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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase
(CPRTase) und eine DNA, die dieses Enzym kodiert. Insbesondere betrifft
die Erfindung die Verwendung von DNA, die Chinolatphosphoribosyltransferase
kodiert, um transgene Pflanzen herzustellen, die genetisch veränderte Nikotinkonzentrationen
aufweisen, und die Pflanzen, die derartig produziert werden.
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Stand der Technik
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Die
Herstellung von Tabak mit verringertem Nikotinanteil ist wegen der
bestehenden Bedenken hinsichtlich der Abhängigkeit hervorrufenden Wirkung
von Nikotin wichtig. Darüber
hinaus sind Tabakpflanzen mit extrem niedrigen Nikotinproduktionswerten
oder gänzlich
ohne Nikotinproduktion als Empfänger
von Transgenen verlockend, aus denen sich wirtschaftlich wertvolle
Produkte gewinnen lassen, wie Arzneimittel- und Kosmetikakomponenten
oder Lebensmittelzusätze.
Zur Entfernung von Nikotin aus Tabak sind verschiedene Verfahren
entwickelt worden. Die meisten dieser Verfahren entfernen aus dem
Tabak allerdings auch andere Inhaltsstoffe zusätzlich zu Nikotin, und beeinträchtigen
somit den Tabak negativ. Traditionelle Pflanzenzuchttechniken haben
Tabakpflanzen mit niedrigerem Nikotinanteil (etwa 8%) erzielt als
Pflanzen wilder Tabaksorten. Wünschenswert
sind Tabakpflanzen und Tabake, die einen noch weiter reduzierten
Nikotinanteil aufweisen.
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Ein
Ansatz zur Verringerung des Anteils eines biologischen Produkts
ist die Verringerung der Enzymmenge, die für einen biosynthetischen Ablauf
benötigt
wird, der zur Herstellung dieses Produkts führt. Wenn das betroffene Enzym
in quotenbestimmender Menge natürlich
vorkommt (im Verhältnis
zu anderen für
diesen Ablauf benötigten
Enzymen) bewirkt jegliche Verringerung der vorhandenen Menge dieses
Enzyms eine Produktionsreduzierung des Endprodukts. Falls der Enzymanteil
normalerweise nicht quotenbestimmend ist, muss sein Anteil in einer
Zelle auf quotenbeschränkende
Werte reduziert werden, um den Ausstoß des Ablaufs zu verringern.
Umgekehrt bewirkt jegliche Erhöhung
der Enzymaktivität
eine Produktionssteigerung des biosynthetischen Ablaufs, wenn die
natürlich
vorkommende Enzymkonzentration quotenbegrenzend ist.
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Nikotin
wird vorwiegend in den Wurzeln von Tabakpflanzen gebildet und anschließend in
die Blätter transportiert,
wo es gespeichert wird (Tso. Physiology and Biochemistry of Tobacco
Plants, pp. 233-34, Dowden, Hutchinson & Ross, Stroudsburg, Pa. (1972)).
Ein unabdingbarer Schritt zur Nikotinbiosynthese ist die Bildung
von Nikotinsäure
aus Chinolinsäure,
wobei dieser Schritt durch das Enzym Chinolinphosphoribosyltransferase
(CPRTase) katalysiert wird. CPRTase scheint im Ablauf ein quotenbegrenzendes
Enzym zu sein, das Nikotinsäure
zur Nikotinsynthese in Tabak liefert. Siehe, z.B. Feth et al., „Regulation
in Tobacco Callus of Enyzme Activities of the Nicotine Pathway", Planta, 168, pp
402-07 (1986); Wagner et al., "The
Regulation of Enzyme Activities of the Nicotine Pathway in Tobacco", Physiol. Plant.,
68, pp. 667-72 (1986). Die Veränderung von
Nikotinkonzentrationen in Tabakpflanzen durch Antisense-Steuerung
oder Putrescencemethyltransferase (PMTase) – Abgabe wird in den U.S. Patentschriften
5,369,023 und 5,260,205 von Nakatani und Malik vorgeschlagen. Die
PCT-Anmeldung WO 94/28142 von Wahad und Malik beschreibt DNA, die
PMT kodiert, und die Verwendung von PMT-Konstrukten in Lese- und
Antisense-Richtung.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Ein
erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes DNA-Molekül, das die
SEQ ID NO:1 umfasst; DNA-Sequenzen,
die ein Enzym kodieren, das die SEQ ID NO: 2 umfasst; DNA-Sequenzen,
die zu mindestens 65% mit einer derartigen DNA homolog sind, und
die ein Chinolatphosphoribosyltransferaseenzym kodieren; und DNA-Sequenzen, die durch
Degeneration des genetischen Kodes von der oben genannten DNA abweichen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Peptid, das von einer
derartigen DNA kodiert wird.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Konstrukt, der einen
Promotor umfasst, der in einer Pflanzenzelle funktionell ist, und
ein DNA-Segment, das eine Chinolatphosphoribosyltransferase-Enzymstellung
kodiert, die dem Promotor nachgeschaltet positioniert ist und mit
diesem funktionell verbunden ist. Die DNA, die das Enzym kodiert,
kann in Antisense- oder in Leserichtung erfolgen.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung einer transgenen pflanzlichen Zelle, die eine verringerte
Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase)-Expression aufweist,
indem eine Pflanzenzelle einer Sorte vorgesehen wird, von der bekannt
ist, dass sie Chinolatphosphoribosyltransferase exprimiert; die
pflanzliche Zelle mit einem exogenen DNA-Konstrukt transformiert
wird, der einen Promotor und DNA umfasst, die wiederum einen Abschnitt
einer Sequenz umfasst, der Chinolatphosphoribosyltransferase-mRNA
kodiert.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze
der Art Nicotiana, die im Vergleich zu einer nicht-transformierten
Kontrollpflanze eine verringerte Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase) – Expression
aufweist. Die Zellen derartiger Pflanzen umfassen einen DNA-Konstrukt,
der ein Segment einer DNA-Sequenz
umfasst, das ein pflanzliches Chinolatphosphoribosyltransferase-mRNA
kodiert.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Verringerung der Expression eines Chinolatphosphoribosyltransferase-Gens
in einer pflanzlichen Zelle, indem eine pflanzliche Zelle kultiviert wird,
die so transformiert wurde, dass sie exogene DNA umfasst, wobei
ein transkribierter Strang der exogenen DNA, der zur Chinolatphosphoribosyltransferase-mRNA
komplementär
ist, die zur Zelle endogen ist. Die Transkription des komplementären Strangs
verringert die Expression des endogenen Chinolatphosphoribosylgens.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von Tabakpflanzen, die in den Blättern der Tabakpflanzen verringerte
Nikotinkonzentrationen aufweisen, indem eine Tabakpflanze mit Zellen
kultiviert wird, die eine exogene DNA-Sequenz umfassen, wobei ein
transkribierter Strang der exogenen DNA-Sequenz zur endogenen Chinolatphosphoribosyltransferase-Messenger-RNA
in den Zellen komplementär
ist.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, die eine erhöhte Chinolatphosphoribosyl-transferase
(CPRTase)-Expression aufweist, indem eine Pflanzenzelle, von der
bekannt ist, dass sie Chinolatphosphoribosyltransferase exprimiert,
mit einem exogenen DNA-Konstrukt transformiert wird, der eine DNA-Sequenz umfasst,
die Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Nicotiana-Pflanze,
die eine erhöhte Chinolatphosphoribosyltransferase
(CPRTase)-Expression aufweist, wobei die Zellen der transgenen Pflanze eine
exogene DNA-Sequenz umfassen, die eine pflanzliche Chinolatphosphoribosyltransferase
kodiert.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zu
erhöhter
Expression eines Chinolatphosphoribosyltransferase-Gens in einer
pflanzlichen Zelle, indem eine pflanzliche Zelle kultiviert wird,
die so transformiert ist, dass sie eine exogene DNA umfasst, die
Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
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Eine
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung einer Tabakpflanze, die in den Blättern erhöhte Nikotinkonzentrationen
aufweist, indem eine Tabakpflanze kultiviert wird, die Zellen aufweist,
die eine exogene DNA-Sequenz aufweisen, die in den Zellen funktionelle
Chinolatphosphoribosyltransferase kodiert.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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In
den Zeichnungen zeigen:
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1 den biosynthetischen Ablauf,
der zu Nikotin führt.
Die Enzymaktivitäten,
von denen bekannt ist, dass sie durch Nic1 und Nic2 gesteuert werden,
sind CPRTase (Chinolatephosphoribosyltransferase) und PMTase (Putrescencemethyltransferase).
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2A die vorgesehene Nukleinsäure-Sequenz
der NtCkPT1cDNA (SEQ ID NO:1), wobei die Kodierungssequenz (SEQ
ID NO:3) in Großbuchstaben
dargestellt ist.
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2B die vorgesehenen abgeleiteten
Aminosäuresequenzen
(SEQ ID NO:2) der Tabak-CPTRase, die durch NtCPT1cDNA kodiert ist.
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3 die Ausrichtung der abgeleiteten
NtCPT1-Aminosäuresequenzen
und die dazugehörigen
Sequenzen der Rhodospirillum rubrum, Mycobacterium lepre, Salmonella
typhimurium, Eschrichia coli, des Menschen und der Saccaromyces
cerevisiae.
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4 die Ergebnisse der Komplementierung
eines Escherichia coli – Mutanten,
dem Chinolatphosphoribosyltransferase (TH265) fehlt, mit NtCPT1
cDNA. Zellen wurden mit einem Expressionsvektor transformiert, der
NtCPT1 trägt;
das Wachstum transformierter TH265-Zellen, die NtCPT1 auf Minimalmedium
exprimieren, dem Nikotinsäure
fehlt, zeigt, das NtCPT1 CPRTase kodiert.
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5 vergleichend Nikotinkonzentrationen
und die relativ gleich bleibenden NtCTP1 mRNA-Konzentrationen in
1 und Nic2 – Tabakmutanten:
wilde Burley 21 – Sorten
(Nic1/Ni1 Nic2/Nic2); Nic1 Burley 21 (nic1/nic1 Nic2/Nic2); Nic2
Burley 21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2); und Nic1– Nic2– Burley
21 (nic1/nic1 nic2/nic2). Absteigend schraffierte Balken bezeichnen
mRNA-Transkriptionskonzentrationen; aufsteigend schraffierte Balken
bezeichnen Nikotinkonzentrationen.
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6 im Zeitverlauf die Konzentrationen
von NtCPT1 mRNA in Tabakpflanzen, deren Triebe gekappt wurden, im
Vergleich zu ungestutzten Kontrollpflanzen. Absteigend schraffierte
Balken geben die Transkriptionskonzentrationen von mRNA an; aufsteigend
schraffierte Balken bezeichnen die Nikotinkonzentrationen.
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Genaue Beschreibung
der Erfindung
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Nikotin
entsteht in Tabakpflanzen, wenn Nikotinsäure und 4-Methylaminobutanal kondensieren. Der biosynthetische
Ablauf, der zur Nikotinproduktion führt, ist in 1 dargestellt. Zwei Steuerpunkte (Nic1
und Nic2) wirken als ausschlaggebende Regulatoren der Nikotinproduktion zusammen.
Enzymanalysen der Wurzeln von Einzel- und Doppel-Nic-Mutanten zeigen, dass die Aktivitäten der
beiden Enzyme, Chinolatphosphoribosyl-transferase (CPRTase) und
Putrescencemethyltransferase (PMTase), zur Nikotinbiosynthese direkt proportional
sind. Ein Vergleich der Enzymaktivität in Tabakzellen (Wurzel und
Narben) unterschiedlicher Kapazitäten an Nikotinsynthese zeigen,
dass sich die CPRTase-Aktivität
genau parallel zum Nikotingehalt verhält (Wagner und Wagner, Planta
165:532 (1985). Saunders und Bush (Plant Physiol 64:236 (1979) zeigten,
dass sich die Konzentration von CPRTase in den Wurzeln von Niedrignikotin-Mutanten
proportional zu den Nikotinkonzentrationen in den Blättern verhält.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst eine neue cDNA-Sequenz (SEQ ID NO:1),
die ein pflanzliches Chinolatphosphoribosyltransferase (CPRTase)
von SEQ ID NO:2 kodiert. Da sich die CPRTase-Aktivität der Nikotinkonzentration
genau kongruent verhält,
führt die
Herstellung von transgenen Tabakpflanzen, in denen CPRTase-Konzentrationen in
den Wurzeln verringert wurde (im Verhältnis zu wilden Pflanzensorten),
zu Pflanzen, die verringerte Nikotinkonzentrationen in den Blättern aufweisen.
Die vorliegende Erfindung sieht Verfahren und Nukleinsäurekonstrukte
zur Herstellung solcher transgenen Pflanzen vor, sowie derartige
transgene Pflanzen. Derartige Verfahren umfassen die Expression
von Antisense-NtCPT1 RNA, die die Konzentration von CPRTase in den
Wurzeln von Tabakpflanzen senkt. Nikotin wurde außerdem in
nicht zu den Tabaken gehörenden
Pflanzenarten und -familien gefunden, obwohl hier normalerweise
die vorhandene Konzentration viel niedriger liegt als bei N. Tabacum.
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Die
vorliegende Erfindung sieht außerdem
in Lese- und Antisense-Orientierung rekombinierte DNA-Moleküle vor,
die CPRTase oder CPRTase-Antisense-RNA-Moleküle kodieren, und Vektoren,
die diese rekombinierten DNA-Moleküle umfassen, sowie transgene
pflanzliche Zellen und Pflanzen, die mit derartigen DNA-Molekülen und
-Vektoren transformiert worden sind. Erfindungsgemäße transgene
Tabakzellen und -pflanzen sind gekennzeichnet durch niedrigere oder
höhere
Nikotinkonzentrationen als nicht transformierte Kontroll-Tabakzellen und -pflanzen.
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Tabakpflanzen
mit äußerst niedrigen
Mengen an Nikotinexpression oder gar keiner Nikotinexpression sind
als Empfänger
von Transgenen wünschenswert,
die wirtschaftlich wertvolle Produkte exprimieren, wie Arzneimittel-
und Kosmetikkomponenten oder Lebensmittelzusatzstoffe. Tabak ist
als Wirtspflanze für
ein Transgen attraktiv, das ein gewünschtes Produkt kodiert, da
Tabak einfach genetisch programmiert werden kann und pro Hektar
eine sehr große
Biomasse erzielt; Tabakpflanzen, die weniger Rohstoffe zur Nikotinproduktion
verwenden, haben deshalb mehr Rohstoffe zur Verfügung, um transgene Produkte
herzustellen. Verfahren zur Transformierung von Tabak mittels Transgenen,
die die erwünschten
Produkte herstellen, sind in Fachkreisen bekannt; jegliche geeignete
Technik kann für
Tabakpflanzen mit erfindungsgemäß niedrigem
Nikotingehalt verwendet werden.
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Erfindungsgemäße Tabakpflanzen
mit verringerter CPRTase-Expression
und verringerter Nikotinkonzentration sind für die Herstellung von Tabakprodukten
wünschenswert,
die eine verringerte Nikotinkonzentration aufweisen. Erfindungsgemäße Tabakpflanzen
sind zur Verwendung in einem beliebigen herkömmlichen Tabakprodukt geeignet,
einschließlich
ohne Beschränkung
in Pfeifen-, Zigarren- und Zigarettentabak sowie Kautabak, und können in
beliebiger Form vorliegen, einschließlich Tabakblättern, zerfasertem
oder geschnittenem Tabak.
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Die
erfindungsgemäßen Konstrukte
können
auch bei der Bereitstellung transgener Pflanzen nützlich sein,
die in der Pflanze eine erhöhte
CPRTase-Expression und eine erhöhte
Nikotinkonzentration aufweisen. Derartige Konstrukte und Verfahren
zur Verwendung dieser Konstrukte und der damit hergestellten Pflanzen können bei
der Herstellung von Tabakprodukten wünschenswert sein, die eine
geänderte
Nikotinkonzentration aufweisen, oder bei der Produktion von Pflanzen,
die für
den Pflanzenschutz einen erhöhten
Nikotingehalt aufweisen.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben erkannt, dass das TobRD2-Gen
(siehe Conkling et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) eine Nicotiana
tabacum CPRTase kodiert, und sehen hiermit die cDNA-Sequenz des
NtCPT1 (früher
TobRD2 genannt) und die Aminosäuresequenz
des kodierten Enzyms vor. Vergleiche der NtCPT1 Aminosäuresequenz
mit der GenBank-Datenbank
offenbaren beschränkte
Sequenzähnlichkeiten
zu bakteriellen Proteinen, die Chinolatphosphoribosyltransferase
(CPRTase) kodieren (3).
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Chinolatphosphoribosyltransferase
wird wiederum zur Biosynthese von Nikotinadenin-Dinukleotid (NAD)
benötigt,
sowie bei Protokaryoten und Eukaryoten. Bei Tabak werden hohe CPRTase – Konzentrationen in
der Wurzel aber nicht in den Blättern
gemessen. Um zu beweisen, dass NTCPT1 CPRTase kodiert, verwenden
die Erfinder der vorliegenden Erfindung Escherichia coli – Bakterienstränge (TH265),
einen Mutanten, dem Chinolatphosphoribosyltransferase (nadC+) fehlt.
Dieser Mutant kann auf Minimalmedium, dem Nikotinsäure fehlt,
nicht gedeihen. In diesem Bakterienstrang stellt nun die Expression
von NtCPT1-Protein
die NadC+ – Erscheinungsform
bereit (4) und bestätigt dadurch,
dass NtCPT1 CPRTase kodiert.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten die Auswirkungen
von Nic1 und Nic2 – Mutanten auf
Tabak, und die Auswirkungen des Stutzens auf Tabakpflanzen, auf
NtCPT1 gleich bleibender mRNA-Konzentrationen und Nikotinkonzentrationen.
(Beseitigung der vorstehenden Krone durch Kappen zu Beginn der Blüte ist allgemein
dafür bekannt,
dass es zu erhöhten
Nikotinbiosynthesewerten und – transport
innerhalb des Tabaks führt
und ist bei der Tabakherstellung ein Standartverfahren.) Falls NtCPT1
wirklich an der Nikotinbiosynthese beteiligt ist, ist es zu erwarten,
dass (1) NtCPT1-mRNA-Konzentrationen in Nic1/Nic2-Doppelmutanten
niedriger wären
und (2) NtCPT1-mRNA-Konzentrationen
nach dem Kronenstutzen steigen würden. NtCPT1-mRNA-Konzentrationen
in Nic1/Nic2-Doppelmutanten lagen bei etwa 25% der Werte wilder
Sorten (5.) Desweiteren
stiegen innerhalb von sechs Stunden nach dem Kronenstutzen die NtCPT1-mRNA-Konzentrationen
in Tabakpflanzen um etwa das achtfache an. Dadurch wurde NtCPT1
als Hauptsteuerungs-Gen beim Ablauf der Nikotin-Biosyntese bestimmt.
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Transgene pflanzliche
Zellen und Pflanzen
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Die
Steuerung von Genexpression in pflanzlichen Zell-Genomen kann durch die Integration von
heterologer DNA unter transkribierender Kontrolle eines Promotors
erreicht werden, der im Wirt funktionell ist, und in dem die transkribierten
Stränge
der heterologen DNA zu dem Strang der DNA komplementär ist, der
vom endogenen Gen transkribiert wird, das gesteuert werden soll.
Die eingeführte
DNA, die als antisense DNA bezeichnet wird, sieht eine RNA-Sequenz
vor, die zu natürlich
hergestellten (endogenen) mRNAs komplementär ist, und die die Expression
endogener mRNAs verhindert. Der Mechanismus derartiger Genexpressions-Regulatoren
durch Antisense ist noch nicht völlig
geklärt.
Um nicht auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu werden, wird angemerkt,
dass nur eine Theorie der Antisense-Steuerung unterstellt, dass
die Transkribierung von Antisense-DNA RNA-Moleküle produziert, die sich an
endogene mRNA-Moleküle
anbinden und einer Tranksription vorbeugen oder diese verhindern.
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Bei
den erfindungsgemäßen Verfahren
kann das Antisense-Produkt
zu den kodierenden oder nicht kodierenden Anschnitten (oder beiden)
der natürlich
vorkommenden Ziel-RNA
komplementär
sein. Das Antisense-Konstrukt kann in beliebiger, angemessener Weise
in die pflanzlichen Zellen eingeführt werden, und kann zur induzierbaren
oder konstituierbaren Transkription der Antisense-Sequenz in die
Pflanzengenome integriert werden. Siehe, z.B. die U.S.
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Patentschriften
Nr. 5,453,566 und 5,107,065 von Shewmaker et al. (in Gänze hierbei
durch Verweis eingeschlossen.)
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Wie
hier verwendet bezeichnen exogene oder heterologe DNA (oder RNA)
DNA (oder RNA), die in eine Zelle (oder einen Vorläufer der
Zelle) durch menschlichen Eingriff eingeführt wurde. Eine solche heterologe
DNA kann die Kopie einer Sequenz sein, die natürlich in der zu transformierenden
Zelle oder Fragmenten davon vorkommt.
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Um
eine Tabakpflanze herzustellen, die verringerte CPRTase-Konzentrationen aufweist,
und dadurch einen niedrigeren Nikotinanteil als nicht transformierte
Kontroll-Tabakpflanzen,
kann eine Tabakzelle mit einer exogenen CPRT Antisense-Transkriptionseinheit
transformiert werden, die eine Teil-CPRT cDNA-Sequenz aufweist,
eine CPRT cDNA-Sequenz
voller Länge,
eine Teil-CPRT Chromosomal-Sequenz oder eine CPRT-Chromosomalsequenz
voller Länge,
in Antisense-Ausrichtung mit der entsprechenden funktionell verbundenen
Steuerungssequenz. Angemessene Steuerungssequenzen umfassen eine
Transkriptions-Einleitungssequenz
(„Promotor"), der in der zu
transformierenden Pflanze operieren kann, und eine Polyadenylierung/Transkriptions-Endsequenz.
Standardtechnologien, wie ein Abgrenzungs-Mapping, Identifizierung
von DNA-Abschnitten durch Elektrophorese nach Hybridisierung und
die Analyse von Nukleotidsequenzen werden dann angewandt, um Klone
zu identifizieren, die CPRTase-Sequenzen in der Antisense-Ausrichtung
tragen, die funktionell mit den Steuerungssequenzen verbunden sind.
Tabakpflanzen werden dann aus erfolgreich transformierten Zellen
regeneriert. Es ist besonders bevorzugt, wenn die verwendeten Antisense-Sequenzen zu
den endogenen Sequenzen komplementär sind, kleinere Abweichungen
in den exogenen und endogenen Sequenzen können allerdings toleriert werden.
Es ist bevorzugt, wenn die Antisense-DNA-Sequenzen zu den unten
beschriebenen strikten Bedingungen eine ausreichende Sequenzähnlichkeit
aufweisen, die eine Bindung der endogenen Sequenzen in der zu steuernden
Zelle ermöglichen.
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Antisense-Technologie
ist in verschiedenen Labors verwendet worden, um transgene Pflanzen
zu erzeugen, die durch bestimmte Enzymkonzentrationen gekennzeichnet
sind, die unter den normalen Werten liegen. Beispielsweise wurden
Pflanzen mit verringerter Chalkonsynthase erzeugt, einem Enyzm eines
biosynthetischen Blütenpigmentablaufs,
indem ein Chalkonsynthase-Antisense-Gen in das Genom von Tabak und Petunia
eingeführt
wurde. Diese transgenen Tabak- und Petuniapflanzen treiben Blüten hellerer
Farbe als normal (Van der Krol et al., „An Anti-Sense Chalcone Synthase
Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature, 333, pp.
866-69 (1988). Antisense-RNA-Technologie wurde auch erfolgreich
angewandt, um die Produktion von Enzympolygalacturonase in Tomaten
zu verhindern (Smith et al., „Antisense
RNA inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic
Tomatoes", Nature,
334, pp. 724-26 (1988); Sheehy et al., „Reduction of Polygalacturonase
Activity in Tomato Fruit by Antisense RNA", Proc. Natl. Acad Sci., USA, 85, pp.
8805-09 (1988)), und eine kleine Untereinheit des Enzyms Ribulose-Bisphosphatcarboxylase
in Tabak (Rodermel et al., „Nuclear-Organelle
Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate Carboxylase
Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell, 55, pp. 673-81 (1988)). Andererseits
können
transgene Pflanzen, die durch übernormale
Mengen eines bestimmten Enzyms gekennzeichnet sind, erzeugt werden,
indem die Pflanzen mit dem Gen für
dieses Enzym in Leserichtung (d.h. normalen Richtung) transformiert
werden. Nikotinkonzentrationen in erfindungsgemäßen transgenen Tabakpflanzen
können
mit Standard-Nikotinanalyseverfahren bestimmt werden. Transformierte
Pflanzen, in denen die Konzentration von CPRTase im Vergleich zu
nicht transformierten Kontrollpflanzen verringert wurde, weisen
entsprechend niedrigere Nikotinkonzentrationen auf im Vergleich
zur Kontrolle; transformierte Pflanzen, in denen die Konzentration
von CPRTase im Vergleich zu nicht transformierten Kontrollpflanzen
erhöht
ist, weisen entsprechend höhere
Nikotinkonzentrationen auf im Vergleich zur Kontrolle.
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Die
heterologe Sequenz, die im erfindungsgemäßen Antisense-Verfahren verwendet
wird, kann so ausgewählt
werden, dass sie ein RNA-Produkt erzeugt, das zur gesamten CORTase
mRNR-Sequenz oder
einem Teil davon komplementär
ist. Die Sequenz kann zu einer beliebigen zusammenhängenden
Sequenz der natürlichen
Messenger-RNA komplementär
sein, d.h. sie kann zur endogenen mRNA-Sequenz komplementär sein,
die sich nahe der 5'End-
oder Deckelseite, der Deckelseite nachgeschaltet, zwischen der Deckelseite
und dem Anfangskodon befindet, und kann den gesamten oder nur einen
Teil des nicht-kodierten Bereichs bedecken, kann einen nicht-kodierten
und einen kodierten Bereich überbrücken, kann
zum gesamten oder einem Teil des kodierten Bereichs komplementär sein,
kann zum 3'Ende
des kodierten Bereichs komplementär sein, oder komplementär zum 3'nicht-transformierten Bereich
der mRNA. Geeignete Antisense- Sequenzen
können von
mindestens 13 bis etwa 15 Nukleotiden reichen, mindestens jedoch
von etwa 16 bis 21 Nukleotiden, mindestens etwa 20 Nukleotiden,
mindestens etwa 30 Nukleotiden, mindestens etwa 50 Nukleotiden,
mindestens etwa 75 Nukleotiden, mindestens etwa 100 Nukleotiden,
mindestens etwa 125 Nukleotiden, mindestens etwa 150 Nukleotiden,
mindestens etwa 200 Nukleotiden oder mehr. Außerdem können die Sequenzen an ihrem
3' oder 5'Ende verlängert oder
verkürzt
sein.
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Die
bestimmte Antisense-Sequenz und die Länge der Antisense-Sequenz variieren
entsprechend des Grads an gewünschter
Hemmungsstärke,
der Stabilität
der Antisense-Sequenz
und ähnlichem.
Ein Fachmann wird sich bei der Auswahl der geeigneten CPRTase Antisense-Sequenz
von Techniken leiten lassen, die in Fachkreisen bekannt und hier
als Information vorgesehen sind. Bezüglich der vorliegenden 2A und SEQ ID NO:1 kann
ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid
ein zusammenhängendes
Fragment einer CPRTase cDNA-Sequenz in Antisense-Ausrichtung sein und eine beliebige
Länge aufweisen,
die ausreicht, den gewünschten
Effekt zu erzielen, wenn sie in eine Empfänger-Pflanzenzelle transformiert
wird.
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Die
vorliegende Erfindung kann auch in Verfahren zur Sense-Mitunterdrückung bei
der Nikotinproduktion verwendet werden. Sense-DNAs, die verwendet
werden, die vorliegende Erfindung auszuführen, weisen eine ausreichende
Länge auf,
um die Expression des der Pflanze eigenen CPRTase Proteins zu unterdrücken, wenn
es in einer pflanzlichen Zelle exprimiert wird, wie es hier für diese
pflanzliche Zelle beschrieben wird. Derartige Sense-DNAs können im Wesentlichen
ganze Genome oder komplementäre
DNAs sein, die das CPRTase-Enzym kodieren, oder Fragmente derselben,
wobei solche Fragmente normalerweise mindestens etwa 15 Nukleotiden
lang sind. Dem Fachmann sind die Verfahren bekannt, die Länge der
Sense-DNA zu bestimmen, die die Expression eines natürlichen
Gens in einer Zelle unterdrücken.
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In
einer anderen erfindungsgemäßen Ausführung werden
Nicotiana Pflanzenzellen mit einem DNA-Konstrukt transformiert,
das ein DNA-Segment enthält,
das ein enzymatisches RNA-Molekül
kodiert (d.h., ein „ribozym"), wobei das enzymatische
RNA-Molekül
gegen die mRNA-Transkription
der DNA gerichtet ist (d.h. abspaltet), die die pflanzliche CPRTase
wie hier beschrieben kodiert. Ribozyme enthalten Substrate, die
Bezirke binden, die sich an zugängliche
Bereiche der Ziel-mRNA anbinden, und Bezirke, die die Spaltung von
RNA katalysieren, und damit die Transformierung und die Proteinproduktion
verhindern. Die bindenden Bezirke können Antisense-Sequenzen umfassen,
die komplementär
zur Ziel-mRNA-Sequenz sind; das katalytische Motiv kann hier ein
Hakenkopf-Motiv oder ein anderes Motiv sein, wie das Haarnadelmotiv.
Ribozym-Abspaltungsstellen
innerhalb einer Ziel-RNA können
zuerst durch Abtasten des Zielmoleküls auf Ribozym-Abspaltungsstellen
identifiziert werden (z.B.: GUA, GUU oder GUC-Sequenzen). Nach der
Identifizierung können
kurze RNA-Sequenzen von 15, 20, 30 oder mehr Ribonukleotiden, die
dem Bezirk des Zielgens zugeordnet sind, der die Abspaltungsstelle
enthält,
auf erwartete strukturelle Eigenschaften bewertet werden. Die Eignung
des anvisierten Ziels kann auch bewertet werden, indem dessen Zugänglichkeit
für Hybridisierung
mit komplementären
Oligonukleotiden getestet wird, wobei Ribonuklease-Herstellungsroutinen
verwendet werden, die in der Fachwelt bekannt sind. DNA-kodierende
enzymatische RNA-Moleküle
können
gemäß bekannter
Techniken hergestellt werden. Siehe, z.B., T. Cech et al., U.S.
Patentschrift Nr. 4,987,071; Keefe et al., U.S. Patentschrift Nr.
5,559.021; Donson et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,589,367; Torrence
et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,583,032; Joyce, U.S. Patentschrift
Nr. 5,580,967; Gold et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,595,877; Wagner
et al., U.S. Patentschriften Nr. 5,591,601; und U.S. Patentschrift
Nr. 5,622,854 (deren Offenlegung hiermit durch Verweis in ihrer
Gesamtheit hierin enthalten ist). Die Herstellung eines derartigen
enzymatischen RNA-Moleküls
in einer pflanzlichen Zelle und die Störung der CPRTase-Proteinproduktion
verringert die CPRTase-Aktivität
in pflanzlichen Zellen auf im Wesentlichen die gleiche Weise wie
die Produktion eines Antisense-RNA-Moleküls: das heißt, durch Störung der
Transformierung der mRNA in der Zelle, die das Enzym produziert.
Der Ausdruck „Ribozym" wird hier verwendet,
eine RNA-enthaltende Nukleinsäure
zu beschreiben, die wie ein Enzym wirkt (beispielsweise als eine
Endoribonuklease) und die wechselweise mit „enzymatischen RNA-Molekülen" verwendet werden
kann. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin DNA, die Ribozyme
kodiert und DNA, die Ribozyme kodiert, die in einen Expressionsvektor
eingebracht wurden, Wirtszellen, die derartige Vektoren enthalten,
und Verfahren zur Verringerung der CPRTase-Produktion in Pflanzen,
die Ribozyme verwenden.
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Nukleinsäuresequenzen,
die verwendet werden, die vorliegenden Erfindung auszuführen, umfassen solche,
die Sequenzen aufweisen, die SEQ ID NO:1 ähneln, und ein Protein kodieren,
das Chinoiatphosphoribosyltransferase-Aktivitäten kodiert. Diese Definition
soll natürliche
alle Abarten des CPRTase-Proteins einschließen. Folglich können auch
DNA-Sequenzen verwendet werden, die zur DNA von SEQ ID NO:1 hybridisieren
und zur Expression von CPRTase kodiert sind, insbesondere pflanzlichem
CPRTase-Enzym, um die vorliegenden Erfindung auszuführen.
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Verschiedene
Formen des Tabak-CPRT-Enzyms können
vorkommen. Die verschiedenen Formen eines Enzyms können von
Modifizierungen eines einzelnen Genprodukts nach der Transformierung
herrühren oder
von verschiedenen Formen des NtCPRT1-Gens.
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Auf
herkömmliche
Weise können
die Bedingungen bestimmt werden, die es anderen DNA-Sequenzen ermöglichen,
die zur Expression eines Proteins kodiert sind, das CPRTase-Aktivitäten aufweist,
zu DNA der SEQ ID NO:1 oder zu anderen DNA-Sequenzen zu hybridisieren,
die das in SEQ ID No.2 dargestellte Protein kodieren. Beispielsweise
kann die Hybridisierung derartiger Sequenzen unter mehr oder weniger
strengen Bedingungen ausgeführt
werden (z.B. Bedingungen, die durch eine Waschknappheit von 0,3
M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 60°C oder sogar 70°C hinsichtlich
DNA repräsentiert
werden, die das hier als SEQ ID NO:2 vorgesehene Protein in einer
Standard – in
situ Hybridisierungsprobe kodieren. Siehe J. Sambrook et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed. 1989) (Cold Spring Harbor
Laboratory)). Im allgemeinen sind derartige Sequenzen zu mindestens
65%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens
90% oder sogar 95% und mehr der Sequenz ähnlich, die hier als SEQ ID
N0:1 angegeben ist oder DNA-Sequenzen, die Proteine der SEQ ID Nr.1
kodieren. (Bestimmungen von Sequenzähnlichkeiten werden durchgeführt, indem
die beiden Sequenzen auf maximale Übereinstimmung ausgerichtet
werden; bei der Ermittlung der maximalen Übereinstimmung darf es Lücken in
der einen oder anderen der beiden Sequenzen geben, die aufeinander
ausgerichtet werden. Lückenlängen von
10 oder weniger sind bevorzugt, Lückenlängen von 5 oder weniger sind
besonders bevorzugt, und Lückenlängen von
2 oder weniger werden noch mehr bevorzugt.)
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Es
gibt Differential-Hybridisierungsverfahren, die die Isolierung von
cDNA-Klonen ermöglichen,
die so kleine mRNA-Konzentrationen
wie 0,05 der poly(A+)RNR aufweisen. Siehe M. Conkling et al., Plant
Physiol. 93, 1203-1211 (1990). In Kürze, cDNA-Dateien werden durch
die Verwendung von Einzelstrang-cDNA-Proben von entgegengesetzt
transkribierten mRNA aus pflanzlichen Zellen geprüft (z.B.,
Wurzeln bzw. Blättern.)
Zur Unterschiedsprüfung
wird eine Nitrocellulose- oder Nylonmembran mit 5xSSC getränkt, in
einen 96-rohrigen Saugverteiler gegeben, über Nacht werden in jedes Rohr
150 μL stationärer Kultur
aus einer Masterplatine übertragen
und Unterdruck angelegt bis die gesamte Flüssigkeit durch den Filter gelaufen
ist. 150 μL
der denaturierten Lösung
(0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) werden mittels einer Mehrfachpipette in
jedes Rohr eingebracht und etwa 3 Minuten stehen gelassen. wie oben
wird Unterdruck angelegt, der Filter entfernt und in 0,5 M Tris-HCl
(pH 8,0) neutralisiert, 1,5 M NaCl. Dann wird es 2 Stunden lang im
Vakuum erhitzt und mit den relevanten Proben inkubiert. Durch die
Verwendung von Nylonmembranfiltern und die Tatsache, dass die Mutterplatine
bei –70°C in 7% DMSO
gelagert wird, können
die Filter mehrfach mit verschiedenen Proben und geeigneten Klonen
geprüft
werden, die auch nach mehreren Jahren der Lagerung wieder hervorgeholt
wurden.
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In
der hier vorliegenden Verwendung bezeichnet das Wort „Gen" eine DNA-Sequenz,
die (1) vorgeschaltete (5')
Steuerungssignale einschließlich
Promotoren umfasst, (2) einen Kodierungsbezirk, der das Produkt,
das Protein oder die RNA des Gens festlegt, (3) nachgeschaltete
(3') Bezirke einschließlich Transkriptionsend-
und Polyadenylierungssignale und (4) dazugehörige Sequenzen, die zur effizienten
und bestimmten Expression benötigt
werden.
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Die
erfindungsgemäße DNA-Sequenz
kann im Wesentlichen aus der hier vorgesehenen Sequenz bestehen
(SEQ ID NO:1) oder gleichwertigen Nukleotidsequenzen, die alle oder
polymorphe Varianten dieses Gens darstellen oder kodierende Bereiche
davon.
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Die
Verwendung des Ausdrucks „wesentliche
Sequenzähnlichkeit" in der vorliegenden
Beschreibung und den Ansprüchen
bezeichnet diejenigen DNA-, RNA- oder Aminosäure-Sequenzen, die geringe
und wirkungslose Sequenzvariationen von der eigentlichen hier offen
gelegten und beanspruchten Sequenz aufweisen und sollen als den
Sequenzen der vorliegenden Erfindung gleichwertig betrachtet werden.
In diesem Sinne bedeuten „geringe
und wirkungslose Sequenzvariationen", dass „ähnliche" Sequenzen (z.B., diejenigen Sequenzen,
die wesentliche Sequenzähnlichkeiten
mit der DNA, RNA oder den Proteinen aufweisen, die hier offen gelegt
und beansprucht werden) den offen gelegten und in der vorliegenden
Erfindung beanspruchten Sequenzen funktionell gleichwertig sind.
Funktionell gleichwertige Sequenzen wirken im Wesentlichen auf gleiche
Weise, um im Wesentlichen die gleichen Verbindungen wie die hier
offen gelegten und beanspruchten Nukleinsäuren und Nukleinsäureverbindungen
herzustellen.
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Hier
vorgesehene DNA-Sequenzen können
in eine Vielzahl an Wirtszellen transformiert werden. In der Fachwelt
steht eine Vielzahl an geeigneten Wirtszellen bereit, die erwünschte Wachstums-
und Weiterleitungseigenschaften aufweisen.
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Die
Verwendung des Ausdrucks „isoliert" oder „im Wesentlichen
rein" in der vorliegenden
Beschreibung und den Ansprüchen
als Regler von DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteinen heißt, dass
die dafür
bestimmten DNA, RNA, Polypeptiden oder Proteine durch menschliche
Einwirkung von ihrer in vivo Zellumgebung getrennt wurden.
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Wie
hier verwendet bezeichnet eine „native DNA-Sequenz" oder „natürliche DNA-Sequenz" eine DNA-Sequenz,
die aus nicht-transgenen Zellen oder -Gewebe isoliert werden kann.
Native DNA-Sequenzen sind solche, die nicht künstlich, wie durch ortsspezifische
Mutagenese verändert
worden sind. Sind native DNA-Sequenzen einmal identifiziert, können DNA-Moleküle, die
native DNA-Sequenzen aufweisen, chemisch synthetisiert oder hergestellt
werden, indem in der Fachwelt bekannte DNA-Rekombinierungsverfahren
verwendet werden. Wie hier verwendet, stellt eine native pflanzliche
DNA-Sequenz eine solche dar, die von nicht-transgenen pflanzlichen
Zellen oder -Geweben isoliert werden kann. Wie hier verwendet stellt
eine native Tabak-DNA-Sequenz eine solche dar, die aus nicht-transgenen
Tabakzellen oder – geweben
isoliert werden kann.
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Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte
oder „Transkriptionskassetten" umfassen einen wie
hier diskutierten Promotor, eine wie hier beschriebene DNA-Sequenz, die funktionell
dem Promotor verbunden ist, und gegebenenfalls eine Endsequenz einschließlich eines
Haltesignals für
RNA-Polymerase und ein Polyadenylationssignal zur Polyadenylase
5' bis 3' in Richtung der
Transkription. Diese Regelbereiche sollten alle in den Zellen des
zu transformierenden Gewebes operieren können. Bei der erfindungsgemäßen Ausführung kann
ein beliebiges geeignetes Endsignal verwendet werden, Beispiele
hierzu umfassen ohne Beschränkung
den Nopalinsynthase(nos)Terminator, den Octapinsymphase(ocs)Terminator,
den CaMV-Terminator oder native Endsignale, die von den gleichen
Genen abgeleitet wurden wie der Transkriptions-Anfangsbereich oder
von einem anderen Gen abgeleitet wurden. Siehe, z.B. Rezian et al.
(1988) s.o. und Rodermel et al. (1988), s.o.
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Der
Ausdruck „funktionell
verbunden", wie
er hier verwendet wird, bezeichnet DNA-Sequenzen eines einzelnen
DNA-Moleküls, die
so zugeordnet sind, dass die Funktion der einen von der anderen
beeinflusst wird. Deshalb ist ein Promotor mit einer DNA funktionell
verbunden, wenn er die Transkription dieser DNA beeinflussen kann
(d.h. die DNA unterliegt der Transkriptionssteuerung des Promotors).
Der Promotor soll der DNA „vorgeschaltet" positioniert sein,
die wiederum dem Promotor „nachgeschaltet" positioniert sein
soll.
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Die
Transkriptionskassette kann in einem DNA-Konstrukt vorgesehen sein,
der ebenfalls mindestens ein Replikationssystem aufweist. Der Einfachheit
halber wird gewöhnlich
Replikationssystem funktional in Escherichia coli vorgesehen, wie
ColE1, pSC101, pACZC184 oder ähnlichen.
Auf diese Weise kann der entstehende Konstrukt in jeder Phase einer
beliebigen Manipulation geklont, sequentiert und auf die Richtigkeit der
Manipulation kontrolliert werden. Zusätzlich oder anstelle des E.coli
Replikationssystems können
eine ganze Reihe verschiedener Wirts-Replikationssysteme verwendet
werden, wie die Replikationssysteme des P-1-Unverträglichkeitsplasmids,
z.B., pRK290. Zusätzlich
zu den Replikationssystemen ist häufig mindestens ein Marker
vorgesehen, der in einem oder mehreren Wirten nützlich sein kann, oder auch
verschiedene Marker für
die einzelnen Wirte. Das heißt,
ein Marker kann für
die Auswahl in einem prokarzotischen Wirt verwendet werden, während ein
anderer Marker für
die Auswahl in einem eukaryotischen Wirt verwendet werden kann, insbesondere
dem pflanzlichen Wirt. Die Marker können gegen ein Pflanzenschutzmittel
schützen,
wie ein Antibiotikum, Gift, Schwermetall oder ähnlichem; sie können Komplementierungen
vorsehen, indem ein auxotropher Wirt mit Prototropie versehen wird;
oder dadurch, dass eine sichtbare Erscheinungsform durch die Herstellung
einer neuen Verbindung in der Pflanze vorgesehen wird.
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Die
verschiedenen Fragmente umfassen verschiedene Konstrukte, Transkriptionskassetten,
Marker und ähnliches,
die nach einander eingeführt
werden können,
indem Enzymspaltungen eines geeigneten Replikationssystems eingeschränkt werden
und bestimmte Konstrukte oder Fragmente in eine vorhandene Stelle eingefügt werden.
Nach der Ligierung und dem Klonen kann das DNA-Konstrukt für weitere
Manipulationen isoliert werden. All diese Techniken werden in der
Literatur ausreichend anhand von Beispielen dargestellt, wie beispielsweise
von J. Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd
Ed. 1989)(Cold Spring Harbor Laboratory).
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Vektoren,
die verwendet werden können,
um Pflanzengewebe mit erfindungsgemäßen Nukleinsäure-konstrukten
zu transformieren, umfassen sowohl Agrobacterium-Vektoren und Stoßvektoren
sowie Vektoren, die zur DNA-vermittelten Transformierung geeignet
sind.
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Der
Ausdruck „Promotor" betrifft einen Bereich
einer DNA-Sequenz,
der die notwendigen Signale zur effizienten Expression kodierter
Sequenzen enthält.
Dieser kann Sequenzen umfassen, an die sich eine RNA-Polymerase
bindet, ist aber nicht auf derartige Sequenzen beschränkt und
kann Bereiche umfassen, an die sich andere Steuerproteine zusammen
mit Bereichen anbinden, die sich mit der Steuerung der Proteintranslation
beschäftigen,
und können
kodierende Sequenzen umfassen.
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Promotoren,
die verwendet werden, die vorliegende Erfindung auszuführen, können konstitutiv
aktive Promotoren sein. Zahlreiche konstitutiv aktive Promotoren
stehen zur Verfügung,
die in Pflanzen funktionell sind. Ein bevorzugtes Beispiel ist der
Blumenkohl-Mosaik Virus (CaMV) 35S – Promotor, der in den meisten Pflanzenzellen
konstitutiv expliziert wird. Alternativ kann der Promotor auch ein
wurzelspezifischer Promotor oder ein wurzelcortexspezifischer Promotor,
wie nachstehend näher
erläutert.
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Antisense
Sequenzen wurden in transgenen Tabakpflanzen expliziert, die den
Blumenkohl-Mosaik Virus (CaMV) 35S Promotor verwenden. Siehe, z.B.,
Cornelissen et al., „Both
RNA Level and Translation Efficiency are Reduced by Anti-Sense RNA in Transgenic
Tobacco", Nucleic
Acids Res. 17, pp. 833-43 (1989); Rezaian et al., „Anti-Sense
RNAs of Cucumber Mosaic Virus in Transgenic Plants Assessed for
Control of the Virus",
Plant Molecular Biology 11, pp. 463-71 (1988); Rodermel et al., „Nuclear-Organelle
Interactions: Nuclear Antisense Gene Inhibits Ribulose Bisphosphate
Carboxylase Enzyme Levels in Transformed Tobacco Plants", Cell 55, pp. 673-81
(1988); Smith et al., „Antisense
RNA Inhibition of Polygalacturonase Gene Expression in Transgenic
Tomatoes", Nature
334, pp. 724-26 (1988); Van der Krol et al., „An Anti-Sense Chalcone Synthase
Gene in Transgenic Plants Inhibits Flower Pigmentation", Nature 333, pp.
866-69 (1988).
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Die
Verwendung des CaMV 35S Promotor ist bevorzugt für die Expression von CPTRase
in erfindungsgemäß transformierten
Tabakzellen und -pflanzen. Die Verwendung des CaMV-Promotors zur Expression
anderer rekombinanter Gene in Tabakwurzeln ist reichlich beschrieben
(Lam et al., „Site-Specific Mutations
Alter in Vitro Factor Binding and Change Promoter Expression Pattern
in Transgenic Plants",
Proc.
-
Nat.
Acad. Sci. USA 86, pp. 7890-94 (1989); Poulsen et al., „Dissection
of 5' Upstream Sequences
for Selective Expression of the Nicotiana plumbaginifolia rbcS-8S
Gene", Mol. Gen.
Genet. 214, pp. 16-23 (1988)).
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Andere
Promotoren, die nur in Wurzelzellen (wurzelspezifische Promotoren)
funktionell sind, sind ebenfalls für die erfindungsgemäßen Verfahren
besonders geeignet. Siehe, z.B., U.S. Patentschrift Nr. 5,459,252
von Conkling et al., Yamamoto et al., The Plant Cell, 3:371 (1991).
Der TobRD2 wurzelcortex-spezifische Promotor kann ebenfalls verwendet
werden. Siehe, z.B., die U.S. Anmeldung SN 08/508,786, die inzwischen
zugelassen wurde, von Conkling et al., PCT WO 9705261. Alle hier
herangezogenen Patente sind hierbei in Gänze durch Verweis eingeschlossen.
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Die
CPRTase rekombinierten DNA-Moleküle
und -Vektoren, die zur Herstellung der erfindungsgemäß transformierten
Tabakzellen und -pflanzen verwendet wurden, können außerdem ein dominantes, wählbares Marker-Gen
umfassen. Geeignete dominante, wählbare
Marker zur Verwendung in Tabak umfassen, unter anderen, antibiotikaresistente
Gene, die Neomycinphosphattransferase (NPTII), Hygromycinphosphotransferase (HPT)
und Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodieren. Ein anderer
bekannter, dominanter, wählbarer Marker,
der zur Verwendung in Tabak geeignet ist, ist ein mutantes Dihydrofolatreductase-Gen,
das methotrexatresistente Dihydrofolatreduktase kodiert. DNA-Vektoren,
die geeignete antibiotikaresistente Gene enthalten, und deren zugehörige Antibiotika
sind im Handel erhältlich.
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Transformierte
Tabakzellen werden aus dem sie umgebenden Gewebe nicht transformierter
Zellen ausgewählt,
indem eine Sammlung unterschiedlicher Zellen in ein Kulturmedium
gegeben wird, das eine geeignete Konzentration Antibiotika enthält (oder
andere, nomalerweise für
Tabakzellen giftige Verbindungen), gegen die die gewählten dominanten,
wählbaren
Markergen-Produkte resistent sind. Dadurch überleben und vermehren sich
nur solche Tabakzellen, die transformiert wurden.
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Verfahren,
die erfindungsgemäße rekombinante
Pflanzen herstellen, beginnen im allgemeinen indem eine regenerierbare
pflanzliche Zelle vorgesehen wird (normalerweise befindet sich eine
solche pflanzliche Zelle in einem regenerierbaren Gewebe). Die pflanzliche
Zelle wird dann mit einem DNA-Konstrukt transformiert, das eine
erfindungsgemäße Transkriptionskassette
umfasst (wie hier beschrieben) und aus der transformierten pflanzlichen
Zelle wird eine rekombinierte Pflanze regeneriert. Wie nachstehend
erläutert,
wird der Transformationsschritt mittels der Fachwelt bekannter Techniken
ausgeführt,
einschließlich
ohne Beschränkung
durch Beschießen
der pflanzlichen Zellen mit Mikropartikelchen, die die Transkriptionskassette
tragen, die die Zellen mit einem Agrobacterium tumefaciens infizieren,
das ein Ti-Plasmid enthält,
das die Transkriptionskassette trägt, oder einer anderen beliebigen
Technik, die geeignet ist, transgene Pflanzen herzustellen.
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Zur
Durchführung
der vorliegenden Erfindung sind zahlreiche Agrobacterium-Vektorsysteme
bekannt. Beispielsweise legt die U.S. Patentschrift Nr. 4,459,355
ein Verfahren zur Transformierung empfänglicher Pflanzen, einschließlich zweikeimblättriger
Pflanzen, mit einem Agrobacterium-Strang offen, das das Ti-Plasmid
enthält.
Die Transformation holziger Pflanzen mit einem Agrobacterium-Vektor
wird in der U.S. Patentschrift Nr. 4,795,855 offen gelegt. Desweiteren
legen die U.S. Patentschriften Nr. 4,940,838 von Schilperoort et
al. einen binären
Agrobacterium-Vektor offen (d.h., einen, in dem das Agrobacterium
ein Plasmid enthält, das
die vir-Region des Ti-Plasmids aber keine T-Region, und ein zweites Plasmid, das
eine T-Region aber keine vir-Region enthält), das zur Durchführung der
vorliegenden Erfindung geeignet ist.
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Mikropartikelchen,
die einen erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt tragen,
dessen Mikropartikelchen zur ballistischen Transformierung einer
pflanzlichen Zelle geeignet sind, können auch zur Herstellung erfindungsgemäß transformierter
Pflanzen verwendet werden. Das Mikropartikelchen wird in eine pflanzliche
Zelle geschossen, um eine transformierte pflanzliche Zelle herzustellen,
und aus der transformierten pflanzlichen Zelle wird eine Pflanze
regeneriert. Jegliches geeignete ballistische Zell-Transformations-Verfahren
und -geräte
können
zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geräte- und Verfahrensbeispiele werden
in Sanford and Wolf, U.S. Patentschrift Nr. 4,945,050 und in Christou
et al., U.S. Patentschrift Nr. 5,015,580 offen gelegt. Wenn ballistische
Transformationsverfahren verwendet werden, kann die Transkriptionskassette
in ein Plasmid eingebracht werden, das replizierbar ist, oder in
der zu transformierenden Zelle. Beispiele geeigneter Mikropartikelchen
zur Verwendung in derartigen Systemen umfassen 1 bis 5 μm Goldkügelchen.
Das DNA-Konstrukt kann durch eine beliebige, geeignete Technik auf
dem Mikropartikelchen aufgebracht werden, beispielsweise durch Abscheidung.
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Pflanzenarten
können
mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt durch eine
DNA-vermittelte Transformation von pflanzlichen Zellprotoplasten
transformiert werden und nachfolgender Regenerierung der Pflanze
aus den transformierten Protoplasten entsprechend in der Fachwelt
bekannter Verfahren. Die Fusion von Tabakprotoplasten mit DNA-enthaltenden
Liposomen oder mittels elektrochemischem Polieren ist in der Fachwelt
bekannt (Shillito et al., „Direct
Gene Transfer to Protoplasts of Dicotyledonous and Monocotyledonous
Plants by a Number of Methods, Including Electroporation", Methods in Enzymology
153, pp. 313-36 (1987).
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In
der vorliegenden Anwendung bezieht sich Transformation auf die Einführung exogener
DNA in Zellen, um transgene Zellen herzustellen, die mit der exogenen
DNA stabil transformiert wurden.
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Transformierte
Zellen werden mittels Anwendung von Tabakzellen und in der Fachwelt
bekannter Zellkultur-Verfahren
eingeführt,
um intakte Tabakpflanzen zu regenerieren. Das Verfahren zur Pflanzenregenerierung
wird so gewählt,
dass es mit den Transformationsverfahren verträglich ist. Die stabile Anwesenheit
und die Ausrichtung der CPRTase-Sequenz in transgenen Tabakpflanzen
kann anhand der CPTRase Sequenz durch die Mendelschen Erbgesetze
bestätigt
werden, wie es sich durch in der Erblehre verwendete Standardverfahren
der DNA-Analyse aus Kontrollkreuzungen ergibt. Nach der Regenerierung
transgener Tabakpflanzen aus transformierten Zellen, wird die eingeführte DNA-Sequenz
auf einfache Weise mittels herkömmlicher Pflanzenzuchtverfahren
und ohne unnötige
Experimente auf andere Tabaksorten transferiert.
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Beispielsweise
kann man zur Analyse der Trennung des Transgens regenerierte transformierte
Pflanzen (R0) zur Reife kultivieren, auf
Nikotinkonzentrationen testen und durch Selbstbestäubung vermehren,
um R1-Pflanzen herzustellen. Ein Teil der
R1-Pflanzen, die das Transgen tragen, sind
für das
Transgen homozyg. Um homozyge R1-Pflanzen zu identifizieren,
werden transgene R1-Pflanzen zur Reife kultiviert
und durch Selbstbestäubung
vermehrt. Homozyge R1-Pflanzen produzieren
R2-Nachkommen, wobei jede Nachkommenspflanze
das Transgen trägt;
die Nachkommen heterozyger R1-Pflanzen trennen
sich im Verhältnis
3:1.
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Da
Nikotin als ein natürliches
Pestizid wirkt, hilft es, Tabakpflanzen vor Beschädigung durch
Ungeziefer zu schützen.
Es kann deshalb wünschenswert
sein, zusätzlich
Pflanzen, die durch die vorliegenden Verfahren niedrigen oder gar
keinen Nikotinanteil aufweisen, mit einem Transgen (wie dem Bacillus
thuringiensis) zu transformieren, der zusätzlichen Schutz vor Insekten
bietet.
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Eine
für das
vorliegende Verfahren bevorzugte Pflanze ist die Art Nicotiana,
oder Tabak, einschliesslich N. Tabacum, N. Rustica und N. Glutinosa.
Beliebige Tabakstränge
oder – Sorten
können
verwendet werden. Bevorzugt werden Stränge, die bereits einen niedrigen
Nikotingehalt aufweisen, wie die Nic1/Nic2 – Doppelmutanten.
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Mit
einem erfindungsgemäßen Vektor
kann ein beliebiges pflanzliches Gewebe, das sich anschließend geklont
fortpflanzen kann, unabhängig
von Organogenese oder Embryogenese, transformiert werden. Der Ausdruck „Organogenese", wie er hier verwendet
wird, bezeichnet ein Verfahren, durch das sich Triebe und Wurzeln
nacheinander aus meristematischen Kernen entwickeln; der Ausdruck „Embryogenese", wie er hier verwendet
wird, bezeichnet ein Verfahren, durch das sich Triebe und Wurzeln
auf konzertierte Art gemeinsam entwickeln (nicht nacheinander),
unabhängig
ob somatische oder geschlechtliche Zellen vorliegen. Das bestimmte
ausgewählte
Gewebe hängt
von dem vorhandenen und am besten geeigneten geklonten Fortpflanzungssystem
für die
bestimmte zu transformierende Art ab. Anvisierte Gewebebeispiele
umfassen Blattscheiben, Pollen, Embryos, Cotyledons, Hypocotyle,
Hautgewebe, bestehendes Stammzellen-Gewebe (z.B. Wurzelhauptstamm-Zellen, Hilfsknospen,
und Wurzelstämme)
und eingeführtes
Stammzellengewebe (z.B., Keimblatt-Stammzellen und Subkeimblatt-Stammzellen).
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Erfindungsgemäße Pflanzen
können
eine Reihe verschiedener Formen aufweisen. Die Pflanzen können Kombinationszüchtungen
transformierter Zellen und nicht transformierter Zellen sein; die
Pflanzen können geklonte
Transformanten sein (z.B., alle Zellen wurden transformiert, um
die Transkriptionskassette zu enthalten); die Pflanzen können Pfropfen
transformierten und nicht transformierten Gewebes enthalten (z.B.,
einen transformierten Wurzelstock, der auf einen nicht transformierten
Ballen einer Zitronenart transformiert wurde). Die transformierten
Pflanzen können
sich auf vielfache Weise vermehren, wie durch geklonte Fortpflanzung oder
klassische Züchtungstechniken.
Beispielsweise kann sich die erste Generation (oder T1) transformierter Pflanzen
mittels Selbstbestäubung
fortpflanzen, um eine homozytische zweite Generation (oder T2) transformierter
Pflanzen zu erhalten, und die T2 Pflanzen können sich dann durch klassische
Züchtungstechniken
weiter fortpflanzen. Ein dominanter, wählbarer Marker (wie der nptll)
kann zur Unterstützung
der Züchtung
der Transkriptionskassette zugeordnet werden.
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Im
Hinblick auf das oben dargestellte ist es offensichtlich, dass die
Pflanzen, an denen die vorliegende Erfindung ausgeführt werden
können,
auch diejenigen der Gattung Nicotiana einschliessen.
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Ein
Fachmann in den oben beschriebenen rekombinanten DNA-Verfahren erkennt,
dass ein CPRTase cDNA Molekül
ganzer Länge
oder ein CPTRase Chromosomen-Gen ganzer Länge verwendet werden kann, das
mit geeigneten funktionell verbundenen Steuersequenzen in Leserichtung
verbunden wird, um transgene Tabakzellen und -pflanzen zu konstruieren.
(Ein Fachmann wird auch erkennen, dass geeignete Steuersequenzen
zur Expression von Genen in Leserichtung zusätzlich zu den oben beschriebenen
Promotor- und Polyadenylations-/Transkriptionsterminierungs-Sequenzen
auch alle bekannten Anfangssequenzen von Kernzellen-Translationen einschliessen.
Derartige transformierte Tabakpflanzen sind durch erhöhte CPRTase-Werte gekennzeichnet,
und damit durch höhere
Nikotinkonzentrationen als nicht-transformierte Kontroll-Tabakpflanzen.
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Es
ist deshalb verständlich,
dass die Verwendung von CPRTase DNA – Sequenzen zur Verringerung oder
Erhöhung
der CPRTase-Enzym – Werte
und dadurch die Verringerung oder Erhöhung der Nikotinwerte in Tabakpflanzen,
im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt.
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Wie
hier verwendet, umfasst eine Ernte eine Vielzahl an erfindungsgemäßen Pflanzen,
die gleichen Geschlechts sind und zusammen auf einem landwirtschaftlichen
Feld angebaut werden. Ein „landwirtschaftliches
Feld" bezeichnet
ein gemeinsames Stück
Erde oder ein Gewächshaus.
Deshalb sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
einer Pflanzenernte vor, die geänderte
CPRTase-Aktivitäten
aufweist und deshalb erhöte
oder verringerte Nikotinwerte aufweist im Vergleich zu ähnlichen
Ernten nicht-transformierter
Pflanzen der gleichen Gattung und Sorte.
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Die
nachfolgenden Beispiele sind zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung
aufgefürt
und sollen nicht als Einschränkung
darauf betrachtet werden.
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BEISPIEL 1
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Isolierung und
Sequentierung
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TobRD2cDNA(Conkling
et al., Plant Phys. 93, 1203 (1990)) wurde sequentiert und ist hier
als SEQ ID NO:1 und die abgeleitete Aminosäuresequenz als SEQ ID NO:2
vorgesehen. Der abgeleiteten Aminosäuresequenz ging ein cytosoles
Protein voraus. Obwohl pflanzliche CPRase-Gene nicht nachgewiesen
wurden, zeigen Vergleiche von NtPT1-Aminosäuresequenzen mit der GenBank
Datenbank (3) in begrenztem
Umfang Sequenzähnlichkeiten
mit bestimmten bakteriellen und anderen Proteinen; Chinolatphosphoribosyltransferase
(CPRTase)- Aktivitäten
wurden für
die S.typhimurium, E.coli. und N. Tabacum-Gene nachgewiesen. Die mit
NtCPT1 kodierte CPTase weist Ähnlichkeiten
zu den abgeleiteten Peptidfragmenten auf, die durch eine Arabidopsis
EST (Expressionssequenztab) – Sequenz
kodiert wird (Genbank Zugangs-Nr. F20096), was einen Teil des Arabidopsis
CPTase-Gens darstellen kann.
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BEISPIEL 2
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In-Situ Hybridisierung
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Um
die räumliche
Verteilung von TobRD2 mRNA-Transkriptionen in den verschiedenen
Wurzelgeweben zu bestimmen, wurden in situ Hybridisierungen an nicht-transformierten
Pflanzen vorgenommen. In-situ Hybridisierungen des Antisense-Strangs
von TobRD2 zu TobRD2 mRNA in Wurzelgewebe wurde mittel Techniken
durchgeführt,
die in Meyerowitz, Plant Mol. Bio. Rep. 5,242 (1987) und Smith et
al., Plant Mol. Biol. Rep. 5,237 (1987) beschrieben wurden. Die
Wurzeln von sieben Tage alten Tabak- (Nicotania tabacum) Setzlingen wurden
auf phosphatgepuffertes Glutaraldehyd aufgebracht, in Paraplast
Plus (Monoject Inc., St. Louis, MO) eingebettet und auf 8mm Dicken
unterteilt, um sowohl Längs-
als auch Querschnitte zu erhalten. Antisense-TobRD2-Transkriptionen,
die in Gegenwart von 35S-ATP in vitro synthetisiert wurden, wurden
als Proben verwendet. Die markierte RNA wurde mit einer Alkalibehandlung
hydrolysiert, um vor der Verwendung durchschnittliche Massenlängen von
100 bis 200 Basen zu erhalten.
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Die
Hybridisierungen wurden in 50%igem Formamid innerhalb 16 Stunden
bei 42°C
vorgenommen, wobei etwa 5 × 106 Teile der bezeichneten RNA pro Minute (cpm)
pro Milliliter hybridisierter Lösung
gezählt wurden.
Nach Exponierung wurden die Objektträger entwickelt und unter heller
und dunkler Feldmikroskopie betrachtet.
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Das
Hybridisierungssignal wurde auf der cortischen Zellebene in den
Wurzeln lokalisiert (Ergebnisse nicht dargestellt). Vergleiche der
beiden hellen und dunklen Feldbilder der gleichen Abschnitte lokalisierten TobRD2-Transkriptionen der
Parenchymat-Zellen des Wurzelcortex. In der Epidermis des Stengels
war kein Hybridisierungssignal sichtbar.
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BEISPIEL 3
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TobRD2 mRNA – Werte
in Nic1 und Nic2 – Tabakmutanten
und die Beziehung zu Nikotinwerten
-
Gleich
bleibende mRNA-Werte von TobRD2 wurden in Nic1 und Nic2-mutierten
Tabakpflanzen untersucht. Von Nic1 und Nic2 ist bekannt, dass sie
Chinolatphosphoribosyl-transferase-Aktivitäten und Putrescencemethyltransferase-Aktivitäten steuern,
und dass sie zusammen dominante Regulatoren der Nikotinproduktion
sind. Die vorliegenden Ergebnisse sind in den Figuren 5A und 5B
dargestellt und zeigen, dass TobRD2 Expression durch Nic1 und Nic2
gesteuert wird.
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RNA
wurde aus den Wurzeln von Tabakpflanzen der wilden Sorte Burley
21 isoliert (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2); Wurzeln von Nic1-Burley 21 (nic1/nic1
Nic2/Nic2), Wurzeln von Nic2 – Burley
21 (Nic1/Nic1 nic2/nic2); und Wurzeln von Nic1-Nic2-Burley 21 (nic1/nic1
nic2/nic2).
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Vier
Burley 21 Tabaklinien (nic) wurden über einen Monat in Erde aus
Samen kultiviert und einen Monat lang in einem Gewächshaus
in hydropone Kammern in belüftete
Nährstofflösung transferiert.
Diese Linien waren genetisch gleich, mit Ausnahme der beiden nikotinarmen
Stellen, und wiesen Erscheinungsformen von Nic1/Nic1 Nic2/Nic2,
Nic1/Nic1 nic2/nic2, nic1/nic1 Nic2/Nic2, nic1/nic1 nic2/nic2 auf.
Aus etwa 20 Pflanzen wurden für
jede Erscheinungsform Wurzeln gewonnen und zur RNA-Isolierung gesammelt.
Die gesamte RNA (1 μg)
jeder Erscheinungsform wurde durch ein 1%iges Agarose-Gel elektrophoresziert,
das 1,1 M Formaldehyd enthielt und auf eine Nylonmembran gemäß Sambrook
et al. (1989) transferiert. Die Membrane wurden mit 32P-bezeichneten
TobRD2 cDNA-Fragmenten hybridisiert. Die relative Intensität von TobRD2-Transkripts wurden
mittels Densiometrie gemessen. 5 (absteigende
Schraffierung) zeigt die relative Transkriptkonzentration (verglichen
mit Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) jedes der vier Erscheinungsformen auf.
Die relative Nikotinkonzentration (verglichen mit Nic1/Nic1 Nic2/Nic2)
der vier Erscheinungsformen sind durch die aufsteigende Schraffierung
dargestellt.
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5 vergleicht grafisch die
relativ gleich bleibenden TobRD2 mRNA-Werte, indem die in wilden
Burley 21 Arten (Nic1/Nic1 Nic2/Nic2) gefundenen Werte als Referenzwerte
verwendet werden. Die TobRD2 mRNA-Werte in Nic1/Nic2-Doppelmutanten betrugen
etwa 25% derer wilder Tabaksorten. Figur 5B vergleicht weiter die
relativen Nikotinwerte in den nahezu gen-gleichen Tabakreihen, die
in dieser Studie untersucht wurden (absteigende Schraffuren zeigen
TobRD2-Transkriptionswerte;
aufsteigende Schraffuren zeigen Nikotinwerte). Es gab eine enge
Verbindung zwischen den Nikotinwerten und den TobRD2-Transkriptionswerten.
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BEISPIEL 4
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Die Auswirkung des Stutzens
auf TobRD2 mRNA-Werte
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In
der Fachwelt ist allgemein bekannt, dass das Entfernen der Blütenköpfe von
Tabakpflanzen (Stutzen) das Wurzelwachstum fördert und den Nikotingehalt
der Blätter
dieser Pflanze erhöht.
Das Stutzen der Pflanzen ist eine Standardpraxis in kommerziellem
Tabakanbau, und der optimale Zeitpunkt des Stutzens einer gegebenen
Tabakpflanze kann bei einer bestimmten Anzahl bekannter Bedingungen
von einem Fachmann einfach bestimmt werden.
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Tabakpflanzen
(N. Tabacum SR1) wurden einen Monat lang aus Samen in Erde gezogen
und in Töpfe mit
Sand verpflanzt. Die Pflanzen wurden weitere zwei Monate im Gewächshaus
kultiviert bis sie anfingen, Knospen anzusetzen. Die Blüten und
zwei Knoten wurden dann von vier Pflanzen entfernt (gekappt). Von
jeder Pflanze wurde nach der angegeben Zeit ein Abschnitt der Wurzeln
geerntet und zur RNA-Extrahierung gesammelt. Die Kontrollpflanzen
wurden nicht gestutzt. Die gesamte RNA (1 μg) eines jeden Zeitpunkts wurde
mittels 1%igem Agarose-Gel elektrophoresziert, das 1,1 M Formaldehyde
enthält,
und auf eine Nylonmembran gemäß Sambrook,
et al. (1989) transformiert. Die Membranen wurden mit 32P-bezeichneten
TobRD2 cDNA Fragmenten hybridisiert. Die relative Intensität der TobRD2-Transkriptionen
wurden mittels Densitometrie gemessen. 6 zeigt die relativen Transkriptionskonzentrationen
(im Vergleich zum Nullpunkt) eines jeden Zeitpunkts für gestutzte
(absteigende Schraffierung) oder nicht gestutzte Pflanzen (aufsteigende
Schraffierung).
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Die
relativen TobRD2-Konzentrationen von Wurzelgewebe wurden über 24 Stunden
bestimmt; die Ergebnisse sind in 6 dargestellt
(absteigende Schraffuren zeigen TobRD2-Transkriptionskonzentrationen gestutzter
Pflanzen an; aufsteigende Schraffuren zeigen die TobRD2-Transkriptionskonzentrationen
nicht gestutzter Kontrollen an.) Innerhalb von sechs Stunden nach
dem Stutzen der Tabakpflanzen steigen in den gestutzten Pflanzen
die mRNA-Konzentrationen
von TobRD2 um etwa das achtfache; in den Kontrollpflanzen wurde
in der gleichen Zeit kein Anstieg festgestellt.
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BEISPIEL 5
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Romplementierung bakterieller
Mutanten Fehlende CPRTase in DNA von SEQ ID NO:1
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Der
Escherichia coli Strang TH265 ist ein Mutant, dem Chinolatphosphoribosyltransferase
(nadC-) fehlt, und kann deshalb nicht auf Medien wachsen, denen
Nikotinsäuren
fehlen.
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TH265-Zellen
wurden mit einem Expressionsvektor (pWS161) transformiert, der DNA
von SEQ ID NO:1 enthält,
oder ausschließlich
mit dem Expressionsvektor (pKK233) transformiert. Das Wachstum der transformierten
Bakterien wurde mit dem Wachstum der TH265 (pKK233) Transformanten
verglichen und mit dem Wachstum des nicht-transformierten TH265
nadC-Mutanten. Das Wachstum wurde auf ME Minimalmedium (dem Nikotinsäure fehlt)
und auf ME Minimalmedium mit zugesetzter Nikotinsäure verglichen.
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Der
E. Coli Strang mit der CPTase-Mutation (nadC), TH265, wurde freundlicherweise
von Dr. K.T.Hughes (Hughes et al., J. Bact. 175:479 (1993) bereit
gestellt. Die Zellen wurden auf LB-Medium unterhalten und kompetente
Zellen wurden wie in Sambrook et al (1989) beschrieben präpariert.
Ein Expressionsplasmid wurde in pKK2233 konstruiert (Brosius, 1984),
wobei die TobRD2 cDNA unter der Kontrolle des Tac Promotor geklont
wurden. Das resultierende Plasmid, pWS161, wurde in TH265-Zellen
transformiert. Die transformierten Zellen wurden dann auf Minimalmediums-Agarplatten
mit und ohne dem Hilfsstoff Nikotinsäure (0,0002) aufgetragen (Vogel
und Bonner, 1956). TH265-Zellen alleine und TH265, das mit pKK2233
transformiert wurde, werden auf ähnliche
Platten aufgetragen, um als Kontrolle zu dienen.
-
Die
Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Nur das TH265, das mit DNA von SEQ ID NO:1 transformiert war, gedieh
in dem Medium ohne Nikotinsäure.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die Expression von DNA auf SEQ
ID NO:1 in TH265-Bakterienzellen
auf das NadC+ dieser Zellen überträgt, und
bestätigt
damit, dass diese Sequenz CPRTase kodiert. Die TobRD2-Nomenklatur
wurde deshalb in NtCPT1 abgeändert.
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BEISPIEL 6
-
Transformierung
von Tabakpflanzen
-
DNA
von SEQ ID NO:1 in Antisense-Richtung ist funktionell mit einem
pflanzlichen Promotor (CaMV 35S oder TobRD2 wurzelcortex-spezifischen
Promotor) verbunden, um zwei verschiedene DNA-Kassetten herzustellen:
CaMV35S Promotor/Antisense SEQ ID NO:1 und TobRD2 Promotor/Antisense
SEQ ID NO:1.
-
Ein
Tabakstamm einer wilden Sorte und ein nikotinarmer Tabakstamm werden
zur Transformierung ausgewählt,
z.B. ein wilder Burley 21 Tabak (Nic1+/Nic2+) und homozyger nic1/nic2-Burley
21. Eine grosse Anzahl an pflanzlichen Tabakzellen jeden Stamms
werden mit jeder der DNA-Kassetten transformiert. Die Transformation
wird mittels eines Agrobacterium-Vektor durchgeführt, d.h., ein binärer Agrobacterium-Vektor trägt eine
Ti-Randsequenz und das nptll-Gen (das Widerstand gegen Kanamycin
unter der Kontrolle des nos-Promotors (nptll)überträgt).
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Transformierte
Zellen werden ausgewählt
und in transgene Tabakpflanzen regeneriert (R0).
Die R0-Pflanzen werden zur Reife kultiviert
und auf ihre Nikotinkonzentration geprüft; eine Teilgruppe der transformierten
Tabakpflanzen zeigten deutlich niedrigere Nikotinkonzentrationen
verglichen mit nicht-transformierten Kontrollpflanzen.
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R0-Pflanzen werden dann mit Selbstbestäubung vermehrt
und die Teilung der Transgene in der R1-Nachkommenschaft
wird analysiert. R1-Nachkommen werden zur
Reife kultiviert und mit Selbstbestäubung vermehrt; die Trennung
der Transgene unter den R2-Nachkommen zeigt an, welche R1-Pflanzen für das Transgen homozyg sind.
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Sequenzliste
-
(1) Allgemeine Informationen:
-
- (i) Anmelder: Conking, Mark A Mendu, Nandini
Song, Wen
- (ii) Titel der Erfindung: Steuerung der Chinolatphosphoribosyltransferase-Expression
- (iii) Anzahl der Sequenzen: 4
- (iv) Korrespondenzanschriften:
(A) Adressat: Kenneth Sibley.
Bell Seltzer Park & Gibson
(B)
Strasse: Post Office Drawer 34009
(C) Stadt: Charlotte
(D)
Bundesstaat: North Carolina
(E) Staat: USA
(F) PLZ: 28234
- (v) Elektronische Version:
(A) Art des Mediums: Floppy
disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem:
PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1.0. Versino
#1.30
- (vi) Aktuelle Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer
(B)
Anmeldedatum
(C) Klassifizierung
- (viii) Informationen zur Rechtsvertretung
i. Name: Sibley,
Kenneth D.
ii. Anmeldenummer: 31.665
iii. Aktenzeichen/Docket-Nr.
5051-338P
b. Telekommunikationsdaten:
i. Telefon: 919-420-2200
ii.
Telefax: 919-881-3175
- (ix) Informationen zur SEQ ID NO:1:
a. Sequenzeigenschaften:
i.
Länge:
1399 Basispaare
ii. Art: Nukleinsäure
iii. Strangart: Einzel
iv.
Topologie: linear
- (ii) Molekülart:
cDNA
- (ix) Eigenschaft:
(A) Name/Schlüssel: CDS
(B) Position:
52..1104
-
(xi)
Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:1
-
-
(2) Information zu SEQ ID
NO:2:
-
- (i) Sequenzeigenschaften:
- (ii)
(A) Länge:
351 Aminosäuren
(B)
Art: Aminosäure
(C)
Topologie: linear
- (iii) Molekülart:
Protein
-
(xi)
Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:2:
-
-
(2) Information zu SEQ ID
NO:3:
-
- (i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 1053
Basispaare
(B) Art: Aminosäure
(C)
Strangart: Einzel
(D) Topologie: linear
- (iv) Molekülart:
cDNA
-
(xi)
Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO:3:
-