DE69823553T2

DE69823553T2 - Benzopyran- and benzothiopyran-derivate mit retinoid-antagonist ähnlicher aktivität

Info

Publication number: DE69823553T2
Application number: DE69823553T
Authority: DE
Inventors: S. Elliott KLEIN; T. Alan JOHNSON; M. Andrew STANDEVEN; L. Richard BEARD; J. Samuel GILLETT; T. Tien DUONG; Sunil Nagpal; Vidyasagar Vuligonda; Min Teng; A. Roshantha CHANDRARATNA
Original assignee: Allergan Inc
Current assignee: Allergan Inc
Priority date: 1997-12-24
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2018-12-22
Also published as: AU744757B2; HK1030167A1; ATE265447T1; CA2316351C; US5958954A; DE69823553D1; JP2001527071A; JP4118511B2; CA2316351A1; EP1042313A1; AU1940699A; WO1999033821A1; EP1042313B1

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part der Anmeldung mit der Nr. 08/871,093, eingereicht am 09. Juni 1997, bei der es sich um eine Teilanmeldung der Anmeldung Nr. 08/613,863, eingereicht am 11. März 1996 handelt, die wiederum Priorität gemäß 35 U. S. C. § 119(e) der drei folgenden US-Anmeldungen beansprucht, die jeweils als Nicht-Provisional Application eingereicht wurden und durch getrennte Eingaben, eingereicht am 31. Januar 1996, Anmeldung Nr. 08/522,778, eingereicht am 01. September 1995; jetzt Provisional Application Nr. 60/019,015; Anmeldung Nr. 08/522,779, eingereicht am 01. September 1995, jetzt Provisional Application _______; und Anmeldung Nr. 08/542,648, eingereicht am 13. Oktober 1995, jetzt Provision Application Nr. 60/020,501, in Provisional Applications umgewandelt wurden. Die vollständigen Offenbarungen dieser verwandten Anmeldungen werden hier durch Inbezugnahme mit eingeschlossen.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen mit Retinoid-negativem Hormon und/oder Retinoid-Antagonist-ähnlichen biologischen Aktivitäten. Insbesondere betrifft die Erfindung 4-Aryl-substituiertes Benzopyran, 4-Aryl-substituiertes Benzothiopyran, 4-Aryl-substituiertes 1,2-Dihydrochinolin und 8-Aryl-substituierte 5,6-Dihydronaphthalinderivate, die auch durch eine substituierte 3-Oxo-1-propenylgruppe substituiert sein können. Diese neuen Verbindungen haben eine Retinoid-Antagonist-ähnliche Aktivität und sind für die Behandlung oder Verhinderung einer Retinoid- und Vitamin A- und Vitamin-A-Vorläufer-induzierten Toxizität bei Säugern und als Hilfsmittel für die Behandlung von Säugern mit Retinoiden geeignet, um unerwünschte oder ungünstige Nebenwirkungen zu verhindern oder abzuschwächen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der negativen Retinoidhormone für die Erhöhung der biologischen Aktivitäten anderer Retinoide und Steroidhormone und die Inhibition der basalen Aktivität Nichtliganden-gebundener Retinolsäurerezeptoren.
Hintergrund der Erfindung
Verbindungen mit einer Retinoid-ähnlichen Aktivität sind auf dem Gebiet wohl bekannt und werden in vielzähligen Patenten aus den Vereinigten Staaten und anderen Ländern und in wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben. Es ist allgemein bekannt und auf dem Gebiet akzeptiert, dass die Retinoid-ähnliche Aktivität für die Behandlung von Säugern nützlich ist, einschließlich dem Menschen, um Symptome, assoziiert mit vielzähligen Erkrankungen und Zuständen, zu heilen oder abzuschwächen.
Retinoide (Vitamin A und seine Derivate) haben bekanntlich breit gefächerte Aktivitäten, einschließlich Wirkungen auf die Zellproliferation und Differenzierung, und zwar in einer Vielzahl biologischer Systeme. Diese Aktivität hat viele Retinoide bei der Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen, einschließlich dermatologischer Störungen und Krebserkrankungen, nützlich gemacht. Im Stand der Technik wurde eine große Zahl chemischer Verbindungen entwickelt, die eine Retinoid-ähnliche biologische Aktivität aufweisen und umfangreiche Patentliteratur wie auch chemische Literatur existiert, die solche Verbindungen beschreibt. Die relevante Patentliteratur beinhaltet die US-Patente Nrn. 4,980,369, 5,006,550, 5,015,658, 5,045,551, 5,089,509, 5,134,159, 5,162,546, 5,234,926, 5,248,777, 5,264,578, 5,272,156, 5,278,318, 5,324,744, 5,346,895, 5,346,915, 5,348,972, 5,348,975, 5,380,877, 5,399,561, 5,407,937 (dem selben Inhaber wie die vorliegende Anmeldung zugeordnet) sowie die darin zitierten Patente und Veröffentlichungen, die insbesondere Chroman-, Thiochroman- und 1,2,3,4-Tetrahydrochinolinderivate beschreiben und diese betreffen, die eine Retinoid-ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Zusätzlich sind mehrere Anmeldungen anhängig, die dem Inhaber der vorliegenden Anmeldung zugeordnet sind und die weitere Verbindungen mit Retinoid-ähnlicher Aktivität betreffen.
US-Patente Nrn. 4,740,519 (Shroot et al.), 4,826,969 (Maignan et al.), 4,326,055 (Loeliger et al.), 5,130,335 (Chandraratna et al.), 5,037,825 (Klaus et al.), 5,231,113 (Chandraratna et al.), 5,324,840 (Chandraratna), 5,344,959 (Chandraratna), 5,130,335 (Chandraratna et al.), veröffentlichte europäische Patentanmeldungen Nrn. 0 176 034 A (Wuest et al.), 0 350 846 A (Klaus et al.), 0 176 032 A (Frickel et al.), 0 176 033 A (Frickel et al.), 0 253 302 A (Klaus et al.), 0 303 915 A (Bryce et al.), GB-Patentanmeldung GB 2 190 378 A (Klaus et al.), deutsche Patentanmeldungen Nrn. DE 37 15 955 A1 (Klaus et al.), DE 36 02 473 A1 (Wuest et al.) und die Artikel J. Amer. Acad. Derm. 15: 756–764 (1986) (Sporn et al.), Chem. Pharm. Bull. 33: 404–407 (1985) (Shudo et al.), J. Med. Chem. 31: 2182–2192 (1988) (Kagechika et al.), Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids CRC Press Inc. 1990, S. 334–335, 354 (Dawson et al.) beschreiben oder betreffen Verbindungen, die einen Tetrahydronaphthylbestandteil beinhalten und eine Retinoid-ähnliche oder verwandte biologische Aktivität aufweisen. Das US-Patent Nr. 4,391,731 (Boiler et al.) beschreibt Tetrahydronaphthalinderivate, die in Flüssigkristallzusammensetzungen geeignet sind.
Ein Artikel von Kagechika et al. in J. Med. Chem. 32: 834 (1989) beschreibt bestimmte 6-(3-Oxo-1-propenyl)-1,2,3,4-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin-Derivate und verwandte Flavonverbindungen mit einer Retinoid-ähnlichen Aktivität. Die Artikel von Shudo et al. in Chem. Pharm. Bull. 33: 404 (1985) und von Jetten et al. in Cancer Research 47: 3523 (1987) beschreiben oder betreffen weitere 3-Oxo-1- propenyl-Derivate (Chalconverbindungen) und ihre Retinoid-ähnliche oder verwandte biologische Aktivität.
Unglücklicherweise haben Verbindungen mit einer Retinoid-ähnlichen Aktivität (Retinoide) auch eine Vielzahl unerwünschter Nebenwirkungen bei therapeutischen Dosierungen, einschließlich Kopfschmerzen, eine Teratogenese, eine mukokutane Toxizität, eine muskelskelettale Toxizität, Dyslipidämien, Hautirritationen, Kopfschmerzen und eine Hepatotoxizität. Diese Nebenwirkungen begrenzen die Akzeptanz und Verwertbarkeit von Retinoiden für die Behandlung von Erkrankungen.
Es ist nun allgemein bekannt, dass zwei Hauptarten von Retinoidrezeptoren in Säugern (und anderen Organismen) existieren. Diese zwei Hauptarten oder Familien von Rezeptoren werden als RARs und RXRs bezeichnet. Innerhalb jeder Art existieren Subtypen: in der RAR-Familie werden die Subtypen als RAR-α, RAR-β und RAR-γ bezeichnet, und in RXR sind die Subtypen: RXR-α, RXR-β und RXR-γ. Beide Familien von Rezeptoren sind Transkriptionsfaktoren, die voneinander basierend auf ihren Ligandenbindungsspezifitäten unterschieden werden können, All-trans-RA (ATRA) bindet und aktiviert eine Klasse von Retinolsäurerezeptoren (RARs), die RAR-α, RAR-β und RAR-γ beinhalten. Ein anderer Ligand, 9-cis-RA (9C-RA) bindet und aktiviert sowohl die RARs als auch die Mitglieder der Retinoid X-Rezeptor-(RXR)-Familie.
Es wurde auf dem Gebiet außerdem etabiliert, dass die Verteilung der beiden Hauptretinoidrezeptorarten und der unterschiedlichen Subtypen in unterschiedlichen Geweben und Organen von Säureorganismen nicht einheitlich ist. Weiterhin ist allgemein auf dem Gebiet anerkannt, dass viele unerwünschte Nebenwirkungen von Retinoiden durch ein oder mehrere der RAR-Rezeptor-Subtypen vermittelt werden. Dementsprechend wird unter Verbindungen mit einer Agonist-ähnlichen Aktivität auf Retinoidrezeptoren, Spezifität oder Selektivität für eine der Hauptarten oder Familien und sogar Spezifität oder Selektivität für eine oder mehrere Subtypen innerhalb einer Familie von Rezeptoren als erwünschte pharmakologische Eigenschaft angesehen.
Relativ kürzlich wurden Verbindungen auf dem Gebiet entwickelt, die RAR-Rezeptoren binden, ohne eine Reaktion oder Reaktionen auszulösen, die von Agonisten derselben Rezeptoren ausgelöst werden. Die Verbindungen oder Mittel, die die RAR-Rezeptoren binden, ohne eine "Retinoid"-Reaktion auszulösen, können daher die Aktivität von RAR-Agonisten in biologischen Assays und Systemen (in geringerem oder größerem Ausmaß) blockieren. Insbesondere beschreibt im Hinblick auf die wissenschaftliche und Patentliteratur auf diesem Gebiet die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 94/14777 bestimmte heterocyclische Carbonsäurederivate, die RAR-Retinoid-Rezeptoren binden und von denen in der Anmeldung gesagt wird, dass sie für die Behandlung bestimmter Erkrankungen oder Zustände nützlich sind, wie z. B. Akne, Psoriasis, rheumatoide Arthritis und virale Infektionen. Eine ähnliche Offenbarung wird in den Artikeln von Yoshimura et al. J. Med. Chem. 38: 3163–3173 (1995) gemacht. Kaneko et al. Med. Chem. Res. 1: 220–225 (1991); Apfel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7129–7133, August 1992, Cell Biology; Eckhardt et al. Toxicology Letters 70: 299–308 (1994); Keidel et al. Molecular and Cellular Biology 14: 287–298 (1994); und Eyrolles et al., J. Med. Chem. 37: 1508–1517 (1994) beschreiben Verbindungen, die eine Antagonist-ähnliche Aktivität auf einen oder mehrere der RAR-Retinoid-Subtypen ausüben.
Zusätzlich zu den unerwünschten Nebenwirkungen einer Therapie mit Retinoid-Verbindungen treten gelegentlich schwerwiegende medizinische Zustände auf, die durch eine Vitamin A- oder Vitamin A-Vorläufer-Überdosis ausgelöst werden, was entweder aus der exzessiven Aufnahme von Vitamin-Ersatzstoffen oder der Verdauung von Leber bestimmter Fische und Tiere resultiert, die hohe Niveaus des Vitamins enthalten. Die chronischen oder akuten Toxizitäten, die bei dem Hypervitaminose A-Syndrom beobachtet werden, beinhalten Kopfschmerzen, Hautablösung, Knochentoxizität, Dyslipidämien, usw. In den letzten Jahren wurde deutlich, dass die mit Vitamin A Analogen, d. h. Retinoiden, beobachteten Toxizitäten, im wesentlichen die des Hypervitaminose A-Syndroms rekapitulieren, was einen gemeinsamen biologischen Auslöser nahe legt, d. h. eine RAR-Aktivierung. Diese Toxizitäten werden gegenwärtig im wesentlichen durch unterstützende Maßnahmen behandelt, indem man sich von einer Aussetzung gegenüber dem auslösenden Mittel zurückhält, ob es sich hierbei um Leber, Vitaminzusatzstoffe oder Retinoide handelt. Während sich einige der Toxizitäten mit der Zeit auflösen, sind andere (z. B. vorzeitiges Schließen der Epiphysenplatte) permanent.
Allgemein gesprochen, sind spezifische Gegenmittel die beste Behandlung für eine Vergiftung durch pharmakologische Mittel, jedoch haben nur ungefähr zwei Dutzend Chemikalien oder Chemikalienklassen von Tausenden, die existieren, spezifische bekannte Gegenmittel. Ein spezifisches Gegenmittel würde für die Behandlung der Hypervitaminose A und der Retinoidtoxizität von klarem Wert sein. Da tatsächlich ständig stärkere Retinoide klinisch verwendet werden, könnte ein spezifisches Gegenmittel für eine Retinoidvergiftung lebensrettend sein.
WO 97/09297 offenbart Aryl-substituierte und Aryl- und (3-Oxo-1-propenyl)-substituierte Benzopyran-, Benzothiopyran-, 1,2-Dihydrochinolin- und 5,6-Dihydronaphthalinderivate mit negativen Retinoidhormon- und/oder Antagonist-ähnlichen biologischen Aktivitäten. Die erfinderischen RAR-Antagonisten können Säugern, einschließlich dem Menschen, verabreicht werden, und zwar zum Zweck einer Verhinderung oder Abschwächung der Wirkung von RAR-Agonisten auf die gebundenen Rezeptorstellen. Spezifisch werden RAR-Agonisten mit Retinoid-Arzneimitteln verabreicht oder co-verabreicht, um eine Toxizität zu verhindern oder abzuschwächen oder die Nebenwirkungen, die von Retinoiden oder Vitamin A oder Vitamin A-Vorläufern ausgelöst werden. Die negativen Retinoidhormone können verwendet werden, um die Aktivitäten anderer Retinoide und nukleärer Rezeptoragonisten zu verstärken. Das negative Retinoidhormon, das als AGN 193109 bezeichnet wird, verstärkt z. B. effektiv die Wirksamkeit anderer Retinoide und Steroidhormone bei in vitro-Transaktivierungsassays. Zusätzlich können Transaktivierungsassays verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die eine negative Hormonaktivität aufweisen. Diese Assays basieren auf der Fähigkeit negativer Hormone, die Aktivität chimärer Retinoidrezeptoren herabzuregulieren, die so manipuliert wurden, dass sie eine Transkriptionsaktivatordomäne besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der Formel 1
worin X S, O, NR' ist, worin R' H oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder
X ist [C(R₁)₂]_n, worin R₁ unabhängig H oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, und n ist eine ganze Zahl von 0 bis 2;
R₂ ist Wasserstoff, ein Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, F, Cl, Br, I, CF₃, Fluor-substituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH, SH, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder Alkylthio mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
R₃ ist Wasserstoff, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder F;
m ist eine ganze Zahl mit dem Wert von 0 bis 3;
o ist eine ganze Zahl mit dem Wert von 0 bis 3;
Z ist -C≡C-,
-N=N-,
-N=CR₁-,
-CR₁=N,
-(CR₁=CR₁)_n'-, worin n' eine ganze Zahl mit dem Wert 0 bis 5 ist,
-CO-NR₁-,
-CS-NR₁-,
-NR₁-CO,
-NR₁-CS,
-COO-,
-OCO-;
-CSO-;
-OCS-;
Y ist eine Phenyl- oder Naphthylgruppe oder Heteroaryl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pyridyl, Thienyl, Furyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl und Pyrrazolyl, wobei die Phenyl- und Heteroarylgruppen optional mit ein oder zwei R₂-Gruppen substituiert sind, oder
wenn Z -(CR₁=CR₁)_n'- ist und n' ist 3, 4 oder 5, dann bedeutet Y eine direkte Valenzbindung zwischen der (CR₂=CR₂)_n'-Gruppe und B;
A ist (CH₂)_q, worin q 0 bis 5 bedeutet, ein verzweigtes Niederalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Doppelbindungen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Dreifachbindungen;
B ist Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, COOR₈, CONR₉R₁₀, -CH₂OH, CH₂OR₁₁, CH₂OCOR₁₁, CHO, CH(OR₁₂)₂, CHOR₁₃O, -COR₇, CR₇(OR₁₂)₂, CR₇OR₁₃O oder ein Nieder-Trialkylsilyl, worin R₇ eine Alkyl-, Cycloalkyl oder Alkenylgruppe ist, enthaltend 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, R₈ ist eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Trimethylsilylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder R₈ ist Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₉ und R₁₀ bedeuten unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₁₁ ist Niederalkyl, Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₁₂ ist Niederalkyl und R₁₃ ist ein divalentes Alkylradikal mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, und
R₁₄ ist (R₁₅)_r-Phenyl, (R₁₅)_r-naphthyl, oder (R₁₅)_r-heteroaryl, worin die Heteroarylgruppe 1 bis 3 Heteroatome aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N, r eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 5, und
R₁₅ ist unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO₂, N(R₈)₂, N(R₈)COR₈, NR₈CON(R₈)₂, OH, OCOR₈, OR₈, CN, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Fluor-substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Dreifachbindungen oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxygruppe, worin die Alkylgruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen.
Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verbindungen der Formel 101
worin X S, O, NR' ist, worin R' H oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, oder
X ist [C(R₁)₂]_n, worin R₁ unabhängig H oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, und n ist eine ganze Zahl von 0 bis 2;
R₂ ist Wasserstoff, ein Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, F, Cl, Br, I, CF₃, Fluor-substituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH, SH, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, oder Alkylthio mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
R₃ ist Wasserstoff, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder F;
m ist eine ganze Zahl mit dem Wert von 0 bis 3;
o ist eine ganze Zahl mit dem Wert von 0 bis 3;
Y ist eine Phenyl- oder Naphthylgruppe oder Heteroaryl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pyridyl, Thienyl, Furyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl und Pyrrazolyl, wobei die Phenyl- und Heteroarylgruppen optional mit ein oder zwei R₂-Gruppen substituiert sind;
A ist (CH₂)_q, worin q 0 bis 5 bedeutet, ein verzweigtes Niederalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Doppelbindungen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Dreifachbindungen;
B ist Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, COOR₈, CONR₉R₁₀, -CH₂OH, CH₂OR₁₁, CH₂OCOR₁₁, CHO, CH(OR₁₂)₂, CHOR₁₃O, -COR₇, CR₇(OR₁₂)₂, CR₇OR₁₃O oder ein Nieder-Trialkylsilyl, worin R₇ eine Alkyl-, Cycloalkyl oder Alkenylgruppe ist, enthaltend 1 bis 5 Kohlenstoffatome, R₈ ist eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Trimethylsilylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder R₈ ist Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₉ und R₁₀ bedeuten unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₁₁ ist Niederalkyl, Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₁₂ ist Niederalkyl und R₁₃ ist ein divalentes Alkylradikal mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, und
R₁₄ ist (R₁₅)_r-phenyl, (R₁₅)_r-naphthyl, oder (R₁₅)_r-heteroaryl, worin die Heteroarylgruppe 1 bis 3 Heteroatome aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N, r eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 5, und
R₁₅ ist unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO₂, N(R₈)₂, N(R₈)COR₈, NR₈CON(R₈)₂, OH, OCOR₈, OR₈, CN, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Fluor-substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkinylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Dreifachbindungen oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxygruppe, worin die Alkylgruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen;
R₁₆ ist H, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
R₁₇ ist H, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH oder OCOR₁₁, und
p ist 0 oder 1, mit der Maßgabe, dass, wenn p 1 ist, es keine R₁₇-Substituentengruppe gibt, und m ist eine ganze Zahl zwischen 0 und 2.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind für die Verhinderung bestimmter unerwünschter Nebenwirkungen von Retinoiden geeignet, die für die Behandlung oder Verhinderung bestimmter Erkrankungen oder Zustände verabreicht werden. Zu diesem Zweck können die Verbindungen der Erfindung mit Retinoiden co-verabreicht werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch für die Behandlung einer akuten oder chronischen Toxizität geeignet, die sich aus einer Überdosierung oder Vergiftung durch retinoide Arzneimittel oder Vitamin A ergibt.
Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich die Verwendung von RAR-Antagonisten für die Blockierung aller oder einiger RAR-Rezeptorstellen in biologischen Systemen, einschließlich Säugern, um die Wirkung von RAR-Agonisten auf diese Rezeptorstellen zu verhindern oder abzuschwächen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von RAR-Antagonisten für (a) die Verhinderung und (b) die Behandlung von einer Retinoid (einschließlich Vitamin A oder Vitamin A-Vorläufer) chronischen oder akuten Toxizität und Nebenwirkungen einer Retinoid-Therapie.
Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für eine Behandlung eines pathologischen Zustands in einem Säuger bereitgestellt. Die behandelten Zustände sind mit einer Retinolsäure-Rezeptoraktivität assoziiert. Dieses Verfahren involviert die Verabreichung eines Retinoid-Antagonisten oder negativen Hormons an einen Säuger, die in der Lage sind, einen der folgenden Retinolsäurerezeptor-Subtypen zu binden: RARα, RARβ und RARγ. Der Antagonist oder das negative Hormon werden in einer pharmazeutisch effektiven Menge für die Bereitstellung eines therapeutischen Nutzens gegen einen pathologischen Zustand bei einem Säuger verabreicht.
Als Gegenmittel gegen eine akute oder chronische Retinoid- oder Vitamin A-Vergiftung kann der RAR-Antagonist einem Säuger enteral verabreicht werden, d. h. durch intragastrische Intubation oder Nahrungsmittel/Wasserzumischung oder parenteral, z. B. intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, topisch usw. Die einzige Anforderung an den Verabreichungsweg ist diejenige, dass er die Zufuhr des Antagonisten zum Zielgewebe sicherstellen muss. Der RAR-Antagonist kann selbst oder in Kombination mit Exzipienzien formuliert werden. Der RAR-Antagonist muss in der Formulierung nicht in Lösung vorliegen, z. B. im Fall einer enteralen Verwendung.
Als Zusatz für eine Therapie mit Retinoiden und um eine oder mehrere Nebenwirkungen des Retinoid-Arzneimittels, das verabreicht wird, zu verhindern, kann der RAR-Antagonist ebenfalls enteral oder parenteral verabreicht werden. Der RAR-Antagonist und RAR-Agonist muss nicht auf dem selben Verabreichungsweg verabreicht werden. Das Ziel ist das, dass ausreichende Mengen des RAR-Antagonisten kontinuierlich in dem betroffenen Gewebe während der Aussetzung gegenüber RAR-Agonisten vorliegen. Für die Verhinderung einer Retinoid-Toxizität ist es das Beste, dass der RAR-Antagonist gleichzeitig oder vor der Behandlung mit dem RAR-Agonisten verabreicht wird. In vielen Situationen wird der RAR-Antagonist auf einem anderen Weg als der Agonist verabreicht werden. Zum Beispiel können unerwünschte Hautwirkungen eines enteral verabreichten Retinoids durch einen RAR-Antagonisten, der topisch verabreicht wird, verhindert oder verbessert werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Identifikationsverfahren von negativen Retinoidhormonen. Das Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte: Erhalt transfizierter Zellen, enthaltend ein Reportergen, das gegenüber einer Bindung eines rekombinanten Retinoidrezeptors transkriptional reaktiv ist, wobei der rekombinante Retinoidrezeptor mindestens Proteindomänen aufweist, die C-terminal zu der DNA-Bindungsdomäne eines intakten Retinoidrezeptors lokalisiert sind, Messung eines Grundniveaus einer Reportergenexpression in nicht behandelten transfizierten Zellen, wobei die nicht behandelten transfizierten Zellen in Abwesenheit eines zugefügten Retinoids propagiert werden, Behandlung der transfizierten Zellen mit einer Retinoidverbindung, die im Hinblick auf ihre negative Hormonaktivität überprüft werden soll, Messung eines Niveaus einer Reportergenexpression in behandelten Zellen, Vergleichen der Niveaus der Reportergenexpression, gemessen in behandelten Zellen und nicht behandelten Zellen zur Identifikation derjenigen Retinoidverbindungen als negative Retinoidhormone, die ein niedrigeres Niveau der Reportergenexpression in behandelten Zellen produzierten im Vergleich mit dem Basalniveau der Reportergenexpression, gemessen in nicht behandelten Zellen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieses Verfahrens ist der intakte Rezeptor ein RAR-α-, RAR-β- oder RAR-γ-Subtyp. In anderen Ausführungsformen ist der intakte Rezeptor ein RXR-α-, RXR-β- oder RXR-γ-Subtyp. Der rekombinante Rezeptor kann auch entweder ein rekombinanter RAR- oder RXR-Rezeptor sein. In einigen Ausführungsformen ist der rekombinante Rezeptor ein chimärer Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne. Eine solche konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne kann eine Vielzahl von Aminosäuren mit einer negativen Nettoladung umfassen oder eine Aminosequenz einer viralen Transkriptionsaktivatordomäne aufweisen, wie z. B. der Transkriptionsaktivatordomäne des Herpes-Simplexvirus VP-16. Bei Ausführungsformen, bei denen die konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne eine negative Nettoladung aufweist, kann der Retinoidrezeptor rekombinant sein, und davon deletiert die DNA-Bindungsdomäne aufweisen, wie z. B. eine DNA-Bindungsdomäne, die für ein cis-regulatorisches Element spezifisch ist, bei dem es sich nicht um das Retinolsäure-reaktive Element handelt. Diese Element beinhalten ein Östrogen-reaktives Element. Die transfizierte Zelle wird vorzugsweise in einem Wachstumsmedium propagiert, das im wesentlichen keine endogenen Retinoide enthält, wie z. B. eines, das aktiviertes Holzkohle-extrahiertes Serum enthält. Bei diesem Verfahren kann das Reportergen das Luciferasegen sein, in welchem Fall diese Schritte eine Luminometrie beinhalten können. Das Reportergen kann auch das β-Galactosidasegen sein, in welchem Fall die Messschritte einen β-Galactosidase-Assay beinhalten würden. Die transfizierte Zelle kann eine transfizierte Säugerzelle sein, wie z. B. eine Zelle der grünen Meerkatze oder eine menschliche Zelle.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für eine Verstärkung der pharmakologischen Aktivität eines Rezeptoragonisten der Steroidsuperfamilie, der einem Säuger verabreicht wird. Dieses Verfahren involviert die gleichzeitige Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch effektive Dosis eines negativen Retinoidhormons an einen Säuger zusammen mit dem Rezeptoragonisten der Steroidsuperfamilie, um die pharmakologische Aktivität des Rezeptoragonisten der Steroidsuperfamilie zu verstärken. Die pharmakologische Aktivität ist in vitro in einem Reportergentransaktivierungs-Assay messbar, wie z. B. durch Messung der anti-AP-1-Aktivität. Die zu verstärkende pharmakologische Aktivität kann eine antiproliferative Aktivität sein, wie z. B. eine Aktivität von der im Retinalpigmentepithel messbaren Sorte. Der Rezeptoragonist der Steroidsuperfamilie kann jeder der folgenden sein: ein Retinoidrezeptoragonist, ein Vitamin D-Rezeptoragonist, eine Glucokortikoidrezeptoragonist, ein Thyroidhormonrezeptoragonist, ein Peroxisomen-Proliferatoraktivierter Rezeptoragonist oder ein Östrogenrezeptoragonist. Der Retinoidrezeptoragonist kann ein RAR-Agonist sein, wie z. B. eine all-trans-Retinolsäure oder 13-cis-Retinolsäure. Der Retinoidrezeptoragonist kann auch ein RXR-Agonist sein. Ein bevorzugter Vitamin D-Rezeptoragonist ist 1,25-Dihydroxyvitamin D₃. Ein bevorzugter Glucokortikoidrezeptoragonist ist Dexamethason. Ein bevorzugter Thyroidhormonrezeptoragonist ist 3,3',5-Triiodthyronin. Das negative Retinoidhormon ist ein RAR-spezifisches negatives Retinoidhormon, das vorzugsweise eine Dissoziierungskonstante von weniger oder ungefähr entsprechend 30 nM aufweist. Beispiele für das RAR-spezifische negative Retinoidhormon beinhalten AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 und AGN 193871. Die Zusammenfassung, umfassend eine pharmazeutische wirksame Menge eines negativen Retinoidhormons kann zum selben Zeitpunkt wie der Agonist der Steroidsuperfamilie gleichzeitig verabreicht werden und kann vor der gleichzeitigen Verabreichung kombiniert werden. Diese können auch als getrennte Zusammensetzungen co-verabreicht werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die chemische Struktur von AGN 193109.
2A bis 2F sind eine Reihe von Liniengrafiken, die zeigen, dass AGN 193109 eine ATRA-abhängige Transaktivierung an den RARs inhibiert. Die 2A und 2B repräsentieren die Aktivität am RAR-α-Rezeptor; 2C und 2D repräsentieren die Aktivität am RAR-β-Rezeptor; 2E und 2F repräsentieren die Aktivität am RAR-γ-Rezeptor. In den 2A, 2C und 2E repräsentieren offene Quadrate die Retinolsäurebehandlung, und gefüllte Kreise repräsentieren eine AGN 193109-Behandlung. In den 2B, 2D und 2F repräsentieren einfache Linien eine Luciferaseaktivität, gemessen nach Behandlung mit 10^–8 M ATRA und variablen Konzentrationen von AGN 193109.
3A und 3B sind Liniengrafiken, die die Luciferaseaktivität, nachgewiesen in CV-1-Zellen repräsentieren, die mit dem Reporterplasmid ERE-tk-Luc und dem Expressionsplasmid ER-RAR-α transfiziert und mit ATRA (3A) oder AGN 193109 (3B) in unterschiedlichen Konzentrationen stimuliert wurden. Datenpunkte repräsentieren das Mittel ± SEM von drei unabhängigen Luciferasebestimmungen. Die Ergebnisse der unter Verwendung verschiedener Mengen co-transfiziertem ER-RAR-α (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Vertiefung) durchgeführten Transfektionen sind in jeder Figur angegeben.
Die 4A und 4B sind Liniengrafiken, die die Luciferaseaktivität in CV-1-Zellen darstellen, die mit dem Reporterplasmid ERE-tk-Luc und dem Expressionsplasmid ER-RAR-β transfiziert und ATRA (4A) oder AGN 193109 (4B) in unterschiedlichen Konzentrationen stimuliert wurden. Datenpunkte repräsentieren das Mittel ± SEM von drei unabhängigen Luciferasebestimmungen. Die Ergebnisse der unter Verwendung verschiedener Mengen co-transfiziertem ER-RAR-β (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Vertiefung) durchgeführten Transfektionen sind in jeder Figur angegeben.
Die 5A und 5B sind Liniengrafiken, die die Luciferaseaktivität repräsentieren, nachgewiesen in CV-1-Zellen, die mit dem Reporterplasmid ERE-tk-Luc und dem Expressionsplasmid ER-RAR-γ transfiziert sind und mit ATRA (5A) oder AGN 193109 (5B) in unterschiedlichen Konzentrationen stimuliert wurden. Datenpunkte repräsentieren das Mittel ± SEM von drei unterschiedlichen Luciferasebestimmungen. Die Ergebnisse der unter Verwendung verschiedener Mengen co-transfiziertem ER-RAR-γ (0,05, 0,1 und 0,2 μg/Vertiefung) durchgeführten Transfektionen sind in jeder Figur angegeben.
6 zeigt ATRA und AGN 193109-Dosisreaktionen von CV-1-Zellen, co-transfiziert mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und entweder mit dem ER-RXR-α-chimären Rezeptorexpressionsplasmid allein oder in Kombination mit dem RAR-γ-VP-16-Expressionsplasmid. ER-RXR-α co-transfizierte Zellen wurden mit ATRA (Quadrat) und AGN 193109 (Diamant) behandelt. Zellen, co-transfiziert mit der Kombination von ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 wurden mit ATRA (Kreis) oder AGN 193109 (Dreieck) behandelt.
7 zeigt eine Liniengrafik, die Luciferaseaktitätsmessungen darstellt, aufgezeichnet in Lysaten von CV-1-Zellen, transfiziert mit dem ERE-tk-Luc-Reporter und ER-RAR-γ-Expressionskonstrukt, dann behandelt mit ATRA mit 10^–8 M und den Testverbindungen in den auf der horizontalen Achse angegebenen Konzentrationen. Die Testverbindungen waren AGN 193109 (Quadrat), AGN 193357 (offener Diamant), AGN 193385 (Kreis), AGN 193389 (Dreieck), AGN 193840 (ausgefülltes Quadrat) und AGN 192870 (ausgefüllter Diamant).
8 zeigt eine Liniengrafik, die Luciferaseaktitätsmessungen darstellt, aufgezeichnet in Lysaten von CV-1-Zellen, transfiziert mit dem ERE-tk-Luc-Reporter und RAR-γ-VP-16 und ER-RXR-α-Expressionskonstrukten, dann behandelt mit den Testverbindungen in den auf der horizontalen Achse angegebenen Konzentrationen. Die Testverbindungen waren ATRA (offenes Quadrat) AGN 193109 (offener Kreis), AGN 193174 (offenes Dreieck), AGN 193199 (ausgefülltes Quadrat), AGN 193385 (ausgefüllter Kreis), AGN 193389 (umgekehrtes Dreieck), AGN 193840 (diagonal ausgefülltes Quadrat) und AGN 193871 (halb-ausgefüllter Diamant).
Die 9A, 9B und 9C zeigen in einem schematischen Diagramm einen Mechanismus, wodurch AGN 193109 die Wechselwirkung zwischen RAR (schattierte Box) und negativen Co-Aktiviatorproteinen (–) modulieren kann, illustriert im Kontext eines Transaktivierungs-Assays. 9A zeigt, dass negative Co-Aktivatorproteine und positive Co-Aktivatorproteine (+) in einem Bindungsgleichgewicht mit dem RAR stehen. In Abwesenheit eines Liganden ergibt sich eine basale Transkription des Reportergens. Wie in 9B illustriert, unterstützt die Zugabe eines RAR-Agonisten die Assoziation positiver Co-Aktivatorproteine mit dem RAR und führt zu einer nach oben regulierten Reportergentranskription. Wie in 9C dargestellt, unterstützt die Zugabe von AGN 193109 die Assoziation negativer Co-Aktivatorproteine mit RAR und verhindert eine Reportergentranskription.
10 ist eine Säulengrafik, die die Inhibierung der TPA-induzierten Str-AP1-CAT-Expression als Funktion der AGN 191183-Konzentration (10^–10 bis 10^–12 M) darstellt, wobei die AGN 193109-Konzentration bei 10^–8 M konstant gehalten wird. Ergebnisse von Versuchen, die mit AGN 191183 allein durchgeführt wurden, sind als ausgefüllte Säulen dargestellt, während gestreifte Säulen die Ergebnisse von einer Behandlung mit der Kombination aus AGN 193109 und AGN 191183 darstellen.
11 zeigt schematisch einen Mechanismus, wodurch AGN 193109 die Aktivitäten der RARs und anderer nukleärer Rezeptorfamilienmitglieder verstärken kann. Wie in dem Diagramm illustriert, haben eingeführte RARs (offene Reckecke mit AB-C-DEF-Domänen) eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber RAR-Liganden in dem anti-AP1-Assay, da negatives Co-Aktivatorprotein (ncp), das in begrenzender Menge vorhanden ist, auf RARs gefangen wird, was zu zwei Populationen führt: RAR + ncp und RAR – ncp. RAR – ncp hat eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Liganden. Non-RAR-nukleare Faktoren (schattierte Reckecke mit AB-C-DEF-Domänen) haben eine erhöhte Empfindlichkeit gegen verwandten Liganden, da ncp an das RAR durch Aktivität von AGN 193109 gefangen wurde. Die modulären Domänen der nukleären Rezeptoren werden unter Verwendung einer Standardnomenklatur als "AB" (Liganden-unabhängige Transaktivierungsdomäne), "C" (DNA-Bindungsdomäne) und "DEF" (Liganden-regulierte Transaktivierungsdomäne und Dimerisierungsdomäne) bezeichnet.
12 ist eine Liniengrafik, die die Wirkung von AGN 193109 auf die 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Dosisreaktion bei CV-1-Zellen zeigt, die mit dem MTV-DR3-Luc-Reporterplasmid transfiziert sind. Transfektanten wurden mit 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (gefülltes Quadrat), 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ und 10^–8 AGN 193109 (gefülltes Dreieck) und 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ und 10^–7 M AGN 193109 (gefüllter Kreis) behandelt.
13 ist eine Säulengrafik, die die Wirkung von AGN 193109 (10 nM) Co-Verabreichung auf die 1,25-Dihydroxyvitamin-D₃-vermittelte Inhibition von TPA induzierter Str-AP1-CAT-Aktivität darstellt. Gefüllte Säulen repräsentieren die Inhibition der CAT-Aktivität in transfizierten Zellen, die alleine mit 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ behandelt wurden. Offene Säulen repräsentieren die Inhibition der CAT-Aktivität in transfizierten Zellen, behandelt mit der Kombination aus 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ und AGN 193109.
14 ist eine Liniengrafik, die die Wirkung von AGN 193109 allein und in Kombination mit AGN 191183 auf HeLa-Zellen darstellt, co-transfiziert mit RAR-γ und dem RAR-reaktiven MTV-TREp-Luc-Reporter-Konstrukt. Die Arzneimittelbehandlungen, die in der Grafik illustriert werden, sind: AGN 193109 allein (Quadrat), AGN 193109 in Kombination mit AGN 191183 bei 10^–10 M (Diamant) und AGN 193109 in Kombination mit AGN 191183 bei 10^–9 M.
15 ist eine Liniengrafik, die zeigt, dass ECE16-1-Zellen in Reaktion auf EGF (gefülltes Quadrat) proliferierten, jedoch nicht in Reaktion auf definiertes Medium allein (offener Kreis). Zellen, die mit AGN 193109 allein behandelt wurden, werden durch das gefüllte Dreieck dargestellt. Die gefüllten Kreise repräsentieren Ergebnisse, die von Zellen erhalten wurden, die mit 10 nM AGN 191183 und 0 bis 1000 nM AGN 193109 behandelt wurden.
16 ist eine Säulengrafik, die die Wirkung von AGN 193109 auf die Proliferation von CaSki-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit des AGN 191183 Retinoidagonisten darstellt. Alle Probengruppen erhielten 20 ng/ml des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) mit Ausnahme der in definiertem Medium (DM) allein propagierten Probe (offene Säule). Gestreifte Säulen repräsentieren Proben, die in Abwesenheit von AGN 193109 propagiert wurden. Gefüllte Säulen repräsentieren Proben, propagiert in Gegenwart von 1000 nM AGN 193109. Die Konzentrationen von AGN 191183, die in dem Verfahren verwendet wurden, sind in der horizontalen Achse dargestellt.
17 ist eine Dosisreaktionskurve, die zeigt, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von ATRA auf retinale Pigmentepithel-(RPE)-Zellen verstärkt. Proben, die mit ATRA allein behandelt wurden, sind durch gefüllte Quadrate repräsentiert. Proben, die mit der Kombination aus ATRA und AGN 193109 (10^–7 M) behandelt wurden, werden durch gefüllte Kreise dargestellt. Die für die Behandlung der verschiedenen Proben verwendete ATRA-Konzentration ist auf der horizontalen Achse angegeben.
18 ist eine Dosisreaktionskurve, die zeigt, dass sowohl 13-cis-RA als auch ATRA das RPE-Zellwachstum inhibierte und dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von 13-cis-RA verstärkte. Die verschiedenen Probenbehandlungen, die in der Dosisreaktion dargestellt sind, beinhalteten 13-cis-RA allein (gefülltes Quadrat), 13-cis-RA in Kombination mit AGN 193109 (10^–6 M) (gefüllter Kreis), 13-cis-RA in Kombination mit AGN 193109 (10^–8 M) (gefülltes Dreieck) und ATRA (gefüllter Diamant). Die Konzentration von 13-cis-RA und ATRA, die in den Probenbehandlungen verwendet wurden, sind auf der horizontalen Achse dargestellt.
19 ist eine Dosisreaktionskurve, die zeigt, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von Dexamethason in primären RPE-Zellkulturen verstärkte. Die verschiedenen Probenbehandlungen, die in der Dosisreaktion dargestellt sind, beinhalteten ATRA (gefülltes Quadrat), Dexamethason allein (gefüllter Kreis), Dexamethason in Kombination mit AGN 193109 (10^–8 M) (gefülltes Dreieck) und Dexamethason in Kombination mit AGN 193109 (10^–6 M) (gefüllter Diamant). Die Konzentrationen von Dexamethason und ATRA, die in den Probenbehandlungen verwendet wurden, sind auf der horizontalen Achse dargestellt.
20 ist eine Dosisreaktionskurve, die zeigt, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von Thyroidhormon (T3) bei primären RPE-Zellkulturen verstärkte. Die verschiedenen Probenbehandlungen, die in der Dosisreaktion dargestellt sind, beinhalteten ATRA (gefülltes Quadrat), T3 allein (gefüllter Kreis), T3 in Kombination mit AGN 193109 (10^–8 M) (gefülltes Dreieck), T3 in Kombination mit AGN 193109 (10^–6 M) (gefüllter Diamant). Die Konzentrationen von T3 und ATRA, die in den Probenbehandlungen verwendet wurden, sind auf der horizontalen Achse dargestellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein RAR-Antagonist als eine Chemikalie definiert, die an eine oder mehrere RAR-Subtypen bindet, mit einer K_d von weniger als 1 Mikromolar (K_d < 1 μM), die jedoch keine signifikante transkriptionelle Aktivierung der RAR-Subtypen-regulierten Gene in einem Rezeptor-Co-Transfektions-Assay aufweist. Konventionell sind Antagonisten chemische Mittel, die die Aktivitäten von Agonisten inhibieren. So wird die Aktivität eines Rezeptorantagonisten konventionell durch seine Fähigkeit zur Inhibition der Aktivität eines Agonisten gemessen.
Ein RAR-Agonist ist als eine Chemikalie definiert, die an ein oder mehrere RAR-Rezeptor-Subtypen mit einer K_d von weniger als 1 Mikromol (K_d < 1 μM) bindet, und eine transkriptionelle Aktivierung der RAR-Subtyp-regulierten Gene in einem Rezeptor-Co-Transfektions-Assay auslöst. Die Bezeichnung "RAR-Agonist" beinhaltet Chemikalien, die andere Rezeptoren zusätzlich zu den RARs; z. B. RXR-Rezeptoren, binden und/oder aktivieren können.
Wie hier verwendet, ist ein negatives Hormon oder inverser Agonist ein Ligand für einen Rezeptor, der dazu führt, dass der Rezeptor einen inaktiven Zustand relativ zu einem Grundzustand annimmt, der in Abwesenheit von irgendeinem Liganden auftritt. Während ein Antagonist also die Aktivität eines Agonisten inhibieren kann, ist ein negatives Hormon ein Ligand, das die Konfirmation des Rezeptors in Abwesenheit eines Agonisten verändert. Das Konzept eines negativen Hormons oder inversen Agonisten wurde von Bond et al. in Nature 374: 272 (1995) untersucht. Insbesondere haben Bond et al. vorgeschlagen, dass nicht ligierte β₂-Adrenozeptoren in einem Gleichgewicht existieren, nämlich zwischen einer inaktiven Konformation und einer spontan aktiven Konformation. Es wird vorgeschlagen, dass Agonisten den Rezeptor in einer aktiven Konformation stabilisieren. Demgegenüber nimmt man von inversen Agonisten an, dass sie eine inaktive Rezeptorkonformation stabilisieren. Während ein Antagonist seine Aktivität also durch die Inhibition eines Agonisten manifestiert, kann ein negatives Hormon zusätzlich seine Aktivität in Abwesenheit eines Agonisten durch Inhibition einer spontanen Umwandlung eines nicht an einen Liganden gebundenen Rezeptor in eine aktiven Konformation manifestieren. Nur eine Untergruppe von Antagonisten wird als negative Hormone wirken. Wie hier offenbart ist, ist AGN 193109 sowohl ein Antagonist als auch ein negatives Hormon.
Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurde von keinen anderen Retinoiden gezeigt, dass sie eine negative Hormonaktivität aufweisen.
Wie hier verwendet, bezeichnet Co-Verabreichung von zwei pharmakologisch aktiven Verbindungen die Zufuhr von zwei getrennten chemischen Einheiten, entweder in vitro oder in vivo. Eine Co-Administration bezieht sich auf die simultane Zufuhr von getrennten Mitteln; auf die simultane Zufuhr einer Mischung von Mitteln, wie auch auf die Zufuhr von einem Mittel, gefolgt von einer Zufuhr des zweiten Mittels. In allen Fällen sollen die Mittel, die co-verabreicht werden, zusammen wirken.
Die Bezeichnung Alkyl bezieht sich auf alle Gruppen, die als normale Alkyl-, verzweigte Alkyl- und Cycloalkylgruppen bekannt sind und umfasst diese. Die Bezeichnung Alkenyl bezieht sich auf alle normalen Alkenyl-, verzweigten Alkenyl- und Cycloalkenylgruppen mit ein oder mehr ungesättigten Stellen und umfasst diese. Ähnlich betrifft die Bezeichnung Alkinyl alle normalen Alkinyl- und verzweigten Alkinylgruppen mit ein oder mehr Dreifachbindungen und umfasst diese.
Niederalkyl bedeutet die oben definierte breite Definition von Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen im Fall eines normalen Niederalkyls, und je nach Anwendung 3 bis 6 Kohlenstoffatome für Niederalkylgruppen, die verzweigt sind, und Cycloalkylgruppen. Niederalkenyl ist ähnlich definiert als 2 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisend für normale Niederalkenylgruppen und 3 bis 6 Kohlenstoffatome für verzweigte und Cycloniederalkenylgruppen. Niederalkinyl ist ebenfalls ähnlich definiert mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen für normale Niederalkinylgruppen und 4 bis 6 Kohlenstoffatome für verzweigte Niederalkinylgruppen.
Die Bezeichnung "Ester", wie hier verwendet, bezeichnet jede Verbindung, die in die Definition dieses Worts fällt, wie es klassischerweise in der organischen Chemie verwendet wird und umfasst diese. Sie beinhaltet organische und anorganische Ester. Wenn B (von Formel 1 oder Formel 101) -COOH ist, umfasst diese Bezeichnung die von der Behandlung dieser Funktion mit Alkohol oder Thiolen abgeleiteten Produkte, vorzugsweise mit aliphatischen Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Wenn der Ester von Verbindungen abgeleitet ist, in denen B -CH₂OH ist, umfasst diese Bezeichnung Verbindungen, abgeleitet von organischen Säuren, die Ester bilden können, einschließlich auf Phosphor und Schwefel basierende Säuren oder Verbindungen der Formel -CH₂OCOR₁₁, worin R₁₁ jede substituierte oder nicht-substituierte aliphatische, aromatische, heteroaromatische oder aliphatische aromatische Gruppe ist, vorzugsweise mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in den aliphatischen Bereichen.
Wenn in dieser Anmeldung nicht anders festgehalten, sind bevorzugte Ester solche, die sich von gesättigten aliphatischen Alkoholen oder Säuren mit 10 oder weniger Kohlenstoffatomen ableiten oder den cyclischen oder gesättigten aliphatischen cyclischen Alkoholen und Säuren mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugte aliphatische Ester sind diejenigen, die sich von niedrigen Alkylsäuren oder Alkoholen ableiten. Ebenfalls bevorzugt werden Phenyl- oder Niederalkylphenylester.
Amide haben die Bedeutung, die dieser Bezeichnung in der organischen Chemie klassicherweise zugeordnet wird. In diesem Fall umfasst sie die unsubstituierten Amide und alle aliphatischen und aromatischen mono- und disubstituierten Amide. Wenn in dieser Anmeldung nicht anders ausgeführt, sind bevorzugte Amide die mono- und disubstituierten Amide, abgeleitet von den gesättigten aliphatischen Resten von 10 oder weniger Kohlenstoffatomen oder den cyclischen oder gesättigten aliphatisch cyclischen Resten mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugte Amide sind diejenigen, die von substituierten oder unsubstituierten Niederalkylaminen abgeleitet sind. Ebenfalls bevorzugt sind mono- und disubstituierte Amide, abgeleitet von den substituierten und unsubstituierten Phenyl- oder Niederalkylphenylaminen. Unsubstituierte Amide werden ebenfalls bevorzugt.
Acetale und Ketale beinhalten die Radikale der Formel -CK, worin K (-OR)₂ ist. Hier ist R ein Niederalkyl. Ebenfalls kann K -OR₇O- sein, worin R₇ ein Niederalkyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist, linear oder verzweigt.
Ein pharmazeutisch akzeptables Salz kann für alle Verbindungen dieser Verbindung hergestellt werden mit einer Funktionalität, die in der Lage ist, ein Salz zu bilden, z. B. einer Säurefunktionalität. Ein pharmazeutisch akzeptables Salz ist jedes Salz, das die Aktivität der Ausgangsverbindung beibehält und keine unerwünschten oder nachteiligen Wirkungen auf das Subjekt ausübt, dem es vermittelt wird und in dem Kontext, in dem es verabreicht wird.
Pharmazeutisch akzeptable Salze können von anorganischen oder organischen Basen abgeleitet werden. Das Salz kann ein mono- oder polyvalentes Ion sein. Von besonderem Interesse sind die anorganischen Ionen, Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium. Organische Salze können mit Aminen hergestellt werden, insbesondere Ammoniumsalze, wie z. B. Mono-, Di- und Trialkylamine, oder Ethanolamine. Salze können auch aus Koffein, Tromethamin und ähnlichen Molekülen gebildet werden. Wenn ein Stickstoff vorliegt, der ausreichend basisch ist, um Säureadditionssalze zu bilden, können solche mit allen anorganischen oder organischen Säuren oder einem Alkylierungsmittel, wie z. B. Methyliodid gebildet werden. Bevorzugte Salze sind die mit anorganischen Säuren gebildeten, wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Alle einfachen organischen Säuren, wie z. B. Mono-, Di- oder Trisäuren, können ebenfalls verwendet werden.
Einige der Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung können trans- und cis-(E und Z)-Isomere aufweisen. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Verbindungen ein oder mehr chirale Zentren enthalten und können daher in enantiomeren und diastereomeren Formen vorliegen. Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll alle solche Isomere per se umfassen, wie auch Mischungen aus cis- und trans-Isomeren, Mischungen von Diastereomeren und racemische Mischungen von Enantiomeren (optischen Isomeren). In der vorliegenden Anmeldung soll eine Mischung solcher Isomere oder eines der Isomere umfasst sein, wenn nicht spezifisch erwähnt ist, welche Konfiguration (cis, trans oder R oder S) einer Verbindung (oder eines asymmetrischen Kohlenstoffs) vorliegt.
Aryl-substituiertes Benzopyran, Benzothiopyran, 1,2-Dihydrochinolin und 5,6-Dihydronaphthalinderivate mit einer Retinoidantagonist-ähnlichen biologischen Aktivität
Im Hinblick auf das Symbol Y in Formel 1 sind die bevorzugten Verbindungen der Erfindung diejenigen, in denen Y Phenyl, Pyridyl, Thienyl oder Furyl ist. Noch bevorzugter sind Verbindungen, worin Y Phenyl oder Pyridyl ist, und noch bevorzugter diejenigen, in denen Y Phenyl ist. Soweit Substitutionen an den Y (Phenyl)- und Y (Pyridyl)-Gruppen betroffen sind, werden Verbindungen bevorzugt, bei denen die Phenylgruppe durch die Z- und A-B-Gruppen 1,4 (para) substituiert ist, und bei denen der Pyridinring durch die Z- und A-B-Gruppen 2,5-substituiert ist. (Die Substitution in den 2,5-Positionen in der "Pyridin"-Nomenklatur korrespondiert zur Substitution in der 6-Position in der "Nicotinsäure"-Nomenklatur.) Bei den bevorzugten Verbindungen der Erfindung gibt es entweder keinen optionalen R₂-Substituenten in der Y-Gruppe oder der optionale R₂-Substituent ist Fluor (F).
Die A-B-Gruppe der bevorzugten Verbindungen ist (CH₂)_n-COOH oder (CH₂)_n-COOR₈, worin n und R₈ wie oben definiert sind.
Noch bevorzugter ist n 0 und R₈ ist Niederalkyl oder n ist 0 und B ist COOH oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Bei vielen der zur Zeit bevorzugten Beispiele von Verbindungen der Erfindung ist X [C(R₁)₂]_n, worin n 1 ist. Verbindungen, worin n 0 ist (Indenderviate) und bei denen X S oder O ist (Benzothiopyran- und Benzopyranderivate) werden ebenfalls bevorzugt. Wenn X [C(R₁)₂]_n ist, und n 1 ist, dann ist R₁ vorzugsweise ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter Methyl.
Die an den aromatischen Teil des Tetrahydronaphthalin-, Benzopyran-, Benzothiopyran- oder Dihydrochinolinbestandteils der Verbindungen der Formel 1 angehaftete R₂-Gruppe ist vorzugsweise H, F, CF₃ oder Alkoxy, wie z. B. OCH₃. R₃ ist vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, noch bevorzugter Wasserstoff.
Die an die Y-Gruppe angehaftete R₂-Gruppe, wenn es einen solchen R₂-Substituenten gibt, ist vorzugsweise F oder CF₃.
Unter Bezugnahme auf die Gruppe Z in den Verbindungen der Erfindung und wie dargestellt in Formel 1, repräsentiert in einer Vielzahl von bevorzugten Beispielen Z eine acetylenische Bindung (Z = -C≡C-). Die "Linker-Gruppe" Z ist jedoch auch bevorzugt eine Diazogruppe (Z = -N=N-), eine olefinische oder polyolefinische Gruppe (Z = -(CR₁=CR₁)_n'-), eine Ester-(Z = -COO-), eine Amid-(Z = -CO-NR₂-) oder Thioamid-(Z = -CS-NR₂-)-Bindung.
Unter Bezugnahme auf die R₁₄-Gruppe werden Verbindungen bevorzugt, in denen R₁₄ Phenyl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 2-Thienyl und 2-Thiazolyl ist. Die R₁₅-Gruppe (Substituent der R₁₄-Gruppe) ist vorzugsweise H, Niederalkyl, Trifluormethyl, Chlor, Niederalkoxy oder Hydroxyl.
Die zur Zeit besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel I sind in Tabelle 1 unter Bezugnahme auf Formel 2, Formel 3, Formel 4, Formel 5 und Formel 5a dargestellt.
Noch bevorzugtere Verbindungen der Erfindung stimmen mit Formel 5b überein, die weiter in Tabelle 1a definiert sind und in dem folgenden experimentellen Bereich.
Tabelle 1a
Aryl- und (3-Oxo-1-propenyl)-substituiertes Benzopyran, Benzothiopyran, Dihydrochinolin und 5,6-Dihydronaphthalinderivate mit einer Retinoidantagonist-ähnlichen biologischen Aktivität
Unter Bezugnahme auf das Symbol Y in Formel 101 sind die bevorzugten Verbindungen der Erfindung diejenigen, in denen Y Phenyl, Pyridyl, Thienyl oder Furyl ist. Noch bevorzugter werden Verbindungen, bei denen Y Phenyl oder Pyridyl ist und besonders bevorzugt sind diejenigen, bei denen Y Phenyl ist. Soweit Substitutionen an Y (Phenyl)- und Y (Pyridyl)-Gruppen betroffen sind, werden Verbindungen bevorzugt, bei denen die Phenylgruppe 1,4 (para)-substituiert ist durch -CR₁₆-=CR₁₇- und A-B-Gruppen, und bei denen der Pyridinring durch die -CR₁₆=CR₁₇- und A-B-Gruppen 2,5-substituiert ist. (Substitutionen in 2,5-Positionen in der "Pyridin"-Nomenklatur korrespondieren zu einer Substitution in 6-Position in der "Nicotinsäure"-Nomenklatur.) Bei den bevorzugten Verbindungen der Erfindung gibt es keinen optionalen R₂-Substituenten an der Y-Gruppe.
Die A-B-Gruppe der bevorzugten Verbindungen ist (CH₂)_n-COOH oder (CH₂)_n-COOR₈, worin n und R₈ wie oben definiert sind. Noch bevorzugter ist n 0 und R₈ ist Niederalkyl oder n ist 0 und B ist COOH oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Bei den zur Zeit bevorzugten Beispielen der Verbindungen der Erfindung ist X [C(R₁)₂]_n, worin n 1 ist. Nichtsdestotrotz sind auch Verbindungen bevorzugt, bei denen X S oder O ist (Benzothiopyran- und Benzopyranderivate). Wenn X [C(R₁)₂]_n ist und n 1 ist, dann ist R₁ vorzugsweise ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, noch bevorzugter Methyl.
Die an den aromatischen Teil des Tetrahydronaphthalin-, Benzopyran-, Benzothiopyran- oder Dihydrochinolinbestandteils der Verbindungen der Formel 101 angehaftete R₂-Gruppe ist vorzugsweise H, F oder CF₃. R₃ ist vorzugsweise Wasserstoff oder Methyl, noch bevorzugter Wasserstoff.
Unter Bezugnahme auf die R₁₄-Gruppe werden Verbindungen bevorzugt, in denen R₁₄ Phenyl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 2-Thienyl und 2-Thiazolyl ist. Die R₁₅-Gruppe (Substituent der R₁₄-Gruppe) ist vorzugsweise H, Niederalkyl, Trifluormethyl, Chlor, Niederalkoxy oder Hydroxy.
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung gemäß Formel 101 sind in Tabelle 2 unter Bezugnahme auf Formel 102 dargestellt.
Tabelle 2
Biologische Aktivität, Verabreichungsarten
Wie oben festgehalten, sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Antagonisten von ein oder mehreren RAR-Rezeptor-Subtypen. Dies bedeutet, dass die erfinderischen Verbindungen an einen oder mehrere RAR-Rezeptor-Subtypen binden, jedoch nicht die Reaktion auslösen, die von Agonisten derselben Rezeptoren ausgelöst wird. Einige Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Antagonisten aller drei RAR-Rezeptor-Subtypen (RAR-α, RAR-β und RAR-γ), und diese werden als "RAR pan Antagonisten" bezeichnet. Einige andere sind Antagonisten von nur ein oder zwei RAR-Rezeptor-Subtypen. Einige Verbindungen in dem Umfang der vorliegenden Erfindung sind teilweise Agonisten von ein oder zwei RAR-Rezeptor-Subtypen und Antagonisten der verbleibenden Subtypen. Die erfinderischen Verbindungen binden nicht an RXR-Rezeptoren, daher sind sie weder Agonisten noch Antagonisten von RXR.
Abhängig von der Stelle und Natur der unerwünschten Nebenwirkungen, die unterdrückt oder verbessert werden sollen, können die in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendeten Verbindungen Antagonisten von nur ein oder zwei der RAR-Rezeptor-Subtypen sein. Einige in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendete Verbindungen können Teilagonisten von ein oder zwei RAR-Rezeptor-Subtypen und Antagonisten der verbleibenden Subtypen sein. Einige Verbindungen sind allgemein gesprochen in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendbar, wenn die antagonistische Wirkung auf den RAR-Rezeptor-Subtyp (oder die -Subtypen) ausgeübt wird, der (die) vorrangig für die Überdosis-Vergiftung oder die unerwünschte Nebenwirkung oder Nebenwirkungen verantwortlich ist (sind). In diesem Zusammenhang wird festgehalten, dass eine Verbindung allgemein gesprochen als Antagonist eines gegebenen Rezeptortyps betrachtet wird, wenn in dem unten beschriebenen Co-Transfektionsassay die Verbindung nicht zu signifikanter transkriptionaler Aktivierung des Rezeptorregulierten Reportergens führt, nichtsdestotrotz jedoch an den Rezeptor mit einem K_d-Wert von weniger als ungefähr 1 μM bindet.
Ob eine Verbindung ein RAR-Antagonist ist und daher in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, kann in den folgenden Assays getestet werden.
Ein chimärer Rezeptortransaktivierungsassay, der die Agonist-ähnliche Aktivität bei den RAR-α-, RAR-β-, RAR-γ- und RXR-α-Rezeptor-Subtypen überprüft und der auf einer Arbeit basiert, veröffentlicht von Feigner P. L. und Holm M. Focus Band 11, Nr. 2 (1989) wird im Detail in der veröffentlichten PCT-Anmeldung, Nr. WO 94/17796, veröffentlicht am 18. August 1994, beschrieben. Die letztere Veröffentlichung ist das PCT-Gegenstück zur US-Anmeldung Nr. 08/016,404, eingereicht am 11. Februar 1993, die zum US-Patent Nr. 5,455,265 geführt hat. PCT-Veröffentlichung WO 94/17796 und die Beschreibung des US-Patents 5,455,265 werden hier ausdrücklich durch Inbezugnahme inkorporiert. Eine Verbindung sollte keine signifikante Aktivierung eines Reportergens durch einen gegebenen Rezeptor-Subtyp (RAR-α, RAR-β oder RAR-γ) in diesem Assay auslösen, um sich als RAR-Antagonist mit Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung zu qualifizieren.
Ein Holorezeptortransaktivierungsassay und ein Ligandenbindungsassay, die die Antagonist/Agonist-ähnliche Aktivität der Verbindungen der Erfindung messen, bzw. ihre Fähigkeit an verschiedene Retinoid-Rezeptor-Subtypen zu binden, werden in der veröffentlichten PCT-Anmeldung Nr. WO 93/11755 (Insbesondere auf den Seiten 30 bis 33 und 37 bis 41), veröffentlicht am 24. Juni 1993, beschrieben, deren Beschreibung hier ebenfalls durch Inbezugnahme inkorporiert ist. Eine Beschreibung des Holorezeptoraktivierungsassays wird ebenfalls unten bereitgestellt.
Holorezeptortransaktivierungsassay
CV1-Zellen (5000 Zellen pro Vertiefung) wurden mit einem RAR-Reporterplasmid MTV-TREp-LUC (50 ng) zusammen mit einem der RAR-Expressionsvektoren (10 ng) in einem automatisierten 96-Vertiefungsformat durch das Calciumphosphatverfahren von Heyman et al. Cell 68: 397–406 transfiziert. Für die RXR-α-, RXR-γ-Transaktivierungsassays wurde ein RXR-reaktives Reporterplasmid CRBPII-tk-LUC (50 ng) zusammen mit den geeigneten RXR-Expressionsvektoren (10 ng) im wesentlichen wie beschrieben von Heyman et al., oben, und Allegretto et al. J. Biol. Chem. 268: 26625–26633, verwendet. Für RXR-β-Transaktivierungsassays wurde ein RXR-reaktives Reporterplasmid CPRE-tk-LUC (50 mg) zusammen mit dem RXR-β-Expressionsvektor (10 mg) wie oben beschrieben verwendet. Diese Reporter enthalten DRI-Elemente von menschlichem CRBPII- bzw. bestimmte DRI-Elemente von dem Promotor (siehe Mangelsdorf et al. The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, S. 319 bis 349, Raven Press Ltd., New York und Heyman et al., wie oben zitiert). Ein β-Galactosidase (50 ng) Expressionsvektor wurde als innere Kontrolle bei den Transfektionen zur Normalisierung für Variationen bei der Transfektionseffizienz verwendet. Die Zellen wurden dreifach 6 Stunden transfiziert, gefolgt von einer Inkubation mit Retinoiden für 36 Stunden, und die Extrakte wurden im Hinblick auf Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivitäten untersucht. Das detaillierte experimentelle Verfahren der Holorezeptortransaktivierungen wurde bei von Heyman et al. oben und Allegretto et al. oben beschrieben. Die in diesem Assay erhaltenen Ergebnisse sind als EC₅₀-Zahlen ausgedrückt, wie auch bei dem chimären Rezeptortransaktivierungsassay. Heyman et al. Cell 68: 397 bis 406, Allegretto et al. J. Biol. Chem. 268: 26625 bis 26633, und Mangelsdorf et al. The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, Seiten 319 bis 349, Raven Press Ltd., New York, sind hier ausdrücklich durch Inbezugnahme inkorporiert. Die Ergebnisse des Ligandenbindungsassays sind in K_d-Zahlen ausgedrückt. (Siehe Cheng et al. Biochemical Pharmacology 22: 3099 bis 3108, ausdrücklich hier durch Inbezugnahme inkorporiert.)
Noch ein weiterer Transaktivierungsassay, der "PGR-Assay" wird in der Veröffentlichung Klein et al. J. Biol. Chem. 271, 22692 bis 22696 (1996) beschrieben, die hier ausdrücklich durch Inbezugnahme inkorporiert ist, und eine detaillierte Beschreibung wird ebenfalls unten bereitgestellt. Die Ergebnisse des PGR-Assays werden ebenfalls in EC₅₀-Zahlen (nanomolare Konzentration) ausgedrückt.
RAR-PGR-Holorezeptortransaktivierungsassay
CV-1-Zellen (4 × 10⁵ Zellen/Vertiefung) wurden transient mit dem Luciferasereporterplasmid MTV-4(R5G)-Luc (0,7 μg/Vertiefung), enthaltend vier Kopien des R5G Retinoid DNA-Reaktionselements, zusammen mit dem RXRα-Expressionsplasmid pRS-hRXRα (0,1 μg/Vertiefung) und einem der RAR-P-GR-Expressionsplasmide (0,05 μg/Vertiefung) in 12 Vertiefungsplatten durch das Calciumphosphatpräzipitationsverfahren, Chen et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 2745 bis 2752, wie beschrieben von Klein et al. in J. Biol. Chem. 271, 22692, oben in Bezug genommen, transfiziert. Die drei unterschiedlichen RAR-P-GR-Expressionsplasmide, pRS-RARα-P-GR, pcDNA3-RARβ-P-GR und pcDNA3-RARγ-P-GR, exprimieren RARα, RARβ bzw. RARγ Rezeptoren, die modifizierte DNA-Verbindungsdomänen enthalten, so dass ihre "P-Boxen" zu der des Glucokortikoidrezeptors verändert wurden. Diese RAR-P-GR-Rezeptoren binden an DNA als heterodimere Komplexe mit RXR. Spezifisch binden die RAR-P-GR-Rezeptoren die Retinolsäurereaktionselemente, bezeichnet als R5G, bestehend aus zwei RAR-Halbstellen (Nucleotidsequenz 5'-GGTTCA-3'), getrennt durch 5 Basenpaare, worin die 3'-Halbstelle zu der der Glucokortikoidrezeptorhalbstelle, 5'-AGAACA-3', modifiziert wurde. Um für eine Varianz in der Transfektionseffizienz zu normalisieren, wurde ein β-Galactosidaseexpressionsplasmid (0,01 μg/Vertiefung) als innere Kontrolle verwendet. Alternativ wurde der Assay in einem 96 Vertiefungsmikrotiterplattenformat (5000 Zellen/Vertiefung) in einer Weise durchgeführt, die zu der obigen identisch war, außer dass 1/5 der Menge des DNA-Calciumphosphatpräzipitats (20 μl anstelle von 100 μl) für jede Vertiefung verwendet wurde. 18 Stunden nach Einführung der DNA-Präzipitanten, wurden die Zellen mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült und mit D-MEM (Gibco- BRL), enthaltend 10% aktiviertes Holzkohle-extrahiertes fötales Kälberserum (Gemini Bio-Products) gefüttert. Die Zellen wurden 18 h mit den in den Figuren angegebenen Verbindungen behandelt. Nach Spülen mit PBS wurden die Zellen mit Luciferaseaktivität lysiert und die Luciferaseaktivität wurde wie vorher in de Wet (1987) Mol. Cell. Biol. 7, 725 bis 737 beschrieben gemessen. Luciferasewerte repräsentieren das Mittel ± SEM von Dreifachbestimmungen, normalisiert auf β-Galactosidaseaktivität.
Eine Verbindung sollte keine signifikante Aktivierung eines Reportergens durch einen gegebenen Rezeptor-Subtyp (RAR-α, RAR-β oder RAR-γ) in den Transaktivierungsassays auslösen, um sich als RAR-Antagonist mit Nützlichkeit in der vorliegenden Erfindung zu qualifizieren. Schließlich sollte eine Verbindung an mindestens einen der RAR-Rezeptor-Subtypen in dem Ligandenbindungsassay mit einer K_d von weniger als ungefähr 1 Mikromolar (K_d < 1 μM) binden, um in der Lage zu sein, als Antagonist des gebundenen Rezeptor-Subtyps zu wirken, unter der Voraussetzung, dass derselbe Rezeptor-Subtyp nicht signifikant durch die Verbindung aktiviert wird.
Tabelle 3 unten zeigt die Ergebnisse des Holorezeptortransaktivierungsassays für bestimmte Verbindungen der Tabelle 1. Tabelle 3a zeigt die Ergebnisse des RAR-PGR-Holorezeptortransaktivierungsassays für die bevorzugten Verbindungen von Tabelle 1a. Tabellen 4 und 4a offenbaren die Wirksamkeit (in Prozent) in diesen Assays der Testverbindungen relativ zu all-trans-Retinolsäure für bestimmte beispielhafte Verbindungen der Erfindung. Tabelle 5 und 5a zeigen die Ergebnisse des Ligandenbindungsassays für bestimmte beispielhafte Verbindungen der Erfindung.
Tabelle 3 Holorezeptortransaktivierungsassay
0.0. in Tabellen 3 und 3a zeigen an, dass die Verbindung in diesem Assay weniger als 20% so aktiv (wirksam) ist wie all-trans-Retinolsäure.
Tabelle 3a RAR-PGR-Holorezeptortransaktivierungsassay
Tabelle 4 Transaktivierungsassay-Effizienz (% der RA-Aktivität)
Tabelle 4a
Tabelle 5 Ligandenbindungsassay
Tabelle 5a
0.0 in Tabellen 5 und 5a geben einen Wert von mehr als 1000 nM an.
Wie sich aus den in Tabellen 3, 3a, 4, 4a, 5 und 5a zusammengefassten Testergebnissen ablesen lässt, sind die darin angegebenen beispielhaften Verbindungen der Erfindung Antagonisten der RAR-Rezeptor-Subtypen, haben jedoch keine Affinität für die RXR-Rezeptor-Subtypen. (Andere Verbindungen der Erfindung können Antagonisten von einigen, aber nicht allen RAR-Rezeptor-Subtypen und Agonisten der verbleibenden RAR-Subtypen sein.) Aufgrund dieser Eigenschaft können diese Verbindungen der Erfindung zum Blockieren der Aktivität von RAR-Agonisten in biologischen Assays verwendet werden. Bei Säugern, einschließlich dem Menschen, können die Verbindungen der Erfindung mit RAR-Agonisten co-verabreicht werden, und durch pharmakologische Selektivität oder ortsspezifische Zufuhr, die unerwünschten Wirkungen von RAR-Agonisten vorzugsweise verhindern. Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um eine Vitamin A-Überdosierung, akut oder chronisch, die sich entweder aus exzessiver Aufnahme von Vitamin A-Zusatzstoffen oder aus der Verdauung von Leber bestimmter Fische und Tiere, die hohe Niveaus an Vitamin A enthalten, ergeben hat. Weiterhin können die erfinderischen Verbindungen ebenfalls verwendet werden, um eine akute oder chronische Toxizität zu behandeln, die von Retinoid-Arzneimitteln ausgelöst wurde. Es war auf dem Gebiet auch bekannt, dass die bei dem Hypervitaminose A-Syndrom beobachteten Toxizitäten (Kopfschmerz, Hautablösung, Knochentoxizität, Dyslipidämien) ähnlich oder identisch zu den Toxizitäten sind, die bei anderen Retinoiden beobachtet wurden, was einen gemeinsamen biologischen Grund nahe legt, nämlich RAR-Aktivierung. Da die Verbindungen der vorliegenden Erfindung die RAR-Aktivierung blockieren, sind sie für die Behandlung der vorstehenden Toxizitäten geeignet.
Die erfinderischen Verbindungen sind auch in der Lage, im wesentlichen eine Hautirrition, die von RAR-Agonistretinoiden ausgelöst wird, zu verhindern, wenn die erfinderischen Verbindungen auf die Haut topisch co-verabreicht werden. In ähnlicher Weise können die Verbindungen der Erfindung topisch auf die Haut verabreicht werden, um eine Hautirritation zu blockieren, bei den Patienten oder Tieren, denen RAR-Agonistverbindungen systemisch verabreicht werden. Die erfinderischen Verbindungen können die Erholung von einer vorher bestehenden Retinoidtoxizität beschleunigen, können eine Hypertriglyceridämie blockieren, ausgelöst durch co-verabreichte Retinoide und können eine Knochentoxizität blockieren, induziert durch einen RAR-Agonisten (Retinoid).
Allgemein gesprochen, können die Antagonistverbindungen für therapeutische Anwendungen beim Säuger in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung enteral oder topisch als Gegenmittel gegen Vitamin A, Vitamin A-Vorläufer oder Gegenmittel gegen eine Retinoidtoxizität, die sich aus einer Überdosierung oder einem verlängerten Aussetzen nachdem die Aufnahme des auslösenden Faktors (Vitamin A-Vorläufer oder ein anderes Retinoid) abgesetzt wurde, verabreicht werden. Alternativ können die Antagonistverbindungen mit Retinoid-Arzneimitteln in Übereinstimmung mit der Erfindung co-verabreicht werden in den Situationen, in denen das Retinoid einen therapeutischen Nutzen bereitstellt, und in denen der co-verabreichte Antagonist ein oder mehr unerwünschte Nebenwirkungen des Retinoids abschwächt oder eliminiert. Für diese Anwendungsart kann der Antagonist in ortsspezifischer Weise verabreicht werden, z. B. als topisch angewandte Creme oder Lotion, während das co-verabreichte Retinoid enteral verabreicht werden kann.
Für therapeutische Anwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Antagonistverbindungen in pharmazeutische Zusammensetzungen, wie z. B. Tabletten, Pillen, Kapseln, Lösungen, Suspensionen, Cremes, Salben, Balsam, Gels, Lotionen und ähnliches inkorporiert unter Verwendung pharmazeutisch akzeptabler Exzipienzien und Vehikel, die auf dem Gebiet per se wohl bekannt sind. Die Herstellung topischer Formulierungen ist z. B. in Remington's Pharmaceutical Science, Ausgabe 17, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, gut beschrieben. Für die topische Anwendung können die antagonistischen Verbindungen ebenfalls als Pulver oder Spray, insbesondere in Aerosolform, verabreicht werden. Wenn das Arzneimittel systemisch verabreicht werden soll, kann es als Pulver, Pille, Tablette oder ähnliches oder als Sirup oder Elixier, geeignet für die orale Verabreichung, konfektioniert werden. Für die intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung wird die antagonistische Verbindung als Lösung oder Suspension hergestellt, die durch Injektion verabreichbar ist. In bestimmten Fällen kann es nützlich sein, die antagonistischen Verbindungen durch Injektion zu formulieren. In bestimmten Fällen kann es nützlich sein, die antagonistischen Verbindungen als Suppositorium oder als Formulierung mit verzögerter Freisetzung für ein Depot unter der Haut oder als intramuskuläre Injektion zu formulieren.
Die antagonistischen Verbindungen werden in einer therapeutisch aktiven Dosis gemäß der Erfindung verabreicht. Eine therapeutische Konzentration wird die Konzentration sein, die die Reduktion des bestimmten Zustands (wie z. B. der Toxizität aufgrund einer Retinoid- oder Vitamin A-Aussetzung oder Nebenwirkungen des Retinoid-Arzneimittels) bewirkt oder seine Ausdehnung verhindert. Es sollte verstanden werden, dass die antagonistischen Verbindungen, wenn sie zum Blockieren einer Retinoid-induzierten Toxizität oder von Nebenwirkungen gemäß der Erfindung co-verabreicht werden, in prophylaktischer Weise verwendet werden, um einen Ausbruch eines bestimmten Zustands, wie z. B. einer Hautirritation, zu verhindern.
Eine geeignete therapeutische oder prophylaktische Konzentration wird von Zustand zu Zustand variieren und kann in bestimmten Fällen je nach Schwere des zu behandelnden Zustands und der Empfänglichkeit des Patienten gegenüber der Behandlung variieren. Dementsprechend wird keine Einzelkonzentration einheitlich nützlich sein, sondern es wird Modifikationen, abhängig von den Eigenarten der chronischen oder akuten Retinoidtoxizität und dem zu behandelnden betroffenen Zustand, geben. Solche Konzentrationen können durch Routineexperimente bestimmt werden. Es wird jedoch vorhergesagt, dass eine Formulierung, die 0,01 bis 1,0 mg einer antagonistischen Verbindung pro ml Formulierung enthält, eine therapeutisch effektive Konzentration für die topische Anwendung darstellen wird. Wenn sie systemisch verabreicht wird, sollte eine Menge zwischen 0,01 und 5 mg/kg Körpergewicht pro Tag ein therapeutisches Ergebnis erzielen können.
Die Grundlage für die Verwendbarkeit der RAR-Antagonisten für die Verhinderung oder Behandlung von RAR-Agonist-induzierter Toxizität ist die kompetitive Inhibition der Aktivierung von RAR-Rezeptoren durch RAR-Agonisten. Der Hauptunterschied zwischen diesen beiden Anwendungen von RAR-Antagonisten ist die Gegenwart oder Abwesenheit einer vorher existierenden Retinoidtoxizität. Die meisten der direkt unten beschriebenen Beispiele betreffen die Verwendung von Retinoiden zur Verhinderung einer Retinoidtoxizität, aber die allgemeinen Verfahren, die hier beschrieben werden, sind auf die Behandlung einer vorher existierenden Retinoidtoxizität ebenfalls anwendbar.
Beschreibung von Experimenten, die die Verwendung von RAR-Antagonisten zur Verhinderung oder Behandlung einer Retinoidtoxizität und/oder Nebenwirkungen von Retinoid-Arzneimitteln demonstrieren
Beispiel 1: Hautirritation, induziert durch einen topisch angewandten Agonisten wird mit einem topisch angewandten Antagonisten behandelt
Die Verbindung 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaphthalin-2-yl)propen-1-yl]benzoesäure, bezeichnet als AGN 191183, ist im Stand der Technik als potenter RAR-Agonist bekannt (siehe z. B. den beschreibenden Teil und 2b des US-Patents Nr. 5,324,840). (Die "AGN"-Nummer ist eine willkürzlich gewählte Referenznummer, die von der Inhaberfirma der vorliegenden Erfindung für die Identifizierung von Verbindungen verwendet wird.)
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 192869, auch als Verbindung 60a bezeichnet) ist eine Verbindung, deren Herstellung unten beschrieben werden wird. Diese Verbindung ist ein RAR-Antagonist.
Eine Hautirritation, induziert durch einen RAR-Agonisten, nämlich AGN 191183, der topisch verabreicht wird, kann durch einen RAR-Antagonisten, nämlich AGN 192869, der ebenfalls topisch verabreicht wird, bei haarlosen Mäusen blockiert werden.
Insbesondere wird die Hautirritation auf einer semiquantitativen Bewertungsskala durch täglich subjektive Bewertung einer Hautflockenbildung und Abschürfungen gemessen. Eine einzelne Zahl, die topische Irritationsbewertung, fasst die Hautirritation während des Verlaufs des Experiments zusammen, die bei einem Tier induziert wird. Die topische Irritationsbewertung wird wie folgt berechnet. Die topische Irritationsbewertung ist die algebraische Summe einer zusammengesetzten Abflockungsbewertung mit einer zusammengesetzten Abschürfungsbewertung. Die zusammengesetzten Bewertungen liegen bei 0–9 und 0–8 für Abflockung bzw. Abschürfungen und messen die maximale Schwere, den Ausbruchsbeginn und die durchschnittliche Schwere von beobachteten Abflockungen und beobachteten Abschürfungen.
Die Schwere der Abflockung wird auf einer 5-Punkteskala bewertet und die Schwere der Abschürfungen wird auf einer 4-Punkteskala bewertet, wobei höhere Bewertungen größere Schwere reflektieren. Die maximale Schwerekomponente der zusammengesetzten Bewertungen würde die höchste tägliche Schwerebewertung sein, die einem gegebenen Tier während des Verlaufs der Beobachtung zugeordnet wurde.
Für den Zeitpunkt des Ausbruchs der zusammengesetzten Bewertung wird eine Bewertung von 0 bis 4 wie folgt zugeordnet.
Tabelle 6 Zeitpunkt des Auftretens von Flocken oder Abschürfungen mit der Schwere 2 oder mehr
Die durchschnittliche Schwerekomponente der zusammengesetzten Bewertung ist die Summe der täglichen Abflockungs- oder Abschürfungsbewertungen, geteilt durch die Zahl der Beobachtungstage. Der erste Tag der Behandlung wird nicht gezählt, da die Arzneimittelverbindung noch nicht die Möglichkeit hatte, zum Zeitpunkt der ersten Behandlung zu wirken.
Um die zusammengesetzten Abflockungs- und Abschürfungsbewertungen zu berechnen, werden die durchschnittliche Schwerebewertung und die Bewertung des Ausbruchszeitpunkts summiert und durch 2 geteilt. Das Ergebnis wird zu der maximalen Schwerebewertung zugefügt. Die zusammengesetzten Abflockungs- und Abschürfungsbewertungen werden dann summiert, um die gesamt-topische Irritationsbewertung zu ergeben. Jedes Tier erhält eine topische Irritationsbewertung und die Werte werden als Mittel ± SD der individuellen Bewertungen einer Gruppe von Tieren ausgedrückt. Die Werte werden auf die nächste ganze Zahl gerundet.
Weibliche haarlose Mäuse [Crl:SKH1-hrBR] (8–12 Wochen alt, n = 6) wurden topisch für 5 aufeinanderfolgende Tage mit Aceton, AGN 191183, AGN 192869, oder einer Kombination aus AGN 192869 und 191183, behandelt. Die Dosierungen der jeweiligen Verbindungen sind in Tabelle 7 angegeben. Die Behandlungen werden auf die dorsale Haut mit einem Gesamtvolumen von 4 ml/kg (ungefähr 0,1 ml) aufgebracht. Die Mäuse wurden täglich beobachtet und im Hinblick auf eine Flockenbildung und Abschürfungen bis zu und einschließlich 3 Tage nach der letzten Behandlung, d. h. Tag 8, bewertet.
Tabelle 7 Experimentaufbau und Ergebnisse, Beispiel 1
Die topischen Irritationsbewertungen für Beispiel 1 werden in Tabelle 7 dargestellt. Weder Aceton (Vehikel), noch AGN 192869 (Antagonist) mit einer Dosis von 1,5 mg/kg/Tag (Gruppe F) führte zu einer beobachtbaren topischen Irritation. AGN-191183, der RAR-Agonist, führte zu einer schwachen topischen Irritation bei einer Dosis von 0,025 mg/kg/Tag. AGN 191183-induzierte topische Irritation wurde jedoch in dosisabhängiger Weise von AGN 192869 inhibiert, mit fast vollständiger Beendigung der Irritation in Gegenwart eines 50-fachen molaren Überschusses an AGN 192869. Dies demonstriert, dass ein topischer RAR-Antagonist eine Hautirritation blockiert, die durch einen topischen RAR-Agonisten ausgelöst wurde. Eine vollständige Blockade der RAR-Agonist-induzierten Hautirritation kann mit niedrigeren molaren Verhältnissen des Antagonisten zu dem Agonisten erreicht werden, wenn die RAR-Antagonisten stärker sind, wie z. B. die Verbindung 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 193109, in dieser Anmeldung auch als Verbindung 60 bezeichnet).
Beispiel 2: Hautirritation, induziert durch einen oral angewandten Agonisten, wird durch einen topisch angewandten Antagonisten blockiert
Der starke RAR-Agonist AGN 191183 (4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethylnaphthalin-2-yl)propen-1-yl]benzoesäure) und der starke RAR-Antagonist 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 193109, Verbindung 60) wurden in diesem Beispiel verwendet und das Körpergewicht der Versuchstiere (Mäuse) wurde als Marker für eine systemische RAR-Agonistaussetzung verwendet.
Gruppen weiblicher haarloser Mäuse (8–12 Wochen alt, n = 6) wurden durch intragastrische Intubation mit Maisöl oder AGN 191183 (0,26 mg/kg), suspendiert in Maisöl (5 ml/kg) behandelt. Die Mäuse wurden simultan topisch auf der dorsalen Haut mit einem Vehikel (97,6% Aceton/2,4% Dimethylsulfoxid) oder Lösungen von AGN 193109 in Vehikel (6 ml/kg) behandelt. Spezifische Dosierungen für die unterschiedlichen Behandlungsgruppen sind in Tabelle 8 angegeben. Die Behandlungen wurden täglich für vier aufeinanderfolgende Tage verabreicht. Die Mäuse wurden gewogen und im Hinblick auf die topische Irritation täglich, wie beschrieben in Beispiel 1, bis zu und einschließlich 1 Tag nach der letzten Behandlung gewogen und eingeteilt. Eine prozentuale Körpergewichtsveränderung wird durch Subtraktion des endgültigen Körpergewichts (Tag 5) vom anfänglichen Körpergewicht (Tag 1), Division durch das anfängliche Körpergewicht und Multiplikation mit 100%, berechnet. Topische Irritationsbewertungen werden wie in Beispiel 1 beschrieben berechnet.
Die topischen Irritationsbewertungen und der Gewichtsverlust für die unterschiedlichen Gruppen sind in Tabelle 8 angegeben. Eine kombinierte Behandlung mit den topischen und oralen Vehikeln, d. h. Aceton bzw. Maisöl, führte zu keiner topischen Irritation oder einem Gewichtsverlust, Ähnlich führte eine kombinierte Behandlung mit oralem Vehikel und dem topischen Antagonisten AGN 193109 zu keiner topischen Irritation oder zu einem Gewichtsverlust. Orales AGN 191183 induzierte per se einen substantiellen Gewichtsverlust und eine Hautirritation. Eine AGN 191183-induzierte Hautirritation wurde substantiell reduziert, wenn mit einer niedrigeren Dosierung AGN 193109 kombiniert wurde, und wurde vollständig bei einer höheren Dosis AGN 193109 blockiert. Ein AGN 191183-induzierter Gewichtsverlust wurde ebenfalls in dosisabhängiger Weise durch topisches AGN 193109 blockiert, jedoch war die Blockade nicht vollständig. So blockierte topisches AGN 193109 vorzugsweise die dermale Toxizität von AGN 191183. Vermutlich wurden niedrige Niveaus AGN 193109 systemisch absorbiert und konnten so den durch AGN 191183 induzierten Gewichtsverlust partiell blockieren. Eine solche Absorption würde jedoch vermutlich bei einer Art mit einer weniger permeablen Haut noch geringer sein, wie z. B. beim Menschen. Alternativ könnte die Gewichtsverlustinhibition durch AGN 193109 an einer Verbesserung der AGN 191183-induzierten Hautirritation liegen.
Tabelle 8 Experimentaufbau und Ergebnisse, Beispiel 2
So demonstriert Beispiel 2, dass RAR-Antagonisten, die topisch verabreicht werden, verwendet werden können, um vorzugsweise die Hautirritation zu blockieren, die durch einen oral verabreichten RAR-Agonisten induziert wird.
Beispiel 3: Ein topisch verabreichter Antagonist beschleunigt die Wiederherstellung von einer vorher existierenden Retinoidtoxizität
In diesem Beispiel wird der Gewichtsverlust durch topische Behandlung mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 induziert und dann wurden die Testtiere topisch mit entweder Vehikel oder mit dem RAR-Antagonisten AGN 193109 behandelt.
Weibliche haarlose Mäuse (8 bis 12 Wochen alt, n = 5) wurden topisch mit AGN 191183 (0,13 mg/kg/Tag) in Vehikel (97,6% Aceton/2,4% DMSO, 4 ml/kg) täglich für 2 Tage behandelt. Gruppen derselben Mäuse (n = 5) wurden dann topisch entweder mit Vehikel oder AGN 193109 in Vehikel (4 ml/kg) täglich für 3 aufeinanderfolgende Tag, beginnend am Tag 3, behandelt. Die Mäuse wurden an den Tagen 1 bis 5 und am Tag 8 gewogen. Körpergewicht wurde als Mittel ± SD ausgedrückt. Die Mittel wurden statistisch unter Verwendung eines nicht-gepaarten, Doppelausläufer-Tests verglichen. Unterschiede wurden als signifikant bei P < 0,05 betrachtet.
Tabelle 9 Ergebnisse, Beispiel 3
Der Zeitverlauf der Körpergewichte in Beispiel 3 ist in Tabelle 9 dargestellt. Das Körpergewicht beider Mäusegruppen erniedrigte sich parallel an den Tagen 2 und 3 als Ergebnis der AGN 191183-Behandlung an den Tagen 1 und 2. Das Körpergewicht in den zwei Gruppen war an den Tagen 1, 2 oder 3 nicht signifikant unterschiedlich. Die AGN 193109-Behandlung erhöhte jedoch signifikant das Körpergewicht relativ zur Vehikelbehandlung an den Tagen 4 und 5. Diese Daten zeigen, dass die Wiedererholung von einem AGN 191183-induzierten Körpergewichtsverlust durch darauffolgende Behandlung mit AGN 193109 beschleunigt wurde. Das Körpergewicht war zwischen den beiden Gruppen der Mäuse am Tag 8 nicht signifikant unterschiedlich, was nahe legt, dass eine vollständige Erholung bei beiden Gruppen mit ausreichender Zeit erreichbar war. So sind RAR-Antagonisten für eine Abschwächung einer RAR-Agonist-induzierten Toxizität effektiv, selbst wenn die RAR-Agonist-induzierte Toxizität vor der RAR-Antagonistbehandlung stattgefunden hat, d. h. in einem RAR-Agonistvergiftungsszenario.
Beispiel 4: Oral verabreichter Antagonist blockiert eine Hypertriglyceridämie, induziert durch einen oral co-verabreichten Retinoidagonisten
5-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-3,5,5,8,8-pentamethylnaphthalin-2-yl)propen-1-yl]-2-thiophencarbonsäure ist ein bekannter RAR/RXR-pan-Agonist (siehe US-Patent Nr. 5,324,840, Spalte 32) und wird als AGN 191659 bezeichnet. Diese Verbindung wurde oral verwendet, um eine akute Hypertriglyceridämie in Ratten zu induzieren, und AGN 193109, Verbindung 60, wurde oral co-verabreicht, um die AGN 191659-induzierte Hypertriglyceridämie zu blockieren.
Männliche Fischer-Ratten (6 bis 7 Wochen alt, n = 5) wurden durch intragastrische Intubation mit Maisöl (Vehikel), AGN 191659, AGN 193109 oder einer Kombination aus AGN 191659 und AGN 193109 behandelt. AGN 191659 und AGN 193109 wurden als feine Suspensionen in Maisöl verabreicht. Der experimentelle Aufbau, einschließlich den Dosierungen, ist in Tabelle 10 angegeben.
Blut wurde aus der Vena cava inferior unter Kohlenstoffdioxidnarkose entnommen. Das Serum wurde von Blut durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit abgetrennt. Gesamtserumtriglyceride (Triglyceride plus Glycerin) wurden mit einem standardspektrofotometrischen Endpunktassay gemessen, der kommerziell als Kit erhältlich ist und auf ein Plattenformat für Platten mit 96 Vertiefungen angepasst wird. Die Serumtriglycerid-Niveaus werden als Mittel ± SD ausgedrückt. Die Mittel wurden statistisch durch eine Einwegsanalyse der Varianz, gefolgt von einem Dunnetts Test, verglichen, wenn signifikante Unterschiede angetroffen wurden. Die Unterschiede wurden als signifikant bei P < 0,05 betrachtet.
Wie in Tabelle 10 dargestellt, führte AGN 191659 per se zu einer signifikanten Erhöhung der Serumtriglyceride relativ zu der Vehikelbehandlung. AGN 193109 per se erhöhte die Serumtriglyceride nicht signifikant. Es ist wichtig, dass die Kombination von AGN 193109 und AGN 191659 in molaren Verhältnissen von 1 : 1 und 5 : 1, die Serumtriglyceride auf Niveaus reduzierte, die sich von der Kontrolle nicht signifikant unterschieden.
Tabelle 10 Experimenteller Aufbau und Ergebnisse, Beispiel 4
Beispiel 4 demonstriert, dass ein RAR-Antagonist verwendet werden kann, um eine von einem co-verabreichten Retinoid induzierte Hypertriglyceridämie zu blockieren.
Beispiel 5: Ein parenteral verabreichter Antagonist blockiert eine Knochentoxizität, die von einem parenteral co-verabreichten Retinoidagonisten induziert wird
Beispiel 5 demonstriert, dass RAR-Antagonisten eine Knochentoxizität blockieren können, die durch einen RAR-Agonisten induziert wird. In diesem Beispiel wird AGN 193109 verwendet, um eine vorzeitige Schließung der Epiphysenplatte zu blockieren, die von einem co-verabreichten RAR-Agonisten, AGN 191183, bei Meerschweinchen ausgelöst wurde.
Gruppen männlicher Hartley-Meerschweinchen (ungefähr 3 Wochen alt, n = 4) wurden intraperitoneal mit osmotischen Pumpen, die Vehikel (20% Dimethylsulfoxid/80% Polyethylenglykol-300), AGN 191183 (0,06 mg/ml) oder AGN 191183 (0,06 mg/ml) in Kombination mit AGN 193109 (0,34 mg/ml) enthielten, implantiert. Die osmotischen Pumpen wurde von dem Hersteller für eine Zufuhr von ungefähr 5 μl Lösung pro Stunde kontinuierlich über 14 Tage entworfen.
Die Tiere wurden durch Kohlendioxiderstickung 14 Tage nach der Implantation euthanasiert. Die linke Tibia wurde entfernt und in 10%iges gepuffertes Formalin platziert. Die Tibias wurden durch Aussetzung gegenüber einer Ameisensäure/Formalinlösung über 3 bis 4 Tage von Calcium befreit und Paraffinsektionen wurden hergestellt. Die Sektionen wurden mit Hämatoxylin und Eosin in Standardverfahren gefärbt. Die proximale Tibia-Epiphysenplatte wurde geprüft und als geschlossen oder nicht geschlossen bewertet. Die Epiphysenplattenschließung wird für diesen Zweck als jeder Bruch der Kontinuität des Epiphysenwachstumsplattenknorpels definiert, d. h. Ersatz durch Knochen und/oder fibroblastisches Gewebe.
Keines der vier Vehikel-behandelten Meerschweinchen zeigte einen Epiphysenplattenschluss am Ende des Experiments. Dies war zu erwarten, da die proximale Epiphysenplatte der Meerschweinchen-Tibia sich normalerweise nicht schließt, bis die Tiere mindestens 10 Monate alt sind. Alle vier AGN 191183-behandelten Meerschweinchen zeigten eine teilweise oder vollständige Epiphysenplattenschließung. Keines der mit der Kombination aus AGN 191183 und AGN 193109 behandelten Meerschweinchen zeigte jedoch eine Epiphysenplattenschließung. So kann AGN 193109 in 5-fachem molaren Überschuss eine AGN 191183-induzierte Knochentoxizität vollständig blockieren, wenn diese Verbindungen parenteral co-verabreicht werden.
RAR-Antagonistverbindungen
Die Verbindungen 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 193109, Verbindung 60) und 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(phenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoesäure (AGN 192869, Verbindung 60a) sind Beispiele für RAR-Antagonisten, die in den oben beschriebenen Tiertests für eine Blockierung von RAR-Rezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Die Verbindungen der folgenden Formel (Formel 1) dienen als weitere und allgemeine Beispiele für zusätzliche RAR-Antagonistverbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung.
In Formel 1 ist X S, O, NR', worin R' H oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, oder
X ist [C(R₁)₂]_n, worin R₁ H oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und n ist eine ganze Zahl zwischen 0 oder 1;
R₂ ist Wasserstoff, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, F, CF₃, ein Fluor-substituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, OH, SH, Alkoxy mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Alkylthio mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen;
R₃ ist Wasserstoff, Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder F;
m ist eine ganze Zahl mit dem Wert von 0 bis 3;
o ist eine ganze Zahl mit dem Wert von 0 bis 3;
Z ist -C≡C-,
-N=N-,
-N=CR₁-,
-CR₁=N,
-(CR₁=CR₁)_n'-, worin n' eine ganze Zahl mit dem Wert 0 bis 5 ist,
-CO-NR₁-,
-CS-NR₁-,
-NR₁-CO,
-NR₁-CS,
-COO-,
-OCO-;
-CSO-;
-OCS-;
Y ist eine Phenyl- oder Naphthylgruppe oder Heteroaryl, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Pyridyl, Thienyl, Furyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Thiazolyl, Oxazolyl, Imidazolyl und Pyrrazolyl, wobei die Phenyl- und Heteroarylgruppen optional mit ein oder zwei R₂-Gruppen substituiert sind, oder
wenn Z -(CR₁=CR₁)_n'- ist und n' ist 3, 4 oder 5, dann bedeutet Y eine direkte Valenzbindung zwischen der (CR₂=CR₂)_n'-Gruppe und B;
A ist (CH₂)_q, worin q 0 bis 5 bedeutet, ein verzweigtes Niederalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffen, Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Doppelbindungen, Alkinyl mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 Dreifachbindungen;
B ist Wasserstoff, COOH oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, COOR₈, CONR₉R₁₀, -CH₂OH, CH₂OR₁₁, CH₂OCOR₁₁, CHO, CH(OR₁₂)₂, CHOR₁₃O, -COR₇, CR₇(OR₁₂)₂, CR₇OR₁₃O oder ein Nieder-Trialkylsilyl, worin R₇ eine Alkyl-, Cycloalkyl oder Alkenylgruppe ist, enthaltend 1 bis 5 Kohlenstoffatome, R₈ ist eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Trimethylsilylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 10 Kohlenstoffatome aufweist, oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder R₈ ist Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₉ und R₁₀ bedeuten unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder eine Cycloalkylgruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen, oder Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₁₁ ist Niederalkyl, Phenyl oder Niederalkylphenyl, R₁₂ ist Niederalkyl und R₁₃ ist ein divalentes Alkylradikal mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen, und
R₁₄ ist (R₁₅)_r-phenyl, (R₁₅)_r-naphthyl, oder (R₁₅)_r-heteroaryl, worin die Heteroarylgruppe 1 bis 3 Heteroatome aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus O, S und N, r eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 5, und
R₁₅ ist unabhängig H, F, Cl, Br, I, NO₂, N(R₈)₂, N(R₈)COR₈, NR₈CON(R₈)₂, OH, OCOR₈, OR₈, CN, eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Fluor-substituierte Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Doppelbindungen, eine Alkinylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 3 Dreifachbindungen oder eine Trialkylsilyl- oder Trialkylsilyloxygruppe, worin die Alkylgruppen unabhängig 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweisen.
Syntheseverfahren – Aryl-substituierte Verbindungen
Die beispielhaften RAR-Antagonistverbindungen der Formel 1 können durch Synthese-chemische Wege hergestellt werden, die hier illustriert sind. Der Synthesechemiker wird klar erkennen, dass die hier aufgeführten Bedingungen spezifische Ausführungsformen sind, die auf alle denkbaren Verbindungen, die durch Formel 1 repräsentiert werden, verallgemeinert werden können.
Reaktionsschema 1
Reaktionsschema 1 (Fortsetzung)
Reaktionsschema 1 illustriert die Synthese von Verbindungen der Formel 1, worin die Z-Gruppe eine Ethinylfunktion (-C≡C-) ist und X ist [C(R₁)₂]_n, worin n = 1. Anders ausgedrückt, illustriert Reaktionsschema 1 die Synthese von Ethinyl-substituierten Dihydronaphthalinderivaten gemäß der vorliegenden Erfindung. Gemäß diesem Schema wird eine Tetrahydronaphthalin-1-on-Verbindung der Formel 6 bromiert, um das Bromderivat der Formel 7 bereitzustellen. Die Verbindungen der Formel 6 tragen bereits die gewünschten R₁-, R₂- und R₃-Substituenten, wie diese oben in Verbindung mit Formel 1 definiert sind. Ein bevorzugtes Beispiel einer Verbindung der Formel 6 ist 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naphthalenon, was in der chemischen Literatur (Arnold et al J. Am. Chem. Soc. 69: 2322–2325 (1947)) beschrieben wird. Ein zur Zeit bevorzugter Weg für die Synthese dieser Verbindung aus 1-Brom-3-phenylpropan wird ebenfalls in dem experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Die Verbindungen der Formel 7 werden dann mit (Trimethylsilyl)acetylen umgesetzt, um die (Trimethylsilyl)ethinyl-substituierten 3,4-Dihydronaphthalin-1(2H)-on-Verbindungen der Formel 8 bereitzustellen. Die Reaktion mit (Trimethylsilyl)acetylen wird typischerweise in Wärme (ungefähr 100°C) in der Gegenwart von Kupferiodid, einem geeigneten Katalysator, typischerweise mit der Formel Pd(PPh₃)₂Cl₂, einem Säureakzeptor (wie z. B. Triethylamin) unter einer inerten Gas-(Argon)-Atmosphäre durchgeführt. Die typische Reaktionszeit beträgt ungefähr 24 h. Die (Trimethylsilyl)ethinyl-substituierten 3,4-Dihydronaphthalin-1(2H)-on-Verbindungen der Formel 8 werden dann mit einer Base (Kaliumhydroxid oder Kaliumcarbonat) in einem alkoholischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, umgesetzt, um die Ethinyl-substituierten 3,4-Dihydro-1-naphthalin-1(2H)-one der Formel 9 bereitzustellen. Verbindungen der Formel 9 werden dann mit dem aromatischen oder heteroaromatischen Reagens X₁-Y(R₂)-A-B' (Formel 10) in Gegenwart von Kupferiodid (einem geeigneten Katalysator), typischerweise Pd(PPh₃)₂Cl₂, einem Säureakzeptor, wie z. B. Triethylamin, unter inerter Gas(Argon)-Atmosphäre gekoppelt. Alternativ kann ein Zinksalz (oder ein anderes geeignetes Metallsalz) der Verbindungen der Formel 9 mit den Reagenzien der Formel 10 in Gegenwart von Pd(PPh₃)₄ oder einem ähnlichen Komplex gekoppelt werden. Im typischen Fall wird die Kopplungsreaktion mit dem Reagens X₁-Y(R₂)-A-B' (Formel 10) bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur durchgeführt. Allgemein gesprochen, ist die Kopplung zwischen einem Ethinylarylderivat oder seinem Zinksalz und einer Halogen-substituierten Aryl- oder einer Heteroarylverbindung, wie z. B. dem Reagens der Formel 10, in dem US-Patent Nr. 5,264,456 beschrieben, dessen Beschreibung hier ausdrücklich durch Inbezugnahme inkorporiert ist. Die Verbindungen der Formel 11 sind Vorläufer der beispielhaften Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung oder Derivate davon, geschützt an der B'-Gruppe, wovon die Schutzgruppe einfach durch wohl bekannte Reaktionen entfernt werden kann. Die Verbindungen der Formel 11 können auch in weitere Vorläufer für die beispielhaften Verbindungen durch Reaktionen und Transformationen umgewandelt werden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind. Solche Reaktionen sind im Reaktionsschema 1 durch Konversion in "Homologe und Derivate" angezeigt. Eine solche Konversion, verwendet für die Synthese verschiedener beispielhafter Verbindungen, ist die Verseifung einer Estergruppe (wenn B oder B' ein Ester ist), um die freie Carbonsäure oder ihr Salz bereitzustellen.
Die Halogen-substituierten Aryl- oder Heteroarylverbindungen der Formel 10 können allgemein gesprochen durch wohl bekannte Reaktionen erhalten werden. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist Ethyl-4-iodbenzoat, das z. B. durch Veresterung von 4-Iodbenzoesäure erhältlich ist. Ein anderes Beispiel ist Ethyl-6-iodnicotinoat, das durch Durchführung einer Halogenaustauschreaktion an einer 6-Chlornicotinsäure, gefolgt von einer Veresterung, erhalten werden kann. Noch allgemeiner gesprochen, können die wohl bekannten und veröffentlichten allgemeinen Prinzipien und synthetische Verfahren verwendet werden, in Bezug auf die Derivatisierung der Verbindungen der Formel 11 und/oder die Synthese von Aryl- und Heteroarylverbindungen der Formel 10, die anschließend mit Verbindungen der Formel 9 umgesetzt werden können.
Carbonsäuren werden typischerweise durch Erwärmen im Rückfluss der Säure in Lösung des geeigneten Alkohols in der Gegenwart eines Säurekatalysators, wie z. B. Wasserstoffchlorid oder Thionylchlorid, verestert. Alternativ kann die Carbonsäure mit einem geeigneten Alkohol in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin kondensiert werden. Der Ester wird durch konventionelle Mittel wiedergewonnen und gereinigt. Acetale und Ketale werden einfach durch das von March, Advanced Organic Chemistry, 2. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company, S. 810 beschriebene Verfahren hergestellt. Alkohole, Aldehyde und Ketone können alle durch die jeweilige Bildung von Ethern und Estern, Acetalen oder Ketalen geschützt werden durch bekannte Verfahren wie die von McOmie, Plenum Publishing Press, 1973 und Protecting Groups, Herausgeber Greene, John Wiley & Sons, 1981 beschriebenen.
Um den Wert von n bei den Verbindungen der Formel 10 vor Durchführung der Kupplungsreaktion gemäß Reaktionsschema 1 zu erhöhen (wenn solche Verbindungen, die zu Formel 10 korrespondieren, von einer kommerziellen Quelle nicht erhältlich sind), werden aromatische oder heteroaromatische Carbonsäuren einer Homologierung (homologation) durch sukzessive Behandlung unter Arndt-Eistert-Bedingungen oder anderen Homologierungsverfahren unterzogen. Alternativ können Derivate, die nicht Carbonsäuren sind, ebenfalls durch geeignete Verfahren homologiert werden. Die homologierten Säuren können dann durch das allgemeine Verfahren, das in dem vorstehenden Absatz beschrieben wurde, verestert werden.
Verbindungen der Formel 10 (oder andere Intermediate oder beispielhafte Verbindungen), bei denen A eine Alkenylgruppe mit ein oder mehr Doppelbindungen ist, können z. B. durch Syntheseschemata hergestellt werden, die dem praktizierenden Organchemiker sehr wohl bekannt sind; z. B. durch Wittig-Reaktionen und ähnliche, oder durch Einführung einer Doppelbindung durch Eliminierung von Halogen von einer alpha-Halogen-arylalkylcarbonsäure, Ester oder ähnlichem Carboxaldehyd. Verbindungen der Formel 10 (oder andere Intermediate oder beispielhafte Verbindungen), bei denen die A-Gruppe eine Dreifach- (acetylenische) Bindung aufweist, können durch Reaktion eines korrespondierenden aromatischen Methylketons mit einer starken Base, wie z. B. Lithiumdiisopropylamid, Reaktion mit Diethylchlorphosphat und darauffolgende Addition von Lithiumdiisopropylamid hergestellt werden.
Die von den Verbindungen der Formel 11 (oder anderen Intermediaten oder beispielhafte Verbindungen) abgeleiteten Säuren und Salze sind einfach von den korrespondierenden Estern erhältlich. Eine basische Verseifung mit einer Alkalimetallbase wird die Säure bereitstellen. Zum Beispiel kann ein Ester der Formel 11 (oder andere Intermediate oder beispielhafte Verbindungen) in einem polaren Lösungsmittel wie z. B. einem Alkanol gelöst werden, vorzugsweise unter inerter Atmosphäre bei Raumtemperatur, mit ungefähr 3 molarem Überschuss der Base, z. B. Lithiumhydroxid oder Kaliumhydroxid. Die Lösung wird für eine verlängerte Zeitspanne, zwischen 15 und 20 h, gerührt, abgekühlt, angesäuert und das Hydrolysat durch konventionelle Mittel gewonnen.
Das Amid kann durch alle geeigneten Amidierungsmittel, die auf dem Gebiet bekannt sind, aus den korrespondierenden Estern oder Carbonsäuren gebildet werden. Ein Weg zur Herstellung solcher Verbindungen ist die Umwandlung einer Säure zu einem Säurechlorid und dann die Behandlung der Verbindung mit Ammoniumhydroxid oder einem geeigneten Amin.
Alkohole werden durch Konversion der korrespondierenden Säuren zu dem Säurechlorid mit Thionylchlorid oder einem anderen Mittel hergestellt (J. March, Advanced Organic Chemistry, 2. Ausgabe, McGraw-Hill Book Company), dann durch Reduktion des Säurechlorids mit Natriumborhydrid (March, ibid, S. 1124), was die korrespondierenden Alkohole ergibt. Alternativ können Ester mit Lithiumaluminiumhydrid bei reduzierten Temperaturen reduziert werden. Alkylierung dieser Alkohole mit geeigneten Alkylhalogeniden unter Williamson-Reaktionsbedingungen (March, ibid, S. 357) ergibt die korrespondierenden Ether. Diese Alkohole können durch ihre Umsetzung mit geeigneten Säuren in Gegenwart von Säurekatalysatoren oder Dicyclohexylcarbodiimid und Dimethylaminopyridin umgewandelt werden.
Aldehyde können aus den korrespondierenden primären Alkoholen unter Verwendung milder Oxidationsmittel, wie z. B. Pyridiniumdichromat, in Methylenchlorid hergestellt werden (Corey E. J., Schmidt G., Tet. Lett. 399, 1979) oder Dimethylsulfoxid/Oxalylchlorid in Methylenchlorid (Omura K., Swern D., Tetrahedron 34: 1651 (1978)).
Ketone können aus einem geeigneten Aldehyd durch Behandlung des Aldehyds mit einem Alkyl-Grignard-Reagens oder ähnlichem Reagens, gefolgt von Oxidation, hergestellt werden.
Acetale oder Ketale können von dem korrespondierenden Aldehyd oder Keton durch das von March, ibid, S. 810 beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Verbindungen der Formel 10 (oder andere Intermediate oder beispielhafte Verbindungen), worin B H ist, können aus den korrespondierenden halogenierten aromatischen oder heteroaromatischen Verbindungen hergestellt werden, vorzugsweise bei denen das Halogen I ist.
Unter Rückbezugnahme auf das Reaktionsschema 1 werden die Verbindungen der Formel 11 mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin in einem inerten etherartigen Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, bei niedrigen Temperaturen (–78°C und 0°C) umgesetzt. Dies ist im Reaktionsschema 1 dargestellt, wo das in der Regel nicht isolierte Natriumsalz-Intermediat in Klammern als Formel 12 angegeben ist. Die Reaktion führt zu den durch Formel 13 dargestellten Trifluormethylsulfonyloxyderivaten. (Tf = SO₂CF₃). Die Verbindungen der Formel 13 werden dann zu den beispielhaften Verbindungen der Erfindung umgewandelt, dargestellt in Formel 14, durch Umsetzung mit einem Organometallderivat, abgeleitet von der Aryl- oder Heteroarylverbindung R₁₄H, so dass die Formel des Organometallderivats R₁₄Met ist (Met steht für monovalentes Metall), vorzugsweise R₁₄Li. (R₁₄ ist in Verbindung mit Formel 1 definiert.) Die Reaktion mit dem Organometallderivat, vorzugsweise Lithiumderivat der Formel R₁₄Li, wird in der Regel in einem inerten etherartigen Lösungsmittel (wie z. B. Tetrahydrofuran) in Gegenwart von Zinkchlorid (ZnCl₂) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (Pd(PPh₃)₄) durchgeführt. Das Organolithiumreagens R₁₄Li kann, falls es kommerziell nicht erhältlich ist, aus der Verbindung R₁₄H (oder ihrem Halogenderivat R₁₄-X₁, worin X₁ Halogen ist) in einem etherartigen Lösungsmittel gemäß bekannter Praxis auf dem Gebiet hergestellt werden. Der Temperaturbereich für die Reaktion zwischen dem Reagens R₁₄Li und den Verbindungen der Formel 13 liegt allgemein gesprochen im Bereich von ungefähr –78°C bis 50°C. Die Verbindungen der Formel 14 können in weitere Homologe und Derivate gemäß den oben diskutierten Reaktionen umgewandelt werden.
Die intermediären 7-Brom-tetrahydronaphthalin-1-on-Verbindungen der Formel 7, wie dargestellt im Reaktionsschema 1, können auch mit einem Grignard-Reagens der Formel R₁₄MgBr (R₁₄ ist wie in Verbindung mit Formel 1 definiert) umgewandelt werden, um den tertiären Alkohol der Formel 15 zu ergeben. Der tertiäre Alkohol wird durch Behandlung mit Säure zur Bereitstellung von 3,4-Dihydro-7-bromnaphthalinderivaten der Formel 16 dehydratisiert, die als Intermediate für die Synthese zusätzlicher Verbindungen der vorliegenden Erfindung dienen (siehe Reaktionsschemata 6, 7 und 8).
Reaktionsschema 2
Unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 2 wird ein Syntheseweg zu diesen Verbindungen offenbart, wo unter Bezugnahme auf Formel 1 X S, Ooder NR' ist und die Z-Gruppe eine Ethinylfunktion (-C≡C-). Das Ausgangsmaterial für diese Reaktionsabfolge ist Bromphenol, Bromthiophenol oder Bromanilin der in Formel 17 dargestellten Struktur. Zum Zweck der Vereinfachung der vorliegenden Beschreibung kann in der folgenden Beschreibung X im wesentlichen als Schwefel wie für die Herstellung der Benzothiopyranderivate betrachtet werden. Man sollte jedoch im Gedächtnis behalten, dass das hier beschriebene Schema auch mit für den Fachmann erkenntlichen Modifikationen für die Herstellung von Benzopyran (X = O)- und Dihydrochinolin (X = NR')-Verbindungen der gegenwärtigen Erfindung geeignet sein wird. So wird die Verbindung der Formel 17, vorzugsweise para-Bromthiophenol, para-Bromphenol oder para-Bromanilin unter basischen Bedingungen mit einer 3-Bromcarbonsäure der Formel 18 umgesetzt. In diesem Reaktionsschema haben die Symbole die in Verbindung mit Formel 1 beschriebenen Bedeutungen. Ein Beispiel für das Reagens der Formel 18, worin R₃ Wasserstoff ist, ist 3-Brompropionsäure. Die Reaktion mit der 3-Bromcarbonsäure der Formel 18 führt zu der Verbindung der Formel 19. Die letztere wird durch Behandlung mit einer Säure zum Erhalt eines 6-Bromthiochroman-4-on-Derivats cyclisiert (worin X S ist) oder eines 6-Bromchromanderivats (wenn X 0 ist) der Formel 20. Die Bromverbindungen der Formel 20 werden dann im wesentlichen derselben Abfolge von Reaktionen unter analogen Bedingungen unterzogen, die in Reaktionsschema 1 für die Umwandlung der Bromverbindungen der Formel 7 zu den Verbindungen der Erfindung beschrieben werden. So werden die Bromverbindungen der Formel 20 zusammengefasst mit (Trimethylsilyl)acetylen zur Bereitstellung von 6-(Trimethylsilyl)ethinyl-substituierten Thiochroman-4-on- oder Chroman-4-on-Verbindungen der Formel 21 umgesetzt. Die 6-(Trimethylsilyl)ethinyl-substituierten Thiochroman-4-on-Verbindungen der Formel 21 werden dann mit einer Base (Kaliumhydroxid oder Kaliumcarbonat) zur Bereitstellung der Ethinyl-substituierten 6-Ethinyl-substituierten Thiochroman-4-one der Formel 22 umgesetzt. Die Verbindungen der Formel 22 werden dann mit dem aromatischen oder heteroaromatischen Reagens X₁-Y(R₂)-A-B' (Formel 10) unter analogen Bedingungen zu denen für die analoge Reaktion des Reaktionsschemas 1 beschriebenen gekoppelt, um Verbindungen der Formel 23 zu ergeben.
Die Verbindungen der Formel 23 werden dann immer noch unter analogen Bedingungen zu den ähnlichen wie im Reaktionsschema 1 beschriebenen Bedingungen mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-Bis(triflormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin umgesetzt, um die 4-Trifluormethylsulfonyloxybenzothiopyran- oder Benzopyranderivate, wie dargestellt in Formel 24, zu ergeben. Die Verbindungen der Formel 24 werden dann in die in Formel 25 dargestellten Verbindungen umgewandelt, indem sie mit einem Organometallderivat umgesetzt werden, das von der Aryl- oder Heteroarylverbindung R₁₄H abgeleitet ist, wie beschrieben ist im Zusammenhang mit Reaktionsschema 1.
Ähnlich wie bei der Verwendung der intermediären 7-Bromtetrahydronaphthalin-1-on-Verbindungen der Formel 7 gemäß Reaktionsschema 1, können die intermediären 6-Bromthiochroman-4-on-Verbindungen von Formel 20 auch für die Herstellung weiterer Verbindungen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden wie unten in Reaktionsschemata 6, 7 und 8 dargestellt. Die Verbindungen der Formel 25 können auch in weitere Homologe und Derivate umgewandelt werden, und zwar in Reaktionen, die zu denen in Zusammenhang mit Reaktionsschema 1 beschriebenen analog sind.
Reaktionsschema 3
Reaktionsschema 3 offenbart einen Syntheseweg zu Verbindungen, bei denen unter Bezugnahme auf Formel 1 X [C(R₁)₂]_n ist, n ist 0 und die Z-Gruppe ist eine Ethinylfunktion (-C≡C-). Gemäß diesem Schema wird ein 6-Brom-2,3-dihydro-1H-inden-1-on-Derivat der Formel 26 in einer Folge von Reaktionen (beginnend mit einer Reaktion mit Trimethylsilylacetylen) umgesetzt, die zu den oben in Verbindung mit Reaktionsschemata 1 und 2 beschriebenen analog sind, um durch Intermediate der Formeln 27 bis 30 die Indenderivate der Formel 31 bereitzustellen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform in dem Umfang des Reaktionsschemas ist das Ausgangsmaterial 6-Brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on, das gemäß der chemischen Literatur zur Verfügung steht (siehe Smith et al., Org. Prep. Proced. Int. 1978 10, 123–131). Verbindungen der Formel 26, wie z. B. 6-Brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on, können auch für die Synthese noch weiterer beispielhafter Verbindungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung, wie unten beschrieben, verwendet werden.
Reaktionsschema 4
Unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 4 wird ein Syntheseweg zu beispielhaften Verbindungen offenbart, worin unter Bezugnahme auf Formel 1 Z -(CR₁=CR₁)_n'- ist, n' ist 3, 4 oder 5 und Y bedeutet eine direkte Valenzbindung zwischen der (CR₁=CR₁)_n'-Gruppe und B. Dieser Syntheseweg wird für Beispiele beschrieben, bei denen die X-Gruppe [C(R₁)₂]_n ist und n ist 1 (Dihydronaphthalinderivate). Nichtsdestotrotz sollte verstanden werden, dass die Reaktionen und Synthesemethodologie, beschrieben im Reaktionsschema 4, und den weiteren folgenden Schemata auch, mit für den Fachmann erkenntlichen Modifikationen – auf Derivate anwendbar ist, bei denen X S, O, NR' (Benzothiopyran-, Benzopyran- oder Dihydrochinolinderivate) oder [C(R₁)₂]_n ist und n ist 0 (Indenderivate).
In Übereinstimmung mit Reaktionsschema 4 wird ein 1,2,3,4-Tetrahydronaphthalinderivat der Formel 32 mit einem Säurechlorid (R₁COCl) unter Friedel Crafts-Bedingungen umgesetzt und das resultierende acetylierte Produkt wird z. B. in einer Jones-Oxidationsreaktion oxidiert, um eine Mischung von isomeren 6- und 7-Acetyl-1(2H)-naphthalenonderivaten der Formel 33 zu ergeben. In einem besonders bevorzugten Beispiel dieser Reaktion ist die Ausgangsverbindung der Formel 32 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalin (eine bekannte Verbindung), die gemäß einem Verfahren hergestellt werden kann, das im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung beschrieben wird. Das 7-Acetyl-1(2H)-naphthalenonderivat der Formel 33 wird mit Ethylenglykol in Gegenwart von Säure umgesetzt, um die Oxofunktion des exocyclischen Ketonbestandteils zu schützen, als Ketalderivat der Formel 34. Das Ketal der Formel 34 wird danach mit einem Grignard-Reagens der Formel R₁₄MgBr umgesetzt (die Symbole sind wie in Verbindung mit Formel 1 definiert), um den tertiären Alkohol der Formel 35 zu ergeben. Danach wird die Dioxolan-Schutzgruppe entfernt und der tertiäre Alkohol wird durch Behandlung mit Säure dehydratisiert, um die 3,4-Dihydro-7-acetylnaphthalinderivate der Formel 36 bereitzustellen. Die Ketonfunktion der Verbindungen der Formel 36 wird einer Horner Emmons- (oder analogen) Reaktion unter stark alkalischen Bedingungen mit einem Phosphonatreagens der Formel 37 unterzogen, um nach Reduktion die Aldehydverbindungen der Formel 38 zu ergeben. Eine weitere Horner Emmons (oder analoge) Reaktion unter stark alkalischen Bedingungen mit einem Reagens der Formel 39 stellt die Verbindungen der Formel 40 bereit. Die letztere kann zu weiteren Homologen und Derivaten gemäß den oben beschriebenen Reaktionen umgewandelt werden. Ein spezifisches Beispiel des Horner Emmons-Reagens der Formel 37, das für die Herstellung einer bevorzugten Verbindung verwendet wird, ist Diethylcyanomethylphosphonat; ein Beispiel für das Horner Emmons-Reagens der Formel 39 ist Diethyl-(E)-3-ethoxycarbonyl-2-methylallylphosphonat.
Reaktionsschema 5
Reaktionsschema 5 offenbart ein Syntheseverfahren für die Herstellung von Verbindungen, bei denen die Z-Gruppe eine Azogruppe ist (-N=N-). Wie im Reaktionsschema 4 wird dieses Verfahren für Beispiele beschrieben, bei denen die X-Gruppe [C(R₁)₂]_n ist und n ist 1 (Dihydronaphthalinderivate). Nichtsdestotrotz sollte verstanden werden, dass die Synthese-Verfahrensweise, die hier beschrieben ist, ebenfalls mit Modifikationen, die dem Fachmann erkenntlich sein werden, auf alle Azoverbindungen zur Verwendung in der Erfindung anwendbar ist, nämlich auf Derivate, bei denen X S, O, NR' (Benzothiopyran-, Benzopyran- oder Dihydrochinolinderivate) oder [C(R₁)₂]_n und n 0 (Indenderivate) ist. So wird eine Nitrogruppe in die Startverbindung der Formel 6 unter im wesentlichen Standardbedingungen einer Nitrierung eingeführt, um das 3,4-Dihydro-7-nitro-1(2H)-naphthalenonderivat der Formel 41 zu ergeben. Letztere Verbindung wird zu dem 3,4-Dihydro-7-amino-1(2H)-naphthalenonderivat der Formel 42 reduziert und danach mit einer Nitrosoverbindung der Formel ON-Y(R₂)-A-B (Formel 43) unter normalerweise verwendeten Bedingungen (Eisessigsäure) zur Herstellung von Azoverbindungen umgesetzt. Die Nitrosoverbindung der Formel 43 kann gemäß den auf dem Gebiet bekannten Reaktionen erhalten werden. Ein spezifisches Beispiel einer solchen Verbindung, die für die Synthese einer bevorzugten Verbindung verwendet wird, ist Ethyl-4-nitrosobenzoat. Die Azoverbindung der Formel 44 wird danach mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin zum Erhalt der 4-Trifluormethylsulfonyloxyderivate, wie dargestellt in Formel 45, umgesetzt. Die Verbindungen der Formel 45 werden dann zu den Azoverbindungen umgewandelt, die in Formel 46 dargestellt sind, durch Reaktion mit einem Organometallderivat, abgeleitet von einer Aryl- oder Heteroarylverbindung R₁₄H. Diese letzteren zwei Reaktionen, nämlich die Konversion zu den 4-Trifluormethylsulfonyloxyderivaten und die darauffolgende Reaktion mit dem Organometallderivat, wurden oben in Verbindung mit Reaktionsschemata 1, 2 und 3 beschrieben und werden in mehreren zur Zeit bevorzugten Syntheseverfahren verwendet, die zu beispielhaften RAR-Antagonistverbindungen führen.
Reaktionsschema 6
Reaktionsschema 6 offenbart ein zur Zeit bevorzugtes Syntheseverfahren zur Herstellung von Verbindungen, bei denen unter Bezugnahme auf Formel 1, die Z-Gruppe COO- oder CONR₁ ist (R₁ ist vorzugsweise H). Diese Ester- und Amidderivate werden aus den 3,4-Dihydro-7-bromnaphthalinderivaten der Formel 16 hergestellt, die wie beschrieben im Reaktionsschema 1 erhalten werden können. So werden die Verbindungen der Formel 16 mit einer starken Base, wie z. B. t-Butyllithium, in einem inerten etherartigen Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, umgesetzt, und zwar bei kalter Temperatur, und Kohlendioxid (CO₂) wird zugesetzt, um die 5,6-Dihydro-2-naphthalincarbonsäurederivate der Formel 47 bereitzustellen. Die Verbindungen der Formel 47 werden dann mit Verbindungen der Formel X₂-Y(R₂)-A-B (Formel 48) umgesetzt, worin X₂ eine OH- oder eine NR₁-Gruppe bedeutet, wobei R₁ vorzugsweise Wasserstoff ist. Der Fachmann wird erkennen, dass die Verbindungen der Formel 48 Aryl- oder Heteroarylhydroxy- oder Amino-Derivate sind, die gemäß dem Stand der Technik erhalten werden können. Die Reaktion zwischen den Verbindungen der Formel 47 und 48 kann unter verschiedenen bekannten Ester- oder Amidbildungsbedingungen durchgeführt werden, wie z. B. Kopplung der zwei in Gegenwart von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid und 4-Dimethylaminopyridin. Alternativ können die Verbindungen der Formel 47 zu dem korrespondierenden Säurechlorid für die Kopplung mit den Verbindungen der Formel 48 in Gegenwart einer Base umgewandelt werden. Die Amid- oder Esterverbindungen der Formel 49 können zu weiteren Homologen und Derivaten wie oben beschrieben umgewandelt werden. Obwohl Reaktionsschema 6 für das Beispiel beschrieben und dargestellt wurde, in dem die X-Gruppe der Formel 1 [C(R₁)₂]_n und n 1 ist (Dihydronaphthalinderivate) kann das hier beschriebene Verfahren an die Herstellung von Benzopyran-, Benzothiopyran-, Dihydrochinolin- und Indenderivaten ebenfalls angepasst werden.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung, bei denen unter Bezugnahme auf Formel 1 Z -OCO-, NR₁CO ist, wie auch die korrespondierenden Thioester- und Thioamid-Analoge können aus den Intermediaten hergestellt werden, abgeleitet von den Verbindungen der Formel 16, bei denen die Bromfunktion durch eine Amino- oder Hydroxylgruppe ersetzt ist und gemäß den Lehren des US-Patents Nr. 5,324,744, dessen Beschreibung durch Inbezugnahme hier ausdrücklich inkorporiert ist.
Reaktionschema 7
Reaktionsschema 7 offenbart ein zur Zeit bevorzugtes Syntheseverfahren für die Herstellung von Verbindungen, bei denen unter Bezugnahme auf Formel 1 Z -(CR₁=CR₁)_n'- und n' 0 ist. Diese Verbindungen der Formel 50 können in einer Kopplungsreaktion zwischen Verbindungen der Formel 16 und einem Grignard-Reagens, abgeleitet von den Halogen-Verbindungen der Formel 10 erhalten werden. Die Kopplungsreaktion wird typischerweise in Gegenwart eines Zinksalzes und eines Nickel(Ni(O))-Katalysators in einem inerten etherartigen Lösungsmittel wie z. B. Tetrahydrofuran durchgeführt werden. Die Verbindungen der Formel 50 können zu weiteren Homologen und Derivaten wie oben beschrieben umgewandelt werden.
Reaktionsschema 8
Unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 8 wird ein zur Zeit bevorzugtes Syntheseverfahren zur Herstellung von Verbindungen offenbart, bei denen Z (CR₁=CR₁)_n'- und n' 1 ist. Insbesondere offenbart Reaktionsschema 8 das zur Zeit bevorzugte Verfahren zur Herstellung derjenigen Verbindungen, die Dihydronaphthalinderivate sind und bei denen die Z-Gruppe eine Vinyl(-CH=CH-)-Funktion repräsentiert. Das hier generisch offenbarte Verfahren kann jedoch mit Modifikationen, die für den Fachmann deutlich sein werden, auf analoge Benzopyran-, Benzothiopyran-, Diphydrochinolin-Verbindungen und Verbindungen, bei denen die Vinylgruppe substituiert ist, ausgedehnt werden. So wird gemäß Reaktionsschema 8 das 7-Brom-1(2H)-naphthalinonderivat der Formel 7 mit einem Vinylderivat der Struktur -CH₂=CH-Y(R₂)-A-B (Formel 51) in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, typischerweise mit der Formel Pd(PPh₃), einem Säureakzeptor (wie z. B. Triethylamin) unter einer inerten Gas(Argon-)Atmosphäre umgesetzt. Die Bedingungen für diese Reaktion sind analog zu der Kopplung der Acetylenderivate der Formel 9 mit dem Reagens der Formel 10 (siehe z. B. Reaktionsschema 1), und diese Reaktionsart ist allgemein als Heck-Reaktion bekannt. Das Vinylderivat der Formel 51 kann gemäß dem Stand der Technik erhalten werden, ein Beispiel für ein solches Reagens, verwendet für die Synthese einer bevorzugten Verbindung, das in der Erfindung verwendet werden kann, ist Ethyl-4-vinylbenzoat.
Das Produkt der Heck-Kopplungsreaktion ist ein Ethinylderivat der Formel 52, das danach zu Verbindungen umgewandelt wird, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und zwar durch Behandlung mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin zum Erhalt der 4-Trifluormethylsulfonyloxyderivate der Formel 53 und darauffolgende Reaktion mit einem Organometallderivat, abgeleitet von der Aryl- oder Heteroarylverbindung R₁₄H, wie oben beschrieben. Die resultierenden Verbindungen der Formel 54 können zu weiteren Homologen und Derivaten umgewandelt werden.
Die Verbindungen der Formel 54 können auch durch Syntheseschemata erhalten werden, die eine Wittig- oder Horner-Emmons-Reaktion verwenden. Zum Beispiel kann das Intermediat der Formel 33 (siehe Reaktionsschema 4) mit einem Triphenylphosphoniumbromid(Wittig)-Reagens oder noch bevorzugter mit einem Diethylphosphonat (Horner Emmons)-Reagens der Struktur (EtO)₂PO-CH₂--Y(R₂)-A-B, wie beschrieben für die analogen Horner Emmons-Reaktionen in US-Patent Nr. 5,324,840, dessen Beschreibung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist, umgesetzt werden. Die gerade erwähnte Horner Emmons-Reaktion stellt Intermediat-Verbindungen bereit, die in ihrer Struktur zur Formel 52 analog sind und die zur Verbindung der Formel 54 durch eine Abfolge von Reaktionen umgewandelt werden können, wie beschrieben im Reaktionsschema 8 für die Verbindungen der Formel 52.
Reaktionsschema 9
Eine Anzahl besonders bevorzugter Verbindungen der Erfindung, z. B. die in Formel 5b und Tabelle 1a dargestellten, werden gemäß Reaktionsschema 9 hergestellt. Ein wichtiges Merkmal der gemäß Reaktionsschema 9 hergestellten Verbindungen ist dasjenige, dass die Gruppe X unter Bezugnahme auf Formel 1 S ist und die 2-Stellung des Benzothiopyran-(Thiochromen)rings der Verbindung mit Alkylgruppen substituiert ist.
Unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 9 dient ein 4-Methoxythiophenol der Formel 55 als Ausgangsmaterial. Das 4-Methoxythiophenol der Formel 55 kann mit ein oder mehr R₂-Gruppen, wie definiert in Verbindung mit Formel 1, substituiert sein. Bei der Synthese der bevorzugten Verbindungen gemäß Reaktionsschema 9 ist die R₂-Gruppe der Formel 55 entweder H, Halogen wie z. B. F, oder eine Alkoxygruppe, vorzugsweise Methoxy. Beispiele für Verbindungen der Formel 55, die für die Synthese spezifischer bevorzugter Verbindungen gemäß der Erfindung verwendet werden, sind 4-Methoxythiophenol und 3-Fluor-4-methoxythiophenol. Das Thiophenol der Formel 55 wird mit einer Alkensäure der Formel 56 durch Erwärmung in Piperidin umgesetzt. Diese Reaktion führt zu der Addition des Thiophenols zu der Doppelbindung des Alkensäure (Michael-Addition), um die Verbindungen der Formel 57 zu erhalten. Die Alkensäure der Formel 56 beinhaltet die R₃-Substituenten, die für die hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen Alkyl, bevorzugter Methyl-Gruppen, sind. Ein Beispiel für die Alkensäure der Formel 56 ist 3-Methyl-2-butensäure. Die Reaktion von Thiophenolen der Formel 55 mit 2-Alkensäuren zur Synthese von 2,2-Dimethyl-thiochroman-4-on-Derivaten wird allgemein von Ferreira et al. Synthesis 1987, S. 149 beschrieben.
Die aromatische Säure der Formel 57 wird zu dem korrespondierenden Säurechlorid, z. B. durch Reaktion mit Oxalylchlorid, und das resultierende Säurechlorid wird danach durch Erwärmen in einem inerten Lösungsmittel wie z. B. CH₂Cl₂ in Gegenwart von Zinntetrachlorid (SnCl₄) zum Erhalt von 2,2-disubstituierten Thiochroman-4-on-Verbindungen der Formel 58 cyclisiert. Das 2,2-disubstituierte Thiochroman-4-on der Formel 58 wird mit Bortribromid zur Entfernung der Methylgruppe von der Methoxyfunktion und zum Erhalt des 2,2-disubstituierten 6-Hydroxy-thiochroman-4-ons der Formel 59 umgesetzt. Die Hydroxyverbindung der Formel 59 wird danach mit einem Trifluormethansulfonsäureanhydrid in wasserfreiem Pyridin umgesetzt, um das 6-Trifluormethansulfonyloxyderivat der Formel 60 zu ergeben.
Das 2,2-disubstituierte 6-Trifluormethansulfonyloxythiochroman-4-on der Formel 60, dargestellt im Reaktionsschema 9, wird mit (Trimethylsilyl)acetylen zur Bereitstellung der 2,2-disubstituierten 6-(Trimethylsilyl)ethinylthiochroman-4-on-Verbindungen umgesetzt, die darauf folgend mit einer Base (K₂CO₃) in einem alkoholischen Lösungsmittel, wie z. B. Methanol, zum Erhalt der 2,2-disubstituierten 6-Ethinyl-thiochroman-4-on-Verbindungen der Formel 61 umgesetzt werden. Die Reaktion mit (Trimethylsilyl)acetylen wird im typischen Fall unter Wärme (ungefähr 95°C) in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, typischerweise mit der Formel Pd(PPh₃)₂Cl₂ und einem Säureakzeptor (wie z. B. Triethylamin) unter einer inerten Gas(Argon-)Atmosphäre durchgeführt. Diese Reaktion ist analog zu den Reaktionen der 6-Brom-thiochroman-4-on-Verbindungen der Formel 20 mit (Trimethylsilyl)acetylen, wie dargestellt in Reaktionsschema 2. Danach wird die 2,2-disubstituierte 6-Ethinyl-thiochroman-4-on-Verbindung der Formel 61 mit dem aromatischen oder heteroaromatischen Reagens X₁-Y(R₂)-A-B' (Formel 10, wie oben definiert) unter ähnlichen Bedingungen gekoppelt, wie den für die analogen Reaktionen der Reaktionsschemata 1 und 2 oben beschriebenen, um die Verbindung der Formel 62 zu ergeben. Bei der Synthese der hier beschriebenen besonders bevorzugten Beispiele der Verbindungen der Formel 62, Ethyl-4-iodbenzoat, Ethyl-2- fluor-4-iodbenzoat und Ethyl-6-iodnicotinat, dienen dieser als Beispiele für das Reagens X₁-Y(R₂)-A-B' (Formel 10).
Die Verbindungen der Formel 62 werden dann immer noch unter ähnlichen Bedingungen wie denen der analogen Reaktionen, beschrieben in Reaktionsschemata 1 und 2 mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin zum Erhalt der 4-Trifluormethylsulfonyloxybenzothiopyran-(Thiochromen)-Derivate, dargestellt durch Formel 63, umgesetzt. Die Verbindungen der Formel 63 werden dann zu den in Formel 64 dargestellten Verbindungen umgewandelt, und zwar durch Reaktion mit einem Organometallderivat, abgeleitet von der Aryl- oder Heteroarylverbindung R₁₄H, R₁₄Br oder R₁₄I, wie beschrieben im Zusammenhang mit Reaktionsschema 1 und 2. Beispiele für Reagenzien und Bedingungen, die gemäß Reaktionsschema 9 zur Umwandlung der 4-Trifluormethansulfonyloxy-Verbindungen der Formel 63 zu den bevorzugten Verbindungen der Formel gemäß Formel 64 verwendet werden, sind:
4-Methylbrombenzol, Tetrahydrofuran (THF), t-Butyllithium und Zinkchlorid (ZnCl₂) zum Erhalt des Organometallreagens, gefolgt von Reaktion mit dem 4-Trifluormethylsulfonyloxy (Triflat)-Derivat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0)-Katalysator;
2-Methylthiophen, THF, n-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
Brombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
4-Ethylbrombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
4-iso-propylbrombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
4-t-Butylbrombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
2-Ethylthiophen, THF, n-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
2-t-Butylthiophen, THF, n-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0); und
4-Brom-2-methylpyridin, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0).
Die 4-Aryl- oder 4-Heteroarylbenzothiopyran-(Thiochromen-)Derivate, dargestellt durch Formel 64, sind bevorzugte Verbindungen im Umfang der Erfindung. Besonders bevorzugt ist die R₃-Gruppe bei diesen Verbindungen Methyl. Die Verbindungen der Formel 64 können zu weiteren Homologen oder Derivaten, wie oben beschrieben im Zusammenhang mit den vorstehenden Reaktionsschemata, umgewandelt werden. Eine häufig verwendete Reaktion in diesem Hinblick, die zu einer Anzahl spezifischer beispielhafter Verbindungen der Erfindung führt, ist eine Verseifung eines Alkylesters (B oder B' repräsentiert eine veresterte Carbonsäuregruppe), um eine freie Carbonsäure oder ihr pharmazeutisch akzeptables Salz zu ergeben.
Reaktionsschema 10
Eine Anzahl besonders bevorzugter Verbindungen der Erfindung, dargestellt in Formel 5b und Tabelle 1a, bei denen unter Bezugnahme auf Formel 1 X Ound die 2-Position des Benzopyran(Chromen-)Rings der Verbindungen mit Alkylgruppen substituiert ist, werden gemäß Reaktionsschema 10 hergestellt. Eine 4-Bromphenolverbindung der Formel 65 dient als Ausgangsmaterial und R₂ ist wie im Zusammenhang mit Formel 1 definiert, obwohl vorzugsweise das 4-Bromphenol nicht substituiert ist oder Alkyl-, Halogen- oder Alkoxy-substituiert ist (die R₂-Gruppe symbolisiert Alkyl, Halogen oder Alkoxy). Das 4-Bromphenol der Formel 65 ist acetyliert, um das Acetyloxy-4-brombenzolderivat der Formel 66 bereitzustellen. Das Acetyloxy-4-brombenzolderivat der Formel 66 wird dann einer Neuanordnungsreaktion (Fries-Umordnung) durch Erwärmung mit Aluminiumchlorid (AlCl₃) unterzogen, und die 3-Brom-6-hydroxyacetophenonderivate der Formel 67 bereitzustellen. Die letzteren Verbindungen werden in Piperidin in Gegenwart von Piperidintrifluoracetat mit einem Keton der Formel R₃-CO-R₃ erwärmt, worin die R₃-Gruppe ein Niederalkyl ist, was die 3-Brom-6-hydroxyacetophenonderivate der Formel 67 zu einer Knoevenagel-Kondensation veranlasst, gefolgt von einer Michael-Addition und dadurch zu einer Ringschließung und Bereitstellung der 2,2-Dialkyl-6-brom-chroman-4-on-Derivate der Formel 68.
Die 2,2-Dialkyl-6-brom-chroman-4-on-Derivate der Formel 68 werden dann mit (Trimethylsilyl)acetylen unter ähnlichen Bedingungen umgesetzt, wie diejenigen, die für die Reaktion mit (Trimethylsilyl)acetylen der Bromverbindungen der Formel 15 und 20 in Reaktionsschema 1 bzw. 2 beschrieben wurden sowie für die 6-Trifluorsulfonyloxythiochroman-4-on-Verbindungen der Formel 60 in Reaktionsschema 9. Die resultierenden 2,2-disubstituierten 6-(Trimethylsilyl)ethinyl-chroman-4-on-Verbindungen (nicht dargestellt in Reaktionsschema 10) werden dann mit einer Base (wie bei den vorher beschriebenen analogen Reaktionen) zur Bereitstellung der 2,2-disubstituierten 6-Ethinylchroman-4-on-Verbindungen der Formel 69 behandelt. Die Verbindungen der Formel 69 werden dann mit dem aromatischen oder heteroaromatischen Reagens X₁-Y(R₂)-A-B' (Formel 10, oben definiert) unter ähnlichen Bedingungen umgesetzt wie denjenigen, die für die analogen Reaktionen der Reaktionsschemata 1, 2 und 9 beschrieben wurde, um die Verbindungen der Formel 70 zu ergeben. Beispiele für das Reagens X₁-Y(R₂)-A-B' (Formel 10), verwendet bei der Synthese der hier beschriebenen spezifischen bevorzugten Ausführungsformen der Verbindungen der Formel 70 sind Ethyl-4-iodbenzoat und Ethyl-2-fluor-4-iodbenzoat.
Immer noch unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 10 werden die 6-(Aryl)- oder 6-(Heteroaryl)ethinyl-2,2-disubstituierten Chroman-4-on-Verbindungen der Formel 70 zu den 6-(Aryl)- oder 6-(Heteroaryl)ethinyl-2,2-disubstituierten 4-Trifluormethylsulfonyloxybenzopyran(Chromen)-Derivaten der Formel 71 durch Behandlung mit Natriumbis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin umgewandelt. Dies ist analog zu der Umwandlung der korrespondierenden Thiochroman-4-on-Verbindungen (Formel 62) zu den korrespondierenden 4-Trifluormethylsulfonyloxybenzothiopyran(Thiochromen)-Derivaten der Formel 63. Die 6-(Aryl)- oder 6-(Heteroaryl)ethinyl-2,2-disubstituierten 4-Trifluormethylsulfonyloxybenzopyran(Chromen)-Derivate der Formel 71 werden dann mit einem Organometallderivat umgesetzt, abgeleitet von der Aryl- oder Heteroarylverbindung R₁₄H, R₁₄Br oder R₁₄I, wie oben beschrieben im Zusammenhang mit Reaktionsschemata 1, 2 und 9, um die bevorzugten Verbindungen der Erfindung, wie dargestellt in Formel 72, zu ergeben. Beispiele für Reagenzien und Bedingungen, die gemäß Reaktionsschema 10 verwendet werden, um die 4-Trifluormethansulfonyloxy-Verbindungen der Formel 71 zu bevorzugten Verbindungen der Erfindung gemäß Formel 72 umzuwandeln, sind:
Brombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
4-Methylbrombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
4-Ethylbrombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in der Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0);
4-iso-Propylbrombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0), und
4-t-Butylbrombenzol, THF, t-Butyllithium und ZnCl₂, gefolgt von Reaktion mit dem Triflat in Gegenwart von Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0).
Die bevorzugten 2,2-disubstituierten Benzopyran(Chromen)-Verbindungen der Erfindung, dargestellt durch Formel 72, können wie oben beschrieben in weitere Homologe und Derivate umgewandelt werden. Eine Verseifung der Alkylester, wie dargestellt durch Formel 72, wenn B' eine veresterte Carboxylgruppe bedeutet, ergibt die besonders bevorzugten Carbonsäure- (oder das pharmazeutisch akzeptable Salz)-Verbindungen der Erfindung.
Syntheseverfahren – Aryl- und (3-Oxy-1-propenyl)-substituierte Verbindungen
Die beispielhaften RAR-Antagonistverbindungen der Formel 101 können durch die hier illustrierten Synthesewege hergestellt werden. Der Synthese-Chemiker wird klar erkennen, das die hier dargestellten Bedingungen spezifische Ausführungsformen sind, die auf alle Verbindungen, wie dargestellt durch Formel 101 verallgemeinert werden können.
Reaktionsschema 101
Reaktionsschema 101 illustriert die Synthese von Verbindungen der Formel 101, bei denen X [C(R₁)₂]_n ist, n ist 1, p ist 0 und R₁₇ ist H oder Niederalkyl. Anders ausgedrückt, illustriert Reaktionsschema 101 die Synthese von Verbindungen der Erfindung, bei denen es sich um 3,4-Dihydronaphthalin-Derivate handelt. Gemäß diesem Schema dient eine Tetrahydronaphthalinverbindungen der Formel 103, die in geeigneter Weise mit den R₃- und R₂-Gruppen (wie diese in Verbindung mit Formel 101 definiert sind) substituiert ist, als Ausgangsmaterial. Ein bevorzugtes Beispiel der Formel 103 ist 1,3,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethyl-naphthalin, das in der chemischen Literatur beschrieben ist (Mathur et al. Tetrahedron, 1985, 41: 1509). Ein zur Zeit bevorzugtes Syntheseverfahren für diese Verbindung aus 1-Brom-3-phenylpropan wird ebenfalls im experimentellen Teil der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Die Verbindung der Formel 103 wird in einer Friedel-Craft-Reaktion mit einem Säurechlorid mit der Struktur R₁₆CH₂COCl (R₁₆ ist definiert wie in Verbindung mit Formel 101) umgesetzt und dann mit Chromtrioxid in Essigsäure zur Bereitstellung der isomeren 6- und 7-Acyl-3,4-dihydro-1(2H)-naphthalenon-Derivate oxidiert. Nur das 6-Acylderivat, das vom Standpunkt der vorliegenden Erfindung her von Interesse ist, wird durch die Strukturformel (Formel 104) in Reaktionsschema 101 dargestellt. Bei der Herstellung der zur Zeit bevorzugten Verbindungen dieser Erfindung bedeuten die R₁-Gruppen Methyl, R₂, R₃ und R₁₆ sind H, und daher ist das bevorzugte Intermediat, korrespondierend zu Formel 104, 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalenon.
Die exocyclische Ketonfunktion der Verbindung der Formel 104 wird danach als Ketal geschützt, z. B. durch Behandlung mit Ethylenglykol in Säure, zur Bereitstellung des 1,3-Dioxolanylderivats der Formel 105. Die Verbindung der Formel 105 wird dann mit einem Grignard-Reagens der Formel R₁₄MgBr umgesetzt (R₁₄ ist definiert wie in Verbindung mit Formel 101), um das 1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-naphthalin-Derivat der Formel 106 zu ergeben. Die exocyclische Ketonfunktion der Verbindung der Formel 106 wird dann durch Behandlung mit Säure von Schutzgruppen befreit und dehydratisiert, um die Verbindung der Formel 107 zu ergeben.
Ein alternatives Verfahren zum Erhalt der Verbindungen der Formel 107 aus den Verbindungen der Formel 105 ist die Umsetzung der Verbindungen der Formel 105 mit Natrium(bis(trimethylsilyl)amid und 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin (Tf = SO₂CF₃) in einem inerten etherartigen Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, bei niedrigen Temperaturen (–78°C und 0°C). Diese Reaktion schreitet durch ein Natriumsalzintermediat fort, das in der Regel nicht isoliert wird und im Reaktionsschema 101 nicht dargestellt ist. Die ganze Reaktion führt zu einem Trifluormethylsulfonyloxy-Derivat, das danach mit einem Organometallderivat umgesetzt wird, abgeleitet von der Aryl- oder Heteroaryl-Verbindung R₁₄H, so dass die Formel des Organometallderivats R₁₄Met ist (Met steht für monovalentes Metall), vorzugsweise R₁₄Li (R₁₄ ist definiert wie in Verbindung mit Formel 101). Die Reaktion mit dem Organometallderivat, vorzugsweise Lithiumderivat der Formel R₁₄Li, wird in der Regel in einem inerten etherartigen Lösungsmittel (wie z. B. Tetrahydrofuran) in Gegenwart von Zinkchlorid (ZnCl₂) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (Pd(PPh₃)₄) durchgeführt. Das Organolithium-Reagens R₁₄Li kann, falls es kommerziell nicht erhältlich ist, aus der Verbindung R₁₄H (oder ihrem Halogenderivat R₁₄-X₁, worin X₁ Halogen ist) in einem etherartigen Lösungsmittel gemäß der bekannten Praxis hergestellt werden. Der Temperaturbereich für die Reaktion zwischen dem Reagens R₁₄Li und dem Trifluormethylsulfonyloxy-Derivat liegt allgemein besprochen im Bereich von ungefähr –78 bis 50°C.
Die Verbindungen der Erfindung werden als Ergebnis einer Kondensation zwischen der Ketonverbindung der Formel 107 und einem Aldehyd oder Keton der Formel 108 gebildet. Bei der Herstellung der bevorzugten beispielhaften Verbindungen der Erfindung ist das Reagens der Formel 108 4-Carboxybenzaldehyd (R₁₇-H). Beispiele für andere Reagenzien im Umfang der Formel 108, die geeignet sind für die Kondensationsreaktion und für die Synthese von Verbindungen im Umfang der Erfindung (Formel 101) sind: 5-Carboxy-pyridin-2-aldehyd, 4-Carboxy-pyridin-2-aldehyd, 4-Carboxy-thiophen-2-aldehyd, 5-Carboxy-thiophen-2-aldehyd, 4-Carboxy-furan-2-aldehyd, 5-Carboxy-furan-2-aldehyd, 4-Carboxyacetophenon, 2-Acetyl-pyridin-5-carbonsäure, 2-Acetyl-pyridin-4-carbonsäure, 2-Acetyl-thiophen-4-carbonsäure, 2-Acetyl-thiophen-5-carbonsäure, 2-Acetyl-furan-4-carbonsäure und 2-Acetyl-furan-4-carbonsäure. Die letzteren Verbindungen sind gemäß der chemischen Literatur erhältlich; siehe z. B. Decroix et al., J. Chem. Res. (S), 4: 134 (1978); Dawson et al., J. Med. Chem. 29: 1282 (1983); und Queguiner et al., Bull Soc. Chimique de France Nr. 10, S. 3678–3683 (1969). Die Kondensationsreaktion zwischen den Verbindungen der Formel 107 und 108 wird in Gegenwart einer Base in einem alkoholischen Lösungsmittel durchgeführt. Vorzugsweise wird die Reaktion in Ethanol in Gegenwart von Natriumhydroxid durchgeführt. Der Fachmann wird diese Kondensationsreaktion als Aldol-Kondensation erkennen und im Fall der hier beschriebenen bevorzugten Beispiele (Kondensation eines Ketons der Formel 107 mit einem Aldehyd der Formel 108) als Claisen-Schmidt-Reaktion (siehe March: Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, S. 694–695 McGraw Hill (1968)). Die Verbindungen der Formel 109 liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung und können auch weiteren Transformationen unterzogen werden, was zu zusätzlichen Verbindungen der Erfindung führt. Alternativ kann die A-B-Gruppe der Formel 108 eine Gruppe sein, die im Umfang der Erfindung liegt, wie definiert in Formel 101, nach nur einer oder mehreren synthetischen Transformationen von einer Art, die dem praktizierenden organischen Chemiker wohl bekannt ist. Zum Beispiel kann die an der A-B-Gruppe durchgeführte Reaktion ein Schritt zur Entfernung von Schutzgruppen sein, eine Homologisierung, eine Veresterung, eine Verseifung, eine Amidbildung oder ähnliches.
Allgemein gesprochen können für die Derivatisierung von Verbindungen der Formel 109 und/oder die Synthese von Aryl- und Heteroarylverbindungen der Formel 108, die danach mit den Verbindungen der Formel 107 umgesetzt werden können, wohl bekannte und veröffentlichte allgemeine Prinzipien und Syntheseverfahren verwendet werden, die ebenfalls oben unter dem Untertitel "synthetische Verfahren – arylsubstituierte Verbindungen" beschrieben wurden.
Reaktionsschema 102
Reaktionsschema 102 (Fortsetzung)
Unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 102 wird ein Syntheseweg zu denjenigen Verbindungen der Erfindung beschrieben, worin unter Bezugnahme auf Formel 101 p 0, R₂ in dem aromatischen Teil der kondensierten Ringstruktur OH und R₁₇ OH ist. Der Fachmann wird einfach erkennen, dass diese Verbindungen β-Diketone in Enolform sind. Reaktionsschema 102 beschreibt auch Syntheseverfahren zu denjenigen Verbindungen der Erfindung, worin p 1 ist. Der Fachmann wird einfach erkennen, dass die letzteren Verbindungen Flavone sind. So wird in Übereinstimmung mit diesem Schema ein 1,2,3,4-Tetrahydro-6-methoxynaphthalin-1-on-Derivat der Formel 110 mit Dialkylzink (R₁Zn) in Gegenwart von Titantetrachlorid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. CH₂Cl₂, zum Ersatz der Oxofunktion mit der geminalen Dialkylgruppe R₁R₁ zum Erhalt einer Verbindung der Formel 111, in der R₁ Niederalkyl ist, umgesetzt. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Verbindungen der Erfindung, die gemäß Reaktionsschema 102 hergestellt werden, ist die R₃-Gruppe Wasserstoff und R₁ Methyl. Dementsprechend ist das Dialkylzinkreagens Dimethylzink, und das bevorzugte Ausgangsmaterial der Formel 110 ist 1,2,3,4-Tetrahydro-6-methoxynaphthalin-1-on. Die letztere Verbindung ist kommerziell z. B. von Aldrich Chemical Company erhältlich. Das 1,2,3,4-Tetrahydro-1,2-dialkyl-6-methoxynaphthalin-Derivat der Formel 111 wird danach mit Chromtrioxid in Essigsäure und Essigsäureanhydrid zum Erhalt des 1,2,3,4-Tetrahydro-3,4-dialkyl-7-methoxynaphthalin-1-on-Derivats gemäß Formel 112 oxidiert. Die Ketonverbindung der Formel 112 wird mit einem Grignard-Reagens (R₁₄MgBr, R₁₄ ist wie in Verbindung mit Formel 101 definiert) zum Erhalt eines 1-Hydroxy-1-aryl-3,4-dihydro-3,4-dialkyl-7-methoxynaphthalin-Derivats der Formel 113 umgesetzt. Die Hydroxyverbindung der Formel 113 wird dann einer Eliminierung durch Erwärmung, vorzugsweise in Säure, zum Erhalt der Dihydronaphthalin-Verbindung der Formel 114 unterzogen. Die Methylgruppe wird von der phenolischen Methyletherfunktion der Verbindung der Formel 114 durch Behandlung mit Bortribromid in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. CH₂Cl₂, entfernt und danach wird das phenolische OH mit einem Acylierungsmittel, das die R₁₆CH₂CO-Gruppe einführt, zum Erhalt einer Verbindung der Formel 115 acyliert. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform ist R₁₆ H und daher ist das Acylierungsmittel Acetylchlorid oder Essigsäureanhydrid. Die Acetylierungsreaktion wird in einem basischen Lösungsmittel, wie z. B. Pyridin, durchgeführt. Die acylierte Phenolverbindung der Formel 115 wird mit Aluminiumchlorid bei erhöhter Temperatur umgesetzt, wodurch sie eine Fries-Neuanordnung durchläuft und die 1-Aryl-3,4-dialkyl-3,4-dihydro-6-acyl-7-hydroxynaphthalin-Verbindung der Formel 116 ergibt. Die phenolische Hydroxylgruppe der Verbindung der Formel 116 wird mit dem Acylierungsmittel (wie z. B. einem Säurechlorid), das die CFO-Y(R₂)-A-B-Gruppe einführt, zum Erhalt einer Verbindung der Formel 117 acyliert. In dem Säurechloridreagens Cl-CO-Y(R₂)-A-B (oder einem ähnlichen Acylierungsreagens) haben die Symbole Y, R₂ und A-B die in Zusammenhang mit Formel 101 definierte Bedeutung. Bei der Herstellung einer bevorzugten Verbindung der Erfindung gemäß diesem Schema ist dieses Reagens ClCOC₆H₄COOEt (das Halb-ethylester-Halbsäurechlorid von Terephthalsäure).
Die Verbindung der Formel 117 wird mit einer starken Base, wie z. B. Kaliumhydroxid in Pyridin, umgesetzt, um als Ergebnis einer intramolekularen Claisen-Kondensationsreaktion eine Verbindung der Formel 118 zu ergeben. Die Verbindungen der Formel 118 liegen im Umfang der Erfindung und von Formel 101, wobei es ein OH für den R₂-Substituenten im aromatischen Teil des kondensierten Ringbestandteils gibt, und R₁₇ ist OH. Im Zusammenhang mit der vorstehenden Reaktion (intramolekulare Claisen-Kondensation) und der vorher erwähnten Fries-Neuanordnung wird festgehalten, dass diese wahrscheinlichen Reaktionsmechanismen in dieser Beschreibung zum Zweck der vollständigen Erklärung der hier beschriebenen Reaktionen erwähnt werden und um die Arbeit eines Fachmanns zur Durchführung der hier beschriebenen Reaktionen und Herstellungen der Verbindungen der Erfindung zu erleichtern.
Nichtsdestotrotz wollen die vorliegenden Erfinder nicht an die Reaktionsmechanismen und Theorien gebunden sein, und die hier beanspruchte Erfindung sollte nicht dadurch begrenzt werden.
Die Verbindungen der Formel 118 werden mit einer starken Säure umgesetzt, wie z. B. Schwefelsäure, und zwar in einem geeigneten protonischen Lösungsmittel, wie z. B. Essigsäure, um die Flavonverbindungen der Formel 119 zu ergeben. Die Verbindungen der Formel 119 sind auch Verbindungen der Erfindung innerhalb des Umfangs der Formel 101, worin p 1 ist. Sowohl die Verbindungen der Formel 118 als auch der Formel 119 können weiteren Reaktionen und Transformationen zur Bereitstellung weiterer Homologe und Derivate unterzogen werden, wie oben im Zusammenhang mit Reaktionsschema 101 beschrieben. Dies ist in Reaktionsschema 102 als Umwandlung zu Homologen und Derivaten angegeben.
Reaktionsschema 103
Reaktionsschema 103 (Fortsetzung)
Unter Bezugnahme auf Reaktionsschema 103 wird ein Syntheseweg gezeigt, der zu denjenigen Verbindungen der Erfindung führt, bei denen unter Bezugnahme auf Formel 101 X S, O oder NR' ist, p = 0 und R₁₇ = H oder Niederalkyl. Durch Anwendung der generischen Prinzipien für eine Synthese, die in Reaktionsschema 102 dargestellt sind, kann jedoch das zur Zeit dargestellte Syntheseverfahren durch den Fachmann so modifziert oder angepasst werden, dass ebenfalls Verbindungen der Erfindung erhalten werden, bei denen X S, O oder NR' ist und p = 1, oder bei denen X S, O oder NR' und p = 0, wobei die R₂-Gruppe im aromatischen Teil des kondensierten Ringbestandteils OH und R₁₇ OH ist.
Die Ausgangsverbindung für Reaktionsschema 103 ist ein Phenol-, Thiophenol- oder Anilinderivat der Formel 120. Bei den zur Zeit bevorzugten Verbindungen der Erfindung sind die R₂- und R₁₆-Gruppen beide Wasserstoff und die bevorzugten Ausgangsverbindungen der Formel 120 sind 3-Ethenyl-thiophenol oder 3-Ethenylphenol, die in der chemischen Literatur bekannt sind (Nuyken et al. Polym. Bull (Berlin) 11: 165 (1984)). Zum Zweck der Vereinfachung der vorliegenden Beschreibung kann in der folgenden Beschreibung X als im wesentlichen Schwefel für die Herstellung von Benzothiopyran-derivaten der vorliegenden Erfindung angesehen werden. Man sollte jedoch im Gedächtnis behalten, dass das hier beschriebene Schema auch mit Modifikationen, die für den Fachmann erkennbar sind, für die Herstellung von Benzopyran- (X = O) und Dihydrochinolin- (X = NR') Verbindungen im Umfang der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Auf diese Weise wird die Verbindung der Formel 120 unter basischen Bedingungen mit einer 3-Bromcarbonsäure der Formel 121 umgesetzt. Bei diesem Reaktionsschema haben die Symbole die im Zusammenhang mit Formel 101 beschriebene Bedeutung. Ein Beispiel für das Reagens der Formel 121, worin R₃ Wasserstoff ist, ist 3-Brompropionsäure. Die Reaktion mit der 3-Bromcarbonsäure der Formel 121 führt zu der Verbindung der Formel 122. Die letztere wird durch Behandlung mit Säure zum Erhalt des 7-Ethenyl-thiochroman-4-on-Derivats (worin X = S) oder 7-Ethenyl-chroman-Derivat (worin X 0 ist) der Formel 123 cyclisiert.
Das 7-Ethenyl-thiochroman-4-on- oder 7-Ethenyl-chroman-4-on-Derivat der Formel 123 wird in Gegenwart von Pd(II)Cl₂- und CuCl₂-Katalysatoren zur Bereitstellung der korrespondierenden 7-Acyl-(Keton-)Verbindung der Formel 124 oxidiert. Der Fachmann wird die letzte Reaktion als Wacker-Oxidation erkennen. Die exocyclische Ketongruppe der Verbindung der Formel 124 wird in Form eines Ketals geschützt, z. B. durch Behandlung mit Ethylenglykol in Säure, um das 1,3-Dioxolanyl-Derivat der Formel 125 bereitzustellen. Danach wird die Verbindung der Formel 125 einer Abfolge von Reaktionen unterzogen, die zu denen analog sind, die für die Verbindungen der Formel 105 in Reaktionsschema 101 beschrieben wurden. So wird das 1,3-Dioxolanylderivat der Formel 125 mit einem Gridnard-Reagens der Formel R₁₄MgBr zum Erhalt des tertiären Alkohols der Formel 126 umgesetzt, die danach in Säure dehydratisiert wird, um das Benzothiopyran- (X ist S), Benzopyran- (X ist O) oder Dihydrochinolin- (X ist NR') Derivat der Formel 127 bereitzustellen. Die Ketonverbindung der Formel 127 wird dann in Gegenwart einer Base mit dem Reagens der Formel 108 in einer Aldol-Kondensation (Claisen-Schmidt) zur Bereitstellung von Verbindungen der Erfindung gemäß Formel 128 umgesetzt. Die Verbindungen der Formel 128 können zu weiteren Homologen und Derivaten umgewandelt werden, wie beschrieben oben in Verbindung mit Reaktionsschemata 101 und 102.
Spezifische Beispiele
2-Hydroxy-2-methyl-5-phenylpentan
Zu einer Mischung aus Magnesiumspänen 13,16 g, (0,541 mol) in 200 ml wasserfreiem Et₂O wurden 100,0 g (0,492 mol) 1-Brom-3-phenylpropan als Lösung in 100 ml Et₂O zugefügt. Nachdem 5 bis 10 ml der Lösung zugefügt worden waren, wurde die Addition beendet, bis die Bildung des Grignard-Reagens im Fortschreiten war. Das verbleibende Bromid wurde dann über 1 h verteilt zugefügt. Das Grignard-Reagens wurde 20 min bei 35°C gerührt und dann wurden 31,64 g (0,541 mol) Aceton über eine 45-minütige Zeitspanne zugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur vor einer Abkühlung auf 0°C gerührt und durch vorsichtige Zugabe von 20%iger HCl angesäuert. Die wässrige Schicht wurde mit Et₂O (3 × 200 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit Wasser gewaschen und mit gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck und Destillation des Rests ergab 63,0 g (72%) des Produkts als schwach-gelbes Öl, Siedepunkt 99–102°C/0,5 mm Hg. 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 7,28–7,18 (5H, m), 2,63 (2H, t, J = 7,5 Hz), 1,68 (2H, m), 1,52 (2H, m), 1,20 (6H, s).
1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalin
Eine Mischung aus P₂O₅ (55,3 g, 0,390 mol) in 400 ml Methansulfonsäure wurde auf 105°C unter Argon erwärmt, bis sich der Feststoff vollständig gelöst hatte. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und 2-Hydroxy-2-methyl-5-phenylpentan (63,0 g, 0,354 mol) wurden langsam unter Rühren zugefügt. Nach 4 Stunden wurde die Reaktion durch sorgfältiges Gießen der Lösung auf 1 l Eis gelöscht. Die resultierende Mischung wurde mit Et₂O (4 × 125 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit Wasser, gesättigem wässrigen NaHCO₃, Wasser und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Konzentration der Lösung bei reduziertem Druck, gefolgt von Destillation ergab 51,0 g (90%) des Produkts als klares farbloses Öl,
Schmelzpunkt 65–67°C/1,1 mm Hg. 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 7,32 (1H, d, J = 7,4 Hz), 7,16–7,05 (3H, M), 2,77 (2H, t, J = 6,3 Hz), 1,80 (2H, m), 1,66 (2H, m), 1,28 (6H, s).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naphthalinon (Verbindung A)
Eine Lösung aus 350 ml Eisessigsäure und 170 ml Essigsäureanhydrid wurde auf 0°C abgekühlt und CrO₃, 25,0 g (0,25 mol) vorsichtig in kleinen Portionen zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 30 min gerührt, bevor 120 ml Benzol zugefügt wurden. 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalin wurde langsam als Lösung in 30 ml Benzol zugefügt. Nach Abschluss der Zugabe wurde die Reaktionsmischung 4 h bei 0°C gerührt. Die Lösung wurde mit H₂O (200 ml) verdünnt und mit Et₂O (5 × 50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigtem wässrigen NaCO₃ und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und eine Destillation ergaben 16,0 g (74%) des Produkts als schwachgelbes Öl,
Schmelzpunkt: 93–96°C/0,3 mm Hg 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 8,02 (1H, dd, J = 1,3, 7,8 Hz), 7,53 (1H, m), 7,42 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,29 (1H, m), 2,74 (2H, t, J = 6,8 Hz), 2,02 (2H, t, J = 6,8 Hz), 1,40 (6H, s).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)-naphthalinon (Verbindung B)
Ein 100 ml-Dreihalskoben, versehen mit einem effizienten Rückflusskondensator und einem Trockenrohr sowie einem Zugabetrichter wurde mit einer Mischung aus AlCl₃, 9,5 g (71,4 mmol) und 3 ml CH₂Cl₂ beladen. Das 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-naphthalinon (5,0 g, 28,7 mmol) wurde tröpfchenweise unter Rühren (Vorsicht: exotherme Reaktion!) zu der Mischung bei Raumtemperatur zugefügt. Brom, 5,5 g (34,5 mmol), wurde dann sehr langsam zugefügt und die resultierende Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. (Merke: Wenn das Rühren endet, kann die Mischung auf 70°C erwärmt werden, bis das Rühren wieder aufgenommen wird). Die Reaktion wurde dann durch langsame Zugabe von eiskalter 6 M HCl gelöscht. Die Mischung wurde mit Et₂O extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigtem wässrigen NaHCl₃ und gesättigtem NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck und Destillation des Rests ergab 5,8 g (80%) des Produkts als schwachgelbes Öl, das sich bei Stehen festigte. Schmelzpunkt: 140°C/0,4 mm Hg. 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 8,11 (1H, d, J = 30 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 3,0, 9,0 Hz), 7,31 (1H, d, J = 9,0 Hz), 2,72 (2H, t, J = 6,0 Hz), 2,01 (2H, t, J = 6,0 Hz), 1,28 (6H, s).
1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalin (Verbindung C)
Zu einer Mischung aus Magnesiumspänen (648,0 mg, 27,0 mmol) in 25 ml THF wurde eine Lösung von 4-Bromtoluol (5,40 g, 31,8 mmol) in 10 ml THF in zwei Teilen zugefügt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml der Lösung initiiert, gefolgt von langsamer Zugabe der verbliebenen Lösung über einen Zugabetrichter. Die Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt und dann wurde die Lösung in einen zweiten Kolben unter Verwendung einer Kanüle übertragen. Zu dem resultierenden Grignard-Reagens wurden 4,0 g (15,9 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)-naphthalinon (Verbindung B) als Lösung in 15 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde im Rückfluss über Nacht erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion wurde durch sorgfältige Zugabe von eiskalter 10%iger HCl gelöscht. Einer Extraktion mit Et₂O folgt ein Waschen der kombinierten organischen Schicht mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl, dann Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab ein Öl, das das Produkt als farblosen Feststoff nach Säulenchromatographie ergab (Hexane/EtOAc, 96 : 4).
1^H-NMR (CDCl₃) δ: 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 7,6 Hz), 7,26 (3H, m), 7,12 (3H, s), 2,34 (3H, s), 2,24–2,04 (2H, m), 1,81 (1H, m), 1,55 (1H, m), 1,35 (3H, s), 1,30 (3H, s).
3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalin (Verbindung D)
Ein Kolben, ausgerüstet mit einer Dean-Stark-Falle wurde mit 3,4 g (9,85 mmol) 1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalin (Verbindung C) und 40 ml Benzol beladen. Eine katalytische Menge p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat wurde zugefügt und die resultierende Lösung im Rückfluss 2 h erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde Et₂O zugefügt und die Lösung wurde mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaHCO₃ und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und dann über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und eine Säulenchromatographie (100 Hexan/Silikagel) ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 7,32 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,21 (5H, m), 7,15 (1H, d, J = 2,1 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,40 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,30 (6H, s).
7-Ethinyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaphthalin-1(2H)-on (Verbindung E)
Zu einer Lösung (durchströmt über 15 min mit einem Argonstrom) von 7 g (27,6 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1(2H)-naphthalinon (Verbindung B) in 150 ml Triethylamin wurden 0,97 g (1,3 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid und 0,26 g (1,3 mmol) Kupferiodid zugefügt. Die Lösungsmischung wurde mit Argon 5 min durchströmt und dann wurden 39 ml (36,6 mmol) (Trimethylsilyl)acetylen zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Druckrohr versiegelt und in einem vorerwärmten Ölbad (100°C) 24 h gehalten. Die Reaktionsmischung wurde dann durch Celite gefiltert, mit Et₂O gewaschen und das Filtrat im Vakuum konzentriert, um rohes 7-(Trimethylsilyl)ethinyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnaphthalin-1(2H)-on zu ergeben. Zu einer Lösung dieser rohen TMS-acetylenischen Verbindung in 50 ml Methanol wurden 0,6 g (4,3 mmol) K₂CO₃ zugefügt. Die Mischung wurde 8 h bei Umgebungstemperatur gerührt und dann gefiltert. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, mit Et₂O verdünnt, mit Wasser gewaschen sowie mit 10%iger HCl und Sole, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung durch Säulenchromatographie (Silika, 10% EtOAc-Hexan) ergab die Titelverbindung als weißen Feststoff. PMR (CDCl₃) δ: 1,39 (6H, s), 2,02 (2H, t, J = 7,0 Hz), 2,73 (2H, t, J = 7,0 Hz), 3,08 (1H, s), 7,39 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 8,14 (1H, d, J = 9 1,8 Hz).
Ethyl-4-iodbenzoat
Zu einer Suspension aus 10 g (40,32 mmol) 4-Iodbenzoesäure in 100 ml Ethanol abs. wurden 2 ml Thionylchlorid zugefügt und die Mischung wurde dann 3 h im Rückfluss erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rest in 100 ml Ether gelöst. Die Etherlösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ und gesättigten NaCl-Lösungen gewaschen und getrocknet (MgSO₄). Dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rest Kugelrohr destilliert (100°C, 0,55 mm), um die Titelverbindung als farbloses Öl zu ergeben, PMR (CDCl₃) δ: 1,42 (3H, t, J ~ 7 Hz), 4,4 (2H, q, J ~ 7 Hz), 7,8 (4H).
6-Iodnicotinsäure
Natriumiodid (20,59 g, 137,40 mmol) wurde auf –78°C unter Argon abgekühlt und dann wurde Hydroiodidsäure (97,13 g, 759,34 mmol) zugefügt. Das Kühlbad wurde entfernt und die Suspension wurde 5 min gerührt. Zu dieser Mischung wurde 6-Chlornicotinsäure (22,09 g, 140,20 mmol) zugefügt und die resultierende Mischung wurde langsam unter Rühren auf Umgebungstemperatur erwärmt. Die Mischung wurde 24 h bei 125°C im Rückfluss erwärmt, auf Umgebungstemperatur abgekühlt und in Aceton (500 ml) bei 0°C gegossen. Der gelbe Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und mit 200 ml 1 N wässriger NaHSO₃-Lösung gewaschen. Die Umkristallisierung aus Methanol (Kristalle wurden Ethylether gewaschen) ergab die Titelverbindung als weiße Kristalle: Schmelzpunkt 177–179°C [lit. Schmelzpunkt 187–192, Newkome et al. "Reductive Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives" J. Org. Chem. 51: 953–954 (1986). 1^H-NMR (DMSO-d₆) δ: 8,81 (1H, dd, J = 0,8, 2,4 Hz), 8,01 (1H, dd, J = 0,8, 8,2 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 2,4, 8,2 Hz).
Ethyl-6-iodnicotinoat
Zu einer Suspension aus 6-Iodnicotinsäure (23,38 g, 94,20 mmol) in Dichlormethan (100 ml) wurde eine Lösung aus 1-(3-Diemthylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (19,86 g, 103,6 mmol) in Dichlormethan (250 ml) zugefügt. Zu dieser Mischung wurde Ethanol (12,40 g, 269,27 mmol), gefolgt von Dimethylaminopyridin (1,15 g, 9,41 mmol) zugefügt. Die Mischung wurde für 24,5 h auf 50°C erwärmt, im Vakuum konzentriert und mit Wasser (200 ml) verdünnt, dann mit Ethylether (550 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und zu einem gelben Feststoff konzentriert. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie (Silika, 10% EtOAc-Hexan) ergab die Titelverbindung als weiße Nadeln: Schmelzpunkt 48–49°C; 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 8,94 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,91 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,85 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung F)
Zu einer Lösung von 4 g (21,7 mmol) 7-Ethinyl-3,4-dihydro-4,4-dimethylnapthalin-1(2H)-on (Verbindung E), 15 min mit einem Argonstrom durchströmt und 6 g (21,7 mmol) Ethyl-4-iodbenzoat in 100 ml Triethylamin wurden 5 g (7,2 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid und 1,4 g (7,2 mmol) Kupferiodid zugefügt. Die Mischung wurde mit Argon 5 min durchströmt und dann bei Umgebungstemperatur 18 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Celite gefiltert und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie (Silika, 10% EtOAc-Hexan) ergab die Titelverbindung als weißen Feststoff. PMR (CDCl₃) δ: 1,41 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,41 (6H, s), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,2 Hz), 7,44 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,68 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 8,04 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,15 (1H, d, J = 1,8 Hz).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl(ethinyl]benzoat (Verbindung G)
Zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 291,6 mg (1,59 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 5,6 ml THF wurde eine Lösung aus 500,0 mg (1,44 mmol) Ethyl-4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung F) in 4,0 ml THF zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei –78°C für 35 min gerührt und dann wurde eine Lösung aus 601,2 mg (1,59 mmol) 5-Chlor(2-bis-trifluormethylsulfonyl)imid in 4,0 ml THF zugefügt. Nach Rühren für 1 h bei –78°C wurde die Lösung auf 0°C erwärmt und 2 h gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Mischung wurde mit EtOAc (50 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5%igem wässrigen NaOH, Wasser und Sole gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet und dann im Vakuum zu einem gelben Öl konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (Silika, 7% EtOAc-Hexane) ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 8,04 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,60 (2H, dd, J = 1,8, 8,4 Hz), 7,51 (2H, m), 7,32 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,02 (1H, t, J = 5,0 Hz), 2,44 (2H, d, J = 5,0 Hz), 1,43 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1)
Eine Lösung aus 4-Lithiotoluol wurde durch Zugabe von 189,9 mg (1,74 ml, 2,96 mmol) t-Butyllithium (1,7 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 253,6 mg (1,482 mmol) 4-Bromtoluol in 2,0 ml THF hergestellt. Nach einem Rühren für 30 min wurde eine Lösung aus 269,4 mg (1,977 mmol) Zinkchlorid in 3,0 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 30 min gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus 472,9 mg (0,988 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) und 50 mg (0,04 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 4,0 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 50°C für 45 min erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigtem wässrigen NH₄Cl verdünnt. Die Mischung wurde mit EtOAc (40 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Sole gewaschen. Die organische Phase wurde mit Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem gelben Öl konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (Silika, 5% EtOAc-Hexane) ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff.
1^H-NMR (d₆-Aceton) δ: 1,35 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,42 (3H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,25 (5H, m), 7,35 (2H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-phenyl-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1a)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 203,8 mg (0,43 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)-oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 58,2 mg (0,36 ml, 0,69 mmol) von Phenyllithium (1,8 M Lösung in Cyclohexan/Et₂O), 116,1 mg (0,85 mmol) Zinkchlorid und 13,8 mg (0,01 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) umgewandelt. PMR (CDCl₃) δ: 1,36 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,02 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,20 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,27 (1H, m), 7,39 (6H, m), 7,52 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 2)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Methyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 284, 8 mg (2, 090 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0, 02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 3-Methylphenyllithium umgewandelt (hergestellt durch Zugabe von 201,2 mg (1,86 ml, 3,14 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 274,0 mg (1,568 mmol) 3-Methylbrombenzol in 2,0 ml THF hergestellt) umgewandelt. 1^H-NMR (CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39–7,14 (7H, m), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 3)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 200,0 mg (0,418 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 199,4 mg (1,463 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 4,0 ml THF und 2-Methylphenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 133,9 mg (1,23 ml, 2,09 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 178,7 mg (1,045 mmol) 2-Methylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. ¹H NMR (CDCl₃) δ: 7,97 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,49–7,19 (6H, m), 6,81 (1H, d, J = 1,6 Hz), 5,89 (1H, t, J = 4,5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,43–2,14 (2H, dq, J = 3,7, 5,4 Hz), 2,15 (3H, s), 1,39–1,34 (9H, m).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3,5-dimethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 4)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250 mg (0,522 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 3,5-Dimethylphenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 249,0 mg (1,305 mmol) 3,5-Dimethylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt.
1H NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40–7,33 (2H, m), 7,20 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,00 (1H, s), 6,97 (2H, s), 5,97 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,36 (6H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-ethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 5)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-napthalenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 4-Ethylphenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 244,0 mg (1,305 mmol) 4-Ethylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt.
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,42–7,24 (7H, m), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,71 (2H, q, J = 7,6 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-(1,1-dimethylethyl)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 6)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 4-tert-Butylphenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) tert-Butyllithium (1,5 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 167,0 mg (0,78 mmol) 4-tert-Butylbrombenzol in 1,0 ml THF) umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,28–7,45 (7H, m), 6,02 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,36 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,59 (3H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,39 (9H, s), 1,35 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 7)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 4-Chlorphenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 252,4 mg (1,3,05 mmol) 4-Chlor-1-brombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. ¹-NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40–7,27 (6H, m), 7,12 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,00 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxyphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 8)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 4-Methoxyphenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 244,1 mg (1,305 mmol) 4-Methoxy-1-brombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,40–7,21 (5H, m), 6,95 (2H, d, J = 8,7 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 4,34 (3H, s), 2,34 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-trifluormethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 9)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahren wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 249,0 mg (1,827 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 4-Trifluormethylphenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 167,7 mg (1,54 ml, 2,62 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 296,6 mg (1,305 mmol) 4-Trifluormethylbrombenzol in 2,0 ml THF) umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,67 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,54–7,36 (6H, m), 7,10 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,06 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 10)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 2-Lithiopyridin (hergestellt durch Zugabe von 100,6 mg (0,97 ml, 1,57 mmol) tert-Butyllithium (1,5 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 123,8 mg (0,784 mmol) 2-Brompyridin in 1,0 ml THF) umgewandelt. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 8,64 (1H, m), 7,99 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,85 (1H, ddd, J = 1,8, 7,7, 9,5 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,50 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,47 (2H, d, J = 1,1 Hz), 7,35 (2H, m), 6,32 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,42 (2H, d, J = 7, 4 Hz), 1,35 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,35 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 11)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 170,0 mg (0,35 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 3-Lithiopyridin (hergestellt durch Zugabe von 100,2 mg (0,92 ml, 1,56 mmol) tert-Butyllithium (1,5 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 123,8 mg (0,784 mmol) 3-Brompyridin in 1,0 ml THF) umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,63–8,61 (2H, dd, J = 1,7 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,67 (1H, dt, J = 7,9 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43–7,34 (3H, m), 7,10 (1H, d, J = 1,6 Hz), 6,07 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,390 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methyl-5-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 12)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,522 mmol) Ethyl-4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid und 2-Methyl-5-lithiopyridin (hergestellt durch Zugabe von 100,5 mg (0,92 ml, 1,57 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 134,8 mg (0,784 mmol) 2-Methyl-5-brompyridin in 1,0 ml THF) umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,50 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,99 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,56 (1H, dd, J = 2,3, 8,0 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 2,3, 8,0 Hz), 7,37 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,21 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,11 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,63 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2-dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung H)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) wurden 150,0 mg (0,314 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 150,0 mg (1,10 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 3-((2,2-Dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 100,2 mg (0,92 ml, 1,564 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 226,0 mg (0,787 mmol) 3-((2,2-Dimethylethyl)-dimethylsiloxy)brombenzol in 2,0 ml THF umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40–7,22 (4H, m), 6,95 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,84–6,82 (2H, m), 6,00 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (3H, s), 0,99 (9H, s), 0,23 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2-dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung I)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahren wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 210,0 mg (0,439 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 209,0 mg (1,53 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 4-((2,2-Dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyllithium (hergestellt durch Zugabe von 140,3 mg (1,30 ml, 2,19 mmol) tert-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 315,0 mg (1,09 mmol) 4-((2,2-Dimethylethyl)-dimethylsiloxy)brombenzol in 2,0 ml THF umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,39–7,25 (3H, m), 7,21 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,87 (2H, d, J = 8,5 Hz), 5,96 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s), 1,01 (9H), s), 0,25 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-hydroxyphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 13)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2-dimethylethyl)-dimethylsiloxy)phenyl)-2-napthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung H), 60,0 mg (0,114 mmol) in 1,0 ml THF bei Raumtemperatur wurden 91,5 mg (0,35 ml, 0,35 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid (1 M Lösung in THF) zugefügt. Nach einem Rühren über Nacht wurde die Lösung mit EtOAc verdünnt und mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen vor einem Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (4 : 1, Hexane : EtOAc) ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,39–7,21 (4H, m), 6,93 (1H, d, J = 7,5 Hz), 6,84 (1H, d, 7,1 Hz), 6,83 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,91 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-hydroxyphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 14)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2-dimethylethyl)dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung I), 50,0 mg (0,095 mmol) in 1,0 ml THF bei Raumtemperatur wurden 73,2 mg (0,29 ml, 0,29 mmol) Tetrabutylammoniumfluorid (1 M Lösung in THF) zugefügt. Nach einem Rühren über Nacht wurde die Lösung mit EtOAc verdünnt und mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen vor einem Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (4 : 1, Hexane : EtOAc) ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,41–7,20 (5H, m), 6,88 (2H, d, J = 8,4 Hz), 5,96 (1H, t, J = 4,5 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,34 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 15)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 264,0 mg (0,552 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 150,0 mg (1,10 mmol) Zinkchlorid, 14 mg (0,012 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 4,0 ml THF und 5-Methylthiazol-2-yl-lithium (hergestellt durch Zugabe von 53,2 mg (0,53 ml, 0,83 mmol) n-Butyllithium (1,55 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 82,0 mg (0,83 mmol) 5-Methylthiazol in 5,0 ml THF) umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,88 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,55 (2H, d, J = 7,8 Hz), 7,54 (1H, s), 7,45 (1H, dd, J = 1,5, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,48 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,51 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (3H, s), 1,32 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 15a)
Eine Lösung von 2-Lithiothiazol wurde durch Zugabe von 41,2 mg (0,42 ml, 0,63 mmol) n-Butyllithium (1,5 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 53,4 mg (0,63 mmol) Thiazol in 1,0 ml THF hergestellt. Die Lösung wurde 30 min gerührt und dann wurde eine Lösung aus 113,9 mg (0,84 mmol) Zinkchlorid in 1,5 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 30 min gerührt und dann wurde Organozink über eine Kanüle zu einer Lösung aus 200,0 mg (0,42 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) und 12,4 mg (0,01 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 1,5 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde 45 min auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigtem wässrigen NH₄Cl verdünnt. Die Mischung wurde mit EtOAc (40 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Sole gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zu einem gelben Öl konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (Silika, 20% EtOAc-Hexane) ergab die Titelverbindung als farbloses Öl. PMR (CDCl₃) δ: 1,35 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,57 (1H, t, J = 4,8 Hz), 7,33 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,92 (1H, d, J = 3,3 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 16)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahren wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 295,0 mg (0,617 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5- dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl)benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 168,0 mg (1,23 mmol) Zinkchlorid, 16 mg (0,014 mmol) Tetrakis)triphenylphosphin)palladium(0) in 6,0 ml THF und 4-Methylthiazol-2-yllithium (hergestellt durch Zugabe von 59,6 mg (0,60 ml, 0,93 mmol) tert-Butyllithium (1,55 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 92,0 mg (0,93 mmol) 4-Methylthiazol in 6,0 ml THF umgewandelt. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,80 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,87 (1H, s), 6,52 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,54 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,2 Hz), 1,33 (3H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 17)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 200,0 mg (0,418 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 110,0 mg (0,84 mmol) Zinkchlorid, 12 mg (0,011 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 4,5-Dimethylthiazol-2-yllithium (hergestellt durch Zugabe von 40,2 mg (0,39 ml, 0,63 mmol) n-Butyllithium (1,55 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 71,0 mg (0,063 mmol) 4,5-Dimethylthiazol in 2,0 ml THF umgewandelt.
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,82 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,54 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,45 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,41 (3H, s), 2,40 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methyl-5-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 18)
Eine Lösung aus 81,7 mg (0,194 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methyl-5-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 12) und 40,7 mg (0,969 mmol) LiOH-H₂O in 3 ml THF/Wasser (3 : 1, V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zum Erhalt der Titelverbindung als farblosen Feststoff konzentriert. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 8,41 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,63 (1H, dd, J = 2,3, 7,9 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, m), 7,33 (1H, d, J = 7,8 Hz), 6,95 (1H, s), 6,11 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,52 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,31 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 19)
Eine Lösung aus 80,0 mg (0,196 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 10) und 20,6 mg (0,491 mmol) LiOH-H₂O in 3 ml THF/Wasser (3 : 1, V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum zum Erhalt der Titelverbindung als farbloser Feststoff konzentriert. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 8,64 (1H, m), 7,94 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,87 (1H, dt, J = 1,7, 7,8 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,47 (2H, s), 7,37 (1H, m), 7,25 (1H, s), 6,30 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,39 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,31 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 20)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 2) 30,0 mg (0,071 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernen der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,46 (2H, s), 7,32–7,13 (4H, m), 7,10 (1H, s), 6,98 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,34 (3H, s), 2,31 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,30 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-ethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 21)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-ethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 5) 47,0 mg (0,108 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 28,0 mg (0,70 mmol, 0,7 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29–7,21 (4H, m), 7,02 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,64 (2H, q, J = 7,5 Hz), 2,33 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,29 (6H, s), 1,22 (3H, t, J = 7,5 Hz).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxyphenyl)-2-naphthalinyl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 22)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methoxyphenyl)-2-naphthalinyl]ethinyl]benzoat (Verbindung 8), 80,0 mg (0,183 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 40,0 mg (1,00 mmol, 1,0 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,45 (2H, s), 7,24 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,02–6,89 (3H, m), 5,98 (1H, t, J = 4,4 Hz), 3,79 (3H, s), 2,31 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,29 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-trifluormethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 23)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-trifluormethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 9), 70,0 mg (0,148 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,80 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,61–7,47 (6H, m), 6,97 (2H, s), 6,16 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,30 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(3,5-dimethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 24)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3,5-trimethylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 4), 90,0 mg (0,207 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,45 (2H, s), 7,00 (1H, s), 6,97 (1H, s), 5,97 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,31 (2H, d, J = 4,5 Hz), 2,30 (6H, s), 1,29 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 25)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-chlorphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 7), 80,0 mg (0,181 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51–7,48 (4H, m), 7,34 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,97 (1H, s), 6,07 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,34 (2H, d, J = 4,6 Hz), 1,29 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl)benzoesäure (Verbindung 26)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-pyridyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 11), 45,0 mg (0,110 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 48,0 mg (1,20 mmol, 1,20 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 8,60 (1H, d, J = 4,6 Hz), 8,55 (1H, s), 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,76 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51–7,46 (3H, m), 6,94 (1H, s), 6,14 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,31 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 27)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 3), 80,0 mg (0,190 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO) δ: 7,89 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,46 (2H, s), 7,29–7,14 (4H, m), 6,59 (1H, s), 5,90 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,39 (2H, m), 2,60 (3H, s), 1,39 (3H, s), 1,29 (3H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-hydroxyphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 28)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(3-((2,2-dimethylethyl)-dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung H), 40,0 mg (0,076 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 40,0 mg (1,00 mmol, 1,00 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,49 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,35 (2H, s), 7,15–7,07 (2H, m), 6,77–6,69 (3H, m), 5,92 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,25 (2H, d, J = 9,7 Hz), 1,23 (6H, s).
4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-hydroxyphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 29)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-((2,2-dimethylethyl)-dimethylsiloxy)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung I), 75,0 mg (0,143 mmol) in 3 ml EtOH und 2 ml THF wurden 60,0 mg (1,50 mmol, 1,50 ml) NaOH (1,0 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 10%iger HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (2H, s), 7,20–7,17 (3H, m), 6,92–6,89 (2H, m), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,34 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methylthiazol-2-yl)-2-napthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 15) (100 mg, 0,23 mmol) und 4 ml EtOH bei Raumtemperatur wurde wässriger NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde für 1 h auf 50°C erwärmt und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde in einer Lösung aus CH₂Cl₂ und Ether (5 : 1) suspendiert und mit 1 M wässriger HCl auf pH 5 angesäuert. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit Sole gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und die Lösungsmittel bei reduziertem Druck zum Erhalt der Titelverbindung als weißen Feststoff entfernt. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 7,96 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,95 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,64 (1H, s), 7,53 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6,59 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,50 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,5 Hz), 1,27 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a)
Eine Lösung aus 33,9 mg (0,08 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 15a) und 8,5 mg (0,20 mmol) LiOH-H₂O in 3 ml THF/Wasser (3 : 1, V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Sole gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben.
PMR (d₆-DMSO) δ: 1,29 (6H, s), 2,42 (2H, d, J = 4,6 Hz), 6,68 (1H, t, J = 4,6 Hz), 7,51 (2H, m), 7,62 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,77 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,93 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,98 (1H, d, J = 3,3 Hz).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 31)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 16) (145,0 mg, 0,34 mmol) und 4 ml EtOH bei Raumtemperatur wurde wässriges NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde 1 h auf 50°C erwärmt und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde in einer Lösung aus CH₂Cl₂ und Ether (5 : 1) suspendiert und mit 1 M wässriger HCl auf pH 5 angesäuert. Die Schichten wurden getrennt, die organische Schicht mit Sole gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und die Lösungsmittel bei reduziertem Druck zum Erhalt der Titelverbindung als weißen Feststoff entfernt. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 7,94 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,87 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,27 (1H, s), 6,58 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,43 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,26 (6H, s).
4-[5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 32)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 17) (58,0 mg, 0,13 mmol) und 4 ml EtOH bei Raumtemperatur wurde wässriges NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde 1 h auf 50°C erwärmt und im Vakuum konzentriert. Der Rest wurde in einer Lösung aus CH₂Cl₂ und Ether (5 : 1) suspendiert und mit 1 M wässriger HCl auf pH 5 angesäuert. Die Schichten wurden getrennt, die organische Schicht mit Sole gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄), gefiltert und die Lösungsmittel bei reduziertem Druck zum Erhalt der Titelverbindung als weißen Feststoff entfernt. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 7,94 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,86 (1H, d, J = 1, 6 Hz), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,50 (1H, dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,51 (1H, t, J = 4,9 Hz), 2,37 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,6 Hz), 2,32 (3H, s), 1,26 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methyl-2-thienyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 33)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 170,0 mg (0,366 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 202,0 mg (1,48 mmol) Zinkchlorid, 24 mg (0,022 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF und 5-Methyl-2-lithiothiophen (hergestellt durch Zugabe von 58,6 mg (0,36 ml, 0,915 mmol) n-Butyllithium (2,5 M Lösung in Hexanen) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 89,8 mg (0,915 mmol) 2-Methylthiophen in 2,0 ml THF) umgewandelt.
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,59 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,35 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,87 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,74 (1H, d, J = 2,8 Hz), 6,15 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,52 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,40 (3H, t, 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 33a)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 186,8 mg (1,37 mmol) Zinkchlorid, 37,1 mg (0,03 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) und 2-Lithiothiophen (hergestellt durch Zugabe von 65,9 mg (0,69 ml, 1,03 mmol) n-Butyllithium (1,5 M Lösung in Hexan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 86,5 mg (1,03 mmol) Thiophen in 1,0 ml THF umgewandelt. PMR (CDCl₃) δ: 1,33 (6H, s), 1,36 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,2 Hz), 6,25 (1H, t, J = 4,7 Hz), 7,13 (2H, m), 7,47 (4H, m), 7,62 (2H, d, J = 8,5 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,5 Hz).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methyl-2-thienyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 34)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(5-methyl-2-thienyl)-2-naphthalinyl]ethinylbenzoat (Verbindung 33) (35,0 mg, 0,082 mmol) in 2 ml EtOH und 1 ml THF bei Raumtemperatur wurde wässriges NaOH (1 ml, 1 M, 1 mmol) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann mit 10% HCl angesäuert. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Trocknen über Na₂SO₄ und Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,54–7,48 (3H, m), 6,89 (1H, m), 6,18 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,49 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 34a)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a) wurden 70,0 mg (0,17 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thienyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 33a) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 17,8 mg (0,42 mmol) LiOH in H₂O umgewandelt. PMR (d₆-DMSO) δ: 1,27 (6H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,23 (1H, t, J = 4,9 Hz), 7,14 (2H, m), 7,38–7,56 (4H, m), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,92 (2H, d, J = 8,3 Hz).
5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalincarbonsäure (Verbindung K)
Eine Lösung aus 3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalin (Verbindung D) (250 mg, 0,764 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und 1,0 ml t-Butyllithium (1,68 mmol, 1,7 M Lösung in Pentan) wurde langsam zugefügt. Nach einem Rühren für 1 h bei –78°C wurde gasförmiges CO₂ (erzeugt durch Evaporation von Trockeneis und passiert durch ein Trockenrohr) für 1 h durch die Reaktion geblasen. Die Lösung ließ man dann auf Raumtemperatur erwärmen und die Reaktion wurde durch Zugabe von 10%iger HCl gelöscht. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Waschen der kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl sowie Trocknen über MgSO₄ folgte. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und Waschen des Feststoffs mit Hexanen ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹NMR (CDCl₃) δ: 7,94 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,76 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,24 (4H, m), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,40 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,35 (6H, s).
Ethyl-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]benzoat (Verbindung 35)
Eine Lösung aus 170,0 mg (0,58 mmol) 5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalincarbonsäure (Verbindung K), 115,0 mg (0,70 mmol) Ethyl-4-aminobenzat, 145,0 mg (0,76 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, und 92,4 mg (0,76 mmol) 4-Dimethylaminopyrin in 6,0 ml DMF wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat wurde zugefügt, die resultierende Lösung mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaHCO₃ und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, dann über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck wurde das Produkt als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie (10 bis 15% EtOAc/Hexane) isoliert. ¹NMR (CDCl₃) δ: 8,02 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,72 (2H, m), 7,65 (2H, d, J = 8,7 Hz), 7,52 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,48 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (4H, m), 6,15 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
4-[[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]benzoesäure (Verbindung 36)
Zu einer Lösung aus 26,5 mg (0,06 mmol) Ethyl-4[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 35) in 3,0 ml EtOH und 4,0 ml THF wurden 240,1 mg NaOH (6,00 mmol, 3,0 ml einer 2 M wässrigen Lösung) zugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 72 h wurde die Reaktion durch Zugabe von 10% HCl gelöscht. Eine Extraktion mit EtOAc und Trocknen der organischen Schichten über MgSO₄ ergab einen Feststoff nach Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Eine Kristallisierung aus CH₃CN ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹NMR (d₆-DMSO) δ: 10,4 (1H, s), 7,91–7,81 (5H, m), 7,54 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,45 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,35 (5H, s), 1,33 (6H, s).
Ethyl-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methyl-phenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]oxy]-benzoat (Verbindung 37)
Eine Lösung aus 25,0 mg (0,086 mmol) 5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalincarbonsäure (Verbindung K), 17,5 mg (0,103 mmol) Ethyl-4-hydroxybenzoat, 21,4 mg (0,112 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, und 12,6 mg (0,103 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 2,0 ml DMF wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat wurde zugefügt und die resultierende Lösung mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaHCO₃ und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, vor einem Trocknen über MgSO₄. Nach Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck wurde das Produkt durch Säulenchromatographie als schwachgelber Feststoff isoliert (10% EtOAc/Hexane).
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,08 (2H, d, J = 8,1 Hz), 8,05 (1H, dd, H = 1,8, 8,1 Hz), 7,89 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,22 (5H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,39 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,38 (3H, s), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,37 (6H, s).
2-Trimethylsilylethyl-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]oxy]-benzoat (Verbindung 38)
Eine Lösung aus 93,5 mg (0,320 mmol) 5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalincarbonsäure (Verbindung K), 76,0 mg (0,319 mmol) 2-Trimethylsilylethyl-4-hydroxybenzoat, 80,0 mg (0,417 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid und 51,0 mg (0,417 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 4,0 ml DMF wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Ethylacetat wurde zugefügt und die resultierende Lösung mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaHCO₃ und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, vor einem Trocknen über MgSO₄. Nach Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck wurde das Produkt durch Säulenchromatographie als farbloser Feststoff isoliert (5 EtOAc/Hexane). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8.08, (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,05 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,50 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,26–7,18 (6H, m), 6,05 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,42 (2H, t, J = 8,4 Hz), 2,40 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,39 (3H, s), 1,38 (6H, s), 0,09 (9H, s).
4-[[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]oxy]-benzoesäure (Verbindung 39)
Eine Lösung aus 110,0 mg (0,213 mmol) 2-Trimethylsilylethyl-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]oxy]benzoat (Verbindung 38) und 167,3 mg Tetrabutylammoniumfluorid (0,640 mmol, 0,64 ml einer 1 M Lösung in THF) in 2,0 ml THF wurde bei Raumtemperatur für 22 h gerührt. Ethylacetat wurde zugefügt und die resultierende Lösung mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, dann mit MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lsöungsmittel bei reduziertem Druck und Waschen des restlichen Feststoffs mit EtOAc und CH₃CN ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 8,10 (2H, d, J = 8,8 Hz), 8,06 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,82 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,35 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,25 (4H, m), 6,08 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,35 (3H, s), 1,39 (6H, s).
Ethyl-2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 40)
Eine Lösung aus 115,0 mg (0,41 mmol) 5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalincarbonsäure (Verbindung K), 89,0 mg (0,49 mmol) Ethyl-2-fluor-4-aminobenzoat, 102,0 mg (0,53 mmol) 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid, und 65,0 mg (0,53 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 5,0 ml DMF wurde für 1 h bei 50°C gerührt und dann über Nacht bei Raumtemperatur. Ethylacetat wurde zugefügt und die resultierende Lösung mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaHCO₃ und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, vor einem Trocknen über MgSO₄. Nach Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck wurde das Produkt durch Säulenchromatographie als farbloser Feststoff isoliert (20 EtOAc/Hexane). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,96 (1H, s), 7,89 (1H, t, J = 8,4 Hz), 7,70 (2H, m), 7,52 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (5H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (3H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,36 (6H, s).
2-Fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]-benzoesäure (Verbindung 41)
Zu einer Lösung aus 41,6 mg (0,091 mmol) Ethyl-2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 40) in 2,0 ml EtOH und 2,0 ml THF wurden 40,0 mg NaOH (1,00 mmol, 1,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die Reaktion durch Zugabe von 10%iger HCl gelöscht. Die Extraktion mit EtOAc und das Trocknen der organischen Schichten über MgSO₄ ergab nach Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck einen Feststoff. Die Kristallisierung aus CH₃CN ergab die Titelverbindung als schwach gelben Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 9,84 (1H, s), 7,94–7,83 (3H, m), 7,64 (1H, dd, J = 2, 0 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,23 (4H, s), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,36 (3H, s), 1,35 (6H, s).
Ethyl-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl-2-naphthalinyl)thiocarbonyl]amino]benzoate (Verbindung 42)
Eine Lösung aus 110,0 mg (0,25 mmol) Ethyl-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]benzoate (Verbindung 35) und 121,0 mg (0,30 mmol) [2,4-Bis(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4-disulfid (Lawesson's Reagens) in 12,0 ml Benzol wurde über Nacht im Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Mischung gefiltert und das Filtrat bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie (10 bis 25% EtOAc/Hexane) als gelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,92 (1H, s), 8,06 (2H, t, J = 8,5 Hz), 7,88–7,70 (3H, m), 7,42 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,18 (4H, m), 6,03 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,38 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,56 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (6H, s).
4-[[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)thiocarbonyl]amino]-benzoesäure (Verbindung 43)
Zu einer Lösung aus 84,0 mg (0,184 mmol) Ethyl-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)thiocarbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 42) in 2,0 ml EtOH und 2,0 ml THF wurden 60,0 mg NaOH (1,50 mmol, 1,5 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die Reaktion durch Zugabe von 10%iger HCl gelöscht. Die Extraktion mit EtOAc und das Trocknen der organischen Schichten über MgSO₄ ergab nach Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck einen Feststoff. Die Kristallisierung aus CH₃CN ergab die Titelverbindung als gelben Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 10,96 (1H, s), 8,05 (4H, m), 7,72 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,54 (1H, s), 7,46 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,20 (4H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,7 Hz), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,33 (3H, s), 1,35 (6H, s).
2-Acetyl-6-bromnaphthalin (Verbindung L)
Zu einer kalten (10°C)-Mischung aus 44,0 g (0,212 mol) 2-Bromnaphthalin und 34,0 g (0,255 mol) Aluminiumchlorid in 400 ml Nitrobenzol wurden 21,0 g (267 mmol) Acetylchlorid zugefügt. Die mechanisch gerührte Reaktionsmischung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und für 18 h auf 40°C angewärmt. Nach Abkühlen auf 0°C in einem Eisbad wurde die Reaktion durch Zugabe von 12 M HCl (70 ml) gelöscht. Die Schichten wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser und verdünntem wässrigen Na₂CO₃ gewaschen. Eine Kugelrohr-Destillation, gefolgt von einer Umkristallisierung aus 10% EtOAc-Hexan ergab 23 g der Titelverbindung als gelbbraunen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,44 (1H, br s), 8,04–8,10 (2H, m), 7,85 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,82 (1H, d, J = 8,8 Hz), 7,64 (1H, d, J = 8,8 Hz), 2,73 (3H, s).
6-Brom-2-naphthalincarbonsäure (Verbindung M)
Zu einer Lösung aus Natriumhypochlorit (62 ml, 5,25% in Wasser (G/G), 3,6 g, 48,18 mmol) und Natriumhydroxid (6,4 g, 160,6 mmol) in 50 ml Wasser wurde eine Lösung aus 2-Acetyl-6-bromnaphthalin (Verbindung L) 4 g (16,06 mmol) in 50 ml 1,4-Dioxan zugefügt. Die gelbe Lösung wurde auf 70°C für 2 h in einem Ölbad erwärmt, auf Umgebungstemperatur abgekühlt und mit Ethylether (2 × 50 ml) extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden mit NaHSO₃-Lösung verdünnt (bis die KI-Indikatorlösung farblos blieb) und dann mit 1 N Schwefelsäure angesäuert (pH < 2), um ein weißes Präzipitat zu ergeben. Die Mischung wurde mit Ethylether extrahiert und die kombinierte organische Phase wurde mit gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, um 3,54 g (88%) der Titelverbindung als Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 8,63 (1H, br s), 8,32 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,10 (1H, d, J = 8,8 Hz), 8,00–8,05 (2H, m), 7,74 (1H, dd, J = 2,0, 8,8 Hz).
Ethyl-6-brom-2-naphthalincarboxylat (Verbindung N)
Zu einer Lösung aus 6-Brom-2-naphthalincarbonsäure (Verbindung M), 3,1 g, (12,43 mmol) in Ethanol (30 ml, 23,55 g, 511,0 mmol) wurden 18 M Schwefelsäure (2 ml) zugefügt. Die Lösung wurde 30 min im Rückfluss gekocht, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktionsmischung zwischen Pentan (100 ml) und Wasser (100 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit Pentan (100 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit gesättigtem wässrigen NaCl (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und konzentriert, um einen gebrochen-weißen Feststoff zu ergeben. Die Reinigung durch Flash-Chromatographie (Silika, 10% EtOAc-Hexan) ergab die Titelverbindung als weißen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,58 (1H, br s), 8,10 (1H, dd, J = 1,7, 9 Hz), 8,06 (1H, d, J = 2 Hz), 7,83 (1H, d, J = 9 Hz), 7,80 (1H, d, J = 9 Hz), 7,62 (1H, dd, J = 2,9 Hz).
Ethyl-(E)-4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalinyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung O)
Zu einer Lösung aus 520,0 mg (2,00 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-brom-1-(2H)-naphthalinon (Verbindung B) und 510,0 mg (2,90 mmol) Ethyl-4-Vinylbenzoat in 4,0 ml Triethylamin (durch Durchströmen mit Argon für 25 min entgast) wurden 124,0 mg (0,40 mmol) Tris(2-methylphenyl)phosphin, gefolgt von 44,0 mg (0,20 mmol) Palladium(II)-acetat zugefügt. Die resultierende Lösung wurde für 2,5 h auf 95°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,19 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,03 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,69 (1H, dd, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,20 (2H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,76 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,04 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz, und 6H, s).
Ethyl(E)-4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-napthalinyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung P)
Zu einer kalten (–78°C) Lösung von 440,0 mg (2,40 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 10,0 ml THF wurden 700,0 mg (2,00 mmol) Ethyl(E)-4-[2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalinyl)ethenyl]benzoat (Verbindung 0) als Lösung in 25,0 ml THF zugefügt. Nach einem Rühren bei –78°C für 1,5 h wurden 960,0 mg (2,40 mmol) 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin in einem Teil zugefügt. Nach 30 min wurde die Lösung auf 0°C erwärmt und 3 h gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit 5%igem wässrigen NaOH gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und die Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt. Die Titelverbindung wurde als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (7 EtOAc/Hexane). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,04 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (1H, s), 7,49 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,33 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,20 (1H, d, J = 16,4 Hz), 7,10 (1H, d, J = 16,4 Hz), 6,00 (1H, t, J = 4,9 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,43 (2H, d, J = 4,9 Hz), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, s).
Ethyl-(E)-4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung 44)
Eine Lösung aus 4-Lithiotoluol wurde bei –78°C durch Zugabe von 130,7 mg t-Butyllithium (2,04 mmol; 1,20 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) zu einer Lösung aus 374,5 mg (2,20 mmol) 4-Bromtoluol in 2,5 ml THF hergestellt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 313,4 mg (2,30 mmol) ZnCl₂ in 2,0 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung auf Raumtemperatur erwärmt, 1,25 h gerührt und dann über eine Kanüle zu einer Lösung aus 285,0 mg (0,590 mmol) Ethyl-(E)-4-[2-(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung P) und 29,0 mg (0,025 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur 1 h und dann bei 55°C 2 h gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Mischung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten Extrakte wurden mit 5%igem wässrigen NaOH, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet, bevor sie bei reduziertem Druck konzentriert wurden. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,96 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,47 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,43–7,16 (7H, m), 7,07 (1H, d, J = 16,3 Hz), 6,93 (1H, d, J = 16,3 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,0 Hz), 2,41 (3H, s), 2,33 (1H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,0 Hz), 1,33 (6H, s).
(E)-4-[2-(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethenyl]-benzoesäure (Verbindung 45)
Zu einer Lösung aus 65,0 mg (0,190 mmol) Ethyl-(E)-4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethenyl]-benzoat (Verbindung 44) in 4,0 ml THF wurden 30,0 mg LiOH (0,909 mmol, 1,0 ml einer 1,1 M Lösung) und 1,0 ml MeOH zugefügt. Die Lösung wurde für 3 h auf 55°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und bei reduziertem Druck konzentriert. Der Rest wurde in H₂O gelöst und mit Hexanen extrahiert. Die wässrige Schicht wurde auf einen pH von 1 mit 10%iger NaCl angesäuert und mit Et₂O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, mit EtOAc verdünnt, um eine klare Lösung zu erhalten und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel wurden bei reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 7,86 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,41 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,28 (1H, d, J = 16,5 Hz), 7,23 (4H, s), 7,08 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,07 (1H, d, J = 16,5 Hz), 5,97 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,31 (1H, d, J = 4,6 Hz), 1,29 (6H, s).
Ethyl-4-[2-(1,1-dimethyl-3-(4-methylphenyl)-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 47)
Eine Lösung aus 32,0 mg (0,187 mmol) 4-Bromtoluol in 1,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und 24,0 mg T-Butyllithium (0,375 mmol, 0,22 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurden langsam zugefügt. Die gelbe Lösung wurde 30 min gerührt, zu welchem Zeitpunkt 29,8 mg (0,219 mmol) ZnCl₂ als Lösung in 1,0 ml THF zugefügt wurden. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und nach 30 min zu einem zweiten Kolben hinzugefügt, enthaltend 29,0 mg (0,062 mmol) Ethyl-4- [2-(1,1-dimethyl-3-(trifluormethylsulfonyl)oxy-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung FF) und 2,9 mg (0,003 mmol) Tetrakis(triphenylphosphinpalladium(0) in 1,0 ml THF. Die resultierende Lösung wurde für 1 h auf 50°C erwärmt und dann 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und dann mit Et₂O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und über MgSO₄ getrocknet, bevor sie bei reduziertem Druck konzentriert wurden. Die Titelverbindung wurde als farbloses Öl durch Säulenchromatographie isoliert (10% Et₂O/Hexane).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,66 (1H, s), 7,58 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,0 Hz), 7,46 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,38 (1H, d, J = 7,7 Hz), 7,28 (2H, d, J = 9 Hz), 6,43 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,2 Hz), 2,43 (3H, s), 1,41 (3H, t; +6H, s).
4-[2-(1,1-Dimethyl-3-(4-methylphenyl)-5-indenyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 48)
Zu einer Lösung aus 10,0 mg (0,025 mmol) Ethyl-4-[2-(1,1-dimethyl-3-(4-methylphenyl)-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 47) in 0,5 ml THF/H₂O (3 : 1 V/V) wurden 5,2 mg (0,12 mmol) LiOH H₂O zugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 48 h wurde die Lösung mit Hexanen extrahiert und die wässrige Schicht wurde mit gesättigtem wässrigen NH₄Cl angesäuert. Festes NaCl wurde zugefügt und die resultierende Mischung mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (Na₂SO₄) und bei reduziertem Druck konzentriert, um die Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-DMSO) δ: 7,95 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,65 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (2H, m), 7,49 (3H, m), 7,30 (2H, d, J = 7,9 Hz), 6,61 (1H, s), 2,36 (3H, s), 1,36 (6H, s).
3-(4-Bromthiophenoxy)propionsäure
Zu einer Lösung aus 1,44 g (35,7 mmol) NaOH in 20,0 ml entgastem H₂O (durchströmt mit Argon) wurden 6,79 g (35,7 mmol) 4-Bromthiophenol zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Ein zweiter Kolben wurden mit 2,26 g (16,3 mmol) K₂CO₃ und 15 ml entgastem H₂O beladen. Zu dieser Lösung wurde (in Teilen) 5,00 g (32,7 mmol) 3-Brompropionsäure zugefügt. Die resultierende Kaliumcarboxylatlösung wurde zu einer Natriumthiolatlösung zugefügt und die resultierende Mischung 48 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat mit Benzol extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden verworfen. Die wässrige Schicht wurde mit 10%iger Salzsäure angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und bei reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende Feststoff wurde aus Et₂O-Hexanen zum Erhalt der Titelverbindung als gebrochen-weiße Kristalle umkristallisiert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,43 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,4 Hz), 3,15 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,68 (2H, t, J = 7,3 Hz).
2,3-Dihydro-6-brom-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
Eine Lösung aus 3,63 g (13,9 mmol) 3-(4-Bromthiophenoxy)propionsäure in 60 ml Methansulfonsäure wurde für 1,5 h bei 75°C erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung mit H₂O verdünnt und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 2 N wässrigem NaOH, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab einen gelben Feststoff, von dem das Produkt durch Säulenchromatographie (3% EtOAc-Hexane) als schwachgelber Feststoff isoliert wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,22 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,48, 1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,17 (1H, d, J = 8,5 Hz), 3,24 (2H, t, J = 6,4 Hz), 2,98 (2H, t, J = 6,7 Hz).
2,3-Dihydro-6-(2-trimethylsilylethinyl)-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
Eine Lösung aus 1,00 g (4,11 mmol) 2,3-Dihydro-6-brom-(4H)-1-benzothiopyran-4-on und 78,3 mg (0,41 mmol) CuI in 15,0 ml THF und 6,0 ml Et₂NH wurden mit Argon 5 min durchströmt. Zu dieser Lösung wurden 2,0 ml (1,39 g, 14,2 mmol) (Trimethylsilyl)acetylen, gefolgt von 288,5 mg (0,41 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid zugefügt. Die resultierende dunkle Lösung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt und dann durch einen Celite-Stopfen gefiltert, der mit EtOAc gewaschen wurde. Das Filtrat wurde mit H₂O gewaschen und mit gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄. Die Titelverbindung wurde als oranges Öl durch Säulenchromatographie isoliert (4% EtOAc-Hexane).
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,13 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 8,2 Hz), 7,14 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,19 (2H, d, J = 6,3 Hz), 2,91 (2H, d, J = 6,3 Hz), 0,21 (9H, s).
2,3-dihydro-6-ethinyl-(4H)-1-benzothiopyran-4-on
Eine Lösung, enthaltend 600,0 mg (2,25 mmol) 2,3-Dihydro-6-(2-trimethylsilylethinyl)-(4H)-1-benzothiopyran-4-on und 100,0 mg (0,72 mmol) K₂CO₃ in 15 ml MeOH wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit H₂O verdünnt und mit Et₂O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O und gesättigtem NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als orangen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,40 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 7,19 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,22 (2H, t, J = 6,3 Hz), 3,08 (1H, s), 2,94 (2H, t, J = 6,3 Hz).
Ethyl-4-[2-(6-(2,3-dihydro-(4H)-1-benzothiopyran-4-onyl))ethinyl]benzoat
Eine Lösung aus 405,0 mg (2,15 mmol) 2,3-Dihydro-6-ethinyl-(4H)-1-benzothiopyran-4-on und 594,0 mg (2,15 mmol) Ethyl-4-iodbenzoat in 15 ml Et₃N und 3 ml THF wurde 15 min mit Argon durchströmt. Zu dieser Lösung wurden 503,0 mg (0,72 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid und 137,0 mg (0,72 mmol) CuI zugefügt. Diese Lösung wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt und dann durch einen Celite-Stopfen gefiltert, der mit EtOAc gewaschen war. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab einen braunen Feststoff. Eine Säulenchromatographie (3% EtOAc-Hexane) ergab die Titelverbindung als orangen Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 8,15 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,61 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,40 (2H, t, J = 6,3 Hz), 2,96 (2H, t, J = 6,3 Hz), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[2-(6-(4-(trifluormethylsulfonyl)oxy-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinyl]benzoat
Zu einer Lösung aus 221,9 mg (1,21 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 3,0 ml THF, gekühlt auf –78°C, wurden 370,0 mg (1,10 mmol) Ethyl-4-[2-(6-(2,3-Dihydro-(4H)-1-benzothiopyran-4-onyl))ethinyl]benzoat in 4,0 ml THF zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin in 4,0 ml THF langsam zugefügt. Die Reaktion wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und nach 5 h durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Mischung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5%igem wässrigen NaOH, Wasser und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (4% EtOAc-Hexane) ergab die Titelverbindung als schwachgelben Feststoff. ¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 8,12 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,66 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,56 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,49 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,33 (1H, t, J = 5,7 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,82 (2H, d, J = 5,7 Hz), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-(2-(6-(4-(4-methylphenyl)-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinyl]benzoat (Verbindung 49)
Zu einer Lösung aus 120,8 mg (0,70 mmol) 4-Bromtoluol in 2,0 ml THF bei –78°C wurden 88,4 mg (1,38 mmol, 0,81 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) t-Butyllithium zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 131,6 mg (0,97 mmol) ZnCl₂ in 2,0 ml THF zugefügt und die resultierende schwachgelbe Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt. Auf ein Rühren für 40 min folgte die Zugabe dieser Lösung zu einem zweiten Kolben, enthaltend 129,2 mg (0,28 mmol) Ethyl-4-[2-(6-(4-trifluormethylsulfonyl)oxy-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinyl]benzoat, 14,0 mg (0,012 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) und 2,0 ml THF. Die resultierende Lösung wurde 5 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Mischung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄) und zu einem orangen Öl konzentriert. Die Titelverbindung wurde als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (3 bis 5% EtOAc-Hexane).
¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44–7,38 (2H, m), 7,26–7,15 (5H, m), 6,14 (1H, t, J = 5,8 Hz), 4,34 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,53 (2H, d, J = 5,8 Hz), 2,37 (2H, s), 1,35 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[2-(6-(4-(4-Methylphenyl)-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinyl]benzoesäure (Verbindung 50)
Zu einer Lösung aus 29,0 mg (0,07 mmol) Ethyl-4-[2-(6-(4-(4-methylphenyl)-(2H)-1-benzothiopyranyl))ethinyl]benzoat (Verbindung 49) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurden 160,0 mg (4,00 mmol, 2,0 ml einer 2 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde 2 h bei 35°C gerührt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt und weitere 2 h gerührt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10%iger wässriger HCl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und dann über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab einen Feststoff, der mit CH₃CN gewaschen wurde und unter Hochvakuum getrocknet wurde, um die Titelverbindung als schwachgelben Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 7,90 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40 (4H, m), 7,25–7,13 (4H, m), 7,02 (1H, d, J = 1,7 Hz), 6,11 (1H, t, J = 5,7 Hz), 3,54 (2H, d, J = 5,7 Hz), 2,34 (3H, s).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung R); und 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalinon (Verbindung S)
Zu einer kalten (0°C) Mischung Aluminiumchlorid (26,3 g, 199,0 mmol) in Dichlormethan (55 ml) wurde Acetylchlorid (15 g, 192 mmol) und 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalin (24,4 g, 152 mmol) in Dichlormethan (20 ml) über 20 min zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt und 4 h gerührt. Eis (200 g) wurde dem Reaktionskolben zugefügt und die Mischung wurde mit Ether (400 ml) verdünnt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Phase mit 10%iger HCl (50 ml), Wasser (50 ml), 10%igem wässrigen Natriumbicarbonat und gesättigtem wässrigen NaCl (50 ml) vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation zum Erhalt eines gelben Öls entfernt, das in Benzol gelöst war (50 ml).
Zu einer kalten (0°C) Lösung Essigsäure (240 ml) und Essigsäureanhydrid (120 ml) wurde Chromtrioxid (50 g, 503 mmol) in kleinen Teilen über 20 min unter Argon zugefügt. Die Mischung wurde 30 min bei 0°C gerührt und mit Benzol (120 ml) verdünnt. Die oben hergestellte Benzollösung wurde unter Rühren über einen Zugabetrichter über 20 min zugefügt. Nach 8 h wurde die Reaktion durch sorgfältige Zugabe von Isopropanol (50 ml) bei 0°C gelöscht, gefolgt von Wasser (100 ml). Nach 15 min wurde die Reaktionsmischung mit Ether (1100 ml) und Wasser (200 ml) verdünnt und dann mit festem Natriumbicarbonat (200 g) neutralisiert. Die Etherschicht wurde mit Wasser (100 ml) gewaschen sowie mit gesättigtem wässrigen NaCl (2 × 100 ml) und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab eine Mischung isomerer Diketone, die durch Chromatographie getrennt wurden (5% EtOAc/Hexane). (Verbindung R): ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,55 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,77 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,62 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,41 (6H, s). (Verbindung S): ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 1,6 8,1 Hz), 2,77 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,64 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1(2H)-naphthalinon (Verbindung T)
Eine Mischung aus 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalinon (Verbindung R) (140,0 mg, 0,60 mmol), Ethylenglykol (55,0 mg, 0,90 mmol), p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (4 mg) und Benzol (25 ml) wurde unter Verwendung einer Dean-Stark-Apparatur für 12 h im Rückfluss erwärmt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10%igem wässrigem Natriumbicarbonat gelöscht und mit Ether (2 × 75 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser (5 ml) und gesättigtem wässrigen NaCl (5 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als Öl. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,13 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,2 Hz), 7,40 (1H, d, J = 8,2 Hz), 3,97–4,10 (2H, m), 3,70–3,83 (2H, m), 2,73 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,01 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,64 (3H, s), 1,39 (6H, s).
1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))naphthalin (Verbindung U)
Zu einer Lösung aus 195,4 mg (1,00 mmol) p-Tolulyl-magnesiumbromid (1,0 ml; 1 M Lösung in Ether) in 2 ml THF wurde eine Lösung aus 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1(2H)-naphthalinon (Verbindung T) 135,0 mg, 0,52 mmol) in 5 ml THF zugefügt. Die Lösung wurde 16 h im Rückfluss erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Ether (50 ml) verdünnt. Die Lösung wurde mit Wasser (5 ml), gesättigtem wässrigen NH₄Cl (5 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und Säulenchromatographie (5 EtOAc/Hexane) ergab die Titelverbindung als Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,37 (2H, d), 7,21 (1H, s), 7,13 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,08 (2H, d, J = 8,5 Hz), 3,88–3,99 (2H, m), 3,58–3,75 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,12–2,30 (2H, m), 1,79–1,90 (1H, m), 1,57 (3H, s), 1,48–1,58 (1H, m), 1,38 (3H, s), 1,31 (3H, s).
3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-acetylnaphthalin (Verbindung V)
Eine Mischung aus 1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))naphthalin (Verbindung U), 130,0 mg (0,38 mmol), p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (4 mg) und Benzol (5 ml) wurde 16 h im Rückfluss gekocht. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit Ether (100 ml) verdünnt und mit 10%igem wässrigen Natriumbicarbonat, Wasser und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde mit MgSO₄ getrocknet und die Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung als Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,83 (1H, dd, J = 1,8, 8,0 Hz), 7,66 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,25 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,22 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,3 Hz), 2,47 (3H, s), 2,41 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 6,3 Hz), 1,36 (6H, s).
(E)-3-(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)-2-butennitril (Verbindung W)
Zu einer Aufschlämmung aus NaH (48,0 mg, 2,00 mmol) in THF (6 ml) wurde Diethylcyanomethylphosphonat (450,0 mg, 2,50 mmol) zugefügt. Nach 40 min wurde eine Lösung aus 3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-acetylnaphthalin (Verbindung V) 95,0 mg, (0,33 mmol) in THF (4 ml) zugefügt. Die Mischung wurde 16 h gerührt, mit Ether (100 ml) verdünnt und mit Wasser gewaschen sowie mit gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung der Lösungsmittel unter reduziertem Druck und eine Säulenchromatographie (3% EtOAc/Hexane) ergab die Titelverbindung als Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,39 (1H, d, J = 1H), 7,32 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,20–7,25 (4H, brs), 7,15 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,03 (1H, t, J = 6,0 Hz), 5,44 (1H, s), 2,42 (3H, s), 2,36 (2H, d, J = 6,0 Hz), 2,35 (3H, s), 1,35 (6H, s).
(E)-3-(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)-2-butenal (Verbindung X)
Zu einer kalten Lösung (–78°C) aus (E)-3-(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)-2-butennitril (Verbindung W), 84,0 mg, 0,29 mmol in Dichlormethan (4 ml) wurden 0,50 ml (0,50 mmol) Diisobutylaluminiumhydrid (1 M Lösung in Dichlormethan) zugefügt. Nach einstündigem Rühren wurde die Reaktion bei –78°C durch Zugabe von 2-Propanol (1 ml), verdünnt mit Ether (100 ml) gelöscht. Nach Aufwärmen auf Raumtemperatur wurde die Lösung mit Wasser, 10%iger HCl und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung als Öl zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 10,12 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,43 (2H, s), 7,19–7,28 (5H, m), 6,27 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,03 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,47 (3H, s), 2,42 (3H, s), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,37 (6H, s).
Ethyl-(E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)-2,4,6-octatrienoat (Verbindung 51)
Zu einer kalten (–78°C) Lösung aus Diethyl-(E)-3-ethoxycarbonyl-2-methylallylphosphonat) [hergestellt gemäß J. Org. Chem. 39: 821 (1974)] 264,0 mg, (1,00 mmol) in THF (2 ml) wurden 26,0 mg (0,41 mmol, 0,65 ml) n-Butyllithium in Hexanen (1,6 M Lösung), zugefügt, gefolgt direkt von einer Zugabe von (E)-3-(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)-2-butenal (Verbindung X), 82,0 mg, (0,26 mmol) in THF (3 ml). Nach 1 h wurde die Reaktionsmischung mit Ether (60 ml) verdünnt, mit Wasser (5 ml), gesättigtem wässrigen NaCl (5 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck wurde die Titelverbindung als Öl durch Säulenchromatographie isoliert (5% EtOAc/Hexane, gefolgt von HPLC unter Verwendung von 1% EtOAc/Hexanen). ¹H-NMR (Aceton-d₆) δ: 7,36–7,43 (2H, m), 7,18–7,27 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,08 (1H, dd, J = 11,2, 15,2 Hz), 6,46 (1H, d, J = 11,2 Hz), 6,38 (1H, d, J = 15,2 Hz), 5,98 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,78 (1H, s), 4,10 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (3H, s), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,12 (3H, s), 1,31 (6H, s), 1,22 (3H, t, J = 7,1 Hz).
(E,E,E)-3-Methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)-2,4,6-octatriensäure (Verbindung 52)
Zu einer Lösung aus Ethyl-(E,E,E)-3-methyl-7-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)-2,4,6-octatrienoat (Verbindung 51), 85,0 mg, (0,20 mmol) in THF (1 ml) und Methanol (1 ml) wurden 12,0 mg (0,50 mmol) LiOH (0,5 ml, 1 M Lösung) zugefügt. Die Mischung wurde 6 h gerührt, mit Ether (60 ml) verdünnt, mit 10% HCl (1 ml) angesäuert. Die Lösung wurde mit Wasser und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen, vor einem Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als Feststoff, der durch Umkristallisierung aus Aceton gereinigt wurde. ¹H-NMR (Aceton-d₆) δ: 7,35–7,45 (2H, m), 7,19–7,28 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,09 (1H, dd, J = 11,5, 15,1 Hz), 6,48 (1H, d, J = 11,5 Hz), 6,42 (1H, d, J = 15,1 Hz), 5,99 (1H, t, J = 4,7 Hz), 5,82 (1H, s), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 2,32 (3H, s), 2,13 (3H, s), 1,32 (6H, s).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-nitro-1(2H)-naphthalinon (Verbindung Y)
Zu 1,7 ml (3,0 g, 30,6 mmol, 18 M) H₂SO₄ bei –5°C (Eis-NaCl-Bad) wurden langsam (783,0 mg (4,49 mmol) 3,4-dihydro-4,4-dimethyl-1(2H)-napthalinon zugefügt. Eine Lösung aus 426,7 mg (6,88 mmol, 0,43 ml, 16 M) HNO₃ und 1,31 g (0,013 mol, 0,74 ml, 18 M) H₂SO₄ wurde langsam zugefügt. Nach 20 min wurde Eis zugefügt und die resultierende Mischung wurde mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden bei reduziertem Druck konzentriert, um einen Rest zu ergeben, aus dem die Titelverbindung, ein schwachgelber Feststoff, durch Säulenchromatographie isoliert wurde (10% EtOAc/Hexane).
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,83 (1H, d, J = 2,6 Hz), 8,31 (1H, dd, J = 2,8, 8,9 Hz), 7,62 (1H, d, J = 8,7 Hz), 2,81 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,08 (2H, t, J = 6,5 Hz), 1,45 (6H, s).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-amino-1(2H)-naphthalinon (Verbindung Z)
Eine Lösung aus 230,0 mg (1,05 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-nitro-1(2H)-naphthalinon (Verbindung Y) in 5,0 ml EtOAc wurde bei Raumtemperatur mit einer katalytischen Menge 10% Pd-C unter 1 atm H₂ für 24 h gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch einen Celite-Stopfen entfernt und das Filtrat bei reduziertem Druck zum Erhalt der Titelverbindung als dunkelgrünes Öl konzentriert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,30 (1H, d, J = 2,7 Hz), 7,22 (1H, d, J = 8,4 Hz), 6,88 (1H, dd, J = 2,7 8,5 Hz), 2,70 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,97 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,34 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6,7,8-tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalinyl)azo]-benzoat (Verbindung AA)
Zu einer Lösung aus 198,7 mg (1,05 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-amino-1(2H)-naphthalinon (Verbindung Z) in 5,0 ml Eisessigsäure wurden 180,0 mg (1,00 mmol) Ethyl-4-nitrosobenzoat zugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann bei reduziertem Druck konzentriert. Das Produkt wurde aus dem Restöl als roter Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (15% EtOAc-Hexane). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,57 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 8,07 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,94 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (1H, d, J = 8,6 Hz), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,79 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,07 (2H, t, J = 7,02 Hz), 1,44 (6H, s), 1,42 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)azo]-benzoat (Verbindung BB)
Zu einer Lösung aus 90,4 mg Natriumbis(trimethylsilyl)amid (0,48 mmol, 0,48 ml einer 1,0 M THF-Lösung) in 2,0 ml THF bei –78°C wurden 153,0 mg (0,437 mmol) Ethyl-4-[(5,6,7,8- Tetrahydro-5,5-dimethyl-8-oxo-2-naphthalinyl)azo]-benzoat (Verbindung AA) in 2,0 ml THF zugefügt. Die dunkelrote Lösung wurde 30 min bei –78°C gerührt und dann wurden 204,0 mg (0,520 mmol) 2-[N,N-Bis(trifluormethylsulfonyl)amino]-5-chlorpyridin als Lösung in 2,0 ml THF zugefügt. Man ließ die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur aufwärmen, nach 3 h wurde sie durch Zugabe von H₂O gelöscht. Die organische Schicht wurde zu einem roten Öl bei reduzierten Druck konzentriert. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (25% EtOAc/Hexane) als rotes Öl isoliert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,21 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (1H, d, J = 8,2 Hz), 6,08 (1H, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,44 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,38 (6H, s).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)azo]-benzoat (Verbindung 46a)
Eine Lösung aus 4-Lithiotoluol wurde durch Zugabe von 62,9 mg (0,58 ml, 0,98 mmol) t-Butyllithium (1,7 M Lösung in Pentan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 84,0 mg (0,491 mmol) 4-Bromtoluol in 1,0 ml THF hergestellt. Nach Rühren für 30 min wurde eine Lösung aus 107.0 mg (0,785 mmol) Zinkchlorid in 2,0 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 30 min gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus 94,7 mg (0,196 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalenyl)azo]-benzoat (Verbindung BB) und 25 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) in 2,0 ml THF zugefügt. Die resultierende Lösung wurde für 1,5 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit gesättigtem wässrigen NH₄Cl verdünnt. Die Mischung wurde mit EtOAc (40 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser und Sole gewaschen. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, im Vakuum konzentriert und die Titelverbindung als roter Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (25% EtOAc-Hexane). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,21 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,96 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,94 (2H, m), 7,49 (1H, d, J = 8,2 Hz), 6,08 (1H, t, J = 2,5 Hz), 4,42 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,49 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,44 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,38 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)azo]-benzoesäure (Verbindung 46b)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)azo]benzoat (Verbindung 46a) 16,5 mg (0,042 mmol) in THF (2 ml) und Ethanol (1 ml) wurden 80,0 mg (2,00 mmol) NaOH (2,0 ml, 1 M wässrige Lösung) zugefügt. Die Mischung wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt, mit 10%iger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen sowie mit gesättigtem wässrigen NaCl und dann über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und die Umkristallisierung des Rests aus EtOAc/Hexan ergab die Titelverbindung als roten Feststoff.
¹H-NMR (Aceton-d₆) δ: 8,19 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,92 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,88 (2H, dd, J = 2,1, 6,1 Hz), 7,66 (1H, s), 7,64 (2H, d, J = 2,3 Hz), 7,28 (4H, d, J = 3,0 Hz), 6,09 (1H, t, J = 2,5 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,39 (3H, s), 1,40 (6H, s).
6-(2-Trimethylsilyl)ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung CC)
Zu einer Lösung aus 815,0 mg (3,41 mmol) 6-Brom-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (siehe Smith et al. Org. Prep. Proced. Int. 1978, 10, 123–131) in 100 ml von entgastem Et₃N (ausgeschwänzt mit Argon für 20 min) wurden 259,6 mg (1,363 mmol) Kupfer(I)-iodid, 956,9 mg (1,363 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid und 3,14 g (34,08 mmol) (Trimethylsilyl)acetylen zugefügt. Diese Mischung wurde für 42 h auf 70°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und durch einen Silika-Stopfen gefiltert sowie mit Ether gewaschen. Das Filtrat wurde mit Wasser, 1 M HCl, Wasser und schließlich mit gesättigtem wäsrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Konzentration der Lösung bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (Silikagel; 10% Et₂O-Hexane) ergab die Titelverbindung als braunes Öl.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,79 (1H, d, J = 1,4 Hz), 7,69 (1H, dd, J = 1,6, 8,3 Hz), 7,42 (1H, d, J = 8,5 Hz), 2,60 (2H, s), 1,41 (6H, s), 0,26 (9H, s).
6-Ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung DD)
Zu einer Lösung aus 875,0 mg (3,41 mmol) 6-(2-Trimethylsilyl)ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung CC) in 28 ml MeOH wurden 197,3 mg (1,43 mmol) K₂CO₃ in einem Teil zugefügt. Nach Rühren für 6 h bei Raumtemperatur wurde die Mischung durch einen Celite-Stopfen gefiltert und das Filtrat bei reduziertem Druck konzentriert. Das Restöl wurde auf eine Silikagelsäule gegeben und mit 5% EtOAc-Hexanen eluiert, um das Titelprodukt als farbloses Öl zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,82 (1H, s), 7,72 (1H, dd, J = 1,6, 7,8 Hz), 7,47 (1H, d, J = 8,4 Hz), 3,11 (1H, s), 2,61 (2H, s), 1,43 (6H, s).
Ethyl-4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-7-oxo-2-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung EE)
Eine Lösung aus 280,0 mg (1,520 mmol) 6-Ethinyl-2,3-dihydro-3,3-dimethyl-1H-inden-1-on (Verbindung DD) und 419,6 mg (1,520 mmol) Ethyl-4-iodbenzoat in 5 ml Et₃N wurde mit Argon 40 min durchströmt. Zu dieser Lösung wurden 271,0 mg (1,033 mmol) Triphenylphosphin, 53,5 mg (0,281 mmol) Kupfer(I)-iodid und 53,5 mg (0,076 mmol) Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid zugefügt. Die resultierende Mischung wurde 2,5 h im Rückfluss erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Et₂O verdünnt. Nach Filtration durch einen Celite-Stopfen wurde das Filtrat mit H₂O, 1 M HCl, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und dann über MgSO₄ getrocknet sowie bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde als schwachgelber Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (15% EtOAc-Hexane). ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,05 (2H, d, J = 8,6 Hz), 7,87 (1H, dd, J = 1,4, 8,1 Hz), 7,75 (2H, m), 7,70 (2H, d, J = 8,5 Hz), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,60 (2H, s), 1,45 (6H, s), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[2-(1,1-dimethyl-3-(trifluormethyl-sulfonyl)oxy-5-indenyl)ethinyl]benzoat (Verbindung FF)
Eine Lösung aus 88,0 mg (0,48 mmol) Natriumbis(trimethylsilyl)amid in 0,5 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und 145,0 mg (0,436 mmol) Ethyl-4-[2-(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-7-oxo-2-indenyl]ethinyl]benzoat (Verbindung EE) wurde als Lösung in 1,0 ml THF zugeführt. Nach 30 min wurden 181,7 mg (0,480 mmol) 2-(N,N-Bis(trifluormethansulfonyl)amino)-5-chlorpyridin als Lösung in 1,0 ml THF zugefügt. Man ließ die Reaktion sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen und löschte nach 5 h durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl. Die Mischung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit 5%igem wässrigen NaOH, H₂O und gesättigtem wässrigem NaCl gewaschen, dann getrocknet (MgSO₄) und bei reduziertem Druck konzentriert. Das Produkt wurde als farbloser Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (10% Et₂O-Hexane). ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,05 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,69 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,63 (2H, s), 7,55 (1H, s), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s), 1,37 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 60)
Eine Lösung aus 142,6 mg (0,339 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) und 35,6 mg (0,848 mmol) LiOH-H₂O in 12 ml THF/Wasser (4 : 1, V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Hexanen extrahiert und der Hexananteil mit 5%igem wässrigem NaOH extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden kombiniert und mit 1 M HCl angesäuert und dann mit EtOAc und Et₂O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 7,91 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,47 (2H, s), 7,23 (4H, q, J = 8,1 Hz), 7,01 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,35 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,30 (6H, s).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-phenyl-2-napthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 60a)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a) wurden 27,0 mg (0,07 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-phenyl-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1a) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 5,9 mg (0,14 mmol) in LiOH in H₂O umgewandelt. PMR (d₆-DMSO) δ: 1,31 (6H, s), 2,35 (2H, d, J = 4,5 Hz), 6,05 (1H, t, J = J = J = 4,5 Hz), 7,00 (1H, s), 7,33 (2H, d, J = 6,2 Hz), 7,44 (4H, m), 7,59 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,90 (2H, d, J = 8,1 Hz).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-(1,1-dimethylethyl)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 61)
Eine Lösung aus 80,0 mg (0,173 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-(1,1-dimethylethyl)phenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 6) und 18,1 mg (0,432 mmol) LiOH-H₂O in 6 ml THF/Wasser (3 : 1, V/V) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, Die Reaktionsmischung wurde mit Hexanen extrahiert und die verbleibende wässrige Schicht mit 1 M HCl angesäuert und dann mit EtOAc extrahiert.
Die kombinierten organischen Schichten wurden mit Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, um die Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (d₆-DMSO) δ: 7,82 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,44 (6H, m), 7,25 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,02 (1H, s), 6,01 (1H, t, J = 4,6 Hz), 2,32 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,32 (9H, s), 1,29 (6H, s).
Ethyl-2 -fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)thiocarbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 62)
Eine Lösung aus 54,4 mg (0,119 mmol) Ethyl-2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)carbonyl]amino]-benzoat (Verbindung 40) und 57,7 mg (0,143 mmol) [2,4-Bis(4-methoxyphenyl)-1,3-dithia-2,4-diphosphetan-2,4-disulfid] (Lawesson's Reagens) in 12,0 ml Benzol wurde über Nacht im Rückfluss gekocht. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Mischung gefiltert und das Filtrat bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde als gelber Feststoff durch Säulenchromatographie isoliert (10 bis 25% EtOAc/Hexane). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 9,08 (1H, s), 7,92 (1H, br s), 7,90 (1H, t, J = 8,2 Hz), 7,66 (1H, dd, J = 2,0, 6,0 Hz), 7,38 (3H, m), 7,18 (4H, m), 6,01 (1H, t, J = 4,7 Hz), 4,35 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,36 (3H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,33 (6H, s).
2-Fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)thiocarbonyl]amino]-benzoesäure (Verbindung 63)
Zu einer Lösung aus 46,5 mg (0,098 mmol) Ethyl-2-fluor-4-[[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)thiocarbonyl]amino]benzoat (Verbindung 62) in 1,0 ml EtOH und 1,0 ml THF wurden 55 mg NaOH (1,4 mmol) und 1,0 ml H₂O zugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde EtOAc zugefügt und die Reaktion wurde durch Zugabe von 10%iger HCl gelöscht. Auf eine Extraktion mit EtOAc folgte ein Waschen der kombinierten organischen Schichten mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl und Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab einen Feststoff, der nach Kristallisierung aus CH₃CN die Titelverbindung als schwachgelben Feststoff ergab.
¹H-NMR (d₆-Aceton) δ: 11,05 (1H, s), 8,02 (1H, m), 7,99 (1H, t; J = 8,3 Hz), 7,75 (1H, m), 7,69 (1H, dd, J = 2,0 6,1 Hz), 7,52 (1H, s), 7,46 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,21 (4H, m), 6,04 (1H, t, J = 4,8 Hz), 2,37 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,33 (3H, s), 1,36 (6H, s).
Ethyl-5',6'-dihydro-5',5'-dimethyl-8'-(4-methylphenyl)-[2,2'-binaphthalin]-6-carboxylat (Verbindung 64)
Eine Lösung aus 3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-7-bromnaphthalin (Verbindung D) 0,45 g, 1,40 mmol) und THF (2,1 ml) wurde zu Magnesiumspänen (0,044 g, 1,82 mmol) bei Raumtemperatur unter Argon zugefügt. Zwei Tropfen Ethylendibromid wurden zugefügt und die Lösung, die langsam wolkig und gelb wurde, wurde im Rückfluss 1,5 h erwärmt. Zu einem zweiten Kolben wurde Zinkchlorid (0,210 g, 1,54 mmol) zugefügt, das unter Hochvakuum geschmolzen wurde, auf Raumtemperatur abgekühlt und in THF gelöst (3 ml). Das Grignard-Reagens wurde dem zweiten Kolben zugefügt, und nach 30 min bei Raumtemperatur wurde eine Lösung aus Ethyl-6-brom-2-napthalincarboxylat (Verbindung N), 0,293 g, (1,05 mmol) und THF (2 ml) zugefügt. In einem dritten Kolben wurde eine Lösung aus Ni(PPh₃)₄ und THF wie folgt hergestellt: Zu einer Lösung aus NiCl₂(PPh₃)₂ (0,82 g, 1,25 mmol) und PPh₃ (0,66 g, 2,5 mmol) in THF (3,5 ml) wurde eine 1 M Lösung aus Diisobutylaluminiumhydrid und Hexanen (2,5 ml, 2,5 mmol) zugefügt und die resultierende Lösung mit THF auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt und bei Raumtemperatur 15 min gerührt. Drei 0,60 ml-Aliquots der Ni(PPh₃)₄-Lösung wurden in 15-minütigen Intervallen dem zweiten Kolben zugefügt. Die resultierende Suspension wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 ml 1 N wässriger HCl gelöscht und 1 h vor Extraktion der Produkte mit Ethylacetat gerührt. Die organischen Schichten wurden kombiniert, mit Sole gewaschen, getrocknet (MgSO₄), gefiltert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rest wurde aus Hexanen zum Erhalt von 130 mg des reinen Materials kristallisiert. Die Mutterflüssigkeit wurde bei reduziertem Druck konzentriert und der Rest durch Silikagelchromatographie (95 : 5-Hexane : Ethylacetat) zum Erhalt von zusätzlichen 170 mg der Titelverbindung gereinigt (Gesamtausbeute = 300 mg, 64%) als farblosen Feststoff.
¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,57 (s, 1H), 8,05 (dd, 1H, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,84–7,95 (überlappende d's, 3H), 7,66 (dd, 1H, J = 1,7, 8,5 Hz), 7,58 (dd, 1H, J = 2,0, 8,0 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,43 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,32 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 6,04 (t, 1H, J = 4,8 Hz), 4,44 (q, 2H, J = 7,1 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,39 (d, 2H, J = 4,8 Hz), 1,45 (t, 3H, J = 7,1 Hz), 1,39 (s, 6H).
5',6'-Dihydro-5',5'-dimethyl-8'-(4-methylphenyl)-[2,2'-binaphthalin]-6-carbonsäure (Verbindung 65)
Eine Lösung aus Ethyl-5',6'-dihydro-5',5'-dimethyl-8'-(4-methylphenyl)-[2,2'-binaphthalin]-6-carboxylat (Verbindung 64), (0,19 g, 0,43 mmol), EtOH (8 ml) und 1 N wässriger NaOH (2 ml) wurde für 3 h auf 60°C erwärmt. Die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und mit 1 N wässriger HCl angesäuert. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organischen Schichten kombiniert, mit Wasser gewaschen, mit Sole, getrocknet (MgSO₄), gefiltert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rest wurde aus THF/Ethylacetat bei 0°C zum Erhalt von 35 mg des reinen Materials umkristallisiert. Die Mutterflüssigkeit wurde bei reduziertem Druck konzentriert und der Rest durch Silikagelchromatographie (100% Ethylacetat) zum Erhalt von zusätzlichen 125 mg der Titelverbindung als farblosen Feststoff gereinigt (Gesamtausbeute = 160 mg, 90%). ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 8,57 (s, 1H), 8,11 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,96–7,82 (überlappende d's, 3H), 7,65 (d, 2H, J = 7,6 Hz), 7,50 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 7,28 (s, 1H), 7,26 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,21 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 6,01 (t, 1H, J = 4,5 Hz), 3,34 (br s, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,31 (d, 2H, J = 4,5 Hz), 1,31 (s, 6H).
Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-furyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 66)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahrens wie für die Herstellung von Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(4-methylphenyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 1) wurden 250,0 mg (0,52 mmol) Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(trifluormethylsulfonyl)oxy-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung G) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 142,4 mg (1,045 mmol) Zinkchlorid, 24,1 mg (0,02 mmol) Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) und 2-Lithiofuran umgewandelt (hergestellt durch Zugabe von 53,4 mg (0,52 ml, 0,78 mmol) n-Butyllithium (1,5 M Lösung in Hexan) zu einer kalten Lösung (–78°C) aus 53,4 mg (0,784 mmol) Furan in 1,0 ml THF). PMR (CDCl₃) δ: 1,32 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 2,35 (2H, d, J = 5,0 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 6,41 (1H, t, J = 5,0 Hz), 6,50 (2H, s), 7,36 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,45 (1H, dd, J = 1,7, 8,0 Hz), 7,49 (1H, s), 7,57 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,63 (1H, d, J = 1,7 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,2 Hz).
4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-furyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 67)
Unter Verwendung desselben allgemeinen Verfahren wie für die Herstellung von 4-[(5,6-Dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-thiazolyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoesäure (Verbindung 30a) wurden Ethyl-4-[(5,6-dihydro-5,5-dimethyl-8-(2-furyl)-2-naphthalinyl)ethinyl]benzoat (Verbindung 66) in die Titelverbindung (farbloser Feststoff) unter Verwendung von 16,0 mg (0,38 mmol) LiOH in H₂O umgewandelt.
PMR (d₆-DMSO) δ: 1,26 (6H, s), 2,33 (2H, d, J = 4,9 Hz), 6,41 (1H, t, J = 4,9 Hz), 6,60 (2H, m), 7,45–7,53 (3H, m), 7,64 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,75 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,93 (2H, d, J = 8,3 Hz).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalenon (Verbindung 100C) und 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalinon (Verbindung 100D)
Zu einer kalten (0°C) Mischung aus Aluminiumchlorid (26,3 g, 199,0 mmol) in Dichlormethan (55 ml) wurde Acetylchlorid (15 g, 192 mmol) und 1,2,3,4-Tetrahydro-1,1-dimethylnaphthalin (24,4 g, 152 mmol) in Dichlormethan (20 ml) über 20 min zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde auf Umgebungstemperatur erwärmt und 4 h gerührt. Eis (200 g) wurden dem Reaktionskolben zugefügt und die Mischung mit Ether (400 ml) verdünnt. Die wässrigen und organischen Schichten wurden abgetrennt und die organische Phase mit 10%iger HCl (50 ml), Wasser (50 ml), 10%igem wässrigen Natriumbicarbonat und gesättigtem wässrigen NaCl (50 ml) gewaschen und dann über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch Destillation entfernt, um ein gelbes Öl zu ergeben, das in Benzol (50 ml) gelöst wurde.
Zu einer kalten (0°C) Lösung Essigsäure (240 ml) und Essigsäureanhydrid (120 ml) wurde Chromtrioxid (50 g, 503 mmol) in kleinen Anteilen über 20 min unter Argon zugefügt. Die Mischung wurde 30 min bei 0°C gerührt und mit Benzol (120 ml) verdünnt. Die oben hergestellte Benzollösung wurde unter Rühren über einen Zugabetrichter in 20 min zugefügt. Nach 8 h wurde die Reaktion durch sorgfältige Zugabe von Isopropanol (50 ml) bei 0°C, gefolgt von Wasser (100 ml) gelöscht. Nach 15 min wurde die Reaktionsmischung mit Ether (1100 ml) und Wasser (200 ml) verdünnt und dann mit festem Natriumbicarbonat (200 g) neutralisiert. Die Etherschicht wurde mit Wasser (100 ml) gewaschen sowie mit gesättigtem wässrigen NaCl (2 × 100 ml) und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab eine Mischung der isomeren Diketone, die durch Chromatographie abgetrennt wurden (5% EtOAc/Hexane). (Verbindung 100C): ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,55 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,13 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,53 (1H, d, J = 8,3 Hz), 2,77 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,62 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 6,6 Hz), 1,41 (6H, s). (Verbindung 100D): ¹H-NMR (CDCl₃): δ 8,10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 8,02 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,82 (1H, dd, J = 1,6, 8,1 Hz), 2,77 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,64 (3H, s), 2,05 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,44 (6H, s).
3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1(2H)-naphthalinon (Verbindung 100E)
Eine Lösung aus 1,80 g (8,34 mmol) einer 1 : 5-Mischung von 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-7-acetyl-1(2H)-naphthalinon (Verbindung 100C); und 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-acetyl-1(2H)-naphthalinon (Verbindung 100D) in 50 ml Benzol wurden mit 517,7 mg (8,34 mmol) Ethylenglykol und 20,0 mg (0,11 mmol) p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat kombiniert. Die resultierende Lösung wurde für 18 h im Rückfluss erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie als farbloses Öl isoliert (10% EtOAc-Hexane). ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,01 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,51 (1H, s), 7,43 (1H, dd, J = 1,7, 6,4 Hz), 4,07 (2H, m), 3,79 (2H, m), 2,74 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,04 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,67 (3H, s), 1,46 (6H, s).
1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))naphthalin (Verbindung 100F)
Zu einer Lösung aus 496,2 mg (2,54 mmol) p-Tolyl-magnesiumbromid in 20 ml THF (2,54 ml; 1 M Lösung in Ether) wurde eine Lösung aus 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolan-yl))-1(2H)-naphthalinon (Verbindung 100E, 200,0 mg, 0,769 mmol) in THF (5 ml) zugefügt. Die Lösung wurde 16 h im Rückfluss erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Wasser gewaschen sowie mit gesättigtem wässrigen NH₄Cl und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und eine Säulenchromatographie (10% EtOAc/Hexane) ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,49 (1H, d, J = 1,7 Hz), 7,19 (2H, m), 7,10 (2H, d, J = 7,9 Hz), 7,04 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,05 (2H, m), 3,80 (2H, m), 2,34 (3H, s), 2,21 (1H, m), 2,10 (1H, m), 1,88 (1H, m), 1,65 (3H, s), 1,54 (1H, m), 1,39 (3H, s), 1,33 (3H, s).
3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-acetylnaphthalin (Verbindung 100G)
Eine Lösung aus 1,2,3,4-Tetrahydro-1-hydroxy-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl)naphthalin (Verbindung 100F) (160,0 mg, 0,52 mmol), p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (4 mg) und 30 ml Benzol wurde 12 h im Rückfluss erwärmt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit Ether (100 ml) verdünnt und mit 10%igem wässrigen Natriumbicarbonat, Wasser und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und die Lösungsmittel bei reduziertem Druck zum Erhalt der Titelverbindung entfernt, die durch Säulenchromatographie (10% EtOAc-Hexane) als gelbes Öl isoliert wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,97 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 1,7, 6,4 Hz), 7,22 (4H, s), 7,13 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,10 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,59 (3H, s), 2,40 (3H, s), 2,38 (2H, d, J = 4,7 Hz), 1,38 (6H, s).
4-[3-Oxo-3-(7,8-dihydro-5-(4-methylphenyl)-8,8-dimethyl-2-naphthalinyl)-1-propenyl]benzoesäure (Verbindung 101)
Zu einer Lösung aus 78,7 mg (0,272 mmol) 3,4-Dihydro-1-(4-methylphenyl)-4,4-dimethyl-6-acetylnaphthalin (Verbindung 100G) in 4,0 ml MeOH wurden 53,1 mg (0,354 mmol) 4-Carboxybenzaldehyd und 80 mg (2,00 mmol; 2,0 ml 1 M wässrige NaOH) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt, bei reduziertem Druck konzentriert und das restliche Öl in EtOAc gelöst. Die Lösung wurde mit 10%iger HCl behandelt und die organische Schicht mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und dann über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab die Titelverbindung als farblosen Feststoff, der durch Umkristallisierung aus CH₃CN gereinigt wurde. ¹H-NMR (Aceton-d₆) δ: 8,00 (7H, m), 7,83 (1H, d, J = 15,6 Hz), 7,24 (4H, s), 7,13 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,12 (1H, t, J = 4,5 Hz), 2,42 (2H, d, J = 4,8 Hz), 2,38 (3H, s), 1,41 (6H, s).
3,4-Dihydro-1-phenyl-4,4-dimethyl-6-acetylnaphthalin (Verbindung 100H)
Zu einer Lösung aus 508,0 mg (1,95 mmol) 3,4-Dihydro-4,4-dimethyl-6-(2-(2-methyl-1,3-dioxolanyl))-1(2H)naphthalinon (Verbindung 100E) in 10 ml THF wurden 496,2 mg (2,54 mmol; 2,54 ml einer 1 M Lösung in Et₂O) Phenylmagnesiumbromid zugefügt. Die resultierende Lösung wurde im Rückfluss 8 h erwärmt, H₂O wurde zugefügt und die Erwärmung 30 min fortgesetzt. Das THF wurde bei reduziertem Druck entfernt und der wässrige Rest mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), bei reduziertem Druck konzentriert und die Titelverbindung aus dem Rest durch Säulenchromatographie (10% EtOAc-Hexane) als farbloses Öl isoliert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 7,97 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,67 (1H, dd, J = 2,1, 8,0 Hz), 7,34 (5H, m), 7.10 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,12 (1H, d, J = 4,6 Hz), 2,59 (3H, s), 2,39 (2H, d, J = 4,8 Hz), 1,38 (6H, s).
4-[3-Oxo-3-(7,8-dihydro-5-phenyl-8,8-dimethyl-2-naphthalinyl)-2-propenyl]benzoesäure (Verbindung 103)
Zu einer Lösung aus 115,0 mg (0,42 mmol) 3,4-Dihydro-1-phenyl-4,4-dimethyl-6-acetylnapthalin (Verbindung 100H) und 65,0 mg (0,43 mmol) 4-Formylbenzoesäure in 5,0 ml EtOH und 1,0 ml THF wurden 120,0 mg (3,00 mmol; 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) NaOH zugefügt. Die resultierende gelbe Lösung wurde 12 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit 6%igem wässrigen HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden getrocknet (MgSO₄), bei reduziertem Druck konzentriert und die Titelverbindung durch Säulenchromatographie (50% EtOAc-Hexane) als schwachgelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (CDCl₃) δ: 8,13 (2H, d, J = 7,7 Hz), 8,04 (1H, s), 7,81 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,75 (3H, m), 7,60 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,35 (5H, m), 7,14 (1H, d, J = 8,1 Hz), 6,15 (1H, t, J = 4,2 Hz), 2,41 (2H, d, J = 4,2 Hz), 1,41 (6H, s).
3-Fluor-4-methoxythiophenol (Verbindung 200)
Ein Kolben, enthaltend Mg-Späne (651,9 mg, 26,8 g-Atome) wurde vorsichtig unter Argonflamme getrocknet. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde der Kolben mit 14,0 ml THF beladen, die Mischung wurde auf Rückflusstemperatur erwärmt und 3-Fluor-4-methoxy-1-brombenzol (5,00 g, 24,4 mmol) wurde langsam zugefügt, während die Mischung im Rückfluss kochte. Nach 6 h schien die Bildung des Grignard-Reagens vollständig zu sein. Die resultierende opak-orange Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und Schwefel (781,8 mg, 24,4 g-Atome) wurde in drei Teilen über 5 min zugefügt. Nach einem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die braune Mischung vorsichtig in eine 10%ige wässrige Eis-HCl-Mischung gegossen. Extraktion mit EtOAc wurde von einem Waschen der kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gefolgt sowie einem Trocknen über MgSO₄. Die Entfernung der Lösung wurde bei reduziertem Druck und Destillation (Kolben-zu-Kolben) des Rests ergab 2,14 g (55%) der Titelverbindung als farbloses Öl (Siedepunkt 90–100°C/5 mm). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,06 (2H, m), 6,85 (1H, t, J = 8,6 Hz), 3,87 (3H, s), 3,43 (1H, s).
3-(3-Fluor-4-methoxy-phenylsulfanyl)-3-methyl-buttersäure (Verbindung 201)
Ein schwerwandiges Schraubdeckelrohr wurde mit 3-Methyl-2-butensäure (1,23 g, 12,33 mmol), 3-Fluor-4-methoxythiophenol (Verbindung 200, 1,95 g, 12,33 mmol) und Piperidin (314,8 mg, 3,70 mmol) beladen. Diese Mischung wurde auf 105°C 23 h erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und in EtOAc (100 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wurde mit 1 M wässriger HCl, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über Na₂SO₄ gewaschen. Konzentration der trockenen Lösung bei reduziertem Druck ergab 3,22 g eines klargelben Öls, das in der nächsten Reaktion ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,32 (2H, m), 6,94 (1H, t, J = 8,4 Hz), 3,92 (3H, s), 2,54 (2H, s), 1,41 (6H, s).
3-(3-Fluor-4-methoxy-phenylsulfanyl)-3-methylbutyroylchlorid (Verbindung 202)
Zu einer Lösung aus 3-(3-Fluor-4-methoxy-phenylsulfanyl)-3-methyl-buttersäure (Verbindung 201, 3,00 g, 11,6 mmol) in 40 ml Benzol bei Raumtemperatur wurde eine Lösung aus Oxalylchlorid (2,21 g, 17,4 mmol) in 5 ml Benzol über 30 min zugefügt. Nach 3 h wurde die Lösung mit eiskaltem, 5%igem wässsrigen NaOh gewaschen (Achtung: ein großes Gasvolumen wird während dieses Verfahrens freigesetzt), gefolgt von eiskaltem H₂O und schließlich gesättigtem wässrigen NaCl. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und bei reduziertem Druck konzentriert, um 2,83 g eines klargelben Öls zu ergeben. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,27 (2H, m), 6,96 (1H, t, J = 8,4 Hz), 3,93 (3H, s), 3,13 (2H, s), 1,42 (6H, s).
6-Methoxy-7-fluor-2,2-dimethyl-thiochroman-4-on (Verbindung 203)
Zu einer Lösung des Acylchlorids (Verbindung 202, 2,80 g, 10,1 mmol) in 35 ml CH₂Cl₂ bei 0°C wurde tröpfchenweise eine Lösung SnCl₄ (2,64 g, 10,1 mmol) in 5 ml CH₂Cl₂ zugefügt. Nach 2,5 h wurde die Reaktion durch langsame Zugabe von 20 ml H₂O gelöscht. Die organische Schicht wurde mit 1 M wässriger HCl, 5% wässrigem NaOH, H₂O und schließlich gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Eine Konzentration bei reduziertem Druck ergab 1,90 g (78%) der Titelverbindung als gelbbraunen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,72 (1H, d, J = 8,9 Hz), 6,95 (1H, d, J = 11,0 Hz), 3,91 (3H, s), 2,85 (2H, s), 1,47 (6H, s).
6-Hydroxy-7-fluor-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 204)
Zu einer Lösung aus 6-Methoxy-7-fluor-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 203, 1,75 g, 7,29 mmol) in 25 ml CH₂Cl₂, gekühlt auf –23°C, wurde BBr₃ (5,46 g, 21,8 mmol; 21,8 ml einer 1 M Lösung in CH₂Cl₂) über eine 10-minütige Zeitspanne zugefügt. Nach einem Rühren für 23 h bei –230°C wurde die Lösung 3 h auf 0°C erwärmt und dann auf –78°C abgekühlt und durch langsame Zugabe von 25 ml H₂O gelöscht. Nach einem Aufwärmen auf Raumtemperatur wurde die wässrige Schicht mit CH₂Cl₂ extrahiert und die kombinierten organischen Schichten wurden mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (10 bis 20% EtOAc/Hexane) ergab 1,12 g (68%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,82 (1H, d, J = 9,3 Hz), 6,97 (1H, d, J = 10,4 Hz), 5,54 (1H, s), 2,86 (2H, s), 1,46 (6H, s).
2,2-Dimethyl-4-oxo-7-fluor-thiochroman-6-yl-trifluormethansulfonat (Verbindung 205)
Zu einer Lösung aus 6-Hydroxy-7-fluor-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 204, 1,12 g, 4,94 mmol) in 25,0 ml wasserfreiem Pyridin bei 0°C wurde Trifluormethansulfonsäureanhydrid (1,61 g, 5,68 mmol) zugefügt. Nach 18 h bei 0°C wurde die Lösung konzentriert und das restliche Öl in Et₂O gelöst, mit H₂O gewaschen, gefolgt von gesättigtem wässrigen NaCl und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und eine Säulenchromatographie (5 bis 8% EtOAc/Hexane) ergab 1,28 g (72%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,07 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,13 (1H, d, J = 9,7 Hz), 2,89 (2H, s), 1,50 (6H, s).
2,2-Dimethyl-6-trimethylsilanylethinyl-7-fluor-thiochroman-4-on (Verbindung 206)
Eine Lösung aus 2,2-Dimethyl-4-oxo-7-fluor-thiochroman-6-yl-trifluormethansulfonat (Verbindung 205, 1,28 g, 3,57 mmol) in 6,0 ml Et₃N und 15,0 ml DMF wurde mit Argon 15 min durchströmt. Zu dieser Lösung wurden Trimethylsilylacetylen (2,0 g, 20,4 mmol) und Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (100,0 mg, 0,14 mmol) zugefügt. Die Lösung wurde 6 h auf 95°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Lösung wurde mit H₂O verdünnt und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Konzentration der trockenen Lösung bei reduziertem Druck und Isolierung des Produkts durch Säulenchromatographie (3 bis 5% EtOAc/Hexane) ergab 850,0 mg (78%) der Titelverbindung als orangen Feststoff.
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,22 (1H, d, J = 7,5 Hz), 6,92 (1H, d, J = 9,3 Hz), 2,85 (2H, s), 1,46 (6H, s), 0,25 (9H, s).
6-Ethinyl-7-fluor-2,2-dimethylthiochroman-4-on (A) (Verbindung 207) und 6-Ethinyl-7-methoxy-2,2-dimethylthiochroman-4-on (B) (Verbindung 208)
Eine Lösung aus 2,2-Dimethyl-6-trimethylsilanylethinyl-7-fluor-thiochroman-4-on (Verbindung 206, 850,0 mg, 2,78 mmol) und K₂CO₃ (180 mg, 1,30 mmol) in 20,0 ml MeOH wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde zu einem Drittel des ursprünglichen Volumens konzentriert, mit EtOAc verdünnt, mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (5 bis 10% EtOAc/Hexane) des restlichen Feststoffs ergaben 330,0 mg (51%) der Verbindung 207 als gelben Feststoff und 217,0 mg (32%) der Verbindung 208 als gelben Feststoff. (Verbindung 207): ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,18 (1H, d, J = 7,5 Hz), 6,90 (1H, d, J = 8,3 Hz), 3,28 (1H, s), 2,81 (2H, s), 1,42 (6H, s). (Verbindung 208); ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,19 (1H, s), 6,64 (1H, s), 3,90 (3H, s), 3,26 (1H, s), 2,80 (2H, s), 1,44 (6H, s).
Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-oxo-7-fluor-thiochroman-6-yl)ethinyl]-benzoat (Verbindung 209)
Eine Lösung von 6-Ethinyl-7-fluor-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 207, 330,0 mg, 1,41 mmol) und Ethyl-4-iodbenzoat (392 mg, 1,41 mmol) in 10,0 ml Et₃N wurde mit Argon 15 min durchströmt. Zu dieser Lösung wurde Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (247 mg, 0,35 mmol) und Kupfer(I)-iodid (67,0 mg, 0,35 mmol) zugefügt. Nach einem Durchströmen für zusätzliche 10 min mit Argon wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt und durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung eines EtOAc-Waschgangs gefiltert. Konzentration des Filtrats bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (3 bis 5% EtOAc/Hexane) des restlichen Feststoffs ergaben 490,0 mg (91%) der Titelverbindung als gelben Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,31 (1H, d, J = 7,6 Hz), 8,04 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,00 (1H, d, J = 9,3 Hz), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,89 (2H, s), 1,50 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-oxo-7-methoxy-thiochroman-6-yl)ethinyl]benzoat (Verbindung 210)
Eine Lösung aus 6-Ethinyl-7-methoxy-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 208, 217,0 mg, 0,88 mmol) und Ethyl-4-iodbenzoat (245,0 mg, 0,89 mmol) in 10,0 ml Et₃N und 2 ml THF wurde mit Argon 15 min gereinigt. Zu dieser Lösung wurde Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (154,0 mg, 0,22 mmol) und Kupfer(I)-iodid (42,0 mg, 0,22 mmol) zugefügt. Nach einem Durchströmen für zusätzliche 10 min mit Argon wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc verdünnt und durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung eines EtOAc-Waschgangs gefiltert. Konzentration des Filtrats bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (5 bis 10% EtOAc/Hexane) des restlichen Feststoffs ergaben 320,0 mg (92%) der Titelverbindung als orangen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,29 (1H, s), 8,03 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,4 Hz), 6,70 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,96 (3H, s), 2,86 (2H, s), 1,50 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 201)
Eine Lösung aus Natriumbis(trimethylsilyl)amid (256,7 mg, 1,44 mmol) in 3,4 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-oxo-7-fluor-thiochroman-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 209, 460,0 mg, 1,20 mmol) in 3,0 ml wurde langsam zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-Bis(trifluormethansulfonyl)amino]-5-pyridin (518,0 mg, 1,32 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Nach 5 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 6 h gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5%igem wässrigen NaOH und H₂O vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 549,0 mg (89%), wurde durch Säulenchromatographie (3 bis 5% EtOAc/Hexane) als schwachgelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,04 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,61 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,60 (1H, d, J = 6,7 Hz), 7,08 (1H, d, J = 9,0 Hz), 5,88 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,53 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-7-methoxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 212)
Eine Lösung aus Natriumbis(trimethylsilyl)amid (155,9 mg, 0,85 mmol) in 2,90 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-oxo-7-methoxy-thiochroman-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 210, 280,0 mg, 0,71 mmol) in 3,0 ml wurde langsam zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-Bis(trifluormethansulfonyl)amino]-5-pyridin (355,0 mg, 0,85 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Nach 5 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und 6 h gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5%igem wässrigen NaOH und H₂O vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 300,0 mg (80%), wurde durch Säulenchromatographie (15% EtOAc/Hexane) als oranger Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,02 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (1H, s), 6,82 (1H, s), 5,76 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,92 (3H, s), 1,51 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 213)
Eine Lösung aus 4-Methylbrombenzol (290,0 mg, 1,69 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (217,2 mg, 3,39 mmol, 2,0 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (409,0 mg, 3,00 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 211, 158,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF übertragen. Diese Lösung wurde 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Diese Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 120,0 mg (86%) wurde durch Säulenchromatographie isoliert (3% EtOAc/Hexane) ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,54 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,27–7,13 (6H, m), 5,79 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,42 (3H, s), 1,48 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(5-methyl-thiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]-benzoat (Verbindung 214)
Eine Lösung aus 2-Methylthiophen (130,0 mg, 1,30 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und n-Butyllithium (83,3 g, 1,30 mmol, 0,84 ml einer 1,6 M Lösung in Hexanen) wurde zugefügt und die Lösung wurde für 1,5 h auf 0°C erwärmt. Eine Lösung aus ZnCl₂ (341,0 mg, 2,50 mmol) in 3,0 ml THF wurde langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 40 min gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-yl)ethinyl]-benzoat (Verbindung 211, 158,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF übertragen. Diese Lösung wurde 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Diese Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 70,0 mg (50%) wurde durch Säulenchromatographie (3% EtOAc/Hexane) als wachsartiger Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,61 (1H, d, J = 7,5 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,13 (1H, d, J = 7,2 Hz), 6,82 (1H, d, J = 4,4 Hz), 6,73 (1H, d, J = 4,4 Hz), 5,96 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,52 (3H, s), 1,46 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-7-methoxy-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 215)
Eine Lösung aus 4-Methylbrombenzol (499,0 mg, 2,92 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (374,2 mg, 5,84 mmol, 3,4 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (613,0 mg, 4,50 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-7-methoxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 212, 285,0 mg, 0,54 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF übertragen. Diese Lösung wurde 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Diese Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 200,0 mg (79%) wurde durch Säulenchromatographie als farbloser Feststoff isoliert (2 bis 5% EtOAc/Hexane). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,54 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,23–7,21 (5H, m), 5,71 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 3,95 (3H, s), 2,41 (3H, s), 1,49 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
3-(4-Methoxy-phenylsulfanyl)-3-methyl-buttersäure (Verbindung 216)
Ein schwerwandiges Schraubdeckelrohr wurde mit 3-Methyl-2-butensäure (13,86 g, 138,4 mmol), 4-Methoxythiophenol (20,0 g, 138,4 mmol) und Piperidin (3,45 g, 41,6 mmol) beladen. Diese Mischung wurde für 32 h auf 105°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und in EtOAc (700 ml) gelöst. die resultierende Lösung wurde mit 1 M wässriger HCl, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über Na₂SO₄ gewaschen. Die Konzentration der trockenen Lösung bei reduziertem Druck ergab ein Öl, das bei Stehenlassen im Gefrierschrank einen kristallinen Feststoff ergab. Die Titelverbindung wurde als schwachgelbe Kristalle durch Waschen des kristallinen Feststoffs mit Pentan isoliert (27,33 g, 82%). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,48 (2H, d, J = 9,0 Hz), 6,89 (2H, d, J = 8,9 Hz), 3,83 (3H, s), 2,54 (2H, s), 1,40 (6H, s).
3-(4-Methoxy-phenylsulfanyl)-3-methyl-butyroylchlorid (Verbindung 217)
Zu einer Lösung aus 3-(4-Methoxy-phenylsulfanyl)-3-methylbuttersäure (Verbindung 216, 20,0 g, 83,2 mmol) in 250 ml Benzol bei Raumtemperatur wurde eine Lösung Oxalylchlorid (15,84 g, 124,8 mmol) in 10 ml Benzol über 30 min zugefügt. Nach 4 h wurde die Lösung mit eiskaltem, 5%igem wässrigen NaOH (Achtung: ein großes Gasvolumen wird während dieses Verfahrens freigesetzt), gefolgt von eiskaltem H₂O und schließlich gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und bei reduziertem Druck konzentriert, um ein klar gelbes Öl zu ergeben. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,45 (2H, d, J = 8,8 Hz), 6,90 (2H, d, J = 8,8 Hz), 3,84 (3H, s), 3,12 (2H, s), 1,41 (6H, s).
6-Methoxy-2,2-dimethyl-thiochroman-4-on (Verbindung 218)
Zu einer Lösung des Acylchlorids (Verbindung 217, 21,5 g, 83,2 mmol) in 250 ml CH₂Cl₂ bei 0°C wurde tröpfchenweise eine Lösung aus SnCl₄ (21,7 g, 83,2 mmol) in 30 ml CH₂Cl₂ zugefügt. Nach 2 h wurde die Reaktion durch langsame Zugabe von 150 ml H₂O gelöscht. Die organische Schicht wurde mit 1 M wässriger HCl, 5% wässrigem NaOH, H₂O, und schließlich gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen vor einem Trocknen über MgSO₄. Eine Konzentration bei reduziertem Druck und eine Vakuumdestillation des restlichen Öls (Kolben-zu-Kolben, 125–135°C, 5 mmHg) ergab 14,48 g (78%) der Titelverbindung als schwach gelbes Öl. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,62 (1H, d, J = 2,9 Hz), 7,14 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,03 (1H, dd, J = 2,8 8,3 Hz), 3,83 (3H, s), 2,87 (2H, s), 1,46 (6H, s).
6-Hydroxy-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 219)
Zu einer Lösung aus 6-Methoxy-2,2-dimethyl-thiochroman-4-on (Verbindung 218, 6,0 g, 27 mmol) in 50 ml CH₂Cl₂, gekühlt auf –23°C, wurde BBr₃ (20,0 g, 80,0 mmol; 80,0 ml einer 1 M Lösung in CH₂Cl₂) über eine 20-minütige Zeitspanne zugefügt. Nach einem Rühren für 5 h bei –23°C wurde die Lösung auf –78°C abgekühlt und durch langsame Zugabe von 50 ml H₂O gelöscht. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wurde die wässrige Schicht mit CH₂Cl₂ extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit gesättigtem wässrigen NaHCO₃, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen über MgSO₄ gewaschen. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck ergab einen grünbraunen Feststoff, der bei Umkristallisierung (Et₂O/Hexane) 2,25 g (40%) der Titelverbindung als hellbraunen Feststoff ergab. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,63 (1H, d, J = 2,8 Hz), 7,15 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,01 (1H, dd, J = 2,8, 8,5 Hz), 2,87 (2H, s), 1,46 (6H, s).
2,2-Dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-yl-trifluormethansulfonat (Verbindung 220)
Zu einer Lösung aus 6-Hydroxy-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 219, 165,0 mg, 0,79 mmol) in 5,0 ml wasserfreiem Pyridin bei 0°C wurde Trifluormethansulfonsäureanhydrid (245,0 mg, 0,87 mmol) zugefügt. Nach 4 h bei 0°C wurde die Lösung konzentriert und das restliche Öl in Et₂O gelöst, mit H₂O gewaschen, gefolgt von gesättigtem wässrigen NaCl und getrocknet über MgSO₄. Die Entfernung der Lösungsmittel bei reduziertem Druck und eine Säulenchromatographie (5 EtOAc/Hexane) ergaben 126,0 mg (47%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,97 (1H, s), 7,32 (2H, s), 2,90 (2H, s), 1,49 (6H, s).
2,2-Dimethyl-6-trimethylsilanylethinyl-thiochroman-4-on (Verbindung 221)
Eine Lösung aus 2,2-Dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-yl-trifluormethansulfonat (Verbindung 220, 2,88 g, 8,50 mmol) in 10 ml Et₃N und 20,0 ml DMF wurde für 10 min mit Argon durchströmt. Zu dieser Lösung wurden Trimethylsilylacetylen (4,15 g, 42,0 mmol) und Bis(triphenylphosphin)-palladium(II)-chlorid (298,0 mg, 0,425 mmol) zugefügt. Die Lösung wurde 5 h auf 95°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit H₂O verdünnt. Eine Extraktion mit EtOAc, gefolgt von einem Waschen der kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl und einem Trocknen über MgSO₄ wurde durchgeführt. Die Konzentration der trockenen Lösung bei reduzierten Druck und die Isolierung des Produkts durch Säulenchromatographie (3% EtOAc/Hexane) ergaben 2,23 g (91%) der Titelverbindung als oranges Öl (¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,18 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,34 (1H, dd, J = 1,9, 8,1 Hz), 7,15 (1H, d, J = 8,1 Hz), 2,85 (2H, s), 1,45 (6H, s), 0,23 (9H, s).
6-Ethinyl-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 222)
Eine Lösung aus 2,2-Dimethyl-6-trimethylsilanylethinyl-thiochroman-4-on (Verbindung 221, 110,0 mg, 0,38 mmol) und K₂CO₃ (40,0 mg, 0,29 mmol) in 10,0 ml MeOH wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit H₂O verdünnt und mit Et₂O extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O gewaschen sowie mit gesättigtem wässrigen NaCl und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck ergab 81 mg (99%) der Titelverbindung als oranges Öl. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,20 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,46 (1H, dd, J = 1,9, 8,1 Hz), 7,18 (1H, d, J = 8,1 Hz), 3,08 (1H, s), 2,86 (2H, s), 1,46 (6H, s).
Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-yl)ethinyl]-benzoat (Verbindung 223)
Eine Lösung aus 6-Ethinyl-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 222, 82,0 mg, 0,38 mmol) und Ethyl-4-iodbenzoat (104,9 mg), 0,38 mmol) in 5,0 ml Et₃N wurde 10 min mit Argon durchströmt. Zu dieser Lösung wurden Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (88,0 mg, 0,12 mmol) und Kupfer(I)-iodid (22,9 mg, 0,12 mmol) zugefügt. Nach einem Durchströmen für zusätzliche 5 min mit Argon wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung einer Et₂O-Waschung gefiltert. Die Konzentration des Filtrats bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie des restlichen Feststoffs ergaben 100 mg (72%) der Titelverbindung als gelben Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,25 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,53 (1H, dd, J = 1,8, 8,2 Hz), 7,21 (1H, d, J = 8,2 Hz), 4,37 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,88 (2H, s), 1,47 (6H, s), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-((2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-yl)ethinyl)-benzoat (Verbindung 224)
Eine Lösung aus Natriumbis(trimethylsilyl)amid (1,12 g, 6,13 mmol) in 16,2 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 223, 1,86 g, 5,10 mmol) in 15,0 ml wurde langsam zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-Bis(trifluormethansulfonyl)amino]-5-pyridin (2,40 g, 6,13 mmol) in 10 ml THF zugefügt. Nach 5 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5%igem NaOH und H₂O vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 1,53 g (61%), wurde durch Säulenchromatographie (2% EtOAc/Hexane) als gelber Feststoff isoliert. (¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,61 (1H, d, J = 1,8 Hz), 7,59 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,41 (1H, dd, J = 1,8, 8,1 Hz), 7,29 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,91 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,53 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-phenyl-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-benzoat (Verbindung 225)
Eine Lösung aus Brombenzol (190,0 mg, 1,18 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (151,2 mg, 2,36 mmol, 1,4 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zugefügt, um eine gelbe Lösung zu erhalten. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (225,0 mg, 1,4 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 224, 200,0 mg, 0,40 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF übertragen. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 155,0 mg (91%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. (¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,42–7,24 (8H, m), 5,78 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,50 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-benzoat (Verbindung 226)
Eine Lösung aus 4-Methylbrombenzol (203,0 g, 1,15 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (147,4 mg, 2,30 mmol, 1,4 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (219,4 mg, 1,4 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 224, 230,0 mg, 0,46 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 165,0 mg (82%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,35–7,21 (7H, m), 5,84 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,42 (3H, s), 1,48 (6H, s), 1,40 (3H, s).
Ethyl-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 227)
Eine Lösung aus 4-Ethylbrombenzol (670,9 mg, 3,63 mmol) in 4,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (464,5 mg, 7,25 mmol, 4,26 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (658,7 mg, 4,83 mmol) in 8,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 224, 1,20 mg, 2,42 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (111,7 mg, 0,097 mmol) in 8,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40 (5H, m), 7,35 (2H, m), 5,85 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,72 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,48 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,30 (3H, t, J = 7,6 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-isopropylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 228)
Eine Lösung aus 4-Isopropylbrombenzol (161 mg, 0,81 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (103,8 mg, 1,62 mmol, 0,95 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (175,5 mg, 1,3 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 224, 160,0 mg, 0,32 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 128,0 mg (85%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloses Öl isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,1 Hz), 7,38–7,22 (7H, m), 5,86 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,98 (1H, hept, 7,0 Hz), 1,49 (6H, s), 1,43 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,32 (6H, d, J = 7,0 Hz).
Ethyl-4-[[4-(t-tert-butylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 229)
Eine Lösung aus 4-tert-Butylbrombenzol (149,0 mg, 0,70 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (92,6 mg, 1,44 mmol, 0,85 ml in einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (133,0 mg, 0,98 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 224, 140,0 mg, 0,28 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 94,0 mg (70%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,43–7,22 (7H, m), 5,86 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,47 (6H, s), 1,40 3H, t, J = 7,1 Hz), 1,38 (9H, s).
Ethyl-4-[[4-(5-methyl-thiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 230)
Eine Lösung aus 2-Methylthiophen (100,0 mg, 1,00 mmol) in 2 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und n-Butyllithium (64,0 mg, 1,00 mmol, 0,63 ml einer 1,6 M Lösung in Hexanen) wurde zugefügt und die Lösung auf 0°C für 1,5 h erwärmt. Eine Lösung aus ZnCl₂ (218,0 mg, 1,60 mmol) in 3,0 ml THF wurde langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 40 min gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-yl)ethinyl]benzoat (Verbindung 224, 200,0 mg, 0,40 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 170,0 mg (96%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als schwachgelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,63 (1H, s), 7,55 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,35 (2H, s), 6,82 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,72 (1H, m), 6,00 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,52 (3H, s), 1,46 (6H, s), 1,40 (2H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(5-ethyl-thiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 231)
Eine Lösung aus 2-Ethylthiophen (112,0 mg, 1,00 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und n-Butyllithium (64,0 mg, 1,00 mmol, 0,63 ml einer 1,6 M Lösung in Hexanen) wurde zugefügt und die Lösung für 1,5 h auf 0°C erwärmt. Eine Lösung aus ZnCl₂ (218,0 mg, 1,60 mmol) in 3,0 ml THF wurde langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 40 min gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-yl)ethinyl]benzoat (Verbindung 224, 200,0 mg, 0,40 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF übertragen. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 29,0 mg (16%), wurde durch Säulenchromatographie (1,25% EtOAc/Hexane) als schwach-gelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,65 (1H, s), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,35 (2H, s), 6,84 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,77 (1H, m), 6,02 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,88 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,46 (6H, s), 1,41 (2H, t, J = 7,1 Hz), 1,35 (2H, t, J = 7,6 Hz).
Ethyl-4-[[4-(5-tert-butyl-thiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]-benzoat (Verbindung 232)
Eine Lösung aus 2-tert-Butylthiophen (105,0 mg, 0,75 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und n-Butyllithium (48,1 mg, 0,75 mmol, 0,47 ml einer 1,6 M Lösung in Hexanen) wurde zugefügt und die Lösung für 1,5 h auf 0°C erwärmt. Eine Lösung aus ZnCl₂ (163,2 mg, 1,20 mmol) in 3,0 ml THF wurde langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 40 min gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-yl)ethinyl]benzoat (Verbindung 224, 200,0 mg, 0,40 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (20,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF übertragen. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 110,0 mg (76%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,68 (1H, s), 7,56 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,36 (2H, m), 6,82 (2H, m), 6,04 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,46 (6H, s), 1,43 (9H, s), 1,41 (2H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(6-methyl-pyridin-3-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 233)
Eine Lösung aus 4-Brom-2-methylpyridin (220,0 mg, 1,28 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (164,0 mg, 2,56 mmol, 1,5 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer rot-orangen Lösungen zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (348,0 mg, 2,56 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt, 40 min gerührt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 224, 172 mg, 0,35 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF übertragen. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 109,0 mg (72%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als schwachgelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,45 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,00 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,49 (1H, dd, J = 2,3, 8,1 Hz), 7,36 (2H, m), 7,20 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,16 (1H, d, J = 1,5 Hz), 5,86 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,63 (3H, s), 1,50 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-yl)ethinyl]-2-fluorbenzoat (Verbindung 234)
Eine Lösung aus 6-Ethinyl-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 222, 1,37 g, 6,34 mmol) und Ethyl-2-fluor-4-iodbenzoat (1,86 g, 6,34 mmol) in 40,0 ml Et₃N wurden 20 min mit Argon gereinigt. Zu dieser Lösung wurden Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (1,05 g, 1,5 mmol) und Kupfer(I)-iodid (286,0 mg, 1,5 mmol) zugefügt. Nach zusätzlichem 10-minütigen Durchströmen mit Argon wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung einer Et₂O-Waschung gefiltert. Konzentration des Filtrats bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) des restlichen Feststoffs ergaben 1,88 g (78%) der Titelverbindung als gelben Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,27 (1H, d, J = 1,9 Hz), 7,92 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,52 (1H, dd, J = 1,9, 8,2 Hz), 7,36–7,24 (3H, m), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,90 (2H, s), 1,50 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-2-fluorbenzoat (Verbindung 235)
Eine Lösung aus Natriumbis(trimethylsilyl)amid (0,82 g, 5,90 mmol) in 16,2 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-yl)ethinyl]-2-fluorbenzoat (Verbindung 234, 1,88 g, 4,91 mmol) in 15,0 ml wurde langsam zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-Bis(trifluormethansulfonyl)amino]-5-pyridin (2,32 g, 5,90 mmol) in 10 ml THF zugefügt. Nach 5 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5%igem wässrigen NaOH und H₂O vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 1,80 g (71%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als gelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,93 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,61 (1H, d, J = 1,6 Hz), 7,43–7,27 (4H, m), 5,92 (1H, s), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,53 (6H, s), 1,42 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]-2-fluorbenzoat (Verbindung 236)
Eine Lösung aus 4-Methylbrombenzol (280,0 mg, 1,64 mmol) in 2,0 THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (209,5 mg, 3,27 mmol, 1,9 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (680,0 mg, 5,0 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 234, 200,0 mg, 0,39 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 1 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 177,0 mg (79%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als schwachgelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,88 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,28–7,18 (9H, m), 5,84 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,42 (3H, s), 1,48 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]-2-fluorbenzoat (Verbindung 237)
Eine Lösung aus 4-Ethylbrombenzol (185,0 mg, 1,00 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C gekühlt und tert-Butyllithium (128,5 mg, 2,0 mmol, 1,2 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (204,5 mg, 1,5 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 234, 200,0 mg, 0,39 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 158,0 mg (86%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als schwachgelber Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,88 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,39–7,20 (9H, m), 5,86 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,72 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,49 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,30 (3H, t, J = 7,6 Hz).
Ethyl-6-[(2,2-dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-yl)ethinyl]nicotinat (Verbindung 238)
Eine Lösung aus 6-Ethinyl-2,2-dimethylthiochroman-4-on (Verbindung 222, 510,0 mg, 2,36 mmol) und Ethyl-6-iodnicotinat (654,0 mg, 2,36 mmol) in 20,0 ml Et₃N wurde mit Argon 20 min gereinigt. Zu dieser Lösung wurden Bis(triphenylphosphin)-palladium(II)-chlorid (425,0 mg, 0,60 mmol) und Kupfer(I)-iodid (115,0 mg, 0,60 mmol) zugefügt. Nach einem Durchströmen für zusätzliche 10 min mit Argon wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc (20 ml) verdünnt und durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung einer Et₂O-Waschung gefiltert. Die Konzentration des Filtrats bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (10 bis 20% EtOAc/Hexane) des restlichen Feststoffs ergab 675 mg (78%) der Titelverbindung als orangen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 9,20 (1H, d, J = 1,0 Hz), 8,34 (1H, d, J = 1,8 Hz), 8,29 (1H, dd, J = 2,2, 8,2 Hz), 7,60 (2H, m), 7,25 (1H, d, J = 8,4 Hz), 4,43 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,90 (2H, s), 1,49 (6H, s), 1,43 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-6-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)-nicotinat (Verbindung 239)
Eine Lösung aus Natriumbis(trimethylsilyl)amid (284,2 mg, 1,55 mmol) in 3,6 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus Ethyl-6-(2,2-dimethyl-4-oxo-thiochroman-6-ylethinyl)-nicotinat (Verbindung 238, 480,0 mg, 1,31 mmol) in 3,0 ml THF wurde langsam zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-Bis(trifluormethansulfonyl)amino]-5-pyridin (608,0 mg, 1,55 mmol) in 3,0 ml THF zugefügt. Nach 5 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5%igem wässrigen NaOH und H₂O vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie (20% EtOAc/Hexane) als gelber Feststoff, 566,0 mg (87%), isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 9,21 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,30 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,68 (1H, d, J = 1,5 Hz), 7,61 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,49 (1H, dd, J = 1,7, 8,1 Hz), 7,31 (1H, d, J = 8,2 Hz), 5,92 (1H, s), 4,41 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,53 (6H, s), 1,43 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-6-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]nicotinat (Verbindung 240)
Eine Lösung aus 4-Methylbrombenzol (280,0 mg, 1,64 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (209,5 mg, 3,27 mmol, 1,9 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (680,0 mg, 5,0 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-6-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)nicotinat (Verbindung 239, 120,0 mg, 0,24 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (20,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 80,0 mg (76%), wurde durch Säulenchromatographie (10 bis 15% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 9,15 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,23 (1H, dd, J = 2,1, 8,0 Hz), 7,51 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,40–7,32 (3H, m), 7,18 (4H, m), 5,83 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,40 (3H, s), 1,47 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-6-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]-nicotinat (Verbindung 241)
Eine Lösung aus 4-Ethylbrombenzol (300,0 mg, 1,62 mmol) in 2,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (207,6 mg, 3,24 mmol, 1,9 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (408.0 mg, 3,0 mmol) in 4,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-6-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-thiochromen-6-ylethinyl)nicotinat (Verbindung 239, 178,0 mg, 0,36 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 1 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung wurde durch Säulenchromatographie (10 bis 15% EtOAc/Hexane) und Umkristallisation aus CH₃CN isoliert, um 136,0 mg (83%) schwach-gelbe Kristalle zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 9,15 (1H, s), 8,23 (1H, dd, J = 2,2, 8,2 Hz), 7,51 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,49–7,34 (3H, m), 7,24–7,17 (4H, m), 5,83 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz) 2,70 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,47 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,29 (3H, t, J = 7,1 Hz).
4-[[4-Phenyl-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 242)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-phenyl-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 225, 105,0 mg, 0,247 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN unter Erhalt der Titelverbindung als schwach-gelben Feststoff umkristallisert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,48–7,29 (7H, m), 7,18 (1H, d, J = 1,3 Hz), 5,96 (1H, s), 1,48 (6H, s).
4-[[4-(4-Methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 243)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 226, 126,0 mg, 0,287 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (160,0 mg, 4,00 mmol, 2,0 ml einer 2 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN unter Erhalt der Titelverbindung als schwach-gelben Feststoff, 85,0 mg (72%), umkristallisert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,45–7,38 (2H, m), 7,28–7,17 (5H, m), 5,92 (1H, s), 2,37 (3H, s), 1,47 (6H, s).
4-[[4-(4-Ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 244)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 227, 940,0 mg, 2,08 mmol) in 10,0 ml THF und 5,0 ml EtOH wurde NaOH (416,0 mg, 10,4 mmol, 5,2 ml einer 2 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN umkristallisiert, um 786,0 mg (89%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,42 (2H, m), 7,29 (2H, m), 7,22 (3H, m), 5,94 (1H, s), 2,69 (2H, q, J = 7,7 Hz), 1,47 (6H, s), 1,25 (3H, t, J = 7,7 Hz).
4-[[4-(4-isopropylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 245)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-isopropylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 228, 89,0 mg, 0,19 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (80,0 mg, 2,0 mmol, 2,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 78,0 mg (93%) der Titelverbindung als schwach-gelber Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,58 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45–7,21 (7H, m), 5,93 (1H, s), 2,95 (1H, hept, J = 7,0 Hz), 1,47 (6H, s), 1,25 (6H, d, J = 7,0 Hz).
4-[[4-(4-tert-Butylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-benzoesäure (Verbindung 246)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-tert-butylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 229, 65,0 mg, 0,135 mmol) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurde NaOH (80,0 mg, 2,0 mmol, 2,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 33,0 mg (54%) der Titelverbindung als schwach-gelber Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,45 (4H, m), 7,24 (3H, m), 5,93 (1H, s), 1,47 (6H, s), 1,34 (9H, s).
4-[[4-(5-Methyl-thiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoesäure (Verbindung 247)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(5-methylthiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 230, 143,0 mg, 0,322 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (160,0 mg, 4,0 mmol, 4,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert.
Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN unter Erhalt der Titelverbindung (110,0 mg) (82%) als schwach-gelber Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (1H, s), 7,44 (2H, s), 6,87 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,79 (1H, m), 6,10 (1H, s), 2,49 (3H, s), 1,45 (6H, s).
4-[[4-(5-Ethyl-thiophenyl-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinylbenzoesäure (Verbindung 248)
Zu einer Lösung von Ethyl-4-[[4-(5-ethylthiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 231, 23,0 mg, 0,05 mmol) in 1,0 ml THF und 1,0 ml EtOH wurde NaOH (40,0 mg, 1,0 mmol, 1.0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN unter Erhalt der Titelverbindung, 15,5 mg (72%), als oranger Feststoff umkristallisiert. ¹NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,61 (1H, s), 7,44 (2H, s), 6,90 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,83 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,10 (1H, s), 2,86 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,45 (6H, s), 1,30 (3H, t, J = 7,6 Hz).
4-[[4-(5-tert-Butylthiopen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 249)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(5-tert-butylthiophen-2-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 232, 88,0 mg, 0,181 mmol) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurde NaOH (160,0 mg, 4,0 mmol, 4,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN unter Erhalt der Titelverbindung, 68,0 mg (82%), als blass-gelber Feststoff umkristallisiert. ¹NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,63 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,62 (1H, s), 7,44 (2H, d, J = 1,2 Hz), 6,87 (2H, s), 6,11 (1H, s), 1,45 (6H, s), 1,39 (9H, s).
4-[[4-(6-Methylpyridin-3-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-benzoesäure (Verbindung 250)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(6-methylpyridin-3-yl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 233, 70,0 mg, 0,159 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei 35°C gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus Aceton zum Erhalt von 60,0 mg (92%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,36 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,91 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,60 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,56 (1H, dd, J = 2,1, 8,0 Hz), 7,45 (2H, m), 7,31 (1H, d, J = 8,0 Hz), 7,06 (1H, s), 6.06 (1H, s), 2,51 (3H, s), 1,44 (6H, s).
4-[[4-(4-Methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-2-fluorbenzoesäure (Verbindung 251)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-2-fluorbenzoat (Verbindung 236, 100,0 mg, 0,219 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (80,0 mg, 2,0 mmol, 2,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 40°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN unter Erhalt der Titelverbindung, 78,0 mg (83%), als schwach-gelber Feststoff umkristallisert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 7,94 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,43–7,17 (9H, m), 5,93 (1H, s), 2,38 (3H, s), 1,47 (6H, s).
4-[[4-(4-Ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-2-fluorbenzoesäure (Verbindung 252)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-2-fluorbenzoat (Verbindung 237, 125 mg, 0,266 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN unter Erhalt der Titelverbindung, 100,0 mg (86%), als schwach-gelber Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 7,94 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,43–7,0 (9H, m), 5,93 (1H, s), 2,68 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,47 (6H, s), 1,24 (3H, t, J = 7,6 Hz).
6-[[4-(4-Methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-nicotinsäure (Verbindung 253)
Zu einer Lösung aus Ethyl-6-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]nicotinat (Verbindung 240, 66,0 mg, 0,15 mmol) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurde NaOH (80,0 mg, 2,0 mmol, 2,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck, um 50,0 mg (81%) der Titelverbindung als gelber Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 9,09 (1H, d, J = 1,4 Hz), 8,30 (1H, dd, J = 2,0, 8,1 Hz), 7,65 (1H, d, J = 8,1 Hz), 7,46 (2H, s), 7,24 (5H, m), 5,94 (1H, s), 2,37 (3H, s), 1,48 (6H, s).
6-[[4-(4-Ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]nicotinsäure (Verbindung 254)
Zu einer Lösung aus Ethyl-6-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]nicotinat (Verbindung 241, 110,0 mg, 0,24 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Diese Mischung wurde für 1 h auf 40°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die resultierende Lösung über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde, um 100 mg (96%) der Titelverbindung als farblosen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 9,08 (1H, d, J = 2,0 Hz), 8,30 (1H, dd, J = 2,2, 8,2 Hz), 7,66 (1H, d, J = 8,2 Hz), 7,46 (2H, s), 7,31–7,21 (5H, m), 5,95 (1H, s), 2,69 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,48 (6H, s), 1,25 (3H, t, J = 7,6 Hz).
4-[[4-(4-Methylphenyl)-2,2-dimethyl-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]-benzoesäure (Verbindung 255)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-yl]-ethinyl]-benzoat (Verbindung 213, 108,0 mg, 0,236 mmol) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN umkristallisiert, um 85 mg (80%) der Titelverbindung als schwach-gelber Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,61 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,31–7,18 (6H, m), 5,90 (1H, s), 2,37 (3H, s), 1,48 (6H, s).
4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-7-methoxy-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 256)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-7-methoxy-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]-benzoat (Verbindung 215, 64,0 mg, 0,113 mmol) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurde NaOH (80,0 mg, 2,0 mmol, 2,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN umkristallisiert, um 50 mg (83%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,56 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,28–7,14 (5H, m), 7,06 (1H, s), 5,76 (1H, s), 3,96 (3H, s), 2,36 (3H, s), 1,47 (6H, s).
4-[[4-(5-Methyl-2-thienyl)-2,2-dimethyl-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 257)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(5-methyl-2-thienyl)-2,2-dimethyl-7-fluor-(2H)-thiochromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 214, 58,0 g, 0,125 mmol) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurde NaOH (80,0 mg, 2,0 mmol, 2,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 45°C erwärmt und über Nacht gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄) vor Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN umkristallisiert, um 50 mg (90%) der Titelverbindung als schwach-gelber Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,05 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,56 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,61 (1H, d, J = 7,4 Hz), 7,31 (1H, d, J = 9,6 Hz), 6,89 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,79 (1H, d, J = 3,5 Hz), 6,06 (1H, s), 2,49 (3H, s), 1,46 (6H, s).
4-Bromphenylacetat (Verbindung 258)
Zu einer Lösung aus 4-Bromphenyl (20,0 g, 0,121 mol) in 200 ml CH₂Cl₂ wurde Triethylamin (14,0 g, 0,139 mmol), gefolgt von Acetylchlorid (9,53 g, 0,121 mol) in kleinen Teilen bei Raumtemperatur zugefügt. Nach einem Rühren für 21 h wurde die Mischung in 200 ml H₂O gegossen. Die organische Schicht wurde mit 5%igem wässrigen NaOH und H₂O gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels bei reduziertem Druck und Destillation des Rests ergab 20,6 g (83%) des Produkts als farbloses Öl, Siedepunkt 93–95°C/2 mm.
2-Hydroxy-5-brom-acetophenon (Verbindung 259)
Eine Mischung aus AlCl₃ (6,20 g, 46,50 mmol) und 4-Bromphenylacetat (Verbindung 258, 10,0 g, 46,50 mmol) wurde für 30 min auf 150°C erwärmt, während ein Argonstrom über den geschmolzenen Feststoff geführt wurde. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der orange Feststoff vorsichtig mit 100 ml H₂O und 100 ml 10%iger wässriger HCl behandelt. Die resultierende Mischung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen vor einem Trocknen über Na₂SO₄. Die Konzentration der Lösung bei reduziertem Druck ergab einen gelbbraunen Feststoff, der nach Umkristallisierung aus i-PrOH 7,18 g (72%) der Titelverbindung als gebrochen-weißen kristallinen Feststoff bereitstellt. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 12,17 (1H, s), 7,84 (1H, d, J = 2,6 Hz), 7,55 (1H, dd, J = 2,5, 9,0 Hz), 6,90 (1H, d, J = 8,9 Hz), 2,64 (3H, s).
2,2-Dimethyl-6-brom-chroman-4-on (Verbindung 260)
Zu einer Lösung aus Piperidin (2,83 g, 33,25 mmol) in 45 ml Benzol wurde Trifluoressigsäure (344,6 mg, 3,02 mmol) als Lösung in 4,0 ml Benzol zugefügt. Aceton (8,78 g, 151,3 mmol) wurde zugefügt, gefolgt von 2-Hydroxy-5-bromacetophenon (Verbindung 259, 6,50 g, 30,23 mmol). Die resultierende Lösung wurde im Rückfluss in einem Kolben erwärmt, der mit einer Dean-Stark-Falle ausgerüstet war. Nach 24 h wurden zusätzliche 2,5 Äquivalente Aceton und 0,1 Äquivalente Trifluoressigsäure zugefügt. Nach einer Gesamtzeit von 43 h wurde die Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt und mit EtOAc verdünnt. Die Lösung wurde mit 1 M wässrigem HCl, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Destillation des restlichen Öls (Kolben-zu-Kolben) ergab 4,80 g (62%) der Titelverbindung als klares gelbes Öl, Siedepunkt 105–115°C/5 mm. Die Reaktionsbedingungen hier sind eine leichte Veränderung der Synthese der Titelverbindung, wie beschrieben von Buckle et al. in J. Med. Chem. 1990 3028–3034. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,97 (1H, d, J = 2,6 Hz), 7,54 (1H, dd, J = 2,6, 8,7 Hz), 6,84 (1H, d, J = 8,8 Hz), 2,72 (2H, s), 1,46 (6H, s).
2,2-Dimethyl-6-trimethylsilanylethinyl-chroman-4-on (Verbindung 261)
Eine Lösung aus 2,2-Dimethyl-6-brom-chroman-4-on (Verbindung 260, 4, 30 g, 16, 85 mmol) und Kupfer(I)-iodid (321 mg, 0,17 mmol) in 55,0 ml Et₃N wurde für 30 min mit Argon durchströmt. Zu dieser Lösung wurden Trimethylsilylacetylen (4,66 g, 50,56 mmol) und Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (1,18 g, 0,17 mmol) zugefügt. Die Mischung wurde 26 h auf 70°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Et₂O (100 ml) verdünnt. Die resultierende Mischung wurde durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung einer Et₂O-Waschung gefiltert und das Filtrat mit H₂O gewaschen, einer Lösung aus NH₄OH/gesättigtem wässrigen NH₄Cl (9.1), H₂O, 1 M wässriger HCl, H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor dem Trocknen (Na₂SO₄) und bei reduziertem Druck konzentriert. Eine Säulenchromatographie (5% EtOAc-Hexane) des restlichen Öls ergab 4,09 g (89%) des Produkts als gelben wachsartigen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,99 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,53 (1H, dd, J = 2,2, 8,6 Hz), 6,86 (1H, d, J = 8,6 Hz), 2,72 (2H, s), 1,45 (6H, s), 0,24 (9H, s).
2,2-Dimethyl-6-ethinyl-chroman-4-on (Verbindung 262)
Zu einer Lösung aus 2,2-Dimethyl-6-trimethylsilanylethinyl-chroman-4-on (Verbindung 261, 4,05 g, 14,87 mmol) in 60,0 ml MeOH wurde K₂CO₃ (410,9 mg, 2,97 mmol) zugefügt. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur 24 h gerührt, mit EtOAc (100 ml) verdünnt und H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen sowie über Na₂SO₄ getrocknet. Die Konzentration dieser Lösung bei reduziertem Druck ergab 2,71 g (91%) des Produkts als gelbbraunen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,01 (1H, d, J = 2,2 Hz), 7,56 (1H, dd, J = 2,2, 8,6 Hz), 6,90 (1H, d, J = 8,6 Hz), 3,02 (1H, s), 2,74 (2H, s), 1,47 (6H, s).
Ethyl-4-[(2,2-dimethyl-4-oxo-chroman-6-yl)ethinyl]-benzoat (Verbindung 263)
Eine Lösung aus 6-Ethinyl-2,2-dimetyhlchroman-4-on (Verbindung 262, 2,60 g, 13,0 mmol) und Ethyl-4-iodbenzoat (3,6 g, 13,0 mmol) in 50,0 ml Et₃N wurde mit Argon 15 min durchströmt. Zu dieser Lösung wurden Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (1,82 g, 2,6 mmol) und Kupfer(I)-iodid (496 mg, 2,6 mmol) zugefügt. Nach einem Durchströmen für zusätzliche 10 min mit Argon wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung einer Et₂O-Waschung gefiltert. Die Konzentration des Filtrats bei reduziertem Druck, gefolgt von Säulenchromatographie (2–5% EtOAc-Hexane) des restlichen Feststoffs ergab 2,28 g (50%) der Titelverbindung als orangen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,06 (1H, d, J = 2,2 Hz), 8,02 (2H, d, J = 8,5 Hz), 2,61 (1H, dd, J = 2,2, 8,6 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,5 Hz), 6,93 (1H, d, J = 8,6 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,75 (3H, s), 1,48 (6H, s), 1,41 (t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 264)
Eine Lösung aus Natriumbis(trimethylsilyl)amid (1,56 g, 8,5 mmol) in 18,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus Ethyl-4-((2,2-dimethyl-4-oxo-chroman-6-yl)ethinyl)benzoat (Verbindung 263, 2,26 g, 6,49 mmol) in 15,0 ml wurde langsam zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-bis(trifluormethansulfonyl)amino]-5-pyridin (3,10 g, 7,79 mmol) in 10 ml THF langsam zugefügt. Nach 5 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5% wässrigem NaOH und H₂O vor dem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 2,0 g (64%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc-Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,03 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,45–7,21 (2H, m), 6,85 (1H, d, J = 8,4 Hz), 5,69 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,55 (6H, s), 1,4 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-phenyl-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]-benzoat (Verbindung 265)
Eine Lösung aus Brombenzol (250,0 mg, 1,59 mmol) in 3,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (203,7 mg, 3,18 mmol, 1,9 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (440,0 mg, 3,18 mmol) in 5,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 264, 150,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 110,0 mg (87%), wurde durch Säulenchromatographie (2,5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,47–7,35 (6H, m), 7,21 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,88 (1H, d, J = 8,4 Hz), 5,66 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,52 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 261)
Eine Lösung aus 4-Methylbrombenzol (237,0 mg, 1,38 mmol) in 3,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (177,5 g (2,77 mmol, 1,6 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (377,0 mg, 2,77 mmol) in 5,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 264, 150,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 120,0 mg (92%), wurde durch Säulenchromatographie (2,5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,98 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,50 (2H, d, J = 8,5 Hz), 7,34 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,25–7,21 (5H, m), 6,85 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,62 (1H, s), 4,36 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,41 (3H, s), 1,49 (6H, s), 1,39 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 267)
Eine Lösung aus 4-Ethylbrombenzol (280,0 mg, 1,51 mmol) in 3,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (198,6 mg, 3,10 mmol, 1,9 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (408,0 mg, 3,10 mmol) in 5,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 264, 150,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 123,0 mg (91%), wurde durch Säulenchromatographie (2,5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,36 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,31–7,25 (5H, m), 6,88 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,65 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,73 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,52 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,31 (2H, t, J = 7,6 Hz)
Ethyl-4-[[4-(4-(1-methylethyl)phenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 268)
Eine Lösung aus 4-iso-Propylbrombenzol (250,0 mg, 1,25 mmol) in 3,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (160,8 mg, 2,51 mmol in 1,5 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (345,0 mg, 2,53 mmol) in 5,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-((2,2-dimethyl-4- trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-yl)ethinyl)-benzoat (Verbindung 264, 150,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 100,0 mg (72%), wurde durch Säulenchromatographie (2,5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,52 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,36 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,30–7,26 (5H, m), 6,88 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,64 (1H, s), 4,38 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,98 (1H, hept, J = 7,0 Hz), 1,51 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,31 (6H, d, J = 7,0 Hz).
Ethyl-4-[[4-(4-(1,1-dimethylethyl)phenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 269)
Eine Lösung aus 4-tert-Butylbrombenzol (280,0 mg, 1,61 mmol) in 3,0 ml wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (206,3 mg, 3,22 mmol, 1,7 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (380,0 mg, 3,22 mmol) in 5,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-4-((2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-yl)ethinyl)-benzoat (Verbindung 264, 150,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (24,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 85,0 mg (59%), wurde durch Säulenchromatographie (2,5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,99 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,53 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,45 (1H, d, J = 8,4 Hz), 7,37 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,32–7,28 (3H, m), 6,89 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,66 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,52 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,39 (9H, s).
Ethyl-2-fluor-4-[(2,2-dimethyl-4-oxo-chroman-6-yl)ethinyl]benzoat (Verbindung 270)
Eine Lösung aus 6-Ethinyl-2,2-dimethylchroman-4-on (Verbindung 262, 314,0 mg, 1,57 mmol) und Ethyl-2-fluor-4-iodbenzoat (440,0 mg, 1,50 mmol) in 10,0 ml Et₃N wurde mit Argon 15 min gereinigt. Zu dieser Lösung wurden Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid (275,0 mg, 0,39 mmol) und Kupfer(I)-iodid (75,0 mg, 0,39 mmol) zugefügt. Nach einem Durchströmen für zusätzliche 10 min mit Argon wurde die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch einen Celite-Stopfen unter Verwendung einer Et₂O-Waschung gefiltert. Die Konzentration des Filtrats bei reduziertem Druck, gefolgt von einer Säulenchromatographie (3–5% EtOAc-Hexane) des restlichen Feststoffs ergaben 400.0 mg (69%) der Titelverbindung als orangen Feststoff. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,05 (1H, d, J = 2,1 Hz), 7,90 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,60 (1H, dd, J = 2,2, 8,5 Hz), 7,29 (1H, dd, J = 1,5, 8,2 Hz), 7,25 (1H, d, J = 11,4 Hz), 6,93 (1H, d, J = 8,5 Hz), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,75 (2H, s), 1,48 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-2-fluor-4-((2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-yl)ethinyl)benzoat (Verbindung 271)
Eine Lösung aus Natriumbis(trimethylsilyl)amid (238,0 mg, 1,30 mmol) in 3,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und eine Lösung aus Ethyl-2-fluor-4-((2,2-dimethyl-4-oxo-chroman-6-yl)ethinyl)benzoat (Verbindung 270, 400,0 mg, 1,09 mmol) in 2,0 ml wurde langsam zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus 2-[N,N-Bis(trifluormethansulfonyl)amino]-5-pyridin (510,0 mg, 1,30 mmol) in 1,0 ml THF zugefügt. Nach 5 min wurde die Lösung auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit 5% wässrigem NaOH und H₂O vor dem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 315,0 mg (58%) wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,92 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,44–7,26 (4H, m), 6,85 (1H, d, J = 8,7 Hz), 5,70 (1H, s), 4,31 (2H, q, J = 7,1 Hz), 1,55 (6H, s), 1,41 (3H, t5, J = 7,1 Hz).
Ethyl-2-fluor-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]-benzoat (Verbindung 272)
Eine Lösung aus 4-Methylbrombenzol (140,0 mg, 0,80 mmol) in 3,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (102,5 mg, 1,60 mmol, 0,94 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (174,0 mg, 1,28 mmol) in 5,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-2-(fluor-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 271, 150,0 mg, 0,31 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (20,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 86,0 mg (62%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,88 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,35 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,35 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 8,4 Hz), 7,28–7,19 (7H, m), 6,88 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,64 (1H, s), 4,40 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,43 (3H, s), 1,51 (6H, s), 1,41 (3H, t, J = 7,1 Hz).
Ethyl-2-fluor-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 273)
Eine Lösung aus 4-Ethylbrombenzol (150,0 mg, 0,80 mmol) in 3,0 ml THF wurde auf –78°C abgekühlt und tert-Butyllithium (102,5 mg, 1,60 mmol, 0,94 ml einer 1,7 M Lösung in Pentan) wurde zum Erhalt einer gelben Lösung zugefügt. Nach 30 min wurde eine Lösung aus ZnCl₂ (218,0 mg, 1,60 mmol) in 5,0 ml THF langsam über eine Kanüle zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf Raumtemperatur erwärmt und über eine Kanüle zu einer Lösung aus Ethyl-2-fluor-4-(2,2-dimethyl-4-trifluormethansulfonyloxy-(2H)-chromen-6-ylethinyl)-benzoat (Verbindung 271, 160,0 mg, 0,32 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (20,0 mg, 0,02 mmol) in 2,0 ml THF zugefügt. Diese Lösung wurde für 2 h auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und die Reaktion durch Zugabe von gesättigtem wässrigen NH₄Cl gelöscht. Die Lösung wurde mit EtOAc extrahiert und die kombinierten organischen Schichten mit H₂O und gesättigtem wässrigen NaCl vor einem Trocknen (MgSO₄) gewaschen und bei reduziertem Druck konzentriert. Die Titelverbindung, 115,0 mg (79%), wurde durch Säulenchromatographie (5% EtOAc/Hexane) als farbloser Feststoff isoliert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 7,88 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,35 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,28–7,20 (7H, m), 6,88 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,65 (1H, s), 4,39 (2H, q, J = 7,1 Hz), 2,73 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,52 (6H, s), 1,40 (3H, t, J = 7,1 Hz), 1,31 (3H, t, J = 7,6 Hz).
4-[[4-Phenyl-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 274)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-phenyl-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 265, 70,0 mg, 0,171 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 35°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 48,0 mg (74%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,00 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,2 Hz), 7,51–7,37 (6H, d), 7,14 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,91 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,80 (1H, s), 1,50 (6H, s).
4-[[4-(4-(4-Methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoesäure (Verbindung 275)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 266, 90,0 mg, 0,213 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3.0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 35°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 70,0 mg (83%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,40 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,30–7,20 (4H, m), 7,16 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,90 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,67 (1H, s), 2,38 (3H, s), 1,49 (6H, s).
4-[[4-(4-Ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]-benzoesäure (Verbindung 276)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]ethinyl]benzoat (Verbindung 267, 82,0 mg, 0,188 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 35°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 65,0 mg (85%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 8,01 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,40 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,35–7,25 (4H, m), 7,17 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,90 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,77 (1H, s), 2,69 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,49 (6H, s), 1,24 (2H, t, J = 7,6 Hz).
4-[[4-(4-(1-Methylethyl)phenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]-benzoesäure (Verbindung 277)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-(1-methylethyl)phenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]benzoat (Verbindung 268, 95,0 mg, 0,210 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 35°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 75,0 mg (84%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ: 8,05 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), 7,36 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,30–7,26 (5H, m), 6,88 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,64 (1H, s), 2,98 (1H, hept, J = 6,9 Hz), 1,51 (6H, s), 1,31 (6H, d, J = 6,9 Hz).
4-[[4-(4-(1,1-Dimethylethyl)phenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]-benzoesäure (Verbindung 278)
Zu einer Lösung aus Ethyl-4-[[4-(4-(1,1-dimethylethyl)phenyl)-2,2-dimethyl(2H)-chromen-6-yl]ethinyl] benzoat (Verbindung 269, 72, 0 mg, 0, 155 mmol) in 3,0 ml THF und 3,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 35°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 50,0 mg (74%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ:
8,0 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,57 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,51 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,41 (1H, dd, J = 2,0, 8,3 Hz), 7,31 (2H, d, J = 8,3 Hz), 7,19 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,91 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,78 (1H, s), 1,49 (6H, s), 1,35 (9H, s).
2-Fluor-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]benzoesäure (Verbindung 279)
Zu einer Lösung aus Ethyl-2-fluor-4-[[4-(4-methylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]-benzoat (Verbindung 272, 60,0 mg, 0,136 mmol) in 2,0 ml THF und 1,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 35°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 53,0 mg (94%) der Titelverbindung als farbloser Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 7,93 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,43–7,16 (8H, m), 6,91 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,77 (1H, s), 2,38 (3H, s), 1,49 (6H, s).
2-Fluor-4-[[4-(4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]-benzoesäure (Verbindung 280)
Zu einer Lösung aus Ethyl-2-fluor-4-[[4-(4-ethylphenyl)-2,2-dimethyl-(2H)-chromen-6-yl]-ethinyl]-benzoat (Verbindung 273, 82,0 mg, 0,180 mmol) in 2,0 ml THF und 2,0 ml EtOH wurde NaOH (120,0 mg, 3,0 mmol, 3,0 ml einer 1 M wässrigen Lösung) zugefügt. Die resultierende Lösung wurde auf 35°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 10%iger wässriger HCl angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit H₂O, gesättigtem wässrigen NaCl gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄), bevor das Lösungsmittel bei reduziertem Druck entfernt wurde. Der restliche Feststoff wurde aus CH₃CN zum Erhalt von 70,0 mg (91%) der Titelverbindung als schwach-gelber Feststoff umkristallisiert. ¹H-NMR (300 MHz, d₆-Aceton) δ: 7,93 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,41 (1H, dd, J = 2,1, 8,3 Hz), 7,37–7,25 (6H, m), 7,18 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,91 (1H, d, J = 8,3 Hz), 5,77 (1H, s), 2,69 (2H, q, J = 7,6 Hz), 1,49 (6H, s), 1,24 (3H, t, J = 7,6 Hz).
Verfahren zur Vervielfachung der Nuklear-Rezeptoragonisten
Übersicht und Einführung
Wir haben entdeckt, dass eine Untergruppe von Retinoidantagonisten, die eine negative Hormonaktivität ausüben, verwendet werden können, um die biologischen Aktivitäten anderer Retinoide und Hormone der Steroidrezeptor-Superfamilie zu verstärken. Diese anderen Retinoide und Steroidrezeptor-Superfamilienhormone können entweder endogene Hormone oder pharmazeutische Mittel sein. Wenn sie z. B. in Kombination mit einem negativen Retinoidhormon verwendet werden, können bestimmte Aktivitäten der pharmazeutischen Retinoidagonisten aktiver für die Hervorrufung spezifischer biologischer Wirkungen gemacht werden. Vorteilhafterweise kann dieser kombinatorische Ansatz für eine Arzneimittelverabreichung unerwünschte Nebenwirkungen pharmazeutischer Retinoide minimieren, da niedrigere Dosierungen der pharmazeutischen Retinoide mit verbesserter Wirksamkeit verwendet werden können.
Insbesondere haben wir entdeckt, dass AGN 193109, ein synthetisches Retinoid mit der in 1 dargestellten Struktur, einzigartige und unerwartete pharmakologische Aktivitäten ausübt. AGN 193109 zeigt eine hohe Affinität für die RAR Subklasse nuklearer Rezeptoren ohne Aktivierung dieser Rezeptoren oder Stimulierung einer Transkription von Retinoid-reaktiven Genen. Stattdessen inhibiert AGN 193109 die Aktivierung von RARs durch Retinoid-Agonisten und verhält sich daher wie ein Retinoidantagonist.
Wir haben außerdem entdeckt, dass negative Retinoidhormone ohne Co-Verabreichung eines Retinoidagonisten oder Steroidhormons zur Kontrolle bestimmter Erkrankungsymptome verwendet werden können. Genauer gesagt, kann das hier offenbarte negative Retinoidhormon das hohe Basalniveau der Transkription von Genen herabregulieren, die auf Nicht- Liganden gebundene RARs reagieren. Wenn sich z. B. eine unkontrollierte zelluläre Proliferation aus der Aktivität von Genen ergibt, die auf Nicht-Liganden gebundene RARs reagieren, dann kann die Genaktivität durch Verabreichung eines negativen Retinoidhormons reduziert werden, das RARs inaktiviert. Dementsprechend kann die zelluläre Proliferation, die von der Aktivität Nicht-Liganden-gebundener RARs abhängt, durch das negative Hormon inhibiert werden. Die Inhibition von Nicht-Liganden-gebundenen RARs kann nicht unter Verwendung konventioneller Antagonisten erreicht werden.
Besonders wichtig ist, dass wir entdeckt haben, dass AGN 193109 sowohl die basale RAR-Aktivität unterdrücken kann, als auch manchmal die Aktivitäten anderer Retinoid- und Steroidrezeptor-Superfamilienhormonagonisten verstärken kann. Im Kontext der Erfindung wird von einem Hormonagonist gesagt, dass er von einem negativen Hormon, wie z. B. AGN 193109, verstärkt wird, wenn eine reduzierte Konzentration des Agonisten in Gegenwart des negativen Hormons im wesentlichen dieselbe quantitative Reaktion hervorruft wie die durch den Agonisten allein erreichbare. Die quantitative Reaktion kann z. B. in einem Reportergenassay in vitro gemessen werden. So wird ein therapeutisches Retinoid, das eine gewünschte Reaktion hervorruft, wenn es in einer bestimmten Dosierung oder Konzentration verwendet wird, durch AGN 193109 verstärkt, wenn in Kombination mit AGN 193109 eine niedrigere Dosierung oder Konzentration des therapeutischen Retinoids verwendet werden kann um im wesentlichen dieselbe Wirkung wie die höhere Dosierung oder Konzentration des therapeutischen Retinoids zu erzeugen, wenn dieses allein verwendet wird. Die Liste der Agonisten, die durch Co-Verabreichung mit AGN 193109 verstärkt werden können, beinhaltet RAR-Agonisten, Vitamin D-Rezeptoragonisten, Glucokortikoid-Rezeptoragonisten und Thyroidhormonrezeptoragonisten. Insbesondere beinhalten spezifische Agonisten, die durch eine Co-Verabreichung verstärkt werden können: ATRA, 13-cis-Retinolsäure, der synthetische RAR-Agonist AGN 191183, 1,25-Dihydroxyvitamin D₃, Dexamethason und Thyroidhormon (3,3',5-Triiodthyronin). Hier wird ebenfalls ein Verfahren offenbart, das verwendet werden kann, um andere Hormone zu identifizieren, die durch Co-Verabreichung mit AGN 193109 verstärkt werden können.
Auf diese Weise verhält sich AGN 193109 in einer Weise, die für einen einfachen Retinoidantagonisten nicht vorhersagbar ist, sondern als negatives Hormon, das die Aktivitäten verschiedener Mitglieder der Familie nuklearer Rezeptoren verstärken kann. Wir offenbaren auch einen möglichen Mechanismus, der sowohl die negative Hormonaktivität als auch die Fähigkeit von AGN 193109 erklären kann, die Aktivitäten anderer nuklearer Rezeptorliganden zu verstärken. Dieser Mechanismus inkorporiert Elemente, von denen bekannt ist, dass sie an den Retinoid-abhängigen Signalisierungswegen teilnehmen und inkorporiert zusätzlich eine neue negative regulatorische Komponente.
Der Fachmann wird erkennen, dass RARs, die Hochaffinitätsziele der AGN 193109-Bindung sind, Transkriptionsfaktoren sind, die die Expression einer Vielzahl von Retinoid-aktiven Genen regulieren. Cis-regulatorische DNA-Bindungsstellen für die RARs wurden nahe von Genen identifiziert, die transkriptionell in Retinoid-abhängiger Weise reguliert werden. Die RAR-Bindung an solche DNA-Stellen, bekannt als Retinolsäurereaktionselemente (RAREs), ist gut definiert worden. Hier ist es wichtig, dass die RAREs Heterodimere binden, bestehend aus einem RAR und einem RXR. Die RXR-Komponente des Heterodimers wirkt zur Unterstützung einer hochaffinen Wechselwirkung zwischen dem RAR/RXR-Heterodimer und dem RARE (Mangelsdorf et al. The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2. Ausgabe, herausgegeben von Sporn et al., Raven Press, Ltd., New York 1994, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme eingeschlossen ist).
Wie unten im Detail dargestellt, betreffen unsere Feststellungen die negative Hormonaktivität von AGN 193109 und sind konsistent mit einem Mechanismus, der die Wechselwirkung eines putativen negativen Co-Aktivatorproteins (NCP) mit RAR involviert. Gemäß dem vorgeschlagenen Mechanismus wird die Wechselwirkung durch AGN 193109 stabilisiert.
Unsere Ergebnisse zeigten weiterhin, dass AGN 193109 die intrazelluläre Verfügbarkeit von NCP für eine Wechselwirkung mit nuklearen Rezeptoren, bei denen es sich nicht um RARs handelt, die von AGN 193109 besetzt sind, modulieren kann. Daraus folgt, dass AGN 193109 transkriptionelle regulatorische Wege verstärken kann, die nukleare Rezeptoren involvieren, die mit den RARs die Fähigkeit einer Bindung an NCP teilen. In diesem Hinblick zeigt AGN 193109 die Fähigkeit zur Modulation einer Vielzahl nuklearer Rezeptorwege, eine Aktivität, die für einen konventionellen Retinoidantagonisten nicht vorhersagbar gewesen wäre. Dementsprechend ist AGN 193109 als Mittel für die Verstärkung der Aktivität der nuklearen Rezeptorliganden geeignet, einschließlich sowohl der endogenen Hormone als auch der verschriebenen Therapeutika. Diese spezifische Ausführungsform illustriert das allgemeine Prinzip, dass jedes negative nukleare Rezeptor-Hormon die Aktivität anderer nuklearer Rezeptoren verstärken wird, die das NCP kompetitiv binden.
Obwohl andere Materialien und Methoden, die zu den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, in der Praxis oder der Überprüfung der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, werden nun die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben. Die allgemeinen Referenzen hinsichtlich Verfahren, die verwendet werden können, um verschiedene Nucleinsäure-Manipulationen und Verfahren durchzuführen, die hier beschrieben werden, finden sich in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Herausgeber Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Herausgeber Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience 1987). Die in diesen Referenzen enthaltenen Offenbarungen werden hier durch Inbezugnahme eingeschlossen. Eine Beschreibung der Experimente und Ergebnisse, die zu der Fertigstellung der vorliegenden Erfindung führten, folgt.
Beispiel 6 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, das AGN 193109 alle drei RARs mit hoher Affinität band, jedoch eine Retinoid-abhängige Genexpression nicht aktivieren konnten.
Beispiel 6
AGN 193109 bindet RARs mit hoher Affinität, transaktiviert jedoch nicht die Retinoid-abhängige Genexpression
Menschliche RAR-α-, RAR-β- und RAR-γ-Rezeptoren wurden getrennt als rekombinante Proteine unter Verwendung eines Baculovirusexpressionssystems exprimiert, im wesentlichen gemäß dem von Allegretto et al. in J. Biol. Chem. 268: 26625 (1993) beschriebenen Verfahren. Die rekombinanten Rezeptorproteine wurden getrennt für eine Bestimmung der AGN 193109-Bindungsaffinitäten unter Verwendung des [³H]-ATRA-Versetzungsassays verwendet, beschrieben von Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992). Dissoziationskonstanten (Kds) wurden gemäß dem von Cheng et al. in Biochemical Pharmacology 22: 3099 (1973) beschriebenen Verfahren bestimmt.
AGN 193109 wurde auch im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Transaktivierung von RARs in CV-1 Zellen hin untersucht, die transient mit RAR-Expressionsvektoren und einem Retinoidreaktiven Reportergenkonstrukt co-transfiziert waren. Rezeptorexpressionsvektoren pRShRAR-α (Giguere et al. Nature 330: 624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook et al. Nature 333: 669 (1988)) und pRShRAR-γ (Ishikawa et al. Mol. Endocrinol. 4: 837 (1990)) wurden separat mit dem ΔMTV-TREp-Luc-Reporterplasmid co-transfiziert. Die Verwendung dieses Luciferasereporterplasmids wurde von Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992) offenbart. ΔMTV-TREp-Luc-Plasmid ist im wesentlichen identisch zu dem ΔMTV-TREp-CAT-Reporterkonstrukt, beschrieben von Umesono et al. in Nature 336: 262 (1988), außer dass das Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT)Reportergen durch eine Polynucleotidsequenz ersetzt wurde, die die Glühwürmchenluciferase codiert.
Die Transfektion von CV-1 Zellen von grünen Meerkatzen wurde unter Verwendung des Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahrens durchgeführt, beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., Herausg. Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). CV-1 Zellen wurden mit einer Dichte von 4 × 10⁴/Vertiefung in Platten mit 12 Vertiefungen ausplattiert und transient mit einem Calciumphosphatpräzipitat transfiziert, enthaltend 0,7 μg Reporterplasmid und 0,1 μg Rezeptorplasmid gemäß Standardlaborverfahren. Die Zellen wurden nach 18 h gewaschen, um das Präzipitat zu entfernen und mit Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM (Gibco) wiederum angezüchtet, enthaltend 10% aktiviertes Holzkohleextrahiertes fötales Kälberserum (Gemini Bio Products). Die Zellen wurden mit Vehikel allein (Ethanol) oder AGN 193109 (10^–9 bis 10^–6 M) 18 h behandelt. Die Zelllysate wurden hergestellt in 0,1 M KPO₄ (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA. Die Luciferaseaktivität wurde wie von de Wet et al. in Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) beschrieben unter Verwendung von Glühwürmchen-Luciferin (Analytical Luminescence Laboratory) und einem EG&G Berthold-Luminometer für Platten mit 96 Vertiefungen gemessen. Die berichteten Luciferasewerte repräsentierten Mittel ± SEM für Dreifachbestimmungen.
Die in Tabelle 11 angegebenen Ergebnisse zeigten, dass AGN 193109 RAR-α, RAR-β und RAR-γ, alle mit hoher Affinität band, jedoch die Retinoid-abhängige Genexpression nicht aktivierte. Genauer gesagt, band AGN 193109 alle drei Rezeptoren mit Kd-Werten im 2 bis 3 nM-Bereich. Trotz dieser festen Bindung konnte AGN 193109 die Genexpression nicht aktivieren, wenn mit Induktionen, stimuliert durch ATRA, verglichen wurde. Dementsprechend war die halb-maximale effektive Konzentration von AGN 193109 (EC₅₀) nicht messbar. Obwohl in der Tabelle nicht dargestellt, stellten wir auch fest, dass AGN 193109 keine messbare Affinität für die RXRs hatte.
Tabelle 11 AGN 193109 Bindung und Transaktivierung der RARs
Beispiel 7 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 ein Antagonist der ATRA-abhängigen Genexpression ist.
Beispiel 7
AGN 193109-abhängige Inhibition der RAR-Transaktivierung durch ATRA
Die Fähigkeit von AGN 193109, um eine ATRA vermittelte RAR-Aktivierung zu antagonisieren, wurde bei CV-1 Zellen untersucht, die durch das Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren co-transfiziert wurden, wie beschrieben bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989). Die eukaryotischen Expressionsvektoren pRShRAR-α (Giguere et al. Nature 330: 624 (1987)), pRShRAR-β (Benbrook et al. Nature 333: 669 (1988)) und pRShRAR-γ (Ishikawa et al. Mol. Endocrinol. 4: 837 (1990)) wurden mit dem ΔMTV-Luc-Reporterplasmid cotransfiziert, beschrieben von Hollenberg et al. (Cell 55: 899 (1988)). Insbesondere enthielt das Reporterplasmid zwei Kopien des TRE-Palindromreaktionselement. Calciumphosphattransfektionen wurden durchgeführt, genauso wie beschrieben in Beispiel 6. Die Zellen wurden mit Vehikel allein (Ethanol), ATRA (10^–9 bis 10^–6 M), AGN 193109 (10^–9 bis 10^–6 M) oder 10^–8 M ATRA in Kombination mit AGN 193109 (10^–9 bis 10^–6 M) für 18 h dosiert. Celllysate und Luciferaseaktivitätsmessungen wurden wie in Beispiel 6 durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Verfahren sind in den 2A bis 2F dargestellt, worin Luciferasewerte das Mittel ± SEM von Dreifachbestimmungen repräsentieren. Insbesondere zeigten die in den 2A, 2C und 2E angegebenen Ergebnisse, dass die Stimulierung der transfizierten Zellen mit ATRA zu einem dosisabhängigen Anstieg der Luciferaseaktivität führte. Dies bestätigte, dass ATRA alle drei RARs im experimentellen System aktivierte und stellte eine Vergleichsbasis für den Nachweis der Aktivität eines Antagonisten bereit. Die grafischen Ergebnisse, die in 2B, 2D und 2F dargestellt sind, zeigen an, dass die Co-Behandlung von transfizierten Zellen mit 10 nm ATRA und ansteigenden Konzentrationen von AGN 193109 zu einer Inhibition der Luciferase-Aktivität führte. Insbesondere ergaben gleiche Dosierungen AGN 193109 und ATRA mehr als 50% Inhibition relativ zu ATRA allein für alle drei RAR-Subtypen. Ein Vergleich mit der ATRA-Dosisreaktion in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen von AGN 193109 zeigte, dass ATRA durch AGN 193109 kompetitiv inhibiert wurde. Insbesondere repräsentiert die horizontale Achse aller in 2 dargestellten Grafiken den log der Retinoid-Konzentration. Diese Ergebnisse bewiesen, dass AGN 193109 ein potenter RAR-Antagonist ist.
Als Nächstes führten wir Experimente durch, um den Mechanismus, der der antagonistischen Aktivität von AGN 193109 zugrunde liegt, zu erhellen. Der Fachmann wird erkennen, dass eine nukleare Rezeptoraktivierung vermutlich eine Konformationsänderung des Rezeptors involviert, die durch die Ligandenbindung induziert wird. Tatsächlich haben die Ergebnisse von Proteaseschutzassays bestätigt, dass nukleare Hormonagonisten und Antagonisten Rezeptorproteine dazu führen, unterschiedliche Konformationen anzunehmen (Keidel et al. Mol. Cell. Biol. 14: 287 (1994); Allan et al. J. Biol. Chem. 267: 19513 (1992)). Wir haben einen solchen Test verwendet, um zu bestimmen, ob AGN 193109 und ATRA RAR-α veranlasste, unterschiedliche Konformationen anzunehmen. AGN 193583, ein RAR-α-selektiver Antagonist, wurde als positive Kontrolle mit aufgenommen, von der bekannt ist, dass sie ein Antagonist-spezifisches Muster einer Protease Sensibilität verleiht.
Beispiel 8 beschreibt ein Verfahren, das verwendet wurde, um Konformationsveränderungen bei RAR-α nachzuweisen, die sich aus einer AGN 193109-Bindung ergaben. Wie unten dargestellt, zeigten die Ergebnisse dieses Verfahrens unerwarteterweise, dass AGN 193109 zu einem Muster einer Trypsinempfindlichkeit führte, das im wesentlichen identisch war mit dem das von ATRA, einem RAR-Agonisten, induziert wurde, und unähnlich demjenigen, das von dem modellhaft verwendeten RAR-Antagonisten induziert wurde. Diese Feststellung legt nahe, dass AGN 193109 andere Eigenschaften besaß als andere Retinoid-Antagonisten.
Beispiel 8
Proteaseschutzanalyse
Ein Plasmid, konstruiert in dem Vektor pGEM3Z (Pharmacia) und enthaltend die RAR-α cDNA (Giguere et al. Nature 330: 624 (1987)) wurde in Verbindung mit dem TNT-gekoppelten Reticulozytlysat in vitro Transkription-Translationssystem (Promega) zur Herstellung von [³⁵S]-Methionin-markiertem RAR-α verwendet. Ein begrenzter proteolytischer Verdau des markierten Proteins RAR-α wurde gemäß von Keidel et al. in Mol. Cell. Biol. 14: 287 (1994) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Aliquots von Reticulozytlysat, enthaltend [³⁵S]-Methionin-markiertes RAR-α, wurden mit entweder ATRA, AGN 193583 oder AGN 193109 auf Eis 45 min in einem Gesamtvolumen von 9 μl inkubiert. Die Retinoidendkonzentration für alle Versuche betrug 100 nM für ATRA und AGN 193109 und 1000 nM für AGN 193583. Der Unterschied zwischen den Endkonzentrationen der Retinoide basierte auf einem ungefähr 10-fachen Unterschied in den relativen Affinitäten von ATRA und AGN 193109 (mit einer Kd von RAR-α von 2 bzw. 10 nM) und AGN 193583 (mit einer Kd auf RAR-α von ≥ 100 nM). Nach einer Ligandenbindung wurde 1 μl des hier in geeigneter Weise konzentrierten Trypsins der Mischung zugefügt, um Endkonzentrationen von 25, 50 oder 100 μg/ml zu ergeben. Die Proben wurden 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und der Trypsinverdau durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Die Proben wurden einer Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen und gemäß den Standardverfahren autoradiofotografiert.
Sowohl Agonist als auch Antagonist führte zu unterschiedlichen Mustern einer Trypsinempfindlichkeit, die sich von dem Ergebnis unterschieden, das durch den Verdau des Nichtliganden-gebundenen Rezeptors erhalten wurde. Die Autoradiografieergebnisse legten nahe, dass Trypsinkonzentrationen von 25, 50 und 100 μg/ml das radioaktiv-markierte RAR-α in 10 min bei Raumtemperatur in Abwesenheit des zugefügten Retinoids vollständig verdaute. Eine vorherige Bindung von ATRA führte zu dem Auftreten von zwei Hauptprotease-resistenten Arten. Eine Vorbindung des RAR-α-selektiven Antagonisten AGN 193583 führte zu einer Protease-resistenten Art, die ein niedrigeres Molekulargewicht hatte, als diejenige, die sich aus der ATRA-Vorbindung ergab. Dieses Ergebnis demonstrierte, dass ein Retinoidagonist und -antagonist zu Konformationsänderungen führten, die durch veränderte Trypsinempfindlichkeiten nachweisbar waren. Überraschenderweise ergab die Vorbindung von AGN 193109 ein Proteaseschutzmuster, das von dem durch die Vorbindung von ATRA nicht zu unterscheiden war.
Die oben dargestellten Ergebnisse bestätigten, dass AGN 193109 RAR-α band und seine Konfirmation veränderte. Interessanterweise ähnelte die Natur der Konformationsänderungen am meisten derjenigen, die sich aus der Bindung eines Agonisten (ATRA) ergab, als der Änderung, die von einem Antagonisten (AGN 193583) erzeugt wurde. Daher ist der Mechanismus des AGN 193109 abhängigen Antagonismus eindeutig einzigartig.
Wir betrachteten mögliche Mechanismen, die die antagonistische Aktivität von AGN 193109 erklären könnten. Insbesondere verwendeten wir einen Standardgel-Shiftassay, um zu überprüfen, ob AGN 193109 die RAR/RXR-Heterodimerbildung störte oder diese Wirkung zwischen RAR und der verwandten DNA-Bindungsstelle inhibierte.
Beispiel 9 beschreibt einen gelelektrophoretischen Mobilitäts-Shiftassay, verwendet um zu demonstrieren, dass AGN 193109 weder die RAR/RXR-Dimerbildung inhibierte, noch die Bindung von Dimeren an eine Ziel-DNA inhibierte.
Beispiel 9
Gelshiftanalyse
In vitro translatiertes RAR-α wurde im wesentlichen wie in Beispiel 8 beschrieben erzeugt, außer dass das ³⁵S-markierte Methionin ausgelassen wurde. In vitro translatiertes RXR-α wurde ähnlich erzeugt unter Verwendung eines auf pBluescript(II)(SK)-basierenden Vektors, enthaltend die RXR-α cDNA, beschrieben von Mangelsdorf et al. in Nature 345: 224–229 (1990) als Matrize für die Erzeugung von in vitro Transkripten. Die markierten RAR-α und RXR-α, allein oder in Kombination oder vorher gebunden mit AGN 193109 (10^–6 M), entweder allein oder in Kombination, ließ man mit einer endmarkierten DR-5 RAR-doppelsträngigen Sonde mit der Sequenz 5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3' (SEQ ID NO: 1) in Wechselwirkung treten. Die Bindungsmischung wurde auf einem nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel elektrophoriert und unter Verwendung von Standardlaborverfharen einer Autoradiographie unterzogen. Eine einzelne retardierte Art, die auf dem Autoradiogramm auftrat, die allen Spuren auf dem Gel gemeinsam war, repräsentierte einen nicht-definierten Sondenbindungsfaktor, der in dem Reticulozyten-Lysat vorlag. Nur die RAR/RXR-Kombination ergab eine Retinoidrezeptorspezifische retardierte Art. Weder RAR allein noch RXR allein banden die Sonde, um diese verlagerte Art zu erzeugen. Die Gegenwart von AGN 193109 verminderte diese Wechselwirkung nicht.
Diese Ergebnisse zeigen an, dass AGN 193109 weder die Homo- noch die Heterodimerbildungseigenschaften von RAR-α wesentlich verändert. Weiterhin inhibierte AGN 193109 die Wechselwirkung von Rezeptordimeren mit einem DNA-Segment, das die verwandte Bindungsstelle enthielt, nicht.
Im Hinblick auf die einzigartigen Eigenschaften, die AGN 193109 kennzeichnen, fuhren wir fort mit der Untersuchung, ob dieser Antagonist zusätzlich die Aktivität von Nicht-Liganden-gebundenen RARs inhibieren könnte. Das verwendete Rezeptor/Reporter-System, um diese Bestimmung durchzuführen, zeigte in vorteilhafter Weise eine konstitutive Aktivität in Abwesenheit eines zugefügten Retinoidagonisten auf hohem Niveau. Genauer gesagt, verwendeten diese Verfahren den ER-RAR-chimären Rezeptor und das ERE-tk-Luc-Reportersystem. Das ERE-tk-Luc-Plasmid beinhaltet die Region –397 bis –87 der Östrogen-reaktiven 5'-flankierenden Region von dem Xenopus vitellogenin A2-Gen, beschrieben von Klein-Hitpass et al. in Cell 46: 1053–1061 (1986), ligiert stromaufwärts von dem HSV-Thymidinkinasepromotor und dem Luciferasereportergen von Plasmid tk-Luc. Die ER-RAR chimären Rezeptoren bestanden aus der Östrogenrezeptor-DNA-Bindungsdomäne, fusiert an die "D-E-F"-Domäne der RARs. Der Fachmann wird erkennen, dass diese "D-E-F"-Domäne zur Bindung des Retinoids wirkt, um eine Retinoid-induzierbare Transaktivierungsfunktion bereitzustellen und eine Kontaktstelle für die Heterodimerisierung mit RXR. So war die Luciferaseexpression in diesem Reportersystem von der Aktivierung des transfizierten chimären Rezeptorkonstrukts abhängig.
Beispiel 10 beschreibt das Verfahren, das verwendet wurde, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die basale Genaktivität, die Nicht-Liganden-gebundenen RARs zuzuordnen ist, inhibierte. Diese Verfahren wurden in Abwesenheit von zugefügtem Retinoidagonisten durchgeführt. Die unten dargestellten Ergebnisse stellten den ersten Hinweis bereit, dass AGN 193109 eine negative Hormonaktivität ausübte.
Beispiel 10
Unterdrückung der basalen Genaktivität eines Retinoidregulierten Reporters in transient co-transfizierten Zelllinien
CV-1-Zellen wurden mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und entweder ER-RAR-α-, ER-RAR-β- oder ER-RAR-γ-Expressionsplasmiden co-transfiziert. Das ERE-tk-Luc-Plasmid enthielt das Östrogen-reaktive Promotorelement des Xenopus laevis vitellogenin A2-Gens und war im wesentlichen identisch zu dem von Klein-Hitpass et al. in Cell 46: 1053 (1986) beschriebenen Reporterplasmid, außer dass das CAT-Reportergen durch eine Polynucleotidsequenz, die Luciferase codiert, substituiert war. Die ER-RAR-α-, ER-RAR-β- oder ER-RAR-γ-chimären Rezeptor-codierenden Polynucleotide, die bei der Co-Transfektion verwendet wurden, wurden von Graupner et al. in Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991) beschrieben. Diese Polynucleotide wurden in den pECE-Expressionsvektor ligiert, beschrieben von Ellis et al. in Cell 45: 721 (1986) und unter transkriptioneller Kontrolle des SV-40-Promotors exprimiert. Calciumphosphattransfektionen wurden genau wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt unter Verwendung von 0,5 μg/Vertiefung des Reporterplasmids und entweder 0,05 μg, 0,10 μg oder 0,2 μg/Vertiefung des Rezeptorplasmids. Zellen wurden mit Vehikel allein (Ethanol), ATRA (10^–9 bis 10^–6 M), oder AGN 193109 (10^–9 bis 10^–6 M) für 18 h dosiert. Zelllysate und Luciferaseaktivitätsmessungen wurden wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt.
Die in den 3A, 4A und 5A dargestellten Ergebnisse bestätigten, dass ATRA die Luciferaseexpression bei allen Transfektanten stark induziert. Die Basalniveauexpression der Luciferase für die drei transfizierten chimären RAR-Isoforme lag bei ungefähr 7.000 bis 40.000 relativen Lichteinheiten (RLE) und war etwas von der Menge des verwendeten Rezeptorplasmids bei der Transfektion abhängig. So waren die drei chimären Rezeptoren durch ATRA wie erwartet aktivierbar. Insbesondere banden alle drei Rezeptoren ATRA und aktivierten die Transkription des Luciferasereportergens auf dem ERE-tk-Luc-Plasmid.
Die 3B, 4B und 5B präsentieren AGN 193109-Dosierungsreaktionskurven erhaltenen in Abwesenheit irgendeines exogenen Retinoidagonisten. Interessanterweise war ER-RAR-α (3B) im wesentlichen von AGN 193109 nicht beeinflusst, während die ER-RAR-β und ER-RAR-γ chimären Rezeptoren (4B bzw. 5B) eine AGN 193109 dosisreaktive Abnahme der Luciferasereporteraktivität zeigten.
Wir untersuchten weiter die negative Hormonaktivität von AGN 193109 durch Überprüfung seiner Fähigkeit zur Unterdrückung der Genexpression, vermittelt durch einen chimären RAR-γ-Rezeptor, so manipuliert, dass er eine konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne besaß. Insbesondere verwendeten wir einen konstitutiv aktiven RAR-γ-chimären Rezeptor, fusioniert an die saure Aktivatordomäne von HSV VP-16, genannt RAR-γ-VP-16 in zwei Arten von Luciferasereportersystemen. Das erste bestand aus dem ERE-tk-Luc-Reporter, cotransfiziert mit ER-RARs und ER-RXR-α. Das zweite verwendete den ΔMTV-TREp-LUC-Reporter anstelle des ERE-tk-Luc-Reporters.
Beispiel 11 beschreibt das Verfahren, das verwendet wurde, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Aktivität einer Transkriptionsaktivatordomäne eines RARs unterdrücken konnte. Die unten präsentierten Ergebnisse bewiesen, dass AGN 193109 die RAR-abhängige Genexpression in Abwesenheit eines Agonisten unterdrücken konnte und bestätigten, dass AGN 193109 eine negative Hormonaktivität ausübte.
Beispiel 11
Unterdrückung der RAR-VP-16-Aktivität bei transient transfizierten Zellen
CV-1-Zellen wurden transient gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Calciumphosphatcopräzipitationsverfahren cotransfiziert unter Verwendung von 0,5 μg/Vertiefung des ERE-tk-Luc-Luciferasereporterplasmids, 0,1 μg/Vertiefung des ER-RXR-α-chimären Reporterexpressionsplasmids und entweder 0 μg oder 0,1 μg/Vertiefung des RAR-γ-VP-16-Expressionsplasmids. Der chimäre Rezeptor ER-RXR-α bestand aus der Hormonbindungsdomäne (Aminosäuren 181 bis 458) von RXR-α (Mangelsdorf et al. Nature 345: 224–229 (1990), fusioniert mit der Östrogenrezeptor-DNA-Bindungsdomäne (Graupner et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991) und wurde von dem von Ellis et al. in Cell 45: 721 (1986) beschriebenen, auf SV-40 basierenden Expressionsvektor pECE exprimiert. RAR-γ-VP16 ist identisch zu dem VP16RAR-γ1 Expressionsplasmid, beschrieben von Nagpal et al. in EMBO J. 12: 2349 (1993), dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist und codiert ein chimäres Protein mit der Aktivierungsdomäne des VP-16-Proteins von HSV, fusioniert an den Amino-Terminus von Gesamtlängen RAR-γ. Nach 18 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gespült und mit DMEM (Gibco-BRL), enthaltend 10% FBS (Gemini Bio-Products), gefüttert, das mit Holzkohle zur Entfernung von Retinoiden extrahiert worden war. Die Zellen wurden mit einer geeigneten Verdünnung AGN 193109 oder ATRA in Ethanolvehikel oder Ethanol allein für 18 Stunden behandelt, dann mit PBS gespült und unter Verwendung von 0,1 M KPO₄ (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA lysiert. Die Luciferaseaktivität wurde gemäß dem von de Wet et al. in Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) beschriebenen Verfahren gemessen unter Verwendung von Glühwürmchenluciferin (Analytical Luminescence Laboratory) und einem EG&G Berthold-Luminometer für Platten mit 96 Vertiefungen. Die Luciferasewerte, die dargestellt sind, sind das Mittel ± SEM von Dreifachbestimmungen.
Wie in 6 dargestellt, zeigten CV-1-Zellen, transfiziert mit dem ERE-tk-Luc-Reporterkonstrukt und dem ER-RAR-α-chimären Expressionsplasmid eine schwache Aktivierung der Luciferaseaktivität durch ATRA, vermutlich aufgrund einer Isomerisierung von ATRA an 9C-RA, den natürlichen Liganden für RXRs (Hexman et al., Cell 68: 397 (1992). Zellen, die mit derselben Mischung aus Reporter- und chimären Rezeptorplasmiden transfiziert waren, jedoch mit AGN 193109 behandelt wurden, zeigten keine Wirkung auf die Luciferaseaktivität. Da AGN 193109 die RXRs nicht bindet, war dieses letztere Ergebnis zu erwarten. CV-1-Zellen, die ähnlich mit dem ERE-tk-Luc-Reporter transfiziert waren, jedoch unter Ersatz eines ER-RAR-chimären Rezeptorexpressionsplasmids für ER-RXR-α, zeigten eine robuste Induktion der Luciferaseaktivität, folgend auf die ATRA-Behandlung.
Demgegenüber führte der Einschluss des RAR-γ-VP16-Expressionsplasmids mit den ER-RXR-α- und ERE-tk-LUC- Plasmiden in der Transfektionsmischung zu einem signifikanten Anstieg der basalen Luciferaseaktivität, gemessen in Abwesenheit von irgendeinem zugefügten Retinoid. Dieser Anstieg der basalen Luciferaseaktivität, der für die ER-RXR-α/RAR-γ-VP-16-Cotransfektanten beobachtet wurde, verglichen mit dem Ergebnis, erhalten unter Verwendung von Zellen, transfiziert mit ER-RXR-α allein, zeigte an, dass rekombinante ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Proteine Heterodimere bilden könnten. Die Wechselwirkung des Heterodimens mit dem cis-regulatorischen Östrogen-reaktiven Element führte zu einer Heranführung der VP-16-Aktivierungsdomäne an den Promotorbereich des ERE-tk-Luc-Reporters. Die Behandlung solcher dreifach-transfizierten Zellen mit ATRA führte zu einem leichten Anstieg der Luciferaseaktivität gegenüber dem hohen basalen Niveau. Die Behandlung der dreifachen Transfektanten mit AGN 193109 führte jedoch zu einer dosisabhängigen Abnahme der Luciferaseaktivität. Insbesondere zeigt 6, dass die AGN 193109-Behandlung von Zellen, cotransfiziert mit ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 zu einer Unterdrückung der Luciferaseaktivität mit maximaler Inhibition bei ungefähr 10^–8 M AGN 193109 führte.
Unsere Beobachtung, dass AGN 193109 die konstitutive transkriptionelle Aktivierungsfunktion von RAR-γ-VP-16 in Gegenwart von RXR unterdrückte, wurde durch ein Modell erklärt, worin die Bindung von AGN 193109 an RAR eine Konformationsänderung im RAR induzierte, die eine negative Konformation stabilisiert, die die Bindung eines transwirkenden negativen Co-Aktivatorproteins erleichterte. Wenn der AGN 193109/RAR-Komplex durch NCP gebunden wird, kann das RAR die Transkription von Genen nicht mehr hochregulieren, die im allgemeinen auf aktivierte RARs reagieren. Unser Modell schlägt weiter vor, dass das intrazelluläre NCP-Reservoir in limitierender Konzentration in bestimmten Kontexten vorliegt und durch AGN 193109 stimulierte Komplexbildung mit RARs vermindert werden kann.
Die in 6 dargestellten Ergebnisse zeigen zusätzlich an, dass selbst bei 10^–6 M AGN 193109 die ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Proteine zur Bildung von Heterodimeren in Wechselwirkung treten konnten, die für die Aktivierung der Transkription des Reportergens kompetent waren. Insbesondere ergaben Zellen, transfiziert mit ER-RXR-α und RAR-γ-VP-16 und behandelt mit AGN 193109 bei einer Konzentration (10^–8 bis 10^–6 M), die ausreichte, um eine maximale Inhibition bereitzustellen, Luciferaseaktivitätsablesungen von ungefähr 16.000 rle. Demgegenüber zeigten Zellen, transfiziert nur mit ER-RXR-α und dann mit AGN 193109, bei einer Konzentration von so hoch wie 10^–6 M behandelt, Luciferaseexpressionsniveaus von nur ungefähr 8.000 rle. Die Tatsache, dass ein höheres Niveau an Luciferaseaktivität bei den Zellen erhalten wurde, die sowohl ER-RXR-α als auch RAR-γ-VP-16 exprimierten, selbst in Gegenwart von 10^–6 M AGN 193109, demonstrierte die Persistenz einer Wechselwirkung zwischen den beiden rekombinanten Rezeptoren. Die Unterdrückung der RAR-γ-VP-16-Aktivität durch AGN 193109 legte nahe, dass die Modulation der NCP-Wechselwirkung mit der VP-16-Aktivierung co-dominant sein kann. Dementsprechend stellten wir fest, dass es möglich sein kann, die Expression von Genen zu modulieren, die in der Regel von Retinoiden nicht reguliert werden, und zwar in eine AGN 193109 abhängigen Weise.
Kandidaten für durch AGN 193109 regulierbare Gene beinhalten die, die durch Transkriptionsfaktorkomplexe aktiviert werden, die aus Nicht-RAR-Faktoren bestehen, die mit RARs assoziieren oder Heterodimere bilden, worin der Nicht-RAR-Faktor keinen RAR-Agonisten für die Aktivierung benötigt. Während die Stimulierung mit einem RAR-Agonisten im wesentlichen keine Wirkung auf die Expression solcher Gene ausüben kann, kann die Verabreichung mit AGN 193109 die Bildung inaktiver Transkriptionskomplexe, umfassend AGN 193109/RAR/NCP, unterstützen. Dementsprechend kann die Zugabe des AGN 193109-negativen Retinoidhormons die Transkription von sonst Retinoid-unempfindlichen Genen herabregulieren.
Derselbe Mechanismus kann die Beobachtung erklären, dass AGN 193109 die Aktivität des Gewebestransglutaminase-(TGase)-Gens bei HL-60-Zellen unterdrückt. Ein Retinoid-reaktives Element, bestehend aus drei kanonischen Retinoidhalbstellen, beabstandet 5 bis 7 Basenpaare, wurde in dem Transkriptionskontrollbereich dieses Gens identifiziert. Während TGase durch RXR-selektive Agonisten induziert werden kann, ist es gegenüber RAR-selektiven Agonisten nicht reaktiv. Das TGase-Retinoidreaktionselement ist an ein RAR/RXR-Heterodimer (Davies et al., in Druck) gebunden. Interessanterweise ist AGN 193109 in der Lage, die durch RXR-Agonisten induzierte TGase-Aktivität zu unterdrücken. Diese AGN 193109 vermittelte Unterdrückung kann durch die Fähigkeit dieses negativen Hormons erklärt werden, NCPs an den RAR-Bestandteil des Heterodimers zu binden, wodurch die Aktivität des assoziierten RXRs unterdrückt wird.
Wir haben auch Ergebnisse erhalten, die Schlussfolgerungen unterstützen, die identisch sind zu denjenigen, die in Beispiel 11 dargestellt wurden, indem RAR-γ-VP-16 und Expressionskonstrukte und das ΔMTV-TREp-Luc-Reporterplasmid anstelle der RAR-γ-VP-16- und ER-RXR-α-Expressionskonstrukte in Kombination mit dem ERE-tk-Luc-Reporterplasmid verwendet wurden. Konsistent mit den Ergebnissen, die oben dargestellt wurden, stellten wir fest, dass die RAR-γ-VP-16-Aktivität am ΔMTV-TREp-Luc-Reporter durch AGN 193109 inhibiert wurde. Daher unterdrückte AGN 193109 die RAR-γ-VP-16-Aktivität, wenn dieser chimäre Rezeptor direkt an ein Retinolsäure-Rezeptorreaktionselement gebunden war, anstatt einer indirekten Bindung an ein Östrogenreaktionelement im Promotorbereich des Reporterplasmids. Diese Feststellungen demonstrierten, dass ein Assay für die Identifizierung von Mitteln mit einer negativen Hormonaktivität nicht auf die Verwendung eines bestimmten Reporterplasmids begrenzt sein muss. Stattdessen involviert das kritische Merkmal, dargestellt durch ein experimentelles System, das für die Identifikation von negativen Retinoidhormonen geeignet ist, den Nachweis der Fähigkeit einer Verbindung die Aktivität von RAR zu unterdrücken, manipuliert um eine konstitutive Transkriptionsaktivierungsdomäne zu enthalten.
Allgemein können negative Retinoidhormone als Untergruppe von Retinoidverbindungen identifiziert werden, die innerhalb einer transfizierten Zelle das basale Niveau der Expression eines Reportergens unterdrücken, das transkriptionell reaktiv zu einer direkten oder indirekten Bindung eines Retinoidrezeptors oder eines chimären Rezeptors ist, der mindestens die Domänen des Retinoidrezeptors beinhaltet, lokalisiert C-terminal zu der DNA-Bindungsdomäne des Rezeptors. Dieser Ansatz wurde an ein Screeningverfahren angepasst, das für die Identifizierung von negativen Retinoidhormonen geeignet ist. In verschiedenen Ausführungsformen des erfundenen Screeningverfahrens ist die Struktur des Rezeptors, für den ein negatives Hormon gesucht wird, variabel. Genauer gesagt, kann der Retinoidrezeptor entweder vom RAR- oder RXR-Subtyp sein. Der Rezeptor kann optional so manipuliert sein, dass er eine konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne beinhaltet. Der für das Screening auf negative Hormone verwendete Retinoidrezeptor enthält optional eine heterologe DNA-Bindungsdomäne als Ersatz für die DNA-Bindungsdomäne, die dem nativen Rezeptor endogen ist. Wenn jedoch ein zweiter Rezeptor in dem Screeningverfahren verwendet wird und wenn der zweite Rezeptor mit dem Retinoidrezeptor, für den ein negatives Hormon gesucht wird, Dimere bilden kann, dann kann dieser Retinoidrezeptor keine DNA-Bindungsdomäne benötigen, da er an die Transkriptionskontrollregion des Reportergens indirekt durch Dimerbildung mit dem zweiten Rezeptor verbunden werden kann, der selbst an die Transkriptionskontrollregion gebunden ist.
In der Praxis des Screeningverfahrens wird die Fähigkeit einer Verbindung zur Unterdrückung der basalen Expression eines Reporters im typischen Fall in einem in vitro-Assay gemessen. Eine basale Expression repräsentiert das Grundlinienniveau einer Reporterexpression in transfizierten Zellen unter Bedingungen, unter denen kein exogen zugefügter Retinoidagonist vorliegt. Optional können Schritte unternommen werden, um endogene Retinoidliganden aus der Umgebung der transfizierten Zellen durch Prozeduren zu entfernen, wie z. B. eine Holzkohleextraktion des Serums, die für Kulturzellen in vitro verwendet wird.
Beispiele für Reportergene, die im Zusammenhang mit dem Screeningverfahren geeignet sind, beinhalten diejenigen, die die Luciferase, beta-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase oder Zelloberflächenantigene codieren, die durch immunchemische Verfahren nachgewiesen werden können. In der Praxis wird nicht angenommen, dass die Natur des Reportergens für die Durchführbarkeit des Verfahrens kritisch ist. Der transkriptionelle regulatorische Bereich des Reporterkonstrukts muss jedoch ein oder mehr cis-regulatorische Elemente beinhalten, die Ziele von Transkriptionsfaktoren sind, für die negative Hormone gesucht werden. Wenn man z. B. RAR-negative Hormone identifizieren will, könnte dann der transkriptionelle regulatorische Bereich des Reporterkonstrukts ein cis-regulatorisches Element enthalten, das durch ein RAR-haltiges Protein gebunden werden kann. In diesem Beispiel sollte eine Korrespondenz zwischen der DNA-Bindungsdomäne von RAR und dem cis-regulatorischen Element des transkriptionell regulatorischen Bereichs des Reporterkonstrukts bestehen. Wenn ein chimäres RAR mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne und einer DNA-Bindungsdomäne, die cis-regulatorische Östrogen-reaktive Elemente binden kann, so in dem Screeningverfahren verwendet wird, dann sollte der transkriptionelle regulatorische Bereich des Reporterkonstrukts ein Östrogen-reaktives Element enthalten. Beispiele für cis-regulatorische Elemente, die direkt Retinoidrezeptoren (RAREs) binden, geeignet im Zusammenhang mit dem Reporterassay, sind von Mangelsdorf et al. in The Retinoid Receptors in The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine, 2. Auflage, herausgegeben von Sporn et al., Raven Press, Ltd., New York (1994) offenbart, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist. Beispiele für cis-regulatorische Elemente, die indirekt chimäre Rezeptoren binden, beinhalten DNA-Bindungsstellen für jedes DNA-Bindungsprotein, für das die DNA-Bindungsdomäne des Proteins in einen chimären Rezeptor eingebaut werden kann, bestehend aus dieser DNA-Bindungsdomäne, gebunden an einen Retinoidrezeptor. Spezifische Beispiele für heterologe DNA-Bindungsdomänen, die in die chimären Rezeptoren manipuliert werden können und die heterologe cis-regulatorische Elemente erkennen werden, beinhalten die, die die Östrogen-reaktiven Elemente erkennen. Der Retinoidrezeptorbereich eines chimären Rezeptors, geeignet im Zusammenhang mit dem Screeningverfahren, muss so nicht die DNA-Bindungsdomäne des Retinoidrezeptors enthalten, muss jedoch mindestens die Ligandenbindungsdomäne des Retinoidrezeptors enthalten.
Ein weiteres Beispiel einer indirekten Retinoidrezeptorbindung an das cis-regulatorische Element beinhaltet die Verwendung eines Proteins, das das cis-regulatorische Element binden kann und mit einem Retinoidrezeptor Dimere bildet. In diesem Fall assoziiert der Retinoidrezeptor sich mit dem cis-regulatorischen Element nur durch Assoziation mit dem für die DNA-Bindung verantwortlichen Protein. Ein Beispiel für ein solches System würde die Verwendung eines Fusionsproteins beinhalten, bestehend aus einer heterologen DNA-Bindungsdomäne, fusioniert an RXR, enthaltend mindestens die Domäne von RXR, die für die Dimerbildung der RARs verantwortlich ist. Gleichzeitig eingeführte RARs können mit einem solchen Fusionsprotein, gebunden durch das cis-regulatorische Element, Dimere bilden. Wir sagen voraus, dass jedes cis-regulatorische Element-Bindungsprotein, das mit RARs Dimere bilden kann, zu indirekter Assoziation des RARs mit dem cis- regulatorischen Element führt, auch zur Verwendung für das Screeningverfahren auf negative Hormone geeignet sein wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Screeningverfahrens werden negative Retinoidhormone identifiziert als diejenigen Retinoide, die die basale Expression eines manipulierten RAR-Transkriptionsfaktors mit erhöhter basaler Aktivität unterdrücken. Obwohl dies für die Durchführbarkeit des Screeningverfahrens nicht essentiell ist, beinhalten die manipulierten RARs, die in dem folgenden Beispiel verwendet werden, eine konstitutive Transkriptionsaktivierungsdomäne. Die Verwendung dieses chimären Rezeptors stellte in vorteilhafter Weise ein Mittel bereit, durch das die basale Expression eines Reportergens in Abwesenheit von jedem Retinoid erhöht werden konnte. Obwohl wir eine transiente Transfektion in den oben im Detail dargestellten Verfahren verwendeten, würden auch stabil transfizierte Zelllinien, die den chimären Rezeptor konstitutiv exprimieren, im Zusammenhang mit dem Screeningverfahren geeignet sein.
Wie im folgenden Beispiel offenbart, konnte ein chimärer Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne mit einem zweiten Rezeptor Heterodimere bilden, der so manipuliert war, dass er eine DNA-Bindungsdomäne enthielt, die spezifisch für ein Östrogenreaktives cis-regulatorisches Element war. In diesem Fall assoziiert der chimäre Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne sich mit dem cis-regulatorischen Bereich, der die Reportergenexpression kontrolliert, und zwar indirekt über Bindung an einen zweiten Rezeptor, der eine DNA-Zielsequenz bindet. Insbesondere wurde der zweite Rezeptor so manipuliert, dass er eine DNA-Bindungsdomäne enthielt, die ein Östrogen-reaktives Element erkannte. In vorteilhafter Weise war das Reportergen mit einem Östrogen-reaktiven Element in dem stromaufwärts gelegenen Promotorbereich nicht reaktiv auf Retinoidagonisten in Abwesenheit des transfizierten chimären Rezeptors mit der konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne. Dementsprechend wurde alle Reportergenaktivität den transfizierten Rezeptoren zugeschrieben. Die kombinatorische Verwendung des Östrogenreaktiven Elements-DNA-Bindungsdomäne und des Östrogenreaktiven Elements-cis-regulatorischen Elements soll nur illustrativ sein. Der Fachmann wird erkennen, dass andere Kombinationen von manipulierten Rezeptoren mit einer Spezifität für Non-RARE-cis-regulortische Elemente ebenfalls für die Praxis des erfundenen Screeningverfahrens geeignet sein können.
Zellen, die im Zusammenhang mit dem Screeningverfahren geeignet sind, werden eukaryotische Zellen sein, die transfiziert werden können. Die Zellen können tierische Zellen sein, wie z. B. vom Menschen, vom Affen oder von Nagern. Wir haben sehr gute Ergebnisse unter Verwendung von CV-1-Zellen erreicht, nehmen jedoch vernünftigerweise an, dass andere kultivierte Zelllinien ebenfalls erfolgreich verwendet werden könnten. Jede Anzahl konventioneller Transfektionsverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind, kann verwendet werden, um ein Expressionsprodukt einzuführen, das den chimären Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne codiert.
Die konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne wird aus einer Vielzahl von Aminosäuren bestehen, die vermutlich einen insgesamt sauren Charakter aufweisen werden, wie dargestellt durch eine negative Ladung bei neutralen pH-Bedingungen. Zum Beispiel kann die konstitutive Transkriptionsaktivatordomäne eine Aminosäuresequenz aufweisen, die in viralen Transkriptionsfaktoren ebenfalls angetroffen wird. Ein Beispiel für einen viralen Transkriptionsfaktor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne ist das Herpes simplex-Virus 16. Andere virale oder synthetische Transkriptionsaktivatordomänen würden jedoch auch für die Konstruktion von Expressionskonstrukten nützlich sein, die den chimären Retinoidrezeptor mit einer konstitutiven Transkriptionsaktivatordomäne codieren.
Wie unten beschrieben, haben wir ein allgemeines Screeningverfahren entwickelt, das für die Identifikation von negativen Retinoidhormonen nützlich ist. Dieses Screeningverfahren stellt ein Mittel zur Unterscheidung einfacher Antagonisten von negativen Hormonen bereit. Tabelle 12 listet verschiedene Retinoidverbindungen auf, die eine starke Affinität für RAR-γ aufweisen, jedoch – mit Ausnahme von ATRA –, diesen Rezeptor in transienten Co-Transfektions-Transaktivierungsassays nicht transaktivieren. Wir haben daher diese Verbindungen getestet, um zu bestimmen, welche RAR-γ-Antagonisten waren und welche, falls überhaupt, von diesen Antagonisten negative Hormonaktivität zeigten.
Beispiel 12 beschreibt das verwendete Verfahren für die Identifikation von Retinoidverbindungen, die Antagonisten waren, und die Untergruppe von Antagonisten, die eine negative Hormonaktivität zeigten.
Beispiel 12
Assay auf negative Retinoidhormone
4 × 10⁴ CV-1-Zellen wurden durch das Calciumphosphat-Co-Präzipitationsverfahren transfiziert, wie beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., herausgegeben von Cold Spring Harbor Lab. Publ. 1989) unter Verwendung von 0,5 μg ERE-tk-Luc-Reporterplasmid und 0,1 μg ER-RAR-γ (Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)) chimären Expressionsplasmid. Nach 18 Stunden wurden die Zellen mit PBS gespült und mit DMEM (Gibco-BRL), enthaltend 10% aktiviertes Holzkohle-extrahiertes FBS (Gemini Bio Products) gefüttert. Die Zellen wurden mit 10^–8 M ATRA in Ethanol oder Ethanol allein behandelt. Zusätzlich wurden ATRA-behandelte Zellen mit 10^–9, 10^–8, 10^–7 oder 10^–6 M der in Tabelle 12 aufgeführten Verbindungen behandelt. Nach 18 Stunden wurden die Zellen in PBS gespült und in 0,1 M KPO₄ (pH 7,8), 1,0% TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA lysiert. Die Luciferaseaktivitäten wurden durch das von de Wet et al. in Mol. Cell. Biol. 7: 725 (1987) beschriebene Verfahren gemessen.
Tabelle 12
Wie durch die zum Teil in 7 und in Tabelle 12 dargestellten Ergebnisse angezeigt, waren mit Ausnahme von ATRA alle in Tabelle 12 aufgeführten Verbindungen Retinoidantagonisten bei RAR-γ.
Die in Tabelle 12 identifizierten RAR-γ-Antagonisten wurden als Nächstes überprüft, um zu bestimmen, ob sie auch Retinoid-negative Hormone waren. 4 × 10⁴ CV-1-Zellen wurden gemäß dem Calciumphosphatverfahren transfiziert, wie beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., herausgegeben von Cold Spring Harbor Lab. Publ. 1989) unter Verwendung des 0,5 μg ERE-tk-Luc-Reporterplasmids und 0,1 μg ER-RXR-α (Graupner et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1554 (1991)) und 0,2 μg RAR-γ-VP-16 (Nagpal et al. EMBO J. 12: 2349 (1993)) chimären Expressionsplasmiden. Nach 18 Stunden wurden die Zellen mit PBS gespült und mit DMEM (Gibco-BRL), enthaltend 10%iges aktiviertes Holzkohle-extrahiertes FBS (Gemini Bio-Products) gefüttert. Die Zellen wurden mit 10^–9, 10^–8, 10^–7 oder 10^–6 M jeder der in Tabelle 12 aufgeführten Verbindungen behandelt. Eine Behandlung mit einem Ethanolvehikel allein, diente als Negativkontrolle. Nach 18 Stunden wurden die Zellen in PBS gespült und in 0,1 M KPO₄ (pH 7,8), 1,0 TRITON X-100, 1,0 mM DTT, 2 mM EDTA lysiert. Die Luciferaseaktivitäten wurden gemessen wie vorher von det Wet et al. in Mol Cell. Biol. 7: 725 (1987) beschrieben.
Wie in 8 dargestellt, konnten die Retinoidantagonisten von Tabelle 12 in zwei Klassen getrennt werden, und zwar durch ihre Wirkung auf die konstitutive Transkriptionsaktivierungsfunktion des RAR-γ-VP-16-chimären Retinoidrezeptors. Eine Gruppe, die AGN 193174, AGN 193199 und AGN 193840 beinhaltete, unterdrückte die RAR-γ-VP-16-Aktivität nicht, obwohl es sich um ATRA-Antagonisten handelte. Demgegenüber zeigten AGN 193109, AGN 193385, AGN 193389 und AGN 193871 eine dosisabhängige Unterdrückung der RAR-γ-VP-16-konstitutiven Aktivität. Während die Verbindungen beider Gruppen RAR-γ-Antagonisten waren, zeigten daher nur die der zweiten Gruppe eine negative Hormonaktivität. Dieser Assay unterschied in vorteilhafter Weise zwischen den negativen Retinoidhormonen und einfachen Retinoidantagonisten.
Die vorstehenden experimentellen Ergebnisse bewiesen, dass AGN 193109 den Kriterien entsprach, die ein negatives Hormon definieren. Insbesondere demonstrierten die unter Beispiel 11 dargestellten Ergebnisse, dass AGN 193109 eine Fähigkeit zur Ausübung einer inhibitorischen Aktivität an den RARs, selbst in Abwesenheit von exogen zugefügten Retinoidliganden hatte. Als solches besaß diese Verbindung biologische Aktivitäten, die nicht von einer Blockade der Wechselwirkung zwischen den RARs und Agonisten, wie z. B. ATRA und AGN 191183, abhing. Diese Feststellungen führten uns zu der Schlussfolgerung, dass AGN 193109 Wechselwirkungen zwischen RARs und NCPs stabilisierte. Wie diagrammhaft in 9 dargestellt, existieren NCP/RAR/PCP-Wechselwirkungen in einem Gleichgewichtszustand. Ein Agonist dient zur Erhöhung der PCP-Wechselwirkungen und einer Verminderung der NCP-Wechselwirkungen, während ein inverser Agonist oder negatives Hormon NCP stabilisiert und PCP-Wechselwirkungen vermindert. Wie vorher angegeben, legten unsere experimentellen Ergebnisse nahe, dass die intrazelluläre Verfügbarkeit von NCP für andere Rezeptoren durch eine AGN 193109-Verabreichung moduliert werden kann. Insbesondere entdeckten wir, dass AGN 193109 die Komplexbildung von NCP mit RARs unterstützen kann und dadurch das intrazelluläre Reservoir an NCP reduziert, das für eine Wechselwirkung mit Transkriptionsfaktoren, bei denen es sich nicht um RARs handelt, zur Verfügung steht.
Als Nächstes untersuchten wir die Wirkung von AGN 193109 auf eine Agonist-vermittelte Inhibition einer AP-1-abhängigen Genexpression. In Endocr. Rev. 14: 651 (1993), offenbarte Pfhal, dass Retinoidagonisten die Genexpression durch einen Mechanismus herabregulieren können, der eine Inhibition der AP-1-Aktivität involvierte. Wir postulierten, dass AGN 193109 einen der beiden Effekte haben könnte, wenn es in Kombination mit einem Retinoidagonisten in einem Modellsystem verwendet würde, das so aufgebaut war, dass die AP-1-Aktivität gemessen wurde. Zunächst könnte AGN 193109 die Wirkung des Agonisten antagonisieren, und dadurch die Agonist-abhängige Inhibition der AP-1-Aktivität erleichtern. Alternativ könnte AGN 193109 die Aktivität des Agonisten verstärken und dadurch die Agonist-abhängige Inhibition der AP-1-Aktivität betonen.
Beispiel 13 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die anti-AP-1-Aktivität eines Retinoidagonisten verstärkte. Wie unten offenbart, inhibierte der AGN 191183 Retinoidagonist, die AP-1-abhängige Genexpression etwas. Die Kombination aus AGN 193109 und dem Retinoidagonisten inhibierte die AP-1-abhängige Genexpression stark. Selbst hatte AGN 193109 im wesentlichen keine anti-AP-1-Aktivität.
Beispiel 13
AGN 193109 verstärkt die Anti-AP-1-Aktivität eines Retinoidagonisten
HeLa-Zellen wurden mit 1 μg des Str-AP1-CAT-Reportergen-Konstrukts und 0,2 μg des pRS-hRARα-Plasmids, beschrieben durch Giguere et al. in Nature 33: 624 (1987), unter Verwendung von LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Inc.), transfiziert. Str-AP1-CAT wurde durch Clonierung des DNA-Fragments, korrespondierend zu den Positionen –84 bis +1 des Rattenstromelysin-1-Promotors (Matrisian et al., Mol. Cell. Biol. 6: 1679 (1986)) zwichen die HindIII-BamHI-Stellen von pBLCAT3 (Luckow et al., Nucl. Acids Res. 15: 5490 (1987)) hergestellt. Diese Sequenz des Stromelysin-1-Promotors enthält ein AP1-Motif als einziges Enhancerelement (Nicholson et al., EMBO J. 9: 4443 (1990)). Die Promotorsequenz wurde durch Verkleben von zwei synthetischen Oligonucleotiden mit den folgenden Sequenzen hergestellt:
5'-AGAAGCTTATGGAAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGGGTGACTCTGCAAATACTGCCACTCTATAAAAGTTGGGCTCAGAAAGGTGGACCTC GAGGATCCAG-3'
(SEQ ID NO. 2); und
5'-CTGGATCCTCGAGGTCCACCTTTCTGAGCCCAACTTTTATAGAGTGGCAGTATTTGCAGAGTCACCCGCAAACTGACTCATAATTGCTTCCATAAGCTTCT-3' (SEQ ID NO: 3). Verfahren, die eine Transfektion, Behandlung mit geeigneten Verbindungen und Messung der CAT-Aktivität involvierten, wurden wie von Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) beschrieben durchgeführt, dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme eingeschlossen ist.
Die Ergebnisse dieser Verfahren legten nahe, dass AGN 193109 die anti-AP-1-Aktivität des Retinoidagonisten, AGN 191183, verstärkte. Insbesondere inhibierte AGN 191183 im Konzentrationsbereich von 10^–12 bis 10^–10 M, die TPA-induzierte Str-AP1-CAT-Expression nicht. Die Behandlung mit AGN 193109 im Konzentrationsbereich von 10^–10 bis 10^–8 M inhibierte die AP-1-vermittelte Reporteraktivität nicht wesentlich. Die in 10 dargestellten Ergebnisse zeigten jedoch, dass die Stimulierung der Transfektanten mit einer Kombination aus AGN 193109 (10^–8 M) und AGN 191183 im Konzentrationsbereich von 10^–12 bis 10^–10 M die TPA-induzierte Str-AP1-CAT-Expression in einer Menge von 12% bis 21% wesentlich inhibierte. Daher verstärkte AGN 193109 die anti-AP-1-Aktivität von AGN 191183 unter Bedingungen, unter denen dieser Retinoidagonist normalerweise die AP-1-Aktivität nicht inhibiert.
Wir überlegten, dass AGN 193109 die Agonist-vermittelte Repression der AP-1-Aktivität durch einen Mechanismus verstärkte, der vermutlich eine AGN 193109-abhängige Sequestration von NCPs an RARs beinhaltete. RARs gehören zu einer Superfamilie von nuklearen Rezeptoren, die auch Rezeptoren für 1,25-Dihydroxyvitamin D₃, Glucokortikoid, Thyroidhormon, Östrogen und Progesteron beinhaltet. Es war eine vernünftige Annahme, dass die Fähigkeit zur Bindung von NCPs von unterschiedlichen Mitgliedern der nuklearen Rezeptorsuperfamilie geteilt wird. Dies führte uns zu der Spekulation, dass AGN 193109 die anti-AP-1-Aktivität von ein oder mehr Liganden verstärken könnte, die mit dieser Superfamilie von nuklearen Rezeptoren in Wechselwirkung treten.
Die in dem vorstehenden Beispiel dargelegten Ergebnisse zeigten deutlich, dass AGN 193109 die anti-AP-1-Aktivität eines Retinoidagonisten verstärkte. Insbesondere erniedrigte AGN 193109 die Grenzwertdosis, bei der eine anti-AP-1-Aktivität von AGN 191183 nachgewiesen werden konnte. Da AGN 193109 selbst im wesentlichen keine anti-AP-1-Aktivität aufwies, war seine Wirkung auf die nuklearen Rezeptoragonisten synergistisch. Wir stellten auch fest, dass das AGN 193109 negative Hormon die anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃, des natürlichen Liganden für den Vitamin D₃-Rezeptor, verstärkte.
Die beobachtete Synergie zwischen AGN 193109 und AGN 191183 im vorstehenden Beispiel legte notwendigerweise nahe, dass die anti-AP-1-Aktivität des Retinoidagonisten und die AGN 193109-vermittelte Verstärkung dieser Aktivität sich aus unterschiedlichen Mechanismen ergeben muss. Wenn die Wirkungsmechanismen der beiden Mittel identisch wären, würde daraus folgen, dass die Wirksamkeit der Kombination von AGN 193109 und des Agonisten additiv sein würde. Stattdessen hat sich die Kombination als effektiver als jedes Mittel allein erwiesen, eine Wirkung, die vor dieser Feststellung nicht vorhergesagt hätte werden können.
Insbesondere wurde die AGN 193109 vermittelte Verstärkung des RAR-Agonisten unter Verwendung eines ca. 100-fachen molaren Überschusses von AGN 193109 über den des Retinoidagonisten durchgeführt. Dementsprechend sollte die Vielzahl von RARS durch AGN 193109 gebunden werden, was sehr wenige RARs für die Agonistenbindung verfügbar lässt. Trotz dieser Tatsache war die Population von RARs, die nicht an AGN 193109 gebunden waren, in der Lage, den Retinoidagonisten zu binden und in kräftiger Weise eine Agonist-abhängige Reaktion zu stimulieren, messbar als Inhibition der Reportergenexpression. So legten unsere Daten eine mögliche Heterogenität von RARs nahe, die durch AGN 193109 induziert werden.
Die negative Hormonaktivität von AGN 193109, seiner Fähigkeit zur Unterstützung der Wechselwirkung von RARs und NCPs zugeordnet, stellte eine Basis für das Verständnis der Synergie zwischen AGN 193109 und Retinoidagonisten bereit.
Unsere Ergebnisse stimmten vollständig mit einem Modell überein, worin eine AGN 193109-Behandlung von Zellen die Bindung von RARs und NCPs unterstützt und dadurch die Anzahl von freien NCP und freien RAR innerhalb der Zelle reduziert. Dies führt zu der Erzeugung von zwei Populationen von RARs, die funktionell unterschiedlich sind. Die erste Population wird durch RARs repräsentiert, assoziiert mit NCPs. Solche AGN 193109/RAR/NCP-Komplexe können durch Retinoidagonisten nicht aktiviert werden. Die zweite Population besteht aus RARs, die nicht durch NCP gebunden werden, und die für eine Wechselwirkung mit Agonisten weiter zur Verfügung stehen. Diese letztere Population wird als "RAR*" bezeichnet, um freie RARs anzuzeigen in einer Umgebung, die im wesentlichen von NCP befreit ist.
Die RAR* haben verminderte Wahrscheinlichkeiten einer Assoziation mit NCP durch Gleichgewichtsbindung und haben eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Retinoidagonisten, messbar z. B. als anti-AP-1-Aktivität. Dies liegt daran, da während das intrazelluläre Reservoir von NCP durch AGN 193109-Verabreichung ausgeschöpft wurde, das Reservoir an PCP nicht ausgeschöpft wurde. Dementsprechend können RAR* an einen Retinoid-Agonisten binden und mit PCP-Faktoren in einer Umgebung interagieren, die im wesentlichen von NCPs frei ist. Die Fähigkeit von AGN 193109 zur Erhöhung der Empfindlichkeit anderer nuklearer Rezeptoren gegenüber ihren jeweiligen Agonisten kann der Fähigkeit dieser unterschiedlichen nuklearen Rezeptoren zur Wechselwirkung mit denselben NCPs zugeschrieben werden, die mit den AGN 193109/RAR-Komplexen interagieren. Dieses Modell einer AGN 193109-vermittelten Modulation der NCP-Verfügbarkeit für nukleare Rezeptorfamilienmitglieder ist schematisch in 11 dargestellt.
Dieses mechanistische Modell führt uns zu der Vorhersage, dass AGN 193109 die Aktivitäten nuklearer Rezeptorliganden, bei denen es sich nicht um Retinoidagonisten handelt, modulieren könnte. Wie in dem folgenden Beispiel illustriert, bestätigten wir, dass AGN 193109 die Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in einem in vitro-Transaktivierungsassay verstärkte.
Beispiel 14 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in einem Transaktivierungsassay verstärkte.
Beispiel 14
AGN 193109 verstärkt die 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Aktivität
HeLa-Zellen wurden unter Verwendung des kationischen Liposomen-vermittelten Transfektionsverfahrens, wie beschrieben von Felgner et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987) transfiziert. 5 × 10⁴-Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen plattiert und mit DMEM, supplementiert mit 10% FBS, angefüttert. Die Zellen wurden in serumfreies Medium unter Verwendung von 2 μg/Vertiefung LIPOFECTAMIN-Reagens (Life Technologies, Inc.) mit 0,7 μg des Reporterplasmids MTV-VDRE-Luc co-transfiziert, enthaltend zwei Kopien des 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Reaktionselements, 5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3' (SEQ ID NO: 4) aus dem Mausosteopontingen (Ferrara et al., J. Biol. Chem. 269: 2971 (1994)), ligiert in das Reporterplasmid ΔMTV-Luc (Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992)), und 0,3 μg des Plasmids pGEM3Z (Pharmacia, Inc.) als Träger-DNA, um die Endkonzentration an DNA auf 1,0 μg/Vertiefung einzustellen. Nach 6 h Transfektion wurden die Zellen mit Wachstumsmedium, enthaltend Holzkohleextrahiertes FBS, bei einer Endkonzentration von 10% gefüttert. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Vehikel allein (Ethanol) oder AGN 193109 in Ethanol bei einer Endkonzentration von entweder 10^–8 oder 10^–7 M behandelt. 6 Stunden später wurde 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in Ethanol zu einer Endkonzentration von 10^–10 bis 10^–7 M zugefügt. Die Zellen wurden lysiert und geerntet, 18 h folgend auf die 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Behandlung. Die Luciferaseaktivität wurde wie oben beschrieben gemessen. Dieses experimentelle System ermöglichte ein geeignetes Verfahren für die Überwachung und Quantifizierung der 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-abhängigen Genexpression.
Die in 12 repräsentierten Ergebnisse legen nahe, dass im Vergleich mit dem unter Verwendung von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ allein erhaltenen Ergebnis AGN 193109, co-verabreicht mit 1,25-Dihydrovitamin D₃, die Dosisreaktionskurve nach links verlagerte. Dies bestätigte, dass AGN 193109 die Wirksamkeit von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in dem in vitro Transaktivierungsassay verstärkte. Insbesondere illustriert 12 graphisch, dass eine AGN 193109-Konzentration, die so niedrig lag wie 10 bis 100 nM, das 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ ungefähr 10-fach aktiver machte. Während eine 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Konzentration von 10^–8 M notwendig war, um eine Luciferaseexpression von ungefähr 2000 rle bereitzustellen, war nur ungefähr ein Zehntel so viel 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ notwendig, um dieselbe Luciferaseausgabe zu erzeugen, wenn das Vitamin zusammen mit AGN 193109 bei einer Konzentration von 10^–8 bis 10^–7 M co-verabreicht wurde. Obwohl in der Graphik gemäß 12 nicht dargestellt, wurden im wesentlichen identische Ergebnisse unter Verwendung von AGN 193109-Konzentrationen von 10^–9 M und 10^–8 M erhalten. So reduzierte die Co-Verabreichung mit AGN 193109 die Menge an 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ wesentlich, die notwendig war, um eine ähnliche Wirkung in Abwesenheit des negativen Hormons zu erzeugen.
Interessanterweise gab es eine koinzidente Abnahme der Fähigkeit von AGN 193109 zur Verstärkung der Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃, wenn das obige Verfahren mit einer Co-Transfektion eines Vitamin D₃-Rezeptor(VDR-)Expressionsplasmids wiederholt wurde. Wir interpretierten dieses Ergebnis so, dass es anzeigte, dass eine Überexpression von VDRs die Fähigkeit von AGN 193109 zur Vestärkung der Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ beeinflussen könnte. So kann die intrazelluläre Konzentration eines Ligandenrezeptors, die in gewebsspezifischer Weise differieren kann, die Fähigkeit von AGN 193109 zur Verstärkung der Aktivität eines Liganden, der den Rezeptor bindet, beeinflussen. Dies stimmte wiederum mit einem Modell überein, worin titrierbare NCPs zu der Regulierung der Vitamin D₃-Reaktion beitrugen und unterstützte das oben dargestellte Modell.
Wie im folgenden Beispiel illustriert, bestätigten wir auch, dass AGN 193109 die anti-AP-1-Aktvität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ verstärkte. Unser Modell für die Aktivität der AGN 193109-Wirkung erklärte diese Beobachtung durch Betrachtung, dass NCPs mit RARs in Gegenwart des Arzneimittels stark assoziieren. Endogene Vitamin D-Rezeptoren, die in HeLa-Zellen vorliegen, wurden vermutlich gegenüber dem 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Liganden empfindlicher gemacht, mit der Konsequenz einer Betonung der Fähigkeit dieses Ligandens zur Inhibition der Expression von dem Str-AP1-CAT-Reporter.
Beispiel 15 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ verstärkte.
Beispiel 15
AGN 193109 verstärkt die anti-AP-1-Aktivität von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃
HeLa-Zellen wurden mit 1 μg Str-AP1-CAT unter Verwendung von LIPOFECTAMINE gemäß dem von Nagpal et al in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) beschriebenen Verfahren transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden mit AGN 193109 allein (10^–9 bis 10^–7 M), 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ allein (10^–12 bis 10^–7 M) oder 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (10^–12 bis 10^–7 M) in Gegenwart von 10^–8 M AGN 193109 behandelt.
Die Ergebnisse dieser Verfahren lege nahe, dass AGN 193109 die Fähigkeit von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ zur Inhibition der TPA-induzierten AP-1-Aktivität verstärkte. Wenn es allein in einem Konzentrationsbereich von 10^–9 bis 10^–7 M verwendet wurde, hatte AGN 193109 keine nachweisbare anti-AP1-Aktivität. Die in 13 dargestellten Ergebnisse zeigten, dass 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ eine TPA-stimulierte Aktivität nur in einem Konzentrationsbereich von 10^–8 bis 10^–7 M unterdrückte. Die Analyse der 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-vermittelten Unterdrückung von TPA-stimulierten CAT-Aktivität in Gegenwart von 10^–8 M AGN 193109 zeigte, dass die anti-AP-1-Aktivität bei 10^–10 und 10^–9 M 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ nachweisbar war und ein Anstieg der Aktivität bei Dosierungen von 10^–8 und 10^–7 M im Vergleich mit 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ behandelten allein. Diese AGN 193109-abhängige Modulation der 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-vermittelten anti-AP-1-Aktivität war konsistent mit unserem Modell, worin die NCP-Sequestrierung an RARs das NCP nicht mehr für eine Wechselwirkung mit anderen Mitgliedern der nuklearen Rezeptorfamilie zur Verfügung stehen ließ. Dementsprechend wurden die Rezeptoren gegenüber der 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Behandlung empfindlicher gemacht.
Die der RAR-vermittelten Transaktivierung und anti-AP-1-Aktivität zugrunde liegenden Mechanismen sind vermutlich unterschiedlich. Diese Schlussfolgerung basierte auf unserer Beobachtung, dass hohe Dosierungen AGN 193109 die Transaktivierung ohne substantielle Inhibition einer anti-AP1-Aktivität vollständig inhibierten. Wir wollten daher zusätzliche Beweise zur Unterstützung unseres Modells für die RAR*-Bildung, vermittelt durch AGN 193109-Behandlung, gewinnen. Um dies zu erreichen, haben wir untersucht, ob AGN 193109 die Aktivität des RAR-spezifischen Agonisten AGN 191183 in einem in vitro-Transaktivierungsassay verstärken könnte.
Beispiel 16 beschreibt die verwendeten Verfahren, um zu zeigen, dass AGN 193109 die Aktivität des RAR-spezifischen Agonisten AGN 191183 verstärkte.
Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten, dass AGN 193109 unter bestimmten Umständen die Potenz des RAR-spezifischen Retinoids verstärkte, und stellten schlagkräftige Beweise bereit, dass AGN 193109 die RAR*-Bildung unterstützte.
Beispiel 16
Verstärkung der Retinoid-Wirksamkeit durch AGN 193109-Co-Verabreichung
HeLa-Zellen wurden unter Verwendung des durch kationische Liposom-vermittelten Transfektionsverfahrens transfiziert, beschrieben von Felgner et al. in Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7413 (1987). 5 × 10⁴-Zellen wurden in Platten mit 12 Vertiefungen plattiert und mit DMEM, supplementiert mit 10% FBS, gefüttert. Die Zellen wurden in serumfreies Medium unter Verwendung von LIPOFECTAMINE-Reagens (2 μg/Vertiefung, Life Technologies, Inc.) mit 0,7 μg des Reporterplasmids MTV-TREp-Luc, enthaltend zwei Kopien des TREpal-Reaktionselements 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3' (SEQ ID NO: 5), inseriert in das Reporterplasmid ΔMTV-Luc (Heyman et al. in Cell 68: 397 (1992)), und 0,1 μg des RAR-γ-Expressionsplasmids pRShRAR-γ (Ishikawa et al., Mol. Endocrinol. 4: 837 (1990)) cotransfiziert. Nach 6 h Transfektion wurden die Zellen mit Wachstumsmedium gefüttert, enthaltend Holzkohle-extrahiertes FBS, bei einer Endkonzentration von 10%. 18 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen mit Vehikel allein (Ethanol) oder AGN 193109 in Ethanol bei einer Endkonzentration von 10^–11 bis 10^–8 M behandelt. 6 Stunden später wurde AGN 191183 in Ethanol zu einer Endkonzentration von entweder 0, 10^–10 oder 10^–9 M zugefügt. Die Zellen wurden nach 18 Stunden einer AGN 191183-Behandlung geerntet und die Luciferaseaktivität wurde wie oben beschrieben gemessen.
Vorläufige Experimente zeigten, dass 10^–9 M AGN 193109 für die Inhibition der Reaktion auf 10^–9 M AGN 191183 bei HeLa-Zellen relativ ineffektiv war. Dies stand im Kontrast zu der Fähigkeit von 10^–9 M AGN 193109 10^–8 M ATRA in CV-1-Zellen (2) zu inhibieren.
Die in 14 dargestellten Ergebnisse unterstützten die Vorhersage, dass AGN 193109 die Bildung von RAR* stimulierte. Konsistent mit unserer Charakterisierung des antagonistischen und der negativen Hormonaktivitäten von AGN 193109 führte die Behandlung von AGN 193109 zu einer biphasischen Dosisreaktionskurve. Die niedrigsten Dosierungen von AGN 193109 (10^–11 und 10^–10 M) führten zu einer Stimulierung der Luciferaseaktivität über diejenige von AGN 191193 allein. Diese Wirkung legt nahe, dass RAR*s von AGN 193109 erzeugt werden. Interessanterweise wurde dies auch für die AGN 193109-Behandlung allein beobachtet, was nahe legt, dass RAR* auf einen endogenen Liganden reagieren können. AGN 191183 ist ein synthetischer Retenoidagonist und aktiviert wie ATRA die Transkription durch RARs. Die Substitution von AGN 191183 durch ATRA in Beispiel 7 wird qualitativ ähnliche Ergebnisse geben (d. h. AGN 193109 würde die Wirkung von 10 nM AGN 191183 antagonisieren). Beispiel 16 illustriert dass, obwohl AGN 193109 als Antagonist von RAR-Agonisten wirken kann, Dosierungsbedingungen einfach identifizierbar wären, worin eine AGN 193109-Co-Verabreichung die Aktivierung, die durch einen RAR-Agonisten vermittelt wird, potenzieren könnte. Es ist auch wichtig festzuhalten, dass die Dosierungen der in Beispiel 16 verwendeten Verbindungen wesentlich niedriger liegen, als die Dosierungen, die in dem gemäß Beispiel 7 beschriebenen Verfahren verwendet wurden. Wir haben vorgeschlagen, dass AGN 193109-Behandlungen zu einer RAR-Heterogenität RARs versus RAR*s führen könnte. Die anscheinende Heterogenität (d. h. die Fähigkeit zur Verstärkung) scheint unterschiedliche Transaktivierungsfenster gegenüber der AP-1-Repression zu haben. Der Grund dafür, dass die Kurven diphasisch sind, ist der, dass mit steigenden Mengen AGN 193109 proportional weniger RAR zur Bindung des Agonisten zur Verfügung steht. Das scheint für die AP-1-Unterdrückung nicht der Fall zu sein und wir können nur spekulieren, dass dieser Unterschied zwei unterschiedliche Mechanismen für die Transaktivierung und AP-1-Unterdrückung durch dieselbe Rezeptorart reflektieren muss.
Klinische Ergebnisse haben bestätigt, dass einige Retinoide für die Inhibition des Wachstums prämaligner und maligner Zervikalläsionen nützlich sind. Beispielhafte Studien, die diese Schlussfolgerung unterstützen, wurden veröffentlicht von Graham et al. in West. J. Med. 145: 192 (1986), durch Lippman et al. in J. Natl. Cancer Inst. 84: 241 (1992) und durch Weiner et al. in Invest. New Drugs 4: 241 (1986)).
Ähnliche Schlussfolgerungen werden durch die Ergebnisse von in vitro-Studien unterstützt, die kultivierte Zellen verwendeten, um die antiproliferativen Wirkungen verschiedener Retinoide zu quantifizieren. Insbesondere Agarwal et al. in Cancer Res. 51: 3982 (1991) verwendete die ECE16-1-Zelllinie, um die Frühstadien von einer zervikalen Dysplasie nachzuahmen und demonstrierten, dass Retinolsäure die epidermale Wachstumsfaktor-(EGF)-abhängige zelluläre Proliferation inhibieren konnte.
Beispiel 17 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Aktivität des AGN 191183 Retinoidagonisten antagonisieren kann, der die Proliferation der ECE16-1 Zelllinie inhibierte.
Beispiel 17
AGN 193109 wirkt antagonistisch auf die antiproliferative Wirkung von Retinoiden bei ECE16-1-Zellen
ECE16-1-Zellen wurden mit einer Dichte von 1 × 10⁴-Zellen pro cm² in Komplettmedium, enthaltend DMEM : F12 (3 : 1), nicht-essentielle Aminosäuren, 5% FBS, 5 μg/ml Transferrin, 2 nM 3,3',5-Triiodthyronin (Thyroidhormon oder "T₃"), 0,1 nM Choleratoxin, 2 mM L-Glutamin, 1,8 × 10^–4 M Adenin und 10 ng/mg EGF, ausgesät. Man ließ die Zellen sich an die Platten über Nacht anhaften und übertrug sie dann auf ein definiertes Medium, enthaltend DMEM : F12 (3 : 1), 2 mM L-Glutamin, nicht-essentielle Aminosäuren, 0,1% Rinderserumalbumin, 1,8 × 10^–4 M Adenin, 5 μg/ml Transferrin, 2 nM T₃, 50 μg/ml Ascorbinsäure, 10 μg/ml Streptomycin, 100 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Gentamicin. Ein definiertes Medium (DM) wurde mit 10 ng/ml EGF supplementiert. EGF-behandelte Zellen erhielten 10 nM des AGN 191183 Retinoidagonisten in Kombination mit entweder 0, 0,1, 1,0, 10, 100 oder 1000 nM AGN 193109 oder 1000 nM AGN 193109 allein. Nach drei Behandlungstagen wurden die Zellen, wie beschrieben von Hembree et al. in Cancer Res. 54: 3160 (1994) geerntet und die Zellzahlen unter Verwendung eines COULTER-Zählers bestimmt.
Die in 15 dargestellten Ergebnisse demonstrieren, dass ECE16-1-Zellen in Reaktion auf EGF, jedoch nicht in definiertem Medium allein proliferierten. Dies bestätigte die von Andreatta-van Leyen et al. in J. Cell. Physio. 160: 265 (1994) und von Hembree et al. in Cancer Res. 54: 3160 (1994) veröffentlichten Feststellungen. Die Zugabe von 10 nM AGN 191183 und 0 nM AGN 193109 inhibierte die EGF-vermittelte Proliferation vollständig. So war AGN 191183 ein starkes proliferatives Retinoid. Eine Erhöhung der AGN 193109-Konzentration von 0 nM auf 10 nm wirkte antagonistisch auf die AGN 191183-vermittelte Wachstumsinhibition um ungefähr 50%. Ein 10-facher molarer Überschuss AGN 193109 kehrte die antiproliferative Wirkung von AGN 191183 vollständig um. Die Behandlung von Zellen mit 1000 nM AGN 193109 hatte keine Wirkung auf den EGF-vermittelten Proliferationsanstieg. Diese Ergebnisse belegten, dass AGN 193109 gegenüber der antiproliferativen Wirkung eines Retinoid antagonistisch wirkte, jedoch im wesentlichen keine antiproliferative Aktivität per se hatte, wenn es verwendet wurde, um Zellen zu behandeln, die das Zervikalepithel repräsentieren, das gegenüber einer Wachstumsinhibition durch Retinoide, wie z. B. AGN 191183 empfindlich ist. Bemerkenswerterweise gab es unter Verwendung des ECE16-1-Modellsystems keinen Beweis dafür, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität des AGN 191183-Agonisten verstärkte.
Gegenüber dem durch die ECE16-1-Zelllinie dargestellten Modellsystems gibt es andere Beispiele, bei denen eine zelluläre Proliferation, assoziiert mit einer zervikalen Dysplasie, durch Retinoidagonisten nicht inhibiert werden konnte. Agarwal et al. in Cancer Res. 54: 2108 (1994) beschrieben z. B. die Verwendung von CaSki-Zellen als Modell für Zervikaltumoren, die gegenüber einer Retinoidtherapie nicht reaktiv sind. Wie unten offenbart, hat die Retinoidbehandlung anstelle einer Inhibition der Zellproliferation im wesentlichen keine Wirkung auf die Wachstumsrate von CaSki-Zellen. Das folgende Beispiel betrifft die Wirkung des AGN 193109-negativen Hormons auf die Proliferationsrate bei dieser Zelllinie. Diese Ergebnisse bewiesen unerwarteterweise, dass AGN 193109 die Proliferation von Zervikaltumorzellen inhibieren konnte, die gegenüber den antiproliferativen Wirkungen von Retinoidagonisten nicht reaktiv waren.
Beispiel 18 beschreibt die verwendeten Verfahren, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 das Wachstum einer Zervikaltumorzelllinie inhibierte, die auf die antiproliferativen Wirkungen anderer Retinoide, wie z. B. AGN 191183, nicht reagierte. Bemerkenswerterweise zeigte AGN 193109 eine antiproliferative Aktivität in Abwesenheit von zugefügtem Retinoid.
Beispiel 18
AGN 193109 inhibiert die Proliferationsrate von einer CaSki-Zervikalcarcinoma abgeleiteten Zelllinie
Wir testeten die Wirkung von EGF auf die CaSki-Zellproliferation, entweder allein oder in Kombination mit dem AGN 191183-Retinoidagonisten und/oder dem AGN 193109 negativen Hormon bei einer Konzentration von 10^–6 M. Zellproliferationsassays wurden wie oben beschrieben für Studien, die ECE16-1-Zellen involvierten, durchgeführt. EGF wurde zu den Retinoid-behandelten Kulturen zugefügt, um eine Endkonzentration von 20 ng/ml zu erhalten. Die Zellen wurden mit AGN 191183 (10^–10 bis 10^–6 M) in Gegenwart oder Abwesenheit von 10^–6 M AGN 193109 für eine Gesamtheit von 3 Tagen behandelt. Die Medien wurden durch frische Medien ersetzt und jede der zwei Retinoidverbindungen, wie passend, täglich. Die Zellzahlen wurden unter Verwendung eines COULTER-Zählers wie oben beschrieben bestimmt.
Die in 16 dargestellten Ergebnisse zeigten, dass CaSki-Zellen im wesentlichen rekraktorisch gegenüber den Wirkungen eines Retinoidagonisten waren und dass AGN 193109 eine antiproliferative Aktivität in Abwesenheit des zugefügten Retinoids ausübte. Die Gegenwart von EGF in den Kulturmedien stimulierte das CaSki-Zellwachstum. Diese Schlussfolgerung basierte auf einem Vergleich der gestreiften Säule, die kein AGN 191183 repräsentiert und der offenen Säule, die das definierte Wachstumsmedium ("DM") allein repräsentiert. Die AGN 191183-Behandlung hatte keine antiproliferative Aktivität auf die CaSki-Tumorzelllinie. Wir vernachlässigten jeden leichten Anstieg der zellulären Proliferationsrate, assoziiert mit dem Retinoidagonisten, da ein 10.000-facher Anstieg der Retinoidagonist-Konzentration mit nur ungefähr einem 20%igen Anstieg der Proliferationsrate assoziiert war. So hatte der AGN 191183-Agonist im wesentlichen keine Wirkung auf die Proliferationsrate von CaSki-Zellen.
Die in 16 dargestellten Ergebnisse zeigten auch, dass AGN 193109 die Proliferation der CaSki-zervikalen Epithelzelllinie inhibierte. Diese Schlussfolgerung basierte auf einem Vergleich der Messungen, die als "0" AGN 191183 schwarze Säule und "0" AGN 191183 gestreifte Säule auftreten. So war AGN 193109 in der Lage, eine biologische Reaktion in Abwesenheit von zugefügten Retinoidagonisten zu stimulieren, wenn es für die Behandlung von zervikalen Tumorzellen verwendet wurde, die durch Retinoidagonisten, wie z. B. AGN 191183, in ihrem Wachstum nicht inhibiert wurden.
Unsere Entdeckung, dass das AGN 193109 negative Hormon die zelluläre Proliferation inhibieren konnte, stimmte mit einem Modell überein, worin nicht-ligierte RARs die Expression von Genen vermittelten, die für die Proliferation nötig waren. Während ein RAR-Agonist wie AGN 191183 im wesentlichen keine Wirkung hatte, oder vielleicht die zelluläre Proliferation nur leicht unterstützte, hatte AGN 193109 eine antiproliferative Wirkung. Das AGN 193109 negative Hormon band RARs vermutlich durch Unterstützung der NCP-Assoziation und durch Veranlassung der RARs zur Annahme einer inaktiven Konformation. Gemäß unserem Modell unterdrückte dies die Genaktivität, die positiv durch Nicht-Liganden gebundene RARs reguliert wurde. Diese Fähigkeit von AGN 193109, die Aktivität von Nicht-Liganden-gebundenen RARs herab zu regulieren, ergab sich vermutlich aus seiner Fähigkeit, die Assoziation von RARs und NCPs zu unterstützen.
Der Fachmann wird erkennen, dass einige Retinoidagonisten für die Kontrolle der unerwünschten Konsequenzen von Zellwachstum nützlich sind, das auf eine Retinalablösung folgt. Nach einer Retinalablösung dedifferenziert sich das Retinalpigmentepithel (RPE), proliferiert und wandert in den Subretinaraum. Dieser Prozess kann den Erfolg von chirurgischen Verfahren, die auf eine Wiederanbindung der Retina abzielen, negativ beeinflussen. Campochiaro et al. in Invest. Opthal & Vis. Sci 32: 65 (1991) haben demonstriert, dass RAR-Agonisten, wie z. B. ATRA, eine antiproliferative Wirkung auf das Wachstum primärer menschlicher RPE-Kulturen ausübte. Retinoidagonisten haben sich auch als die Inzidenz einer Retinalablösung, folgend auf eine Ritina-Wiederanhaftungchirurgie (Fekrat et al. Opthamology 102: 412 (1994)) vermindernd erwiesen. Wie in dem folgenden Beispiel offenbart, analysierten wir die Fähigkeit des AGN 193109 negativen Hormons, das Wachstum in den primären menschlichen RPE-Kulturen zu unterdrücken.
Beispiel 19 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die antiproliferative Wirkung eines Retinoidantagonisten in einer primären Kultur des menschlichen Retinalpigmentepithels verstärkt.
Beispiel 19
AGN 193109 verstärkt die antiproliferative Aktivität von ATRA
Primärkulturen von menschlichem Retinalpigmentepithel (RPE) wurden gemäß dem von Campochiaro et al. in Invest Opthal & Vis. Sci 32: 65 (1991) beschriebenen Verfahren etabliert.
5 × 10⁴-Zellen wurden in 16 mm-Vertiefungen von Platten mit 24 Vertiefungen in DMEM (Gibco), enthaltend 5% FBS, ausplattiert. Die Zellen wurden mit Ethanolvehikel allein blindbehandelt, mit ATRA (10^–10 bis 10^–6 M) in Ethanol, AGN 193109 (10^–10 bis 10^–6 M) in Ethanol oder ATRA (10^–10 bis 10^–6 M) und 10^–6 M AGN 193109. Die Zellen wurden mit frischen Medien, enthaltend die geeigneten Konzentrationen dieser Verbindungen alle zwei Tage für eine Gesamtzeit von 5 Behandlungstagen gefüttert. Die Zellen wurden von den Platten durch vorsichtigen Verdau mit Trypsin entfernt und die Anzahl der Zellen wurde mit einem elektronischen Zellzähler gezählt.
Die in 7 dargestellten Ergebnisse zeigten, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von ATRA auf RPE-Zellen dramastisch verstärkte. Die Behandlung primärer RPE-Zellen mit ATRA führte zu einer dosisabhängigen Abnahme der RPE-Zellproliferation mit einer ungefähr 40%igen Abnahme bei 10^–6 M ATRA, relativ zu den Kontrollkulturen. Die AGN 193109-Behandlung veränderte die Wachstumsrate der RPE-Zellen bei jeder Konzentration, die in diesem Verfahren getestet wurde, nicht substantiell. Unerwarteterweise hatte die Kombination aus ATRA (10^–11 bis 10^–6 M) und 10^–6 M AGN 193109 eine stärkere antiproliferative Aktivität als ATRA allein. So verstärkte die AGN 193109 Co-Behandlung die antiproliferative Wirkung von ATRA. Genauer gesagt, zeigten die in der Figur dargestellten Ergebnisse, dass die antiproliferative Wirkung von 10^–8 M ATRA unter Verwendung von nur 10^–10 M ATRA in Kombination mit 10^–7 M AGN 193109 erhaltbar war. So verstärkte das AGN 193109 negative Hormon in vorteilhafter Weise die antiproliferative Aktivität von ATRA um das unfähr 100-Fache.
In einem unabhängigen Experiment zeigte ein Vergleich der antiproliferativen Wirkung von ATRA (10^–11 bis 10^–6 M) mit der von ATRA und 10^–6 M AGN 193109 wiederum den anscheinenden Anstieg der Empfindlichkeit von primären RPE-Zellen gegenüber ATRA in Gegenwart von AGN 193109. Bei diesem System wirkte AGN 193109 weder als Retinoidantagonist, noch zeigte es, wenn allein verwendet, eine antiproliferative Wirkung. Die AGN 193109-Co-Verabreichung verstärkte jedoch die antiproliferative Aktivität des Retinoidagonisten.
AGN 193109 wurde im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Verstärkung der antiproliferativen Wirkung von 13-cis-Retinolsäure (13-cis RA) in primären RPE-Kulturen unter Verwendung von Bedingungen und Verfahren zur Messung der RPE-Zellproliferation, wie oben beschrieben, getestet. Bemerkenswerterweise ist 13-cis RA klinisch signifikant. Insbesondere ist 13-cis-RA für die Behandlung verschiedener Krankheitszustände nützlich, einschließlich Akne (Peck et al., N. Engl. J. Med. 300: 329 (1977); Jones et al. Br. J. Dermatol. 108: 333 (1980)) und sequamöses Zellkarzinom der Haut und des Cervix in Kombinationsbehandlung mit Interfereon 2α (Lippman et al., J. Natl. Cancer Inst. 84: 241 (1992); Moore et al., Seminars in Hematology 31: 31 (1994)).
Die in 18 dargestellten Ergebnisse zeigten, dass sowohl 13-cisRA (10^–12 bis 10^–6 M) als auch ATRA (10^–12 bis 10^–6 M) effektiv das RPE-Zellwachstum inhibierten. Bemerkenswerterweise war das 13-cis Isomer ungefähr zwei Größenordnungen weniger effektiv in diesem Assay als ATRA. Ähnlich zu den Ergebnissen, die unter Verwendung einer Co-Verabreichung von AGN 193109 und ATRA erhalten wurden (oben), erhöhte die Co-Verabreichung von AGN 193109 (entweder 10^–8 oder 10^–6 M) mit 13-cis RA (10^–12 bis 10^–6 M) dramatisch die Wirksamkeit von 13-cis RA bei einer Vermittlung einer Unterdrückung der RPE-Zellproliferation. In Kontrast zu der Behandlung mit 13-cis RA allein, verstärkte die Co-Verabreichung von AGN 193109 die Potenz von 13-cis RA. So verstärkte AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von 13-cis RA.
Als Nächstes überprüften wir die Fähigkeit von AGN 193109, die Aktivitäten anderer nuklearer Rezeptorhormone in primären RPE-Zellkulturen zu vestärken. Dexamethason, ein synthetischer Glucokortikoidrezeptoragonist, ist ein Mitglied einer Klasse von Verbindungen, die klinisch für ihre wirksame antiinflammatorischen und immunsuppressiven Eigenschaften verwendet wurden. Das Thyroidhormon (T3; 3,3',5'-Triiodthyronin) ist ein natürlicher Thyroidhormonrezeptoragonist, der vorrangig für eine Hormonersatztherapie bei der Behandlung von Hypothyroidismus verwendet wird. Verfahren, die in diesen Experimenten verwendet wurden, sind identisch zu den oben beschriebenen im Hinblick auf die Verfahren unter Verwendung von ATRA und 13-cis RA.
Die Ergebnisse dieser Verfahren zeigen, dass die Co-Verabreichung von AGN 193109 und der nuklearen Rezeptoragonisten die antiproliferativen Aktivitäten der nuklearen Rezeptoragonisten verstärkten. Insbesondere zeigten die in 19 dargestellten Ergebnisse, dass Einzel-Mittel-Behandlungen von RPE-Zellen mit entweder Dexamethason (10^–11 bis 10^–6 M) oder ATRA (10^–12 bis 10^–6 M) im wesentlichen nicht in der Lage waren, die RPE-Zellproliferation zu inhibieren. Eine Behandlung von RPE-Zellen mit Dexamethason (10^–11 bis 10^–6 M) und entweder 10^–8 oder 10^–6 M AGN 193109 unterdrückte jedoch die RPE-Zellproliferation in einem Ausmaß, der ungefähr der Inhibition gleich kam, ausgelöst durch Behandlung mit ATRA. Ähnlich zeigten die in 20 dargestellten Ergebnisse, das AGN 193109 die antiproliferative Aktivität des Thyroidhormons verstärkte. Ähnlich zu denen unter Verwendung von Dexamethason erhaltenen Ergebnissen war die Proliferation von RPE-Zellen zu einer Einzel-Mittel-Behandlung mit Thyroidhormon (10^–11 bis 10^–6 M) refraktorisch. Die Co-Behandlung von RPE-Zellen mit Thyroidhormon (10^–11 bis 10^–6 M) und AGN 193109 (entweder 10^–8 oder 10^–6 M) inhibierte jedoch die RPE-Zellproliferation in einer Thyroidhormon-abhängigen Weise. Wir zogen daraus die Schlussfolgerung, dass AGN 193109 primäre RPE-Kulturen empfindlich gegenüber anti-proliferativen Wirkungen dieser nuklearen Rezeptoragonisten machte. Der Mechanismus, durch den AGN 193109 diese Effekte vermittelte, involvierte vermutlich eine Modulation von NCP/RAR-Wechselwirkungen.
Wir untersuchten zusätzlich die Wirkung von AGN 193109 auf die Expression von Markergenen in anderen experimentellen Systemen, die gegenüber Retinoidagonisten empfindlich waren. Sowohl von. den MRP8 als auch den Stromelysingenen ist bekannt, dass sie durch Retinoidagonisten in einer Vielzahl biologischer Systeme inhibiert werden. Zum Beispiel haben Wilkinson et al. in J. Cell Sci. 91: 221 (1988) und Madsen et al. in J. Invest. Dermatol. 99: 299 (1992) offenbart, dass die MRP8-Genexpression bei der Psoriasis erhöht war. Demgegenüber wurde MRP8-Genexpression durch den Retinoidagonisten AGN 190168 bei menschlicher Psoriasishaut unterdrückt (Nagpal et al., eingereicht 1995), ebenso bei menschlichen Keratinozyt-Raftkulturen (Chandraratna et al., J. Invest. Dermatol. 102: 625 (1994)) und bei kultiviertem menschlichen Neugeborenen-Keratinozyten der Vorhaut (Thacher et al., J. Invest. Dermatol. 104: 594 (1995)). Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) haben offenbart, dass Stromelysin mRNA-Niveaus durch Retinoidagonisten wie z. B. AGN 190168 bei kultivierten menschlichen Neugeborenen-Keratinozyten der Vorhaut unterdrückt waren. Wir analysierten die regulierte Expression dieser Gene, folgend auf die Behandlung kultivierter menschlicher Neugeborenen-Keratinozyten der Vorhaut entweder mit AGN 191183 Retinoidagonisten oder AGN 193109.
Beispiel 20 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die MRP-8-Expression in kultivierten Keratinozyten unterdrückte.
Beispiel 20
AGN 193109 inhibiert MRP-8-Expression in Keratinozyten
Primäre Vorhaut-Keratinozyten wurden gemäß dem von Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) beschriebenen Verfahren isoliert und in einem Keratinozytenwachstumsmedium (KGM) kultiviert, das von Clonetics gekauft wurde. Nach 3 Behandlungstagen mit AGN 191183 (10^–7 M) oder AGN 193109 (10^–6 M) wurde eine gesamtzelluläre RNA aus behandelten und Kontrollkeratinozyten gemäß Standardverfahren isoliert. Die mRNA wurde mit reverser Transcriptase in cDNA umgewandelt, die dann als Matrize in einem PCR-Amplifizierungsprotokoll diente unter Verwendung von Primern, die entweder für das Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH)-Haushaltsgen oder MRP-8 waren. Die GAPDH-Primer hatten die Sequenzen 5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3' (SEQ ID NO: 6) und 5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3' (SEQ ID NO: 7). Die MRP-8-Primer hatten die Sequenzen 5'-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3' (SEQ ID NO: 8) und 5'-ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3' (SEQ ID NO: 9). Ein Aliquot von der MRP-8-Amplifizierungsreaktion (10 μl) wurde nach jedem Zyklus der PCR-Amplifizierung, startend von 12 Zyklen und endend bei 21 Zyklen, entfernt. Ähnlich wurde ein Aliquot der GAPDH-Amplifizierungsreaktion nach jedem PCR-Zyklus entfernt, startend bei 15 Zyklen und endend bei 24 Zyklen. Die Proben wurden auf 2%igen Agarosegelen elektrophoretisch behandelt und die abgetrennten Amplifikationsprodukte durch Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen. Die Färbungsintensität der Amplifikationsprodukte diente als quantitatives Maß der Menge an Ausgangs-mRNA, die für ein gegebenes Primerset spezifisch war.
Die Ergebnisse dieses Verfahrens zeigten, dass sowohl AGN 191183 als auch AGN 193109 die MRP-8-Expression in Keratinozyten unabhängig inhibierten. Die Intensität des gefärbten GAPDH-Amplifizierungsprodukts war im wesentlichen äquivalent in den Spuren des Gels, die das Startmaterial darstellten, isoliert aus der Kontrolle, AGN 191183 und AGN 193109 behandelten Keratinozyten. Schwache Banden, die das GAPDH-Amplifizierungsprodukt repräsentierten, waren zunächst in den Spuren nachweisbar, die zu den Proben korrespondierten, die nach 18 Zyklen einer PCR-Amplifizierung entfernt wurden. Die äquivalenten Färbungsintensitäten unter den verschiedenen Spuren des Gels zeigten, dass äquivalente Mengen an Ausgangsmaterial für alle Proben verwendet wurden. Dementsprechend waren Unterschiede in den Intensitäten der gefärbten Banden, die die MRP-8-Amplifizierungsprodukte repräsentierten, indikativ für Unterschiede in der MRP-8-mRNA-Expression zwischen den verschiedenen Ausgangsproben. Wie erwartet, wurde das MRP-8 vervielfachte Signal bei den AGN 191183 (10^–7 M) behandelten Kulturen relativ zu einer unbehandelten Kultur inhibiert. Die AGN 193109 (10^–6 M)-Behandlung kultivierter Keratinozyten unterdrückte auch die MRP8-Expression, wie durch die niedrigere Intensität des gefärbten Amplifikationsprodukts nachgewiesen.
Wie in dem folgenden Beispiel illustriert, inhibierte AGN 193109 auch die Expression eines zweiten Markergens in Keratinozyten. Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995) offenbarten, dass Stromelysin mRNA-Expression durch RAR-spezifische Agonisten bei kultivierten Neugeborenen menschlichen Keratinozyten der Vorhaut herabreguliert wurden. Nicholson et al. (EMBO J. 9: 4443 (1990) offenbarten, dass ein AP-1-Promotorelement eine Rolle bei der Retinoid-abhängigen negativen Regulation des Stromelysin-1-Gens spielte. So war es von Interesse zu bestimmen, ob AGN 193109 die Expression dieses Gens verändern könnte.
Beispiel 21 beschreibt die Verfahren, die verwendet wurden, um zu demonstrieren, dass AGN 193109 die Stromelysin-1-Genexpression in Abwesenheit eines exogen zugefügten Rentinoidagonisten inhibierte.
Beispiel 21
AGN 193109 inhibiert die Stromelysin-1-Expression in kultivierten Keratinozyten
Primäre Keratinozyten der Vorhaut wurden entweder blindbehandelt oder für 24 h mit dem rAR-Agonisten AGN 191183 (10^–7 M), oder AGN 193109 (10^–6 M) behandelt. Die Gesamt-RNA, hergestellt aus blindbehandelten und Retinoid-behandelten Keratinozyten wurde mit reverser Transkriptase behandelt und die resultierende cDNA wurde durch PCR vervielfacht unter Verwendung von β-Actin oder Stromelysin-1-Oligo-Primern, exakt wie beschrieben von Nagpal et al. in J. Biol. Chem. 270: 923 (1995), dessen Offenbarung hier durch Inbezugnahme inkorporiert ist. Eine Probe (10 μl) von der PCR-Amplifizierungsreaktion wurde nach allen drei Zyklen, beginnend nach 18 Zyklen der PCR-Amplifikation, entfernt. Die Probe wurde auf einem 2%igen Agarosegel elektrophoretisch behandelt und nach Ethidiumbromidfärbung nachgewiesen.
Ergebnisse dieser Verfahren zeigten, dass AGN 193109 die Stromelysin-1-Genexpression in Abwesenheit eines exogen zugefügten Retinoidagonisten inhibierte. Insbesondere waren Ethidium-gefärbte Banden, die β-Actinamplifikationsprodukte repräsentierten, einfach in den Agarosegelen nach 18 Zyklen PCR nachweisbar. Während alle Bandenintensitäten mit zusätzlichen Zyklen der Amplifikationsreaktion zunahmen, waren gefärbte Banden weniger intensiv bei Proben, die AGN 191183 behandelte Zellen repräsentierten. Dies zeigte, dass eine etwas geringere Menge RNA in den Ausgangsproben vorliegen muss, korrespondierend zu den Zellen, behandelt mit AGN 191183. Die Ergebnisse zeigten auch, dass Stromelysin-1 mRNA in blind-behandelten Keratinozyten nachweisbar war, beginnend 33 Zyklen nach Beginn der PCR-Amplifikation. Wie erwartet, wurde die Stromelysin-1 mRNA-Expression nach AGN 191183 (10^–7 M)-Behandlung inhibiert, wie bewertet durch eine schwachere Bandenintensität im Vergleich zu Proben, abgeleitet von blind-behandelten Proben. Wenn auf die Intensität der β-Actinamplifikationsprodukte normalisiert wurde und konsistent mit den Ergebnissen, erhalten bei den Messungen der MRP-8-Expression, führte die AGN 193109 (10^–6 M)-Behandlung von Keratinozyten zu einer Herabregulierung der Stromelysin-1-mRNA-Niveaus. Tatsächlich war die Herabregulierung, stimuliert durch AGN 193109-Behandlung, von der Herabregulierung nicht unterscheidbar, die durch Behandlung von Keratinozyten mit dem RAR-Agonisten AGN 191183 ausgelöst wurde.
Wie hier offenbart, kann AGN 193109 alle drei möglichen Effekte im Hinblick auf eine Modulation der Aktivität von coverabreichtem Steroidsuperfamilienagonisten annehmen. Zunächst kann AGN 193109 keine Wirkung haben. Zweitens kann AGN 193109 die Wirkung des Agonisten antagonisieren und dadurch zu einer Abnahme der Aktivität des Agonisten führen. Schließlich kann AGN 193109 die Aktivität des Agonisten verstärken und dadurch zu einer Stimulierung der gemessenen Wirkung, erzeugt durch den Agonisten, führen.
Verbindungen mit Aktivitäten, die durch AGN 193109 moduliert werden können, beinhalten Retinoidrezeptoragonisten und Agonisten, die an andere Mitglieder der Steroidrezeptorsuperfamilie binden. Diese letztere Kategorie von Agonisten beinhaltet Vitamin D-Rezeptoragonisten, Glucokortikoidrezeptoragonisten und Thyroidhormonrezeptoragonisten. Vom Peroxisomen-Proliferator-aktivierte Rezeptoren, Östrogenrezeptoren und "Orphan"-Rezeptoren haben zur Zeit unbekannte Liganden und können ebenfalls durch AGN 193109 verstärkt werden. In dem Fall, in dem der Steroidsuperfamilienagonist ein RAR-Agonist ist, kann AGN 193109 entweder antagonistisch wirken oder die Aktivität der Agonisten verstärken. In dem Fall, in dem der verwendete Agonist in Kombination mit AGN 193109 eine Verbindung ist, die an einen anderen nuklearen Rezeptor bindet als RAR, wird die Co-Verabreichung von AGN 193109 entweder keine Wirkung haben oder das System gegen den Agonisten sensibilisieren, so dass die Aktivität des Agonisten verstärkt wird.
Ein verallgemeinertes beispielhaftes Verfahren zur Bestimmung, welche der drei möglichen Aktivitäten AGN 193109 in einem bestimmten System annehmen wird, folgt. Diese Beschreibung illustriert jedes der möglichen Ergebnisse für AGN 193109 Co-Verabreichung mit einem Steroidrezeptorsuperfamilienagonisten. Biologische Systeme, die für die Bewertung der Fähigkeit von AGN 193109 zur Modulation der Aktivität eines nuklearen Rezeptoragonisten geeignet sind, beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf: etablierte Gewebskulturzelllinien, viral transformierte Zelllinien, ex vivo primäre Kulturzellen und in vivo-Studien unter Verwendung lebender Organismen. Die Messung der biologischen Wirkung von AGN 193109 in solchen Systemen könnte eine Bestimmung von jeder von einer Vielzahl biologischer Endpunkte beinhalten. Diese Endpunkte beinhalten: Analyse einer zellulären Proliferation, Analyse des programmierten Zelltods (Apoptose), Analyse des Differenzierungszustands von Zellen über Genexpressionsassays, Analyse der Fähigkeit von Zellen zur Bildung von Tumoren in Nacktmäusen und Analyse der Genexpression nach transienter oder stabiler Einführung von Reportergenkonstrukten.
Für illustrative Zwecke wird eine mRNA-Art, bezeichnet als mRNA "X" von dem Gen "X" in primären Kultur-"Y"-Zellen exprimiert, isoliert aus dem Organ "Z". Unter Standardkulturbedingungen, wo verschiedene "Y"-zellgenetische Marker enthalten sind, einschließlich einer Expression des Gens "X", führt die Zugabe eines Retinoidagonisten zu einer Abnahme des Überflusses von "X" mRNA. Die Analyse der Gen-X-Expression kann über eine Isolierung der zellulären X mRNA-Messungen des Überflusses an X mRNA-Niveaus über die Polymerasekettenreaktion, Ribonucleaseschutz oder RNR- Blottingverfahren, wie z. B. Northern Analysen, bewertet werden. Nach Isolierung aus dem Organ Z, werden primäre Y-Zellen in einem geeigneten Wachstumsmedium kultiviert. Die Primärkulturen werden dann in Gewebskulturplatten für eine Expansion der Zellpopulation plattiert. Dieser Schritt erleichtert die Abtrennung der Zellen in vier Probengruppen, so dass verschiedene Dosierungen des Retinoidagonisten und AGN 193109 zugeführt werden können. Die erste Gruppe wird eine Kontrolle sein, die nur Vehikel enthält. Die zweite Gruppe wird den RAR-Agonisten, Retinolsäure, zugeführt in Ethanol in ausreichenden Mengen, um Endkonzentrationen im Bereich von 10^–11 bis 10^–6 M herzustellen, erhalten. Die niedrigste Dosierung kann empirisch bestimmt werden müssen, abhängig von der Empfindlichkeit des Systems. Solche Bestimmungen fallen in dem Umfang von Routineexperimenten für den Fachmann. Die dritte Gruppe wird sowohl den nuklearen Rezeptoragonisten mit denselben Dosierungen erhalten, die für die Behandlung der Zellen der Gruppe 2 verwendet wurden als auch eine konstante Dosis AGN 193109. Die verwendete Dosis von AGN 193109 für die Behandlung der Zellen der Gruppe 3 muss auch empirisch bestimmt werden, sollte jedoch ungefähr der Affinitätskonstante (Kd) von AGN 193109 für die RAR-Subtypen (d. h. mindestens 10^–8 M) entsprechen. Die vierte Gruppe wird AGN 193109 in Dosierungen enthalten, die mindestens die beinhalten, die für die Agonist-Co-Verabreichung in Gruppe 3 verwendet wurden. Gemäß einer Alternative zu dieser Dosierungsbehandlungsvorschrift wurde AGN 193109 für den in dem vorstehenden Beispiel beschriebenen Retinoidagonisten, wie in Gruppe 2 spezifiziert substituiert, und eine konstante Dosis des Retinoidagonisten, anstelle von AGN 193109 wie in den Gruppen 3 und 4 spezifiziert. Nach einer geeigneten Inkubationszeitspanne sollten die Zellen in einer geeigneten Weise für die Bestimmung des biologischen Endpunkts geerntet werden, der als Indikator der Agonistaktivität gemessen wird.
Zum Beispiel würde der Analyse der Wirkung von AGN 193109 auf Retinolsäure-abhängige Regulation der Genexpression einen Vergleich des Überflusses der mRNA Art X in dem mRNA-Pool involvieren, geerntet von Zellen, behandelt gemäß jedem der vier oben beschriebenen Protokolle. RNA, abgeleitet von Kontrollzellen, wird dazu dienen, die Grundlinienexpression von X mRNA zu bestimmen und wird den Zustand repräsentieren, korrespondierend zu keiner Unterdrückung. Ein Vergleich dieses Niveaus mit demjenigen, das für den mRNA-Pool gemessen wird, abgeleitet von Zellen, behandelt mit Retinolsäure, wird eine Bestimmung der Wirkung dieses Agonisten auf die Genexpression ermöglichen. Quantifizierte Niveaus der Unterdrückung spezifischer mRNAs, die sich aus der Retinolsäurebehandlung ergeben, können dann mit dem mRNA-Überfluss in Zellen, behandelt parallel mit entweder AGN 193109 allein oder AGN 193109 in Kombination mit Retinolsäure, verglichen werden. Während dieses verallgemeinerte Beispiel eine Analyse der Wirkung von coverabreichtem AGN 193109 auf die Expression eines Gens illustriert, unterdrückt durch einen Retinoidagonisten, könnte das Beispiel alternativ die Analyse der Wirkung von co-verabreichtem AGN 193109 auf ein Gen beschreiben, das durch einen Retinoidagonisten induziert wurde. Kritische Merkmale für die Bestimmung, ob AGN 193109 sich als Agonist verhalten wird, als negatives Hormon oder keine Wirkung in einem bestimmten System zeigen wird, werden einen quantitativen Vergleich der Größenordnung der Wirkung in Gegenwart und Abwesenheit von AGN 193109 involvieren.
Ein Beispiel, bei dem AGN 193109 die Aktivität eines co-verabreichten Agonisten verstärkte, würde ein Fall sein, worin die AGN 193109-Co-Behandlung mit Retinolsäure zu einem Niveau der X mRNA-Expression führen würde, das relativ zu dem Niveau, das bei Zellen gemessen wurde, behandelt mit Retinolsäure allein weiter unterdrückt wäre. Genauer gesagt, würde ein Vergleich mit der Dosis Reaktionskurve der biologischen Wirkung (d. h. Unterdrückung des X mRNA- Überflusses), aufgetragen auf der Y-Achse gegenüber der Dosis des Agonisten (logarithmische Skala) auf der X-Achse einen Vergleich der Agonist-vermittelten Unterdrückung des X mRNA-Überflusses in Gegenwart und Abwesenheit der AGN 193109 Co-Behandlung ermöglichen. Die Fähigkeit von AGN 193109, die biologische Reaktion auf den Agonisten zu sensibilisieren und dadurch die Aktivität des Agonisten zu verstärken, wird für eine nach links gerichtete Verschiebung in der Dosis-Reaktionskurve indikativ sein. Insbesondere würde in Gegenwart von AGN 193109 weniger Agonist notwendig sein, um dieselbe biologische Wirkung zu erhalten, die unter Verwendung des Agonisten allein erhältlich ist.
Ein Beispiel für einen AGN 193109 vermittelten Antagonismus eines co-verabreichten Agonisten würde ein Fall sein, worin die AGN 193109 Co-Behandlung mit Retinolsäure zu einem Niveau der X mRNA-Expression führen würde, das gegenüber demjenigen, gemessen an Zellen, behandelt mit Retinolsäure allein, weniger unterdrückt würde. Ein Vergleich der Dosis-Reaktionskurven von X mRNA-Unterdrückung gegenüber der log Dosis des Agonisten in Gegenwart und Abwesenheit von AGN 193109 wird eine Verlagerung nach rechts in der Dosis-Reaktionskurve demonstrieren. Insbesondere würde in Gegenwart von AGN 193109 mehr Agonist notwendig sein, um dieselbe biologische Wirkung zu erreichen, die durch Einzelmittelbehandlung mit dem Agonisten allein erhalten werden könnte.
Die obigen Beispiele, worin AGN 193109 entweder einen Antagonismus oder eine Verstärkung vermittelt, beschreiben experimentelle Ergebnisse für die Co-Verabreichung von AGN 193109 mit einem Retinoidagonisten. Wenn jedoch der Agonist, der mit AGN 193109 co-verabreicht wird, ein Agonist ist, der zur Bindung und Aktivierung eines Mitglieds der Steroidrezeptorsuperfamilie in der Lage ist, wobei es sich nicht um RAR handelt, dann wird es anstelle einer antagonistischen Wirkung auf den Agonisten möglich, dass AGN 193109 keine Wirkung auf die Aktivität des Agonisten ausübt. Wenn die AGN 193109 Co-Behandlung mit solch einem Agonisten zu einem Niveau der mRNA-Expression führt, das vergleichbar ist mit demjenigen, das bei Zellen gemessen wird, die mit dem Agonisten allein behandelt wurden, dann wird die Fähigkeit von AGN 193109 zur Bewirkung der Verfügbarkeit von NCPs über eine Unterstützung der RAR : NCP-Assoziationen in diesem System still sein. Dies würde ein Beispiel sein, worin AGN 193109 keine Wirkung auf einen co-verabreichten Agonisten ausübt.
Beispiel für einen Antagonismus
Das in dem oben verallgemeinerten Beispiel für die Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, co-verabreicht mit einem Retinoidagonisten, offenbarte Verfahren, wird beispielhaft dargestellt durch das unter Beispiel 7 beschriebene Verfahren. CV-1-Zellen, co-transfiziert mit einem der drei Retinolsäurerezeptoren und dem Retinoidagonist-induzierbaren MTV-TREp-Luc-Reporterkonstrukt wurden mit entweder Ethanol (Kontrolle, Gruppe 1), AGN 193109 bei Endkonzentration von 10^–9 bis 10^–6 M (Gruppe 2), AGN 193109 bei Endkonzentrationen von 10^–9 bis 10^–6 M, co-verabreicht mit Retinolsäure bei 10^–8 M (Gruppe 3) oder Retinolsäure (10^–8 M, Gruppe 4) co-transfiziert. Der Vergleich der Luciferaseaktivität von Gruppe 1 mit derjenigen von Gruppe 4 ermöglicht die Bestimmung des Niveaus der Retinoidagonist-induzierten Expression des Luciferasereportergens in Abwesenheit von zugefügtem AGN 193109. Der Vergleich der Luciferase-Reportergenexpression in Zellen der Gruppe 3 mit derjenigen, gemessen in Zellen der Gruppe 4, zeigte, dass sich AGN 193109 in diesem System als Antagonist des Retinoidagonisten verhielt.
Beispiel für einen Antagonismus
Das in dem verallgemeinerten Beispiel zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, co-verabreicht mit einem Retinoidagonisten, offenbarte Verfahren wurde ähnlich verwendet, um in Beispiel 17 zu bestimmen, dass AGN 193109 als Antagonist bei einer Retinoidagonist-vermittelten Wirkung der EGF-stimulierten zellulären Proliferation in ECE-16-1-transformierten zervikalen Epithelzellen wirkt. Bei diesem Verfahren beinhalteten Behandlungen von ECE-16-1-Zellen eine Kontrollprobe, behandelt mit EGF allein (Gruppe 1), eine Probe, behandelt mit einer Kombination aus EGF und AGN 193109 in einer Endkonzentration von 10^–6 M (Gruppe 2), eine Probe, behandelt mit der Kombination aus EGF und AGN 193109 in Endkonzentrationen von 10^–10 bis 10^–6 M, co-verabreicht mit einer Einzeldosis des Retinoidagonisten AGN 191183 mit 10^–8 M (Gruppe 3) und einer Probe, behandelt mit der Kombination aus EGF und AGN 191183 bei 10^–8 M (Gruppe 4). Nach 3 Tagen Behandlung wurden zelluläre Proliferationsraten bestimmt. Die Bestimmung, dass die Zellen zur Proliferation durch EGF stimuliert wurden, war möglich, da eine zusätzliche Kontrollbehandlung beinhaltet war, bei der Zellen gegenüber einem definierten Medium exponiert wurden, das kein EGF enthielt. Der Vergleich der Zahl der Zellen in Gruppe 1 mit der Zahl der Zellen in Gruppe 4 ermöglichte die Bestimmung, dass der RAR-Agonist AGN 191183 die EGF-stimulierte Proliferation von ECE-16-1-Zellen unterdrückte. Ein Vergleich der Gruppe 3 mit Gruppe 4 zeigte, dass AGN 193109 in diesem System antagonistisch auf die Aktivität des RAR-Agonisten wirkte.
Beispiel für eine Verstärkung
Das in dem verallgemeinerten Beispiel zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, co-verabreicht mit einem Retinoidagonisten, offenbarte Verfahren wurde ebenfalls in Beispiel 14 verwendet, um zu bestimmen, dass AGN 193109 die Aktivität eines nuklearen Rezeptoragonisten in HeLa-Zellen verstärkte, die mit dem 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ induzierbaren MTV-VDRE-Luc-Reportergen transfiziert waren. Behandlungen transfizierter Zellen beinhalteten Vehikel allein (Kontrolle, Gruppe 1), 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in Endkonzentrationen von 10^–10 bis 10^–7 M (Gruppe 2), 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in Endkonzentrationen von 10^–10 bis 10^–7 M, co-verabreicht mit AGN 193109 in Endkonzentrationen von entweder 10^–8 oder 10^–7 M (Gruppe 3) und AGN 193109 als Monotherapie in einer Endkonzentration von entweder 10^–8 oder 10^–7 M (Gruppe 4). Der Vergleich der bei Gruppe 1-(Kontroll-)Zellen gemessenen Luciferaseaktivität mit der von Gruppe 2-Zellen ermöglichte die Bestimmung, dass 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ die Luciferaseaktivität in dosisabhängiger Weise stimulierte. Ein Vergleich der Luciferaseaktivität, gemessen bei Zellen der Gruppe 4 (AGN 193109, Monotherapie) mit der in Zellen der Gruppe 3 gemessenen (AGN 193109 Co-Verabreichung), ermöglichte ähnlich die Bestimmung einer dosisabhängigen 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-stimulierten Luciferaseaktivität in Gegenwart einer gegebenen Konzentration von AGN 193109. In diesem Fall repräsentierte der Nullwert der Luciferaseaktivität in Zellen, behandelt mit AGN 193109 allein (Gruppe 4). Eine solche Dosierungsbehandlungsvorschrift ermöglichte den Vergleich von drei 1,25-Dihydroxyvitamin D₃-Dosis-Reaktionskurven. Der Vergleich der Dosis-Reaktionskurve von 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ in Abwesenheit von AGN 193109 mit der Kurve, die die Co-Verabreichung von AGN 193109 repräsentierte (entweder 10^–8 oder 10^–7 M) demonstrierte die Vestärkung der Agonistaktivität, wie bewiesen durch die Verlagerung der halb-maximalen Reaktion nach links.
Beispiel der Verstärkung
Das in dem verallgemeinerten Beispiel zur Bestimmung der Wirkung von AGN 193109, co-verabreicht mit einem Retinoidagonisten, offenbarte Verfahren wurde weiterhin verwendet, um in Beispiel 19 zu bestimmen, dass AGN 193109 die antiproliferative Aktivität eines RAR-Agonisten in Primärkulturen von menschlichen Retinalpigmentepithelzellen verstärkte. Die Behandlung der Zellen beinhalete: Ethanolvehikel allein (Gruppe 1), Retinolsäure in Endkonzentrationen von 10^–10 bis 10^–6 M (Gruppe 2), Retinolsäure in Endkonzentrationen von 10^–10 bis 10^–6 M, co-verabreicht mit 10^–6 M AGN 193109 (Gruppe 3) und AGN 193109 allein in Endkonzentrationen von 10^–10 bis 10^–6 M (Gruppe 4). Der Vergleich der Assayergebnisse, erhalten unter Verwendung von Zellen der Gruppen 1 und 2, ermöglichte die Bestimmung der dosisabhängigen Inhibition der Proliferation dieser Zellen durch Retinolsäure. Ähnlich ermöglichte der Vergleich der Ergebnisse, erhalten unter Verwendung von Zellen der Gruppe 3 mit denjenigen der Gruppe 1 die Bestimmung der dosisabhängigen Inhibition der Proliferation dieser Zellen durch Retinolsäure in Gegenwart von co-verabreichtem AGN 193109. Gruppe 4 demonstriert die Unfähigkeit von AGN 193109, die Proliferationsrate dieser Zellen wesentlich zu verändern, wenn es als Monotherapie verwendet wurde. Der Vergleich der Dosis-Reaktionskurven von der Retinolsäure-vermittelten Unterdrückung der zellulären Proliferation, erzeugt in den Gruppen 2 und 3, stellte die Basis für die Schlussfolgerung bereit, dass AGN 193109 primäre RPE-Zellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen des RAR-Agonisten sensibilisierte und dadurch die Aktivität des RAR-Agonisten verstärkte.
Wie oben angegeben, zeigten Agarwal et al. in Cancer Res. 54: 2108 (1994), dass das CaSki-Zellwachstum anders als Wachstum der HPV-immortalisierten ECE-16-1-Zellen durch die Behandlung mit Retinoidagonisten nicht inhibiert war. Wie hier offenbart, stellten wir unerwarteterweise fest, dass das CaSki-Zellwachstum durch AGN 193109 in Abwesenheit eines Retinoidagonisten inhibiert wurde. Das folgende Beispiel illustriert, wie AGN 193109 verwendet werden kann, um das Wachstum von CaSki-Zelltumoren in vivo zu inhibieren.
Beispiel 22
Inhibition des CaSki-Zelltumorwachstums bei nackten Mäusen
Folgend auf eine Verabreichung von AGN 193109
1 × 10⁶ CaSki-Zellen werden in jede von einem Panel von nackten Mäusen injiziert. Die Tumorbildung wurde unter Verwendung von Techniken bewertet, die dem Fachmann bekannt sein werden. Nach der Injektion wurden die Mäuse willkürlich in Kontroll- und Testgruppen unterteilt. Die Kontrollgruppe erhält ein Placebo. Die Testgruppe wird mit AGN 193109 behandelt. Tieren, die das Placebo erhielten, erhalten eine intragastrische Intubation Maisöl. Die Testtiere erhalten 20 μMol/kg AGN 193109 in Maisöl täglich für die Zeitspanne der Behandlung. Das Tumorvolumen wird in Kubikmilliliter unter Verwendung von graduierten Maßstäben gemessen. Das Tumorvolumen wird als Funktion der Zeit aufgetragen. Mäuse, die AGN 193109 erhalten, zeigen Tumore, die in ihrer Wachstumsrate im Vergleich mit Tumoren deutlich reduziert sind, die bei den Kontrollmäusen beobachtet werden, wie bewertet durch Tumorgröße und Zahl über die Zeitspanne der Studie. Dieses Ergebnis stellt eine in vivo-Demonstration bereit, dass AGN 193109 das Wachstum von fortgeschrittenen Zervikalkarzinomen inhibiert, die gegenüber einer Therapie resistent sind, umfassend die Verabreichung eines Retinoidagonisten.
Wie oben angegeben, sind CaSki-Zellen ein Modell von Zervikaltumoren, die gegenüber der Retinoidagonisttherapie nicht reaktiv sind. Wir haben hier jedoch offenbart, dass das CaSki-Zellwachstum durch AGN 193109 in Abwesenheit einer Behandlung mit einem Retinoidagonisten inhibiert wurde. Die Fähigkeit von AGN 193109 zur Inhibition der Proliferation von CaSki-Zellen legt nahe, dass AGN 193109 verwendet werden könnte, um Zervikalkarzinome therapeutisch zu behandeln, die gegenüber einer Retinoidagonisttherapie unempfindlich sind.
Das folgende Beispiel illustriert ein Verfahren, das verwendet werden kann, um das therapeutische Potential von AGN 193109 bei der Behandlung eines Zervikalkarzinoms zu bewerten.
Beispiel 23
Bewertung des therapeutischen Potentials von AGN 193109 bei Patienten mit Zervikalkarzinom
Ein Patient, der sich mit einem fortgeschrittenen Zervikalkarzinom präsentierte, wird zunächst identifiziert. Eine Zervikalbiopsie wird gemäß den dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten. Zellen von dem explantierten Tumor werden in Gewebskulturen gemäß Standardverfahren propagiert, um Zellzahlen bereitzustellen, die ausreichen, um eine Unterteilung in drei Probengruppen zu ermöglichen. Die Kulturbedingungen, wie beschrieben von Agarwal et al. in Cancer Res. 54: 2108 (1994) werden für diesen Zweck verwendet. Die erste Gruppe wird als Kontrolle reserviert und erhält nur Vehikel (Ethanol). Die zweite Gruppe wird mit dem RAR-Agonisten Retinolsäure in einer Konzentration von 10^–10 bis 10^–6 M behandelt. Die dritte Gruppe wird mit AGN 193109 in einer Dosis im Bereich von 10^–10 bis 10^–6 M behandelt. Zellen werden mit frischem Wachstumsmedium täglich gefüttert und werden mit den oben beschriebenen Retinoiden versehen wie für jede Probengruppe geeignet. Die Zellen werden nach 3 Tagen unter Verwendung eines elektrischen Zellzählers gezählt. Ein Vergleich der Zahl der Zellen in den Kontrollkulturen mit der Zahl der Zellen in Retinolsäure-behandelten Kulturen zeigt, dass der RAR-Agonist die Wachstumsrate der kultivierten Zervikalkarzinomzellen nicht substantiell inhibiert. Demgegenüber zeigen Zellen, behandelt mit AGN 193109 eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl im Vergleich mit den Zellzahlen der Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis, worin die AGN 193109-Behandlung die Zervikalkarzinom-Zellproliferation in Kultur inhibiert, zeigt, dass AGN 193109 ein nützliches Therapeutikum für die Behandlung von Zervikalkarzinompatienten mit metastatischen Erkrankungen sein wird.
Zervikalkarzinompatienten, die eine Chirurgie zur Entfernung von Primärtumoren durchgemacht haben und die sich mit metastatischen Erkrankungen präsentieren, werden in einer statistischen klinischen Studie eingebracht, die den therapeutischen Nutzen von AGN 193109 bei dieser Indikation demonstrieren soll. Die Patienten werden in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe ist eine Kontrollgruppe, während Mitglieder der zweiten Gruppe mit AGN 193109 behandelt werden. AGN 193109 wird mit einem pharmazeutisch akzeptablen Excipiens kombiniert, um eine Zusammensetzung zu erzeugen, die für die systemische Verabreichung geeignet ist, alles gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Der Kontrollgruppe wird eine Placeboformulierung verabreicht und die experimentelle Gruppe wird mit der Formulierung, enthaltend das AGN 193109 negative Hormon, behandelt. Die Dosierung von Patienten liegt bei der maximalen tolerierten Dosis und wird jeden zweiten Tag über eine Zeitspanne von 3 Monaten bis 1 Jahr durchgeführt. Der Ausgang dieser Studie wird über Messungen eines krankheitsfreien Überlebens über die Zeit quantifiziert. Individuen, die AGN 193109 erhalten, zeigen einen signifikanten Anstieg an einem erkrankungsfreien Überleben, einschließlich einer unproportional hohen Anzahl von Patienten, die eine vollständige Remission ihrer metastatischen Erkrankung zeigen. Dieses Ergebnis zeigt, dass AGN 193109 eine therapeutische Verwendbarkeit für die in vivo-Behandlung von Zervikalkarzinomen hat, die gegenüber den antiproliferativen Wirkungen von Retinoidagonisten, wie z. B. Retinolsäure, nicht reaktiv sind.
Wie oben offenbart, verstärkte AGN 193109 die antiproliferative Aktivität von RAR-Agonisten in Primärkulturen von menschlichen Retinalpigmentepithelzellen. Dementsprechend kann man in vernünftiger Weise annehmen, dass die Co-Verabreichung von AGN 193109 mit einem RAR-Agonisten in vivo den therapeutischen Index des Agonisten erhöht, da eine geringere Menge des RAR-Agonisten notwendig sein wird, um denselben therapeutischen Endpunkt zu erhalten. Zusätzlich wurde von AGN 193109 gezeigt, dass es Primärkulturen menschlicher Retinalpigmentepithelzellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen von Glucokortikoid- und Thyroidhormon-Rezeptoragonisten sensibilisiert. Das folgende Kaninchenmodell von PVR wird in zwei getrennten Studien verwendet, um den erhöhten therapeutischen Index zu demonstrieren, der durch Co-Verabreichung von AGN 193109 mit einem RAR-Agonisten (13-cis-Retinsolsäure) bzw. einem Thyroidhormonrezeptoragonisten erhalten wird. Es wurde das Kaninchenmodell der Retina-Wiederablösung, veröffentlicht von Sen et al. in Arch. Opthalmol. 106: 1291 (1988) verwendet, um zu demonstrieren, dass Retinoidagonisten, die die Proliferation von primären RPS-Zellen in vitro inhibieren, ebenfalls die Frequenz der Retinaablösung in vivo inhibieren (Araiz et al., Invest. Opthalmol. 34: 522 (1993)). So besteht im Hinblick auf die Verwendung als Therapeutika für die Verhinderung der Retinaablösung eine Korrelation zwischen den in vitro- und den in vivo-Aktivitäten von Retinoidagonisten, die bereits etabliert wurde. Die folgenden Beispiele illustrieren, wie AGN 193109 bei therapeutischen Anwendungen verwendet werden kann, die auf die Verhinderung einer Retinaablösung gerichtet sind.
Beispiel 24
Verwendung von AGN 193109 zur Erhöhung des therapeutischen Potentials von Agonisten der Steroidsuperfamilierezeptoren bei der Behandlung der proliferativen Vitreoretinopathie (PVR)
In einer ersten Studie wurden menschliche RPE-Zellen in die Glaskörperhöhlung von Kaninchenaugen gemäß dem von Sen et al. in Arch. Opthalmol. 106: 1291 (1988) beschriebenen Verfahren injiziert. Nach einer Injektion in den Glaskörper wurden die Kaninchen in 5 Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) wird nur Vehikel durch Injektion in den Glaskörper erhalten. Die zweite Gruppe erhält Retinolsäure als Monotherapie (100 μg) durch Injektion in den Glaskörper. Die dritte Gruppe erhält AGN 193109 als Monotherapie (100 μg) durch Injektion in den Glaskörper. Die vierte Gruppe erhält durch Injektion in den Glaskörper den RAR-Agonisten (Retinolsäure) in einer Dosis, die 1/10 der Menge beträgt, die der Gruppe 2 verabreicht wurde (10 μg). Die fünfte Gruppe erhält die Kombination auf AGN 193109 (100 μg) und Retinolsäure (10 μg) durch Injektion in den Glaskörper. Die Tiere erhalten eine einzelne Injektion in den Glaskörper der geeigneten Behandlung 1 Tag nach der Injektion in den Glaskörper von menschlichen RPE-Zellen. Die Kaninchen werden durch indirekte Ophthalmoskopie an den Tagen 7, 14 und 28 untersucht und werden im Hinblick auf die Frequenz und Schwere einer traktionalen Retinaablösung eingeteilt. Die Kaninchen aus der Gruppe, der 100 μg Retinolsäure injiziert wurde, zeigen eine signifikant reduzierte Frequenz und Schwere eine Retinaablösung im Vergleich mit Kontrollkaninchen oder Kaninchen, die entweder AGN 193109 oder Retinolsäure (10 μg) allein erhielten. Kaninchen in der Gruppe, der die Kombination aus AGN 193109 und Retinolsäure (10 μg) verabreicht wurde, zeigen eine signifikant reduzierte Frequenz und Schwere der Retinaablösung, verglichen mit denjenigen in den Gruppen der Kontrolle, AGN 193109 oder Retinolsäure (10 μg). Dieses Ergebnis zeigt, dass AGN 193109 den therapeutischen Index des RAR-Agonisten Retinolsäure bei einem in vivo-Modell von PVR verbessert.
In einer zweiten Studie werden Kaninchen zunächst mit einer Injektion von menschlichen RPE-Zellen in die Glaskörperhöhlung des Auges versehen und dann in vier Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe (Kontrolle) erhält Vehikel allein durch Injektionen in den Glaskörper. Die zweite Gruppe erhält Thyroidhormon als Monotherapie (100 μg) durch Injektion in den Glaskörper. Der dritten Gruppe wird AGN 193109 als Monotherapie (100 μg) durch Injektion in den Glaskörper verabreicht. Der vierten Gruppe wird eine Kombination aus AGN 193109 (100 μg) und Thyroidhormon (100 μg) verabreicht. Die Kaninchen werden durch indirekte Ophthalmoskopie an den Tagen 7, 14 und 28 untersucht und im Hinblick auf Frequenz und Schwere der traktionalen Retinaablösung eingeteilt. Ein Vergleich der Frequenz und Schwere der Retinaablösung in den vier Gruppen demonstriert, dass eine Monotherapie mit entweder AGN 193109 oder Thyroidhormon die Retinaablösung im Vergleich mit den Kontrollkaninchen nicht inhibierte. Dem gegenüber zeigte die Kaninchengruppe, der die Kombination aus AGN 193109 und Thyroidhormon verabreicht wurde, eine signifikant reduzierte Inzidenz und Schwere der Retinaablösung. Dieses Ergebnis demonstriert, dass AGN 193109 den therapeutischen Index von Thyroidhormon bei einem in vivo-Modell von PVR verbessert.
Das folgende Beispiel illustriert, wie AGN 193109 verwendet werden kann, um den therapeutischen Index eines RAR-Agonisten zu verbessern, der verwendet wird, um Menschen, folgend auf eine Retinalwiederanhaftungschirurgie zu behandeln.
Beispiel 25
Erhöhung des therapeutischen Index des RAR-Agonisten 13-cis Retinolsäure
Eine Population an erwachsenen Freiwilligen mit einer Retinaablösung, die sich auf einer PVR ergab, wurde zunächst identifiziert. Individuen durchlaufen eine chirurgische Behandlung der Ablösungen unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Techniken. Die Patienten werden dann in 5 Gruppen unterteilt. Die Kontrollgruppe besteht aus Patienten, die eine chirurgische Behandlung der Retinaablösung durchlaufen und keine Retinoidverbindung erhalten. Die zweite Gruppe erhält 40 mg oral 13-cis-Retinolsäure, zweimal täglich über 4 Wochen postoperativ. Die dritte Gruppe erhält 40 mg oral AGN 193109, zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ. Die vierte Gruppe erhält 4 mg oral 13-cis-Retinolsäure, zweimal täglich über 4 Wochen postoperativ. Die fünfte Gruppe erhält 40 mg oral AGN 193109 in Kombination mit 4 mg oral 13-cis-Retinolsäure, zweimal täglich für 4 Wochen postoperativ. Das Behandlungsprotokoll und die Bewertung der Arzneimitteleffizienz wird im wesentlichen wie von Fekrat et al. in Ophthalmology 102: 412 (1995) beschrieben durchgeführt.
Die Frequenz und Schwere der Retina-Wiederablösung bei postoperativen Patienten bei allen fünf Gruppen wird über einen Zeitraum von 9 Monaten unter Verwendung von ophthalmologischen Überwachungstechniken überwacht, die dem Fachmann bekannt sind. Patienten, die 40 mg orale 13-cis-Retinolsäure erhielten, zeigen eine signifikant reduzierte Inzidenz der Retina-Wiederablösung, im Vergleich mit Kontrollpatienten, Patienten, die 4 mg oral 13-cis Retinolsäure zweimal täglich erhielten oder mit Patienten, die 40 mg oral AGN 193109 zweimal täglich erhielt. Die Überprüfung der Patientengruppe, die die Kombination aus 40 mg oral AGN 193109 und 4 mg oral 13-cis-Retinolsäure, zweimal täglich über 4 Wochen postoperativ erhielt, demonstriert den therapeutischen Ausgang bei dieser Patientengruppe als gleich oder besser als bei den Patienten, die 40 mg oral 13-cis-Retinolsäure, zweimal täglich über 4 Wochen postoperativ erhielten. Dieses Ergebnis demonstriert, dass das AGN 193109 negative Hormon den therapeutischen Index eines RAR-Agonisten durch Verminderung der Frequenz und Schwere der Retina-Wiederablösung bei PVR-Patienten verbessert.
Verallgemeinerter Assay zur Identifizierung von nuklearen Rezeptor-negativen Hormonen
Wir haben oben demonstriert, dass AGN 193109 als negatives Hormon wirken kann, das die basale transkriptionelle Aktivität von RAR-nuklearen Rezeptoren unterdrücken kann. Wir haben weiterhin einen Assay beschrieben, der CV-1-Zellen, co-transfiziert mit dem ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmid und den ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Rezeptorexpressionsplasmiden für die Unterscheidung von RAR-Liganden verwendet, die einfache Antagonisten sind und von denjenigen, die eine negative Hormonaktivität aufweisen.
Wir haben die Schlussfolgerung gezogen, dass RAR-negative Hormone eine Unterdrückung der RAR-vermittelten transkriptionellen Aktivität durch Unterstützung der erhöhten Wechselwirkung zwischen RAR und NCPs vermitteln. Weiterhin haben wir demonstriert, dass AGN 193109 die Wirkungen von Agonisten anderer nuklearer Rezeptoren in einer Weise verstärken kann, die mit der gemeinsamen Teilung der NCPs zwischen Mitgliedern der Steroidsuperfamilie von nuklearen Rezeptoren übereinstimmt. Als solche können Liganden entworfen und überwacht werden, um Verbindungen zu identifizieren, die eine negative Hormonaktivität an diesen Non-RAR-nuklearen Rezeptoren aufweisen.
Unser Verfahren eines RAR-negativen Hormonscreenings, basierend auf der Verwendung von CV-1-Zellen, co-transfiziert mit dem ERE-tk-Luc-Luciferase-Reporterplasmid und den ER-RXR-α- und RAR-γ-VP-16-Rezeptorexpressionsplasmiden kann allgemein so angepasst werden, dass der RAR-γ-Bestandteil des RAR-γ-VP-16-Plasmids zu dem der Peroxisomproliferatoraktivierten Rezeptoren (PPAR), Vitamin D-Rezeptor (VDR), Thyroidhormonrezeptor (T3R) oder jedem anderen nuklearen Rezeptor der Steroidsuperfamilie, der mit RXR Heterodimere bilden kann, umgewandelt wird. CV-1-Zellen, co-transfiziert mit solchen Plasmiden, würden hohe Grundniveaus einer Luciferaseaktivität exprimieren. Liganden, die in der Lage sind, die Ligandenbindungsdomäne des für den RAR-γ-Bestandteil eingesetzten Rezeptors zu binden, könnten einfach im Hinblick auf negative Hormonaktivität durch Messung ihrer Fähigkeit zur Unterdrückung der Luciferaseaktivität gesucht werden.
Für Steroidsuperfamilien-nukleare Rezeptoren, die mit RXR keine Heterodimere bilden (z. B. Glucokortikoid- und Östrogenrezeptoren), kann dasselbe Endergebnis unter Verwendung von GR-VP-16- oder ER-VP-16-Rezeptoren und einem Luciferase-Reporterplasmid erreicht werden, bestehend aus dem geeigneten Glucokortikoid- oder Östrogenreaktionselement, fusioniert mit einem heterologen Promotorelement und Luciferase oder einem anderen Reportergen. Ein essentielles Merkmal des verallgemeinerten Assays zum Screening von negativen Hormonen ist der Einschluss von mindestens der Ligandenbindungsdomäne des bestimmten nuklearen Rezeptors, für den die inversen Agonisten gesucht werden sollen, und ein Verfahren zum Lokalisieren der nuklearen Rezeptorligandenbindungsdomäne an den Promotor eines Reportergens. Dies könnte unter Verwendung der natürlichen DNA-Bindungsstelle des Rezeptors oder alternativ durch Konstruktion eines primären Rezeptors mit einer heterologen DNA-Bindungsdomäne und korrespondierende Verwendung eines Reportergens, das sich unter Kontrolle eines regulatorischen DNA-Elements befindet, das durch die heterologe DNA-Bindungsdomäne erkannt wird, erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform würde das Plasmid, das den nuklearen Rezeptor exprimiert, für den inverse Agonisten gesucht werden, diesen nuklearen Rezeptor als Fusionsprotein exprimieren, enthalten eine konstitutive Aktivierungsdomäne, wie z. B. die HSV VP-16-Aktivierungsdomäne, um eine hohe basale Aktivität zu ermöglichen. Diese hohe basale Aktivität würde effektiv die Assayempfindlichkeit erhöhen und dadurch eine Analyse von nuklearen Rezeptorliganden ermöglichen, die die basale transkriptionelle Aktivität in Abwesenheit von zugefügtem nuklearen Rezeptoragonisten unterdrücken.
Das folgende Beispiel illustriert ein Verfahren, das verwendet werden kann, um Verbindungen mit einer negativen Hormonaktivität am Thyroidhormonrezeptor zu suchen.
Beispiel 26
Verfahren zur Identifizierung von negativen Hormonen des Thyroidhormonrezeptors
CV-1-Zellen werden mit dem Luciferasereporterplasmid ERE-tk-Luc und den Plasmiden ER-RXR-α und T3R-VP-16 co-transfiziert. T3R-VP-16 ist identisch zu dem Plasmid RAR-γ-VP-16, außer dass der RAR-γ-Bestandteil von RAR-γ-VP-16 durch die Thyroidhormonrezeptor cDNA ersetzt wurde. Als solches exprimiert T3R-VP-16 ein Fusionsprotein, enthaltend die Aktivierungsdomäne von HSV VP-16 in einem Rahmen mit dem N-Terminus des Thyroidhormonrezeptors. Standardtransfektions- und Zellkulturverfahren werden für diesen Zweck verwendet. Nach der Transfektion werden die Zellen mit Wachstumsmedium, enthaltend 10%iges fötales Kälberserum, gespült und gefüttert, das mit aktivierter Holzkohle extrahiert wurde. Die Zellen werden mit Vehikel allein (Ethanol), Thyroidhormon (10^–9 bis 10^–10 M) oder der Verbindung TR-1 (10^–9 bis 10^–6 M) behandelt. TR-1 ist ein synthetischer Thyroidhormonrezeptorligand, der eine starke Affinität für den Thyroidhormonrezeptor in Kompetitionsbindungsstudien zeigt, der jedoch transfizierten Thyroidhormonrezeptor in transienten Co-Transfektionstransaktivierungsassays unter Verwendung eines Thyroidhormon-reaktiven Reportergens und eines Thyroidhormonrezeptorexpressionsplasmid nicht aktiviert. Weiterhin ist TR-1 in der Lage, gegenüber der vom Thyroidhormon vermittelten Transaktivierung antagonistisch zu wirken und ist als solcher ein Thyroidrezeptorantagonist.
Die Analyse der Luciferaseaktivität von CV-1-Zellen, transfiziert mit ERE-tk-Luc, ER-RXRα und T3R-VP-16 demonstriert ein hohes Grundniveau der Luciferase-Reporteraktivität in Vehikel-behandelten Zellen. Zellen, die mit Thyroidhormon behandelt wurden, zeigen einen leichten Anstieg der Luciferaseaktivität in dosisabhängiger Weise. Zellen, die mit TR-1 behandelt wurden, zeigen eine dosisabhängige Abnahme der Luciferaseaktivität. Dies zeigt, dass TR-1 eine Thyroidrezeptor-inverse agonistische Aktivität ausübt, vermutlich aufgrund der erhöhten Wechselwirkung des NCP mit dem Thyroidhormonrezeptor.
Die Proliferationsrate von menschlichen primären Retinapigmentepithelzellen wird durch Behandlung mit RAR-Agonisten unterdrückt. Der therapeutische Wert dieser Beobachtung wurde bei der post-operativen Retinoidtherapie nach Retina-Wiederanhaftungschirurgie demonstriert. Wir haben oben demonstriert, dass das AGN 193109-RAR-negative Hormon primäre RPE-Zellen gegenüber der antiproliferativen Wirkung von ATRA und 13-cis-Retinolsäure in Co-Verabreichungsverfahren sensibilisieren kann. Weiterhin wurde von AGN 193109 ebenfalls gezeigt, dass es RPE-Zellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen anderer nuklearer Rezeptoragonisten sensibilisiert. Insbesondere sensibilisiert AGN 193109 RPE-Zellen gegenüber den proliferativen Wirkungen des Glucokortikoidagonisten, Dexamethason und des Thyroidhormonagonisten 3,3',5'-Triiodthyronin, T3. Diese Daten sind konsistent mit unserem Arbeitsmodell, worin AGN 193109 die Verfügbarkeit von NCPs modulierte, die von den Mitgliedern der nuklearen Rezeptorfamilie geteilt werden. Die Behandlung von RPE-Zellen mit dem Thyroidhormonrezeptorinversen Agonisten TR-1 wird ähnlich die Verfügbarkeit von geteilten NPCs verändern, so dass die Co-Verabreichungen mit einem Nicht-Thyroidrezeptoragonisten, wie z. B. dem RAR-Agonisten 13-cis-Retinolsäure, zu einer erhöhten antiproliferativen Wirkung auf die RPE-Kulturen führen wird, verglichen mit 13-cis-Retinolsäure als Monotherapie.
Das folgende Beispiel illustriert ein Verfahren, das verwendet werden kann, um primäre RPE-Zellen gegenüber der antiproliferativen Aktivität eines RAR-Agonisten empfindlicher zu machen. Insbesondere illustriert dieses Beispiel weiterhin, wie die Aktivität von RAR-Agonisten durch Co-Verabreichung mit dem einem negativen Hormon verstärkt werden kann.
Beispiel 27
Sensibilisierung primärer Retinapigmentepithelzellen gegenüber den antiproliferativen Wirkungen von RAR-Agonisten durch Co-Verabreichung des TR-1-Thyroidhormon-inversen Agonisten
Menschliche primäre RPE-Zellen werden erhalten und gemäß Standardverfahren kultiviert. Die kultivierten Zellen werden in 4 Gruppen unterteilt und wie folgt behandelt. Gruppe 1 erhält Vehikel allein (Ethanol). Gruppe 2 wird mit 13-cis-Retinolsäure in Konzentrationen von 10^–11 bis 10^–6 M behandelt. Gruppe 3 wird mit dem Thyroidhormon-inversen Agonisten TR-1 in Konzentrationen von 10^–11 bis 10^–1 M behandelt. Gruppe 4 wird mit 13-cis-Retinolsäure in Konzentrationen von 10^–11 bis 10^–6 M TR-1 co-behandelt. Die Zellen werden wieder mit frischem Wachstumsmedium gefüttert und wieder mit der geeigneten Verbindung alle 2 Tage für eine Gesamtzeit von 5 Behandlungstagen behandelt. Die Proliferationsrate über die Dauer des Experiments wird durch Messung der Zellzahlen in Kulturen unter Verwendung eines elektrischen Zellzählers quantifiziert.
TR-1-behandelte Zellen (Gruppe 3) zeigen Raten in der zellulären Proliferation, die im wesentlichen dieselben sind wie die bei den Kontroll-(Gruppe 1)-Zellen, und es gibt keine Wirkung dieses inversen Agonisten auf die gemessene Wachstumsrate der Kulturen.
Zellen, die mit 13-cis-Retinolsäure (Gruppe 2) behandelt wurden, zeigen eine dosisabhängige Abnahme der Zellzahl. Ein Vergleich dieser dosisabhängigen Abnahme der zellulären Proliferation der Gruppe 4-Zellen (13-cis RA und TR-1-Co-Verabreichung) mit der in Gruppe 3 erhaltenen, demonstriert die Fähigkeit der TR-1-Thyroidhormonrezeptor-inversen Agonist-Co-Verabreichung zur Sensibilisierung von RPE-Kulturen gegenüber der antiproliferativen Wirkung von 13-cis-Retinolsäure, gemessen durch die Verlagerung der Dosis-Reaktionskurve dieses RAR-Agonisten nach links in Gruppe 4 im Vergleich mit Gruppe 2-Zellen.

Claims

Verbindung der Formel
worin: X₁ S oder O ist; X₂ ist CH oder N; R₂ ist H, F, CF₃ oder C_1-6-Alkoxy; R₂* ist H, F oder CF₃; R₈ ist H oder Niederalkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen; R₁₄ ist unsubstituiertes Phenyl, Thienyl oder Pyridyl oder Phenyl, Thienyl oder Pyridyl, das mit 1–3 R₁₅-Gruppen substituiert ist, worin R₁₅ Niederalkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen, Chlor, CF₃ oder Alkoxy mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 1, worin X₁ S ist.
Verbindung gemäss Anspruch 2, worin X₂ CH ist.
Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R₁₄ unsubstituiertes oder mit einer Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen substituiertes Phenyl, 2-Thienyl oder 3-Pyridyl ist.
Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R₂ H oder F ist.
Verbindung gemäss Anspruch 2, worin R₂* H oder F ist.
Verbindung gemäss Anspruch 2, worin X₂ N ist.
Verbindung gemäss Anspruch 1, worin X₁ O ist.
Verbindung gemäss Anspruch 8, worin X₂ CH ist.
Verbindung gemäss Anspruch 8, worin R₁₄ unsubstituiertes oder mit einer Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen substituiertes Phenyl, 2-Thienyl oder 3-Pyridyl ist.
Verbindung gemäss Anspruch 8, worin R₂ H oder F ist.
Verbindung gemäss Anspruch 8, worin R₂* H oder F ist.
Verwendung eines Retinoid-Antagonisten oder einer negativen Hormonverbindung gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, der/die in der Lage ist, einen Retinolsäure-Rezeptorsubtyp, ausgewählt aus RARα, RARβ und RARγ, zu binden, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines pathologischen Zustands, der mit einer Retinolsäure-Rezeptoraktivität in einem Säugetier in Verbindung steht, wobei der Antagonist oder das negative Hormon in einer pharmazeutisch wirksamen Menge zur Bereitstellung eines therapeutischen Nutzens gegen den pathologischen Zustand in dem Säugetier verabreicht wird.
Verwendung gemäss Anspruch 13, worin der pathologische Zustand die Toxizität oder unerwünschte Wirkungen darstellen, die aus der Verabreichung einer Retinoidverbindung in dem Säuger resultieren, und worin der therapeutische Nutzen die Vorbeugung oder Abschwächung der Toxizität oder der unerwünschten Nebenwirkungen ist.
Verwendung gemäss Anspruch 13 oder 14, worin der Retinoid-Antagonist oder das negative Hormon verabreicht wird zur Heilung oder Abschwächung eines vorexistierenden pathologischen Zustands, der durch Einnahme eines Retinoidwirkstoffs oder von Vitamin A oder Vitamin A-Vorläufern durch den Säuger hervorgerufen wurde.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 13 bis 15, worin der Retinoid-Antagonist oder das negative Hormon topisch zur Blockierung oder Abschwächung unerwünschter topischer Nebenwirkungen eines zu einem therapeutischen Zweck verabreichten Retinoidwirkstoffs verabreicht wird.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 13 bis 16, worin der Retinoid-Antagonist oder das negative Hormon topisch zur Blockierung oder Abschwächung unerwünschter topischer Nebenwirkungen eines systemisch zu einem therapeutischen Zweck verabreichten Retinoidwirkstoffs verabreicht wird.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 13 bis 17, worin der Retinoid-Antagonist oder das negative Hormon topisch zur Behandlung eines vorexistierenden Zustands oder einer Nebenwirkung, die durch einen Retinoidwirkstoff oder Vitamin A hervorgerufen wurden, verabreicht wird.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 13 bis 18, worin der Retinoid-Antagonist oder das negative Hormon systemisch zur Behandlung eines vorexistierenden Zustands oder einer Nebenwirkung, die durch einen Retinoidwirkstoff oder Vitamin A hervorgerufen wurden, verabreicht wird.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 13 bis 19, worin der Retinoid-Antagonist oder das negative Hormon systemisch zur Blockierung oder Abschwächung der Knochentoxizität, die durch Co-Verabreichung eines Retinoidwirkstoffs oder von Vitamin A hervorgerufen wird, verabreicht wird.
Verbindung der Formel:
worin: X₂ CH oder N ist; R₂ ist H, F oder OCH₃; R₂* ist H oder F; R₈ ist H oder Niederalkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen; und R₁₄ ist ausgewählt aus Phenyl, 4-(Niederalkyl)phenyl, 5-(Niederalkyl)-2-thienyl und 6-(Niederalkyl)-3-pyridyl, worin das Niederalkyl 1–6 Kohlenstoffatome aufweist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 21, worin X₂ CH ist.
Verbindung gemäss Anspruch 22, worin R₂ H ist.
Verbindung gemäss Anspruch 23, worin R₂* H ist.
Verbindung gemäss Anspruch 24, worin die Gruppe R₁₄ ausgewählt ist aus Phenyl, 4-Methylphenyl, 4-Ethylphenyl, 4-i-Propylphenyl, 4-t-Butylphenyl, 5-Methyl-2-thienyl, 5-Ethyl-2-thienyl, 5-t-Butyl-2-thienyl und 6-Methyl-3-pyridyl.
Verbindung gemäss Anspruch 25, worin R₈ Ethyl oder H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 23, worin R₂* F ist.
Verbindung gemäss Anspruch 27, worin die Gruppe R₁₄ ausgewählt ist aus 4-Methylphenyl und 4-Ethylphenyl.
Verbindung gemäss Anspruch 28, worin R₈ Ethyl oder H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 22, worin R₂ F ist und R₂* ist H.
Verbindung gemäss Anspruch 30, worin die Gruppe R₁₄ ausgewählt ist aus 4-Methylphenyl und 5-Methyl-2-thienyl.
Verbindung gemäss Anspruch 30, worin R₈ Ethyl oder H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 22, worin R₂ OCH₃ ist, R₂* ist H und R₁₄ ist 4-Methylphenyl.
Verbindung gemäss Anspruch 33, worin R₈ Ethyl oder H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 21, worin X₂ N ist, R₂ ist H, R₂* ist H und R₁₄ ist ausgewählt aus 4-Methylphenyl und 4-Ethylphenyl.
Verbindung gemäss Anspruch 35, worin R₈ Ethyl oder H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung der Formel
worin: R₂* H oder F ist; R₈ ist H oder Niederalkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen; und R₁₄ ist ausgewählt aus Phenyl und 4-(Niederalkyl)phenyl, wobei das Niederalkyl 1–6 Kohlenstoffatome hat, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 37, worin R₂* H ist.
Verbindung gemäss Anspruch 38, worin die Gruppe R₁₄ ausgewählt ist aus Phenyl, 4-Methylphenyl, 4-Ethylphenyl, 4-i-Propylphenyl und 4-t-Butylphenyl.
Verbindung gemäss Anspruch 39, worin R₈ Ethyl oder H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 37, worin R₂* F ist.
Verbindung gemäss Anspruch 41, worin R₁₄ ausgewählt ist aus 4-Methylphenyl und 4-Ethylphenyl.
Verbindung gemäss Anspruch 42, worin R₈ Ethyl oder H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung der Formel
worin R₈ H oder Niederalkyl mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 44, worin R₈ H ist, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz dieser Verbindung.
Verbindung gemäss Anspruch 44, worin R₈ Ethyl ist.