DE69837544T2

DE69837544T2 - Testgerät und methode zur entdeckung von analyten in proben

Info

Publication number: DE69837544T2
Application number: DE69837544T
Authority: DE
Inventors: Robert J. Markovsky; Cheryl A. Malden BOYER; Stanley E. Boston CHARM; Paul R. Southboro DONAHUE; Yael Brookline AGI-GLICKMAN; Steven J. Arlington SAUL; Joan L. Chelmsford SCHEEMAKER; Richard T. North Reading SKIFFINGTON; Shifali B. Quincy TRIVEDI; Eliezer Newton ZOMER
Original assignee: Charm Sciences Inc
Current assignee: Charm Sciences Inc
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2018-07-17
Also published as: US6319466B1; EP0998676B1; AU8489698A; EP0998676A1; ES2323540T3; WO1999004267A3; DE69837544D1; DE69841864D1; US7097983B2; DE69840657D1; WO1999004267A2; US20030207442A1; ES2284210T3

Description

Lateralströmungs- oder immunchromatographische Testkits und Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart oder Konzentration chemischer Rückstände oder von Analyten oder Klassen davon in Flüssigkeitsproben sind entwickelt worden. Ein Beispiel eines solchen Testkits umfasst ein Schwangerschaftstestkit. Weitere Beispiele sind in US 5,451,504 , EP 0 279 573 und WO 96/38720 beschrieben.
Insbesondere im Bereich der Nahrungsmittelsicherheit ist es seit langem anerkannt, dass ein Rückstandsnachweis genau, kostengünstig und leicht durchführbar sein sollte. Bei Verbrauchern und Regierungen erhöht sich das Bewusstsein bezüglich des Erfordernisses, Nahrungsmittel im Hinblick auf unerwünschte Rückstände zu testen, die natürlich oder in anderer Weise vorkommen.
Da es sich bei einem großen Teil der Verbraucher um Kinder handelt, ist die Nahrungsmittelsicherheit in der Milchproduktindustrie seit langer Zeit kritisch. Antibiotikarückstände, die in einem Milcherzeugungsbetrieb verwendet werden, finden sich gelegentlich in der Milch. Die Gefahren, die mit diesen unerwünschten Rückständen einhergehen, umfassen allergische Reaktionen, die Unterstützung der Ausbreitung neuer und manchmal arzneistoffresistenter Mikroorganismen und andere Langzeit-Gesundheitsrisiken.
Behörden haben in manchen Fällen gesetzliche Grenzen für bestimmte Rückstände in Nahrungsmitteln eingeführt, wie z.B. für Antibiotikarückstände in Milch. Rückstände über der „gesetzlichen" Grenze werden für den Verbrauch durch den Menschen als unsicher angesehen. Rückstandskonzentrationen unter der gesetzlichen Grenze werden als „sicher" angesehen. Es ist daher wichtig, dass Nachweisverfahren zusätzlich dazu, dass sie kostengünstig sind und leicht durchgeführt werden können, keine positiven Ergebnisse liefern, wenn die Rückstände unter den gesetzlichen Grenzen liegen, so dass akzeptable Milch oder andere Nahrungsmittel nicht entsorgt oder auf andere Weise behandelt werden, als ob sie Rückstände über den gesetzlichen Grenzen enthalten würden.
Erfindungsgemäß wird eine Testvorrichtung zum Nachweisen der Gegenwart eines Analytrückstands in einer Probe bereitgestellt, die

(a) eine Zusammensetzung einer mobilen Phase mit einem Rezeptor zum Binden mit dem Analyten, wobei die Zusammensetzung der mobilen Phase in der Probe mitgeführt werden kann,
(b) eine Membran einer stationären Phase mit einem ersten Membranende, das mit der Zusammensetzung der mobilen Phase in Kontakt steht, und einem zweiten Membranen de, wobei die Membran eine laterale kapillare Strömung der Probe von dem ersten Membranende zu dem zweiten Membranende zulässt,
(c) eine Testzone auf der Membran der stationären Phase zwischen dem ersten Membranende und dem zweiten Membranende, die ein erstes Bindemittel zum Binden mit einem ungebundenen Rezeptor aufweist,
(d) eine Kontrollzone auf der Membran der stationären Phase zwischen der Testzone und dem zweiten Membranende, die ein zweites Bindemittel zum Binden mit einem Analytgebundenen Rezeptor aufweist, umfasst,

Häufig weist eine Flüssigkeit, wie z.B. Milch, eine(n) oder mehrere Verunreinigung(en) oder Analyten auf, der bzw. die in Spurenmengen vorliegt bzw. vorliegen und getestet werden muss bzw. müssen. Zum Nachweisen des Analyten nutzt eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einen markierten Rezeptor, der mit dem Analyten zur Bildung eines Analyt-Rezeptor-Komplexes reagiert. Der markierte Rezeptor ist innerhalb oder nahe an einer Membran positioniert und wenn diese der Flüssigkeit ausgesetzt wird, findet eine laterale, kapillare Strömung darauf statt. In der Strömung führt die Flüssigkeit den Analyt-Rezeptor-Komplex und jedweden ungebundenen Rezeptor mit. Eine Testzone ist auf der Membran in dem Strömungsweg angeordnet. Die Testzone weist ein repräsentatives Analytkonjugat auf, das an die Membran gebunden ist, um ungebundenen Rezeptor zu binden, so dass ein erster Analyt-Konjugat-Rezeptor-Komplex gebildet wird, der als Folge des Markers ein Signal erzeugt, das für das Auge sichtbar oder mit einem Gerät lesbar ist.
Die kapillare Strömung der Flüssigkeit setzt sich auf der Membran zu einer Kontrollzone fort. Die Kontrollzone umfasst ein Bindemittel, das an der Membran gebunden ist und das mit dem markierten Rezeptor bindet. Nach dem Binden ändert sich die Kontrollzone und erzeugt ein Signal, das für das Auge sichtbar oder mit einem Gerät lesbar ist oder das unter speziellen Lichtbedingungen, wie z.B. Ultraviolett, sichtbar ist. Wenn das Signal in der Testzone intensiver ist als das Signal in der Kontrollzone zeigt der Test, dass der Analyt nicht in einer ausreichenden Menge vorliegt (ein negativer Test). Wenn das Signal in der Testzone weniger intensiv ist als das Signal in der Kontrollzone, zeigt der Test, dass der Analyt in einer Menge über einem zulässigen Niveau vorliegt (ein positiver Test).
Der Rezeptor kann eine Familie von Analyten (einen oder eine Mehrzahl von Analyten) binden, die ähnliche strukturelle Bindungsstellen aufweisen. Mitglieder einer Analytfamilie können verschiedene Nachweiskonzentrationsanforderungen aufweisen und daher können zusätzliche Analytbindemittel verwendet werden, wie z.B. monoklonale oder polyklonale Antikörper, die einen Teil des Analyten konkurrierend mit dem Rezeptor in der Probe binden, wodurch die Testempfindlichkeit vermindert wird. Die Antikörper werden mit dem markierten Rezeptor in einer Menge gemischt, so dass die Empfindlichkeit für einen spezifischen Analyten oder eine spezifische Gruppe von Analyten eingestellt wird. Die Empfindlichkeit des Tests wird so eingestellt, dass ein positives Testergebnis nicht erhalten wird, bis eine bestimmte Schwelle eines Analyten in der Probe vorliegt.
Die vorliegende Erfindung umfasst viele Vorteile, wie z.B. das Kombinieren hochreiner Breitspektrumrezeptoren oder -antikörper mit einer hohen spezifischen Aktivität pro Oberfläche kombiniert mit entgegenwirkenden, rückstandsspezifischen Antikörpern (z.B. monoklonal), um einen Rückstandsnachweis in der Größenordnung von Konzentrationen von Teilen pro Milliarde (ppb) (10^–9) oder Teilen pro Trillion (ppt) (10^–12) an oder nahe an den behördlichen Anforderungen zu erreichen. Das gezielte Ansteuern der aktiven Gruppe des chemischen Rückstands ermöglicht den Nachweis eines breiten Spektrums aktiver Pharmazeutika (z.B. tierärztlicher Arzneistoffe, Agrochemikalien (z.B. Pestizide) oder mikrobieller Toxine und deren aktive Metaboliten). Ferner können zusätzliche Antikörper zugesetzt werden, um die Empfindlichkeitsschwelle des Tests einzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Testvorrichtung und ein Verfahren zum Nachweisen der Gegenwart eines Analytrückstands in einer Probe. Der Test und die Vorrichtung nutzen Breitspektrumtests auf einer direkten Farb-, Fluoreszenz- oder Infrarot-Erkennungsbasis, um die Gegenwart eines Chemikalienrückstands oder eines Rückstands einer Familie von Chemikalien, die gleiche Erkennungsstellen gemeinsam haben, im niedrigen Teil pro Milliarde-Bereich schnell nachzuweisen. Die Kits sind zum Testen von Antibiotika, Toxinen und Pestiziden in Nahrungsmittel- oder Umweltproben im Feld bzw. Außenbereich oder im Labor gestaltet. Diese Tests sind nicht-kompetitiv und nutzen eine Sättigungschemie.
Die vorstehend genannten und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, die lediglich beispielhaft angegeben ist, und gemäß der Veranschaulichung in den beigefügten Zeichnungen, in denen sich in den unterschiedlichen Ansichten entsprechende Bezugszeichen auf die gleichen Teile beziehen. Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu, wobei stattdessen auf die Ver anschaulichung der Prinzipien der Erfindung Wert gelegt wurde. Alle Prozentangaben und Teile beziehen sich auf das Gewicht, falls nichts anderes angegeben ist.
Die 1 ist eine perspektivische, auseinander gezogene Ansicht einer Testvorrichtung mit geformtem Gehäuse.
Die 2, 3 und 4 sind schematische, veranschaulichende Ansichten der Verwendung der Testvorrichtung von 1.
Die 5 ist eine perspektivische Ansicht eines Inkubators und der Testvorrichtung mit einer Flüssigkeitsprobe.
Die 6 ist eine vergrößerte Draufsicht des Teststreifens der 1 bis 5 von vorne mit vergrößerten Vorderseitenschnittansichten positiver und negativer Testergebnisse.
Die 7 ist eine perspektivische, auseinander gezogene Ansicht einer Blisterverpackungstestvorrichtung.
Die 8, 9 und 10 sind schematische, veranschaulichende Seitenansichten der Verwendung der Testvorrichtung von 7.
Die 11 und 12 sind perspektivische Ansichten eines Inkubators und der Testvorrichtung mit einer Flüssigkeitsprobe.
Die 13 ist eine vergrößerte Draufsicht des Teststreifens der 7 bis 12 von vorne mit vergrößerten Vorderseitenschnittansichten positiver und negativer Testergebnisse.
Die 14 ist eine perspektivische, auseinander gezogene Ansicht einer Blisterverpackungstestvorrichtung mit vorgewölbter Kaschierung und einer Verengung des Blisters zur Erzeugung von Klemmpunkten.
Die 15, 16 und 17 sind schematische, veranschaulichende Seitenansichten der Verwendung der Testvorrichtung von 14.
Die 18 ist eine vergrößerte Ansicht der Streifenbewegungsbeschränkungszone von 14.
In den Zeichnungen zeigen die 1 bis 6 eine Analyt-Testvorrichtung 10, die ein längliches geformtes Gehäuse 12 umfasst. Das Gehäuse 12 kann aus einem einstückigen, spritzgegossenen transparenten Styrolpolymer ausgebildet sein. Das Gehäuse 12 definiert einen länglichen Gehäusehohlraum 14 mit einem offenen Ende 16 und einem vergrößerten, rechteckigen Aufbringausdehnungshohlraum 18 an dem offenen Ende 16 des Gehäuses 12. Das Gehäuse 12 umfasst einen Hohlraum mit länglichem Boden, der während des Spritzgussverfahrens gebildet worden ist. Das Gehäuse umfasst eine optional entfernbare, durch Reibung passende oder einschnappende Schutzkappe 22, die angepasst ist, über das offene Ende 16 des Gehäuses 12 zu passen, und Flüssigkeitsausdehnungsöffnungen 19 in der oberen Abdeckung des Aufbringgehäusehohlraums zur Erhöhung der Effizienz der Ausdehnung einer probenabsorbierenden Matrix, wie z.B. eines Schwamms 32, innerhalb der Testzeit.
Der Gehäusehohlraum 14 umfasst darin auf der Bodenfläche einen Lateralströmungsteststreifen 28, der angepasst ist, die Gegenwart eines Analyten in einer Flüssigkeitsprobe, wie z.B. Milch, nachzuweisen. Der Teststreifen 28 umfasst einen Trägerstreifen 30 mit einem an einem Ende angebrachten Schwamm 32. Der Schwamm 32 kann eine Mehrzahl aufeinander folgender Schichten umfassen, die eine rechteckige Lage eines trockenen, gepressten Cellulosematerials als Flüssigkeitsprobenabsorptionsmittel umfassen, die an der vorderen Oberfläche des Trägerstreifens 30 angebracht ist. Der Schwamm 32 wird so ausgewählt, dass er sich in Kontakt mit der Flüssigkeit, wie z.B. Milch, ausdehnt, so dass der Ausdehnungshohlraum 18 gefüllt sind, wobei sich der Schwamm 32 in zwei Dimensionen anpasst. Beispielsweise weist der Schwamm 32 mit Milch Abmessungen von etwa 3 bis 4 mm × 12 bis 14 mm auf, während der Hohlraum 18 Abmessungen von etwa 5 bis 6 mm × 15 bis 16 mm × eine Höhe von 4 bis 6 mm aufweist. Der Ausdehnungshohlraum 18 kann etwa 60 % bis 30 % kleiner dimensioniert werden als die volle Ausdehnung des Schwammmaterials.
Der Trägerstreifen 30 umfasst einen behandelten Träger einer mobilen Phase 33 mit einer Zusammensetzung der mobilen Phase 34, eine Membran einer stationären Phase 36, die eine Testzone 38 und eine Kontrollzone 40 für den nachzuweisenden Analyten umfasst, und eine Entsorgungszone 43 an dem zweiten Ende des Trägerstreifens 30 zum Einfangen von überschüssiger Flüssigkeitsprobe. Das Gehäuse 12 umfasst eine transparente obere Abdeckung 42 zur visuellen Untersuchung der Testzone (Bezugszone) 38 und der Kontrollzone 40. Der Teststreifen 28 ist in dem länglichen Hohlraum 14 lose angeordnet und positioniert, wobei der Schwamm 32 unterhalb des Ausdehnungshohlraums 18 angeordnet ist und sich der Schwamm 32 im Allgemeinen zu etwa oder geringfügig unterhalb der Ebene des offenen Aufbringendes erstreckt und das Ende vor der Verwendung durch eine Schutzkappe 22 bedeckt ist.
Bei der Anwendung wird die Schutzkappe 22 vor der Verwendung entfernt und das offene Aufbringende 12 wird kurz (etwa 1 bis 10 Sekunden) in die Flüssigkeit, wie z.B. Milch, die getestet werden soll, eingetaucht, wobei das längliche Gehäuse 12 als Griff verwendet wird, vgl. die 2. Die Testvorrichtung 10 wird entnommen und der Schwamm 32 wird sich ausdehnen gelassen, so dass der Ausdehnungshohlraum 18 gefüllt wird und die Lateralströmung der Milchprobe durch den Teststreifen 28 (2 bis 6 min) beginnt, vgl. die 3 und 4. Vorzugsweise wird die Schutzkappe 22 aufgesetzt, um gegen eine Kreuzkontamination zu schützen, und die Testvorrichtung 10 wird dann in einer horizontalen Position angeordnet, wobei sich der Aufbringhohlraum 18 nach unten in einen elektrisch geheizten Inkubator 46 erstreckt, wobei der Inkubatorhohlraum 47 so geformt ist, dass er die Testvorrichtung aufnehmen kann, und eine Inkubation wird z.B. für 3 bis 10 min durchgeführt. Die Inkubationstemperatur wird durch die Temperaturanzeigeskala 48 beobachtet, vgl. die 5. Die inkubierte Testvorrichtung 10 wird dann entnommen und umgedreht, und die Vorderseite der Testvorrichtung mit der Testzone 38 und der Kontrollzone 40 wird betrachtet, vgl. die 6. Die Linienablesungen für positive und negative Kontrollen sind in der 6 angrenzend an die Vorderansicht der Testvorrichtung 10 veranschaulicht. In dem Schwamm 32 wird die Ausdehnung durch das Volumen und die Größe des Ausdehnungshohlraums 18 kontrolliert, was dazu führt, dass der Schwamm 32 den Ausdehnungshohlraum 18 mit einem vorausgewählten Flüssigkeitsvolumen, wie z.B. 0,1 bis 1,0 ml, vollständig füllt, so dass die Menge der Flüssigkeitsprobe, die für den Test eingeführt wird, auf die korrekte Menge eingestellt wird. Die Abmessungen des Ausdehnungshohlraums 18 verhindern, dass sich der Schwamm 32 vollständig ausdehnt, so dass der Druck in dem ausgedehnten Schwamm aufrechterhalten wird, wie es in der 4 gezeigt ist, um beim Drücken der kapillaren Lateralströmung der Flüssigkeitsprobe durch den Teststreifen 28 in dem Gehäuse 12 zu unterstützen.
Die Zeichnungen in den 7 bis 13 veranschaulichen eine weitere Testvorrichtung 50 in einer transparenten Blisterverpackung, die einen Kunststoffversiegelungsstreifen 52 aus einem transparenten Band mit einem Ablösestreifen 54 an einem Ende und eine transparente Blisterverpackung 56, die klebend an dem Streifen 52 befestigt ist, um den Teststreifen 28 darin einzuschließen, umfasst. Die Blisterverpackung 56 umfasst einen länglichen Hohlraum zum Halten des Streifens 28 und ein Ausdehnungshohlraumgehäuse 58 an dem einen Ende, so dass ein im Allgemeinen zahnbürstenförmiger Hohlraum innerhalb der Kunststoffblisterverpackung 56 gebildet wird, und den Streifen 52. Der ausgewählte Teststreifen 28 ist innerhalb der Blisterverpackung 56 versiegelt und eingeschlossen.
Die 8 zeigt eine Seitenschnittansicht der Blisterverpackungstestvorrichtung 50 vor der Verwendung. Die 9 zeigt die Blisterverpackungstestvorrichtung 50, bei der ein Ende durch den Ablösestreifen 54 nach hinten abgelöst worden ist, um den Ausdehnungsgehäusehohlraum 58 und den Schwamm 32 des Teststreifens 28 freizulegen, so dass eine definierte Menge einer Flüssigkeitsprobe z.B. in der gezeigten Weise mit einer Pipette zugesetzt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Hohlraum 18 entsprechend dem Schwamm 32 dreiecksförmig, wie es in der 9 gezeigt ist.
Die 10 veranschaulicht die Testvorrichtung 50 nach der Zugabe der Flüssigkeitsprobe und mit wieder verschlossenem Ablösestreifen 54 und mit dem durch die Flüssigkeitsprobe innerhalb des Gehäusehohlraums 58 voll ausgedehnten Schwamm 32 und bereit zur Inkubation.
Die 11 veranschaulicht die Testvorrichtung 50 mit der Oberseite nach unten und wie sie in einen von zwei Hohlräumen 47 in dem Inkubator 46 angeordnet ist. Die 12 veranschaulicht die Technik des Zugebens der Flüssigkeitsprobe mit einer Pipette, während der Ablösestreifen 54 von dem Ende der Testvorrichtung 50 in dem Inkubator 46 weggezogen ist. Die Testvorrichtung 50 wird verschlossen und inkubiert. Die Testergebnisse des fertiggestellten Tests können durch eine transparente obere Abdeckung der Blisterverpackung 56 abgelesen werden, wie es in der 13 gezeigt ist, so dass positive oder negative Testergebnisse erhalten werden.
Der Inhibierungstest-Teststreifen 28 (7), der bezüglich beta-Lactamen in Milch ausgewählt wird, ist ein Schnelltest bezüglich beta-Lactamen in Rohmilch und pasteurisierter Milch, die gemischt sind. Bei der Verwendung wird eine Temperaturmesseinrichtung 48 in dem Inkubator 46 geprüft, um eine Inkubatortemperatur von etwa 55°C sicherzustellen. Beispielsweise kann die Temperaturanzeige 48 für die Verwendung gefärbt sein, wie z.B. grün. Die Testvorrichtung 50 wird mit der nach oben gerichteten flachen Seite in einen Hohlraum 47 des Inkubators 46 angeordnet und der Ablösestreifen 54 wird weit genug zurückgezogen, um den Schwamm 32 freizulegen, wie z.B. 1 cm. Die Milch wird vor dem Testen sorgfältig gemischt und etwa 0,2 bis 0,7 ml, vorzugsweise 0,3 bis 0,5 ml, werden mit einer Pipette dem freigelegten Schwamm 32 zugesetzt. Der Klebebandstreifen 54 wird durch Handdruck wieder versiegelt und die Abdeckung des Inkubators 46 wird verschlossen. Die Testvorrichtung 50 wird z.B. mindestens 6 bis 8 min inkubiert und dann von dem Inkubator 46 entfernt und vertikal gehalten und ein Vergleich wird innerhalb etwa einer Stunde zwischen der Testzone 38 und der Kontrollzone 40 durchgeführt. Wenn keine Kontrollzone 40 erscheint, ist der Test ungültig. Ein negativer Test liegt vor, wenn die Bezugszone 38 mit der Kontrollzone 40 iden tisch oder dunkler als diese ist. Ein positiver Test liegt vor, wenn die Testzone 38 fehlt oder deutlich heller als die Kontrollzone 40 ist.
Insbesondere umfasst die Testvorrichtung 10, die Analyten in biologischen Fluiden nachweisen kann, die folgenden Komponenten:
Der Schwamm 32, ein gepresstes Material wie z.B. Cellulose, kann ein biologisches Fluid absorbieren und als Vorfilter zum Entfernen von groben Verunreinigungen, wie z.B. von Haaren, Schmutz, usw., wirken. Der Schwamm 32 weist eine Größe auf, die derart ist, dass eine festgelegte Menge einer Probe, die erforderlich ist, um den Test abzuschließen, absorbiert wird. Wenn sich dieses gepresste Material ausdehnt und die Innenwand des Gehäuses 12 kontaktiert, verursacht es einen Druck, der ausreichend ist, um die kapillare Strömung entlang der Komponenten des Schwamms 32, des Trägers der mobilen Phase 33, der Membran der stationären Phase 36 und der Entsorgungszone 43 voranzutreiben, und zwar in der für einen vermarktbaren Test erforderlichen Zeit (etwa 3 bis 8 min). Der Schwamm 32 überlappt den Träger der mobilen Phase (Konjugatlage) 33 um 1 bis 10 mm, so dass dann, wenn eine wässrige Probe, wie z.B. Milch, dem Schwamm 32 zugesetzt wird, die Probe auf den Träger der mobilen Phase 33 strömt.
Die Testvorrichtung kann einen biologischen Rezeptor nutzen, der mit ausreichenden Mengen an Farb-, Infrarot-, Fluoreszenz- oder Lumineszenzfarbstoffen markiert ist. Die verflüssigte Probe (z.B. Milch, Mais, Futtermittel, Erdnussextrakt, Fleischextrakt, Serum, eine Umweltprobe, usw.) resuspendiert den markierten Rezeptor, der im Vorhinein mit leicht löslichen Additiven in einer Zusammensetzung der mobilen Phase stabilisiert worden ist. Der zeitgesteuert freigesetzte markierte Rezeptor reagiert mit dem Analyten in der Probe, während sie sich in eine Reaktionszone auf der Membran der stationären Phase 36 bewegt.
Rückstandsspezifische monoklonale Antikörper werden auch in die Zusammensetzung der mobilen Phase einbezogen, um überschüssigen Rückstand mit hoher Empfindlichkeit spezifisch zu binden, wodurch die Empfindlichkeit für diese spezifischen Rückstände nach unten eingestellt wird (um den Test weniger empfindlich zu machen). Da weniger dieser Rückstände zu Verfügung stehen, um mit dem Breitspektrumrezeptor zu konkurrieren, wird die Empfindlichkeit näher an die Erfordernisse der Vorschriften eingestellt. Beispielsweise ist die anfängliche Empfindlichkeit des beta-Lactam-Rezeptors für Cephapirin 3 bis 5 ppb. Durch das Einbeziehen spezifischer Antikörper für Cephapirin wird die Empfindlichkeit auf 15 bis 20 ppb eingestellt. Die vorgeschriebene „sichere" Konzentration in gemischter Rohmilch der „Fond and Drug Administration" beträgt 20 ppb.
Es sollte beachtet werden, dass spezifische Antikörper mit freien Antikörpern in einer Probe einen Komplex bilden, wodurch die komplexierten Antikörper für eine weitere Messung in jedwedem Bindungs- oder Rezeptorinhibierungstest nicht zur Verfügung stehen.
Das Gehäuse 12 sollte verwendet werden, um die Zugabe einer biologischen Probe entweder durch Eintauchen, Gießen oder Pipettieren zu ermöglichen. Das Gehäuse 12 kann aus einem flexiblen oder harten Material, wie z.B. Polystyrol, Polypropylen oder Polyethylen, aufgebaut sein.
Der Träger der mobilen Phase 33 kann aus einer Glasmembran oder einem Polymer, wie z.B. Polyester oder Polyethylen, hergestellt sein, die bzw. das als Sekundärfilter zum Entfernen von weniger groben Materialien (somatischen Zellen) wirkt. Der Träger wird mit einer chemischen Lösung, wie z.B. 0,01 bis 0,2 M Natriumcitrat, pH 6 bis 8, die Störungen neutralisieren kann, welche in biologischen Proben auftreten, vorbehandelt. Der Träger der mobilen Phase überlappt die Membran der stationären Phase 36 (Reaktionsstreifen) um etwa 1 bis 4 mm.
Die Farb- oder Fluoreszenz-Rezeptor/Antikörper-beschichteten Mikrokügelchen werden in einer Lösung suspendiert, die Protein, wie z.B. Rinderalbumin (BSA), Glycerin, Zucker oder ein Äquivalent davon, wie z.B. Saccharose (SUC) oder Trehalose (TRE), Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 8000 (PEG), Aminosäuregemische (AA) oder Detergenzien als Stabilisatoren und Benetzungsmittel enthält, und unter Verwendung eines Sprühgeräts, wie es z.B. von Biodot erhältlich ist, in der Membran absorbiert oder in diese gesprüht. Ferner werden die rückstandsspezifischen Antikörper in dieser Matrix sprühgetrocknet oder immobilisiert. Die Probenpufferung wird hier auch durch die Verwendung eines Puffers mit einem gegebenen pH-Wert, eines Salzes oder von jedwedem erforderlichen Cofaktor, der benötigt wird, um die Rezeptor/Antikörper-Bindungskinetik zu optimieren, optimiert.
Die mobile Phase umfasst hochspezifische Bindungsproteine, wie z.B. ein Enzym, oder monoklonale Antikörper, die an einen Analyten binden können und zu einer bekannten Konzentration titriert werden, um sie für eine(n) weitere(n) Reaktion/Nachweis einer bekannten Menge eines Analyten unverfügbar zu machen. Diese Unverfügbarkeit für eine(n) weitere(n) Reaktion/Nachweis ermöglicht die Einstellung einer Nachweiskonzentration von einem oder mehreren Analyten auf eine festgelegte interessierende Konzentration. Beispielsweise kann bei Ceftiofur, einem beta-Lactam mit einer Toleranzkonzentration von 50 ppb in Milch, die Empfindlichkeit von 5 ppb durch die Zugabe eines monoklonalen Antikörpers, der für Ceftio fur spezifisch ist, auf zwischen 40 und 50 ppb geändert werden. Der spezifische monoklonale Antikörper konkurriert mit dem markierten Rezeptor bezüglich der Entfernung eines spezifischen Analyten von einer Bindung an einen Rezeptor oder Antikörper, der an eine Familie verwandter Verbindungen binden kann.
Hochgereinigte Proteine, wie z.B. ein beta-Lactam-Rezeptor oder anti-tet IgG, die durch eine Affinitätsreinigung und/oder eine Kombination aus einer hydrophoben/Ionenaustauschchromatographie hergestellt worden sind, werden an eine gefärbte, fluoreszierende oder Infrarotsonde gebunden, die durch optische/instrumentelle Mittel oder beides beobachtet werden kann. Die Bindung von Proteinen an eine Sonde wird als Bindungsprotein/Sonde-Komplex bezeichnet.
Die Zusammensetzung der mobilen Phase 34, wie z.B. Goldkügelchen, wird auf eine Teilchengröße zwischen 10 und 60 nm eingestellt. Die Kügelchen können auf einen Träger der mobilen Phase 33, wie z.B. vorbehandeltes Polyethylen mit hoher Dichte, gesprüht werden. Die Zusammensetzung der mobilen Phase wird unter Verwendung eines Geräts, wie z.B. von Ivek, Biodot oder Camag, gesprüht oder auf einem Schwamm 32 in einer Lösung, die 5 bis 20 % Zucker, wie z.B. Saccharose oder Trehalose, 5 bis 20 % Protein, wie z.B. BSA oder Primatone, 5 bis 100 mm einer Pufferlösung (Phosphat- oder Trizma-Basis) mit einem EndpH zwischen 6 und 8 enthält, absorbiert. Die Zusammensetzung der mobilen Phase wird auf den oberen Abschnitt des Trägers der mobilen Phase derart gesprüht, dass der Schwamm 32 nicht den Abschnitt mit der aufgesprühten Zusammensetzung der mobilen Phase des Trägers der mobilen Phase überlappt, und zwar dadurch, dass der oberste Abschnitt des Schwamms 32 1 bis 7 mm vor dem besprühten Abschnitt der Zusammensetzung der mobilen Phase angeordnet wird.
Die Membran der stationären Phase kann aus Nitrocellulose oder Nylon bestehen und weist mehrere Reaktionszonen auf. Die Kontrollzone, die einen Antikörper für den Rezeptor enthält, wird gleichzeitig versprüht und die Nitrozellulose wird getrocknet. Die Zonendicke wird durch BSA, das der Zusammensetzung der mobilen Phase zugesetzt wird, eingestellt. Die Zusammensetzung der mobilen Phase wird derart auf den oberen Abschnitt des Trägers der mobilen Phase 33 gesprüht, dass die Zusammensetzung der mobilen Phase 34 nicht den Schwamm 32 überlappt, sondern vielmehr so, dass der Träger der mobilen Phase 33 den Schwamm 32 dadurch überlappt, dass der oberste Abschnitt des Schwamms 32 etwa 1 bis 7 mm vor dem besprühten Abschnitt der mobilen Phase angeordnet wird. Der Träger der mobilen Phase wird getrocknet und in einem Testsystem für die Empfindlichkeit aller Arzneistoffe getestet. Die Antikörperkonzentrationen in der Lösung der Zusammensetzung der mobilen Phase werden dann je nach Erfordernis eingestellt.
Um zu ermöglichen, dass die mobile Phase die beste Farb- oder Fluoreszenzreaktion erreicht, können hochgereinigte Proteine (z.B. der beta-Lactam-Rezeptor oder anti-tet IgG) durch (I) eine Affinitätsreinigung und/oder (ii) eine Kombination aus hydrophober/Ionenaustauschchromatographie hergestellt werden.
Für Farb-, Infrarot- oder Fluoreszenzsonden kann der Rezeptor/Antikörper entweder ein Farb-, Infrarot- oder Fluoreszenz-Farbstoff sein, der z.B. in einem 0,02 bis 10 Mikrometer-Mikrokügelchen oder kolloidalem Gold immobilisiert ist. Diese Träger absorbieren entweder Protein oder weisen funktionelle Gruppen, wie z.B. NH₂, COOH oder CHO, zum kovalenten Binden von Protein auf. Das Mikrokügelchen ist im Allgemeinen mit einer hohen Konzentration an hochspezifisch bindenden Proteinen beschichtet.
Typischerweise ist die Membran der stationären Phase aus Nitrocellulose, Nylon, Polyethylen oder einem anderen geeigneten Material ausgebildet. In der stationären Phase wird der repräsentative Arzneistoff mit einem hohen spezifischen Verhältnis an einen Träger wie z.B. ein Protein, wie z.B. BSA, IgG oder Protein A, gebunden. Die Membran der stationären Phase 36 weist Mehrfachreaktionszonen auf und umfasst eine Testzone 38, die unter Verwendung eines geeigneten Sprühgeräts in einer Linie gesprüht wird. Der Zweck der Testzone ist das Einfangen von nicht-umgesetztem Bindungsprotein/Sonde-Komplex zum Betrachten oder zum Messen. Die Testzone 38 (6) besteht aus einem nachzuweisenden Analyten, d.h. Ceforanid oder einem Mitglied der Analytfamilie, d.h. beta-Lactamen, der bzw. das an ein Trägerprotein, d.h. BSA, IgG, KLH, gebunden und in einer 5 bis 100 mM-Pufferlösung (wie z.B. Phosphat- oder Pufferbasis) bei einem pH-Bereich von 3 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8 suspendiert ist. Die Gesamtproteinkonzentration der Antikörperlösung reicht von 0,2 bis 100 mg/ml. Der Analytträger, der in einer Pufferlösung, wie z.B. 10 mM Phosphatpuffer, pH 6,9, die Zucker, wie z.B. Trehalose, oder andere Additive enthält, gelöst ist, wird als eine Linie auf die Membran der stationären Phase gesprüht. Eine Tentakelimmobilisierung eines Analytkonjugats an einen Mehrfachbindungsstellenträger, wie z.B. Protein A oder Latexmikrokügelchen, erhöht die Stabilität und die Bindungskapazität. Eine anschließende Wärmebehandlung der Membran stabilisiert die Haftung weiter. Auf der Testvorrichtung kann der Reaktionszone eine zweite Testzone hinzugefügt werden, um bezüglich eines zweiten Analyten zu testen. Beispielsweise kann die erste Testzone ein erstes Bindemittel für Amoxicillin, Ampicillin, Ceftiofur, Cephaparin und Penicillin G aufweisen. Die zweite Testzone kann ein zweites Bindemittel für Cloxacillin aufweisen. Alternativ kann die erste Testzone bezüglich beta- Lactamen testen und die zweite Testzone kann bezüglich Sulfonamiden testen. Zusätzliche Testzonen können zum Testen bezüglich zusätzlicher Analyten hinzugefügt werden.
Die Reaktionszone umfasst auch eine Kontrollzone 40, die in der 13 gezeigt ist und unter Verwendung eines geeigneten Sprühgeräts in einer Linienform gesprüht wird. Ein Zweck der Kontrollzone 40 besteht darin, einen Bindungsprotein/Sonde-Komplex, der nicht an die Testzone 38 gebunden hat, einzufangen. Die Kontrollzone 40 kann aus einem Antikörper bestehen, der für das Bindungsprotein/die Sonde spezifisch ist, und der in 5 bis 100 mM einer Pufferlösung (Phosphat oder Trizma) in einem pH-Bereich von 3 bis 10 suspendiert ist. Die Gesamtproteinkonzentration der Antikörperlösung reicht im Allgemeinen von 0,2 bis 100 mg/ml.
In einer Ausführungsform wird das Material für Ceforanid-SM der SMCC-BSA-NEM-Lösung zugesetzt und die Reaktion wird bei 4°C unter Rühren über Nacht fortgesetzt. Das Ceforanid-BSA wird dialysiert, um freies Ceforanid zu entfernen. Die Kontrollzone umfasst einen Antikörper für den markierten Rezeptor oder einen Breitspektrumantikörper, der als Linie parallel zur Testzone immobilisiert ist. Folglich wird der Rezeptor/Antikörper der Zusammensetzung der mobilen Phase in dieser Linie ungeachtet der Gegenwart oder des Fehlens eines Analyten in der Probe eingefangen. Die Kontrollzone besteht aus einem Antikörper, der für den beta-Lactam-Rezeptor hergestellt worden ist. Der Rezeptor wird mittels Affinitätschromatographie gereinigt.
Durch einen Vergleich der Kontrollzone mit der Testzone wird das Testergebnis erhalten. Typischerweise liegt dann, wen die Kontrollzone dunkler ist als die Testzone, der Analyt bei der Nachweiskonzentration oder mehr vor (vgl. die 6).
Die Entsorgungszone 43, die in der 7 gezeigt ist, ist typischerweise aus gepresster Cellulose oder einem anderen Absorptionsmittelmaterial hergestellt, um die Probenströmung einheitlich zu halten und die umgesetzte Probe zurückzuhalten. Die Entsorgungszone überlappt im Allgemeinen die Membran der stationären Phase 36 um etwa 1 bis 5 mm.
Die Mobilität der Probe (Milch, Blutserum oder andere Fluide) wird getestet, um die Reaktionszeiten und die Einheitlichkeit der Reaktion zu optimieren. Membranen mit großer Porengröße (15 bis 140 μm) werden verwendet, um eine Strömung viskoser Proben, wie z.B. Milch oder Serum, zu ermöglichen.
Die Entsorgungszone 43 umfasst typischerweise eine Absorptionsmittellage, bei der es sich um eine absorbierende Membran handelt, die aus einer Cellulose, einem synthetischen Schwamm oder einem anderen Material hergestellt ist. Diese Lage hält die Probe am Strömen und stoppt die Strömung bei der Sättigung, wodurch der Test eine zeitliche Kontrolle und ein vermindertes Hintergrundrauschen erhält.
Eine wässrige biologische Probe wird dem Schwamm 32 der Testvorrichtung zugesetzt. Der Schwamm 32 dient als Probenlage, die sich ausdehnt, wenn sie die Probe absorbiert. Die Schwammlage 32 überlappt den Träger der mobilen Phase 33 und das Fluid strömt auf den Träger der mobilen Phase 33, wobei sich die Materialien der mobilen Phase in dem biologischen Fluid lösen. Analyten, die in der Probe vorliegen, beginnen mit der Bindung an das bzw. die spezifische(n) Bindungsprotein(e), das bzw. die an der Sonde gebunden ist bzw. sind. Gleichzeitig binden spezifisch gebundene oder ungebundene Antikörper oder Bindungsproteine mit spezifischen Analyten, so dass deren Empfindlichkeit für den Test eingestellt wird. Der Träger der mobilen Phase 33 überlappt die Membran der stationären Phase 36 und das biologische Fluid reagiert zusammen mit der Zusammensetzung der mobilen Phase 34 (gefärbte Kügelchen) weiter, wenn die Materialien entlang der Membran der stationären Phase 36 strömen. Wenn der Bindungsprotein/Sonde-Komplex die Testzone 38 erreicht, bindet ein Teil des Bindungsprotein/Sonde-Komplexes an die Testzone. In einer positiven Probe wird der Analyt in der Probe an den Bindungsprotein/Sonde-Komplex gebunden, was die Menge an Bindungsprotein/Sonde-Komplex vermindert, die an die Testzone 38 binden kann. Wenn das Material die Kontrollzone 40 erreicht, bindet ein Teil des Bindungsprotein/Sonde-Komplexes an der Kontrollzone 40. Überschüssiges Reagenz wird dann in der Entsorgungslage 43 absorbiert.
In einer negativen Probe werden Reagenzien so titriert, dass die Testzone 38 die gleiche Menge oder vorzugsweise eine größere Menge der Sonde aufweist, die daran bindet, als in der Kontrollzone 40. Umgekehrt weist in einer positiven Probe die Kontrollzone 40 eine größere Menge der Sonde auf, die daran bindet, als die Testzone 38.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein beta-Lactam-Test zum Testen bezüglich beta-Lactamen in Milch bei einer Sicherheitskonzentration durchgeführt. Ein partiell gereinigter beta-Lactam-Rezeptor von BST (Bacillus stearothermophilus) wird an eine kolloidale Goldlösung gebunden, um eine beta-Lactam-bindende Protein/Goldkügelchen-Sonde herzustellen. Diese wird zusammen mit monoklonalen Antikörpern bezüglich Ceftiofur, Cephapirin, Ampicillin und Amoxicillin auf den Träger der mobilen Phase 33 gesprüht, um die Empfindlichkeit dieser vier Antikörper zu vermindern, so dass der Test eine gewünschte Dosisreakti on ergibt. Auf die Testzone 38 wird ein Ceforanid-BSA-Konjugat gesprüht und auf die Kontrollzone 40 wird ein Antikörper für den BST-beta-Lactam-Rezeptor gesprüht. Eine Rohmilchprobe, vorzugsweise zwischen 0,1 und 1,0 ml, wird mittels einer Pipette auf die Probenlage aufgebracht und der Teststreifen wird bei 55°C inkubiert. Nach etwa 8 min wird der Teststreifen 10 aus dem Inkubator entfernt und analysiert. Wenn die Testzone 38 dunkler ist oder die gleiche Farbe aufweist wie die Linie der Kontrollzone 40, ist die Probe negativ, und wenn die Testzone 38 heller ist als die Kontrollzone 40, ist die Probe positiv.
Die Testergebnisse sind in der Tabelle 1 in der folgenden Weise gezeigt: Tabelle 1. Beta-Lactam-Test in Milch unter Verwendung einer Lateralströmungstestvorrichtung
Der beschriebene Test ist ein Test des Inhibierungstyps. Der Analyt in der Probe bindet mit einer beta-Lactam-Bindungsprotein/Zusammensetzung der mobilen Phase-Sonde und inhibiert das Binden an ein stationäres beta-Lactam, das an die Oberfläche der Membran gebunden ist. Die Zugabe eines spezifischen monoklonalen Antikörpers bezüglich Ceftiofur hat dessen Inhibierungskonzentration von etwa 5 ppb zu zwischen 40 und 50 ppb verändert. Die Zugabe eines spezifischen monoklonalen Antikörpers zu Cephapirin hat dessen Empfindlichkeit von etwa 3 bis 5 ppb auf zwischen 15 und 20 ppb vermindert.
Die Testvorrichtung der Erfindung kann mit Teststreifen zum Nachweisen verschiedener Analyten verwendet werden, wie z.B. Toxinen, wie z.B. Alfatoxinen, Pestiziden, wie z.B. Organophosphaten und Carbamaten, sowie beta-Lactamen, wie z.B. Penicillin, Ampicillin, Amoxicillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Oxacillin, Ceftiofur und Cephapirin, Tetracyclinen, wie z.B. Chlortetracyclin, Oxytetracyclin und Tetracyclin, Sulfonamiden, wie z.B. Sulfamethazin, Sulfadimethoxin, Sulfamerazin, Sulfathiazol und Sulfadiazin, Makroliden, wie z.B. Erythromycin, Spiramycin und Tylosin, Aminoglykosiden, wie z.B. Gentamicin, Neomycin und DH/Striptomycin, und anderen, wie z.B. Dapson, Chloramphenicol, Novobiocin, Spectinomicin und Trimethoprim, um die maximalen Analytrückstandsgrenzen in der Probe nachzuweisen. Die meisten der Elemente für jeden Test sind identisch, mit Ausnahme der Chemie der mobilen Phase, der Testzone und der Kontrollzone, die für den spezifischen Analytnachweis maßgeschneidert wird.
Wenn die Probe von der Membran der stationären Phase 36 in die Entsorgungszone 43 strömt (bis zur Sättigung der Absorptionsmittellage), wird der nicht-umgesetzte markierte Rezeptor in der Reaktionszone durch einen repräsentativen Analyten einer immobilisierten Gruppe eingefangen. Der Chemikalienrückstand in der Probe reagiert mit dem markierten Rezeptor, wodurch dieser bezüglich der Testlinie unreaktiv wird. Folglich wird in der Testzone ein umso geringeres Signal nachgewiesen, je mehr Rückstand in der Probe vorliegt.
Die Membran der stationären Phase ist aus einer stark porösen Matrix aufgebaut, die für viskose Proben, wie z.B. Milch oder Fleischextrakte, geeignet ist. In jeder Zone ist eine Kombination löslicher Polymere (z.B. Proteine, Polyethylenglykol, usw.) eingebettet, um die Kinetik der Mobilität der Probe von der Zusammensetzung der mobilen Phase zur Reaktionszone und in der Reaktionszone selbst zu steuern.
Daten wurden mit einem mikrobiellen beta-Lactam-Rezeptor, spezifischen Antikörpern für Sulfamethazin, Tetracyclin und Aflatoxin (pt CHII ADAC) erzeugt, um einen Nachweis bezüglich des Vorliegens entsprechender Rückstände in Milch oder anderen Matrizen, wie z.B. Serum, durchzuführen. Mit diesen Experimenten wurden Konzentrationen von 3 bis 5 ppb Penicillin G (PEN G) und 5 bis 20 ppb Cephapirin, 30 bis 100 ppb Oxytetracyclin (OXT), 10 bis 100 ppb Sulfamethazin (SMZ) und 2 bis 40 ppb Aflatoxin B1 nachgewiesen.
Ein Inkubator mit einstellbarer Temperatur bis zu 70°C ist im Allgemeinen bevorzugt. Die Testvorrichtung kann ein tragbares Kolorimeter oder ein refraktives Fluorometer oder ein Infrarotlesegerät nutzen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Testvorrichtung ein Lesegerät, das zum Lesen eines Teststreifens verwendet wird, der zwei Linien enthält. Die Kontrolllinie ist eine Bezugslinie, die sicherstellt, dass der Test korrekt durchgeführt worden ist. Die Kontrolllinie wird auch als Bezug verwendet, wenn das Lesegerät bestimmt, ob die Probe positiv oder negativ ist. Die Testlinie zeigt die Konzentration der getesteten Substanz. Je dunkler die Testlinie ist, desto höher ist die Konzentration der Substanz in der Pro be. Das Lesegerät umfasst zwei Komponenten, nämlich eine Steuereinrichtung und ein Messgerät.
Das Messgerät liest den Streifen, wenn der Streifen in das Messgerät eingesetzt wird und das Messgerät den Befehl zum Lesen des Streifens erhält. Das Messgerät schaltet dann eine Reihe von lichtemittierenden Dioden (LED), vorzugsweise sieben, in regelmäßiger Wiederholung ein. Das von den LED's emittierte Licht wird von dem gelesenen Streifen reflektiert. Das Licht wird dann auf einen 128 × 1-Optosensor reflektiert. Der Sensor sendet 128 Datenwerte, welche die Intensität des Lichts an jedem der 128 Pixel darstellen, an eine im Gerät angeordnete Mikrosteuereinrichtung. Die Pixeldaten werden dann in dem Speicher des Messgeräts gespeichert. Die dunklen Bereiche des Streifens weisen einen niedrigeren Wert auf als die hellen Bereiche. Diese Information wird später verwendet, um die Intensität der zwei gelesenen Linien zu berechnen.
Die Steuereinrichtung sendet einen Befehl zu dem Messgerät, um die durch das Messgerät gelesenen Daten abzufragen. Die Steuereinrichtung führt mit den Daten Berechnungen durch, um die Intensität der zwei Linien zu berechnen. Wenn die Testlinie dunkler ist als die Kontrolllinie, dann weist der Test ein negatives Ergebnis auf. Wenn die Testlinie heller ist als die Kontrolllinie, dann weist der Test ein positives Ergebnis auf. Die Steuereinrichtung zeigt dem Anwender das Ergebnis sowie einen Rohwert an, der die Differenz der Intensität der zwei Linien darstellt.
Die Integration des Inkubators mit einer Faseroptik zum Lesen der Ergebnisse kann den Test vollautomatisch machen.
Die Testeinheit, wie z.B. in einer Blisterverpackungsform, wird in einem Inkubator angeordnet, der auf etwa 56,5°C ± 100 erwärmt worden ist. Das Band wird zurückgezogen und eine Flüssigkeitsprobe, 0,3 ml, wird der Probe zugesetzt und das Band wird wieder versiegelt. Die Testeinheit wird mindestens 5 min inkubiert.
Sobald die Probe der Probenvertiefung zugesetzt worden ist, wird sie von dem Probenschwamm, der sich innerhalb der Vertiefung ausdehnt, absorbiert. Der obere Abschnitt der Kunststoffvertiefung verhindert die volle Ausdehnung des Schwamms. Der Druck des Schwamms gegen die Vertiefung an der Oberseite und den Träger der mobilen Phase auf der Unterseite führt zu einer gewissen zusätzlichen Kraft zum Treiben der Flüssigkeitsprobe entlang des Teststreifens mit einer höheren Geschwindigkeit, als dies ansonsten der Fall wäre. Der Schwamm dehnt sich aus und die Probe bewegt sich als nächstes auf dem Träger der mobilen Phase und geht eine Wechselwirkung mit der Zusammensetzung der mobilen Phase ein. Die Zusammensetzung der mobilen Phase beginnt sich auf der Nitrozellulose zu bewegen. Während dieser Zeit binden vorhandene Rückstände oder Analyten in der Probe an den Rezeptor oder den Antikörper, der an dem Konjugat der mobilen Phase gebunden ist.
Wenn die Zusammensetzung der mobilen Phase die Testzone erreicht, bindet der freie markierte Rezeptor an die Testzone, was zu einer dunklen unteren Linie führt. Ein Rezeptor oder Antikörper mit gebundenem Analyten bindet nicht an die Testlinie, was zu einer nichtgefärbten oder hell gefärbten Testzonenlinie führt. Dies ist ein Test des aufeinander folgenden Inhibierungstyps, bei dem die betreffende Verbindung nicht an die Testzone bindet. Die Zusammensetzung der mobilen Phase bewegt sich über die Kontrollzone hinaus und auf eine Absorptionsmittellage, die als Vorrat zum Einfangen einer ungebundenen Zusammensetzung der mobilen Phase dient.
Die 14 bis 17 veranschaulichen eine Ausführungsform der Vorrichtung 101 in einer transparenten Blisterverpackung 103, die den Kunststoffversiegelungsstreifen 111 aus einem transparenten Band umfasst, um den Teststreifen 105 darin einzuschließen. Die Blisterverpackung 103 umfasst einen länglichen Hohlraum zum Halten des Streifens 105 und ein Ausdehnungshohlraumgehäuse 104 zur Bildung eines im Allgemeinen zahnbürstenförmigen Hohlraums innerhalb der Kunststoffblisterverpackung 103, und den Streifen 105. Wie es gezeigt ist, ist das Ausdehnungshohlraumgehäuse 104 dreieckig geformt. Die Blisterverpackung 103 umfasst eine Bewegungsbeschränkungszone 114, welche die Entsorgungslage 106 umgibt, und eine andere Bewegungsbeschränkungszone 115, welche die Haftkaschierung 113 an dem Punkt umgibt, an dem die Kaschierung 113 vor dem Probenabsorptionsschwamm 109 vorsteht. Die Bewegungsbeschränkungszonen 114, 115 bilden Klemmpunkte, die den Streifen 105 innerhalb der Blisterverpackung 103 halten. Die Vorrichtung ist daher so gestaltet, dass eine Stelle, an der eine Verengung vorliegt, an der Entsorgungslage 106 vorliegt, wobei sich in dieser Zone ein Absorptionsmittelmaterial befindet, das als Absorptionsmittellage wirkt. Vorzugsweise ist die Vorrichtung so gestaltet und die Anordnung von Komponenten ist derart, dass etwa 1 cm der Haftkaschierung vor der Probenschwammlage vorragt, die innerhalb der Probenaufbringzone enthalten ist. Der Streifen wird daher entweder an einem Ende oder an beiden Enden an Ort und Stelle gehalten, wodurch eine unbeeinträchtigte Probenströmung ermöglicht wird.
Die 15 zeigt eine Seitenschnittansicht einer Blisterverpackungstestvorrichtung 101 vor der Verwendung. Die 15 zeigt eine Blisterverpackungstestvorrichtung 101, bei der ein Ende durch den Ablösestreifen 112 zurückgezogen worden ist, so dass der Ausdehnungsge häusehohlraum 104 und die Trockenfilterabsorptionsmittelschwammlage 109 des Teststreifens 105 freiliegen, so dass eine definierte Menge einer Flüssigkeitsprobe z.B. in der gezeigten Weise mit einer Pipette zugesetzt werden kann. Die 17 veranschaulicht die Testvorrichtung 101 nach der Zugabe der Flüssigkeitsprobe und mit dem wieder versiegelten Ablösestreifen 112 und mit der durch die Flüssigkeitsprobe innerhalb des Gehäusehohlraums 104 vollständig ausgedehnten Schwammlage 109 bereit zur Inkubation.
Die 18 ist eine vergrößerte Ansicht der Absorptionsmittellage 109 der Testvorrichtung. Die 18 veranschaulicht die Verengung der Innenwände des Gehäuses in der Zone A zur Bildung einer Bewegungsbeschränkungszone 114, welche die Haftkaschierung 113 hält, und dadurch wird der Streifen 105 (in der 18 nicht gezeigt) innerhalb des Kunststoffblisters 113 an Ort und Stelle gehalten. Die 18 veranschaulicht auch die Luftraumzone B, die zwischen dem Streifen 105 und der Haftkaschierung 113 vorliegt, die eine einheitliche Strömung der Probe entlang des Streifens ermöglicht.

Claims

Testvorrichtung (50, 101) zum Nachweisen der Gegenwart eines Analytrückstands in einer Probe, die (a) eine Zusammensetzung einer mobilen Phase (34, 110) mit einem Rezeptor zum Binden mit dem Analyten, wobei die Zusammensetzung der mobilen Phase in der Probe mitgeführt werden kann, (b) eine Membran einer stationären Phase (36, 107) mit einem ersten Membranende, das mit der Zusammensetzung der mobilen Phase in Kontakt steht, und einem zweiten Membranende, wobei die Membran eine laterale kapillare Strömung der Probe von dem ersten Membranende zu dem zweiten Membranende zulässt, (c) eine Testzone (38) auf der Membran der stationären Phase (36, 107) zwischen dem ersten Membranende und dem zweiten Membranende, die ein erstes Bindemittel zum Binden mit einem ungebundenen Rezeptor aufweist, (d) eine Kontrollzone (40) auf der Membran der stationären Phase zwischen der Testzone und dem zweiten Membranende, die ein zweites Bindemittel zum Binden mit einem Analyt-gebundenen Rezeptor aufweist, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung der mobilen Phase ferner einen Antikörper oder zusätzliches Bindemittel umfasst, der bzw. das an einen ausgewählten Analyten bindet, um mit dem Rezeptor zu konkurrieren, wodurch die Empfindlichkeit für den ausgewählten Analyten vermindert wird.
Testvorrichtung nach Anspruch 1, bei welcher das zusätzliche Bindemittel ein Antikörper ist, der aus den Antikörpern für Cephapirin, Ampicillin, Ceftiofur und Amoxicillin ausgewählt ist.
Testvorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welcher der Rezeptor ein markierter Rezeptor ist, der eine Familie von Analyten bindet, die ähnlich strukturierte Bindungsstellen aufweisen.
Testvorrichtung nach Anspruch 3, bei welcher Mitglieder der Familie von Analyten unterschiedliche Nachweiskonzentrationsanforderungen aufweisen und bei welcher der Antikörper oder das zusätzliche Bindemittel ein Antikörper ist und mit dem markierten Rezeptor in einer Menge gemischt ist, die derart ist, dass die Empfindlichkeit für den ausgewählten Analyten so eingestellt wird, dass kein positives Ergebnis erhalten wird, sofern nicht ein bestimmter Schwellenwert des ausgewählten Analyten in der Probe vorliegt.
Testvorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche zum Nachweisen von Antibiotikarückständen in Milch.