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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der cytologischen
und molekularen Tests und insbesondere das Gebiet der Tests zur
Bewertung einer Krankheit unter Verwendung eines sensitiven Tests
zur Diagnose und Prognose von HPV-induziertem Karzinom.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Der
Nachweis und die Diagnose der Krankheit sind von offenkundiger Bedeutung
für die
Behandlung der Krankheit. Zahlreiche Merkmale von Krankheiten wurden
identifiziert, und viele werden zur Diagnose der Krankheit verwendet.
Vielen Krankheiten gehen Veränderungen
des Zustandes der betroffenen Zellen voraus, und sie sind dadurch
charakterisiert. Die Veränderungen
können
die Expression viraler Gene in den infizierten Zellen, Veränderungen
der Expressionsmuster der Gene in den betroffenen Zellen und Veränderungen
der Zellmorphologie einschließen.
Der Nachweis, die Diagnose und die Überwachung der Krankheiten
können durch
die Bewertung derartiger Zellzustände unterstützt werden.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft das humane Papillomvirus
(HPV), das gutartige Epithelproliferationen der Haut und Schleimhaut
beim Menschen induziert und mit anogenitaler Neoplasie und Karzinomen
assoziiert ist. Die intakte DNA von HPV ist superspiralisiert und ähnelt einer
unendlichen Schleife einer verdrillten Telefonschnur. In dieser
Hülle ist
die Virus-DNA in und um Proteine aus dem Zellkern, Histone und assoziierte
Peptide in einer Struktur verpackt, die dem zellulären Chromatin ähnelt. (Turek,
(1994)). Bisher charakterisierte humane Papillomviren sind mit Läsionen assoziiert,
die auf die Epithelschichten der Haut oder der Mund-, Pharynx-,
Atemwegs- und am wichtigsten der anogenitalen Schleimhaut begrenzt
sind. Spezifische humane Papillomvirustypen, einschließlich HPV
6 und 11, verursachen häufig
gutartige Schleimhautläsionen, während man
andere Typen, HPV 16, 18 und die meisten anderen Stämme, hauptsächlich in
hochgradigen Läsionen
und Krebs findet. Allen humanen und tierischen Papillomviren scheint
eine ähnliche
genetische Organisation gemeinsam zu sein, obwohl es Unterschiede
bei den Funktionen der einzelnen viralen Gene und bei ihrer Regulation
gibt. Der häufigste
genitale, mit Zervixkarzinom assoziierte HPV-Typ, HPV 16, wurde
am ausführlichsten
untersucht.
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Alle
großen
offenen Leserahmen (ORFs) in HPV liegen auf einem DNA-Strang. mRNAs des
Papillomvirus scheinen nur aus einem Einzelstrang der infizierten
Zellen transkribiert zu werden. Das Virusgenom kann in drei Regionen
eingeteilt werden, die stromaufwärtsliegende
regulatorische Region (URR) oder die lange Kontrollregion (LCR),
die die Kontrollsequenzen für
die HPV-Replikation und Genexpression enthält, die frühe virale Genregion, die unter
anderem die E2-, E6- und E7-Gene codiert, und die späte Region,
die die L1- und L2-Gene codiert (Turek, (1994)).
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Die
HPV-Genexpression bei einer hochgradigen prämalignen Erkrankung oder Krebs
scheint möglicherweise
aufgrund des Aufhörens
der von den viralen E6- und E7-Genen induzierten Zelldifferenzierung
auf die frühen
Gene beschränkt
zu sein. Im Vergleich zur aktiven HPV-Infektion ist die E6- und
E7-Genkontrolle bei
Krebs durch Mutationen in der viralen URR und in integrierten Virusfragmenten
durch die Unterbrechung des viralen E2-Gens, durch die Stabilisierung
der E6- und E7-mRNAs und durch die Einflüsse auf die zelluläre Integrationsstelle
gestört.
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Da
das E2-Gen bei invasiven Zervixkarzinomen in integrierten HPV-Fragmenten unterbrochen
oder inaktiviert ist (Cullen, (1991); Dürst, (1985); Matsukura, (1989);
Schneider-Gädicke.
(1986); Schwarz, (1985); Wilczynski, (1988)), wurde vorhergesagt,
dass der Verlust von E2 einen selektiven Wachstumsvorteil für die infizierte
Zelle aufgrund der unkontrollierten E6- und E7-Expression verleiht
(Schneider-Gädicke,
(1986); Schwarz, (1985)). Tatsächlich
trennen sich die Zervixzellen, die replizierende HPV-Genome enthalten,
schnell ab und werden in Kultur von Zellen überwachsen, die integrierte
Virusgenome enthalten (Jeon (1995)), aber der/die zugrunde liegende(n)
Mechanismus/Mechanismen blieb/blieben bisher unklar. Die HPV 16-E2-Genprodukte
mit der gesamten Länge
sind starke Transkriptionsaktivatoren im Vergleich zu HPV 1 E2 bei
einfachen viralen sowie bei einfachen synthetischen Promotoren (Demeret
(1994); Ushikai (1994)).
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Man
ist der Ansicht, dass die Gene E6 und E7 onkogene Aktivität besitzen.
Die codierten Proteine interagieren mit den physiologischen Funktionen
der an der Zellzykluskontrolle beteiligten Zellproteine und stören sie.
Die E6/E7-Proteine von HPV 16, 18 oder von verwandten Typen sind
in dieser Hinsicht am effizientesten. Einige dieser Aktivitäten führen zu
genetischer Instabilität
der ständig
infizierten menschlichen Zelle. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit von
Mutationen in zellulären
Protoonkogenen und Tumorsuppressorgenen und trägt daher zur Tumorprogression
bei. Mutationen in zellulären
Genen, die an der intrazellulären Überwachung von
HPV-Infektionen,
der Integration von viraler DNA und Deletionen oder Mutation der
viralen Transkriptionskontrollsequenzen beteiligt sind, führen zu
einer signifikant erhöhten
Expression der E6/E7-Gene, die ein konsistentes Merkmal von hochgradiger
intraepithelialer Neoplasie und Krebs ist. Die genetische Instabilität, die von
viralen Onkoproteinen verursacht wird, und der autokatalytische
Anstieg der Onkoproteinexpression, der durch Mutationen im Virus-
und Zellgenom verursacht wird, identifizieren das Virus als die
hauptsächliche
treibende Kraft der Progression zum Karzinom.
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WO
91/08312 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung
spezifischer DNA und/oder RNA-Transkripte von HPV E6- und/oder E7-Genen,
wobei ein prognostischer Indikator für die gravierende Zervixneoplasie
und Krebs bereitgestellt wird.
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Einzelne
Typen der humanen Papillomviren (HPV), die Schleimhautoberflächen infizieren,
wurden als Krankheitserreger für
Karzinome in der Zervix, im Anus, Penis, Kehlkopf und in der Mundhöhle, für gelegentliche
periunguale Karzinome sowie für
gutartige anogenitale Warzen in Verbindung gebracht. Die Identifizierung
bestimmter HPV-Typen wird zur Identifizierung von Patienten mit
prämalignen
Läsionen
verwendet, bei denen ein Risiko besteht, dass eine Progression zur
Malignität
erfolgen kann. Obwohl sichtbare anogenitale Läsionen in einigen Personen
vorhanden sind, die mit dem humanen Papillomvirus infiziert sind,
weist die Mehrheit der Individuen mit einer HPV-Infektion des Genitaltrakts
keine klinisch offensichtliche Erkrankung auf, aber die Analyse
der cytomorphologischen Merkmale, die in Zervixabstrichen vorliegen,
kann verwendet werden, um die HPV-Infektion nachzuweisen. Herkömmliche
Virennachweistests, einschließlich
serologischer Tests und dem Wachstum in Zellkultur, sind nicht im
Handel erhältlich
und/oder nicht für
die Diagnose und Verfolgung der HPV-Infektion geeignet. Papanicolaou-Tests
sind ein wertvolles Durchmusterungswerkzeug, aber ihnen entgeht
ein großer
Anteil der HPV-infizierten Personen.
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Daher
ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bewertung
des Stadiums der auf HPV basierenden Krankheit bereitzustellen.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Test bereitzustellen,
der mit anderen Tests kombiniert werden kann, um die Genauigkeit
und Zuverlässigkeit
der prognostischen und diagnostischen Bewertung der auf HPV basierenden
Krankheit zu verbessern.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Bewertung des Risikos bereitzustellen, dass ein mit HPV infizierter
Patient eine auf HPV basierende Krankheit entwickelt.
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Es
ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Klassifizierung von Patienten bereitzustellen, die derzeit mit
HPV infiziert sind, jedoch ohne nachweisbare auf HPV basierende
Krankheit, in diejenigen, für
die ein Risiko besteht, dass eine Progression der Erkrankung erfolgt,
und diejenigen, für
die kein Risiko besteht, dass eine Progression der Erkrankung erfolgt.
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Es
ist auch ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Identifizierung von Behandlungsregimen für Patienten mit einer auf HPV
basierenden Krankheit bereitzustellen.
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Noch
ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein
Verfahren zur Überwachung
der Wirksamkeit der Behandlung der auf HPV basierenden Krankheit
bereitzustellen.
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Ein
anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, Kits zur
Bewertung des Stadiums der auf HPV basierenden Krankheit bereitzustellen.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein computergestütztes Verfahren,
eine Analyse und ein Datenmanagement der Testdaten bereitzustellen,
um das Stadium der auf HPV basierenden Krankheit zu bewerten.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Messung der Expressionsspiegel
der Gene, die an einem Zellzustand beteiligt sind, und den Vergleich
ihrer Expression miteinander oder mit Referenzgenen in einem spezifischen
Verhältnis
als Indikation für
den Krankheitszustand in der Zellprobe. Die vorliegende Erfindung
kann verwendet werden, um das Stadium oder das Risiko zu bewerten,
wie durch den Zustand der Zellen angezeigt. Sie kann auch verwendet
werden, um die Wirksamkeit einer Therapie für eine Krankheit zu lenken
oder zu bewerten, indem basierend auf dem angegebenen Zellzustand
die geeignete Therapie identifiziert wird, oder indem jede Veränderung
des Zustandes der Zellen, die der Therapie unterzogen werden, angezeigt
wird.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden der Zustand und die Prognose einer
humanen Papillomvirus (HPV)-Infektion oder einer auf HPV basierenden
Krankheit bewertet. Diese Ausführungsform
beinhaltet die Messung des Expressionsspiegels von zwei oder mehreren
HPV-Genen. Gene für
diesen Zweck sind die HPV E6-, E7-, L1- und E2-Gene, obwohl andere
Gene wie E1, E4, E5 und L2 ebenfalls verwendet werden können. Man
fand heraus, dass der Expressionsspiegel dieser Gene, das Expressionsverhältnis dieser
Gene zueinander oder zu Referenzgenen oder beides auf das Stadium
der auf HPV basierenden Krankheit hinweist.
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Die
Genexpressionsspiegel werden nach dieser Erfindung verwendet, um
die Progression der HPV-Infektion vom gutartigen zum bösartigen
Wachstum zu bewerten. Die Progression der HPV-Infektion erfolgt
von CIN I bis CIN III und schließlich bis zu bösartigem
Krebs. Diese Stadien können
durch die Verhältnisse
der HPV-Gene identifiziert werden. Insbesondere der Übergang
von CIN I zu CIN II/III d.h. ein Übergang zur Prämalignität kann vorhergesagt
werden, wenn das Verhältnis
der vorliegenden Erfindung eins überschreitet.
Ein Verhältnis
größer als
3 in der vorliegenden Erfindung zeigt einen Übergang von der Prämalignität zu bösartigem
Krebs an. Daher zeigt ein Verhältnis,
das kleiner als 1 ist, eine niedriggradige CIN in einer HPV-infizierten Zelle
an. Ein Verhältnis
zwischen eins und etwa drei zeigt hochgradige CIN (d.h. CIN III)
oder einen prämalignen
Zustand an. Und ein Verhältnis
von ungefähr
größer drei,
ist ein Hinweis auf eine HPV-induzierte
Malignität.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine graphische Darstellung des Nachweises von E6/E7-mRNA, die als
die Anzahl der Zellen/Vertiefung gegenüber der Anzahl von E6/E7-mRNA/Vertiefung dargestellt
ist.
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2 ist
eine graphische Darstellung der Sensitivität eines HPV L1-Tests, die als die
Anzahl der RNA-Moleküle/Vertiefung
gegenüber
dem Signal-zu-Rauschen-Verhältnis minus
1 dargestellt ist.
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3 ist
die Sondensequenz für
HPV 16 L2 (SEQ ID NO: 2).
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4 ist
die Sondensequenz für
HPV 16 L1 (SEQ ID NO: 2).
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5 ist
die Sondensequenz für
HPV 16 E6/E7 (SEQ ID NO: 3).
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6 ist
die Sondensequenz für
HPV 16 E2 (SEQ ID NO: 4).
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7 ist
die Sondensequenz für
HPV 16 E4 (SEQ ID NO: 5).
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Überwachung
von erkrankten Zellen. Ein Verfahren beinhaltet die Messung der
Expressionsspiegel von Genen, die an einem Krankheitszustand beteiligt sind,
und den Vergleich ihrer Expression miteinander oder mit Referenzgenen
als Hinweis auf den Zustand der Zellen. Derartige Messungen können mit
anderen Tests kombiniert werden, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit
der Beurteilung des Krankheitszustandes zu erhöhen. Ein Verfahren der vorliegenden
Erfindung kann verwendet werden, um das Stadium einer Krankheit
zu bewerten, wie durch den Zustand der Zellen angezeigt. Dieses
Verfahren kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Therapie
für eine
Krankheit zu lenken oder zu bewerten, indem basierend auf dem angezeigten
Krankheitszustand die geeignete Therapie ermittelt wird, oder indem
jede Veränderung
des Zustandes der Zellen, die der Therapie unterzogen werden, angezeigt
wird.
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Viele
Krankheiten werden durch spezifische Zellphänotypen und Genexpressionsmuster
charakterisiert. Beispielsweise zeigen neoplastische und Krebszellen
im Allgemeinen bestimmte unterschiedliche Morphologien und Wachstumsmerkmale.
Molekulare Merkmale wie Genmutationen und Genexpressionsmuster sind
ebenfalls ein guter Indikator für
die Progression der Krankheit. Mit Viren infizierte Zellen können verschiedene
Morphologien und Genexpressionsmuster, einschließlich der Expression von viralen
Genen, zeigen. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung können die
Merkmale des Zellzustandes, wie Veränderungen der Zellmorphologie,
oder die Expression von Genen aus einer Patientenprobe bestimmt
werden.
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Die
nachzuweisenden Merkmale sind im Allgemeinen für den Zellzustand von Interesse
und die Erkrankung spezifisch, von der man vermutet, dass sie in
der Zellprobe vorliegt. Derartige Merkmale können im Allgemeinen in zwei
Typen eingeteilt werden: Cytologische Merkmale und molekulare Merkmale.
Wie hier verwendet, sind cytologische Merkmale, Merkmale wie beispielsweise
die Gesamtzellform und -erscheinung. Die primäre Identifizierung und Klassifizierung
vieler neoplastischer Zellen oder Krebszellen erfolgten traditionell unter
Verwendung cytologischer Merkmale. Die Identifizierung von cytologischen
Merkmalen ist im Allgemeinen langsam, erfordert ein relativ hohes
Ausbildungsniveau und kann im Allgemeinen nicht leicht automatisiert werden.
Wie hier verwendet, sind molekulare Merkmale das Vorliegen und der
Zustand von bestimmten molekularen Spezies wie Proteine, Nucleinsäuren und
Metaboliten. Derartige molekulare Merkmale werden im Allgemeinen
durch den Nachweis und die Messung der speziellen Moleküle von Interesse
identifiziert.
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Die
getesteten Merkmale können
Zusatz- oder Ersatzmerkmale von Markern einschließen, die
nicht eine direkte Ursache oder das Ergebnis der Krankheit sind,
aber die mit bestimmten Erkrankungen und Zellzuständen in
Beziehung stehen. Beispiele derartiger zusätzlicher Marker schließen polymorphe
Marker, humane Leukocytenantigene (HLA) wie B7, die Frauen für Zervixkarzinome
prädisponieren,
Onkogene, p53-Mutationen, andere Krebsmarker, Onkosuppressoren,
Cytokine, Wachstumsfaktorrezeptoren und Hormone ein. Derartige Marker
können
in den Zellen, die zustands- oder krankheitsspezifische Merkmale
zeigen, vorliegen oder fehlen, und ein derartiges Vorliegen oder
Fehlen kann beispielsweise auf einen gravierenden oder weniger gravierenden
Krankheitszustand hinweisen. Diese Marker können in Verbindung mit dem
offenbarten Verfahren verwendet werden, um entweder ein höheres oder
niedrigeres Risiko einer neoplastischen Erkrankung abzuleiten, abhängig von
der Anzahl der anormalen Bewertungen oder dem Ausmaß der Änderungen
der quantitativen Marker.
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Beispiele
von Krankheitszuständen
zur Bewertung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung schließen ein,
sind jedoch nicht begrenzt auf Neoplasien und Krebs. Krankheitzustände von
Interesse sind auf HPV basierende Krankheiten – einschließlich HPV-Infektion, zervikale
intraepitheliale Neoplasie (CIN) und Krebs, atypische Plattenepithelien
unbestimmter Signifikanz (ASCUS), Warzen, Condylomata, Epidermodysplasia
verruciformis und andere Hauterkrankungen, Kehlkopfpapillome, orale
Papillome und Bindehautpapillome.
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Eine
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis und die Messung der
Expressionsspiegel bestimmter HPV-Gene. Während des letzten Jahrzehnts
wurde eine beeindruckende Datenmenge angesammelt, die zeigte, dass
das Zervixkarzinom mit einer Infektion von bestimmten HPV-Typen
assoziiert ist. Obwohl das Vorliegen von HPV-DNA in einer präcancerösen Läsion auf
ein erhöhtes
relatives Risiko für eine
Zervixdisplasie und ein invasives Karzinom hinweist, ist es immer
noch schwierig, das klinische Verhalten von präcancerösen Zervixläsionen vorherzusagen. Tumoren
entstehen aufgrund der Anhäufung
von genetischen Veränderungen,
die Onkogene aktivieren können
und/oder Tumorsuppressorgene und/oder Gene inaktivieren, die an
der Erkennung und Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind.
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Die
Expressionsspiegel von E6- und E7-Onkoproteinen, die von Hochrisiko-HPV-Typen codiert
werden, sind ein sensitiveres und genaueres Maß für das potenzielle Risiko, dass
sich eine HPV-Infektion zu einer Krebsläsion entwickelt. Die vorliegende
Erfindung misst die relativen Mengen der E6- und/oder E7-Expressionsspiegel
und E2 und/oder L1 in einer HPV-infizierten Läsion, um das Verhältnis von
E6 und/oder E7 zu L1 und/oder E2 zu bestimmen, wobei in diesem Verhältnis ein
direktes Maß des
Risikos und die Anfälligkeit
für die
Entwicklung einer Krebsläsion
beinhaltet ist. Die HPV-Expression kann durch mRNA oder die Proteinspiegel
in der Zelle gemessen werden
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In
einem erfindungsgemäßen Aspekt
wird das Stadium und die Prognose einer humanen Papillomvirus (HPV)-Infektion
oder auf HPV basierenden Krankheit bewertet. Diese Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Messung des Expressionsspiegels
von einem oder mehreren HPV-Genen, von denen man herausgefunden
hat, dass sie mit dem Stadium und der Natur der auf HPV basierenden
Krankheit in Beziehung stehen. Gene, die für diesen Zweck nützlich sind,
schließen
die HPV E6-, E7-, L1- und E2-Gene ein. Man fand heraus, dass der
Expressionsspiegel dieser Gene, das Verhältnis der Expression dieser
Gene zueinander oder zu einem oder mehreren anderen Genen oder beides
auf das Stadium der auf HPV basierenden Krankheit hinweist. Der
Expressionsspiegel ist relativ zu anderen HPV-Genen, oder der Expressionsspiegel
ist relativ zu einem Nicht-HPV-Gen, das hier als Referenzgen bezeichnet
wird. Derartige Referenzgene können jedes
geeignete Gen sein (das nicht von HPV codiert wird) und sind beispielsweise „Housekeeping"-Gene oder andere
konstitutiv exprimierte Gene. Beispiele von Referenzgenen schließen Actingene,
Gene des Cytoskeletts, Histongene, Tubulingene, epidermale Wachstumsfaktorrezeptorgene,
das normale p53-Gen, das normale pRB-Gen, Cyclingene, β-Globulingene
und Glucose-6-phosphatdehydrogenasegene
ein. Die Expression der Referenzgene kann in derselben Zelle gemessen
werden wie der Spiegel der HPV-Gene gemessen wird oder in benachbarten
Zellen in derselben Zellprobe. In einem derartigen Fall ist das
Referenzgen eine interne Kontrolle für die Genexpression.
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Das
Verhältnis
des relativen Expressionsspiegels dieser Gene zum Zustand der mit
HPV infizierten Zellen wird allgemein in der nachstehenden Tabelle
1 veranschaulicht.
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Die
auf HPV basierende hochgradige CIN, auf die in der Tabelle Bezug
genommen wird, ist das prämaligne
Stadium, das zu Krebs führt,
und niedriggradige CIN ist eine produktive Virusinfektion mit geringem bösartigen
Potential, aber sie ist ein Anliegen des öffentlichen Gesundheitswesens
hinsichtlich der Ausbreitung der HPV-Infektion. Normales Gewebe
bezieht sich auf cytologisch normales Gewebe, das mit HPV infiziert
ist. Obwohl nicht auf diesen Standard begrenzt, ist ein Standard
zur Etablierung dieser niedrigen Expressionsgrenze ein Spiegel,
der unter demjenigen liegt, der bei Verwendung des von Digene in
WO 93/10263 beschriebenen Hybrid-Capture-Tests nachweisbar ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich E6/E7 auf E6, E7 oder E6 + E7.
Die Zugabe von Genen wie beispielsweise bei „E6 + E7" bezieht sich auf die kombinierte Expression der
zugegebenen Gene.
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Wie
man leicht erkennen kann, wird jeder Hauptkrankheitszustand von
einem einzigartigen Expressionsmuster dieser drei Gensets repräsentiert.
Beide Zustände
werden als gravierende medizinische Beschwerden betrachtet. Andere
Verhältnisse,
die den relativen Expressionsspiegel anderer HPV-Gene (wie E1, E4,
E5 und L2) und anderer Nicht-HPV-Gene beinhalten, können ebenfalls
verwendet werden, um den Zellzustand zu bewerten. Beispielsweise
sind L2 und E4 häufig
mit gutartigen Erkrankungen assoziiert, bei denen Viren produziert
werden, und E1 ähnelt
im Profil E2 und ist häufig
bei bösartigen
Tumoren deletiert. Andere Verhältnisse der
Expression für
diese HPV-Proteine können
für andere
auf HPV basierende Krankheiten existieren und das offenbarte Verfahren
kann verwendet werden, um den Zustand derartiger anderer Krankheiten
unter Verwendung der geeigneten Spiegel und Verhältnisse für jene Krankheit zu bewerten.
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Unter
Verwendung der Informationen über
die Spiegel und Verhältnisse
der HPV-Gene in verschiedenen Zellzuständen, kann das Stadium der
Krankheit auf mehrere Arten beurteilt werden. In einigen Fällen ist das
Vorliegen oder Fehlen der nachweisbaren Expression ein Indikator
für den
Krankheitszustand in den infizierten Zellen. Beispielsweise weist
ein Fehlen der E2-Expression (wenn HPV vorliegt) auf hochgradige
CIN oder Krebs hin. In anderen Fällen
kann eine Veränderung
oder ein Unterschied bei der Expression eines HPV-Genprodukts auf
die Veränderung
hinweisen, die in dem infizierten Zellzustand auftritt. Beispielsweise kann
ein erhöhter
Expressionsspiegel von E6 und E7 – relativ zu beispielsweise
einer früheren
Probe oder einer Referenzprobe auf hochgradige CIN oder Krebs hinweisen.
Eine Änderung
des Verhältnisses
der E6/E7-Expression zur E2-Expression wird verwendet, um niedriggradige
CIN oder eine Verschiebung von normalen Zellen zu niedriggradiger
CIN zu identifizieren. Viele andere Kombinationen von Vergleichen
sind ebenfalls möglich,
und andere Kombinationen können
aus den Angaben in Tabelle 1 zur Verwendung beim Verfahren der vorliegenden
Erfindung abgeleitet werden.
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Eine
Art, mit der die Verhältnisse
der HPV-Gene mit einer auf HPV basierenden Krankheit in Beziehung
gebracht werden können,
beinhaltet die Bezugnahme auf Gruppen von HPV-Genen. Für diesen
Zweck schließen Gruppe
1-Gene oder Gensets E6, E7 und E6 + E7 ein. Gruppe 2-Gene oder Gensets
schließen
L1, L2, E4 und irgendwelche Kombinationen davon ein. Gruppe 3-Gene
oder Gensets schließen
E1, E2, E5 und irgendwelche Kombinationen davon ein. Nützliche
Expressionsverhältnisse
schließen
Verhältnisse
von Mitgliedern von Gruppe 1 zu Mitgliedern von Gruppe 2 oder Gruppe
3 ein. Beispiele dieser Verhältnisse
sind (E6 + E7)/(L1 + L2), E6/L1, E7/L1, E6/L2, E7/L2, (E6 + E7)/L1,
(E6 + E7)/L2, E6/(L1 + L2) und E7/(L1 + L2). Für derartige Verhältnisse
weist ein Wert, der kleiner als zwei ist, auf eine gutartige humane
Papillomvirusinfektion oder eine niedriggradige intraepitheliale
Neoplasie hin. Dieser Infektionstyp wird auch als CIN I klassifiziert. HPV-Infektionen
mit einer Progression über
CIN I zeigen, dass eine Zelltransformation aufgetreten ist und das Krebswachstum
begonnen hat. Diese späteren
Infektionen (CIN II/III) haben Verhältnisse, die größer als
2 sind. Ein Expressionsverhältnis,
das größer als
zwei ist, weist auf eine hochgradige intraepitheliale Neoplasie oder
prämalignen
Krebs hin. Ein Expressionsverhältnis,
das um vieles größer als
zwei ist (d.h. über
4 bis unendlich) weist auf Krebs hin. Bevorzugte Verhältnisse
zur Verwendung in dieser Erfindung sind (E6 + E7)/L1, (E6 + E7)/(L1
+ L2), (E6 + E7 + E2 + E4)/(L1 + L2), (E6 + E7)/(E2 + E4), (E6 +
E7)/E2, (E6 + E7 + E2 + E4)/(L1 + L2).
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Es
gibt mehrere Arten, mit denen die gemessenen Expressionsspiegel
von HPV-Genen verglichen und in Kategorien eingeordnet werden können. Wo
beispielsweise das Vorliegen oder Fehlen der Expression auf den
Zellzustand hinweist, wird die Expression des HPV-Gens ohne Bezugnahme
auf den Expressionsspiegel anderer Gene analysiert. Wo der relative
Expressionsspiegel eines HPV-Gens auf den Zellzustand hinweist,
wird der gemessene Expressionsspiegel beispielsweise mit dem Expressionsspiegel
desselben HPV-Gentyps in einer unterschiedlichen Zellprobe (wie
eine frühere
Zellprobe von derselben Quelle oder Referenzzellen, die HPV tragen),
mit dem Expressionsspiegel eines unterschiedlichen HPV-Gentyps in
derselben oder einer unterschiedlichen Zellprobe, mit dem Expressionsspiegel
eines Nicht-HPV-Referenzgens
derselben Zellprobe oder mit dem Expressionsspiegel eines Nicht-HPV-Referenzgens
in Referenzzellen verglichen.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden die Expressionsspiegel und Expressionsverhältnisse
der HPV-Gene mit den Spiegeln derselben Gene in einer Zelllinie
verglichen, die HPV (wie HeLa oder CaSki) enthält. Derartige Zelllinien stellen
einen Standard bereit, mit dem die Expressionsspiegel der HPV-Gene
in Zellproben verglichen werden. Derartige Vergleiche werden verwendet,
um die absoluten Expressionsspiegel dieser HPV-Proteine mit denjenigen
in einer Standard- oder Vergleichszelllinie zu bewerten und zu vergleichen.
Andere Zelllinien, die für
diesen Zweck nützlich
sind, sind mit HPV 16 infizierte nichtkanzeröse Zelllinien (wie W 12) oder
HPV 31 (wie CIN-612; Meyers (1992)).
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Die
Expressionsspiegel und Expressionsverhältnisse der HPV-Gene werden
auch mit Referenzgenen wie „Housekeeping"-Genen oder anderen
konstitutiv exprimierten Genen in denselben Zellen oder in Referenzzellen
wie einer Zelllinie verglichen. Der Expressionsspiegel des HPV-Gens
und des Referenzgens wird beispielsweise in derselben Zellprobe
verglichen. Derartige Messungen stellen eine interne Kontrolle des
Gesamtexpressionsspiegels in einer Zellprobe bereit und werden verwendet,
um den korrigierten Expressionsspiegel für das HPV-Gen zu berechnen,
um genauere Vergleiche des Expressionsspiegels zwischen verschiedenen
Zellproben zuzulassen. Eine Form der Korrektur wird als Normalisierung
bezeichnet. Daher kann der Expressionsspiegel von einem oder mehreren
HPV-Genen in zwei oder mehr Zellproben zusammen mit dem Expressionsspiegel
desselben Referenzgens in jeder der Zellproben gemessen werden.
Der Expressionsspiegel der HPV-Gene wird dann zueinander normalisiert,
basierend auf Unterschieden, falls vorhanden, zwischen dem Expressionsspiegel
des Referenzgens in jeder der Proben.
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In
einigen Stadien der auf HPV basierenden Krankheit ist die Expression
eines bestimmten HPV-Gens niedrig oder nicht nachweisbar. Ein derartiges
Fehlen der nachweisbaren Expression wird hier verwendet, um Expressionsmuster
zu identifizieren, die als prognostische oder diagnostische Indikatoren
dienen. Die Expression anderer HPV-Gene wird parallel oder in demselben
Test bewertet, um eine Kontrolle für das Fehlen der Expression
von einem oder mehreren Genen, die bewertet werden, bereitzustellen.
Dies erfolgt, indem die Expression von mehreren HPV-Genen zusammen
oder parallel gemessen wird. Beispielsweise ist die parallele Messung
des Expressionsspiegels der HPV E6-, E7-, L1-, E4- und E2-Gene nützlich,
da mindestens eines dieser Gene in allen Stadien der auf HPV basierenden
Krankheit exprimiert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt das Verhältnis von E6/E7 zu L1/E2 einen
Indikator der Wahrscheinlichkeit, Krebs aufgrund der HPV-Infektion
zu entwickeln, bereit. Auf diese Weise werden hinweisende Informationen
gesammelt sowie eine interne Kontrolle bereitgestellt. Das Vorliegen
von L1, L2 und E4 in Kombination weist ebenfalls auf eine gutartige
Erkrankung hin, während
das Fehlen von E1 und/oder E2 auf ein neoplastisches Potential hinweist.
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Die
vorstehend beschriebenen Vergleichstypen können auch bei anderen Genen
und anderen Krankheitszuständen
verwendet werden. D.h., dass der gemessene Expressionsspiegel eines
Gens von Interesse beispielsweise mit dem Expressionsspiegel desselben
Gentyps in einer unterschiedlichen Zellprobe (wie eine frühere Zellprobe
aus derselben Quelle oder geeignete Referenzzellen), mit dem Expressionsspiegel
eines unterschiedlichen Gentyps in derselben oder in einer unterschiedlichen
Zellprobe, mit dem Expressionsspiegel eines Referenzgens in derselben
Zellprobe, oder mit dem Expressionsspiegel eines Referenzgens in
Referenzzellen verglichen werden kann.
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Die
Expression der Gene von Interesse wie die HPV E6-, E7-, L1-, E4-
und E2-Gene können
unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens bewertet werden. Beispielsweise
kann RNA unter Verwendung von Hybridisierung, Amplifikation oder
Sequenziertechniken nachgewiesen werden, und Protein kann unter
Verwendung spezifischer Antikörper
nachgewiesen werden. Viele Verfahren für den spezifischen Nachweis
der Genexpression durch Nachweis von Expressionsprodukten sind bekannt
und können
mit den offenbarten Verfahren verwendet werden. Ein Verfahren zum
Nachweis und der Messung des Expressionsspiegels von Genen von Interesse
ist der Nachweis von RNA, die aus den Genen von Interesse transkribiert
wird. Für
die verlässlichsten
Vergleiche sollten Expressionsspiegel, die verglichen werden sollen,
unter Verwendung desselben Verfahrens verglichen werden und auf
dieselbe Weise durchgeführt
werden.
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Für den Hybridisierungsnachweis
der HPV-Nucleinsäuren
kann ein Gemisch von für
diese Sequenzen spezifischen Sonden aus verschiedenen HPV-Typen
verwendet werden. Dies stellt sicher, dass das Verfahren die Expression
unabhängig
vom beteiligten HPV-Typ nachweist. Für einige Zwecke kann es wünschenswert sein,
für die
Sequenz eines bestimmten HPV-Typs konstruierte Sonden oder ein Gemisch
von Sonden für
nur einige HPV-Typen zu verwenden. Derartige Sonden können typspezifisch
sein oder nicht, abhängig
von den Unterschieden zwischen den Sequenzen der nachzuweisenden
HPV-Nucleinsäuren.
Ein nützliches
Gemisch für
diesen Zweck würde
Sonden für
HPV-Typen einschließen,
die enger mit einer Progression von Krebs assoziiert sind. Die HPV-Typen,
die am häufigsten
mit Zervixkrebs assoziiert sind, sind die Typen 16 und 18.
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Nützliche
Verfahren zur Messung des Expressionsspiegels eines Gens von Interesse
in einer Zellprobe schließen
das in WO 93/10263 von Digene beschriebene Hybrid-Capture-Verfahren,
das von (Nuovo, 1997)) beschriebene PCR-in-situ-Hybridisierungsverfahren,
b-DNA-Tests (Chernoff (1997)), die transkriptionsvermittelte Amplifikation
(TMA) (Stoflet (1988)) und die Polymerasekettenreaktion (PCR), die
Ligasekettenreaktion (LCR), die selbsterhaltende Sequenzreplikation
(3SR), die nucleinsäuresequenzbasierte
Amplifikation (NASBA), die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) und
die Amplifikation mit Qß-Replikase
ein (Birkenmeyer und Mushahwar, (1991); Landegren, (1993)).
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Zahlreiche
Tests zum Nachweis und zur Messung von Genexpressionsprodukten sind
bekannt und können
für die
Bestimmung des Expressionsspiegels von Genen von Interesse in dem
offenbarten Test angepasst werden. Beispielsweise können viele
der Verfahren zum Nachweis von HPV im Allgemeinen oder der Expression
anderer HPV-Gene, die nachstehend beschrieben werden, auch zur Verwendung
in dem offenbarten Test zum Nachweis der HPV-Gene E6, E7, L1, E4
und E2 angepasst werden.
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Viele
HPV-Nachweis- und Typisierungstests, die in dem offenbarten Verfahren
verwendet werden können,
sind bekannt, einschließlich
Tests, die Southern Blots, Dot-Blots, in-situ-Hybridisierung, Polymerasekettenreaktion
und Hybridisierung in Lösung
beinhalten. Mant (1997) beschreibt PCR-Tests, die zur Identifizierung von
DNA aus spezifischen HPV-Typen verwendet werden. Cope (1997) beschreibt
einen auf PCR basierenden Test, bei dem ein Consensusprimer verwendet
wird, und einen Hybrid-Capture-Test (HCA) zum Nachweis von HPV-Typen.
Der Hybrid-Capture-Test wird auch in WO 93/10263 von Digene beschrieben.
Der Hybrid-Capture-Test ist ein nützliches Verfahren zum Nachweis
von HPV und zur Bestimmung des HPV-Typs in Kombination mit dem offenbarten
Test.
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Swan
(1997) offenbart einen HPV-Nachweistest, der die 5' bis 3' Exonucleaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase
ausnutzt, um das Signal von Fluoreszenzfarbstoffen zu erhöhen, indem
sie von genotypspezifischen Sonden während der PCR freigesetzt werden.
Lizardi (1997) beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von HPV unter
Verwendung von in-situ-Hybridisierung mit nicht radioaktiven Sonden
und Sichtbarmachung mit einer herkömmlichen Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie
oder konfokaler Laserscanningmikroskopie. Zehbe [1] (1997) beschreibt
eine modifizierte Version der in-situ-Hybridisierung zum Nachweis
von HPV, die eine Signalverstärkung
beinhaltet. Leiserowitz (1997) beschreibt die Verwendung von reverser
Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion,
um HPV nachzuweisen. Zehbe [2] (1997) beschreibt einen nicht isotopischen,
auf einem enzymgekoppelten Immunabsorbtionstest basierenden Sandwich-Capture-Hybridisierungstest
zum HPV-Nachweis.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wurde RNA direkt durch Verfahren analysiert, die
auf Hybridisierung in Lösung
basieren. Die Zellen wurden zuerst lysiert, indem ein proteolytisches
Enzym zu den in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte enthaltenen
Zellen gegeben wurde. Nicht begrenzende Beispiele von Enzymen zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen Proteinase K oder Pronase
ein. Die Zellen können
auch einer Detergenzlyse oder osmotischen Lyse oder einer French
Press unterzogen werden. Nach der Inkubation wurden jeder Vertiefung
die biotinylierten DNA-Sonden zugegeben. Die RNA:DNA-Hybride wurden
auf einer festen Phase eingefangen, indem sie auf mit Steptavidin
beschichteten Mikrotiterplatten übertragen
wurden. Jeder Vertiefung in der Hybridisierungsmikriotiterplatte
wurden alkalische Phosphatase-konjugierte Antikörper gegen RNA:DNA-Hybride
zugegeben, und die Signale wurden erzeugt, indem jeder Vertiefung
ein chemilumineszentes Mittel wie CDP-Star® mit
Emerald II (Tropix) zugegeben wurde. Das Signal wurde von der Mikrotiterplatte
abgelesen. Die auf Lösung
basierende DNA-Analyse wurde auf ähnliche Weise wie die RNA-Analyse
durchgeführt,
mit der Ausnahme, dass die Mikrotiterplatten mit anti-DNA:RNA-Hybridantikörpern beschichtet
waren und die Sonden RNA-Sonden waren.
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Andere
Verfahren zum Nachweis und zur Bewertung von HPV-Infektionen, die
in dem offenbarten Verfahren verwendet werden können, werden in den U.S.-Patenten
Nr. 5,415,995, 4,777,239, 5,484,699, 4,983,728, 5,527,898, 5,364,758,
5,639,871, 5,501,947, 5,665,533, 4,748,109, 5,623,932, 5,665,571
und 5,648,459 beschrieben. Diese sind nur Beispiele von HPV-Nachweis-
und Typisierungstests, die in Verbindung mit dem offenbarten molekularen
Test verwendet werden können.
Viele dieser vorstehend beschriebenen Verfahren können auch
für die
Verwendung in dem offenbarten Test zum Nachweis der Expression der
HPV-Gene angepasst werden.
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Der
offenbarte Test und andere Tests können auch sequenziell kombiniert
werden. D.h., zuerst kann eine Testart durchgeführt werden, und dann können abhängig von
den Ergebnissen weitere Tests durchgeführt werden. Beispielsweise
kann ein Test zum Nachweis von HPV (oder des HPV-Typs) zuerst durchgeführt werden
und dann, falls HPV vorhanden ist, kann der offenbarte molekulare
Test durchgeführt
werden. Als weiteres Beispiel kann der offenbarte molekulare Test
zuerst durchgeführt
werden, und falls die Ergebnisse des Tests auf eine hochgradige
CIN oder Krebs hinweisen, kann ein cytologischer Test oder eine
Biopsie durchgeführt werden.
Derartige sequenzielle Kombinationen sind insbesondere nützlich,
um weitreichendere Tests auf die Patienten und Proben zu beschränken, die
als mit hohem Risiko behaftet identifiziert werden.
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Nützliche
sequenzielle Reihenfolgen für
die Tests sind (1) ein HPV-Test, gefolgt von einem Test für einen
oder mehrere andere Marker, gefolgt von einem cytologischen oder
histologischen Test; (2) ein cytologischer oder histologischer Test,
gefolgt von einem HPV-Test oder einem Test für einen oder mehrere andere Marker
(je nachdem, welcher nicht zuerst durchgeführt wurde); (3) ein cytologischer
oder histologischer Test, gefolgt von einem kombinierten oder gleichzeitigen
HPV- und Markertest; (4) ein kombinierter oder gleichzeitiger HPV-
und Markertest, gefolgt von einem cytologischen oder histologischen
Test; und (5) Nachweis von HPV, Nachweis des HPV-Typs, ein HPV-Test
und ein cytologischer oder histologischer Test. Auf jede Testkombination
folgt eine Bewertung des Zellzustandes, Krankheitszustandes, Patientenstatus,
Patientenprognose oder andere Bewertungen unter Verwendung der kombinierten
Testergebnisse, wie hier beschrieben.
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Wo
die Ergebnisse der ersten Tests entweder zweideutig sind oder ein
gravierenderes Krankheitsstadium nahe legen, sind weitere Tests
nützlich,
um die Ausgangsergebnisse zu klären
und zu bestätigen.
Wo beispielsweise eine Zellprobe ein Mosaik mit einigen Zellen,
die gutartig mit HPV infiziert sind, und mit anderen, die eine hochgradige
Neoplasie oder Krebs zeigen, bildet, kann ein Test, der die Expression
der HPV-Gene misst, zweideutige Ergebnisse liefern. Indem anschließend ein
morphologischer Test durchgeführt
wird, kann das Vorliegen von hochgradig neoplastischen oder Krebszellen
etabliert werden. In diesem Fall besteht der Nutzen des offenbarten
Verfahrens darin, dass nur einige der getesteten Zellproben (diejenigen
mit entweder zweideutigen oder gravierenden Ergebnissen) weiter
getestet werden müssen.
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Das
offenbarte Verfahren kann auch mit Behandlungsregimen kombiniert
werden. Beispielsweise legen die Ergebnisse, die in dem offenbarten
Test oder dem Verfahren auf hochgradige CIN oder Krebs hinweisen,
nahe, dass die antivirale Therapie ineffektiv ist, da diese Krankheitsstadien
häufig
mit einer HPV-Integration in das Genom einhergehen. Andererseits
legen Test- oder Verfahrensergebnisse, die auf normale oder niedriggradige
Krankheitsstadien hinweisen, antivirale Behandlungen nahe, da HPV
im Allgemeinen bei diesen Stadien nicht integriert wird. Antivirale
Behandlungen schließen
beispielsweise Medikamente oder therapeutische Impfstoffe ein. Wo
die Ergebnisse des offenbarten Verfahrens auf einen gutartigen Zellzustand
hinweisen, kann die Behandlung insgesamt vermieden werden. Die Fähigkeit,
derartige Bewertungen zuverlässig und
genau vorzunehmen, ist ein bedeutender Nutzen des offenbarten Tests.
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Das
offenbarte Verfahren kann die Kombination eines molekularen Tests,
wie vorstehend beschrieben, mit irgendeinem anderen Test zur Bewertung
einer Krankheit oder des Zustandes der Zellen in einer Zellprobe einschließen. Beispielsweise
kann ein molekularer Test, der den Expressionsspiegel oder das Expressionsverhältnis der
HPV-Gene misst, mit cytologischen Tests, histologischen Tests, der
Bestimmung des vorliegenden HPV-Typs, der Bestimmung des Spiegels
des vorliegenden HPV, Tests, die andere zelluläre Marker wie Onkoproteine
oder Tumorsuppressoren nachweisen, oder Kombinationen dieser Tests
kombiniert werden. Derartige Tests sind bekannt und werden zur Diagnose
der HPV-Infektion oder auf HPV basierenden Krankheit und zur Bewertung
des Krankheitsstadiums verwendet. Ergebnisse aus einem molekularen
Test und einem oder mehreren zusätzlichen
Tests können
kombiniert werden, um die Zuverlässigkeit
von jeglicher Beurteilung, Prognose, Diagnose oder Überwachung
der auf HPV basierenden Krankheit zu erhöhen. Diese Möglichkeit
der Kombination ist ein besonders nützlicher Aspekt des offenbarten
Verfahrens, da die vorstehend beschriebenen molekularen HPV-Tests
Informationen über
die auf HPV basierende Krankheit liefern, die sich von anderen Tests
unterscheiden. Wo multiple Tests in dieselbe prognostische oder
diagnostische Richtung zeigen, wird die Zuverlässigkeit der Bewertung erhöht. Nützliche
Kombinationen schließen
einen cytologischen Test und den offenbarten molekularen Test, einen
Test zur Bestimmung des HPV-Typs und den offenbarten molekularen Test,
sowie eine Kombination eines cytologischen Tests, eines Typisierungstests,
eines Tests zum Nachweis von Krebsmarkern und des offenbarten molekularen
Tests ein. Kombinierte Tests können
in irgendeiner Reihenfolge und in irgendeiner zeitlichen Beziehung
durchgeführt
werden. Verschiedene Tests können
beispielsweise parallel oder gleichzeitig erfolgen. Derartige Tests
können
auf jegliche Art und Weise wie auf demselben Gerät von derselben Person, mit
einem unterschiedlichen Gerät
oder in denselben oder unterschiedlichen Orten durchgeführt werden.
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Cytologische
Tests zur Verwendung bei der Bewertung des Stadiums der auf HPV
basierenden Krankheit sind bekannt und können in dem offenbarten Verfahren
verwendet werden. Der gut etablierte Pap-Abstrich und die Hämatoxylin- & Eosin-Färbungen
(H & E) sind
bevorzugte Beispiele. Die Verwendung und Analyse von Pap-Abstrichen
und Hämatoxylin- & Eosin-Färbungen (H & E) sind gut im Fachgebiet bekannt.
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Eine
Zellprobe, wie der Begriff hier verwendet wird, ist hauptsächlich eine
Sammlung von Zellen aus einem Patienten. Ein Verfahren, um Zellen
zu erhalten, ist mittels nicht invasiver Mittel, was hier definiert
wird als erhalten, ohne einen Patienten zu punktieren. Beispiele
nicht invasiver Mittel sind beispielsweise Zellproben, die aus Urin
oder Nasen-, Epithel-, Zervix- oder anderen Zelloberflächenabstrichen
erhalten wurden. Patientenzellen können auch durch andere Mittel
erhalten werden, einschließlich
beispielsweise Biopsie mittels Nadel oder Gewebebiopsie.
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Die
Zellprobe kann in einem Sammelmedium aufbewahrt werden, das eine
Kombination von zwei oder mehr Tests mit verschiedenen Merkmalen
in Bezug auf einen Zellzustand von Interesse zulässt. Wie hier verwendet, bezieht
sich der Test oder beziehen sich die Tests auf den Nachweis oder
die Messung spezifischer Merkmale, deren Ergebnisse mit anderen
derartigen Messungen von anderen Merkmalen zu einer Gesamtbewertung
einer Zelle, von der man vermutet, dass sie mit einer oder mehreren
Krankheiten infiziert wurde, kombiniert werden können. Die Tests können beispielsweise
eine Kombination einer morphologischen Analyse und Quantifizierung
einer bestimmten RNA oder DNA oder eines bestimmten Proteins einschließen, deren/dessen Spiegel
eine spezifische Indikation für
das Vorliegen oder die Progression einer Krankheit liefern. Alternativ kann
beispielsweise das Sammelmedium verwendet werden, um einen Test
zu kombinieren, mit dem die Morphologie der Zellen in einer Zellprobe
mit einem oder mehreren Tests identifiziert wird, mit denen der
beteiligte HPV-Typ identifiziert wird, und mit denen beispielsweise
identifiziert wird, ob der identifizierte HPV-Typ ein Hochrisiko-
oder Niedrigrisiko-HPV-Typ für
die Entwicklung von HPV-iduzierter Zelltransformation und Krebs ist.
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Beispielsweise
schließen
die Quellen der Zellproben zur Bewertung der auf HPV basierenden
Krankheit Zervix, Vagina, Vulva, Anus, Penis, Kehlkopf, Mundhöhle, Lymphknoten,
maligne Ablagerungen in irgendeinem Teil des menschlichen Körpers und
die Epidermis ein, die alle als Orte der HPV-Infektion und Pathologie bekannt sind.
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Zellproben
zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können gesammelt werden und in
flüssigem Medium
aufbewahrt werden. Beispiele nützlicher
Zellsammelmedien sind STM (Digene), PreservCyt® (Cytyc) und
CytoRichTM (Autocyte). Diese Medien (PreservCyt® und
CytoRichTM) wurden für die Sammlung cytologischer
Proben entwickelt, können
jedoch zur Verwendung bei molekularen Tests angepasst werden.
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Zellproben
zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung können auf
jede Weise fixiert oder verarbeitet werden, die mit den durchzuführenden
Tests im Einklang steht. Beispielsweise können sowohl cytologische als
auch molekulare Tests unter Verwendung von Zellen durchgeführt werden,
die auf einem festen Substrat wie beispielsweise einem Deckglas
fixiert sind. Die Anforderungen für diese durchzuführenden Tests
bestimmen im Allgemeinen die zu verwendende Aufbereitung der Probe.
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Die
vorliegende Erfindung kann bequem unter Verwendung von Kits durchgeführt werden,
die ein oder mehrere der für
dieses Verfahren benötigten
Materialien wie Reagenzien und Materialien zur Sammlung und Verarbeitung
der Proben einschließen.
Kits können
beispielsweise Zellsammelmedium, Reagenzien zur Probenkonservierung,
Reagenzien für
den spezifischen Nachweis von DNA und/oder Expressionsprodukten (RNA
oder Proteine) von einem oder mehreren der E2-, E4-, E5-, E6-, E7-,
L1- oder L2-Gene und Behälter
zur Probenverarbeitung einschließen. Nützliche Reagenzien zum Expressionsnachweis
der HPV-Gene sind Nucleinsäuresonden
für jene
Gene. Ein Kit kann auch Kontrollproben oder -reagenzien oder Reagenzien
und Materialien zur Durchführung
von anderen Tests enthalten, die mit dem offenbarten Test kombiniert
werden. Zusätzlich
können
die Kits Reagenzien zur Trennung von RNA und/oder DNA von anderen
Zellkomponenten enthalten.
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Die
vorliegende Erfindung kann unter Verwendung von Geräten durchgeführt werden,
die an das Verfahren angepasst sind. Zahlreiche Geräte zur Durchführung ähnlicher
Tests sind bekannt und in Gebrauch und können zur Verwendung mit den
offenbarten Tests und Verfahren angepasst werden. Beispielsweise
sind Geräte
zur Automatisierung aller oder eines Teils der Probentests und Probenverarbeitung
in Tests bekannt.
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Das
ganze oder ein Teil des offenbarten Verfahrens kann unter Verwendung
von Spezialcomputerprogrammen kontrolliert oder gehandhabt werden.
Die Daten, die von dem offenbarten Verfahren gesammelt werden und
Daten von jedem anderen, in Kombination verwendeten Verfahren können in
verschiedenen Formen für
verschiedene Zwecke unter Verwendung von Spezialcomputerprogrammen
zusammengestellt, analysiert und ausgegeben werden. Derartige Programme
können
mit anderen Patienten- oder Datenmanagement-Computerprogrammen verwendet
oder kombiniert werden. Die Nützlichkeit
eines derartigen Programms erhöht
sich mit der Anzahl der zu kombinierenden Messungen oder Bewertungen
und der relativen Bedeutung jeder Art der Messung zur Gesamtbewertung.
Computerprogramme zur Verwendung mit dem offenbarten Verfahren können auf
Mehrzweckcomputern verwendet werden oder können in Spezialcomputern oder
in computerisierte Geräte
zur Kontrolle des offenbarten Verfahrens, zur Verarbeitung und Analyse
der Daten aus dem offenbarten Verfahren oder beides integriert werden.
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BEISPIELE
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Die
Beispiele hier sollen die verschiedenen Aspekte der Durchführung der
Erfindung beispielhaft zeigen und sollen die Erfindung in keiner
Weise einschränken.
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Beispiel 1: Allgemeine
Verfahren zur Nucleinsäureanalyse.
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Der
Test für
Nucleinsäuren
folgt im Allgemeinen dem Verfahren zum Nachweis von HIV-RNA durch den
in WO 93/10263 von Digene beschriebenen Digene-Hybrid-Capture-HIV-Test.
Kurz gesagt, nach der Lyse wurden jeder Vertiefung 50 μl Sondengemisch
(enthaltend biotinylierte DNA-Sonde) zugegeben. Die Platte wurde
versiegelt und 2 Stunden bei 65 °C
inkubiert, so dass eine Hybridisierung erfolgte. Nach der Hybridisierung
wurden die Proben auf eine mit Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatter übertragen
und jeder Vertiefung wurden 25 μl
anti-Hybridantikörper
zugegeben. Die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur bei 1100
UpM geschüttelt.
Die Vertiefungen wurden 6 x mit 65°C warmen Waschpuffer gewaschen,
worauf ein Waschschritt unter Verwendung von destilliertem Wasser
folgte. Jeder Vertiefung wurden 100 μl Chemilumineszenzsubstrat zugeben
und die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Platte wurde dann im DML 2000-Luminometer gelesen. Die Daten wurden
dann als Signal-zu-Rauschen-Verhältnis
ausgedrückt.
Unter Verwendung einer Kalibrierungskurve wurde das von jeder Probe
erzeugte Chemilumineszenzsignal in mRNA-Kopien pro Zelle umgewandelt.
Der vorstehend beschriebene Test kann entweder mit ganzen lysierten Zellen
oder mit von den Zellkomponenten abgetrennter Nucleinsäure durchgeführt werden.
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Beispiel 2: Quantifizierung
von HPV
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Messung der HPV E6/E7-Expression zur
Verwendung in dem offenbarten Verfahren. Ein Verfahren zum Nachweis
und zur Quantifizierung von HPV-mRNA, einschließlich E6/E7 und mRNA, wurde
entwickelt. Dieses Beispiel misst die Expression in CaSki-Zellen,
aber das Verfahren ist allgemein auf andere Zelllinien und klinische
Proben anwendbar. Die CaSki-Zellen enthalten ein integriertes Hochrisiko-HPV-16-Genom (etwa 600 Kopien/Zelle).
Die CaSki-Zellen wurden in RMPI 1640-Medium, enthaltend 10% FBS und 10 mM
Natriumpyruvat, in Subkonfluenz aufrechterhalten. Für dieses
Beispiel wurden die CaSki-Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet und
aus den Schalen durch Behandlung mit 0,1% Trypsin-0,5 mM EDTA entfernt.
Unter Verwendung von Trypanblau wurden die lebenden Zellen unter
dem Mikroskop gezählt. Die
Zellen wurden in 10 μl
Volumina bis zu Endkonzentrationen von 10, 102,
103, 104 und 105 Zellen/Vertiefung in einer Gewebekultur
behandelten Polystyrol-Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen angesetzt.
Jede Verdünnung
wurde dreifach durchgeführt
und angesetzt.
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Die
Zellen wurden mit Proteinase K (30 Einheiten) in Tris-EDTA-gepuffertem SDS lysiert.
Die Lösungen
der Platte (20 mM Tris pH 7,4, 20 mM EDTA) und 0,5' wurde versiegelt,
30 Sekunden bei 1100 UpM geschüttelt
und 30 Minuten bei 37°C
inkubiert. Der Test für
die HPV-mRNA folgt im Allgemeinen dem Verfahren zum Nachweis von
HIV-RNA durch den in WO 93/10263 von Digene beschriebenen Digene-Hybrid-Capture-HIV-Test.
Kurz gesagt, nach der Lyse wurden jeder Vertiefung 50 μl Sondengemisch (enthaltend
E6/E7 biotinylierte DNA-Sonde) zugegeben. Die Platte wurde versiegelt
und 1,5 Stunden bei 65°C
inkubiert, so dass eine Hybridisierung erfolgte. Nach der Hybridisierung
wurden die Proben auf eine mit Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatter übertragen
und jeder Vertiefung wurden 25 μl
anti-Hybridantikörper
zugegeben. Die Platte wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur bei 1100
UpM geschüttelt.
Die Vertiefungen wurden 6 x mit 65°C warmen Waschpuffer gewaschen,
worauf ein Waschschritt unter Verwendung von destilliertem Wasser
folgte. Jeder Vertiefung wurden 100 μl Chemilumineszenzsubstrat zugeben,
und die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Platte wurde dann im DML 2000-Luminometer gelesen. Die Daten wurden
dann als Signal-zu-Rauschen-Verhältnis
ausgedrückt.
Unter Verwendung einer Kalibrierungskurve wurde das von jeder Probe
erzeugte Chemilumineszenzsignal in mRNA-Kopien pro Zelle umgewandelt.
Die Daten für
den direkten Nachweis von HPV-mRNA aus CaSki-Zellen sind in 1 dargestellt.
Dieses Verfahren ist ein Beispiel für den Nachweis und die Quantifizierung
von E6/E7-mRNA, aber wurde auch angewandt, um andere mRNA-Moleküle (beispielsweise
HPV L1-mRNA) aus CaSki-Zellen zu quantifizieren (2).
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Beispiel 3: Quantifizierung
von HPV-mRNA unter Verwendung von Konservierungssammelmedium
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Die
CaSki-Zelllinie wurde mit Trypsin behandelt, indem sie 5 Minuten
mit 0,25% Trypsin-EDTA bei 37°C
inkubiert wurde. Die Zellen wurden aus der Suspension durch 3-minütige Zentrifugation
in einer Sorvall RT 6000-Zentrifuge
bei 800 UpM pelletiert. Das Zellpellet wurden in 500 μl 1x PBS
resuspendiert und unter dem Mikroskop in Trypanblau-Lösung gezählt. Die
Zellen wurden auf 50 und 500 Zellen/μl in 1x PBS verdünnt. 10 μl jeder Zellkonzentration,
einschließlich
dem Nullpunkt (10 μl
1x PBS), wurden mit 3 ml PreservCyt-Reagenz versetzt. 100 μl Probenkonversionspuffer
wurden in jede Wanne gegeben, um die Sichtbarmachung des Zellpellets
zu unterstützen.
Alle Proben wurden gut gemischt und 15 Minuten in der Sorvall RT
6000-Zentrifuge bei 3800 UpM herunterzentrifugiert. Die Überstände wurden
verworfen, und die Röhrchen
wurden getrocknet, indem sie 2 bis 5 Minuten umgekehrt auf Papierhandtüchern auf
die Laborbank gestellt wurden. Alle Pellets wurden mit 50 μl Lysereagenz
(50 Einheiten Proteinase K) resuspendiert und das Gemisch wurde
auf die mit Streptavidin beschichtete Platte übertragen. Die Platte wurde
mit Plattenversiegelungsfolie versehen und unter Schütteln, das
alle 15 Minuten erfolgte, 30 Minuten bei 37° (Wärmeblock) inkubiert.
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50 μl jeder E6/E7-RNA-Kalibrierung
wurden in die vorgesehenen Vertiefungen bei 0, 103,
104, 105, 106, 107 und 108 Molekülen/Vertiefung
gegeben, um eine Kalibrierungskurve für die mRNA in der Probe zu
erstellen. Jeder Vertiefung wurden 50 μl des Sondengemisches zugegeben.
Die Platte wurde mit Plattenversiegelungsfolie versehen und 1 Minute
auf dem Tischschüttler
bei 1100 UpM geschüttelt.
Die Proben wurden 1,5 Stunden bei 65° C (Hybridisierungsreaktion)
im Wärmeblock
inkubiert. Die Platte wurde auf den Tischschüttler übertragen und 1 Stunde unter
Schütteln
bei 1100 UpM bei Raumtemperatur (Einfangreaktion) inkubiert. Jeder
Vertiefung wurden 25 μl
Nachweisreagenz 1 zugegeben und die Platte wurde ohne Schütteln 1
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
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Der
Inhalt der Platte wurde verworfen und die Platte wurde sechsmal
mit Waschpuffer bei 65°C
und einmal mit deionisiertem Wasser bei Raumtemperatur kräftig gewaschen.
Die Platte wurde auf Papierhandtüchern
getrocknet und jeder Vertiefung wurden 100 μl Nachweisreagenz 2 zugegeben.
Die Platte wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert.
Am Ende der Inkubationszeit wurde die Platte im DML 2000-Luminometer
gelesen und die Daten wurden dann als Signal-zu-Rauschen-Verhältnis ausgedrückt.
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Beispiel 4: Vergleich
der E6/E7-RNA- und L1-RNA- Expression in Zelllinien, die episomale
und integrierte HPV 16-DNA enthalten
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Getestete Zelllinien
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Die
folgenden Zelllinien wurden nach den vorstehend umrissenen Verfahren
untersucht.
HaCaT: eine immortalisierte menschliche Keratinocytenzellline
(Boukamp (1988))
SiHa: eine menschliche Krebszellline (Friedl
(1970))
W 12: eine nicht kanzerogene menschliche zervikale
Keratinocytenzellline (Stanley, (1989))
-
HPV-Infektionsstatus
-
HaCaT-Zellen
wurden mit HPV 16 mittels des Verfahrens von White et al. (White
(1998)) infiziert, um eine episomale (nicht integrierte, nicht gespleißte Gesamtsequenz)
HPV-Infektion zu produzieren. In jeder 40. Zelle lag etwa 1 HPV
16-Kopie vor. Diese Zellen werden als repräsentativ für die Infektion im frühen Stadium oder
CIN I (zervikale intraepitheliale Neoplasie) betrachtet. W12-Zellen
enthalten etwa 100 Kopien mit episomaler HPV 16-DNA und repräsentieren
prämaligne,
immortalisierte Zellen oder CIN II oder CIN III. SiHa-Zellen enthalten
1–2 Kopien
von in das Genom integriertem HPV 16. Man ist der Ansicht, dass
diese Zellen Krebs repräsentieren.
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Verfahren
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Die
RNA-Analyse erfolgte nach Beispiel 1 oder dem folgenden Verfahren.
Einzelsträngige,
biotinylierte DNA-Sonden, die spezifische HPV16-Gensequenzen enthalten, wurden hergestellt.
Für die
HaCaT- und SiHa-Zelllinen
wurden die Zellen bis zur Konfluenz gezüchtet, die Zellen wurden geerntet
und die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-Kits (Qiagen
Inc., Santa Clarita, CA) gereinigt. Für W 12 wurden ganze Zellen
für die
Analyse verwendet. RNA-Kalibratoren, die das vollständige HPV-Genom
enthalten, wurden hergestellt, indem (+) Sense-RNA aus einem Plasmid,
das das vollständige
HPV 16-Genom enthält,
mit T7-RNA-Polymerase transkribiert wurde. Die RNA wurde dann zu
103, 104, 105, 106 und 107 Kopien pro 50 μl verdünnt. Aliquotenanteile mit zellulärer RNA
wurden auf 50 μl
verdünnt
und dann wurden 50 μl
Sondengemisch (enthaltend die biotinylierte, einzelsträngige DNA-Sonde)
zugegeben und mit den RNA-Proben 2 Stunden bei 65°C hybridisiert.
Die Hybridisierungsreaktionen wurden auf eine mit Streptavidin beschichtete
Mikrotiterplatte übertragen
und jeder Vertiefung wurden 25 μl
Nachweisreagenz 1 zugegeben. (Nachweisreagenz 1 enthält das alkalische
Phosphatase – monoclonale
anti-RNA:DNA-Antikörperkonjugat.)
Während
einer 1-stündigen
Inkubation mit Schütteln
wurden die RNA:DNA-Hybride auf der mit Streptavidin beschichteten
Platte eingefangen, und man ließ sie
gleichzeitig mit dem anti-Hybridantikörperkonjugat reagieren. Nach
mehreren Waschschritten wurde den Vertiefungen ein Chemilumineszenzsubstrat
(Tropix CDP-star mit Emerald) zugegeben, und die Leuchtkraft wurde
nach 30-minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur in einem Mikrotiterplattenluminometer
gemessen.
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Quantifizierung
-
Die
Quantifizierung der HPV-mRNA wurde wie folgt durchgeführt. Die
Ergebnisse aus den RNA-Kalibratoren wurden verwendet, um Standardkurven
zu erstellen. Die Regressionsgleichung wurde aus dem Logarithmus
der Kopien gegenüber
dem Logarithmus des Signal-zu-Rauschen-Verhältnisses minus eins [(S/N)–1)] berechnet.
Die Regressionsgleichung wurde dann verwendet, um die Anzahl der
mRNA-Kopien in den RNA-Zellproben zu berechnen.
-
Ergebnisse der Verhältnisse
-
Die
Verhältnisse
von HPV 16 E6, E7, E2, E4, L1 und L2 wurden für jeden Zelltyp berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen,
dass in einem episomalen, frühen
Infektionsstadium das Verhältnis
von (E6 + E7)/L1 etwa 0,7 ist, in der prämalignen immortalisierten Zelllinie
ist das Verhältnis
etwa 4 und in der Krebszelllinie nähert sich das Verhältnis unendlich
an.
-
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- *L1-Gentranskripte waren in SiHa-Zellen nicht nachweisbar.
Daher sind die Verhältnisse
der anderen Gentranskripte zum L1-Gentranskript unendlich groß.
-
Die
hier zitierten Veröffentlichungen
und das Material, für
das sie zitiert werden, sind ausdrücklich durch Bezugnahme einbezogen.
-
Der
Fachmann erkennt oder kann unter Verwendung von Routineversuchen
sicherstellen, dass es viele Äquivalente
zu den beschriebenen spezifischen erfindungsgemäßen Ausführungsformen gibt. Derartige Äquivalente
sollen von den folgenden Patentansprüchen umfasst werden.
-
Literatur
-
- Birkenmeyer & Mushahwar,
J. Virol. Meth., 35:117–126(1991)
- Boukamp, et al., J. Cell Biol. 106:761–771 (1988).
- Chernoff et al. J. Clinical Microbiology 35(11):2740–2744 (1997)
- Cope et al. J. Clin Microbiol. 35(9):2262–2265 (1997)
- Cullen et al., J. Virol. 65(2):606-612 (1991)
- Demeret et al., J. Virol. 68(1):7075–7082 (1994)
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(1985)
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- Jean et al., J. Virol. 69(5):2989–2997 (1995)
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