DE69825303T2

DE69825303T2 - Verfahren zur messung der gewebestruktur

Info

Publication number: DE69825303T2
Application number: DE69825303T
Authority: DE
Inventors: Lev T. Perelman; Vadim Backman; Michael S. Feld; George Zonios; Irving Itzkan; Ramasamy Manoharan
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1997-10-10
Filing date: 1998-10-09
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2018-10-10
Also published as: US6091984A; ATE271830T1; WO1999018845A1; AU9693298A; EP1021126A1; EP1021126B1; CN1278153A; CA2305898A1; DE69825303D1; US6922583B1; JP2001519190A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Methoden zur frühzeitigen Diagnose von Krebs sind für die Krebsvorsorge und Krebstherapie wesentlich. Viele Krebsarten entstehen aus epithelialem Gewebe, das innere und äußere Flächen des menschlichen Körpers bedeckt. Viele dieser Arten, so zum Beispiel der Krebs im Magen-Darm-Trakt, entstehen im Stadium der Dysplasie. Dysplasie kann als neoplastisches Gewebe definiert werden, das noch nicht bösartig ist, jedoch als Vorbote eines bösartigen Tumors angesehen wird. Die meisten Tumore sind zu diesem Zeitpunkt der Diagnose heilbar. Im Falle von Tumoren im Magen-Darm-Trakt basieren die derzeitigen Diagnosemethoden auf der Endoskopie. Jedoch ist dysplastisches Gewebe häufig nicht endoskopisch ersichtlich. Somit stütz sich die Entdeckung von Dysplasie im Magen-Darm-Trakt und anderen Stellen auf eine sporadische Probenentnahme für diesen „unsichtbaren" bösartigen Vorboten. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit dysplastische Veränderungen durch sporadische Biopsien nicht zu entdecken hoch. In einigen Fällen ist die Methode der Biopsie nicht möglich.
Anstrengungen wurden unternommen gewöhnliche Biopsien zu ersetzen, um eine akkurate Diagnose von kanzerösem Gewebe in verschiedenen Organen im lebenden Organismus und in Echtzeit zu liefern. Zu diesem Zweck können optische Techniken im lebenden Organismus eingesetzt werden, die nicht invasiv sind und keine Entfernung von Gewebe erfordern. Solche Methoden stellen Informationen auf mikroskopischer Ebene bereit und können deshalb bei der Suche nach kleinen Stellen helfen, die man wahrscheinlich mittels gewöhnlicher Biopsien übersehen würde. Die meisten menschlichen Organe können anhand von optischen Techniken, diese optischen Techniken sind insbesondere auf Gewebe in Höhlräumen des menschlichen Körpers anwendbar, diagnostiziert werden, da diese mittels optischer Sonden leicht zugänglich sind, indem man die Sonden in einen der Kanäle konventionell endoskopischer Schläuche einführt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Anwendung von Licht, um die physikalischen Eigenschaften einer strukturierten Materialschicht und insbesondere gewisse qualitative Informationen betreffend die Morphologie von Gewebestrukturen durch Nutzung von Streulicht zu bestimmen. Abhängig von der Materialdicke, der Größe und Verteilung der zu messenden Struktur können sowohl Streuungs- als auch Durchleuchtungsmethoden eingesetzt werden. Beispiele für messbare Materialeigenschaften umfassen die Oberflächenrauheit, Parasitismus, Cytometer-Messungen oder andere Materialien, bei denen Änderungen in der Brechzahl eines Materials mit den Änderungen in der Struktur korrespondieren. Diese Art von Streu-Spektroskopie kann von der Absorptionsspektroskopie unterschieden werden, mittels derer keine quantitative Messung der Partikelmorphologie möglich ist.
Trotz umfangreicher Untersuchungen ist keine zuverlässige optische Technik zur Diagnose von Dysplasie im lebenden Organismus (in vivo) bekannt. Eine der Schwierigkeiten liegt darin, dass sich dysplastische Veränderungen auf die oberste epitheliale Schicht beschränken, die 20μm dünn sein kann und eine Einzellenschicht darstellt, die nahezu transparent für optische Strahlung ist.
Gewebe im Magen-Darm-Trakt beispielsweise (oder anderer Hohlorgane, die die gleichen Eigenschaften aufweisen) ist mit einer Zellenschicht bedeckt, die als Epithelium bezeichnet wird (und zwischen 20 μm und 300μm dick ist, abhängig vom Teil des Trakts) und durch ein relativ azellulares und höchst gefäßfreies Bindegewebe, die Lamina Propria, gestützt wird, die bis zu 500μm dick sein kann, ein Netzwerk von Kollagen und elastischen Fasern und eine Vielfalt von weißen Blutkörperchen enthält. Unterhalb der Lamina Propria liegt eine muskuläre Schicht, die Lamina muscularis mucosae, (bis zu 400μm dick) und eine weitere Schicht von mäßig dichtem Bindegewebe, die Submucosa (400-600μm dick), die viele kleine Blutgefäße, reichlich Kollagen und elastische Fasern enthält. Die Gesamtdicke dieser Schichten beträgt ungefähr 1mm. Da die charakteristische Penetranztiefe von optischer Strahlung in biologischem Gewebe normalerweise 1mm nicht übersteigt, reicht es für eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung aus die Gewebemessungen auf diese Schichten zu beschränken.
Das Adenokarzinom der Speiseröhre entsteht in metaplastischen säulenförmigen epithelialen Zellen in der Speiseröhre, bezeichnet als Barrett-Speiseröhre (Barrett-Ösophagus), die eine Komplikation eines langwierigen Magen-Darm-Trakt-Refluxes darstellt. In diesem Zustand wird das distale schuppenartige Epithelium durch säulenförmiges Epithelium, bestehend aus einer Einzellenschicht ersetzt, die der von Eingeweide ähnelt. Die Barrett-Speiseröhre geht häufig mit Dysplasie einher, die sich später zu Krebs entwickeln kann. Versuche mittels endoskopischer Überwachung an Patienten mit einer Barrett-Speiseröhre haben nicht zu einer Reduktion der Sterblichkeit infolge des Ösophaguskarzinoms geführt. Die wahrscheinlichste Erklärung hierfür ist, dass die in der Speiseröhre auftretende Dysplasie nicht mittels gewöhnlicher Endoskopieaufnahmen entdeckt werden kann und folglich sporadische Biopsie-Stichprobenentnahmen notwendig sind. Mit diesem Verfahren können nur etwa 0,3% des gefährdeten Gewebes als Stichprobe entnommen werden. Somit verbleibt ein enormes Fehlerpotential für die Stickprobenentnahme.
Die Anwendung von optischen Techniken zur Diagnose von Dysplasie in der Barrett-Speiseröhre wird durch die Tatsache eingeschränkt, dass primäre Veränderungen des Gewebes im Epithelium entstehen, das der Dicke einer Zelle entspricht (≈20-30μm), und Fluoreszenz- und Reflexionsspektren meistens in tieferen Gewebeschichten gebildet werden. Eines der bedeutendsten Eigenschaften eines dysplastischen Epitheliums ist die Präsenz von vergrößerten hypochromatischen und gedrängten Zellkernen. Tatsächlich sind diese Veränderungen der Zellkerne hinsichtlich ihrer Größe und räumlichen Verteilung der seitens eines Pathologen genutzte Haupthinweis zur Diagnose von dysplastischen Gewebeproben. In anderen Gewebeschichten werden keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Unglücklicherweise enthält das Epithelium keine starken Absorber oder Fluorophore und die Dicke des Epitheliums ist relativ gering, und deshalb unwesentlich. Dies macht die Diagnose in der Barrett-Speiseröhre zum schwierigen Problem.
Diffuse Reflexionsspektroskopie kann quantitative biochemische und morphologische Informationen zur Analyse von biologischen Gewebeepithelien und zur Erkennung von praekanzerösen Läsionen liefern. Es wurden diffuse Reflexionsspektren von adenomatösen Dickdarmpolypen (Krebsvorboten) und normaler Dickdarmschleimhaut von sich einer Darmspiegelung unterziehenden Patienten erfasst. Die Daten wurden unter Nutzung eines analytischen Lichtdiffusionssystems analysiert, das sich auf ein aus Polystyrolkgelen und Hämoglobin zusammengesetztes physikalisches Gewebemodell stützt. Vier Parameter wurden erhalten: die Hämoglobin-Konzentration, die Hämoglobin-Sauerstoff-Sättigung, die effektive Streuerdichte und die effektive Streuergröße. Normale und adenomatöse Gewebestellen wiesen Unterschiede in der Hämoglobin-Konzentration und der effektiven Streuergröße auf. Somit kann die diffuse Reflexion dazu benutzt werden, um biochemische und morphologische Informationen im lebenden Organismus (in vivo) zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein System zur Messung einer feinen Strukturkomponente mittels vom Schleimhautgewebe zurückgestrahlten Licht, das hinsichtlich der Wellenlänge periodisch ist. Diese Struktur ist gewöhnlich von einem diffusen Hintergrund verdeckt, der beseitigt werden muss, um sie sichtbar zu machen. Die Entstehung dieser Komponente ist auf die Mie-Streuung des Lichts durch die in der Oberfläche des Epitheliums liegenden Zellkerne zurückzuführen. Durch die Analyse der Amplitude und der Frequenz der periodischen Struktur kann die Dichte und die Größeverteilung dieser Zellkerne gewonnen werden. Diese Quantitäten sind wichtige Indikatoren für neoplastische praekanzeröse Veränderungen in biologischem Gewebe, so dass die Technik ein nützliches Werkzeug zur Beobachtung solcher Veränderungen bei sich einer Darmspiegelung unterziehenden Patienten bilden kann.
Das an der Gewebeoberfläche in die dünne Schicht einfallende Licht wird nicht vollständig zufällig zerstreut. In dieser dünnen Region können die Details des elastischen Streuungsprozesses konserviert werden. Schleimhautgewebe, das die Hohlorgane des Körpers bedeckt, besteht im Allgemeinen aus einer dünnen Oberflächenschicht epithelialer Zellen, die durch das darunter liegende relativ azelluläre Bindegewebe gestützt wird. In gesundem Gewebe besteht das Epithelium oft aus einer einzigen, gut organisierten Schicht von Zellen mit einem Durchmesser von rund 10-20μm und einer Höhe von rund 25μm. In kanzerösem und praekanzerösem (dysplastischem) Epithelium vermehren sich die Zellen, die zelluläre Schicht verdickt sich oft und wird dichter gepackt, und die Zellkerne vergrößern sich und erscheinen dunkler (hyperchromatisch) bei Einfärbung. Dies kann auf eine erhöhte Säuredichte und infolgedessen auf eine erhöhte Brechzahl hinweisen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung benutzt eine Breibandlichtquelle, um die interessierende Region im Gewebe mit optischer Strahlung im Bereich zwischen 350 und 700nm zu bestrahlen. Ein faseroptischer Messfühler kann benutzt werden, um Strahlung an das Gewebe abzugeben und/oder vom Gewebe aufzunehmen. Das System kann bei der Endoskopie eines Patienten benutzt werden, um einen Körperhohlraum im Inneren des Patienten optisch zu untersuchen und dabei die Notwendigkeit des Entfernens von Gewebe für die Biopsie zu eliminieren, oder alternativ dazu benutzt werden die Lokalisierung von für die Biopsie geeignetem Gewebe zu unterstützen.
Zurückgestreutes Licht wird vorzugsweise mittels eines kleinen Sammelwinkels zwischen 2° und 12°, vorzugsweise im Bereich zwischen 3° und 8°, erfasst. Bei Benutzung eines faseroptischen Systems zum Aufnahme von gestreutem Licht können Fasern mit einer Apertur von zwischen 0,05 und 0,22, vorzugsweise zwischen 0,07 und 0,1, genutzt werden. Erfassungswinkel bzw. Sammelwinkel dieser Größenordnung reduzieren den Grad des Hintergrundlichts ohne den Verlust der periodischen Komponente im zurückgestrahlten Licht.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Es zeigen:
1 eine schematische Darstellung eines faseroptischen Messfühlers gemäß der Erfindung,
2 eine vergrößerte Ansicht des distalen Endes eines Endoskops gemäß der Erfindung,
3A, 3B und 3C Reflexionsspektren von Zell-Einfachschichten bezüglich normaler Dickdarmzellen (R = 0,46); T84 Zellen (R = 0,38); einer BaSO₄ Diffusionsplatte (R = 1,0),
4 die Zellkerngrößenverteilungen für die Daten aus den 3A bzw. 3B für normale Dickdarmzellen bzw. T84 Zellen. In beiden Fällen steht die durchgezogene Linie für die aus den Daten extrahierte Verteilung und die gestrichelte Linie für die mittels Lichtmikroskopie gemessene Verteilung,
5A, 5B und 5C Reflexionsspektren von Barrett-Speiseröhren betreffend die diffuse Reflexion einer normalen Stelle (durchgezogene Linie); die diffuse Reflexion einer dysplastischen Stelle (gestrichelte Linie) und die Modellanpassung (dicke durchgezogene Linie); für entsprechend feine Strukturen bzw. für resultierende Zellkerngrößenverteilungen,
6 einen graphischen Vergleich zwischen durch standardmäßige Pathologie und durch optische Methoden gemäß der Erfindung analysierte Proben,
7 ein System, das für in vitro (außerhalb des Organismus) Gewebeanalysen gemäß der Erfindung benutzt wird,
8 ein Prozess-Flussdiagramm, das eine Methode für das Durchführen einer optischen Gewebediagnose gemäß der Erfindung beschreibt,
9 die molaren Extinktionskoeffizientenspektren von mit Sauerstoff angereichertem (dünne Linie O) und mit Sauerstoff abgereichertem (dicke Linie) Hämoglobin (21). Man beachte die charakteristischen Höchstwerte bei 415, 542 und 577nm (Oxyhemoglobin-HbO₂) und bei 430 und 555nm (Deoxyhemoglobin-Hb),
10 mittels der Mie-Theorie berechnete reduzierte Streuungsquerschnittsspektren σ^|(λ). Es werden die Ergebnisse für verschiedene Durchmesser d_s (0,2; 0,6; 1,0 und 2,0μm) gezeigt. Die Steigung der Spektren steht in umgekehrter Beziehung zum Durchmesser. Eine Brechzahl von 1,4 wurde für die Streupartikel und 1,36 für das umgebende Medium angenommen,
11 mittels physikalischer Gewebemodelle (dicke Linie) berechnete diffuse Reflexionsspektren, die vier verschiedenen Hb Konzentrationen entsprechen: (a) 0,0 mg/dL, (b) 50 mg/dL, (c) 120 mg/dL, (d) 250 mg/dL. Die analytischen Modellvorhersagen werden auch gezeigt (dünne Linie), wobei die gleichen, wie bei der Erstellung der physikalischen Gewebemodelle angewandten, optischen Parameter genutzt werden, mit einer sehr guten Übereinstimmung zwischen dem analytischen und dem Gewebemodell,
12 typisch normale und adenomatöse Polypenspektren (dicke Linie) und die besten Anpassung an die Daten unter Nutzung des Modells (dünne Linie). Die Mie-Theorie wurde angewandt, um den für die Modelanpassungen benutzten reduzierten Streuungskoeffizienten anzunähern (siehe 13),
13 die mit den Daten aus 12 (dünne Linie) erhaltenen Streuungsspektren und die besten Modellanpassungen (dicke Linie) durch Nutzung der Mie-Theorie. Die Mie-Theorie Anpassungen ordnen den reduzierten Streuungsspektren eine effektive Streuergröße d_s zu. Der Polyp hat eine im Vergleich zu normaler Schleimhaut (d_s = 0,35μm) größere effektive Streuergröße (d_s = 1,5μm),
14A–14D Parameter, die aus der Datenanalyse gewonnen wurden: (A) die gesamte Hb Konzentration C_Hb, (B) die Hb Sauerstoffsättigung α, (C) die effektive Streuerdichte p_s, (D) die effektive Streuergröße d_s. Der größte Unterschied zwischen normaler Schleimhaut (Vierecke) und adenomatösen Polypen (Sterne) liegt in der gesamten Hb Konzentration, und
15 eine binäre graphische Darstellung der gesamten Hb Konzentration C_Hb verglichen mit der effektiven Streuergröße d_s. Die normalen Daten neigen dazu eine gut zu unterscheidende Anhäufung von Punkten zu formen, während die adenomatösen Polypendaten durch eine größere Variation gekennzeichnet sind.
Das vorangegangen Beschriebene und andere Ziele, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden durch die nun folgende präzisere Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die in den beiliegenden Zeichnungen dargestellt sind, ersichtlich, wobei mittels Bezugszeichen durchweg auf die gleichen Teile Bezug genommen wird. Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise im einschränkenden Sinne, sondern vielmehr als Darstellung des Prinzips der Erfindung zu verstehen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst den Einsatz eines faseroptischen Systems zum Abstrahlen von Licht und zum Erfassen von Licht einer interessierenden Region, um eine oder mehrere physikalische Eigenschaften einer Oberflächenschicht zu messen. Solch ein System ist in 1 abgebildet. Dieses System kann eine Lichtquelle 50, beispielsweise eine Breitbandlichtquelle, eine faseroptische Vorrichtung 10 zum Abstrahlen und/oder Erfassen von Licht des Gewebes, ein Detektorsystem 80, das das vom Gewebe gestreute Licht detektiert, einen Rechner 120 mit einem Speicher 122, der die detektierten Spektren analysiert und speichert, und ein Display 124 zur Anzeige der Messergebnisse umfassen. Eine Linse 60 kann zur Einkopplung des Lichts der Quelle 50 in die Anregungsfaser 30 des Messfühlers 10 benutzt werden. Ein Filter 110 und ein Linsensystem 90, 100 können benutzt werden, um erfasstes Licht effizient in ein Spektrogramm 70 einzukoppeln. Ein mit dem Datenverarbeitungssystem 120 verbundener Controller 140 kann mit einem Taktgeber und einem Impulsgeber 150, der die Lichtquelle 50 steuert, verbunden werden.
Das distale Ende 15 des Messfühlers 10 ist in 2 abgebildet, in der die zentrale Anregungsfaser 30 von sechs peripheren Sammelfasern 20 umgeben ist. Das distale Ende der Vorrichtung kann beispielsweise, wie in der U.S. Patentschrift U.S. 5,199,431 beschrieben ist, von einer optischen Abdeckung 25 umschlossen sein. Andere endoskopische Vorrichtungen, beispielsweise eine optische Nadel, wie in der zuvor zitierten Patentschrift oder wie es in der in der Patentschrift U.S. 5,280,788 beschrieben ist, benutzt werden.
Die Sammelfasern 20 haben vorzugsweise eine numerische Apertur im Bereich von 0,05 bis 0,22, um einen gewünschten Sammelwinkel bezüglich des zu messenden Materials zu bilden. Dies unterstützt die Reduktion des Hintergrundes, der von dem Streuspektrum ohne den Verlust der periodischen Komponente entfernt wird.
Die Sammelfasern können auch durch einen distal montierten Bildsensor 35, wie z.B. eine Ladungskopplungsvorrichtung oder ein CMOS Sensor, ersetzt oder ergänzt werden. Der Sensor besitzt eine pixelartige Struktur, die gegenüber den im zu messenden Streuspektrum enthaltenen Farben sensibel ist.
Das mittels dieses Systems erfasste zurückgestreute Licht kann analysiert werden, um gewisse physikalische Eigenschaften des epithelialen Gewebes zu bestimmen. Die Beziehung zwischen dem erfassten Licht und den zu bestimmenden physikalischen Eigenschaften kann wie folgt beschrieben werden.
Epitheliale Zellkerne können als spheroidale Mie-Streuer mit einer gegenüber dem umgebenden Zellplasma höheren Brechzahl betrachtet werden. Normale Zellkerne besitzen eine charakteristischen Durchmesser 1= 4 – 7μm.
Demgegenüber kann die Größe dysplastischer Zellkerndurchmesser bis zu 20μm betragen, wobei sie nahezu das ganze Zellvolumen ausfüllen. Somit werden im sichtbaren Bereich die Wellenlänge λ ≪ 1 und die Komponente des durch die Zellkerne gestreuten Lichts eine Periodizität in der Wellenlänge aufweisen, die aus der Kerngrößenverteilung bestimmt wird. Die Van de Hulst Näherung kann für die Beschreibung des optischen Streuquerschnitts der Zellkerne benutzt werden:
wobei δ = πln_c (n – 1), n_c die Brechzahl von Zellplasma und n die Brechzahl der Zellkerne relativ zu der von Zellplasma ist.
Beim Einfallen eines Lichtstrahls in die epitheliale Gewebeschicht wird ein Teil des Lichts von den Zellkernen zurückgestreut, während der Rest in tiefere Gewebeschichten weitergeleitet und dabei mehrfach willkürlich (zufällig) gestreut wird. All das nicht vom Gewebe absorbierte diffuse Licht kehrt schließlich zur Oberfläche zurück, wobei es ein weiteres mal das Epithelium durchdringt und nochmals durch die Zellkerne gestreut wird. Somit setzt sich das austretende Licht aus einem sehr diffusen Hintergrund zuzüglich einer Komponente aus der Vorwärtsstreuung und Rückstreuung des Lichts durch die Zellkerne in der epithelialen Schicht zusammen. Für eine dünne epitheliale Gewebeschicht mit einer Größenverteilung der Zellkerne N(l) (Anzahl der Zellkerne pro Flächeneinheit (mm²) und pro Längeneinheit des Zellkerndurchmessers (μm)) ist die approximierte Lösung der Transportgleichung für die Reflexion R(λ), die mittels eines faseroptischen Messfühlers und mit der Annahme eines festen Winkels Ω_c erfasst wird, durch den folgenden Ausdruck gegeben:
wobei I_i(λ, s) die Intensität des unter einem festen Winkel Ω_i einfallenden Lichts, I_d (λ, s) die Intensität des aus dem zugrundeliegenden Gewebe heraustretenden Lichts ist, und
für eine beliebige Funktion I(s) und festen Winkel Ω ist, mit s, einem von der Gewebeoberfläche arbiträr nach außen zeigenden Einheitsvektor. Die Quantität R(λ) = ⟨I_d(λ,s)⟩_Ωc /⟨I_i(λ,s)⟩_Ωc ist die Reflexion des diffusen Hintergrunds. Die optische Wegstrecke
und Streuphasenfunktion
hängen beide von N(l) ab; für eine Sphäre, p(λ,l, s, s¹ ) wird mit der Mie-Theorie bestimmt. Der erste Term in Gleichung (2) beschreibt die Abschwächung des diffusen Hintergrunds und die Terme in den Klammern beschreiben die Rückstreuung des einfallenden Lichts bzw. die Vorwärtsstreuung des diffusen Hintergrunds durch die epithelialen Zellkerne.
Für kleine Ω_c kann der Term für die Vorwärtsstreuung in Gleichung (2) erweitert werden in τ(λ). Somit ist ⟨⟨I_d(λ,s')⟩_2π⟩_Ωc/⟨I_d(λ,s)⟩_Ωc≌ ⨍₀ + ⨍₁τ/τ₀, mit
Es wurde numerisch herausgefunden, dass f1 ≪ f₀ ist und f₁, f₀ im interessierenden Bereich (λ_min = 360 bis λ_max = 685nm) näherungsweise unabhängig von der Wellenlänge sind. Gleichermaßen gilt für den Term für die Rückstreuung
Man beachte, dass in dem Beitrag für die Vorwärtsstreuung der Term erster Ordnung phasengleich zu τ(λ) schwingt, wie es das optische Theorem erfordert, wohingegen der Beitrag für die Rückstreuung gegenphasig ist. Somit reduziert sich die Gleichung (2) zu
was anzeigt, dass die epithelialen Zellkerne eine periodisch feine Strukturkomponente in die Reflexion einbringen mit einer Wellelängenabhängigkeit ähnlich zu der des entsprechenden Streuerquerschnitts. Ihre Periodizität ist näherungsweise proportional zum Zellkerndurchmesser und ihre Amplitude ist eine Funktion der Größe und Anzahl der Zellkerne in der epithelialen Schicht. Diese Quantitäten können durch die Analyse der Reflexion R(λ) bestimmt werden.
Zur Veranschaulichung der in Gleichung (2) beschriebenen Effekte wurde die elastische Lichtstreuung von normalen menschlichen Einfachschichten des Dickdarms und menschlichen T84 Tumorzellen des Dickdarms (10 bzw. 15 Stellen) gemessen und analysiert. Die Zellen, näherungsweise 15μm lang, wurden auf Glastücken in einer Pufferlösung befestigt und auf eine BaSO₄ Diffusionsplatte gesetzt. Die BaSO₄ Platte wurde zur Annäherung der diffusen Reflexion des zugrundeliegende Gewebes benutzt. Die Durchmesser der normalen Zellkerne reichten im allgemeinen von 5 bis 7μm und die von Tumorzellen von 7 bis 16μm.
Ein faseroptischer Messfühler wurde zur Abstrahlung von weißem Licht einer Xenonbogenblitzlampe auf die Proben benutzt, und um das von den Proben zurückreflektierte Licht zu erfassen, wie in 1 gezeigt. Die Messfühlerspitze, 1 mm im Durchmesser, bestand aus einer zentralen Abstrahl- bzw. Anregungsfaser, die von sechs Sammelfasern umgeben war, von denen alle mit einer 1mm dicken optischen Quarzabdeckung umschlossen waren. Die Fasern waren 200μm dicke umgossene Silica-Kerne, NA = 0,22( Ω_i = Ω_c = πNA²). Um die spiegelnde Reflexion zu eliminieren, wurde der Messfühler um 17° gegenüber der Prüfflächennormalen abgeschrägt. An dem proximalen Ende wurden die Sammelfasern in einer Linie angebracht und auf den Eingangsschlitz eines Spektrogramms abgebildet. Ein Dioden-Array-Detektor nahm die Reflexionsspektren von 360 bis 685nm auf.
3A und 3B zeigen die normalisierten Reflexionen R(λ)/R(λ) von normalen Zellenproben bzw. T84 Tumorzellenproben. Verschiedene spektrale Eigenschaften sind zu erkennen. Zum Vergleich wird auch das BaSO₄ platteneigene Reflexionsspektrum in 3C gezeigt. Dieses Spektrum weist keine bedeutenden Struktureigenschaften auf.
Um aus den Reflexionsdaten Informationen bezüglich der Zellkerngrößenverteilung zu bekommen, muss Gleichung (3) invertiert werden. Die Zellkerngrößenverteilung N(l) kann dann aus einer Fourier-Transformation des periodischen Anteils der optischen Wegstrecke τ – τ₀ ≅ (1- R(λ))/q erhalten werden. Der Parameter q = 1 – b₀ – f₀ + 2 (b₁ – f₁) geht mit der Vorwärts- und Rückwärtsstreuung einher und hängt von der Mess-Sonden bzw. Messfühlergeometrie und der Winkelverteilung des einfallenden und reflektierten Lichts ab. In diesem speziellen Beispiel ist q ≈ 0,15. Durch die Einführung der effektiven Wellenzahl k = 2Πn_c(n - 1)/λ-k₀ und k_o = 2πn_c(n - 1)/λ_max, K = 2πn_c(n - 1)⟨λ^-1 _min – λ^-1 _max⟩ erhalten wir
Gleichung (4) wurde zur Analyse der Daten benutzt. Um unerwünschte Oszillationen zu beseitigen, wurde N(l) ferner mit der gaußschen Filterfunktion in Verbindung gebracht. Die voll durchgezogenen Kurven in 4 zeigen die resultierenden Zellkerngrößenverteilungen von normalen und T84 Tumorzelleneinfachschichtproben, die den Spektren aus den 3A und 3B entnommen sind. Es wurden eine relative von Zellkern auf Zellplasma bezogene Brechzahl von n = 1,06 und eine Zellplasma-Brechzahl von n_c = 1,36 benutzt. Die gestrichelten Kurven zeigen die entsprechenden morphometrisch mittels Lichtmikroskopie gemessenen Größenverteilungen. Die Größenverteilungen können durch gaußsche Verteilungen approximiert werden. Die Parameter dieser Verteilungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die extrahierten und gemessenen Verteilungen stimmen sowohl für die normalen als auch die T84 Zellproben gut überein.
Tabelle 1:
Die periodisch feine Struktur in der diffusen Reflexion der Speiseröhre und Dickdarmschleimhaut (Kolonschleimhaut) menschlicher Objekte können während gastroenterologischer Endoskopiemethoden gemessen werden. Im Falle der Barret-Speiseröhre, in der Epithelium aus einer dünnen Einfachschicht säulenförmiger Zellen besteht, die den in Zellkulturenversuchen benutzten ähneln, wurden Daten wie in den Zellkulturenstudien erfasst. Der faseroptische Messfühler wird in den Biopsiekanal eines Endoskops eingesetzt und mit der Gewebeoberfläche in Verbindung gebracht. Die hierin beschriebenen Methoden können auch zur Messung struktureller Eigenschaften anderer GI Gewebe, Gewebe in der Mundhöhle, der Zervix, der Harnblase und der Haut benutzt werden.
Die feine Strukturkomponente, die die Streusignatur der Zellkerne darstellt, macht typischerweise weniger als 5% des Gesamtsignals aus und wird gewöhnlich durch den Hintergrund des diffus gestreuten Lichts des zugrundeliegenden Gewebes, verdeckt, das selbst spektrale Eigenschaften hinsichtlich der Absorption und Streuung aufweist, wie in 5A gezeigt wird. Seine spektralen Eigenschaften werden durch die charakteristischen Absorptionsfequenzbereiche von Hämoglobin- und Kollagen-Streuung dominiert. Um die feine Struktur beobachten zu können, muss der Hintergrund beseitig werden. Die Absorptionslänge μ_a ^-1 reicht von 0,5 bis 250mm, da die Wellenlänge variiert, und die effektive Streulänge (μ_s ^|)^-1 reicht von 0,1 bis 1 mm. Somit müssen sowohl die Streuung als auch die Absorption für die Subtraktion oder Beseitigung des Hintergrundsignals berücksichtigt werden.
Um den Hintergrund darzustellen muss angenommen werden, dass das in das Gewebe einfallende Licht exponentiell abgeschwächt wird und das in jeder Tiefe z ein zum reduzierten Streuungskoeffizienten μ_a proportionaler Lichtanteil in Richtung der Oberfläche zurückgestreut und ferner exponentiell abgeschwächt wird. Da die Lichtabschwächung sowohl von der Streuung als auch Absorption abhängt, muss der Schwächungskoeffizient als Summe aus Absorptionskoeffizient μ_a und effektivem Streuungskoeffizient μ_s ⁽ ^e ⁾ = βμ_s ^| angenommen werden. Der Parameter β wurde durch den Vergleich mit Mote Carlo Simulationen und akkurateren Modellen für den Lichttransport bestimmt und beträgt β ≅ 0,07. Da Licht lediglich ≈ 1mm ins Gewebe eindringt, ist das meiste diffus zurückgestreute Licht auf die Schleimhautschicht beschränkt.
Das Gewebe wird dabei als Zweischichtmedium dargestellt, wobei das diffus reflektierte Licht der unteren Schicht vernachlässigt wird. Man erhält den folgenden approximierten Ausdruck für das aus dem unteren Gewebe in die epitheliale Zellschicht eindringende diffuse Licht:
mit der Lambert Funktion F(s), die die Winkelabhängigkeit des aus der Schleimhautschicht austretenden Lichts beschreibt, einem die Dicke der Schleimhautschicht beschreibenden Parameter L und der Konzentration c von Hämoglobin, die wir als den Hauptabsorber relativ zu der von Kollagen ansehen, die für die Lichtstreuung verantwortlich ist. Da sowohl mit Sauerstoff angereichertes Hämoglobin als auch mit Sauerstoff abgereichertes Hämoglobin gegenwärtig ist, wird die gesamte Hämoglobinabsorption durch
mit dem Sauerstoffsättigungsparameter α dargestellt (0≤α≤1).
5A zeigt die Reflexionsspektren von Gewebestellen zweier Barrett-Speiseröhren, die beide unabhängig von einander mittels gewöhnlicher pathologischer Analyse als (1) normales und (2) praekanzeröses Gewebe aufweisend (z.B. schwach fortgeschrittene Dysplasie) diagnostiziert wurden. Wie man sehen kann sind die Unterschiede dieser unverarbeiteten Spektren gering. Um sie zu analysieren, wurde Gleichung (5) zunächst an die deutlichen Eigenschaften der Daten durch Variation der Parameter c, a und L angepasst. Wie man der 5A entnehmen kann, sind die resultierenden Anpassungen ziemlich akkurat. Nach der Beseitigung dieser diffusen Hintergrundstruktur durch Berechnung von R(λ)/R(λ) wird die periodisch feine Struktur in 5B ersichtlich. Man beachte, dass die feine Struktur der dysplastischen Gewebestellen einen gegenüber normalen Gewebestellen höher frequenten Informationsinhalt aufweist. Gleichung (4) wurde dann dazu benutzt die entsprechenden Zellkerngrößenverteilungen zu extrahieren, die aus Figur 5C hervorgehen. Die Unterschiede zwischen normalen und dysplastischen Gewebestellen sind offensichtlich. Gegenüber den normalen Stellten ist die Verteilung der Zellkerne in den dysplastischen Stellen viel breiter und der Spitzenwert für den Durchmesser ist um -7 bis 10μm versetzt. Zusätzlich sind sowohl die relative Anzahl von großen Zellkernen (> 10μm) und die Gesamtzahl von Zellkernen signifikant angestiegen.
Basierend auf der Computeranalyse wird die Unsicherheit der Extraktion von Zellkerngrößeninformationen gemäß der obigen Methode, abhängig vom Rauschpegel und der Genauigkeit des Modells, auf 5 bis 30 % geschätzt. Die Verteilungen wurden unter Nutzung der gleichen Brechzahl für normale und dysplastische Zellkerne berechnet. Dies ist nicht gänzlich korrekt insofern, als dass in eingefärbten histologischen Abschnitten dysplastische Zellkerne hyperchromatisch erscheinen, was ein Hinweis für eine Brechzahl sein kann. Somit ist die relative Anzahl großer Zellkerne in den Verteilungen für die gemessenen dysplastischen Stellen geringfügig überschätzt.
Die Fähigkeit Zellkerngrößenverteilungen im lebenden Organismus (in vivo) zu berechnen hat wertvolle Anwendungen in der klinischen Medizin. Vergrößerte Zellkerne sind primäre Indikatoren für Krebs, Dysplasie und Zellenregeneration. Zusätzlich kann die Messung von Zellkernen unterschiedlicher Größe Informationen über die Präsenz bestimmter Zellen liefern und somit beispielsweise als Indikator für entzündliche Reaktionen im biologischen Gewebe dienen. Dies deutet darauf hin, dass eine unterschiedliche Morphologie/Pathologie in der Schleimhautschicht verschiedene Muster von Zellkernverteilungen zur Folge hat.
Nützliche physikalische Eigenschaften, die zur Unterscheidung zwischen nicht dysplastischem und dysplatischem Barrett-Epithelium gefunden wurden, sind die Gesamtanzahl von Zellkernen und der Prozentsatz großer Zellkerne (L > 10 μm). Einen Vergleich zwischen pathologisch analysierten Proben mit den hiervon optisch Analysierten lieferte die graphische Darstellung in 6 (Gesamtzahl von Zellkernen verglichen mit dem Prozentsatz von Zellkernen mit einem Durchmesser größer 10μm). Aus der Analyse von fünfzig Stellen ergab sich eine kumulierte Empfindlichkeit und Genauigkeit der Analyse von 83% bzw. 100%. Die Studie hatte einen positiven Vorhersagewert von 100 %. Die mit n gekennzeichneten Punkte waren entweder normal oder entzündet und die mit d gekennzeichneten Punkte waren dysplastisch. Ein Prozentsatz im Bereich von 20 bis 30%, in diesem speziellen Beispiel sind es 25%, wurde als akkurate Diagnose für diesen Typ befunden.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines Spektrogrammsystems 300 zur Sammlung von seitens exzidierter Gewebeproben zurückgestreuten spektralen Daten, wobei ein Spektrogramm und eine ladungsgekoppelte Vorrichtung (CCD), CMOS oder ein anderer integrierter Festkörper-Abbildungsarray (solid state imaging array) benutzt werden, ist in 7 dargestellt.
Das System 300 kann eine Breitbandlichtquelle oder einen einstellbaren Laser 314 zum Bestrahlen einer Probe 46 nutzen. Die Quelle 314 erzeugt einen Strahl 316, der durch einen Spiegel 318 auf eine fokussierende Optik 320 gerichtet wird, um auf einer Probe 46 aufzutreffen, die auf einem streuenden Substrat 325 hinter einem transparenten Fenster 321 montiert ist. Der Strahl wurde in einem Einfallwinkel auf die Probe fokussiert. Der Sammelwinkel 330 kann durch eine Öffnung oder einen Kollimator 340 bestimmt werden und liegt zwischen 2° und 12°, vorzugsweise zwischen 3° und 8°.
Ein Teil des durch die Probe 46 gestreuten Lichts 322 wurde mit einer erfassenden Optik 324 in einem kleinen Winkel relativ zu dem einfallenden Licht erfasst. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beziehen sich der Einfallwinkel und der Sammelwinkel auf eine einzige gemeinsame Achse. Die erfassende Optik 324 kollimiert das erfasste Licht für das Spektrogramm 310. Vor dem Eintritt in den Einlassschlitz des Spektrogramms 310 wurde das Licht durch eine Serie von Filtern 326 geführt, durch die die ungewollte Streukomponente des erfassten Lichts abgeschwächt wurde.
8 zeigt grundsätzlich einen Prozess 400 für das Erfassen und Analysieren des Streuspektrums eines interessierenden Materials, wie zum Beispiel Gewebe. Die Methode kann in vitro unter Nutzung eines Mikroskopiesystems oder eines Farbbildsystems, wie in 7 gezeigt, oder in vivo am Patienten angewandt werden. Das strahlende Licht 402 einer Quelle kann Strahlung im Bereich von 300 bis 1200nm, einschließlich des infraroten Bereichs, nutzen. Nach dem Erfassen 404 und Detektieren 406 der Strahlung können der diffuse Hintergrund 408 beseitigt und die gewünschten Eigenschaften 410 berechnet werden. Anhand dieser Ergebnisse kann für den interessierenden Bereich eine Diagnose erstellt werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung benutzt eine analytische Methode, die auf einer mittels eines faseroptischen Messfühlers mit einer festgelegten Anregungs- und Erfassungsgeometrie erfassten Datensammlung basiert. Die Datenanalyse nutzt Lichtdiffusion, wobei anstelle der direkten Anwendung des Modells zur Analyse der Gewebespektren eher eine Übereinstimmung zwischen den diffusen Reflexionsspektren und einer physikalischen Gewebedarstellung hergestellt wird, die sich aus Streuern und Absorbern mit bekannten optischen Eigenschaften zusammensetzt. Durch die Analyse der Spektren aus diesem Gewebemodell unter Nutzung der analytischen Formulierung wird ein Kalibrationssystem bereitgestellt, das einfach zu invertieren ist und Konzentrationen von Streuern und Absorbern akkurat vorhersagt. Ist die Kalibration erstellt, wird die Methode auf Gewebespektren angewandt.
Das Folgende bezieht sich auf die Anwendung der Spektralanalyse auf die Schleimhautoberfläche von Gewebe am lebenden Organismus (in vivo). In diesem Beispiel werden adenomatöse Dickdarmpolypen gemessen, die Vorboten des Dickdarmkarzinoms sind. Diese Polypen stellen eine Art Dickdarmdysplasie dar, die histologisch visuell nicht nachweisbarer flacher Dysplasie ähnelt und leicht feststellbar ist. Die Ergebnisse korrelieren mit standardmäßig histologischen Untersuchungen und können zur frühzeitigen Erkennung von Erkrankungen benutzt werden, und wichtiger noch, sie veranschaulichen wie diese spektroskopische Methode am lebenden Organismus (in vivo) angewendet werden kann, um morphologische und biochemische Informationen zu erhalten.
Diffuse Reflexionsspektren wurden in vivo von adenomatösen Polypen bei dreizehn sich einer Routinedarmspiegelung unterziehenden Patienten erfasst. Die Daten wurden simultan mit Multi-Anregungsfluoreszenzspektren erfasst:
eine Xenonbogenblitzlampe mit 10μs Pulsdauer und einem mittleren Energieaufwand von 4Jj/Puls wurde als weiße Lichtquelle benutzt. Ein Abbildungspektrogramm dispergierte das erfasste Licht und ein gesperrter Diodenarraydetektor wurde zur Lichtdetektion im Spektralbereich von 360 – 685nm verwendet. Ein 12μs mit dem Lampenpuls synchronisiertes Gate wurde benutzt, um den Hintergrund von endoskopischer Bestrahlung zu minimieren. Der Detektor wurde durch einen Notebook-Rechner (notebook computer) gesteuert, an den die Daten übermittelt und in dem die Daten gespeichert wurden.
Das Licht wurde unter Nutzung eines faseroptischen Messfühlers bereitgestellt und erfasst, wobei der Messfühler durch den Zugangskanal eines Kolonoskopes bis zur Gewebestelle befördert und mit dieser in Kontakt gebracht wurde. Der Messfühler bestand aus einer zentralen optischen Faser zur Bereitstellung von Licht, die von sechs konzentrischen Fasern zur Erfassung von Licht umgeben war. Alle Fasern hatten einen 200μm großen Kerndurchmesser und NA = 0,22. Die Messfühlerspitze war mit einer Quarzabdeckung von ungefähr 1,5mm Länge und Breite ausgestattet, die eine festgemachte Anregungs/Erfassungsgeometrie mit einheitlich kreisförmigen Anregungs- und Erfassungsspitzen in der Form von überlappenden Kegeln mit Radien von näherungsweise r_d = 0,35mm bzw. r_c = 0,55mm aufwies. Die Spitze wurde in einem Winkel von 17° abgeschrägt, um unerwünschte spiegelnde Reflexionen der Abdeckung zu beseitigen.
Das diffuse Reflexionsspektrum einer 20%-volumenprozentigen BaSO₄ Pulversuspension wurde als Referenz benutzt, um die spektralen Eigenschaften und die Gesamtintensität der Xenonlampe zu berücksichtigen. Der Messfühler wurde in die Suspension eingetaucht und ein diffuses Referenzreflexionsspektrum wurde vor der Erfassung der einzelnen Datensätze erfasst. Die Gewebespektren wurden durch die Division durch dieses Referenzspektrum kalibriert. Diffuse Reflexionsspektren wurden von einigen verschiedenen Stellen mit adenomatösen Polypen und von entsprechenden Stellen der umgebenden normalen Schleimhaut gemessen. Eine Einzelimpulsanregung wurde angewandt, um Bewegungsartefakte zu vermeiden. Die Polypen wurden dann beseitigt und histologisch untersucht, während die normalen Schleimhautstellen keiner Biopsie unterzogen wurden.
Um die diffuse Reflexion zu repräsentieren, wurde das biologische Gewebe als ein homogenes halb unendliches trübes Medium approximiert mit einem reduzierten Streuungs- und Absorptionskoeffizienten μ_s'(λ) bzw. μ_a'(λ)(λ ist die Wellenlänge des Lichts). Ein Teil des einfallenden Lichts wird vom Gewebe absorbiert, während der nichtabsorbierte Teil Gegenstand einer mehrfachen Streuung ist und schließlich aus der Oberfläche als diffuse Reflexion austritt. Ein gewisser Bruchteil dieses zurückkehrenden Lichts wird durch den Messfühler erfasst, während der restliche Teil unbemerkt entweicht. Die Menge des erfassten Lichts hängt von den optischen Eigenschaften μ_s'(λ) und μ_a'(λ) sowie vom Durchmesser r_p des Messfühlers ab. Da r_P endlich ist, dient er als Skalenlänge und ermöglicht die separate Bestimmung von μ_s'(λ) und μ_a'(λ).
Um die Erfassung von Licht mit einem optischen Messfühler zu charakterisieren, werden Kenntnisse über die räumliche und Winkelverteilung der diffusen Reflexion auf der Gewebeoberfläche benötigt. Unter Nutzung der Abbildungsmethode, um die Diffusionsapproximation in die Strahlungstransportgleichung zu implementieren, ergibt sich die radiale Dichte der diffusen Reflexion, R (λ, r), in einer Entfernung r vom Einfallspunkt des Lichts auf der Oberfläche eines halb unendlich trüben Mediums durch

Der Parameter A hängt von der Brechzahl n des Mediums ab (A = 1 für n = 1 und A > 1 für n > 1). Eine sinnvolle Annahme für die mittlere Brechzahl von Dickdarmgewebe ist n ≅ 1,4 so dass A ≅ 3,2 ist.
Um das gesamte vom Messfühler erfasste Licht festzustellen, muss Gleichung (6) über die gesamte räumliche Ausdehnung der Anregungs- und Erfassungsbereiche integriert werden, die durch die Radien r_d bzw. r_c charakterisiert sind. Mit der Annahme, dass die Lichtintensität des einfallenden Lichts über die gesamte Anregungsfläche gleichförmig ist, ergibt sich für die vom Messfühler erfasste Reflexion R_P(λ)
mit
Die Integrale in Gleichung (7) können numerisch evaluiert werden. Jedoch nehmen wir für den Bereitstellungspunkt des Lichts (r_d = 0) und für die Erfassung des Lichts eine kreisförmige Stelle mit dem Radius r_c an, um einen einfachen analytischen Ausdruck für R_P (λ) zu erhalten:
Der optimale Wert r_c wurde durch Kalibrierung der Gleichung (8) mit physikalischen Gewebemodellen anhand ihrer bekannten optischen Eigenschaften gefunden. Der Vorteil des Gebrauchs von Gleichung (8) liegt darin, dass sie viel einfacher als Gleichung (7) zu invertieren ist, was numerische Integration erfordert. Gleichung (8) liefert die diffuse Reflexion rechtwinklig zur Gewebeoberfläche. Dies ist zulässig, da das Licht lediglich durch den optischen Messfühler in Richtungen mit einer maximalen Abweichung von ungefähr 10° von der Richtung senkrecht zur Oberfläche erfasst wird.
Gleichung (8) kann benutzt werden, um die durch den Messfühler erfassten diffusen Reflexionsspektren zu analysieren. Aus diesen Messungen der Gewebespektren ergibt sich, dass Hämoglobin der einzig signifikante Lichtabsorber im Dickdarmgewebe im sichtbaren Bereich des Spektrums ist und sowohl in Sauerstoff angereicherter als auch in Sauerstoff abgereichter Form vorliegt. Die Lichtabsorptionseigenschaften beider Formen wurden untersucht und ihre molaren Anregungskoeffizientenspektren ε_HbO2(λ), ε_Hb(λ) sind in 9 dargestellt. Die Oxyhämoglobinabsorption weist ein Maximum bei 415nm und zwei sekundäre Maxima bei 542 und 577nm auf, während Deoxyhämoglobin ein Maximum bei 430nm und nur ein sekundäres Maximum bei 555nm aufweist. Der Gesamtabsorptionskoeffizient μ_j(λ) ist gegeben durch
wobei
der Hb Sauerstoffsättigungsparameter ist, C_hbO2 und C_Hb die Konzentrationen von Oxy bzw. Deoxy Hb sind, und C_hb = C_hbO2 + C_Hb die Gesamtkonzentration von Hb ist.
Die Bestimmung von C_Hb und α wurde wie folgt durchgeführt. Für ein gegebenes Gewebespektrum R_P (λ) wurden Anfangswerte zugewiesen (typischerweise C_Hb = 0,0 und α = 0,5). Gleichung (8) wurde dann numerisch invertiert, um μ_s'(λ) zu finden, wobei μ_s'(λ) restliche spektrale Eigenschaften von HB Absorption aufwies. Die Parameter C_Hb und α wurden dann modifiziert und der Prozess wurde rekursiv wiederholt bis μ_s'(λ) eine glatte spektrale Form ohne HB Spektraleigenschaften aufwies. Auf diese Weise wurde μ_s'(λ) simultan mit C_Hb und α bestimmt.
Tabelle 2
Das obige Verfahren basiert auf der Annahme, dass μ_s'(λ) eine relativ glatte Funktion der Wellenlänge λ ist, was die Analyse bestätigt und die nachfolgende Diskussion zeigen wird. Im Allgemeinen stellt μ_s'(λ) die Summe der Beiträge der verschiedenartigen Gewebestreuer dar. Unglücklicherweise sind keine detaillierten Informationen über die individuellen Streuer verfügbar. Deshalb wurde μ_s'(λ) wie folgt beschrieben μs'(λ) = ρsσ'(λ), (10)wobei ρ_s die effektive Streudichte und σ' (λ) der effektiv reduzierte Streuquerschnitt ist, beispielsweise werden die Streueigenschaften von Gewebe durchschnittlich so modelliert, als ob das Gewebe einen einzigen wohldefinierten Streutypen enthielte. Im Allgemeinen hängt σ' (λ) von der Brechzahl, der Form und der Größe der Streuer, aber auch der Brechzahl des umgebenden Mediums, ab. Für einen sphärischen Streuer mit einem Durchmesse d_s kann σ' (λ) numerisch unter Nutzung der Mie-Streutheorie berechnet werden.
10 zeigt eine solche Berechnung von σ'(λ). Man beachte, dass die Steigung von σ'(λ) von d_s in einfacher Weise abhängt, z. B. steht die Steigung im umgekehrten Verhältnis zur Streugröße. Auf diese Weise war es möglich jedem σ'(λ) eine Streugröße zuzuordnen und somit jedem μ_s'(λ) im Bereich d_s = 0,2 bis 2,0μm. Zum Beispiel kann bei der Untersuchung von μ_s'(λ) für normale Dickdarmschleimhaut beobachtet werden, dass die Werte mit der Streugröße d_s ≅ 0,35μm korrespondieren. Wurde d_s einmal bestimmt, folgte die Dichte p_s aus der Division von μ_s'(λ) durch σ'(λ). Zusammenfassend wurden für jedes diffuse Gewebereflektionsspektrum vier Parameter erhalten, C_Hb, α, p_s und d_s.
Bei der Berechnung der Ergebnisse, die in 10 gezeigt werden, wurden die Streuer und die Brechzahlen des umgebenden Mediums in Anlehnung an die Werte angenommen, die man wahrscheinlich im Gewebe vorfinden würde. Sinnvolle Approximationen sind eine Brechzahl von näherungsweise 1,4 für die Streuer und 1,36 für das umgebende Medium. Diese Werte können dadurch gerechtfertigt werden, dass die untere Grenze der Gewebebrechzahl durch die Brechzahl von Wasser festgelegt ist, die näherungsweise gleich 1,33 in sichtbarem Bereich beträgt, und die obere Grenze durch die maximale Brechzahl von Weichgewebe festgelegt ist, die ungefähr 1,45 beträgt. Diese Werte stimmen mit den im Allgemeinen für biologisches Weichgewebe beobachteten Werten überein.
Die physikalische Gewebedarstellung diente als Methode zur Bestätigung der Anwendbarkeit der verschiedenartigen Approximationen, die bei der Entwicklung von Gleichung 8 gemacht wurden. Die Proben bestanden aus Mischungen von sphärischen Mikropartikeln mit Hb in verschiedenartigen Konzentrationen. Das Modell legte fest, dass diese Mischungen die optischen Eigenschaften von Gewebeproben simulierten. Zusätzlich wurde der Gültigkeitsbereich des analytischen Modells hinsichtlich der optischen Eigenschaften festgelegt und der optimale Wert für den Parameter r_c in Gleichung (8) bestimmt.
Polystyrolkugelsuspensionen in entionisiertem Wasser (Polysciences, Inc.) wurden benutzt, um die Gewebestreuung von Licht zu simulieren und Hb Lösungen aus lyophilisiertem menschlichen Hb (Sigma, H0267) wurden benutzt, um die Absorption zu stimulieren. Die Streueigenschaften der Kugeln wurden unter Nutzung der Mie-Theorie berechnet. Der Kugeldurchmesser betrug 1,07 μm und die Brechzahl n_p von Polystyrol war durch den Ausdruck von n_p = 1560 + 10002/λ²(26), (λ in nm), gegeben und die Polystyrolkonzentration betrug 0,625 Volumenprozent. Der reduzierte Streuungskoeffizient variierte näherungsweise von 1,7mm^-1 bei 400nm. Diese spektrale Abhängigkeit ähnelt der in 10 gezeigten mit d_s = 1,0 μm, mit dem Unterschied, dass die Steigung größer ist aufgrund der größeren Brechzahl von Polystyrol.
Da die Lichtabsorption von Polystyrol im sichtbaren Bereich vernachlässigbar ist, wurde die Absorption ausschließlich auf Oxyhemoglobin zurückgeführt. Die Größe des physikalischen Gewebemodells war näherungsweise 3×3×0,5 cm, wobei die flache Geometrie von normaler Dickdarmschleimhaut simuliert wurde. Zusätzliche Geometrien wurden untersucht, so z.B. eine zylindrische Geometrie mit einer Tiefe von 1 cm und einem Durchmesser von 0,5 cm, um die Geometrie von Polypen zu simulieren, wobei jedoch keine signifikanten spektralen Unterschiede gefunden wurden. Der Bereich der benutzten optischen Parameter wurde auf Basis der zuvor berichteten unabhängigen Messungen der optischen Parameter von Dickdarmgewebe gewählt, die in vitro durchgeführt wurden.
11 zeigt diffuse Reflektionsspektren, die mittels des physikalischen Gewebemodells berechnet wurden mit verschiedenartigen Konzentrationen von Hb verglichen mit den analytischen Modellvorhersagen, die mit einem Wert von r_c = 0,45mm in Gleichung (3) erhalten wurden. Dieser Wert wurde als optimaler Wert für r_c bestimmt, der durchweg für die ganze Datenanalyse konstant gehalten wurde. Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass der Paramter Z₀ = 1/(0,6μd + μ_s') die Übereinstimmung zwischen den analytischen und den physikalischen Gewebemodelldaten verbessert, insbesondere für große Absorptionswerte. Die in 11 gezeigten physikalischen Gewebemodellspektren ähneln sehr den nachstehend dargestellten Gewebespektren. Diese Tatsache dient als indirekte Bestätigung der Annahmen, die bei der Entwicklung des Modells, betreffend die Gewebestreuer (modelliert als Mikrosphären) und die Gewebeabsorption (zurückzuführen auf Hb), gemacht wurden.
Es stellte sich heraus, dass das analytische Modell die physikalischen Modellspektren für Hb Konzentrationen in dem physiologisch interessierenden Bereich akkurat vorhersagt. Für Hb Konzentrationen kleiner 100 mg/dL war die Abweichung zwischen den beiden Modellen immer kleiner als 10% über den ganzen Wellenlängenbereich. Die größte Abweichung trat auf, wenn die Absorption vergleichbar mit der Streuung war. Dies wird durch die Kurve (d) in 11 gezeigt, in der Nähe des Höchstwertes für die Hb Absorption bei ungefähr 415nm. Die Hb Konzentration betrug in diesem Fall 250 mg/dL, was dem Absorptionskoeffizienten von ungefähr 5 mm^-1 bei 415nm entspricht, während der Wert für den Streukoeffizienten ungefähr 2,8mm^-1 bei der gleichen Wellenlänge betrug.
12 zeigt typische diffuse Reflektionsspektren einer adenomatösen Polypenstelle und einer normalen Schleimhautstelle. Signifikant spektrale Unterschiede sind leicht zu beobachten, insbesondere im blauen Spektralbereich, wo das Hb Absorptionstal um 420nm die bedeutende spektrale Eigenschaft darstellt. Dieses Absorptionstal ist viel bedeutender im Polypenspektrum, das auch eine kontinuierliche Abnahme in der Intensität beginnend vom roten Ende (~ 700nm) bis zum grünen Bereich (~500nm) des Spektrums zeigt, während im gleichen Bereich das normale Schleimhautspektrum eine stetige Zunahme der Intensität zeigt. Die sekundären Absorptionseinbrüche von Oxyhemoglobin (542 und 577nm) sind viel bedeutender im adenomatösen Polypenspektrum, wobei sie eine erhöhte Hb Konzentration anzeigen. Gemäß der Modellanalyse wurde das normale Schleimhautspektrum durch eine Hb Konzentration von C_Hb = 22,5 mg/dL charakterisiert, während der entsprechende Wert für den adenomatösen Polypen rund 6 mal höher war (C_Hb = 165 mg/dL). Die Hb Sättigung wurde mit 0,65 ± 0,05 bzw. 0,55 ± 0,05 festgestellt.
13 zeigt die Streuspektren μ_s'(λ), die mittels der in 12 gezeigten Daten berechnet wurden, zusammen mit den besten Mie-Theorieanpassungen. Der Hauptunterschied zwischen den Spektren der beiden Gewebetypen ist in der spektralen Steigung zu beobachten, die verschiedenen effektiven Streugrößen entspricht, d_s = 1,5μm für den Polypen und d_s = 0,35μm für normale Schleimhaut. Die Werte für die Streuerdichten wurden mit p_s = 15 × 10⁸ mm^-3 für normale Schleimhaut und p_s = 1,3 × 10⁸mm^-3 für den adenomatösen Polypen festgestellt. 12 zeigt zudem die besten analytischen Modellanpassungen zu den Daten unter Nutzung von Gleichung (8). Trotz der beobachteten dramatischen Unterschiede in der spektralen Form zwischen den beiden Gewebetypen und der Tatsache, dass μ_s'(λ) unter Annahme einer homogenen Verteilung von sphärischen Streuern approximiert wurde, beschreibt das Modell die Daten akkurat. Die Abweichung zwischen den Daten und dem Modell ist typischerweise kleiner als 10% für die meisten Wellenlängenbereiche.
14A–14D zeigen die berechneten Werte der vier Parameter für alle untersuchten Gewebestellen: (A) gesamte Hb-Konzentration C_Hb(B) Hb- Sauerstoffsättigung α, (C) effektive Streuerdichte p_s und (D) Effektivität der Streuergröße d_s. Adenomatöse Polypen wurden klar durch eine erhöhte Hb Konzentration gekennzeichnet, während keine sichtbaren Unterschiede hinsichtlich der Hb Sauerstoffsättigung beobachtet werden konnten. Die effektive Streuerdichte war im Allgemeinen geringer in adenomatösen Polypen und die effektive Streuergröße größer, obwohl eine signifikante Überlappung dieser Parameterverteilungen zwischen den zwei Gewebetypen bestand. Tabelle 2 fasst die in de 14A–14D gezeigten Ergebnisse zusammen, wobei für jeden Parameter der Durchschnittswert und die Standardabweichung angegeben werden.
15 zeigt eine grafische Darstellung der Hb Konzentration C_Hb verglichen mit der effektiven Streugröße d_s. Diese beiden Parameter werden zusammen gezeigt, um die gefundenen Unterschiede in den Streu- und Absorptionseigenschaften von normaler Schleimhaut und adenomatösen Polypen im Dickdarm zusammenzufassen und darzustellen. Man beachte, dass die normalen Schleimhautdaten dazu tendieren eine Anhäufung von Punkten zu bilden, während die adenomatösen Polypendaten voneinander getrennt sind und durch eine weitergestreute und unregelmäßige Verteilung sowohl in der effektiven Streuergröße als auch der Hb Konzentration charakterisiert werden.
Eine Methodologie wurde beschrieben, die quantitative Informationen über Dickdarmschleimhautgewebe im lebenden Organismus (in vivo) basierend auf diffusen Reflektionsmessungen liefert. Die Hauptkomponenten dieser Methodologie sind (a) die Datenerfassung mittels eines faseroptischen Messfühlers mit einer festen Anregungs-/Erfassungsgeometrie, (b) ein analytisches Modell für die Datenanalyse basierend auf Lichtdiffusion, und (c) ein physikalisches Gewebemodell zur Kalibrierung des analytischen Modells.
Die Nutzung eines optischen Messfühlers mit fester Geometrie ermöglicht eine konsistente Datensammlung und eine unabhängige Bestimmung der Streuung und Absorption. Die Modellierung der Messfühlergeometrie wird durch den Einsatz des Parameters r_c unterstützt, der auch die Empfindlichkeit des Messfühlers bezüglich der Absorption definiert. Ein Messfühler mit großem r_c wird gegenüber der Gewebeabsorption empfindlichere Spektren erfassen, als ein Messfühler mit einem kleineren Wert für r_c. In 4 sind die sekundären Hb Absorptionsspitzen im normalen Schleimhautspektrum kaum spürbar: ein Messfühler mit großem r_c würde diese Eigenschaften stärker hervorheben.
Das analytische Diffusionstheoriemodell ist für numerische Inversionen zugänglich und beschreibt erfolgreich die Gewebedaten nach der Kalibrierung mit dem physikalischen Gewebemodell, das sich aus Polystyrolkugeln und Oxyhemoglobin zusammensetzt. Andere Forscher haben bereits Varianten des hier beschriebenen analytischen Modells zur Studie der diffusen Reflektion von Geweben und zur Studie von physikalischen Gewebemodellen im infraroten Bereich benutzt. Die vorliegende Studie ist unseres Wissens nach die erste, die das Modell in sichtbaren Bereich auf in vivo Daten von menschlich muskulärem Gewebe anwendet, wobei die Daten mittels eines faseroptischen Messfühlers gemessen wurden. Beim Arbeiten im eher sichtbaren als im Infrarotbereich wurde die Lichtpenetranz auf ungefähr 0,5 mm beschränkt, z.B. auf die Schleimhautschicht, in der praekanzeröse Veränderungen auftreten. Durch Nutzung des Modells haben wir gezeigt, dass es möglich ist quantitative Informationen über die untersuchten Gewebe zu erhalten, so zum Beispiel die Hb Konzentration, die Hb Sauerstoffsättigung, die effektive Streuergröße und die effektive Streuerdichte. Die Ergebnisse zeigen, dass die diffuse Reflektion ein Werkzeug zur quantitativen Analyse von Schleimhautgewebeoberflächen im lebenden Organismus (in vivo) liefert.
Die grundlegende Approximation, die in dem Modell gemacht wurde, ist dass Hb der einzig signifikante Absorber in der Dickdarmschleimhaut im sichtbaren Bereich des Spektrums ist. Obwohl es für diese Annahme keine direkte Bestätigung gibt, zeigt die Tatsache, dass die Daten die charakteristischen Eigenschaften von Hb Absorption fest aufweisen, eindeutig, dass Hb ein Hauptabsorber ist. Zusätzlich ähneln die mittels des physikalischen Modells gemessenen Spektren, in denen Hb der einzige Absorber war, sehr den Gewebespektren.
In ähnlicher Weise wurde die Gewebestreuung in Folge homogener sphärischer Streuer mit bekannter Brechzahl modelliert. Die Approximation erlaubt eine quantitative Charakterisierung in Hinblick auf zwei wesentliche Parameter, die effektive Streuergröße und die effektive Streuerdichte. Diese Parameter liefern eine Schätzung der durchschnittlichen Streueigenschaften. Die Tatsache, dass die mittels des physikalischen Gewebemodells gemessenen Spektren die gegenwärtigen Gewebespektren reproduzieren, liefert abermals (wie für den Fall von Hb) eine indirekte Bestätigung für die Gültigkeit dieser Approximation.
Die Datenanalyse zeigte, dass adenomatöse Dickdarmpolypen durch eine erhöhte Hb Konzentration charakterisiert wurden. Durch die Nutzung von Morphometrie und vaskulärer Darstellung in Verbindung mit Abtastelektronenmikroskoptechniken ist es bekannt, dass Tumor- und Krebsgewebe eine erhöhte Mikrovaskularisation aufweisen und folglich einen erhöhten Blutgehalt.
Praekanzeröses Gewebe, wie zum Beispiel adenomatöse Polypen des Dickdarms, wird auch durch ein erhöhtes mikrovaskuläres Volumen des selbigen in Übereinstimmung mit diesen Berichten hinsichtlich der beobachteten erhöhten Hb Konzentration charakterisiert. Andere berichten eine erhöhte Mikrovaskularisation der Dickdarmschleimhaut in Verbindung mit der Crohn's Erkrankung und einer eiternden Colitis. Obwohl diese Gewebetypen unsererseits nicht untersucht wurden, könnte sich die hier angewandte Technik zur in vivo Untersuchung solcher Krankheiten als nützlich erweisen.
Die Hb Sauerstoffsättigung betrug näherungsweise 60% im Durchschnitt sowohl für die normale Schleimhaut als auch die adenomatösen Polypen. Diese Ergebnisse sind sinnvoll, weil die Messungen im wesentlichen im kapillaren Netzwerk der Schleimhaut durchgeführt wurden, wo Sauerstoff durch Hb an das Gewebe transferiert wird. Die Hb Sauerstoffsättigung fällt innerhalb der Kapillargefäße von näherungsweise 97% (arterielles Blut) auf ungefähr 40% (venöses Blut) ab, wobei die gemessenen Werte näherungsweise in der Mitte dieses Bereiches liegen. Die Tatsache, dass zwischen diesen beiden Gewebetypen keine Unterschiede beobachtet wurden, kann wahrscheinlich auf die Tatsache zurückgeführt werden, dass sich adenomatöse Polypenmetabolismen nicht signifikant verändern, um Veränderungen in der Oxygenierung einzuleiten, was wahrscheinlich in Beziehung zu den gestörten Metabolismen solcher Gewebe steht. Die hier beschriebene Technik könnte in vivo zur Studie von Tumoren auf Oberflächen hohlförmiger Organe oder zur Studie anderer Gewebetypen eingesetzt werden, sobald Kenntnisse über HB die Sättigung erforderlich sind.
In den Streueigenschaften wurde eine intrinsische Differenzierung zwischen den beiden Gewebetypen beobachtet. Für adenomatöse Polypen war die mittlere effektive Streuergröße größer und die mittlere effektive Streuerdichte kleiner im Vergleich zu normaler Schleimhaut. Es gibt etliche Hypothesen, die Beiträge zur Streuung von verschiedenartigen Mikrostrukturen ermitteln, sowohl für extrazellulare Mikrostrukturen als auch Kollagenfasern und intrazellulare Mikrostrukturen, wie zum Beispiel Mitochondrien und Zellkerne. Ein Modell liefert Beiträge zur Lichtstreuung von intrazellularen Strukturen, die in adenomatösen Polypen vergrößert sind, da die Zellen ein größeres Volumenverhältnis aufweisen. Zusätzlich ist die Submukosa, in der Kollagen dichter gepackt ist, für gewöhnlich zu weit von den Polypen entfernt angeordnet, um zur Lichtstreuung beitragen zu können. Dies kann die geringere Streuerdichte in adenomatösen Polypen erklären, vorausgesetzt, dass intrazellulare Streuer im Mittel größer sind als extrazellulare Streuer.
Während diese Erfindung besonders in Hinblick auf die bevorzugten Ausführungsformen hiervon beschrieben wurde, wird es dem Fachmann naheliegend erscheinen, dass zahlreiche Änderungen in Form und Details hierin vollführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der Erfindung, wie er durch die Ansprüche definiert wird, zu verlassen. Der Fachmann wird anhand von Routineuntersuchungen viele Entsprechungen zu den hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung erkennen oder feststellen können. Es wird beabsichtigt diese Entsprechungen im Rahmen des Schutzbereiches mit zu umfassen.

Claims

Verfahren zur optischen Analyse eines Materials, bei dem man: Licht auf ein Gebiet von Interesse im Material richtet; Licht von dem Material sammelt; ein Streuspektrum des gestreuten Lichts erfasst; und einen Bestandteil des erfassten Lichts, der periodisch in der Wellenlänge ist, misst, um eine physikalische Eigenschaft des Materials zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man des Weiteren das detektierte Streulicht mit einem Datenprozessor analysiert.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man des Weiteren das Licht von dem Material mit einem faseroptischen Messfühler sammelt, wobei der Messfühler eine optische Faser mit einer numerischen Öffnung im Bereich von 0,05 bis 0,25 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man des Weiteren die mittlere Kerngröße der Kerne in einem Gebiet von Interesse bestimmt und/oder des Weiteren die Zahl der Teilchen pro Einheitsfläche in dem Gebiet von Interesse bestimmt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man des Weiteren die spektrale Darstellung des detektierten Lichts bildet und einen diffusen spektralen Hintergrund aus der spektralen Darstellung entfernt und/oder des Weiteren das Licht mit einem bildgebenden Sensor detektiert.
Gerät zur optischen Messung von Gewebe, aufweisend eine Lichtquelle (50), die ein Gebiet von Interesse im zu beurteilenden Gewebes beleuchtet, eine optische Anordnung (90, 100, 110), die Streulicht vom Gewebe sammelt, ein Detektorsystem (80), welches das gesammelte Licht abtastet, und einen Datenprozessor (120), der eine strukturierte Komponente des gestreuten Lichts, das periodisch in der Wellenlänge ist, analysiert, um eine physikalische Eigenschaft des Gewebes zu bestimmen.
Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es des Weiteren eine Breitbandlichtquelle (50), die Licht im Bereich von 350 bis 700 nm erzeugt, aufweist.
Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es des Weiteren einen faseroptischen Messfühler (10, 30) aufweist, der die Quelle (50) mit dem Gewebe verbindet, und/oder des Weiteren einen faseroptischen Messfühler (10, 20) aufweist, der das Licht in einem Sammelwinkel zwischen 2 und 12 Grad sammelt, und wobei beispielsweise der Licht sammelnde Messfühler in ein Endoskop eingesetzt werden kann.
Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektorsystem (80) einen bildgebenden Sensor (35) und einen Spektrographen (70) aufweist.
Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Datenprozessor (120) einen diffusen, spektralen Hintergrundanteil vom detektierten Streulicht entfernt und/oder das Gerät des Weiteren einen Filter (110) aufweist, der Teile des gestreuten Lichts entfernt.