DE69830497T2

DE69830497T2 - Bibliothek für die in-vitro Expression von Peptiden oder Proteinen

Info

Publication number: DE69830497T2
Application number: DE69830497T
Authority: DE
Inventors: H. Bjorn LINDQVIST; David Andrews; Elizabeth Haggard-Ljungquist; Morten . ISAKSEN
Original assignee: Isogenica Ltd
Current assignee: Isogenica Ltd
Priority date: 1997-02-18
Filing date: 1998-02-18
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2018-02-19
Also published as: AU6108698A; ES2241117T3; NO993953D0; WO1998037186A1; IL131435A0; DE69830497D1; PT1007654E; JP2001512474A; EP1007654B1; NO322653B1; DE1007654T1; IL131435A; GB9703369D0; NO993953L; CA2282497C; JP4644321B2; ATE297462T1; US7416847B1; CA2282497A1; EP1007654A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Erzeugung einer in-vitro-Peptid- oder -Protein-Expressionsbibliothek, die eine diverse Population von Peptiden oder Proteinen ausstellt, die so erzeugte Expressionsbibliothek und die Verwendung der Bibliothek zur Identifizierung von Peptiden oder Proteinen, die die gewünschten Eigenschaften ausüben. Die Erfindung betrifft auch spezifische DNA-Sequenzen, die den codierenden Bereich für die Peptide oder Proteine beinhalten und die spezifisch an ihr Translationsprodukt durch kovalente Anbindung binden.
Auf die selbe Weise, in der Bibliotheken den Leser mit einer großen Sammlung einer Vielzahl von Büchern versehen, die entnehmbar sind, so stellt auch eine molekulare Bibliothek eine Referenzbank von Molekülen bereit, die gewählt und entnommen werden können. Solche Bibliotheken können genetisches Material enthalten, z.B. Fragmente von DNA-Sequenzen in einem Plasmid oder Bakteriophagen oder Peptide oder Proteine exprimieren, codiert durch das genetische Material in der Bibliothek. Im letzteren Fall muss, um eine Selektion des relevanten Mitglieds der Bibliothek zu ermöglichen, das exprimierte Peptid oder Protein notwendigerweise mit dem genetischen Material assoziiert sein, das es codiert. Zur Zeit wird dies auf eine Anzahl unterschiedlicher Weisen erreicht.
Zunächst können Peptide auf den äußeren Oberflächen genetischer Packungen wie Zellen, Viren und Sporen, insbesondere Bakteriophagen, als fusionierte Teile eines Ausstellungsproteins (display protein) ausgestellt werden. Der nicht-varierende Bestandteil des Displayproteins in einer bestimmten Bibliothek wird so selektiert, dass er die Eigenschaft aufweist, dass er auf der Oberfläche der genetischen Packung exprimiert wird, z.B. einer Zelle oder eines Virions, und stabil mit der Zelle oder dem Virion assoziiert ist, so dass genetische Packungen zum Exprimieren des Zielproteins oder -peptids entnommen werden können.
Smith und Scott (Smith (1985), Science, 228, S. 1315–6; Scott und Smith (1990), Science, 249, S. 386–390) beschreiben die Verwendung des Bakteriophagen Fd als Displayvektor für eine Zufallssequenz von Peptiden, exponiert auf der Virionoberfläche. US-A-5,223,409 von Ladner exprimiert Familien potentieller Bindungsdomänen auf der äußeren Oberfläche bakterieller Zellen oder Bakteriophagen. Andere Arbeiter in vielen Laboratorien haben ähnlich solche genetischen Packungen für die Erzeugung von Expressionsbibliotheken verwendet. viel von dieser Arbeit wurde an filamentösen Phagen wie M13 durchgeführt, die sich als robuste und relativ einfache Systeme für die Verarbeitung erwiesen haben.
Diese Technologie leidet jedoch noch an bestimmten Nachteilen, wie z.B. die benötigte Zeit und der benötigte Aufwand, um eine Bibliothek herzustellen, die groß genug ist, um ausreichend Varianten für die Selektion zu erzeugen. Außerdem müssen die bis jetzt verwendeten genetischen Packungen in einem lebensfähigen Zustand erhalten werden, um sowohl die Expression des codierten Proteins und/oder Peptids als auch die Vervielfältigungen der genetischen Packung während sukzessiven Screeningschritten zu ermöglichen. Weiterhin muss das ausgestellte Polypeptid mit dem Export aus dem Organismus und einer Anordnung des Fusionspartners in der geeigneten Struktur auf dem Organismus kompatibel sein. Da die Proteinsynthese in vivo auftritt, können auch nur diejenigen Modifikationen, die vom Translationswirt bewirkt werden können, in die ausgestellte Sequenz eingebaut werden.
Die für die Propagation der gewählten genetischen Packungen benötigte Zeit während des Screeningprotokolls stellt auch eine signifikante Zeitbelastung für den Forscher dar. Weiterhin ist es bei den zur Zeit verwendeten in vivo-Displaybibliotheken notwendig, das genetische Material der Bibliotheken in einen Wirt zu transfizieren, um die Replikation und Expression zu ermöglichen, und es ist bekannt, dass die Transformation ein ineffizientes Verfahren ist, was dadurch die Anzahl von Mitgliedern reduziert, die in einer Expressionsbibliothek vorliegen können.
In letzter Zeit wurden in vitro-Expressionsbibliotheken beschrieben, die einige der oben erwähnten Begrenzungen der in vivo Expressionsbibliotheken überwinden. Zum Beispiel wurde ein Polysomendisplay beschrieben, worin ein korrekt gefaltetes vollständiges Protein, das unterschiedliche Displaypeptide in unterschiedlichen Mitgliedern der Bibliothek trägt und seine codierende mRNA beide an die Ribosomen angehaftet verbleiben. Dies wird erreicht, indem sichergestellt wird, dass die Proteinkette das Ribosom nicht verlässt und dass die mRNA das Ribosom nicht verlässt (d.h., es gibt kein Stop-Kodon und die Ribosomen sind stabilisiert). Solche Expressionsbibliotheken sind Gegenstand etlicher Patentanmeldungen, wie z.B. veröffentlicht in WO 92/02536 (The Regents of the University of Colorado), WO 93/03172 (University Reseach Corporation) und WO 91/05058 (Kawasaki).
Polysomenbibliotheken leiden an bestimmten Begrenzungen. Die RNA ist gegenüber RNAsen sehr empfindlich, und es ist daher schwierig, damit zu arbeiten. Um die Anhaftung an die Ribosomen aufrecht zu erhalten, ist die kontinuierliche Gegenwart von Magnesiumionen notwendig, die Probleme für das Screening erzeugen, wie auch für andere Schritte, wo diese immer vorliegen müssen. Besonders wichtig können alle Schritte nach der Translation, insbesondere während des Screening und den Selektionsverfahren nicht mit harten Reagenzien durchgeführt werden, da die Polysomen:RNA-Bindung erhalten bleiben muss.
Eine andere vorgeschlagene in vitro-Expessionsbibliothek involviert die Verwendung von DNA-Bindungsproteinen. Diese Proteine werden in einem Bakterium oder einem anderen Membran-abgegrenzten Organismus exprimiert, wobei ein Plasmid verwendet wird, das eine Bindungsstelle für das DNA-Bindungsprotein enthält. Das Polypeptid und die codierende Nukleinsäure sind operativ gebunden, da das Protein sich transient mit der codierenden Nukleinsäure assoziiert. Bibliothekssequenzen werden in das Polypeptid ohne Bewirkung einer Bindung an die DNA durch Insertion des Displaybestandteils zum Erhalt eines Fusionsproteins eingeführt. Solche Bibliotheken werden z.B. in der Internationalen Patentanmeldung WO 93/08278 (Affymax Technologies N.V.) beschrieben.
Während solche in vitro-Bibliotheken den Vorteil haben, dass das Screening in vitro durchgeführt werden kann, muss, da das codierte Fusionsprotein nicht einzigartig seine eigene codierende DNA erkennt (sondern sich auch mit der Bindungsstelle auf der DNA, wo immer diese auftritt, assoziiert und diese erkennt) muss zumindest die Translation in vivo mit nur einem einzigen Bibliotheksmitglied pro Wirtszelle oder Organismus durchgeführt werden. Dies begrenzt die Komplexität, die die Bibliothek erreichen kann, deutlich. So sind einige der Begrenzungen von in vivo-Expressionsbibliotheken, wie z.B. die Ineffizienz der Transformation ebenfalls hier zutreffend. Weiterhin ist die Assoziation zwischen den DNA-Bindungsproteinen und ihrer Anbindungsstelle an der DNA nicht kovalent und daher gibt eine Off-Zeit, assoziiert mit der Wechselwirkung, die im Bereich von nur 30 Minuten liegen kann. So muss die notwendige Zeit zur Durchführung der Screeningschritte nach der Translation so kurz wie möglich gehalten werden und die Bedingungen des Screenings müssen so gewählt werden, dass sich die Off-Rate nicht weiter erhöht. So existieren bei den Expressionsbibliotheken des Stands der Technik immer noch restriktive Begrenzungen.
Es wurde nun überraschend festgestellt, dass eine Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek erzeugt werden kann, worin die spezifischen Translationsprodukte des genetischen Materials in der Bibliothek direkt und kovalent an die codierende DNA-Sequenz angebunden sind. Dies vermeidet dann die Verwendung zellulärer genetischer Packungen mit ihren inhärenten Grenzen während der Konstruktion und dem Screening der Expressionsbibliothek. Dieser Vorteil ermöglicht ein schnelles Screening im Hinblick auf gewünschte Peptide oder Proteine mit Zyklen einer Selektion, DNA-Amplifikation und Expression. Während die DNA-Amplifikation eine Selbstreplikation involvieren kann, kann dies stattdessen in geeigneter und schneller Weise unter Verwendung von Standardamplifikationstechniken, z.B. der Polymerasekettenreaktion (PCR), wie hier noch im Detail beschrieben, durchgeführt werden.
Kovalente DNA:Proteinexpressionsbibliotheken der Erfindung werden durch den Einschluss einer Sequenz in das genetische Material möglich gemacht, dass ein Protein oder ein Teil davon codiert, kovalent an die eigene codierende DNA bindend und die die codierende Sequenz für das Peptid oder das Protein für das Display beinhaltet oder damit überlappt oder benachbart ist. Bei der Expression bilden sich das DNA-Bindungsprotein und das Displaypeptid oder Protein als einzelnes Polypeptid, das kovalent an die codierende DNA angebunden wird. Es wird anerkannt werden, dass eine solche Bindung nur möglich sein wird, wenn das genetische Material und sein Translationsprodukt füreinander zugänglich sind. So sollte das genetische Material vorzugsweise frei von Sequenzen sein, die effektiv Peptide oder Proteine codieren, die in die Protein:DNA-Wechselwirkung eingreifen würden.
Wie aus der Diskussion unten deutlich werden wird, wird in bestimmten Fällen das DNA-Bindungsprotein die DNA, an die es angebunden wurde, spalten. Unter diesen Umständen kann, abhängig von der Konstruktion der DNA-Moleküle der Bibliothek und dem Platzieren der Bibliothekssequenzen darin, das DNA-Bindungsprotein kovalent an ein DNA-Fragment gebunden werden, das die Bibliothekssequenzen aufgrund der Spaltung des Fragments von dem Rest des DNA-Moleküls nicht enthält. Der Matrizenstrang wird jedoch, unter der Voraussetzung, dass hybridisierende Bedingungen verwendet werden, die komplementären zwei codierenden Strangfragmente erhalten und so bleibt das DNA-Bindungsprotein an die codierende DNA über ein Intermediat einer kovalenten DNA:Proteinbindung assoziiert. Bezugnahme auf eine "direkte" Anbindung, wie hier verwendet, soll diese Möglichkeit beinhalten. Weiterhin ist in einem solchen Fall klar, dass das DNA-Bindungsprotein an ein Fragment der codierenden DNA angebunden ist. Diese Möglichkeit ist jedoch durch die Bezeichnung "spezifisch mit der codierenden DNA assoziiert", wie hier verwendet, umfasst.
So stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren zur Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek bereit, die eine diverse Population von Peptiden oder Proteinen ausstellt, wobei die Peptide oder Proteine mit der DNA, die sie codiert, durch eine kovalente Protein:DNA-Bindung spezifisch assoziiert sind, wobei das Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst:

(1) Herstellung einer amplifizierbaren genetischen Bibliothek von DNA-Molekülen, die folgendes enthalten: (i) eine Nukleotidsequenz, codierend eine Aminosäuresequenz, wobei die Aminosäuresequenz an ihre codierende Sequenz durch eine kovalente Protein:DNA-Bindung (Bindungsbestandteil) spezifisch bindet, und (ii) eine Nukleotidsequenz, codierend eine Aminosäuresequenz für die Ausstellung (Ausstellungsbestandteil) und
(2) Expression der so gebildeten genetischen Bibliothek, wobei das DNA-Molekül, wenn es exprimiert wird, ein Translationsprodukt ergibt, das den Ausstellungsbestandteil und den Bindungsbestandteil enthält, und wobei das DNA-Molekül mindestens eine Anbindungsstelle für den Bindungsbestandteil aufweist.

So kann die Erzeugung einer Vielzahl unterschiedlicher Translationsprodukte, die kovalent an ihr spezifisches codierendes genetisches Material anbinden, realisiert werden. Diese Feststellung wurde für die Entwicklung der hier beschriebenen Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek verwendet. Diese Bibliothek unterscheidet sich von früheren in vivo-Bibliotheken unter Verwendung von Zellen oder einzelligen Organismen zur Expression der Peptide, da das Peptid oder Protein für die Ausstellung direkt auf dem genetischen Material, das es codiert, präsentiert wird und nicht auf einer Oberfläche einer Membran oder Zellwand.
Weiterhin kann eine monovalente oder divalente Ausstellung im allgemeinen erreicht werden, und dieses Verfahren ermöglicht die Expression einer extrem hohen Bibliotheksdiversität. Zusätzlich kann eine PCR-Amplifikation des genetischen Materials, das ein Bibliotheksmitglied, das die gewünschten Eigenschaften zeigt, codiert, wenn eine solche durchgeführt werden soll, in situ auf der DNA dieses Mitglieds der Peptidbibliothek durchgeführt werden, da die DNA für die Bindung geeigneter Primer frei zugänglich ist und keine vorherige Extraktion oder Elution von Materialien benötigt, verwendet während ihrer Selektion oder nicht-genetischen Anteilen des Peptid- oder Proteinbibliothekskonjugats. Dies vereinfacht und beschleunigt das Verfahren signifikant. Weiterhin ist die harte Behandlung, z.B. niedriger pH, der üblicherweise für die Elution des genetischen Materials aus zielbindenden Zellen oder Virionen vor der Amplifikation benötigt wird, nicht notwendig.
Zusätzlich bedeutet anders als bei den in vitro-Expressionsbibliotheken des Stands der Technik die kovalente Bindung zwischen der DNA und dem codierten Polypeptid, dass das Display-Peptid oder Protein von der DNA durch ionische Bedingungen und Lösungsmittel nicht freigesetzt werden wird, die Bakteriophagen, DNA-Bindungsprotein:DNA-Wechselwirkungen oder Ribosomen aufbrechen würden. Weiterhin ermöglicht die kovalente Bindung eine Selektion in einem breiteren Temperaturbereich, über längere Zeitspannen und mit dazwischen geschalteten Einfrierschritten. So ist die Selektion sehr viel praktischer wie auch potentiell rigoroser.
Wie hier verwendet, soll die Bezeichnung "bindet spezifisch an die codierende Sequenz" anzeigen, dass die Aminosäuresequenz, obwohl sie die codierende DNA u. U. nicht einzigartig erkennen kann, wenn isoliert und in eine Reihe von unterschiedlichen DNA-Sequenzen eingeführt, ihre eigene codierende Sequenz binden wird, wenn sie von der codierenden DNA durch Transkription und Translation erzeugt wird. Diese Spezifität kann auf einer Anzahl von Weisen wie unten beschrieben erreicht werden. Wie hier bezeichnet, soll die "codierende" DNA das DNA-Molekül bezeichnen, das bei Expression ein Translationsprodukt ergibt, das das Displayprotein oder Peptid und die DNA-Bindungseinheit enthält. Der DNA-Bereich, an der die DNA bindende Bestandteil bindet, liegt jedoch nicht notwendigerweise in dem Bereich, der die Display- oder Bindungsbestandteile codiert, sondern ist nur auf dem selben DNA-Molekül vorhanden.
Proteine, die in vitro mit der DNA-Sequenz interagieren, die sie codiert, sind hier als "cis-wirkende Proteine" (auch als cis-Proteine bezeichnet) bekannt und etablieren eine kovalente Bindung an ihre eigene DNA-Matrize. "Pseudo-cis wirkende Proteine" sollen hier solche Proteine sein, die in cis-Weise wirken (d.h. an ihre codierende DNA binden), und zwar unter den geeigneten Bedingungen.
Eine Pseudo-cis-Peptid- oder -Protein-Expressionsbibliothek kann durch die Verwendung eines DNA-bindenden Bestandteils erzeugt werden, das kovalent an die codierende DNA unter den geeigneten Bedingungen bindet. Dies kann z.B. durch Durchführung des Translationsschritts in den Grenzen einer Zelle oder eines Organismus erreicht werden, worin jede Zelle DNA, die nur ein einzelnes Bibliotheksmitglied codiert, enthält.
In diesem Fall und da der DNA-Bindungsbestandteil nur eine einzelne Erkennungs- und Anbindungsstelle aufweisen wird, die zur Verfügung steht (obwohl es mehr als eine Kopie der DNA geben kann), wird er an die eigene codierende DNA binden (Pseudo-cis-Wirkung). Dies stellt so eine operationale Bindung zwischen der codierenden DNA und dem exprimierten Peptid oder Protein, gebunden durch eine kovalente Bindung, bereit. Wie hier verwendet, beinhaltet die "Anbindungsstelle" die Erkennungsstelle, durch die der DNA-Bindungsbestandteil sich vor der kovalenten Bindung assoziiert, d.h. diese Bezeichnung betrifft die benötigte Nukleotidsequenz um eine kovalente Bindung des DNA-Bindungsproteins zu erreichen.
So stellt die Erfindung in einem bevorzugten Aspekt ein Verfahren zur Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek wie oben definiert bereit, wobei die Expression des genetischen Materials in vivo mit einem einzelnen Bibliotheksmitglied durchgeführt wird, optional in mehr als einer Kopie vorliegend, exprimiert pro Wirtszelle oder Organismus.
Geeignete Pseudo-cis-Proteine sind alle Proteine, die spezifische Bindungsstellen (Anbindungsstellen) auf der DNA erkennen und zu einer kovalenten DNA:Proteinbindung führen. Beispiele beinhalten terminale Proteine, Replikationsproteine und andere Priming-Proteine. Weiterhin können funktionell äquivalente Fragmente, Varianten oder Derivate der bekannten kovalenten DNA-Bindungsproteine verwendet werden. Es wird anerkannt werden, dass die unten beschriebenen cis-Bindungsproteine auch in dem oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können.
Echte cis-wirkende Proteine bieten bestimmte Vorteile für die Herstellung von in vitro-Expressionsbibliotheken. Beispiele für cis-wirkende Proteine beinhalten diejenigen, die an einer Initiation der Replikation beteiligt sind. Eine Replikation vom Rollkreistyp (rolling circle) wird allgemein unter zirkulären Replikons von unterschiedlichem Ursprung verwendet, z.B. bei einzelsträngigen (ss) und doppelsträngigen (ds) DNA-Phagen (Van Mansfield et al. (1984), Adv. Exp. Med. Biol., 179, S. 221–230; Baas & Jansz (1988), Cur. Topics Microbiol. Immunol., 136, S. 31–70), ssDNA-Plasmide (Gruss & Ehrlich (1989), Microbiol. Rev., 53, S. 231–241; Novick (1989), Ann. Rev. Microbiol., 93, S. 537–565), ssDNA-Pflanzenviren (Stenger et al. (1991), PNAS, 88, 5. 8025–8033; Saunders et al. (1991), Nucl. Acids Res., 19, S. 2325–2330), ss- und ds-DNA-Tierviren (Berns (1990), Microbiol. Rev., 54, S. 316–329; Dasgupta et al. (1992), J. Mol. Biol., 228, p1–6) und ds-DNA-Bakterienplasmide (Kham, 1997, Microbiol. Molec. Biol. Rev., 61(4), S. 445–455). In den untersuchten Systemen besitzen die Initiationsproteine eine Nick-Schließ- und Topoisomeraseähnliche Aktivität. Das best untersuchte System ist dasjenige des ssDNA-Phagen ϕX174, wobei das A-Protein die ori-Stelle im viralen Strang der replikativen Form mit einem Nick versieht und eine kovalente Bindung an das 5'-Ende des gespaltenen Strangs bildet. Das 3'-Ende wird danach durch die Wirtspolymerase verlängert, wobei der 5'-virale Strang ersetzt wird, und nach einer Replikationsrunde wird der Eltern-virale Strang religiert und das A-Protein wird auf den Nachkommensstrang übertragen, um eine neue Replikationsrunde zu beginnen (Baas & Jansz, 1988, supra). Es hat sich auch erwiesen, dass das P2 A-Protein die ori-Stelle in dem Kodierungsbereich des A-Gens an einer Stelle spaltet, der eine Sekundärstruktur fehlt und an das 5'-Ende des gespaltenen Strang bindet (Liu & Haggård-Ljungquist (1994), Nucl. Acids Res., 22, S. 5204–5210).
Diese cis-Wirkung wirkt wie berichtet in vivo, und so kann der Translationsschritt in vivo durchgeführt werden, jedoch mit mehr als einem einzelnen Bibliotheksmitglied exprimiert pro Zeile, bevor die Zelle aufgebrochen wird, um die Displaybibliothek zu erzeugen. Das Verfahren, das es ermöglicht, dass das cis-Protein seine cis-Wirkung ausübt, trotz der Gegenwart anderer geeigneter Bindungsstellen auf anderen DNA-Molekülen, die auch in der Zelle oder dem Organismus enthalten sind, ist nicht bekannt, obwohl vorgeschlagen wurde, dass eine Kompartimentierung während der Translation auftritt oder dass die cis-Proteine sich in der Zelle nicht einfach verteilen können.
So stellt in einem besonders bevorzugten Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek wie oben definiert bereit, wobei die Aminosäuresequenz, die spezifisch an die codierende Sequenz bindet, von einem cis-wirkenden Protein oder einem funktionell äquivalenten Fragment, Derivat oder einer Variante davon abstammt und wobei die Expression des genetischen Materials in vivo mit mindestens einem Bibliotheksmitglied, optional in mehr als einer Kopie vorliegend, exprimiert pro Wirtszelle oder Organismus durchgeführt wird.
Geeignete cis-wirkende Proteine, die in vitro cis-wirkend verbleiben, beinhalten die Familie der Replikationsproteine einschließlich P2A, die durch Sequenz (vorzugsweise mit 60 % Sequenzidentität, noch bevorzugter 70, 80 oder 90 %), Organisation und Replikationsweise verwandt sind; wie z.B. äquivalente Proteine des Phagen 186 (Sivaprasad et al., 1990, J. Mol. Biol., 213 (S. 449–463), HP1 (Esposito et al., 1996, Nucl. Acids Res., 24, S. 2360–2368) und PSP3 (Bullas et al., 1991, Virology, 185, S. 918–921) und funktionell äquivalente Fragmente, Derivate und Varianten davon. Cis-wirkende Proteine, die in vivo cis wirken, zeigen eine ähnliche Replikation vom Rollkreis-Typ und Organisation wie P2A. Solche Proteine beinhalten z.B. das A-Protein von ϕX174, wie oben erwähnt. Geeignete Pseudo-cis-Proteine sind mit P2A verwandt, wie z.B. terminale Proteine, z.B. von unterschiedlichen Organismen.
Die Verwendung der obigen Bibliotheken ermöglicht einen Anstieg der Diversität der Bibliothek und eine Reduktion des Signal-zu-Hintergrundverhältnisses aufgrund der niedrigen Zahl von Wirtszellen oder Organismen, die relativ zu bekannten in vivo-Expressionsbibliotheken benötigt werden.
Es wurde immer angenommen, dass cis-wirkende Proteine nur in vivo wirken und eine korrespondierende Wirkung in vitro wurde weder vorgeschlagen noch beobachtet. Es wurde jedoch überraschend festgestellt, dass die cis-Wirkung selbst dann aufrechterhalten bleibt, wenn die Translation in vitro durchgeführt wird.
Wie anerkannt werden wird, ergeben sich etliche Vorteile aus dieser Feststellung. Zunächst hat die Bildung einer kovalenten Bindung verschiedene Vorteile wie vorher erwähnt. Da weiterhin die codierten Proteine in der Lage sind, ihre codierende DNA aufzufinden, trotz der Gegenwart von benachbarten Strängen von DNA, die geeignete Bindungsstellen zeigen, kann die gesamte Herstellung der Bibliothek und ihr Screening in vitro durchgeführt werden. Dies reduziert die Zeit und die Mühe drastisch, die für die Erzeugung und das Screening benötigt werden, und viele der Begrenzungen von in vivo-Bibliotheken werden vermieden. Es können z.B. mindestens 12 Stunden pro Expressions-, Screening- und Amplifikationsrunde gespart werden. Da Wirtszellen oder Organismen vollständig abgeschafft werden können, kann die Bibliothek bis zu 10¹² unterschiedliche Mitglieder aufweisen.
Eine in vitro-Translation ermöglicht den Einbau von vielen co- und post-translationalen Modifikationen (die chemisch oder enzymatisch während oder nach dem Translationsschritt durchgeführt werden können), wobei einige von ihnen vorher nicht möglich waren, als die Translation in vivo durchgeführt wurde. Es können z.B. eine Phosphorylierung oder Sulfatierung, eine Bildung von Disulfidbindungen, eine Glycosylierung oder Isomerisierung durchgeführt werden. (Diese Schritte könnten auch an Bibliotheksmitgliedern durchgeführt werden, sobald sie in vivo exprimiert und dann freigesetzt wurden.) Diese Reaktionen können in vitro bewirkt werden, indem der Extrakt mit dem Enzym, das für die Modifikation verantwortlich ist, supplementiert wird. Nicht-natürliche Aminosäuren können ebenfalls eingeführt werden, z.B. durch chemische Beladung einer t-RNA oder durch Modifikation der Aminosäure auf einer beladenen t-RNA.
So stellt die vorliegende Erfindung in einem besonders bevorzugten Aspekt ein Verfahren zur Erzeugung einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek wie oben definiert bereit, wobei die Aminosäuresequenz, die spezifisch an die codierende Sequenz bindet, von einem cis-wirkenden Protein oder einem funktionell äquivalenten Fragment, Derivat oder einer Variante davon abstammt, und die Expression des genetischen Materials in vitro durchgeführt wird.
Wie hier verwendet, definieren "funktionell äquivalente" Fragmente, Derivate und Varianten Peptide oder Proteine, die mit einem nativen Protein wie hier definiert (z.B. einem cis-wirkenden Protein) verwandt sind oder davon abstammen, wobei die Aminosäuresequenz durch einfache oder multiple Aminosäuresubstitutionen, Additionen und/oder Deletionen modifiziert wurde, die alternativ oder zusätzlich Aminosäuren beinhalten, die chemisch modifiziert sein können, z.B. durch Deglycosylierung oder Glycosylierung, die jedoch nichtsdestotrotz die gewünschte Funktionalität beibehalten, z.B. cis- oder Pseudo-cis-DNA-Bindungseigenschaften. In geeigneter Weise können solche Derivate oder Varianten 80 oder 90 % Sequenzidentität zum nativen Protein, von dem sie abstammen, aufweisen. Funktionell äquivalente Varianten beinhalten natürliche biologische Variationen (z.B. Allelvarianten oder geographische Variationen innerhalb einer Art) und Derivate, die unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können funktionell äquivalente Peptide oder Proteine entweder durch chemische Synthese oder in rekombinanter Form unter Verwendung der bekannten Techniken einer ortsgerichteten Mutagenese, statistischen Mutagenese oder enzymatischer Spaltung und/oder Ligation von Nukleinsäuren hergestellt werden.
Es wird anerkannt werden, dass cis-wirkende Proteine oder Fragmente, Varianten oder Derivate davon verwendet werden können, um Bibliotheken der Erfindung gemäß den für pseudo-cis-wirkende Proteine beschriebenen Verfahren zu erzeugen, die im größeren Detail unten beschrieben werden.
In geeigneter Weise stammen die cis-Proteine zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung von dem Phagen P2-DNA-Replikations-Initiations-System ab. Das P2 A-Protein erkennt eine definierte Initiatorsequenz, lokalisiert innerhalb des P2 A-Gens auf demselben DNA-Molekül, das für es codiert (cis-Wirkung) und bildet spezifisch Nicks von einem der Stränge, während eine kovalente Bindung mit einer der freien Endbasen an der Nick-Stelle gebildet wird (Liu & Haggård-Ljungquist, 1994, supra). Ein solcher Protein-DNA-Komplex bildet ein genetisches Konjugat, das für Peptiddisplayzwecke verwendet werden kann. Die Sequenz des P2 A-Gens wurde berichtet (Liu et al. (1993), J. Mol. Biol., 231, S. 361–374).
Es ist bekannt, dass das P2 A-Protein Aminosäureveränderungen tolerieren kann (siehe z.B. Liu et al., 1993, supra), und so können Displaypeptide oder -proteine ohne einen Verlust einer Funktion eingeführt werden. Die Eigenschaft der cis-Wirkung von A ermöglicht Peptid- oder Proteinbibliothekskonstruktionen in vitro, indem eine Bibliothek von DNA-Matrizen (mit Sequenzen, die verschiedene Hybrid A-Peptide oder -Proteine für ein Display codieren, einem geeigneten Promotor zur Transkription des A-Gens und der Stelle, an die P2A bindet) einem zellfreien gekoppelten Transkriptions/Translationsschritt unterzogen werden. Dies führt zu Hybrid A-Peptiden oder -Proteinen, die kovalent an ihre eigene Matrizen-DNA binden.
Die Hybrid A:DNA-Konjugate bilden eine in vitro-Peptid- oder -Proteinbibliothek, die die unterschiedlichen Hybrid A-Peptide oder -Proteine ausstellt, die einem Navigieren (Panning) auf ein Ziel oder einem Test auf eine gewünschte Aktivität unterzogen werden können. Die spezifischen Hybrid A:DNA-Konjugate, die an das Ziel binden oder eine gewünschte Eigenschaft ausüben können, falls nötig gewonnen werden und das genetische Material kann dann z.B. durch PCR amplifiziert und einem gekoppelten Transkriptions/Translationsschritt in einem zellfreien Extrakt unterzogen werden. Dieser Zyklus kann wie gewünscht wiederholt werden, um einen individuellen Hybrid A:DNA-Klon zu erhalten. Dies kann durch DNA-Sequenzierung überwacht werden, bis eine geeignete Zahl von DNA-Sequenzen erhalten ist. Geeignete Screening-Verfahren werden im Detail unten beschrieben.
Wie hier unter Bezugnahme auf die Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek verwendet, die eine diverse Population von Peptiden oder Proteinen ausstellt, soll die Bezeichnung "Peptid oder Protein" eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens eine Displaysequenz (Displaybestandteil) enthält (die in der Sequenz, die die codierende DNA bindet, enthalten sein kann, mit dieser überlappen kann oder von dieser unterschiedlich sein kann), die in unterschiedlichen Mitgliedern der Bibliothek variiert ist und die durch geeignete Selektionsverfahren gewählt werden kann. Jedes Expressionsbibliotheksmitglied enthält auch als Teil des exprimierten Polypeptids, eine nicht variierende Sequenz (die ein Teil oder die gesamte Sequenz sein kann), die für die Anbindung des Peptids oder Proteins, das sich aus der Expression der codierenden DNA ergibt, verantwortlich ist (der Bindungsbestandteil). Notwendigerweise werden sowohl Bindungs- als auch Displaybestandteile auf einem einzelnen Peptid oder Protein exprimiert.
Wenn der Displaybestandteil größer ist als ein Peptid (und hier als Displayprotein bezeichnet wird), ist es wahrscheinlich, dass verschiedene Aminosäuren des Proteins nicht variieren werden, so wie wenn ein Protein als Gerüstsubstanz verwendet wird und dass sich das Bibliotheksmitglied nur in bestimmten Regionen von dem Displayprotein unterscheiden wird.
Die DNA-Sequenzen, die die Peptide oder Proteine für eine Expression in Bibliotheken der Erfindung codieren, enthalten Sequenzen, die die Display- und Bindungsbestandteile codieren und mindestens eine Stelle der Anbindung für den Bindungsbestandteil, wobei die Nukleinsäuremoleküle Moleküle mit degenerierten und/oder funktionell äquivalenten Sequenzen beinhalten und bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung. Funktionell äquivalente Nukleinsäuremoleküle beinhalten Fragmente, Derivate und Varianten, z.B. substantiell homologe und hybridisierende Sequenzen, die Peptide oder Proteine, wie hier definiert, mit der benötigten Funktionalität, z.B. cis-bindende Wirkung, codieren.
Unter "im wesentlichen homolog" werden Sequenzen verstanden, die mindestens 60 %, vorzugsweise mindestens 70 oder 80 % Sequenzhomologie darstellen. Hybridisierende Sequenzen, beinhaltet im Umfang der Erfindung, sind diejenigen, die unter nicht-stringenten Bedingungen (6 X SSC/50 Formamid bei Raumtemperatur) binden und gewaschen unter Bedingungen einer niedrigen Stringenz (2 × SSC, Raumtemperatur, noch bevorzugter 2 X SSC, 42°C, oder Bedingungen hoher Stringenz, z.B. 2 X SSC, 65°C (worin SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2), wie auch diejenigen, die, wenn es nicht den degenerierten Code gäbe, unter den oben erwähnten Bedingungen hybridisieren würden.
Es wird anerkannt werden, dass durch die Produktion einer Bibliothek von DNA-Sequenzen (mit assoziierten codierten Proteinen oder Peptiden) die vorliegende Erfindung auch eine DNA-Displaybibliothek bereitstellt. So wird eine bifunktionelle Bibliothek für die Selektion von Mitgliedern bereitgestellt, basierend auf ihrem Displaypeptid/protein oder DNA-Bestandteilen.
Die Erfindung wird in geeigneter Weise unter Verwendung des P2 A-Proteins oder eines funktionellen äquivalenten Fragments, Derivats oder einer Variante davon als Bindungsbestandteil durchgeführt. Die relevante Nukleotidsequenz zur Bindung des DNA-Bindungsbestandteils muss ebenfalls an einer geeigneten Stelle bereitgestellt werden, obwohl diese von ihrer natürlich auftretenden Position weg bewegt werden kann. Im Fall des Beispiels P2A sollte z.B. mindestens die Sequenz TCGGA, z.B. in der Sequenz GCGCCTCGGAGTCCTGTCAA, in der DNA enthalten sein, codierend die Peptide oder Proteine der Expressionsbibliothek oder ein funktionell äquivalentes Fragment, Derivat oder eine Variante davon, die durch den DNA-Bindungsbestandteil erkannt wird und damit eine kovalente Bindung bildet. In geeigneter Weise wird die Sequenz, codierend den Displaybestandteil, in die Sequenz, codierend das N-terminale Ende des P2 A-Proteins, inseriert, überlappt damit oder ist dazu benachbart.
Die zur die Erzeugung der Bibliothek verwendeten DNA-Moleküle können mit Mitteln sowohl für eine Amplifikation als auch Transkription versehen sein. Geeignete DNA-Moleküle mit Mitteln für eine Amplifikation beinhalten doppelsträngige DNA mit einem Replikationsursprung, z.B. sich selbst replizierende Plasmide, die sich so in vitro z.B. in zellfreien Extrakten replizieren können oder in vivo, falls vorliegend, in Wirtszellen. Wenn die DNA zur Selbstreplikation nicht in der Lage ist, kann dies in geeigneten Fällen durch den Einschluss eines Replikationsursprungs überwunden werden. Zum Beispiel binden bestimmte Proteine, wie hier beschrieben, wie z.B. P2A, an ihren eigenen Replikationsursprung. Wenn das Protein nicht von dem Ursprung freigesetzt wird (z.B. wenn die hier beschriebenen Mutanten verwendet werden), wird die Replikation des DNA-Moleküls, enthaltend das DNA-Bindungsbestandteilgen, inhibiert. In diesen Fällen kann ein zweiter Replikationsursprung eingeschlossen werden. Geeigneter Weise befinden sich die Nukleinsäuremoleküle zur Erzeugung der Bibliothek in Form von Vektoren, Plasmiden oder linearer DNA.
Alternativ kann die DNA durch technische Eingriffe amplifiziert werden, z.B. durch Bereitstellung geeigneter Stellen für die Bindung von Primern für eine Amplifizierungsreaktion, z.B. PCR, für die DNA, was eine in vitro-Amplifikation ermöglicht. Natürlich würden solche Stellen in den meisten Fällen inhärent in allen DNA-Molekülen vorliegen, so dass die geeignete Wahl der Primer die Amplifizierung erleichtern würde.
Mittel für eine Transkription beinhalten die Bereitstellung einer Promotorsequenz. Wenn ein Wildtyp-Gen oder eine degenerierte Sequenz oder ein funktionell äquivalentes Fragment, Derivat oder eine Variante davon verwendet wird, kann der Promotor konstitutiv vorliegen. Falls nicht, kann ein induzierbarer oder nicht-induzierbarer Promotor eingeschlossen werden. In solchen Fällen, in denen das Produkt der Translation die Transkription inhibieren würde (z.B. wenn die Mutante P2A, wie hier beschrieben, verwendet wird), ist es ratsam, einen induzierbaren Promotor zu verwenden, der nur während des Transkriptions/Translationsschritts aktiviert werden kann. Alternativ kann in einem solchen Fall ein nicht induzierbarer Promotor verwendet werden, wenn dieser effektiv in induzierbarer Weise wirkt, z.B. durch sehr wenig Transkription unter geeigneten Bedingungen (z.B. T7 in bakteriellen Wirten, enthaltend ein reguliertes T7-Polymerasegen, oder durch Zufuhr eines Promotors zu geeigneter Zeit, z.B. durch virale Infektion). Wenn jedoch ein nicht-induzierbarer Promotor verwendet wird, wenn während des Verlaufs des Bibliothek-Screenings, die Translation in einem bakteriellen Wirt durchgeführt werden muss, muss ein induzierbares Polymerasegen in einem Bakterien vorliegen oder durch Infektion eingeführt werden.
Beispiele für geeignete induzierbare Promotoren beinhalten AraB, den lambda-Promotor (in Zellen, die einen Temperatur-empfindlichen Repressor exprimieren, wie z.B. N4830-1) oder einen TAC- oder LAC-Promotor, kombiniert mit einer effizienten LAC O-Sequenz. Geeignete nicht-induzierbare Promotoren beinhalten den T7-Promotor oder die SP6- oder T3-Promotoren. Der Promotor sollte stromaufwärts von dem zu exprimierenden Polypeptid lokalisiert sein, jedoch kann dies erreicht werden, wenn der Promotor sich stromabwärts befindet, indem eine lineare DNA zirkularisiert wird.
DNA-Moleküle für eine Verwendung bei der Herstellung der Bibliothek müssen auch notwendigerweise diverse Displaypeptide oder Protein-codierende Sequenzen enthalten, um eine Bibliothek unterschiedlicher Peptide oder Proteine zur Ausstellung zu erhalten. Solche unterschiedlichen Sequenzen können z.B. durch Randomisierung eingeführt werden, wie beschrieben in der Literatur, unter Verwendung randomisierter Primersequenzen in PCR (Schmidt und Skerra (1993), Protein Engineering, 6, S. 109–122), wie im Detail unten beschrieben. Randomisierte Primersequenzen können unter Verwendung von standardchemischen Syntheseverfahren mit kommerziellen DNA-Synthetisierern erzeugt werden oder kommerziell erworben werden. Alternativ, insbesondere wenn die Variation in den nicht benachbarten Aminosäuren eingefügt werden soll, können Megaprimer erzeugt und durch Mutagenese variiert werden.
Die DNA-Moleküle mit den für die Erzeugung einer Bibliothek notwendigen Merkmalen bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Die Expression des genetischen Materials der Bibliothek kann wie im Detail unten beschrieben durchgeführt werden.
Im Hinblick auf einen weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine in vitro-Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek bereit, die eine diverse Population von Peptiden oder Proteinen ausstellt, wobei die Peptide oder Proteine spezifisch mit der DNA assoziiert sind, die sie codiert, und zwar durch kovalente Protein:DNA-Bindung und wobei die codierende Sequenz auf einem DNA-Molekül getragen wird, was eine Sequenz enthält, codierend eine Aminosäuresequenz, die spezifisch an die codierende Sequenz bindet (Bindungsbestandteil), eine Sequenz, codierend eine Aminosäuresequenz für die Ausstellung (Dispaybestandteil) und mindestens eine Anbindungsstelle für den Bindungsbestandteil.
Wie aus dem Obigen deutlich wird, stellt die Erfindung viele unterschiedliche Bibliotheksarten und Verfahren für ihre Erzeugung bereit. Obwohl Verfahren für die Erzeugung solcher Bibliotheken im Umfang des Fachmanns sein würden, wird das Folgende zur Illustration einiger Bibliotheksarten bereitgestellt und wie diese erzeugt werden könnten, unter besonderer Bezugnahme auf die Verwendung des Gens, das P2A codiert, als Beispiel eines cis-wirkenden Proteins.
Eine Bibliothek kann erzeugt werden, worin die Peptide oder Proteine für die Ausstellung statistische, pseudostatistische, teilweise statistische oder verteilte Variationen ausüben und die Gesamtheit oder ein Teil des genetischen Materials, codierend Mitglieder der Bibliothek, chemisch synthetisiert werden kann oder von genotischen/codierenden Sequenzen verschiedener Organismen abstammt. Die variierten Regionen können benachbart oder nicht benachbart sein. Kombinationsbibliotheken (worin die variierten Regionen benachbart liegen) bestehen im allgemeinen aus weniger als 20 Aminosäuren aufgrund der möglichen Zahl der Permutationen. Es ist daher üblich, nicht benachbarte Regionen einer Variation für längere Abschnitte von Aminosäuren zu verwenden. So können z.B. in einem Displaypeptid von 40 Resten Permutationen von nur 13 dieser Aminosäuren erzeugt werden. Dies hat den Vorteil der Reduktion der Gesamtzahl der Permutationen (Bibliotheksmitglieder) relativ zu einer Bibliothek, worin alle Positionen variiert wurden. Die Verwendung von Sequenzen, worin bestimmte Reste nicht variieren, stellt eine Gerüst- (invariante) Struktur bereit, mit bestimmten Regionen, die darin enthalten oder durch das Gerüst gestützt sind, die variiert sind.
Diese Gerüststrukturen können inhärent in Proteinen existieren, worin Bibliotheken verwendet werden könnten, um Varianten der Proteine zu isolieren, die gewünschte Eigenschaften zeigen, basierend auf einer Variation gewählter Reste. So könnte z.B. die Spezifität oder thermische Stabilität eines Enzyms variiert werden, wenn das ursprüngliche Enzym als Gerüst verwendet wurde. Alternativ könnten Gerüstsequenzen benachbart zu dem DNA-Bindungsbestandteil eingeführt werden oder direkt darin um ein nicht benachbartes Displaypeptid oder -protein zu präsentieren. Gerüstsequenzen können an einer oder mehreren Stellen irgendwo in der Sequenz des Peptids oder Proteins lokalisiert sein, das sich an seine codierende DNA anbindet, unter der Voraussetzung, dass die Gerüstsequenz (die -sequenzen) nicht in die kovalente Bindung des codierten Peptids oder Proteins an seine DNA eingreifen.
Wie bereits vorher erwähnt, kann genetisches Material, codierend die unterschiedlichen Bibliotheksmitglieder über die Verwendung von Primern erzeugt werden, worin ein Teil des Primers variiert wird (um einen Primerarray zu erzeugen), um die oben beschriebenen Permutationen zu erzeugen. Bis zu 10¹² bis 10¹⁴ Bibliotheksmitglieder können auf diese Weise erzeugt werden. Im Fall der codierten Produkte (wie z.B. P2A und seine funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate oder Varianten), die an ihre codierende DNA über den codierenden Strang binden, um eine Transkription des Matrizenstranges und Bindung von P2A an den codierenden Strang zu ermöglichen, ist es notwendig, dass sich die endgültigen Produkte aus der Erzeugung und Amplifikation (wenn die letztere durchgeführt wird) ergeben, sowohl Matrizen als auch codierende Stränge zu sein. Dies kann z.B. durch die Verwendung von Matrizenstrangprimern erreicht werden, die Bibliothekssequenzen (d.h. einen Pool variierter Primer) enthalten, und die zusätzlich eine Matrizenstrang-Primerbindungsstelle enthalten, um eine weitere Amplifikation zu ermöglichen, falls dies nötig ist. Diese Stelle kann weiterhin als einzigartige Identifikationsstelle für die Selektion (und Amplifikation) nach dem Screening verwendet werden. Sobald ein Satz von Matrizensträngen erzeugt wurde, die die Bibliothekssequenzen enthalten, kann ein geeigneter Primer, der an den Matrizenstrang bindet, verwendet werden, um codierende Stränge zu erzeugen, die die Bibliothekssequenzen enthalten.
Die Erzeugung der Nukleinsäuremoleküle für die Herstellung der Bibliothek und/oder ihre Amplifikation kann einfach unter Verwendung einer Kombination dieser Primer simultan oder aufeinander folgend durchgeführt werden. Wenn die Amplifikation zur selben Zeit wie die Erzeugung der Bibliothek durchgeführt werden soll, kann ein einzelner Primer verwendet werden, um eine Reihe von linearen Amplifikationen durchzuführen, gefolgt von der Verwendung des zweiten Primers oder beide Reaktionen können zusammen durchgeführt werden. Primer können aus Nukleotidbasen bestehen, die derivatisiert sein können (z.B. mit einer immobilisierenden Einheit) oder alternative geeignete Bestandteile enthalten, wie z.B. von PNA abgeleitet oder Kombinationen davon.
Nukleinsäuremoleküle, die unterschiedliche Bibliotheksmitglieder codieren oder deren variable Teile, können alternativ durch Mutation oder Klonieren erzeugt werden, optional in Kombination mit Amplifikationstechniken. So kann z.B. eine anfängliche Bibliothek durch Klonieren erzeugt werden und als anfängliche Matrize verwendet werden, die weiter durch Verwendung eines Primerarrays mit Bibliothekssequenzen und/oder durch statistische Mutagenese variiert werden kann.
Von vorrangiger Bedeutung bei den Nukleinsäuremolekülen für die Herstellung der Expressionsbibliotheken der Erfindung ist der Bereich, der den DNA-Bindungsbestandteil codiert. Wie vorher erwähnt, beinhaltet dies jedes DNA-Bindungsprotein oder funktionell äquivalentes Fragment, Derivat oder eine Variante davon, die eine kovalente Bindung mit ihrem codierenden genetischen Material bildet, zur Bildung einer operativen Bindung. Abhängig davon, ob der Translationsschritt in vitro oder in vivo durchgeführt werden soll, mit einem einzelnen oder vielen Bibliotheksmitgliedern pro Wirtszelle oder Organismus, kann der DNA-Bindungsbestandteil in cis- oder Pseudo-cis-Weise wirken. Ein Beispiel eines cis-wirkenden DNA-Bindungsbestandteils, der für die Verwendung in der Erfindung geeignet ist, ist das P2A-Protein oder seine funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate oder Varianten.
Ein geeignetes Fragment, umfassend mindestens den Bereich des DNA-Bindungsproteins, der notwendig ist, um eine kovalente Bindung an die DNA zu erreichen, muss in den Nukleinsäuremolekülen, die für die Bildung der Bibliothek verwendet werden, vorliegen. Im Fall von P2A sollte z.B. das Gen, codierend das Protein, oder eine degenerierte Sequenz oder ein funktionell äquivalentes Fragment, eine Variante oder ein Derivat davon, mit geeigneten DNA-Bindungseigenschaften vorliegen. Dieses Gen kann durch Addition oder Deletion von Teilen des Gens variiert werden, wenn das resultierende exprimierte Peptid oder Protein seine funktionelle Aktivität beibehält, d.h. immer noch zu einer kovalenten Bindung an die DNA führt. Die Peptid/Protein-Bindungsstelle auf der DNA (Anbindungsstelle) kann z.B. versetzt werden oder eine zusätzliche Bindungsstelle kann eingeführt werden (z.B. wenn die Wildtyp-Bindungsstelle aufgrund einer Variation, z.B. durch Mutation, nicht mehr funktionell ist). Dies ist insbesondere wichtig um sicherzustellen, dass das Displaypeptid oder -protein an die DNA angebunden bleibt, die es codiert, wenn der DNA-Bindungsbestandteil, der verwendet wird, zusätzlich zu einer Nickbildung der DNA führt.
Weiterhin kann der Bereich, codierend das Displaypeptid oder -protein (Displaybestandteil) in die Region inseriert sein, die den DNA-Bindungsbestandteil codiert, dazu benachbart liegen oder außerhalb liegen, unter der Voraussetzung, dass der Displaybestandteil, sobald er exprimiert wird, kovalent an den DNA-Bindungsbestandteil angebunden ist, d.h. ein Teil desselben exprimierten Peptids oder Proteins ist. Dies kann ein Versetzen des Terminationskodons in einen stromabwärts gelegenen Bereich zu der Region notwendig machen, die den Displaybestandteil codiert. Wie bei der Positionierung der Proteinbindungsstelle auf der DNA sollte durch geeignetes Positionieren der Region, codierend den Displaybestandteil, sichergestellt werden, dass der Displaybestandteil an die DNA angebunden bleibt, die ihn codiert, insbesondere, wenn eine Nickbildung des DNA-codierenden Stranges beteiligt ist. Dies kann auf eine Anzahl von unterschiedlichen Weisen erreicht werden.
Eine Nickbildung tritt auf dem codierenden Strang auf und das DNA-Bindungspeptid oder -protein (gebunden an das Displaypeptid oder -protein) ist an das 5'-Ende kovalent angebunden, das während des Nickbildungsvorganges erzeugt wird. So sollte sichergestellt werden, dass das genetische Material, codierend den Displaybestandteil, auf dem Teil des codierenden Stranges getragen wird, der kovalent an das exprimierte Peptid oder Protein angebunden ist oder damit assoziiert verbleibt. Wenn DNA in doppelsträngiger Form, folgend auf die Translation und während der Selektion erhalten bleibt, dann wird der Matrizenstrang sicherstellen, dass beide codierenden Stränge mit dem DNA-Bindungsbestandteil assoziiert sind.
Alternativ kann eine zirkuläre DNA für eine Translation verwendet werden, was nach einer Nickbildung (unter nicht hybridisierenden Bedingungen) zu einem linearen codierenden Strang führt, umfassend den gesamten codierenden Strang vor der Nickbildung. Alternativ, wenn weder eine zirkuläre DNA noch hybridisierende Bedingungen verwendet werden, sollte die Proteinanbindungsstelle und die Stelle der Bibliothekssequenzen so gewählt werden, dass sich der DNA-Bindungsbestandteil kovalent an den Teil des codierenden Strangs, der den Displaybestandteil codiert, anbindet. Dies kann durch Insertion des den Displaybestandteil codierenden Bereichs am Carboxyl-codierenden terminalen Ende der Anbindungsstelle erreicht werden (wobei die letztere auch von ihrer natürlichen Position versetzt werden kann). Dies wird besonders vereinfacht durch Insertion in einen stromaufwärts gelegenen Bereich von der natürlich auftretenden Anbindungsstelle erreicht, d.h. am Carboxyl-codierenden Ende. Der Bereich, der den Displaybestandteil codiert, kann jedoch am Aminoende eingeführt werden, wenn die Anbindungsstelle ebenfalls stromaufwärts verlagert ist.
Falls notwendig, kann die Anbindungsstelle so verlagert werden, dass sie der gesamten codierenden Region vorgeschaltet ist. Wenn die Region, die den Displaybestandteil codiert, am Aminoende eingefügt werden soll, sollten, um eine Transkription sicherzustellen, wenn die Bibliothekssequenzen durch Primer eingeführt werden, Megaprimer verwendet werden, die zusätzlich mindestens einen geeigneten Promotor und ein Initiationskondon umfassen, die den Bibliothekssequenzen vorgeschaltet sind.
Bibliothekssequenzen können in den codierenden Bereich inseriert werden, anstatt am Amino- oder Carboxylende, z.B. durch Amplifikation von zirkularisierter DNA unter Verwendung von Primern, die mit der codierenden Sequenz hybridisieren, zusätzlich jedoch Bibliothekssequenzen in einem nicht hybridisierenden Bereich enthalten. Nach Verlängerung unter Verwendung eines solchen Primers kann ein geeigneter Primer gewählt werden, um einen hybridisierenden Strang zu erzeugen, worin die terminalen Stränge des doppelsträngigen Verlängerungsprodukts (nach der Hybridisierung) glatt gemacht wurden oder nach Verdau mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease einen Überhang zeigen, so dass eine Ligation zur Erzeugung von DNA-Molekülen mit intern inserierten Bibliothekssequenzen durchgeführt werden kann.
Wenn Proteine ausgestellt werden sollen, z.B. als Gerüst, dann wird anerkannt werden, dass das Displayprotein in die Codierungssequenz oder eine relevante Stelle inseriert werden sollte und darauf folgend an spezifischen Resten oder Regionen variiert wird, um die Bibliothek zu erzeugen.
Zusätzlich sollte die Positionierung des Bereichs, codierend den Displaybestandteil, durch die Toleranz des codierten Peptids oder Proteins bestimmt werden, insbesondere des DNA-Bindungsbestandteils, und zwar gegenüber Insertionen oder Ersatz an dieser Stelle.
Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können zusätzlich weitere Merkmale wie Antibiotika-Resistenzmarker umfassen. Das Gen für eine β-Lactamase kann z.B. eingefügt werden, wenn die Schritte der Amplifikation und/oder Translation/Transkription und/oder Screening und/oder Isolation eine Transformation involvieren, um eine Identifizierung und Selektion (durch die Antibiotikaresistenz) geeigneter Transformanten zu ermöglichen.
Die Moleküle können alternative Marker oder Reportermoleküle enthalten (z.B. radioaktiv markierte Nukleotide oder einen Partner eines Bindungspaars, wie z.B. Streptavidin:Biotin), so dass die Gegenwart oder Identität der Nukleinsäuremoleküle sichergestellt werden kann. Die Marker oder Reportermoleküle können auch als Werkzeug für eine Immobilisierung und/oder Reinigung der Nukleinsäuremoleküle verwendet werden, z.B. kann eine Streptavidin-tragende Säule im Fall eines Biotin-Markers zum Sammeln der Moleküle verwendet werden. Zusätzlich können Nukleinsäuremoleküle, die die Bibliothek codieren, nicht-natürliche Nukleotide oder methylierte Basen beinhalten, insbesondere in den flankierenden Sequenzen, um die DNA in den Zelllysaten und/oder während der Selektion zu stabilisieren.
In geeigneter Weise kann jeder der in den oben beschriebenen Verfahren verwendeten Primer auch eine angebundene Immobilisierungseinheit, wie z.B. Biotin, enthalten, um es den Verlängerungsprodukten (dem genetischen Material, codierend die Bibliothek) zu ermöglichen, in den späteren Schritten einfach isoliert zu werden. Falls geeignet, können die Primer weiterhin mit Merkmalen versehen sein, die in die resultierende Nukleinsäuremoleküle eingebaut werden sollen, z.B. Promotorsequenzen, Terminationssequenzen, Gene, die für eine Antibiotika-Resistenz benötigt werden.
Sobald Nukleinsäuremoleküle, codierend die Bibliothek, erzeugt wurden, kann die Bibliothek durch die Schritte der (i) Amplifikation des genetischen Materials, (ii) Transkription und (iii) Translation erzeugt werden, wobei die letzteren beiden Schritte in der Regel gekoppelt werden. Abhängig davon, ob eine cis- oder Peudo-cis-DNA-Bindungsproteinfunktion verwendet wird, können diese Schritte in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Wenn cis-Bindungsproteine verwendet werden, kann jeder Schritt entweder in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Wenn Pseudo-cis-Bindungsproteine verwendet werden, kann die Amplifikation in vitro oder in vivo durchgeführt werden, jedoch müssen Transkription und Translation in vivo durchgeführt werden.
Die Amplifikation kann in vitro während der Erzeugung des genetischen Materials von der Bibliothek durchgeführt werden, wenn z.B. Primer und PCR verwendet werden, um die Moleküle zu erzeugen. Alternativ oder zusätzlich können die Nukleinsäuremoleküle durch konventionelle in vitro-Amplifikationsverfahren, wie z.B. PCR, NASBA (auch als 3SR bekannt) (siehe Malek et al. (1994), Methods Mol. Biol., 28, S. 253–260; Gebinoga & Oehlenschlager (1996), Eur. J. Biochem., 235, S. 256–261; und Ehricht et al. (1997), Eur. J. Biochem., 243, S. 358–364) oder lineare Amplifikation vervielfältigt werden. Alternativ kann die Replikation in vitro unter Verwendung von zellfreien Extrakten (siehe z.B. Kool, 1996, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. USA 25, S. 1–28) durchgeführt werden oder in vivo nach Insertion der Nukleinsäuremoleküle in Wirtszellen oder Organismen, z.B. durch Transfektion.
Wenn die Replikation in vitro durchgeführt wird, sollte der zellfreie Extrakt in geeigneter Weise gewählt werden, z.B. sollte er dNTPs enthalten. Die Zirkularisierung kann vor der Transfektion oder Replikation, wenn nötig, durchgeführt werden.
Weiterhin kann, wie unten erwähnt, zur Vermeidung einer Ablösung des DNA-Bindungsproteins, die während der Replikation auftritt, eine nicht-ablösbare Mutante notwendig werden. Die Nukleinsäuremoleküle können bereits in Wirtszellen oder Organismen existieren, wenn ihre Erzeugung durch Mutation durchgeführt wurde.
Die Erzeugung der Bibliothek, die das Displaypeptid exprimiert, kann in vivo durch Züchten transformierter Zellen oder Organismen durchgeführt werden. Geeignete Organismen für diesen Zweck beinhalten Bakterien (wie z.B. E. coli), Viren, Bacteriophagen und Zellen, wie z.B. Hefe, oder prokaryontische, eukaryontische Zellen oder Archaebakterien, die verwendet werden können. Um die Expressionsbibliothek freizusetzen, sollten die Zellen oder Organismen dann lysiert werden, um die Protein/Peptid:DNA-Expressionseinheiten und/oder das genetische Material, codierend die Bibliothek, freizusetzen und zu reinigen (z.B. Plasmid oder Minichromosom) vor der Transkription/Translation. Wie hier verwendet, soll die Bezeichnung "Bibliothek" jedoch eine Sammlung von Bibliotheksmitgliedern beinhalten, die immer noch in ihren Wirtszellen oder Organismen enthalten sind, wenn sie in vivo erzeugt wurden, wie auch solche Bibliotheksmitglieder, die nach der Freisetzung existieren, falls in vivo erzeugt, oder falls in vitro erzeugt.
In vitro kann eine gekoppelte Transkription/Translation in zellfreien Extrakten durchgeführt werden. Dies kann in geeigneter Weise in zellfreien Extrakten von Prokaryonten oder Eukaryonten durchgeführt werden, z.B. von E. coli (Nevin & Pratt (1991), FEBS, 291, S. 259–263). Prokaryontische (z.B. E. coli, S-30 oder S-135) und eukaryontische (z.B. Weizenkeimlinge oder Reticulocyten) zellfreie Extrakte sind kommerziell erhältlich (Amersham/Promega). Abhängig von dem Konstrukt der DNA-Moleküle und ob ein Nickbildungsprotein codiert wird, kann es notwendig sein, die DNA vor der Translation zu zirkularisieren, um sicherzustellen, dass der Displaybestandteil an seiner codierenden DNA assoziiert verbleibt.
Unabhängig davon, ob in vivo oder in vitro durchgeführt, sollte der Transkriptionsprozess, wenn ein induzierbarer Promotor verwendet wurde, induziert werden.
Es wurde festgestellt, dass die Bindung bestimmter DNA-Bindungsproteine (z.B. P2A) in vitro verbessert werden kann, z.B. durch Veränderung der Eigenschaften der Anbindungsstelle. Alternativ können spezifische Cofaktoren (z.B. spezifische Wirtsproteine) notwendig sein, um die Bindung und die Aktivität der DNA-Bindungsproteine zu verstärken. Vorzugsweise sollte die Anbindungsstelle einzelsträngig sein. Dies kann auf eine Anzahl unterschiedlicher Weisen bewirkt werden, z.B. kann bei der Verwendung doppelsträngiger DNA eine Schleife oder Öffnung an der Anbindungsstelle eingeführt werden. Ein Mis-Match-Oligonukleotid kann während der Translationsreaktion eingefügt werden, das an den codierenden Strang an beiden Seiten benachbart zur Anbindungsstelle hybridisiert. In dem Bereich, der die Anbindungsstelle auf dem codierenden Strang enthält, ist der korrespondierende Teil des Mis-Match-Oligonukleotids zur Hybridisierung nicht in der Lage und macht so den codierenden Strang auf effektive Weise über diesen Bereich einzelsträngig. Die Verwendung eines Mis-Match-Primers bildet einen bevorzugten Aspekt der Erfindung.
Dieser Mis-Match-Bereich kann sich über die Länge des Anbindungsbereichs erstrecken oder kann sich über diesen Bereich hinaus erstrecken, z.B. kann diese Fehlpaarung über einen Bereich von 10 Nukleotiden auftreten. Zum Beispiel kann im Fall der P2A-Anbindungstelle (TCGGA, vorliegend in der Sequenz 5'-AGCGGCATCGCCGCGCCTCGGAGTCCTGTC-3'), ein Mis- Match-Oligonukleotid, enthaltend eine Sequenz, wie z.B. 3'-TCGCCGTAGCGGCGTAAGATTCTAGGACAG-5' verwendet werden, worin die Fehlpaarungsregion unterstrichen ist.
Alternativ können geeignete Primer bei der Erzeugung von Nukleinsäurematerial, codierend die Bibliothek und/oder die Amplifikation zur Einführung eines einzelsträngigen Bereichs an der Anbindungsstelle verwendet werden. Dies kann z.B. durch Verwendung eines Primers, der einen. Mis-Match-Bereich zu der Anbindungsstelle aufweist, durchgeführt werden. Wenn die Anbindungsstelle sich im codierenden Bereich des DNA-Bindungsbestandteils befindet, sollte dann die Sequenz der Fehlpaarung so gewählt werden, dass sie die Aminosäuresequenz, codiert durch die DNA, nicht beeinflusst und sollte daher eine leise Variation sein, d.h. eine Variation des Kodons in der 3. Position, codierend jedoch dieselbe Aminosäure. Es wurde von den gegenwärtigen Erfindern festgestellt, dass eine verbesserte Anhaftung beobachtet wurde, wenn ein Mis-Match in dem Matrizenstrang, korrespondierend zur Anbindungsstelle auf dem codierenden Strang vorlag.
Wenn die Anbindungsstelle alternativ sich am Ende des codierenden Bereiches befindet und ein Mis-Match-Primer verwendet wird, können geeignete Primer nach dem Screeningschritt gewählt werden, so dass während der Amplifikation die Anbindungsstelle wieder hergestellt wird.
Alternativ, wenn die Anbindungsstelle am Ende der DNA gebildet wird, kann die doppelsträngige DNA in diesem Bereich durch Verdau mit einer Restriktionsendonuklease einzelsträngig gemacht werden, die eine 5'-Verlängerung, enthaltend die Gesamtheit oder einen Teil der Anbindungsstelle, zurücklässt. Das Enzym HgaI lässt z.B. einen 5-Basen-5'-Überhang 5 Nukleotide von der HgaI-Erkennungsstelle zurück. Wenn dieser Bereich zu klein ist, dann kann ein größerer Bereich einzelsträngig durch Einbau von nicht natürlichen Basen in einen Primer für die Amplifikation (z.B. Desoxyuridinen) einzelsträngig gemacht werden, gefolgt von der Verwendung von DNA-Reparaturenzymen, wie z.B. Uracil-DNA-Glycosylase oder T4-Endonuklease, um spezifische Nukleotide auszuschneiden, und einen einzelsträngigen Bereich zurückzulassen (Watson & Bennet (1997), BioTechniques, 23, S. 858–864).
Wenn die Erfindung unter Verwendung bestimmter cis-Bindungsproteine, wie z.B. P2A, durchgeführt wird oder ihrer funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate oder Varianten wird, während der DNA-Bindungsbestandteil sich kovalent an die codierende DNA assoziieren wird, wird dies ein kinetisches Intermediat darstellen und wenn die Replikation auftritt, wird sich das Peptid oder Protein an den codierenden Strang religieren und sich von diesem Strang ablösen, und sich auf eine weitere codierende Sequenz mit einer intakten Anbindungsstelle übertragen. Die Replikation kann in vitro vermieden werden, jedoch stellt dieser Transfer ein potentielles Problem in den Fällen dar, in denen die Translation in vivo durchgeführt wird.
Um dies zu vermeiden, kann eine Mutante verwendet werden, die sich nicht ablöst. Die Verwendung eines modifizierten Bindungsbestandteils, der kovalent an seine codierende DNA in den Verfahren der Erfindung angebunden bleibt, bildet einen bevorzugten Aspekt der Erfindung. Zum Beispiel im Fall von P2A kann Y450F, das eine Substitution des Tyrosins an Aminoposition 450 des A-Proteins durch Phenylalanin umfasst, verwendet werden. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass, wenn die Translationsreaktion in vitro durchgeführt wird unter der Voraussetzung, dass eine Replikation auftritt (z.B. durch Sicherstellung, dass keine dNTPs vorliegen) und das Wildtypprotein wird assoziiert an die DNA bleiben, die es codiert, was die Durchführung des Screenings ermöglicht.
Eine wie hier beschrieben erzeugte Bibliothek kann für jede der Anwendungen verwendet werden, für die konventionell in vivo oder in vitro Displaybibliotheken auf dem Gebiet verwendet werden. Solche Verwendungen sind in der Literatur gut dokumentiert. Die Bibliothek der Erfindung kann z.B. zur Identifizierung eines Peptids oder Proteins verwendet werden, das sich spezifisch an ein Zielmolekül bindet.
Es ist auf dem Gebiet bekannt, dass Peptide unterschiedlicher Größe in einer geeigneten tertiären Struktur angeordnet werden können, um eine Domäne zu erzeugen, die bestimmte sterische oder Ladungseigenschaften aufweist. Eine solche Domäne kann z.B. durch ihre spezifische tertiäre Anordnung ein bestimmtes Zielmolekül spezifisch erkennen oder daran binden. Beispiele für solche Peptide beinhalten Bindungsregionen von Proteinen und die variablen Bindungsregionen von Antikörpern sind jedoch nicht darauf begrenzt. Solche kleinen Peptide ohne definierte tertiäre Struktur können ebenfalls spezifische Zielbindungseigenschaften aufweisen. Die Peptide zur Ausstellung durch die Bibliothek der Erfindung können so kleine Peptide sein, z.B. mit bis zu 40 Aminosäuren, z.B. 5 bis 30, vorzugsweise 7 bis 20 und noch bevorzugter 10 bis 15 Aminosäureresten, die keine fixierte tertiäre Struktur aufweisen oder können größere Peptide sein, die eine fixierte tertiäre Struktur bilden.
Alternativ kann die Bibliothek Displayproteine (die einen Teil des Polypeptids bilden, enthaltend den DNA-Bindungsbestandteil) exprimieren, worin nur bestimmte Reste in den unterschiedlichen Bibliotheksmitgliedern variiert sind. Zum Beispiel kann ein Protein mit einer definierten Spezifität, wie z.B. ein Antikörper oder ein Rezeptor, die Basis einer Bibliothek bilden, worin z.B. 5 bis 30, vorzugsweise 7 bis 20 Aminosäurepositionen in der Bibliothek variiert sind und Displayproteine, die eine veränderte Spezifität zeigen, können gewählt werden.
Zielmoleküle können kleine chemische Verbindungen beinhalten, z.B. Heterocyclen oder pharmazeutische Verbindungen, Polypeptide, Proteine, Polynukleotide oder jede Einheit mit distinkten Oberflächeneigenschaften, die spezifisch erkannt werden können. So können z.B. spezifische Zielbindungsproteine oder -peptide identifiziert werden, die eine Nützlichkeit in diagnostischen Assays aufweisen würden, z.B. in klinischen Verfahren, um das Niveau biologischer oder nicht biologischer Moleküle im menschlichen Körper oder in Proben, Extrakten oder davon abgeleitetem Material zu bestimmen oder in Assays, die das Niveau von biologischem oder nicht-biologischem Material in anderen nicht biologisch abgeleiteten Materialien sicherstellen.
Erfindungsgemäße Bibliotheken haben auch ihre Nützlichkeit in Screening-Protokollen für die Identifizierung von Verbindungen mit geeigneten biochemischen, biologischen oder Struktureigenschaften, z.B. zur Identifizierung von Peptiden oder Proteinen, die bestimmte biochemische Aktivitäten in einem definierten Assay aufweisen. Durch dieses Verfahren können Peptide oder Proteine mit enzymatischen, inhibitorischen oder stimulierenden Eigenschaften identifiziert werden, die z.B. eine Nützlichkeit auf dem pharmazeutischen Gebiet aufweisen. Enzymatische Aktivitäten können z.B. durch Überwachung von z.B. erhöhter oder erniedrigter Bioaktivität gescreent werden, wie z.B. eine Chemifluoreszenz, Nukleaseaktivität, Phosphotransferaseaktivität, Inhibition usw. Wenn Gerüstpolypeptide mit bekannter Aktivität verwendet werden, können Varianten mit veränderten Eigenschaften oder Aktivitäten aus der Bibliothek gewählt werden.
Solche Peptide oder Proteine können, sobald sie aus der Bibliothek identifiziert wurden, für die Herstellung von Verbindungen mit einer bestimmten Aktivität verwendet werden, z.B. Inhibitoren, Aktivatoren oder Katalysatoren bestimmter Reaktionen oder Interaktionen.
Im allgemeinen werden Peptide oder Proteine von Interesse aus der Bibliothek gemäß dem folgenden Protokoll identifiziert, beinhaltend die Schritte des (i) Screening, (ii) der Isolation und/oder Reinigung, (iii) der Evolution, (iv) der Amplifikation, (v) der Herstellung einer Bibliothek für ein Re-Screening (beinhaltend Transkription und Translation), (vi) ein Re-Screening (und nachfolgend die Schritte (ii) bis (vi) so oft wie nötig) und (vii) Isolierung des genetischen Materials von Interesse. Die Schritte (ii) und/oder (iii) und/oder (iv) können jedoch je nach Bedarf weggelassen werden.
Unabhängig davon, ob cis-wirkende oder pseudo-cis-wirkende Proteine verwendet werden, müssen die Screening- und Isolierungsschritte in vitro durchgeführt werden. Wenn cis-wirkende Bindungsproteine oder ihre funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate oder Varianten verwendet werden, können die verbleibenden Schritte in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Wenn jedoch pseudo-cis-wirkende Proteine oder ihre funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate oder Varianten verwendet werden, muss mindestens ein Teil von Schritt (v), nämlich die Transkription und Translation in vivo durchgeführt werden.
Das Screening, das in vitro durchgeführt werden muss, involviert die Verwendung eines geeigneten Assays, wie z.B. einer Affinitätsbindung, Phasentrennung oder eines enzymatischen Assays, zur Identifizierung von Displaypeptiden oder -proteinen von Interesse, wie hiernach im Detail beschrieben. Eine Phasentrennung (siehe z.B. Garg et al., 1994, Biotech, Appl. Biochem., 20, S. 119–215) hat verschiedene Anwendungen für die Identifizierung von Displaypeptiden/-proteinen, die sich in die organische Phase abtrennen (z.B. Triton X-114) als Resultat einer Variation innerhalb der Bibliothek. Dieses Verfahren hat eine mehr allgemeine Anwendbarkeit, wenn die organische Phase, z.B. das Detergens, modifiziert wird, um einen geeigneten Bindungspartner für das Zielausstellungspeptid oder -protein, z.B. einen Antikörper oder ein Antigen, zu tragen.
Die Identifizierung veränderter enzymatischer Eigenschaften verlässt sich auf veränderte physikalische Eigenschaften, z.B. eine Bindung an ein Substrat oder eine Exposition einer vorher nicht zugänglichen Stelle, z.B. durch eine Proteaseaktivität oder Phosphorylierung.
Die Bindung des Displaypeptids oder -proteins an einen geeigneten Bindungspartner kann durch jedes geeignete Mittel identifiziert werden, z.B. durch Affinitätsbindung und Elution oder Nachweis der enzymatischen Aktivität, z.B. Erzeugung des Reaktionsprodukts. So können Bibliotheken der Erfindung zur Identifizierung von Bindungspartnern verwendet werden, worin das exprimierte Peptid oder Protein einer der Bindungspartner ist. Auf diese Weise können die Bibliotheken der Erfindung vollständig in vitro-Alternativen zu Techniken darstellen, wie z.B. das Zwei-Hybridsystem. In einem solchen System werden zwei Hybridmoleküle erzeugt, worin jedes Molekül eines des Bindungspaars trägt (z.B. ein Enzym und Substrat). Wenn diese Bindungspartner binden, werden die anderen funktionellen Teile der Fusionsproteine zusammengebracht. Durch geeignete Wahl dieser funktionellen Bestandteile der Fusionsproteine kann eine nachweisbare Interaktion identifiziert werden.
Dieser Systemtyp wird z.B. von Field & Song (1989, Nature, 340, S. 245–246) beschrieben, worin die Fusionsproteine unterschiedliche Teile von GAL4 von Saccharomyces cerevisiae enthalten, wobei die Komponenten, wenn sie durch Bindung der auf den Fusionsproteinen exprimierten Bindungspartner zusammengebracht werden, GAL4 rekonstituieren, so dass seine Transkriptionsaktivierungsaktivität beobachtet werden kann. Dies bedeutet so eine Bindung zwischen den Bindungspartnern der Fusionsproteine. Gyuris et al., 1993, Cell, 75, 5. 791–803, beschreiben ähnliche Komplementierung der Komponenten eines Transkriptionsaktivators. Weiterhin wurde die Komplementierung unter Verwendung von β-Galactosidasedeletionsmutanten von Rossi et al. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, S. 8405–8910) beschrieben. Die Komplementierung kann auch so erreicht werden, dass das zweite Fusionsprotein ein komplexerer Bestandteil ist, jedoch die oben beschriebenen Merkmale aufweist, d.h. ein Partner des Bindungspaars und ein funktioneller Bestandteil, die mit einem funktionellen Bestandteil auf dem ersten Fusionsprotein in Wechselwirkung treten. Ein Beispiel hierfür wird von Krebber et al. bereitgestellt (1997, J. Mol. Biol., 268, S. 607–618), worin ein nicht-infektiöser Phage durch Bindung eines Fusionsproteins durch geeignete Bindungspartner infektiös gemacht wird. Aronheim et al. (1997, Mol. Cell Biol., 17, S. 3094–3102) beschreiben ein System, worin das zweite Fusionsprotein äquivalent einen Bindungspartner aufweist, der in der Natur eine Nukleinsäure ist, und der funktionelle Bestandteil ist ein Protein, das in der Plasmamembran vorliegt, an die der Bindungspartner gebunden ist.
So kann die Bibliothek der Erfindung ein Fusionsprotein exprimieren, mit einem Bestandteil, verantwortlich für eine Bindungsinteraktion (die Gesamtheit oder ein Teil des Displaypeptids oder -proteins), und einem zweiten Bestandteil, der an der Komplementierung beteiligt ist. Ein zweites Fusionsprotein (oder eine geeignete Einheit), das den Bindungspartner trägt und die Komponente, benötigt für die Komplementierung, können ein Teil der Bibliothek bilden oder können der Bibliothek zugefügt werden. Der Bindungspartner von ein oder beiden Fusionsproteinen kann in der Bibliothek variiert werden.
Abhängig von dem Konstrukt der Nukleinsäuremoleküle der Erfindung, wie oben erwähnt, kann es notwendig sein, das Screening unter hybridisierenden Bedingungen durchzuführen.
Die Bibliothek kann vor dem Screening modifiziert werden, z.B. durch Modulation der Faltung der ausgestellten Peptide oder Proteine durch Zugabe von Enzymen, wie z.B. Chaperonen (z.B. hsp70), oder durch Faltungsmodifikatoren, wie z.B. Proteindisulfidisomerase, oxidierende Mittel oder Enzyme, die die oxidierende Aktivität des bakteriellen Cytoplasmas oder von Translationsextrakten verändern. Weiterhin können sowohl homooligomere als auch heterooligomere Proteine gescreent werden. Der Signalerkennungsteilchenrezeptor (SR) ist z.B. ein Heterodimer aus Untereinheiten, die SR-alpha und SR-beta genannt werden und Bibliotheksexprimierende Varianten von nur einer der Untereinheiten können exprimiert werden. Die Varianten können dann auf eine gewünschte Eigenschaft hin überprüft werden, unabhängig von der anderen Untereinheit oder auf eine Eigenschaft, abhängig von einer vorherigen Heterodimerbildung mit der anderen Untereinheit.
Ein klassisches Beispiel der Heterodimerbildung wird durch die schweren und leichten Ketten eines Antikörpers bereitgestellt. In diesem Fall kann z.B. nur eine Kette in der Bibliothek vorliegen und die andere Kette könnte während dem Assay zugeführt werden. Zusätzlich zu einem Polypeptid können ein Metall, Porphyrine, Cofaktoren, DNA, RNA und andere Moleküle alle auf der Screeningstufe zugefügt werden, um die Eigenschaften des ausgestellten Peptids oder Proteins zu verändern.
Folgend auf das Screening müssen die Displaypeptide oder -proteine von Interesse aus dem Pool der Bibliothek entfernt werden (Isolation) und optional gereinigt werden. In bestimmten Fällen kann dies während des Screenings erreicht werden, z.B. durch die Verwendung von Affinitätssäulen.
Die Evolution der gewählten DNA-Moleküle kann durchgeführt werden, um weitere Variationen in der Bibliothek zu erzeugen, die die gewünschten Eigenschaften in einem größeren Ausmaß zeigen. Dies wurde im Stand der Technik durchgeführt, um eine Fucosidase von einer Galactosidase zu entwickeln (siehe Zhang et al. (1997), PNAS USA, 94, S. 4504–4509) oder um eine spezifische enzymatische Funktion zu verändern (siehe Crameri et al. (1997), Nature Biotechnology, 15, S. 436–438; You & Arnold (1996), Protein Eng., 9, S. 77–83).
Evolution kann durch Einführung zusätzlicher neuer Mutationen an zufälligen Stellungen chemisch unter Verwendung von irgendeiner einer Anzahl von Verfahren, die auf dem Gebiet bekannt ist, durchgeführt werden; genetisch unter Verwendung von Mutatorstämmen von Bakterien (Degnen & Cox (1974), J. Bact., 117, S. 477–487), bakteriellen Stämmen, die Aminosäuresubstitutionen einführen, wobei Suppressor tRNAs verwendet werden (Markiewicz et al. (1994), J. Mol. Biol., 240, S. 421–433), durch mutagene PCR-Verfahren, wie z.B. regionale Kodonrandomisierung (Cormack & Struhl (1993), Science, 262, S. 244–248) oder durch Verwendung von eines der Standardverfahren, um die Zuverlässigkeit der Polymerase, die in der PCR-Reaktion verwendet wird, oder der reversen Transkriptase in NASBA zu erniedrigen. Mis-Match-Primer- oder Megaprimer-Bibliotheken können verwendet werden, um Substitutionen an definierten Stellen einzuführen. Die gewählten Bibliotheksmitglieder, enthaltend unterschiedliche unabhängige Variationen, können auch unter Verwendung eines DNA-Shufflings rekombiniert werden (Stemmer (1994), Nature, 370, S. 389–391) oder durch traditionellere Klonierungsverfahren.
Folgend auf die Isolierung oder Evolution, falls diese durchgeführt würde, werden die gewählten Bibliotheksmitglieder oder entwickelten Bibliotheksmitglieder amplifiziert (falls nötig) und eine Bibliothek für ein Re-Screening unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zur Erzeugung der Bibliothek hergestellt. Als Konsequenz davon, dass ein Peptid oder Protein an das genetische Material der Bibliothek gebunden ist, kann es, um das genetische Material in geeigneter Form für die darauf folgenden Schritte zu erhalten, z.B. die Transformation, notwendig sein, den codierenden Bereich in ein unterschiedliches DNA-Molekül zu entfernen, wie z.B. einen Vektor. Das Re-Screening kann dann so oft wie nötig durchgeführt werden, um die gewählte Population zu stabilisieren, optional unter Erhöhung der Stringenz des Screenings oder der Einführung weiterer Variationen (z.B. in vitro-Evolution).
Sobald das Screening abgeschlossen ist, kann das genetische Material, codierend das gewählte Peptid oder Protein, isoliert werden, z.B. durch Reinigung des Plasmids oder Minichromosoms. Optional können die gewählten Bibliotheksmitglieder vor der Isolation amplifiziert werden, z.B. durch Transformation und Kultur oder durch PCR.
Aus dem Obigen wird deutlich, dass verschiedene Verfahren verwendet werden können, um die Bibliothek der Erfindung zu erzeugen und einem Screening zu unterziehen. Die folgenden Schemata werden jedoch bevorzugt. Wenn cis-Bindungsproteine oder ihre funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate oder Varianten verwendet werden, sollten um ein möglich schnelles und effizientes Protokoll (wie vorher beschrieben) zu gewährleisten, alle Schritte in vitro durchgeführt werden. Da in solchen Fällen keine lebenden Organismen nötig sind, wird anerkannt werden, dass das gesamte Verfahren einer Automatisierung zugänglich ist. Weiterhin ist es nicht notwendig, Bedingungen und Vorgänge zu verwenden, die gewählt werden, um die Lebensfähigkeit des Organismus sicherzustellen.
Vorzugsweise werden die genetischen Konstrukte, die für die Erzeugung der Expressionsbibliothek verwendet werden, unter Verwendung von Primern (mit Bibliothekssequenzen) konstruiert, die die Bibliothekssequenzen an das Carboxylende des DNA-Bindungsbestandteils anhaften oder darin inserieren. Dies vermeidet den Bedarf an Hybridisierungsbedingungen während Translation oder Zirkularisierung vor der Translation, wenn DNA-Bindungsbestandteile verwendet werden, die sich in ähnlicher Weise wie P2A verhalten.
Es wird weiterhin bevorzugt, wenn DNA-Bindungsproteine oder funktionell äquivalente Fragmente, Varianten oder Derivate davon verwendet werden, die zu einer Ablösung von der DNA, durch die sie codiert werden, neigen, das DNA-Bindungsprotein zu mutieren, z.B. Y450F, wie hier beschrieben, so dass das Protein oder sein Fragment, seine Varianten oder Derivat sich daran binden wird, jedoch nicht abgelöst wird (so die operationale Bindung zwischen der DNA und ihrem codierten Produkt aufrechterhält). Zusätzlich könnte eine weitere ori-Stelle notwendig sein, um die Replikation zu ermöglichen. Das Konstrukt sollte so weiterhin induzierbare Promotoren enthalten.
Vorzugsweise stammt der DNA-Bindungsbestandteil von dem P2A-Protein oder einem funktionell äquivalenten Fragment, einer Variante oder einem Derivat davon ab. Während der Translation kann die Verwendung eines Mis-Match-Oligonukleotids wünschenswert sein. Die Gegenwart von mindestens einem Antibiotikaresistenzmarker wird ebenfalls für die endgültige Transformation der gewünschten Nukleinsäuresequenz in die Wirtszellen, sobald isoliert, bevorzugt.
Wenn Pseudo-cis-Bindungsproteine oder ihre funktionell äquivalenten Fragmente, Derivate oder Varianten bei der Erzeugung der Bibliothek verwendet werden, wird die Amplifikation des genetischen Materials vorzugsweise in vitro durch geeignete Verfahren wie PCR durchgeführt. Die bevorzugten Konstrukte sind diejenigen, worin die Bibliothekssequenzen am Carboxylende der Region auftreten, codierend den DNA-Bindungsbestandteil, um die Verwendung von Megaprimern zu vermeiden und Probleme in dem Fall, dass eine Nickbildung des DNA auftritt. Die Gegenwart von Genen, codierend für Antibiotikaresistenzmarker, und ein induzierbarer Promotor wird ebenfalls bevorzugt. Während des Screenings wird es bevorzugt, dass die Amplifikation ebenfalls in vitro durchgeführt wird.
So stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Reinigung eines Bibliotheksmitglieds bereit, das die gewünschten Eigenschaften ausübt, aus einer Peptid- oder Proteinexpressionsbibliothek, wie vorher definiert, wobei das Verfahren mindestens die Schritte von a) Screening einer Bibliothek der Erfindung und b) Selektion und Isolierung des relevanten Bibliotheksmitglieds umfasst. Das Verfahren kann auf die Isolierung des Peptids oder Proteins ausgedehnt werden, das die gewünschte Eigenschaft ausübt oder der DNA, die es codiert, durch den zusätzlichen Schritt der Isolierung des Peptids, Proteins oder der codierenden DNA aus dem isolierten Bibliotheksmitglied.
In den Fällen, in denen die gewünschte Eigenschaft die Fähigkeit zur Bindung an ein Ziel ist, können Zielmoleküle, vorzugsweise in gereinigter Form, verwendet werden, um ein spezifisches Zielbindungspeptid oder -protein tragendes genetisches Konjugat aus der Bibliothek auf eine Anzahl unterschiedlicher Weisen zu selektieren. Geeigneter Weise kann das Ziel an einen festen Träger angebunden sein und als Affinitätsmatrix verwendet werden. Vielzählige feste Träger und Verfahren für die Anbindung von Molekülen auf direkte oder indirekte Weise, kovalent oder nicht-kovalent (z.B. durch Streptavidin-Biotin- oder IgG-Protein A-Kopplung) sind auf dem Gebiet wohl bekannt und in der Literatur gut beschrieben.
So können z.B. Träger in Form von Mikrotitervertiefungen, Röhren, Tauchstäbchen, Teilchen, Fasern oder Kapillaren verwendet werden. Vorteilhafter Weise kann der Träger magnetische Teilchen, z.B. die superparamagnetischen Teilchen, die von Dynal AS erzeugt werden (Oslo, Norwegen, verkauft unter der Marke DYNABEADS), umfassen.
Für die Selektion kann die Expressionsbibliothek mit dem Ziel, angebunden an einen festen Träger, kontaktiert werden. Der Träger kann gewaschen werden, um Mitglieder der Bibliothek zu entfernen, die nicht das Ziel binden oder aus der Expressionsbibliothek extrahiert werden, wie geeignet für den verwendeten Träger. Gewählte Peptid/Protein:DNA-Konjugate können dann von dem festen Träger freigesetzt werden, falls nötig, durch Auflösung der Bindung zwischen den Zielmolekülen und dem festen Träger oder Zielmolekülen und Peptid/Protein:DNA-Konjugaten für die darauf folgende Amplifikation oder Isolierung des genetischen Materials. Alternativ kann die Amplifizierung in situ ohne Aufbrechen der Ziel-an-Peptid/Protein:DNA-Konjugatbindung durchgeführt werden oder durch Freisetzung des genetischen Materials aus dem Konjugat.
Das Zielmolekül kann auch als freies Mittel in Abwesenheit eines Trägers verwendet werden. Die Selektion kann dann durch Entfernung von nicht-gebundenen Konjugaten durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung von Antikörpern, die gegen einen Bereich des exprimierten Peptids oder Proteins gerichtet sind, der in allen Mitgliedern der Bibliothek vorliegt und der nur zugänglich ist, wenn er nicht an die Zielmoleküle gebunden ist. Zielmoleküle können alternativ mit einem Mittel für eine Immobilisierung versehen sein, so dass dies zur Entfernung des Ziels und gebundenen Peptid/Protein:DNA-Konjugaten nach Mischen des Ziels und der Bibliothek verwendet werden kann. Solche Immobilisierungsmittel können z.B. einen Teil eines Kopplungspaars bilden, z.B. Streptavidin-Biotin, angebunden an das Zielmolekül und der andere Teil angebunden an den für die Gewinnung zu verwendenden Träger.
So stellt die Erfindung in noch einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Identifizierung eines spezifischen Zielbindungspeptids oder -proteins bereit, wobei das Verfahren mindestens die Schritte von a) Screening einer Bibliothek der Erfindung mit Zielmolekülen und b) Selektion und Isolierung eines Bibliotheksmitglieds, das an das Zielmolekül bindet und c) Isolierung des Peptids oder Proteins, das spezifisch an das Zielmolekül bindet, umfasst. Ein Verfahren der Isolierung von DNA, codierend ein spezifisches Zielbindungspeptid oder -protein wird auch bereitgestellt, worin nach Schritt b) oben die DNA, die das Peptid oder Protein exprimiert, das spezifisch an das Zielmolekül bindet, isoliert wird.
Mehr als ein Screening-Zyklus und eine Selektion können notwendig sein, um ein Zielbindungspeptid oder -protein der gewünschten Spezifität zu erhalten.
Ähnlich kann die Bibliothek einem Screening unterzogen werden, um ein Protein oder Peptid mit bestimmten funktionalen Attributen zu identifizieren, z.B. einer enzymatischen Aktivität.
Ein gewähltes Peptid oder Protein, angebunden an die codierende DNA, kann durch Abtrennung von dem genetischen Material isoliert werden, kann durch Transkription und Translation des genetischen Materials synthetisiert werden, das amplifiziert sein kann, oder kann chemisch nach Sequenzieren der geeigneten DNA-Sequenz, die es codiert, oder direktes Sequenzieren des Peptids oder Proteins synthetisiert werden. Eine chemische Synthese des Peptids oder Proteins kann durch auf dem Gebiet wohlbekannte Verfahren durchgeführt werden, die zyklische Sätze von Reaktionen einer selektiven Schutzgruppenentfernung der funktionellen Gruppen einer terminalen Aminosäure und Kopplung von selektiv geschützten Aminosäureresten, gefolgt schließlich von einer vollständigen Schutzgruppenentfernung aller funktionellen Gruppen involvieren. Die Synthese kann in Lösung oder auf einem festen Träger durchgeführt werden, wobei geeignete Festphasen, wie auf dem Gebiet bekannt, verwendet werden.
Vorzugsweise kann, falls die Affinität des gewählten Peptids oder Proteins für das Zielmolekül oder die Aktivität des Peptids oder Proteins nicht signifikant beeinflusst ist, nur der Displaybestandteil des exprimierten Peptids oder Proteins synthetisiert werden. Optional kann es notwendig oder vorzuziehen sein, das Peptid oder Protein, wie es in dem Polypeptid auftritt, zu erzeugen, enthaltend den DNA-Bindungsbestandteil durch Erzeugung von der gesamten oder einem Teil der Sequenz des DNA-Bindungsbestandteils und/oder anderer Bereiche des exprimierten Peptids oder Proteins. Dies gilt insbesondere, wenn eine Gerüstbibliothek erzeugt wurde.
Geeignete Zielbindungspeptid/Protein:DNA-Konjugate können mit einem Reportermolekül für die Verwendung in qualitativen oder quantitativen Assays für die Bestimmung der Gegenwart oder Abwesenheit von Zielmolekülen bereitgestellt werden.
So stellt die Erfindung in noch einem weiteren Aspekt ein Verfahren für einen Assay auf die Gegenwart eines Zielmoleküls in einer Probe bereit, wobei das Verfahren (a) das Kontaktieren der Probe (z.B. von biologischem, von biologisch-abgeleitetem oder von nicht-biologischem Material) mit einer molekularen Sonde, umfassend i) einen Peptid- oder Proteinzielbindungsbestandteil, der selektiv an das Zielmolekül binden kann, mit angehafteter codierender DNA, den DNA-Bestandteil, gewählt aus der Bibliothek der Erfindung und ii) einen Reporterbestandteil und (b) direktes oder indirektes Bewerten der zielgebundenen Sonde umfasst.
Bifunktionelle Molekularsonden (umfassend (i) und (ii), wie oben beschrieben) zur Verwendung in dem Assay bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
In diesem Assayverfahren kann die Bewertung der Bindung der bifunktionellen Verbindung an eines der Ziele, für die sie spezifisch ist, die in der Probe vorliegen, direkt oder indirekt geschehen. Eine direkte oder indirekte Bewertung sind auf dem Gebiet der Diagnoseassays wohl bekannt. Solche Verfahren können die Abtrennung der gebundenen (oder nicht gebundenen) bifunktionellen Verbindung involvieren, die beide als Analyt dienen können. Die Bewertung des Zielmoleküls:bifunktionellen Verbindungskonjugats kann qualitativ oder bevorzugter quantitativ geschehen und wird eine direkte oder indirekte Bewertung des Reporterbestandteils involvieren.
Der Assay kann auf die Bewertung eines zweiten Ziels mit dem ersten Ziel gerichtet sein, worin der Reporterbestandteil auf einer Sonde für das zweite Ziel durch die bifunktionelle Verbindung erkannt wird. So kann eine bifunktionelle Verbindung auf eine Sonde, vorzugsweise molekular gerichtet sein, die ein weiteres Ziel erkennt, in welchem Fall man die Sonde an das weitere Ziel unter geeigneten Bindungsbedingungen vor der Zugabe der bifunktionellen Verbindung, wie oben erwähnt, binden lässt.
Um die Sonde bereitzustellen, kann das spezifische Zielbindungspeptid/Protein:DNA-Konjugat inkorporiert oder an einen Reporterbestandteil konjugiert sein, so dass die Gegenwart innerhalb einer Testprobe des Ziels von Interesse bestimmt und/oder quantifiziert werden kann.
Der Peptid- oder Protein-Zielbindungsbestandteil in der bifunktionellen Verbindung bindet an das Ziel durch eine Zielbindungsregion, die einige oder alle der Aminosäurereste des exprimierten Peptids oder Proteins bildet. Allgemein wird dies zu mindestens einem Teil des Displaybestandteils wie vorher definiert korrespondieren.
Der Reporterbestandteil kann jeder Bestandteil sein, der zu einem direkten oder indirekten Nachweis in der Lage ist, z.B. durch seine enzymatischen Eigenschaften, Strahlungsemission, Streuung oder Absorptionseigenschaften, seine magnetischen Eigenschaften oder seine Fähigkeit, mit einem komplementären Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Effekts zu kooperieren oder daran zu binden, z.B. mit einem Enzym zu interagieren, um ein Signal zu erzeugen, eine Gaserzeugung, Lichtemission, Farbveränderung, Trübheit, Präzipitation usw. Der Reporterbestandteil kann alternativ jeder Teil des Peptid/Protein:DNA-Konjugats sein, der erkennbar ist und ein weiteres Molekül binden kann, das direkt oder indirekt ein Signal erzeugt. So kann z.B. ein Antikörper, gerichtet gegen einen bestimmten Bereich des genetischen Materials oder Peptids/Proteins verwendet werden. Die oben erwähnten Bestandteile sind auf dem Gebiet der diagnostischen Assays wohl bekannt.
Der Reporterbestandteil der bifunktionellen Verbindungen der Erfindung kann in das Peptid/Protein oder den DNA-Bestandteil eingebaut sein oder damit konjugiert sein. So können z.B. radioaktiv markierte Aminosäuren oder Nukleotide für die Erzeugung des Peptids/Proteins oder der codierenden DNA verwendet werden, wobei die Radionuklide in das Peptid/Protein oder die Nukleinsäurestrukturen eingebaut sind und dann als Reporterbestandteile wirken. Solche markierten Bestandteile können während der Herstellung der Eltern-Bibliothek eingebaut werden oder während der darauf folgenden Screening- oder Amplifikationsschritte, wenn diese durchgeführt werden.
Alternativ kann ein Reportermolekül an das Peptid/Protein oder die DNA konjugiert sein, was direkt oder indirekt den Nachweis oder die Messung der Gegenwart des Ziels, an das das Peptid oder Protein binden kann, ermöglicht. Solche Reportermoleküle beinhalten z.B. radioaktive Markierungen, chemische Markierungen, z.B. Chromophore oder Fluorophore (z.B. Farbstoffe, wie Fluorescein und Rhodamin) oder Reagenzien mit einer hohen Elektronendichte, wie z.B. Ferritin, Hämocyanin oder kolloidales Gold.
Alternativ kann das Reportermolekül ein Enzym sein, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, worin die Gegenwart des Enzyms durch seine Wechselwirkung mit einer geeigneten Einheit, z.B. einem Substrat, sichtbar gemacht wird. Die enzymatische Aktivität kann durch das exprimierte Protein oder Peptid bereitgestellt werden, beinhaltend die Peptid- oder Protein-Zielbindungseinheit, wenn das Ziel, an das es bindet, z.B. ein Rezeptor für das Enzym oder ein Substrat dafür ist. Die Kopplung von Enzymen an Peptide oder Proteine kann unter Verwendung konventioneller Techniken bewirkt werden, z.B. unter Verwendung eines aktivierten Enzyms, wie z.B. aktivierter alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim Biochemicals).
Der Reporterbestandteil kann auch einen Teil eines Signalpaars bilden, worin das andere Mitglied des Paars auf dem Ziel oder in enger Nachbarschaft dazu gefunden wird, an das das Peptid oder Protein bindet, z.B. eine fluoreszierende Verbindung und ein Quench-fluoreszierendes Substrat. Wie vorher erwähnt, kann das Peptid/Protein oder die DNA auch durch Assoziation mit einem weiteren Molekül (oder Bindung daran) nachgewiesen werden, das seine (ihre) Identität erkennt, z.B. einen Antikörper, gerichtet gegen einen Teil der Sequenz, die einen Teil der Zielbindungsregion des Peptids/Proteins oder einer Region des Peptids oder Proteins bilden kann, die an der Zielbindung nicht involviert sind, die optional für die Zwecke der Erkennung zugefügt werden können, oder im Fall von DNA, gerichtet gegen spezifische Nukleinsäuremotive. So kann der spezifische Zielbindungsbereich in ein größeres Peptid oder Protein fallen, worin die Teile des Peptids oder Proteins, die an der Bindung an das Ziel nicht beteiligt sind, eine strukturelle oder funktionelle Rolle für das exprimierte Peptid oder Protein haben können, z.B. als Gerüstsequenz oder als Reporterbestandteil wirken können oder als Bindungsgruppe, die den spezifischen Zielbindungsbereich an einen Reporterbestandteil bindet oder an eine weitere Komponente der Sonde, z.B. einen Träger oder ein Makromolekül.
Die gemäß der Erfindung nützlichen bifunktionellen Verbindungen können durch Konjugation eines Reportermoleküls an das resultierende geeignete Peptid oder Protein erzeugt werden, entweder direkt oder durch einen Linkerbestandteil. Allgemein wird dies durch Reaktion mit einer optional aktivierten Carboxyl- oder Aminfunktionalität auf dem Peptid oder Protein durchgeführt. Solche Konjugationsreaktionen liegen in der Fähigkeit eines Chemikers mit gewöhnlichen Fähigkeiten.
Alternativ kann das Reportermolekül durch Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Aminosäure bei der Konstruktion des Peptids oder Proteins eingeführt werden.
Die bifunktionellen Sondenverbindungen können verwendet werden, um spezifische Ziele von Interesse in verschiedenen Systemen, die auf dem Gebiet bekannt sind, zu erkennen, einschließlich Diagnoseassays, wie vorher erwähnt.
Die folgenden Beispiele sind nur illustrativ, unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, worin:
1 die Konstruktion der pEN21- und pEN24-Konstrukte darstellt, und
2 die Produktion von DNA-Molekülen zeigt, enthaltend einen randomisierten Bereich von 30 Basenpaaren, erzeugt durch PCR, worin Spur 1 ein Marker ist (λ, HindIII) und Spur 2 das PCR-Produkt ist.
Beispiel 1:
Allgemeine Verfahrensweise zur Erzeugung einer in vitro-Peptidbibliothek und Panning auf ein Ziel
Materialien:

A. Plasmid oder PCR-Fragment, enthaltend den T7-Promotor, die Ribosombindungsstelle, das P2A-Gen und den T7-Terminator. Solche Plasmide wurden z.B. von Liu & Haggård--Ljungquist (1994, supra) beschrieben oder können von dem Biotechnology Centre of Oslo, University of Oslo (BiO) erhalten werden.
B. Ein Primer (Bibliotheksprimer), der die folgenden Sequenzen enthält, komplementär zum Plasmid/Fragment: – T7-Promotor, – Ribosomenbindungsstelle, – 30 zufällige Nukleotide (XXT/G) nach dem ersten ATG-Startkodon, alternativ ein Cysteinkodon nach dem ersten Startkodon und nach der statistischen Sequenz (für begrenzte Peptidbibliotheken), – ungefähr 20 Nukleotide stromabwärts vom ersten Startkodon komplementär zur codierenden Sequenz für das P2A-Gen. Primer können je nach Bedarf synthetisiert oder von BiO erhalten werden.
C. Einen PCR-Primer-T7-Promotorbereich (BiO)
D. einen PCR-Primer in dem T7-Terminatorbereich (gegen die Uhrzeigerrichtung) (BiO)
E. Ein Ziel, gebunden an einen festen Träger. In geeigneter Weise kann dies unter Verwendung eines biotinylierten Ziels und Bindung an Streptavidin oder Avidin auf einen festen Träger geschehen. Alternativ kann Avidin selbst das "Ziel" sein, wenn nach Avidin-Bindungspeptiden gesucht wird. Streptavidin, gebunden an Mikrotitervertiefung oder Streptavidin, gebunden an magnetische Teilchen oder Avidinharz können von Dynal (Norwegen) bzw. Promega (USA) erworben werden.
F. T7 S30-Extrakt für eine in vitro gekoppelte Transkription/Translation linearer Matrizen kann von Promega erhalten werden (USA). * Der Rest des Materials, der benötigt wird, ist für den Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie-Verfahren Standard.

Verfahren:

1. Beginnend mit einem Plasmid oder PCR-Fragment, wie in A erwähnt, wird eine lineare PCR durch Zugabe des in B erwähnten Bibliotheksprimers durchgeführt. Der exakte Aufbau für diese Reaktion hängt von dem Primer und denselben Betrachtungen ab, die für die PCR oder eine cyclische Sequenzierung zutreffen und finden hier ebenfalls Anwendung. Dies wird zu einer Bibliothek mit bis zu 10¹² bis 10¹³ Molekülen führen, abhängig von der Wirksamkeit der PCR. Um einen Primerwettkampf im nächsten Schritt zu vermeiden, sollten die verbleibenden Bibliotheksprimer vorzugsweise zu diesem Zeitpunkt durch Verwendung einer Centricon-100-Säule (Amicon) entfernt werden.
2. Um dieses Material zu amplifizieren, werden 5–7 PCR-Zyklen mit den Primern C und D durchgeführt. Dies wird unter Verwendung der Bibliotheksprimer verlängerten DNA, verteilt auf fünf Teile, durchgeführt.
3. Ein Teil des Materials von der erzeugten Bibliothek (aus einem Fünftel) wird zu dem S30-Extrakt für lineare Fragmente, enthaltend T7-RNA-Polymerase (F), wie beschrieben im Promega-Handbuch, zugefügt. Die Reaktion wird 30 bis 60 min bei 37°C inkubiert und dann beendet, indem das Röhrchen (die Röhrchen) auf Eis platziert werden.
4. Das Ziel wird direkt an einen festen Träger durch das Biotin-Streptavidin-System angebunden. Avidin, gekoppelt an eine Harzmatrix, oder Streptavidin-magnetische Kügelchen, können kommerziell von Promega bzw. Dynal erhalten werden.
5. Der S30-Extrakt wird 1:10 in den gewünschten Bindungspuffer (Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning : A laboratory manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) verdünnt und die Peptidbibliothek in dem S30-Extrakt lässt man mit dem Ziel 1–3 Stunden (oder über Nacht) in Wechselwirkung treten. Nicht-gebundene werden durch 5-maliges Waschen mit lXPBS + 0,5 % Tween-20 (Sigma) für 5 min entfernt. Der gebundene Peptid-Protein A-DNA-Komplex wird von dem Ziel mit dem gewünschten Elutionsmittel eluiert, z.B. Biotin, wenn das Ziel Avidin ist und ein Avidin-Bindungspeptid gesucht wird. Die Elution mit kochendem dH₂O kann auch durchgeführt werden, um den Komplex aus dem Ziel freizusetzen und simultan das genetische Material von dem nicht-genetischen Material freizusetzen.
6. Die eluierte DNA wird konzentriert, bevor man in die nächste PCR-Runde geht. Dies wird besonders geeigneter Weise durch Verwendung einer Centricon-100-Säule und folgend den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das Endvolumen der eluierten DNA beträgt 50 μl. Alternativ kann der Komplex vor der PCR ohne Abtrennung vom genetischen und nicht-genetischen Material gereinigt werden.
7. Eine neue PCR-Reaktion wird unter Verwendung der Primer C und D mit 30–40 Zyklen aufgebaut.
8. Das gesamte Verfahren von Schritt 3–7 wird wiederum durchgeführt, und zwar 4-bis 5-mal.
9. Nach dem letzten Elutionszyklus und PCR müssen die Fragmente kloniert werden, um die individuellen Fragmente zur Bestimmung ihrer Sequenzen zu isolieren und zu studieren. Dies wird durch Verdau des endgültigen PCR-Fragments mit XbaI und BamHI durchgeführt und durch Ligation in den Vektor pET-3a (Novagene) (A), verdaut mit denselben Enzymen.
10. Der ligierte Vektor wird dann in E. coli transformiert. Da es viele Kopien derselben Sequenz gibt, ist die Effizienz der Transformation nicht kritisch.
11. Individuelle Klone werden genommen und die Plasmid-DNA durch Standardprotokolle isoliert. Eine abschließende Runde von einer S30-Extraktion und -Selektion (Schritte 3 bis 7) wird durchgeführt, um Bindende zu verhindern, die nur kooperativ wirken (zusammen mit anderen Bindenden).
12. Das endgültige PCR-Produkt wird über den gesamten variablen Bereich sequenziert und einen Konsensus-Sequenz wird erhalten. Um eine gute Konsensus-Sequenz zu erhalten, sollten bis zu 50 Klone sequenziert werden.
13. Die abgeleitete Peptidsequenz wird synthetisiert und getrennt und im Hinblick auf die Bindungseigenschaften getestet.

Beispiel 2
Eine Bibliothekspopulation wird unter Verwendung eines randomisierten Basenprimers für die Amplifikation des A-Gens erhalten. Das Displaymodul, das zu ungefähr 3000 Basenpaaren korrespondiert, ist schematisch wie folgt für das linearisierte Plasmid pEE709 dargestellt (A-Gen inseriert in pET8c = pET3d an der NcoI-Stelle nach dem Fill-In).

worin:
T7p = T7-Promotor ϕ10
T7t = T7-Terminator
RBS = Ribosomenbindungsstelle
AUG = Startkodon für das A-Protein
A = A-Protein
P = ausgestelltes Peptid/Protein
B = Bibliotheksstrangprimer, enthaltend eine zufällige Sequenz (L), wie definiert in Beispiel 1
C = PCR-Primer (T7p)
D = PCR-Primer (T7t)

In dem obigen Diagramm beginnt das A-Gen-Insert mit GCC (dem zweiten Kodon) und endet mit GCA (Basen 3427–29).
(Siehe DNA-Sequenz von Liu et al., 1993, supra).
Die in dem Beispiel verwendeten Primer sind die folgenden:
B: GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAA TAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATG – [XXT/G]₁₀ – GCCGTTAAA GCCTCCGGG [135 Nukleotide]
C: GAAATTAATACGACTCACTATAGGG
D: CAAAAAACCCCTCAAGACCCG
1. Erzeugung einer Peptid-Bibliothek
Eine DNA-Fragmentpopulation mit einem Satz randomisierter Basen wird wie folgt erhalten:
Eine lineare Amplifikation (oder Primerverlängerung) wird an dem linearisierten (HindIII) Plasmid pEE709 durch den Bibliotheksprimer B durchgeführt. Die Reaktionsmischung mit 100 μl enthält: 0,3 μg Plasmid-DNA (ungefähr 6×10¹⁰ Moleküle oder 0,1 pmol), 5 μg Bibliotheksprimer-DNA (ungefähr 7×10¹³ Moleküle oder 125 pmol) und den Rest der Bestandteile wie für die unten stehende PCR-Reaktion beschrieben. Die Mischung wird 5 PCR-Zyklen wie unten beschrieben unterzogen. Der Bibliotheksprimer wird vorzugsweise unter Verwendung einer Centricon-100 entfernt. Die Bibliotheksprimer verlängert DNA (Bibliothek) wird verdünnt und in fünf 100 μl (Endvolumen) Aliquots unterteilt und einer begrenzten PCR (5 Zyklen) unter Verwendung der Primer C und D unterzogen. Jede Reaktionsmischung enthält: 0,6 μg Bibliotheksprimer-verlängerte DNA, 125 pmol der jeweiligen Primer C und D, 0,2 mM von jedem dNTP, 50 mM KCl, 4 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 bei 25°C), 0,1 % Triton X-100 und 2,5 E Taq DNA-Polymerase (Promega) in einem Endvolumen von 100 μl. Die Mischung wird 35 Zyklen von 1 min bei 94°C unterzogen, 2 min bei 42°C und 3 min bei 72°C in einem Thermocycler (Perkin Elmer, Modell PCR1000). Das PCR-Produkt wird durch Entfernung des Primers, durch Phenolbehandlung und Ethanolpräzipitation gereinigt (Centricon-100). An diesem Punkt sollte die Bibliothek 10¹² bis 10¹³ DNA-Moleküle umfassen.
Ein alternativer Bibliotheksansatz würde einfach die Durchführung von PCR-Zyklen an der Vektorfragment-DNA unter Verwendung der Bibliotheksprimer B und D zum Antreiben der PCR sein.
2. In vitro-Translation und Screening auf ein Avidinbindungspeptid

A. Eine Kombination von Promega's T7 S30- und S30-linearem Matrizenextrakt wird für eine gekoppelte Transkription/Translation linearer DNA-Matrizen verwendet. Die Transkription des A-Gens wird durch die T7-RNA-Polymerase von dem T7-Promotor ϕ10 angetrieben. Einer der fünf DNA-Bibliotheksansätze, der phenolbehandelt und mit Ethanol präzipitiert ist, wird in 9 μl destilliertem Wasser resuspendiert. Zu diesem Volumen werden die Bestandteile (5 μl Aminosäuremischung, 20μl S30-Vormischung, 1 μl T7 S30 und 15 μl S30 für lineare Matrizen) des S30-Protokolls (Promega) zur Einstellung eines Endvolumens von 50 μl zugefügt. Das gekoppelte Transkriptions/Translationsverfahren lässt man 60 Minuten fortschreiten (oder so lang wie nötig), und zwar bei 37°C.
B. Die Reaktionsmischung (50 μl) wird zu 50μl SoftLink Avidin-Harz (Promega) zugefügt, und man ließ dies zwei Stunden bei Raumtemperatur für ein Panning von Peptidbindung an Avidin mischen. Das Harz wird durch Zentrifugation (10.000 Umdrehungen/min für 5 min) pelletisiert und gewaschen (fünfmal mit PBS, 20 mM Na₂HPO₄, 100 mM NaCl pH 7,5). Potentielle Avidinbinder werden mit 5 mM Biotin eluiert oder einfach, indem der gesamte Avidin-Harz-Komplex einer PCR mit den Primern C und D, wie beschrieben in 1A, unterzogen wird. Das PCR-Produkt wird von dem Avidin-Harz durch Zentrifugation abgetrennt, phenolbehandelt und durch Ethanol präzipitiert, bevor es einem neuen gekoppelten Transkriptions/Translations- und Panning-Zyklus unterzogen wird. Die Zyklen der Peptidausstellung und des Pannings können wiederholt werden, bis die vorhergesehene Peptidanreicherung erreicht wurde. Polyklonale Antikörper, die für das A-Protein spezifisch sind, können verwendet werden, um die Gegenwart und den Anstieg des Protein A-Trägers während des Pannings zu überwachen. Nach der vierten Runde eines Pannings wird das endgültige PCR-Produkt mit den Restriktionsenzymen XbaI und BamHI geschnitten und in pET-3a inseriert (geschnitten mit denselben Enzymen), und zwar durch Ligation. Nach den Transformationen werden individuelle Kolonien isoliert und Plasmide für eine Sequenzbestimmung des Inserts extrahiert, um die Aminosäuresequenz des Peptids zu erhalten.

Beispiel 3
Eine Peptidbibliothek wird wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt und einem Screening unterzogen, jedoch werden diesmal vor der Translation (Schritt 2) die DNA-Moleküle gereinigt und dann mit T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemäß einem Standardprotokoll (siehe Sambrook, 1989, supra) zirkularisiert.
In diesem Fall müssen die Hybridisierungsbedingungen während des Screenings nicht aufrecht erhalten bleiben, und es kann so z.B. in 1 Triton X-100, 0,5 M KOAc oder 1 % Triton X-100, 350 mM NaCl, 5 % Glycerin durchgeführt werden, wobei es sich um Bedingungen handelt, die für ein Screening auf eine SRP-Rezeptorheterodimer-Bindung geeignet sind, oder in 1 % Triton X-100, 2 M Harnstoff, 100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,5, oder 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, pH 7,5, wobei es sich um Bedingungen handelt, die für ein Screening auf Antikörper:Antigen-Wechselwirkungen geeignet sind.
Beispiel 4
Demonstration der in vitro cis-Wirkung des P2 DNA-Replikationsinitiations-Proteins A
Experiment 1
Eine gleiche Menge DNA von zwei Plasmiden, die das P2 A-Gen tragen (pEE709; trägt auch ein amp-Resistenzgen, Liu und Haggård-Ljungquist, 1994, supra) und das P2 A-Gen, fusioniert mit einem Abschnitt von 6 Histidinen an dem N-terminalen Ende von A (pEE711; trägt auch ein amp-Resistenzgen, Liu & Haggård-Ljungquist, 1994, supra) wurden einer gekoppelten Transkriptions/Translations-Reaktion in einem S30-T7-Extrakt (Promega, USA) unterzogen. Die Gegenwart des Histidinabschnitts transformiert das A-Protein in ein Ni-Bindungsprotein. So sollte das His::A exprimierende Plasmid pEE711 selektiv an einen Ni-haltigen festen Träger binden, wenn das A-Protein in dem S30-T7-Extrakt cis-wirkt. In beiden Plasmidkonstrukten befindet sich die Transkription des A-Gens unter der Kontrolle des Phagen T7 ϕ10-Promotors. Nach der Translation wurde das Ausmaß der Bindung an eine Ni-Säule bestimmt.
Material und Methoden
1 μg DNA der pEE70- und pEE711-Plasmide wurde zu dem gekoppelten Transkriptions/Translationsextraktkit (20 μl S30-Vormischung, 5 μl Aminosäuremischung und 15 μl E. coli T7-S30-Extraktsystem für zirkuläre DNA, Promega, USA) zugefügt. Man ließ die Transkription/Translation 60 min bei 37°C fortschreiten. Die Extraktmischung wurde 12-fach in Waschpuffer verdünnt (Qiagen; Puffer 11 – 50 mM Na-phosphat pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 1 mM PMSF) und einer Ni-Selektion durch Zugabe einer Ni-NTA-Spin-Säule (Qiagen, Deutschland) äquilibriert mit Puffer 1 (50 mM Na-phosphat pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol) unter nicht denaturierenden Bedingungen unterzogen. Das Waschen wurde dreifach mit 600 μl Puffer 11 durchgeführt und die Elution wurde zweimal mit 250 μl Puffer 111 (50 mM Naphosphat pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol) durchgeführt wie vom Hersteller empfohlen (siehe Protokoll für Ni-NTA-Spin-Kit (Qiagen, Deutschland), Frühling 1994). Eine Standard-Tischzentrifuge wurde verwendet, um die Ni-Säulen 2 min bei 2000 U/min während des Waschens und der Elution abzuzentrifugieren. Hocheffiziente kompetente Zellen JM109 (Promega, USA) wurden mit einem Teil des Eluens transformiert und im Hinblick auf Ampicillin-resistente Kolonien bewertet. Plasmide individueller Kolonien wurden isoliert und durch Agarosegelelektrophorese typcharakterisiert.
Um die Verteilung (das Verhältnis) der Plasmidtypen im Eluens zu bestimmen, wurde die Gegenwart von Plasmiden durch Transformation des Stamms JM 109 (Promega) im Hinblick auf eine amp-Resistenz gemessen. Die Kolonien wurden genommen und im Hinblick auf ihren Plasmidtyp (differenziert durch Größe) nach der Plasmidextraktion, gefolgt von Agarosegelelektrophorese, analysiert. Das Verhältnis von pEE711 (His::A) zu pEE709 (A) in Abwesenheit der Ni-Säulenselektion wurde ebenfalls bestimmt.
Ergebnisse:
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle unten dargestellt:
Experiment 2
In dem zweiten Experiment wurden 2 neue Plasmidkonstrukte pEN21 (ein A-Genkonstrukt mit einem amp-Resistenzgen, siehe 1) und pEN24 (ein His::A-Genkonstrukt mit einem tag von 6 Histidinresten und einem Kanamycin-Resistenzgen, siehe 1) derselben Experimentart wie in Experiment 1 oben unterzogen, mit den in Material und Methoden unten angegebenen Modifikationen. Durch Verwendung dieser differenziellen Antibiotikaresistenz ist es möglich, die individuellen Plasmidtypen direkt als bakterielle Kolonien zu bewerten.
Material und Methoden
pEN21 und 24 sind Derivate von pET21a und pET24a (Novagen Inc. USA). Die pET21a- und pET24a-Vektoren unterscheiden sich nur durch ihre selektierbaren Marker (Ampicillin- bzw. Kanamycin-Resistenz). pEN21 und pEN24 wurden durch Restriktionsschneiden von pEE709 und pEE711 mit XbaI und BlpI konstruiert, die das A-Gen ausschneiden, wie auch die flankierenden Regionen. pET21a und pET24a wurden mit denselben Restriktionsenzymen geschnitten. Die A-Fragmente und neuen Vektorfragmente wurden von einem Agarosegel nach Elektrophorese durch SpinBind-Säulen (FMC) isoliert. Das A-Fragment von pEE709 wurde in den pET21a-Vektor kloniert und das His-A-Fragment wurde in den pET24a-Vektor kloniert. Die Plasmide wurden 30 min in den S30-Extrakten inkubiert und die Plasmidtypen durch differenzielle Antibiotikaresistenz unter Verwendung von Ampicillin- (pEN21) und Kanamycin- (pEN24) Platten nach Transformation des E. coli-Stamms BK 2118 durch Elektroporation bewertet. Puffer 11 wurde hier modifiziert, um 1 mM Imidazol anstelle von 20 mM Imidazol zu enthalten und der Proteaseinhibitor PMSF wurde weggelassen, und dies wurde Puffer 11*) genannt. Die Ni-NTA-Spin-Säule wurde durch Waschpuffer (Puffer 11*, nicht denaturierende Bedingungen) äquilibriert. Das Waschen wurde dreimal mit 600 μl Puffer 11* durchgeführt und die Elution zweimal mit 250 μl Puffer 111, wie empfohlen vom Hersteller (siehe das Protokoll für den Ni-NTA- Spinkit, Qiagen, Deutschland, Frühling 1999). Eine Plasmidmischung mit gleichen Mengen von pEN21- und pEN24-DNA, die dem S30-Extrakt gegenüber nicht exponiert worden war, wurde einer Ni-Selektion als Kontrolle unterzogen.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten angegeben.
In dem Fall, in dem der S30-Extrakt weggelassen und die reine Plasmidmischung der Ni-Säule unterzogen wurde, wurde keine Anreicherung beobachtet.
Schlussfolgerung
Wie erwartet, war in allen Experimenten das Verhältnis von His:A/A-Plasmiden in Abwesenheit der Ni-Selektion ungefähr 1. Demgegenüber betrug das Verhältnis von His::A/A-Plasmiden nach Ni-Selektion ungefähr 9,3 und 3,4 und führte zu einer Anreichung der His::A-Plasmide von ungefähr 13 bzw. 7. Um zu bestimmen, ob die Zahlen eine effiziente cis-Wirkung des mit einem His-tag versehenen P2 A in vitro demonstrierten, war es notwendig, diese Werte für die Anreicherung mit der Anreicherung zu vergleichen, die theoretisch erhalten werden könnte, unter Verwendung der oben erwähnten experimentellen Bedingungen. Um einen Vergleich der experimentellen Daten mit den theoretischen Werten zu ermöglichen, maßen wir den nicht-spezifischen Hintergrund in den Eluans-Fraktionen und bestimmten die Menge von His::A, synthetisiert in der Transkription/Translationsreaktion.
Der nicht-spezifische Hintergrund, der in den Proben verblieb, wurde durch Durchführung einer Nickelsäulenselektion an Plasmiden gemessen, ohne Translation in E. coli-Lysat. Ein Drittel des Eluans wurde in E. coli transformiert und die resultierenden Kolonien wurden gezählt. Unter Verwendung der gemessenen Transformationseffizienz für die verwendeten E. coli-Zellen berechneten wir dann, dass das Eluans 0,3 fmol von jedem Plasmid in Abwesenheit von His-tag P2 A-Protein enthält.
Es wird geschätzt, dass ungefähr 5 fmol (3 × 10⁹ Moleküle) Protein A in unserer Standardreaktion synthetisiert wurden. Unter der Annahme, dass jedes His::A-Molekül, das synthetisiert wurde, an ein codierendes DNA- Molekül band, würde die erhaltene Anreicherung (5 + ,3)/,3 = 18 sein. Die in den beiden Ergebnissen erhaltene durchschnittliche Anreicherung betrug (13 + 7)/2 = 10. So interpretieren wir diese Ergebnisse so, dass das P2 A-Protein in der Lage ist, effizient in cis in vitro zu funktionieren als auch einen Abschnitt von sechs Histidinen, fusioniert an sein N-Terminal, auszustellen. Trotz der schlechten Translationseffizienz in den gegenwärtigen Experimenten wird angenommen, dass eine Bibliothek mit 1012 Mitgliedern erhalten werden kann. Es wird weiterhin vorhergesagt, dass zusätzliche oder kräftigere Waschschritte die Anreicherung verbessern werden und dass das dabei helfen wird, die Bibliotheken der Erfindung zu erzeugen.
Experiment 5
DNA-Moleküle, die für die Expression einer Peptidbibliothek der Erfindung verwendet werden sollen, wurden hergestellt.
Material und Methoden
DNA-Moleküle, die für eine Expression der in vitro-Peptidausstellungsbibliothek zu verwenden sind, wurden durch Amplifikation des A-Gens von dem linearisierten Plasmid pEN21 (siehe 1 und Beispiel 4) unter Verwendung der folgenden Primer hergestellt:
B: 5' CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC Ctc tag aAA TAA TTT TGT TTA ACT TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG (NNT/G)₁₀ GCC GTT AAA GCC TCC GGG 3' [144 Nukleotide mit einem Bereich von 30 randomisierten Basen und einer einzigartigen xbaI-Stelle (Kleinbuchstaben), die zu Primer B in Beispiel 2 korrespondiert, unter Addition von 9 5'-Nukleotiden]
C: 5' AGA TCT CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G 3' [40 Basenprimer, komplementär zum stromaufwärts gelegenen Bereich von Plasmid pEN21, abdeckend den T7-Promotor wie auch die Basen stromaufwärts vom T7-Promotor, die zu Primer C in Beispiel 2 korrespondieren unter Addition von 15 5'-Nukleotiden]
D: 5' CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG 3' [21 Basenprimer, komplementär zu einer Sequenz stromabwärts vom T7-Terminator und korrespondierend zu Primer D in Beispiel 2]
Die Primer wurden in einer Applied Biosystems 394 DNA/RNA-Synthetisiervorrichtung synthetisiert und durch eine Polyacrylamidgelelektrophorese überprüft. Der Bibliotheksprimer zeigte eine Heterogenität auf dem Gel aufgrund seiner randomisierten Natur.
Die Primer B und D wurden verwendet, um die DNA-Moleküle der Bibliothek in einer PCR-Reaktion herzustellen (ähnlich wie die PCR-Reaktion, die in Beispiel 2 beschrieben wird, durchgeführt), wobei 5 μl Polymerasepuffer (10x Vent pol. Puffer, New England Biolabs), 50 pmol Primer B, 20 pmol Primer D, 10 ng DNA-Matrize (pEN21), 1 μl dNTP-Mix (10 mM, New England Biolabs), 1 μl Deep Vent Polymerase (New England Biolabs) verwendet wurde, alle in einem Gesamtvolumen von 50 μl, mit einem Heißstart von 94°C für 5 min, einer Annealing-Temperatur von 55°C für 30 s (Post-Annealing bei 58°C für 2 min), einer Polymerisationstemperatur von 74°C für 2 min (Post-Polymerisation bei 74°C für 7 min) für 25 Runden.
Primer C wird verwendet, um die Bibliothek weiter zu amplifizieren (und Heteroduplex-Moleküle zu entfernen), in Abwesenheit des Bibliotheksprimers B. Es wird empfohlen, Primer B durch Reinigung vor diesem Amplifikationsschritt zu entfernen.
Ergebnisse:
Ein DNA-Displaymodul mit ungefähr 3000 Basenpaaren wurde mit einer randomisierten Sequenz von 30 Basen am 5'-Ende des A-Gens (folgend auf das Startkodon RTG) erzeugt. Das PCR-Produkt, das die Bibliothek bildet, ist in 2 dargestellt.

Claims

Verfahren zur Erzeugung einer Peptid- oder Protein-Expressionsbibliothek, die eine diverse Population von Peptiden oder Proteinen ausstellt, wobei die Peptide oder Proteine mit der DNA, die sie codiert, durch eine kovalente Protein:DNA-Bindung spezifisch assoziiert sind, wobei das Verfahren mindestens die folgenden Schritte umfasst: (1) Herstellung einer amplifizierbaren genetischen Bibliothek von DNA-Molekülen, die folgendes enthalten: (i) eine Nukleotidsequenz, codierend eine Aminosäuresequenz, wobei die Aminosäuresequenz an ihre codierende Sequenz durch eine kovalente Protein:DNA-Bindung (Bindungsbestandteil) spezifisch bindet, und (ii) eine Nukleotidsequenz, codierend eine Aminosäuresequenz für die Ausstellung (Ausstellungsbestandteil) und (2) Expression der so gebildeten genetischen Bibliothek, wobei das DNA-Molekül, wenn es exprimiert wird, ein Translationsprodukt ergibt, das den Ausstellungsbestandteil und den Bindungsbestandteil enthält, und wobei das DNA-Molekül mindestens eine Anbindungsstelle für den Bindungsbestandteil aufweist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Expression des genetischen Materials eine in-vitro-zelluläre Expression ist, wobei ein einzelnes Bibliotheksmitglied, das optional in mehr als einer Kopie vorliegt, pro Wirtszelle oder Organismus exprimiert wird.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz, die spezifisch an ihre codierende Sequenz bindet, ein cis-wirkendes Protein ist, das in-vitro mit der DNA-Sequenz, die es codiert, in Wechselwirkung tritt, und das eine kovalente Bindung mit seiner eigenen DNA-Matrize etabliert, und wobei die Expression des genetischen Materials eine in-vitro-zelluläre Expression ist, wobei mindestens ein Bibliotheksmitglied, das optional in mehr als einer Kopie vorliegt, pro Wirtszelle oder Organismus exprimiert wird.
Verfahren gemäss Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz, die an ihre codierende Sequenz bindet, von einem cis-wirkenden Protein abgeleitet ist, das in-vitro mit der DNA-Sequenz, die es codiert, in Wechselwirkung tritt und eine kovalente Bindung mit der eigenen DNA-Matrize etabliert, und wobei die Expression des genetischen Materials eine zellfreie in-vitro-Expression ist.
Verfahren gemäss Anspruch 3 oder 4, wobei das cis-wirkende Protein das A-Protein des Bakteriophagen P2 (P2 A) ist.
Verfahren gemäss Anspruch 4 oder 5, wobei die Expression in Gegenwart eines mis-match-Oligonukleotids durchgeführt wird, das mit der DNA benachbart zu der Anbindungsstelle an beiden Seiten hybridisiert, jedoch nicht in der Region, korrespondierend zu der Anbindungsstelle hybridisiert.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Aminosäuresequenz zur Ausstellung bis zu 40 Aminosäurereste umfasst.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Aminosäuresequenz zur Ausstellung durch Klonieren erzeugt wird oder DNA-Fragmente aus dem Klonieren umfasst.
Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Bindungsbestandteil so modifiziert ist, dass der Bindungsbestandteil an die codierende DNA kovalent angebunden bleibt.
Verfahren gemäss Anspruch 9, wobei der Bindungsbestandteil von dem A-Protein des Bakteriophagen P2 (P2 A) abgeleitet ist, das durch Ersatz des Tyrosins an der Aminosäurestellung 450 durch Phenylalanin modifiziert wurde.
In-vitro-Peptid-Expressionsbibliothek, erzeugt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 10.
DNA-Molekül, enthaltend eine DNA-Sequenz, codierend ein Peptid oder ein Protein für die Expression in einer Bibliothek gemäss Anspruch 11, enthaltend: (i) eine Nukleotidsequenz, codierend eine Aminosäuresequenz, wobei die Aminosäuresequenz an ihre codierende Sequenz durch eine kovalente Protein:DNA-Bindung (Bindungsbestandteil) spezifisch bindet, und (ii) eine Nukleotidsequenz, codierend eine Aminosäuresequenz für die Ausstellung (Ausstellungsbestandteil), wobei das DNA-Molekül, wenn es exprimiert wird, ein Translationsprodukt ergibt, das den Ausstellungsbestandteil und den Bindungsbestandteil enthält, und wobei das DNA-Molekül mindestens eine Anbindungsstelle für den Bindungsbestandteil aufweist.
DNA-Vektor, enthaltend eine DNA-Sequenz gemäss Anspruch 12.
Verfahren zur Identifizierung und/oder Reinigung eines Bibliotheksmitglieds, das gewünschte Eigenschaften aufweist, aus einer Peptid- oder Protein-Expressionsbibliothek, wie in Anspruch 11 definiert, umfassend mindestens die Schritte: (a) Screenen einer Bibliothek, wie in Anspruch 11 definiert, und (b) Selektion und Isolierung des relevanten Bibliotheksmitglieds.
Verfahren zur Identifizierung eines spezifischen zielanbindenden Peptids oder Proteins, wobei das Verfahren mindestens die Schritte (a) Screenen einer Bibliothek gemäss Anspruch 11 mit Zielmolekülen, und (b) Selektion und Isolierung eines Bibliotheksmitglieds, das an das Zielmolekül bindet, und (c) Isolierung des Peptids oder Proteins, das spezifisch an das Zielmolekül bindet, umfasst.
Verfahren gemäss Anspruch 15, worin die DNA, die das Peptid oder Protein, das spezifisch an das Zielmolekül bindet, zusätzlich isoliert wird.
Assay-Verfahren auf die Gegenwart eines Zielmoleküls in einer Probe, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Kontaktieren der Probe mit einer molekularen Sonde, umfassend (i) einen Peptid- oder Protein-Zielbindungsbestandteil, der selektiv das Zielmolekül binden kann, mit angehafteter codierender DNA, dem DNA-Bestandteil, gewählt aus der Bibliothek gemäss Anspruch 11, und (ii) einen Reporterbestandteil, und (b) direktes oder indirektes Bewerten der zielgebundenen Sonde.
Bifunktionelle molekulare Sonde zur Verwendung in dem Assay-Verfahren gemäss Anspruch 17, umfassend (i) einen Peptid- oder Protein-Bestandteil, der in der Lage ist, selektiv ein Zielmolekül zu binden, mit angehafteter codierender DNA, dem DNA-Bestandteil, gewählt aus der Bibliothek gemäss Anspruch 11, und (ii) einen Reporterbestandteil.