DE69828392T2

DE69828392T2 - Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Standard-Gentranskriptionsmusters

Info

Publication number: DE69828392T2
Application number: DE69828392T
Authority: DE
Inventors: Praveen Sharma; Anders LÖNNEBORG
Original assignee: Diagenic AS
Current assignee: Diagenic AS
Priority date: 1997-04-30
Filing date: 1998-04-30
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2018-05-01
Also published as: EP1323728B1; JP4163758B2; NO327084B1; US20040121390A1; EP1323728A2; JP2001526534A; HK1026003A1; US20020022222A1; EP0979308B1; DE69828392D1; ES2230688T3; EP1323728A3; ATE286143T1; HK1057217A1; US6720138B2; AU7222698A; US20130337446A1; DK0979308T3; EP0979308A1; ATE412003T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung diagnostischer Gentranskriptionsmuster-Standards, Verfahren zur Herstellung von Sondenkits für die Diagnose und Diagnoseverfahren unter Verwendung solcher Kits.
Es gibt zahlreiche Beispiele für Diagnoseverfahren, die physische, anatomische und Verhaltensuntersuchungen und/oder biochemische, elektrische oder elektromagnetische Untersuchungen und/oder Assays beinhalten.
Diese Diagnoseverfahren sind ausgereift und stellen oft effiziente Mittel zur Identifizierung vieler pathologischer Zustände dar. Sie beruhen auf neueren Entwicklungen und Forschungen ebenso wie auf den Beobachtungen, der Erfahrung und den empirischen Daten, die von den im Gesundheitswesen Tätigen, die sich mit Krankheiten des Menschen, Tieren und Pflanzen befassen, über einen Zeitraum von mindestens 6000 Jahren gesammelt wurden.
Das Arsenal diagnostischer Mittel war niemals umfangreicher als zur Zeit, aber selbst angesichts dieser Tatsache ist die ungenaue Diagnose von Leiden und anderer Krankheitszustände noch weit verbreitet.
Man entdeckt neue Krankheiten und Krankheitszustände, die mit Umweltveränderungen oder Mutationen oder anderen Veränderungen sowohl aktiver Agenzien oder Organismen wie auch innerhalb des ausgesetzten Organismus in Zusammenhang stehen können. Außerdem gibt es keine geeigneten diagnostischen Tests für den Nachweis einer Reihe altbekannter und neuer illegaler Substanzen, die beim Sport und von Drogenabhängigen verwendet werden.
Mehrere Krankheitszustände sind mit den verfügbaren Verfahren nicht einfach zu identifizieren und/oder die schlüssige Identifizierung einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes erfolgt unter Umständen zu spät für eine angemessene korrigierende Behandlung.
Auf Grund des hohen Zeitaufwands, der für ein vollständiges Diagnoseverfahren anfällt, beginnt man häufig zu früh mit einer falschen Antibiotikatherapie, noch bevor eine schlüssige Diagnose vorliegt. Diese Praxis in der Medizin kann das ernsthafte Problem der Entwicklung Antibiotika-resistenter Bakterienstämme verschlimmern.
Obwohl eine große Anzahl differenzieller Diagnoseverfahren entwickelt wurde, gibt es somit immer noch eine beträchtliche Anzahl nahe verwandter Krankheitszustände oder Kombinationen von Krankheitszuständen, die einer schnellen, sicheren und zweifelsfreien Identifizierung bei geringen Kosten nicht zugänglich sind.
Darüber hinaus beruht eine Reihe von Diagnoseverfahren auf der Injektion körperfremder Flüssigkeiten oder anderer Arten der Übertragung diagnostischer Hilfsmittel auf oder in den untersuchten Organismus, oder erfordert Biopsien. Die Entfernung von Probengewebe aus Teilen des Organismus, die häufig nicht leicht zugänglich sind, kann auch einen nachteiligen Effekt auf den Identifizierungsvorgang und den Heilungsprozess selbst haben.
Es ist bekannt, dass bestimmte Krankheiten zu einer erhöhten Expression verschiedener Gene führen, was in einigen Fällen die Ursache für die Pathogenizität der fraglichen Krankheit oder des fraglichen Krankheitszustandes darstellen kann. Dementsprechend wurde das Screening auf das Vorliegen eines bestimmten Transkripts als Hinweis für das Vorliegen einer Krankheit beschrieben (siehe beispielsweise Enderlin et al., FEBS Letters, (1997), 412, Seiten 629-632). Verfahren zur Quantifizierung der Mengen verschiedener Transkripte über die Bindung an cDNA, die aus Genbibliotheken erhalten wurde, oder durch Sequenzierung und elektronischen Vergleich mit anderen Bibliotheken wurde beispielsweise beschrieben in Schena et al., (1996), PNAS USA, 93, Seiten 10614-10619; Schena et al., (1995), Science, 270, Seiten 467-470, Heller et al. (1997), PNAS USA, 94, Seiten 2150-2155 und der internationalen Patentanmeldung Nr. WO95/20681.
Ein schnelles und einfaches Verfahren unter Verwendung charakteristischer Muster der Genexpression während einer Krankheit oder anderen Krankheitszuständen oder Stadien davon als Mittel zur Diagnose und/oder Prognose, insbesondere ein Verfahren, das keine Kenntnis der Krankheitsmerkmale, der beteiligten Gene oder deren Sequenzen erfordert, wurde bisher jedoch nicht beschrieben.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass ein einfaches Diagnoseverfahren für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon durchgeführt werden kann, indem man einen charakteristischen Gentranskriptionsmuster-Standard oder Fingerabdruck (diagnostisches Sonden-Standardmuster) für diese Krankheit/diesen Krankheitszustand herstellt, und anschließend einen Vergleich des Transkriptionsmusters eines untersuchten Patienten oder Organismus mit diesem Muster anstellt. Der Standard wird durch Identifizierung einer Reihe spezifischer und informativer Sonden hergestellt, die als Satz von Markern für die zu identifizierende Krankheit, den Krankheitszustand oder deren/dessen Stadium dient. Diese Sonden werden an einen festen Träger gebunden und dann mit mRNA hybridisiert, die gegebenenfalls revers transkribiert und/oder amplifiziert wurde. Die Menge des Nukleinsäurematerials, das an die verschiedenen Sonden bindet, wird bestimmt und bildet insgesamt den Transkriptionsmuster-Standard dieser Krankheit, dieses Krankheitszustands oder deren/dessen Stadiums.
Um somit Krankheiten, Zustände des Unwohlseins oder andere Krankheitszustände zu identifizieren, die durch andere Organismen, Toxine, Stress, Altern, Umweltveränderungen usw. bei Menschen, Tieren, Pflanzen und allen anderen lebenden eukaryotischen und prokaryotischen Organismen hervorgerufen werden, kann ein Satz von Standard-Sondenmustern der Transkriptmengen eines oder mehrerer informativer Gene relativ zu einem Standard erstellt werden, wobei jedes dieser Standard-Sondenmuster für eine Art von Leiden oder einen Krankheitszustand und/oder ein Stadium solcher Leiden charakteristisch ist. Diese Standard-Sondenmuster werden anschließend unter Verwendung der gleichen Sonden mit einem Muster der Transkriptionsmengen verglichen, das aus einer neueren Gewebeprobe oder Körperflüssigkeitsprobe hergestellt wurde, welche vom zu diagnostizierenden Patienten entnommen wurde, wobei solche Muster für den aktuellen Krankheitszustand des Patienten spezifisch sind.
Reaktionen auf Infektionen, Toxine oder Verschlechterungen gehen üblicherweise mit Änderungen des Aktivitätsgrads mehrerer oder vieler Gene einher. Diese Aktivitätsgrade, die relativ betrachtet entweder höher oder niedriger sein können, sind zusammen spezifisch für die Art des angetroffenen Krankheitszustandes. Die normale Aktivität und die veränderte Aktivität kann zu einem großen Teil über die Menge an vorliegendem spezifischem Transkript oder mRNA gemessen werden. Somit können standardisierte Sonden für die Analyse entwickelt werden, die Aktivitätsmuster aufweisen, welche charakteristisch sind für jeden Krankheitszustand oder jede Kombination von Krankheitszuständen, der/die identifiziert oder diagnostiziert werden soll(en). Diese standardisierten Sonden können für einen Vergleich des standardisierten Sondenmusters mit Transkriptmustern aus Gewebe- oder Körperflüssigkeitsproben, die auf ähnliche Weise hergestellt wurden und von einem lebenden, zu untersuchenden Patienten oder dem Organismus gewonnen wurden, verwendet werden.
Für eine praktische Anwendung der Erfindung müssen zwei Arten von im Wesentlichen auf gleiche Weise entwickelten Diagnosesonden für einen Vergleich verfügbar sein.

1. Ein diagnostisches Sonden-Standardmuster (SDPP), das für das vermutete Leiden charakteristisch ist und auf der Basis eines oder mehrerer Organismen erstellt wurde, welche den fraglichen Krankheitszustand oder die fragliche Krankheit oder ein Stadium davon aufweisen und
2. ein patientenspezifisches Sondenmuster (PSPP), das aus einer neueren Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe eines zu untersuchenden Organismus erstellt wurde.

Um die Erfindung bei einem spezifischen Krankheitszustand anzuwenden, muss das Muster eines SDPP, das für das vermutete Leiden oder dessen Stadium charakteristisch ist, zuvor erstellt worden sein. Zusätzlich muss für einen Vergleich mit einem oder mehreren verschiedenen SDPPs für die Reihe von vermuteten Leiden und deren unterschiedlichen Stadien eine neuere, gut erhaltene Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe des Patienten für eine Erstellung des PSPP verfügbar sein.
Zur Entwicklung und Erstellung der Muster der SDPPs, die für ein Leiden charakteristisch sind, können bekannte Techniken der mRNA-Isolierung, der Konstruktion und Amplifizierung von cDNA und der Selektion über differenzielle Hybridisierung und differenzielles Display verwendet werden.
Ausgewählte informative mRNA- oder cDNA-Sonden eines oder mehrerer Patienten, für die zweifelsfrei das fragliche Leiden diagnostiziert wurde, werden isoliert und amplifiziert. Diese SDPPs zusammen werden verwendet, um zu vergleichen, ob das PSPP dem SDPP ähnelt. Repräsentativ für verschiedene Stadien des gleichen Leidens können mehrere solcher charakteristischer SDPPs erstellt werden.
Das Muster solcher Standardsonden für eine große Anzahl von Leiden und unterschiedlicher Stadien solcher Leiden kann in Datenbanken gesammelt und auf Anfrage Laboratorien zugänglich gemacht werden.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Gentranskriptionsmuster-Sondenkits zur Herstellung eines Musters, das in einem eukaryotischen Organismus für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon charakteristisch ist, wobei das Verfahren wenigstens die folgenden Schritte umfasst:

a) Isolierung von mRNA aus Proben des normalen Gewebes, normaler Zellen oder normaler Körperflüssigkeit, die aus einem oder mehreren normalen eukaryotischen Organismen isoliert wurden;
b) Isolierung von mRNA aus entsprechenden Proben kranken Gewebes, kranker Zellen oder kranker Körperflüssigkeit, welche aus einem oder mehreren Organismen gemäß Schritt a) isoliert wurden, die eine Krankheit oder einen Krankheitszustand von Interesse oder ein Stadium davon aufweisen;
c) Auftrennung der mRNA gemäß Schritt a) und b), die gegebenenfalls in cDNA revers transkribiert wurde, mit Hilfe einer nicht auf Sequenz basierenden Trenntechnik;
d) Auswahl zweier oder mehrerer mRNA- oder cDNA-Spezies, welche in unterschiedlichen Mengen in normalen Proben und kranken Proben enthalten sind;
e) Isolierung der mRNA- oder cDNA-Spezies, welche in Schritt d) identifiziert wurden;
f) gegebenenfalls die reverse Transkription der mRNA aus Schritt d) oder e) in cDNA, sofern dies nicht vorher in Schritt c) durchgeführt wurde; und
g) Immobilisierung der mRNA- oder cDNA-Sonden gemäß Schritt e) oder f) auf einem oder mehreren festen Trägern.

Eine Krankheit oder ein Krankheitszustand kann hier jeder Krankheitszustand, jedes Leiden, jede Krankheit oder Reaktion sein, die zu einer relativen Zunahme oder Abnahme der Aktivität informativer Gene irgendeines oder aller eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen führt, unabhängig davon, ob diese Veränderungen durch den Einfluss von Bakterien, Viren, Prionen, Parasiten, Pilzen, Strahlung, natürlichen oder künstlichen Toxinen, Wirkstoffen oder Allergenen, hervorgerufen wurden, einschließlich mentaler Krankheiten auf Grund von Stress, Neurose, Psychose oder Verschlechterungen auf Grund des Alterns des Organismus, und Krankheitszustände oder Krankheiten mit unbekannter Ursache.
Solche Krankheiten umfassen solche, die zu metabolischen oder physiologischen Änderungen führen, beispielsweise mit Fieber in Zusammenhang stehende Krankheiten wie Influenza oder Malaria. Weitere Krankheiten, die nachgewiesen werden können, umfassen beispielsweise Gelbfieber, durch Geschlechtsverkehr übertragene Krankheiten, wie beispielsweise Gonorrhöe, Fibromyalgie, in Zusammenhang mit Candida stehenden Komplex, Krebs (beispielsweise Magen-, Lungen-, Brust-, Prostatadrüsen-, Darm-, Hautkrebs, usw.), Alzheimer-Krankheit, durch Retroviren verursachte Krankheiten wie beispielsweise HIV, senile Demenz, Multiple Sklerose und Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, um nur einige zu nennen.
Die Erfindung kann auch zur Identifizierung von Patienten mit psychiatrischen oder psychosomatischen Krankheiten wie beispielsweise Schizophrenie und Essstörungen verwendet werden. Von besonderer Bedeutung ist die Verwendung des vorliegenden Verfahrens zum Nachweis von Krankheiten oder Stadien davon, die mit bekannten Diagnoseverfahren nicht einfach nachzuweisen sind, beispielsweise HIV, das im Allgemeinen unter Verwendung bekannter Techniken ein bis vier Monate nach der Infektion nicht nachweisbar ist. Krankheitszustände, die identifiziert werden können, umfassen beispielsweise Drogenmissbrauch, beispielsweise den Gebrauch von Narkotika, Alkohol, Steroiden oder leistungsteigernden Drogen. Das Diagnoseverfahren kann allein als Alternative zu anderen Diagnosetechniken oder zusätzlich zu solchen Techniken verwendet werden. Erfindungsgemäße Verfahren können beispielsweise als Alternative oder als zusätzliche Diagnosemaßnahme für eine Diagnose auf der Grundlage von Bildgebungsverfahren wie beispielsweise Kernspinresonanztomographie (MRI), Ultraschallabbildung, Isotopenabbildung oder Röntgenabbildung verwendet werden, beispielsweise bei der Identifizierung und/oder Diagnose von Tumoren.
„Stadien" davon bezieht sich unterschiedliche Stadien der Krankheit oder des Krankheitszustandes, die eventuell bestimmte physiologische oder metabolische Veränderungen zeigen oder nicht zeigen, aber Änderungen auf genetischer Ebene zeigen, die als veränderte Genexpression nachgewiesen werden können. Es ist ersichtlich, dass im Verlauf einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes die Expression verschiedener Transkripte variieren kann. In bestimmten Stadien zeigt sich somit unter Umständen keine unterschiedliche Expression bestimmter Transkripte im Vergleich mit „normalen" Proben. Jedoch werden informative Sonden unter solchen Transkripten ausgewählt, die eine veränderte Expression in einem oder mehreren Stadien durch den Verlauf der Krankheit hindurch zeigen, und die gemeinsam mit der Information hinsichtlich des Transkriptionsgrads anderer Transkripte verwendet werden können, um ein charakteristisches Muster bereitzustellen, das ein bestimmtes Stadium der Krankheit anzeigt. Solche informativen Sonden können gemäß dem oben beschriebenen Verfahren durch Vergleich der Transkripte normaler Proben mit Transkripten kranker Proben aus einem oder mehreren Stadien der Krankheit oder des Krankheitszustandes identifiziert werden, oder durch Vergleich unterschiedlicher Stadien der Krankheit oder des Krankheitszustandes miteinander.
Die prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen können hier beliebige eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Menschen, andere Säugetiere und Tiere, Vögel, Insekten, Fische und Pflanzen, und beliebige prokaryotische Organismen, wie beispielsweise Bakterien, sein.
„Gewebe" kann hier ein Gewebe sein, das im Verlauf einer Operation, beispielsweise durch Biopsie, oder über andere Mittel erhalten wurde. „Zellen" umfassen aus Geweben oder Körperflüssigkeiten oder Körperausscheidungen isolierte Zellen, oder im Fall von prokaryotischen Organismen den Organismus selbst. „Körperflüssigkeiten" umfassen Urin, Blut, Sperma usw. Es ist jedoch ersichtlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Standard-Transkriptionsmusters und das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren auch auf lebende Teile eukaryotischer Organismen, wie beispielsweise Zelllinien und Organkulturen und Explantate anwendbar sind.
„Normal" bezieht sich hier auf Organismen oder Proben, die zu Vergleichszwecken verwendet werden. Diese sind vorzugsweise „normal" in dem Sinn, dass bei ihnen kein Anzeichen für irgendeine Krankheit oder einen Krankheitszustand vorliegt, die/der eine Genexpression beeinflussen würde, insbesondere hinsichtlich der Krankheit, für die sie als Standard verwendet werden sollen, oder dass von ihnen nicht angenommen wird, eine solche Krankheit oder ein solcher Krankheitszustand läge vor. Es ist jedoch ersichtlich, dass unterschiedliche Stadien einer Krankheit oder eine Krankheitszustandes verglichen werden können, wobei in solchen Fällen die „normale" Probe dem früheren Stadium der Krankheit oder des Krankheitszustandes entspricht. „Kranke" Proben und Organismen umfassen Proben und Organismen, die mit einem Leiden oder einem bestimmten Krankheitszustand behaftet sind, und stellen solche dar, welche die untersuchte Krankheit oder den untersuchten Krankheitszustand oder ein Stadium davon aufweisen oder zeigen.
„Komplementäre Stränge" wird im üblichen Sinn verwendet und bezieht sich auf DNA-Stränge, die in jeder Basenposition zu der Template-cDNA komplementär sind, von der sie abgeleitet sind. „cDNA" umfasst hier Erststrang-cDNA, die durch reverse Transkription von RNA hergestellt wurde, und zur cDNA des ersten Stranges komplementäre Stränge, nämlich Zweitstrang-cDNA.
„Unterschiedliche Mengen" von Nukleinsäurespezies bezieht sich auf quantitative oder qualitative Unterschiede, die eine differenzielle Expression nahe legen. Eine „Sonde" kann ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle umfassen, die gleich oder verschieden sein können (d.h. ein Gemisch), aber als Gesamtheit in den normalen und den kranken Proben differenziell exprimiert werden. Wenn unterschiedliche Stadien der Krankheit/des Krankheitszustandes untersucht werden, sollte eine differenzielle Expression der den Sonden entsprechenden Transkripte entweder im Vergleich mit einer krankheitsfreien Probe oder im Vergleich mit einem unterschiedlichen Stadium der Krankheit/des Krankheitszustandes gezeigt werden. Im Allgemeinen sind solche Sonden cDNA, die aus mRNA revers transkribiert wurden, oder deren komplementäre Stränge, obwohl die mRNA selbst ebenfalls verwendet werden kann. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass man ein DNA-Fragment als Template für die Sonde durch Insertion in einen Vektor hinter einem T3- oder ähnlichen Promotor verwendet. Es ist jedoch ersichtlich, dass dieses Nukleinsäurematerial ohne Beeinträchtigung der Leistungsfähigkeit der vorliegenden Erfindung modifiziert werden kann, sofern eine Hybridisierung mit den Nukleinsäuremolekülen der Probe noch möglich ist. Die Nukleinsäuremoleküle, auf die hier Bezug genommen wird, beispielsweise mRNA und cDNA, umfassen somit Moleküle, die modifiziert sind (z.B. methyliert) oder die modifizierte oder nicht-natürliche Basen umfassen, die bei der Herstellung der cDNA oder während der Amplifizierung verwendet werden können. Ähnliche Überlegungen gelten für beliebige hier beschriebene Nukleinsäuremoleküle. Die in den Proben vorliegenden Transkripte können somit beispielsweise in Form von RNA vorliegen oder in modifizierte Formen von RNA und/oder in modifizierte oder unmodifizierte Formen von DNA geändert werden und/oder in Form von Primern, Antikörpern oder anderen Molekülen, welche die Zielsonden erkennen und binden, insbesondere über spezifische Hybridisierung an die Zielsonden, vorliegen.
„Bestimmen" bezieht sich hier sowohl auf quantitative als auch auf qualitative Bestimmung, welche mit absoluten oder relativen Angaben vorgenommen werden kann. Das charakteristische „Muster", das über diese Technik erzeugt wird, bezieht sich auf Information, die beispielsweise in tabellarischer oder graphischer Form dargestellt werden kann, und Informationen über das mit zwei oder mehreren Sonden assoziierte Signal vermittelt.
Eine Bezugnahme auf „entsprechende" Gewebe usw. bezieht sich hierin auf vorzugsweise das gleiche Gewebe, die gleichen Zellen oder die gleiche Flüssigkeit, umfasst aber auch Gewebe, Zellen oder Flüssigkeit, die zum Zwecke des Herstellens des Standards ausreichend ähnlich sind. Wenn dieser Ausdruck im Zusammenhang mit Genen, die den Sonden „entsprechen" verwendet wird, bezieht er sich auf Gene, die über ihre Sequenz (die komplementär sein kann) mit den Sonden verwandt sind, obwohl die Sonden unterschiedliche Splice-Produkte der Expression darstellen können. Dementsprechend können für eine einzelne Krankheit zwei unterschiedliche Sonden erstellt werden, die vom selben Gen transkribiert werden, aber unterschiedliche Splice-Vorgänge reflektieren. Die Verwendung von Sonden, die eine veränderte Genexpression zweier oder mehrerer verschiedener Gene wiedergeben, ist jedoch bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung betrifft sowohl ein Diagnoseprinzip als auch ein Verfahren zur Identifizierung von Krankheiten, Zuständen des Unwohlseins und Syndromen in beliebigen eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen, wie auch das zugehörige Verfahren für die Entwicklung und Erstellung diagnostischer Sonden zur Verwendung bei den jeweiligen Messungen, die erforderlich sind, um eine spezifische Diagnose zu stellen oder die betreffenden Krankheitszustände zu identifizieren.
Die Erfindung betrifft ein schnelles und genaues Verfahren zur Diagnose jeder Krankheit oder jedes Krankheitszustandes, die/der zu Veränderungen der Aktivität von Genen in einem Muster führt, das für jeden bestimmten Krankheitszustand des untersuchten Organismus spezifisch ist.
Die Fähigkeit zum Entwurf diagnostischer Standard-Sonden für die Identifizierung üblicher Krankheitszustände, die gegenwärtig schwierig zu identifizieren sind, wie auch die Fähigkeit zur schnellen Anpassung des Entwurfs an die Herstellung neuer Sonden zur Identifizierung möglicher neuer Krankheitszustände, sobald diese identifiziert sind, wird sich daher als von großem Nutzen erweisen.
Beginnend mit den sehr frühen Stadien von Krankheiten, die durch Infektionen, toxische Substanzen, Altern oder andere Umstände, welche die Lebensqualität lebender eukaryotischer Organismen verändern, reagiert der gesamte Organismus auf die veränderten Umstände. Die Reaktion tritt im ganzen Organismus auf, selbst wenn nur ein geringer Teil des Organismus betroffen zu sein scheint. Die Reaktion dauert an, bis der Krankheitszustand geheilt ist oder der Tod des betroffenen Organismus eintritt.
Die Vorteile der Erfindung sind sowohl primärer als auch sekundärer Natur. Gewebe- oder Körperflüssigkeitsproben können von Teilen des Organismus erhalten werden, die vom untersuchten Krankheitszustand nicht betroffen sind. Eine Probe reicht für eine vollständige Identifizierung, wodurch große Einsparungen an Kosten, Zeit und Aufwand erzielt werden können, indem eine Einweisung ins Krankenhaus vermieden wird, die bei den üblichen, umfassenden Reihen diagnostischer Tests anfällt, die an menschlichen oder anderen tierischen Patienten vorgenommen werden.
Um zur Identifizierung des Krankheitszustandes beizutragen ist es nicht erforderlich, Fremdsubstanzen auf den Körper des untersuchten Organismus anzuwenden oder in diesen einzubringen, womit die Erfindung das Risiko anaphylaktischer Reaktionen auf solche induzierten diagnostischen Substanzen verringert.
Die Erfindung hat das Potential, die meisten Krankheiten und Syndrome somatischer, psychosomatischer und mentaler Art, wie auch eine Zustandsverschlechterung auf Grund des Alterns des Organismus, nachzuweisen. Das Verfahren kann zusätzlich dafür verwendet werden, die Reaktionen des Organismus auf toxische Substanzen, Strahlung, Pestizide, Antibiotika, Wirkstoffe, Allergene und Kombinationen mehrerer solcher Faktoren nachzuweisen.
Die Erfindung ermöglicht es weiterhin, Krankheiten und unerwünschte Krankheitszustände in einem Organismus in sehr frühen Stadien zu erkennen, sogar Jahre vor dem Auftreten anderer subjektiver oder objektiver Symptome.
Das Prinzip wird selbst in Fällen von Nutzen sein, in denen der Patient an einem bis dahin nicht identifizierten Krankheitszustand stirbt und die Todesursache nicht festgestellt wird, bis eine gerichtsmedizinische post-mortale Untersuchung durchgeführt wurde. Wenn eine Reihe patientenspezifischer Sondenmuster in dem Versuch erstellt wurden, für den Patienten vor dessen Tod eine Diagnose zu stellen, können diese Sonden für die Entwicklung neuer Standard-Sondenmuster verwendet werden, die zur Diagnose späterer Fälle ähnlicher Krankheitszustände verwendet werden können.
Die zur Anwendung der Erfindung erforderlichen analytischen Geräte und Ausrüstungsgegenstände sind in Laboratorien, die mit biochemischen und biotechnologischen Routinearbeiten befasst sind, ohne Weiteres verfügbar.
Um mit der Herstellung des Gentranskriptionsmuster-Sondenkits zu beginnen, wird mRNA aus den Geweben, Zellen oder der Körperflüssigkeit mit bekannten Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et. al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) aus einem normalen Individiuum oder Organismus extrahiert.
mRNA wird ebenfalls extrahiert, vorzugsweise aus dem gleichen Körperteil eines entsprechenden Individuums oder Organismus, bei dem die Krankheit oder der Krankheitszustand vorliegt, für den ein diagnostisches Standardmuster erzeugt werden soll. Auf Grund der Schwierigkeiten beim Arbeiten mit RNA wird die RNA in diesem Stadium vorzugsweise unter Bildung einer Erststrang-cDNA revers transkribiert, obwohl dies nach Auftrennung und Identifizierung der Transkripte von Interesse erfolgen kann, wenn cDNA-Sonden hergestellt werden sollen. Bei diesem oder anderen erfindungsgemäßen Verfahren ist jedoch die Klonierung der cDNA oder die Selektion aus einer cDNA-Bibliothek, oder die Benutzung einer cDNA-Bibliothek, nicht erforderlich.
Es werden vorzugsweise die komplementären Stränge der Erststrang-cDNAs synthetisiert, d.h. Zweitstrang-cDNAs, was aber davon abhängt, welche Stränge zur Verwendung als Sonden vorgesehen sind, und von der Art der Nukleinsäuremoleküle in der während des Diagnoseverfahrens mit den Sonden zu untersuchenden Probe abhängt. Die Zweitstrang-cDNA-Stränge werden vorzugsweise zur Sondierung von cDNA-Strängen verwendet, die durch reverse Transkription der Proben-mRNA hergestellt wurden.
Die cDNA-Stränge werden vorzugsweise über bekannte Amplifizierungstechniken wie beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert. Alternativ können die cDNA-Stränge mit einem Vektor kloniert werden, der zur Transformation eines Bakteriums wie beispielsweise E.coli verwendet wird, das dann zur Vervielfältigung der Nukleinsäuremoleküle kultiviert werden kann. Wenn die Sequenz der cDNAs nicht bekannt ist, können Primer gegen Regionen der Nukleinsäuremoleküle gerichtet sein, die eingeführt wurden. Wie in den Beispielen hier beschrieben, können dementsprechend beispielsweise Adapter an die cDNA-Moleküle ligiert werden und zur Amplifizierung der cDNA-Moleküle Primer gegen diese Bereiche gerichtet werden. Im Fall eukaryotischer Proben kann alternativ der polyA-Schwanz und die cap-Region der RNA zur Herstellung geeigneter Primer ausgenutzt werden.
Die Auftrennung der normalen und der kranken Proben-mRNA oder -cDNA wird getrennt für jede Probe unter Verwendung von nicht auf Sequenz basierenden Trenntechniken durchgeführt, die jede beliebige Technik sein können, welche die Unterscheidung zwischen Transkripten und deren entsprechenden cDNAs ermöglichen, ohne die Sequenzinformation bestimmter Transkripte zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen Transkripten/cDNA zu verwenden. Dies schließt jedoch nicht die Möglichkeit aus, beispielsweise Sonden zu verwenden, die Markierungen zur Erzeugung von Signalen auf den Transkripten tragen, wenn die Sonden gegen Sequenzen gerichtet sind, die allen oder den meisten der Transkripten gemeinsam sind, wobei die Sequenzen nicht zum Zwecke der Unterscheidung der Transkripte verwendet werden. Dementsprechend kann mRNA oder cDNA praktischerweise durch elektrophoretische Trennung in einem Agarose- oder Polyacrylamidgel oder einem ähnlichen, für die Trennung der Nukleinsäuremoleküle geeigneten Gel aufgetrennt werden. Alternativ können die Produkte über Gaschromatographie oder HPLC oder ähnliche Techniken aufgetrennt werden (Trenntechniken auf der Grundlage von Sequenzen, die ausgeschlossen sind, umfassen beispielsweise den Einfang mit Sonden, die gegen unterschiedliche Sequenzen gerichtet sind, über Hybridisierung, oder Sequenzierung).
Solche Verfahren bieten den Vorteil, dass in erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Sonden aus der ganzen Population von Transkripten oder cDNA identifiziert und ausgewählt werden, da vor der Trennung keine Selektion auf der Grundlage von deren Sequenz vorgenommen wird, z.B. über Hybridisierung an immobilisierte Nukleinsäure aus Kontrollproben. Die Identifizierung der Transkripte weist somit keine Präferenz für die Selektion bestimmter Transkripte aus einer Teilmenge der gesamten Transkripte auf.
Um einen Vergleich zwischen den Proben zu ermöglichen, sollte die Trennung der Transkripte/cDNA bei den normalen und kranken Proben so gleichzeitig wie möglich durchgeführt werden, z.B. in aufeinander folgenden Läufen oder auf demselben Gel.
Zur Identifizierung der verschiedenen Transkripte oder der cDNA ist es erforderlich, ein Signal zu identifizieren, das jedem Transkript/jeder cDNA entspricht. Dies kann praktischerweise durch Verwendung einer radiaktiven oder anderen Markierung erfolgen, die während der Erzeugung der cDNA oder während der Amplifizierung eingebaut werden kann.
Geeignete Markierungen sind solche, die direkt oder indirekt den Nachweis oder die Messung des Vorliegens der Transkripte/cDNA ermöglichen. Solche Markierungen umfassen beispielsweise Radiomarkierungen, chemische Markierungen, beispielsweise Chromophore oder Fluorophore (z.B. Farbstoffe wie Fluorescein und Rhodamin), oder Reagenzien hoher Elektronendichte wie beispielsweise Ferritin, Hämocyanin oder kolloidales Gold. Alternativ kann die Markierung ein Enzym sein, beispielsweise Peroxidase oder alkalische Phosphatase, wobei das Vorliegen des Enzyms durch dessen Wechselwirkung mit einer geeigneten Einheit, beispielsweise einem Substrat, sichtbar gemacht wird. Die Markierung kann auch einen Teil eines Signalpaars bilden, worin der andere Partner des Paares auf oder in unmittelbarer Nähe zur Zielsonde vorliegt, an welche das Transkript/die cDNA bindet, beispielsweise können eine fluoreszierende Verbindung und ein quenchendes Substrat verwendet werden. Eine Markierung kann auch auf einer unterschiedlichen Einheit bereitgestellt werden, beispielsweise einem Antikörper, der einen Peptidrest erkennt, welcher an die Transkripte/cDNA gebunden ist, beispielsweise an eine Base, die während der Synthese oder Amplifizierung verwendet wird.
Ein Signal kann durch die Einführung einer Markierung vor, während oder nach dem Trennschritt bewirkt werden. Beispielsweise könnte somit ein Gel, auf dem die Transkripte aufgetrennt wurden, mit markierten polyT-Oligonukleotiden sondiert werden, oder cDNA könnte mit markierten polyA-Oligonukleotiden oder mit markierten Oligonukleotiden, die gegen eine durch Ligation und/oder Amplifzierung eingeführte Sequenz gerichtet sind, sondiert werden. Alternativ kann das Vorliegen von Transkripten über weitere physikalische Eigenschaften, beispielsweise deren Extinktion, bestimmt werden, wenn Techniken wie beispielsweise Gaschromatographie oder HPLC für die Trennung verwendet werden.
In Abhängigkeit von der für die Trennung verwendeten Technik können die Signale verschiedener Transkripte oder deren cDNAs überlappen und werden möglicherweise nicht vollständig aufgelöst. Während Sonden hergestellt werden können, die ein Gemisch von Transkripten oder von deren cDNA enthalten (das Bereitstellen des Gemisches als Ganzes zeigt differenzielle Expression in normalen und kranken Proben), kann gegebenenfalls das Gemisch aus Transkripten/cDNA extrahiert und wiederholten oder alternativen Trenntechniken unterworfen werden, um eine kleinere Population von Transkripten/cDNAs zu isolieren, welche die geänderte Expression aufzeigen.
Es werden Nukleinsäurespezies identifiziert, die im Vergleich von normalen mit kranken Proben, oder in wenigstens einem Stadium der Krankheit eine differenzielle Expression aufweisen. Dies erfordert einen Vergleich der von den normalen und den kranken Proben erzeugten Signale. Transkripte/cDNAs von Interesse sind solche, die, wie durch unterschiedliche Signalmengen angezeigt, in den verschiedenen Proben differenziell exprimiert sind. Dies kann einer Spezies entsprechen, die in der kranken Probe vorliegt und in der normalen Probe nicht vorliegt, oder umgekehrt. Auf diese Weise reflektiert sich sowohl Genexpression, die angestellt ist, als auch Genexpression, die abgestellt ist. Dies bietet entscheidende Vorteile gegenüber Verfahren nach dem Stand der Technik, bei denen eine veränderte Genexpression relativ zu normalen Proben identifiziert wird (wobei cDNA aus normalen Bibliotheken als Hybridisierungstemplate verwendet wird, an das Proben-mRNA gebunden wird, und der relative Unterschied zwischen „normalen" und „kranken" Proben gemessen wird). Das erfindungsgemäße Verfahren kann somit Gene identifizieren, die nicht konstitutiv oder nur zu einem geringen Grad in normalen Proben exprimiert werden, aber bei der fraglichen Krankheit/dem fraglichen Krankheitszustand, oder wenigstens einem Stadium davon aktiviert sind.
Transkripte/cDNA, die eine Variation des Ausmaßes der Expression reflektieren, können verwendet werden, aber vorzugsweise werden solche Spezies verwendet, die ausgeprägte Unterschiede reflektieren, z.B. Fehlen oder Vorliegen eines Transkripts/einer cDNA.
Nach ihrer Identifizierung werden die mRNA- oder cDNA-Spezies (die ein Gemisch aus Molekülen unterschiedlicher Sequenzen sein können) isoliert. Zur Herstellung eines diagnostischen Standardmusters werden zwei oder mehr Spezies (Sonden) isoliert, die eine veränderte Genexpression in wenigstens einem Stadium der Krankheit oder des Krankheitszustands reflektieren. Während in einigen Fällen bereits zwei Sonden ausreichen können, um ein diagnostisches Standardmuster für einen bestimmten Krankheitszustand oder eine bestimmte Krankheit oder ein Stadium davon zu erzeugen, ist ersichtlich, dass eine Erhöhung der Zahl der Sonden die Möglichkeit einer Fehldiagnose durch Vergleich mit anderen Krankheiten, welche die Expression der bestimmten fraglichen Gene in ähnlicher Weise verändern könnten, verhindert. Dementsprechend werden vorzugsweise zwischen 2 und 1000 Sondenspezies für die Isolierung ausgewählt, besonders bevorzugt zwischen 10 und 500, besonders bevorzugt 50 und 100, beispielsweise 70 Sondenspezies. Diese Sonden reflektieren Gene, die bei den fraglichen Krankheiten oder Krankheitszuständen eine veränderte Expression aufweisen, oder bestimmte Stadien davon werden als „informativ" in Bezug auf diese bestimmte Krankheit in dem untersuchten Organismus erachtet, und nur solche Proben mit dieser Informationseigenschaft werden ausgewählt.
Eine Isolierung kann über Selektion geeigneter Fraktionen vorgenommen werden, wenn die Trennung beispielsweise auf einer Säule vorgenommen wurde, oder über physikalische Entfernung von der Trennmatrix, beispielsweise dem Ausschneiden von Gelstücken, welche die Nukleinsäurespezies von Interesse enthalten. Die darin enthaltene Nukleinsäuremoleküle werden dann isoliert und, falls für die nachfolgenden Schritte erforderlich, aufgereinigt, vorzugsweise mit Amplifizierung.
In Fällen, bei denen die Transkripte selbst abgetrennt und isoliert wurden, können diese dann in cDNA umgewandelt werden, vorzugsweise mit Amplifzierung.
Die mRNA- oder cDNA-Sondenspezies, die gemäß dem obigen Verfahren hergestellt wurden, werden dann auf einem festen Träger immobilisiert, um den Sondenkit oder Gentranskriptionsmuster- (oder Fingerabdruck-) Sondenkit der Krankheit oder des Krankheitszustandes herzustellen. Dem Fachmann sind zahlreiche feste Träger bekannt, die als immobilisierende Gruppen für Nukleinsäuremoleküle geeignet sind und in der Literatur umfassend beschrieben sind, und im Allgemeinen kann der feste Träger jeder beliebige der allgemein bekannten Träger oder Matrizes sein, die gegenwärtig für die Immobilisierung, Abtrennung usw. in chemischen und biochemischen Verfahren umfassend verwendet oder vorgeschlagen werden. Die immobilisierenden Gruppen können somit beispielsweise in Form von Partikeln, Blättern, Gelen, Filtern, Membranen, Mikrofaserstreifen, Röhren oder Platten, Fasern oder Kapillaren vorliegen, die beispielsweise aus einem polymeren Material, z.B. Agarose, Cellulose, Alginat, Teflon, Latex oder Polystyrol bestehen. Im Allgemeinen sind partikuläre Materialien, z.B. Beads, bevorzugt. Die immobilisierende Gruppe kann praktischerweise magnetische Partikel umfassen, beispielsweise superparamagnetische Partikel.
Die Bindung der Nukleinsäuremoleküle an den festen Träger kann direkt oder indirekt erfolgen. Wenn beispielsweise ein Filter verwendet wird, kann die Bindung über UV-induzierte Vernetzung erfolgen. Die Bindung kann alternativ indirekt unter Verwendung einer Bindungsgruppe durchgeführt werden, die von den Nukleinsäuremolekülen und/oder dem festen Träger getragen wird. Beispielsweise kann dementsprechend ein Paar aus Affinitätsbindungspartnern verwendet werden, beispielsweise Avidin, Streptavidin oder Biotin, DNA oder DNA-bindendes Protein (z.B. entweder das lac I-Repressorprotein oder die lac-Operatorsequenz, an welche dieses bindet), Antikörper (die mono- oder polyklonal sein können), Antikörperfragmente oder die Epitope oder Haptene von Antikörpern. In diesen Fällen wird ein Partner des Bindungspaares an den festen Träger gebunden (oder ist ein inhärenter Teil davon) und der andere Partner wird an die Nukleinsäuremoleküle gebunden (oder ist inhärenter Teil davon).
Die Bindung geeigneter funktioneller Gruppen an den festen Träger kann über Methoden erfolgen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, und beispielsweise die Bindung über Hydroxyl-, Carboxyl-, Aldehyd- oder Aminogruppen umfassen, welche bereitgestellt werden können, indem der feste Träger so behandelt wird, dass er geeignete Oberflächenbeschichtungen bereitstellt. Die Bindung geeigneter funktioneller Gruppen an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kann durch Ligation erfolgen oder während der Synthese oder Amplifizierung eingeführt werden, beispielsweise unter Verwendung von Primern, die eine geeignete Gruppe tragen, beispielsweise Biotin oder eine bestimmte Einfangsequenz.
Die individuellen Sonden bilden Module des Kits und können auf einem oder mehreren festen Trägern vorliegen. Die festen Träger der verschiedenen Module sind praktischerweise physikalisch assoziiert, obwohl die Signale jeder Sonde getrennt bestimmbar sein müssen. Dementsprechend können beispielsweise Platten mit mehreren Wells als fester Träger verwendet werden, wobei unterschiedliche Sonden in den verschiedenen Wells vorliegen, oder Bereiche eines festen Trägers können die verschiedenen Module umfassen, beispielsweise können die verschiedenen mRNA- oder cDNA-Sonden an getrennten Stellen an einen Filter gebunden sein.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung eines Gentranskriptionsmuster-Sondenkits zur Erzeugung eines Musters, das für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon in einem eukaryotischen Organismus charakteristisch ist, bereitgestellt, welches wenigstens die folgenden Schritte umfasst:

a) Isolierung von mRNA aus Proben eines normalen Gewebes, normaler Zellen oder normaler Körperflüssigkeit, die aus einem oder mehreren eukaryotischen Organismen isoliert wurden;
b) Isolierung von mRNA aus entsprechenden Proben kranken Gewebes, kranker Zellen oder kranker Körperflüssigkeit, welche aus einem oder mehreren Organismen gemäß Schritt a) isoliert wurden, die die Krankheit oder den Krankheitszustand von Interesse oder ein Stadium davon aufweisen;
c) reverse Transkription der mRNA gemäß den Schritten a) und b) in cDNA;
d) gegebenenfalls Amplifizierung der Stränge, gegebenenfalls Einbau einer Markierung in die Stränge;
e) Auftrennung der cDNA gemäß Schritt d) mit Hilfe einer nicht auf Sequenz basierenden Trenntechnik;
f) Auswahl zweier oder mehrerer cDNA-Spezies, welche in unterschiedlichen Mengen in den normalen Proben und den kranken Proben enthalten sind;
g) Isolierung der cDNA-Spezies, die in Schritt f) identifiziert wurden; und
h) Immobilisierung der cDNA-Proben gemäß Schritt g) auf einem oder mehreren festen Trägern.

Die gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Gentranskriptionsmuster-Sondenkits können für die Diagnose oder Identifizierung einer bestimmten Krankheit/eines bestimmten Krankheitszustandes oder eines Stadiums davon in einem bestimmten Individuum/Organismus oder für die Herstellung eines diagnostischen Gentranskriptionsmuster-Standards verwendet werden.
Für die Diagnose, Identifizierung oder Herstellung eines diagnostischen Gentranskriptionsmuster-Standards einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes oder eines Stadiums davon in einem eukaryotischen Organismus kann ein Gentranskriptionsmuster-Sondenkit verwendet werden, der wenigstens Folgendes umfasst:

a) einen oder mehrere feste Träger, die zwei oder mehr erfindungsgemäße Sondenspezies tragen, welche Transkripten entsprechen, die eine Genexpression eines oder mehrerer ausgewählter Gene reflektieren, welche für den Krankheitszustand oder die Krankheit oder das Stadium davon in dem untersuchten Organismus charakteristisch sind.

Der Kit kann gegebenenfalls auch Informationen hinsichtlich der von normalen und kranken Proben erzeugten Signale, standardisierende Materialien, z.B. mRNA oder cDNA aus normalen und/oder kranken Proben für Vergleichszwecke, Markierungen zum Einbau in cDNA, Adapter zur Einführung von Nukleinsäuresequenzen für Amplifizierungszwecke, Primer für Amplifizierung und/oder geeignete Enzyme, Puffer und Lösungen enthalten.
Die Verwendung solcher Kits zur Herstellung diagnostischer Gentranskriptionsmuster-Standards stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar, wie unten beschrieben wird.
Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Gentranskriptionsmuster-Standards, der für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon in einem eukaryotischen Organismus charakteristisch ist, welches wenigstens die folgenden Schritte umfasst:

a) Isolierung von mRNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeit, die aus einem oder mehreren der Organismen isoliert wurden, welche die Krankheit, den Krankheitszustand oder ein Stadium davon aufweisen, die gegebenenfalls in cDNA revers transkribiert wird,
b) Hybridisierung der mRNA oder cDNA aus Schritt a) mit den mRNA- oder cDNA-Sonden auf einem erfindungsgemäßen Kit, wobei die Sonden spezifisch für die Krankheit oder den Krankheitszustand oder das Stadium davon in dem Gewebe, den Zellen oder der Körperflüssigkeit eines Organismus sind, welche dem untersuchten Gewebe, den untersuchten Zellen oder der untersuchten Körperflüssigkeit und dem untersuchten Organismus entsprechen; und
c) Bestimmung der Menge an mRNA oder cDNA, die mit jeder der Sonden auf dem(n) festen Träger(n) hybridisiert, um ein charakteristisches Muster zu erzeugen, welches die Genexpression in der Probe mit der Krankheit, dem Krankheitszustand oder dem Stadium davon für ein oder mehrere ausgewählte Gene, die den Sonden entsprechen, reflektiert.

Zur Herstellung des diagnostischen Gentranskriptionsmuster-Standards oder Fingerabdrucks für eine bestimmte Krankheit oder einen bestimmten Krankheitszustand oder ein Stadium davon wird der oben hergestellte Sondenkit zur Sondierung von mRNA oder cDNA einer kranken Probe verwendet, wodurch ein Signal für die Hybridisierung mit jeder bestimmten Sondenspezies erzeugt wird, die an den festen Träger gebunden ist, d.h. den Modulen des Kits. Falls gewünscht, kann ein Kontrollgentranskriptionsmuster-Standard unter Verwendung von mRNA aus einer normalen Probe hergestellt werden. Dementsprechend wird Gesamt-mRNA, die auf dieselbe Weise wie oben beschrieben isoliert wurde, oder deren cDNA (in Abhängigkeit von der Komplementarität der Sondenspezies auf dem Modul des Sondenkits) einer kranken Probe (entsprechend der Krankheit, gegen welche die Sonden gerichtet sind) (gegebenenfalls auch eine normale Probe) unter geeigneten Bedingungen mit den Sondenspezies auf den Modulen des Sondenkits hybridisiert. Wenn beide Proben sondiert werden, kann dies nacheinander auf denselben Modulen des Sondenkits oder gleichzeitig durch Hybridisierung mit den Modulen eines entsprechenden Sondenkits erfolgen.
Um einen Hinweis auf die Anzahl von Transkripten/cDNA-Molekülen zu erhalten, die an die Module des Sondenkits gebunden werden, wird das Signal nachgewiesen, das bei der Hybridisierung der Transkripte erzeugt wird (z.B. durch Nachweis doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle oder Nachweis der Moleküle, die binden, nachdem nicht-gebundene Moleküle entfernt wurden, z.B. durch Waschen). In letzterem Fall werden vorzugsweise markierte mRNA-/cDNA-Moleküle als Probe verwendet, beispielsweise durch Einbau radiomarkierter Basen während der reversen Transkription, der Erzeugung komplementärer cDNA-Stränge oder der Amplifizierung. Die Signalmenge wird dann für jedes Modul des Sondenkits bestimmt. Die Bestimmung kann quantitativ oder qualitativ sein und auf der Bindung einer einzelnen Transkript-Spezies an jede Sonde, einer Kombination von Transkripten, oder repräsentativen Formen der Transkripte, wie beispielsweise cDNA oder modifizierten Nukleinsäuremolekülen, wie oben beschrieben, beruhen. Es ist ersichtlich, dass die quantitativen Ergebnisse weitere Informationen für den Transkript-Fingerabdruck der Krankheit, der erstellt wird, liefern. Diese Daten können als absolute Werte ausgedrückt werden oder relativ zu einem bestimmten Standard oder einem Ergebnis eines Sondenmoduls bestimmt werden. Der Wert des Signals der normalen Probe kann von dem Signal der kranken Probe abgezogen werden, wenn der erstgenannte Wert bestimmt wird, obwohl vorzugsweise die Ergebnisse aus Testproben mit dem erzeugten, nicht-standardisierten Fingerabdruck der Krankheit verglichen werden.
Es ist weiterhin ersichtlich, dass das Transkript des diagnostischen Gentranskriptionsmuster-Standards unter Verwendung der Ergebnisse einer oder mehrerer kranker und/oder normaler Proben hergestellt werden kann, um Sonden für den Probenkit zu identifizieren, und eine oder mehrere kranke Proben (und, falls verwendet, normale Proben) können verwendet werden, um den Hybridisierungsschritt für den Erhalt des diagnostischen Gentranskriptionsmuster-Standards durchzuführen.
Die Verwendung solcher Kits und diagnostischer Gentranskriptionsmuster-Standards für die Identifizierung oder Diagnose einer bestimmten Krankheit oder eines bestimmten Krankheitszustandes oder eines Stadiums davon in einem bestimmten Organismus stellt einen weiteren Aspekt der Erfindung dar, wie in den Ansprüchen dargelegt ist.
Sobald ein diagnostischer Standard-Fingerabdruck oder ein diagnostisches Standardmuster für eine bestimmte Krankheit oder einen Krankheitszustand unter Verwendung der ausgewählten Sondenspezies bestimmt wurde, kann diese Information dazu verwendet werden, das Vorliegen, Fehlen oder das Ausmaß dieser Krankheit oder dieses Krankheitszustandes in einem unterschiedlichen Organismus oder Individuum zu bestimmen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Diagnose oder Identifizierung einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes oder eines Stadiums davon in einem eukaryotischen Organismus, welches wenigstens die folgenden Schritte umfasst:

a) Isolierung von mRNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeit, isoliert aus dem Organismus, welche gegebenenfalls in cDNA revers transkribiert werden kann;
b) Hybridisierung der mRNA oder cDNA aus Schritt a) mit einem erfindungsgemäßen Kit, der spezifisch ist für die Krankheit oder den Krankheitszustand oder ein Stadium davon in dem Gewebe, den Zellen oder der Körperflüssigkeit eines Organismus, die dem untersuchten Gewebe, den untersuchten Zellen oder der untersuchten Körperflüssigkeit und dem untersuchten Organismus entsprechen;
c) Bestimmung der Menge an mRNA oder cDNA, welche mit jeder der Sonden auf den festen Trägern hybridisiert, wobei ein charakteristisches Muster erzeugt wird, welches die Genexpression für ein oder mehrere ausgewählte Gene, welche den Sonden entsprechen, reflektiert;
d) Vergleichen dieses Musters mit einem diagnostischen Standardmuster, erzeugt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung entsprechender Proben aus einem oder mehreren Organismen, welche dem untersuchten Organismus entsprechen, der die Krankheit, den Krankheitszustand oder das Stadium davon, das untersucht wird, aufweist, um den Korrelationsgrad zu bestimmen, der auf das Vorliegen der Krankheit, des Krankheitszustandes oder des Stadiums davon in dem untersuchten Organismus hinweist.

Der für die Bestätigung des Vorliegens, des Fehlens oder des Ausmaßes einer Krankheit oder eines Krankheitszustandes erforderliche Korrelationsgrad berücksichtigt notwendigerweise den Bereich der Werte, die für normale und kranke Proben erhalten werden Obwohl dies durch Berechnung der Standardabweichungen für mehrere repräsentative Proben, die an die Sonden zur Erstellung des Standards binden, erfolgen kann, ist ersichtlich, dass einzelne Proben ausreichen können, um das Standardmuster für die Identifizierung einer Krankheit zu erzeugen, falls die Testprobe eine ausreichend hohe Korrelation mit diesem Standard aufweist.
Das Diagnoseverfahren kann zur Identifizierung, Quantifizierung oder Diagnose einer Krankheit, eines Krankheitszustandes oder Leidens oder dessen Stadium oder Verlauf, beispielsweise Krebs beim Menschen oder Boviner Spongiformer Enzephalopathie beim Rind, verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch verwendet werden, um den Krankheitszustand/Zustand von Pflanzen zu überwachen, beispielsweise um die Wirkungen von Umweltverschmutzung oder im Fall prokaryotischer Organismen deren Zustand während Prozessen wie der Fermentation oder der Abwasserverarbeitung zu überwachen.
Auf Grund der Wirkungen, die bestimmte exogene Faktoren oder Krankheiten auf alle Teile des Körpers ausüben, d.h. die Wirkungen auf die Genexpression sind nicht auf die Bereiche der zutage tretenden Krankheit beschränkt, können somit Körperteile, die von dem Ort von Interesse, z.B. einem Tumor, entfernt liegen analysiert werden. Dementsprechend können Proben für eine Überprüfung auf nicht-invasive Art erhalten werden, beispielsweise eine Körperflüssigkeit wie Blut. Da Proben aus unterschiedlichen Teilen des Körpers stammen können, die einige Unterschiede hinsichtlich ihrer Transkriptionsprodukte aufweisen können, sollten die für die Erzeugung der Standardproben und der Testproben verwendeten Proben vorzugsweise aufeinander abgestimmt werden. Die erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren betreffen drei verschiedene Proben, die aus unterschiedlichen Quellen stammen können. Dabei handelt es sich m die Proben, die für die Herstellung der Sonden verwendet werden, die kranken Proben, die für die Herstellung des diagnostischen Standardmusters verwendet werden, und die Testprobe. Vorzugsweise stammen alle Proben aus vergleichbaren Quellen, aber besonders bevorzugt stammen wenigstens die kranke Probe, die für die Erzeugung des Standardmusters verwendet wird, und die Testprobe aus einander entsprechenden Quellen.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung, wobei folgendermaßen auf die Figuren Bezug genommen wird:
1 zeigt in graphischer Form ein diagnostischen Genexpressions-Standardmuster für eine Krankheit in Arabidopsis; und
2 zeigt das Ausmaß der Bindung von cDNA an 7 unterschiedliche Sonden, wobei die cDNA aus Picea abies isoliert wurde, die unterschiedlichen Arten von Stress ausgesetzt worden waren.
Beispiel 1: Diagnose von Alzheimer-Syndrom
Einem Patienten mit Verdacht auf dieses Leiden wird eine Blutprobe entnommen. Die Probe wird unverzüglich in flüssigem Stickstoff konserviert, um einen Abbau der mRNA der Probe zu verhindern.
Die Probe wird für die Analyse überführt, die mRNA in cDNA umgewandelt, über PCR (Polymerase-Kettenreaktion) amplifiziert und mit geeigneten radioaktiven Nukleotiden markiert.
Die markierte cDNA wird mit mehreren diagnostischen DNA-Sonden hybridisiert, die auf einem Filter immobilisiert sind.
Die radiaktiven Signale des PSPP-Filters werden unter Verwendung eines Instant Imager quantifiziert und der relative Signalwert für jede der unterschiedlichen Sonden bestimmt.
Die relativen Werte für die unterschiedlichen Sonden erzeugen zusammen ein Muster, das PSPP, das für das Leiden des Patienten spezifisch ist.
Dieses für den Patienten spezifische Muster wird mit den SDPPs verglichen, die für das Alzheimer-Syndrom in unterschiedlichen Stadien charakteristisch sind. Wenn die Muster des SDPP und des PSPP übereinstimmen, ist das Leiden und dessen Stadium mit großer Sicherheit diagnostiziert.
Wenn die Muster nicht übereinstimmen, kann das Leiden ausgeschlossen werden und dasselbe PSPP manuell oder automatisch mit einer beliebigen Anzahl verfügbarer SDPPs verglichen werden, bis eine Übereinstimmung gefunden wird.
Beispiel 2: Diagnose seniler Demenz
Die patientenspezifische Probe wird nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben entnommen, konserviert, die mRNA in cDNA umgewandelt, amplifiziert und markiert.
Die vergleichende Hybridisierung wird mit einem unterschiedlichen Satz von SDPPs durchgeführt, die erstellt wurden, um zwischen verschiedenen Arten und Stadien seniler Demenz zu unterscheiden.
Beispiel 3: Gesundheitszustand über ein breites Spektrum hinweg
Die patientenspezifische Probe wird über das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben entnommen, konserviert, die mRNA in cDNA umgewandelt, amplifiziert und markiert.
Primer für die Detektion eines Satzes von Transkripten werden für die Markierung verwendet.
Die markierten Proben werden über Gelelektrophorese aufgetrennt und alle DNA-Fragmente nachgewiesen und quantifiziert.
Das erhaltene, für den Patienten spezifische Muster (PSPP) wird anschließend mit SDPPs einer Reihe verschiedener Krankheiten verglichen. Für jede vorgefundene Nichtübereinstimmung kann das zugehörige Leiden ausgeschlossen werden.
Beispiel 4: Diagnose einer Krankheit/eines Krankheitszustandes in Arabidopsis
Die Diagnose kann in zwei Schritte unterteilt werden:

– Erstellung eines reproduzierbaren Expressionsmusters (Fingerabdruck), das für die zu diagnostizierende Krankheit/den zu diagnostizierenden Krankheitszustand typisch ist.
– Anwendung des entwickelten Verfahrens auf eine Probe aus einem nichtdiagnostizierten Patienten oder Organismus und Vergleich des Expressionsmusters mit Mustern, die für die Krankheit/den Krankheitszustand erstellt wurden.

4.1 Entwicklung eines reproduzierbaren Expressionsmusters, das für die zu diagnostizierende Krankheit/den zu diagnostizierenden Krankheitszustand typisch ist.
4.1.1 Extraktion von Gesamt-RNA aus Blättern von Arabidopsis
Proben aus 15 g Blätter von jeweils Pflanzen mit einer diagnostizierten Krankheit und gesunden Pflanzen werden gesammelt und sofort in flüssigem Stickstoff gefroren. Jede Probe wird in zwei Aliquots aufgeteilt.
Die Blätter eines der beiden Aliquots jeder Probe werden mit einem Mörser und Stössel in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen. Das zweite Aliquot jeder Probe wird bei -70 °C gelagert.
Die zermahlenen Blätter werden sofort in ein 500 ml-Becherglas mit 150 ml Puffer für das Zermahlen (0,18 M Tris-HCl, pH 8,2, 0,09 M LiCl, 4,5 mM EDTA, 1 % (g/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) plus 50 ml TLE-äquilibriertes Phenol (TLE = 0,2 M Tris-HCl, pH 8,2, 0,1 M LiCl, 5 mM EDTA)), überführt.
Das Gemisch wird mit einem Polytron 2 min bei mäßiger Geschwindigkeit (Stellung 5-6) homogenisiert. 50 ml Chloroform werden zugegeben und unter Verwendung des Polytrons in das Homogenisat gemischt. Die Aufschlämmung wird in ein Zentrifugengefäß gegossen und 20 min bei 50 °C erhitzt. Anschließend wird 20 min bei 17 700 × g, 4 °C, zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wird so viel wie möglich von der wässrigen Schicht entfernt, ohne die Zwischenschicht zu stören, und diese Phase in einem neuen Zentrifugengefäß mit 50 ml TLE-äquilibriertem Phenol durch Schütteln gemischt. Dann werden 50 ml Chloroform zugegeben, das Gefäß stark geschüttelt und anschließend 15 min bei 17 700 × g, 4 °C, zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wird die wässrige Phase entfernt und mit TLE-äquilibriertem Phenol reextrahiert, bis man keine Zwischenschicht mehr erhält. Die wässrige Phase wird einmal mit Chlorform extrahiert.
Die wässrige Phase wird in ein sauberes Zentrifugengefäß überführt und 8 M LiCL1 auf eine Endkonzentration von 2 M LiCl zugegeben. RNA wird über Nacht bei 4 °C gefällt.
Diese wird dann 20 min bei 15 300 × g, 4 °C, zentrifugiert. Das Pellet wird mit einigen ml 2 M LiCl gespült. Das Pellet wird dann in 5 ml Wasser resuspendiert und in ein Zentrifugenröhrchen überführt. 8 M LiCl wird auf eine Endkonzentration von 2 M LiCl zugegeben und die RNA 3 h bei 4 °C gefällt. Die RNA wird durch 20minütige Zentrifugation bei 12 100 × g, 4 °C, pelletiert. Das Pellet wird mit 2 M LiCl gespült und in 2 ml Wasser resuspendiert. 200 μl 3 M Na-Acetat und 5,5 ml 100 % Ethanol werden zugegeben und die RNA über Nacht bei -20 °C gefällt.
Die RNA wird 15 min bei 17 700 × g, 4 °C, pelletiert. Das Pellet wird getrocknet und in 1 ml Wasser resuspendiert.
Die RNA-Konzentration wird berechnet und die Reinheit in einer 1:100-Verdünnung der Stammlösung anhand der Extinktion bei 260 nm, 280 nm, 230 nm und 320 nm bestimmt. Vor dem Ablesen wird der pH mit konzentriertem Na₂HPO₄ auf 1 eingestellt.
Zur Bestimmung des Grades an nachweisbarer DNA-Kontaminierung und RNA-Abbau werden etwa 1 μg jeder Probe auf einem Agarosegel aufgetrennt. Die Proben werden bei -70 °C gelagert.
4.1.2 Erststrang-cDNA-Synthese
Aus 4 μg Gesamt-RNA wird unter Verwendung paramagnetischer Beads (DYNAL A.S., Oslo, Norwegen) nach den Herstellerangaben mRNA isoliert.
Zu jeder Probe werden 20 μl Wasser zugegeben und die mRNA 2 min bei 65 °C von den Beads eluiert. Der Überstand wird in einem neuen Röhrchen gesammelt und die Elution wiederholt. Die zwei Eluate werden vereinigt.
1 ml Oligo dT_(12-18) (500 ng), 5 μl (aus ≥ 1 μg Gesamt-RNA) mRNA und Wasser für ein Endvolumen von 12 μl werden gemischt. Das Gemisch wird 10 min auf 70 °C erhitzt, sofort auf Eis gekühlt und kurz zentrifugiert, um die kondensierte Lösung von den Röhrchenwänden zu entfernen.
4 μl Erststrangpuffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl und 15 mM MgCl₂), 2 μl 0,1 mM Dithiotreitol und 1 μl dNTP-Mix (jeweils 10 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP) werden zugegeben. Dann wird vorsichtig gemischt und 2 min bei 37 °C inkubiert. 1 μl (200 U) Reverse Transkriptase, d.h. Superskript, wird zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Röhrchen werden dann auf Eis gestellt.
4.1.3 Zweitstrang-(Komplementärstrang-)cDNA-Synthese
Zu den Proben werden 91,8 μl Wasser, 32 μl Zweitstrang-Puffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 0,25 mg/ml Rinderserumalbumin und 500 mM (NH₄)₂SO₄, 3 μl dNTP-Mix, 6 μl 0,1 M Dithiotreitol, 2 μl E. coli DNA-Ligase (10 U/μl), 4 μl E. coli DNA-Polymerase (10 U/μl) und 0,7 μl E.coli RNase H (1 U/μl) gegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei 16 °C werden 2 μl T4 DNA-Polymerase (10 U)/μg zugegeben. Anschließend wird weitere 5 min bei 16 °C inkubiert.
Daraufhin erfolgt eine einmalige Extraktion mit 1 Vol. wassergesättigtem Phenol und danach eine einmalige Extraktion mit 0,5 Vol. Phenol und 0,5 Vol. Chloroform:Isoamylalkohol (39:1). 3 M Na-Acetat, pH 5,2 wird auf eine Endkonzentration von 0,3 M zugegeben und vorsichtig vermischt. 2,5 Vol. 96 % Ethanol (-20 °C) werden zugegeben und das Gemisch bei 4 °C 30 min bei 10 000 × g zentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen und 100 μl 75 % Ethanol (-20 °C) werden zu dem Pellet gegeben. Dieses Gemisch wird bei 4 °C 5 min bei 10 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet bis zur Trockne bei Raumtemperatur aufbewahrt. Das Pellet wird dann in 15 μl Wasser resuspendiert.
4.1.4 Adapter-Annealing
Jeweils 5 pMol/μl der zwei TaqI-Adapter und der zwei AseI-Adapter werden vorgemischt.
TaqI-Adapter 1: GACGATGAGTCCGAC
TaqI-Adapter 2: CGGTCAGGACTCAT
AseI-Adapter 1: CTCGTAGACTGCGTACC
AseI-Adapter 2: TAGGTACGCAGTC
Das Gemisch wird 2 min bei 70 °C erhitzt und langsam auf 30 °C abgekühlt.
4.1.5 Ligation der Adapter mit der cDNA
Die zwei cDNA-Proben (nach Schritt 4.1.3 hergestellt, siehe oben) werden mit TaqI und AseI verdaut. 15 μl der Probe werden mit 3 μl Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiotreitol), 0,3 μl Rinderserumalbumin (10 mg/ml), 1 μl AseI (10 U) und 1 μl TaqI (10 U) gemischt. Das Gemisch wird wenigstens 2 h bei 37 °C inkubiert.
Das Kondensat wird herunterzentrifugiert und bei 65 °C wenigstens 1,5 h inkubiert. 1 μl AseI-Adapter (5 pmol), 1 μl TaqI-Adapter (50 pmol), 4 μl Ligase-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM Dithiotreitol und 25 μg/m1 Rinderserumalbumin), 3 μl Wasser und 1 μl T4 DNA-Ligase (1 U) werden zugegeben. Dieses Gemisch wird 3 h bei 37 °C inkubiert. Das Gemisch wird dann mit TE, pH 8,0 (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) auf 500 μl verdünnt.
4.1.6 Voramplifizierung
5 μl der Proben aus dem vorhergehenden Schritt werden mit 2,5 μl Amplifizierungspuffer (0,1 M Tris-HCl, pH 8,3, 0,5 M KCl, 15 mM MgCl₂ und 0,1 % (g/v) Gelatine), 1 μl (5 ng) AseI-Präamplifizierungsprimer, 1 ml (30 ng) TaqI-Präamplifizierungsprimer, 1 μl dNTP-Mix, 13,5 μl Wasser und 1 μl (1 U) TaqI DNA-Polymerase gemischt.
AseI-Präamplifizierungsprimer: CTCGTAGACTGCGTACCTAAT
TaqI-Präamplifizierungsprimer: GACGATGAGTCCTGACCGA
Ein Temperaturzyklus von 30 sec bei 94 °C, 30 sec bei 56 °C und 1 min bei 72 °C wird über 25 Zyklen durchgeführt.
4.1.7 Amplifizierung
5 μl der Proben aus dem Präamplifizierungsschritt werden jeweils mit 1 μl AseI-Primer (5 ng), 1 μl TaqI-Primer (30 ng), 0,2 μl Taq-Polymerase (1 U), 4 μl Amplifizierungspuffer, 0,4 μl dNTP-Mix und 8,4 μl Wasser gemischt. Die Primer sind am Ende mit γ³²P-ATP markiert.
AseI-Amplifizierungsprimer: GACTGCGTACCTAATNN
TaqI-Amplifizierungsprimer: GATGAGTCCTGACCGANN
(N bezeichnet jedes beliebige der vier Deoxynukleotide)
In den ersten 11 Zyklen, die mit 30 sec bei 65 °C, 1 min bei 72 °C und 30 sec bei 94 °C beginnen, wird eine Temperaturabsenkung um 0,7 °C im ersten Schritt durchgeführt. Nach den ersten 11 Zyklen wird der Zyklus mit zusätzlichen 23 Zyklen mit 30 sec bei 65 °C, 1 min bei 72 °C und 30 sec bei 94 °C durchgeführt. Die Proben werden bei 4 °C gelagert.
4.1.8 Differenzielle Darstellung
Ein 6 % Sequenziergel wird gegossen und die Sequenziergelvorrichtung vorbereitet. Ein Vorlauf des Gels wird durchgeführt, bis es eine Temperatur von 55 °C erreicht hat.
5 μl jeder Probe werden mit 5 μl Sequenzierungsprobenfarbstoff (95 % Formamid, 20 mM EDTA, 0,05 % Bromphenolblau und 0,05 % Xylol Cyanol FF) gemischt. Die Proben werden 2 min auf 75 °C bis 80 °C erhitzt und sofort auf das Gel geladen. Die Proben werden an dicht benachbarten Stellen auf das Gel aufgetragen.
Das Gel wird bei 55 °C gefahren, bis die Xylol Cyanol FF-Bande aus dem Gel eluiert ist. Das Gel wird getrocknet und ein Autoradiogramm auf das Gel gelegt. Der Film wird bei Dunkelheit über Nacht exponiert. Sowohl der Film als auch das trockene Gel werden markiert, um für nachfolgende Prozeduren eine genaue Deckung zu ermöglichen. Der Film wird entwickelt.
4.1.9 Auswahl differenziell exprimierter cDNA-Klone als Sonden
Das Muster wird zwischen den beiden Proben (normal und krank) verglichen und es werden Proben ausgewählt, die in einer der Proben eindeutig vorliegen, nicht dagegen in der anderen. Der Film wird exakt auf das getrocknete Gel gelegt. Das Gelstück, das einem ausgewählten Fragment (welches ein Transkript darstellt) auf dem Film entspricht, wird ausgeschnitten und in einem Röhrchen gesammelt, indem 2 μl Wasser in ein Röhrchen und 0,5 μl Wasser zu jedem ausgewählten Gelfragment innerhalb der Schnittlinien gegeben werden, ein Skalpell verwendet wird, um das Fragment abzuschaben und das Fragment in das Röhrchen zu überführen. Auf diese Weise können zwischen ein und zehn Fragmente aus jeder Reaktion mit einem spezifischen Primer gesammelt werden. Da beide der als N gekennzeichneten Nukleotide auf jedem der Amplifizierungsprimer eines von vier möglichen Nukleotiden darstellen können, gibt es 4⁴ oder 256 mögliche Kombinationen, die für die Amplifizierung verwendet werden können. Da ein bis 10 Fragmente aus jeder einzelnen Amplifizierung unter Verwendung nur eines einzelnen Primers gewählt werden können, können unter Verwendung aller Permutationen der Amplifizierungsprimer insgesamt zwischen 256 und 2560 Fragmente aus einer Probe gewählt werden.
Unter Verwendung nicht-markierter Amplifizierungsprimer wird ein Temperaturzyklus wie vorstehend beschrieben durchgeführt, wobei jedoch die Konzentration der Primer auf 1 μM und des dNTP-Mix auf 200 μM erhöht wird und 40 Zyklen durchgeführt werden.
30 ng der amplifizierten Fragmente (Sonden) werden unter Verwendung einer Dot Blot-Vorrichtung auf einen Hybond N-Filter aufgetragen. Es werden wenigstens zwei Replikate des Filters hergestellt. Die DNA wird über UV-Vernetzung auf den Filter fixiert.
4.1.10 Hybridisierung der Testproben-cDNA mit dem Filter mit der Sonden-cDNA
Das zweite Aliquot der Blätter aus Pflanzen mit der diagnostizierten Krankheit und der gesunden Pflanzen wird dazu verwendet, RNA wie vorstehend beschrieben zu isolieren. Erststrang-cDNA wird wie vorstehend beschrieben hergestellt, wobei jedoch 5 μl [³²P]αdCTP (spezifische Aktivität = 10 mCi/ml) statt 5 μl Wasser zugegeben werden, um die markierte Proben-DNA herzustellen. Der Filter wird in einer Lösung aus 4,8 × SSC (4,2 % (g/v) NaCl, 2,1 % (g/v) Na-Citrat, pH 7,0), 1 × Denhardt (0,02 % (g/v) Ficoll 400, 0,02 % (g/v) Polyvinylpyrrolidon 40, 0,02 % (g/v) Rinderserumalbumin, Fraktion V), 50 % (g/v) Formatted, 0,2 M Tris-HCl, pH 7,6, 5 % (g/v) Dextransulfat, 0,1 % Na-Dodecylsulfat wenigstens 2 Stunden in einem Hybridisierungsofen bei 42 °C prähybridisiert. Die markierte Proben-DNA wird 3 min gekocht und sofort zur Prähybridisierungslösung gegeben. Dann wird wenigstens 6 Stunden oder über Nacht bei 42 °C in dem Hybridisierungsofen inkubiert.
Der Filter wird dann 2 × in 2 × SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 10 min, gewaschen, dann 2 × in 1 × SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 15 min, gewaschen, dann 2 × in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS, 50 °C, 30 min, gewaschen. Der Film wird dann in einem Instant Imager exponiert.
4.1.11 Erzeugung des Standards
Eines der Signale (das aus der Bindung einer der Proben an eine der an den Filter hybridisierten Sonden herrührt) wird als Standard ausgewählt. Das Verhältnis aller anderen Signale auf dem Filter wird relativ zu diesem Standardsignal bestimmt.
Die Verhältnisse der entsprechenden Signale werden zwischen Pflanzen mit der Krankheit und solchen ohne dieselbe Krankheit verglichen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 1 bis 9 für ausgewählte cDNAs gezeigt. P1 wurde als Standard verwendet. „Gesund" bezieht sich auf die Probe aus gesunden Pflanzen und „Leiden" bezieht sich auf die Probe von Pflanzen mit der fraglichen Krankheit.
4.2 Anwendung des entwickelten Verfahrens auf eine nicht-diagnostizierte Pflanze
2 g Blattprobe werden von der untersuchten Pflanze entnommen und sofort in zwei 1 g-Aliquots eingefroren. Von einem der Aliquots wird wie vorstehend beschrieben RNA extrahiert.
Erststrang-cDNA wird wie vorstehend beschrieben synthetisiert und durch Einbeziehung von [³²P]αdCTP in die Synthese markiert.
Die markierte Probe wird wie vorstehend beschrieben mit einem Filter hybridisiert, der die ausgewählten cDNA-Sonden trägt, gewaschen, und die Signale mit einem Instant Imager nachgewiesen.
Das Muster der relativen Signale der verschiedenen Sonden auf dem Filter wird mit den Mustern der gesunden Pflanzen und der Pflanzen, welche die Krankheit aufweisen, verglichen, und eine Diagnose für das Vorliegen oder Fehlen dieser Krankheit in der neuen Pflanze erstellt.
Beispiel 5: Diagnose einer Krankheit/eines Krankheitszustandes beim Menschen
Die Diagnose kann in zwei Schritte unterteilt werden:

– Erstellung eines reproduzierbaren Expressionsmusters (Fingerabdruck), das für die zu diagnostizierende Krankheit/den zu diagnostizierenden Krankheitszustand typisch ist.
– Anwendung des entwickelten Verfahrens auf eine Probe eines Patienten und Vergleich des Expressionsmusters mit Mustern, die für die Krankheit/den Krankheitszustand erstellt wurden.

5.1 Entwicklung eines reproduzierbaren Expressionsmusters, das für die zu diagnostizierende Krankheit/den zu diagnostizierenden Krankheitszustand typisch ist
5.1.1 Extraktion von Gesamt-RNA aus Blut
Jeweils 10 ml Blut werden einem Patienten entnommen, bei dem die Krankheit von Interesse diagnostiziert wurde, und ebenso von einem Patienten ohne diese Krankheit, der aber sonst hinsichtlich des Alters, des Geschlechts und anderer Faktoren, die das Ergebnis beeinflussen können, so ähnlich wie möglich ist. Jede Probe wird in zwei Aliquots aufgeteilt, die sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.
Unter Verwendung eines Aliquots jeder Probe werden die Aliquots nach dem Auftauen 5 min bei 10 000 × g zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die Pellets werden in 1 ml Lösung A (4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Na-Citrat, pH 7,0, 0,5 % (g/v) N-Laurylsarcosin, 0,1 M 2-Mercaptoethanol) suspendiert und das Lysat 7-10 Mal durch eine Pipette gesaugt. 0,1 ml 2 M Na-Acetat, pH 4, werden zugegeben und sorgfältig durch Inversion vermischt. 1 ml Wasser gesättigtes Phenol wird zugegeben und sorgfältig vermischt. 0,2 ml 49:1 Chloroform/Bromchlorpropan werden zugegeben, sorgfältig gemischt und 15 min bei 0 °C bis 4 °C inkubiert. Dieses Gemisch wird 20 min bei 10 000 × g zentrifugiert und die obere, wässrige Phase in ein sauberes Röhrchen überführt.
Die RNA wird durch Zugabe von 1 ml (1 Vol) 100 % Isopropanol gefällt und die Proben 30 min bei -20 °C inkubiert und anschließend 10 min bei 10 000 × g, 4 °C, zentrifugiert.
Das RNA-Pellet wird in 0,3 ml Lösung A gelöst. Die RNA wird dann mit 0,3 ml (1 Vol) 100 % Isopropanol bei -20 °C 30 min gefällt. Danach zentrifugiert man 10 min bei 10 000 × g, 4 °C, und verwirft den Überstand. Das Pellet wird in 75 % Ethanol resuspendiert, gevortext und 10-15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach zentrifugiert man 5 min bei 10 000 × g, 4 °C, und verwirft den Überstand. Das Pellet wird bei Raumtemperatur etwa 10-15 min getrocknet. Das Pellet wird in 100 μl Wasser resuspendiert und 10-15 min bei 55 bis 60 °C inkubiert.
Die RNA-Konzentration wird berechnet und die Reinheit in einer 1:100-Verdünnung der Stammlösung unter Verwendung der Extiaktion bei 260 nm, 280 nm, 230 nm und 320 nm bestimmt. Vor dem Ablesen wird der pH mit konzentriertem Na₂HPO₄ auf 1 eingestellt.
Etwa 1 μg jeder Probe werden auf einem Agarosegel aufgetrennt, um den Grad der nachweisbaren DNA-Kontaminierung und des RNA-Abbaus zu bestimmen. Die Proben werden bei -70 °C gelagert.
5.1.2 Erststrang-cDNA-Synthese für die Selektion differenziell exprimierter cDNA-Klone als Sonden
Diese Schritte werden wie in den Paragraphen 4.1.2 bis 4.1.9 oben beschrieben durchgeführt.
5.1.3 Hybridisierung der Testproben-cDNA an Filter mit Sonden-cDNA
Das zweite Aliquot Blut der normalen und kranken Patienten wird verwendet, um wie in Paragraph 4.1.10 beschrieben RNA zu isolieren, markierte Erststrang-cDNA herzustellen, eine Hybridisierung mit dem Filter vorzunehmen, der die Sonden trägt, und den Film zu exponieren.
5.1.4 Erzeugung des Standards
Die Ergebnisse werden wie in 4.1.11 oben beschrieben relativ zu einem einzelnen Signal standardisiert.
Die Verhältnisse der entsprechenden Signale zwischen dem Patienten mit der Krankheit und dem Patienten ohne dieselbe Krankheit werden verglichen.
Ergebnisse
Man erhält ähnliche Ergebnisse wie die in 1 gezeigten.
5.2 Anwendung des entwickelten Verfahrens auf einen nicht diagnostizierten Patienten
Eine 2 ml-Blutprobe wird einem Patienten entnommen und sofort in zwei 1 ml-Aliquots eingefroren. Aus einem der Aliquots wird nach Auftauen RNA wie vorstehend beschrieben extrahiert.
Erststrang-cDNA wird wie vorstehend beschrieben synthetisiert und durch Einbeziehung von [³²P]αdCTP in die Synthese markiert.
Die markierte Probe wird wie vorstehend beschrieben mit einem Filter hybridisiert, der die ausgewählten cDNA-Sonden trägt, gewaschen, und die Signale werden mit einem Instant Imager nachgewiesen.
Das Muster der relativen Signale der verschiedenen Sonden auf dem Filter wird mit den Mustern des gesunden Patienten und des Patienten mit der Krankheit verglichen, und eine Diagnose für das Vorliegen oder Fehlen dieser Krankheit bei dem neuen Patienten erstellt.
Beispiel 6: Unterschiedliche relative Expressionsmuster von 7 ausgewählten Sonden aus der Wurzel norwegischer Fichten (Picea abies), die verschiedenen Arten von Stress ausgesetzt wurden
Methoden

1. Sieben unterschiedliche informative cDNA-Sonden wurden an eine Nylonmembran gebunden. Die meisten der Klone wurden aus einer subtrahierten cDNA-Bibliothek aus Wurzeln der norwegischen Fichte, die mit dem Pilzpathogen Pythium dimorphum infiziert waren (gemäß der in Beispiel 4 beschriebenen Methode) isoliert, während andere über ähnliche Methoden aus norwegischen Fichten isoliert wurden, die anderen Arten von Stress ausgesetzt waren. Die subtrahierte Bibliothek wurde nach der in Lönneborg et al. (1995), PCR Meth. Applic., 4, Hrsg. David Bentley, Richard Gibbs, Eric Green, Richard Myers, Cold Spring HarborLaboratory Press, NY, Seiten S168-5177 beschriebenen Methode hergestellt. Es war bekannt, dass alle dieser Klone durch wenigstens eine Art von Stress induziert worden waren.
2. Norwegische Fichten wurden zwei Monate in einer Wachstumskammer mit einem Tag/Nacht-Zyklus von 12 h/12 h bei einer Lichtintensität von 500 μMol × m^-2 × sec^-1 und Bewässerung mit optimaler Nährstoffversorgung einmal pro Tag kultiviert. Die Pflanzen wurden dann entweder einer Ernährung wie zuvor (Kontrolle), Maltosemedium, 24 mg (Frischgewicht) Pythium dimorphum, oder 24 mg (Frischgewicht) Rhizoctonia sp. ausgesetzt. Die Pflanzen wurden diesen Faktoren 4 und 8 Tage ausgesetzt. Danach wurden die Wurzeln und der obere Teil sofort eingefroren.
3. Die verbleibenden Schritte 4 bis 10 wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
4. Aus den Wurzeln und den oberen Teilen wurde RNA extrahiert und auf Qualität und Ausbeute überprüft.
5. Erststrang- und Zweitstrang-cDNA wurde unter Verwendung eines polyT-Primers und eines auf dem Vorliegen eines 5'-Caps basierenden Primers synthetisiert. Auf diese Weise wurden nur Klone voller Länge unter Vermeidung des Risikos einer durch mehrfache Priming-Stellen beeinflussten Synthese synthetisiert.
6. Alle cDNAs wurden mit der PCR-Technik unter Verwendung derselben Primer-Sätze amplifiziert.
7. Der cDNA-Pool wurde unter Verwendung des polyT-Primers markiert.
8. Filter, die jeweils die sieben Sonden trugen, wurden sechs Stunden bei 65 °C prähybridisiert, worauf man die markierten cDNA-Proben zu jeweils einem Filter gab und die immobilisierten Filter über Nacht bei 65 °C hybridisieren ließ.
9. Die Filter wurden gewaschen, um alle unspezifisch hybridisierten Markierungen zu entfernen.
10. Die radioaktiven Signale der einzelnen Sonden auf jedem Filter wurden mit einem Instant Imager gezählt und die relativen Signale berechnet.

Ergebnisse
Das für die Filter der Wurzeln für Kontrolle (Tag 4), Maltose (Tag 4 und 8), Pythium dimorphum (Tag 4 und 8), Rhizotonia sp. (Tag 4) und Nadeln der Kontrolle (Tag 4) und Pythium dimorphum (Tag 4) erzeugte Muster ist in 2 gezeigt. Für Maltose bei Tag 4 wurden zwei unabhängige Wiederholungen durchgeführt, welche die Reproduzierbarkeit des Experiments zeigten.
Die Ergebnisse zeigen, dass jeder dieser Stressfaktoren unter Verwendung dieses Sondensatzes spezifische Muster erzeugt. Es ist ebenfalls ersichtlich, dass die Stressfaktoren die Pflanzen systemisch induzieren, was die Verwendung verschiedener Teile der Pflanzen für den Assay ermöglicht. Weiterhin kann auch die differenzielle Expression bestimmter Transkripte in verschiedenen Stadien des Stresses sichtbar sein.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Gentranskriptionsmuster-Sondenkits zur Erzeugung eines für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon charakteristischen Musters in einem eukaryotischen Organismus, welches wenigstens die folgenden Schritte umfasst: a) Isolierung von mRNA aus Proben eines normalen Gewebes, normaler Zellen oder einer normalen Körperflüssigkeit, die aus einem oder mehreren normalen eukaryotischen Organismen isoliert wurden; b) Isolierung von mRNA aus entsprechenden Proben kranken Gewebes, kranker Zellen oder kranker Körperflüssigkeit, welche aus einem oder mehreren Organismen gemäß Schritt a) isoliert wurden, die eine Krankheit oder einen Krankheitszustand von Interesse oder ein Stadium davon aufweisen; c) Auftrennung der mRNA gemäß Schritt a) und b), welche gegebenenfalls in cDNA revers transkribiert wurde, mit Hilfe einer nicht auf Sequenz basierenden Trenntechnik; d) Auswahl zweier oder mehrerer mRNA- oder cDNA-Spezies, welche in unterschiedlichen Mengen in normalen Proben und kranken Proben enthalten sind; e) Isolierung der mRNA- oder cDNA-Spezies, welche in Schritt d) identifiziert wurden; f) gegebenenfalls die reverse Transkription der mRNA aus Schritt d) oder e) in cDNA, sofern dies nicht vorher in Schritt c) durchgeführt wurde; und g) Immobilisierung der mRNA- oder cDNA-Sonden gemäß Schritt e) oder f) auf einem oder mehreren festen Trägern.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mRNA oder cDNA aus Schritt e) oder Schritt f) vor der Immobilisierung gemäß Schritt g) amplifiziert wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, worin die mRNA aus Schritt a) und b) in cDNA revers transkribiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die cDNA amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, worin die cDNA, die aus mRNA gemäß Schritt a) und b) produziert wurde, eine Markierung trägt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin zwischen 50 und 100 mRNA- oder cDNA-Sonden isoliert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin 10 bis 500 mRNA- oder cDNA-Sonden isoliert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin Gelelektrophorese als Trenntechnik verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines diagnostischen Gentranskriptionsmuster-Standards, der charakteristisch ist für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon in einem eukaryotischen Organismus, umfassend wenigstens die folgenden Schritte: a) Isolierung von mRNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeit, isoliert aus einem oder mehreren der Organismen, welche die Krankheit, den Krankheitszustand oder ein Stadium davon aufweisen, die gegebenenfalls in cDNA transkribiert wurde; b) Hybridisierung der mRNA oder cDNA aus Schritt a) mit dem Kit, wobei die Sonden auf diesem Kit spezifisch für die Krankheit oder den Krankheitszustand oder das Stadium davon in dem Gewebe, den Zellen oder der Körperflüssigkeit eines Organismus sind, welche dem untersuchten Gewebe, den untersuchten Zellen oder der untersuchten Körperflüssigkeit und dem untersuchten Organismus entsprechen; c) Bestimmung der Menge an mRNA oder cDNA, die mit jeder der Sonden auf dem(n) festen Träger(n) hybridisiert, um ein charakteristisches Muster zu erzeugen, welches die Genexpression in der Probe mit der Krankheit, dem Krankheitszustand oder Stadium davon für ein oder mehrere ausgewählte Gene, die den Sonden entsprechen, reflektiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines patientenspezifischen Gentranskriptionsmusters für einen eukaryotischen Organismus, welches wenigstens folgende Schritte umfasst: a) Isolierung von mRNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeit, isoliert aus dem Organismus, welche gegebenenfalls in cDNA revers transkribiert wurde; b) Hybridisierung der mRNA oder cDNA aus Schritt a) mit dem Kit, wobei die Sonden auf dem Kit spezifisch für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon in dem Gewebe, den Zellen oder der Körperflüssigkeit eines Organismus sind, welche dem untersuchten Gewebe, den untersuchten Zellen oder der untersuchten Körperflüssigkeit und dem untersuchten Organismus entsprechen; und c) Bestimmung der Menge an mRNA oder cDNA, welche mit jeder der Sonden auf den festen Trägern hybridisiert, um ein charakteristisches Muster zu erzeugen, welches die Genexpression für ein oder mehrere der ausgewählten Gene, welche den Sonden entsprechen, reflektiert.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die mRNA von Schritt b) in cDNA revers transkribiert wird und gegebenenfalls eine Markierung trägt.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die cDNA amplifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Diagnose oder Identifizierung einer Krankheit, eines Krankheitszustandes oder eines Stadiums davon in einem eukaryotischen Organismus, umfassend wenigstens folgende Schritte: a) Isolierung von mRNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeit, isoliert aus dem Organismus, welche gegebenenfalls in cDNA revers transkribiert wurde; b) Hybridisierung der mRNA oder cDNA aus Schritt a) mit dem Kit, wobei die Sonden auf dem Kit spezifisch für eine Krankheit oder einen Krankheitszustand oder ein Stadium davon in dem Gewebe, den Zellen oder der Körperflüssigkeit eines Organismus sind, welche dem untersuchten Gewebe, den untersuchten Zellen oder der untersuchten Körperflüssigkeit und dem untersuchten Organismus entsprechen; und c) Bestimmung der Menge an mRNA oder cDNA, welche mit jeder der Sonden auf den festen Trägern hybridisiert, um ein charakteristisches Muster zu erzeugen, welches die Genexpression für ein oder mehrere der ausgewählten Gene, welche den Sonden entsprechen, reflektiert; und d) Vergleichen dieses Musters mit einem diagnostischen Standardmuster, erzeugt nach einem der Ansprüche 9, 11 oder 12, unter Verwendung entsprechender Proben aus einem oder mehreren Organismen, welche dem untersuchten Organismus entsprechen, der die Krankheit, den Krankheitszustand oder das Stadium davon, das untersucht wird, aufweist, um den Korrelationsgrad zu bestimmen, der auf das Vorliegen der Krankheit, des Krankheitszustands oder des Stadiums davon in dem untersuchten Organismus hinweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin der Organismus ein humaner Organismus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin der feste Träger ein Filter ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin die Erkrankung Krebs ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin die Erkrankung Magen-, Lungen-, Brust-, Prostata-, Darm- oder Hautkrebs ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin die Erkrankung die Alzheimer-Erkrankung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin die Zellen aus Gewebe, Körperflüssigkeit oder einer Körperausscheidung des eukaryotischen Organismus gewonnen werden.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Körperflüssigkeit Blut ist.