DE69830927T2 - Bewertung von humaner papillomvirus verwandter krankheit - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der cytologischen und molekularen Tests und insbesondere das Gebiet der Tests zur Bewertung einer Krankheit unter Verwendung eines sensitiven Tests zur Diagnose und Prognose von HPV-induziertem Karzinom.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Der Nachweis und die Diagnose der Krankheit sind von offenkundiger Bedeutung für die Behandlung der Krankheit. Zahlreiche Merkmale von Krankheiten wurden identifiziert, und viele werden zur Diagnose der Krankheit verwendet. Vielen Krankheiten gehen Veränderungen des Zustandes der betroffenen Zellen voraus, und sie sind dadurch charakterisiert. Die Veränderungen können die Expression viraler Gene in den infizierten Zellen, Veränderungen der Expressionsmuster der Gene in den betroffenen Zellen und Veränderungen der Zellmorphologie einschließen. Der Nachweis, die Diagnose und die Überwachung der Krankheiten können durch die Bewertung derartiger Zellzustände unterstützt werden.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das humane Papillomvirus (HPV), das gutartige Epithelproliferationen der Haut und Schleimhaut beim Menschen induziert und mit anogenitaler Neoplasie und Karzinomen assoziiert ist. Die intakte DNA von HPV ist superspiralisiert und ähnelt einer unendlichen Schleife einer verdrillten Telefonschnur. In dieser Hülle ist die Virus-DNA in und um Proteine aus dem Zellkern, Histone und assoziierte Peptide in einer Struktur verpackt, die dem zellulären Chromatin ähnelt. (Turek, (1994)). Bisher charakterisierte humane Papillomviren sind mit Läsionen assoziiert, die auf die Epithelschichten der Haut oder der Mund-, Pharynx-, Atemwegs- und am wichtigsten der anogenitalen Schleimhaut begrenzt sind. Spezifische humane Papillomvirustypen, einschließlich HPV 6 und 11, verursachen häufig gutartige Schleimhautläsionen, während man andere Typen, HPV 16, 18 und die meisten anderen Stämme, hauptsächlich in hochgradigen Läsionen und Krebs findet. Allen humanen und tierischen Papillomviren scheint eine ähnliche genetische Organisation gemeinsam zu sein, obwohl es Unterschiede bei den Funktionen der einzelnen viralen Gene und bei ihrer Regulation gibt. Der häufigste genitale, mit Zervixkarzinom assoziierte HPV-Typ, HPV 16, wurde am ausführlichsten untersucht.
  • Alle großen offenen Leserahmen (ORFs) in HPV liegen auf einem DNA-Strang. mRNAs des Papillomvirus scheinen nur aus einem Einzelstrang der infizierten Zellen transkribiert zu werden. Das Virusgenom kann in drei Regionen eingeteilt werden, die stromaufwärtsliegende regulatorische Region (URR) oder die lange Kontrollregion (LCR), die die Kontrollsequenzen für die HPV-Replikation und Genexpression enthält, die frühe virale Genregion, die unter anderem die E2-, E6- und E7-Gene codiert, und die späte Region, die die L1- und L2-Gene codiert (Turek, (1994)).
  • Die HPV-Genexpression bei einer hochgradigen prämalignen Erkrankung oder Krebs scheint möglicherweise aufgrund des Aufhörens der von den viralen E6- und E7-Genen induzierten Zelldifferenzierung auf die frühen Gene beschränkt zu sein. Im Vergleich zur aktiven HPV-Infektion ist die E6- und E7-Genkontrolle bei Krebs durch Mutationen in der viralen URR und in integrierten Virusfragmenten durch die Unterbrechung des viralen E2-Gens, durch die Stabilisierung der E6- und E7-mRNAs und durch die Einflüsse auf die zelluläre Integrationsstelle gestört.
  • Da das E2-Gen bei invasiven Zervixkarzinomen in integrierten HPV-Fragmenten unterbrochen oder inaktiviert ist (Cullen, (1991); Dürst, (1985); Matsukura, (1989); Schneider-Gädicke. (1986); Schwarz, (1985); Wilczynski, (1988)), wurde vorhergesagt, dass der Verlust von E2 einen selektiven Wachstumsvorteil für die infizierte Zelle aufgrund der unkontrollierten E6- und E7-Expression verleiht (Schneider-Gädicke, (1986); Schwarz, (1985)). Tatsächlich trennen sich die Zervixzellen, die replizierende HPV-Genome enthalten, schnell ab und werden in Kultur von Zellen überwachsen, die integrierte Virusgenome enthalten (Jeon (1995)), aber der/die zugrunde liegende(n) Mechanismus/Mechanismen blieb/blieben bisher unklar. Die HPV 16-E2-Genprodukte mit der gesamten Länge sind starke Transkriptionsaktivatoren im Vergleich zu HPV 1 E2 bei einfachen viralen sowie bei einfachen synthetischen Promotoren (Demeret (1994); Ushikai (1994)).
  • Man ist der Ansicht, dass die Gene E6 und E7 onkogene Aktivität besitzen. Die codierten Proteine interagieren mit den physiologischen Funktionen der an der Zellzykluskontrolle beteiligten Zellproteine und stören sie. Die E6/E7-Proteine von HPV 16, 18 oder von verwandten Typen sind in dieser Hinsicht am effizientesten. Einige dieser Aktivitäten führen zu genetischer Instabilität der ständig infizierten menschlichen Zelle. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit von Mutationen in zellulären Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen und trägt daher zur Tumorprogression bei. Mutationen in zellulären Genen, die an der intrazellulären Überwachung von HPV-Infektionen, der Integration von viraler DNA und Deletionen oder Mutation der viralen Transkriptionskontrollsequenzen beteiligt sind, führen zu einer signifikant erhöhten Expression der E6/E7-Gene, die ein konsistentes Merkmal von hochgradiger intraepithelialer Neoplasie und Krebs ist. Die genetische Instabilität, die von viralen Onkoproteinen verursacht wird, und der autokatalytische Anstieg der Onkoproteinexpression, der durch Mutationen im Virus- und Zellgenom verursacht wird, identifizieren das Virus als die hauptsächliche treibende Kraft der Progression zum Karzinom.
  • WO 91/08312 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung spezifischer DNA und/oder RNA-Transkripte von HPV E6- und/oder E7-Genen, wobei ein prognostischer Indikator für die gravierende Zervixneoplasie und Krebs bereitgestellt wird.
  • Einzelne Typen der humanen Papillomviren (HPV), die Schleimhautoberflächen infizieren, wurden als Krankheitserreger für Karzinome in der Zervix, im Anus, Penis, Kehlkopf und in der Mundhöhle, für gelegentliche periunguale Karzinome sowie für gutartige anogenitale Warzen in Verbindung gebracht. Die Identifizierung bestimmter HPV-Typen wird zur Identifizierung von Patienten mit prämalignen Läsionen verwendet, bei denen ein Risiko besteht, dass eine Progression zur Malignität erfolgen kann. Obwohl sichtbare anogenitale Läsionen in einigen Personen vorhanden sind, die mit dem humanen Papillomvirus infiziert sind, weist die Mehrheit der Individuen mit einer HPV-Infektion des Genitaltrakts keine klinisch offensichtliche Erkrankung auf, aber die Analyse der cytomorphologischen Merkmale, die in Zervixabstrichen vorliegen, kann verwendet werden, um die HPV-Infektion nachzuweisen. Herkömmliche Virennachweistests, einschließlich serologischer Tests und dem Wachstum in Zellkultur, sind nicht im Handel erhältlich und/oder nicht für die Diagnose und Verfolgung der HPV-Infektion geeignet. Papanicolaou-Tests sind ein wertvolles Durchmusterungswerkzeug, aber ihnen entgeht ein großer Anteil der HPV-infizierten Personen.
  • Daher ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bewertung des Stadiums der auf HPV basierenden Krankheit bereitzustellen.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Test bereitzustellen, der mit anderen Tests kombiniert werden kann, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der prognostischen und diagnostischen Bewertung der auf HPV basierenden Krankheit zu verbessern.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bewertung des Risikos bereitzustellen, dass ein mit HPV infizierter Patient eine auf HPV basierende Krankheit entwickelt.
  • Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Klassifizierung von Patienten bereitzustellen, die derzeit mit HPV infiziert sind, jedoch ohne nachweisbare auf HPV basierende Krankheit, in diejenigen, für die ein Risiko besteht, dass eine Progression der Erkrankung erfolgt, und diejenigen, für die kein Risiko besteht, dass eine Progression der Erkrankung erfolgt.
  • Es ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Identifizierung von Behandlungsregimen für Patienten mit einer auf HPV basierenden Krankheit bereitzustellen.
  • Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit der Behandlung der auf HPV basierenden Krankheit bereitzustellen.
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Kits zur Bewertung des Stadiums der auf HPV basierenden Krankheit bereitzustellen.
  • Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein computergestütztes Verfahren, eine Analyse und ein Datenmanagement der Testdaten bereitzustellen, um das Stadium der auf HPV basierenden Krankheit zu bewerten.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Messung der Expressionsspiegel der Gene, die an einem Zellzustand beteiligt sind, und den Vergleich ihrer Expression miteinander oder mit Referenzgenen in einem spezifischen Verhältnis als Indikation für den Krankheitszustand in der Zellprobe. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um das Stadium oder das Risiko zu bewerten, wie durch den Zustand der Zellen angezeigt. Sie kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Therapie für eine Krankheit zu lenken oder zu bewerten, indem basierend auf dem angegebenen Zellzustand die geeignete Therapie identifiziert wird, oder indem jede Veränderung des Zustandes der Zellen, die der Therapie unterzogen werden, angezeigt wird.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden der Zustand und die Prognose einer humanen Papillomvirus (HPV)-Infektion oder einer auf HPV basierenden Krankheit bewertet. Diese Ausführungsform beinhaltet die Messung des Expressionsspiegels von zwei oder mehreren HPV-Genen. Gene für diesen Zweck sind die HPV E6-, E7-, L1- und E2-Gene, obwohl andere Gene wie E1, E4, E5 und L2 ebenfalls verwendet werden können. Man fand heraus, dass der Expressionsspiegel dieser Gene, das Expressionsverhältnis dieser Gene zueinander oder zu Referenzgenen oder beides auf das Stadium der auf HPV basierenden Krankheit hinweist.
  • Die Genexpressionsspiegel werden nach dieser Erfindung verwendet, um die Progression der HPV-Infektion vom gutartigen zum bösartigen Wachstum zu bewerten. Die Progression der HPV-Infektion erfolgt von CIN I bis CIN III und schließlich bis zu bösartigem Krebs. Diese Stadien können durch die Verhältnisse der HPV-Gene identifiziert werden. Insbesondere der Übergang von CIN I zu CIN II/III d.h. ein Übergang zur Prämalignität kann vorhergesagt werden, wenn das Verhältnis der vorliegenden Erfindung eins überschreitet. Ein Verhältnis größer als 3 in der vorliegenden Erfindung zeigt einen Übergang von der Prämalignität zu bösartigem Krebs an. Daher zeigt ein Verhältnis, das kleiner als 1 ist, eine niedriggradige CIN in einer HPV-infizierten Zelle an. Ein Verhältnis zwischen eins und etwa drei zeigt hochgradige CIN (d.h. CIN III) oder einen prämalignen Zustand an. Und ein Verhältnis von ungefähr größer drei, ist ein Hinweis auf eine HPV-induzierte Malignität.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 ist eine graphische Darstellung des Nachweises von E6/E7-mRNA, die als die Anzahl der Zellen/Vertiefung gegenüber der Anzahl von E6/E7-mRNA/Vertiefung dargestellt ist.
  • 2 ist eine graphische Darstellung der Sensitivität eines HPV L1-Tests, die als die Anzahl der RNA-Moleküle/Vertiefung gegenüber dem Signal-zu-Rauschen-Verhältnis minus 1 dargestellt ist.
  • 3 ist die Sondensequenz für HPV 16 L2 (SEQ ID NO: 2).
  • 4 ist die Sondensequenz für HPV 16 L1 (SEQ ID NO: 2).
  • 5 ist die Sondensequenz für HPV 16 E6/E7 (SEQ ID NO: 3).
  • 6 ist die Sondensequenz für HPV 16 E2 (SEQ ID NO: 4).
  • 7 ist die Sondensequenz für HPV 16 E4 (SEQ ID NO: 5).
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Überwachung von erkrankten Zellen. Ein Verfahren beinhaltet die Messung der Expressionsspiegel von Genen, die an einem Krankheitszustand beteiligt sind, und den Vergleich ihrer Expression miteinander oder mit Referenzgenen als Hinweis auf den Zustand der Zellen. Derartige Messungen können mit anderen Tests kombiniert werden, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Beurteilung des Krankheitszustandes zu erhöhen. Ein Verfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um das Stadium einer Krankheit zu bewerten, wie durch den Zustand der Zellen angezeigt. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Therapie für eine Krankheit zu lenken oder zu bewerten, indem basierend auf dem angezeigten Krankheitszustand die geeignete Therapie ermittelt wird, oder indem jede Veränderung des Zustandes der Zellen, die der Therapie unterzogen werden, angezeigt wird.
  • Viele Krankheiten werden durch spezifische Zellphänotypen und Genexpressionsmuster charakterisiert. Beispielsweise zeigen neoplastische und Krebszellen im Allgemeinen bestimmte unterschiedliche Morphologien und Wachstumsmerkmale. Molekulare Merkmale wie Genmutationen und Genexpressionsmuster sind ebenfalls ein guter Indikator für die Progression der Krankheit. Mit Viren infizierte Zellen können verschiedene Morphologien und Genexpressionsmuster, einschließlich der Expression von viralen Genen, zeigen. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung können die Merkmale des Zellzustandes, wie Veränderungen der Zellmorphologie, oder die Expression von Genen aus einer Patientenprobe bestimmt werden.
  • Die nachzuweisenden Merkmale sind im Allgemeinen für den Zellzustand von Interesse und die Erkrankung spezifisch, von der man vermutet, dass sie in der Zellprobe vorliegt. Derartige Merkmale können im Allgemeinen in zwei Typen eingeteilt werden: Cytologische Merkmale und molekulare Merkmale. Wie hier verwendet, sind cytologische Merkmale, Merkmale wie beispielsweise die Gesamtzellform und -erscheinung. Die primäre Identifizierung und Klassifizierung vieler neoplastischer Zellen oder Krebszellen erfolgten traditionell unter Verwendung cytologischer Merkmale. Die Identifizierung von cytologischen Merkmalen ist im Allgemeinen langsam, erfordert ein relativ hohes Ausbildungsniveau und kann im Allgemeinen nicht leicht automatisiert werden. Wie hier verwendet, sind molekulare Merkmale das Vorliegen und der Zustand von bestimmten molekularen Spezies wie Proteine, Nucleinsäuren und Metaboliten. Derartige molekulare Merkmale werden im Allgemeinen durch den Nachweis und die Messung der speziellen Moleküle von Interesse identifiziert.
  • Die getesteten Merkmale können Zusatz- oder Ersatzmerkmale von Markern einschließen, die nicht eine direkte Ursache oder das Ergebnis der Krankheit sind, aber die mit bestimmten Erkrankungen und Zellzuständen in Beziehung stehen. Beispiele derartiger zusätzlicher Marker schließen polymorphe Marker, humane Leukocytenantigene (HLA) wie B7, die Frauen für Zervixkarzinome prädisponieren, Onkogene, p53-Mutationen, andere Krebsmarker, Onkosuppressoren, Cytokine, Wachstumsfaktorrezeptoren und Hormone ein. Derartige Marker können in den Zellen, die zustands- oder krankheitsspezifische Merkmale zeigen, vorliegen oder fehlen, und ein derartiges Vorliegen oder Fehlen kann beispielsweise auf einen gravierenden oder weniger gravierenden Krankheitszustand hinweisen. Diese Marker können in Verbindung mit dem offenbarten Verfahren verwendet werden, um entweder ein höheres oder niedrigeres Risiko einer neoplastischen Erkrankung abzuleiten, abhängig von der Anzahl der anormalen Bewertungen oder dem Ausmaß der Änderungen der quantitativen Marker.
  • Beispiele von Krankheitszuständen zur Bewertung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Neoplasien und Krebs. Krankheitzustände von Interesse sind auf HPV basierende Krankheiten – einschließlich HPV-Infektion, zervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN) und Krebs, atypische Plattenepithelien unbestimmter Signifikanz (ASCUS), Warzen, Condylomata, Epidermodysplasia verruciformis und andere Hauterkrankungen, Kehlkopfpapillome, orale Papillome und Bindehautpapillome.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis und die Messung der Expressionsspiegel bestimmter HPV-Gene. Während des letzten Jahrzehnts wurde eine beeindruckende Datenmenge angesammelt, die zeigte, dass das Zervixkarzinom mit einer Infektion von bestimmten HPV-Typen assoziiert ist. Obwohl das Vorliegen von HPV-DNA in einer präcancerösen Läsion auf ein erhöhtes relatives Risiko für eine Zervixdisplasie und ein invasives Karzinom hinweist, ist es immer noch schwierig, das klinische Verhalten von präcancerösen Zervixläsionen vorherzusagen. Tumoren entstehen aufgrund der Anhäufung von genetischen Veränderungen, die Onkogene aktivieren können und/oder Tumorsuppressorgene und/oder Gene inaktivieren, die an der Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.
  • Die Expressionsspiegel von E6- und E7-Onkoproteinen, die von Hochrisiko-HPV-Typen codiert werden, sind ein sensitiveres und genaueres Maß für das potenzielle Risiko, dass sich eine HPV-Infektion zu einer Krebsläsion entwickelt. Die vorliegende Erfindung misst die relativen Mengen der E6- und/oder E7-Expressionsspiegel und E2 und/oder L1 in einer HPV-infizierten Läsion, um das Verhältnis von E6 und/oder E7 zu L1 und/oder E2 zu bestimmen, wobei in diesem Verhältnis ein direktes Maß des Risikos und die Anfälligkeit für die Entwicklung einer Krebsläsion beinhaltet ist. Die HPV-Expression kann durch mRNA oder die Proteinspiegel in der Zelle gemessen werden
  • In einem erfindungsgemäßen Aspekt wird das Stadium und die Prognose einer humanen Papillomvirus (HPV)-Infektion oder auf HPV basierenden Krankheit bewertet. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Messung des Expressionsspiegels von einem oder mehreren HPV-Genen, von denen man herausgefunden hat, dass sie mit dem Stadium und der Natur der auf HPV basierenden Krankheit in Beziehung stehen. Gene, die für diesen Zweck nützlich sind, schließen die HPV E6-, E7-, L1- und E2-Gene ein. Man fand heraus, dass der Expressionsspiegel dieser Gene, das Verhältnis der Expression dieser Gene zueinander oder zu einem oder mehreren anderen Genen oder beides auf das Stadium der auf HPV basierenden Krankheit hinweist. Der Expressionsspiegel ist relativ zu anderen HPV-Genen, oder der Expressionsspiegel ist relativ zu einem Nicht-HPV-Gen, das hier als Referenzgen bezeichnet wird. Derartige Referenzgene können jedes geeignete Gen sein (das nicht von HPV codiert wird) und sind beispielsweise „Housekeeping"-Gene oder andere konstitutiv exprimierte Gene. Beispiele von Referenzgenen schließen Actingene, Gene des Cytoskeletts, Histongene, Tubulingene, epidermale Wachstumsfaktorrezeptorgene, das normale p53-Gen, das normale pRB-Gen, Cyclingene, β-Globulingene und Glucose-6-phosphatdehydrogenasegene ein. Die Expression der Referenzgene kann in derselben Zelle gemessen werden wie der Spiegel der HPV-Gene gemessen wird oder in benachbarten Zellen in derselben Zellprobe. In einem derartigen Fall ist das Referenzgen eine interne Kontrolle für die Genexpression.
  • Das Verhältnis des relativen Expressionsspiegels dieser Gene zum Zustand der mit HPV infizierten Zellen wird allgemein in der nachstehenden Tabelle 1 veranschaulicht.
  • Figure 00100001
  • Die auf HPV basierende hochgradige CIN, auf die in der Tabelle Bezug genommen wird, ist das prämaligne Stadium, das zu Krebs führt, und niedriggradige CIN ist eine produktive Virusinfektion mit geringem bösartigen Potential, aber sie ist ein Anliegen des öffentlichen Gesundheitswesens hinsichtlich der Ausbreitung der HPV-Infektion. Normales Gewebe bezieht sich auf cytologisch normales Gewebe, das mit HPV infiziert ist. Obwohl nicht auf diesen Standard begrenzt, ist ein Standard zur Etablierung dieser niedrigen Expressionsgrenze ein Spiegel, der unter demjenigen liegt, der bei Verwendung des von Digene in WO 93/10263 beschriebenen Hybrid-Capture-Tests nachweisbar ist. Wie hier verwendet, bezieht sich E6/E7 auf E6, E7 oder E6 + E7. Die Zugabe von Genen wie beispielsweise bei „E6 + E7" bezieht sich auf die kombinierte Expression der zugegebenen Gene.
  • Wie man leicht erkennen kann, wird jeder Hauptkrankheitszustand von einem einzigartigen Expressionsmuster dieser drei Gensets repräsentiert. Beide Zustände werden als gravierende medizinische Beschwerden betrachtet. Andere Verhältnisse, die den relativen Expressionsspiegel anderer HPV-Gene (wie E1, E4, E5 und L2) und anderer Nicht-HPV-Gene beinhalten, können ebenfalls verwendet werden, um den Zellzustand zu bewerten. Beispielsweise sind L2 und E4 häufig mit gutartigen Erkrankungen assoziiert, bei denen Viren produziert werden, und E1 ähnelt im Profil E2 und ist häufig bei bösartigen Tumoren deletiert. Andere Verhältnisse der Expression für diese HPV-Proteine können für andere auf HPV basierende Krankheiten existieren und das offenbarte Verfahren kann verwendet werden, um den Zustand derartiger anderer Krankheiten unter Verwendung der geeigneten Spiegel und Verhältnisse für jene Krankheit zu bewerten.
  • Unter Verwendung der Informationen über die Spiegel und Verhältnisse der HPV-Gene in verschiedenen Zellzuständen, kann das Stadium der Krankheit auf mehrere Arten beurteilt werden. In einigen Fällen ist das Vorliegen oder Fehlen der nachweisbaren Expression ein Indikator für den Krankheitszustand in den infizierten Zellen. Beispielsweise weist ein Fehlen der E2-Expression (wenn HPV vorliegt) auf hochgradige CIN oder Krebs hin. In anderen Fällen kann eine Veränderung oder ein Unterschied bei der Expression eines HPV-Genprodukts auf die Veränderung hinweisen, die in dem infizierten Zellzustand auftritt. Beispielsweise kann ein erhöhter Expressionsspiegel von E6 und E7 – relativ zu beispielsweise einer früheren Probe oder einer Referenzprobe auf hochgradige CIN oder Krebs hinweisen. Eine Änderung des Verhältnisses der E6/E7-Expression zur E2-Expression wird verwendet, um niedriggradige CIN oder eine Verschiebung von normalen Zellen zu niedriggradiger CIN zu identifizieren. Viele andere Kombinationen von Vergleichen sind ebenfalls möglich, und andere Kombinationen können aus den Angaben in Tabelle 1 zur Verwendung beim Verfahren der vorliegenden Erfindung abgeleitet werden.
  • Eine Art, mit der die Verhältnisse der HPV-Gene mit einer auf HPV basierenden Krankheit in Beziehung gebracht werden können, beinhaltet die Bezugnahme auf Gruppen von HPV-Genen. Für diesen Zweck schließen Gruppe 1-Gene oder Gensets E6, E7 und E6 + E7 ein. Gruppe 2-Gene oder Gensets schließen L1, L2, E4 und irgendwelche Kombinationen davon ein. Gruppe 3-Gene oder Gensets schließen E1, E2, E5 und irgendwelche Kombinationen davon ein. Nützliche Expressionsverhältnisse schließen Verhältnisse von Mitgliedern von Gruppe 1 zu Mitgliedern von Gruppe 2 oder Gruppe 3 ein. Beispiele dieser Verhältnisse sind (E6 + E7)/(L1 + L2), E6/L1, E7/L1, E6/L2, E7/L2, (E6 + E7)/L1, (E6 + E7)/L2, E6/(L1 + L2) und E7/(L1 + L2). Für derartige Verhältnisse weist ein Wert, der kleiner als zwei ist, auf eine gutartige humane Papillomvirusinfektion oder eine niedriggradige intraepitheliale Neoplasie hin. Dieser Infektionstyp wird auch als CIN I klassifiziert. HPV-Infektionen mit einer Progression über CIN I zeigen, dass eine Zelltransformation aufgetreten ist und das Krebswachstum begonnen hat. Diese späteren Infektionen (CIN II/III) haben Verhältnisse, die größer als 2 sind. Ein Expressionsverhältnis, das größer als zwei ist, weist auf eine hochgradige intraepitheliale Neoplasie oder prämalignen Krebs hin. Ein Expressionsverhältnis, das um vieles größer als zwei ist (d.h. über 4 bis unendlich) weist auf Krebs hin. Bevorzugte Verhältnisse zur Verwendung in dieser Erfindung sind (E6 + E7)/L1, (E6 + E7)/(L1 + L2), (E6 + E7 + E2 + E4)/(L1 + L2), (E6 + E7)/(E2 + E4), (E6 + E7)/E2, (E6 + E7 + E2 + E4)/(L1 + L2).
  • Es gibt mehrere Arten, mit denen die gemessenen Expressionsspiegel von HPV-Genen verglichen und in Kategorien eingeordnet werden können. Wo beispielsweise das Vorliegen oder Fehlen der Expression auf den Zellzustand hinweist, wird die Expression des HPV-Gens ohne Bezugnahme auf den Expressionsspiegel anderer Gene analysiert. Wo der relative Expressionsspiegel eines HPV-Gens auf den Zellzustand hinweist, wird der gemessene Expressionsspiegel beispielsweise mit dem Expressionsspiegel desselben HPV-Gentyps in einer unterschiedlichen Zellprobe (wie eine frühere Zellprobe von derselben Quelle oder Referenzzellen, die HPV tragen), mit dem Expressionsspiegel eines unterschiedlichen HPV-Gentyps in derselben oder einer unterschiedlichen Zellprobe, mit dem Expressionsspiegel eines Nicht-HPV-Referenzgens derselben Zellprobe oder mit dem Expressionsspiegel eines Nicht-HPV-Referenzgens in Referenzzellen verglichen.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Expressionsspiegel und Expressionsverhältnisse der HPV-Gene mit den Spiegeln derselben Gene in einer Zelllinie verglichen, die HPV (wie HeLa oder CaSki) enthält. Derartige Zelllinien stellen einen Standard bereit, mit dem die Expressionsspiegel der HPV-Gene in Zellproben verglichen werden. Derartige Vergleiche werden verwendet, um die absoluten Expressionsspiegel dieser HPV-Proteine mit denjenigen in einer Standard- oder Vergleichszelllinie zu bewerten und zu vergleichen. Andere Zelllinien, die für diesen Zweck nützlich sind, sind mit HPV 16 infizierte nichtkanzeröse Zelllinien (wie W 12) oder HPV 31 (wie CIN-612; Meyers (1992)).
  • Die Expressionsspiegel und Expressionsverhältnisse der HPV-Gene werden auch mit Referenzgenen wie „Housekeeping"-Genen oder anderen konstitutiv exprimierten Genen in denselben Zellen oder in Referenzzellen wie einer Zelllinie verglichen. Der Expressionsspiegel des HPV-Gens und des Referenzgens wird beispielsweise in derselben Zellprobe verglichen. Derartige Messungen stellen eine interne Kontrolle des Gesamtexpressionsspiegels in einer Zellprobe bereit und werden verwendet, um den korrigierten Expressionsspiegel für das HPV-Gen zu berechnen, um genauere Vergleiche des Expressionsspiegels zwischen verschiedenen Zellproben zuzulassen. Eine Form der Korrektur wird als Normalisierung bezeichnet. Daher kann der Expressionsspiegel von einem oder mehreren HPV-Genen in zwei oder mehr Zellproben zusammen mit dem Expressionsspiegel desselben Referenzgens in jeder der Zellproben gemessen werden. Der Expressionsspiegel der HPV-Gene wird dann zueinander normalisiert, basierend auf Unterschieden, falls vorhanden, zwischen dem Expressionsspiegel des Referenzgens in jeder der Proben.
  • In einigen Stadien der auf HPV basierenden Krankheit ist die Expression eines bestimmten HPV-Gens niedrig oder nicht nachweisbar. Ein derartiges Fehlen der nachweisbaren Expression wird hier verwendet, um Expressionsmuster zu identifizieren, die als prognostische oder diagnostische Indikatoren dienen. Die Expression anderer HPV-Gene wird parallel oder in demselben Test bewertet, um eine Kontrolle für das Fehlen der Expression von einem oder mehreren Genen, die bewertet werden, bereitzustellen. Dies erfolgt, indem die Expression von mehreren HPV-Genen zusammen oder parallel gemessen wird. Beispielsweise ist die parallele Messung des Expressionsspiegels der HPV E6-, E7-, L1-, E4- und E2-Gene nützlich, da mindestens eines dieser Gene in allen Stadien der auf HPV basierenden Krankheit exprimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt das Verhältnis von E6/E7 zu L1/E2 einen Indikator der Wahrscheinlichkeit, Krebs aufgrund der HPV-Infektion zu entwickeln, bereit. Auf diese Weise werden hinweisende Informationen gesammelt sowie eine interne Kontrolle bereitgestellt. Das Vorliegen von L1, L2 und E4 in Kombination weist ebenfalls auf eine gutartige Erkrankung hin, während das Fehlen von E1 und/oder E2 auf ein neoplastisches Potential hinweist.
  • Die vorstehend beschriebenen Vergleichstypen können auch bei anderen Genen und anderen Krankheitszuständen verwendet werden. D.h., dass der gemessene Expressionsspiegel eines Gens von Interesse beispielsweise mit dem Expressionsspiegel desselben Gentyps in einer unterschiedlichen Zellprobe (wie eine frühere Zellprobe aus derselben Quelle oder geeignete Referenzzellen), mit dem Expressionsspiegel eines unterschiedlichen Gentyps in derselben oder in einer unterschiedlichen Zellprobe, mit dem Expressionsspiegel eines Referenzgens in derselben Zellprobe, oder mit dem Expressionsspiegel eines Referenzgens in Referenzzellen verglichen werden kann.
  • Die Expression der Gene von Interesse wie die HPV E6-, E7-, L1-, E4- und E2-Gene können unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens bewertet werden. Beispielsweise kann RNA unter Verwendung von Hybridisierung, Amplifikation oder Sequenziertechniken nachgewiesen werden, und Protein kann unter Verwendung spezifischer Antikörper nachgewiesen werden. Viele Verfahren für den spezifischen Nachweis der Genexpression durch Nachweis von Expressionsprodukten sind bekannt und können mit den offenbarten Verfahren verwendet werden. Ein Verfahren zum Nachweis und der Messung des Expressionsspiegels von Genen von Interesse ist der Nachweis von RNA, die aus den Genen von Interesse transkribiert wird. Für die verlässlichsten Vergleiche sollten Expressionsspiegel, die verglichen werden sollen, unter Verwendung desselben Verfahrens verglichen werden und auf dieselbe Weise durchgeführt werden.
  • Für den Hybridisierungsnachweis der HPV-Nucleinsäuren kann ein Gemisch von für diese Sequenzen spezifischen Sonden aus verschiedenen HPV-Typen verwendet werden. Dies stellt sicher, dass das Verfahren die Expression unabhängig vom beteiligten HPV-Typ nachweist. Für einige Zwecke kann es wünschenswert sein, für die Sequenz eines bestimmten HPV-Typs konstruierte Sonden oder ein Gemisch von Sonden für nur einige HPV-Typen zu verwenden. Derartige Sonden können typspezifisch sein oder nicht, abhängig von den Unterschieden zwischen den Sequenzen der nachzuweisenden HPV-Nucleinsäuren. Ein nützliches Gemisch für diesen Zweck würde Sonden für HPV-Typen einschließen, die enger mit einer Progression von Krebs assoziiert sind. Die HPV-Typen, die am häufigsten mit Zervixkrebs assoziiert sind, sind die Typen 16 und 18.
  • Nützliche Verfahren zur Messung des Expressionsspiegels eines Gens von Interesse in einer Zellprobe schließen das in WO 93/10263 von Digene beschriebene Hybrid-Capture-Verfahren, das von (Nuovo, 1997)) beschriebene PCR-in-situ-Hybridisierungsverfahren, b-DNA-Tests (Chernoff (1997)), die transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) (Stoflet (1988)) und die Polymerasekettenreaktion (PCR), die Ligasekettenreaktion (LCR), die selbsterhaltende Sequenzreplikation (3SR), die nucleinsäuresequenzbasierte Amplifikation (NASBA), die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) und die Amplifikation mit Qß-Replikase ein (Birkenmeyer und Mushahwar, (1991); Landegren, (1993)).
  • Zahlreiche Tests zum Nachweis und zur Messung von Genexpressionsprodukten sind bekannt und können für die Bestimmung des Expressionsspiegels von Genen von Interesse in dem offenbarten Test angepasst werden. Beispielsweise können viele der Verfahren zum Nachweis von HPV im Allgemeinen oder der Expression anderer HPV-Gene, die nachstehend beschrieben werden, auch zur Verwendung in dem offenbarten Test zum Nachweis der HPV-Gene E6, E7, L1, E4 und E2 angepasst werden.
  • Viele HPV-Nachweis- und Typisierungstests, die in dem offenbarten Verfahren verwendet werden können, sind bekannt, einschließlich Tests, die Southern Blots, Dot-Blots, in-situ-Hybridisierung, Polymerasekettenreaktion und Hybridisierung in Lösung beinhalten. Mant (1997) beschreibt PCR-Tests, die zur Identifizierung von DNA aus spezifischen HPV-Typen verwendet werden. Cope (1997) beschreibt einen auf PCR basierenden Test, bei dem ein Consensusprimer verwendet wird, und einen Hybrid-Capture-Test (HCA) zum Nachweis von HPV-Typen. Der Hybrid-Capture-Test wird auch in WO 93/10263 von Digene beschrieben. Der Hybrid-Capture-Test ist ein nützliches Verfahren zum Nachweis von HPV und zur Bestimmung des HPV-Typs in Kombination mit dem offenbarten Test.
  • Swan (1997) offenbart einen HPV-Nachweistest, der die 5' bis 3' Exonucleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase ausnutzt, um das Signal von Fluoreszenzfarbstoffen zu erhöhen, indem sie von genotypspezifischen Sonden während der PCR freigesetzt werden. Lizardi (1997) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von HPV unter Verwendung von in-situ-Hybridisierung mit nicht radioaktiven Sonden und Sichtbarmachung mit einer herkömmlichen Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanningmikroskopie. Zehbe [1] (1997) beschreibt eine modifizierte Version der in-situ-Hybridisierung zum Nachweis von HPV, die eine Signalverstärkung beinhaltet. Leiserowitz (1997) beschreibt die Verwendung von reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion, um HPV nachzuweisen. Zehbe [2] (1997) beschreibt einen nicht isotopischen, auf einem enzymgekoppelten Immunabsorbtionstest basierenden Sandwich-Capture-Hybridisierungstest zum HPV-Nachweis.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde RNA direkt durch Verfahren analysiert, die auf Hybridisierung in Lösung basieren. Die Zellen wurden zuerst lysiert, indem ein proteolytisches Enzym zu den in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte enthaltenen Zellen gegeben wurde. Nicht begrenzende Beispiele von Enzymen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Proteinase K oder Pronase ein. Die Zellen können auch einer Detergenzlyse oder osmotischen Lyse oder einer French Press unterzogen werden. Nach der Inkubation wurden jeder Vertiefung die biotinylierten DNA-Sonden zugegeben. Die RNA:DNA-Hybride wurden auf einer festen Phase eingefangen, indem sie auf mit Steptavidin beschichteten Mikrotiterplatten übertragen wurden. Jeder Vertiefung in der Hybridisierungsmikriotiterplatte wurden alkalische Phosphatase-konjugierte Antikörper gegen RNA:DNA-Hybride zugegeben, und die Signale wurden erzeugt, indem jeder Vertiefung ein chemilumineszentes Mittel wie CDP-Star® mit Emerald II (Tropix) zugegeben wurde. Das Signal wurde von der Mikrotiterplatte abgelesen. Die auf Lösung basierende DNA-Analyse wurde auf ähnliche Weise wie die RNA-Analyse durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Mikrotiterplatten mit anti-DNA:RNA-Hybridantikörpern beschichtet waren und die Sonden RNA-Sonden waren.
  • Andere Verfahren zum Nachweis und zur Bewertung von HPV-Infektionen, die in dem offenbarten Verfahren verwendet werden können, werden in den U.S.-Patenten Nr. 5,415,995, 4,777,239, 5,484,699, 4,983,728, 5,527,898, 5,364,758, 5,639,871, 5,501,947, 5,665,533, 4,748,109, 5,623,932, 5,665,571 und 5,648,459 beschrieben. Diese sind nur Beispiele von HPV-Nachweis- und Typisierungstests, die in Verbindung mit dem offenbarten molekularen Test verwendet werden können. Viele dieser vorstehend beschriebenen Verfahren können auch für die Verwendung in dem offenbarten Test zum Nachweis der Expression der HPV-Gene angepasst werden.
  • Der offenbarte Test und andere Tests können auch sequenziell kombiniert werden. D.h., zuerst kann eine Testart durchgeführt werden, und dann können abhängig von den Ergebnissen weitere Tests durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein Test zum Nachweis von HPV (oder des HPV-Typs) zuerst durchgeführt werden und dann, falls HPV vorhanden ist, kann der offenbarte molekulare Test durchgeführt werden. Als weiteres Beispiel kann der offenbarte molekulare Test zuerst durchgeführt werden, und falls die Ergebnisse des Tests auf eine hochgradige CIN oder Krebs hinweisen, kann ein cytologischer Test oder eine Biopsie durchgeführt werden. Derartige sequenzielle Kombinationen sind insbesondere nützlich, um weitreichendere Tests auf die Patienten und Proben zu beschränken, die als mit hohem Risiko behaftet identifiziert werden.
  • Nützliche sequenzielle Reihenfolgen für die Tests sind (1) ein HPV-Test, gefolgt von einem Test für einen oder mehrere andere Marker, gefolgt von einem cytologischen oder histologischen Test; (2) ein cytologischer oder histologischer Test, gefolgt von einem HPV-Test oder einem Test für einen oder mehrere andere Marker (je nachdem, welcher nicht zuerst durchgeführt wurde); (3) ein cytologischer oder histologischer Test, gefolgt von einem kombinierten oder gleichzeitigen HPV- und Markertest; (4) ein kombinierter oder gleichzeitiger HPV- und Markertest, gefolgt von einem cytologischen oder histologischen Test; und (5) Nachweis von HPV, Nachweis des HPV-Typs, ein HPV-Test und ein cytologischer oder histologischer Test. Auf jede Testkombination folgt eine Bewertung des Zellzustandes, Krankheitszustandes, Patientenstatus, Patientenprognose oder andere Bewertungen unter Verwendung der kombinierten Testergebnisse, wie hier beschrieben.
  • Wo die Ergebnisse der ersten Tests entweder zweideutig sind oder ein gravierenderes Krankheitsstadium nahe legen, sind weitere Tests nützlich, um die Ausgangsergebnisse zu klären und zu bestätigen. Wo beispielsweise eine Zellprobe ein Mosaik mit einigen Zellen, die gutartig mit HPV infiziert sind, und mit anderen, die eine hochgradige Neoplasie oder Krebs zeigen, bildet, kann ein Test, der die Expression der HPV-Gene misst, zweideutige Ergebnisse liefern. Indem anschließend ein morphologischer Test durchgeführt wird, kann das Vorliegen von hochgradig neoplastischen oder Krebszellen etabliert werden. In diesem Fall besteht der Nutzen des offenbarten Verfahrens darin, dass nur einige der getesteten Zellproben (diejenigen mit entweder zweideutigen oder gravierenden Ergebnissen) weiter getestet werden müssen.
  • Das offenbarte Verfahren kann auch mit Behandlungsregimen kombiniert werden. Beispielsweise legen die Ergebnisse, die in dem offenbarten Test oder dem Verfahren auf hochgradige CIN oder Krebs hinweisen, nahe, dass die antivirale Therapie ineffektiv ist, da diese Krankheitsstadien häufig mit einer HPV-Integration in das Genom einhergehen. Andererseits legen Test- oder Verfahrensergebnisse, die auf normale oder niedriggradige Krankheitsstadien hinweisen, antivirale Behandlungen nahe, da HPV im Allgemeinen bei diesen Stadien nicht integriert wird. Antivirale Behandlungen schließen beispielsweise Medikamente oder therapeutische Impfstoffe ein. Wo die Ergebnisse des offenbarten Verfahrens auf einen gutartigen Zellzustand hinweisen, kann die Behandlung insgesamt vermieden werden. Die Fähigkeit, derartige Bewertungen zuverlässig und genau vorzunehmen, ist ein bedeutender Nutzen des offenbarten Tests.
  • Das offenbarte Verfahren kann die Kombination eines molekularen Tests, wie vorstehend beschrieben, mit irgendeinem anderen Test zur Bewertung einer Krankheit oder des Zustandes der Zellen in einer Zellprobe einschließen. Beispielsweise kann ein molekularer Test, der den Expressionsspiegel oder das Expressionsverhältnis der HPV-Gene misst, mit cytologischen Tests, histologischen Tests, der Bestimmung des vorliegenden HPV-Typs, der Bestimmung des Spiegels des vorliegenden HPV, Tests, die andere zelluläre Marker wie Onkoproteine oder Tumorsuppressoren nachweisen, oder Kombinationen dieser Tests kombiniert werden. Derartige Tests sind bekannt und werden zur Diagnose der HPV-Infektion oder auf HPV basierenden Krankheit und zur Bewertung des Krankheitsstadiums verwendet. Ergebnisse aus einem molekularen Test und einem oder mehreren zusätzlichen Tests können kombiniert werden, um die Zuverlässigkeit von jeglicher Beurteilung, Prognose, Diagnose oder Überwachung der auf HPV basierenden Krankheit zu erhöhen. Diese Möglichkeit der Kombination ist ein besonders nützlicher Aspekt des offenbarten Verfahrens, da die vorstehend beschriebenen molekularen HPV-Tests Informationen über die auf HPV basierende Krankheit liefern, die sich von anderen Tests unterscheiden. Wo multiple Tests in dieselbe prognostische oder diagnostische Richtung zeigen, wird die Zuverlässigkeit der Bewertung erhöht. Nützliche Kombinationen schließen einen cytologischen Test und den offenbarten molekularen Test, einen Test zur Bestimmung des HPV-Typs und den offenbarten molekularen Test, sowie eine Kombination eines cytologischen Tests, eines Typisierungstests, eines Tests zum Nachweis von Krebsmarkern und des offenbarten molekularen Tests ein. Kombinierte Tests können in irgendeiner Reihenfolge und in irgendeiner zeitlichen Beziehung durchgeführt werden. Verschiedene Tests können beispielsweise parallel oder gleichzeitig erfolgen. Derartige Tests können auf jegliche Art und Weise wie auf demselben Gerät von derselben Person, mit einem unterschiedlichen Gerät oder in denselben oder unterschiedlichen Orten durchgeführt werden.
  • Cytologische Tests zur Verwendung bei der Bewertung des Stadiums der auf HPV basierenden Krankheit sind bekannt und können in dem offenbarten Verfahren verwendet werden. Der gut etablierte Pap-Abstrich und die Hämatoxylin- & Eosin-Färbungen (H & E) sind bevorzugte Beispiele. Die Verwendung und Analyse von Pap-Abstrichen und Hämatoxylin- & Eosin-Färbungen (H & E) sind gut im Fachgebiet bekannt.
  • Eine Zellprobe, wie der Begriff hier verwendet wird, ist hauptsächlich eine Sammlung von Zellen aus einem Patienten. Ein Verfahren, um Zellen zu erhalten, ist mittels nicht invasiver Mittel, was hier definiert wird als erhalten, ohne einen Patienten zu punktieren. Beispiele nicht invasiver Mittel sind beispielsweise Zellproben, die aus Urin oder Nasen-, Epithel-, Zervix- oder anderen Zelloberflächenabstrichen erhalten wurden. Patientenzellen können auch durch andere Mittel erhalten werden, einschließlich beispielsweise Biopsie mittels Nadel oder Gewebebiopsie.
  • Die Zellprobe kann in einem Sammelmedium aufbewahrt werden, das eine Kombination von zwei oder mehr Tests mit verschiedenen Merkmalen in Bezug auf einen Zellzustand von Interesse zulässt. Wie hier verwendet, bezieht sich der Test oder beziehen sich die Tests auf den Nachweis oder die Messung spezifischer Merkmale, deren Ergebnisse mit anderen derartigen Messungen von anderen Merkmalen zu einer Gesamtbewertung einer Zelle, von der man vermutet, dass sie mit einer oder mehreren Krankheiten infiziert wurde, kombiniert werden können. Die Tests können beispielsweise eine Kombination einer morphologischen Analyse und Quantifizierung einer bestimmten RNA oder DNA oder eines bestimmten Proteins einschließen, deren/dessen Spiegel eine spezifische Indikation für das Vorliegen oder die Progression einer Krankheit liefern. Alternativ kann beispielsweise das Sammelmedium verwendet werden, um einen Test zu kombinieren, mit dem die Morphologie der Zellen in einer Zellprobe mit einem oder mehreren Tests identifiziert wird, mit denen der beteiligte HPV-Typ identifiziert wird, und mit denen beispielsweise identifiziert wird, ob der identifizierte HPV-Typ ein Hochrisiko- oder Niedrigrisiko-HPV-Typ für die Entwicklung von HPV-iduzierter Zelltransformation und Krebs ist.
  • Beispielsweise schließen die Quellen der Zellproben zur Bewertung der auf HPV basierenden Krankheit Zervix, Vagina, Vulva, Anus, Penis, Kehlkopf, Mundhöhle, Lymphknoten, maligne Ablagerungen in irgendeinem Teil des menschlichen Körpers und die Epidermis ein, die alle als Orte der HPV-Infektion und Pathologie bekannt sind.
  • Zellproben zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können gesammelt werden und in flüssigem Medium aufbewahrt werden. Beispiele nützlicher Zellsammelmedien sind STM (Digene), PreservCyt® (Cytyc) und CytoRichTM (Autocyte). Diese Medien (PreservCyt® und CytoRichTM) wurden für die Sammlung cytologischer Proben entwickelt, können jedoch zur Verwendung bei molekularen Tests angepasst werden.
  • Zellproben zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung können auf jede Weise fixiert oder verarbeitet werden, die mit den durchzuführenden Tests im Einklang steht. Beispielsweise können sowohl cytologische als auch molekulare Tests unter Verwendung von Zellen durchgeführt werden, die auf einem festen Substrat wie beispielsweise einem Deckglas fixiert sind. Die Anforderungen für diese durchzuführenden Tests bestimmen im Allgemeinen die zu verwendende Aufbereitung der Probe.
  • Die vorliegende Erfindung kann bequem unter Verwendung von Kits durchgeführt werden, die ein oder mehrere der für dieses Verfahren benötigten Materialien wie Reagenzien und Materialien zur Sammlung und Verarbeitung der Proben einschließen. Kits können beispielsweise Zellsammelmedium, Reagenzien zur Probenkonservierung, Reagenzien für den spezifischen Nachweis von DNA und/oder Expressionsprodukten (RNA oder Proteine) von einem oder mehreren der E2-, E4-, E5-, E6-, E7-, L1- oder L2-Gene und Behälter zur Probenverarbeitung einschließen. Nützliche Reagenzien zum Expressionsnachweis der HPV-Gene sind Nucleinsäuresonden für jene Gene. Ein Kit kann auch Kontrollproben oder -reagenzien oder Reagenzien und Materialien zur Durchführung von anderen Tests enthalten, die mit dem offenbarten Test kombiniert werden. Zusätzlich können die Kits Reagenzien zur Trennung von RNA und/oder DNA von anderen Zellkomponenten enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung kann unter Verwendung von Geräten durchgeführt werden, die an das Verfahren angepasst sind. Zahlreiche Geräte zur Durchführung ähnlicher Tests sind bekannt und in Gebrauch und können zur Verwendung mit den offenbarten Tests und Verfahren angepasst werden. Beispielsweise sind Geräte zur Automatisierung aller oder eines Teils der Probentests und Probenverarbeitung in Tests bekannt.
  • Das ganze oder ein Teil des offenbarten Verfahrens kann unter Verwendung von Spezialcomputerprogrammen kontrolliert oder gehandhabt werden. Die Daten, die von dem offenbarten Verfahren gesammelt werden und Daten von jedem anderen, in Kombination verwendeten Verfahren können in verschiedenen Formen für verschiedene Zwecke unter Verwendung von Spezialcomputerprogrammen zusammengestellt, analysiert und ausgegeben werden. Derartige Programme können mit anderen Patienten- oder Datenmanagement-Computerprogrammen verwendet oder kombiniert werden. Die Nützlichkeit eines derartigen Programms erhöht sich mit der Anzahl der zu kombinierenden Messungen oder Bewertungen und der relativen Bedeutung jeder Art der Messung zur Gesamtbewertung. Computerprogramme zur Verwendung mit dem offenbarten Verfahren können auf Mehrzweckcomputern verwendet werden oder können in Spezialcomputern oder in computerisierte Geräte zur Kontrolle des offenbarten Verfahrens, zur Verarbeitung und Analyse der Daten aus dem offenbarten Verfahren oder beides integriert werden.
  • BEISPIELE
  • Die Beispiele hier sollen die verschiedenen Aspekte der Durchführung der Erfindung beispielhaft zeigen und sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • Beispiel 1: Allgemeine Verfahren zur Nucleinsäureanalyse.
  • Der Test für Nucleinsäuren folgt im Allgemeinen dem Verfahren zum Nachweis von HIV-RNA durch den in WO 93/10263 von Digene beschriebenen Digene-Hybrid-Capture-HIV-Test. Kurz gesagt, nach der Lyse wurden jeder Vertiefung 50 μl Sondengemisch (enthaltend biotinylierte DNA-Sonde) zugegeben. Die Platte wurde versiegelt und 2 Stunden bei 65 °C inkubiert, so dass eine Hybridisierung erfolgte. Nach der Hybridisierung wurden die Proben auf eine mit Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatter übertragen und jeder Vertiefung wurden 25 μl anti-Hybridantikörper zugegeben. Die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur bei 1100 UpM geschüttelt. Die Vertiefungen wurden 6 x mit 65°C warmen Waschpuffer gewaschen, worauf ein Waschschritt unter Verwendung von destilliertem Wasser folgte. Jeder Vertiefung wurden 100 μl Chemilumineszenzsubstrat zugeben und die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann im DML 2000-Luminometer gelesen. Die Daten wurden dann als Signal-zu-Rauschen-Verhältnis ausgedrückt. Unter Verwendung einer Kalibrierungskurve wurde das von jeder Probe erzeugte Chemilumineszenzsignal in mRNA-Kopien pro Zelle umgewandelt. Der vorstehend beschriebene Test kann entweder mit ganzen lysierten Zellen oder mit von den Zellkomponenten abgetrennter Nucleinsäure durchgeführt werden.
  • Beispiel 2: Quantifizierung von HPV
  • Dieses Beispiel veranschaulicht die Messung der HPV E6/E7-Expression zur Verwendung in dem offenbarten Verfahren. Ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von HPV-mRNA, einschließlich E6/E7 und mRNA, wurde entwickelt. Dieses Beispiel misst die Expression in CaSki-Zellen, aber das Verfahren ist allgemein auf andere Zelllinien und klinische Proben anwendbar. Die CaSki-Zellen enthalten ein integriertes Hochrisiko-HPV-16-Genom (etwa 600 Kopien/Zelle). Die CaSki-Zellen wurden in RMPI 1640-Medium, enthaltend 10% FBS und 10 mM Natriumpyruvat, in Subkonfluenz aufrechterhalten. Für dieses Beispiel wurden die CaSki-Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet und aus den Schalen durch Behandlung mit 0,1% Trypsin-0,5 mM EDTA entfernt. Unter Verwendung von Trypanblau wurden die lebenden Zellen unter dem Mikroskop gezählt. Die Zellen wurden in 10 μl Volumina bis zu Endkonzentrationen von 10, 102, 103, 104 und 105 Zellen/Vertiefung in einer Gewebekultur behandelten Polystyrol-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen angesetzt. Jede Verdünnung wurde dreifach durchgeführt und angesetzt.
  • Die Zellen wurden mit Proteinase K (30 Einheiten) in Tris-EDTA-gepuffertem SDS lysiert. Die Lösungen der Platte (20 mM Tris pH 7,4, 20 mM EDTA) und 0,5' wurde versiegelt, 30 Sekunden bei 1100 UpM geschüttelt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Der Test für die HPV-mRNA folgt im Allgemeinen dem Verfahren zum Nachweis von HIV-RNA durch den in WO 93/10263 von Digene beschriebenen Digene-Hybrid-Capture-HIV-Test. Kurz gesagt, nach der Lyse wurden jeder Vertiefung 50 μl Sondengemisch (enthaltend E6/E7 biotinylierte DNA-Sonde) zugegeben. Die Platte wurde versiegelt und 1,5 Stunden bei 65°C inkubiert, so dass eine Hybridisierung erfolgte. Nach der Hybridisierung wurden die Proben auf eine mit Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatter übertragen und jeder Vertiefung wurden 25 μl anti-Hybridantikörper zugegeben. Die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur bei 1100 UpM geschüttelt. Die Vertiefungen wurden 6 x mit 65°C warmen Waschpuffer gewaschen, worauf ein Waschschritt unter Verwendung von destilliertem Wasser folgte. Jeder Vertiefung wurden 100 μl Chemilumineszenzsubstrat zugeben, und die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann im DML 2000-Luminometer gelesen. Die Daten wurden dann als Signal-zu-Rauschen-Verhältnis ausgedrückt. Unter Verwendung einer Kalibrierungskurve wurde das von jeder Probe erzeugte Chemilumineszenzsignal in mRNA-Kopien pro Zelle umgewandelt. Die Daten für den direkten Nachweis von HPV-mRNA aus CaSki-Zellen sind in 1 dargestellt. Dieses Verfahren ist ein Beispiel für den Nachweis und die Quantifizierung von E6/E7-mRNA, aber wurde auch angewandt, um andere mRNA-Moleküle (beispielsweise HPV L1-mRNA) aus CaSki-Zellen zu quantifizieren (2).
  • Beispiel 3: Quantifizierung von HPV-mRNA unter Verwendung von Konservierungssammelmedium
  • Die CaSki-Zelllinie wurde mit Trypsin behandelt, indem sie 5 Minuten mit 0,25% Trypsin-EDTA bei 37°C inkubiert wurde. Die Zellen wurden aus der Suspension durch 3-minütige Zentrifugation in einer Sorvall RT 6000-Zentrifuge bei 800 UpM pelletiert. Das Zellpellet wurden in 500 μl 1x PBS resuspendiert und unter dem Mikroskop in Trypanblau-Lösung gezählt. Die Zellen wurden auf 50 und 500 Zellen/μl in 1x PBS verdünnt. 10 μl jeder Zellkonzentration, einschließlich dem Nullpunkt (10 μl 1x PBS), wurden mit 3 ml PreservCyt-Reagenz versetzt. 100 μl Probenkonversionspuffer wurden in jede Wanne gegeben, um die Sichtbarmachung des Zellpellets zu unterstützen. Alle Proben wurden gut gemischt und 15 Minuten in der Sorvall RT 6000-Zentrifuge bei 3800 UpM herunterzentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen, und die Röhrchen wurden getrocknet, indem sie 2 bis 5 Minuten umgekehrt auf Papierhandtüchern auf die Laborbank gestellt wurden. Alle Pellets wurden mit 50 μl Lysereagenz (50 Einheiten Proteinase K) resuspendiert und das Gemisch wurde auf die mit Streptavidin beschichtete Platte übertragen. Die Platte wurde mit Plattenversiegelungsfolie versehen und unter Schütteln, das alle 15 Minuten erfolgte, 30 Minuten bei 37° (Wärmeblock) inkubiert.
  • 50 μl jeder E6/E7-RNA-Kalibrierung wurden in die vorgesehenen Vertiefungen bei 0, 103, 104, 105, 106, 107 und 108 Molekülen/Vertiefung gegeben, um eine Kalibrierungskurve für die mRNA in der Probe zu erstellen. Jeder Vertiefung wurden 50 μl des Sondengemisches zugegeben. Die Platte wurde mit Plattenversiegelungsfolie versehen und 1 Minute auf dem Tischschüttler bei 1100 UpM geschüttelt. Die Proben wurden 1,5 Stunden bei 65° C (Hybridisierungsreaktion) im Wärmeblock inkubiert. Die Platte wurde auf den Tischschüttler übertragen und 1 Stunde unter Schütteln bei 1100 UpM bei Raumtemperatur (Einfangreaktion) inkubiert. Jeder Vertiefung wurden 25 μl Nachweisreagenz 1 zugegeben und die Platte wurde ohne Schütteln 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Der Inhalt der Platte wurde verworfen und die Platte wurde sechsmal mit Waschpuffer bei 65°C und einmal mit deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur kräftig gewaschen. Die Platte wurde auf Papierhandtüchern getrocknet und jeder Vertiefung wurden 100 μl Nachweisreagenz 2 zugegeben. Die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert. Am Ende der Inkubationszeit wurde die Platte im DML 2000-Luminometer gelesen und die Daten wurden dann als Signal-zu-Rauschen-Verhältnis ausgedrückt.
  • Beispiel 4: Vergleich der E6/E7-RNA- und L1-RNA- Expression in Zelllinien, die episomale und integrierte HPV 16-DNA enthalten
  • Getestete Zelllinien
  • Die folgenden Zelllinien wurden nach den vorstehend umrissenen Verfahren untersucht.
    HaCaT: eine immortalisierte menschliche Keratinocytenzellline (Boukamp (1988))
    SiHa: eine menschliche Krebszellline (Friedl (1970))
    W 12: eine nicht kanzerogene menschliche zervikale Keratinocytenzellline (Stanley, (1989))
  • HPV-Infektionsstatus
  • HaCaT-Zellen wurden mit HPV 16 mittels des Verfahrens von White et al. (White (1998)) infiziert, um eine episomale (nicht integrierte, nicht gespleißte Gesamtsequenz) HPV-Infektion zu produzieren. In jeder 40. Zelle lag etwa 1 HPV 16-Kopie vor. Diese Zellen werden als repräsentativ für die Infektion im frühen Stadium oder CIN I (zervikale intraepitheliale Neoplasie) betrachtet. W12-Zellen enthalten etwa 100 Kopien mit episomaler HPV 16-DNA und repräsentieren prämaligne, immortalisierte Zellen oder CIN II oder CIN III. SiHa-Zellen enthalten 1–2 Kopien von in das Genom integriertem HPV 16. Man ist der Ansicht, dass diese Zellen Krebs repräsentieren.
  • Verfahren
  • Die RNA-Analyse erfolgte nach Beispiel 1 oder dem folgenden Verfahren. Einzelsträngige, biotinylierte DNA-Sonden, die spezifische HPV16-Gensequenzen enthalten, wurden hergestellt. Für die HaCaT- und SiHa-Zelllinen wurden die Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet, die Zellen wurden geerntet und die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-Kits (Qiagen Inc., Santa Clarita, CA) gereinigt. Für W 12 wurden ganze Zellen für die Analyse verwendet. RNA-Kalibratoren, die das vollständige HPV-Genom enthalten, wurden hergestellt, indem (+) Sense-RNA aus einem Plasmid, das das vollständige HPV 16-Genom enthält, mit T7-RNA-Polymerase transkribiert wurde. Die RNA wurde dann zu 103, 104, 105, 106 und 107 Kopien pro 50 μl verdünnt. Aliquotenanteile mit zellulärer RNA wurden auf 50 μl verdünnt und dann wurden 50 μl Sondengemisch (enthaltend die biotinylierte, einzelsträngige DNA-Sonde) zugegeben und mit den RNA-Proben 2 Stunden bei 65°C hybridisiert. Die Hybridisierungsreaktionen wurden auf eine mit Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatte übertragen und jeder Vertiefung wurden 25 μl Nachweisreagenz 1 zugegeben. (Nachweisreagenz 1 enthält das alkalische Phosphatase – monoclonale anti-RNA:DNA-Antikörperkonjugat.) Während einer 1-stündigen Inkubation mit Schütteln wurden die RNA:DNA-Hybride auf der mit Streptavidin beschichteten Platte eingefangen, und man ließ sie gleichzeitig mit dem anti-Hybridantikörperkonjugat reagieren. Nach mehreren Waschschritten wurde den Vertiefungen ein Chemilumineszenzsubstrat (Tropix CDP-star mit Emerald) zugegeben, und die Leuchtkraft wurde nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur in einem Mikrotiterplattenluminometer gemessen.
  • Quantifizierung
  • Die Quantifizierung der HPV-mRNA wurde wie folgt durchgeführt. Die Ergebnisse aus den RNA-Kalibratoren wurden verwendet, um Standardkurven zu erstellen. Die Regressionsgleichung wurde aus dem Logarithmus der Kopien gegenüber dem Logarithmus des Signal-zu-Rauschen-Verhältnisses minus eins [(S/N)–1)] berechnet. Die Regressionsgleichung wurde dann verwendet, um die Anzahl der mRNA-Kopien in den RNA-Zellproben zu berechnen.
  • Ergebnisse der Verhältnisse
  • Die Verhältnisse von HPV 16 E6, E7, E2, E4, L1 und L2 wurden für jeden Zelltyp berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass in einem episomalen, frühen Infektionsstadium das Verhältnis von (E6 + E7)/L1 etwa 0,7 ist, in der prämalignen immortalisierten Zelllinie ist das Verhältnis etwa 4 und in der Krebszelllinie nähert sich das Verhältnis unendlich an.
  • Figure 00280001
    • *L1-Gentranskripte waren in SiHa-Zellen nicht nachweisbar. Daher sind die Verhältnisse der anderen Gentranskripte zum L1-Gentranskript unendlich groß.
  • Die hier zitierten Veröffentlichungen und das Material, für das sie zitiert werden, sind ausdrücklich durch Bezugnahme einbezogen.
  • Der Fachmann erkennt oder kann unter Verwendung von Routineversuchen sicherstellen, dass es viele Äquivalente zu den beschriebenen spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen gibt. Derartige Äquivalente sollen von den folgenden Patentansprüchen umfasst werden.
  • Literatur
    • Birkenmeyer & Mushahwar, J. Virol. Meth., 35:117–126(1991)
    • Boukamp, et al., J. Cell Biol. 106:761–771 (1988).
    • Chernoff et al. J. Clinical Microbiology 35(11):2740–2744 (1997)
    • Cope et al. J. Clin Microbiol. 35(9):2262–2265 (1997)
    • Cullen et al., J. Virol. 65(2):606-612 (1991)
    • Demeret et al., J. Virol. 68(1):7075–7082 (1994)
    • Dürst et al., J. Gen. Virol. 66:1515–1522 (1985)
    • Friedl et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 135(3):543-5 (1970)
    • Jean et al., J. Virol. 69(5):2989–2997 (1995)
    • Kongsamul et al., Biochem. Biophys. Res. Cammun. 127(1):71-9 (1985).
    • Landegren, Trends Genetics. 9(6):199–204 (1993)
    • Leiserowitz et al. Gynecol. Oncol. 66(2):295–299 (1997)
    • Lizard et al. Histochem J. 29(7):545–554 (1997)
    • Mant et al. J. Virol. Meth. 66(2):169–178 (1997)
    • Matsukura et al., Virology 172(1):63–72 (1989)
    • Meyers et al., Science 14; 257:971-3 (1992)
    • Nuovo, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications. 3. Ausgabe
    • Lippencott-Raven Publishers, Philadelphia 1997
    • Pattillo et al., Science 196(4297):1456-8 (1977).
    • Schneider-Gädicke et al. EMBO J. 5:2285–2292 (1986)
    • Schwarz, et al., Nature 314:111–114 (1985)
    • Stanley et al., Int. J. Cancer 15;43(4):672-6 (1989)
    • Stoflet et al. Science 239:491–494 (1988)
    • Swan et al. J. Clin. Microbiol. 35(4):886–891 (1997)
    • Turek. Adv Virus Res. 44:305–356 (1994)
    • Ushikai et al., J. Virol. 68(1):6655–6666 (1994)
    • White et al., J. Virol. 72(2):959–964 (1998).
    • Wilczynski et al., Virology 166:624-267 (1988)
    • Zehbe (1) et al. Am. J. Pathol. 150(5): 1553–1561 (1997)
    • Zehbe (2) et al. Mod. Pathol 10(3):188-91(1997)

Claims (8)

  1. Verfahren zum Nachweis HPV-induzierter Zelltransformation in einem Patienten, der mit HPV infiziert ist, das die Schritte umfasst: – Messen von mindestens zwei HPV-exprimierten mRNA-Spiegeln in einer Probe, die von dem Patienten gewonnen wurde, wobei die mRNAs eine erste RNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E6-mRNA und E7-mRNA, und eine zweite RNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E2-mRNA und L1-mRNA, umfassen; – Bestimmen des Expressionsspiegels von E6 und/oder E7 und des Expressionsspiegels von E2 und/oder L1, sodass ein Verhältnis von E6 und/oder E7 zu L1 und/oder E2 bestimmt wird, wobei ein Verhältnis größer als 2 eine HPV-induzierte Zelltransformation und das Risiko von Neoplasie anzeigt.
  2. Verfahren zur Voraussage des Ausbruchs von HPV-induziertem Krebs in einem Patienten, der mit HPV infiziert ist, das die Schritte umfasst: – Messen von HPV-mRNA einer Gruppe 1 und einer Gruppe 2 und/oder einer Gruppe 3 in einer Probe, die von dem Patienten gewonnen wurde, – Bestimmen des Verhältnisses des mRNA-Spiegels der Gruppe 1 zu dem mRNA-Spiegel der Gruppe 2 und/oder zu dem der Gruppe 3, wobei ein Verhältnis größer als 2 auf einen neoplastischen Ausbruch hinweist; wobei die Gruppe 1 Gene oder Gensets einschließlich E6, E7 und E6 + E7 beinhaltet; die Gruppe 2 Gene oder Gensets einschließlich L1, L2, E4 und jeder Kombination daraus beinhaltet und die Gruppe 3 Gene oder Gensets einschließlich E1, E2, E5 und jeder Kombination daraus beinhaltet.
  3. Verfahren zur Überwachung des Stadiums einer HPV-induzierten Krankheit in einem Patienten, der mit HPV infiziert ist, das die Schritte umfasst: – Messen der HPV-exprimierten mRNA-Spiegel in einer Probe, die von dem Patienten gewonnen wurde; – Bestimmen des Expressionsspiegels von E6 und/oder E7 und des Expressionsspiegels von E2 und/oder L1; und – Bestimmen des Verhältnisses des Expressionsspiegels von E6 und/oder E7 zu dem Expressionsspiegel von L1 und/oder E2, wobei ein Verhältnis von größer als 2 eine neoplastische Veränderung anzeigt.
  4. Verfahren zum Nachweis von HPV-induziertem Krebs in einem Patienten, der mit HPV infiziert ist, das die Schritte umfasst: – Messen von mindestens zwei HPV-exprimierten mRNA-Spiegeln in einer Probe, die von dem Patienten gewonnen wurde, wobei die mRNAs eine erste RNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E6-mRNA und E7-mRNA, und eine zweite RNA, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E2-mRNA und L1-mRNA, umfassen; – Bestimmen des Expressionsspiegels von E6 und/oder E7 und des Expressionsspiegels von E2 und/oder L1, sodass ein Verhältnis von E6 und/oder E7 zu L1 und/oder E2 bestimmt wird, wobei ein Verhältnis größer als 4 HPV-induzierten Krebs anzeigt.
  5. Verfahren zur Vorhersage des Risikos eines Ausbruchs von HPV-induziertem Krebs in einem Patienten, der mit HPV infiziert ist, das die Schritte umfasst: – Messen von HPV-mRNA einer Gruppe 1, einer Gruppe 2 und/oder einer Gruppe 3 in einer Probe, die von dem Patienten gewonnen wurde; – Bestimmen des Verhältnisses des mRNA-Spiegels der Gruppe 1 zu dem mRNA-Spiegel der Gruppe 2 und/oder zu dem der Gruppe 3, wobei ein Verhältnis größer als 4 auf den Ausbruch von HPV-induziertem Krebs hinweist; wobei die Gruppe 1 Gene oder Gensets einschließlich E6, E7 und E6 + E7 beinhaltet; die Gruppe 2 Gene oder Gensets einschließlich L1, L2, E4 und jeder Kombination daraus beinhaltet und die Gruppe 3 Gene oder Gensets einschließlich E1, E2, E5 und jeder Kombination daraus beinhaltet.
  6. Kit, umfassend mindestens zwei verschiedene Sonden, die fähig sind, HPV-Nucleinsäuren nachzuweisen, wobei eine erste Sonde fähig ist, DNA und/oder RNA oder Proteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: E2, E4, E6 und E7 spezifisch nachzuweisen, und eine zweite Sonde fähig ist, DNA und/oder RNA oder Proteine ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L1, L2, E1, E2, E4 und E5 spezifisch nachzuweisen.
  7. Kit nach Anspruch 6, wobei mindestens eine Sonde eine DNA-Sonde ist.
  8. Kit nach Anspruch 6, wobei die zweite Sonde aus der Gruppe bestehend aus: L1, L2, E1 und E5 ausgewählt ist.
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Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6969585B2 (en) * 1997-12-12 2005-11-29 Digene Corporation Universal collection medium
KR20020064298A (ko) 1999-10-13 2002-08-07 시쿼넘, 인코포레이티드 다형성 유전 마커를 동정하기 위한 데이타베이스 및 이의제조 방법
KR100382703B1 (ko) * 2000-03-15 2003-05-09 주식회사 바이오메드랩 인유두종바이러스의 유전형 진단키트 및 상기 진단키트의제조방법
AU2001249526A1 (en) * 2000-03-28 2001-10-08 Biosearch International Pty Ltd Approaches for hpv detection and staging by targeting the e6 gene region of the viral genome
US20040115692A1 (en) * 2000-04-03 2004-06-17 Cytyc Corporation Methods, compositions and apparatuses for detecting a target in a preservative solution
EP1294939B1 (de) * 2000-04-03 2010-01-27 Cytyc Corporation Nachweis und typisierung des papillomavirus mittels pna-sonden
IT1316070B1 (it) * 2000-05-05 2003-03-28 Bioanalisi Ct Sud Snc Di Perse Metodo e mezzi per l'identificazione di virus hpv
US7439016B1 (en) * 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
ATE466930T1 (de) 2000-06-21 2010-05-15 Qiagen Gaithersburg Inc Universelles sammelmedium
GB0018140D0 (en) * 2000-07-24 2000-09-13 Medical Res Council Screening for abnormalities
US20040229298A1 (en) * 2000-11-11 2004-11-18 Lu Peter S. Methods and compositions for treating cervical cancer
US20040121310A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in forensic studies
KR100437626B1 (ko) * 2001-06-21 2004-06-26 주식회사 마이진 인간 유두종바이러스 유전자형 검사 방법과 이를 위한검사 키트
DK1463839T3 (da) 2002-01-07 2007-07-02 Norchip As Fremgangsmåde til detektering af human papillomavirus mRNA
WO2004037175A2 (en) 2002-10-21 2004-05-06 Mgi Pharma Biologics, Inc. Compositions and methods for treating human papillomavirus-mediated disease
EP1464709B1 (de) * 2003-03-31 2007-12-26 Stichting Researchfonds Pathologie Nachweis von invasivem Krebs induziert von HPV und dessen Vorläufer Läsionen mit Invasionspotential
US20040203004A1 (en) * 2003-04-10 2004-10-14 Bernard Hans Ulrich Diagnostic apparatus and method
US7361460B2 (en) 2003-04-11 2008-04-22 Digene Corporation Approach to molecular diagnosis of human papillomavirus-related diseases
US20070065810A1 (en) * 2003-07-18 2007-03-22 Georgetown University Diagnosis and treatment of cervical cancer
EP1510820B1 (de) * 2003-08-25 2010-03-17 MTM Laboratories AG Verfahren zum Nachweis von medizinisch relevanten Zuständen in gelösten LBC-Proben
DE60300339T2 (de) * 2003-08-25 2006-04-13 Mtm Laboratories Ag Verfahren zum Nachweis von Karzinomen in solubilisierten zervikalen Körperproben
US7482142B1 (en) 2004-05-07 2009-01-27 Roche Molecular Systems, Inc. High-risk human papillomavirus detection
US7316904B1 (en) 2004-06-30 2008-01-08 Chromodynamics, Inc. Automated pap screening using optical detection of HPV with or without multispectral imaging
KR100572721B1 (ko) * 2004-07-26 2006-04-24 이미영 환원전리수를 포함하는 rna 보존액 및 그를 이용한rna 보존방법
US7354719B2 (en) 2004-12-08 2008-04-08 Gen-Probe Incorporated Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses
US20060189893A1 (en) * 2005-01-06 2006-08-24 Diamics, Inc. Systems and methods for detecting abnormal cells
US20060161076A1 (en) * 2005-01-06 2006-07-20 Diamics, Inc. Systems and methods for collection of cell clusters
GB0500996D0 (en) * 2005-01-18 2005-02-23 Delfts Diagnostic Labaratory B Detection method and materials therefor
US7524631B2 (en) * 2005-02-02 2009-04-28 Patterson Bruce K HPV E6, E7 mRNA assay and methods of use thereof
US20070111960A1 (en) * 2005-03-04 2007-05-17 Advandx, Inc. High affinity probes for analysis of human papillomavirus expression
DE102005015005A1 (de) * 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
US7972776B2 (en) * 2005-11-15 2011-07-05 Oncohealth Corporation Protein chips for HPV detection
US7732166B2 (en) * 2005-11-15 2010-06-08 Oncohealth Corporation Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer
CA2655458A1 (en) * 2006-06-19 2007-12-27 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for obtaining amplifiable nucleic acids from tissues, cells, or viruses exposed to transport media
CA2659632A1 (en) * 2006-08-01 2008-02-07 Applera Corporation Detection of analytes and nucleic acids
WO2010129821A1 (en) 2009-05-07 2010-11-11 Oncohealth Corporation Identification of high grade or ≥cin2 for early stages and late stages detection, screening, and diagnosis of human papillomavirus (hpv) and hpv-associated cancers
US8968995B2 (en) * 2008-11-12 2015-03-03 Oncohealth Corp. Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers
US20100003704A1 (en) * 2008-06-13 2010-01-07 Shuling Cheng IN SITU detection of early stages and late stages HPV infection
WO2008071998A2 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Oncomethylome Sciences Sa Diagnostic methods for diseases caused by a hpv infection comprising determining the methylation status of the hpv genome
JP5241100B2 (ja) * 2006-12-28 2013-07-17 シスメックス株式会社 抗原賦活化液、抗原賦活化方法及び細胞の検出方法
US20090311392A1 (en) * 2007-09-20 2009-12-17 Paul Bernard Newman Novel approach to the controlled decontamination and or detoxification of nuts, grains, fruits and vegetables
WO2009092017A1 (en) * 2008-01-16 2009-07-23 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Biomarkers for hpv-induced cancer
EP2262911B1 (de) * 2008-04-17 2016-10-12 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Zusammensetzungen, verfahren und kits mit synthetischen sonden zum nachweis der anwesenheit einer target-nukleinsäure
US9332973B2 (en) 2008-10-01 2016-05-10 Covidien Lp Needle biopsy device with exchangeable needle and integrated needle protection
US8968210B2 (en) 2008-10-01 2015-03-03 Covidien LLP Device for needle biopsy with integrated needle protection
US11298113B2 (en) 2008-10-01 2022-04-12 Covidien Lp Device for needle biopsy with integrated needle protection
US9186128B2 (en) 2008-10-01 2015-11-17 Covidien Lp Needle biopsy device
US9782565B2 (en) 2008-10-01 2017-10-10 Covidien Lp Endoscopic ultrasound-guided biliary access system
US8288520B2 (en) 2008-10-27 2012-10-16 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and system
EP2184368A1 (de) 2008-11-07 2010-05-12 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Diagnosetranskript- und Spleißmuster von HPV16 bei verschiedenen Halsverletzungen
GB0820822D0 (en) * 2008-11-13 2008-12-24 Inst Catala D Oncologia Novel product and processes
JPWO2010064628A1 (ja) * 2008-12-05 2012-05-10 オリンパス株式会社 核酸含有試料の調製方法、試料調製用溶液、及び核酸の解析方法
SG2014006167A (en) 2009-01-27 2014-03-28 Genetic Technologies Ltd Biological sampling device
WO2010088292A1 (en) * 2009-01-28 2010-08-05 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sequence-specific large volume sample preparation method and assay
JP5738278B2 (ja) 2009-05-01 2015-06-24 キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド 試料中のrnaスプライシング形態を検出するための非標的増幅法
US10190152B2 (en) 2009-09-03 2019-01-29 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for direct chemical lysis
AU2010291990B2 (en) 2009-09-14 2016-05-05 Qiagen Gaithersburg, Inc. Compositions and methods for recovery of nucleic acids or proteins from tissue samples fixed in cytology media
AU2011203450B2 (en) * 2010-01-04 2016-01-07 Qiagen Gaithersburg, Inc. Methods, compositions, and kits for recovery of nucleic acids or proteins from fixed tissue samples
WO2011084598A1 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Oncohealth Corporation High throughput cell-based hpv immunoassays for diagnosis and screening of hpv-associated cancers
CN102822353A (zh) 2010-01-29 2012-12-12 奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司 确定和确认样品中存在hpv的方法
US9689047B2 (en) * 2010-01-29 2017-06-27 Qiagen Gaithersburg Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
WO2011146629A2 (en) 2010-05-19 2011-11-24 Qiagen Gaithersburg Inc. Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids
WO2011149897A1 (en) 2010-05-25 2011-12-01 Qiagen Gaithersburg, Inc. Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes
EP2678442B1 (de) 2011-02-24 2019-01-16 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Materialien und verfahren für den nachweis von hpv-nukleinsäuren
US20140127745A1 (en) * 2011-06-24 2014-05-08 Biotechnology Developers, S.A. Method, compositions and device for preparing cytological specimens
US9777264B2 (en) 2011-11-03 2017-10-03 Qiagen Gaithersburg, Inc. Materials and method for immobilizing, isolating, and concentrating cells using carboxylated surfaces
JP5960421B2 (ja) * 2011-12-05 2016-08-02 株式会社日立ハイテクノロジーズ 細胞の測定方法及び細胞の測定用試薬
DE112013002256T5 (de) 2012-04-28 2015-03-12 CYTOCORE, Inc Verfahren, Verpackung und Vorrichtung zum Entnehmen von biologischen Proben
US8734364B1 (en) 2013-11-07 2014-05-27 Genetic Technologies Limited Device and method for obtaining a biological sample
WO2016005789A1 (en) * 2014-07-07 2016-01-14 Institut Pasteur Broad range gene and genotype papillomavirus transcriptome as a biomarker of papillomavirus- associated cancer stages
AU2016287037B2 (en) 2015-06-30 2017-09-07 Sysmex Corporation Cell preservative solution, use of same, and method for producing cell preservative solution
MA46354A (fr) 2016-10-03 2019-08-07 Juno Therapeutics Inc Molécules se liant spécifiquement au vph
MX2020003536A (es) 2017-10-03 2020-09-14 Juno Therapeutics Inc Moleculas de union especifica a virus de papiloma humano (hpv).
US11471489B2 (en) 2018-04-05 2022-10-18 Juno Therapeutics, Inc. T cell receptors and engineered cells expressing same
PL240016B1 (pl) * 2019-09-09 2022-02-07 Genomtec Spolka Akcyjna Zestaw starterów do wykrywania wirusa brodawczaka ludzkiego typ 16 (HPV16 Human papillomavirus type 16), sposób wykrywania infekcji HPV16, zastosowanie zestawu starterów do wykrywania infekcji HPV16
EP4100051A2 (de) * 2020-02-07 2022-12-14 ISA Pharmaceuticals B.V. Behandlung von hpv-assoziierten erkrankungen
WO2023081900A1 (en) 2021-11-08 2023-05-11 Juno Therapeutics, Inc. Engineered t cells expressing a recombinant t cell receptor (tcr) and related systems and methods

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4732847A (en) 1981-06-09 1988-03-22 University Of Hawaii Monoclonal antibodies for DNA-RNA hybrid complexes and their uses
FI63596C (fi) 1981-10-16 1983-07-11 Orion Yhtymae Oy Mikrobdiagnostiskt foerfarande som grundar sig pao skiktshybridisering av nukleinsyror och vid foerfarandet anvaenda kombinationer av reagenser
US4578282A (en) * 1982-02-04 1986-03-25 Harrison James S Composition for diagnostic reagents
US4465078A (en) 1982-09-30 1984-08-14 Medtest Corporation Method for cell sampling in a body cavity
US4865980A (en) 1982-12-29 1989-09-12 University Of Hawaii Monoclonal antibodies for DNA-RNA hybrid complexes and their uses
WO1984002721A1 (en) 1983-01-10 1984-07-19 Gen Probe Inc Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses
US5288611A (en) 1983-01-10 1994-02-22 Gen-Probe Incorporated Method for detecting, identifying, and quantitating organisms and viruses
US5200313A (en) 1983-08-05 1993-04-06 Miles Inc. Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies
US4743535A (en) 1984-11-07 1988-05-10 Miles Inc. Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid
EP0144914A3 (de) 1983-12-12 1986-08-13 Miles Inc. Hybridisierungstest mittels markierter Paare von hybridbindenden Reagenzien
AU3844485A (en) 1984-02-09 1985-08-15 Enzo Biochem Inc. Heterologous detection of cabeled dna
FI71768C (fi) 1984-02-17 1987-02-09 Orion Yhtymae Oy Foerbaettrade nykleinsyrareagenser och foerfarande foer deras framstaellning.
CA1260372A (en) * 1984-04-27 1989-09-26 Elazar Rabbani Hybridization method for the detection of genetic materials
US6221581B1 (en) 1984-04-27 2001-04-24 Enzo Diagnostics, Inc. Processes for detecting polynucleotides, determining genetic mutations or defects in genetic material, separating or isolating nucleic acid of interest from samples, and useful compositions of matter and multihybrid complex compositions
ZA853756B (en) 1984-06-01 1986-01-29 Miles Lab Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes
CA1253777A (en) 1984-06-01 1989-05-09 Robert J. Carrico Nucleic acid hybridization assay employing immobilized rna probes
US4563417A (en) 1984-08-31 1986-01-07 Miles Laboratories, Inc. Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes
US4775619A (en) 1984-10-16 1988-10-04 Chiron Corporation Polynucleotide determination with selectable cleavage sites
US4751177A (en) 1985-06-13 1988-06-14 Amgen Methods and kits for performing nucleic acid hybridization assays
US5641630A (en) 1985-06-13 1997-06-24 Amgen Inc. Method and kit for performing nucleic acid hybridization assays
US4888278A (en) * 1985-10-22 1989-12-19 University Of Massachusetts Medical Center In-situ hybridization to detect nucleic acid sequences in morphologically intact cells
US4868105A (en) 1985-12-11 1989-09-19 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assay
US5750338A (en) 1986-10-23 1998-05-12 Amoco Corporation Target and background capture methods with amplification for affinity assays
IL85551A0 (en) 1987-04-01 1988-08-31 Miles Inc Rapid hybridization assay and reagent system used therein
GB8717169D0 (en) * 1987-07-21 1987-08-26 Ti Interlock Ltd Pneumatic control system
US5656731A (en) 1987-10-15 1997-08-12 Chiron Corporation Nucleic acid-amplified immunoassay probes
US5359100A (en) 1987-10-15 1994-10-25 Chiron Corporation Bifunctional blocked phosphoramidites useful in making nucleic acid mutimers
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
US6326136B1 (en) 1988-04-01 2001-12-04 Digene Corporation Macromolecular conjugate made using unsaturated aldehydes
US5374524A (en) 1988-05-10 1994-12-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Solution sandwich hybridization, capture and detection of amplified nucleic acids
US5639871A (en) * 1988-09-09 1997-06-17 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction
JP3046837B2 (ja) 1989-03-10 2000-05-29 バイシス・インコーポレーテツド 固定化されたオリゴヌクレオチドのプローブおよびそれらの使用
US5106727A (en) 1989-04-27 1992-04-21 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequences as primers
EP0405913B1 (de) 1989-06-30 1998-12-23 Chiron Corporation Hydrophobe Nukleinsäure-Sonde
US5116734A (en) 1989-09-01 1992-05-26 Digene Diagnostics, Inc. Highly sensitive method for detecting peroxidase
US5580970A (en) * 1989-12-01 1996-12-03 Amoco Corporation Detection of HPV transcripts
JPH05501650A (ja) * 1989-12-01 1993-04-02 バイシス・インコーポレーテツド Hpv転写物の検出
US5629153A (en) 1990-01-10 1997-05-13 Chiron Corporation Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays
US5792606A (en) 1990-02-26 1998-08-11 Boehringer Mannheim Gmbh Nucleic acid hybridization based assay for determining a substance of interest
CA2039517C (en) 1990-04-03 2006-11-07 David Segev Dna probe signal amplification
US5695926A (en) 1990-06-11 1997-12-09 Bio Merieux Sandwich hybridization assays using very short capture probes noncovalently bound to a hydrophobic support
US5484699A (en) 1990-09-28 1996-01-16 Abbott Laboratories Nucleotide sequences useful as type specific probes, PCR primers and LCR probes for the amplification and detection of human papilloma virus, and related kits and methods
EP0557456A4 (en) 1990-11-14 1995-11-15 Siska Diagnostics Inc Non-isotopic detection of nucleic acids using a polystyrene support-based sandwich hybridization assay and compositions useful therefor
US5256571A (en) * 1991-05-01 1993-10-26 Cytyc Corporation Cell preservative solution
US5543294A (en) * 1991-07-19 1996-08-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism method for the detection and typing of myobacteria
US5556748A (en) 1991-07-30 1996-09-17 Xenopore Corporation Methods of sandwich hybridization for the quantitative analysis of oligonucleotides
US5981179A (en) 1991-11-14 1999-11-09 Digene Diagnostics, Inc. Continuous amplification reaction
AU673813B2 (en) 1991-11-14 1996-11-28 Qiagen Gaithersburg, Inc. Non-radioactive hybridization assay and kit
JPH07502653A (ja) 1991-12-23 1995-03-23 カイロン コーポレイション 溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイに用いるためのhbv増幅プローブ
US5747244A (en) 1991-12-23 1998-05-05 Chiron Corporation Nucleic acid probes immobilized on polystyrene surfaces
US5424413A (en) 1992-01-22 1995-06-13 Gen-Probe Incorporated Branched nucleic acid probes
IL106273A0 (en) * 1992-07-17 1993-11-15 Res Dev Foundation Rapid detection of biopolymers in stained specimens
WO1994010335A2 (en) 1992-10-09 1994-05-11 Amoco Corporation Assay methods
AU6031094A (en) 1993-01-15 1994-08-15 Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc., The Sensitive nucleic acid sandwich hybridization assays and kits
US5357977A (en) 1993-04-23 1994-10-25 St. Mary's Hospital And Medical Center, Inc. Cytological sampling method and device
WO1994028156A1 (en) 1993-05-20 1994-12-08 Dana-Farber Cancer Institute Compositions and methods for treatment of herpesvirus infections
CA2167838C (en) 1993-07-23 1999-11-23 Thomas B. Ryder Methods for enhancing nucleic acid amplification
DE4331012A1 (de) 1993-09-13 1995-03-16 Bayer Ag Nukleinsäuren-bindende Oligomere mit N-Verzweigung für Therapie und Diagnostik
US5370128A (en) * 1993-12-02 1994-12-06 Wainwright; Sharon R. Pap brush and pap unit container systems
US5681697A (en) 1993-12-08 1997-10-28 Chiron Corporation Solution phase nucleic acid sandwich assays having reduced background noise and kits therefor
CA2186465A1 (en) 1994-04-04 1995-10-12 Richard A. Martinelli Hybridization-ligation assays for the detection of specific nucleic acid sequences
CA2126952C (en) 1994-06-28 2010-12-14 Sithian Pandian Probe, kit, and method of amplification for increasing the sensitivity of nucleic acid hybridization assays
US5681702A (en) 1994-08-30 1997-10-28 Chiron Corporation Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes
JP3093116B2 (ja) 1994-09-30 2000-10-03 株式会社豊田中央研究所 核酸検出方法
US6057099A (en) 1994-12-02 2000-05-02 Intelligene Ltd. Detection of nucleic acid sequences
US5747248A (en) 1994-12-05 1998-05-05 Chiron Corporation Discontinuous probe design using hybritope mapping
DE4445769C1 (de) * 1994-12-21 1995-11-09 Biochrom Kg Protektionsmedium zum Aufbewahren vitaler Gewebe, insbesondere von Zähnen
CA2139070C (en) 1994-12-23 2010-03-30 Burton W. Blais Method for enhancing detection ability of nucleic acid assays employing polymerase chain reaction
US5731153A (en) 1996-08-26 1998-03-24 The Regents Of The University Of California Identification of random nucleic acid sequence aberrations using dual capture probes which hybridize to different chromosome regions
US5888724A (en) 1995-02-17 1999-03-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Detection of high oncogenic-risk papilloma virus in high grade cervical lesions and cancers by a PCR/ELISA assay
US6083925A (en) 1995-06-07 2000-07-04 Connaught Laboratories Limited Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines
AU726047B2 (en) 1995-11-15 2000-10-26 Gen-Probe Incorporated Nucleic acid probes complementary to human papillomavirus nucleic acid and related methods and kits
US5853993A (en) 1996-10-21 1998-12-29 Hewlett-Packard Company Signal enhancement method and kit
US5679333A (en) * 1996-10-25 1997-10-21 Dunphy; Brian William Formaldehyde-free tissue preservative compositions
US6110676A (en) 1996-12-04 2000-08-29 Boston Probes, Inc. Methods for suppressing the binding of detectable probes to non-target sequences in hybridization assays
US20020034737A1 (en) 1997-03-04 2002-03-21 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6043038A (en) 1998-03-31 2000-03-28 Tularik, Inc. High-throughput screening assays for modulators of primase activity
JP2002505071A (ja) 1997-11-04 2002-02-19 ロシュ ダイアグノスティックス ゲーエムベーハー 特異的かつ高感度な核酸検出方法
US6969585B2 (en) * 1997-12-12 2005-11-29 Digene Corporation Universal collection medium
US20030096232A1 (en) 1997-12-19 2003-05-22 Kris Richard M. High throughput assay system
US7399589B2 (en) 1998-02-06 2008-07-15 Digene Corporation Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays
US6686151B1 (en) 1998-02-06 2004-02-03 Digene Corporation Immunological detection of RNA:DNA hybrids on microarrays
US5994079A (en) 1998-02-06 1999-11-30 Digene Corporation Direct detection of RNA mediated by reverse transcriptase lacking RNAse H function
US20010055766A1 (en) 1999-04-02 2001-12-27 Alexander Aristarkhov Immunosorbant assay using branched bis-biotin/avidin/multiple label complex as a detection reagent
US7019822B1 (en) 1999-04-29 2006-03-28 Mss, Inc. Multi-grade object sorting system and method
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US6893819B1 (en) 2000-11-21 2005-05-17 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US6436662B1 (en) 2000-04-04 2002-08-20 Digene Corporation Device and method for cytology slide preparation
US6521190B1 (en) 2000-05-19 2003-02-18 Digene Corporation Cell collection apparatus
AU2001274869A1 (en) 2000-05-20 2001-12-03 The Regents Of The University Of Michigan Method of producing a dna library using positional amplification
US7601497B2 (en) 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
ATE466930T1 (de) 2000-06-21 2010-05-15 Qiagen Gaithersburg Inc Universelles sammelmedium
US6977148B2 (en) 2001-10-15 2005-12-20 Qiagen Gmbh Multiple displacement amplification
CN101151379A (zh) 2005-01-14 2008-03-26 密执安州立大学董事会 检测生物样品中的人乳头瘤病毒的系统、方法和组合物
US7972776B2 (en) 2005-11-15 2011-07-05 Oncohealth Corporation Protein chips for HPV detection
DK2114990T5 (da) 2007-02-27 2012-05-07 Nuclea Biomarkers Llc Fremgangsmåde til forudsigelse af NSCLC-patienters respons på behandling med en EGFR-TK-inhibitor
US7985375B2 (en) 2007-04-06 2011-07-26 Qiagen Gaithersburg, Inc. Sample preparation system and method for processing clinical specimens
EP2262911B1 (de) 2008-04-17 2016-10-12 QIAGEN Gaithersburg, Inc. Zusammensetzungen, verfahren und kits mit synthetischen sonden zum nachweis der anwesenheit einer target-nukleinsäure
US9090948B2 (en) 2008-09-30 2015-07-28 Abbott Molecular Inc. Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples

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Publication number Publication date
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WO1999029890A3 (en) 1999-09-10

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