
the rescue of early region I mutations into infectious human adenovirus
type 5. Virology (1988) 163: 614–7
- 37. Rodrigues EG, Zavala F, Eichinger D, Wilson JM, Tsuji M.
Single immunizing dose of recombinant adenovirus efficiently induces
CD8+ T cell-mediated protective immunity against malaria. Journal
of Immunology (1997) 158: 1268–74.
- 38. Davis HL, Michel ML, Whalen RG. DNA-based immunization induces
continuous secretion of hepatitis B surface antigen and high levels
of circulating antibody. Human Molecular Genetics (1993) 2: 1847–51.
- 39. Miyahira Y, Murata K, Rodriguez D et al. Quantification
of antigen specific CD8+ T cells using an ELISPOT assay. J Immunol
Methods (1995) 18: 45–54.
- 40. Allsopp CEM, Plebanski M, Gilbert S et al. (1996) Comparison
of numerous delivery systems for the induction of cytotoxic T lymphocytes.
European Journal of Immunology (1996) 26: 1951–1959.
- 41. Rodrigues EG, Zavala F, Eichinger D, Wilson JM, Tsuji M.
Single immunizing dose of recombinant adenovirus efficiently induces
CD8+ T cell-mediated protective immunity against malaria. J. Immunol.
(1997) 158: 1268–74.
- 42. Schodel F, Wirtz R, Peterson D, Hughes J, Warren R, Sadoff
J, Milich D. Immunity to malaria elicited by hybrid hepatitis B
virus core particles carrying circumsporozoite protein epitopes.
J. Exp. Med. (1994) 180: 1037–46.
- 43. Satchidanandam V, Zavala F, Moss B. Studies using a recombinant
vaccinia virus expressing the circumsporozoite protein of Plasmodium
berghei. Mol. Biochem. Parasitol. (1991) 48: 89–99.
- 44. Davis JR, Murphy JR, Baqar S, Clyde DF, Herrington DA, Levine
MM. Estimate of anti-Plasmodium
falciparum sporozoite activity in humans vaccinated with synthetic
circumsporozoite protein (NANP)3. Transactions of the Royal Society
for Tropical Medicine and Hygiene. (1989) 83: 748–50.
- 45. Meyer, H., Sutter, G. und Mayr, A. (1991). Mapping of deletions
in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their
influence on virulence. J. Gen. Virol. 72: 1031–38.
- 46. Sutter G, Wyatt LS, Foley PL, Bennink JR, Moss B. A recombinant
vector derived from the host range-restricted and highly attenuated
MVA strain of vaccinia virus stimulates protective immunity in mice
to influenza virus. Vaccine (1994) 12: 1032–40.
- 47. Doolan DL, Sedegah M, Hedstrom RC, Hobart P, Charoenvit
Y, Hoffman, SL Circumventing genetic restriction of protection against
malaria with multigene DNA immunization: CD8+ cell-, interferon
gamma-, and nitric oxide-dependent immunity. J. Exp. Med. (1996)
183: 1739–46.
- 48. Muller HM, Reckmann I, Hollingdale MR, Bujard H, Robson
KJ, Crisanti A. Thrombospondin related anonymous protein (TRAP)
of Plasmodium falciparum binds specifically to sulfated glycoconjugates
and to HepG2 hepatoma cells suggesting a role for this molecule
in sporozoite invasion of hepatocytes. EMBO-J. (1993) 12: 2881–9.
- 49. Chakrabarti S et al. Mol. Cell. Biol. (1995) 5: 3403–9.
- 50. Morrison HG, Bauer SP, Lange JV, Esposito JJ, McCormick
JB, Auperin DD Protection of guinea pigs from Lassa fever by vaccinia
virus recombinants expressing the nucleoprotein or the envelope
glycoproteins of Lassa virus. Virology. (1989) 171: 179–88.
- 51. Mackett M et al. J. Virol. (1984) 49: 857–864.
- 52. Carroll MW und Moss BE, Biotechnology (1995) 19: 352–4.
-
INDICATIONS
RELATING TO A DEPOSITED MICROORGANISM (PCT
Rule 13 bis)
-
INDICATIONS RELATING TO A
DEPOSITED MICROORGANISM
-
C. ADDITIONAL INDICATIONS (continued)
-
Patents
Act Sections 22 and 33(3), Icelandic Patents Act Sections 22 and
33(3), Norwegian Patents Act Sections 22 and 33(3) and generally
similar provisions mutatis mutandis for any other designated State.
-
Die
folgenden Gegenstände
werden ebenfalls offenbart:
- Gegenstand 1: Ein
Kit zur Erzeugung einer schützenden
CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen wenigstens ein Zielantigen, wobei
das Kit folgendes umfaßt:
(i)
eine Initialisierungszusammensetzung mit einer Quelle für ein oder
mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens zusammen mit einem
pharmazeutisch verträglichen
Träger
und
(ii) eine Verstärkungszusammensetzung
mit einer Quelle für
ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens, einschließlich wenigstens
einem CD8+ T-Zell-Epitop,
welches das gleiche wie ein CD8+ T-Zell-Epitop der Initialisierungszusammensetzung
ist, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope ein nichtreplizierender oder bezüglich Replikation
beeinträchtigter
rekombinanter Pockenvirusvektor ist, zusammen mit einem pharmazeutisch
verträglichen
Träger,
mit
der Bedingung, daß,
wenn die Quelle für
Epitope in (i) ein viraler Vektor ist, der virale Vektor
in
(ii) von einem anderen Virus abgeleitet ist.
- Gegenstand 2: Das Kit gemäß Gegenstand
1, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in (i) ein nicht-viraler Vektor oder ein nichtreplizierender
oder bezüglich
Replikation beeinträchtigter
viraler Vektor ist.
- Gegenstand 3: Das Kit gemäß Gegenstand
1 oder 2, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope
in (i) kein Pockenvirusvektor ist.
- Gegenstand 4: Das Kit gemäß Gegenstand
2 oder 3, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope
in (i) DNA oder RNA ist.
- Gegenstand 5: Das Kit gemäß Gegenstand
4, wobei die Quelle für
Epitope in (i) ein rekombinantes DNA-Plasmid ist.
- Gegenstand 6: Das Kit gemäß Gegenstand
4 oder 5, welches weiterhin GM-CSF als ein Adjuvans für (i) umfaßt.
- Gegenstand 7: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 6, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in (i) das Zielantigen codiert oder umfaßt.
- Gegenstand 8: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
4 bis 6, wobei die Quelle für
Epitope in (i) ein einzelnes CD8+ T-Zell-Epitop oder eine rekombinante
Folge von zwei oder mehreren CD8+ T-Zell-Epitopen codiert.
- Gegenstand 9: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 3, wobei die Quelle für
Epitope in (i) ein Peptid, Polypeptid, Protein, Polyprotein oder
Teilchen ist, welches zwei oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope umfaßt, die
in einer rekombinanten Folge von CD8+ T-Zell-Epitopen oder in einem
Zielantigen vorliegen.
- Gegenstand 10: Das Kit gemäß Gegenstand
9, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in (i) ein rekombinantes Proteinteilchen, wie
ein Ty-Virus-artiges Teilchen (VIP), ist.
- Gegenstand 11: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 3, wobei die Quelle für
Epitope in (i) ein rekombinanter Adenovirusvektor ist.
- Gegenstand 12: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 11, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in (ii) ein rekombinanter Vacciniavirusvektor
ist.
- Gegenstand 13: Das Kit gemäß Gegenstand
12, wobei der rekombinante Vacciniavirusvektor zu dem Vacciniavirusstamm
modifiziertes Virus Ankara (MVA) oder einem davon abgeleiteten Stamm
gehört.
- Gegenstand 14: Das Kit gemäß Gegenstand
12, wobei der rekombinante Vacciniavirusvektor zu dem Stamm NYVAC
oder einem davon abgeleiteten Stamm gehört.
- Gegenstand 15: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 11, wobei die Quelle für
CD8+ T-Zell-Epitope in (ii) ein rekombinanter Avipox-Vektor, wie
Kanarienvogelpocken oder Geflügelpocken
oder davon abgeleitete Stämme,
wie ALVAC, ist.
- Gegenstand 16: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 15 zur Erzeugung einer schützenden
Immunantwort gegen ein Pathogen oder einen Tumor, welches das Zielantigen
umfaßt.
- Gegenstand 17: Das Kit gemäß Gegenstand
16 zur Erzeugung einer schützenden
Immunantwort gegen ein Malaria-Pathogen, wie Plasmodium falciparum.
- Gegenstand 18: Ein Kit gemäß Gegenstand
17, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope in oder codiert durch (i) ein oder
mehrere Malariaepitope aus der in Tabelle 1 angegebenen Liste einschließen.
- Gegenstand 19: Das Kit gemäß Gegenstand
18, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope in (i) alle der in Tabelle 1 angegebenen
Epitope einschließen.
- Gegenstand 20: Das Kit gemäß Gegenstand
16 zur Erzeugung einer Immunantwort gegen HIV.
- Gegenstand 21: Das Kit gemäß Gegenstand
20, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope in oder codiert durch (i) ein oder
mehrere HIV-Epitope aus der in Tabelle 2 angegebenen Liste einschließen.
- Gegenstand 22: Das Kit gemäß Gegenstand
20, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope in oder codiert durch (i) alle der
in Tabelle 2 angegebenen Epitope einschließen.
- Gegenstand 23: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 22, wobei die Initialisierungs- und Verstärkungszusammensetzungen dahingehend
identisch sind, daß beide
die Quelle für
Epitope in (i) und die Quelle für
Epitope in (ii) enthalten.
- Gegenstand 24: Das Kit gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 23, wobei die Initialisierungszusammensetzung und/oder die
Verstärkungszusammensetzung
in partikulärer
Form vorliegt, die für
die Verabreichung mittels einer Genpistole geeignet ist.
- Gegenstand 25: Verfahren zur Erzeugung einer schützenden
CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen wenigstens ein Zielantigen, wobei
das Verfahren die Verabreichung wenigstens einer Do sis von Komponente
(i), gefolgt von wenigstens einer Dosis von Komponente (ii) des
Kits gemäß einem
der Gegenstände
1 bis 24 umfaßt.
- Gegenstand 26: Verfahren zur Erzeugung einer schützenden
CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen ein Pathogen oder einen Tumor, wobei
das Verfahren die Verabreichung wenigstens einer Dosis eines rekombinanten
DNA-Plasmids, das wenigstens ein CD8+ T-Zell-Epitop oder Antigen
des Pathogens oder des Krebses codiert, gefolgt von wenigstens einer
Dosis eines rekombinanten nichtreplizierenden oder bezüglich Replikation
beeinträchtigten
Pockenvirus, welches das gleiche Epitop oder Antigen codiert, umfaßt.
- Gegenstand 27: Verfahren gemäß Gegenstand
25, wobei das rekombinante Vacciniavirus ein rekombinanter MVA-Vektor
ist.
- Gegenstand 28: Verfahren zur Erzeugung einer schützenden
CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen ein Pathogen oder einen Tumor, wobei
das Verfahren die Verabreichung wenigstens einer Dosis eines rekombinanten
Proteins oder Teilchens, welches wenigstens ein Epitop oder Antigen
des Pathogens oder des Krebses umfaßt, gefolgt von wenigstens
einer Dosis eines rekombinanten MVA-Vektors, welcher das gleiche
Epitop oder Antigen codiert, umfaßt.
- Gegenstand 29: Verfahren gemäß einem
der Gegenstände
26 bis 28 zur Erzeugung einer schützenden CD8+ T-Zell-Immunantwort
gegen Malaria, wie P. falciparum-Malaria.
- Gegenstand 30: Verfahren gemäß einem
der Gegenstände
26 bis 28 zur Erzeugung einer schützenden CD8+ T-Zell-Immunantwort
gegen HIV.
- Gegenstand 31: Verfahren gemäß einem
der Gegenstände
25 bis 30, wobei (ii) intravenös,
intraepidermal oder intradermal verabreicht wird.
- Gegenstand 32: Medikament zur Verstärkung einer initialisierten
CD8+ T-Zell-Antwort gegen wenigstens ein Zielantigen, welches eine
Quelle für
ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens, wobei die Quelle
für CD8+
T-Zell-Epitope ein nichtreplizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter
rekombinanter Pockenvirusvektor ist, und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfaßt.
- Gegenstand 33: Medikament gemäß Gegenstand 32, wobei der
Vektor ein Vacciniavirusvektor, wie MVA, ist.
- Gegenstand 34: Medikament gemäß Gegenstand 32 oder 33 zur
Verstärkung
einer natürlich
initialisierten CD8+ T-Zell-Antwort gegen Malaria.
- Gegenstand 35: Verfahren zur Verstärkung einer initialisierten
CD8+ T-Zell-Immunantwort, wobei das Verfahren die Verabreichung
eines Medikaments gemäß einem
der Gegenstände
32 bis 34 umfaßt.
- Gegenstand 36: Verwendung eines rekombinanten nichtreplizierenden
oder bezüglich
Replikation beeinträchtigten
Pockenvirusvektors bei der Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung einer
CD8+ T-Zell-Immunantwort.
- Gegenstand 37: Verwendung eines MVA-Vektors bei der Herstellung
eines Medikaments zur Verstärkung einer
CD8+ T-Zell-Immunantwort.
- Gegenstand 38: Epitopstrang, welcher die in Tabelle 1 aufgelisteten
Aminosäuresequenzen
umfaßt.
- Gegenstand 39: Rekombinantes Ty-VLP, welches den Epitopstrang
gemäß Gegenstand
38 umfaßt,
zur Immunisierung gegen Malaria.
- Gegenstand 40: Rekombinantes DNA-Plasmid oder rekombinantes
nichtreplizierendes oder bezüglich
Replikation beeinträchtigtes
Pockenvirus, welches den Epitopstrang gemäß Gegenstand 38 codiert, zur
Immunisierung gegen Malaria.
- Gegenstand 41: Rekombinantes DNA-Plasmid oder rekombinantes
nichtreplizierendes oder bezüglich
Replikation beeinträchtigtes
Pockenvirus, welches das P. falciparum-Antigen TRAP codiert, zur
Immunisierung gegen Malaria.
- Gegenstand 42: Rekombinantes Vacciniavirus gemäß Gegenstand
40 oder 41 des MVA-Stranges.
- Gegenstand 43: Epitopstrang, welcher die in Tabelle 2 aufgelisteten
Aminosäuresequenzen
umfaßt.
- Gegenstand 44: Rekombinantes Polypeptid, welches ein vollständiges oder
im wesentlichen vollständiges Proteinantigen,
wie TRAP, und eine Folge von zwei oder mehreren Epitopen, wie CTL-Epitopen
von Malaria, umfaßt.
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-