DE69832624T2

DE69832624T2 - Hefestämme zur herstellung von milchsäure

Info

Publication number: DE69832624T2
Application number: DE69832624T
Authority: DE
Inventors: Danilo Porro; Michele Bianchi; Maria Bianca RANZI; Laura Frontali; Marina Vai; Adrian Aaron WINKLER; Lilia Alberghina
Original assignee: Tate and Lyle Ingredients Americas LLC
Current assignee: Primary Products Ingredients Americas LLC
Priority date: 1997-09-12
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2018-09-12
Also published as: IT1294728B1; BR9812434A; CA2302434A1; AU9539298A; US7049108B2; ES2252863T3; ATE311460T1; AU748462B2; DE69832624D1; US20030032152A1; ITMI972080A1; JP2001516584A; EP1012298A1; DK1012298T3; WO1999014335A1; US7326550B2; US20060148050A1; EP1012298B1; SI1012298T1; US6429006B1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Hefestämme, die mit wenigstens einer Kopie eines Gens, welches für Milchsäuredehydrogenase (LDH) codiert, transformiert sind und die ferner für die Produktion von Milchsäure mit einer hohen Ausbeute und Produktivität modifiziert sind.
Die Verwendungen für Milchsäure und von Derivaten davon umfassen viele Felder von industriellen Aktivitäten (d.h. Chemie, Kosmetik und Pharmazie) sowie bedeutende Aspekte der Nahrungsmittelherstellung und Verwendung. Es besteht heute ein wachsendes Interesse an der Produktion von solch einer organischen Säure, die direkt für die Synthese von bioabbaubaren Polymermaterialien verwendet werden.
Milchsäure kann durch chemische Synthese oder durch Fermentation von Kohlenhydraten unter Verwendung von Mikroorganismen hergestellt werden. Das letztere Verfahren wird heute kommerziell bevorzugt, da Mikroorganismen entwickelt worden sind, die exklusiv ein Isomer herstellen im Gegensatz zu einem racemischen Gemisch, das durch die chemische Synthese erzielt wird. Die bedeutendsten industriellen Mikroorganismen, wie die Arten der Gattung Lactobacillus, Bacillus und Rhizobus, stellen L(+)-Milchsäure her. Die Produktion von D(–)-Milchsäure oder Mischungen von L(+)- und D(–)-Milchsäure durch Fermentation sind auch bekannt.
Während einer typischen Milchsäurefermentation entsteht ein hemmender Effekt, der durch Milchsäure hervorgerufen wird, die durch die metabolischen Aktivitäten des produzierenden Mikroorganismus hergestellt wird. Neben der Gegenwart von Milchsäure führt auch die Absenkung des pH-Wertes zu einer Hemmung des Zellwachstums und der metabolischen Aktivität.
Im Ergebnis wird das Maß der Milchsäureproduktion deutlich reduziert.
Die Zugabe von Ca(OH)₂, CaCO₃, NaOH oder NH₄OH, um die Milchsäure zu neutralisieren und um so einen pH-Abfall zu verhindern, ist eine bekannte Maßnahme bei industriellen Verfahren, um den negativen Wirkungen der freien Milchsäureakkumulation entgegenzuwirken.
Diese Verfahren erlauben die Produktion von Lactat(en) durch die Aufrechterhaltung des pH's auf einem konstanten Wert in dem Bereich von etwa 5 bis 7. Dies ist deutlich über dem pK_a der Milchsäure von 3,86.
Die Hauptnachteile sind mit der Neutralisation der Milchsäure während der Fermentation verbunden. Zusätzliche Maßnahmen sind erforderlich, um die freie Milchsäure aus ihren Salzen zu regenerieren und um das neutralisierende Kation zu verwerfen oder wieder zu verwerten. Dies ist ein teuerer Vorgang. All diese Extramaßnahmen und Ausgaben könnten eliminiert werden, wenn freie Milchsäure durch Mikroorganismen, die bei niedrigen pH-Werten wachsen, akkumuliert werden könnte, wodurch so die Produktion von Lactat(en) minimiert würde.
Es wurde die Verwendung von rekombinanten Hefen, welche das Lactatdehydrogenase-Gen exprimieren, vorgeschlagen, um so den glycolytischen Fluss in Richtung der Herstellung von Milchsäure zu verändern.
Die FR-A-2 692 591 (Institut Nationale Ia Recherche Agronomique) offenbart Hefestämme, insbesondere Saccharomyces-Stämme, die wenigstens eine Kopie eines Gens, welches für eine Milchsäuredehydrogenase aus einem Milchsäurebakterium codiert, enthalten, wobei dieses Gen unter der Kontrolle von Sequenzen steht, die seine Expression in den Hefen reguliert.
Diese Stämme können sowohl eine alkoholische als auch eine Milchsäurefermentation durchführen. Diese so genannte „intermediäre" oder „balancierte" Fermentation kann in Bereichen, wie dem Brauwesen, Enologie und dem Backwesen, ausgenutzt werden.
Porro et al. (Biotechnol. Prog. 11, 294–298, 1995) haben auch die Transformation von S. cerevisiae mit einem Gen berichtet, das für Rinder-Milchsäuredehydrogenase codiert.
Aufgrund der hohen Produktion von Ethanol war jedoch die Ausbeute bei der Herstellung von Milchsäure für beide beschriebenen Verfahren als nicht kompetitiv im Vergleich zu der Herstellung unter Verwendung von Milchsäurebakterien betrachtet worden.
In der vergangenen Dekade erzielten „nicht konventionelle Hefen", die nicht S. cerevisiae waren, ein bemerkenswertes industrielles Interesse als Wirt für die Expression von heterologen Proteinen. Beispiele sind die Methanol verwertenden Hefen, wie Hansenula polimorpha und Pichia pastoris, sowie die Lactose verwertenden Hefen, wie Kluyveromyces lactis. Zusätzlich zur Befähigung der Verwendung eines größeren Bereiches von Substraten wie Kohlenstoff und Energiequellen, haben andere Argumente die industrielle Verwendung von „nicht konventionellen Hefen" vorwärts getrieben. Im Allgemeinen sind die Biomasse und die Produktausbeute in einigen von diesen Hefen durch extreme Bedingungen der zellulären Umgebung weniger beeinträchtigt. Hoch Zucker-tolerante (d.h. 50–80% Gew./Vol. Glucosemedium; sind Torulaspora syn. Zygosaccharomyces delbrueckii, Zygosaccharomyces rouxii und Zygosaccharomyces bailii; Ok T und Hashinaga F., Journal of General & Applied Microbiology 43(1); 39–47, 1997) und Säure- und Milchsäure-tolerante (Zygosaccharomyces rouxii und Zygosaccharomyces bailii; Houtsma PC, et al., Journal of Food Protection 59(12), 1300–1304, 1996) „nicht konventionelle Hefen" sind verfügbar. Wie bereits erwähnt, konnten die Kosten der nachgeordneten Verarbeitung stark reduziert werden, wenn das Fermentationsverfahren unter einer oder mehreren der oben erwähnten „extremen Bedingungen" durchgeführt wird.
Gemäß einer ersten Ausführungsform stellt die Erfindung Hefestämme bereit, die mit wenigsten einer Kopie eines Gens transformiert sind, welches für Milchsäuredehydrogenase (LDH) codiert und das funktional mit Promotersequenzen verbunden ist, welche die Expression dieses Gens in Hefen erlauben.
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Hefestämme von Kluyveromyces-, Torulaspora- und Zygosaccharomyces-Arten bereit, die mit wenigstens einer Kopie eines Gens transformiert sind, welches für Milchsäuredehydrogenase (LDH) codiert und das mit Promotersequenzen funktional verbunden ist, welche die Expression des Gens in diesen Hefen erlauben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung auch Hefezellen bereit, die mit einem heterologen LDH-Gen transformiert sind und einen Lactattransporter überexprimieren.
Andere Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz umfassen, welche für eine Milchsäuredehydrogenase codieren, die mit einer Hefepromotersequenz funktional verbunden ist, und ein Verfahren für die Herstellung von DL-, D- oder L- Milchsäure durch die Kultivierung der oben beschriebenen, metabolisch hergestellten Hefestämme in einem Fermentationsmedium, das eine Kohlenstoffquelle enthält, und durch die Gewinnung der Milchsäure aus dem Fermentationsmedium.
Ferner stellt die Erfindung Verfahren zur Verbesserung der Produktivität (g/l/Std.), Produktion (g/l) und der Ausbeute (g/g) auf der Kohlenstoffquelle für die Milchsäure bereit, wobei Hefestämme in einem manipulierten Fermentationsmedium kultiviert werden und die Milchsäure aus dem Fermentationsmedium gewonnen wird.
Es wurde gefunden, dass die Herstellung von Milchsäure durch metabolisch modifizierte Hefen erzielt werden kann, die zu der Gattung Kluyveromyces, Saccharomyces, Torulaspora und Zygosaccharomyces gehören.
Es wurde insbesondere herausgefunden, dass sehr hohe Ausbeuten bei der Herstellung von Milchsäure durch veränderte Hefestämme erzielt werden können, wenn zumindest die ethanolische Fermentation durch die Milchsäurefermentation ersetzt wird.
Noch höhere Ausbeuten (> 80% g/g) bei der Herstellung von Milchsäure können durch veränderte Hefestämme erzielt werden, bei denen sowohl die Ethanolfermentation und die Verwendung von Pyruvat durch die Mitochondrien durch die Milchsäurefermentation ersetzt sind.
Zu diesem Zweck stellt die Erfindung auch transformierte Hefezellen mit einer erhöhten LDH-Aktivität bereit, zum Beispiel als eine Konsequenz einer erhöhten LDH-Kopienzahl pro Zelle oder aufgrund der Verwendung von stärkeren Promotoren, welche die LDH-Expression kontrollieren.
Eine erhöhte LDH-Kopienzahl pro Zelle bedeutet wenigstens eine Kopie einer Nukleinsäuresequenz, die für das Milchsäuredehydrogenase-Protein codiert, vorzugsweise wenigstens zwei Kopien, mehr bevorzugt sind vier Kopien oder noch weiter bevorzugt sind wenigstens 10–50 Kopien dieser Nukleinsäuresequenz.
Um die höchste Produktion an Milchsäure zu erzielen, überexprimieren die gemäß der Erfindung transformierten Hefezellen vorzugsweise einen Lactattransporter. Dies kann erzielt werden durch die Transformation von Hefezellen mit einer oder mehreren Kopien eines Gens, das für den Lactattransport erforderlich ist.
Die Stämme gemäß der Erfindung können durch verschiedene Verfahren erzielt werden, zum Beispiel durch gentechnologische Verfahren, welche auf die Expression einer Milchsäuredehydrogenase-Aktivität abzielen, und durch Inaktivierung oder Unterdrückung der Pyruvatdecarboxylase- und Alkoholdehydrogenase-Aktivitäten, sowie durch Inaktivierung oder Unterdrückung der enzymatischen Aktivitäten, die bei der Verwendung von Pyruvat durch die Mitochondrien beteiligt sind.
Da die Pyruvatdecarboxylase den ersten Schritt des Alkoholstoffwechsels katalysiert, sind Hefestämme bevorzugt, die keine oder eine im Wesentlichen reduzierte Pyruvatdecarboxylase (PDC)-Aktivität haben, und ein heterologes Milchsäuredehydrogenase-Gen exprimieren.
Da die Pyruvatdehydrogenase den ersten Schritt in der Verwendung von Pyruvat durch die Mitochondrien katalysiert, sind auch Hefestämme bevorzugt, die keine oder eine im Wesentlichen reduzierte Pyruvatdehydrogenase (PDH)-Aktivität haben, und ein heterologes Milchsäuredehydrogenase-Gen exprimieren.
Da Lactat in dem Medium über einen Lactattransporter ausgeschieden wird, sind auch Zellen bevorzugt, welche Milchsäure herstellen und den Lactattransporter überexprimieren.
Die Expression eines LDH-Gens in Hefestämmen erlaubt die Herstellung von Milchsäure bei sauren pH-Werten, so dass die freie Säure direkt erzielt wird und die beschwerliche Umwandlung und Gewinnung der Lactatsalze minimiert wird. Bei dieser Erfindung kann der pH des Fermentationsmediums zu Beginn größer als 4,5 sein, wobei er aber auf einen pH von 4,5 oder weniger absinken wird, vorzugsweise auf einen pH von 3 oder weniger, bei der Beendigung der Fermentation.
Jede Art von Hefestamm kann gemäß der Erfindung verwendet werden, wobei aber Kluyveromyces-, Saccharomyces-, Torulaspora- und Zygosaccharomyces-Arten bevorzugt sind, da diese Stämme bei einem sehr niedrigen pH wachsen und/oder metabolisieren können, insbesondere in dem Bereich von pH 4,5 oder weniger. Die gentechnologischen Verfahren für diese Stämme sind gut entwickelt und diese Stämme sind zur Verwendung in nahrungsmittelverwandten Anwendungen breit akzeptiert.
Große Ausbeuten an Milchsäure können darüber hinaus erzielt werden mit Kluyveromyces-, Torulaspora- und Zygosaccharomyces-Stämmen, die mit einem Gen transformiert sind, welches für Milchsäuredehydrogenase mit einer „Wildtyp"-Pyruvatdecarboxylase- und/oder einer Pyruvatdehydrogenase-Aktivität codiert.
Der Ausdruck „reduzierte Pyruvatdecarboxylase-Aktivität" bedeutet entweder eine reduzierte Konzentration des Enzyms in der Zelle oder eine reduzierte oder keine spezifisch katalytische Aktivität des Enzyms.
Der Ausdruck „reduzierte Pyruvatdehydrogenase-Aktivität" bedeutet entweder eine reduzierte Konzentration des Enzyms in der Zelle oder eine reduzierte oder keine spezifisch katalytische Aktivität des Enzyms.
Gemäß der Erfindung ist die Verwendung von Stämmen bevorzugt, bei denen die Ethanolproduktion null oder fast null ist, wobei aber eine reduzierte Produktion zum Beispiel niedriger als 60%, vorzugsweise niedriger als 80%, und weiter bevorzugt von niedriger als 90% als die normale Produktion der Wildtypstämme akzeptabel ist.
Gemäß der Erfindung ist die Verwendung von Stämmen bevorzugt, worin die Pyruvatdecarboxylase- und/oder die Pyruvatdehydrogenase-Aktivitäten null oder annährend null sind, wobei aber eine reduzierte Aktivität um wenigstens 60%, vorzugsweise um wenigstens 80% und weiter bevorzugt um wenigstens 90% im Vergleich zu der normalen Produktion der Wildtypstämme akzeptabel ist.
Ein Beispiel für K. lactis mit keiner PDC-Aktivität wurde offenbart in Mol. Microbiol. 19(1), 27–36, 1996.
Beispiele für Saccharomyces-Stämme mit einer reduzierten PDC-Aktivität sind verfügbar von ATCC unter den Hinterlegungsnummern 200027 und 200028. Ein weiteres Beispiel für einen Saccharomyces-Stamm mit einer reduzierten PDC-Aktivität als Konsequenz der Deletion des regulatorischen PDC2-Gens ist beschrieben in Hohmann, S (1993) (Mol. Gen. Genet. 241: 657–666).
Ein Beispiel für einen Saccharomyces-Stamm mit keiner PDC-Aktivität ist beschrieben in Flikweert M. T. et al. (Yeast, 12: 247–257, 1996). In S. cerevisiae kann eine Reduktion der PDC-Aktivität entweder durch Deletion der Strukturgene (PDC1, PDC5, PDC6) oder durch Deletion des regulatorischen Gens (PDC2) erzielt werden.
Ein Beispiel für einen Kluyveromyces-Stamm mit keiner PDH-Aktivität ist beschrieben in Zeeman et al. (Genes involved in pyruvate metabolism in K. lactis; Yeast, Bd. 13, Special Issue April 1997, Eighteenth International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, S. 143).
Ein Beispiel für einen Saccharomyces-Stamm mit keiner PDH-Aktivität ist beschrieben in Pronk JT. et al. (Microbiology. 140 (Pt 3): 601–10, 1994.
Die PDC-Gene sind hoch konserviert unter den verschiedenen Hefegattungen (Bianchi et al., Molecular Microbiology, 19(1): 27–36, 1996; Lu P. et al., Applied & Environmental Microbiology, 64(1): 94–7, 1998). Es kann somit leicht angenommen werden, dass mit klassischen molekularen Schritten, wie dies berichtet wurde von Lu P. et al. (supra), es möglich ist, das oder die Gene zu identifizieren, zu klonieren und zu unterbrechen, die für eine Pyruvatdecarboxylase-Aktivität aus den Hefearten Torulaspora und Zygosaccharomyces notwendig sind. Es ist ferner zu erwarten, dass mit den gleichen klassischen Schritten, wie berichtet von Neveling U. et al. (1998, Journal of Bacteriology, 180(6): 1540–8, 1998), es möglich ist, das oder die Gene zu isolieren, klonieren und zu unterbrechen, welche für die PDH-Aktivität in den beiden Hefearten Torulaspora und Zygosaccharomyces erforderlich sind.
Die Pyruvatdecarboxylase-Aktivität kann durch bekannte Verfahren gemessen werden, zum Beispiel gemäß Ulbrich J., Methods in Enzymology, Bd. 18, Seiten 109–115, 1970, Academic Press, New York.
Die Pyruvatdehydrogenase-Aktivität kann durch bekannte Verfahren gemessen werden, zum Beispiel gemäß Neveling U. et al. (supra).
Geeignete Stämme können durch die Selektion von Mutationen und/oder durch Modifikation des Wildtyps oder durch Stämme aus Sammlungen erzielt werden. Hunderte von Mutanten können durch „High Throughput Screen"-Schritte ausgewählt werden. Die Modulation der Pyruvatdecarboxylase-Aktivität durch Verwendung von Nahrungsstoffen, die unterschiedliche glycolytische Fließraten unterstützen (Biotechnol. Prog. 11, 294–298, 1995) haben sich als nicht zufrieden stellend herausgestellt.
Ein bevorzugtes Verfahren für die Reduktion oder die Zerstörung der Pyruvatdecarboxylase-Aktivität und/oder der Pyruvatdehydronase-Aktivität in einem Hefestamm gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in der Deletion des entsprechenden Gens oder der Gene.
Diese Deletionen können durch bekannte Verfahren durchgeführt werden, wie solche, die offenbart sind in Bianchi et al., (Molecular Microbiol. 19(1), 27–36, 1996; Flikweert M. T. et al., Yeast, 12: 247–257, 1996 und Pronk JT. et al., Microbiology. 140 (Pt 3): 601–10, 1994), oder durch Deletion oder Insertion von selektierbaren Markern, zum Beispiel von dem URA3-Marker, vorzugsweise dem URA3-Marker aus Saccharomyces cerevisiae. Alternativ können Deletionen, Punktmutationen und/oder Leserastermutationen in funktionelle Promotoren und Gene eingeführt werden, welche für die PDC- und/oder die PDH-Aktivitäten notwendig sind. Diese Techniken sind zum Beispiel offenbart in Nature, 305, 391–397, 1983. Ein zusätzliches Verfahren zur Reduktion von diesen Aktivitäten kann in der Einführung eines Stopp-Codons in die Gensequenzen oder in der Expression von Antisense-mRNAs liegen, um die Translation von PDC und PDH mRNAs zu hemmen.
Ein Kluyveromyces lactis-Stamm, bei dem das PDC-Gen durch das URA3-Gen von S. cerevisiae ersetzt worden ist, ist bereits beschrieben worden in Molecular Microbiology 19(1), 27–36, 1996.
Das für Milchsäuredehydrogenase codierende Gen kann von jeder Spezies abstammen (zum Beispiel Säugetier, wie Rind, oder Bakterien) und es kann für L(+)-LDH oder für D(–)-LDH codieren. Alternativ können beide Typen an LDH-Genen simultan exprimiert werden. Ferner kann jede natürliche oder synthetische Variante der LDH DNA-Sequenzen, jede DNA- Sequenz mit hoher Identität zu einem Wildtyp LDH-Gen und jede DNA-Sequenz, welche die normale LDH-Aktivitiät ergänzt, verwendet werden.
Als Transportergen kann zum Beispiel das JEN1-Gen, welches für den Lactattransporter von S. cerevisiae codiert, verwendet werden.
Die Transformation der Hefestämme kann entweder mit integrativen oder replikativen Vektoren, linear oder plasmidiär, durchgeführt werden.
Die rekombinanten Zellen nach der Erfindung können durch jedes Verfahren erzielt werden, welches die Einführung einer fremden DNA in eine Zelle erlaubt (Spencer Jf, et al., Journal of Basic Microbiology 28(5): 321–333, 1988), zum Beispiel Transformation, Elektroporation, Konjugation, Fusion von Protoplasten oder jede andere bekannte Technik. Hinsichtlich der Transformation sind verschiedene Protokolle beschrieben: Insbesondere kann die Transformation durchgeführt werden durch die Behandlung von ganzen Zellen in Gegenwart von Lithiumacetat und von Polyethylenglycol gemäß Ito H. et al. (J. Bacteriol., 153: 163, 1983), oder in Gegenwart von Ethylenglycol und Dimethylsulfoxid gemäß Durrens P. et al. (Curr. Genet., 18: 7, 1990). Ein alternatives Protokoll ist beschrieben in der EP 361 991 . Die Elektroporation kann durchgeführt werden gemäß Becker D. M. und Guarente L. (Methods in Enzymology, 194: 18, 1991).
Die Verwendung von nicht-bakteriellen integrativen Vektoren kann bevorzugt sein, wenn am Ende des Fermentationsverfahrens die Hefebiomasse als Futterhefe oder für andere Züchtungszwecke, landwirtschaftliche Zwecke oder Ernährungszwecke verwendet wird.
Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante DNA Teil eines Expressionsplasmides, das autonom oder integrativ replizieren kann.
Insbesondere für S. cerevisiae und K. lactis können autonome Replikationsvektoren unter Verwendung von autonomen Replikationssequenzen in dem ausgewählten Wirt erzielt werden. Insbesondere in Hefen können sie Replikationsstartpunkte sein, die von Plasmiden (2 μ, pKD1, etc.) oder sogar von chromosomalen Sequenzen (ARS) abstammen.
Die integrativen Vektoren können unter Verwendung von homologen DNA-Sequenzen in bestimmten Regionen des Wirtgenoms erzielt werden, was eine Integration des Vektors durch homologe Rekombination erlaubt.
Genetische Werkzeuge für die Genexpression sind für S. cerevisiae gut entwickelt und beschrieben in Romanos, M. A. et al., Yeast, 8: 423, 1992. Genetische Werkzeuge sind auch entwickelt worden, um die Verwendung der Hefearten Kluyveromyces und Torulaspora als Wirtszellen für die Herstellung von rekombinanten Proteinen zu ermöglichen (Spencer Jf, et al., supra; Reiser J. et al., Advances in Biochemical Engineering-Biotechnology. 43, 75–102, 1990). Einige Beispiele für autonom in K. lactis replizierende Vektoren wurden berichtet, entweder auf Basis des linearen Plasmides pKG1 von K. lactis (de Lovencourt L. et al., J. Bacteriol., 154: 737, 1982), oder eine chromosomale Sequenz von K. lactis selbst (KARS) enthaltend, was dem Vektor die Fähigkeit zur Selbstreplikation und korrekten Segregation verleiht (Das S., Hollenberg C. P., Curr. Genet., 6: 123, 1982). Ferner erlaubt die Erkennung eines 2 μ-ähnlichen Plasmides nativ zu K. drosophilarum (Plasmid pKD1 – US 5 166 070 ) ein sehr effizientes Wirts/Vektor-System für die Herstellung von herzustellenden, rekombinanten Proteinen (EP-A-361991). Rekombinante Vektoren auf Basis von pKD1 enthalten die gesamte Originalsequenz, die mit geeigneten Hefe- und Bakterienmarkern fusioniert ist. Alternativ ist es möglich, einen Teil von pKD1 mit bekannten S. cerevisiae Expressionsvektoren (Romanos M. A. et al. Yeast, 8: 423, 1992) (Chen et al., Curr. Genet. 16: 95, 1989) zu kombinieren.
Es ist bekannt, dass das 2 μ Plasmid von S. cerevisiae in Torulaspora repliziert und stabil erhalten werden kann. In dieser Hefe wurde die Expression von heterologen Proteinen durch ein Co-Transformationsverfahren erzielt, d.h., die gleichzeitige Anwesenheit eines Expressionsvektors für S. cerevisiae und das gesamte 2 μ Plasmid (Compagno C. et al., Mol. Microb., 3: 1003–1010, 1989). Als Ergebnis der inter- und intramolekularen Rekombinationen ist es möglich, ein Hybridplasmid zu isolieren, welches die komplette 2 μ Sequenz und das heterologe Gen trägt. Solch ein Plasmid ist im Prinzip in der Lage, Torulaspora direkt zu transformieren.
Ferner wurde auch ein episomales Plasmid auf Basis einer S. cerevisiae ARS1 Sequenz beschrieben, wobei aber die Stabilität dieses Plasmides sehr klein ist, Compagno et al. (supra).
Vor kurzem wurde ein endogenes, 2 μ ähnliches Plasmid mit dem Namen pTD1 in Torulaspora (Blaisonneau J. et al., Plasmid, 38: 202–209, 1997) isoliert. Die für S. cerevisiae verfügbaren genetischen Werkzeuge können auf das neue Plasmid transferiert werden, wodurch Expressionsvektoren erzielt werden, die Torulaspora-Hefearten zugeordnet sind.
Genetische Marker für die Hefetorulaspora umfassen zum Beispiel URA3 (Watanabe Y. et al., FEMS Microb. Letters, 145: 415–420, 1996), G418 Resistenz (Compagno C. et al., Mol. Microb., 3: 1003–1010, 1989) und Cicloheximid-Resistenz (Nakata K. et Okamura K., Biosc. Biotechnol. Biochem., 60: 1686–1689, 1996).
2 μ ähnliche Plasmide von Zygosaccharomyces-Arten sind bekannt und wurden isoliert in Z. rouxii (pSR1), in Z. bisporus (pSB3), in Z. fermentati (pSM1) und in Z. bailii (pSB2) (Spencer JF. et al., supra).
Das Plasmid pSR1 ist das am besten bekannte Plasmid: Es repliziert in S. cerevisiae, aber 2 μ ARS wird nicht erkannt in Z. rouxii (Araki H. und Hoshima Y., J. Mol. Biol., 207: 757–769, 1989).
Episomale Vektoren auf Basis von S. cerevisiae ARS1 sind beschrieben für Z. rouxii (Araki et al., Mol Gen. Genet., 238: 120–128, 1993).
Ein selektiver Marker für Zygosaccharomyces ist das Gen APT1, was das Wachstum in Medien erlaubt, die G418 enthalten (Ogawa et al., Agric. Biol. Chem., 54: 2521–2529, 1990).
Jeder Hefepromoter, induzierbar oder konstitutiv, kann gemäß der Erfindung verwendet werden. Promotoren, die für die Expression von Proteinen in S. cerevisiae verwendet werden, sind gut beschrieben von Romanos et al. (supra). Promotoren, die im Allgemeinen bei Fremdproteinexpression in K. lactis verwendet werden, sind S. cerevisiae PGK und PH05 (Romanos et al., supra), oder homologe Promotoren, wie LAC4 (van den Berg J. A. et al., BioTechnology, 8: 135, 1990) und K1DC ( US 5 631 143 ). Der Promoter von den Pyrovatdecarboxylase-Genen von K. lactis (K1PDC) ist besonders bevorzugt.
Vektoren für die Expression von heterologen Genen, die besonders effizient für die Transformation von Kluyveromyces lactis-Stämmen sind, sind offenbart in US 5 166 070 , die hier durch Verweis eingeführt ist.
Pyruvatdecarboxylase-Genpromotoren, vorzugsweise von Kluyveromyces-Arten und mehr bevorzugt von Kluyveromyces lactis, offenbart in Molecular Microbiol. 19(1), 27–36, 1996, sind besonders bevorzugt. Triosephosphatisomerase- und Alkoholdehydrogenase-Promotoren, vorzugsweise von Saccharomyces-Arten und mehr bevorzugt von Saccharomyces cerevisiae, sind auch bevorzugt (Romanos et al, supra).
Für die Herstellung von Milchsäure werden die Hefestämme gemäß der Erfindung in einem Medium kultiviert, das eine Kohlenstoffquelle und andere essentielle Nährstoffe enthält. Die Milchsäure wird bei einem pH von 7 oder weniger, vorzugsweise bei einem pH von 4,5 oder weniger, wobei ein pH von 3 oder weniger noch mehr bevorzugt ist, gewonnen. Da der pH des Kulturmediums reduziert wird, ist eine geringe Menge eines Neutralisationsmittels notwendig. Die Bildung des Lactatsalzes wird entsprechend reduziert und es ist somit anteilsmäßig eine geringere Regeneration der freien Säure notwendig, um die Milchsäure zu gewinnen. Der Gewinnungsprozess kann nach einem der bekannten Verfahren durchgeführt werden (T. B. Vickroy, Band 3, Abschnitt 38 in „Comprehensive Biotechnology", (Hrsg: M. Moo-Young), Pergamon, Oxford, 1985) (R. Datta et al., FEMS Microbriology Reviews 16, 221–231, 1995). Die Mikroorganismen werden in typischer Weise durch Filtration oder Zentrifugation vor der Milchsäuregewinnung entfernt. Bekannte Verfahren für die Gewinnung der Milchsäure umfassen zum Beispiel die Extraktion der Milchsäure in eine nicht-lösliche Lösungsmittelphase oder die Destillation der Milchsäure oder eines Esters davon. Höhere Ausbeuten hinsichtlich der Kohlenstoffquelle (g Milchsäure/g Glucoseverbrauch) und höhere Produktivitäten (g Milchsäure/L/Std.) werden durch das Wachstum von Hefestämmen, insbesondere Saccharomyces-Stämmen, in Medien erzielt, denen Mg⁺⁺ und Zn⁺⁺-Ionen fehlen oder eine reduzierte Verfügbarkeit an diesen Ionen besitzen. Die Kulturmedien werden vorzugsweise weniger als 5 mM von Mg⁺⁺ und/oder weniger als 0,02 mM von Zn⁺⁺ enthalten.
Die vorliegende Erfindung bietet die folgenden Vorteile bei der Produktion von Milchsäure:

1. Wenn die Fermentation bei einem pH von 4,5 oder weniger durchgeführt wird, ist die Gefahr einer Kontamination durch fremde Mikroorganismen im Vergleich zu einem konventionellen Verfahren geringer. Ferner kann die Fermentationsvorrichtung vereinfacht und die Fermentationskontrolle erleichtert werden.
2. Da weniger Neutralisationsmittel dem Kulturmedium für die Neutralisation zugesetzt wird, gibt es eine entsprechend geringere Notwendigkeit, mineralische Säuren oder andere regenerierende Mittel für die Umwandlung des Lactatsalzes in die freie Milchsäure zu verwenden. Somit können die Produktionskosten reduziert werden.
3. Da weniger Neutralisationsmittel dem Kulturmedium zugesetzt wird, ist die Viskosität des Kulturmediums reduziert. Somit kann das Kulturmedium einfacher verarbeitet werden.
4. Die gemäß der vorliegenden Erfindung abgetrennten Zellen können als Samen-Mikroorganismen für eine frische Milchsäurefermentation wieder benutzt werden.
5. Die Zellen können während der Milchsäurefermentation gemäß de vorliegenden Erfindung kontinuierlich abgetrennt und gewonnen werden, wodurch die Fermentation kontinuierlich durchgeführt werden kann.
6. Da den rekombinanten Hefestämmen ein Ethanolherstellungsvermögen und eine Pyruvatdehyrogenase-Aktivität fehlt oder jeweils eine reduzierte Ethanolproduktion und eine reduzierte Pyruvatdehydrogenase-Aktivität besitzen, kann die Herstellung der Milchsäure mit einer höheren Ausbeute durchgeführt werden im Vergleich zu Hefestämmen, die beide Wildtypeigenschaften zur Herstellung von Ethanol und für die Verwendung von Pyruvat durch die Mitochondrien aufweisen.
7. Die Herstellung von Milchsäure durch metabolisch modifizierte, nicht-konventionelle Hefen, die zu den Kluyveromyces-, Torulaspora- und Zygosaccharomyces-Arten gehören, kann mit nicht-konventionellen Kohlenstoffquellen (d.h., Galactose, Lactose, Saccharose, Raffinose, Maltose, Cellobiose, Arabinose, Xylose, um einige Beispiele zu nennen) erzielt werden, wobei die Zellen in einem Hochzuckermedium wachsen und die Zellen in Gegenwart einer hohen Konzentration von Milchsäure wachsen.

1. Die Klonierung des Milchsäuredehydrogenase-Gens verändert den glycolytischen Fluss in Richtung zur Herstellung von Milchsäure.
Die wichtigsten enzymatischen Reaktionen an dem Pyruvat-Verzweigungspunkt werden durch die folgenden Enzyme katalysiert: (1): Pyruvatdecarboxylase; (2): Alkoholdehydrogenase; (3): Acetaldehyddehydrogenase; (4): Acetyl-CoA-Synthetase; (5): Acetyl-CoA Shuttle von dem Cytosol zu den Mitochondrien; (6): Acetyl-CoA Shuttle von den Mitochondrien zu dem Cytosol; (7): heterologe Milchsäuredehydrogenase; (8): Pyruvatdehydrogenase. Die enzymatischen Reaktionen, die bei anaplerotischen Synthesen beteiligt sind, wurden weggelassen.
2. Diagramm des Plasmides pVC1.
3A, 3B. Diagramm der Plasmide pKSMD8/7 und pKSEXH/16.
4. Diagramm des Plasmides pEPL2.
5. Diagramm des Plasmides pLC5.
6. Diagramm des Plasmides pLAT-ADH.
7A. L(+)-Milchsäure-Produktion von dem transformierten Kluyveromyces lactis PM6-7a(pEPL2) während des Wachstums auf Medien mit Glu-YNB Basis. Die restliche Glucosekonzentration bei T = 49 war nicht nachweisbar. Die Herstellung von D(–)-Milchsäure war ebenfalls nicht nachweisbar. Die spezifische LDH-Aktivität war größer als 3 U/mg des Gesamtzellproteins während des gesamten Experimentes.
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt unter Verwendung des bakteriellen L. casei LDH (Daten nicht gezeigt).
(Δ) Zellen/ml; (–) pH-Wert; (o) Ethanolproduktion, g/l
(☐) L(+)-Milchsäureproduktion, g/l
7B. L(+)-Milchsäure-Produktion von dem transformierten Kluyveromyces lactis PM6-7a(pEPL2) während dem Wachstum auf Medien, die auf Glu-YNB basierten. Das Medium war zum Zeitpunkt T = 0 (pH = 5,6) unter Verwendung von 200 mM Phosphatpuffer gepuffert. In dieser Charge nahm der pH-Wert viel später ab als während der Charge, die in der 7A gezeigt ist. Die restliche Glucosekonzentration zum Zeitpunkt T = 49 war nicht nachweisbar. Die spezifische LDH-Aktivität war größer als 3 U/mg des Gesamtzellproteins während des gesamten Experimentes.
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt unter Verwendung der bakteriellen L. casei LDH (Daten nicht gezeigt).
(Δ) Zellen/ml; (–) pH-Wert; (o) Ethanolproduktion, g/l
(☐) L(+)-Milchsäureproduktion, g/l
8A. L(+)-Milchsäure-Produktion von dem transformierten Kluyveromyces lactis PM1/C1 (pEPL2) während dem Wachstum auf Medien, die auf Glu-YNB basierten. Die restliche Glucosekonzentration zum Zeitpunkt T = 60 war 12,01 g/l. Längere Inkubationszeiten führten nicht zu erhöhten Produktionen der Biomasse und der L(+)-Milchsäure. Die spezifische LDH-Aktivität war über das gesamte Experiment größer als 3 U/mg Gesamtzellprotein.
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt unter Verwendung der bakteriellen L. casei LDH (Daten nicht gezeigt).
(Δ) Zellen/ml; (–) pH-Wert; (o) Ethanolproduktion, g/l
(☐) L(+)-Milchsäureherstellung, g/l
8B. L(+)-Milchsäure-Produktion von dem transformierten Kluyveromyces lactis PM1/C1(pEPL2) während des Wachstums auf Medien, die auf Glu-YNB basierten. Das Medium war zum Zeitpunkt T = 0 (pH = 5,6) unter Verwendung von 200 mM Phosphatpuffer gepuffert. Bei dieser Charge nahm der pH-Wert später ab als während der Charge, die in 8A gezeigt ist. Die restliche Glucosekonzentration zum Zeitpunkt T = 87 war Null. Die spezifische LDH-Aktivität war über das Experiment größer als 3 U/mg Gesamtzellprotein.
(Δ) Zellen/ml; (–) pH-Wert; (o) Ethanolproduktion, g/l
(☐) L(+)-Milchsäureherstellung, g/l
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt unter Verwendung der bakteriellen L. casei LDH (Daten nicht gezeigt).
9A. L(+)-Milchsäure-Produktion von transformierten Kluyveromyces BM3-12D[pLAZ10] Zellen in einem gerührten Bioreaktortank (siehe auch Text).
(Δ) Zellen/ml; (o) Glucosekonzentration g/l
(☐) L(+)-Milchsäureproduktion, g/l
9B. L(+)-Milchsäure-Ausbeute von transformierten Kluyveromyces BM3-12D[pLAZ10] Zellen in einem gerührten Bioreaktortank.
Glucose versus Milchsäure-Produktion. Die Ausbeute (g/g) betrug 85,46%.
10. L(+)-Milchsäureproduktion von transformierten Torulaspora (syn. Zygosaccharomyces) delbrueckii CBS817[pLAT-ADH] während des Wachstums auf Medien, die auf Glu-YNB basierten. Die Restglucosekonzentration zum Zeitpunkt T = 130 betrug 3 g/L. Längere Inkubationszeiten führten zu keiner höheren Produktion an Biomasse und der L(+)-Milchsäure. Die spezifische LDH-Aktivität war über das gesamte Experiment größer als 0,5 U/mg Gesamtzellprotein.
(Δ) Zellen/ml; (–) pH-Wert; (o) Ethanolproduktion, g/l
(☐) L(+)-Milchsäureproduktion, g/l
11. L(+)-Milchsäure-Produktion von dem transformierten Zygosaccharomyces bailii ATCC60463[pLAT-ADH] während des Wachstums auf Medien, die auf Glu-YNB basierten. Die restliche Glucosekonzentration zum Zeitpunkt T = 60 betrug 8 g/L. Längere Inkubationszeiten führten nicht zu höheren Produktionen an Biomasse und L(+)-Milchsäure. Die spezifische LDH-Aktivität war über das gesamte Experiment größer als 0,5 U/mg Gesamtzellprotein. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt unter Verwendung eines anderen Stammes (ATCC36947, Daten nicht gezeigt).
(Δ) Zellen/ml; (–) pH-Wert; (o) Ethanolproduktion, g/l
(☐) L(+)Milchsäureproduktion, g/l
Definitionen
Die folgenden Definitionen werden mit dem Ziel bereitgestellt, damit die Fachleute die detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung verstehen können.
„Amplifikation" bezieht sich auf das Ansteigen der Zahl an Kopien eines gewünschten Nukleinsäuremoleküls.
„Codon" bezieht sich auf eine Sequenz von drei Nukleotiden, die eine bestimmte Aminosäure spezifizieren.
„Deletion" bezieht sich auf eine Mutation, wo ein oder mehrere Nukleotide aus einer Nukleinsäuresequenz entfernt sind.
„DNA-Ligase" bezieht sich auf ein Enzym, das zwei Stücke einer doppelsträngigen DNA kovalent miteinander verbindet.
„Elektroporation" bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung von Fremd-DNA in Zellen, wobei eine kurze Hochvolt-Gleichstromentladung verwendet wird, um die Wirtszellen zu permeabilisieren, wodurch diese extra chromosomale DNA aufnehmen können.
Der Ausdruck „endogen" bezieht sich auf Materialien, die vom Innern eines Organismus oder einer Zelle abstammen.
„Endonuklease" bezieht sich auf ein Enzym, das doppelsträngige DNA an internen Stellen hydrolysiert.
Der Ausdruck „Expression" bezieht sich auf die Transkription eines Gens zur Herstellung der entsprechenden mRNA und die Translation dieser mRNA zur Herstellung des entsprechenden Genproduktes, d.h. ein Peptid, Polypeptid oder Protein.
Der Ausdruck „Expression von Antisens-RNA" bezieht sich auf die Transkription einer DNA zur Herstellung eines ersten RNA-Moleküls, das mit einem zweiten RNA-Molekül hybridisieren kann, welches für ein Genprodukt, zum Beispiel ein Protein, codiert. Die Bildung des RNA-RNA Hybrids hemmt die Translation des zweiten RNA-Moleküls zur Herstellung des Genproduktes.
Der Ausdruck „funktional verbunden" bezieht sich auf einen Promoter oder eine Promoterregion und eine codierende oder strukturelle Sequenz in solch einer Anordnung und Entfernung, dass die Transkription der codierenden oder strukturellen Sequenz direkt durch den Promoter oder die Promoterregion gesteuert wird.
Der Ausdruck „Gen" bezieht sich auf chromosomale DNA, Plasmid-DNA, cDNA, synthetische DNA oder andere DNA, die für ein Peptid, Polypeptid, Protein oder RNA-Molekül codiert, sowie auf Regionen, welche die codierende Sequenz flankieren und bei der Regulation der Expression eine Rolle spielen.
Der Ausdruck „Genom" umfasst sowohl das Chromosom wie auch die Plasmide innerhalb einer Wirtszelle. Codierende DNAs gemäß der vorliegenden Erfindung, die in Wirtszellen eingeführt ist, kann somit chromosomal-integriert oder plasmid-lokalisiert sein.
„Heterologe DNA" bezieht sich auf DNA von einer Quelle, die von der einer Empfangszelle verschieden ist.
„Homologe DNA" bezieht sich auf DNA aus der gleichen Quelle wie die der Empfangszelle.
„Hybridisierung" bezieht sich auf die Fähigkeit eines Stranges von Nukleinsäure sich mit einem komplementären Strang über Basenpaarung miteinander zu verbinden. Die Hybridisierung geschieht, wenn komplementäre Sequenzen in den zwei Nukleinsäuresträngen aneinander binden.
„Milchsäuredehydrogenase" (LDH) bezieht sich auf ein Protein, welches die Umwandlung von Pyruvat und NADH zu Milchsäure und NAD⁺ katalysiert. L(+)-LDH produziert L(+)-Milchsäure und D(–)-LDH produziert D(–)-Milchsäure.
Der Ausdruck „Lactattransporter" bezieht sich auf ein Protein, welches den Transport von Lactat von innen nach außen einer Zelle ermöglicht.
„Mutation" bezieht sich auf jede Veränderung oder Wechsel in einer Nukleinsäuresequenz. Es existieren verschiedene Typen, einschließlich der Punktmutation, Leserahmenmutation und Splicing. Die Mutation kann spezifisch durchgeführt werden (zum Beispiel ortsgerichtete Mutagenese) oder zufällig (zum Beispiel mit chemischen Mitteln, Passage durch bakterielle Stämme ohne Reparatur).
Nukleinsäure-Bezeichnungen: A = Adenosin; C = Cytosin; G = Guanosin; T = Thymidin; N = äquimolar A, C, G und T; I = Deoxyinosin; K = äquimolar G und T; R = äquimolar A und G; S = äquimolar C und G; W = äquimolar A und T; Y = äquimolar C und T.
„Offenes Leseraster (ORF)" bezieht sich auf eine Region der DNA oder der RNA, die für ein Peptid, Polypeptid oder Protein codiert.
„Pyruvatdecarboxylase" (PDC) bezieht sich auf ein Protein, das die Umwandlung von Pyruvat zu Acetaldehyd katalysiert.
„Pyruvatdehydrogenase" (PDH) bezieht sich auf einen Proteinkomplex, der die Umwandlung von Pyruvat zu Acetyl-CoA katalysiert.
„Plasmid" bezieht sich auf ein zirkuläres, extrachromosomales, selbstreplizierendes Stück von DNA.
„Punktmutation" bezieht sich auf eine Veränderung eines einzelnen Nukleotides in einer Nukleinsäuresequenz.
„Polymerase-Kettenreaktion (PCR)" bezieht sich auf eine enzymatische Technik zur Erzeugung von mehreren Kopien einer Sequenz einer Nukleinsäure. Die Kopien der DNA-Sequenz werden hergestellt durch Pendeln einer DNA-Polymerase zwischen zwei Amplimern. Die Basis von dieser Amplifizierungsmethode sind mehrere Kreisläufe mit Temperaturwechsel für die Denaturierung und anschließendes Wiederverbinden der Amplimeren, gefolgt von einer Verlängerung zur Synthese von neuen DNA-Strängen in der Region, die zwischen den flankierenden Amplimeren angeordnet sind.
Der Ausdruck „Promoter" oder „Promoterregion" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die Elemente umfasst, welche die Herstellung von Boten-RNA (mRNA) steuert, in dem die Erkennungsstellen für die RNA-Polymerase und/oder andere Faktoren, die für den Start der Transkription an der korrekten Stelle notwendig sind, bereitgestellt werden.
Eine „rekombinante Zelle" oder „transformierte Zelle" ist eine Zelle, deren DNA durch die Einführung eines exogenen Nukleinsäuremoleküls in diese Zelle verändert worden ist.
Der Ausdruck „rekombinantes DNA-Konstrukt" oder „rekombinanter Vektor" bezieht sich auf jedes Mittel, wie ein Plasmid, Cosmid, Virus, autonom replizierende Sequenz, Phage oder lineare oder zirkuläre, einzelsträngige oder doppelsträngige DNA-oder RNA-Nukleotidsequenz, die von jeder Quelle abstammt und die zur genomischen Integration oder autonomen Replikation in der Lage ist und die ein DNA-Molekül umfasst, in dem eine oder mehrere DNA-Sequenzen in einer funktional operativen Weise miteinander verbunden sind. Solche rekombinanten DNA-Konstrukte oder Vektoren sind fähig zur Einführung einer 5' regulatorischen Sequenz oder Promotorregion und einer DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt in eine Zelle und zwar in solch einer Weise, dass die DNA-Sequenz in eine funktionale mRNA transkribiert wird, die dann ihrerseits translatiert und somit exprimiert wird. Rekombinante DNA-Konstrukte oder rekombinante Vektoren können alternativ hergestellt sein, um Antisense RNAs zu exprimieren für die Hemmung der Translation einer spezifischen RNA von Interesse.
„Reduzierte (enzymatische) Aktivität" bezieht sich auf eine geringere gemessene enzymatische Aktivität, isoliert aus einem transformierten oder mutagenisierten Stamm, im Vergleich zu der gemessenen enzymatischen Aktivität, die aus einem Wildtypstamm der gleichen Spezies isoliert wurde. Reduzierte enzymatische Aktivität kann das Ergebnis einer reduzierten Konzentration des Enzyms, einer reduzierten spezifischen Aktivität des Enzyms oder einer Kombination davon sein.
„Reparatur- Minus" oder „reparaturdefiziente" Stämme beziehen sich auf Organismen, die reduzierte oder eliminierte DNA-Reparaturstoffwechselwege besitzen. Solche Stämme zeigen erhöhte Mutationsraten im Vergleich zu den Raten der Wildtypstämme der gleichen Spezies. Eine Vermehrung der Nukleinsäuresequenz über einen Reparatur-Minus-Stamm führt zur Einlagerung von zufälligen Mutationen über die Nukleinsäuresequenz.
„Restriktionsenzym" bezieht sich auf ein Enzym, das eine spezifische palindromische Sequenz an Nukleotiden in doppelsträngiger DNA erkennt und beide Stränge schneidet, auch Restriktionsendonuklease genannt. Das Schneiden passiert typischerweise innerhalb der Restriktionsstelle.
„Selektierbare Marker" bezieht sich auf eine Nukleinsäuresequenz, deren Expression zu einem Genotyp führt, was die Identifikation von Zellen mit der Nukleinsäuresequenz erleichtert. Selektierbare Marker umfassen solche, die eine Resistenz gegenüber toxischen Chemikalien verleihen (zum Beispiel Ampicillinresistenz, Kanamycinresistenz), ein Nährstoffdefizit komplementieren (zum Beispiel Uracil, Histidin, Leucin) oder eine visuell unterscheidbare Eigenschaft verleihen (zum Beispiel Farbwechsel, Fluoreszenz).
„Transkription" bezieht sich auf ein Verfahren der Herstellung einer RNA-Kopie von einem DNA-Template.
„Transformation" bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung einer exogenen Nukleinsäuresequenz (zum Beispiel ein Vektor, ein Plasmid, ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül) in eine Zelle, in der diese exogene Nukleinsäure in das Chromosom eingelagert wird oder zur autonomen Replikation in der Lage ist.
„Translation" bezieht sich auf die Herstellung von Protein aus Boten-RNA.
Der Ausdruck „Ausbeute" bezieht sich auf die Menge an hergestellter Milchsäure (g/L) dividiert durch die Menge der verbrauchten Glucose (g/L).
„Einheit" eines Enzyms bezieht sich auf die enzymatische Aktivität und zeigt die Menge an Mikromolen des umgewandelten Substrates pro mg Gesamtzellprotein pro Minute an.
„Vektor" bezieht sich auf ein Plasmid, Cosmid, einen Bakteriophagen oder ein Virus, welches eine Nukleinsäuresequenz in einen Wirtsorganismus einbringt.
Ortsgerichtete Mutagenese des Rind-Milchsäuredehydrogenase-Gens LDH-A
Um von der vollständigen cDNA die codierende Sequenz des Rinderenzyms LDH-A (EC 1.1.1.27) zu isolieren, wurde eine klassische ortsgerichtete Mutagenese durchgeführt (J. Biol. Chem. 253: 6551, 1978, Meth. Enzymol. 154: 329, 1987). Eine ortsgerichtete Mutagenese auf Oligonukleotidbasis basiert auf der in vitro Hybridisierung eines einzelsträngigen DNA-Fragmentes mit einem synthetischen Oligonukleotid, das komplementär zu dem DNA-Fragment ist mit Ausnahme einer zentralen fehlpaarenden Region gemäß der DNA-Sequenz, die mutagenisiert werden soll.
Um eine XbaI Restriktionsenzym-Stelle 11 Basenpaare vor das ATG Codon einzuführen, wurde 1743 Basenpaare Rinder-LDH cDNA kloniert aus dem Plasmid pLDH12 (Ishiguro et al., Gene, 91 281–285, 1991) durch Verdau mit EcoRI und HindIII Restriktionsenzymen (New England Biolabs, Beverly, MA). Das isolierte DNA-Fragment wurde dann isoliert in dem pALTER-1 (Promega, Cat # 96210; lot # 48645, 1996)-Expressionsvektor.
Dieser Vektor enthält M13 und R408 Bakteriophagen-Replikationsstartpunkte und zwei Gene für Antibiotikaresistenz. Eines von diesen Genen für die Tetracyclinresistenz ist funktional. Das andere Gen (d.h., Ampicillinresistenz) wurde inaktiviert. Ein Oligonukleotid wird bereitgestellt, welches die Ampicillinresistenz auf dem Mutantenstrang während der Mutagenesereaktion (oligoAMP; Promega, Madison,. WI Tab. 1) wiederherstellt. Dieses Oligonukleotid wird mit dem einzelsträngigen DNA (ssDNA) Template verschmolzen. Zur gleichen Zeit wird das mutagene Oligonukleotid (oligoLDH, Madison WI) auch verbunden. Nach DNA-Synthese und Ligation wird die DNA in einen Reparatur-Minus-Stamm von E. coli (BMH 71–18 mutS; Kit Promega) transformiert. Die Selektion wurde durchgeführt auf LB + Ampicillin (Molecular Cloning, A laboratory manual, herausgegeben von Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). Eine zweite Runde der Transformation in JM 109 (Kit Promega) E. coli Stamm stellte eine geeignete Segregation der Mutanten- und Wildtyp-Plasmide sicher.

OLIGONUKLEOTIDE SEQUENZ

OligoAMP (Sequenz Id. Nr. 1) 5'-GTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTG-3'

OligoLDH (Sequenz Id. Nr. 2) 5'-CCTTTAGGGTCTAGATCCAAGATGGCAAC-3'
Tabelle 1: Nukleotidsequenz der für die ortsgerichtete Mutagenese verwendeteten, synthetischen Oligonukleotide. Die unterstrichene Sequenz in Oligo LDH zeigt die XbaI Restriktionsstelle, die durch Mutagenese eingeführt wurde.
Weitere Details der Technik und der verwendeten Materialien (mit Ausnahme von oligoLDH) sind in dem Datenblatt des Kits dargestellt.
Das erzielte Plasmid, das die mutierte cDNA für die Rinder-LDH enthielt, wurde als pVC1 (2) bezeichnet.
PCR-Mutagenese des bakteriellen Milchsäuredehydroaenase-Gens (LDH) aus Lactobacillus casei, Bacillus megaterium und Bacillus stearothermophylus.
Das ursprüngliche Startcodon (GTG) von Lactobacillus casei LDH Gens (GTG) (die LDH Sequenz ist verfügbar unter der Hinterlegungsnummer M76708 bei „Gen Bank Sequence Database", bereitgestellt von National Center of Biotechnology-NCBI-, Web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) wird von S. cerevisiae nicht korrekt erkannt. Wir erhielten das Plasmid pST2 und die LDH-Sequenz von Hutkins Robert, University of Nebraska, USA). PST2 basiert auf dem pUC19 Vektor (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, Cat. 885827) und enthält ein BamHI-SphI LDH-cDNA Fragment, amplifiziert mit L. casei 686 (Kultursammlung der University of Nebraska).
Um eine codierende Sequenz zu erzielen, die mit dem normalen eukaryontischen ersten Codon (d.h., ATG) beginnt, wurde die LDH-Sequenz über PCR mutagenisiert.
Die Einführung einer NcoI Restriktionsenzymstelle an der Position 163 der LDH-Sequenz (Hinterlegungsnummer M76708 der GenBAnk Sequence Database, supra) erlaubt die gleichzeitige Veränderung des ursprünglichen GTG Codons in ATG. PCR Reaktion (Mastercycler 5330, Eppendorf, Hamburg, Germany) wurde durchgeführt durch Start mit dem Plasmid pLC1, basierend auf pGEM7Z f(+) (Promega Corporation, Madison WI, USA, Cat. P2251) Vektor, welcher das L. casei Gen enthält (Fragment BamHI-SphI, ausgeschnitten von pST2). Die Sequenzen der als Primer für die Reaktion verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 2 dargestellt.
Amplifizierungskreislauf:
Am Ende der Reaktion wurde ein einzelnes Band entsprechend dem amplifizierten und mutierten Gen isoliert. Das DNA-Fragment wurde dann inseriert an der EcoRV Stelle von pMOSBlue (Amersham Life Science, Buckingamshire, England; cod. RPN5110) Klonierungsvektor mit einer Blunt-end-Ligation, was zu dem pLC3 Plasmid führte.
Jedes andere Mutageneseprotokoll kann analog verwendet werden. Tabelle 2

OLIGONUKLEOTIDE SEQUENZ

Oligo ATG (Sequenz Id. Nr. 3) 5'-CCATGGCAAGTATTACGGATAAGGATC-3'

Oligo ANTISENSE (Sequenz Id. Nr. 4) 5'-CTATCACTGCAGGGTTTCGATGTC-3'
Tabelle 2: Nukleotidsequenz der synthetischen Oligonukleotide, die für die PCR-Amplifikation verwendet wurden. Die unterstrichenen Sequenzen in dem oligoATG zeigt die NcoI Restriktionsstelle, die durch Mutagenese eingeführt wurde, und das erzielte ATG Startcodon.
Gemäß einem klassischen PCR-Verfahren klonierten wir auch die L(+) LDH-Gene der Bakterien Bacillus megaterium und Bacillus stearothermophylus (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1391) (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1167) (die DNA-Sequenz ist auch verfügbar unter den Hinterlegungsnummern M22305 und M19396 von der Genbank Sequence Database, bereitgestellt durch das National Center of Biotechnology-NCBI-Web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) in die Expressionsvektoren für die Hefe S. cerevisiae (d.h., pBME2 beziehungsweise pBST2, siehe unten).
Konstruktion des replikativen pEPL2 Vektors, der den K1PDCA Promotor und Rinder-LDH cDNA enthält.
Der K1PDCA Promotor und die codierende Sequenz wurden subkloniert als ein 4 Kbp HindIII Fragment aus einem K. lactis genomischen Bibliotheksklon, der die rag 6 Mutation von K. lactis (Bianchi et al., Mol. Microbiol., 19: 27–36, 1996) komplementiert. Die Promotorregion wurde in SalI und XbaI Stellen des Vektors pBleuscript II KS (Stratagene, LaJolla, Ca # 212205) mit T4 DNA Lipase unter Verwendung von molekularen Standardklonierungsverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning, supra) subkloniert. Die Rinder-LDH-Sequenz, die als ein XbaI-HindIII Fragment von 1675 Basenpaaren aus dem pVC1 Vektor isoliert wurde, wurde in die entsprechenden Klonierungsstellen des Vektors pBleuscript II KS. GM82 E. coli Stamm (dam^– dcm^–) (verfügbar von ATCC- oder CGSC-Sammlungen) kloniert und mit zwei neuen Vektoren transformiert, die pKSMD8/7 bzw. pKSEXH/16 (3A und 3B) genannt wurden.
Der K1PDCA Promotor und die Rinder-LDH-Sequenz, isoliert als SalI-XbaI Fragmente von pKSMD8/7 bzw. pKSEXH/16, wurden in vitro mit T4 DNA Lipase bei Raumtemperatur in Gegenwart von SalI Endonuklease ligiert, um die Ligation an den XbaI Enden zu ermöglichen. Das Ligationsprodukt wurde in die SalI Klonierungsstellen des pE1 Vektors kloniert (Bianchi M. et al., Curr. Genet. 12: 185–192, 1987; Chen X. J. et al., Curr. Genet. 16: 95–98, 1989 und US # 5166070). Dieses Plasmid basiert auf dem integrativen Ylp5 Plasmid, welches den Saccharomyces cerevisiae genetischen Marker URA3 enthält, und auf dem pKD1 Plasmid (US # 5166070), das aus Kluyveromyces drosophilarum isoliert wurde. Das Plasmid pE1 hat eine funktionale Organisation, die ähnlich zu der S. cerevisiae 2 μ DNA ist, und ist in der Lage stabil in Kluyveromyces lactis Zellen (Chen X. J. et al., supra) zu replizieren. Der URA3 Marker auf dem Plasmid erlaubt die Komplementation der K. lactis uraA1-1 Mutation (de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154: 737–742 (1982)) und somit das Wachstum der transformierten Zellen in einem selektiven Medium ohne Uracil.
Der erzielte Vektor wurde pEPL2 (4) genannt und wurde verwendet, um E. coli DH5-alfa Stamm (Life Technologies Inc., Gaitherburg, MA) zu transformieren.
Konstruktion des replikativen pEPL4 Vektors, der den K1PDCA Promotor und das bakterielle LDH-Gen enthält.
Das für das pEPL2 Plasmid beschriebene LDH Gen vom Rind wurde mit der LDH DNA-Sequenz von dem bakteriellen Lactobacillus-Gen (siehe oben) substituiert gemäß den hier im Text beschriebenen, klassischen moleklaren Verfahren, was zu dem Plasmid pEPL4 führte. Transformierte K. lactis Hefezellen, welche die Rind- oder bakterielle LDH trugen, ergaben ähnliche Egebnisse
Konstruktion des replikativen pLAZ10 Vektors, der den K1PDCA Promotor und die Rinder-LDH cDNA enthält.
Der Vektor pLAZ10 wurde erzielt durch Klonierung des SalI Fragmentes von pEPL2, welches den K1PDC1 Promotor und die codierende Sequenz von Rinder-LDH trägt, in die einzelne SalI Stelle des Vektors p3K31. Der Vektor p3K31 besteht aus dem kommerziellen Vektor pUC19 und der G418 Resistenzkassette des Vektors pKan707 (Fleer et al. Bio/technology 9: 968–974, 1991), eingesetzt in die einzelne Stelle von Plasmid pKD1.
Konstruktion der integrativen pLC5, pLC7, pB1, pBM2, pBST2, pLC5-KanMX und pJEN1 Vektoren.
Das L. casei LDH-Gen wurde mit einem NcoI-SalI Schnitt aus pLC3 (oben beschrieben) geschnitten und in die integrativen pYX012 oder pYX022 Vektoren ligiert (R&D System Europe Ltd, Abingdon, England).
Die zwei erzielten Plasmide enthielten die mutierte DNA für das bakterielle LDH-Gen unter der Kontrolle des TPI Promotors und trugen die auxotrophen Marker URA3 oder HIS3. Diese zwei Plasmide wurden als pLC5 (5) und pLC7 bezeichnet. Für die Konstruktion von pB1, pBM2 und pBST2 wurde ein ähnliches Verfahren, wie jenes verwendet, das für die Konstruktion von pLC5 beschrieben ist. Wir verwendeten jedoch die Rinder-LDH, die B. megaterium LDH bzw. die B. stearothermophylus LDH (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1391) (Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 1987, 368: 1167). Das Plasmid pFA6a-KanMX (Wach et al, Yeast, 1994, 10: 1793–1808) wurde mit SacI und SmaI geschnitten und das erzielte Fragment wurde in einem pLC5 Schnitt mit den gleichen Enzymen ligiert, wobei sich das Plasmid pLC5-kanMX ergab. Auf dem Plasmid ist das LDH-Gen unter der Kontrolle des TPI Promotors.
Die DNA-Sequenz von JEN1 (die DNA-Sequenz ist verfügbar unter der Hinterlegungsnummer U24155 der Genbank Sequence Database, erhältlich von dem National Center of Biotechnology-NCBI-Web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), die für den Lactattransporter von S. cerevisiae (Davis E. S., Thesis, 1994, Laboratory of Eukaryotic Gene Expression, Advanced Bioscience Laboratories) (Davis, E. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (23), 11169, 1992) (Andre, B. Yeast (11), 1575, 1995), codiert, wurde von E. S. Davis (University of Maryland, USA) erhalten. Die JEN1 codierende Sequenz wurde mit einem klassischen PCR-Verfahren, das im Text beschrieben ist, amplifiziert und in das Plasmid PYX022 (siehe oben) cloniert. Auf dem integrativen Plasmid ist die JEN1 Überexpression unter der Kontrolle des TPI Promotors.
Konstruktion des replikativen pLAT-ADH Vektors, der den ADH1 Promotor und die cDNA von Rinder-LDH enthält.
Zunächst wurde das pLDH-Kan Plasmid hergestellt durch Klonieren des APT1 Gens, welches Geneticin (G418) Resistenz vermittelt, an der EcoRV Stelle von dem pBluescript II KS (Promega corporation, Madison WI, USA, Cat. 212208) Klonierungsvektor. Das Plasmid stammte von einem SmaI/EcoRV Verdau des pFA6-KanMX4 Vektors (Wach et al. Yeast 10: 1793–1808 (1994)).
Zweitens wurde die codierende Region des LDH-Gens vom Rind unter die Kontrolle des S. cerevisiae's ADH1 Promotor und Terminatorsequenzen kloniert durch Subklonierung eines XbaI/HindIII Fragmentes von dem zuvor beschriebenen pVC1 Plasmid in den pVT102-U Vektor (Vernet et al. Gene 52: 225–233 (1987)).
Schließlich wurde die gesamte Expressionskassette (ADH1 Promotor – LDH-Gen – ADH1 Terminator) mit einem SphI Verdau geschnitten und mit pLDH-Kan ligiert, linearisiert mit SphI, wodurch der pLAT-ADH Vektor (6) erzielt wurde.
Isolierung des K. lactis PMI/C1 Stammes
Die Deletion des K1PDCA Gens in dem PM6-7A Hefestamm (MAT a, adeT-600, uraA1-1) (Wesolowski et al., Yeast 1992, 8: 711) ergab den Stamm PMI. Die Deletion wurde durch Insertion des URA3 Markers von S. cerevisiae durchgeführt. Der Stamm PMI wuchs auf Glucoseenthaltendem Medium. Die PDC-Aktivität war nicht nachweisbar und der Stamm produzierte kein Ethanol (Bianchi M. M., et al., (1996), supra). Es ist wichtig hervorzuheben, dass die S. cerevisiae Zellen ohne jegliche nachweisbare PDC-Aktivität nicht auf Glucosemineralmedien wuchsen (Flikweert M. T. et al. Yeast, 12: 247–257, 1996).
1 × 10⁷–3 × 10⁷ Zellen von einer stationären Kultur von PMI Hefezellen wurden auf einem synthetischen Medium angeordnet, das 5-Fluororotsäure enthielt. Das Wachstum der Hefezellen in dem Medium mit 5-Fluorotsäure erlaubt die Selektion von Zellen mit beschädigter Uracilsynthese (McCusker und Davis, Yeast 7: 607–608 (1991)). Nach 5-tägiger Inkubation bei 28°C wurden einige ura- Mutanten isoliert. Eine der erzielten Mutanten, PMI/CI genannt, war in dem URA3 Gen mutiert, das zuvor durch integrative Transformation eingeführt worden war, wie es sich aus einem Komplementationstest durch Transformation ergab mit einem URA3 Gen enthaltenden Plasmid (Kep6 Vektor; Chen et al., J. Basic Microbiol. 28: 211–220 (1988)). Der Genotyp von PMI/C1 ist der folgende: MATa, adeT-600, uraA1-1, pdcA::ura3.
Isolierung von dem CENPK113ΔPDC1ΔPDC5ΔPDC6, CENPK113ΔPDC2 und GRF18UΔPDC2 Stamm.
Die allgemeine Strategie war zunächst Einzeldeletions-Mutanten von jedem der PDC-Gene zu erzeugen (PDC1, PDC2, PDC5 und PDC6). Die Gendeletionen wurden durchgeführt durch Integration einer loxP-Kan^SRD-loxP Kassette durch homologe Rekombination an der Stelle des entsprechenden PDC-Gens unter Verwendung des PCR-Verfahrens mit kurzer flankierender Homologie (SFH), beschrieben von Wach et al. (1994; Yeast 10, 1793–1808) und Güldener et al. (1996; Nucleic Acids Res. 24, 2519–2524). Anschließend wurde die Deletionskassette durch Expression der cre-Rekombinase entfernt, wodurch eine einzelne Kopie der loxP Stelle an den Deletionsplatz erzielt wurde. Die pdc1 pdc5 pdc6 Dreifach-Deletionsmutante wurde geschaffen durch aufeinanderfolgendes Kreuzen der einzelnen haploiden Deletionsstämme.
Die PCR-Reaktion wurde auf einem DNA-Template durchgeführt, dass das Gen für die Kanamycinresistenz enthielt (offener Leserahmen des E. coli Transposon Tn903), welches mit den Kontrollsequenzen (Promotor/Terminator) eines bestimmten Schwanniomyces occidentalis Gens (vertraulich) fusioniert war. Diese Selektionskassette wurde an beiden Enden flankiert von einer loxP Sequenz (loxP-Kan^SRD-loxP) und wurde entwickelt mit SRD (Scientific Research and Development GmbH). Der verwendete Primer zur Amplifikation der loxP-Kan^SRD-loxP Kassette war so aufgebaut, dass die DNA-Sequenz des Sense-Primers homolog zu dem 5'-Ende der Selektionskassettensequenz war und das der Primer zusätzlich an seinem 5'-Ende eine Region mit 40 Nukleotiden aufwies, die mit der 5'-terminalen Sequenz des bestimmten Saccharomyces cerevisiae PDC-Gens korrespondierte. Der Antisense-Primer wurde in einer analogen Weise hergestellt. Er ist komplementär zu dem 3'-Ende der Selektionskassette, wobei dieser Primer an seinem 5'-Ende eine Region von auch vorzugsweise 40 Nukleotiden enthält, die mit der 3'-terminalen Sequenz des bestimmten Saccharomyces cerevisiae PDC-Gens korrespondiert.
Die folgende Tabelle zeigt die verwendeten Primer für die Gendeletion der entsprechenden PDC-Gene unter Verwendung des SFH PCR Verfahrens. Die unterstrichenen Sequenzen sind homolog zu dem korrespondierenden PDC-Gen, und die Sequenzen, die komplementär zu der loxP-Kan^SRD-loxP Kassette sind, sind im Fettdruck dargestellt.
Die PCR amplifizierte Deletionskassette wurde für die Transformation des prototrophen, diploiden Saccharomyces cerevisiae Stammes CEN.PK 122, entwickelt durch SRD, verwendet.
CEN.PK 122 (Mata, alpha, URA3, URA3, HIS3, HIS3, LEU2, LEU2, TRP1, TRP1, MAL2-8^C, MAL2-8^C, SUC2, SUC2)
Für die Selektion der Transformanten wurde Geneticin (G-418 Sulfat, Life Technologies) mit einer Endkonzentration von 200 mg/L zugesetzt. Nach Tetradenanalyse wurden die G418 resistenten Sporen anschließend durch diagnostische PCR analysiert, um die korrekte Deletion des entsprechenden PDC-Gens zu bestätigen und um den Paarungstyp des haploiden Stammes zu bestimmen.
Um einen Stamm zu erzielen, der für die drei PDC-Gene PDC1, PDC5 und PDC6 deletiert war, wurden die haploiden Deletionsstämme nacheinander gekreuzt. Um die zwei doppelten Deletionsstämme, pdc1::Kan^SRD pdcb::Kan^SRD und pdc5::Kan^SRD pdcb::Kan^SRD, zu gewinnen, wurden die entsprechenden haploiden Stämme miteinander gekreuzt. Nach Tetradenanalyse wurden die Sporen, welche den nicht-parenteralen Dityp für den Kan^SRD Marker zeigten, nacheinander durch diagnostische PCR analysiert, um die korrekte Deletion der beiden Gene zu bestätigen und den Kreuzungstyp zu bestimmen. Die erzielten Doppeldeletionsstämme wurden gekreuzt, um den dreifachen Deletionsstamm zu gewinnen. Nach Tetradenanalyse wurde eine diagnostische PCR für die Sporen durchgeführt, welche die drei PDC-Gene verloren hatten.
Um den Kan^SRD Marker von dem erfolgreich unterbrochenen Gen zu eliminieren, wurden die haploiden Deletionsstämme (Einfach-, Doppel- und Dreifachmutanten) mit dem cre-Rekombinase-Plasmid, pPK-ILV2^SMR (entwickelt durch SRD) transformiert. Das Plasmid pPK-ILV2^SMR enthält die cre-Rekombinase unter der Kontrolle des GAL1 Promotors und als dominanter Selektionsmarker das ILV2 Resistenzgen, das mit dem Plasmid pPK-ILV2^SMR transformierten Hefezellen erlaubt, in Gegenwart von Sulfomethuronmethyl (30 mg/L) zu wachsen. Das korrekte Ausschneiden des Kan^SRD Markers wurde anschließend durch diagnostische PCR mit ganzen Hefezellen analysiert. Um das Plasmid pPK-ILV2^SMR zu entfernen, wurden die Hefezellen über einen geeigneten Zeitraum ohne Sulfomethuronmethyl im Medium inkubiert und anschließend wurde nach Sulfomethuronmethyl-sensitiven Zellen geforscht.
Die folgende Tabelle zeigt die erzielten Hefestämme. Die Zahlen in Klammern zeigen die deletierten Nukleotide (ATG = 1) der entsprechenden Gene an. Im Falle von negativen Zahlen bedeutet die erste Zahl die deletierten Nukleotide vor dem ATG und die zweite Zahl bezeichnet die deletierten Nukleotide nach dem Stopp-Codon.
Es wurden hauptsächlich die Stämme CEN.PK211 und CEN.PK182 verwendet, die auch bezeichnet wurden als CENPK113ΔPDC2 und CENPK113ΔPDC1ΔPDC5ΔPDC6. Die erzielten Daten sind in den Tabellen zusammengefasst.
Mit einem ähnlichen Ansatz wurde ein S. cerevisiae GRF18U Stamm (Mat alpha, his3, leu2, ura3), der eine Deletion in dem PDC2-Gen trug, konstruiert (GRF18UΔPDC2; Mat alpha, his3, leu2, ura3, pdc2::APT1). Es wurde das APT1 Gen, welches G418 Resistenz verleiht, als Marker für die Integration verwendet. Das Gen wurde aus dem Plasmid pFA6a-KanMX (Wach et al. supra) isoliert. Die PDC-Aktivität war Null für den Stamm, der die Deletionen in den PDC1, PDC5 und PDC6 Genen trug. Für die Stämme mit einer Deletion in dem PDC2 Gen betrug die PDC-Aktivität etwa 20 bis 40% des Niveaus in den Wildtypstämmen.
Isolierung von K. lactis BM3-12D [pLAZ10].
Ein doppelter Deletationsstamm K1pdc1Δ/K1pda1Δ wurde aus der haploiden Segregationspopulation eines diploiden Stammes selektiert, der durch Kreuzung des Stammes MW341-5/K1pdc1Δ (MATa, lac4-8, leu2, lysA1-1, uraA1-1, Klpdc1::URA3; erzielt wie oben beschrieben in Bianchi et. al, 1996, Mol. Microbiol. 19(1), 27–36; Destruelle et al., eingereicht) mit dem Stamm CBS2359/Klpda1Δ (MATa, URA3-48, Klpda1::Tn5BLE) erzielt wurde. Die Deletion des PDA1 Gens, das für den Pyruvatdehydrogenase-Komplex E1-alpha Untereinheit (EC.1.2.4.1) (die DNA-Sequenz wurde erzielt von Steensma H. Y.; Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Clusius Laboratory, Leiden, The Netherland; die DNA Sequenz ist ebenfalls verfügbar unter der Hinterlegungsnummer AF023920 der Genbank Sequence Database, erhältlich von dem National Center of Biotechnology-NCBI-Web site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), codiert, in dem Hefestamm CBS2359 wurde erzielt gemäß dem klassischen PCR Verfahren und der Hefetransformation, die hier im Text beschrieben ist. Es wurde der Marker Tn5Ble (Gatignol et al., Gene, 91: 35, 1990) verwendet, der Phleomycinresistenz vermittelt, als Marker der Integration.
Der doppelte Deletionsstamm, genannt BM1-3C (MATa, leu2, Klpdc1::URA3; Klpda1::Tn5BLE), wurde als ein phleomycinresistenter/antimycinsensitiver Segregationsstamm selektiert. Der Vektor pLAZ10 wurde dann wie folgt zu dem doppelten Deletionsstamm genetisch transferiert.
Ein pLAZ10 Tranformant des Klpdc1::URA3 Stammes PMI/8 (MATa, adeT-600, uraA1-1, Klpdc1::URA3; Bianchi et al., Mol. Michrobiol. 19: 27–36. 1996) wurde gekreuzt mit dem Stamm MW109-BC (MATa, lysA1-1, trpA1-1). Nach Sporulation des erzielten diploiden Stammes wurde ein geneticinresistenter/antimycinsensitiver Stamm, genannt Stamm 7C (MATa, adeT-600, lysA1-1, Klpdc1::URA3, pLAZ10⁺), selektiert.
Die Stämme BM1-3C und 7C wurden gekreuzt und phleomycinresistente/geneticinresistente, haploide Segregationsstämme wurden nach Sporulation des erzielten diploiden Stammes selektiert. Alle haploiden Segreganten waren antimycinsensitiv. Der prototrophe Stamm BM3-12D (Klpdc1::URA3; Klpda1::Tn5BLE, pLAZ10⁺) wurde für weitere Experimente ausgewählt.
Transformation von Kluyveromyces Hefe PM6-7A und PMI/C1 mit den Vektoren pEPL2 und pEPL4.
PM6-7A und PMI/C1 Zellen wuchsen in einem YPD-Medium bis zu einer Konzentration von 0,5 × 10⁸ Zellen/ml. Die Zellen wurden geerntet, einmal in Wasser gewaschen, zweimal in 1 M Sorbitol und dann in 1 M Sorbitol mit einer Konzentration von 2 × 10⁹ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden elektroporiert (7,5 KV/cm, 25 μF, 200 Ω: GenePulser, Biorad, Hercules, Ca) in Gegenwart von 5–10 Mikrogramm von pEPL2 oder pEPL4. Die Selektion der URA⁺ Transformanten wurde in Gegenwart von synthetischem Festmedium ohne Uracil durchgeführt (0,7% Gew./Vol. Hefe-Stickstoffbase, 2 Gew./Vol.% Glucose, 200 mg/L Adenin, 2 Gew./Vol.% Agar).
Transformation von Torulaspora-Hefe mit dem Vektor pLAT-ADH.
CBS817-Zellen wuchsen in YPD-Medium bis zu einer Konzentration von 6 × 10⁷ Zellen/ml. Die Zellen wurden geerntet, einmal in Wasser und zweimal in 1 M Sorbitol gewaschen und dann in 1 M Sorbitol mit einer Konzentration von 2 × 10⁹ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden elektroporiert (1,5 kV, 7,5 KV/cm, 25 μF, 200 Ω: GenePulser, Biorad, Hercules, Ca) in Gegenwart von 1 μg pLAT-ADH.
Die Zellen wuchsen über Nacht in sterilen mikrobiologischen Röhrchen, die 5 ml YEPD, 1 M Sorbitol enthielten. Die Selektion der G418^R Transformanten wurde in Festmedium durchgeführt (2 Gew./Vol.% Glucose, 2 Gew./Vol.% Pepton, 1 Gew./Vol.% Hefeextrakt, 2 Gew./Vol.% Agar, 200 μg/ml G418 (Gibco BRL, Cat. 11811–031).
Transformation von Zygaosaccharomyces-Hefen mit dem Vektor pLAT-ADH.
ATTC36947-Zellen und ATTC60483-Zellen wuchsen in YPD-Medium bis zu einer Konzentration von 2 × 10⁸ Zellen/ml. Die Zellen wurden geerntet und in 0,1 M Lithiumacetat, 10 mM Dithiothreitol, 10 mM Tris-HCL, pH 7,5 mit einer Konzentration von 4 × 10⁸ Zellen/ml bei Raumtemperatur für 1 Stunde resuspendiert. Die Zellen wurden einmal in Wasser und zweimal in 1 M Sorbitol gewaschen und in 1 M Sorbitol bei einer Konzentration von 5 × 10⁹ Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden elektroporiert (1,5 kV, 7,5 KV/cm, 25 μF, 200 Ω: GenePulser, Biorad, Hercules, Ca) in Gegenwart von 3 μg pLAT-ADH.
Die Zellen wuchsen über Nacht in sterilen mikrobiologischen Röhrchen, die 5 ml YEPD und 1 M Sorbitol enthielten. Die Selektion der G418^R Transformanten wurde in Festmedium durchgeführt (2 Gew./Vol.% Glucose, 2 Gew./Vol.% Pepton, 1 Gew./Vol.% Hefeextrakt, 2 Gew./Vol.% Agar, 200 μg/ml G418 (Gibco BRL, Cat. 11811–031).
Transformation von Saccharomyces-Hefezellen mit den Vektoren pLC5, pLC7, pB1, pBST2, pBME2, pLAT-ADH, pLC5-kanMX und pJEN1.
GRF18U (oben beschrieben), GRF18UΔPDC2 (oben beschrieben), GRF18U[pLC5] (Mat alpha, his3, leu2, ura3::TP1-LDH), CENPK113 (Mat a; CBS8340), CENPK-1 (Mat a, ura3), CENPK113ΔPDC1ΔPDC5ΔPDC6 (oben beschrieben) und CENPK113ΔPDC2 (oben beschrieben) Hefezellen wachsen in reichem YPD Komplettmedium (2% Gew./Vol. Hefeextrakt, 1% Gew./Vol. Pepton, 2% Gew./Vol. Glucose) bis zu einer Konzentration von 2 × 10⁷ Zellen/ml. Die Zellen wurden einmal in 0,1 M Lithiumacetat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCL, pH 8, gewaschen, geerntet und in 0,1 M Lithiumacetat, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCL, pH 8, mit einer Konzentration von 2 × 10⁹ Zellen/ml resuspendiert. 100 μL der zellulären Suspension wurde 5 Minuten mit 5–10 μg des Vektors inkubiert (d.h., zuvor linearisiert in dem auxotrophen Marker im Falle von pLC5, pLC7, pB1, pBST2, pBME2, pLC5-kanMX, pJEN1). Nach Zugabe von 280 μL von PEG 4000 wurden die Zellen für wenigstens 45 Minuten bei 30° inkubiert. 43 μL von DMSO wurden zugesetzt und die Suspension wurde für 5 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit Wasser gewaschen und auf selektives Medium ausgestrichen. Für die Isolierung des CENPK-1 Stammes (ura3) Wuchse aus CENPK113 Zellen in Medien, die 5-Fluororotsäure (siehe auch oben) enthielten.
Einzelne transformierte Klone wurden mit 0,7% Gew./Vol. Hefestickstoffbase, 2% Gew./Vol. Glucose, 2% Gew./Vol. Agar sowie die entsprechenden Ergänzungen oder G418, wie angezeigt, erzielt. Für die Selektion der G418^R Transformanten wurden die Zellen auch auf 2 Gew./Vol.% Glucose, 2 Gew./Vol.% Pepton, 1 Gew./Vol.% Hefeextrakt, 2 Gew./Vol.% Agar, 200 μg/ml G418 (Gibco BRL, Cat. 11811–031 bestimmt.
Transformierter Stamm: Ergänzungen

GRF18U[pLAT-ADH]: 200 mg/L Uracil, 200 mg/L Leucin, 200 mg/L Histidin, 200 mg/L G418.
GRF18U[pB1]: 200 mg/L Leucin, 200 mg/L Histidin.
GRF18U[pLC5]: 200 mg/L Leucin, 200 mg/L Histidin.
GRF18U[pLC5][pLC7]: 200 mg/L Leucin.
GRF18U[pBM2]: 200 mg/L Leucin, 200 mg/L Histidin.
GRF18U[pBST2]: 200 mg/L Leucin, 200 mg/L Histidin.
GRF18U[pLC5][pJENI]: 200 mg/L Leucin.
GRF18UΔPDC2[pLC5]: 200 mg/L Leucin, 200 mg/L Histidin.
CENPK-1[pLC5]: keine Ergänzungen
CENPK113[pLC5-KanMX]: 200 mg/L G418
CENPK113ΔPDC1ΔPDC5ΔPDC6[pLC5-KanMX]: 200 mg/L G418
CENPK113ΔPDC2[pLC5-KanMX]: 200 mg/L G418

Liste der verwendeten Expressionsvektoren:

KL: = K. lactis's Promoter
SC: = S. cerevisiae's Promoter
B. Ste.: = Bacillus stearothermophylus

pJEN1 wurde verwendet für die Überexpression des JEN1 Gens.
BATCH-TESTS
Batch-Analyse von Kluyveromyces PM6-7A[pEPL2]. PMI/C1[pEPL2], PM6-7A[pEPL4] und PMI/C1[pEPL41 transformierten Zellen.
Die durch das oben beschriebene Transformationsverfahren erzielten Klone wurden in Batch-Kultur während des Wachstums auf minimalem Synthesemedium getestet (1,3% Gew./Vol. Hefestickstoffbase – aa (Difco, Detroit, MI), 200 mg/L Adenin, 50 g/L Glucose). Die verwendeten Medien waren mit 200 mM Phosphatpuffer auf einen pH von 5,6 gepuffert oder nicht.
Die Zellen wurden in dem gleichen Testmedium vorinokuliert. Exponentiell wachsende Zellen wurden in Flaschen (300 ml Volumen), die 100 ml frisches Medium enthielten, gebracht. Die Flaschen wurden bei 30°C in einem Schüttelbad (Dubnoff, 150 Umdrehungen pro Minute) inkubiert und die Fermentation wurde an bestimmten Zeitpunkten erfasst. Die Zellzahlkonzentration wurde bestimmt mit einem elektronischen Coulter-Counter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics Harpenden, GB; Porro et al., Res. Microbiol. (1991) 142, 535–539), nach dem die Proben beschallt worden waren, um zelluläre Aggregate zu vermeiden (Sonicator Fisher 300, mittlerer Punkt, Einstellung 35%, 10 Sekunden) (7 und 8 und Tabelle 3).
Batch-Analyse von Kluyveromyces BM3-12D[pLAZ10] transformierten Zellen.
Die durch das oben beschriebene Verfahren erzielten Klone wurden in Batch-Kultur während des Wachstums auf minimalem synthetischen Gewebe getestet (1,3% Gew./Vol. Hefestickstoffbase – aa (Difco, Detroit, MI), 50 g/L Glucose, 20 g/L Ethanol, 200 mg/L G418). Die verwendeten Medien waren mit 200 mM Phosphatpuffer auf einen pH von 5,6 gepuffert.
Die Zellen wurden in das gleiche Testmedium vorinokuliert. Exponentiell wachsende Zellen wurden in einem Kolben (300 ml Volumen), der 100 ml frisches Medium enthielt, inokuliert. Die Kolben wurden bei 30°C in einem Schüttelbad (Dubnoff, 150 Umdrehungen pro Minute) inkubiert und die Fermentation wurde an bestimmten Zeitpunkten überprüft. Die Zellzahlkonzentration wurde bestimmt mit einem elektronischen Coulter-Counter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991) 142, 535–539), nach dem die Proben beschallt worden waren, um zelluläre Aggregate zu vermeiden (Sonicator Fisher 300, mittlerer Punkt, Einstellung 35%, 10 Sekunden). Zu Beginn verwendeten die Zellen Ethanol und transformierten dann Glucose zu Milchsäure in einer sehr hohen Ausbeute (> 0,75; g Milchsäure/g verbrauchte Glucose) (Tabelle 3).
Batch-Analyse von Torulaspora CBS817[pLAT-ADH] transformierten Zellen.
Die durch das oben beschriebene Transformationsverfahren erzielten Klone wurden in Batch-Kultur während des Wachstums auf minimalem sythetischen Medium getestet (1,3% Gew./Vol. Hefestickstoffbase – aa (Difco, Detroit, MI), 20 g/L Glucose, 200 mg/L G418). Die Medien waren nicht gepuffert.
Die Zellen wurden in dem gleichen Testmedium vorinokuliert. Exponentiell wachsende Zellen wurden in einem Kolben (300 ml Volumen), der 100 ml frisches Medium enthielt, inokuliert. Die Kolben wurden bei 30°C in einem Schüttelbad (Dubnoff, 150 Umdrehungen pro Minute) inkubiert und die Fermentation wurde zu bestimmten Zeitpunkten überwacht. Die Zellzahlkonzentration wurde bestimmt mit einem elektronischen Coulter-Counter (Coulter Counter ZBI Counter Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991) 142, 535–539), nach dem die Proben beschallt worden waren, um zelluläre Aggregate zu vermeiden (Sonicator Fisher 300, mittlerer Punkt, Einstellung 35%, 10 Sekunden) (10 und Tabelle 3).
Batch-Analyse von Zygosaccharomyces ATCC36947[pLAT-ADH] und ATCC60483[pLAT-ADH] transformierten Zellen.
Die durch das oben beschriebene Transformationsverfahren erzielten Klone wurden in Batch-Kultur während des Wachstums auf minimalem sythetischen Medium getestet (1,3% Gew./Vol. Hefestickstoffbase – aa (Difco, Detroit, MI), 50 g/L Glucose, 200 mg/L G418). Die verwendeten Medien waren nicht gepuffert.
Die Zellen wurden in das gleiche Testmedium vorinokuliert. Exponentiell wachsende Zellen wurden in einem Kolben (300 ml Volumen), der 100 ml frisches Medium enthielt inokuliert. Die Kolben wurden bei 30°C in einem Schüttelbad (Dubnoff, 150 Umdrehungen pro Minute) inkubiert und die Fermentation wurde zu bestimmten Zeitpunkten überwacht. Die Zellzahlkonzentration wurde bestimmt mit einem elektronischen Coulter-Counter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991) 142, 535–539), nach dem die Proben beschallt worden waren, um zelluläre Aggregate zu vermeiden (Sonicator Fisher 300, mittlerer Punkt, Einstellung 35%, 10 Sekunden) (11 und Tabelle 3).
Batch-Analyse von Saccharomyces GRF18U[pLAT-ADH], GRF18U[pB1], GRF18U[pLC5], GRF18U[pLC5][pLC7], GRF18U[pBM2], GRF18U[pBST2], CENPK-1[pLC5] transformierten Zellen.
Die durch das oben beschriebene Transformationsverfahren erzielten Klone wurden in Batch-Kultur während des Wachstums auf einem minimalem sythetischen Medium getestet (1,3% Gew./Vol. Hefestickstoffbase – aa (Difco, Detroit, MI), 50 g/L Glucose und geeignete Ergänzungen (siehe oben). Die verwendeten Medien waren nicht gepuffert.
Die Zellen wurden in dem gleichen Testmedium vorinokuliert. Exponentiell wachsende Zellen wurden in einem Kolben (300 ml Volumen), der 100 ml frisches Medium enthielt inokuliert. Die Kolben wurden bei 30°C in einem Schüttelbad (Dubnoff, 150 Umdrehungen pro Minute) inkubiert und die Fermentation wurde zu bestimmten Zeitpunkten überwacht. Die Zellzahlkonzentration wurde bestimmt mit einem elektronischen Coulter-Counter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991) 142, 535–539), nach dem die Proben beschallt worden waren, um zelluläre Aggregate zu vermeiden (Sonicator Fisher 300, mittlerer Punkt, Einstellung 35%, 10 Sekunden) (Tabelle 3).
Batch-Analyse-Spinnerkolben- von Saccharomvces, GRF18UΔPDC2[pLC5], CENPK113[plC5-kanMX], CENPK113ΔPDC2[plC5-kanMX] und CENPK113ΔPDC1ΔPDC5ΔPDC6[plC5-kanMX] transformierten Zellen.
Die durch die oben beschriebenen Verfahren erzielten Klone wurden in Batch-Kultur während des Wachstums auf einem reichen Medium getestet (1% Gew./Vol. Hefeextrakt, 2% Gew./Vol. Pepton, 100 g/L Glucose). Die Medien waren nicht gepuffert.
Die Zellen wurden vorinokuliert auf Hefeextrakt-Pepton + Ethanol (5 g/L) Medien. 100 ml wurden in Spinnerkolben (1,5 L Arbeitsvolumen; anfänglicher pH = 5,7) inokuliert. Die Spinnerkolben wurden bei 30°C mit Rühren bei 55 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Die Fermentation wurde an bestimmten Zeitpunkten erfasst (Tabellen A, B, C und Tabelle 3).
Die spezifische LDH-Aktivität von den verschiedenen transformierten Stämmen war größer als 5 U/mg Gesamtzellprotein.
LDH-Aktivitätsdosierung
Rind-LDH. Etwa 10⁸ Zellen wurden geerntet, in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, gewaschen und in dem gleichen Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden in 5 Kreisläufen mit heftigem Schütteln (Vortex) in Gegenwart von Glasmikrokügelchen (Durchmesser 400 μm, SIGMA, G-8772) bei 4°C lysiert. Die zellulären Reste wurden durch Zentrifugation entfernt (Eppendorf, Hamburg, D-5415 C, 13600 RCF, 10 Min.). Die Konzentration der Proteinextrakte wurde bestimmt mit Micro Assay, Biorad, Hercules, Ca (Cat. 500-0006).
Etwa 0,2 mg des Extraktes wurde auf seine LDH-Aktivität getestet unter Verwendung des SIGMA (St. Louis, MO) Kits DG1340-UV und gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Bakterielle LDHs. Etwa 10⁸ Zellen wurden geerntet, in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, gewaschen und in dem gleichen Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden in 5 Kreisläufen heftig geschüttelt (Vortex) in Gegenwart von Glasmikrokügelchen (Durchmesser 400 μm, SIGMA, G-8772) bei 4°C lysiert. Die zellulären Reste wurden mit Zentrifugation entfernt (Eppendorf, Hamburg, D-5415 C, 13600 RCF, 10 Min.). Die Konzentration der Proteinextrakte wurde bestimmt mit Micro Assay, Biorad, Hercules, Ca (Cat. 500-0006).
Der zelluläre Extrakt wurde auf seine LDH-Aktivitiät getestet unter Verwendung von:
0,01 ml von 12,8 mM NADH
0,1 ml von 2 mM Fructose-1,6-diphosphat
0,74 ml von 50 mM Acetatpuffer (pH = 5,6)
0,05 ml von einem geeignet verdünnten Zellextrakt und
0,1 ml Natriumpyruvat, 100 mM.
Die LDH-Aktivität wurde bestimmt als pro Minute oxidierten Mikromole NADH pro Milligramm Gesamtzellextrakt bei 340 nm, 25°C.
Metabolitendosierung in dem Wachstumsmedium.
Proben des Wachstumsmediums, die nach Entfernung der Zellen mittels Zentrifugation erzielt wurden, wurden auf die Gegenwart von Glucose, Ethanol, L(+)- und D(–)- Milchsäure analysiert unter Verwendung der Kits von Boehringer Mannheim, Mannheim DE, (Katalog Nr. 716251, 176290 bzw. 1112821) und gemäß den Vorschriften des Herstellers.
Die experimentellen Batch-Tests bezüglich den Kluyveromyces PM6-7A[pEPL2] und PMI/C1[pEPL2] transformierten Hefen sind in den 7A, 7B und in den 8A und 8B gezeigt.
Die experimentellen Daten bezüglich den Torulaspora CBS817[pLAT-ADH] transformierten Hefen sind in der 10 dargestellt.
Die experimentellen Daten bezüglich den Zygosaccharomyces ATCC60483[pLAT-ADH] transformierten Hefen sind in der 11 gezeigt.
Die experimentellen Daten bezüglich den Saccharomyces CENPK113[pLC5-KanMX], CENPK113ΔPDC2[pLC5-kanMX] und CENPK113ΔPDC1ΔPDC5ΔPDC6[pLC5-kanMX] transformierten Hefen, die in Spinnerkolben wuchsen, sind in den Tabellen A, B und C dargestellt.
Tabelle A Übersicht der Kultur mit S. cerevisiae (CENPK113[pLC5-KanMX])
Tabelle B Übersicht der Anzucht von S. cerevisae (CEN.PK113Δpdc2[pLC5-KanMX])
Tabelle C Übersicht der Anzucht von S. cerevisiae (CENPK113Δpdc1Δpdc5Δpdcb [pLC5-KanMX])
Die mit den transformierten Kluyveromyces-, Torulaspora-, Zygosaccharomyces- und Saccharomyces-Hefen erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengefasst und verglichen. Die Ausbeute ist die Menge an hergestellter Milchsäure (g/L) geteilt durch die Menge an verbrauchter Glucose (g/L). Der Prozentsatz der freien Milchsäure wird erzielt durch die Henderson-Hasselbalch-Gleichung: pH = pK_a + log[(% Lactat)/(% freie Milchsäure)], wobei der pK_a für Milchsäure 3,86 ist.
Ein Vergleich der in den Tabellen 3A und 3B gezeigten Daten zeigt deutlich, dass in verschiedenen Hefegattungen die Produktion der Milchsäure mit einem hohen Ertrag auf Basis von Glucose durch Veränderung des relativen Verhältnisses – auf zellulärem Niveau – der LDH- und PDC- Aktivitäten erzielt werden können. Dieses Ziel kann wenigstens durch die zwei folgenden unterschiedlichen Schritte erreicht werden:

(1) Durch Reduktion der PDC-Aktivität (vergleiche Daten von transformierten K. lactis Wirten: PM6-7A vs PMI/C1; vergleiche Daten von transformierten S. cerevisiae Wirten GRF18U vs GRF18ΔPDC2 und CENPK113 vs CENPK113ΔPDC2 und CENPK113ΔPDC1ΔPDC5ΔPDC6).
(2) Durch Erhöhung der LDH-Genkopienzahl und damit der LDH-Aktivität (vergleiche Daten vom S. cerevisiae Wirt: GRF18U[pLC5] vs GRF18U[pLCS] [pLC7]; die heterologe LDH-Aktivität in den zwei Stämmen ist 5–6 bzw. 7–8 U/mg Gesamtzellprotein).

Ferner können hohe Erträge durch Manipulation der 5 Zusammensetzung des Wachstumsmediums erzielt werden. Auch in diesem Fall wird eine reduzierte Ethanolproduktion beobachtet (siehe auch Tabelle 4). Tabelle 3A: Batch-Tests Milchsäureproduktion von transformierten Kluyveromyces lactis –, Torulaspora delbrueckii –, Zygosaccharomyces bailii – und Saccharomyces cerevisiae-Hefen, die ein heterologes LDH-Gen tragen.

Tabelle 3B: Batch-Tests Der Milchsäureertrag kann durch genetische und physiologische Schritte verbessert werden (vergleiche mit Tabelle 3A).

(§ : siehe auch Tabelle 4 für mehr Details über diese letzten Daten)
** im Spinnerkolben erzielte Daten unter teilweise anaeroben Bedingungen (siehe auch die Tabellen A, B und C).

Experimentelle Daten zu Saccharomyces GRF18[pLC5][pLC7], gewachsen in einem manipulierten Mineralmedium (Tabelle 41.
Milchsäureproduktion von Saccharomyces GRF18U[pLC5][pLC7] transformierten Zellen wurde auch durchgeführt durch Wachstum der Zellen in einem synthetischen Medium (D. Porro et al., Development of a pH controlled fed-batch system for budding yeast. Res. In Microbiol., 142, 535–539, 1991). In dem verwendeten synthetischen Medium sind MgSO₄ (5 mM) und ZnSO₄ × 7H₂O (0,02 mM) die Quellen für die Mg- und Zn-Salze. Die Produktion wurde in aerober Batch-Kultur (Glucosekonzentration 50 g/L) getestet, wie oben für die anderen transformierten Saccharomyces Zellen beschrieben. Es wurde gefunden, dass die Verminderung von MgSO₄ und ZnSO₄ × 7H₂O höhere Erträge und höhere Milchsäureproduktionen ergab. Diese Mineralien können tatsächlich als Cofaktor für die enzymatischen Aktivitäten erforderlich sein, die zu einer Ethanolproduktion führen. Die Daten sind in der Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 L(+) L-Milchsäureproduktion von Saccharomyces GRF18[pLC5][pLC7] transformierten Zellen während Batch-Wachstum in manipulierten Mineralmedien.

Kontrolle:: vollständig sythetisches Medium (Res. in Microbiol., 142, 535–539, 1991; beigefügt)
-Mg:: identisch zur Kontrolle, aber ohne MgSO₄.
-Zn:: identisch zu der Kontrolle, aber ohne ZnSO₄ × 7H₂O.

Bei allen Tests war der End-pH-Wert niedriger als 3,0 und somit war der Prozentsatz an freier Milchsäure größer als 88%.
Milchsäureproduktion durch Hefezellen die das JEN1-Gen überexprimieren.
Eine bessere Milchsäureproduktion und eine niedrigere Ethanolproduktion wurde erzielt durch Überexpression des JEN1-Gens, das für den Lactattransporter codiert.
GRF18U[pLC5] (d.h. negative Kontrolle) und GRF18U[pLCS][pJEN1] wuchsen in Medien, die 2% Glucose, 0,67% YNB Gew./Vol. und Ergänzungen (d.h. 100 mg/L Leucin-Histidin bzw. 100 mg/L Leucin) enthielten.
Die Zellen wurden in dem gleichen Testmedium vorinokuliert. Exponentiell wachsende Zellen wurden in einem Kolben (300 ml Volumen), der 100 ml frisches Medium enthielt, inokuliert. Die Kolben wurden bei 30°C in einem Schüttelbad (Dubnoff, 150 Umdrehungen pro Minute) inkubiert und die Fermentation wurde zu bestimmten Zeitpunkten überwacht. Die Zellzahlkonzentration wurde bestimmt mit einem elektronischen Coulter-Counter (Coulter Counter ZBI Coulter Electronics Harpenden, GB, Porro et al., Res. Microbiol. (1991) 142, 535–539), nachdem die Proben beschallt worden waren, um zelluläre Aggregate zu vermeiden (Sonicator Fisher 300, mittlerer Punkt, Einstellung 35%, 10 Sekunden).
Tabelle 5 Vergleich von Lactat- und Ethanolproduktion während Batch-Kultur
Kontinuierliche Milchsäureproduktion.
Eine kontinuierliche und stabile Produktion von Milchsäure wurde über einen Zeitraum von mehr als zwei Wochen erzielt mit klassischen Chemostat-Kulturen (kontinuierlicher Fluss von frischem Medium zu dem Bioreaktor unterstützte die spezifische Wachstumsrate in dem Bereich von 0,01 bis 0,3 Std.^–1) unter Verwendung der beiden transformierten K. lactis PM6-7A[pEPL2], PMI/C1[pEPL2] und die transformierten S. cerevisiae GRF18U[pLC5][pLC7] Stämme.
FED-Batch-Tests
Milchsäureproduktion durch PMI/C1[pEPL2] in einem gerührten Tankfermenter.
Die Milchsäureproduktion von PMI/C1[pEPL2] wurde ferner getestet durch Kultivierung in einem 14 Liter gerührten Tankfermenter, der 8 Liter Nährmedium enthielt (30 g Trockenfeststoff/L leichtes Maisquellwasser, A. E. Staley Manufacturing Co., Decatur, IL; 10 g/L Difco-Hefeextrakt, Difco, Detroit, MI; 200 mg/L Adenin, 50 g/L Glucose). Der Fermenter wurde bei 30°C gehalten, bei 400 Umdrehungen pro Minute gerührt und belüftet mit 2 Liter/Min. Antischaummittel (Antifoam 1520, Dow Corning Corp., Midland, MI) wurde zugesetzt nach Bedarf, um das Schäumen zu kontrollieren. Glucose wurde nach Bedarf zugeführt, um die Restkonzentration in dem Fermentationsmedium auf etwa 25–50 g/L zu halten. Der pH wurde durch automatische Zugabe von 14,8 M Ammoniumhydroxid in Wasser aufrechterhalten, wenn er kontrolliert wurde. Die Milchsäureproduktion bei einem sauren pH wurde wie folgt getestet: (1) Der Fermentations-pH wurde während der Fermentation auf 4,5 gehalten. (2) Der Anfangsfermentations-pH wurde auf 4,0 gehalten, bis 80 ml an 14,8 M Ammoniumhydroxid zugegeben waren. Dann erfolgte die pH-Kontrolle diskontinuirlich. (3) Der anfängliche Fermentations-pH war 5,0 und während der Fermentation wurde kein Neutralisierungsmittel zugesetzt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 gezeigt. Die vergangene Zeit ab Inokulationszeitpunkt wurde gemessen. Die Proben von der Fermentation, die nach Entfernung der Zellen durch Filtration erzielt wurden, wurden auf Anwesenheit von Glucose und L(+)-Milchsäure analysiert unter Verwendung von YSI Modell 2700 Select Biochemistry Analyzer (Yellow Springs Instrument Co., Inc., Yellow Springs, OH). Mittels Gaschromatographie gemessenes Ethanol konnte bei keiner Fermentation nachgewiesen werden. Ertrag und der Prozentsatz an freier Milchsäure wurden wie oben beschrieben berechnet. Die Animpfungen für die Fermentationen wurden hergestellt durch Vorkultur von PMI(C1[pEPL2] in 50 ml synthetischem Minimalmedium (1,3% Gew./Vol. Hefestickstoffbase – aa (Difco, Detroit, MI), 200 mg/L Adenin, 5 g/L Ammoniumsulfat, 50 g/L Glucose) in einem 250 mL abgeschirmten Erlenmeyerkolben für 30 Std. bei 30°C und bei 300 Umdrehungen pro Minute in einem Inkubationsschüttler (Modell G-24, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ).
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt unter Verwendung des bakteriellen LDH-Gens (Plasmid pEPL4; Daten nicht gezeigt).
Tabelle 6 Milchsäureproduktion von Kluyveromyces PMI/C1[pEPL2] Zellen in einem Fermenter.
Milchsäureproduktion durch BM3-12D[pLAZ10] in einem gerührten Tankfermenter.
Die Milchsäureproduktion von BM3-12D[pLAZ10] wurde ferner getestet durch Kultivierung in einem 1 Liter gerührten Tankfermenter, der 0,8 Liter Nährmedium enthielt (6,7 g/YNB/Hefstickstoffbase-Difco, Detroit, MI, 45 g/L Glucose, 2% Vol./Vol. Ethanol, G418 200 mg/L). Der Fermenter wurde bei 30°C gehalten, mit 400 Umdrehungen pro Minute gerührt und mit 0,8 Liter/Min. belüftet. Antischaummittel (Antifoam 1520, Dow Corning Corp., Midland, MI) wurde bei Bedarf zugesetzt, um das Schäumen zu kontrollieren. Die transformierten Zellen verwendeten zuerst Ethanol für die Produktion von Biomasse (die ersten fünfzig Stunden des Wachstums) und wandelten dann Glucose zu L(+) Milchsäure um. Der pH wurde durch automatische Zugabe von 2 M KOH auf 4,5 gehalten. Bei Bedarf wurde Glucose zugegeben, um eine Restkonzentration in dem Fermentationsmedium von etwa 35–45 g/L aufrecht zu erhalten.
Die Ergebnisse sind in der 9 und in der Tabelle 7 (Fall 1) gezeigt. Die vom Zeitpunkt der Inokulation vergangene Zeit wurde erfasst. Proben von der Fermentation, die nach Entfernung der Zellen durch Filtration erzielt worden waren, wurden auf die Gegenwart von Glucose, Ethanol und L(+)-Milchsäure analysiert unter Verwendung einer Standardenzymanalyse gemäß der Beschreibung in Porro et al. 1995 (supra). Nach T = 50 Std. war kein Ethanol in einem Probentest nachzuweisen. Der Ertrag und der Prozentsatz an freier Milchsäure wurde wie oben beschrieben berechnet.
Die Animpfungen für die Fermentationen wurden hergestellt durch Vorkultur von BM3-12D[pLAZ10] in 50 ml minimalem synthetischen Medium (1,3% Gew./Vol. Hefestickstoffbase – aa (Difco, Detroit, MI), 2% v/v Ethanol, G418 200 mg/L) in einem 250 ml abgeschirmten Erlenmeyerkolben für 40 Std. bei 30°C und bei 300 Umdrehungen pro Minute in einem Inkubationsschüttler (Modell G-24, New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ).
In einem anderen Experiment (Tabelle 7, Fall 2) betrug der anfängliche Fermentations-pH 5,4 und während der Fermentation wurde kein Neutralisierungsmittel zugesetzt.
Tabelle 7 Milchsäureproduktion von Kluyveromyces BM3-12D[pLAZ10] Zellen in einem Fermenter.
Sequenzliste

Claims

Pichia-, Kluyveromyces-, Torulaspora- oder Zygosaccharomyces-Stamm, der mit mindestens einer Kopie eines Gens zum Kodieren von Milchsäure-Dehydrogenase transformiert ist, die funktionell an Promoter-Sequenzen gebunden ist, die die Expression des Gens in Hefen ermöglichen, und wobei der Hefestamm so konstruiert ist, dass er verminderte Pyruvat-Decarboxylase- und/oder Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität aufweist.
Hefestamm nach Anspruch 1, welcher eine reduzierte Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität aufweist.
Hefestamm nach Anspruch 1, welcher eine reduzierte Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität aufweist.
Hefestamm nach Anspruch 1, welcher sowohl reduzierte Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität als auch reduzierte Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität aufweist.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gen oder die Gene, die für Pyruvat-Decarboxylase, für Pyruvat-Dehydrogenase oder beide kodieren, durch Deletion oder Insertion mit Hilfe eines oder mehrerer selektierbarer Markern unterbrochen wurde(n).
Hefestamm nach Anspruch 5, wobei der selektierbare Marker ein URA3-Marker ist.
Hefestamm nach Anspruch 6, wobei der selektierbare Marker der URA3-Marker aus Saccharomyces cerevisiae ist.
Hefestamm nach Anspruch 7, wobei der selektierbare Marker ein dominanter Marker ist, der für die Resistenz gegen toxische Verbindungen kodiert.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ausgewählt aus Kluyveromyces-, Torulaspora- und Zygosaccharomyces-Spezies.
Hefestamm nach Anspruch 9, welcher ein Stamm von Kluyveromyces lactis ist.
Hefestamm nach Anspruch 9, welcher ein Stamm von Torulaspora delbrueckii ist.
Hefestamm nach Anspruch 9, welcher ein Stamm von Zygosaccharomyces bailii ist.
Hefestamm, ausgewählt aus Kluyveromyces-, Torulaspora- und Zygosaccharomyces-Spezies, die transformiert sind mit mindestens einer Kopie eines für Milchsäure-Dehydrogenase kodierenden Gens, welches funktionell an Promoter-Sequenzen gebunden ist, die die Expression des Gens in diesen Hefen ermöglicht.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 13, der mit einem für Rinder-Lactat-Dehydrogenase kodierenden Gen transformiert ist.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 14, der mit einem für bakterielle Lactat-Dehydrogenase kodierenden Gen transformiert ist.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das für Lactat-Dehydrogenase kodierende Gen in das Hefegenom integriert ist.
Hefestamm nach einem der Ansprüche 1 bis 16, welcher durch einen Expressionsvektor transformiert wurde, der eine Promoter-Sequenz und eine DNA-Sequenz umfasst, welche für Lactat-Dehydrogenase unter der Regulierung dieser Promotor-Sequenz kodiert.
Hefestamm nach Anspruch 17, wobei die Promoter-Sequenz ein Pyruvat-Decarboxylase-Gen-Promoter ist,
Hefestamm nach Anspruch 18, wobei die Promoter-Sequenz ein Kluyveromyces-Pyruvat-Decarboxylase-Gen-Promoter ist,
Hefestamm nach einem der vorstehenden Ansprüche, der einen Lactat-Transporter überexprimiert,
Hefestamm nach Anspruch 20, wobei der Lactat-Transporter JEN1 ist.
Verfahren zur Herstellung von Milchsäure, umfassend das Wachstum eines rekombinanten Hefestamms nach den Ansprüchen 1 bis 21 in einem Fermentationsmedium, welches eine Kohlenstoffquelle enthält, und Isolierung der Milchsäure aus dem Fermentationsmedium,
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Kohlenstoffquelle ausgewählt wird aus einem oder mehreren von Glukose, Fruktose, Galactose, Lactose, Sucrose, Raffinose, Maltose, Cellobiose, Arabinose, Xylose.
Verfahren zur Herstellung von Milchsäure nach Anspruch 22 oder 23, wobei das Fermentationsmedium weniger als 5 mM Mg⁺⁺ und/oder weniger als 0,02 mM Zn⁺⁺ enthält,
Verfahren nach den Ansprüchen 22 bis 24, wobei das Fermentationsmedium einen pH von 7 oder weniger aufweist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei der pH 4,5 oder weniger ist,
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der pH 3 oder weniger ist,
Verfahren nach Anspruch 22 zur Herstellung von D- oder L-Milchsäure oder einem Gemisch der beiden,