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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Chelatverbindungen,
Radionuklidmetall-Chelatverbindung (das heißt Komplexe) und Radio-markierte
Targeting-Einheiten (das heißt
Konjugate), die daraus gebildet werden und Verfahren zur Herstellung
und die Verwendung dieser Verbindungen, Komplexe und Konjugate für diagnostische
und therapeutische Zwecke. Die Erfindung betrifft insbesondere Verbindungen,
in denen mindestens zwei der chelatisierenden Atome Stickstoffatome
sind, die direkt an aromatische Ringe gebunden sind und bei denen
ein Nicht-Wasserstoffsubstituent direkt an wenigstens eines dieser
chelatisierenden Stickstoffatome gebunden ist.
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Hintergrund
der Erfindung
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Radio-markierte
Chelatverbindung werden seit einer Vielzahl an Jahren untersucht
und als Pharmazeutika zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken
eingesetzt. Die Anforderungen an eine geeignete Radio-markierte
Verbindung sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Nuklearmedizin
und der radiopharmazeutischen Forschung wohl bekannt. Zusammengefasst
umfassen die Anforderungen: effiziente Endherstellung des Radiopharmazeutikums,
so dass die Herstellung im Krankenhaus oder der Apotheke möglich ist;
effizienter Transport des Radiopharmazeutikums zum Zielorgan; effiziente
Extraktion des Radiopharmazeutikums durch das Zielorgan, so dass
geeignete Ziel zu Hintergrund-Verhältnisse erhalten werden, die
diagnostische und therapeutische Unterscheidungen ermöglichen
und geeignete Retention im Zielorgan, um den Nachweis und die Therapie
unter Verwendung einer konventionell erhältlichen Strahlungsnachweisausrüstung zu
ermöglichen.
Beispielhafte Organe, die interessant sind, sind solche, die maligne
Zellen oder aktivierte Plättchen
enthalten. Bildgebende Mittel oder therapeutische Mittel waren typischerweise
aufgrund von schlechter in vivo Stabilität nach der Chelatisierung,
die zu einer nicht geeigneten Retention und einer Akkretion in den
betroffenen Zellen führen,
ungeeignet.
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Aus
diesem Grund besteht im Stand der Technik ein Bedürfnis nach
verbesserten Chelatverbindungen zur Bildgebung und Therapie. Die
vorliegende Erfindung erfüllt
dieses Bedürfnis
und stellt weiterhin andere, damit in Zusammenhang stehende Vorteile
bereit.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Zusammengefasst:
die vorliegende Erfindung stellt in einem Aspekt Verbindungen gemäß Anspruch
1 bereit. Es werden dort Verbindungen mit der folgenden Formel offenbart:
wobei:
n = 0 oder 1
ist,
R
1 und R
2 unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff, =O mit der Maßgabe,
dass nicht beide =O sind, -(CH
2)
m-Z, wobei m 0-10 ist und Z eine Konjugationsgruppe
oder eine Targeting-Einheit darstellt, oder -(CH
2)
m-W, wobei m 0-10 ist und W eine hydrolysierbare
Gruppe darstellt, oder R
1 und R
2 zusammen
genommen worden sind, um ein cyclisches Anhydrid oder einen Benzolring
zu bilden;
R
3 Wasserstoff, Niederalkyl,
Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z oder -(CH
2)
m-W ist;
R
4 und
R
5 an einer oder mehr Ringpositionen befestigt
sind und unabhängig
ausgewählt
sind aus Wasserstoff, Niederalkyl, Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro,
-(CH
2)
m-Z und -(CH
2)
m-W;
R
6 und R
7 unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff mit der Maßgabe,
dass nicht beide Wasserstoff sind, Niederalkyl, Alkoxy, Halogen,
Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z
und -(CH
2)
m-W und
wobei Q eine multivalente
Säurefunktionalität darstellt,
die in der Lage ist, mit Metallionen zu koordinieren und p = 0 bis
1 ist, R
12 und R
13 unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff, Hydroxyl, Carboxyl, Phosphor und Kohlenwasserstoffradikalen
mit 1-10 Kohlenstoffatomen und physiologisch akzeptable Salze der
Säureradikale,
X,
X', Y und Y' unabhängig ausgewählt sind
aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, um unabhängig 5-
oder 6-gliedrige aromatische Ringe zu bilden, wobei die verbleibenden
Ringatome Kohlenstoff sind;
A und A' unabhängig ausgewählt sind aus Schwefel, Stickstoff
und Sauerstoff, wobei ein Stickstoff ein Wasserstoff tragen kann,
oder wo A und A' Stickstoff
sind A R
8 oder R
10 oder
beides tragen kann und A' R
9 oder R
11 oder beides
tragen, wobei R
8, R
9,
R
10 und R
11 unabhängig aus
Niederalkyl, Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z, -(CH
2)
m-W und
ausgewählt sind oder R
8 und
R
10 können
verbunden sein, um ein cyclisches Anhydrid zu bilden oder R
9 und R
11 können verbunden
sein, um ein cyclisches Anhydrid zu bilden, oder wenn A und A' beides Stickstoff
sind, können
R
10 und R
11 verbunden
sein, um T zu bilden, wobei T
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Ist
und n 0 bis 1 ist, und R1' und R2' unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff, =O mit der Maßgabe, dass
nicht beide =O sind, -(CH2)m-Z
und -(CH2)m-W, oder
R1' und
R2' sind
zusammen genommen worden, um ein cyclisches Anhydrid oder einen
Benzolring zu bilden; und R3' Wasserstoff, Niederalkyl,
Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro, -(CH2)m-Z oder -(CH2)m-W ist und die Verbindung wenigstens ein
Z, W oder Q aufweist.
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Die
Erfindung stellt Chelate bereit, die Radionuklid-Metalle (einschließlich Oxide
oder Nitride davon), die mit einer oben beschriebenen Verbindung
komplexiert sind, bereit. Eine offenbarte Metallchelat-Verbindung
besitzt die Formel:
wobei:
M ein Radionuklidmetall
oder ein Oxid davon oder ein Nitrid davon ist, welches ausgewählt ist
aus Technetium, Kupfer, Rhenium, Samarium, Yttrium, Indium, Blei,
Bismuth, Ruthenium, Rhodium, Gold und Palladium;
n = 0 oder
1 ist,
R
1 und R
2 unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff, =O mit der Maßgabe,
dass nicht beide =O sind, -(CH
2)
m-Z, wobei m 0-10 ist und Z eine Konjugationsgruppe
oder eine Targeting-Einheit darstellt, oder -(CH
2)
m-W, wobei m 0-10 ist und W eine hydrolysierbare
Gruppe darstellt, oder R
1 und R
2 zusammen
genommen worden sind, um ein cyclisches Anhydrid oder einen Benzolring
zu bilden;
R
3 Wasserstoff, Niederalkyl,
Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z oder -(CH
2)
m-W ist;
R
4 und
R
5 an einer oder mehr Ringpositionen befestigt
sind und unabhängig
ausgewählt
sind aus Wasserstoff, Niederalkyl, Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro,
-(CH
2)
m-Z und -(CH
2)
m-W;
R
6 und R
1 unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff mit der Maßgabe,
dass nicht beide Wasserstoff sind, Niederalkyl, Alkoxy, Halogen,
Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z
und -(CH
2)
m-W und
wobei Q eine multivalente
Säurefunktion
darstellt, die in der Lage ist, mit Metallionen zu koordinieren
und p = 0 bis 1 ist, R
12 und R
13 unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff, Hydroxyl, Carboxyl, Phosphor und Kohlenwasserstoffradikalen
mit 1-10 Kohlenstoffatomen und physiologisch akzeptable Salze der
Säureradikale,
X,
X', Y und Y' unabhängig ausgewählt sind
aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel, um unabhängig 5-
oder 6-gliedrige aromatische Ringe zu bilden, wobei die verbleibenden
Ringatome Kohlenstoff sind;
A und A' unabhängig ausgewählt sind aus Schwefel, Stickstoff
und Sauerstoff, wobei ein Stickstoff ein Wasserstoff tragen kann,
oder wo A und A' Stickstoff
sind A R
8 oder R
10 oder
beides tragen kann und A' R
9 oder R
11 oder beides
tragen, wobei R
8, R
9,
R
10 und R
11 unabhängig aus
Niederalkyl, Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z, -(CH
2)
m-W und
ausgewählt sind oder R
8 und
R
10 können
verbunden sein, um ein cyclisches Anhydrid zu bilden oder R
9 und R
11 können verbunden
sein, um ein cyclisches Anhydrid zu bilden, oder wenn A und A' beides Stickstoff
sind, können
R
10 und R
11 verbunden
sein, um T zu bilden, wobei T
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Ist
und n 0 bis 1 ist, und R1' und R2' unabhängig ausgewählt sind
aus Wasserstoff, =O mit der Maßgabe, dass
nicht beide =O sind, -(CH2)m-Z,
oder R1' und
R2' sind
zusammen genommen worden, um ein cyclisches Anhydrid oder einen
Benzolring zu bilden; und R3' Wasserstoff, Niederalkyl,
Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro, -(CH2)m-Z oder -(CH2)m-W ist und die Verbindung wenigstens ein
Z, W oder Q aufweist.
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In
noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verbindungen
der Erfindung zum Einsatz in einem diagnostischen oder therapeutischen
Verfahren bereit. Ein diagnostisches Verfahren benennt den Nachweis
der Anwesenheit oder des Fehlens einer Zielstelle in einem Säugetier-Gast.
Dieses Verfahren umfasst die Bereitstellung einer diagnostisch effektiven
Dosis einer Verbindung der vorliegenden Erfindung, welche ein Metall-Radionuklid,
wie 99mTc und/oder 111In,
enthält
an Zellen und den Nachweis der Bioverteilung der Radionuklide. Ein
therapeutisches Verfahren benennt die Bereitstellung eines Radionuklids
wie 186Re/188Re, 90Y und 153Sm an
eine Zielstelle in einem Säugetier-Gast.
Dieses Verfahren umfasst die Bereitstellung einer therapeutisch
effektiven Dosis einer Chelat-Verbindung der vorliegenden Erfindung
an Zellen.
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Andere
Aspekte der Erfindung werden unter Verweis auf die folgende detaillierte
Beschreibung offensichtlich werden.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Vor
der Beschreibung der Erfindung kann es für deren Verständnis hilfreich
sein, Definitionen von bestimmten Begriffen, die hier verwendet
wurden, zu geben.
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Eine
Targeting-Einheit ist jedes Molekül, dass an eine bestimmte Population
an Zellen bindet und umfasst Analoga von natürlich vorkommenden und synthetisch
oder rekombinatorisch hergestellten Molekülen. Die Targeting-Einheit
kann an einen Rezeptor, ein Oligonukleotid, ein enzymatisches Substrat,
eine antigene Determinante oder andere Bindungsstellen, die auf
oder in der Zielpopulation vorhanden sind, binden. Zum Beispiel
kann ein Protein eine Targeting-Einheit sein. Antikörper und
Peptide werden in der Beschreibung als prototypische Beispiele für Targeting-Einheiten
benutzt. Bei der Beschreibung der Erfindung wird Tumor als prototypisches
Beispiel eines Ziels verwendet.
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Protein,
wie hier verwendet, umfasst Proteine, Fusionsproteine, Polypeptide
und Peptide und kann ein intaktes Molekül, ein Fragment davon oder
ein funktionales Äquivalent
davon sein und kann gentechnisch hergestellt sein.
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Antikörper, wie
hier verwendet, umfasst polyklonale sowohl als auch monoklonale
Antikörper
und kann ein intaktes Molekül,
ein Fragment davon oder ein funktionales Äquivalent davon sein und kann
gentechnisch hergestellt sein. Beispiele an Antikörper-Fragmenten
schliessen F(ab')2, Fab',
Fab und Fv ein.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Chelatverbindungen und Radionuklidmetall-Chelatverbindung
(das heißt
Komplexe), die ausgehend davon hergestellt wurden, genauso wie Radio-markierten
Targeting-Einheiten, die die Chelatverbindungen oder Chelate daran
gebunden enthalten (das heißt
Konjugate). Die Radionuklidmetall-Chelate der vorliegenden Erfindung
können
an Targeting-Einheiten, wie Antikörper und Proteine, gebunden
sein, um Radio markierte Targeting-Einheiten zu bilden, die diagnostische
und therapeutische Verwendung besitzen.
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Alternativ
können
die Radionuklidmetall-Chelate der vorliegenden Erfindung ohne Bindung
an Targetineinheiten zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken
eingesetzt werden.
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Die
vorliegende Erfindung stellt Verbindungen bereit, die eine Vielzahl
an Verwendungen, einschließlich
der Abbildung von malignen Zellen und Therapie genauso wie Thrombusabbildung
besitzen. Die Verbindungen sind in der Lage, schnell an ein Metall
zu komplexieren, genauso wie ein stabiles Metallchelat (Komplex)
zu bilden. Die Anwesenheit von Stickstoffatomen innerhalb der chelatisierenden
Verbindung beschleunigt die Komplexbildung mit dem Metall. Diese
Beschleunigung liegt teilweise an der Tatasache, dass ein Metall (zum
Beispiel Technetium) eine weiche Säure ist und Stickstoff (in
Form eines Amins oder eines Amids) eine Base ist. Amine bewirken
im Allgemeinen einen größeren Anstieg
in den Chelatisierungsgeschwindigkeiten als Amide. Dort wo Schwefelatome
zusätzlich
in der Chelatverbindung vorhanden sind, stellen diese eine erhöhte Metallkomplexierungsgeschwindigkeit
bereit und tragen zur Stabilität
der erhaltenen Chelate bei. Die Anwesenheit von phenolischen Hydroxylgruppen
innerhalb der Chelatverbindung hilft bei schnelleren Kinetiken der Metallionenchelatisierung.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind durch wünschenswerte
Eigenschaften der Metall-Chelat-Retentionsthermodynamik
charakterisiert. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen
den weiteren Vorteil an Stickstoffatomen, die direkt an aromatische
Ringe gebunden sind, die bei schnellen Chelatisierungskinetiken
helfen und weiter die Stabilität
der aromatischen Ester dieser Erfindung im Hinblick auf Hydrolyse
im Blutstrom erhöhen.
Weiterhin ist ein zusätzlicher
Vorteil der vorliegenden Erfindung die Anwesenheit von Substituenten,
die in der Chelatverbindung an die Stickstoff-Atome gebunden sind, da
diese der Chelatverbnindung eine höhere Basizität verleihen
und weitere Donoratome zur Komplexierung ermöglichen und somit den Typ an
Radionukliden, die für
die Radiotherapie und Radionachweis der vorliegenden Erfindung geeignet
sind, erweitern. Zusätzlich
zu den oben genannten Vorteilen verstärkt die Anwesenheit von Substituenten
die Pharmakokinetiken und Pharmakodynamiken, wie zum Beispiel biopharmazeutische
Eigenschaften (Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung).
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Die
Chelatverbindungen der vorliegenden Offenbarung besitzen die folgende
Formel (I):
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Beispiele
an spezifischen Ausführungsformen
der Elemente der oben stehenden Formel umfassen die Folgenden:
R1 und R2 können unabhängig ausgewählt sein
aus Wasserstoff (H), einer Oxygruppe (=O), -(CH2)m-Z, wobei m 0-10 ist und Z eine Konjugationsgruppe
oder eine Targeting-Einheit darstellt, oder -(CH2)m-W, wobei m 0-10 ist und W eine hydrolysierbare
Gruppe darstellt. Wie hier verwendet bedeutet der Ausdruck unabhängig ausgewählt, dass
die Auswahl eines Substituenten ohne Rücksicht auf die die Auswahl
des anderen Substituenten gemacht werden kann. Alternativ können R1 und R2 zusammen
genommen werden, um eine cyclische Gruppe zu bilden, wie zum Beispiel
ein cyclisches Anhydrid oder einen Benzolring. Wie hier verwendet
bedeutet Benzolring, dass dies Benzol oder ein Benzol mit einem
oder mehr Substituenten sein kann. Ein Substituent kann jede Elektronen-schiebende
(Methyl, Methoxy, Amin und ähnliche)
und/oder Elektronen-ziehende (Halogene, Nitro, Carboxy, Nitril und ähnliche)
und funktionelle Gruppe (Ester, Imidate, Carbaminate und ähnliche),
die im Stand der Technik bekannt sind, sein. Beispiele an solchen
Substituenten umfassen Cl, CH3, OCH3, F, Br, I, CF3 und
ein Triazen, wie ein -N=N-N(CH3)2.
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Wie
oben angegeben stellt Z eine Konjugationsgruppe oder eine Targeting-Einheit dar. Eine „Konjugationsgruppe" in den Verbindungen
der vorliegenden Erfindung ist jede chemisch reaktive Gruppe, die
in der Lage ist, unter Bedingungen, die die funktionellen Eigenschaften
einer Targeting-Einheit nicht negativ beeinflussen, eine kovalente
Bindung mit der Targeting-Einheit auszubilden. Dort wo die Targeting-Einheit
beispielsweise ein Protein, wie zum Beispiel ein Antikörper ist,
ist die Kojugationsgruppe ausreichend reaktiv mit einer funktionellen
Gruppe auf dem Protein, so dass die Reaktion in im Wesentlichen
wässrigen
Lösungen
und ohne äußere Kräfte (zum
Beispiel mittels Erhitzens auf hohe Temperaturen, die das Protein
denaturieren könnten) durchgeführt werden
kann.
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Eine
Konjugationsgruppe kann stark elektrophil oder nukleophil und dadurch
in der Lage sein, direkt mit einer Targeting-Einheit zu reagieren.
Eine Vorstufe zu einer Konjugationsgruppe kann ein schwächeres Elektrophil
oder Nukleophil sein, das vor Konjugation mit einer Targeting-Einheit
eine Aktivierung erfordert. Umwandlung einer Gruppe aus einer Vorstufen-Gruppe
zu einer Konjugationsgruppe wird im Allgemeinen in einem separaten
Schritt vor der Konjugation mit einer Targeting-Einheit durchgeführt. Wenn
jedoch eine Targeting-Einheit mit den Umwandlungsreagentien nicht
reaktiv ist und von den Reaktionsbedingungen nicht beeinflußt wird,
ist es möglich,
eine Konjugationsgruppe in der Gegenwart der Targeting-Einheit zu
erzeugen.
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Eine
elektrophile Konjugationsgruppe kann direkt mit einem Nukleophil
reagieren, entweder durch nukleophile Substitution oder durch nukleophile
Addition. In der vorliegenden Erfindung reagieren elektrophile Konjugationsgruppen
mit der Targeting-Einheit, die als das Nukleophil wirkt. Eine Targeting-Einheit
kann von Natur eine oder mehrere nukleophilie Gruppen besitzen.
Eine Targeting-Einheit kann zum Beispiel eine Aminogruppe oder eine
Sulfhydrylgruppe enthalten. Alternativ kann eine Targeting-Einheit
modifiziert worden sein, um eine oder mehrere nukleophile Gruppen
zu enthalten. Verfahren zur Modifizierung von Molekülen, um
nukleophile Gruppen zu enthalten, sind den Fachleuten gut bekannt
(siehe zum Beispiel Katalog von Pierce Chemical Co., Rockford, IL,
und U.S.-Patent Nr. 4,659,839).
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Elektrophile
Gruppen, die Konjugation durch nukleophile Substitution liefern,
schließen
diejenigen Gruppen ein, die Substituenten enthalten, die leicht
verdrängt
werden. Solche leicht zu verdrängenden
Substituenten werden üblicherweise
als Abgangsgruppen bezeichnet. Abgangsgruppen schließen Halogenide,
die aus Alkylhalogeniden und Alpha-Halocarbonylverbindungen leicht
verdrängt
werden, bzw. Carboxylat und stabilisierte Oxyanionen ein, die aus
Carbonyl-haltigen Gruppen, wie etwa Anhydriden und Aktivestern,
leicht verdrängt
werden. Zusätzlich
zu Halogenid-Ion-Abgangsgruppen, wie etwa Iodid-, Bromid- und Chlorid-Ionen, schließen weitere
Abgangsgruppen zum Beispiel Carboxylat-Ionen, wie etwa Acetat und
Trifluoracetat, und Phenolat-Ionen, wie etwa Phenolat und p-Nitrophenolat,
ein. Geeignete Aktivester-Gruppen, schließen N-Hydroxysuccinimidyl,
Tetrafluorphenyl, Nitrophenyl und 1-Hydroxybenzotriazolyl ein.
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Elektrophile
Gruppen, die Konjugation durch nukleophile Addition liefern, schließen diejenigen
Gruppen ein, die ungesättigte
Kohlenstoffatome enthalten, die für nukleophile Additionen empfänglich sind.
Geeignete elektrophile Kohlenstoffspezies schließen Thiocyanate, Isocyanate,
Isothiocyanate und Maleimide ein.
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Wie
oben erwähnt,
kann eine Konjugationsgruppe, die in der Lage ist, direkt mit einer
Targeting-Einheit zu reagieren, durch Umwandlung einer schwächeren elektrophilen
oder nukleophilen Gruppe in eine stärkere hergestellt werden. Eine
Carbonsäuregruppe
ist eine Vorstufen-Gruppe, die aktiviert werden kann (zum Beispiel
durch Umwandlung in eine Aktivester-Konjugationsgruppe, die zur
Reaktion mit Targeting-Einheiten, wie oben beschrieben, in der Lage
ist). Ein weiteres Beispiel einer Umwandlung in eine starke elektrophile
Gruppe ist das Entschützen
eines Phenylsulfonylsuccinimids, um ein Maleimid zu liefern, das
zur Reaktion mit nukleophilen Targeting-Einheiten, wie oben beschrieben,
in der Lage ist.
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Die
Konjugationsgruppe kann auch eine nukleophile Gruppe sein, wie etwa
eine Amino- oder Sulfhydrylgruppe. Solch ein Nukleophil ist in der
Lage, mit einer elektrophilen Targeting-Einheit zu reagieren, wie etwa
einer, die von Natur eine oder mehrere elektrophile Gruppen besitzt,
oder einer, die so modifiziert worden ist, dass sie eine oder mehrere
elektrophile Gruppen einschließt.
Eine Targeting-Einheit
kann zum Beispiel eine Aktivester- oder eine Maleimid-Gruppe enthalten.
Alternativ sind den Fachleuten Verfahren zur Modifizierung von Molekülen, um
elektrophile Gruppen zu enthalten, gut bekannt (siehe zum Beispiel
Katalog von Pierce Chemical Co., Rockford, IL, und U.S.-Patent Nr.
4,671,958).
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Alternativ
kann Z eine Targeting-Einheit statt einer Konjugationsgruppe sein.
Eine "Targeting-Einheit" in den Verbindungen
der vorliegenden Erfindung hat die funktionelle Eigenschaft, dass
sie an eine definierte Target-Zellpopulation bindet, wie etwa Turmorzellen.
Bevorzugte Targeting-Einheiten, die in dieser Hinsicht nützlich sind,
schließen
Antikörper
und Antikörperfragmente,
Peptide, Hormone, Avidin, Streptavidin und Biotin ein. Proteine,
die bekannten Zelloberflächenrezeptoren
(einschließlich
low density-Lipoproteinen, Transferin und Insulin) entsprechen,
fibrinolytische Enzyme, anti-HER2, Plättchen-bindende-Proteine wie etwa
Annexine, Avidin, Streptavidin, und Modifikatoren der biologischen
Antwort (einschließlich
Interleukin, Interferon, Erythropoietin und Kolonie-stimulierendem
Faktor, TNF-Gewebe-Nekrose-Faktor und ähnliche Cytokine) sind ebenfalls
bevorzugte Targeting-Einheiten. Anti-EGF-Rezeptor-Antikörper, die
sich im Anschluß an
die Bindung an den Rezeptor internalisieren und in gewissem Umfang
zum Kern wandern, sind bevorzugte Targeting-Einheiten zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung, um die Zuführung
von Auger-Emittern und Kern-bindenden Wirkstoffen zu den Target-Zellkernen
zu erleichtern. Oligonukleotide, zum Beispiel antisense-Oligonukleotide, die
zu Bereichen von Target-Zellnukleinsäuren (DNA oder RNA) komplementär sind,
sind ebenfalls als Targeting-Einheiten in der Praxis der vorliegenden
Erfindung nützlich.
Oligonukleotide, die an Zelloberflächen binden, sind ebenfalls
nützlich.
Analoga, einschliesslich der oben aufgeführten Targeting-Einheiten,
die die Fähigkeit
beibehalten, sich an eine definierte Target-Zellpopulation zu binden,
können
ebenfalls im Rahmen der beanspruchten Erfindung verwendet werden.
Zusätzlich
können
synthetische oder rekombinante Targeting-Einheiten entwickelt und
hergestellt werden.
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Funktionelle Äquivalente
der obengenannten Moleküle
sind ebenfalls als Targeting-Einheiten der vorliegenden Erfindung
nützlich.
Ein Beispiel für
ein funktionelles Äquivalent
einer Targeting-Einheit ist eine "mimetische" Verbindung, die ein Konstrukt der organischen
Chemie ist, welches so konstruiert ist, dass sie die richtige Konfiguration
und/oder Orientierung für
die Bindung zwischen Targeting-Einheit und Targetzelle nachahmt.
Ein weiteres Beispiel für
ein funktionelles Äquivalent
einer Targeting-Einheit ist ein kurzes Polypeptid, das als ein "minimales" Polypeptid bezeichnet
wird. Solch ein Polypeptid wird unter Verwendung computerunterstützter Molekülmodellierung
und Mutanten mit veränderter
Bindungsaffinität
zu der Targeting-Einheit konstruiert.
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Wie
oben offenbart sind Proteine, Antikörper (polyklonal oder monoklonal),
Peptide, Oligonukleotide oder dergleichen bevorzugte Targeting-Einheiten
der vorliegenden Erfindung. Polyklonale Antikörper, die in der Praxis der
vorliegenden Erfindung nützlich
sind, sind polyklonal (Vial und Callahan, Univ. Mich. Med. Bull. 20:284-6,
1956), affinitätsgereinigt
polyklonal oder Fragmente davon (Chao et al., Res. Comm. in Chem.
Path. & Pharm.
9:749-61, 1974).
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Monoklonale
Antikörper,
die in der Praxis der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen ganze Antikörper und
Fragmente derselben ein. Solche monoklonalen Antikörper und
Fragmente sind gemäß herkömmlicher
Techniken herstellbar, wie etwa Hybridoma-Synthese, rekombinanten
DNA-Techniken und Proteinsynthese. Nützliche monoklonale Antikörper und
Fragmente können
von jeder Spezies (einschließlich
Menschen) gewonnen werden oder können
als chimäre
Proteine hergestellt werden, die Sequenzen aus mehr als einer Spezies
einsetzen. Siehe allgemein Kohler und Milstein, Nature 256:495-97,
1975; Eur. J. Immunol. 6:511-19,1976.
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Menschliche
monoklonale Antikörper
oder ein "vermenschlichter" muriner Antikörper sind
ebenfalls als Targeting-Einheiten gemäß der vorliegenden Erfindung
nützlich.
Ein muriner monoklonaler Antikörper
kann zum Beispiel dadurch "vermenschlicht" werden, dass die
Nukleotidsequenz, die die murine Fv-Region (d.h., die die Antigen-Bindungsstellen
enthält)
kodiert, oder die die Komplementarität bestimmenden Regionen („CDR's") davon, gentechnologisch mit der Nukleotidsequenz
genetisch kombiniert wird, die eine menschliche konstante Domänenregion
und eine Fc-Region (das heißt
menschliches Gerüst)
kodiert, zum Beispiel in einer Art und Weise, die ähnlich ist
zu derjenigen, die in den US-Patenten 4,816,397; 4,816,567; 5,530,101
und 5,585,089 offenbart ist. Einige murine Reste können auch
innerhalb der menschlichen Domänen
des Variable-Region-Systems beibehalten werden, um richtige Target-Stellen-Bindungseigenschaften
zu gewährleisten. Von
vermenschlichten Targeting-Einheiten
ist bekannt, dass sie die Immunreaktivität des Antikörpers oder Polypeptids im Wirtsempfänger senken,
was einen Anstieg der Halbwertszeit und eine Verringerung der Möglichkeit
nachteiliger Immunreaktionen erlaubt.
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Eine
weitere bevorzugte Targeting-Einheit der vorliegenden Erfindung
sind ein Annexin und andere Plättchen-bindende
Proteine wie zum Beispiel PAP-1 („Placental Anticoagulant Protein
oder Annexin V). Annexine sind (mit Ausnahme von Annexin II) einzelsträngige, nicht
glycosylierte Proteine mit ungefähr
36 Kilodalton. In der Gegenwart von Calcium besitzen diese Proteine
ein insbesonders hohe Affinität
zu negativ geladenen Phospholipiden, wie zum Beispiel Phosphatitylserin.
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Wie
oben erwähnt,
ist W eine hydrolysierbare Gruppe. Wie hierin verwendet, betrifft
der Begriff "hydrolysierbare
Gruppe" jede neutrale
organische Gruppe, die bei Hydrolyse eine geladene Gruppe liefert.
Die Hydrolyse kann chemischer oder enzymatischer Natur sein. Beispiele
für hydrolysierbare
Gruppen schließen
Ester, Imidate und Nitrile ein, die zu Carbonsäuren hydrolysiert werden können, und
Carbamate, die zu Aminen hydrolysiert werden können.
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Bezug
nehmend auf die obige Formel kann der Abstand, durch den die chelatisierenden
Stickstoffatome getrennt sind, durch Zwischenschieben einer Methylengruppe,
-CH2-, zwischen die Kohlenstoffatome, die an
die bezeichneten Stickstoffe gebunden sind, vergrößert werden.
Wenn keine Methylengruppe dazwischen geschoben ist, was in der obigen
Formel dargestellt ist, wenn n = 0 ist, sind die chelatisierenden
Stickstoffe durch zwei Kohlenstoffatome getrennt. Wenn n = 1 ist,
kann die dazwischen geschobene Methylengruppe mit R3 substituiert
sein.
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R3 kann Wasserstoff, eine Niederalkylgruppe,
eine Alkylgruppe, eine Alkoxygruppe, ein Halogen, eine Hydroxygruppe,
eine Nitrogruppe, -(CH2)m-Z
oder -(CH2)m-W sein.
Wie hierin verwendet, ist eine Niederalkylgruppe eine Alkylgruppe
mit 1-10 Kohlenstoffatomen und physiologisch akzeptablen Salzen
der Säureradikale, welche
ein substituiertes Niederalkyl beinhalten. Eine substituierte Niederalkylgruppe
ist eine Niederalkylgruppe, die einen Halogen-, Perhaloalkyl-, Hydroxyl-
oder Alkoxy-Substituenten trägt.
Eine Alkoxygruppe ist jede Alkoxygruppe mit C6 oder
weniger. Geeignete Halogene schließen Fluor, Chlor, Brom und
Iod ein.
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R4 und R5 können an
eine oder mehrere der Positionen des aromatischen Ringes gebunden
sein, vorzugsweise die Ringkohlenstoffatome. R4 und
R5 sind unabhängig ausgewählt aus Wasserstoff, einer
Niederalkylgruppe, einer Alkoxygruppe, einem Halogen, einer Hydroxygruppe,
einer Nitrogruppe, -(CH2)m-Z und -(CH2)m-W. Für R4 und R5 schließen bevorzugte
Gruppen Niederalkylgruppen wie etwa Methyl, Alkoxygruppen wie etwa
Methoxy und Halogengruppen wie etwa Fluor ein. Bevorzugte Z-Gruppen
schließen
Aktivester wie etwa N-Hydroxysuccinimidester und Maleimide ein.
Bevorzugte W-Gruppen schließen
Ester- und Carbamatgruppen wie etwa Ethylester und Ethylcarbamate
ein. Vorzugsweise sind solche bevorzugten Alkylgruppen, Alkoxygruppen
und Estergruppen an dem Kohlenstoff des aromatischen Ringes, ortho
oder para zum chelatisierenden Stickstoff substituiert, dargestellt
in Formel (I) oben.
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R
6 und R
7 können unabhängig ausgewählt sein
aus Wasserstoff, Niederalkyl, Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro,
-(CH
2)
m-Z und -(CH
2)
m-W und
wobei Q eine multivalente
Säurefunktionalität darstellt,
und p = 0 bis 1 ist, R
12 und R
13 sind
unabhängig
ausgewählt
aus Wasserstoff, Hydroxyl, Carboxyl, Phosphon und Kohlenwasserstoffradikalen
mit 1-10 Kohlenstoffatomen und physiologisch akzeptable Salze der
Säureradikale.
R
12 und R
13 können gleich
oder verschieden voneinander sein. In einer Ausführungsform kann R
7 Wasserstoff
sein, wenn R
6 ist und Q ist eine Phosphon-
oder eine Carbonsäure
und R
6 kann Wasserstoff sein, wenn R
7 ist und Q ist eine Phosphon-
oder eine Carbonsäure,
aber R
6 und R
7 können nicht
beide gleichzeitig Wasserstoff sein. Wie oben beschrieben stellt
Q eine multivalente Säure-Funktionalität dar. Wie
hier verwendet bezeichnet der Ausdruck multivalente Säurefunktionalität jede multivalente
Säure,
die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und in der Lage ist, ein
Metallion zu komplexieren. In bevorzugten Ausführungsformen tragen R
6 oder R
7 oder beide
einen Q-enthaltende Substituenten. Bevorzugte multivalente Säuren sind
die Folgenden: eine Phosphonsäure,
eine Carbonsäure,
eine Thioessigsäure
und eine Sulfonsäure.
Insbesondere bevorzugt sind eine Phosphonsäure und eine Carbonsäure. Die
multivalente Säurestellt
zusätzlich
Donoratome bereit, welche die Bindung eines Metalls über Koordination
an ein solches Donoratom ermöglicht,
und dadurch eine vielseitige Chelatverbindung für eine diagnostische und therapeutische
Verwendung bereitstellt.
-
Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung besitzen typischerweise
eine oder mehr Q-, Z- und/oder W-Gruppen. Zum Beispiel kann eine
Verbindung ein Z oder ein W oder ein Q oder eine Kombination aller
drei oder einige wenigere Kombination besitzen. Alternativ kann
eine Verbindung zum Beispiel mehrere Z- und/oder mehrere W- und/oder mehrere
Q-Gruppen enthalten.
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A
und A' können unabhängig ausgewählt sein
aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel. Wenn ein Schwefel vorhanden
ist, kann es einen Wasserstoff oder eine Schwefelschutzgruppe tragen.
Wenn A und A' beide
Schwefel sind, können
sie miteinander durch eine Bindung oder jede aus dem Stand der Technik bekannte
Schwefelschutzgruppe verknüpft
sein. Wenn ein Sauerstoff oder ein Stickstoff vorhanden ist, kann
er einen Wasserstoff tragen.
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Wenn
A oder A' Stickstoff
sind, kann A R
8 oder R
10 oder
beides tragen und A' kann
R
9 oder R
11 oder beides
tragen kann, wobei R
8, R
9,
R
10 und R
11 unabhängig aus
Niederalkyl, Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z, -(CH
2)
m-W und
wobei Q eine multivalente
Säure-Funktionalität, die in
der Lage ist mit Metallionen zu koordinieren, ist und R
12 und
R
13 unabhängig ausgewählt aus Wasserstoff, Hydroxyl,
Carboxyl, Phosphon und Kohlenwasserstoffradikalen mit 1-10 Kohlenstoffatomen
und physiologisch akzeptable Salze der Säureradikale sind. R
12 und R
13 können gleich
oder verschieden voneinander sein. R
8 und
R
10 können
verbunden sein, um ein cyclisches Anhydrid zu bilden oder R
9 und R
11 können verbunden
sein, um ein cyclisches Anhydrid zu bilden.
-
Wenn
A und A' beide Stickstoff
sind, können
R
10 und R
11 verbunden
sein, um T zu bilden, wobei T
und n 0 bis 1 ist. R
1' und
R
2' können unabhängig ausgewählt sein
aus Wasserstoff, =O, -(CH
2)
m-Z
und -(CH
2)
m-W oder
R
1' und
R
2' sind
zusammen genommen worden, um ein cyclisches Anhydrid oder einen
Benzolring zu bilden. R
3' ist ausgewählt aus Wasserstoff, Niederalkyl,
substituiertes Niederalkyl, Alkoxy, Perhaloalkyl, Halogen, einer
Hydroxyl, Nitro, -(CH
2)
m-Z
und -(CH
2)
m-W.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform,
wo beide Schwefel sind, sind die Schwefelatome durch eine Bindung
miteinander verknüpft,
wodurch ein Disulfid gebildet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform, wenn
A und A' beide Stickstoff
sind, sind R
10 und R
11 verbunden,
um T zu bilden, wobei n entweder 0 oder 1 ist und R
8 und
R
9 sind, wobei Q eine multivalente
Säure-Funktionalität, die in
der Lage ist, mit Metallionen zu koordinieren, ist, m = 0 bis 1
ist und R
12 und R
13 unabhängig ausgewählt aus
Wasserstoff, Hydroxyl, Carboxyl, Phosphon und Kohlenwasserstoffradikalen
mit 1-10 Kohlenstoffatomen und physiologisch akzeptable Salze der
Säureradikale
sind. R
12 und R
13 können gleich
oder verschieden voneinander sein.
-
Die
Chelatverbindungen der vorliegenden Erfindung können durch die Zahl und die
Art der chelatisierenden Atome (das heißt NxSyOz, wobei x 2 bis
4 ist, y 0 bis 2 ist und z 0 bis 2) kategorisiert werden. Wenn zum Beispiel
A und A' beide Stickstoff
sind, sind die Chelatbildner der vorliegenden Erfindung in der Lage,
ein Metall durch Koordination mit allen vier Stickstoffatomen zu
binden. Solch ein Chelatbildner kann als eine "N4"-Verbindung (N4S0O0)
bezeichnet werden. In einer anderen Ausführungsform sind sowohl A als
auch A' Schwefel, was
zur Fähigkeit
einer Metallchelatisierung durch zwei Stickstoffatome und zwei Schwefelatome
führt und
damit eine "N2S2"-Chelatverbindung
(N2S2O0)
liefert. Alternativ kann A Stickstoff sein und A' Schwefel oder kann A Schwefel sein
und A' Stickstoff.
Jede diese Ausführungsformen
ist zur Metallchelatisierung unter Einbeziehung von drei Stickstoffatomen
und einem einzelnen Schwefelatom in der Lage, eine "N3S"-Chelatverbindung (N3S1O0).
In einer anderen Ausführungsform
können
A und/oder A' Sauerstoffatome
sein (zum Beispiel Hydroxylgruppen). Wenn sowohl A als auch A' Sauerstoff sind,
resultiert ein "N2O2"Chelatbildner (N2S0O2).
Andere Ausführungsformen
schließen "N3O" (N3S0O1)und "N2SO"-Chelatverbindungen
(N2S1O1)
ein, in denen entweder A oder A' Sauerstoff
ist und das andere Stickstoff bzw. Schwefel ist.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung binden die Chelatverbindungen ein Metallradionuklid
mit den Donoratomen, die bis zu acht Koordinationsstellen bereitstellen.
Zum Beispiel sind A und A' beide
Stickstoff, können
R
10 und R
11 die
beiden Stickstoffatome durch die Bildung von T verbinden, um eine
cyclisches „N
4"-Chelatverbindung
(N
4S
0O
0)
hervorzubringen und worin R
6, R
7,
R
8 und R
9 sind und Q bevorzugt eine
multivalente Säure-Funktionalität ist, wie
zum Beispiel eine Phosphon- und/oder Carbonsäure. So stellen zusätzlich zu
den vier chelatisierenden Stickstoffatomen die Sauerstoffatome der
multivalenten Säurefunktionalität bis zu
vier zusätzliche
Koordinationsstellen bereit und erweitern so den Typ an Radionuklid,
der in dieser Erfindung nützlich
ist (zum Beispiel Indium und Yttrium).
-
Wie
oben angemerkt, können
die Schwefelatome der Chelatverbindungen Schwefelschutzgruppen tragen.
Geeignete Schwefelschutzgruppen schließen irgendeine der den Fachleuten
bekannten Alkyl-, Acyl- und Arylgruppen, Disulfide und Bunte-Salze
ein. Bevorzugte Schwefelschutzgruppen sind diejenigen, die zur Bildung
von Thioacetal-, Hemithioacetal-, Thioketal-, Hemithioketal-, Thioester
oder Acetamidomethyl-Substituenten führen. Besonders bevorzugte
Gruppen schließen
p-Anisylidin, Acetonyl, Tetrahydrylfuranyl, Ethoxyethyl, Tetrahydrylpyranyl,
Acetamidomethyl und Derivate derselben ein. Beim Konjugieren eines
Chelatbildners der vorliegenden Erfindung an eine Targeting-Einheit können die
Schutzgruppen unmittelbar vor der Metallkomplexierung oder während der
Reaktion der radioaktiven Markierung entfernt werden.
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Eine
Acetoamidometyl-Schwefelschutzgruppe ist durch die folgende Formel
dargestellt, in der das dargestellte Schwefelatom ein Schwefel-Donoratom
des Chelatbildners ist:
-
Die
Acetamidomethylgruppe wird aus der Chelatverbindung während der
radioaktiven Markierung verdrängt,
die bei etwa 50°C
in einer Reaktionsmischung mit einem pH von etwa 3 bis 6 durchgeführt wird.
-
Wenn
Hemithioacetal-Schutzgruppen verwendet werden, weist jedes zu schützende Schwefelatom eine
separate daran gebundene Schutzgruppe auf, die zusammen mit dem
Schwefelatom eine Hemithioacetalgruppe definiert. Die Hemithioacetalgruppen
enthalten ein Kohlenstoffatom, das direkt (d.h. ohne irgendwelche
dazwischen geschalteten Atome) an ein Schwefelatom und ein Sauerstoffatom
gebunden ist, d.h.
-
-
Bevorzugte
Hemithioacetale besitzen im Allgemeinen die folgende Formel, in
der das Schwefelatom ein Schwefelatom der Chelatverbindung ist und
an jedes der Schwefelatome auf der Chelatverbindung eine separate
Schutzgruppe gebunden ist:
wobei R
a eine
Alkylgruppe ist, bevorzugt mit von 2-5 Kohlenstoffatomen, und R
b eine Niederalkylgruppe ist, bevorzugt mit
von 1-3 Kohlenstoffatomen. Alternativ können R
a und
R
b mit dem in der Formel dargestellten Kohlenstoffatom
und dem Sauerstoffatom zusammengenommen werden, um einen nicht-aromatischen
Ring zu definieren, der vorzugsweise zusätzlich zu den in der Formel
dargestellten Kohlenstoff- und Sauerstoffatomen 3-7 Kohlenstoffatome
umfasst. R
c stellt Wasserstoff oder eine
Niederalkylgruppe dar, wobei die Alkylgruppe vorzugsweise 1-3 Kohlenstoffatome
aufweist. Beispiele für
solche bevorzugten Hemithioacetale umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein:
-
In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
die Schwefelschutzgruppen die zwei Schwefel-Chelatisierungsatome
verknüpfen.
Bevorzugte Ausführungsformen
der Schwefelschutzgruppen schließen Thioketale und Thioacetale
ein, die durch Kondensation der schwefelhaltigen Chelatverbindung
mit Ketonen bzw. Aldehyden hergestellt werden können. Diese besonderen Schwefelschutzgruppen
werden durch die folgende Formel dargestellt, in der die dargestellten
Schwefelatome die Schwefel-Donoratome der Chelatverbindung sind:
-
In
der Formel sind Rd und Re unabhängig ausgewählt aus
Wasserstoff, Niederalkylgruppen (vorzugsweise Methyl oder Ethyl),
Niederalkoxygruppen (vorzugsweise ein oder zwei Kohlenstoffatome
enthaltend), Arylgruppen oder zusammengenommen, um eine cyclische
Gruppe zu bilden (vorzugsweise einen Cyclopentan- oder Cyclohexanring).
-
Diese
Schwefelschutzgruppen werden während
der Reaktion zur radioaktiven Markierung verdrängt, die bei saurem pH durchgeführt wird,
in, wie man glaubt, Metall-unterstützter Säurespaltung. Kovalente Bindungen
bilden sich zwischen den Schwefelatomen und dem Metallradionuklid.
Ein separater Schritt zur Entfernung der Schwefelschutzgruppen ist
nicht erforderlich. Das Verfahren zur radioaktiven Markierung wird
somit vereinfacht. Zusätzlich
werden die basischen pH-Bedingungen und die scharfen Bedingungen,
die mit bestimmten bekannten Verfahren zur radioaktiven Markierung
oder Verfahren zur Entfernung anderer Schwefelschutzgruppen verbunden
sind, vermieden. Aus diesem Grund überleben Basen-empfindliche
Gruppen auf der Chelatverbindung den Schritt der radioaktiven Markierung
intakt. Solche basenlabilen Gruppen schließen jede Gruppe ein, die durch
Einwirkung von basischem pH zerstört, hydrolysiert oder in anderer
Weise nachteilig beeinflusst wird. Im Allgemeinen schließen solche
Gruppen unter anderen Ester, Maleimide und Isothiocyanate ein. Solche
Gruppen können
auf der Chelatverbindung als Konjugationsgruppen vorliegen.
-
Die
Atome des aromatischen Ringes, die als X, Y, X' und Y' bezeichnet sind, sind unabhängig ausgewählt aus
Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff, um unabhängig fünf- oder
sechs-gliedrige Ringe zu bilden, bei denen die verbleibenden Atome
Kohlenstoff sind. Die aromatischen Ringe, die X und Y oder X' und Y' enthalten, werden
unabhängig
ausgewählt.
Zum Beispiel kann ein Ring ein fünfgliedriger
Ring sein und der andere ein sechs-gliedriger Ring. Wenn X, Y, X' und Y' alle Kohlenstoff
sind, sind die aromatischen Ringe Ringe vom Benzoltyp. Wenn X, Y,
X' und Y alle Stickstoff
sind, sind die aromatischen Ringe Ringe vom Pyrimidintyp. Wenn eines
von X oder Y und eines von X' oder
Y' Stickstoff sind,
sind die aromatischen Ringe Ringe von Pyridintyp.
-
Für fünf-gliedrige
Ringesind, wenn X, Y, X' und
Y alle Stickstoff sind, sind die aromatischen Ringe Ringe vom Imidazol-
oder Pyrazoltyp. Wenn einer von X oder Y und einer von X' und Y' Schwefel ist, sind
die aromatischen Ringe Ringe vom Thiophentyp. Wenn einer von X oder
Y und einer von X' und
Y' Schwefel und Stickstoff
sind, sind die aromatischen Ringe Ringe vom Thiazol- oder Imidazoltyp.
Wenn einer von X oder Y und einer von X' und Y' Schwefel ist, sind die aromatischen
Ringe Ringe vom Furantyp. Wenn einer von X oder Y und einer von
X' und Y' Sauerstoff und Stickstoff
sind, sind die aromatischen Ringe Ringe vom Oxazol- oder Isooxazoltyp.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der aromatischen Ringe, die mit X, Y, X' und Y' bezeichnet sind, umfassen Benzol, Pyrimidin,
Pyridin und Thiophen, wobei Benzol und Thiophen am meisten bevorzugt
sind. Diese speziellen aromatische Ringe sind innerhalb der Chelatverbindung
austauschbar, da sind entweder strukturell verwandt sind oder ähnliche
Eigenschaften beitragen, zum Beispiel (Raumstruktur, Elektronenresonanz
und induktive Eigenschaften (das heißt elektronenziehende oder
elektronenschiebende Effekte).
-
Die
Chelatverbindungen und Metallchelate der vorliegenden Erfindungen
können
im Hinblick auf die Natur der aromatischen Ringe auch asymmetrisch
sein. Die aromatischen Ringen sind zum Beispiel eine Kombination
von Benzol- und Pyridintyp, wenn X und Y beide Kohlenstoff sind
und entweder X' oder
Y' Stickstoff ist
oder entweder X oder Y Stickstoff ist und X' und Y' beide Kohlenstoff sind. In einer anderen
Ausführungsform sind
die aromatischen Ringe eine Kombination von Benzol- und Pyrimidintyp,
wenn X und Y beide Kohlenstoff sind und X' und Y' beide Stickstoff sind oder X und Y
beide Stickstoff sind und X' und
Y' beide Kohlenstoff
sind. In einer weiteren Ausführungsform
sind die aromatischen Ringe eine Kombination der Pyridin- und Pyrimidintypen,
wenn entweder X oder Y Stickstoff ist und X' und Y' beide Stickstoff sind oder X und Y
beide Stickstoff sind und entweder X' oder Y' Stickstoff ist. In einer weiteren Ausführungsform
sind die aromatischen Ringe eine Kombination der Benzol- und Thiophentypen,
wenn X oder Y beide Kohlenstoff sind und entweder X' oder Y' Schwefel ist oder
entweder X oder Y Schwefel ist und X' und Y' beide Kohlenstoff sind. In einer weiteren
Ausführungsform
sind die aromatischen Ringe eine Kombination der Pyridin- und Thiophentypen,
wenn entweder X oder Y Stickstoff ist und einer davon Kohlenstoff
und entweder X' oder
Y' Schwefel ist
und einer davon Kohlenstoff oder entweder X oder Y Schwefel ist
und einer davon Kohlenstoff ist und entweder X' oder Y' Stickstoff und einer davon Kohlenstoff
ist. Weitere Variationen der aromatischen Ringe der gerade identifizierten
Chelatverbindungen werden dem Fachmann basierend auf der vorliegenden
Offenbarung offensichtlich werden.
-
Wie
oben angemerkt, liefert die vorliegende Erfindung, zusätzlich dazu,
dass sie Chelatbildner liefert, Radionuklidmetall-Chelatverbindungen,
in denen ein Metall chelatisiert (komplexiert) ist. Die Chelatverbindungen
der vorliegenden Erfindung bilden schnell stabile Metallkomplexe
(Radionuklidmetall-Chelate), wenn sie mit einem Metall umgesetzt
werden.
-
Die
Radionuklidmetall-Chelatverbindung (Komplexe) der vorliegenden Erfindung
haben die folgende Formel (II):
in der R
1-R
11, n, X, X, Y, Y' wie in Anspruch 1 definiert sind. A
und A' können unabhängig ausgewählt sein
aus Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff. M ist ein Radionuklidmetall
oder ein Radionuklidmetalloxid oder -nitrid, das von einer Verbindung
der vorliegenden Erfindung chelatisiert werden kann. Bevorzugte
Metalle und Metalloxide schließen
Radionuklide von Kupfer, Yttrium, Ruthenium, Technetium, Rhodium,
Palladium, Gadolinium, Samarium, Holmium, Ytterbium, Lutetium, Indium,
Rhenium, Gold, Blei und Bismut ein. Insbesondere bevorzugt sind
64Cu,
67Cu,
90Y,
97Rh,
99mTc,
105Rh,
109Pd,
111In,
153Sm,
159Gd,
166Ho,
175Yb,
177Lu,
186Re,
188Re,
198Au,
199Au,
203Pb,
212Pb und
212Bi.
-
Verfahren
zur Herstellung dieser Isotope sind bekannt. Molybdän/Technetium-Generatoren zur Erzeugung
von 99mTc sind kommerziell erhältlich.
Verfahren zur Herstellung von 186Re schließen die
Verfahren ein, die von Deutsch et al. (Nucl. Med. Biol. 13(4):465-477,
1986) und Vanderheyden et al. (Inorganic Chemistry 24:1666-1673,
1985) beschrieben sind, und Verfahren zur Herstellung von 188Re sind beschrieben worden von Blachot
et al. (Intl. J. of Applied Radiation and Isotopes 20:467-470, 1969)
und von Klofutar et al. (J. of Radioanalytical Chem. 5:3-10, 1970)
(siehe auch US-Patent 4,859,431). Die Herstellung von 109Pd
ist beschrieben in Fawwaz et al. (J. Nucl. Med. 25:786, 1984). Die
Herstellung von 212Pb und 212Bi
ist beschrieben in Gansow et al. (Amer. Chem. Soc. Symp. Ser 241:215-217,
1984) und Kozah et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83.474-478, 1986).
Die Herstellung von 90Y, einem Partikel-emittierenden
therapeutischen Radionuklid, welche aus Transmutationverfahren resultiert
(ohne das Vorhandensein von nicht-radioaktiven Trägerformen)
ist kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich, einschließlich Pacific
Northwest National Laboratory, welches in Richland, Washington sitzt;
Nordion International Inc., die in Kanata, Ontario, Kanada sitzen
und von Du Pont als NEN Forschungsprodukte, die in North Billerica,
Massachusetts sitzen. Die Herstellung von 153Sm
ist in Goeckeler et al (Nucl. Med. Biol., Vol. 20, Nr. 5, S. 657-661,
1993) beschrieben. 111In ist kommerziell
erhältlich als
INDICLORTM, welches von Amersham, die in
Arlington Heights, Illinois sitzen, vertrieben wird. 99mTc
ist für diagnostische
Verwendung bevorzugt und die anderen Radionuklide, die oben aufgelistet
sind, finden bevorzugt therapeutische Verwendung.
-
In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die Chelatverbindungen der Erfindung, einschließlich Acetamidomethyl-
und/oder Hemithioacetal-Schwefelschutzgruppen, mit einem Metallradionuklid
radioaktiv markiert, indem die Verbindung mit dem Radionuklid unter
Bedingungen mit saurem pH umgesetzt wird. Man glaubt, dass der saure
pH und das Vorhandensein des Metalls zur Verdrängung der Schwefelschutzgruppen
aus der Chelatverbindung beitragen. Das Radionuklid ist in chelatisierbarer
Form, wenn es mit den Chelatverbindungen der Erfindung umgesetzt
wird.
-
Im
Fall von Technetium und Rhenium erfordert das Vorliegen in "chelatisierbarer
Form" im Allgemeinen einen
Reduktionsschritt. Ein Reduktionsmittel wird eingesetzt werden,
um die Radionuklide (zum Beispiel in der Form von Pertechnetat bzw.
Perrhenat) zu einem niedrigeren Oxidationszustand zu reduzieren,
in dem Chelatisierung auftreten wird. Viele geeignete Reduktionsmittel,
und die Verwendung derselben, sind bekannt. (Siehe zum Beispiel
U.S.-Patente 4,440,738; 4,434,151; und 4,652,440) Solche Reduktionsmittel
schließen das
Zinn-Ion (zum Beispiel in der Form von beispielsweise Zinn-Salzen,
wie etwa Zinnchlorid oder Zinnfluorid), metallisches Zinn, Eisen(II)-Ion
(zum Beispiel in der Form von Eisen(II)-Salzen, wie etwa Eisen(II)chlorid,
Eisen(II)sulfat oder Eisen(II)ascorbat) und viele andere ein, sind
aber nicht hierauf beschränkt.
Natriumpertechnetat (d.h. 99mTcO4 –1, das in der Oxidationsstufe
+7 vorliegt) oder Natriumperrhenat (d.h. 188ReO4 –1, 186ReO4 –1) können gleichzeitig mit einem
Reduktionsmittel und einer Chelatverbindung der Erfindung gemäß dem Verfahren
zur radioaktiven Markierung der Erfindung kombiniert werden, um
ein Chelat zu bilden.
-
Vorzugsweise
wird das Radionuklid mit einem Reduktionsmittel und einem Komplexierungsmittel
behandelt, um einen Zwischenkomplex (d.h. einen "Austauschkomplex") zu bilden. Komplexierungsmittel sind Verbindungen,
die das Radionuklid schwächer
binden, als dass die Chelatverbindungen der Erfindung tun, und können schwache
Chelatoren sein. Alle geeigneten bekannten Komplexierungsmittel
können
verwendet werden, einschließlich
Gluconsäure,
Glucoheptonsäure,
Tontansäure,
Methylendisphosphonat, Glycersäure,
Glykolsäure,
Mannitol, Oxalsäure,
Malonsäure,
Bernsteinsäure,
Bicin, N,N'-Bis(2- hydroxyethyl)ethylendiamin,
Zitronensäure,
Ascorbinsäure
und Gentisinsäure,
sind aber nicht hierauf beschränkt.
Gute Ergebnisse werden bei Verwendung von Gluconsäure oder
Glucoheptonsäure
als dem Tc-Komplexierungsmittel und Zitronensäure für Rhenium erhalten. Wenn das
Radionuklid in der Form eines solchen Austauschkomplexes mit der
Chelatverbindung der Erfindung umgesetzt wird, wird das Radionuklid
auf die Chelatverbindung übergehen,
die das Radionuklid stärker
bindet, um Chelate gemäß der Erfindung
zu bilden. In einigen Fällen
ist Erhitzen notwendig, um den Transfer des Radionuklids zu fördern. Radionuklide
in der Form solcher Komplexe werden ebenfalls als für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung in "chelatisierbarer
Form" vorliegend
angesehen.
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Y-90
ist ein besonders bevorzugtes Radionuklid für eine Therapie, da es vorteilhafte
Eigenschaften, einschließlich
hoher spezifischer Aktivität,
lange Weglängen
im Hinblick auf die Abgabe von Strahlung in Gewebe, eine hohe Gleichgewichtsdosiskonstante
und vorteilhafte Halbwertszeit-Eigenschaften. Im Speziellen macht
die beta-Emission von Y-90 (Betaav = 0,937
MeV) es zu einem der energetischsten von allen beta-Emittern. Der
X90-Wert von Y-90 ist 5,34 mm (das heißt 90 %
der Energie, die von einer Punktquelle emittiert werden, werden
in einer Kugel mit einem Radius von 5,34 mm absorbiert). Y-90 besitzt
eine hohe Gleichgewichtsdosiskonstante oder mittlere Energie/Kernübergan,
Delta = 1,99 Rad-Gramm/Microcuriestunden und eine 64 h Halbwertszeit,
die für
eine gezielte Therapie geeignet ist. Y-90 kann mit hoher spezifischer
Aktivität
hergestellt werden und ist als ein Generatorprodukt erhältlich.
Spezifische Vorteile von Y-90 sind (1) dass es die Fähigkeit
besitzt, benachbarte Zielzellen tötet, die nicht direkt durch
konventionelle Verfahren erfasst werden, (2) dass mehr Strahlung
pro lokalisiertem Microcurie als für andere Beta-Emitter mit niedrigerer
mittlerer Partikelenergie (vorausgesetzt, dass eine ausreichend
grosses Zielvolumen vorhanden ist) abgeschieden wird.
-
Chelate
von 212Pb, 212Bi, 109Pd, Cu64 und Cu67 können
hergestellt werden, indem das geeignete Salz des Radionuklids mit
der Chelatverbindung zusammengebracht wird und die Reaktionsmischung
bei Raumtemperatur oder bei höheren
Temperaturen inkubiert wird. Es ist nicht erforderlich, die Blei-,
Bismut-, Palladium- und Kupfer-Radioisotope vor der Chelatisierung
mit einem Reduktionsmittel zu behandeln, da solche Isotope bereits
in einem für
die Chelatisierung geeigneten Oxidationszustand (d.h. in chelatisierbarer
Form) sind. Die spezifischen Reaktionsbedingungen für die radioaktive
Markierung können
entsprechend dem bestimmten betroffenen Radionuklid und Chelatbildner
etwas variieren.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung, wenn die Schwefelatome durch Bildung einer Disulfidbindung
geschützt
sind, werden die Chelatverbindungen der Erfindung im Anschluss an
die Reduktion der Disulfidbindung unter milden Bedingungen radioaktiv
markiert. Das Disulfid kann zum Beispiel mit SnCl2 unter Bedingungen
reduziert werden, die keine Disulfide auf Proteinen, wie etwa Antikörpern, reduzieren.
-
Die
Chelatverbindungen und Metallchelate der vorliegenden Erfindung
haben eine Vielfalt von Verwendungen, obgleich bestimmte Verwendungen
in Abhängigkeit
von der bestimmten Ausführungsform
bevorzugt sind. In einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung können
die Chelatverbindungen in „Pretargeting"-Verfahren, wie im
US-Patent 5,608,060 beschrieben, eingesetzt werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die Chelatverbindungen und die Radionuklidmetall-Chelate
entweder mit einer Targeting-Einheit reaktiv oder sind an eine Targeting-Einheit konjugiert.
Diese Verbindungen können
allgemein durch die oben beschriebenen Verbindungen dargestellt werden,
die die Gruppe Z tragen. Eine Chelatverbindung oder ein Metallchelat,
der (die) mit einer Targeting-Einheit reaktiv ist, trägt wenigstens
eine Konjugationsgruppe Z. Solche Konjugationsgruppen schließen diejenigen
ein, die oben beschrieben sind (zum Beispiel einen Aktivester oder
ein Maleimid). Alternativ können die
Chelatverbindung oder das Metallchelat an eine Targeting-Einheit Z konjugiert
sein. Solche Targeting-Einheiten schließen diejenigen ein, die oben
beschrieben sind (zum Beispiel Proteine wie etwa Antikörper). Die Herstellung
beispielhafter Chelatverbindungen, die mit Targeting-Einheiten reaktiv
sind, ist in den Beispielen unten dargestellt. Die Herstellung beispielhafter Radionuklidmetall-Targeting-Einheits-Konjugate
ist ebenfalls in den Beispielen unten dargestellt.
-
In
der Praxis der vorliegenden Erfindung können die Metallchelat-Targeting-Einheit-Konjugate
durch Komplexierung des Radionuklidmetalls, entweder bevor oder
nach dem die Chelatverbindung an die Targeting-Einheit konjugiert
wird, hergestellt werden. Genauer kann ein Konjugat "vorgebildet" oder "nachgebildet" werden, in Abhängigkeit
davon, ob die Chelatverbindung und die Targeting-Einheit nach oder vor der Komplexierung
des Radionuklidmetalls verknüpft
werden. Ein vorgebildetes Konjugat umfasst eine Chelatverbindung der
vorliegenden Erfindung, die zunächst
mit einem Radionuklidmetall markiert und anschließend an
eine Targeting-Einheit konjugiert wird. Ein nachgebildetes Konjugat
umfasst einen Chelatverbindung der vorliegenden Erfindung, die zunächst an
eine Targeting-Einheit konjugiert und dann mit einem Radionuklidmetall
markiert wird. Somit wird das Radionuklid für vorgeformte Konjugate vor
der Zugabe der Targeting-Einheit zu der Chelatverbindung gegeben,
wohingegen für
nachgebildete Konjugate das Radionuklid nach der Zugabe der Targeting-Einheit
zugegeben wird. Das endgültige
Konjugat ist dasselbe, unabhängig
davon, wie es gebildet ist.
-
Allgemein
können
die Chelatverbindungen der vorliegenden Erfindung, die entweder
mit Targeting-Einheiten reaktiv oder an Targeting-Einheiten konjugiert
sind, durch die Formel (I) oben dargestellt werden, wobei die spezifischen
Ausführungsformen
der Elemente der Formel folgendes einschließen:
R1 und
R2 können
unabhängig
Wasserstoff (H), eine Oxygruppe (=O) oder -(CH2)m-Z, wobei m 0-10 ist und Z eine Konjugationsgruppe
oder Targeting-Einheit
darstellt, sein; oder R1 und R2 können zusammengenommen sein,
um ein cyklisches Anhydrid oder einen Benzolring zu bilden.
-
Der
Abstand zwischen den chelatisierenden Stickstoffatomen von Formel
(I) kann durch das Einfügen einer
Methylengruppe variiert werden. Wenn eingefügt, kann die Methylengruppe
mit R3 substituiert sein.
-
R3 kann Wasserstoff, einer Niederalkylgruppe,
eine Alkoxygruppe, ein Halogen, eine Hydroxylgruppe, eine Nitrogruppe
oder -(CH2)m-Z sein.
-
R4 und R5 können an
eine oder mehrere der Positionen des aromatischen Ringes gebunden
sein, vorzugsweise die Kohlenstoffatome des Ringes, und sind unabhängig ausgewählt aus
Wasserstoff, einer Niederalkylgruppe, einer Alkoxygruppe, einem
Halogen, einer Hydroxylgruppe, einer Nitrogruppe und -(CH2)m-Z.
-
R
6 und R
7 können unabhängig ausgewählt sein
aus Wasserstoff, Niederalkyl, Alkoxy, Halogen, Hydroxyl, Nitro,
-(CH
2)
m-Z und
wobei Q eine multivalente
Säure darstellt,
und p = 0 bis 1 ist, R
12 und R
13 sind
unabhängig
ausgewählt
aus Wasserstoff, Hydroxyl, Carboxyl, Phosphon und Kohlenwasserstoffradikalen
mit 1-10 Kohlenstoffatomen und physiologisch akzeptable Salze der
Säureradikale.
R
12 und R
13 können gleich
oder verschieden voneinander sein.
-
Die
Chelatverbindungen, die mit Targeting-Einheiten reaktiv oder an
diese konjugiert sind, besitzen wenigstens ein Z, können aber
mehr als ein Z enthalten. Zum Beispiel können jede zwei Gruppen, die
ausgewählt
sind aus R1-R5,
Z sein.
-
A,
A', X, X, Y, Y', und n sind wie
oben für
Formel (I) beschrieben.
-
In ähnlicher
Weise können
die Radionuklidmetall-Chelatverbindungen der vorliegenden Erfindung,
die entweder mit Targeting-Einheiten reaktiv sind oder an Targeting-Einheiten
konjugiert sind, durch die Formel (II) dargestellt werden. Die spezifischen
Ausführungsformen
derjenigen Elemente der Formel, die mit R1-R5,
n, X, X', Y und
Y', bezeichnet sind,
sind wie unmittelbar zuvor für
die Chelatverbindungen beschrieben. M ist ein Radionuklid, Radionuklidmetalloxid
oder Radionuklidmetallnitrid. Die MetallChelatverbindungen, die
mit Targeting-Einheit
reaktiv oder an diese konjugiert sind, besitzen wenigstens ein Z,
können
aber mehr als ein Z enthalten.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung "N4"(N4S0O0)-Chelatverbindungen
und -Metallchelate. Daher sind A und A', für
bevorzugte Chelatverbindungen und Metallchelate, Stickstoff. Für besonders
bevorzugte Chelatverbindungen sind A und A' Stickstoffatome, die durch eine Bindung
miteinander verknüpft
sind, d.h. R10 und R11 bilden
T und die Chelatverbindungen sind tetraazacyclisch, ein Tetradectan-System.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben X, Y, X
und Y' als Kohlenstoff,
Stickstoff und Schwefel. Für
die Metallchelate der vorliegenden Erfindung sind Technetium (zum
Beispiel 99mTc) und Indium (zum Beispiel 111In) bevorzugte Metalle für diagnostische
Zwecke und Rhenium (zum Beispiel 186Re und 188Re) und Yttrium (zum Beispiel 90Y) sind bevorzugte Metalle für therapeutische
Zwecke.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die mit Targeting-Einheiten
reaktiv sind, besitzen in einer bevorzugten Ausführungsform außerdem eine
einzelne Konjugationsgruppe. Eine bevorzugte Konjugationsgruppe
ist die N-Hydroxysuccinimidestergruppe.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die Konjugationsgruppe, zusätzlich
zu den oben genannten Bevorzugungen, ein Substituent des aromatischen
Ringes, d.h. entweder R
4 oder R
5 ist
-(CH
2)
m-Z. Für eine solche
bevorzugte Ausführungsform
ist n = 1, sind R
1-R
4 Wasserstoff
und ist R
5 -(CH
2)
m-Z, wobei m = 0 und Z ein Aktivester ist,
wie etwa ein N-Hydroxysuccindiester. Alternativ kann die Konjugationsgruppe
ein Substituent der Kohlenstoffe sein, die die chelatisierenden
Stickstoffe verbinden, d.h. R
1-R
3. In einer solchen bevorzugten Ausführungsform
ist n = 1, ist R
1 oder R
2 -(CH
2)
m-Z, wobei m =
0 und Z ein N-Hydroxysuccinimidester
ist, ist R
3 Wasserstoff und sind R
4 und R
5 Wasserstoff.
In einer weiteren solchen bevorzugten Ausführungsform ist n = 1, sind
R
1 und R
2 Wasserstoff,
ist R3 -(CH
2)
m-Z,
wie unmittelbar zuvor beschrieben, und sind R
4 und
R
5 Wasserstoff. R
6,
R
7, R
8 und R
9 können
sein, wobei Q eine multivalente
Säure-Funktionalität, die in
der Lage ist mit Metallionen zu koordinieren, ist und R
12 und
R
13 unabhängig ausgewählt aus Wasserstoff, Hydroxyl,
Carboxyl, Phosphon und Kohlenwasserstoffradikalen mit 1-10 Kohlenstoffatomen
und physiologisch akzeptable Salze der Säureradikale sind. R
12 und R
13 können gleich
oder verschieden voneinander sein.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist in den „N
4" (N
4S
0O
0)
Verbindungen der vorliegenden Erfindung die Konjugationsgruppe ein
Anhydrid, das heißt
R
8 und R
10 und R
9 und R
11 sind in
einer vicinalen Konfiguration zusammen genommen, um ein cyclisches
Anhydrid, -(CH
2)
m-Z,
zu bilden, wobei m = 1 ist und Z ein Carbonsäureanhydrid ist, welches aus
vicinalen Dicarbonsäuren
resultiert. In einer dieser Ausführungsformen
sind zusätzlich
zu den oben genannten Präferenzen
R
1-R
5 Wasserstoff,
ist n = 1, sind R
6 und R
7 wobei Q eine multivalente
Säure-Funktionalität, die in
der Lage ist mit Metallionen zu koordinieren, ist und p = 0 bis
1 ist; R
12 und R
13 unabhängig ausgewählt aus
Wasserstoff, Hydroxyl, Carboxyl, Phosphon und Kohlenwasserstoffradikalen
mit 1-10 Kohlenstoffatomen und physiologisch akzeptable Salze der
Säureradikale
sind und R
12 und R
13 gleich
oder verschieden voneinander sein können.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Konjugationsgruppe ein Anhydrid, das heißt R1 und
R2 sind zusammengenommen, um ein cyclisches
Anhydrid zu bilden. In einer solchen Ausführungsform sind R1 und
R2, zusätzlich
zu den oben genannten Präferenzen,
zusammengenommen, um ein cyclisches Anhydrid zu bilden, ist n =
0 und sind R4 und R5 Fluor.
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Für die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung, die an Targeting-Einheiten konjugiert
sind, schließen
bevorzugte Targeting-Einheiten Proteine wie etwa Antikörper und
Annexin genauso wie Bindungsproteine wie etwa Avidin und Streptavidin
ein.
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In
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Chelatverbindungen
und die Radionuklidmetall-Chelatverbindungen in radiopharmazeutischen
Anwendungen verwendet, ohne die Notwendigkeit einer Konjugationsgruppe
oder Targeting-Einheit. Solche Chelatbildner und Metall-Chelatverbindungen sind
aufgrund ihrer lipophilen Eigenschaften nützlich und können allgemein
durch die oben beschriebenen Verbindungen dargestellt werden, die
eine hydrolysierbare Gruppe W tragen.
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Im
Allgemeinen können
die Chelatverbindungen der vorliegenden Erfindung, die nützlich sind,
ohne eine Konjugationsgruppe oder Targeting-Einheit zu besitzen,
durch die Formel (I) oben dargestellt werden, bei der die spezifischen
Ausführungsformen
der Elemente der Formel folgendes einschließen.
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R1 und R2 können unabhängig Wasserstoff
(H), eine Oxygruppe (=O) oder -(CH2)m-W, wobei W eine hydrolysierbare Gruppe
darstellt, sein; oder R1 und R2 können zusammengenommen
sein, um ein cyclisches Anhydrid oder einen Benzolring zu bilden.
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Der
Abstand zwischen den chelatisierenden Stickstoffatomen der Formel
(I) kann durch das Einschieben einer Methylengruppe -CH2 variiert
werden. Wenn eingeschoben, kann die Methylengruppe mit R3 substituiert sein.
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R3 kann Wasserstoff, eine Niederalkylgruppe,
eine Alkoxygruppe, ein Halogen, eine Hydroxylgruppe, eine Nitrogruppe
und -(CH2)m-W sein.
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R4 und R5 können an
eine oder mehrere der Positionen des aromatischen Ringes gebunden
sein, vorzugsweise die Kohlenstoffatome des Ringes, und sind unabhängig ausgewählt aus
Wasserstoff, einer Niederalkylgruppe, einer Alkoxygruppe, einem
Halogen, einer Hydroxylgruppe, einer Nitrogruppe oder -(CH2)m-W.
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Chelatverbindungen,
die bei Abwesenheit einer Konjugationsgruppe oder Targeting-Einheit
nützlich sind,
besitzen wenigstens ein W, können
aber mehr als ein W enthalten. Zum Beispiel können jede zwei Gruppen, die
aus R1 bis R5 ausgewählt sind,
W sein.
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A,
A', X, X, Y, Y', R6,
R7 sowie R8 bis
R11 und n sind wie oben für Formel
(I) beschrieben.
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In ähnlicher
Weise können
die Radionuklidmetall-Chelatverbindungen der vorliegenden Erfindung,
die ohne eine Konjugationsgruppe oder Targeting-Einheit nützlich sind, durch die Formel
(II) dargestellt werden, in der die spezifischen Ausführungsformen
der Elemente der Formel, R1-R5,
R6-R11, n, X, X', Y und Y' wie unmittelbar
zuvor für
die Chelatverbindungen beschrieben sind. M ist ein Radionuklid,
Radionuklidmetalloxid oder Radionuklidmetallnitrid. Die Metallchelate,
die bei Abwesenheit einer Konjugationsgruppe oder Targeting-Einheit nützlich sind,
besitzen wenigstens ein W, können
aber mehr als ein W enthalten.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist W eine Enzym-hydrolysierbare Gruppe, wie etwa ein Ester oder
ein Carbamat. Solche Gruppen unterliegen einer Hydrolyse durch Esterasen,
die üblicherweise
in Geweben anzutreffen sind, wie etwa dem Herz und dem Knochenmark.
In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die hydrolysierbare Gruppe ein Ethylester oder Ethylcarbamat.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Verbindungen, die hydrolysierbare Gruppen W besitzen, schließen die
Bevorzugungen für
M, A, A', X, Y,
X' und Y' ein, die oben für die Verbindungen
beschrieben sind, die eine Konjugationsgruppe oder Targeting-Einheit,
Z, besitzen. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzen die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung mit hydrolysierbaren Gruppen W mehr als
ein W.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist die hydrolysierbare Gruppe, zusätzlich zu den oben genannten
Präferenzen,
ein Substituent des aromatischen Ringes, das heißt R4 und
R5 sind -(CH2)m-W. Für
eine solche Ausführungsform
ist n = 1, sind R1-R3 Wasserstoff
und sind R4 und R5 -(CH2)m-W, wobei m =
0 und W entweder ein Ester (das heißt -CO2Et),
ein Carbamat (das heißt
-NH-CO2Et) oder ein Nitril (-CN) ist.
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Alternativ
ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, wenn sowohl R4 als auch R5 -(CH2)m-W sind, wie unmittelbar
zuvor beschrieben, n = 1, ist entweder R1 oder
R2 eine Oxygruppe (=O) und ist R3 entweder Wasserstoff oder -(CH2)m-W.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die hydrolysierbare Gruppe W ein Substituent der Kohlenstoffatome,
die die chelatisierenden Stickstoffe verbinden, das heißt eines
oder mehrere von R1 bis R3 sind
-(CH2)m-W. Zum Beispiel
ist in einer solchen bevorzugten Ausführungsform, zusätzlich zu
den oben angemerkten Präferenzen,
n = 0, sind R1 und R2 -(CH2)m-W, wobei m =
0 und W ein Ester ist, und sind R4 und R5 Fluor. In einer weiteren solchen bevorzugten
Ausführungsform
ist n = 1, ist entweder R1 oder R2 eine Oxygruppe (=O), ist R3 -(CH2)m-W, wie unmittelbar
zuvor beschrieben, und sind R4 und R5 Methyl. In einer weiteren solchen bevorzugten
Ausführungsform
ist n = 1, sind R1 und R2 Wasserstoff,
ist R3 -(CH2)m-W, wie oben beschrieben, und sind R4 und R5 Methoxy.
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Die
lipophilen Eigenschaften dieser Chelatverbindungen und Metallchelatverbindungen
beruhen teilweise auf der hydrophoben Natur des hydrolysierbaren
W. Wie oben angemerkt schließt
W jede neutrale organische Gruppe ein, die bei Hydrolyse eine geladene
Gruppe liefert. Im Allgemeinen ist die neutrale organische Gruppe
von W hydrophob und verleiht den Chelatverbindungen und Metallchelatverbindungen
lipophilen Charakter.
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Die
lipophilen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in vivo
besonders nützlich,
wo es wünschenswert
ist, die Metallchelate in Geweben, wie dem Gehirn und Knochenmark,
zu akkumulieren. In solchen Anwendungen erreichen die verabreichten
lipophilen Metallchelate diese Gewebe durch den Blutstrom und die Metallchelate
werden wegen ihrer lipophilen Eigenschaften von den Geweben absorbiert.
Wenn sie erst einmal in die Gewebe hinein absorbiert sind, unterliegen
die Metallchelate einer Hydrolyse, in der die hydrolysierbare Gruppe,
W (zum Beispiel ein Ester), die dem Chelat Lipophilie verliehen
hat, in eine geladene Spezies (zum Beispiel eine Säure, wenn
der Ester ein Carbonsäureester
ist, und eine Base, wenn der Ester ein Carbamatester ist) umgewandelt
wird und dadurch das Austreten aus dem Gewebe verhindert wird.
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Geeignete
hydrolysierbare Gruppen W schließen Nitrile, Carbamate und
Ester ein. Bevorzugte hydrolysierbare Gruppen schließen Carbamate
und Carbonsäureester
ein. Bevorzugte Carbonsäureester
schließen Methyl-,
Ethyl-, Propyl- und Isopropylester ein. Bevorzugte Carbamatester
schließen
Methyl- und Ethylester ein.
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Die
lipophilen Metallchelate der vorliegenden Erfindung, die hydrolysierbare
Gruppen W tragen, können
entweder eine chemische oder enzymatische Hydrolyse durchlaufen,
um im Ergebnis geladene Metallchelate zu liefern. Um wirksam zu
sein, sind die Metallchelate gegenüber einer schnellen Hydrolyse
im Blutstrom resistent, werden aber bei Aufnahme durch das interessierende
Gewebe leicht hydrolysiert. Hydrolyse, die im Blutstrom eintritt,
ist primär
chemischer Natur, während
Gewebehydrolyse primär
enzymatisch ist.
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In
einer Ausführungsform
sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zusätzlich gegenüber chemischer
Hydrolyse resistent. Die Chelatbildner und Metallchelate, die Estergruppen
tragen, die direkt an den aromatischen Ring als entweder ortho-
oder para-Substituenten relativ zu dem chelatisierenden Stickstoff konjugiert
sind, sind zum Beispiel besonders stabil gegenüber chemischer Hydrolyse. Bezug
nehmend auf die obigen Formeln werden diese bevorzugten Verbindungen
durch diejenigen Verbindungen dargestellt, in denen R4 und/oder
R5 -(CH2)m-W sind (m = 0 und W ist ein Ester) und
R4 und/oder R5 ortho
oder para zum chelatisierenden Stickstoff angeordnet ist/sind.
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Solche
in geeigneter Weise substituierte Ester sind gegen chemische Hydrolyse
aufgrund Elektronendonation vom chelatisierenden Stickstoff über den
aromatischen Ring zu der Estercarbonylgruppe resistent. Diese Verteilung
der Elektronendichte macht das Estercarbonyl relativ elektronenreich
und verringert seine Reaktivität
als ein Elektrophil. Da der geschwindigkeitsbestimmende Schritt
in der Esterhydrolyse die Addition des nukleophilen Wässsermoleküls an das
Estercarbonyl ist, reagieren Estercarbonylgruppen, die weniger elektrophil
sind, langsamer g Gründen
sind die oben beschriebenen Ester der vorliegenden Erfindung gegenüber chemischer
Hydrolyse im Blutstrom resistent.
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Obgleich
die Wirksamkeit der Verabreichung der lipophilen Verbindungen der
vorliegenden Erfindung teilweise in ihrer Stabilität gegenüber Hydrolyse
im Blutstrom liegt, beruht ihre letztendliche Nützlichkeit als radiopharmazeutische
Mittel auf ihrer Fähigkeit,
von spezifischen Geweben aufgenommen und zurückgehalten zu werden. Die Aufnahme
dieser Verbindungen in das Gewebe resultiert aus dem besonderen
Charakter der Verbindungen und der Permeabilität der Gewebe gegenüber solchen
Verbindungen.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in einem Gewebe,
wie etwa malignen Zellen, durch Umwandlung der lipophilen Verbindungen
zu geladenen Verbindungen (ionische Spezies) durch Hydrolyse zurückgehalten.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, die gegenüber chemischer
Hydrolyse resistent sind, sind gegenüber enzymatischer Hydrolyse
leicht anfällig.
Geeignete hydrolysierbare Gruppen, die durch enzymatische Wirkung
in geladene Verbindungen umgewandelt werden, schließen Ester-
und Carbamatgruppen ein, die zu Carbonsäure bzw. Aminogruppen umgewandelt
werden.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können von verschiedenen Geweben
aufgenommen werden, sind aber primär für Gewebe gedacht, die maligne
Zellen und aktivierte Plättchen
enthalten. Die Metallchelate der vorliegenden Erfindungen können selektiv
von Gewebe mit malignen Zellen in Abhängigkeit von der Natur des
Chelates aufgenommen werden.
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Die
radioaktiv markierten Chelate der vorliegenden Erfindung finden
Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Verfahren, sowohl
für in-vitro-Assays
als auch für
medizinische in-vivo-Verfahren. Die radioaktiv markierten Chelate
können
intravenös,
intraperitoneal, intralymphatisch, lokal oder durch andere geeignete
Mittel (zum Beispiel an einen Warmblütler wie einem Menschen verabreicht)
zugeführt
werden, abhängig
von solchen Faktoren wie der Art der Target-Stelle. Die zuzuführende Menge
wird entsprechend solchen Faktoren variieren wie dem Radionuklid-Typ
(zum Beispiel ob es ein diagnostisches oder ein therapeutisches Radionuklid
ist), dem Verabreichungsweg, der Art der Target-Stelle(n), der Affinität der Targeting-Einheit,
falls eingesetzt, für
die interessierende Target-Stelle und jeglicher Kreuzreaktivität der Targeting-Einheit,
falls eingesetzt, mit normalen Geweben. Geeignete Mengen können mit
herkömmlichen
Verfahren hergestellt werden und ein auf diesem Gebiet ausgebildeter
Arzt, an den sich diese Erfindung richtet, wird in der Lage sein,
eine geeignete Menge für
einen Patienten zu bestimmen. Eine diagnostisch wirksame Menge beträgt im Allgemeinen
von etwa 5 bis etwa 35 und typischerweise von etwa 10 bis etwa 30
mCi pro 70 kg Körpergewicht.
Eine therapeutisch wirksame Menge beträgt im Allgemeinen von etwa
20 mCi bis etwa 300 mCi oder höher.
Für eine Diagnose
werden herkömmliche,
nicht-invasive Verfahren (zum Beispiel Gamma-Kameras) verwendet,
um die Bioverteilung des diagnostischen Radionuklids nachzuweisen,
wodurch das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der interessierenden
Target-Stellen (zum Beispiel Tumore, Herz, Gehirn) bestimmt wird.
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Die
vergleichsweise geringe intestinale Lokalisierung der therapeutischen
radioaktiv markierten Chelate der vorliegenden Erfindung oder Kataboliten
davon erlaubt erhöhte
Dosierungen, da die Intestinalgewebe geringerer Bestrahlung ausgesetzt
werden. Die Klarheit und Genauigkeit diagnostischer Bilder wird
durch die verringerte Lokalisierung von radioaktiv markierten Chelaten
oder Kataboliten davon in normalen Geweben über einen Anstieg des Target
zu Nicht-Target-Verhältnisses
verbessert.
-
Die
Erfindung wird durch die Präsentation
der folgenden Beispiele weiter beschrieben. Die folgenden Beispiele
werden zu Veranschaulichungszwecken, nicht zur Beschränkung bereit
gestellt. BEISPIELE Beispiel
1 N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propyldiaminohexaessigsäure 5
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N,N'-Bis(2-dinitrophenyl)-1,3-propyldiamin
2:
-
Eine
gerührte
Suspension von 30,0 g (0,217 mol) 2-Nitroanilin 1, 5,0 ml (0,044
mol) 1,3-Diiodpropan und 1,90 g (0,023 mol) Natriumbicarbonat in
100 ml Xylol wurde bei 140-145 °C
für 36
Stunden erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Eisbad gekühlt. Der
Niederschlag wurde mittels Filtration gesammelt. Der rote Feststoff
wurde mehrmals mit kaltem Heptan gewaschen, um überschüssiges, nicht-reagiertes 2-Nitroanilin
1 und 2-Nitro-N-methylanilin zu entfernen. Das Rohprodukt wurde
mittels Flash-Chromatographie an einer Kieselgelsäule unter
Verwendung von 20% Ethylacetat in Hexan als ein Eluenzlösungsmittel
gereinigt. Nachdem 2-Nitroanilin und 2-Nitro-N-methylanilin aus
diesem Lösungsmittelsystem
entfernt wurden, wurde das gewünschte
Produkt dann von der Säule
unter Verwendung von 50% Ethylacetat in Hexan eluiert. Die Fraktionen, die
das Produkt enthielten, wurden kombiniert. Das Lösungsmittel wurde bei reduziertem
Druck entfernt und und getrocknet, um 10,30 g (15%) an Verbindung
2 zu ergeben.
-
N,N'-Bis(2-Diaminophenyl)-1,3-propan-diamin
3:
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1,0
g (0,003 mol) N,N'-Bis(2-dinitrophenyl)-1,3-propyldiamin
2 wurden in eine Parr-Hydrierungsflasche gegeben. 200 ml an 2% Eisessig
in absolutem Ethanol wurden zugegeben. Zu dieser Suspension wurden
0,2 g an 10% Palladium auf aktiviertem Kohlenstoff gegeben. Die
Reaktionsmischung wurde in Wasserstoff-Atmosphäre bei 40 PSI für 4-6 Stunden
katalytisch reduziert.
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Die
Lösung
wurde filtriert und das Lösungsmittel
wurde bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet. Der rohe Rückstand
wurde in eine Natriumbicarbonat-Lösung gegeben
und das freie Amin wurde mit Methylenchlorid dreimal extrahiert,
jeweils mit einem Volumen von 100 ml. Die kombinierten organischen
Phasen wurden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel
wurde bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um einen rohen
Rückstand
zu ergeben. Der rohe Rückstand
wurde mittels Kieselgel-Säulenchromatographie
unter Verwendung von 50% Ethylacetat in Hexan als ein Eluationslösungsmittel
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten,
wurden kombiniert.
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Das
Lösungsmittel
wurde bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um 0,53 g (65%)
der Verbindung 3 zu ergeben.
-
N,N'-Bis(2-Diaminophenyl)-1,3-propandiaminohexessigsäure 4:
-
Zu
einer gerührten
Suspension an 5,0 g (0,020 mol) N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propandiamin
3 in 75 ml destilliertem Wasser werden 20,0 g (0,143 mol) Bromessigsäure gegeben
und magnetisch gerührt.
Der pH der Lösung
wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 10.0 eingestellt und die Reaktionsmischung
wird in einem Ölbad
bei 45 °C
für 16
Stunden erhitzt. Der pH wird während
des gesamten Verlaufs der Reaktion mit 5,0 N Natriumhydroxid zwischen
9,75 und 10,0 gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wird mittels
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer PRP-X100 Anionaustauscher-Säule (geliefert
von Hamilton) verfolgt. Kleine Menge an Bromessigsäure (das
heißt
100 bis 200 mg) werden zu der Reaktionsmischung gegeben, um die
Reaktion zur Vollständigkeit
zu führen.
Die Reaktionsmischung wird mit sterilem Wasser auf ein Volumen von
2 Litern verdünnt
und der pH mit 6,0 N Salzsäure
auf 6.8 eingestellt. Die Leitfähigkeit
dieser Lösung
beträgt
4,89 ms/cm. Sie wird weiter mit sterilem Wasser auf 4 Liter verdünnt und der
pH wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die bestimmte
Leitfähigkeit
beträgt
2.89 ms/cm. Diese Lösung
wird auf eine 5 × 60
cm Säule
mit 900 ml Austauschervolumen an AG® 1-X2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) (Acetat-Form) Harz, welche
mit 1 Liter 1,5 M Essigsäure,
1,5 Liter Wasser, 0,5 Liter 0,02 N Ammoniumumacetat pH 7.18 und
4 Liter Wasser finales Eluenz pH 4.29 mitte s Schnellleistungs-Flüssigchromatographie
(FPLC) bei 40 ml/min vorgewaschen wird, gegeben. Die Säule wird
mit Wasser eluiert und graduell das Lösungsmittel B (1,50 M Essigsäure) des
Gradientensystems erhöht.
Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengefasst und
das Lösungsmittel
entfernt und im hohen Vakuum getrocknet, um 6,75 g (57 %) der Verbindung
4 zu ergeben.
-
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-diaminohexamethylenphosphonsäure 5:
-
25,0
g (0,31 mol) Phosphorsäure
und 25 ml entgastes Wasser werden in einen 3-Hals-Rundkolben, der mit einem Tropftrichter,
einem Thermometer und einem magnetischem Rührfisch ausgestattet war, gegeben.
Der Kolben wird mit Stickstoff geflutet und ein langsamer Strom
an Stickstoff wird in dem Kolben aufrecht gehalten.
-
Die
Auflösung
der Phosphorsäure
wird durch das Rühren
erzielt. 30 ml konzentrierter Salzsäure werden zu der Reaktionsmischung
gegeben und das Rühren
wird fortgesetzt. Der Tropftrichter wird mit 20,0 g (0,078 mol)
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propandiamin
gelöst
in 25 ml Wasser beladen.
-
Die
Amin-Lösung
aus dem Tropftrichter wird unter Stickstoff-Atmosphäre tropfenweise
zu der gerührten
sauren Lösung
gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wird die Reaktionsmischung unter
Rückfluss
unter Verwendung eines Ölbads
für mindestens
1,0 Stunden erhitzt. Dann wird der Tropftrichter mit Formaldehyd 27,2
g (0,938 mol) einer 37% wässrigen
Lösung
beladen und diese tropfenweise über
einen Zeitraum von 2 bis 3 Stunden zu der Reaktionsmischung gegeben.
Die Reaktionsmischung wird während
der gesamten Zeit der Formaldehyd-Zugabe weiter unter Rückfluss
erhitzt. Nach Komplettierung der gesamten Formaldehyd-Lösung wird
die Reaktionsmischung für
weitere 3 bis 4 Stunden unter Rückfluss
gerührt.
Die Reaktionsmischung wird dann abkühlen gelassen und das Produkt
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-diaminohexamethylenphosphonsäure wird
aus der Reaktionsmischung isoliert und mittels Ionen-Austauschharz-Chromatographie gereinigt.
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BEISPIEL II
-
2,3,9,10-Diphenylenyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-Tetraessigsäure 7 und
2,3,9,10-Diphenylenyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenphosphonsäure 8
-
2,3,9,10-Diphenylenyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan
6:
-
Eine
gerührte
Lösung
von 10,0 g (0,039 mol) N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-diamin 3,
2,30 g (0,008 mol) 1,3-Diiodpropan und 6,50 g (0,08 mol) Natriumbicarbonat
in 100 ml trockenem Dimethylsulfoxid wird für 4 Stunden bei 115 °C in Stickstoffatmosphäre erhitzt.
Das Dimethylsulfoxid-Lösungsmittel
wird im hohen Vakuum entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wird
drei Mal jeweils mit 100 ml Methylenchlorid durch Aufteilung mit
Wasser extrahiert. Die kombinierte Methylenchlorid-Schicht wird
mit Kochsalz-Lösung
und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel
aus dem Filtrat wird bei reduziertem Druck entfernt, um das Rohprodukt
zu ergeben. Der rohe Rückstand
wird mittels Kieselgel-Säulenchromatographie
unter Verwendung von 25% Ethylacetat in Hexan als ein Eluationslösungsmittel
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden
kombiniert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um 1,20 g (10
%) der Verbindung 6 zu ergeben.
-
2,3,9,10-Diphenylenyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure 7:
-
Zu
einer gerührten
Suspension von 10,0 g (0,034 mol) 6 in 200 ml destilliertem Wasser
wird 40,0 g (0,288 mol) Bromessigsäure gegeben. Die Reaktionsmischung
wird magnetisch bei Raumtemperatur gerührt. Der pH der Lösung wird
mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 10.0 eingestellt und die Reaktionsmischung
wird in einem Ölbad
bei 45 °C
für 16
Stunden erhitzt. Der pH wird während
des gesamten Verlaufs der Reaktion mit 5.0 N Natriumhydroxid zwischen
9,75 und 10,0 gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wird mittels
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer PRP-X100 Anionaustauscher-Säule (geliefert
von Hamilton) verfolgt. Kleine Menge an Bromessigsäure werden
zu der Reaktionsmischung gegeben, um die Reaktion zur Vollständigkeit
zu führen.
Die Reaktionsmischung wird mit sterilem Wasser auf ein Volumen von
2 Litern verdünnt
und der pH mit 6,0 N Salzsäure
auf 6.8 eingestellt. Die Leitfähigkeit
dieser Lösung beträgt 4,89
ms/cm. Sie wird weiter mit sterilem Wasser auf 4 Liter verdünnt und
der pH wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die bestimmte
Leitfähigkeit
beträgt
2.89 ms/cm. Diese Lösung
wird auf eine 5 × 60
cm Säule
mit 900 ml Austauschervolumen an AG®1-X2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) (Acetat-Form) Harz, welche
mit 1 Liter 1,5 M Essigsäure,
1,5 Liter Wasser, 0,5 Liter 0,02 N Ammoniumacetat pH 7.18 und 4
Liter Wasser finales Eluenz pH 4.29 mittels Schnellleistungs-Flüssigchromatographie
(FPLC) bei 40 ml/min vorgewaschen wird, gegeben. Die Säule wird
mit Wasser eluiert und graduell das Lösungsmittel B (1,50 M Essigsäure) des
Gradientensystems erhöht.
Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengefasst und
das Lösungsmittel
entfernt und im hohen Vakuum getrocknet, um 7,10 g (40 %) der Verbindung
7 zu ergeben.
-
2,3,9,10-Diphenylenyl-1,4,8,11-tetraazacyclo
tetradecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenphosphonsäure 8:
-
5,0
g (0,061 mol) Phosphorsäure
und 10 ml entgastes Wasser werden in einen 3-Hals-Rundkolben, der mit einem Tropftrichter,
einem Thermometer und einem Rührfisch
ausgestattet war, gegeben. Der Kolben wird mit Stickstoff geflutet
und ein langsamer Strom an Stickstoff wird in dem Kolben aufrecht
gehalten. Die Auflösung
der Phosphorsäure
wird durch das Rühren
erzielt. 8.0 ml konzentrierte Salzsäure wird zu der Reaktionsmischung
gegeben und das Rühren
wird fortgesetzt.
-
Der
Tropftrichter wird mit 4,0 g (0,014 mol) 2,3,9,10-diphenylenyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan
6, gelöst
in 10 ml Wasser, beladen.
-
Die
Lösung
des cyclischen Amins aus dem Tropftrichter wird unter Stickstoff-Atmosphäre tropfenweise zu
der gerührten
sauren Lösung
gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wird die Reaktionsmischung unter Rückfluss
unter Verwendung eines Ölbads
für mindestens
1 Stunde erhitzt. Dann wird der Tropftrichter mit Formaldehyd 5,0
g (0,172 mol) einer 37% wässrigen
Lösung
beladen und dieses tropfenweise über
einen Zeitraum von 2 bis 3 Stunden zu der Reaktionsmischung gegeben.
Die Reaktionsmischung wird während
der gesamten Zeit der Formaldehyd-Zugabe weiter unter Rückfluss
erhitzt. Nach Komplettierung der gesamten Formaldehyd-Lösung wird
die Reaktionsmischung für
weitere 3 bis 4 Stunden weiter unter Rückfluss gerührt. Die Reaktionsmischung
wird dann abkühlen
gelassen und das Produkt 2,3,9,10-Diphenylenyl-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenphosphonsäure 8 wird
aus der Reaktionsmischung isoliert und mittels Ionen-Austauschharz-Chromatographie
in einer Ausbeute von 35 % gereinigt.
-
Beispiel III
-
2,3,8,9-Diphenylenyl
5,6,11,12-bis-ortho-carboxydiphenylenyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure 13 und 2,3,8,9-Diphenylenyl-5,6,11,12-bis-ortho-carboxydiphenylenyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N,N'',N'''-tetramethylenphosphorsäure 14
-
-
-
N-Phenyl-N-(1-chlor-3-carboxyphenyl)amin
9:
-
Zu
einer gerührten
Lösung
von 10,0 g (0,039 mol) 2-Nitroanilin, 28,0 g (0,146 mol) 2,3-Dichlorbenzoesäure in 200
ml trockenem Dimethylsulfoxid werden 20,0 g (0,19 mol) trockenes
Natriumbicarbonat gegeben. Die Reaktionsmischung wird für 5 Stunden
bei 115 °C
in Stickstoffatmosphäre
erhitzt. Das Dimethylsulfoxid-Lösungsmittel
wird im hohen Vakuum entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wird
drei Mal jeweils mit 100 ml Methylenchlorid durch Aufteilung mit
Wasser extrahiert. Die kombinierte Methylenchlorid-Schicht wird über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und filtriert.
-
Das
Lösungsmittel
aus dem Filtrat wird bei reduziertem Druck entferntund getrocknet.
Der rohe Rückstand
wurde an einer Kieselgel 60 Säule
(230-400 mesh) chromatographiert unter Verwendung von 25% Ethylacetat
in Hexan als ein Eluationslösungsmittel
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden
kombiniert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um 20,0 g (47
%) N-Phenyl-N-(1-chlor-3-carboxyphenyl)amin 9 zu ergeben.
-
N,N'-Bis(2-dinitrophenyl)-2,3-diaminobenzoesäure 10:
-
10,0
g (0,034 mol) N-phenyl-N-(1-chlor-3-carboxyphenyl)amin 9 und 5,20
g (0,038 mol) 2-Nitroanilin 1 werden in 200 ml wasserfreiem Dimethylformamid
(DMF) Lösungsmittel
gelöst.
Zu der magnetisch gerührten Lösung werden
0,22 g (0,0035 mol) Kupfer-Pulver und 0,65 g (0,0034 mol) Kupferiodid
und 3,62 g (0,034 mol) Natriumcarbonat gegeben und unter Rückfluss
in einem Ölbad
erhitzt. Ein langsamer Strom an Stickstoff-Gas wird während des
gesamten Verlaufs der Reaktion aufrecht gehalten. Die Reaktionsmischung
wird für
24 Stunden erhitzt. Das Lösungsmittel
aus der Reaktionsmischung wird im hohen Vakuum entfernt und getrocknet. Das
Rohprodukt wird drei Mal mit 150 ml Methylenchlorid extrahiert.
Die kombinierten Methylenchlorid-Extrakte werden mit Kochsalz-Lösung und
Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel
aus dem Filtrat wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet.
Der rohe Rückstand
wird mittels Kieselgel-Säulenchromatographie
unter Verwendung von 25% Ethylacetat in Hexan als ein Eluationslösungsmittel
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden
kombiniert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um 8,0 g (60
%) der gewünschten
Verbindung 10 zu ergeben.
-
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-2,3-diaminobenzoesäure 11:
-
2,0
g (0,005 mol) of N,N'-Bis(2-dinitrophenyl)-2,3-diaminobenzoesäure 10 werden
in eine Parr-Hydrierungsdruckflasche gegeben. 200 ml an 2% Eisessig
in absolutem Ethanol werden zugegeben. Zu dieser Suspension werden
0,4 g an 10% Palladium auf aktiviertem Kohlenstoff gegeben. Die
Reaktionsmischung wird in Wasserstoff-Atmosphäre unter Verwendung eines Parr-Hydrierungsapparat
bei 60 PSI für
6 Stunden katalytisch reduziert. Die Lösung wird filtriert und das
Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet. Der rohe Rückstand
wird als Acetat-Salz ohne weitere Aufreinigung in weiteren Reaktionen
eingesetzt. Die Ausbeute des Produkts beträgt 50-60 %.
-
2,3,8,9-Diphenylenyl-5,6,11,12-bis-ortho-carboxydiphenylenyl-1,4,7,10-tetraazadodecan 12:
-
1,0
g (0,002 mol) of N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-2,3diaminobenzoesäurediacetat
11 und 0,47 (0,002 mol) 2,3-Dichlorbenzoesäure werden in 100 ml wasserfreiem
Dimethylformamid (DMF) Lösungsmittel
gelöst. Zu
der magnetisch gerührten
Lösung
werden 0,160 g (0,1002 mol) Kupfer-Pulver und 0,38 g (0,002 mol)
Kupferiodid und 1,0 g (0,01 mol) Natriumcarbonat gegeben und unter
Rückfluss
in einem Ölbad
erhitzt. Ein langsamer Strom an Stickstoff-Gas wird während des
gesamten Verlaufs der Reaktion aufrecht gehalten. Die Reaktionsmischung
wird für
36 Stunden bei 115 bis 120 °C
erhitzt. Das Lösungsmittel
aus der Reaktionsmischung wird im hohen Vakuum entfernt und getrocknet.
Das Rohprodukt wird mittels einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung
von Acetonitril, das Essigsäure
als eine mobile Phase enthält,
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden
kombiniert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt, um 50% der gewünschten
Verbindung 2,3,8,9-Diphenylenyl-5,6,11,12-bis-ortho-carboxy-diphenylenyl-1,4,7,10-tetraazadodecan
12 zu ergeben.
-
2,3,8,9-Diphenylenyl-5,6,11,12-bis-ortho-carboxydiphenylenyl-4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure 13:
-
Zu
einer gerührten
Suspension von 10,0 g (0,022 mol) 2,3,8,9-Diphenylenyl-5,6,11,12-bis-ortho-carboxy-diphenylenyl-1,4,7,10-tetraazadodecan
12 in 200 ml destilliertem Wasser wird 30,8 g (0,22 mol) Bromessigsäure gegeben
und magnetisch gerührt.
Der pH der Lösung
wurde mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 10.0 eingestellt und die Reaktionsmischung
wird in einem Ölbad
bei 45 °C
für 20
Stunden erhitzt. Der pH wurde während
des gesamten Verlaufs der Reaktion mit 5,0 N Natriumhydroxid zwischen
9,75 und 10,0 gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wurde mittels
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer PRP-X100 Anionaustauscher-Säule (geliefert
von Hamilton) verfolgt und kleine Menge an Bromessigsäure (das
heißt
100 bis 200 mg) werden zugegeben, um die Reaktion zur Vollständigkeit
zu führen.
Die Reaktionsmischung wird mit sterilem Wasser auf ein Volumen von
2 Litern verdünnt
und der pH mit 6,0 N Salzsäure
auf 6.8 eingestellt. Die Leitfähigkeit
dieser Lösung
beträgt
4,89 ms/cm. Sie wird weiter mit sterilem Wasser auf 4 Liter verdünnt und
der pH wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die bestimmte
Leitfähigkeit
beträgt
2.89 ms/cm. Diese Lösung
wurde auf eine 5 × 60
cm Säule
mit 900 ml Austauschervolumen an AG® 1-X2
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) (Acetat-Form) Harz, welche
mit 1 Liter 1,5 M Essigsäure,
1,5 Liter Wasser, 0,5 Liter 0,02 N Ammoniumacetat pH 7.18 und 4
Liter Wasser finales Eluenz pH 4.29 mittels FPLC bei 40 ml/min vorgewaschen
wurde, gegeben. Die Säule
wird mit Wasser eluiert und graduell das Lösungsmittel B (1,50 M Essigsäure) des
Gradientensystems erhöht.
Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengefasst und
das Lösungsmittel
entfernt und im hohen Vakuum getrocknet, um 5,6 g (40 %) der reinen
Verbindung 13 zu ergeben.
-
2,3,8,9-Diphenylenyl-5,6,11,12-bis-ortho-carboxydiphenylenyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenghosphonsäure 14:
-
25,0
g (0,31 mol) Phosphorsäure
und 20 ml entgastes Wasser werden in einen 3-Hals-Rundkolben, der mit einem Tropftrichter,
einem Thermometer und einem magnetischen Rührfisch ausgestattet war, gegeben.
Der Kolben wird mit Stickstoff geflutet und ein langsamer Strom
an Stickstoff wird in dem Reaktionskolben aufrecht gehalten. Die
Auflösung
der Phosphorsäure
wird durch das Rühren
erzielt. 15,0 ml konzentrierte Salzsäure wird zu der Reaktionsmischung
gegeben und das Rühren
wird fortgesetzt. Der Tropftrichter wird mit 20,0 g (0,044 mol)
2,3,8,9-Diphenylenyl-5,6,11,12-bis-ortho-carboxydiphenylenyl-1,4,7,10-tetraazadodecan
12, gelöst
in 25 ml Wasser, beladen.
-
Die
Lösung
des cyclischen Tetramins aus dem Tropftrichter wird unter Stickstoff-Atmosphäre tropfenweise
zu der gerührten
sauren Lösung
gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wird die Reaktionsmischung unter
Rückfluss
unter Verwendung eines Ölbads
für mindestens
1,0 Stunden erhitzt. Der Tropftrichter wird mit Formaldehyd 27,2
g (0,938 mol) einer 37% wässrigen
Lösung
beladen und diese wird tropfenweise über einen Zeitraum von 2 bis
3 Stunden zu der Reaktionsmischung gegeben. Die Reaktionsmischung
wird während
der gesamten Zeit der Formaldehyd-Zugabe weiter unter Rückfluss
erhitzt. Nach Komplettierung der gesamten Formaldehyd-Lösung wird
die Reaktionsmischung kontinuierlich für weitere 3 bis 4 Stunden unter
Rückfluss gerührt. Die Reaktionsmischung
wird dann abkühlen
gelassen und das Produkt 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenphosphonsäure 14 wird
aus der Reaktionsmischung isoliert und mittels Ionen-Austauschharz-Chromatographie
in einer Ausbeute von 40-50 % gereinigt.
-
Beispiel IV
-
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid 15 konjugiert
mit Annexin V
-
-
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid 15:
-
10,0
g (0,018 mol) N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propandiaminohexaessigsäure 4 werden
in einen 500 Rundkolben gegeben. Zu dem Kolben werden 200 ml of
Essigsäureanhydrid
gegeben. Die Reaktionsmischung wird magnetisch gerührt und
unter Rückfluss
für 48
Stunden erhitzt. Das Lösungsmittel
aus der Reaktionsmischung wird im hohen Vakuum entfernt und getrocknet.
Der rohe Rückstand
wird mittels Sublimation gereinigt, um 6,0 g (64 %) N,N'-Bis(2- diaminophenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid
15 zu ergeben.
-
r-Annexin-V-Konjugation
von N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid 16:
-
Die
Vorstufe N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid 15 wird r-Annexin
V in molaren Verhältnissen
von 300:1, 150:1, 75:1, 25:1, 10:1 und 5:1 angeboten. Typisch für ein molares
Angebot von 75:1 an Dianhydride zu r-Annexin V werden 100 μl Dimethylsulfoxid-
oder DMF-Lösungsmittel,
enthaltend 7,74 mg of N4-Ligand-Anhydrid tropfenweise
unter Rühren
zu 2 ml Puffer mit 25 mM HEPES ((N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure])),
150 mM Natriumchlorid, pH 8,0 umfassend 7,2 mg r-Annexin V gegeben.
Die Reaktionsmischung wird für
2 Stunden bei 25 °C-37 °C gerührt, gefolgt
von einer Reinigung mittels PD-10 Ausschlußchromatographie, äquilibriert
in PBS. Das Endprodukt des Konjugats wird erschöpfend in PBS dialysiert.
-
Beispiel V
-
Tc
99m-radiomarkiertes N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid
15
-
Beipiel VI
-
Y90-markierte
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-diaminohexessigsäure 4 und
N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-diaminohexamethylenphosphonsäure 5
-
-
99mTc-Radiomarkierungsverfahren
für N4-Ligand-r-Annexin-V-Konjugat 16:
-
METHODE
A: Zinngluconat-Kits werden hergestellt, die 5,0 mg Natriumgluconat,
100 Mikrogramm Zinnchlorid, 1,0 mg (1 mg/ml) N4-Ligand-r-Annexin-V-Konjugat
16 und 0,1 bis 1,0 mg Lactose enthalten. Der pH wird unter Verwendung
von Salzsäure,
Essigsäure
oder Natriumhydroxid zwischen 5 und 7 gehalten. Zu dem Zinngluconat-Kit
werden 1,0 ml Natriumpertechnetat (99mTcO4 –) mit einer spezifischen
Aktivität
von 50 mCi/ml gegeben. Das Glasfläschen wird gründlich gemischt
und bei 25 °C-37 °C für 15'-30' inkubiert.
-
Die
prozentuale Bildung von radiomarkiertem Konjugat, verbleibendes
TcO4 und hydrolysiertes, reduziertes Technetium
werden mittels ITLC in 12 % TCA als Entwicklungslösungsmittel
bestimmt.
-
METHODE
B: Zinntartrat-Kits werden in einem Evakuierungsglasfläschen unter
Stickstoff hergestellt, um 0,5 ml Dinatriumtartrat (10 mg/ml) und
0,1 ml Zinnchlorid (1,0 mg/ml in Ethanol) zu enthalten. Der pH der Lösung wird
zwischen 5 und 7, vorzugsweise 6,0 gehalten. Zu dieser Zinntartrat-Lösung werden
1,0 ml Natriumpertechnetat in einer spezifischen Konzentration von
50 mCi/ml gegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur
stehen gelassen. In ein evakuiertes Glasfläschen werden nacheinander 200 μl Natriumphosphat
(0,5 M, pH 8,0 oder 10,0) und 1,0 ml N,N'-Bis(2diaminophenyl)-1,3-propandiaminohexaessigsäure 4 (1,0 mg/ml)
gegeben. Dann wird Tc-99m-tartrat (50 mCi) zugegeben und das Glasfläschen wird
bei 25 °C-37 °C für 15'-30' inkubiert. Die prozentuale
Bildung von radiomarkiertem Konjugat, verbleibendes TcO4 und
hydrolysiertes, reduziertes Technetium werden mittels ITLC in verschiedenen
als Entwicklungslösungsmittelsysteme
bestimmt.
-
90Y-Radiomarkierung
von Verbindung 4 (18):
-
Zu
Träger-freiem
0,6 mCi Y-90 Cl3 (10 μl, 50 mM HCl, NEN Dupont) werden
0,18 mg Verbindung 4 in 450 μl
2,0 M NH4OAc, pH 5,0 gegeben und die Reaktionsmischung
wird für
30 Minuten bei 80 °C
fortschreiten gelassen. Die prozentuale 90Y-Radiomarkierung,
die mittels eines Gradient-HPLC-Systems, welches mit einem radiometrischen
Detektor ausgestattet ist, beobachtet wird, beträgt größer 99 %.
-
90Y-Radiomarkierung
von Verbindung 5 (19):
-
Zu
Träger-freiem
0,6 mCi Y-90 Cl3 (10 μl, 50 mM HCl, NEN Dupont) werden
0,18 mg Verbindung 5 in 450 μl
2,0 M Ammoniumacetat, pH 7,0 gegeben und die Reaktionsmischung wird
für 30
Minuten bei 80 °C
fortschreiten gelassen. Die prozentuale 90Y-Radiomarkierung,
die mittels eines Gradient-HPLC-Systems, welches mit einem radiometrischen
Detektor ausgestattet ist, beobachtet wird, beträgt größer 99 %.
-
Beispiel VII
-
4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propandiaminohexaessigsäure 23 und
4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propandiaminohexamethylenphosphonsäure 24
-
-
4-N,N'-1-Bis(3-dinitrothiophenyl)-1,3-propyldiamin
21:
-
Zu
einer gerührten
Lösung
von 25,0 g (0,174 mol) 3-Nitro-4-aminothiophen und 10,2 g (0,034
mol) 1,3-Diiodpropan in 200 ml trockenem Dimethylsulfoxid werden
18,3 g (0,172 mol) Natriumcarbonat gegeben und das ganze wird für 12 Stunden
bei 110 °C-115 °C erhitzt.
Das Lösungsmittel
aus der Reaktionsmischung wird im hohen Vakuum entfernt und getrocknet.
Der rohe Rückstand
wird mittels Kieselgel-Säulenchromatographie
unter Verwendung von 30 % Ethylacetat in Hexan als ein Eluationslösungsmittel
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten,
werden kombiniert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um 8,0 g (14
%) der Verbindung 14 zu ergeben.
-
4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propyldiamin
22:
-
5,0
g (0,015 mol) 4-N,N'-Bis(3-dinitrothiophenyl)-1,3-propyldiamin
21 wird in eine Hydrierungsflasche gegeben. 250 ml an 2% Eisessig
in absolutem Ethanol wird zugefügt.
Zu dieser Suspension werden 0,5 g an 10% Palladium auf aktiviertem
Kohlenstoff gegeben. Die Reaktionsmischung wird in Wasserstoff-Atmosphäre unter
Verwendung eines Parr-Hydrierungsapparats bei 60 PSI für 4-6 Stunden
katalytisch reduziert. Die Lösung
wird filtriert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet.
-
Der
rohe Rückstand
wird mit einer gesättigten
Natriumbicarbonat-Lösung
aufgenommen und das freie Amin wird drei Mal, jeweils mit 150 ml,
in Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierte organische Schicht
wird über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert.
-
Das
Lösungsmittel
des Filtrats wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet,
um einen rohen Rückstand
zu ergeben. Das Rohprodukt wird mittels Kieselgel-Säulenchromatographie
unter Verwendung von 50 % Ethylacetat in Hexan als ein Eluationslösungsmittel
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten,
werden kombiniert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um 3,50 g (75
%) an Verbindung 22 zu ergeben.
-
4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propandiaminohexaessigsäure 23:
-
Zu
einer gerührten
Suspension von 5,0 g (0,016 mol) 4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propandiamin
22 in 100 ml destilliertem Wasser werden 22,6 g (0,163 mol) Bromessigsäure gegeben
und magnetisch gerührt.
Der pH der Lösung
wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 10,0 eingestellt und die Reaktionsmischung wird
in einem Ölbad
bei 45 °C
für 16
Stunden erhitzt. Der pH wird während
des gesamten Verlaufs der Reaktion mit 5,0 N Natriumhydroxid zwischen
9,75 und 10,0 gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wird mittels
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer PRP-X100 Anionaustauscher-Säule (geliefert
von Hamilton) verfolgt und kleine Menge an Bromessigsäure werden
zugegeben, um die Reaktion zur Vollständigkeit zu führen. Die
Reaktionsmischung wird mit sterilem Wasser auf ein Volumen von 2
Litern verdünnt
und der pH mit 6,0 N Salzsäure
auf 6,8 eingestellt. Die Leitfähigkeit
dieser Lösung
beträgt
4,89 Ms/cm. Sie wird weiter mit sterilem Wasser auf 4 Liter verdünnt und
der pH wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die bestimmte
Leitfähigkeit
beträgt
2.89 Ms/cm. Diese Lösung
wird auf eine 5 × 60
cm Säule mit
900 ml Austauschervolumen an AG®1-X2
(Acetat-Form) Harz, welche mit 1 Liter 1,50 M Essigsäure, 1,5 Liter
Wasser, 0,5 Liter 0,02 N Ammoniumacetat pH 7.18 und 4 Liter Wasser
finales Eluenz pH 4.29 mittels FPLC bei 40 ml/min vorgewaschen wird,
gegeben. Die Säule
wird mit Wasser eluiert und graduell das Lösungsmittel B (1,50 M Essigsäure) des
Gradientensystems erhöht.
Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengefasst und
das Lösungsmittel
entfernt und im hohen Vakuum getrocknet, um 7,50 g (81 %) der reinen
Verbindung 23 zu ergeben.
-
4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propandiaminohexamethylenphosphonsäure 24:
-
25,0
g (0,31 mol) Phosphorsäure
und 25 ml entgastes Wasser werden in einen 3-Hals-Rundkolben, der mit einem Tropftrichter,
einem Thermometer und einem magnetischem Rührfisch ausgestattet war, gegeben.
Der Kolben wird mit Stickstoff geflutet und ein langsamer Strom
an Stickstoff wird in dem Kolben aufrecht gehalten.
-
Die
Auflösung
der Phosphorsäure
wird durch das Rühren
erzielt. 30 ml konzentrierte Salzsäure werden zu der Reaktionsmischung
gegeben und das Rühren
wird fortgesetzt. Der Tropftrichter wird mit 20,0 g (0,065 mol)
4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propandiamin,
gelöst
in 25 ml Wasser, beladen.
-
Die
Amin-Lösung
aus dem Tropftrichter wird unter Stickstoff-Atmosphäre tropfenweise
zu der magnetisch gerührten
sauren Lösung
gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wird die Reaktionsmischung unter Rückfluss
unter Verwendung eines Ölbads
für mindestens
1,0 Stunden erhitzt. Dann wird der Tropftrichter mit Formaldehyd
22,0 g (0,73 mol) einer 37% wässrigen
Lösung
beladen und dieses tropfenweise über
einen Zeitraum von 2 bis 3 Stunden zu der Reaktionsmischung gegeben.
Die Reaktionsmischung wird während
der gesamten Zeit der Formaldehyd-Zugabe weiter unter Rückfluss
erhitzt. Nach Komplettierung der gesamten Formaldehyd-Lösung wird
die Reaktionsmischung für
weitere 4-6 Stunden weiter unter Rückfluss gerührt. Die Reaktionsmischung
wird dann abkühlen
gelassen und das Produkt 4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propandiaminohexamethylenphosphonsäure 24 wird
aus der Reaktionsmischung isoliert und mittels Ionen-Austauschharz-Chromatographie
gereinigt.
-
Beispiel VIII
-
2,3,9,10-[2,3-C,9,10-C)-dithiophenyl]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure 26 und 2,3,9,10-[2,3-C,9,10-C)-dithiophenyl]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'-tetramethylenphosphonsäure 27
-
-
2,3,9,10-(2,3-C;9,10-C')-dithioghenyll-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan
25:
-
Eine
gerührte
Lösung
von 10,0 g (0,037 mol) 4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)-1,3-propyldiamin
22, 2,0 g (0,007 mol) 1,3-Diiodpropan und 5,70 g (0,068 mol) Natriumbicarbonat
in 100 ml trockenem Dimethylsulfoxid wird für 4 Stunden bei 115 °C in Stickstoffatmosphäre erhitzt.
Das Dimethylsulfoxid-Lösungsmittel
wird im hohen Vakuum entfernt und getrocknet. Das Rohprodukt wird
drei Mal jeweils mit 100 ml Methylenchlorid durch Aufteilung mit
Wasser extrahiert. Die kombinierte Methylenchlorid-Schicht wird
mit Kochsalzlösung
und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und filtriert.
-
Das
Lösungsmittel
aus dem Filtrat wird bei reduziertem Druck entfernt, um einen rohen
Rückstand
zu ergeben. Der rohe Rückstand
wird mittels Kieselgel-Säulenchromatographie
unter Verwendung von 30 % Ethylacetat in Hexan als ein Eluationslösungsmittel
gereinigt. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthalten, werden
kombiniert und das Lösungsmittel
wird bei reduziertem Druck entfernt und getrocknet, um 4,0 g (35
%) der Verbindung 25 zu ergeben.
-
2,3,9,10-[(2,3C,9,10-C)-dithiophenyl]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure 26:
-
Zu
einer gerührten
Suspension von 10,0 g (0,033 mol) Verbindung 25 in 200 ml destilliertem
Wasser werden 40,0 g (0,288 mol) Bromessigsäure gegeben. Die Reaktionsmischung
wird magnetisch bei Raumtemperatur gerührt. Der pH der Lösung wird
mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 10,0 eingestellt und die Reaktionsmischung
wird in einem Ölbad
bei 45 °C
für 20
Stunden erhitzt. Der pH wurde während
des gesamten Verlaufs der Reaktion mit 5,0 N Natriumhydroxid zwischen
9,75 und 10,0 gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wird mittels
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer PRP-X100 Anionaustauscher-Säule verfolgt
und kleine Menge an Bromessigsäure
(das heißt
100-200 mg) werden zugegeben, um die Reaktion zur Vollständigkeit
zu führen.
Die Reaktionsmischung wird mit sterilem Wasser auf ein Volumen von 2
Litern verdünnt
und der pH mit 6,0 N Salzsäure
auf 6,8 eingestellt. Die Leitfähigkeit
dieser Lösung
beträgt 4,89
Ms/cm. Sie wird weiter mit sterilem Wasser auf 4 Liter verdünnt und
der pH wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die bestimmte
Leitfähigkeit
beträgt
2.89 Ms/cm. Diese Lösung
wird auf eine 5 × 60
cm Säule mit
900 ml Austauschervolumen an AG® 1-X2
(Acetat-Form) Harz, welche mit 1 Liter 1,50 M Essigsäure, 1,5 Liter
Wasser, 0,5 Liter 0,02 N Ammoniumacetat pH 7.18 und 4 Liter Wasser
finales Eluenz pH 4.29 mittels FPLC bei 40 ml/min vorgewaschen wurde,
gegeben. Die Säule
wird mit Wasser eluiert und graduell das Lösungsmittel B (1,50 M Essigsäure) des
Gradientensystems erhöht.
Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengefasst und
das Lösungsmittel
entfernt und im hohen Vakuum getrocknet, um 8,0 g (46 %) der Verbindung
26 zu ergeben.
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2,3,9,10-[(2,3-C,9,10-C)-dithiophenyl]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenphosphonsäure 27:
-
5,0
g (0,061 mol) Phosphorsäure
und 10 ml entgastes Wasser werden in einen 3-Hals-Rundkolben, der mit einem Tropftrichter,
einem Thermometer und einem Rührfisch
ausgestattet war, gegeben. Der Kolben wird mit Stickstoff geflutet
und ein langsamer Strom an Stickstoff wird in dem Kolben aufrecht
gehalten. Die Auflösung
der Phosphorsäure
wird durch das Rühren
erzielt. 10 ml konzentrierte Salzsäure werden zu der Reaktionsmischung
gegeben und das Rühren
wird fortgesetzt. Der Tropftrichter wird mit 4,0 g (0,013 mol) 2,3,9,10-(2,3-C;9,10-C')-dithiophenyl]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan
gelöst
in 15 ml Wasser beladen.
-
Die
Lösung
des cyclischen Amins aus dem Tropftrichter wird unter Stickstoff-Atmosphäre tropfenweise zu
der magnetisch gerührten
sauren Lösung
gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wird die Reaktionsmischung unter
Rückfluss
unter Verwendung eines Ölbads
für mindestens
1,0 Stunden erhitzt. Dann wird der Tropftrichter mit Formaldehyd
5,0 g (0,172 mol) einer 37% wässrigen
Lösung
beladen und diese tropfenweise über
einen Zeitraum von 2 bis 3 Stunden zu der Reaktionsmischung gegeben.
Die Reaktionsmischung wird während
der gesamten Zeit der Formaldehyd-Zugabe weiter unter Rückfluss
erhitzt. Nach Komplettierung der gesamten Formaldehyd-Lösung wird
die Reaktionsmischung für
weitere 3 bis 4 Stunden weiter unter Rückfluss gerührt. Die Reaktionsmischung
wird dann abkühlen
gelassen und das Produkt 2,3,9,10-[(2,3- C,9,10-C)-dithiophenyl]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenphosphonsäure 27 wird
aus der Reaktionsmischung isoliert und mittels Ionen-Austauschharz-Chromatographie
in einer Ausbeute von 25 % gereinigt.
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Beispiel IX
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4-N,N'-Bis(3-diaminothiophenyl)1,3-propandiaminohexamethylenphosphonsäure 24 und 2,3,9,10-[(2,3-C,9,10-C)-dithiophenyl]-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan-N,N',N'',N'''-tetramethylenphosphonsäure 27 werden
Y
90 markiert.
-
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90Y-Radiomarkierung
von Verbindung 24 (28):
-
Zu
Träger-freiem
0,6 mCi Y-90 Cl3 (10 μl, 50 mM HCl, NEN Dupont) werden
0,18 mg Verbindung 24 in 450 μl
2,0 M Ammoniumacetat, pH 5,0 gegeben und die Reaktionsmischung wird
für 30
Minuten bei 80 °C
fortschreiten gelassen. Die prozentuale 90Y-Radiomarkierung,
die mittels eines Gradient-HPLC-Systems, welches mit einem radiometrischen
Detektor ausgestattet ist, beobachtet wird, beträgt größer 99 %.
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90Y-Radiomarkierung
von Verbindung 27 (29):
-
Zu
Träger-freiem
0,6 mCi Y-90 Cl3 (10 μl, 50 mM HCl, NEN Dupont) werden
0,18 mg Verbindung 24 in 450 μl
2,0 M Ammoniumacetat, pH 5,0 gegeben und die Reaktionsmischung wird
für 30
Minuten bei 80 °C
fortschreiten gelassen. Die prozentuale 90Y-Radiomarkierung,
die mittels eines Gradient-HPLC-Systems, welches mit einem radiometrischen
Detektor ausgestattet ist, beobachtet wird, beträgt größer 99 %.
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Beispiel X
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Biocytin
konjugiert an Tc
99m radiomarkiertem N,N'-Bis(2-diaminophenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid
15:
-
-
Biocytin-Konjugation von
N,N'-Bis(2-diaminonhenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid 15 (20):
-
Typischerweise
werden zu einem gerührten
Becherglas mit 25,0 ml an 0,20 M Borat, pH 8.0 in sequentieller
Abfolge 1,25 ml Dimethylformamid, enthaltend 129 mg (0,25 m mol)
N,N'-Bis(2-diaminonhenyl)-1,3-propan-N,N'-diessigsäure-2,2'-tetraessigsäuredianhydrid-Chelat gefolgt
von 1,25 ml DMF, enthaltend 9,3 mg (0,025 m mol) Biocytin-freie
Base gegeben.
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Nach
Inkubation bei 25 °C
für 2 Stunden
unter Rühren
wird das gewünschte
Produkt von den Reaktanten und Nebenprodukten mittels präparativer Umkehrphasen-C-18-Chromatographie,
wie zum Beispiel die DYNAMAX®-60A (bezogen von Rainin
Instrument Co.), getrennt.
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Alternativ
werden zu einem gerührten
Becherglas mit 25 ml Dimethylformamid 1,25 ml Dimethylformamid,
enthaltend 124 mg (0,25 m mol) N4-Dianhydrid-Chelat 15, 1,25 ml
DMF, enthaltend 9,3 mg (0,025 m mol) Biocytin-freie Base und 1,25
ml DMF, enthaltend 0,025 m mol Diisopropylethylamin gegeben. Die
Reaktionsmischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das
gewünschte
Produkt wird mittels Umkehrphasen-C-18-Chromatographie gereinigt.
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Die
in vitro-Bindungseffizienz des Biocytin-derivatisierten N4-Chelats zu Avidin oder Streptavidin wird unter
Verwendung der Standard-HABA ([2(4'Hydroxyazobenzol)benzoesäure]Farbstoff)
UV/VIS spektrophotometrischer Assay von Green et al. (Biochem. J.,
94:23c-24c, 1965) bestimmt. Die Radiomarkierung mit radioaktiven 90Y and 111In wird
in 2,0 M Acetatpuffer, pH 5,0, wie früher für die Markierung der N4-Tetramethylenphosphonat-Liganden beschrieben,
durchgeführt.
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Beispiel XI
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N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-ethoxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin
-
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4,4-Diethoxycarbonylphenyl-1,3-dianilin
31:
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Eine
gerührte
Suspension von 2,065 g (1,25 mol) Ethyl-4-aminobenzoat 3, 14,35
ml (0,125 mol) 1,3-Diiodpropan und 10,5 g (0,125 mol) Natriumbicarbonat
in 500 ml trockenem Dimethylsulfoxide wurde für 3 Stunden bei 110 °C unter Stickstoff
erhitzt.
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Beim
Abkühlen
wurde die Mischung unter Rühren
in 2 L Eiswasser gegossen und der resultierende Niederschlag mittels
Filtration gesammelt. Der Niederschlag wurde dann mit Eisessig (14 × 75 ml)
gewaschen bis das gesamte Ausgangsmaterial Ethyl-4-aminobenzoat
entfernt worden ist. Nach Trocknem im Vakuum wurde das so erhaltene
Produkt 31 ohne weitere Aufreinigung im nächsten Schritt eingesetzt.
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1,3-Di(2-imino-6-ethoxycarbonylbenzthiazolyl-3-)propan
32:
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Ammoniumthiocyanat
(16,5 g, 0,217 mol) wurde zu einer magnetisch gerührten Suspension
von 4,4-Diethoxycarbonylpropyl-1,3-dianilin (10,0 g, 0,027 mol)
(wie oben beschrieben hergestellt) in 1500 ml Eisessig gegeben.
Eine Lösung
von Brom (34,6 g, 0,216 mol) in 100 ml Eisessig wurde dann tropfenweise
unter Rühren
bei Raumtemperatur zu der Suspension gegeben. Nach Rühren der
Reaktionsmischung über
Nacht bei Raumtemperatur wurde das Dihydrobromid-Salz des Rohproduktes mittels Filtration
gesammelt und getrocknet. Das Produkt 32 wurde mittels Lösens des
Rohprodukts in heissem Wasser, Einstellen eines basischen pHs durch
die Zugabe von gesättigter
Natriumbicarbonat-Lösung,
Sammeln des Niederschlags und Trocknen im Vakuum isoliert.
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N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-carbonylphenyl)-1,3-propyldiamin
33:
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Festes
Kaliumhydroxid (20,0 g, 0,357 mol) wurde zu einer Suspension von
32 (1,0 g, 0,002 mol) in 40 ml destilliertem Wasser gegeben und
die erhaltene Mischung wurde für
12 Stunden bei 120 °C
erhitzt. Eine vollständige
Auflösung
erfolgte nach 1 Stunde.
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Die
Reaktionsmischung wurde dann in einem Eisbad gekühlt und der pH wurde mit 5,0
N Essigsäure auf
5,0 eingestellt. Die wässrige
Lösung
wurde dann mit drei 100 ml Portionen Ethylacetat extrahiert. Die
kombinierten Ethylacetat-Extrakte
wurden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Trocknungsmittel wurde
filtriert. Entfernung des Lösungsmittels
ergab das Produkt 33.
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N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-ethoxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin
34:
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Eine
magnetisch gerührte
Suspension von 33 (0,5 g, 0,0013 mol) in 200 ml absolutem Ethylalkohol wurde
mit trockenem Chlorwasserstoff-Gas gesättigt. Die Reaktionsmischung
wurde dann für
3 Tage unter Rückfluß erhitzt.
Beim Abkühlen
wurde das Lösungsmittel
bei reduziertem Druck entfernt, um Produkt 34 als Dihydrochlorid-Salz
zu ergeben. Eine Lösung
des Salzes in 100 ml destilliertem Wasser wurde mit 0,2 M Natriumbicarbonat-Lösung auf
einen pH 8,5 bis 9,0 eingestellt und die wässrige Lösung wurde mit drei 100 ml Portionen
Methylenchlorid extrahiert. Die kombinierten Methylenchlorid-Extrakte
wurden über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Trocknungsmittel wurde
filtriert. Entfernung des Lösungsmittels
ergab das Rohrodukt 34, welches mittels Flash-Chromatographie unter
Verwendung von Kieselgel und Elution mit Methylenchlorid und Ethylacetat
isoliert und gereinigt wurde.
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N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-ethoxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin
N,N'-diessigsäure 35
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Zu
einer gerührten
Suspension von 10,0 g (0,023 mol) Verbindung 34 in 200 ml destilliertem
Wasser werden 40,0 g (0,288 mol) Bromessigsäure gegeben. Die Reaktionsmischung
wird magnetisch bei Raumtemperatur gerührt. Der pH der Lösung wird
mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 10,0 eingestellt und die Reaktionsmischung
wird in einem Ölbad
bei 45 °C
für 16
Stunden erhitzt. Der pH wird während
des gesamten Verlaufs der Reaktion mit 5,0 N Natriumhydroxid zwischen
9,75 und 10,0 gehalten. Der Fortschritt der Reaktion wird mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) unter Verwendung einer PRP-X100 Anionaustauscher-Säule verfolgt
und kleine Menge an Bromessigsäure
werden zugegeben, um die Reaktion zur Vollständigkeit zu führen. Die
Reaktionsmischung wird mit sterilem Wasser auf ein Volumen von 2
Litern verdünnt
und der pH mit 6,0 N Salzsäure
auf 6,8 eingestellt. Die Leitfähigkeit
dieser Lösung
beträgt
4,89 Ms/cm. Sie wird weiter mit sterilem Wasser auf 4 Liter verdünnt und
der pH wird mit 2,0 N Natriumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die bestimmte
Leitfähigkeit
beträgt
2.89 Ms/cm. Diese Lösung
wird auf eine 5 × 60
cm Säule
mit 900 ml Austauschervolumen an AG® 1-X2
(Acetat-Form) Harz,
welche mit 1 Liter 1,50 M Essigsäure,
1,5 Liter Wasser, 0,5 Liter 0,02 N Ammoniumacetat pH 7.18 und 4
Liter Wasser finales Eluenz pH 4.29 mittels FPLC bei 40 ml/min vorgewaschen
wurde, gegeben. Die Säule
wird mit Wasser eluiert und graduell das Lösungsmittel B (1,50 M Essigsäure) des
Gradientensystems erhöht.
Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden zusammengefasst und
das Lösungsmittel
entfernt und im hohen Vakuum getrocknet, um 7,10 g (40%) der Verbindung
35 zu ergeben.
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Tc-99m-Radiomarkierung
von N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-ethoxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin N,N'-diessigsäure 36:
-
0,6
ml einer Lösung
von 170 ug/ml N,N'-Bis(2-disulfidyl-4-ethoxycarbonylphenyl)-1,3-propyldiamin N,N'-diessigsäure in entweder
Acetonitril oder Isopropanol werden zu 1,1 ml Tc-99m-gluconat (hergestellt
aus 0,12 mg Zinnchloriddihydrat, 5,0 mg Natriumgluconat bei pH 6,1-6,3
und 100 mCi/ml Tc-99m-pertechnetat) gegeben. Die resultierende Mischung
wird entweder für
15-30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert oder für 2-5 Minuten
bei 75 °C
erhitzt, gefolgt von einer Abkühlung
mit einem Eisbad. Die rohe Reaktionsmischung wird dann mit 3 ml
Wasser verdünnt
und mittels Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt. Das Rohprodukt
wird auf eine vorkonditionierte C-18 Probenpräparationskassette (SPICETM-Kassette bezogen von Analtech) und mit
5 ml Wasser gefolgt von 10 ml 5%iger ethanolischer Kochsalz-Lösung und
10 ml 10% Ethanol-Kochsalzlösung eluiert.
Das Tc99m-Chelatprodukt wird mit 10 ml 50%iger Ethanol-Kochsalzlösung eluiert,
um 75 % radiochemische Ausbeute des gewünschten Produkts zu ergeben.
Die radiochemische Reinheit des Eluats wird mittels Umkehrphasen-C-18
isokratischer Flüssigchromatographie
unter Verwendung 50% ethanolischer Kochsalzlösung als die mobile Phase bei
einer Fließrate
von 0,8 ml pro Minute analysiert.