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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Introduktion bzw. Einführung von Material in Zellen,
z. B. Gentransfer. Insbesondere betrifft die Erfindung Anordnungen
und Verfahren, die Elektrospray-Techniken zur Durchführung einer
solchen Einführung
von Material in Zellen nutzen.
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Hintergrund der Erfindung
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Verschiedene
Vorrichtungen und Verfahren zur Verwendung bei der genetischen Transformation von
Pflanzen- und Lebewesenzellen sind bisher benutzt worden, und viele
andere sind bisher in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben
worden. Beispielsweise weisen einige frühe Techniken zur Durchführung des
Transports von Substanzen, z. B. DNA, in Zellen Aufnahmemechanismen,
Fusionsmechanismen und Mikroinjektionsmechanismen auf. Im allgemeinen
schließen
Aufnahmemechanismen die Verwendung von Substanzen ein, wie beispielsweise etwa
Liposomen, die Substanzen einhüllen
und den Transfer von Substanzen in die Zelle durch Fusion der Liposomen
mit der Zellmembran, Elektroporation, Kalziumchloridprezipitation
und dgl. ermöglichen. Die
Aufnahmeprotokolle sind im allgemeinen sehr einfach und ermöglichen
die Behandlung großer Mengen
von Zellen gleichzeitig, aber diese Technik neigt dazu, eine sehr
niedrige Effizienz zu haben, das heißt, die Transformationsfrequenz
ist niedrig.
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Im
allgemeinen beziehen Fusionsmechanismen genetisches Material dadurch
in eine Zelle, daß sie
eine Zelle mit einer Membran verschmelzen lassen, die mit der Zellmembran
der Zelle kompatibel ist. Die Fusion zweier Zellen kann zur Einführung von Material
in eine Zelle verwendet werden. Zellfusionstechnologien können bessere
Effizienzen haben als Aufnahmemecha nismen, aber die Zellselektion kann
komplexer sein, und die resultierenden Zellen haben normalerweise
eine erhöhte
Ploidie, die ihre Brauchbarkeit einschränkt.
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Mikroinjektionsmechanismen
verwenden normalerweise extrem feine herausgezogene Kapillarröhrchen,
die mitunter Mikropipetten oder Nadeln sind. Diese Kapillarröhrchen können ausreichend klein
gemacht werden und als Spritzennadeln zur direkten Injektion von
Biomaterial in bestimmte Typen von Einzelzellen verwendet werden.
Wenn in sehr kleine Zellen zu injizieren ist, sind sehr scharfe
Kapillarröhrchen
erforderlich, deren Spitzen sehr leicht brechen oder verstopfen.
Hohe Drücke
sind dann erforderlich, um den Volumenstrom durch die kleinen Öffnungen
zu ermöglichen,
und eine Regulierung dieses Stroms ist schwierig. Eine Form von
Mikroinjektion, die gemeinhin als Ionophorese bezeichnet wird, wird
ebenfalls verwendet. Die Ionophorese nutzt die Elektrophorese von
Substanzen aus einer Mikroelektrode und in eine Zelle als Alternative
zum Hochdruckvolumenstrom aus. Obwohl die Effizienz der Mikroinjektion,
wie man erwarten könnte,
hoch ist, erfolgt die Transformation einzelner Zellen durch Einzelzellenmanipulation,
und daher ist die Massenbehandlung von Zellen schwierig.
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In
jüngster
Zeit sind verschiedene Techniken, die eine Beschleunigung von Substanzen
zur Bombardierung mit Zellen, um Gentransfer zu ermöglichen,
verwendet und beschrieben worden, z. B. Genkanonen. Beispielsweise
schließen
solche Techniken die Verwendung eines mechanischen Aufpralls zum
Herausschleudern solcher Substanzen, die Verwendung von elektrostatischer
Beschleunigung der Substanzen und/oder die Verwendung von elektrostatischer
Entladung zum Herausschleudern solcher Substanzen, ein. Es ist bisher
festgestellt worden, daß es
solche Techniken ermöglichen,
daß die
Substanzen eine Geschwindigkeit erreichen, die sie in Zellen eindringen
lassen.
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Verschiedene
Formen der Beschleunigung von Substanzen sind beispielsweise in
dem Genkanonen-Patent von Sanford et al., US-Patent 4 945 050 mit
dem Titel "Method
for Transforming Substances into Living Cells and Tissues and Apparatus Therefor" beschrieben. Wie
dort beschrieben, wird beispielsweise ein mechanischer Stoß auf eine Schicht
von Partikeln (z. B. Gold) ausgeübt,
die beschichtet, imprägniert
oder einem Biomaterial anderweitig zugeordnet sind. Der Aufprall
bewirkt, daß sich die
Partikel so beschleunigen, daß die
Partikel auf die zu transformierenden Zellen hinter der Anordnung auftreffen,
die den mechanischen Stoß bewirkt.
Die Partikel durchschlagen die Zellmembran und dringen in die Zelle
ein, wobei das Biomaterial in den Zellen verbleibt.
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Funkenentladungstechniken
zur Beschleunigung der Partikel, wie im US-Patent 5 120 657 von McCabe
et al. beschrieben, schließen
die Verwendung einer Funkenentladungskammer ein. Die Kammer weist
Elektroden auf, die durch einen Funkenspalt beabstandet sind. Ein
beweglicher Partikelträger
wird bewegt, wenn eine Funkenentladung in der Kammer eine Stoßwelle erzeugt,
die den beweglichen Partikelträger
so beschleunigt, daß der
bewegliche Partikelträger
auf ein anderes Objekt auftrifft und dabei die Zellen für den Zusammenprall
mit den zu transformierenden Ziel- bzw. Targetzellen beschleunigt.
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Solche
mechanischen Stoßtechniken
haben jedoch verschiedene Nachteile. Zunächst sind die Techniken im
allgemeinen Chargenverarbeitungstechniken, d. h. sie transferieren
eine bestimmte Charge beschichteter oder imprägnierter Partikel. Wenn mehr
Partikel als die Anzahl der Partikel einer einzelnen Charge zu transferieren
sind, muß eine weitere
Serie oder Charge ausgelöst
werden. Dies kann beispielsweise das Nachladen oder Neubestücken eines
Teils der Anordnung, der die Partikel aufnimmt, z. B. den oben beschriebenen
beweglichen Partikelträger,
umfassen.
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Ferner
können
die beschichteten oder imprägnierten
Partikel, wenn sie auf der Transferoberfläche, z. B. auf dem beweglichen
Partikelträger,
positioniert sind, agglomerieren, oder eine solche Agglomeration
kann während
des Transfers auftreten. Die Agglomeration der Partikel kann Schäden durch
unerwünschte
Vertiefungen an den Targetzellen beim Zusammenprall mit ihnen bewirken.
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Außerdem ist
die Herstellung von beschichteten oder imprägnierten Partikeln ein zeitaufwendiger
Prozeß.
Beispielsweise kann es einen oder mehrere Tage dauern, bis beschichtete
oder imprägnierte Partikel
aus einer Lösung,
die die Träger partikel
oder das zu transferierende Biomaterial enthält, abgeschieden sind.
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Außerdem kann
der Gesamtprozeß nicht ohne
weiteres gesteuert werden. Beispielsweise gibt es normalerweise
nur einen begrenzten Aufprallgeschwindigkeitsbereich, den die beschichteten
oder imprägnierten
Partikel erreichen können.
Der Typ oder Ausgangspunkt der Zelle kann die zur Transformation
notwendige Geschwindigkeit beeinflussen. Daher sind Vorrichtungen,
die einen größeren Bereich
von Aufprallgeschwindigkeiten erzeugen können, erwünscht. Ferner ist beispielsweise
die gleichmäßige Abgabe
von Partikeln an die Targetzellen nicht leicht zu steuern. Daher
können
Targetzellen, die sich in bestimmten Positionen befinden, leichter als
diejenigen Targetzellen, die diese Positionen umgeben, beschädigt werden.
Beispielsweise können Targetzellen,
die sich in der Mitte einer Charge von Targetzellen befinden, leichter
als diejenigen, die sich um einen Targetbereich herum befinden,
zerstört oder
abgetötet
werden, wenn sie mit beschichteten oder imprägnierten Partikeln durch herkömmliche Chargen-Genkanonenvorrichtungen
bombardiert werden. Dies kann zumindest teilweise auf die Agglomeration
der Partikel zurückzuführen sein.
Da der Gesamtprozeß nicht
leicht gesteuert werden kann, ist die Menge des an die Targetzellen
abzugebenden Biomaterials nicht ohne weiteres steuerbar.
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Weitere
Beschleunigungstechniken, z. B. Aerosolstrahltechnologie, elektrostatische
Beschleunigungsfelder, Zentrifugaltechniken usw., wie im US-Patent
4 945 050 in der internationalen Veröffentlichung WO 91/00915 mit
dem Titel "Aerosol
Beam Microinjector" und
in verschiedenen und zahlreichen anderen Dokumenten beschrieben,
müssen
nicht sämtliche
Nachteile aufweisen, wie mit Bezug auf die Verwendung eines mechanischen
Stoßes
beschrieben. Solche Techniken mildern jedoch nicht alle diese Probleme.
Beispielsweise kann die Aerosoltechnik ein kontinuierlicheres Transferverfahren
im Gegensatz zu einem Chargenverarbeitungsverfahren ermöglichen,
hat aber dennoch die damit verbundenen Agglomerationsnachteile.
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Aus
den oben genannten Gründen
besteht in der Fachwelt Bedarf an Gentransferverfahren und -anordnungen,
die die Aus wirkung solcher Nachteile, wie oben beschrieben, reduzieren.
Die Erfindung löst die
oben beschriebenen und weitere Probleme, wie sie für den Fachmann
aus der nachstehenden ausführlichen
Beschreibung erkennbar werden.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein
erfindungsgemäßes Verfahren
zur Einführung
von Biomaterial in Zellen weist die Schritte auf: Bereitstellen
eines oder mehrerer Targetzellen und Erzeugen eines Sprays aus im
wesentlichen dispergierten Partikeln, einschließlich Biomaterial. An die im
wesentlichen dispergierten Partikel wird eine elektrische Ladung
angelegt, so daß ein
oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays
in eine oder mehrere Targetzellen eingeführt werden.
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In
einer Ausführungsform
des Verfahrens weist der Schritt des Erzeugens des Sprays aus im wesentlichen
dispergierten Partikeln den Schritt auf: Abgeben eines Sprays von
Mikrotröpfchen,
die Partikel suspendieren. Die elektrische Ladung wird auf die suspendierten
Partikel konzentriert, während
die Mikrotröpfchen
verdampfen.
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In
verschiedenen Ausführungsformen
können
die suspendierten Partikel Trägerpartikel
mit den Trägerpartikeln
zugeordnetem Biomaterial aufweisen, oder die suspendierten Partikel
können
Partikel aus Biomaterial aufweisen. Das Spray kann auch ein geladenes
Spray aus pulverförmigem
Biomaterial sein.
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Ferner
kann in noch einer weiteren Ausführungsform
der Schritt des Abgebens von Spray von Mikrotröpfchen, die Partikeln suspendieren,
den Schritt aufweisen: Erzeugen eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes zwischen
einer Abgabespitze, an der das Spray erzeugt wird, und einer Elektrode,
die von der Abgabespitze elektrisch getrennt ist. Die im wesentlichen
dispergierten Partikel können
unter Verwendung der Elektrode, die von der Abgabespitze getrennt
ist, auf die eine oder mehreren Targetzellen gelenkt werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ermöglicht
der Raumladungseffekt der konzentrierten elektrischen Ladung der
im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays, daß ein oder
mehrere der Partikel in ein oder mehrere der Targetzellen ein geführt werden.
Die elektrische Ladung, die auf ein bestimmtes Partikel konzentriert
ist, ist im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% der maximalen Ladung,
die von dem Mikrotröpfchen,
das das bestimmte Partikel suspendiert, gehalten werden kann.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
des Verfahrens weist der Schritt des Erzeugens eines Sprays aus
im wesentlichen dispergierten Partikeln auf: Herstellen eines kontinuierlichen
Sprays aus im wesentlichen dispergierten Partikeln.
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Eine
erfindungsgemäße Anordnung
zum Einführen
von Biomaterial in eine oder mehrere Targetzellen weist eine Biomaterialquelle
auf, die zumindest Biomaterial aufweist. Die Anordnung weist ferner
eine Abgabevorrichtung auf, die betriebsfähig mit der Biomaterialquelle
verbunden ist, um zumindest Biomaterial aus der Biomaterialquelle
aufzunehmen. Die Abgabevorrichtung weist ein Spray von im wesentlichen
dispergierten Partikeln aus zumindest dem Biomaterial auf. Ferner
wird an das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln eine
elektrische Ladung angelegt, so daß eine oder mehrere der im
wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in eine oder mehrere
der Targetzellen eingeführt
werden.
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In
einer Ausführungsform
der Anordnung weist die Biomaterialquelle eine Suspensionsquelle auf.
Die Suspensionsquelle weist eine Suspension von zumindest Biomaterial
auf. Ferner nimmt die Abgabevorrichtung die Suspension auf und gibt
ein Spray aus Mikrotröpfchen
ab, die Partikel aus zumindest Biomaterial suspendieren.
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In
einer weiteren Ausführungsform
weist die Abgabevorrichtung eine Abgabespitze, von der das Spray
von Mikrotröpfchen
suspendierenden Partikeln abgegeben wird, und eine von der Abgabespitze
getrennte Elektrode auf. Ein ungleichmäßiges elektrisches Feld wird
zwischen der Abgabespitze und der Elektrode erzeugt. Im allgemeinen
befindet sich die Elektrode, z. B. eine Ringelektrode oder eine
leitfähige
Targetoberfläche,
in einer Position relativ zur Abgabespitze, um das Spray von im
wesentlichen dispergierten Partikeln auf eine oder mehrere Targetzellen
zu lenken. Das Target und die Dispersionsvorrichtung können relativ
zueinander beweglich sein, z. B. kann ein Abstand zwischen der Abgabevorrichtung und
dem Target reguliert werden.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Vorrichtung zur
Einführung
von Biomaterial in Targetzellen weist eine Biomaterialquelle mit
einer Suspension aus zumindest Biomaterial auf. Die Vorrichtung
weist ferner eine Kapillarröhrchen-Elektrode
auf. Die Kapillarröhrchen-Elektrode
weist ein Kapillarröhrchen
mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende auf,
wobei das Kapillarröhrchen
betriebsfähig mit
der Biomaterialquelle verbunden ist, um einen Strom der Suspension
aus zumindest Biomaterial an ihrem ersten offenen Ende aufzunehmen.
Die Anordnung weist ferner eine Elektrode auf, die von dem zweiten
offenen Ende des Kapillarröhrchens
getrennt, aber in dessen Nähe
positioniert ist. Ein ungleichmäßiges elektrisches
Feld wird zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode
und der Elektrode erzeugt, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen,
die Partikel aus zumindest Biomaterial suspendieren, aus dem zweiten
Ende des Kapillarröhrchens
hervorgebracht wird. Ferner wird bei Verdampfung der Mikrotröpfchen eine
elektrische Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert,
was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln
führt,
so daß ein
oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays
in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
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In
einer Ausführungsform
der Anordnung weist die Kapillarröhrchen-Elektrode ferner eine
Umhüllung
auf, die konzentrisch mit mindestens einem Abschnitt des Kapillarröhrchens
zwischen seinem ersten und zweiten offenen Ende ist. Das zweite
offene Ende des Kapillarröhrchens
erstreckt sich um eine vorbestimmte Strecke über die Umhüllung hinaus. Die Anordnung
weist ferner eine Gasquelle auf, die ein Gas bereitstellt, das zwischen
dem Kapillarröhrchen
und der konzentrischen Umhüllung
aufzunehmen ist.
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Noch
eine weitere erfindungsgemäße Anordnung
zur Einführung
von Biomaterial in Targetzellen ist nachstehend beschrieben. Die
Anordnung weist eine Biomaterialquelle mit einer Suspension aus
zumindest Biomaterial und einer Elektrolytquelle zur Bereitstellung
einer Lösung
auf. Die Anordnung weist ferner eine Kapillarröhrchen-Elektrode mit einer
Abgabespitze auf. Die Kapillarröhrchen-Elektrode
weist ein erstes Kapillarröhrchen
mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende auf,
wobei das Kapillarröhrchen
betriebsfähig
mit der Biomaterialquelle verbunden ist, um einen Strom der Suspension
aus zumindest Biomaterial an ihrem ersten offenen Ende aufzunehmen.
Die Kapillarröhrchen-Elektrode
weist ferner ein zweites Kapillarröhrchen auf, das mit mindestens
einem Abschnitt des ersten Kapillarröhrchens konzentrisch ist. Die
Lösung
wird in einer ringförmigen Öffnung aufgenommen,
die zwischen dem ersten und dem zweiten konzentrischen Kapillarröhrchen gebildet
wird. Noch eine weitere Anordnung weist eine Elektrode auf, die
von der Abgabespitze der Kapillarröhrchen-Elektrode getrennt, aber in deren Nähe positioniert
ist. Ein ungleichmäßiges elektrisches
Feld wird zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode
und der Elektrode erzeugt, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen,
die Partikel aus zumindest Biomaterial suspendieren, an der Abgabespitze
bereitgestellt wird. Bei Verdampfung der Mikrotröpfchen wird eine elektrische
Ladung auf die suspendierten Partikeln konzentriert, was zu einem
geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln führt.
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Ein
weiteres erfindungsgemäßes Verfahren zur
Einführung
von Biomaterial in Targetzellen weist die Schritte auf: Bereitstellen
einer oder mehrerer Targetzellen, Bereitstellen eines ersten Stroms
aus einer Suspension, die zumindest Biomaterial aufweist, und Bereitstellen
eines zweiten Stroms einer Elektrolytlösung. Ein Spray aus im wesentlichen
dispergierten Partikeln mit zumindest Biomaterial wird aus dem ersten
Strom und dem zweiten Strom erzeugt. An die im wesentlichen dispergierten
Partikel wird eine elektrische Ladung angelegt, so daß ein oder
mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in
eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
- 1.
Verfahren zur Einführung
von Biomaterial in Zellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
aufweist:
Bereitstellen einer oder mehrerer Targetzellen; und
Erzeugen
eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln, die zumindest
Biomaterial aufweisen, wobei an die im wesentlichen dispergierten
Partikel eine elektrische Ladung angelegt wird, so daß ein oder
mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays in
eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
- 2. Verfahren gemäß Ausführungsform
1, wobei der Schritt der Erzeugung des Sprays von im wesentlichen
dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays
von Mikrotröpfchen, die
eine oder mehrere Partikel suspendieren, und wobei ferner die elektrische
Ladung auf die in den Mikrotröpfchen
suspendierten Partikel konzentriert wird, während die Mikrotröpfchen verdampfen.
- 3. Verfahren gemäß Ausführungsform
2, wobei die suspendierten Partikel Partikelträger und Biomaterial aufweisen.
- 4. Verfahren gemäß Ausführungsform
2, wobei die suspendierten Partikel Partikel aus Biomaterial sind.
- 5. Verfahren gemäß Ausführungsform
2, wobei der Schritt des Abgebens des Sprays von Mikrotröpfchen den
Schritt aufweist: Erzeugen eines gleichmäßigen elektrischen Feldes zwischen
einer Abgabespitze, an der das Spray erzeugt wird, und einer Elektrode,
die von der Abgabespitze elektrisch getrennt ist.
- 6. Verfahren gemäß Ausführungsform
5, wobei das verfahren ferner den Schritt aufweist: Lenken des Sprays
von im wesentlichen dispergierten Partikeln in Richtung der einen
oder mehreren Targetzellen unter Verwendung der von der Abgabespitze
getrennten Elektrode.
- 7. Verfahren gemäß Ausführungsform
2, wobei ein Raumladungseffekt der konzentrierten elektrischen Ladung
der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays ermöglicht,
daß einer
oder mehrere der Partikel im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% einer
maximalen Ladung ist, die von dem Mikrotröpfchen gehalten wird, das das
bestimmte Partikel suspendiert.
- 8. Verfahren gemäß Ausführungsform
7, wobei die elektrische Ladung, die auf ein bestimmtes Partikel
konzentriert ist, im Bereich von etwa 80% bis etwa 95% einer maximalen
La dung ist, die von dem Mikrotröpfchen
gehalten wird, das das bestimmte Partikel suspendiert.
- 9. Verfahren gemäß Ausführungsform
1, wobei der Schritt des Erzeugens eines Sprays von im wesentlichen
dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Erzeugen eines kontinuierlichen
Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln.
- 10. Verfahren gemäß Ausführungsform
1, wobei der Schritt des Erzeugens eines Sprays von im wesentlichen
dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays
von pulverförmigem
Biomaterial.
- 11. Anordnung zum Einführen
von Biomaterial in eine oder mehrere Targetzellen, wobei die Anordnung
aufweist:
eine Biomaterialquelle, die zumindest Biomaterial aufweist;
und
eine Abgabevorrichtung, die mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden
ist, um zumindest Biomaterial von der Biomaterialquelle aufzunehmen,
wobei die Abgabevorrichtung ein Spray von im wesentlichen dispergierten
Partikeln zumindest des Biomaterials bereitstellt und wobei ferner an
das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln eine elektrische
Ladung angelegt wird, so daß ein
oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays
in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
- 12. Anordnung gemäß Ausführungsform
11, wobei die Biomaterialquelle eine Suspensionsquelle aufweist,
wobei die Suspensionsquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial
aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung die Suspension aufnimmt
und ein Spray von Mikrotröpfchen abgibt,
die Partikel mit Biomaterial suspendieren.
- 13. Anordnung gemäß Ausführungsform
12, wobei die Abgabevorrichtung aufweist:
eine Abgabespitze,
von der das Spray von Partikel suspendierenden Mikrotröpfchen abgegeben wird;
und
eine Elektrode, die von der Abgabespitze getrennt ist,
wobei ein ungleichmäßiges elektrisches
Feld zwischen der Abgabespitze und der Elektrode erzeugt wird.
- 14. Anordnung gemäß Ausführungsform
13, wobei die Elektrode sich in einer Position relativ zur Abgabespitze
befin det, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln
in Richtung der einen oder mehreren Targetzellen zu lenken.
- 15. Anordnung gemäß Ausführungsform
11, wobei die Anordnung ferner eine Vakuumkammer aufweist, in der
sich eine oder mehrere Targetzellen befinden, und wobei ferner die
Abgabevorrichtung ein Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln
in die Kammer einbringt.
- 16. Anordnung gemäß Ausführungsform
11, wobei die Anordnung ferner ein Target mit der einen oder mehreren
Targetzellen aufweist, und wobei ferner das Target relativ zur Abgabespitze
positioniert ist, um die Einführung
von einem oder mehreren der Partikel in eine oder mehrere der Zielzellen
zu ermöglichen.
- 17. Anordnung gemäß Ausführungsform
16, wobei mindestens eines, das Target und/oder die Abgabevorrichtung
relativ zueinander beweglich sind.
- 18. Anordnung gemäß Ausführungsform
11, wobei die Biomaterialquelle eine Suspension aus zumindest Biomaterial
aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung aufweist:
eine
Kapillarröhrchenelektrode,
wobei die Kapillarröhrchenelektrode
ein Kapillarröhrchen
mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende aufweist,
wobei das erste Kapillarröhrchen
mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um einen
Strom der Suspension von zumindest Biomaterial an seinem ersten
offenen Ende aufzunehmen; und
eine Elektrode, die von der Abgabespitze
der Kapillarröhrchen-Elektrode
getrennt, aber in der Nähe
derselben positioniert ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen
der Kapillarröhrchen-Elektrode
und der Elektrode erzeugt wird, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen, die
Partikel von zumindest Biomaterial suspendieren, aus dem zweiten
Ende des Kapillarröhrchens hervorgebracht
wird, und wobei ferner nach Verdampfung der Mikrotröpfchen eine
elektrische Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert wird,
was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln
führt,
so daß einer
oder mehrere der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays
in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt wird.
- 19. Anordnung gemäß Ausführungsform
18, wobei die Elektrode sich in einer Position relativ zum zweiten
offenen Ende des Kapillarröhrchens
befindet, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln
in Richtung der Zielzellen zu lenken.
- 20. Anordnung gemäß Ausführungsform
19, wobei die Elektrode ist, die einen Durchmesser hat, der größer ist
als der Durchmesser des Kapillarröhrchens, und die so positioniert
ist, daß eine Achse
durch die Mitte der Ringelektrode mit einer Achse übereinstimmt,
die sich durch das Kapillarröhrchen
erstreckt.
- 21. Anordnung gemäß Ausführungsform
19, wobei die Elektrode ein leitfähiges Target ist, das eine
oder mehrere ihm zugeordnete Zellen aufweist und vor dem zweiten
offenen Ende des Kapillarröhrchens
positioniert ist, wobei das leitfähige Target eine Oberfläche hat,
die größer ist
als die Schnittfläche
des Kapillarröhrchens,
senkrecht zur Längsachse,
die sich durch das Kapillarröhrchen
erstreckt.
- 22. Anordnung gemäß Ausführungsform
18, wobei wobei die Kapillarröhrchen-Elektrode
ferner eine Umhüllung
aufweist, die zumindest mit einem Abschnitt des Kapillarröhrchens
zwischen seinem ersten und zweiten offenen Ende konzentrisch ist, wobei
das zweite offene Ende des Kapillarröhrchens sich um eine vorbestimmte
Strecke über die
Umhüllung
hinaus erstreckt und wobei ferner die Anordnung eine Gasquelle aufweist,
die ein aufzunehmendes Gas zwischen dem Kapillarröhrchen und
der konzentrischen Umhüllung
bereitstellt.
- 23. Anordnung gemäß Ausführungsform
11, wobei die Biomaterialquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial
aufweist, wobei die Anordnung ferner eine Elektrolytquelle zur Bereitstellung
einer Lösung
aufweist und wobei ferner die Abgabevorrichtung aufweist:
eine
Kapillarröhrchenelektrode
mit einer Abgabespitze, wobei die Kapillarröhrchenelektrode aufweist:
ein
erstes Kapillarröhrchen
mit einem ersten offenen Ende und einem zweiten offenen Ende, wobei das
erste Kapillarröhrchen
mit der Biomaterialquelle betriebsfähig verbunden ist, um einen Strom
der Suspension aus zumindest Biomaterial an seinem ersten offenen
Ende aufzunehmen, und
ein zweites Kapillarröhrchen, das zumindest mit einem
Abschnitt des ersten Kapillarröhrchens konzentrisch
ist, wobei die Elektrolytlösung
in einer ringförmigen Öffnung aufgenommen
wird, die zwischen dem ersten und zweiten Kapillarröhrchen,
die konzentrisch sind, gebildet wird; und
eine Elektrode, die
von der Abgabespitze der Kapillarröhrchenelektrode getrennt, aber
in der Nähe derselben
positioniert ist, wobei ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zwischen
der Kapillarröhrchen-Elektrode
und der Elektrode erzeugt wird, so daß ein Spray von Mikrotröpfchen,
die Partikel von zumindest Biomaterial suspendieren, an der Abgabespitze
bereitgestellt wird, und wobei ferner bei Verdampfung der Mikrotröpfchen eine
elektrische Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert wird,
was zu einem geladenen Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln
führt.
- 24. Anordnung gemäß Ausführungsform
12, 18 oder 23, wobei die suspendierten Partikel Trägerpartikel
und Biomaterial aufweisen.
- 25. Anordnung gemäß Ausführungsform
12, 18 oder 23, wobei die suspendierten Partikel Partikel aus Biomaterial
aufweisen.
- 26. Anordnung gemäß Ausführungsform
18 oder 23, wobei die Biomaterialquelle eine kontinuierliche Quelle
von zumindest Biomaterial an das erste offene Ende des ersten Kapillarröhrchens
liefert.
- 27. Anordnung gemäß Ausführungsform
18 oder 23, wobei die Elektrode sich in einer Position relativ zur
Kapillarröhrchenelektrode
befindet, um das Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln in
Richtung der Targetzellen zu lenken.
- 28. Anordnung gemäß Ausführungsform
18 oder 23, wobei die Elektrode eine Ringelektrode ist, die einen
Durchmesser hat, der größer als
der Durchmesser der ersten oder zweiten Kapillarröhre ist, und
die so positioniert ist, daß eine
Achse durch die Mitte der Ringelektrode mit der Längsachse übereinstimmt,
die sich durch das erste Kapillarröhrchen erstreckt.
- 29. Anordnung gemäß Ausführungsform
18 oder 23, wobei die Elektrode ein leitfähiges Target ist, das einer
oder mehreren Zellen zugeordnet ist, wobei das leitfähige Target
vor dem zweiten offenen Ende des Kapillarröhrchens positioniert ist, und
wobei ferner das leitfähige
Target eine Oberfläche
hat, die größer ist
als eine Schnittfläche
des ersten oder zweiten Kapillarröhrchens senkrecht zu einer
Längsachse
ist, die sich durch das Kapillarröhrchen erstreckt.
- 30. Verfahren zum Einführen
von Biomaterial in Zellen, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:
Bereitstellen
einer oder mehrerer Targetzellen;
Bereitstellen eines ersten
Stroms einer Suspension, die zumindest Biomaterial aufweist;
Bereitstellen
eines zweiten Stroms einer Lösung; und
Erzeugen
eines Sprays von im wesentlichen dispergierten Partikeln, die zumindest
Biomaterial aufweisen, aus dem ersten Strom und dem zweiten Strom,
wobei an die im wesentlichen dispergierten Partikel eine elektrische
Ladung angelegt wird, so daß ein
oder der mehrere im wesentlichen dispergierte Partikel des Sprays
in eine oder mehrere der Targetzellen eingeführt werden.
- 31. Verfahren gemäß Ausführungsform
30, wobei der Schritt des Erzeugens des Sprays von im wesentlichen
dispergierten Partikeln den Schritt aufweist: Abgeben eines Sprays
von Partikel suspendierenden Mikrotröpfchen, und wobei ferner die elektrische
Ladung auf die suspendierten Partikel konzentriert wird, während das
Mikrotröpfchen verdampft.
- 32. Verfahren gemäß Ausführungsform
31, wobei die suspendierten Partikel Trägerpartikel und Biomaterial
aufweisen.
- 33. Verfahren gemäß Ausführungsform
31, wobei die suspendierten Partikel Partikel aus Biomaterial sind.
- 34. Verfahren gemäß Ausführungsform
30, wobei die Lösung
ein Mittel zur Förderung
des Eindringens in die Targetzellen aufweist.
- 35. Verfahren gemäß Ausführungsform
30, wobei die Lösung
ein Mittel zur Förderung
des Eindringens in die Targetzellen aufweist.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1A ist
ein allgemeines Blockschaltbild, das eine erfindungsgemäße Elektrospray-Anordnung zur
Erzeugung eines geladenen Sprays unter Verwendung einer Biomaterialquelle
darstellt.
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1B ist
eine allgemeine bildliche Darstellung einer erfindungsgemäßen Elektrospray-Anordnung
zur Erzeugung eines geladenen Sprays unter Verwendung einer Biomaterialquelle,
einschließlich einer
Suspension.
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1C ist
eine erfindungsgemäße Ausführungsform
einer Elektrospray-Anordnung gemäß 1B zur
Erzeugung eines geladenen Sprays unter Verwendung einer Kapillarröhrchen-Elektrode und
einer Biomaterialquelle, einschließlich einer Suspension.
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2 ist
eine bildliche Darstellung einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform
einer Elektrospray-Anordnung gemäß 1B.
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3 ist
eine bildliche Darstellung einer in 2 gezeigten
Anordnung mit einem zusätzlichen elektrostatischen
Beschleunigungsfeld.
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4 ist
eine bildliche Darstellung einer Anordnung gemäß 2 mit einem
Plazierungssteuerteil.
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5 ist
eine bildliche Darstellung einer alternativen erfindungsgemäßen Elektrospray-Anordnung,
die eine Vakuumkammer verwendet.
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6 ist
eine weitere alternative erfindungsgemäße Elektrospray-Anordnung,
die eine kontinuierliche Elektrospray-Anordnung darstellt.
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7 ist
eine ausführlichere
Darstellung eines Abschnitts der erfindungsgemäßen Elektrospray-Anordnung
mit einem Verteilerkopf mit einfachem Kapillarröhrchen.
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8 ist
eine ausführlichere
Darstellung einer alternativen Kapillarkonfiguration zur Verwendung
in der in 7 gezeigten Anordnung mit einem Verteilerkopf
mit doppelten Kapillarröhrchen.
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9 zeigt
eine bildliche Darstellung eines Abschnitts einer erfindungsgemäßen kompakten stiftartigen
Elektrospray-Anordnung.
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Ausführliche
Beschreibung der Ausführungsformen
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Die
Erfindung wird zunächst
allgemein mit Bezug auf 1A bis 1C beschrieben.
Verschiedene weitere Ausführungsformen
der Erfindung werden dann ferner mit Bezug auf 2 bis 9 beschrieben.
Der Fachmann wird unschwer erkennen, daß Elemente von einer Ausführungsform
in Kombination mit Elementen der anderen Ausführungsformen verwendet werden
können
und daß die Erfindung
nicht auf die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen,
sondern nur durch die beigefügten
Ansprüche
beschränkt
ist.
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Die
Erfindung betrifft Anordnungen und Verfahren zur Einführung von
Biomaterialien, z. B. DNA, in Targetzellen, z. B. Zellen von Pflanzen
oder Lebewesen. Wie in 1A gezeigt, verwendet die Erfindung
eine Elektrospray-Anordnung 1, um ein Spray 4 geladener
Partikel zu erzeugen. Die Elektrospray-Anordnung 1 weist
eine Abgabevorrichtung 3 auf, die zumindest Biomaterial
aus einer Biomaterialquelle 2 aufnimmt und das geladene
Spray 4 vor dieser erzeugt. Der Raumladungseffekt der geladenen Partikel
des Sprays 4 ermöglicht
es, daß die
Partikel eine solche Geschwindigkeit erreichen, daß die Partikel
zwangsläufig
die Targetzellen 5 berühren
und vorzugsweise eindringen, wenn sie aufprallen.
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Der
Begriff geladenes Spray 4, wie er hier verwendet wird,
bezeichnet ein Spray von Partikeln, an das eine Ladung angelegt
ist und das aus einer Biomaterialquelle 2 kommend erzeugt
wird. Die Biomaterialquelle kann eine Quelle für trockenes Biomaterial allein
oder für
Biomaterial, das Trägerpartikeln
zugeordnet ist, d. h. für
pulverförmiges
Biomaterial, sein. Vorzugsweise ist die Biomaterialquelle 2 eine Suspension
aus Biomaterial, nämlich
eine Lösung, die
zumindest Biomaterial aufweist. Beispielsweise kann die Biomaterialsuspension
eine Suspension aus Biomaterial allein oder eine Suspension aus
Biomaterial und Trägerpartikeln
sein. Jede Quelle für
Biomaterial, das mit einer angelegten unipolaren Ladung (d. h. Ladung
mit der gleichen Polarität)
versprüht
werden kann, kann jedoch erfindungsgemäß verwendet werden.
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Die
Abgabevorrichtung 3 kann eine beliebige Vorrichtung zur
Erzeugung eines Sprays von Ladungspartikeln 4 mit einer angelegten
unipolaren Ladung sein, so daß der
Raumladungseffekt der geladenen Partikel des Sprays 4 die
Partikel eine Geschwindigkeit erreichen läßt, die es ermöglicht,
daß die
Partikel zwangsläufig
die Targetzelle 5 berühren und
vorzugsweise eindringen. Die Konfiguration der Abgabevorrichtung 3 hängt zumindest
vom Typ der verwendeten Biomaterialquelle 2 ab. Wenn beispielsweise
die Biomaterialquelle 2 eine Quelle für trockenes Biomaterial allein
oder Trägerpartikeln
zugeordnetes Biomaterial ist, z. B. pulverförmiges Biomaterial, kann die
Abgabevorrichtung 3 die Form einer Sprühvorrichtung haben, die durch
Koronaentladung eine unipolare Ladung an die Partikel des Sprays
anlegt. Eine solche Sprühvorrichtung
kann eine Struktur mit einer durchgehenden Öffnung aufweisen. Ein Strom
des pulverförmigen
Materials kann durch die Öffnung
befördert
werden, beispielsweise durch eine Druckgasquelle. Beim Austritt
aus der Öffnung
können
die Partikel des Sprays einer schwachen Korona ausgesetzt werden,
die durch um die Öffnung
herum positionierte Bürsten
erzeugt wird. Der Fachmann wird anerkennen, daß dies lediglich ein anschauliches
Beispiel einer Vorrichtung zum Versprühen von pulverförmigem Biomaterial
mit einer angelegten Ladung ist und daß die Erfindung eindeutig nicht
auf diese bestimmte Ausführungsform,
sondern lediglich durch die beigefügten Ansprüche beschränkt ist.
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Wie
der Fachmann anerkennen wird, bezeichnet der Begriff 'angelegte Ladung', wie er hier verwendet
wird, das Anlegen einer unipolaren Ladung (z. B. der Ladung gleicher
Polarität)
an die Partikel des Sprays 4. Beispielsweise kann die Ladung durch
Koronaentladung angelegt werden, wie oben mit Bezug auf das pulverförmige Biomaterial
beschrieben. Ferner kann die Ladung beispielsweise durch Ladungskonzentration
auf das Spray von Partikeln durch Verdampfung einer Lösung, die
die Partikel suspendiert, in einem elektrischen Feld ausgeübt werden,
wie ferner unten mit Bezug auf die allgemeine Darstellung in 1B beschrieben.
Das heißt, die
Biomaterialquelle 2 ist beispielsweise eine Biomaterialsuspension,
und ein Mikrotröpfchenspray wird
von der Abgabevorrichtung 3 hervorgebracht, das heißt, in Mikrotröpfchen suspendierte
Partikel werden abgegeben. Die in Mikrotröpfchen suspendierten Partikel
können Trägerpartikel
und Biomaterial oder Biomaterial selbst ohne Verwendung von Trägerpartikeln
sein. Das heißt,
wenn das Spray abgegeben wird, ist es vorzugsweise ein Spray flüssiger suspendierter
Partikel im Gegensatz zu einem Pulverspray. Der flüssige Anteil
des Sprays suspendierter Partikel verdampft im allgemeinen, um die
Ladung des flüssigen
Anteils auf den Partikeln zu konzentrieren, was zu einem Spray geladener
Partikel führt,
wie ferner nachstehend mit Bezug auf 1B beschrieben
wird.
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Das
durch ein Elektrosprayverfahren bereitgestellte Spray von Partikeln
ermöglicht
einen steuerbaren Biomaterialtransferprozeß, der nicht auf eine Chargenverarbeitung
beschränkt
ist. Vielmehr kann die Elektrospraytechnik kontinuierlich genutzt
werden.
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Der
Elektrospraymechanismus 1 stellt ein geladenes Spray mit
einer hohen Konzentration von geladenen Partikeln bereit. Vorzugsweise
ist die Konzentration der geladenen Partikel im Spray im Bereich
von etwa 105 Partikel/Kubikzentimeter (Partikel/cm3) bis etwa 1012 Partikel/cm3; besonders bevorzugt im Bereich von etwa
107 Partikel/cm3 bis
etwa 1010 Partikel/cm3;
und noch mehr bevorzugt etwa 109 Partikel/cm3. Unter etwa 105 Partikel/cm3 ist die Konzentration geladener Partikel
so niedrig für
den Raumladungseffekt, daß die
Geschwindigkeit zur Einführung
in die meisten Targetzellen nicht erreicht wird. Aufgrund des Raumladungseffekts,
d. h. des Effekts, der durch die Ladungsabstoßung von geladenen Partikeln
entsteht, wird ein Spray von im wesentlichen dispergierten Partikeln
mit der Ladung gleicher Polarität
mit den Partikeln versehen, die im wesentlichen gleichmäßig über die
Sprayfläche
(z. B. die Fläche,
die durch D in 1A dargestellt ist) verteilt sind,
wo sich die Targetzellen befinden. Der Begriff 'im wesentlichen dispergierte Partikel', wie er hier verwendet
wird, bezeichnet gleichmäßig und/oder ungleichmäßig große Partikel,
die durch eine angelegte abstoßende
elektrostatische Kraft getrennt sind. Der Elektrosprayprozeß ist ein
beständiger
und reproduzierbarer Transferprozeß. Da die geladenen Partikel
des Sprays einander abstoßen,
wird ferner eine Agglomeration der Partikel vermieden. Daher ermög licht die
Elektrospraytechnologie eine reduzierte Beschädigung durch Vertiefungen und
Stoßbeschädigung,
die übliche
Ergebnisse sind, wenn bei Verwendung herkömmlicher Transferverfahren
Partikelagglomeration auftritt. Außerdem ermöglicht die Elektrospraytechnik,
wie sie nachstehend beschrieben wird, daß der Gentransferprozeß auf verschiedene
Weise gesteuert werden kann.
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Aufgrund
der geringen Größe der geladenen Partikel
des Sprays, das im Bereich eines Targets erzeugt wird, das eine
oder mehrere Zellen aufweist, stellt der Raumladungseffekt, d. h.
der Effekt, der durch die Ladungsabstoßung von geladenen Partikeln
entsteht, Partikel mit einer ausreichenden Geschwindigkeit bereit,
um eine oder mehrere Targetzellen zwangsläufig zu berühren und vorzugsweise einzudringen.
Ein solcher Raumladungseffekt erzeugt jedoch auch ein Spray geladener
Partikel, das im allgemeinen nicht enthalten ist, d. h. der Partikel, die
zufällig
in verschiedenen Richtungen verteilt sind. Deshalb wird bevorzugt,
das Spray geladener Partikel auf die eine oder mehreren Targetzellen
zu beschränken
oder zu lenken. Wie nachstehend dargestellt, besteht eine Technik
der Durchführung
einer solchen Beschränkung
und/oder Lenkung für
solche geladenen Partikel darin, eine Elektrode zu verwenden, die
bereits erforderlich ist, um das geladene Spray zu erzeugen, wenn
die Biomaterialquelle eine Suspension von zumindest Biomaterial
ist. Das heißt, die
Elektrode wird verwendet, um ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zur
Erzeugung eines geladenen Sprays bereitzustellen und führt die
Lenkung der Partikel des geladenen Sprays durch, wie nachstehend
ausführlich
beschrieben wird.
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1B zeigt
allgemein eine bildliche Darstellung einer Elektrospray-Anordnung 6 zur
Erzeugung eines geladenen Sprays 28 unter Verwendung einer
Abgabevorrichtung 8, die einen Strom einer Suspension von
einer Biomaterialquelle 7 aufnimmt. Die Biomaterialquelle 7 enthält eine
Suspension von zumindest Biomaterial, z. B. Biomaterial allein oder Biomaterial
und Trägerpartikel.
Im allgemeinen weist die Abgabevorrichtung 8 eine gleitfähige Struktur 17 auf,
die eine Öffnung 9 bildet
(z. B. ein Kapillarröhrchen,
eine Öffnung,
die in einer Flut kammer ausgebildet ist usw.) zum Aufnehmen eines
Stroms einer Partikel suspendierenden Lösung, z. B. Biomaterial allein
oder Trägerpartikel
zusammen mit Biomaterial. Beispielsweise kann die Lösung durch
die Öffnung 9 an
der Abgabespitze 27 der leitfähigen Struktur 17, die
die Öffnung 9 bildet,
gedrückt
oder gesaugt werden, z. B. durch eine Pumpe gedrückt. Die leitfähige Struktur 17,
die die Öffnung 9 bildet,
fungiert als eine erste Elektrode der Abgabevorrichtung 8,
wobei die Abgabespitze 27 der leitfähigen Struktur zur Abgabe von
Mikrotröpfchen
in Richtung der Targetzellen 5 positioniert ist. Ferner
weist die Abgabevorrichtung 8 eine zweite Elektrodenstruktur 11 auf.
Eine elektrische Potentialdifferenz wird zwischen die erste Elektrode 17 und
die zweite Elektrode 11 angelegt, um ein ungleichmäßiges elektrisches
Feld zwischen der ersten Elektrode 17 und der zweiten Elektrode 11 zu
erzeugen. Der Fachmann wird anerkennen, daß die Elektroden unter Verwendung
eines oder mehrerer leitfähiger
Elemente ausgebildet sein können.
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Im
allgemeinen wird im Betrieb ein Strom der Suspension durch die Öffnung 9 bereitgestellt,
der z. B. durch die Öffnung 9 gedrückt und/oder
gesaugt wird. Ein Meniskus entsteht an der Abgabespitze 27, wo
die Öffnung 9 einen
Durchmesser in einem bevorzugten Bereich von etwa 6 Mikrometer bis
etwa 2 Millimeter (mm) hat. Eine Potentialdifferenz wird angelegt,
um ein ungleichmäßiges Feld 15 zwischen
der ersten Elektrode 17 und der zweiten Elektrode 11 zu erzeugen.
Beispielsweise kann eine hohe positive Spannung an die erste Elektrode 17 angelegt
werden, während
die zweite Elektrode 11 geerdet ist. Ferner kann beispielsweise
eine Spannungsdifferenz im bevorzugten Bereich von etwa 2000 V bis
etwa 6000 V angelegt werden.
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Ein
ungleichmäßiges elektrisches
Feld, wie es hier verwendet wird, bezeichnet ein elektrisches Feld,
das durch eine elektrische Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden
entsteht. Das ungleichmäßige elektrische
Feld weist mindestens einige elektrische Feldlinien auf, die an
einer Elektrode in bezug auf die andere Elektrode stärker lokal
konzentriert sind, z. B. an der Abgabespitze in bezug auf die zweite
Elektrode stärker
konzentriert. Das heißt,
beispielsweise sind zu mindest einige der Feldlinien abseits der
Achse relativ zu der durch die Mitte der Öffnung 9 verlaufenden
Längsachse 29.
Ferner ist beispielsweise die Elektrode 11 vor der Abgabespitze 27 in
Richtung der Targetzellen 5 positioniert, und die Elektrode 11 hat
eine Größe und/oder
weist mindestens einen Abschnitt auf, der in einer Position abseits von
der Längsachse 29 befindet.
Ferner kann beispielsweise die Elektrode 11 eine Ringelektrode
mit einem Durchmesser sein, der größer als der Durchmesser der Öffnung 9 ist,
und vor der Abgabespitze 27 positioniert sein, wobei eine
Achse durch die Mitte der Ringelektrode verläuft, die mit der Längsachse 29 der Öffnung 9 übereinstimmt.
Ferner kann beispielsweise die Elektrode 11 eine leitfähige Targetfläche mit
einer Fläche,
die größer als
der Querschnitt der Öffnung 9 senkrecht
zur Längsachse 29 ist,
und vor der Abgabespitze 27 positioniert sein.
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Wenn
die Biomaterialquelle 7 eine Suspension aus Biomaterial
(ohne Verwendung von Trägerpartikeln)
ist, wird die Suspension durch die Öffnung 9 befördert (beispielsweise
gedrückt
und/oder gesaugt). Im allgemeinen hat der flüssige Anteil der Suspension,
der an der Öffnung 9 geliefert
wird, eine elektrische Leitfähigkeit.
Das Biomaterial hat eine ihm zugeordnete kleine Ladung, z. B. kann
DNA eine kleine negative Ladung haben, aber die Ladung des Biomaterials
ist infolge der größeren Ladung,
die auf das Biomaterial konzentriert ist, belanglos, wie nachstehend
beschrieben wird.
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Während die
Suspension durch die Öffnung strömt, entzieht
die Potentialdifferenz zwischen der ersten und zweiten Elektrode,
die das elektrische Feld zwischen beiden erzeugt, der Flüssigkeit
eine Ladungspolarität,
d. h. die negative Ladung wird entzogen, wenn eine hohe positive
Spannung an die Elektrode 17 angelegt wird, wobei ein positiv
geladenes Mikrotröpfchen
zurückbleibt,
das von der Abgabespitze 27 abzugeben ist. Beispielsweise
kann der Meniskus an der Abgabespitze einen Kegelstrahl zum Abgeben
eines Sprays von Biomaterial suspendierendem Mikrotröpfchen bilden,
wenn die Kräfte des
ungleichmäßigen Feldes 15 die
Oberflächenspannung
des Meniskus ausgleichen. Das Mikrotröpfchenspray wird ferner in
dem ungleichmäßigen elektrischen
Feld 15 positiver.
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Während die
Mikrotröpfchen
verdampfen, konzentriert sich die Ladung der Mikrotröpfchen auf das
Biomaterial, was zu einem Spray geladener Biomaterialpartikel führt. Die
Ladungsmenge der Tröpfchen
und somit die Ladungsmenge eines Partikels nach der Verdampfung
beruht zumindest auf der Leitfähigkeit
der Flüssigkeit,
die verwendet wird, um die Mikrotröpfchen zu versprühen, der
Oberflächenspannung
der Flüssigkeit,
der Dielektrizitätskonstante
der Flüssigkeit
und der Zuführungsdurchflußrate der Flüssigkeit.
Im allgemeinen ermöglicht
der Raumladungseffekt, der auf die konzentrierte elektrische Ladung
der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays zurückzuführen ist,
daß die
Partikel zwangsläufig
die Targetzellen berühren
und vorzugsweise eindringen. Die elektrische Ladung, die auf ein
bestimmtes Partikel konzentriert ist, ist vorzugsweise im Bereich
von etwa 80% bis etwa 95% einer maximalen Ladung, die von dem Mikrotröpfchen gehalten
werden kann, das das bestimmte Partikel, z. B. das Biomaterialpartikel,
suspendiert, ohne daß das
Mikrotröpfchen
zerstört
oder zerrissen wird, d. h. im Bereich von etwa 80% bis etwa 95%
der Rayleigh-Ladungsgrenze.
Bei 100% wird die Oberflächenspannung
des Mikrotröpfchens
durch die elektrischen Kräfte,
die die Zerstörung
der Tröpfchen
bewirken, beseitigt. Das ungleichmäßige elektrische Feld ermöglicht auch
den Einschluß der
Partikel und/oder der Richtung der Partikel, die sich andernfalls
infolge des Raumladungseffekts in Zufallsrichtungen fortbewegen
würden.
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Wenn
die Biomaterialquelle 7 eine Suspension aus Biomaterial
und Trägerpartikeln
ist, wird die Suspension durch die Öffnung 9 befördert (z.
B. gedrückt
oder gesaugt). Im allgemeinen hat der flüssige Anteil der Suspension,
der zur Öffnung 9 befördert wird,
eine elektrische Leitfähigkeit.
Wie nachstehend beschrieben wird, kann mehr als ein Lösungsstrom verwendet
werden, um das Spray zu erzeugen. Beispielsweise kann ein Materialstrom
eine Suspension aus Material sein, die deionisiertes Wasser verwendet,
während
ein zweiter Materialstrom eine Elektrolytlösung mit einer geeigneten Leitfähigkeit
aufweist. Das Biomaterial hat im allgemeinen eine kleine, aber belanglose
zugeordnete Ladung. Die Trägerpartikel sind
im allgemeinen neutral.
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Während die
Suspension durch die Öffnung strömt, entzieht
die Potentialdifferenz zwischen der ersten und zweiten Elektrode,
die das ungleichmäßige Feld
zwischen beiden erzeugt, der Flüssigkeit eine
Ladungspolarität,
d. h. die negative Ladung wird entzogen, wenn eine hohe positive
Spannung an die Elektrode 17 angelegt wird, wobei ein positiv
geladenes Mikrotröpfchen
zurückbleibt,
das von der Abgabespitze 27 abzugeben ist. Ein Spray von
Mikrotröpfchen,
die Biomaterial und Trägerpartikel
suspendieren, wird vor der Abgabespitze 27 erzeugt, wobei
die Mikrotröpfchen
positiv geladen sind.
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Während die
Mikrotröpfchen
verdampfen, konzentriert sich die Ladung der Mikrotröpfchen auf das
Biomaterial und die Trägerpartikeln,
was zu einem Spray positiv geladener Trägerpartikel führt, die dem
Biomaterial zugeordnet sind. Das Biomaterial, das die geringfügig negative
Ladung haben kann, wird zu den positiv geladenen Trägerpartikeln
hingezogen, was zu einer besseren Adhäsion zwischen dem Biomaterial
und den Trägerpartikeln
führt.
Dies ist anders als bei herkömmlich
hergestellten Trägerpartikeln
mit zugeordnetem Biomaterial, da bei herkömmlichen Verfahren die neutralen
Trägerpartikel bei
dem geringfügig
negativ geladenen Biomaterial keine solchen Anziehungskräfte erzeugen.
Das heißt,
die Erfindung ermöglicht
einen besseren Beschichtungsprozeß zum Beschichten von Trägerpartikeln
mit Biomaterial. Dies führt
zu einer gleichmäßigeren
Verteilung des Biomaterials, das an die Targetzellen zu verabreichen
ist. Im allgemeinen ermöglicht der
Raumladungseffekt, der auf die konzentrierte elektrische Ladung
der im wesentlichen dispergierten Partikel des Sprays zurückzuführen ist,
wie oben beschrieben, daß die
Partikel zwangsläufig
die Targetzellen berühren
und vorzugsweise eindringen.
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Der
Fachmann wird anerkennen, daß die
angelegten Spannungen umgekehrt sein können. Beispielsweise kann die
erste Elektrode geerdet sein, während
an die zweite Elektrode eine hohe positive Spannung angelegt wird.
In einem solchen Fall wäre auf
die Partikel des Sprays eine negative Ladung konzentriert. Ferner
kann eine beliebige andere angelegte Spannungs konfiguration, die
ein ungleichmäßiges elektrisches
Feld bereitstellt, um das geladene Spray von Partikeln zu erzeugen,
verwendet werden.
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Ferner
wird der Fachmann anerkennen, daß das Spray von Partikeln kein
Biomaterial haben muß, das
den Partikelträgern
zugeordnet ist. Wenn beispielsweise eine positive Spannung an die
zweite Elektrode 11 angelegt wird und die erste Elektrode 17 geerdet
ist, dann haben die Trägerpartikel,
die normalerweise in der Suspension neutral sind, eine negative
Ladung, während
sie versprüht
werden. Wenn Biomaterial geringfügig
negativ ist, können
Abstoßungskräfte die
Trägerpartikel
von dem Biomaterial getrennt halten und somit von einer Zuordnung
zu ihm fernhalten. Auf diese Weise wären die Trägerpartikel und die Biomaterialpartikel
in dem Spray geladener Partikel voneinander getrennt. Die Trägerpartikel können in
die Targetzellen eindringen und dabei zunächst einen Kanal in den Targetzellen
bilden, so daß die
Biomaterialpartikel zur Einführung
in die Targetzellen ohne weiteres durch diesen hindurchgelangen können.
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Eine
verallgemeinerte Ausführungsform
der Elektrospray-Anordnung 6,
die insgesamt in 1B gezeigt ist, wird nachstehend
mit Bezug auf die Elektrospray-Vorrichtung 10 beschrieben,
die in 1C gezeigt ist. Im allgemeinen
weist die erfindungsgemäße Elektrospray-Anordnung 10 eine
Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 auf, die zur Bereitstellung
eines geladenen Sprays 28 positioniert ist. Hinter oder
vor der Abgabevorrichtung 12 ist ein Target 13 mit
einer oder mehreren Targetzellen 40 positioniert.
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Erfindungsgemäß wird durch
eine hohe positive Spannungsquelle 20, die an eine Kapillarröhrchen-Elektrode 18 eines
Verteilerkopfs 19 der Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 und
die mit Erde 38 verbundene Elektrode 21 angelegt
wird, eine Ladung an das Spray 28 angelegt. Das Spray 28 entsteht, wie
oben beschrieben, unter Verwendung des ungleichmäßigen elektrischen Feldes,
das zwischen der Abgabespitze 23 der Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und
der Elektrode 21 erzeugt wird. Das Spray 28 kann
durch jede Elektrospray-Abgabevorrichtung bereitgestellt werden,
die zur Bereitstellung eines Sprays 28 mit einer angelegten
Ladung geeignet ist. Vorzugsweise ist die Ladung der Partikel so
hoch, daß die
Partikel des Sprays 28 infolge des Raumladungseffekts eine
Geschwindigkeit bekommen, die so hoch ist, daß die dispergierten Partikel
des Sprays 28 in Targetzellen 40 eindringen können.
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Die
Partikelgeschwindigkeit ist hauptsächlich eine Funktion der Partikelladung
und des Raumladungseffekts. Das zwischen der Hochspannungskapillarröhrchen-Elektrode 18 und
der elektrisch geerdeten Elektrode 21 gebildete ungleichmäßige elektrische
Feld ermöglicht
die Abgabe des Sprays 28 von der Abgabespitze 23 des
Verteilerkopfs 19. Wie nachstehend beschrieben wird, können in
Abhängigkeit
von der Potentialdifferenz, die zwischen dem Verteilerkopf 19 mit
der ersten Elektrode, z. B. der Kapillarröhrchen-Elektrode 18,
und der zweiten Elektrode 21 verschiedene Spraybetriebsmodi
festgelegt werden.
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Das
ungleichmäßige elektrische
Feld kann durch verschiedene Konfigurationen bereitgestellt werden.
Beispielsweise kann die zweite Elektrode 21 ein leitfähiges Material
sein, das so geerdet und positioniert ist, daß die Ausbildung eines Sprays 28 an der
Abgabespitze 23 des Verteilerkopfs 19 erfolgt oder
die Hervorbringung eines geladenen Sprays aus dem Verteilerkopf 19 anderweitig
bewirkt wird, z. B. kann die zweite Elektrode eine geerdete Ringelektrode,
eine geerdete Targetoberfläche,
die die Zellen hält,
usw. sein. Die zweite Elektrode 21 kann sich in verschiedenen
Positionen befinden, wie in 1C gezeigt.
Beispielsweise kann sich die Elektrode 21 in einer Position
direkt vor dem Verteilerkopf 19 befinden, oder die Elektrode 21 kann
sich weiter weg vom Verteilerkopf 19 und näher an den
Targetzellen 40 befinden.
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Man
wird anerkennen, daß die
zweite Elektrode 21 eine von vielen verschiedenen Konfigurationen
haben kann. Beispielsweise kann die Elektrode eine leitfähige Plattform
sein, auf der die Zellen positioniert werden. Ferner kann beispielsweise
die Elektrode 21 eine Ringelektrode mit einer Achse sein,
die mit einer Achse des Verteilerkopfs 19 übereinstimmt usw.
Damit das elektrische Feld ungleichmäßig ist, muß mindestens ein Abschnitt
der Elektrode 21 außerhalb
eines hypothe tischen Zylinders 25 positioniert sein, der
sich vom Umfang der Kapillarröhrchen-Elektrode
zum Target 13 erstreckt. Das heißt, die elektrischen Feldlinien
müssen
sich zu und/oder von einem Bereich außerhalb des hypothetischen Zylinders 25 erstrecken.
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Die
Stärke
des Feldes kann durch Regulierung des Abstands zwischen der ersten
Elektrode 18 und der zweiten Elektrode 21 reguliert
werden. Je weiter die Elektrode 21 vom Verteilerkopf 19 entfernt ist,
um so geringer ist die Feldstärke.
Bei einem solchen zunehmenden Abstand wird jedoch mehr Richtwirkung
für das
Spray 28 erreicht. Wenn beispielsweise die zweite Elektrode 21 nahe
dem Verteilerkopf 19 ist, bewirkt der Raumladungseffekt,
daß sich
die Partikel auf eine relativ große Fläche D verteilen. Andererseits
können
die Partikel zu verschiedenen Targets gelenkt werden, indem die
Elektrode 21 in verschiedene Positionen verschoben wird.
Beispielsweise kann die Elektrode 21, z. B. eine Ringelektrode, nahe
an die Targetzellen 40 herangeschoben werden, um ein gleichmäßiges Spray 28 in
dem Bereich in ihrem unmittelbarer Nähe bereitzustellen.
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Die
Quelle 22, die Biomaterial an die Zuführeinrichtung 24 liefert,
kann eine von vielen Typen von Biomaterialquellen sein. Die Quelle 22 kann
eine flüssige
Suspension sein, die Biomaterial aufweist. Ferner kann die flüssige Suspension
eine flüssige
Suspension von Biogrundmaterial (d. h. ohne Trägerpartikel) aufweisen, kann
eine flüssige
Suspension aus Trägerpartikeln
und Biomaterial sein oder kann eine flüssige Suspension aus Trägerpartikeln
mit ihm zugeordneten Biomaterial sein, z. B. Trägerpartikel, die mit DNA beschichtet
oder imprägniert
sind.
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Die
Erfindung wird nachstehend hauptsächlich mit Bezug auf die Verwendung
einer Quelle 22 beschrieben, die eine Suspension von Trägerpartikeln
und Biomaterial, z. B. DNA-Goldpartikel-Suspension,
ist. Obwohl sich die Beschreibung auf die Verwendung einer Trägerpartikelsuspension
konzentriert, sind jedoch die Vorteile der Erfindung eindeutig anwendbar,
auch wenn andere Quellen zur Bereitstellung von geladenen Sprays,
wie hierin beschrieben, verwendet werden. Man wird an erkennen, daß Trägerpartikel
der Suspension aus Trägerpartikeln und
Biomaterial vor der Herstellung und Verwendung der Suspension nicht
mit Biomaterial beschichtet werden müssen. Das heißt, eine
solche Suspension wird im allgemeinen durch Vermischen der Trägerpartikel
und des Biomaterials zu einer Suspensionsflüssigkeit, z. B. einer Pufferlösung, einer
Elektrolytlösung,
deionisiertem Wasser usw., erzeugt. Dadurch fallen im allgemeinen
die im wesentlichen zeitaufwendigen herkömmlichen Herstellungsprozesse weg,
die bei der Beschichtung oder Imprägnierung von Trägerpartikeln
zur Verwendung bei Genkanonenvorrichtungen zur herkömmlichen
Chargenverarbeitung erforderlich sind.
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Die
Suspension kann beliebige Flüssigkeiten aufweisen,
die für
eine Biomaterialverabreichung geeignet sind. Ferner kann eine Kalciumchloridkomponente
in der Flüssigkeit
verwendet werden. Beliebige Lösungen,
die zur Züchtung
von Zellen geeignet sind, z. B. Nährlösungen, können auch verwendet werden.
Ferner kann beispielsweise die Flüssigkeit, die in der Suspension
verwendet wird, deionisiertes Wasser sein, wenn eine zusätzliche
leitfähige
Flüssigkeit
dabei verwendet wird oder wenn ein anderer Elektrolytlösungsstrom
mit dem Suspensionsstrom verwendet wird, um das Spray von Partikeln
zu erzeugen.
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Wie
dem Fachmann bekannt ist, können
verschiedene inerte Partikel als Trägerpartikel verwendet werden.
Beispielsweise können
solche inerten Trägerpartikel
Ferritkristalle, Gold, Wolframkugeln und andere Metallkugeln sowie
Kugeln und Partikel, z. B. Glas-, Polystyrol- und Latexperlen, aufweisen. Vorzugsweise
werden die Trägerpartikel
nur in der Suspension mit dem Biomaterial vermischt. Solche Trägerpartikel
können
mit Biomaterial beschichtet oder imprägniert oder ihnen anderweitig
zugeordnet werden. Beispielsweise kann Biomaterial auf die Oberfläche von
Trägerpartikeln
aufgebracht, aufgeklebt oder abgeschieden oder mit dem Biomaterial imprägniert werden.
Wie oben beschrieben, werden die Trägerpartikel im allgemeinen
dem Biomaterial zugeordnet, wenn die Suspension ein Spray ist. Die Trägerpartikel
wirken als Träger
zum Transportieren der Biomaterialien in die Targetzellen. Wenn
ein oder mehrere Träger partikel
mit ihnen zugeordnetem Biomaterial die Zellmembran der Targetzellen
durchdringen, wird das Biomaterial in der Zelle dispergiert.
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Biomaterialien,
die mit den inerten Trägerpartikeln
verwendet werden können,
sind u. a., ohne darauf beschränkt
zu sein: biologische Färbungsmittel,
z. B. Fluoreszens- oder Markierungssonden, Viren, Organellen, Vesikel,
Peptiden, Ammosäuren,
Lipiden, Proteinen, z. B. Enzyme oder Hormone, Nukleinsäuren, Polynukleinsäuren mit
DNA und RNA, einzelne Nukleinsäuren,
kleine Moleküle,
z. B. bioaktive Substanzen, Medikamente oder dgl. Das Biomaterial
kann eine trockene Form haben oder eine Naßlösung sein. Die Erfindung ist
jedoch eindeutig nicht auf die hierin aufgeführten Materialien beschränkt.
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Obwohl
bevorzugt ist, daß eine
Suspension aus Trägerpartikeln
und Biomaterial oder eine Suspension aus Biomaterial erfindungsgemäß verwendet
wird, sind auch andere Formen von Biomaterialpartikeln, nämlich sowohl
in trockener als auch in suspendierter Form, erfindungsgemäß denkbar.
Beispielsweise können
solche Biomaterialpartikel Biomaterial aufweisen, das gefriergetrocknet
oder anderweitig als freie Partikel hergestellt ist oder anderweitig
als Partikel zum Zusammenprall mit Targetzellen verwendet wird,
um in solche Zellen einzudringen. Wenn die Biomaterialpartikel die
Targetzellen durchdrungen haben, würde man erwarten, daß solche
Biomaterialpartikel oder Teile davon unbeschädigt zu ihrem natürlichen
Zustand zurückkehren
oder anderweitig zu einer gewünschten
biologischen Aktivität
in der Targetzelle beitragen. Beispielsweise können die Biomaterialpartikel
zu ihrem natürlichen
Zustand durch Hydration, Auftauen oder Auflösen usw. zurückkehren.
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Die
Partikelsuspension von der Quelle 22 wird zu einer Zuführeinrichtung 24 befördert, die
den kontinuierlichen Strom des Quellmaterials zur Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 steuert,
wenn sie betriebsfähig
ist. Die Zuführeinrichtung 24 kann
eine Flüssigkeitspumpe
(z. B. eine Spritzenpumpe, eine Schwerkraftpumpe, ein druckreguliertes
Flüssigkeitsreservoir
usw.), eine Massenstromsteuereinrichtung oder eine andere Stromsteuervorrichtung
sein, die zur Beförderung
des Quellmaterials zur Abgabevorrichtung geeignet ist, wie dem Fachmann
bekannt ist.
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Der
Strom einer Partikelsuspension, d. h. eine Lösung, wird durch die Abgabevorrichtung 12 zu Mikrotröpfchen zerstäubt. Die
Zerstäubung
kann durch eine beliebige bekannte Technik zur Herstellung von Mikrotröpfchen erfolgen,
wobei Mikrotröpfchen
vorzugsweise einen Nenndurchmesser von etwa 10 nm oder mehr, besonders
bevorzugt etwa 20 nm bis etwa 10 μm
und am meisten bevorzugt etwa 30 nm bis etwa 1 μm haben. Vorzugsweise wird eine elektrostatische
Zerstäubung
angewendet. Andere Zerstäubungsvorrichtungen
(z. B. druckregulierte Zerstäuber,
Ultraschallzerstäuber,
hydraulische Düsen
usw.) können
eine entsprechende Zerstäubung durchführen. Wie
beschrieben in den Artikeln mit den Titeln "Electrospraying of Conducting Liquids
for Dispersed Aerosol Generation in the 4 nm to 1,8 μm Diameter
Range", von Chen
et al., J. Aerosol Sci, Vol. 26, Nr. 6, Seiten 963-977 (1995) und "Experimental Investigation
of Scaling Laws for Electrospraying: Dielectric Constant Effect", von Chen et al.,
Aerosol Science and Technology, 27:367-380 (1997), deren Inhalt
hierin durch Bezugnahme vollständig
aufgenommen werden, können
Mikrotröpfchen
mit Nenndurchmessern im Bereich von etwa 10 nm bis etwa 2 μm durch Elektrospray
erzeugt werden. Verschiede Faktoren, wie in diesen Dokumenten beschrieben, beeinflussen
die erzeugte Tröpfchengröße. Beispielsweise
die Kapillargröße, die
Flüssigkeitszuführrate zur
Abgabevorrichtung, die Eigenschaften des umgebenden Gases usw. Der
Fachmann wird anerkennen, daß solche
Faktoren und andere modifiziert werden können, um Mikrotröpfchen von
gewünschten
Größen zu erzeugen.
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Durch
Anwendung verschiedener elektrischer Potentialdifferenzen zwischen
der Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und
der zweiten Elektrode 21 können verschiedene Betriebsmodi
festgelegt werden. Beispielsweise wird eine hohe positive Spannung 20 an
die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 bei
geerdeter Elektrode 21 angelegt, um das Spray 28 mit
einer relativ hohen positiven Ladung bereitzustellen. Beispielsweise
kann die Hochspannungsquelle 20 eine hohe positive Spannung
vorzugsweise im Bereich von etwa 2000 V bis etwa 50000 V und besonders bevorzugt
2000 V bis etwa 10000 V anlegen. Die zweite Elektrode 21 kann
in einem solchen Fall mit Erde 38 verbunden sein oder kann
mit einer negativen Spannung verbunden sein. Wenn relativ große Potentialdifferenzen
angelegt werden, wie in den oben genannten Dokumenten beschrieben,
können pulsierende
Betriebsmodi oder Kegelstrahl-Betriebsmodi erreicht werden. In einem
Kegelstrahl-Betriebsmodus wird ein kegelförmiger Flüssigkeitsmeniskus an der Abgabespitze 23 gebildet,
während
im pulsierenden Modus die Form des Flüssigkeitsmeniskus zwischen
einer Kegelform und einer runden Form wechselt. Dagegen tritt bei
relativ niedrigen elektrischen Potentialdifferenzen, die zwischen
die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und
die zweite Elektrode 21 angelegt werden, kommt es zu einem
Abtropfen von der Abgabespitze.
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Der
Fachmann wird anerkennen, daß eine hohe
positive Spannung an die Elektrode 21 angelegt werden kann,
während
die Röhrenelektrode 18 geerdet
ist, um eine hohe negative Ladung der Partikel des Sprays 28 zu
ermöglichen.
Die einzige Anforderung, die für
die Potentialdifferenz notwendig ist, die zwischen der Kapillarröhrchen-Elektrode 18 des
Verteilerkopfs 19 und der zweiten Elektrode 21 angelegt wird,
besteht darin, daß die
elektrische Potentialdifferenz ein ungleichmäßiges elektrisches Feld zur
Erzeugung eines geladenen Sprays 28 ermöglicht. Die Ladung der Partikel
des Sprays 28 muß so
konzentriert werden, daß der
Raumladungseffekt der geladenen Partikel einen Zwangskontakt mit
den Targetzellen 40 ermöglicht
und vorzugsweise ein Eindringen in diese Targetzellen 40 zuläßt.
-
Man
beachte, daß die
Partikelgeschwindigkeit in erster Linie durch den Raumladungseffekt
bewirkt wird, der auf die konzentrierte Ladung der Partikel des
Sprays zurückzuführen ist.
Erst in zweiter Linie wird die Geschwindigkeit der Partikel durch
die Anziehungskräfte
zwischen dem geladenen Spray 28 und der zweiten Elektrode 21 verursacht.
Es ist festgestellt worden, daß bei
Partikeln mit relativ großer Abmessung,
z. B. Partikel mit Nenndurchmessern von weniger als etwa 0,5 μm, weniger
als etwa 5% der Geschwindigkeit auf das elektrische Feld zurückzuführen ist,
das durch die angelegte Spannung erzeugt wird. Bei Partikeln mit
relativ kleineren Größen, z.
B. Partikeln mit Nenndurchmessern von weniger als etwa 0,05 μm, ist im übrigen weniger
als 1% der Geschwindigkeit auf das elektrische Feld zurückzuführen, das
durch die angelegte Spannung erzeugt wird. Nach Abgabe von der Abgabespitze 23,
ist die Geschwindigkeit der geladenen Partikel zunächst auf das
elektrische Feld zurückzuführen, das
durch die angelegte Spannung erzeugt wird. Eine solche Anfangsgeschwindigkeit
wird jedoch beinahe unmittelbar durch die riesige Geschwindigkeit überboten,
die infolge des Raumladungseffekts der geladenen Partikel erreicht
wird. Die zweite Elektrode 21 wird hauptsächlich zur
Herstellung des geladenen Sprays vor der Abgabespitze 23 und
ferner zur Lenkung der Partikel des Sprays und deren Einschließung verwendet.
-
Obwohl
verschiedene Konfigurationen für die
Abgabevorrichtung geeignet sein können, weist die Abgabevorrichtung 12 vorzugsweise
ein Kapillarröhrchen
auf, das aus einem geeigneten Material, z. B. Platin, Silika usw.,
zur Bereitstellung des Sprays 28 besteht. Beispielsweise
kann das Kapillarröhrchen
einen Außendurchmesser
in dem bevorzugten Bereich von etwa 6 μm bis etwa 2,5 mm und einen
Innendurchmesser in dem bevorzugten Bereich von etwa 6 μm bis etwa
2 mm haben. Ferner kann die Abgabevorrichtung 12 eine leitfähige oder
nichtleitfähige
Umhüllung
haben, die mit dem Kapillarröhrchen konzentrisch
ist und die verwendet wird, um eine Gashülle, z. B. CO2,
SF6 usw., um das Kapillarröhrchen bereitzustellen,
um die elektrostatische Durchschlagspannung für das Kapillarröhrchen zu
erhöhen,
um beispielsweise eine Koronaentladung zu verhindern. Die Verwendung
einer solchen Gashülle ist
besonders vorteilhaft, wenn das Spray unter Verwendung einer Flüssigkeit
mit einer hohen Oberflächenspannung,
z. B. deionisiertes Wasser, erzeugt wird. Mehrere ausführliche
Konfigurationen für
die Abgabevorrichtung 12 sind nachstehend ausführlicher
beschrieben.
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Die
gewünschte
Geschwindigkeit, auf die die Partikel des Sprays 28 beschleunigt
werden, hängt von
verschiedenen Faktoren ab. Solche Faktoren sind, ohne darauf beschränkt zu sein,
beispielsweise die Ladung der Partikel, ob eine Vakuumkammer verwendet
wird, die Größe und Dichte
der Partikel sowie der Typ der Targetzellen 40, auf die
der Aufprall erfolgt. Vorzugsweise ist die gewünschte Geschwindigkeit die
minimale Geschwindigkeit, die notwendig ist, damit die Partikel
die Zellmembran der Targetzellen 40 durchdringen können. Die
Geschwindigkeit, die notwendig ist, um in solche Zellen einzudringen, hängt vom
Typ der Targetzelle ab, die beispielsweise Bakterien, einzellige
Protozoen, Pflanzenpollen, pflanzlicher Protoplast, Embryos, Kallusgewebe,
Zellen von Lebewesen, einschließlich
Vorläuferzellen (einschließlich pluripotente
Zellen, Stammzellen, Eier, Eizellen und Embryozellen, ohne darauf
beschränkt
zu sein) von Lebewesen, Knochenmarkzellen und Vorläuferzellen,
Muskel- oder Epidemiszellen, Epithelzellen, Blutzellen, isolierte
Gewebeexplantate, verschiedene andere Pflanzenzellen von Lebewesen
oder verschiedene andere Zellen von Lebewesen. Die Targetzellen
können
Teil eines Gewebes sein, können
eine Monoschicht von Zellen, eine Vielfachschicht von Zellen, eine
Suspension von Zellen sowie an einer Oberfläche angebracht sein oder können jede
andere Form haben, wie dem Fachmann ohne weiteres bekannt ist.
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Bei
den bevorzugten Konfigurationen, wie sie hierin beschrieben sind,
sind Geschwindigkeiten im Bereich von etwa 30 m/s bis etwa 600 m/s
für Partikel
mit einem nominalen Durchmesser im Bereich von etwa 2 nm bis etwa
1 μm möglich. Die
Geschwindigkeiten am höheren
Ende des Bereichs sind hauptsächlich
auf die kleine Partikelgröße, die
hohe Partikelladung und/oder den reduzierten Druck zurückzuführen. Ferner
können
Partikel unter Verwendung einer solchen Konfiguration erzeugt und
an die Targetfläche
mit Raten im Bereich von etwa 108 Partikels bis
etwa 1011 Partikel/s kontinuierlich abgegeben werden.
Die Partikelerzeugungsrate kann unter Verwendung mehrerer Kapillarröhrchen-Elektroden
erhöht
werden. Die bevorzugte Geschwindigkeit, nominal im Bereich von etwa
150 m/s bis etwa 300 m/s, ist ausreichend, um in die meisten Typen
von Targetzellen einzudringen, ohne sie zu zerstören.
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Das
Spray von Partikeln 28, das durch die Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 erzeugt
wird, wenn die Quelle 22 eine Suspension mit Trägerpartikeln
und Biomaterial ist, entsteht im allgemeinen, wie bereits hierin
beschrieben, durch Abgeben von Mikrotröpfchen mit darin suspendierten
Trägerpartikeln und
Biomaterial. Danach verdampfen die Mikrotröpfchen, wobei die Ladung der
Mikrotröpfchen
auf die Trägerpartikeln
und das ihnen normalerweise zugeordnete Biomaterial konzentriert
wird. Ebenso entsteht das Spray von Partikeln 28, das durch
die Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 erzeugt wird, wenn die
Quelle 22 eine Suspension mit Biogrundmaterial ist, im
allgemeinen, wie hierin bereits beschrieben, durch Abgabe von Mikrotröpfchen mit
darin suspendiertem Biomaterial. Danach wird durch Verdampfung der
Mikrotröpfchen
die Ladung der Mikrotröpfchen
aus das Biomaterial konzentriert. Durch Steuerung verschiedener
Parameter der Elektrospray-Anordnung kann die Menge des Biomaterials,
das für den
Zusammenprall mit den Targetzellen 40 abgegeben wird, gesteuert
werden. Ferner kann auch die Geschwindigkeit solcher Partikel erhöht werden.
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Verschiedene
Charakteristika, die gesteuert werden können, sind u. a. die Mikrotröpfchengröße, die
Konzentration des Biomaterials und die Trägerpartikelgröße der im
Spray 28 suspendierten Partikel. Zunächst kann die Geschwindigkeit
der Partikel durch Steuerung der Partikelgröße, d. h. der Trägerpartikelgröße, erhöht werden.
Partikel mit kleineren Abmessungen können infolge des Raumladungseffekts
höhere
Geschwindigkeiten haben.
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Ferner
kann durch Steuerung der Größe der versprühten Mikrotröpfchen und
der Trägerpartikelgröße die Menge
des abgegebenen Biomaterials gesteuert werden, und es können höhere Geschwindigkeiten
für die
Partikel erreicht werden. Zunächst
kann der Nenndurchmesser der Mikrotröpfchen gesteuert werden. Beispielsweise
kann der Mikrotröpfchendurchmesser
durch Steuerung der Kapillargröße, der Flüssigkeitszuführungsrate
für Suspensionen,
der elektrischen Leitfähigkeit
für die
Suspension usw. gesteuert werden. Der Nenndurchmesser liegt normalerweise
in den Bereichen, wie bereits hierin beschrieben.
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Bei
Verwendung von Trägerpartikeln
mit kleineren Nenndurchmessern relativ zu den Mikrotröpfchen,
z. B. Partikel mit einem Nenndurchmesser im Bereich von etwa 2 nm
bis etwa 1000 nm oder vorzugsweise im Bereich von etwa 10 nm bis
etwa 100 nm, (oder durch Erhöhung
der Größe der Mikrotröpfchen relativ
zu den Partikeln), kann die Ladungsmenge, die die Trägerpartikel
transportieren kann, erhöht werden.
Das heißt, durch
Erhöhung
der Größendifferenz
zwischen den Mikrotröpfchen
und den Partikeln können
die Trägerpartikel
(z. B. Gold) nach Verdampfung eine Ladung transportieren, die viel
höher ist
als die Rayleigh-Grenze für
normale flüssige
Suspensionen. Auf diese Weise ermöglicht der Raumladungseffekt
die Erreichung einer höheren
Geschwindigkeit, so daß die
Partikel in verschiedene Tiefen der Zellgewebe eindringen können. Ferner
können
unter Verwendung einer Vakuumkammer, in die die Partikel eingesprüht werden,
erhöhte
Geschwindigkeiten erreicht werden.
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Ferner
können
Mikrotröpfchen
mit Größen, die
geringfügig
größer sind
als die Trägerpartikel und/oder
das darin suspendierte Biomaterial erzeugt werden. Dies führt zu gleichmäßig großen Partikeln, ohne
daß sich
Agglomerate bilden. Der Effekt der Raumladungsabstoßung der
unipolar geladenen Partikel hält
sie getrennt und verhindert Partikelagglomeration im Spray und verleiht
den Partikeln die Geschwindigkeit, die für einen zwangsläufigen Kontakt
mit den Targetzellen, vorzugsweise zum Eindringen in die Targetzellen,
notwendig ist.
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Ferner
ist durch Steuerung der Größe des Mikrotröpfchens
und der Größe der Trägerpartikel
ein Partikel pro Mikrotröpfchen
erreichbar. Bei einem gesteuerten Strom und einer bekannten Konzentration des
verwendeten Biomaterials in Verbindung mit den Trägerpartikeln
kann die Menge des Biomaterials im Spray 28 oder des an
die Sprayfläche
abgegeben Biomaterials gesteuert werden und ist reproduzierbar, d.
h. kann beständig
wiederholt werden.
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Nachdem
die Mikrotröpfchen
der Flüssigkeit, die
die Partikel und/oder das Biomaterial suspendiert, abgegeben worden
sind, beginnt das Lösemittel
der Mikrotröpfchen
zu verdampfen, wobei die Größe des Mikrotröpfchens
abnimmt. In den Targetzellen 40 bleibt normalerweise nur
das Trägerpartikel
mit zugeordnetem Biomaterial (oder Biomaterial allein im Falle einer
Biomaterialsuspension ohne Trägerpartikel)
für den
Zusammenprall mit den Targetzellen 40 übrig. Die Spraypartikelgröße kann
auf immerhin wenige Nanometer im Durchmesser kleiner gemacht werden
und dennoch die notwendige Geschwindigkeit unter den Auswirkungen
der Raumladung erreichen. Dadurch wird es möglich, kleineren Zellen und Geweben
Biomaterialien zu verabreichen.
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Neben
dem erfindungsgemäßen Eindringen in
die Zellen als Ergebnis der Bombardierung der Zellen mit Material
unter Verwendung kann die hierin beschriebene Mikrospraytechnik
verwendet werden, um Liposomtröpfchen,
die Biomaterial, z. B. DNA, einhüllen,
zu erzeugen. Die Liposomtröpfchen
können
durch das elektrische Feld gelenkt und gleichmäßig über Targetzellen, wie diejenigen,
die hierin beschrieben sind, verteilt werden, z. B. durch die Bewegung
der Targetfläche,
die Bewegung des Verteilerkopfs usw. Anders als beim Eindringen
in die Zellen beim Zusammenprall erleichtern die Liposomen, die das
Biomaterial einhüllen,
den Transfer des Materials in die Zellen durch Fusion des Liposoms
mit der Zellmembran, wie dem Fachmann bekannt ist. Die Liposomtröpfchen können verschiedene
Größen haben, z.
B. einen Nenndurchmesser von etwa 10 nm bis etwa 10 μm. Die Elektrospraytechnik,
die verwendet wird, um die Liposomen zu den Zelle zu lenken, kann reguliert
werden (z. B. der Abstand von der Düse bis zur Targetfläche, elektrisches
Potential oder Stärke des
Feldes usw, können
reguliert werden), um die Geschwindigkeit der Liposomtröpfchen zu
verändern,
so daß die
Liposomtröpfchen
so eintreffen, daß der
Fusionsmechanismus durchgeführt
werden kann.
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Eine
erfindungsgemäße Ausführungsform einer
Elektrospray-Anordnung 42 ist in 2 gezeigt.
Im allgemeinen ist die Elektrospray-Abgabevorrichtung 12,
die zum Einbringen eines Sprays 28 in eine Kammer 16 positioniert
ist, im wesentlichen äquivalent
mit derjenigen, die allgemein mit Bezug auf 1C beschrieben
ist, wie durch gleiche Bezugszeichen für gleiche Elemente angegeben
ist. In der Ausführungsform
in 2 ist die Targetfläche 14 jedoch mit
einer oder mehreren darauf angeordneten Targetzellen 40 hinter
oder vor der Abgabevorrichtung 12 positioniert.
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Im
Spray 28 ist eine erste elektrische Ladung auf die Partikel
konzentriert ist, wie bereits hierin beschrieben, und zwar nach
Verdampfung der Mikrotröpfchen
im elektrischen Feld, das durch die Hochspannungsquelle 20 erzeugt
wird, die an die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und
an die Erdung der Targetflä che 14 angelegt
ist. Die Kapillarröhrchen-Elektrode 18 fungiert
als erste Elektrode, wie mit Bezug auf 1B beschrieben,
und die leitfähige
Targetfläche 14 fungiert
als die zweite Elektrode, die mit Bezug auf 1B beschrieben
ist. Bei einer elektrischen Potentialdifferenz, die zwischen der
Kapillarröhrchen-Elektrode 18 und
der Targetfläche 14 erzeugt wird,
wird ein ungleichmäßiges Feld
von der Abgabespitze 23 bis zur Targetfläche 14 bereitgestellt,
um vor der Abgabespitze 23 das Spray von Partikeln 28 zu
erzeugen. Neben der Erzeugung des ungleichmäßigen elektrischen Feldes zur
Erzeugung des Sprays von Partikeln 28 ermöglicht die
leitfähige
Targetfläche 14,
die mit Erde 38 verbunden ist, den Einschluß der Partikel
bis zu einer bestimmten Fläche,
um einen Zwangskontakt mit den Targetzellen 40 zu ermöglichen.
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Wie
in 2 gezeigt, kann in Abhängigkeit von der verwendeten
Abgabevorrichtung und anderen Komponenten der Anordnung die von
der Quelle 22 bereitgestellte Partikelsuspension von einer Druckquelle
stammen. Als Alternative kann eine Druckgasquelle 26 in
Verbindung mit einer Zuführeinrichtung 24 oder
einem anderen Teil der Abgabevorrichtung 12 benutzt werden,
um Druck bereitzustellen, um das Spray 28 in die Kammer 16 abzugeben. Beispielsweise
kann die Quelle 22 im Bereich von mehreren Zehnteln einer
Atmosphäre
bis zu mehreren 100 Atmosphären
unter Druck gesetzt werden, oder die verwendete Druckgasquelle 26 kann
ein Gas sein, z. B. Kohlendioxid, Umgebungsluft, Wasserstoff, Helium,
Stickstoff oder die gleichen Drücke haben.
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Die
Targetfläche 14 kann
jede geeignete Fläche
zur Plazierung von Targetzellen sein. Beispielsweise kann die Targetfläche eine
elektrisch leitfähige Fläche sein,
die mit einer elektrischen Erde oder Ladung verbunden ist. Im allgemeinen
können
die Zellen durch natürliche
Befeuchtung der Zellen oder auf eine beliebige andere Weise, z.
B. Beschichtung, Nährlösungen,
zur Targetfläche
leitfähig
gemacht werden. Die Targetfläche 14 ist
eine im wesentlichen horizontale Fläche, die in der Lage ist, die
Targetzellen zu stützen.
Das elektrische Potential oder Erde kann an die Targetfläche angelegt
werden, so daß ein Teil
oder die gesamte Fläche
das Spray anzieht, z. B.
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werden
die Partikel auf bestimmte Bereiche der Targetfläche durch das elektrische Feld
gelenkt, das durch die Potentialdifferenz erzeugt wird, die zwischen
dem Verteilerkopf und der Targetfläche angelegt wird. Daß das Spray
auf einen bestimmten Abschnitt der Targetfläche gelenkt werden kann, ist
insofern vorteilhaft, als eine übermäßige Versprühung vermieden
wird. Das heißt,
das Spray wird zu einem Abschnitt der Targetfläche mit einer angelegten Spannung
hingezogen, z. B. ein Abschnitt, der von anderen Abschnitten isoliert
ist, wo Targetzellen positioniert worden sind. Es ist sogar möglich, das
elektrische Feld zwischen dem Verteilerkopf 19 und der Targetfläche 14 zu
regulieren, so daß die
Partikel von einer Position der Targetfläche zur anderen gelenkt werden,
z. B. durch Schaltmechanismen oder angelegte alternative Spannungsquellen.
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Vorzugsweise
ist die Targetfläche 14 entlang der
x-, y- und z-Achse
beweglich, wie allgemein mit Pfeilen 33 und 34 angezeigt.
Die Targetfläche 14 ist mit
einem beweglichen Positionierteil (nicht dargestellt) versehen und
wird von diesem unterstützt,
das es ermöglicht,
die Targetfläche
entlang dieser Achsen zu bewegen. Beispielsweise kann die Targetfläche entweder
näher heran
oder weiter weg von der Elektrospray-Abgabevorrichtung 12 bewegt
werden.
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Der
Abstand zwischen der Abgabespitze 23 des Verteilerkopfs 19 in
der Kammer 16 und der Targetfläche 14 ist vorzugsweise
im Bereich von etwa 5 mm bis etwa 3 cm je nach gewünschtem
elektrischem Feld und gewünschter
Sprayfläche
(D). Dieser Abstand kann jedoch in Abhängigkeit von der spezifischen
Anwendung variieren, und es ist erkennbar, daß die Sprayfläche D einen
kleineren Durchmesser hat, wenn die Abgabespitze 23 des Verteilerkopfs 19 und
die Targetfläche 14 näher aneinander
geschoben sind.
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Da
alle Partikel des Sprays 28 die Ladung gleicher Polarität tragen,
wenn sie in die Kammer 16 abgegeben werden, neigen die
Partikel dazu, einander abzustoßen
und Agglomeration zu vermeiden. Die Elektrospraytechnik kann die
Sprayfläche
D gleichmäßig versorgen.
Man beachte, daß die
Abstoßung
der mit gleicher Polarität
geladenen Partikel mindestens teilweise die Verbreitung des Sprays 28 bestimmt,
das in die Kammer 16 abgegeben wird.
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3 zeigt
bildlich die Elektrospray-Anordnung 42 von 2 mit
dem Zusatz eines externen elektrostatischen Feldes 50 zur
weiteren Beschleunigung der geladenen Partikel des Sprays 28,
das in die Kammer 16 abgegeben wird. Das externe elektrostatische
Feld 50 wird unter Verwendung von Ringelektroden 52 erzeugt,
mit der eine hoher negative Spannungsversorgung 54 verbunden
ist und die ferner mit Masse 56 verbunden sind. Das Feld
beschleunigt die geladenen Partikel, die durch die Ringelektroden
in die Kammer 16 abgegeben werden. Auf diese Weise werden
die Partikel weiter in Richtung der geerdeten Targetfläche 14 beschleunigt.
Die an die Ringelektroden angelegte Spannung kann im bevorzugten
Bereich von etwa 200 V bis etwa 5 kV liegen.
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Für den Fachmann
ist ohne weiteres erkennbar, daß die
Beschleunigung der geladenen Partikel des Sprays 28 durch
das externe elektrische Feld 50 zur Beschleunigung der
Partikel auf eine gewünschte Geschwindigkeit,
die zum Eindringen in bestimmte Targetzellen 40 auf der
Targetfläche 14 notwendig
ist, benötigt
werden kann. Erfindungsgemäß ist eine
solche zusätzliche
Beschleunigung im allgemeinen jedoch unnötig, da der Raumladungseffekt
die notwendige Geschwindigkeit für
ein solches Eindringen ermöglicht.
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4 stellt
bildlich die Elektrospray-Anordnung 42 dar, wie sie in 2 dargestellt
ist, aber weist ferner ein Plazierungssteuerteil 70 auf.
Das Plazierungssteuerteil 70 weist eine Öffnung 71 auf, durch
die ein Teil der Partikel des Sprays 28 zum Zusammenprall
mit Targetzellen 40 hindurchgelassen wird. Auf diese Weise
kann der Aufprall auf die bestimmten Targetzellen 40 gesteuert
werden.
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5 ist
eine bildliche Darstellung einer alternativen Elektrospray-Anordnung 100,
die der Elektrospray-Anordnung 42 in 2 gleicht,
die jedoch mehrere zusätzliche
vorteilhafte Komponenten aufweist. Die Elektrospray-Anordnung 100 weist
eine Elektrospray-Abgabevorrichtung 112 auf, die mit der in 1 gezeigten identisch ist, die jedoch
das Spray 128 in eine Vakuumkammer 116 abgibt,
die durch eine Vakuumpumpe 142 evakuiert wird. Die Geschwindigkeit
der Partikel des Sprays 128 ist aufgrund des Raumladungseffekts
im allgemeinen größer, da
der Druck in der Kammer 116 verringert ist. Vorzugsweise
ist der Druck in der Kammer im Bereich von etwa 1 Atmosphäre bis etwa
0,1 Atmosphären.
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Die
Elektrospray-Anordnung 100 weist ferner eine Targetfläche 114 auf,
auf der Targetzellen 140 plaziert sind und die mit Masse 138 verbunden ist.
Die Targetfläche
ist mittels eines motorbetriebenen Positionierungsteils 115 um
eine Achse 119 drehbar. Die Targetfläche 114 kann dann
gedreht werden, und eine gleichmäßigere Verteilung
der Partikel des Sprays 128 an die Targetzellen 140 wird
erreicht. Ferner ist die Abgabevorrichtung 112 entlang der
x-, y- und z-Achse beweglich, wie allgemein durch Pfeile 131 und 132 dargestellt.
Daher können Partikel
zum Zusammenprall mit der Gesamtfläche der rotierenden Oberfläche 114 abgegeben
werden. Beispielsweise kann die Abgabevorrichtung 112 abseits
von der Achse 119 (z. B. die halbe Strecke zwischen der
Achse 119 und dem Rand der drehbaren Targetfläche 114)
positioniert sein. Auf diese Weise kann das Spray 128 gleichmäßig auf
den Zellen auf der Targetfläche 114 verteilt
werden, während
sich die Targetfläche
dreht.
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6 stellt
bildlich eine alternative Konfiguration einer Elektrospray-Anordnung 200 dar.
Die Elektrospray-Anordnung 200 weist
ein Transportsystem 260 auf, das relativ zur Abgabevorrichtung 212 positioniert
ist. Die Abgabevorrichtung 212 gleicht einer hierin beschriebenen
Elektrospray-Abgabevorrichtung.
Die elektrische Potentialdifferenz zum Hervorbringen des Sprays
aus der Abgabevorrichtung 212 wird durch eine Spannungsquelle 220 und
durch Erdung des Transportsystems 260 angelegt. Das Transportsystem 260 weist
eine Targetfläche 262 auf,
die durch ein motorbetriebenes Element 264 bewegt wird.
Auf diese Weise ermöglicht
die kontinuierliche Bereitstellung des Sprays 228 durch
kontinuierliche Bewegung der Targetfläche 262 mit darauf
plazierten Targetzellen 240 ein Massenproduktionssystem
zum Transfer von Biomaterial in Targetzellen.
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Man
kann ohne weiteres erkennen, daß die Zellen,
die durch das Biomaterial zu modifizieren sind, in ihrem natürli chen
Zustand sein können,
z. B. in situ. Solche Zellen können
behandelt werden, während
sie im Körper
eines Lebewesens sind, d. h. in vivo, oder wenn solche Zellen aus
dem Körper
entfernt sind, d. h. ex vivo. Beispielsweise sind die Gewebe, die
bombardiert werden können,
u. a. menschliches Gewebe oder Gewebe von anderen Lebewesen, z. B.
Epidermisgewebe, Organgewebe, Tumorgewebe, Pflanzengewebe und dgl.,
während
es sich im Körper befindet
oder aus dem Körper
entfernt ist. Eine tragbare Elektrospray-Anordnung kann zur Gentherapie oder
für andere
spezialisierte In-situ-Anwendungen, z. B. Immunisierung, verwendet
werden. Beispielsweise können
in einer solchen tragbaren Konfiguration die Targetzellen, die durch
die geladenen Partikel zum Aufprallen gebracht werden, In-situ-Zellen
sein, im Gegensatz zu Zellen, die auf einer Targetfläche plaziert
sind. Eine anschauliche tragbare Elektrospray-Anordnung ist nachstehend
allgemein mit Bezug auf 9 beschrieben und weist im allgemeinen Elemente
oder Komponenten auf, die die gleiche Funktion haben wie bei der
Konfiguration in 1C.
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Für den Fachmann
sollte erkennbar sein, daß die
verschiedenen Elemente, die mit Bezug auf 1 bis 6 beschrieben
sind, auf vielerlei Art kombiniert werden können, und jede alternative
Konfiguration der Elektrospray-Anordnung, die hierin beschrieben
ist, dient lediglich der Darstellung. Beispielsweise kann die mit
Bezug auf 5 beschriebene Vakuumkammer 116 mit
der Elektrospray-Anordnung in 4 verwendet
werden, das mit Bezug auf 4 beschriebene
Plazierungsteil 70 kann in der Elektrospray-Anordnung 42 in 2 verwendet werden,
das Transportsystem 260, wie es mit Bezug auf 6 beschrieben
ist, kann mit dem externen elektrischen Feld 50 verwendet
werden, wie es mit Bezug auf 3 beschrieben
ist, usw.
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7 ist
eine ausführliche
Darstellung einer Konfiguration eines Abschnitts 300 der
insgesamt in 2 dargestellten Elektrospray-Anordnung
mit einer erfindungsgemäßen Abgabevorrichtung 314.
Wie in 7 gezeigt, wird das Spray 328 in eine
Kammer 303 gesprüht,
die durch ein Gehäuse 302 mit
einer durchgehenden Achse 301 gebildet wird. Das Gehäuse 302 weist
ein erstes Ende 304 und ein zweites Ende 306 auf,
die durch eine zylindrische Wand um die Achse 301 miteinander
verbunden sind. Vorzugsweise ist das Gehäuse 302 eine Vakuumkammer,
die evakuiert werden kann, wie nachstehend weiter beschrieben wird.
Man wird anerkennen, daß verschiedene
Konfigurationen zur Bildung des Gehäuses 302 gewählt werden
können
und daß die
Erfindung nicht auf bestimmte Konfigurationen beschränkt ist.
Das Gehäuse 302 besteht
im allgemeinen aus isolierenden Materialien. Beispielsweise ist
die zylindrische Wandumhausung 308 aus optischen Gründen vorzugsweise
eine zylindrische Plexiglaswand, während das erste und das zweite
Ende 304, 306 aus verschiedenen isolierenden Materialien
bestehen können.
Das erste Ende 304 kann auch aus leitfähigen Abschnitten bestehen,
um das Anlegen von Spannungen oder Erde an das Kapillarröhrchen 320 zu
erleichtern.
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Das
zweite Ende 306 des Gehäuses 302 weist
ein Endelement 311 auf, das mit den zylindrischen Wänden 308 verbunden
ist. Relativ zu einer oberen Fläche 370 des
Endelements 311 ist eine Targetplattform 312 positioniert,
auf der Targetzellen positioniert werden können. Beispielsweise kann eine Röhre, eine
Schale oder eine andere Struktur, die Zellen aufweist, auf der Plattform 312 positioniert werden,
oder die Zellen können
auf der Plattform 312 ohne eine zusätzliche Struktur positioniert
werden. Ferner ist ein drehbarer Mikrometerreguliermechanismus 310 durchgehend
in einer unteren Fläche 371 des
Endelements 311 zum Kontakt mit der Plattform 312 vorgesehen,
so daß die
Höhe der
Plattform 312 verändert
werden kann, z. B. kann der Abstand zwischen den Targetzellen 340 und
der Abgabespitze 380 der Abgabevorrichtung 314 reguliert
werden. Die Plattform 312 besteht aus einem leitfähigen Material, z.
B. nichtrostendem Stahl, und kann als zweite Elektrode der Abgabevorrichtung 314 zur
Erzeugung des Sprays 328 an der Abgabespitze 380 der
Abgabevorrichtung 314 fungieren.
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Das
erste Ende 304 des Gehäuses 302 weist einen
Verteilerkopf 316 auf, der sich durch dieses erstreckt
und der eine Achse aufweist, die mit der Achse 301 zur
Verwendung bei der Erzeugung des Sprays 328 in der Kammer 303 in
Kombination mit der leitfähigen
Plattform 312 übereinstimmt.
Der Verteilerkopf 316 weist ein Kapillarröhrchen 320 mit
einer durchgehenden Achse auf, die mit der Achse 301 übereinstimmt.
Das Kapillarröhrchen 320 weist
ein erstes Ende 330 auf, das in einer Öffnung 385 des ersten
Endes 330 durch ein leitfähiges Dichtelement 337 in
der oberen Fläche 383 des
ersten Endes 304 dichtend positioniert ist. Das Kapillarröhrchen 320 weist
ferner ein zweites Ende 332 auf, das zum Abgeben des Sprays 328 nach
Bedarf positioniert wird. Das Kapillarröhrchen 320 kann aus
einem beliebigen geeigneten Material, z. B. Platin, Silika, nichtrostender
Stahl usw., bestehen und kann jede geeignete Größe haben. Beispielsweise kann
das Kapillarröhrchen
vorzugsweise einen Außendurchmesser
in dem Bereich von etwa 8 μm
bis etwa 2,5 mm und einen Innendurchmesser in dem bevorzugten Bereich
von etwa 6 μm
bis etwa 2 mm haben. Besonders bevorzugt ist der Innendurchmesser
des Kapillarröhrchens im
Bereich von etwa 10 μm
bis etwa 200 μm.
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Ferner
weist der Verteilerkopf 316 einen Düsenabschnitt oder eine Düsenumhüllung 322 auf,
die in 7 als langgestreckte, im wesentlichen zylindrische
Metallumhüllung
dargestellt ist, die mit dem Kapillarröhrchen 320 konzentrisch
ist. Die Umhüllung 322 kann
jedoch leitfähig
oder nichtleitfähig
sein. Ferner kann die Umhüllung 322 jede
Konfiguration oder Form haben, die den Strom eines Hüllgases
um das Kapillarröhrchen 320 herum
ermöglicht.
Zusammengenommen bilden in dieser bestimmten Ausführungsform
das Kapillarröhrchen 320 und
die Umhüllung 322 die
Kapillarröhrchen-Elektrode
des Verteilerkopfs 316 zur Verwendung bei der Einleitung
des Sprays 328 in die Kammer in Verbindung mit der leitfähigen Plattform 312.
Die Umhüllung
oder der Düsenabschnitt 322 weist
einen ersten Endabschnitt 336 auf, der sich am Abschnitt 335 zu
einem schmaleren zweiten Endabschnitt 338 verjüngt. Der
zweite Endabschnitt 338 erstreckt sich von dem sich verjüngenden
Abschnitt 335 und ist konzentrisch mit dem zweiten Ende 332 des
Kapillarröhrchens 320.
Das schmale Ende des sich verjüngenden
Abschnitts 335 erstreckt sich um eine bevorzugte Strecke
von etwa 5 mm bis etwa 5 cm von der unteren Fläche 385 des ersten
Endes 304. Der Außendurchmesser
des zweiten Endabschnitts 338 ist vorzugsweise im Bereich von
etwa 2 mm bis etwa 5 mm, und der Innendurchmesser des zweiten Endabschnitts 338 ist
vor zugsweise im Bereich von etwa 0,1 cm bis etwa 0,2 cm. Das zweite
Ende 332 des Kapillarröhrchens 320 erstreckt
sich um eine Strecke von vorzugsweise etwa 2 mm bis etwa 5 mm über den
zweiten Endabschnitt der Metallumhüllung oder des Düsenabschnitts 322 hinaus
in Richtung der Targetzellen 340. Der Düsenabschnitt 322 besteht
aus einem beliebigen geeigneten Metall oder nichtleitfähigen Material,
z. B. nichtrostender Stahl, Messing, Aluminiumoxid oder ein anderes
geeignetes leitfähiges
oder nichtleitfähiges Material.
Der Düsenabschnitt 322 ist
vom Kapillarröhrchen 320 durch
Abstandselemente 326 oder andere Abstandsstrukturen beabstandet.
Beispielsweise kann eine Metallumhüllung 322 an bestimmten Abschnitten
deformiert sein, z. B. Nadelspitzen oder Vertiefungen, um einen
Hals zur Zentrierung des Kapillarröhrchens 320 in diesem
zu erzeugen.
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Die
Kapillarröhrchen-Elektrode
kann eine von vielen Konfigurationen haben. Von größter Wichtigkeit
ist jedoch, daß die
Kapillarröhrchen-Elektrode eine
Elektrode zur Erzeugung eines ungleichmäßigen elektrischen Feldes darstellt
und mindestens eine Gashülle
um das Kapillarröhrchen
bereitstellt, um eine Koronaentladung zu vermeiden, wenn Flüssigkeiten
mit hoher Oberflächenspannung,
z. B. deionisiertes Wasser, versprüht werden. Beispielsweise kann
in einer Elektrospray-Anordnung, wo das Spray in einer Kammer erzeugt
wird, die Kapillarröhrchen-Elektrode
nur ein Kapillarröhrchen
selbst aufweisen, wogegen eine Umhüllung, z. B. ein Metallumhüllung 322,
erforderlich sein kann, um einen ringförmigen Raum für den Strom
des Hüllgases
bereitzustellen. In einer solchen Konfiguration kann die Kammer
mit dem Gas zur Verhinderung einer Koronaentladung geflutet werden.
Wenn Flüssigkeiten, die
keine Flüssigkeiten
mit hoher Oberflächenspannung
sind, versprüht
werden, ist das Hüllgas
außerdem
möglicherweise
nicht erforderlich.
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Ein
Gaseinlaß 348 ist
im ersten Ende 304 des Gehäuses 302 vorgesehen,
um das Eintreten eines Stroms von elektrisch negativen Gasen zu
ermöglichen,
z. B. CO2, SF6 usw.,
um eine Gashülle
um das Kapillarröhrchen 320 zu
bilden. Der Einlaß ist zum
Lenken eines Stroms eines elektronegativen Gases in eine Öffnung 350 zwischen
dem konzentrischen Kapillarröhrchen 320 und
dem Düsenabschnitt 322 konfiguriert.
Diese Gashülle
ermöglicht
es, daß die
angelegte Spannung ohne Koronaentladung auf höhere Werte erhöht werden
kann, z. B. wird die elektrostatische Durchschlagspannung für die Kapillarröhrchen-Elektrode
erhöht.
Der gesamte Abschnitt des Endes 304 oder dessen Abschnitte
können
aus leitfähigen
Materialien bestehen, um das Anlegen einer Spannung oder von Erde
an die Kapillarröhrchen-Elektrode zu ermöglichen.
Beispielsweise können
Dichtelemente 337 nichtleitfähig sein, sind aber vorzugsweise
leitfähig,
um das Anlegen einer Spannung oder von Erde an das Kapillarröhrchen 320 zu ermöglichen.
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Das
erste Ende 304 weist ferner einen Austrittskanal 354 auf,
damit Gase die Kammer 303 verlassen können. Beispielsweise kann sich
der Austrittskanal 354 in eine ringförmige Kammer 389 öffnen, die
im ersten Ende 304 gebildet wird, das eine untere Frontplatte 390 mit
einer Serie von Löchern aufweist,
zum Durchlassen des Stroms aus der Kammer 303 durch den
Austrittskanal 354 nach draußen. Eine Vakuumpumpe kann
mit dem Austrittskanal 354 zum Evakuieren der Kammer 303 auf
einen niedrigen Druck verbunden sein. Beispielsweise ist der Druck in
der Kammer vorzugsweise im Bereich von etwa 1 Atmosphäre bis etwa
0,1 Atmosphären.
Ferner kann anstelle oder zusätzlich
zur Bereitstellung der Gashülle
zwischen dem Kapillarröhrchen 320 und
dem Düsenabschnitt 322 die
Kammer 303 mit einem Gas durch den Austrittskanal 354 geflutet
werden, um die elektrostatische Durchschlagspannung für die Kapillarröhrchen-Elektrode zu erhöhen.
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In
einer Ausführungsform
wird die Kammer 303 durch den Austrittskanal 354 mit
dem Gas geflutet, und dann setzt sich der Strom in dem bevorzugten
Bereich von etwa 5 cm3/min bis etwa 200
cm3/min durch den Austrittskanal 354 fort.
Jeder in die Kammer 303 führende Kanal kann zum Austritt
des Gases aus der gefluteten Kammer verwendet werden, z. B. ein
Kanal, der zur Erfassung eines Drucks (nicht dargestellt) in der
Kammer verfügbar
ist. Wenn die Kammer 303 geflutet ist, ist die Gashülle zwischen
dem Kapillarröhrchen 320 und
dem Düsenabschnitt 322 möglicherweise
nicht erforderlich. Daher ist das Fluten der Kammer eine Alternative
zur Verwendung einer solchen Gas hülle zwischen dem Kapillarröhrchen 320 und
dem Düsenabschnitt 322.
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Um
das Spray 328 in der Kammer 303 zu erzeugen, wird
ein Biomaterial bereitgestellt, z. B. in einer Lösung suspendiert, und in das
erste Ende 330 des Kapillarröhrchens 320 aufgenommen.
Vorzugsweise kann die Durchflußrate
der Suspension im Bereich von etwa 0,01 μl/min bis etwa 5 μl/min liegen. Vorzugsweise
kann eine relativ hohe Spannung, z. B. im Bereich von etwa 2000
V bis etwa 6000 V, an die Plattform 312 relativ zum Kapillarröhrchen 320,
das elektrisch geerdet ist angelegt werden (oder umgekehrt), um
die Potentialdifferenz zwischen der ersten und zweiten Elektrode
der Spray-Anordnung zu erzeugen. In dieser bestimmten anschaulichen
Konfiguration sind das Kapillarröhrchen 320,
die Metallumhüllung 322 und
das Dichtelement 337 leitfähig. Das Spray 328 wird
vor der Abgabespitze 380 des zweiten Endes 332 des
Kapillarröhrchens 320 in
einem Betriebsmodus erzeugt, wie bereits beschrieben. Die Potentialdifferenz
zwischen den Elektroden erzeugt ein elektrisches Feld zwischen diesen,
was zur Bildung einer kleineren Fadenkathode am Meniskus führt, der
an der Abgabespitze 380 gebildet wird, während die
Suspension nach unten zu den Targetzellen hingezogen wird.
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8 ist
eine ausführlichere
Darstellung einer alternativen Kapillarelektrodenkonfiguration 400 für den Verteilerkopf 316 in 7.
Gleiche Bezugszeichen in 8 werden für entsprechende gleiche Elemente
in 7 verwendet, um die Beschreibung der alternativen
Kapillarkonfiguration 400 zu vereinfachen. Im allgemeinen
wird die alternative Kapillarelektrodenkonfiguration 400 anstelle
des einfachen Kapillarröhrchens 320 der
in 7 gezeigten Struktur verwendet oder ersetzt diese.
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Die
Kapillarelektrodenkonfiguration 400 weist ein erstes Kapillarröhrchen 412 mit
einer Achse auf, die mit der Achse 301 übereinstimmt, zum Aufnehmen
von Biomaterial von einer Quelle, z. B. eine Suspension aus Biomaterial.
Ferner ist das zweite Kapillarröhrchen 414 konzentrisch
mit dem ersten Kapillarröhrchen 412.
Ein ringförmiger
Raum 487 zwischen dem inneren und dem äußeren Kapillarröhrchen 412, 414 wird
verwen det, um einen Strom von Elektrolytflüssigkeiten mit gesteuerten
Leitfähigkeiten
zur Abgabespitze 495 zu lenken, und zwar zur Verwendung
bei der Erzeugung des Sprays vor dieser. Durch die Verwendung einer
Elektrolytlösung, die
zur Abgabespitze 495 zur Erzeugung des Sprays von Mikrotröpfchen an
dieser strömt,
kann die Suspension aus Biomaterial mit deionisiertem Wasser hergestellt
werden, das eine Charakteristik, z. B. pH, hat, die die Biomaterialeigenschaften
nicht stört.
Bei Verwendung der Elektrolytlösung
wird eine ausreichende Ladung in den Mikrotröpfchen erreicht, die sich danach
auf die Partikel des Sprays konzentriert, damit durch Raumladungseffekte
die Partikel ausreichende Geschwindigkeiten zum Eindringen in Targetzellen
erreichen können.
Ohne den zweiten Elektrolytlösungsstrom
muß der
Suspension möglicherweise
eine Elektrolytlösung
hinzugesetzt werden, um eine solche Ladungskonzentration zu erreichen.
Ferner kann die Elektrolytlösungscharakteristik,
z. B. die Leitfähigkeit,
geändert
werden, um die Ladung, die sich auf die Partikel konzentriert, zu
regulieren, ohne daß die
Suspensionscharakteristik geändert
werden muß.
Der Strom von Elektrolytflüssigkeiten
wird in den ringförmigen
Raum 487 gelenkt, so daß er mit der Suspension in
unmittelbarer Nähe
der Abgabespitze 495 in Kontakt kommt. Genauer gesagt,
weist der Gehäuseabschnitt 430 eine Öffnung 483 auf,
die sich von einem ersten Ende 480 des Gehäuseabschnitts 430 zu
seinem zweiten Ende 482 erstreckt. Ein Einlaßkanal 420 öffnet sich
in die Öffnung 483. Der
Einlaßkanal 420 empfängt einen
Strom von Elektrolytflüssigkeiten 422,
um sie in den ringförmigen Raum 487 um
das Kapillarröhrchen 412 herum
zu lenken. Das erste Kapillarröhrchen 412 hat
ein erstes Ende 413 und ein zweites Ende 415.
Das Kapillarröhrchen 412 ist
in der Öffnung 483 des
Gehäuseabschnitts 430 mit
einer im allgemeinen T-förmigen Konfiguration
positioniert. Das erste Ende 413 des Kapillarröhrchens 412 ist
gegen das Gehäuse 430 unter
Verwendung eines leitfähigen
Elements 431 am ersten Ende 480 des Gehäuseabschnitts 430 abgedichtet.
Das Kapillarröhrchen 412 erstreckt
sich vom zweiten Ende 482 des Gehäuseabschnitts 430 und
bildet mit dem zweiten Kapillarröhrchen 414 den ringförmigen Raum 487.
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Das
zweite Kapillarröhrchen 414 weist
ein erstes Ende 490 und ein zweites Ende 491 auf.
Das zweite Kapillarröhrchen 414 ist
so positioniert, daß es konzentrisch
mit dem ersten Kapillarröhrchen 412 ist. Das
erste Ende 490 des zweiten Kapillarröhrchens 412 ist mit
dem zweiten Ende 482 des Gehäuseabschnitts 430 unter
Verwendung eines leitfähigen
Elements 432 gekoppelt. Ferner wird das zweite Ende 491 des
zweiten Kapillarröhrchens 414 relativ
zum Düsenabschnitt 322 durch
Abstandselemente 326 an Ort und Stelle gehalten. Das zweite
Kapillarröhrchen 414 erstreckt
sich um eine vorbestimmte Strecke in der Richtung der Targetzellen
von vorzugsweise etwa 0,2 mm bis etwa 1 mm über das erste Kapillarröhrchen 412 hinaus.
Der Abschnitt des zweiten Kapillarröhrchens 414 an der
Abgabespitze 495, der sich über das erste Kapillarröhrchen hinaus
erstreckt, ist zur Erreichung eines stabilen Sprühmusters und Betriebsmodus,
nämlich
beständiger
Sprühmuster
in einem Winkel von 60° bis
75° verjüngt. Ohne
die Verjüngung
kann ein intermittierender Betrieb auftreten. Ferner erstreckt sich
das zweite Kapillarröhrchen 414 um
eine vorbestimmte Strecke (d5), vorzugsweise etwa 2 mm bis etwa
5 mm über
das zweite Ende 338 des Düsenabschnitts 322 hinaus.
Das erste Kapillarröhrchen 412 hat
vorzugsweise einen Durchmesser wie das Kapillarröhrchen 320 in 7.
Das zweite Kapillarröhrchen,
das mit dem ersten Kapillarröhrchen
konzentrisch ist, hat einen bevorzugten Außendurchmesser von etwa 533,4 μm bis etwa
546,1 μm und
einen bevorzugten Innendurchmesser von etwa 393,7 μm bis etwa
431,8 μm.
Der Spalt d6 an der Spitze des zweiten Kapillarröhrchens 414 ist vorzugsweise
im Bereich von etwa 10 μm
bis etwa 80 μm.
Die anderen bevorzugten Konfigurationsparameter sind im wesentlichen
mit denen mit Bezug auf 7 beschriebenen äquivalent.
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In
einer solchen Konfiguration werden zwei Ströme von Flüssigkeiten zur Erzeugung eines Sprays
an der Abgabespitze 495 der Anordnung bereitgestellt, wenn
eine Suspension aus Biomaterial oder eine Suspension aus Trägerpartikeln
und Biomaterial verwendet wird. Dies hat die Vorteile, wie bereits
beschrieben. Ferner kann auch eine Gashülle durch den Einlaßkanal 348 bereitgestellt
werden, wie bereits mit Bezug auf 7 beschrieben.
Doch außerdem
kann sich das erste Kapillarröhrchen 412 über das
Ende des zweiten Kapillarröhrchens 414 hinaus
erstrecken, z. B. wird die Abgabespitze an dem Ende des ersten Kapillarröhrchens 412 gebildet,
das näher
an den Targetzellen ist als das Ende des zweiten Kapillarröhrchens 414.
Das heißt,
die Suspension kann die Elektrolytlösung kontaktieren, bevor sie
aus der Abgabespitze 495 austritt, oder die Suspension kann
die Elektrolytlösung
beim Austreten aus dem Ende des ersten Kapillarröhrchens 412 kontaktieren. Ferner
kann das zweite Kapillarröhrchen
verschiedene andere Konfigurationen haben, um den Raum zur Beförderung
der Elektrolytlösung
zur Abgabespitze bereitzustellen, nicht notwendigerweise eine Kapillarröhrchenstruktur.
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Die
erste oder mittige Kapillare kann verwendet werden, um Suspensionen
aus Biomaterial mit oder ohne Verwendung von Trägerpartikeln zu versprühen. Die
Durchflußrate
solcher Suspensionen kann variieren. Vorzugsweise ist die Durchflußrate etwa
0,01 μl/min
bis etwa 2,0 μl/min.
Der ringförmige Raum
zwischen der inneren 412 und äußeren 414 Kapillare
wird verwendet, um den Strom von Elektrolytflüssigkeiten mit gesteuerten
Leitfähigkeiten
zu lenken. Die Durchflußrate
solcher Elektrolytflüssigkeiten
kann variieren. Vorzugsweise ist die Durchflußrate etwa 0,1 bis etwa 5 μl/min. Beispielsweise können solche
Elektrolytlösungen
deionisiertes Wasser mit einer Spur Salpetersäure, Nährlösungen, die zum Züchten von
Kulturzellen verwendet werden, oder jede andere geeignete Komponente
für Biomateriallösungen oder
Targetzellen aufweisen. Die elektrische Leitfähigkeit solcher Elektrolytflüssigkeiten
ist vorzugsweise im Bereich von etwa 60 μΩ-1/cm
bis etwa 80000 μΩ-1/cm.
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Neben
der Steuerung der Leitfähigkeit
und somit der Ladung der versprühten
Partikel kann ferner der Doppelstrom von Flüssigkeiten zu anderen Zwecken
verwendet werden. Beispielsweise kann der Außenstrom eine Suspension von
Liposomen sein, die mit einer Suspension anderer Biomaterialien,
z. B. DNA, die durch die mittige Kapillare bereitgestellt wird,
versprüht
wird. Somit weist der äußere Strom
der Suspension ein Mittel auf, z. B. Liposomen, das verwendet wird,
um das Eindringen in die Targetzellen zu fördern, z. B. die Außenhäute zu lösen.
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9 zeigt
eine anschauliche Darstellung einer Abgabevorrichtung 500 für eine erfindungsgemäße kompakte
stiftartige Elektrospray-Anordnung, die zur Einführung von Biomaterial in Zellen,
z. B. In-situ-Zellen, z. B. menschliches Gewebe oder Gewebe anderer
Lebewesen, z. B. Epidermisgewebe, Organgewebe, Tumorgewebe, Pflanzengewebe
und dgl., verwendet werden kann. Die Abgabevorrichtung 500 weist
ein Kapillarröhrchen 502 und
einen Düsenabschnitt 504 auf,
der im wesentlichen genauso konfiguriert ist, wie mit Bezug auf 7 beschrieben.
Die Anordnung weist ferner eine Gashülle 509 auf, die zwischen
dem Kapillarröhrchen 502 und
dem Düsenabschnitt 504 bereitgestellt
wird. Der Hauptunterschied zwischen der Anordnung, wie sie in 7 gezeigt
ist, und der in 9 besteht darin, daß eine Ringelektrode 530,
die zur Erzeugung des Sprays an der Abgabespitze 531 verwendet
wird, am zweiten Ende 533 des zylindrischen isolierenden
Mantels 514 positioniert ist, der mit dem Düsenabschnitt 504 entlang mindestens
eines Abschnitts eines ersten Endes 535 des Mantels 514 konzentrisch
und vorzugsweise mit diesem in Kontakt ist.
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Beispiel 1
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Unter
Verwendung einer Anordnung, die der in 7 gezeigten
und mit Bezug darauf beschriebenen Anordnung äquivalent ist und die mit dem
Verteilerkopf mit doppelten Kapillarröhrchen 400 modifiziert
ist, der in 8 gezeigt und mit Bezug darauf beschrieben
ist, wurde ein Biomaterialtransfer erfolgreich durchgeführt. Die
verwendete Anordnung war mit einem mittigen Kapillarröhrchen 413 mit
einem Außendurchmesser
von etwa 229 μm
bis etwa 241 μm
und einem Innendurchmesser von etwa 89 μm bis etwa 127 μm konfiguriert.
Das zweite Kapillarröhrchen 414,
das mit dem mittigen Kapillarröhrchen
konzentrisch war, hatte einen Außendurchmesser von etwa 533 μm bis etwa
546 μm und
einen Innendurchmesser von etwa 394 μm bis etwa 432 μm. Der in 8 gezeigte
Abstand d1 von dem Ende des sich verjüngenden Teils 335 bis
zu dem Ende der Metallumhüllung 322 ist
etwa 2 cm. Der Durchmesser d2 des ersten Endes 336 des
Düsenabschnitts
oder der Metallumhüllung 322 ist
etwa 0,5 cm. Der Außendurchmesser
d4 des zweiten Endes 338 des Düsenabschnitts 322 ist
etwa 1715 μm
bis etwa 1740 μm und
hat einen Innendurchmesser d3 von etwa 1333 μm bis etwa 1410 μm. Der Abstand
d5 von der Spitze des zweiten Endes 338 des Düsenabschnitts 322 bis zur
Spitze des Endes des zweiten Kapillarröhrchens 414 ist etwa
5 mm. Der Spalt d6 an der Spitze des zweiten Kapillarröhrchens 414 ist
etwa 40 μm.
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Die
Abgabevorrichtung bestand aus verschiedenen Materialien. Hauptsächlich bestanden die
leitfähigen
Elemente aus nichtrostendem Stahl, die Kammerwand bestand aus Plexiglas,
und die isolierenden Teile, z. B. Abschnitte der Enden 304 und 306 bestanden
aus schwarzem Delrinkunststoffmaterial.
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Die
Biomaterialquelle war eine Suspension aus Plasmid und Au-Partikeln
mit Durchmessern von 5 und 10 nm (vertrieben von Sigma in St. Louis,
MO). Das Plasmid war ein handelsübliches
Plasmid mit EGFP-Gen (Enhanced Green Fluorescent Protein von einer
Qualle). Das Plasmid ist unter der Bezeichnung EGFP von Clontech
in Palo Alto, CA erhältlich. Das
Plasmid wurde zur Verwendung mit 0,05 μg/μl in deionisiertem Wasser mit
einer Konzentration von 0,01% Au-Partikeln resuspendiert.
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Die
Targetzellen waren Fibroplastzellen vom afrikanischen Grünaffen (COS-1),
vertrieben von American Type Culture Collection (Rockville, MD)
unter der Bezeichnung ATCC CRL-1650,
fibroplastartige Zellen aus einer Menschenaffenniere, die mit einem
SV40-Virus transformiert waren. Die Targetzellen waren eine Monoschicht
mit einer geschätzten Konzentration
von etwa 800 Zellen/cm2. Die Targetzellen
sind in einem Dulbecco's
Modified Eagle Medium (DMEM-Hi), das 10% fötales Kälberserum und 90% deionisiertes
Wasser aufweist (vertrieben von Gibco/BRL in Rockville, MD).
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Das
Elektrospray wurde in einem pulsierenden Modus in einer gefluteten
Kammer 302 verarbeitet. Die Kammer 302 wurde mittels
eines CO2-Stroms von 50 cm3/min
durch den Kanal 354 geflutet. Es war keine Gashülle um das
zweite Kapillarröhrchen 414 vorgesehen.
Eine Spannung von 4300 V wurde an das leitfähige Element 312 angelegt,
wie in 7 gezeigt. Der Abstand von der Abgabespitze 495 des zweiten
Kapillarröhrchens 414 bis zu
den Targetzellen 340 war etwa 2,5 cm. Die Zellen wurden
in kleinen Mulden 396 bereitgestellt (die von einer Kulturschale
mit 12 Mulden abgetrennt waren, vertrieben von Corning in Cambridge,
MA), die aus optisch reinem fabrikneuem Polystyrol, behandelt mit
optimaler Zellhaftung, bestanden und einen Durchmesser von etwa
22 mm aufwiesen. Die Mulde 396 wurde auf der Plattform 312 des
zweiten Endes 306 des Gehäuses 302 plaziert.
Leitfähige
Drähte 397 wurden
vom Innern der Mulde 396 bis zur leitfähigen Plattform 312 bereitgestellt,
um die Streuladung abzuführen
und auch um das Spray zu erzeugen.
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Die
Hüllflüssigkeit,
die in dem ringförmigen Raum 487 zwischen
dem ersten und dem zweiten Kapillarröhrchen 412, 414 bereitgestellt
wird, war ein deionisierter Wasserstrom von 1 μl/min plus eine Spur von Salpetersäure in einem
Verhältnis
von etwa (1:50) mit einer elektrischen Leitfähigkeit von etwa 300 μΩ-1/cm. Die oben beschriebene Suspension wurde
mit einer Spritzenpumpe, die unter der Bezeichnung Doppelspritzenpumpe
Harvard "33" von Harvard Apparatus
in Holliston, MA vertrieben wird, mit einer Rate von 1,0 μl/min bereitgestellt.
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Die
Zellen wurden für
etwa 2 min bei einer Temperatur von 20°C und einem Druck von 1 Atmosphäre versprüht. Die
Mulde, die die Targetzellen enthielt, war für 1,5 Tage bei einer Temperatur
von etwa 37°C,
d. h. die Zeit, die Zellen brauchen, um sich selbst zu teilen und
Fluoreszenz zu exprimieren, in einem Inkubator (vertrieben von NAPCO
in Landrum, SC) plaziert. Ein UV-Mikroskop, das unter der Bezeichnung
Nikon Inverted Fluorescent Mikroscope von Fryer Co. in Minneapolis,
MN vertrieben wird, wurde verwendet, um die Fluoreszenz zu visualisieren.
Annähern
40% bis 60% der Zellen fluoreszierten. Da Fluoreszenz festgestellt
wurde, war die Einführung
von Biomaterial in die Zelle erfolgreich.
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Beispiel 2
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Es
wurde der gleiche Aufbau wie in Beispiel 1 verwendet. Der einzige
Unterschied bestand darin, daß der
Suspension Au-Partikel hinzugesetzt wurden und die an das Element 312 angelegte
Spannung 5600 V betrug, so daß die
Abgabevorrichtung in einem Kegelstrahlmodus betrieben wurde. Wiederum wurde
das UV-Mikroskop verwendet, um die Fluoreszenz zu visualisieren.
Annähernd
40% bis 60% der Zellen fluoreszierten. Da Fluoreszenz beobachtet wurde,
war die Einführung
von Biomaterial in die Zelle erfolgreich.