DE69836012T2 - Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid - Google Patents

Zwei-schritt hybridisierung und einfang von einem polynukleotid Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Einfangen eines Polynukleotids, das in einer Probe auf einem festen Träger vorhanden sein kann. Die Erfindung ist besonders zum Abtrennen eines Ziel-Polynukleotids vom anderen Material in einer Probe geeignet und wird bevorzugt als Teil eines diagnostischen Verfahrens zum Detektieren der Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids in einer Probe verwendet.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Ein Ziel-Polynukleotid ist ein in einer Probe vorhandenes Polynukleotid, das aus einer oder mehreren Probenbestandteilen aufgereinigt werden kann und/oder dessen Anwesenheit mittels verschiedener Techniken detektiert werden kann. Solche Techniken werden üblicherweise als Teil eines diagnostischen Verfahrens zum Detektieren der Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids, das einen Hinweis auf die Anwesenheit eines infektiösen Agens oder eines pathogenen Zustandes gibt, durchgeführt.
  • Die Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotid-Basensequenzbereichs, der in einem Ziel-Polynukleotid vorhanden ist, kann mittels verschiedener Verfahren, wie z.B. solchen, die Nukleinsäuresonden verwenden, die mit einer Ziel-Sequenz hybridisieren, detektiert werden. Sonden können entworfen werden, um verschiedene Ziel-Sequenzen, wie z.B. solche, die für Mikroorganismen, Viren, menschliche Gene, Pflanzen oder tierische Gene und/oder pathogene Zustände charakteristisch sind, zu detektieren.
  • Eine Technik zum Auf reinigen eines Ziel-Polynukleotids, die häufig in diagnostischen Verfahren verwendet wird, schließt das Einfangen eines Ziel-Polynukleotids auf einem Trägermaterial ein. Das Trägermaterial hält das Ziel-Polynukleotid während eines oder mehrerer Waschschritte im Reinigungsverfahren für das Ziel-Polynukleotid fest.
  • Ranki et al., U.S. Pat. Nr. 4,486,539 beschreiben eine Hybridisierungs-Sandwichtechnik zum Einfangen und zum Detektieren der Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids. Die Technik schließt das Einfangen eines Ziel-Polynukleotids durch eine Sonde, die an ein Trägermaterial gebunden ist, und das Hybridisieren einer Detektionssonde mit dem eingefangenen Ziel-Polynukleotid ein. Die Detektionssonden, die nicht mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisiert sind, werden einfach vom Trägermaterial abgewaschen. Daher ist der verbleibende Marker mit dem Ziel-Polynukleotid, das von Anfang an in der Probe vorhanden ist, verbunden.
  • Stabinsky, U.S. Pat. Nr. 4,751,177 beschreibt ein Verfahren, das ein Vermittler-Polynukleotid verwendet, das sowohl mit einem Ziel-Polynukleotid als auch mit einem Polynukleotid, das an einem Trägermaterial fixiert ist, hybridisiert. Das Vermittler-Polynukleotid bindet das Ziel-Polynukleotid an das Trägermaterial, um ein gebundenes Ziel zu erzeugen. Eine markierte Sonde kann mit dem gebundenen Ziel hybridisiert werden, und die ungebundene markierte Sonde kann vom Trägermaterial weggewaschen werden.
  • Collins et al., EP Pat. Veröffentlichungsnr. 0328829 offenbaren ein Verfahren zum Detektieren einer Ziel-Nukleinsäure, in dem diese mit einer ersten Sonde bei einer ersten Temperatur inkubiert wird, eine immobilisierte zweite Sonde, die zur ersten komplementär ist, bei einer zweiten Temperatur zugegeben wird, das eingefangene Ziel gereinigt, amplifiziert und mit einer markierten Sonde detektiert wird.
  • Englehardt et al., U.S. Pat. Nr. 4,894,324 und 5,288,609 beschreiben ein Verfahren zum Detektieren eines Ziel-Polynukleotids. Im Verfahren werden zwei einzelsträngige Polynukleotidsegmente verwendet, die mit dem gleichen oder gegenüberliegenden Strängen des Ziels komplementär sind, und die Bildung eines Doppelhybrids mit dem Ziel-Polynukleotid ergibt. In einer Ausführungsform kann das Doppelhybrid auf einem Trägermaterial eingefangen werden.
  • Cape et al., EP Pat. Veröffentlichungsnr. 0 370 694 beschreiben Verfahren und Kits zum Detektieren von Nukleinsäuren unter Verwendung eines Festphaseneinfangmittels. Die Verfahren verwenden Oligonukleotidprimer, die mit spezifischen Bindungspartnern markiert sind, um Primer und Primer-Verlängerungsprodukte zu immobilisieren. Der Marker komplexiert spezifisch mit seinem Rezeptor, der an einem Trägermaterial gebunden ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß eines Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren zum Einfangen eines in einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotids offenbart, das die Schritte einschließt: Inkubieren einer Mischung, die ein Ziel-Polynukleotid, eine Fänger-Sonde und eine immobilisierte Sonde enthält, bei einer ersten Hybridisierungsbedingung, die die Bildung eines Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes, der aus der Fänger-Sonde und dem Ziel-Polynukleotid gebildet wird, begünstigt und die Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes, der aus der immobilisierten Sonde und der Fänger-Sonde gebildet wird, weniger begünstigt; und dann Inkubieren der Mischung bei einer zweiten Hybridisierungsbedingung, die die Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes begünstigt, wodurch das Ziel-Polynukleotid in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplex, der aus der immobilisierten Sonde, der Fänger-Sonde und dem Ziel-Polynukleotid gebildet wird, einfängt. Im ersten Inkubationsschritt wird eine Temperatur unterhalb einer Tm des Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes und oberhalb einer Tm des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes verwendet, und im zweiten Inkubationsschritt wird eine Temperatur unterhalb einer Tm des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes verwendet. Zum zweiten Inkubationsschritt gelangt man bevorzugt durch Verringern der Temperatur bei der ersten Hybridisierungsbedingung um wenigstens etwa 10°C, oder um wenigstens etwa 20°C. In einer Ausführungsform wird im ersten Inkubationsschritt eine Temperatur von etwa 60°C verwendet, und im zweiten Inkubationsschritt wird eine Temperatur von etwa 40°C oder niedriger verwendet. Das Verfahren schließt auch den Schritt des Aufreinigens des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes ein. In anderen Ausführungsformen des Verfahrens wird der Schritt des Detektierens des Ziel-Polynukleotids im immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplex durch Hybridisieren einer markierten Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid und Detektieren der markierten Sonde eingeschlossen. Das Verfahren kann ebenfalls den Schritt des Amplifizierens des Ziel-Polynukleotids einschließen, um eine amplifizierte Nukleinsäure, bevorzugt durch ein transkriptionsgebundenes Amplifikationsverfahren, herzustellen. Wenn der Amplifikationsschritt eingeschlossen ist, kann das Verfahren ebenfalls den Schritt des Detektierens der amplifizierten Nukleinsäure einschließen, bei dem bevorzugt die Schritte des Hybridisierens einer markierten Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure, die zum Ziel-Polynukleotid komplementär ist, und das Detektieren der markierten Sonde eingeschlossen sind. Das Verfahren kann im Detektionsschritt auch einen Schritt zum Entfernen der unhybridisierten markierten Sonde einschließen. In bevorzugten Ausführungsformen ist bei beiden Inkubationsschritten die Verwendung der immobilisierten Sonde, die einen Fänger-Sonde-Bindungsbereich von wenigstens fünf Nukleotidbasen- Erkennungsgruppen in der Länge einschließt, und die Fänger-Sonde, die einen immobilisierte Sonde-Bindungsbereich von wenigstens fünf Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen in der Länge einschließt, vorausgesetzt dass der Fänger-Sonde-Bindungsbereich zum immobilisierte Sonde-Bindungsbereich komplementär ist, eingeschlossen. Bevorzugt umfasst der Fänger-Sonde-Bindungsbereich: (a) ein erstes Rückgrat, das wenigstens eine Zucker-Phosphordiester-Verknüpfung oder wenigstens eine Peptid-Nukleinsäuregruppe, wenigstens eine Phosphorthioat-Verknüpfung oder eine Kombination davon und (b) wenigstens zehn Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem ersten Rückgrat verbunden sind, enthält, wobei jede Nukleotid-Erkennungsgruppe mit Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil oder Inosin eine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden kann; und der immobilisierte Sonde-Bindungsbereich umfasst: (a) ein zweites Rückgrat, das wenigstens eine Zucker-Phosphordiester-Verknüpfung oder wenigstens eine Peptid-Nukleinsäuregruppe, wenigstens eine Phosphorthioat-Verknüpfung oder eine Kombination davon, und (b) wenigstens zehn Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem ersten Rückgrat verbunden sind, die mit den Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem ersten Rückgrat verbunden sind, Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können, enthält. In einer Ausführungsform des Verfahrens besteht der Fänger-Sonde-Bindungsbereich aus einem Homopolymer, das wenigstens 10 Nukleotide umfasst, und der immobilisierten Sonde-Bindungsbereich besteht aus einem Homopolymer, das wenigstens 25 Nukleotide, von denen wenigstens 10 Nukleotide komplementär zu den 10 Nukleotiden des Fänger-Sonde-Bindungsbereiches sind, umfasst. Bevorzugt schließt der Fänger-Sonde-Bindungsbereich etwa vierzehn nebeneinander liegende A- oder T-Basen ein, und der immobilisierte Sonde-Bindungsbereich schließt eine Sequenz von etwa 30 dazu komplementären Basen ein. In bevorzugten Ausführungsformen werden in den Inkubationsschritten eine Mischung aus der immobilisierten Sonde und der Fänger-Sonde verwendet, in der jede Sonde Desoxynukleotide, Ribonukleotide, 2'-Methoxy substituierte Nukleotide, 2'-Halo substituierte Nukleotid-Komponenten oder Kombinationen davon einschließt.
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids in einer Probe. Dieses Verfahren schließt die Schritte ein:
    Bereitstellen einer Fänger-Sonde, die mit einem in einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotid hybridisieren kann; Mischen der Fänger-Sonde mit einer Probe, die vermutlich das Ziel-Polynukleotid enthält, bei einer ersten Inkubationstemperatur, die die Hybridisierung der Fänger-Sonde und des Ziel-Polynukleotids begünstigt, wodurch ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex erzeugt wird; Bereitstellen einer immobilisierten Sonde, die mit der Fänger-Sonde hybridisieren kann; Inkubieren des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes und der Immobilisierungssonde bei einer zweiten Inkubationstemperatur, die die Hybridisierung der immobilisierten Sonde und der Fänger-Sonde begünstigt, wodurch ein eingefangenes Ziel-Polynukleotid, das einen immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex umfasst, erzeugt wird; Aufreinigen des eingefangenen Ziel-Polynukleotids, wodurch ein gereinigtes Ziel-Polynukleotid erzeugt wird; Amplifizieren des gereinigten Ziel-Polynukleotids, wodurch eine amplifizierte Nukleinsäure erzeugt wird und Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure, um die Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids in der Probe zu bestimmen. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens sind beim Detektionsschritt das Hybridisieren einer markierten Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure, die mit dem Ziel-Polynukleotid oder einem Abschnitt davon komplementär ist, und das Detektieren der markierten Sonde eingeschlossen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1A und B illustrieren schematisch die Verwendung zwei verschiedener Hybridisierungsbedingungen, um ein Ziel-Polynukleotid, das mit einem "(c)" gekennzeichnet ist, mittels einer immobilisierten Sonde, die mit einem "(a)" gekennzeichnet ist, die an einem Trägermaterial gebunden ist, und einer Fänger-Sonde, die durch ein "(b)" gekennzeichnet ist, einzufangen. In 1A wird bei der ersten Hybridisierungsbedingung die Hybridisierung einer Fänger-Sonde (b) und eines Ziel-Polynukleotids (c) ermöglicht, um einen Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex 15 zu bilden, wobei jedoch die Hybridisierung der Fänger-Sonde (b) und der immobilisierten Sonde (a) nicht ermöglicht wird. In 1B wird bei der zweiten Hybridisierungsbedingung die Hybridisierung der Fänger-Sonde (b) und der immobilisierten Sonde (a) ermöglicht, um einen immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex 20 zu bilden.
  • 2 illustriert die Schritte A bis F eines Verfahrens, das die Amplifikation einer eingefangenen Ziel-Polynukleotidsequenz (Schritt (A)) mittels einer transkriptionsgebundenen Amplifikation (Schritte (B) bis (F)) einschließt. In 2, Schritt (A), sind eine immobilisierte Sonde (a), die an ein Trägermaterial 10 gebunden ist, eine Fänger-Sonde (b) und eine Ziel-Polynukleotidsequenz (c) wie in 1 gekennzeichnet. Eine Promotorsequenz, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird, ist mit "P" gekennzeichnet; "(-)" gibt das 5'-Ende einer Nukleinsäure an und "(+)" gibt das 3'-Ende einer komplementären Nukleinsäure an; und eine gestrichelte Linie "(---)" gibt eine Nukleinsäurepolymerisation an.
  • 3A, 3B und 3C illustrieren die Verwendung zweier verschiedener Hybridisierungsbedingungen, um die Anwesenheit eines Ziel-Polynukleotids (c) mittels einer immobilisierten Sonde (a), die an ein Trägermaterial 10 gebunden ist, einer Fänger-Sonde (b), die wie in 1 gekennzeichnet ist, und markierter Sonden, die als "(d)" dargestellt werden, zu detektieren. In 3A wird bei der ersten Hybridisierungsbedingung die Bildung eines Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte Sonde-Komplexes 30 ermöglicht. In 3B wird bei der zweiten Hybridisierungsbedingung die Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte Sonde-Komplexes 40 ermöglicht, wobei ungebundene markierte Sonden 50 zurückbleiben. In 3C sind die ungebundenen markierten Sonden weggewaschen worden, wobei der gereinigte immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte Sonde-Komplex 40 zurückbleibt.
  • 4 illustriert das Beispiel eines Trägermaterials 10 mit angebundenen immobilisierten Sonden, die aus einer T14-Sequenzen bestehen; die obere Sonde (neben "(a)" auf der rechten Seite liegend) ist ein immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex, in dem die T19 immobilisierte Sonde (dargestellt als ":" zwischen den Basen) mit einer Fänger-Sonde (3' A14 TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG 5'(SEQ ID NO:1)), die eine komplementäre A14 Sequenz enthält, hybridisiert ist; die mittlere Sonde (neben "(b)" auf der rechten Seite liegend) liegt in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex vor, der die immobilisierte Sonde enthält, die mit der Fänger-Sonde, die mit einer Ziel-Sequenz (5' CAGTCATTGGAACTAAGTAGTTC 3'(SEQ ID NO: 2)) innerhalb einer größeren Sequenz (gekennzeichnet durch terminale "NNNNNN"-Sequenzen) hybridisiert ist, hybridisiert; und die untere Sonde (neben "(b)" auf der rechten Seite liegend) ist eine unhybridisierte immobilisierte T14-Sonde.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt Verfahren zum Einfangen eines Ziel-Polynukleotids auf einem Trägermaterial unter Verwendung einer Fänger-Sonde und zweier verschiedener Hybridisierungsbedingungen. Es werden verschiedene Hybridisierungsbedingungen verwendet, um die Reihenfolge der Hybridisierung in einer Probe, die ein Ziel-Polynukleotid enthält, das mit einer Fänger-Sonde und einer immobilisierten Sonde gemischt ist, zu kontrollieren. Unter einer "Hybridisierungsbedingung" ist die für eine Reaktion verwendete kumulative Umgebung gemeint, in der eine einzelsträngige Nukleinsäure Wasserstoffbrückenbindungen mit einer zweiten einzelsträngigen Nukleinsäure ausbildet, um einen Hybridisationskomplex (der hier manchmal als ein "Komplex" bezeichnet wird) zu erzeugen. Die kumulative Umgebung schließt z.B. die Konzentrationen und Komponenten (z.B. Salze, chelatierende Agenzien und nicht-kompetitive inhibierende Nukleinsäuren) einer wässrigen oder organischen Lösung, die die einzelsträngigen Nukleinsäuren enthält, und die Temperatur der Reaktionsmischung ein. Andere Faktoren, die einen Beitrag zur kumulativen Umgebung leisten, schließen zum Beispiel den Zeitraum in dem die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen möglich ist, die physikalische Geometrie der die Reaktanten enthaltenden Kammer und den Einsatz des Mischens oder Rührens während der Hybridisierung ein. Alle diese Umgebungsbedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt (z.B., siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)). In der vorliegenden Erfindung erleichtert die erste Hybridisierungsbedingung die Hybridisierung der Fänger-Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid während die Hybridisierung der Fänger-Sonde und der immobilisierten Sonde im Wesentlichen ausgeschlossen ist, und bei einer zweiten Hybridisierungsbedingung wird die Hybridisierung der Fänger-Sonde und der immobilisierten Sonde erleichtert.
  • Eine immobilisierte Sonde stellt Mittel zum Anbinden einer Fänger-Sonde an einen immobilisierten Träger bereit. Die immobilisierte Sonde ist ein Basensequenz-Erkennungsmolekül, das an ein Trägermaterial gebunden ist, das das Abtrennen des gebundenen Ziel-Polynukleotids vom ungebundenen Material erleichtert. Jedes bekannte Trägermaterial kann verwendet werden, wie z.B. Matrizen und frei in Lösung vorliegende Partikel. Zum Beispiel können Trägermaterialien Nitrozellulose, Nylon, Glas, Polyacrylat, gemischte Polymere, Polystyren, Silanpolypropylen und bevorzugt magnetisierbare Partikel sein. Besonders bevorzugte Träger sind magnetische Kügelchen, die monodispers sind (d.h., einheitlich in der Größe ± etwa 5%), wodurch gleich bleibende Ergebnisse erzeugt werden, was besonders für die Verwendung in automatisierten Assays von Vorteil ist.
  • Die immobilisierte Sonde ist direkt oder indirekt über eine Verknüpfung oder Wechselwirkung, die bei der ersten und zweiten Hybridisierungsbedingung, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, stabil ist, mit einem Trägermaterial verbunden. Es gibt eine direkte Verbindung, wenn das immobilisierte Sondenmolekül in Abwesenheit einer intermediären Gruppe mit dem Trägermaterial verbunden ist. Zum Beispiel kann die direkte Verbindung eine kovalente Verknüpfung, Chelatierung oder ionische Interaktion sein. Es gibt eine indirekte Verbindung, wenn die immobilisierte Sonde über einen oder mehrere Linker mit dem Trägermaterial verbunden ist. Ein "Linker" ist ein Mittel, um mindestens zwei unterschiedliche Moleküle in einem stabilen Komplex zu binden und enthält eine oder mehrere Komponenten einer Bindungspartnerreihe.
  • Mitglieder einer Bindungspartnerreihe sind in der Lage einander zu erkennen und zu binden. Bindungspartnerreihen können zum Beispiel Rezeptor und Ligand, Enzym und Substrat, Enzym und Kofaktor, Enzym und Koenzym, Antikörper und Antigen, Zucker und Lectin, Biotin und Streptavidin, Ligand und chelatierendes Agens, Nickel und Histidin, im Wesentlichen komplementäre Nukleotidbasen-Erkennungsmoleküle, und komplementäre, homopolymere Nukleinsäuren oder homopolymere Abschnitte von polymeren Nukleinsäuren sein. Komponenten einer Bindungspartnerreihe sind die Bereiche der Mitglieder, die an der Bindung teilnehmen.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung weisen viele verschiedene Ausführungsformen auf. In einer ist der Linker direkt mit dem Trägermaterial verbunden und ist durch Komponenten einer Bindungspartnerreihe an die immobilisierte Sonde gebunden. In einer anderen Ausführungsform gibt es mehr als ein Linker, wobei ein erster Linker direkt mit dem Trägermaterial verbunden ist, und wenigstens ein zweiter Linker durch Komponenten einer Bindungspartnerreihe mit der immobilisierten Sonde verbunden ist. Zusätzliche Linker können verwendet werden, um an den ersten und zweiten Linker zu binden.
  • Ein "Basensequenz-Erkennungsmolekül" ist ein Polymer, das Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen enthält, die über ein Rückgrat miteinander verknüpft sind. Die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen stellen Sequenzinformationen zum Hybridisieren mit einem komplementären Molekül bereit. Eine individuelle Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe kann mit Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C), Thymin (T), Uracil (U) oder Derivaten davon Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden. Das Rückgrat eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls stellt die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen mit der geeigneten Orientierung und Beabstandung für die Wasserstoffbrückenbindung während der Hybridisierung, insbesondere zu Basen einer Nukleinsäure, bereit. Basensequenz-Erkennungsmoleküle können, z.B. RNA, DNA, eine Peptidnukleinsäure oder Derivate davon sein.
  • Eine Fänger-Sonde stellt Mittel zum stabilen Verbinden eines Ziel-Polynukleotids und einer immobilisierten Sonde bereit. Die Fänger-Sonde schließt einen oder mehrere Basensequenz-Erkennungsabschnitte ein: einen Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich und einen immobilisierte Sonde-Bindungsbereich. Diese zwei Bindungsbereiche können in einem oder mehreren Basensequenz-Erkennungsmolekülen vorhanden sein, sind jedoch bevorzugt in einem einzelnen Basensequenz-Erkennungsmolekül, das die zwei Bindungsbereiche enthält, eingeschlossen. In einer anderen Ausführungsform enthält die Fänger-Sonde einen Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich und einen immobilisierte Sonde-Bindungsbereich, die auf zwei verschiedenen Basensequenz-Erkennungsmolekülen, die durch einen oder mehrere Linker verbunden sind, vorhanden sind. Zum Beispiel kann ein immobilisierte Sonde-Bindungsbereich in einem ersten Basensequenz-Erkennungsmolekül vorhanden sein, der Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich kann in einem zweiten Basensequenz-Erkennungsmolekül vorhanden sein und die zwei verschiedenen Moleküle sind über einen Linker miteinander verbunden, der ein Basensequenz-Erkennungsmolekül ist, das mit den ersten und zweiten Basensequenz-Erkennungsmolekülen hybridisiert.
  • Die vorliegende Erfindung schließt ein Verfahren zum Fangen eines in einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotids ein. Als erstes wird eine Mischung, die die Probe, eine Fänger-Sonde und eine immobilisierte Sonde einschließt, hergestellt und bei einer ersten Hybridisierungsbedingung inkubiert, um einen Fänger-Sonde:Ziel-Komplex zu bilden, der aus der mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisierten Fänger-Sonde zusammengesetzt ist. Die erste Hybridisierungsbedingung verwendet eine Temperatur unterhalb der Tm eines Fänger-Sonde:Ziel-Komplexes und oberhalb der Tm eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybrids. Bevorzugt liegt bei der ersten Hybridisierungsbedingung weniger als wenigstens 50% der Fänger-Sonde in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex vor. Bevorzugter liegen bei der ersten Hybridisierungsbedingung weniger als 25%, noch bevorzugter weniger als 10% und am meisten bevorzugt weniger als 1% der Fänger-Sonde in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex vor.
  • Dann wird eine zweite Hybridisierungsbedingung verwendet, um einen immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex zu bilden, der aus der immobilisierten Sonde, die mit der Fänger-Sonde hybridisiert ist, die mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisiert ist, zusammengesetzt ist. Die Temperatur der zweiten Hybridisierungsbedingung liegt unterhalb der Tm des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes und ist daher kompatibel mit der Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes. Bevorzugt liegt die immobilisierte Sonde relativ zur Fänger-Sonde im Überschuss vor.
  • "Tm" bezieht sich auf die Schmelztemperatur bei der 50% der Hybridisationskomplexe, die zwischen den Basensequenz-Erkennungsmolekülen gebildet werden, denaturiert sind. Bei einer Temperatur unterhalb der Tm wird die Bildung des Hybridisations-Komplexes begünstigt, während bei einer Temperatur oberhalb der Tm die Komplexbildung nicht begünstigt wird.
  • Die Bezugnahme auf die Tm eines Hybridisations-Komplexes, der eine Fänger-Sonde oder immobilisierte Sonde enthält, schließt Komplexe eine, die durch Hybridisierung mit einem oder mehreren Linkern, die vorhanden sein können, gebildet werden. Wenn Linker vorhanden sind, dann spiegelt die Tm eines Hybridisations-Komplexes die allgemeine Stabilität des Komplexes wieder, so wie es auch vom Fachmann berechnet werden kann. Zum Beispiel gibt es bei einer Fänger-Sonde, die aus drei Oligonukleotiden zusammengesetzt ist, eine erste Tm des ersten Oligonukleotids, das mit dem zweiten Oligonukleotid hybridisiert ist, und eine zweite Tm des zweiten Oligonukleotids, das mit einem dritten Oligonukleotid hybridisiert ist. Der Niedrigere dieser ersten und zweiten Tm bestimmt die Stabilität der Fänger-Sonde und ob die drei Oligonukleotide aus denen die Fänger-Sonde zusammengesetzt ist, bei einer bestimmten Hybridisierungsbedingung hybridisiert bleiben.
  • Der Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Hybridisations-Komplex kann, so wie andere hierin beschriebene Komplexe, neben den angegebenen Komponenten weitere Gruppen enthalten. Solche zusätzlichen Gruppen schließen zum Beispiel eine markierte Sonde, die mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisiert ist, oder ein Oligonukleotid, das mit dem Ziel hybridisiert ist, das für die Amplifikation des Ziel-Polynukleotids hilfreich ist, ein. Zusätzliche Gruppen, die das Funktionieren der vorliegenden Erfindung nicht beeinflussen, können ebenfalls vorhanden sein.
  • Eine markierte Sonde ist ein Basensequenz-Erkennungsmolekül, das eine detektierbare Gruppe enthält. Detektierbare Gruppen können zum Beispiel ein fluoreszierender Rest, ein chemilumineszierender Rest, ein Radioisotop, Biotin, Avidin, ein Enzym oder Enzymsubstrat oder eine reaktive Gruppe sein.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können außerdem einen Reinigungsschritt einschließen. Mit "Reinigen" ist gemeint, dass eine oder mehrere Komponenten, die Bestandteil der Probe vor der Reinigung sind, von einer oder mehreren anderen Komponenten der Probe entfernt werden. Probenkomponenten schließen Nukleinsäuren ein und können auch Materialien, wie zum Beispiel Proteine, Kohlenhydrate, Lipide und markierte Sonden einschließen. Bevorzugt entfernt der Reinigungsschritt wenigstens etwa 70%, noch bevorzugter wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 95% der Nicht-Ziel-Nukleinsäure, die in der Probe vorhanden ist.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können auch das Amplifizieren eines gereinigten Ziel-Polynukleotids nach dem Fangen (hierin als "Gefangenes Ziel" bezeichnet) einschließen, um eine amplifizierte Nukleinsäure herzustellen. Das Amplifizieren einer Ziel-Nukleinsäure verwendet eine Nukleinsäurepolymerase, um mehrere Kopien des gesamten Ziel-Polynukleotids, oder Fragmenten davon oder einer Nukleinsäure, die zum gesamten Ziel-Polynukleotid oder Fragmenten davon komplementär ist, herzustellen. Geeignete Amplifikationstechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, schließen zum Beispiel eine transkriptionsgebundene Amplifikation, Polymerasekettenreaktion (PCR), eine durch eine Replikase vermittelte Amplifikation und Ligase-Kettenreaktion (LCR) ein.
  • Die Amplifikation von "Fragmenten davon" betrifft das Herstellen einer amplifizierten Nukleinsäure, die weniger als das vollständige Ziel-Polynukleotid oder das Komplement davon enthält. Solche Fragmente können durch das Amplifizieren eines Abschnitts des Ziel-Polynukleotids, zum Beispiel durch Verwenden eines Amplifikationsoligonukleotides, das die Polymerisation einer internen Position des Ziel-Polynukleotids hybridisiert, und die Polymerisation davon initiiert, hergestellt werden. Bevorzugt enthält das amplifizierte Fragment eine detektierbare Ziel-Sequenz. Die Anwesenheit einer amplifizierten Nukleinsäure kann mittels verschiedener gut bekannter Techniken, wie zum Beispiel das Hybridisieren einer markierten Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure, detektiert werden. Andere im Stand der Technik gut gekannte Techniken zum Detektieren von Nukleinsäure schließen zum Beispiel die Gelfiltration, die Gelelektrophorese und die Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) ein.
  • Eine markierte Sonde kann verwendet werden, um die Anwesenheit eines gereinigten Gefangenen Ziels zu detektieren. Bevorzugt wird ein Reinigungsschritt verwendet, um ungebundene markierte Sonden von gebundenen markierten Sonden, die mit gefangenen Ziel-Polynukleotiden hybridisiert sind, zu entfernen. Der Reinigungsschritt kann simultan zum Reinigen des gefangenen Ziel-Polynukleotids verwendet werden. Alternativ dazu können markierte Sonden zu einem gereinigten, eingefangenen Ziel-Polynukleotid zugegeben werden und ungebundene, markierte Sonden können in einem darauf folgenden Reinigungsschritt entfernt werden.
  • Mit "Entfernen" in Bezug auf eine Probenkomponente oder einer Hybridisierungsreaktionskomponente (z.B. ungebundene, markierte Sonde) ist gemeint, dass wenigstens 70% der unerwünschten Komponente von einer festgehaltenen Komponente abgetrennt werden. Noch bevorzugter werden wenigstens 90% und am meisten bevorzugt wenigstens 95% der unerwünschten Komponente entfernt. Komponenten können unter Verwendung von Standardverfahren, wie zum Beispiel durch Verwendung eines Waschverfahrens, entfernt werden.
  • Die Anwesenheit eines eingefangenen Ziel-Polynukleotids kann mittels eines homogenen detektierbaren Markers, der an der Fänger-Sonde oder an einer separaten Detektionssonde angeordnet ist, detektiert werden. Ein "homogener detektierbarer Marker" betrifft einen Marker, dessen Anwesenheit auf homogene Art und Weise, basierend darauf, ob der Marker an einem Molekül vorliegt, das mit dem Ziel-Polynukleotid hybridisiert ist, detektiert werden kann. Demnach kann der homogene detektierbare Marker ohne physikalisches Entfernen der hybridisierten von den unhybridisierten Formen des Markers detektiert werden. Homogene detektierbare Marker sind zuvor bereits beschrieben worden, einschließlich Beispielen in Arnold et al., U.S. Pat. Nr. 5,283,174; Woodhead et al., U.S. Pat. Nr. 5,656,207 und Nelson et al., U.S. Pat. Nr. 5,658,737.
  • Die immobilisierte Sonde kann eine oder mehrere repetitive Basensequenzen, die komplementär zu einer oder mehreren repetitiven Basensequenzen der Fänger-Sonde sind, enthalten. Diese komplementären repetitiven Sequenzen sind bevorzugte Sequenzen von wenigsten fünf Basen in der Länge und dienen als Bindungsbereiche (d.h. ein Fänger-Sonde-Bindungsbereich der immobilisierten Sonde und ein immobilisierte Sonde-Bindungsbereich der Fänger-Sonde). Die komplementären repetitiven Sequenzen der immobilisierten und der Fänger-Sonden erleichtern das Hybridisieren zwischen den zwei Sonden.
  • Eine "repetitive" Sequenz bezieht sich auf sich regelmäßig wiederholende Basensequenzen, wie zum Beispiel jene, die zum Beispiel durch Nukleinsäurehomopolymere von Poly-Adenin (An), Poly-Thymin (Tn), Poly-Cytosin (Cn) und Poly-Guanin (Gn) gebildet werden. Repetitive Sequenzen schließen auch aus Nukleinsäure gemischte Polymere, wie zum Beispiel AT Wiederholungen ([AT]n), ein.
  • Die repetitive Basensequenz der Fänger-Sonde ist bevorzugt länger als eine komplementäre repetitive Basensequenz der immobilisierten Sonde. Die Längen der komplementären repetitiven Sequenzen der zwei Sonden bestimmen den Tm des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes. Die längere repetitive Basensequenz der Fänger-Sonde erleichtert das Binden an die repetitive Basensequenz der immobilisierten Sonde, da die zusätzliche Länge einen Abstand zwischen der Sekundärstruktur eines Ziel-Polynukleotids bereitstellt, die ansonsten mit der Hybridisierung der immobilisierten Sonde interferieren würde. Die repetitive Basensequenz der immobilisierten Sonde ist bevorzugt wenigstens etwa 10 Basen, noch bevorzugter etwa 14 Basen in der Länge; und die repetitive Basensequenz der komplementären Fänger-Sonde ist wenigstens etwa 10 Basen, bevorzugt wenigstens etwa 14 Basen, noch bevorzugter wenigstens etwa 25 Basen in der Länge und am meisten bevorzugt etwa 30 Basen in der Länge.
  • Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung wird verwendet, um zu bestimmen, ob ein Ziel-Polynukleotid in einer Probe vorhanden ist. Das Verfahren schließt einen Schritt zum Einfangen des Ziels ein, der zwei Hybridisierungen, einen Reinigungsschritt, gegebenenfalls einen Amplifizierungsschritt und einen Detektionsschritt einschließt. In Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids wird bei der ersten Hybridisierung ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex erzeugt und bei der zweiten Hybridisierung hybridisiert eine immobilisierte Sonde mit der Fänger-Sonde. Demnach führt in Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids der Schritt des Einfangens des Ziels zur Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Komplexes, der eine immobilisierte Sonde, eine Fänger-Sonde und ein Ziel-Polynukleotid umfasst. Wenn kein Ziel-Polynukleotid vorhanden ist, dann wird dieser immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Komplex nicht gebildet und nur der immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex der zweiten Hybridisierung wird gebildet. Der Komplex, der während des Schritts zum Einfangen des Ziels gebildet wird, wird gereinigt, um ein gereinigtes Ziel-Polynukleotid für Proben, die ein Ziel-Polynukleotid enthalten, zu erzeugen.
  • Das gereinigte Ziel-Polynukleotid kann amplifiziert und dann detektiert werden oder das gereinigte Ziel-Polynukleotid kann ohne einen Amplifikationsschritt detektiert werden. Die Anwesenheit des gereinigten, eingefangenen Ziel-Polynukleotids oder der amplifizierten Nukleinsäure wird bevorzugt mittels einer markierten Sonde detektiert. Noch bevorzugter hybridisiert die markierte Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid, um einen markierte Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex mit einer Tm über der Temperatur der ersten Hybridisierungsbedingung zu bilden. Die Detektion der markierten Sonde im Komplex zeigt die Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids in der Probe an.
  • Wenn ein optionaler Amplifizierungsschritt im Verfahren eingeschlossen ist, wird das gereinigte Ziel-Polynukleotid amplifiziert, um eine amplifizierte Nukleinsäure zu erzeugen, die dann mittels einer markierten Sonde, wie weiter oben beschrieben, oder durch irgendeine Variante bekannter Techniken zum Detektieren von Nukleinsäure (z.B. Visualisierung mit einem fluoreszenzinterkalierenden Agens) detektiert wird. Die Detektion der amplifizierten Nukleinsäure zeigt an, dass das Ziel-Polynukleotid anfänglich in der Probe vorhanden war.
  • Während der Hybridisierung einer Fänger-Sonde mit einem Ziel-Polynukleotid ist es hilfreich die Fänger-Sonde in Lösung zu haben anstatt an einen festen Träger gebunden, um die Konzentration der freien Fänger-Sonde zu maximieren, und um die günstigen Hybridisierungskinetiken in der flüssigen Phase, die dem Fachmann bekannt sind, auszunutzen. Das heißt, dass die Hybridisierung in der gelösten Phase im Allgemeinen 100-fach schneller erfolgt als eine Hybridisierung in der festen Phase, bei der die gleichen komplementären Bindungssequenzen verwendet werden. Es ist auch wünschenswert, die immobilisierte Sonde vor der Hybridisierung der Fänger-Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid zuzugeben, um die Anzahl von Reagenzzugaben und Abtrennungen und die Komplexität der Chemie zu minimieren. Diese Aspekte der Erfindung sind besonders wichtig für ein automatisiertes Assay.
  • In den Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Fangen eines Ziel-Polynukleotids auf einem festen Träger mittels einer Fänger-Sonde und zweier verschiedener Hybridisierungsbedingungen, kann der feste Träger bei beiden Hybridisierungsbedingungen mit einer immobilisierten Sonde, Fänger-Sonde und Ziel-Nukleinsäure vorhanden sein. Die gefangene Ziel-Nukleinsäure kann von anderem Material, das vorhanden ist, durch wegwaschen des anderen Materials unter Bedingungen bei denen das eingefangene Ziel beibehalten wird, gereinigt werden. Dann kann das gereinigte Ziel-Polynukleotid mittels geeigneter Bedingungen vom festen Träger, wie zum Beispiel durch Inkubieren bei einer Temperatur über der Tm des Fänger-Sonde:immobilisierte Sonde-Komplexes, eluiert werden.
  • Diese Verfahren sind besonders nützlich als Teil eines diagnostischen Assays, in dem das Ziel-Polynukleotid amplifiziert wird, um große Mengen von amplifizierten Nukleinsäuren zu erzeugen, die frei in Lösung vorliegen. Die amplifizierten Nukleinsäuren in Lösung können mittels gut bekannter Techniken, wie zum Beispiel Nukleinsäurehybridisierung, detektiert werden.
  • Ein automatisiertes diagnostisches Assay unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung kann durchgeführt werden zum Beispiel durch: (1) Hinzufügen einer Probe, die vermutlich ein Ziel-Polynukleotid aufweist, zu einem Behälter, der eine Fänger-Sonde, die für das Ziel spezifisch ist, und eine immobilisierte Sonde, die mit einem festen Träger verbunden ist, enthält; (2) Durchführen einer Zwei-Schritt-Hybridisierung, um das Ziel-Polynukleotid durch Inkubieren bei einer ersten Hybridisierungsbedingung und dann Erniedrigen der Temperatur bis auf die der zweiten Hybridisierungsbedingung auf dem festen Träger zu Fangen; (3) Entfernen von Probenkomponenten, die nicht an dem festen Träger gebunden sind, zum Beispiel durch Verwenden eines Waschschrittes; (4) Zugeben einer Lösung, die Oligonukleotide enthält, die bei der Nukleinsäureamplifikation aller oder eines Teils des Ziels verwendet wird, die geeigneten Lösungskomponenten zum Durchführen der Amplifikation, und eine Sonde, die mit der amplifizierten Nukleinsäure hybridisiert und einen homogenen detektierbaren Marker enthält, zum festen Träger; (5) Herstellen amplifizierter Nukleinsäure; und (6) Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure, wie zum Beispiel durch Behandeln der Probe, um ein Signal vom Marker, der mit der amplifizierten Nukleinsäure hybridisiert ist, zu erhalten. Das Detektieren des Signals zeigt die Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids in der Probe an. Verschiedene Abwandlungen des obigen Schemas können auf Grundlage der hierin bereitgestellten Offenbarung durchgeführt werden.
  • 1 bis 3 stellen schematische Illustrationen der Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Fangen eines Ziel-Polynukleotids, um ein Polynukleotidziel optimal zu detektieren und die Anwesenheit des Polynukleotidziels zu detektieren, dar. Obwohl 1 bis 3 bevorzugte Ausführungsformen darstellen, wird der Fachmann erkennen, dass andere Abwandlungen und Äquivalente verwendet werden können, um die beschriebene Erfindung basierend auf der hierin bereitgestellten Beschreibung durchzuführen. 4 zeigt ein Beispiel der Arten von Komplexen, die über eine immobilisierte Sonde, die ein Homopolymer ist, an einen festen Träger angebunden werden können.
  • 1A und 1B illustrieren das Fangen eines Ziel-Polynukleotids. Am Anfang des Assays ist die immobilisierte Sonde (a) an ein festes Trägerpartikel 10 gebunden und die Fänger-Sonde (b) und das Ziel-Polynukleotid (c) liegen frei in Lösung vor. Bezug nehmend auf 1A, wird bei der ersten Hybridisierungsbedingung ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex 15 in Lösung gebildet, wobei jedoch die Fänger-Sonde (b) im Wesentlichen nicht an die immobilisierte Sonde (a) gebunden ist. Dann wird die Reaktion bei der zweiten Hybridisierungsbedingung, wie in 1B dargestellt, inkubiert. Bei der zweiten Hybridisierungsbedingung hybridisiert die Fänger-Sonde (b) mit der immobilisierten Sonde (a), wodurch das Ziel-Polynukleotid (c) in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Nukleinsäure-Komplex 20 gefangen wird. Bevorzugt tritt die zweite Hybridisierungsbedingung in der gleichen Lösung durch Erniedrigen der Temperatur gegenüber der ersten Hybridisierungsbedingung auf. Ein spezifisches Beispiel der Komplexe, die an einen festen Träger über eine immobilisierte Sonde gebunden werden können, wird in 4 dargestellt.
  • 2 illustriert eine Ausführungsform, die weiter die Amplifikation einer Ziel-Polynukleotidsequenz (c) mittels einer transkriptionsgebundenen Amplifikation einschließt. Das 5' und 3' Ende der Nukleinsäuren wird durch (-) bzw. (+) auf der rechten Seite der Figur neben der Linie, die die Nukleinsäuren darstellt, angegeben; mittels dieser Bezeichnung geben Stränge, die mit "(-)" markiert sind Antisense-Stränge an, und Stränge, die mit einem "(+)" markiert sind, geben Sinn-Stränge an. Die gestrichelte Linie (---), die in einem Pfeil endet (→ oder ←), gibt eine Nukleinsäurepolymerisation eines komplementären Strangs einer Nukleinsäure an.
  • In 2 illustriert Schritt (A) ein gefangenes Ziel-Polynukleotid (c), wie für 1B beschrieben, das mit einem Oligonukleotid, das eine Promotorsequenz "P" enthält, hybridisiert worden ist, um einen Nukleinsäure-Hybridisations-Komplex 22 auszubilden. Mittels einer Polymerase, wie zum Beispiel einer reversen Transkriptase, wird eine komplementäre DNA synthetisiert (dargestellt durch ---). In Schritt (B) wird der (-)-Strang mit einem Primer 24 hybridisiert und die reverse Transkriptase wird verwendet, um eine DNA-Duplex 23, die einen doppelsträngigen Promotor P enthält, durch Polymerisation (dargestellt durch ---) zu bilden. In Schritt (B) wird der Komplex 23 frei in Lösung vorliegend dargestellt, obwohl er nicht vom festen Träger 10 freigesetzt werden muss. Das Verfügbarmachen des (-)-Stranges für die Hybridisierung mit einem Primer 24 kann mittels verschiedener Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel durch Verwenden eines Denaturierungsschritts oder einer RNase H-Aktivität, erzielt werden. Bevorzugt wird die RNase H-Aktivität verwendet, wenn das Ziel ein RNA-Polynukleotid ist.
  • 2 Schritte (C) bis (E) stellen die Herstellung der amplifizierten Nukleinsäure ausgehend vom Produkt aus Schritt (B) dar. Eine RNA-Polymerase, wie zum Beispiel die T7-RNA-Polymerase wird verwendet, um mehrere Sinn-RNA-Transkripte (Schritt (C)) herzustellen, an die der Primer 24 für die Primerverlängerung binden kann (Schritt (D)). Die gestrichelte Linie in Schritt (D) illustriert die Primerverlängerung. Der Primer 24, der manchmal als Promotor-Primer beschrieben wird, kann vor dem Beginn der Amplifikation zugegeben werden.
  • Zwischen den Schritten (C) bis (F) werden die (-)-Stränge für das Hybridisieren mit einem Promotor-Primer 24 zugänglich gemacht. 2, Schritte (D) bis (F) illustrieren die Verwendung eines Promotor-Primers, um einen doppelsträngigen Promotor zu bilden, der durch eine RNA-Polymerase erkannt wird und zum Erzeugen zusätzlicher RNA-Transkripte verwendet wird.
  • Die erzeugten Transkripte können in einem anderen Amplifizierungszyklus verwendet werden (dargestellt durch den Pfeil auf der linken Seite von 2, der die Schritte (F) und (C) verbindet). Die Amplifizierungsschritte werden im detaillierter weiter unten unter "Transkriptionsgebundene Amplifikation" beschrieben.
  • 3A bis 3C illustrieren das Fangen und Detektieren eines Ziel-Polynukleotids (c) mit einer markierten Sonde (d). Am Anfang des Assays schließt die Reagenzmischung die immobilisierte Sonde (a), die an ein festes Partikel 10 gebunden ist, die Fänger-Sonde (b), das Ziel-Polynukleotid (c) und die markierte Sonde (d) frei in Lösung ein. Wie in 3A dargestellt, wird bei der ersten Hybridisierungsbedingung ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte Sonde-Hybridisations-Komplex 30 in der Lösung gebildet. Die Fänger-Sonde (b), die in 3A dargestellt wird, besteht aus einem Linker 31, der mit einem ersten Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 33 und einem zweiten Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 35 verbunden ist. Das erste Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 33 schließt einen Ziel-Polynukleotid-Bindungsbereich 32 ein und das zweite Basensequenz-Erkennungspolynukleotid 35 schließt einen immobilisierte Sonde-Bindungsbereich 34 ein.
  • Wie in 3B dargestellt, hybridisiert bei der zweiten Hybridisierungsbedingung der Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte Sonde-Hybridisations-Komplex 30 mit der immobilisierten Sonde (a), wodurch ein immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid:markierte Sonde-Komplex 40 (d.h. eine gebundene markierte Sonde) erzeugt wird. Dieser Komplex 40 wird gebildet, wenn die immobilisierte Sonde (a) mit dem immobilisierte Sonde-Bindungsbereich 34 hybridisiert. Die zweite Hybridisierungsbedingung kann durch Erniedrigen der Temperatur der ersten Hybridisierungsbedingung erreicht werden.
  • Es kann in Bezugnahme auf 3C ein Waschschritt verwendet werden, um eine ungebundene markierte Sonde (nicht dargestellt) von der gebundenen markierten Sonde (d), die im Komplex 40, der am festen Träger 10 gebunden ist, vorhanden ist, zu entfernen. Das Detektieren der gebundenen markierten Sonde (d) ist ein Hinweis für die anfängliche Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids in der Probe.
  • 4 illustriert ein Beispiel eines festen Trägers 10, an den immobilisierte Sonden, die als T14-Seguenzen dargestellt werden, angebunden sind. Die obere immobilisierte Sonde (markiert als (a) auf der rechten Seite) ist in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplex dargestellt, in dem die T14-Sonde mit einer komplementären A14-Sequenz einer Fänger-Sonde, dargestellt als 3' A14TTTGTCAGTAACCTTGATTCATCAAG 5'(SEQ ID NO: 1), hybridisiert ist (dargestellt als ":" zwischen den Basen). Die mittlere immobilisierte Sonde (markiert als (b) auf der rechten Seite) wird in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex dargestellt, der die Komponenten des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes mit dem 5'-Bereich der Fänger-Sonde, die mit einer komplementären Ziel-Sequenz, dargestellt als 5' CAGTCATTGGAACTAAGTAGTTC 3'(SEQ ID NO: 2), hybridisiert ist, enthält. Die dargestellte Zielsequenz ist eine interne Sequenz, die durch die terminalen "NNNNNN"-Sequenzen dargestellt wird. Die niedrigste immobilisierte Sonde (auf der rechten Seite mit (c) markiert) ist unhybridisiert.
  • Basensequenz-Erkennungsmoleküle
  • Basensequenz-Erkennungsmoleküle enthalten Sequenzinformationen, die die Hybridisierung mit im Wesentlichen komplementären Nukleinsäuren bei geeigneten Reaktionsbedingungen ermöglichen. Mit "ausreichend komplementär" ist eine zusammenhängende Nukleinsäurebasensequenz gemeint, die mit einem Basensequenzerkennungsmolekül (z.B. einer anderen zusammenhängenden Nukleinsäurebasensequenz) durch das Ausbilden von Wasserbrückenbindungen zwischen komplementären Basen hybridisieren kann. Die komplementäre Basensequenz kann in jeder Position im Basensequenz-Erkennungsmolekül bei Standardbasenpaarung (z.B. G:C, A:T oder A:U-Paarung) komplementär sein. Alternativ dazu kann die komplementäre Basensequenz einen oder mehrere Reste enthalten, die bei Verwendung der Standardwasserstoffbrückenbindung (einschließlich abasische "Nukleotide") nicht komplementär sind, die gesamte komplementäre Basensequenz jedoch in der Lage sein mit dem Basensequenzerkennungsmolekül bei geeigneter Hybridisierungsbedingung spezifisch zu hybridisieren. Für den Fachmann sind geeignete Hybridisierungsbedingungen gut bekannt, können einfach aufgrund der Sequenzzusammensetzung vorhergesagt werden oder können empirisch durch Verwendung von Routinetests bestimmt werden (z.B. siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 und 11.47-11.57 teilweise in §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 und 11.55-11.57). Diese Basensequenz-Erkennungsmoleküle können zusätzliche Gruppen enthalten, die keine Sequenzinformationen bereitstellen. Diese zusätzlichen Gruppen, wenn vorhanden, verhindern nicht die Hybridisierung eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls mit einer ausreichend komplementären Nukleinsäure bei den Reaktionsbedingungen.
  • Ein Basensequenz-Erkennungsmolekül umfasst Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die über ein Rückgrat miteinander verbunden sind. Die Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen können mit stickstoffhaltigen Nukleotidbasen, die in einer Nukleinsäure vorhanden sind, Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden. Das Rückgrat stellt eine geeignete Konformation und Beabstandung bereit, um es den Gruppen zu ermöglichen, eine Wasserstoffbrückenbindung mit Nukleotiden einer Nukleinsäure auszubilden.
  • Eine gegebene Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe kann mit einem bestimmten Nukleotid (z.B. A, G, C, T und U) komplementär sein und daher in der Lage sein mit einem Nukleotid, das in einer Nukleinsäure vorhanden ist, Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden. Eine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe kann auch Wasserstoffbrückenbindungen mit unterschiedlichen Nukleotiden ausbilden. Wenn zum Beispiel Inosin eine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe ist, kann es eine Wasserstoffbrückenbindung mit U, A oder C ausbilden.
  • Bevorzugte Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen sind stickstoffhaltige Purin- oder Pyrimidinbasen oder Derivate davon, die Wasserstoffbrückenbindungen entweder mit A, G, C, T, U oder Inosin (I) ausbilden können. Beispiele von Basensequenz-Erkennungsgruppen schließen A, G, C, T, U oder I und Derivate davon ein. Beispiele von Derivaten schließen modifizierte Purin- oder Pyrimidinbasen, wie zum Beispiel N4-Methyldesoxyguanosin, Deaza- oder Azapurine und Deaza- oder Azapyrimidine, die anstelle von natürlichen Purin- und Pyrimidinbasen verwendet werden, Pyrimidinbasen mit Substituentengruppen in der 5- oder 6-Position und Purinbasen mit einem veränderten oder Ersatzsubstituenten in den 2, 6 oder 8-Positionen ein. Solche Derivate und ihre Synthese sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe Cook, PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 93/13121). Zusätzliche Beispiele sind 2-Amino-6-methylaminopurin, O6-Methylguanin, 4-Thio-pyrimidine, 4-Aminopyrimidine, 4-Dimethylhydrazinpyrimindine, O4-Alkylpyrimidine, und andere im Stand der Technik bekannte.
  • Das Rückgrat eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls kann aus verschiedenen Gruppen oder Verknüpfungen, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden. Bevorzugt enthält das Rückgrat ein oder mehrere Zucker-Phosphordiester-Verknüpfungen, eine oder mehrere Peptidnukleinsäurerückgratgruppen, eine oder mehrere Phosphorthioat-Verknüpfungen oder Kombinationen davon.
  • Struktur I illustriert eine Zucker-Phosphordiestertyp-Rückgratgruppe, in der die Zucker-Gruppe eine Pentofuranosyl-Gruppe ist. Die Zuckergruppen werden durch eine Phosphordiester-Verknüpfung oder andere geeignete Verknüpfungen miteinander verbunden.
  • STRUKTUR I
    Figure 00270001
  • Bezug nehmend auf Struktur I, repräsentiert X die Gruppe, die zwei Zucker miteinander verbindet. Beispiele für X schließen -P(O)3-, -NHP(O)3-, -OCOO-, -OCH2CONH-,-OCH2COO- und -OCONH- ein.
  • In Bezug auf die anderen hierin bereitgestellten Beispiele und basierend auf der bereitgestellten Offenbarung, können andere im Stand der Technik gut bekannte Äquivalente ebenfalls verwendet werden. Y1 und Y2 sind unabhängig voneinander ausgewählte Gruppen. Beispiele für Y1 und Y2 schließen H, OH, ein Alkoxy, das bis zu 4 Kohlenstoffatome enthält, Halogen und C1-C4 Alkyl ein. Y1 und Y2 sind bevorzugt unabhängig voneinander H, OH, F oder OCH3. Base1 und Base2 sind unabhängig ausgewählte Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen. Bevorzugt sind Base1 und Base2 unabhängig entweder A, G, C, T, U oder Inosin (I). R1 und R2 repräsentieren unabhängig ausgewählte Gruppen, die zusätzliche Zucker-Phosphordiestertypgruppen, eine Peptidnukleinsäure und Reste, die keine Sequenzinformationen enthalten, wie zum Beispiel abasische "Nukleotide" (die ein Phosphordiesterrückgrat enthalten, jedoch keine Nukleotidbasen-Erkennungsgruppe), Polymere, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, Polysacharide, Polypeptide, Peptide und andere Nicht-Nukleotid-Verknüpfungen, einschließen. Andere Typen von Nicht-Nukleotid-Verknüpfungen sind gut bekannt (siehe Arnold et al., U.S. Pat. Nr. 5,585,481).
  • Derivate der Struktur I, die eine Komponente eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls sein können, sind im Stand der Technik gut bekannt, wie zum Beispiel Moleküle mit einem unterschiedlichen Zuckertyp im Rückgrat. Zum Beispiel kann ein Basensequenz-Erkennungsmolekül Cyclobutyl-Reste aufweisen, die durch Verknüpfungsreste verbunden sind, wobei die Cyclobutyl-Reste heterozyklische Basen aufweisen, die daran gebunden sind (z.B. siehe Cook et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 94/19023).
  • Ein anderer Rückgrattyp eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls ist eine peptidartige Bindung, wie zum Beispiel die, die in Peptidnukleinsäuren vorhanden ist. Die "Peptidnukleinsäure" betrifft ein DNA-Analog, in dem das Desoxyribosephosphatrückgrat durch ein Pseudopeptidrückgrat ersetzt worden ist, wie bereits zuvor beschrieben von (Hyrup & Nielsen, 1996, Bioorg. & Med. Chem. 4:5-23; Hydig-Hielsen et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 95/32305). Bevorzugt ist die Peptidnukleinsäure aus N-(2-Aminoethyl)glycin-Einheiten zusammengesetzt, wie in Struktur II dargestellt, in der R1, R2 und Base1 die gleichen sind, wie sie für Struktur I artige Verbindungen beschrieben worden sind.
  • STRUKTUR II
    Figure 00290001
  • Basensequenz-Erkennungsmoleküle können mittels bekannter Verfahren, wie zum Beispiel Organische Standardsyntheseverfahren zum Erzeugen von Oligonukleotiden und modifizierten Oligonukleotiden erzeugt werden (zum Beispiel, siehe Eckstein, F., Oligonukleotides and Analogues, a Practical Approach, Kapitel 1-5, 1991; Caruthers et al., Meth. In Enzymol., Vol. 154, S. 287, 1987; Bhatt, U.S. Pat. Nr. 5,252,723; Klem et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 92/07864; Cook, PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 93/13121; Miller et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 94/15619; McGee et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 94/02051; Cook et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 94/19023; Hyrup et al., Bioorg. Med. Chem. 4:5-23, 1996 und Hydig-Hielsen et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 95/32305; Ordoukhanian et al., Nuc. Acids Res. 25(19):3783-3786, 1997; Myer et al., Bioconjug. Chem. 7(4):401-412, 1996; Schultz et al. Nuc. Acids Res. 24(15):2966-2973, 1996; Woo et al., Nuc. Acids Res. 24(13):2470-2475, 1996; Agris et al. Biochemie 77:125-134, 1995; Berressem et al., Nuc. Acids Res. 23(17):3465-3472, 1995; Seela et al., Nuc. Acids Res. 23(13):2499-2505, 1995; Vinayak et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 33:123-125, 1995; Limbach et al., Nuc. Acids Res. 22(12):2183-2196, 1994; Gryaznov et al., Nuc. Acids Res. 20(8):1879-1882, 1992; Kawana et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 25:93-94, 1991; Pfleiderer et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 24:29-32, 1991; Wagner et al., Nuc. Acids Res. 19(21):5965-5971, 1991; Marquez et al., Nuc. Acids Symp. Ser. 22:35-36, 1990; Lin et al., Nuc. Acids Res. 17(24):10373-10383, 1989; Farrance et al., Anal. Biochem. 179(1):60-65, 1989; Gildea et al., Nuc. Acids Res. 17(6):2261-2281, 1989; Yeung et al., Nuc. Acids Res. 16(10):4539-4554, 1988; Pon et al., Nuc. Acids Res. 13(18):6447-6465, 1985; Millican et al., Nuc. Acids Res. 12(19):7435-7453, 1984; Schinazi et al., J. Med. Chem. 21(11):1141-1146, 1978).
  • Bevorzugte Basensequenz-Erkennungsmoleküle schließen unabhängig ein: (i) ein Rückgrat, das wenigstens eine Zucker-Phosphordiesterartige Gruppe, wenigstens eine Peptidnukleinsäure-Gruppe, wenigstens eine Phosphorthioat-Gruppe oder eine Kombination davon, und (ii) unabhängig ausgewählte Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit A, G, C, T, U oder I, die mit dem Rückgrat verbunden sind, Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können. Basensequenz-Erkennungsmoleküle können Komponenten einschließen, die aus Desoxynukleotiden, Ribonukleotiden, 2'-Methoxy-substituierten Ribonukleotiden oder 2'-Halo-substituierten Ribonukleotiden ausgewählt werden. Bevorzugt machen eine oder mehrere der in Bezug genommenen Komponenten wenigstens etwa 70%, bevorzugt wenigstens etwa 80%, noch bevorzugter wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt etwa 100% des Basensequenz-Erkennungsmoleküls aus.
  • Immobilisierung an einem festen Träger
  • Ein Basensequenz-Erkennungsmolekül kann durch verschiedene bekannte Mittel an verschiedene Trägertypen angebunden werden, um eine immobilisierte Sonde zu bilden. Kovalentes Anhängen von Oligonukleotiden, die unter Verwendung von chemischen Standardtechniken an einen festen Träger synthetisiert worden sind, sind zuvor bereits beschrieben worden (Lund, et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988; Europäische Pat. Anm. Veröffentlichungsnr. 0444120). Besonders bevorzugte feste Träger sind magnetisch anziehbare Partikel, die in einem Abtrennungsschritt nützlich sind, da die Partikel zum Standort eines Reaktionsbehälters gezogen und in Position gehalten werden können, während ungebundene Lösungskomponenten weggewaschen werden. Magnetisch anziehbare Partikel können mittels Standardtechniken erzeugt werden oder aus kommerziell zugänglichen Quellen bezogen werden.
  • Tm und Hybridisierungsbedingungen
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung verändern die Hybridisierungsbedingungen, um den Zeitablauf der Bildung eines Fänger-Sonde:Ziel-Komplexes und eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes zu kontrollieren. Die Fähigkeit von zwei Basensequenz-Erkennungsmolekülen zu hybridisieren, hängt von den Strukturen und den umgebenden Reaktionsumfeld ab. Das Reaktionsumfeld schließt die Zusammensetzung der Lösung, die zwei oder mehr Erkennungsmoleküle enthält, und die Lösungstemperatur ein.
  • Bei einer bestimmten Assay-Zusammensetzung ist ein Hybridisationskomplex nicht stabil, wenn die Assay-Temperatur über dem Tm des Komplexes liegt. Lösungsfaktoren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie zum Beispiel die Salzkonzentration und die Anwesenheit von denaturierenden Agenzien, können die Tm eines gegebenen Komplexes beeinflussen. Zwei Basensequenz-Erkennungsmoleküle, die einen Hybridisationskomplex ausmachen, können konstruiert werden, damit sie Tm-Charakteristika aufweisen, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung basierend auf den hierin bereitgestellten Beschreibungen und im Stand der Technik gut bekannter Techniken geeignet sind (z.B., siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Gold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 und 11.47-11.57, besonders in §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 und 11.55-11.57).
  • Die Hybridisationskomplexstabilität wird durch die Länge und den Grad der Komplementarität zwischen den zwei Basensequenz-Erkennungsmolekülen, den Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen und dem Rückgrat des Basensequenz-Erkennungsmoleküls beeinflusst. Zum Beispiel kann die Tm eines Komplexes, der zwischen zwei Basensequenz-Erkennungsmolekülen gebildet wird, durch ein Konstruieren der Moleküle, die dann interne Bereiche von weniger als 100 Komplementarität zueinander aufweisen, erniedrigt werden. Dies kann durch das Einbeziehen von Fehlpaarungen oder Linker-Komponenten, wie zum Beispiel Nicht-Nukleotid-Linkern und abasischen "Nukleotiden" erreicht werden. Linker-Komponenten können auf der gegenüberliegenden Seite einer Base in einem gegenüberliegenden Strang positioniert sein oder können aus einem Strang "ausbuchten", wodurch die Komplexstabilität verringert wird. Der Typ der Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, der auf gegenüberliegenden Strängen vorhanden ist, wird auch die Stabilität eines Sonden-Hybridisationskomplexes beeinflussen. Zum Beispiel ist die G:C-Paarung stärker als die A:T-Paarung, da die Wasserstoffbrückenbindung in G:C-Paaren im Vergleich zu A:T-Paaren erhöht ist.
  • Die Rückgratzusammensetzung eines Basensequenz-Erkennungsmoleküls kann auf verschiedenen Wegen angepasst werden, um die Stabilität des Hybridisationskomplexes zu beeinflussen. Bevorzugte Rückgrate sind Peptidverknüpfungen, wie zum Beispiel jene, die in einer Peptidnukleinsäure vorhanden sind, und Zucker-Phosphordiestertyp-Verknüpfungen, wie zum Beispiel jene, die in Ribonukleinsäuren und Desoxyribonukleinsäuren oder Derivaten davon vorhanden sind. Peptidnukleinsäuren bilden im Allgemeinen einen stabileren Komplex mit RNA als mit der korrespondieren DNA-Sequenz. Noch bevorzugter wird das Rückgrat aus Verknüpfungen des Zucker-Phosphordiestertyps hergestellt, in der sowohl die Zuckergruppe als auch die Verknüpfung in Verbindung mit der Gruppe die Stabilität des Komplexes beeinflussen können. Zum Beispiel kann der Zuckereffekt mit 2'-Methoxy-substituierten RNA-Gruppen, in denen ein Hybridisationskomplex, der zwischen der 2'-Methoxy-substituierten RNA und der komplementären 2'OH-RNA gebildet wird, im Allgemeinen stabiler ist als ein entsprechender DNA:RNA-Komplex, verdeutlicht werden. Eine 2'-Fluor-substituierte RNA hat im Wesentlichen den gleichen Wirkungstyp wie 2'-Methoxy-substituierte RNA auf die Komplexstabilität.
  • Eine Verknüpfung, die zwei Zuckergruppen verbindet, kann die Stabilität des Hybridisationskomplexes durch Beeinflussen der allgemeinen Ladung, oder der Ladungsdichte oder durch Beeinflussen der sterischen Assoziierung zwischen zwei Molekülkomponenten beeinflussen. Sterische Interaktionen von großen Verknüpfungen erzeugen "Ausbuchtungen", die die Stabilität des Komplexes verringern. Verknüpfungen mit geladenen (z.B. Phosphorthioaten) oder neutralen (z.B. Methylphosphonaten) Gruppen können die Stabilität des Komplexes beeinflussen.
  • Die Tm kann mittels Standardberechnungen vorhergesagt werden und mittels Routinetesttechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, gemessen werden. Solche Verfahren werden zum Beispiel beschrieben von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) in §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 und 11.47-11.57, besonders in §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 und 11.55-11.57), und Hogan et al., U.S. Pat. Nr. 5,547,842.
  • Bei der ersten Hybridisierungslösung von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Tm des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes um wenigstens etwa 5°C, bevorzugt um etwa wenigstens 10°C, noch bevorzugter um etwa wenigstens 20°C und am meisten bevorzugt um etwa wenigstens 25°C größer als die Tm des immobilisierten Sonde:Fänger-Sonde-Komplexes.
  • Ändern der Hybridisierungsbedingungen
  • Das bevorzugte Verfahren zum Ändern der Hybridisierungsbedingungen erfolgt durch Ändern der Temperatur der Hybridisierungslösung, die Assay-Komponenten enthält. Veränderungen in der Temperatur können ohne die Zugabe von Reagenzien zur Lösung einfach erzielt werden und sind daher kompatibler bei einer Automation. Ein automatisiertes Assay ist eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt wird die zweite Hybridisierungsbedingung durch Verringern der Temperatur der ersten Hybridisierungsbedingung um wenigstens etwa 10°C, bevorzugt um wenigstens etwa 15°C, noch bevorzugter um wenigstens etwa 20°C und am meisten bevorzugt um wenigstens etwa 25°C erzielt. Jedoch kann jedes bekannte Verfahren zum Verringern der Stringenz einer Hybridisierungsbedingung, wie zum Beispiel durch Erhöhen der Ionenstärke der Lösung oder Verdünnen der Lösung mit Denaturierungsreagenzien, verwendet werden, um die zweite Hybridisierungsbedingung zu erreichen.
  • Amplifikation
  • Die Amplifikation erhöht die Kopienanzahl des Ziel-Polynukleotids. Die Amplifikationsbedingungen sind kompatibel mit der Nukleinsäurepolymerisation zum Erzeugen eines Nukleinsäurestranges, der komplementär zu einer Nukleinsäurematrize ist, durch Verwenden wenigstens einer Nukleinsäurepolymerase. Die Amplifikationsbedingungen schließen ein oder mehrere Enzyme, Amplifikationsoligonukleotide, Nukleotidtriphosphatsubstrate, Puffer und die Inkubation bei einer geeigneten Temperatur ein. Die spezifischen Bedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt und hängen vom Typ der verwendeten Nukleinsäureamplifikation ab.
  • Enzyme
  • Geeignete Nukleinsäurepolymerasen zum Durchführen der Nukleinsäureamplifikationsverfahren sind kommerziell einfach zugänglich oder können isoliert und gereinigt werden. Solche Polymerasen schließen zum Beispiel die DNA-abhängigen DNA-Polymerasen, wie zum Beispiel Escherichia coli DNA-Polymerase I, Bazillus stearothermophilus DNA-Polymerase I, B. caldotenex DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase und die Taq Polymerase ein. Andere geeignete Enzyme sind DNA-abhängige RNA-Polymerasen, wie zum Beispiel die T7 RNA-Polymerase, die T3 RNA-Polymerase und die SP6 RNA-Polymerase. Geeignete Enzyme schließen auch RNA-abhängige DNA-Polymerasen, wie zum Beispiel die Avian Myeloblastosis Virus (AMV) reverse Transkriptase und die Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) reverse Transkriptase ein. Die Amplifikation kann auch durch Verwendung von Replikasen (z.B. Qβ-Replikase), Ligasen (z.B., E. coli DNA-Ligase und T4 DNA-Ligase) oder Kombinationen von Enzymen durchgeführt werden.
  • Amplifikationsoligonukleotide
  • "Amplifikationsoligonukleotide" sind Oligonukleotide, die mit einer Ziel-Nukleinsäure, oder seinem Komplement hybridisieren und an einer Amplifikationsreaktion teilnehmen. Beispiele für Amplifikationsoligonukleotide schließen Primer und Promotor-Primer ein.
  • Die Auswahl von Amplifikationsoligonukleotiden hängt vom verwendeten Amplifikationsverfahren und der zu amplifizierenden Nukleinsäure ab. Ein bestimmtes Amplifikationsoligonukleotid kann abhängig von der Sequenz der gewünschten Ziel-Nukleinsäure und dem vom Praktiker der vorliegenden Erfindung gewählten Amplifikationsverfahren durch einen Fachmann einfach entworfen und synthetisiert werden. Beispiele für allgemein verwendete Amplifikationsoligonukleotide schließen solche ein, die analog oder komplementär zu einer Nukleotidbasensequenz sind und die optional Nukleinsäuresequenzbereiche enthalten, die zur Ziel-Nukleinsäure nicht komplementär sind. Zum Beispiel kann ein Amplifikationsoligonukleotid eine Promotorsequenz enthalten, die durch eine RNA-Polymerase erkannt wird oder eine Basensequenz, die durch eine Replikase erkannt wird.
  • Ein analoges Amplifikationsoligonukleotid schließt einen Bereich ein, der mit einer Nukleinsäure hybridisieren kann, die völlig komplementär zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäure ist (z.B. eine cDNA, wenn die Ziel-Nukleinsäure eine RNA ist). Das analoge Oligonukleotid kann mit der komplementären Nukleinsäure in einer Position hybridisieren, die nahe dem 3' Ende der komplementären Ziel-Sequenz lokalisiert ist. Das analoge Oligonukleotid kann auch einen nicht-komplementären Bereich, wie z.B. einen Promotorsequenzbereich, und/oder eine oder mehrere Modifikationen, wie z.B. eine Modifikation, die die Aktivität der Nukleinsäurepolymerase inhibiert, enthalten. Bevorzugt enthält das analoge Oligonukleotid wenigstens etwa 10 nebeneinander liegende Basen und noch bevorzugter wenigstens etwa 12 nebeneinander liegende Basen, die komplementär zur Nukleinsäure sind, die völlig komplementär zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäure ist. Die nebeneinander liegenden Basen sind bevorzugt zu wenigstens etwa 80%, noch bevorzugter zu wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt zu etwa 100% komplementär zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäuresequenz. Das analoge Oligonukleotid ist bevorzugt etwa 12 bis 60 Nukleotidbasen lang und kann gegebenenfalls modifizierte Nukleotidbasen einschließen.
  • Ein zur Matrize komplementäres Amplifikationsoligonukleotid weist einen Bereich auf, der mit der Ziel-Nukleinsäure in einer Position, die am 3' der Ziel-Sequenz lokalisiert ist, hybridisieren kann. Das zur Matrize komplementäre Oligonukleotid kann einen nicht-komplementären Bereich, wie zum Beispiel einen 5' Promotorbereich, enthalten. Bevorzugt enthält das zum Ziel komplementäre Oligonukleotid wenigstens etwa 10 nebeneinander liegende Basen und noch bevorzugter wenigstens etwa 12 nebeneinander liegende Basen, die komplementär zu einem Bereich der Ziel-Nukleinsäuresequenz sind. Die nebeneinander liegenden Basen sind bevorzugt zu wenigstens etwa 80%, noch bevorzugter zu wenigstens etwa 90% und am meisten bevorzugt zu etwa 100 komplementär mit einem Bereich der Ziel-Sequenz. Das zur Matrize komplementäre Oligonukleotid ist bevorzugt 12 bis 60 Basen lang und kann gegebenenfalls modifizierte Nukleotide einschließen.
  • Ein "Primer" betrifft ein optional modifiziertes Oligonukleotid, das mit einer Matrize hybridisieren kann und das ein 3' Ende aufweist, das in einer bekannten Polymerisationsreaktion wirksam verlängert werden kann. Der 5' Bereich des Primers kann nicht-komplementär zur Ziel-Nukleinsäure sein. Wenn der 5' nicht-komplementäre Bereich eine Promotorsequenz einschließt, wird er als "Promotor-Primer" bezeichnet. Ein Primer oder Promotor-Primer kann analog oder komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure sein.
  • Transkriptionsgebundene Amplifikation
  • Die transkriptionsgebundene Amplifikation verwendet eine RNA-Polymerase, um mehrere RNA-Transkripte ausgehend von einer Nukleinsäurematrize zu erzeugen. Die transkriptionsgebundene Amplifikation verwendet im Allgemeinen eine RNA-Polymerase, eine DNA-Polymerase, Desoxyribonukleosidtriphosphate, Ribonukleosidtriphosphate und ein zur Promotor-Matrize komplementäres Oligonukleotid. Häufig wird auch ein analoges Oligonukleotid verwendet.
  • Unterschiedliche Variationen transkriptionsgebundener Amplifikationen sind im Stand der Technik gut bekannt. Beispiele für unterschiedliche Variationen, die unterschiedliche Reaktionsbedingungen und unterschiedliche Anzahlen und Typen von Amplifikationsoligonukleotiden verwenden, werden im Detail beschrieben von Burg et al., U.S. Pat. Nr. 5,437,990; Kacian et al., U.S. Pat. Nr. 5,399,491 und 5,554,516; Kacian et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. 93/22461; Gingeras et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 88/01302; Gingeras et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 88/10315; Malek et al., U.S. Pat. Nr. 5,130,238; Urdea et al., U.S. Pat. Nr. 4,868,105 und 5,124,246; McDonough et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 94/03472 und Ryder et al., PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 95/03430.
  • Kurz dargestellt, im Allgemeinen verwendet eine transkriptionsgebundene Amplifikation ein zur Promotor-Matrize komplementäres Oligonukleotid, das einen 5' Basensequenzbereich enthält, der, wenn er doppelsträngig erzeugt wird, durch eine RNA-Polymerase (in 2 mit "P" markiert) erkannt wird, und einen 3' Sequenzbereich, der mit einer Nukleinsäurematrize in einem Punkt 3' von einer Ziel-Sequenz (wie in 2 dargestellt) hybridisieren kann. Nach der Hybridisation des zur Promotor-Matrize komplementären Oligonukleotids und der Matrize, wird ein doppelsträngiger Promotor stromaufwärts der Matrize gebildet. Der doppelsträngige Promotor kann durch eine Polymerasevermittelte Primerverlängerung des zur Promotor-Matrize komplementären Oligonukleotids gebildet werden, um einen Zielkomplementären Strang (2) zu erzeugen, gefolgt von einer Hybridisierung eines analogen Oligonukleotids (z.B. Primer 24 in 2) und einer Primerverlängerung des analogen Oligonukleotids (siehe 2). Andere bekannte Techniken sind für das Bilden eines doppelsträngigen Promotors geeignet, wie zum Beispiel solche, die eine Primerverlängerung der Ziel-Nukleinsäure einschließen.
  • Die transkriptionsgebundene Amplifikation schreitet mit der Bindung eines Enzyms mit RNA-Polymeraseaktivität in einem Promotorbereich und der Synthese von einzelsträngigen RNA-Transkripten in einer 5' bis 3' Richtung (siehe 2) voran. Multiple RNA-Transkripte (z.B., etwa 100 bis 3000) können durch transkriptionsgebundene Amplifikation mittels einer einzelnen Matrize (z.B., durch Wiederholen von 2, C bis F) erzeugt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein transkriptionsgebundenes Amplifikationsverfahren, das eine RNase H Aktivität verwendet, für die Ziel-Amplifikation verwendet. Dies erzeugt große Mengen einzelsträngiger amplifizierter Nukleinsäure bei einer im Wesentlichen konstanten Reaktionsbedingung. Noch bevorzugter wird die RNase H Aktivität durch eine reverse Transkriptase bereitgestellt.
  • Andere Amplifikationsverfahren
  • Andere gut bekannte Amplifikationsverfahren können im Amplifikationsschritt der Verfahren der vorliegenden Erfindung, einschließlich der Replikase-vermittelten Amplifikation, der Polymerasekettenreaktion (PCR) und der Ligase-Kettenreaktion (LCR) verwendet werden. Die Replikasevermittelte Amplifikation verwendet selbst replizierende RNA-Moleküle und eine Replikase, wie zum Beispiel die Qβ-Replikase (z.B., siehe Kramer et al., U.S. Pat. Nr. 4,786,600; PCT Int. Veröffentlichungsnr. WO 90/14439). Die PCR Amplifikation ist gut bekannt und verwendet die DNA-Polymerase, Primer und den Wärmewechsel, um mehrere Kopien der zwei komplementären Stränge der DNA oder cDNA zu synthetisieren (z.B., siehe Mullis et al., U.S. Pat. Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159; Methods in Enzymology, 1987, Vol.155:335-350). Die LCR verwendet wenigstens vier separate Oligonukleotide, um ein Ziel und seinen komplementären Strang zu amplifizieren, indem mehrere Zyklen der Hybridisierung, Ligation und Denaturierung verwendet werden (siehe Europäische Pat. Anm. Veröffentlichungsnr. 0 320 308).
  • Detektion des Ziel-Polynukleotids
  • Die Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids kann mittels verschiedener Techniken, die eine Detektionssonde verwenden und/oder eine amplifizierte Nukleinsäure detektieren, detektiert werden. Das Ziel-Polynukleotid wird bevorzugt mittels einer markierten Sonde detektiert, die mit dem Ziel-Polynukleotid oder mit einem Amplifikationsprodukt des Ziel-Polynukleotids, besonders eine amplifizierte Nukleinsäure, die zum Ziel-Polynukleotid komplementär ist, hybridisiert.
  • Markierte Sonden können verschiedene Markertypen enthalten und verschiedene Techniken können verwendet werden, um den Marker zu detektieren. Zum Beispiel enthalten gut bekannte Sonden Radioisotope, Fluoreszenzreste, chemilumineszierende Reste und katalytische Gruppen (z.B. ein Enzym, das an einer Reaktion teilnimmt, die zu einer Farbveränderung führt). Beispiele für das Erzeugen und/oder Verwenden von solchen markierten Sonden werden im Detail beschrieben von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10; Nelson et al., U.S. Pat. Nr. 5,658,737; Woodhead et al., U.S. Pat. Nr. 5,656,207; Hogan et al., U.S. Pat. Nr. 5,547,842; Arnold et al., U.S. Pat. Nr. 5,283,174; Kourilsky et al., U.S. Pat. Nr. 4,581,333 und Becker et al., Europäische Pat. Anm. Veröffentlichungsnr. 0 747 706.
  • Markierte Sonden können mit einem Ziel-Polynukleotid, einer amplifizierten Nukleinsäure oder einem intermediären Molekül, das direkt oder indirekt mit dem Ziel-Polynukleotid oder der amplifizierten Nukleinsäure hybridisiert ist, hybridisiert sein. Die indirekte Hybridisierung kann durch Verwenden mehrerer intermediärer Moleküle, die miteinander hybridisiert sind, erreicht werden.
  • Die amplifizierte Nukleinsäure kann mittels einer markierten Sonde oder mittels anderer gut bekannter Verfahren zum Detektieren von Nukleinsäure detektiert werden. Zum Beispiel kann die amplifizierte Nukleinsäure während der Amplifizierung durch Verwenden markierter Vorstufen oder nach der Amplifikation mittels fluoreszierender interkalierender Agenzien (z.B. Ethidiumbromid) markiert werden. Die markierte amplifizierte Nukleinsäure kann mittels gut bekannter Verfahren, wie zum Beispiel der Gelfiltration, der Gelelektrophorese und der HPLC detektiert werden.
  • Die folgenden Beispiele illustrieren einige bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, obwohl der Fachmann erkennen wird, dass andere Reagenzien und Reaktionsbedingungen verwendet werden können, um die Verfahren der vorliegenden Erfindung vergleichbar zu praktizieren.
  • Beispiel 1: Anpassen der Tm durch Variieren der Komplementaritätslänge
  • Ein Verfahren zum Anpassen der Tm eines Hybridisationskomplexes ist es, die Länge der Komplementarität zwischen zwei Nukleinsäuren, aus denen der Komplex zusammengesetzt ist, zu variieren. Dieses Beispiel illustriert die Veränderung der Tm infolge von Unterschieden in der Länge der Komplementarität in einem Komplex.
  • Hybride wurden zwischen einem ersten und zweiten Oligonukleotidstrang gebildet. Der erste Strang war ein Homopolymer von 40 Desoxythymidinen (dT40) und der zweite Strang war ein Homopolymer von Desoxyadenosinen variierender Größer (dAn). Diese Oligonukleotide wurden mittels Standardnukleinsäuresyntheseverfahren synthetisiert.
  • Beide Stränge (von jedem 350 pmol) wurden in einem 40 μl Volumen, das 20 μl eines 2X Hybridisierungspuffers (200 mM Lithium Succinat (pH 5,1-5,2), 17% Lithiumlaurylsulfat (LLS) 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 3 mM Ehtylenglykol-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA)) enthält, gemischt und bei 55°C für 30 Minuten erhitzt. Dann wurde jeder Komplex mit 1 × Hybridisierungspuffer (d.h. die Hälfte der Konzentration des 2X Hybridisierungspuffers) auf 300 μl verdünnt.
  • In dieser Lösung wurde die Tm durch Detektieren einer hyperchromatischen Verschiebung detektiert. Kurz dargestellt, wurde das Absorptionsvermögen bei 260 nm während der inkrementellen Veränderungen der Temperatur der Reaktionsmischung gemessen und eine Verschiebung des Absorptionsvermögens der Lösung wurde über den Temperaturbereich hin detektiert. Die Tm ist die Temperatur am Mittelpunkt der Verschiebung des Absorptionsvermögens. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Hybridisationskomplexe, in denen die dAn-Länge über einem Bereich von dA10 bis dA40 variierte.
  • Tabelle 1
    Figure 00420001
  • Wie man anhand dieser Ergebnisse sehen kann, erhöht sich auch die Tm des Komplexes, wenn die Länge der Komplementarität erhöht wird. Die längeren Hybridisationskomplexe (z.B. dA30:dT40) tendierten dazu, relativ breite Verschiebungen des Absorptionsvermögens aufzuweisen, da es aufgrund der Staffelung der Paarung (z.B. 30-mer, 29-mer, 28-mer Paarung usw.) viele mögliche Typen von Hybridisationskomplexen in der Mischung gibt. Die Kombinationen von Homopolymeren, die zu kürzeren Hybridisationskomplexen führten (z.B. dA15:dT40, das einen Komplex bis zu 15-mer bilden kann) hatte eine Tm von unter etwa 60°C.
  • Diese Eigenschaft wurde durch Inkubieren von 100 μg einer immobilisierten Poly-dT14 oder dT30-Sonde, die an magnetische Kügelchen gebunden war, mit 2,5 pmol einer 32P-markierten dT30-Fänger-Sonde in Lösung weiter untersucht. Die Reaktanten wurden in einem Hybridisierungspuffer (3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 17% LLS, 190 mM Bernsteinsäure, 250 mM Lithiumhydroxid, pH 5,1 ± 0,1) für 30 min bei entweder 60°C oder Raumtemperatur (etwa 25°C) in fünf Wiederholungen für jede Hybridisierungsbedingung inkubiert. Bei Raumtemperatur lagen die durchschnittlichen Prozentzahlen der markierten dA30-Sonden, die mit den dT14 und dT30-Sonden hybridisierten bei 90% bzw. 88%, wohingegen bei 60°C der durchschnittliche Prozentsatz der markierten dA30-Sonden, die mit den dT14 und dT30-Sonden hybridisiert waren bei 61% bzw. 1% lagen.
  • Diese Hybridisierungscharakteristika nutzte man in einem Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay, in dem die immobilisierte Sonde bei den Hybridisierungsbedingungen bei zwei unterschiedlichen Temperaturen, wie es im nachfolgenden Beispiel verdeutlicht wird, vorhanden war.
  • Beispiel 2: Zwei-Schritt-Hybridisierung
  • Dieses Beispiel illustriert das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren mittels Zwei-Schritt-Hybridisierungstemperaturen, um das Fangen des Ziel-Polynukleotids zu erreichen. Bei einer Assaybedingung lagen die Fänger-Sonde, das Ziel-Polynukleotid und die immobilisierte Sonde gleichzeitig in der Beimischung während beider Hybridisierungsbedingungen vor. In einem anderen Assay wurde die immbolisierte Sonde nach der Hybridisierung der Fänger-Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid bei der ersten Hybridisierungsbedingung beigegeben. Das gleichzeitige Beimengen des ersten Assays ist vorteilhaft, da es weniger Reagenzzugabeschritte erfordert, jedoch führte die separate Zugabe der immobilisierten Sonde im Allgemeinen zu einem zweifach höheren Signal als das, was bei der Zwei-Schritt-Hybridisierung, die bei gleichzeitiger Beimengung durchgeführt wurde, beobachtet werden konnte.
  • Das Fänger-Sonde Oligonukleotid und das Acridiniumester (AE)-markierte Ziel-Polynukleotid wurden mittels Standardtechniken synthetisiert und detektiert. Solche Techniken sind im Stand der Technik bekannt, wie es von Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Kapitel 10; Nelson et al., U.S. Pat. Nr. 5,658,737; Woodhead et al., U.S. Pat. Nr. 5,656,207; Hogan et al., U.S. Pat. Nr. 5,547,842; und Arnold et al., U.S. Pat. Nr. 5,283,174 beschrieben wird.
  • Die Fänger-Sonde (1,25 pmol) und das AE-markierte Ziel-Polynukleotid wurden anfänglich mit oder ohne 100 μg einer Poly-T immobilisierten Sonde, die an Seradyn magnetische Kügelchen gebunden war, für 30 min bei 60°C in 1 × Hybridisierungspuffer (siehe Beispiel 1) inkubiert, und dann wechselte man für 30 min auf Raumtemperatur. Für Proben, die bei 60°C ohne die an die Kügelchen gebundene immobilisierte Sonde inkubiert wurden, wurde dieser Bestandteil (in 50 μl 1 × Hybridisierungspuffer) zu Beginn der zweiten Inkubation zugegeben. Die Volumina beider Proben wurden durch Zugabe von 50 μl 1 × Hybridisierungspuffer zum Assay, das bereits die immobilisierte Sonde enthielt, gleichgehalten. Die immobilisierte Sonde war ein Homopolymer aus dT14 oder dT30, die an den festen Träger, der aus Magnetkügelchen bestand, gebunden war. Die Fänger-Sonde war ein Polynukleotid, das eine Basensequenz-Komplementarität mit einer Sequenz im Ziel-Polynukleotid (eine Neisseria gonorrhoeae 16S rRNA-Sequenz) und einen Poly-A-Schwanz aus dA15 oder dA30 aufwies. Die Ziel-Sequenz war AE-markierte N. gonorrhoeae 16S rRNA. Bei Verwendung dieser Kombination wurde ein immobilisierter Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex durch Hybridisierung der Ziel-Sequenz mit der komplementären Ziel-Sequenz der Fänger-Sonde während der ersten Hybridisierung bei 60°C und der Hybridisierung des dA-Bereiches der Fänger-Sonde mit dem dT-Bereich der immobilisierten Sonde während der zweiten Hybridisierung bei Raumtemperatur gebildet.
  • Das eingefangene AE-markierte Ziel-Polynukleotid wurde durch Einwirken eines magnetischen Feldes, das die Kügelchen mit der immobilisierten Sonde an einen Ort im Reaktionsbehälter zieht und anschließendem zweimaligem Waschen mit dem Bindungspuffer (50 mM Lithiumsuccinat, 100 mM LiCl, 1,5% LLS, 1,5 mM EDTA, 1,5 mM EGTA, pH 5,2) gereinigt. Die Kügelchen wurden resuspendiert und das gefangene Ziel-Polynukleotid wurde durch Messen der Chemilumineszenz, die von dem AE-Marker erzeugt wurde, detektiert. Die Chemilumineszenz wurde in relativen Lichteinheiten (RLU) mittels Techniken, die im Wesentlichen dem bereits zuvor beschriebenen entsprachen (Arnold et al., Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989); Nelson et al., U.S. Pat. Nr. 5,658,737) detektiert. Die RLU Ergebnisse werden in Tabelle 2 dargestellt und stellen Mittelwerte in dreifach getesteten Proben dar. Tabelle 2
    Figure 00450001
    • 1repräsentiert das Fangen von 62% des markierten Ziels
    • 2repräsentiert das Fangen von 67% des markierten Ziels
  • Die Ergebnisse der Tabelle 2 zeigen, dass eine Zwei-Schritt-Hybridisierung verwendet werden kann, um das Ziel-Polynukleotid mittels einer Fänger-Sonde und einer immobilisierten Sonde, die beide während beider Hybridisierungen in der Reaktionsmischung vorhanden sind oder vor der zweiten Hybridisierung zugegeben werden, effektiv zu fangen. Daher kann dieses Verfahren zum Fangen des Ziels führen, wenn alle Reagenzien während beider Hybridisierungen gleichzeitig vorhanden sind, wodurch weniger Reagenzzugabeschritte erforderlich sind. Die Ergebnisse der Tabelle 2 zeigen auch, dass relativ kurze komplementäre Sequenzen (dT14 und dA15) für das Fangen des Ziels im immobilisierten Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex effektiv waren. Die Verwendung der 14-mer immobilisierten Sonde ergab im Wesentlichen das gleiche Signal, egal ob die immobilisierte Sonde bei der zweiten Hybridisierung zugegeben wurde oder während beider Hybridisierungen vorhanden war. Ein kürzeres immobilisiertes Sonden-Homopolymer erschien vorteilhafter als ein kürzeres Fänger-Sonde-Homopolymer, wie anhand des höheren Signals deutlich wird, das mit der dT14:dA30-Kombination im Vergleich zur dT30:dA15-Kombination erhalten wurde.
  • Beispiel 3: Zwei-Schritt-Hybridisierung mit amplifizierter Ziel-Sequenz
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um ein Mycobacterium tuberculosis Ziel-Polynukleotid, das in einer klinischen Probe vorhanden ist, zu detektieren. Das Assay ist auch in der Lage, andere Mycobacterium Spezies (d.h., M. bovis, M. simiae und M. africanum, die häufig kollektiv als M. tuberculosis-Komplex bezeichnet werden) zu detektieren, wird jedoch, aufgrund der Einfachheit, hierin in Bezug auf M. tuberculosis beschrieben.
  • Das Basisprotokoll enthielt die folgenden Schritte. Ein Lysat der Probe wurde durch Zugabe einer klinischen Probe (z.B. 500 μl des Sediments vom Sputum, der bronchoalveolaren Spülung oder von Bronchialwaschungen) zum gleichen Volumen eines Lysepuffers (2,2 M LiCl, 250 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, der 4% (w/v) LLS enthält) vorbereitet und die Organismen im Lysat wurden durch Hitze abgetötet (95°C für 15 min). Wenn M. tuberculosis in der klinischen Probe vorhanden ist, wird ein Ziel-Polynukleotid (z.B. rRNA-Sequenz), die von M. tuberculosis stammt, im Lysat vorhanden sein. Ein Aliquot (250 μl) des Lysats wurde mit dem gleichen Volumen einer Lösung vermischt, die die für die M. tuberculosis Ziel-Sequenz spezifische Fänger-Sonde und eine immobilisierte Sonde, die an einem festen Träger gebunden ist, enthält. Die Fänger-Sonde war ein 58-Basen Oligonukleotid, das eine 5' 15-Basensequenz, die zu einer M. tuberculosis rRNA-Sequenz komplementär ist, eine interne T3 und einen 3' dA40-Schwanz enthält. Die immobilisierte Sonde war eine Poly-dT14-Sequenz, die mittels Carbodiimidchemie (im Wesentlichen wie bereits zuvor von Lund, et al., Nuc. Acids Res. 16:10861-10880, 1988 beschrieben) an einen festen Träger aus magnetischen Partikeln (0,7-1,05 μ Partikel, Seradyn, Indianapolis, IN) gebunden worden ist. In diesem Assay wurden 5 pmol der Fänger-Sonde und 50 μg der immobilisierten Sondenpartikel pro Reaktion verwendet. Die Mischung wurde sukzessive bei zwei verschiedenen Temperaturen (60°C für 20 min und 25°C für 15 min) inkubiert. Bei der ersten Temperatur hybridisierte die M. tuberculosiskomplementäre Sequenz der Fänger-Sonde mit der Ziel-Sequenz, da die Tm dieses Hybridisationskomplexes größer ist als 60°C, und bei der zweiten Temperatur hybridisierte die homopolymere immobilisierte Sonde mit dem komplementären homopolymeren Bereich der Fänger-Sonde, da die Tm des dA:dT-Komplexes bei weniger als etwa 50°C liegt. Beiden Inkubationen nachfolgend wurden die Magnetkügelchen mittels eines magnetischen Feldes, so wie es im Wesentlichen in Beispiel 2 beschrieben wurde, aus den Lösungen abgetrennt. Wenn M. tuberculosis in der Probe vorhanden war, befanden sich an diesen magnetischen Kügelchen ein Hybridisationskomplex, der aus dem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid besteht. Wenn M. tuberculosis in der Probe nicht vorhanden war, befand sich an den Kügelchen ein Hybridisationskomplex, der aus der immobilisierten Sonde und der Fänger-Sonde besteht. Die Kügelchen wurden zweimal durch Resuspendieren der Kügelchen im Puffer mit 1 ml des Waschpuffers pro Waschung und anschließendem Wiederholen des magnetischen Abtrennungsschrittes gewaschen. Gewaschene Kügelchen wurden dann in 75 μl einer Nukleinsäure-Amplifikations-Reagenzlösung zur transkriptionsgebundenen Amplifikation mittels Verfahren, die im Wesentlichen wie bei Kacian et al., U.S. Pat. Nr. 5,399,491 und 5,554,516 beschrieben wurden, resuspendiert. Die Kügelchen und 15 pmol jedes einzelnen Primers, der für das M. tuberculosis Ziel-Polynukleotid spezifisch ist, wurden in einer Reaktionsmischung (40 mM Trizma-Base pH 7,5, 17,5 mM KCl, 20 mM MgCl2, 5% Polyvinylpyrrolidon (PVP), 1 mM jedes dNTPs, 4 mM jedes rNTPs), die mit einer Schicht (200 μl) aus einem inerten Öl bedeckt wurde, um die Verdampfung zu verhindern, bei 60°C für 10-15 min und dann bei 41,5-42°C für 5 min inkubiert. Die reverse Transkriptase (etwa 750 Einheiten und etwa 2000 Einheiten der T7 RNA-Polymerase in 25 μl) wurde pro Reaktion zugegeben, vermischt, und die Amplifikation des Ziel-Polynukleotids bei 41,5-42°C für 2 h fortgesetzt. Amplifizierte M. tuberculosis Ziel-Sequenzen wurden mittels einer AE-markierten Sonde detektiert, die durch Chemilumineszenz detektiert wurde, und in relativen Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt, wie es im Wesentlichen bereits vorher beschrieben wurde (U.S. Pat. Nr. 5,658,737 in Spalte 25, Zeilen 27-46; Nelson et al., 1996, Biochem. 35:8429-8438 bei 8432). Für jedes Assay wurde eine negative Kontrolle, die aus allen gleichen Reagenzien, jedoch durch gleiche Volumen negativen Sputums als Probe ersetzt, bestand, und eine positive Kontrolle, die aus allen gleichen Reagenzien, jedoch 50 μl extrahierter gesamtzellulärer M. tuberculosis RNA (enthielt etwa 2000 Kopien rRNA) anstelle der Probe, bestand, erstellt. Die Proben wurden für jedes Assay zweifach getestet (RLU Nr. 1 und RLU Nr. 2 in Tabelle 3).
  • Die Ergebnisse dieses Assays, die bei 15 klinischen Proben, die unabhängig positiv auf die Anwesenheit von M. tuberculosis bestimmt worden sind (basierend auf den standardklinischen Abstrichanalysen und/oder BACTEC Kulturlösungsergebnissen), werden in Tabelle 3 dargestellt.
  • Tabelle 3
    Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Wie anhand der Ergebnisse in Tabelle 3 deutlich wird, wurden alle Proben, die für M. tuberculosis basierend auf wenigstens einem klinischen Assayergebnis positiv waren, im Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay relativ zur Negativkontrolle positiv getestet. Positiv-Ergebnisse basierten auf Proben mit einer RLU Auslesung, die um wenigstens etwa 10-fach größer ist als die einer Negativkontrolle. Für die meisten Proben basierte das Positiv-Ergebnis auf einer RLU Auslesung, die wenigstens etwa 100-fach größer war als die einer Negativkontrolle. Im Allgemeinen war die Chemilumineszenz die auf das M. tuberculosis Ziel-Polynukleotid in der Probe hinwies um etwa 1000-fach größer als die, die in der Negativ-Kontrolle detektiert wurde und im Wesentlichen gleich oder größer als die der Positiv-Kontrolle.
  • Beispiel 4: Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay zum Detektieren variierender Niveaus eines Neisseria gonorrhoeae-Ziels
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um weniger als 5 fg eines Ziel-Polynukleotids, das auf eine bakterielle Infektion hinweist, zu detektieren. Das Ziel-Polynukleotid war eine rRNA-Sequenz, die für N. gonorrhoeae spezifisch war (Hogan et al., U.S. Pat. Nr. 5,541,308; Nelson et al., 1996, Biochem. 35:8429-8438). Darüber hinaus waren die Ergebnisse mit kleineren Variationen reproduzierbar, wenn die Proben über eine dreitägige Periode bei 0-4°C gelagert wurden und am 1., 2. und 3. Tag untersucht wurden. Die 5 fg und 50 fg Mengen des untersuchten N, gonorrhoeae-Ziel-Polynukleotids entsprachen der rRNA, die in 1 Zelle bzw. 10 Zellen vorhanden war.
  • Das verwendete Basisprotokoll schließt die folgenden Schritte ein. Für jede untersuchte Probe wurden 20 μl einer wässrigen Lösung von entweder 0 fg (Negativkontrolle), 5 fg oder 50 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids in 400 μl Wasser mit 400 μl einer synthetischen Urinkontrolle (KOVATROLTM; Hycor Biomedical, Inc.) und 200 μl eines Ziel-Fänger-Puffers (TCB; bestehend aus 2,2 M LiCl, 250 mM HEPES-Puffer, pH 7,5), der ein Fänger-Oligonukleotid (6,25 nM) mit einer Sequenzkomplementarität zum N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid, und eine dT3dA30-Sequenz enthält, vermischt. Eine immobilisierte dT14-Sonde, die an magnetische Partikel als feste Träger gebunden ist, wurde zu 100 μg/ml gegeben und die Mischung wurde sukzessive bei zwei verschiedenen Temperaturen (60°C für 20 min und 25°C für 15 min) inkubiert. Bei der ersten Temperatur hybridisierten die Fänger-Sonde und das Ziel-Polynukleotid, da die Tm des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes größer ist als 60°C, und bei der zweiten Temperatur hybridisierten die immobilisierte Sonde und der Poly-dA-Abschnitt der Fänger-Sonde, da die Tm des dA:dT-Komplexes geringer ist als etwa 52°C. Nach der Inkubation sind die magnetischen Kügelchen mittels eines magnetischen Feldes, wie im Wesentlichen in Beispiel 2 beschrieben, abgetrennt worden. Für Proben, die das N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid enthielten, haben die magnetischen Kügelchen den immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex angebunden, wohingegen für die Negativ-Kontrollproben die Kügelchen die immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde gebunden haben. Dann wurden die Kügelchen, im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben, zweimal gewaschen und die gewaschenen Kügelchen wurden in 75 μl eines Nukleinsäureamplifkationsreagenzes resuspendiert und im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben mittels eines Primers, der für das N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid spezifisch ist, amplifiziert. Nach der Amplifikation wurden die amplifizierten Ziel-Sequenzen mittels einer AE-markierten Sonde, die mittels eines Chemilumineszenzassays, wie in Beispiel 3 beschrieben, detektiert wurde, detektiert, und das Signal wurde in relativen Lichteinheiten (RLU) ausgedrückt. Für die Assays der einzelnen Tage wurden die Hintergrund RLU der Negativ-Kontrollen und der Positiv-Kontrollen auf die gleiche Weise mittels der gleichen Reagenzien bestimmt. Die Ergebnisse der Assays sind in Tabelle 4 dargestellt, einschließlich der RLU-Ergebnisse für jede experimentelle Probe und die Mittelwerte von zwei Positiv-Kontrollen und zehn Negativ-Kontrollen, die für jeden Tag erhalten wurden. Die Hintergrund (Durchschnitt für zwei Proben)-Werte lagen bei 6,81 × 102, 1,18 × 103 und 6,61 × 102 RLU für die Tage 1, 2 bzw. 3.
  • Tabelle 4
    Figure 00520001
  • Die in Tabelle 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay weniger als 5 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids reproduzierbar detektieren kann, wobei die erzeugte Chemilumineszenz signifikant über der von Proben liegt, die kein Ziel-Polynukleotid enthalten, die unter den gleichen Bedingungen getestet wurden. Darüber hinaus, wenn die Proben gelagert wurden und wiederholt mittels des Verfahrens über einen Zeitraum von 3 Tagen getestet wurden, ergab sich eine gute Reproduzierbarkeit der Ergebnisse über den gesamten Zeitraum. Die Ergebnisse zeigen auch eine gute von Probe-zu-Probe-Reproduzierbarkeit über den drei Tageszeitraum.
  • Beispiel 5: Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay zum Detektieren von Bakterien in klinischen Urinproben
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um ein Ziel zu detektieren, das für eine bakterielle Infektion bei Verwendung von klinischen Urinproben Indikativ ist. Das Ziel-Polynukleotid war eine Sequenz, die für Chlamydia trachomatis spezifisch ist. Die Proben sind unabhängig voneinander mittels eines PCR-basierten Assays auf C. trachomatis getestet worden, und die Ergebnisse, die mit dem Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren erhalten wurden, sind mit denen verglichen worden, die mit dem PCR-basierten Assay erhalten wurden. Die Urinproben wurden bei Verwendung des Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahrens doppelt getestet, wobei die Proben in zufälliger Reihenfolge relativ zu ihrer Klassifizierung (positiv oder negativ) bezogen auf den PCR-basierenden Assayergebnissen angeordnet wurden.
  • Kurz gesagt, sah das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassayprotokoll wie folgt aus. Jedes Reaktionsröhrchen enthielt 200 μl TCB (wie in Beispiel 4 definiert), der 6,25 pmol eines Fänger-Oligonukleotids mit einer Sequenzkomplementarität zum C. trachomatis Ziel-Polynukleotid und einer dT3dA30-Sequenz aufwies, zu dem 800 μl der vorbereiteten Urinprobe (400 μl Urin plus 400 μl TM-Puffer (100 mM (NH4)2SO4, 50 mM Hepes, pH 7,5, 8% LLS)) oder 800 μl an Kontrollen (als Negativ-Kontrollen wurden benutzt 400 μl KOVATROLTM plus 400 μl TM-Puffer; als Positiv-Kontrollen wurden benutzt 400 μl KOVATROLTM plus 400 μl TM-Puffer, der 5 fg von C. trachomatis gesamtzellulärer RNA (d.h. rRNA-Ziel-Polynukleotid enthält) zugegeben wurden. Die Röhrchen wurden versiegelt, vermischt und bei 60°C für 30 min inkubiert und dann bei 40°C für 30 min. Die Röhrchen wurden dann einem Magnetfeld ausgesetzt, und die magnetischen Kügelchen mit der immobilisierten Sonde wurden von der Lösung abgetrennt und die immobilisierten Komponenten wurden zweimal gewaschen, im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben. Bei 60°C hybridisierte die Fänger-Sonde und das C. trachomatis Ziel-Polynukleotid, weil die Tm des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes größer ist als 60°C, und bei der zweiten Temperatur hybridisierte die Poly-dT-Sonde und der Poly-A-Abschnitt der Fänger-Sonde, da die Tm des dA:dT-Komplexes geringer ist als etwa 52°C. Das Ziel-Polynukleotid wurde mittels eines Primers, der für die C. trachomatis Ziel-Sequenz spezifisch ist, und Reagenzien für die transkriptionsgebundene Amplifikation, die in einem Volumen von 75 μl, im Wesentlichen wie in Beispiel 3 beschrieben, amplifiziert, mit der Ausnahme, dass die Amplifikation für 1 h stattfand. Die AE-markierte Sonde, die für die C. trachomatis Ziel-Sequenz spezifisch ist, wurde zugegeben (in 100 μl), vermischt und die Mischung bei 60°C für 20 min inkubiert, wonach 300 μl des Selektionsreagenzes zugegeben wurden, vermischt, inkubiert und als RLU (siehe Beispiel 3) detektiert wurden.
  • Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse des Zwei-Schritt-Hybridisierungsassays ("RLU" ist der Mittelwert der doppelten Tests für 30 Urinproben und die Mittelwerte der fünf positiven und fünf negativen Kontrollen) und der PCR-basierten Tests (positiv oder negativ für die Detektion von C. trachomatis Nukleinsäure).
  • Tabelle 5
    Figure 00550001
  • Wie man anhand der Ergebnisse in Tabelle 5 sehen kann, ergibt in allen untersuchten Proben das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren positive Ergebnisse für solche Proben, die mit dem unabhängigen PCR-basierten Assay positiv getestet wurden, und in allen Fällen, in denen mit dem PCR-basierten Assay negativ getestet worden ist, waren die Proben ebenfalls negativ, wenn sie mit dem Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren getestet wurden. Für solche negativen Proben, die relativ hohe (103) negative Signale (Proben 2, 8 und 22) aufwiesen, schlossen die doppelten Assays immer ein "0" RLU-Signal ein und ein relativ hohes Hintergrundsignal. Daher kann das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay verwendet werden, um Bakterien zu detektieren, die in klinischen Urinproben vorhanden sind, und man erhält positive oder negative Ergebnisse die mit denen im PCR-Assay erhaltenen vergleichbar sind.
  • Beispiel 6: Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay zum Detektieren mehrerer bakterieller Ziele in einer Probe
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um mehrere Ziele zu detektieren, die auf bakterielle Infektionen durch verschiedene Spezies in einer einzelnen Probe hinweisen. Die Ziel-Polynukleotide waren Sequenzen, die für Neisseria gonorrhoeae und Chlamydia trachomatis spezifisch sind, und die Assays wurden im Wesentlichen wie in den Beispielen 3-6 beschrieben durchgeführt. Diese Proben wurden auch mit Kontaminanten (1% bis 10% v/v Blut) versetzt.
  • Die Assays wurden im Wesentlichen wie in den Beispielen 3-6 beschrieben durchgeführt, in denen die Proben aus normalen Urin (keine bakterielle Kontamination) bestanden, die entweder enthielten: kein Ziel-Polynukleotid (Negativ-Kontrollen); 5 fg eines C. trachomatis Ziel-Polynukleotids; 5 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids; oder eine Mischung aus 5 fg eines C. trachomatis Ziel-Polynukleotids und 5 fg eines N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotids. In jedem Probensatz enthielten die Assayröhrchen weiter entweder 0%, 1%, 5 oder 10% v/v Blut. Das gleichzeitige Detektieren der zwei Ziel-Sequenzen mittels Chemilumineszenzsonden wurde im Wesentlichen nach der Beschreibung von Nelson et al. (1996, Biochem. 35:8429-8438 bei 8432) mittels einer ortho-F-AE-markierten Sonde, die für das C. trachomatis Ziel-Polynukleotid spezifisch ist, und einer 2-Me-AE-markierten Sonde, die für das N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid spezifisch ist, durchgeführt. Die Urinproben wurden vorbereitet und bei 60°C für 30 min und dann bei 40°C für 30 min für die sukzessiven Hybridisierungsschritte, im Wesentlichen wie hierin in Beispiel 5 beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Blutkontaminante in einigen der Proben, wie weiter oben beschrieben, enthalten war, inkubiert. Die immobilisierten Sonden in den Hybridisationskomplexen wurden mittels des Magnetfeldes und der Waschschritte gereinigt und die gereinigten Ziel-Sequenzen wurden mittels transkriptionsgebundener Amplifikationsverfahren, die Primer enthielten, die für das C. trachomatis Ziel-Polynukleotid und das N. gonorrhoeae Ziel-Polynukleotid spezifisch sind, wie in Beispielen 4 und 5 weiter oben beschrieben, amplifiziert. Das Detektionsreagenz wurde zugegeben und gleichzeitig wurde die Chemilumineszenz von der C. trachomatis spezifischen markierten Sonde und der N. gonorrhoeae spezifischen markierten Sonde detektiert. Für jeden untersuchten Probentyp wurden vier Wiederholungsversuche angesetzt und untersucht und die RLU-Ergebnisse (Mittelwerte für jeden Probentyp) in Tabelle 6 dargestellt. In Tabelle 6 wird das für die C. trachomatis-spezifische markierte Sonde detektierte Signal (RLU) durch "CT" dargestellt und das Signal, das für die N. gonorrhoeae-spezifische markierte Sonde detektiert wurde, wird durch "NG" dargestellt.
  • Tabelle 6
    Figure 00570001
  • Die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Zwei-Schritt-Hybridisierungsassay verwendet werden kann, um zwei Ziele in einer einzelnen Probe gleichzeitig zu detektieren. Die Negativkontrollen geben im Wesentlichen vernachlässigbare Signale verglichen zu denen der Proben, die das C. trachomatis-Ziel alleine enthielten, das N. gonorrhoeae-Ziel alleine oder beide Ziele. Die Detektion beider Ziele wurde von einer bis zu 10% v/v Blutkontamination nicht gestört und beide Ziele wurden gleichzeitig in einer einzelnen Probe detektiert, sogar mit einer Blutkontamination bis zu 10% v/v.
  • Obwohl mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung hierin beschrieben worden sind, können verschiedene Modifikationen der einzelnen Sonde vorgenommen werden ohne vom Geist und vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, der durch die folgenden Ansprüche beschrieben wird, abzuweichen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00590001
  • Figure 00600001

Claims (18)

  1. Ein Verfahren zum Fangen eines in einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotids, das das Binden eines Ziel-Polynukleotids an einen festen Träger umfasst, durch die Schritte gekennzeichnet: Bereitstellen einer Mischung, die ein Ziel-Polynukleotid, eine Fänger-Sonde und eine immobilisierte Sonde umfasst; Inkubieren der Mischung unter einer ersten Hybridisierungsbedingung, die eine Temperatur unterhalb einer Tm eines Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes, der die Fänger-Sonde und das Ziel-Polynukleotid umfasst, und über einem Tm eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes, der die immobilisierte Sonde und die Fänger-Sonde umfasst, verwendet, wobei die Bildung eines Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes begünstigt wird und die Bildung eines immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes weniger begünstigt wird; dann Inkubieren der Mischung bei einer zweiten Hybridisierungsbedingung, die eine Temperatur unterhalb der Tm des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes verwendet, wobei die Bildung des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde-Hybridisations-Komplexes und das Fangen des Ziel-Polynukleotids in einem immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplex, der die immobilisierte Sonde, die Fänger-Sonde und das Ziel-Polynukleotid umfasst, begünstigt wird; und Reinigen des immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplexes.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Inkubationsschritt bei der zweiten Hybridisierungsbedingung das Verringern der Temperatur bei der ersten Hybridisierungsbedingung um wenigstens etwa 10°C umfasst ist.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Inkubationsschritt bei der zweiten Hybridisierungsbedingung das Verringern der Temperatur bei der ersten Hybridisierungsbedingung um wenigstens etwa 20°C umfasst ist.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Inkubationsschritt bei der ersten Hybridisierungsbedingung eine Temperatur von etwa 60°C verwendet wird und im Inkubationsschritt bei der zweiten Hybridisierungsbedingung eine Temperatur von etwa 40°C oder weniger verwendet wird.
  5. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiter durch den Schritt des Detektierens des Ziel-Polynukleotids im immobilisierten Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplex durch Hybridisieren einer markierten Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid und Detektieren der hybridisierten, markierten Sonde gekennzeichnet ist.
  6. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das weiter durch den Schritt des Amplifizierens eines gereinigten Ziel-Polynukleotids aus dem immobilisierten Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Hybridisations-Komplex, um eine amplifizierte Nukleinsäure zu erzeugen, gekennzeichnet ist.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Amplifizierungsschritt ein transkriptionsgebundenes Amplifikationsverfahren umfasst.
  8. Das Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, das weiter durch den Schritt des Detektierens der amplifizierten Nukleinsäure gekennzeichnet ist.
  9. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Detektionsschritt das Hybridisieren einer markierten Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure, die zum Ziel-Polynukleotid komplementär ist, und das Detektieren der hybridisierten, markierten Sonde umfasst.
  10. Das Verfahren nach Anspruch 5 oder 9, wobei das Detektieren der hybridisierten, markierten Sonde das Entfernen der unhybridisierten, markierten Sonde einschließt.
  11. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Bereitstellungsschritt eine Mischung bereitstellt, wobei die immobilisierte Sonde einen Fänger-Sonde-Bindungsbereich von wenigstens fünf Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen in der Länge umfasst, und die Fänger-Sonde einen immobilisierte Sonde-Bindungsbereich von wenigstens fünf Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen in der Länge umfasst, wobei der Fänger-Sonde-Bindungsbereich komplementär zum immobilisierte Sonde-Bindungsbereich ist.
  12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei im Bereitstellungsschritt der Fänger-Sonde-Bindungsbereich der immobilisierten Sonde umfasst: (a) ein erstes Rückgrat, das wenigstens eine Zucker-Phosphodiester-Verknüpfung, wenigstens eine Peptid-Nukleinsäuregruppe, wenigstens eine Phosphorthioat-Verknüpfung oder eine Kombination davon enthält, und (b) wenigstens zehn Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem ersten Rückgrat verbunden sind, wobei jede Nukleotid-Erkennungsgruppe eine Wasserstoffbrückenbindung mit Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Uracil oder Inosin ausbilden kann; und der immobilisierte Sonde-Bindungsbereich der Fänger-Sonde umfasst: (a) ein zweites Rückgrat, das wenigstens eine Zucker-Phosphodiester-Verknüpfung, wenigstens eine Peptid-Nukleinsäuregruppe, wenigstens eine Phosphorthioat-Verknüpfung oder eine Kombination davon enthält, und (b) wenigstens zehn Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem zweiten Rückgrat verbunden sind, die eine Wasserstoffbrückenbindung mit den Nukleotidbasen-Erkennungsgruppen, die mit dem ersten Rückgrat verbunden sind, ausbilden können.
  13. Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Fänger-Sonde-Bindungsbereich aus einem Homopolymer besteht, das wenigstens 10 Nukleotide umfasst, und der immobilisierte Sonde-Bindungsbereich aus einem Homopolymer besteht, das wenigstens 25 Nukleotide, von denen wenigstens 10 Nukleotide komplementär zu 10 Nukleotiden im Fänger-Sonde-Bindungsbereich sind, umfasst.
  14. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der Fänger-Sonde-Bindungsbereich etwa vierzehn zusammenhängende A- oder T-Basen umfasst, und der immobilisierte Sonde-Bindungsbereich eine Sequenz von etwa 30 Basen, die komplementär zu den zusammenhängenden Basen des Fänger-Sonde-Bindungsbereiches sind, umfasst.
  15. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Bereitstellungsschritt eine Mischung bereitstellt, wobei die Fänger-Sonde Desoxynukleotid, Ribonukleotid, 2'-Methoxysubstituieres Nukleotid, 2'-Halo-substituierte Nukleotidbestandteile oder eine Kombination davon umfasst, und wobei die immobilisierte Sonde Desoxynukleotid, Ribonukleotid, 2'-Methoxy-substituiertes Nukleotid, 2'-Halo substituierte Nukleotidbestandteile oder eine Kombination davon umfasst.
  16. Ein Verfahren zum Bestimmen der Gegenwart eines Ziel-Polynukleotids in einer Probe, das das Binden des Ziel-Polynukleotids an einen festen Träger, das Amplifizieren des Ziel-Polynukleotids und das Detektieren des amplifizierten Ziel-Polynukleotids umfasst, durch die Schritte gekennzeichnet: Bereitstellen einer Fänger-Sonde, die mit einem in einer Probe vorhandenen Ziel-Polynukleotid hybridisieren kann und eine immobilisierte Sonde, die mit der Fänger-Sonde hybridisieren kann; Mischen der Fänger-Sonde und der immobilisierten Sonde mit einer Probe, die vermutlich das Ziel-Polynukleotid enthält, bei einer ersten Inkubationstemperatur, die das Hybridisieren der Fänger-Sonde mit dem Ziel-Polynukleotid begünstigt und die Hybridisierung der immobilisierten Sonde mit der Fänger-Sonde weniger begünstigt, wobei ein Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex erzeugt wird; Inkubieren des Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplexes und der immobilisierten Sonde bei einer zweiten Inkubationstemperatur, die die Hybridisierung der immobilisierten Sonde und der Fänger-Sonde begünstigt, wobei ein eingefangenes Ziel-Polynukleotid, das einen immobilisierte Sonde:Fänger-Sonde:Ziel-Polynukleotid-Komplex umfasst, erzeugt wird; Reinigen des eingefangenen Ziel-Polynukleotids von anderen Komponenten der Probe, wobei ein gereinigtes Ziel-Polynukleotid erzeugt wird; Amplifizieren des gereinigten Ziel-Polynukleotids unter Verwendung eines Primers, der für das Ziel-Polynukleotid spezifisch ist, wobei eine amplifizierte Nukleinsäure erzeugt wird; und Detektieren der amplifizierten Nukleinsäure, um die Anwesenheit des Ziel-Polynukleotids in der Probe zu bestimmen.
  17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Detektionsschritt das Hybridisieren einer markierten Sonde mit der amplifizierten Nukleinsäure, die mit dem Ziel-Polynukleotid oder einem Abschnitt davon komplementär ist, und das Detektieren der hybridisierten, markierten Sonde umfasst.
  18. Das Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei der Amplifikationsschritt ein zielspezifisches, transkriptionsgebundenes Amplifikationsverfahren verwendet.
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