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Technisches
Gebiet
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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung
zum Separieren von Makromolekülen
durch Elektrophorese, insbesondere durch isoelektrisches Fokussieren.
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Technischer
Hintergrund
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Zweidimensionale (2D-)Elektrophorese
ist ein nützliches
und bekanntes Trennverfahren zum Reinigen von Makromolekülen und
zum Trennen komplexer Makromolekülgemische,
welches häufig eine
viel höhere
Auflösungsleistung
bietet als typische elektrophoretische Trennung in einer Dimension
oder einer Richtung.
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Bei der zweidimensionalen Elektrophorese erfolgt
das Separieren unter zwei verschiedenen Bedingungen oder nach Maßgabe von
zwei unterschiedlichen Separierungsparametern, einer in einer ersten
Richtung, der andere in einer zweiten Richtung, üblicherweise rechtwinklig zu
der ersten Richtung. Die erste Dimension der Separierung erfolgt
typischerweise in einem länglichen,
stabförmigen
oder streifenförmigen
Gel, wobei die Migration und Trennung von Makromolekülen in Längsrichtung
des Gels stattfindet. Nachdem sich die Makromoleküle erst einmal
in einzelnen Zonen in Längsrichtung
des Gels gruppiert haben, wird das Gel entlang einem Rand eines
Slab-Gels platziert, und der elektrische Strom wird quer zu den
beiden Gelen in einer Richtung rechtwinklig oder anderweitig quer
zu dem ersten (länglichen)
Gel eingeprägt.
Dies veranlasst die Migration der Makromoleküle aus jeder Zone des länglichen
Gels in den Slab-Gel und die Separierung von Makromolekülen innerhalb
jeder Zone.
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Man kann eine Vielfalt von Kombinationen für die Separierungen
in der ersten und der zweiten Dimension einsetzen. An die Separierung
durch Ladung oder pI kann sich die Separierung basierend auf beispielsweise
dem Molekulargewicht anschließen. In ähnlicher
Weise kann sich an die Separierung in einem Gel der einen Konzentration
eine Separierung in einem Gel des gleichen Materials mit einer anderen Konzentration
anschließen.
Zweidimensionale Separierungen wurden ebenfalls dazu eingesetzt,
eine schrittweise Änderung
im pH-Wert hervorzurufen, um zunächst
in einem homogenen Gel und dann in einem Poren-Gradientengel zu
separieren, um in Medien zu separieren, die als erstes einen Proteinlöser und
dann einen anderen Löser
enthalten, oder in Medien, die einen Proteinlöser zuerst in einer Konzentration
und dann in einer anderen Konzentration enthalten, um als erstes
in einem diskontinuierlichen Puffersystem und dann in einem kontinuierlichen
Puffersystem zu separieren, und um zuerst durch isoelektrisches
Fokussieren und dann durch homogene oder Poren-Gradientenelektrophorese
zu separieren. Kombinationen aus diesen Möglichkeiten können dazu
benutzt werden, zahlreiche Arten von Makromolekülen zu separieren, einschließlich Seren
oder Zellproteine, bakterielle Proteine, nicht-histone Chromatinproteine,
Ribosomal-Proteine, Gemischen aus Ribonucleinproteinen und Ribosomal-Proteinen,
Glycoproteine und Nucleinsäuren.
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Es gibt zahlreiche Schwierigkeiten
und Nachteile bei existierenden Geräten, die mit immobilisierten
pH-Gradienten (IPGs) arbeiten können.
Es gibt keine Möglichkeit
zum Rehydrieren der IPGs innerhalb der Vorrichtung. Sämtliche
handelsüblichen Systeme
besitzen Elektroden, die abnehmbar sind und daher beim Einsatz möglicherweise
nicht korrekt platziert werden. Zahlreiche der Elektroden sind nachgiebig,
was zu einem schlechten elektrischen Kontakt führen kann. Aufgrund der Abmessungen und
Konfiguration der verfügbaren
Geräte
erfordern diese eine relativ große Menge Paraffinöl (etwa
250 ml). Dies führt
nicht nur zu Kosten beim Entsorgen des Öls, sondern erfordert außerdem ein
intensives Spülen
zwischen einzelnen Durchläufen
und nach jeder Benutzung. Aufgrund des nicht zusammenhängenden
Entwurfs laufender Systeme besitzen diese relativ große Stellflächen und
erfordern dementsprechend viel Arbeitsplatz auf dem Labortisch.
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Ein weiterer Nachteil zweidimensionaler Elektrophoresesysteme
ist der, dass sie arbeitsin- tensiv und zeitraubend sind. Langgestreckte
Gele sind kompliziert in der Handhabung, ihr Einsatz ist fehleranfällig und
außerdem
anfällig
für einen
Verlust von Proben und Zeit. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung
haben jetzt eine neue Elektrophoresevorrichtung entwickelt, die
sich zum Betreiben von IPGs eignet.
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Die
US
4 151 065 offenbart eine Elektrophoresevorrichtung mit
einem herausnehmbaren Behälter.
Die Vorrichtung dient für
den Einsatz bei horizontaler Gel-Elektrophorese und eignet sich
nicht für
laufende IPGs.
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Die
EP
457 526 zeigt eine Elektrophoresevorrichtung mit einem
herausnehmbaren Behälter,
in einem Ende des Behälters
befindliche Puffervertiefungen und abnehmbaren Elektrodenhaltern.
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Offenbarung
der Erfindung
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In einem ersten Aspekt besteht die
Erfindung in einer Elektrophoresevorrichtung zur gleichzeitigen elektrophoretischen
Separierung einer Mehrzahl von Komponentengemischen, wobei die Vorrichtung
aufweist:
einen von der Vorrichtung lösbaren und abnehmbaren Behälter, der
mehrere Rinnen bildet, von denen jede Rinne so geformt ist, dass
sie einen länglichen Streifen
eines isoelektrischen Fokussiermediums sowie ausreichend Flüssigkeit
zum Eintauchen des länglichen
Streifens aufnimmt;
einen Rahmen zum Halten des Behälters in
einer vorbestimmten Stellung;
ein Paar Haltestäbe, die
an oder in der Nähe
jedes Endes des Behälters
positionierbar sind, wobei jeder Haltestab mehrere herabhängende Elektroden
haltert und derart angeordnet ist, dass jede Elektrode mit jeder
Rinne des Behälters
ausgerichtet und in ihr gelegen ist, wenn der Behälter sich
in einer vorbestimmten Stellung befindet, wobei diese Elektroden sich
nahe den jeweiligen Enden des Behälters befinden, und
elektrisch
leitende Verbindungsmittel zum Anschließen an eine Einrichtung, mit
der zwischen den Elektroden an einem Haltestab und den Elektroden
an dem anderen Haltestab ein elektrisches Potential eingerichtet
wird.
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In einer bevorzugten Form ist der
Behälter mit
in den Rinnen positionierten Elektroden und mit an einem Ende der
Leitungen angeordneten elektrischen Anschlüssen ausgestattet. Wenn der
Behälter in
den Rahmen eingesetzt wird, treten die Anschlüsse mit dort befindlichen Stecken
in Verbindung, so dass zwischen den Leitungen ein elektrisches Potential
entstehen kann.
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Ein Hauptvorteil der Erfindung besteht
darin, dass sie ermöglicht,
den Behälter
entsorgbar zu machen, obschon Behälter möglichst für mehrfachen Gebrauch vorgesehen
sein sollten, falls dies erwünscht
ist. Im Fall von Wegwerfbehältern,
die Elektroden enthalten, kann jedes geeignete leitende Material
als Elektrode verwendet werden, welches mit der Elektrophorese kompatibel
ist, obschon natürlich billigere
Elektroden wie solche aus Graphit Platinelektroden zu bevorzugen
wären,
wenn der Behälter nach
dem Gebrauch weggeworfen wird.
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Vorzugsweise wird der Behälter aus
einem wärmedurchlässigen Material
hergestellt, um eine Temperatursteuerung der Rinnen über den
Behälter hinweg
zu ermöglichen.
In einer Form enthält
der Behälter 3 bis 24,
vorzugsweise 6 bis 18 im wesentlichen parallele
Rinnen. Die Rinnen haben vorzugsweise gleiche Längen, jeweils von 6 cm bis
20 cm. Allerdings sieht man, dass der Behälter jede beliebige Anzahl
von Rinnen aufnehmen kann, und dass die Rinnen jede geeignete Länge und
Tiefe besitzen können.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß dem ersten
Aspekt ermöglicht
folglich das Stapeln mehrerer Behälter und das gleichzeitige
Ausführen mehrerer
Separierungen. Die Behälter
sind zur Bestückung
und dergleichen abnehmbar und werden dann einfach in einen geeigneten
Rahmen eingesteckt, der sich zur Aufnahme einer Reihe von horizontal
gestapelten Behältern
eignet. Damit kann man mit einer Stromversorgung für mehrere
Behälter
auskommen.
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Alternativ können mehrere den Rahmen mit dem
angebrachten Behälter
enthaltende Vorrichtungen gestapelt werden, um gleichzeitige Separierungen
vorzunehmen.
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Im Betrieb wird jeder längliche
Streifen eines isoelektrischen Fokussiermediums, der in einer Rinne
platziert ist, dem elektrischen Potential ausgesetzt. Die elektrisch
leitende Verbindungseinrichtung kann die Form elektrischer Leitungen
haben, die an den Elektroden anbringbar sind, um die Elektroden mit
einer geeigneten Spannungsquelle zu verbinden. In einem damit in
Zusammenhang stehenden Aspekt besteht die Erfindung in einer Elektrophoresevorrichtung
zur gleichzeitigen elektrophoretischen Trennung mehrerer Komponentengemische,
wobei die Vorrichtung aufweist:
einen abnehmbaren Behälter, der
mehrere Rinnen enthält,
von denen jede Rinne so geformt ist, dass sie einen länglichen
Streifen eines isoelektrischen Fokussiermediums sowie ausreichend
Flüssigkeit
zum Eintauchen des länglichen
Streifens aufnimmt;
einen Rahmen zum Halten des Behälters in
einer im wesentlichen horizontalen Stellung;
ein Paar Halteelemente,
die drehbar an dem Rahmen gelagert sind, so dass, wenn der Behälter dort
aufgenommen ist, jedes Halteelement die mehreren Rinnen überspannt,
jedes Halteelement mehrere Elektroden haltert, die derart angeordnet
sind, dass eine Elektrode von jedem Halteelement mit jeder der mehreren
Rinnen fluchtet;
eine Einrichtung zum Drehen jedes Halteelements zwischen
einer ersten Stellung, in der sämtliche
daran befindlichen Elektroden sich in die Rinnen hinein erstrecken,
und einer zweiten Stellung, in der sämtliche daran befindlichen
Elektroden von den Rinnen abgerückt
sind; und
elektrisch leitende Verbindungsmittel zum Anschließen an eine
Einrichtung, mit der zwischen den Elektroden an einem Halteelement
und den Elektroden an dem anderen Halteelement ein elektrisches
Potential eingerichtet wird.
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Vorzugsweise besitzt jedes der Halteelemente
eine Drehachse quer zu den parallelen Rinnen. Die Vorrichtung kann
weiterhin eine Einrichtung zum Vorspannen jedes Halteelements in
die erste Stellung aufweisen. Die Halteelemente können zusätzlich zu
ihrer drehbaren Lagerung an dem Rahmen auch bewegbar derart an dem
Rahmen gelagert sein, dass sie voneinander mit einem veränderlichen Abstand
angeordnet sind.
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Vorzugsweise ist der Rahmen aus einem wärmedurchlässigen Material
gefertigt, um eine Temperatursteuerung der Rinnen über den
Rahmen hinweg zu ermöglichen.
In einer Form enthält
der Rahmen 3 bis 24, vorzugsweise 6 bis 18 im
wesentlichen parallele Rinnen. Die Rinnen haben vorzugsweise gleiche
Länge,
jeweils von 6 cm bis 20 cm.
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Die elektrisch leitenden Verbindungsmittel können elektrische
Leiter sein, die an den Elektroden anbringbar sind, um die Elektroden
mit einer passenden Energiequelle zu verbinden.
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Gemäß einem dritten Aspekt besteht
die Erfindung in einem Verfahren zum Separieren eines Makromoleküls, umfassend
das Unterziehen des Makromoleküls
einer Elektrophorese in einer Vorrichtung gemäß dem ersten oder dem zweiten
Aspekt der Erfindung.
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Wenn der Kontext nichts anderes erfordert, bedeutet
in dieser Spezifikation der Ausdruck „umfassen" oder Abwandlungen wie „umfasst" oder „umfassend" die Einbeziehung
eines angegebenen Elements oder einer Einheit oder einer Gruppe
von Elementen oder Einheiten, nicht jedoch den Ausschluß eines
weiteren Elements oder einer Einheit oder einer Gruppe von Elementen
oder Einheiten.
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Zum besseren Verständnis der
Erfindung werden bevorzugte Ausführungsformen
anhand der folgenden Beispiele und der begleitenden Zeichnungen
erläutert.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine Draufsicht auf eine Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform
der Erfindung;
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2 ist
eine Querschnittansicht des Behälters
und einer elektrischen Leitergruppe der Vorrichtung nach 1, betrachtet entlang der
Linie 2-2 in 1;
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3 ist
eine Längsschnittansicht
des Behälters
und der Halterung für
die elektrischen Leitungen der Vorrichtung nach 1, betrachtet entlang der Linie 3-3 in 1;
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4 ist
eine schematische Darstellung einer Vorrichtung gemäß dem ersten
Aspekt der Erfindung im auseinandergebauten Zustand;
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5 ist
eine schematische Ansicht einer Vorrichtung gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung im
zusammengebauten Zustand; und
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6 ist
eine Querschnittansicht einer noch weiteren Abwandlung der Erfindung,
bei der es sich um eine Mehrfachapparatur handelt, die drei Elektrophoresevorrichtungen
in vertikal gestapelter Anordnung umfasst.
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Ausführungsformen
der Erfindung
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Während
die Erfindung einen umfangreichen Bereich von Ausgestaltungen, Prozeduren
und Ausführungsformen
zugänglich
ist, versteht man die Erfindung am besten anhand einer detaillierten
Erläuterung
einer speziellen Struktur und deren Arbeitsweise. Eine solche Struktur
ist in den Zeichnungen dargestellt, und der Aufbau und Einsatz werden
im folgenden erläutert.
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In der Draufsicht der 1 ist der Behälter 11 dargestellt,
gehalten im Inneren eines Rahmens 12 durch Halteblöcke 13.
Der Behälter
ist in 1 im Querschnitt
dargestellt, er enthält
eine Gruppe paralleler Rinnen 14, die in 1 von oben und in 2 im Profil erkennbar sind. Jede Rinne
erstreckt sich nahezu über
die gesamte Länge
des Behälters 11 und
ist lang genug zur Aufnahme eines einzelnen Stab- oder streifenförmigen Gels,
welches für
die Separierung in der ersten Dimension im Zuge der zweidimensionalen
Elektrophorese verwendet wird. Im übrigen ist die Länge unkritisch,
sie kann variieren zur Aufnahme von Gelstreifen oder -stäben unterschiedlicher
Größen. Eine
angemessene Länge
für die
meisten Anwendungen der vorliegenden Erfindung reicht von etwa 6
cm bis zu etwa 20 cm. Die Rinnen haben im allgemeinen gleiche Länge. Tiefe, Breite,
Abstand und Profil jeder Rinne ist ebenfalls unkritisch und kann
variieren. Eine geeignete Tiefe für die meisten Anwendungen reicht
von etwa 0,3 cm bis etwa 3,0 cm, eine angemessene Breite reicht
in ähnlicher
Weise von etwa 0,3 bis etwa 3,0 cm, und ein passender Mittenabstand
reicht von etwa 0,5 cm bis etwa 3,5 cm. Während ein kurvenförmiges oder gekrümmtes Profil
in 2 dargestellt ist,
kommen auch andere Profile in Betracht, beispielsweise ein rechteckiges
Profil. Schließlich
enthält
der in den Zeichnungen dargestellte Behälter sechs Rinnen, jedoch erstreckt
sich die Erfindung auf Behälter
mit jeder Mehrzahl von Rinnen. Bei den meisten Anwendungen reicht
eine geeignete Zahl von Rinnen von 3 bis 24, vorzugsweise von 6
bis 18.
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Bei gewissen Ausführungsformen der Erfindung
ist der Behälter 11 als
Wegwerfartikel für
den einmaligen Gebrauch ausgelegt. Vorzugsweise dient der Behälter auch
als Wärmetransferelement,
um eine Temperatursteuerung der Gelstreifen und der Flüssigkeiten
zu ermöglichen,
die sich in den Rinnen befinden. Der Behälter kann so beispielsweise
eine durch Wärme
geformte Kunststoffkomponente sein, deren Wände dünn genug sind, um einen Wärmeübergang
zu und von jeder Rinne bezüglich
einer Temperatursteuerung zu ermöglichen,
beispielsweise einem Heizelement oder einer Wärmesenke, das bzw. die die
Unterseite des Behälters
berührt.
Die Temperatursteuerung ist zwar in den Zeichnungen nicht dargestellt,
kann aber in die Struktur des Rahmens 12 einbezogen sein.
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Ebenfalls an dem Rahmen 12 angebracht
ist ein Paar Schienen 21, 22, welche die Länge des Rahmeninneren überspannen
und parallel zueinander und zu den Rinnen des Behälters 11 verlaufen. Jede
Schiene ist elektrisch leitend und ist elektrisch mit Bananenste ckern 23 und 24 oder
anderen elektrischen Verbindungen an dem Äußeren des Rahmens angeschlossen.
Ein Paar Querträger 25, 26 sind
quer zu den beiden Schienen 21, 22 sowohl in Längsrichtung
verschieblich als auch axial drehbar gelagert. Jeder Träger ist
in die Pfeilrichtungen 27 und 28 in 1 in Längsrichtung und unabhängig verschieblich
und ist um seine Achse in den Pfeilrichtungen 29, 30 in 3 drehbar. Stellschrauben 33, 34, 35 und 36 können angezogen
werden, um die Träger
an irgendeiner ausgewählten
Stelle entlang den Schienen 21, 22 zu fixieren,
ohne dabei die axiale Drehung der Träger 25, 26 zu
behindern. Eine Drehung jedes Trägers
wird erleichtert durch Knöpfe 37, 38 zum
manuellen Drehen durch die Bedienungsperson. Jeder Träger ist
außerdem
mit einer Feder (von denen eine Feder 39 in 3 gezeigt ist) ausgestattet,
um den Träger
nach Innen vorzuspannen.
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An jedem drehbaren Träger ist
ein kleinerer Rahmen 41, 42 befestigt, wobei jeder
dieser kleineren Rahmen sich zusammen mit der Drehung seines zugehörigen Trägers dreht.
Von jedem dieser kleineren Rahmen ausgehend erstreckt sich eine
Reihe von Elektroden 43 (die Elektroden eines Rahmens sind
in 2 erkennbar) in Form
eines Feldes entsprechend den Rinnen 14 des Behälters 11.
Wenn sich der Behälter 11 an
seiner Stelle in dem äußeren Rahmen 12 befindet
und die kleineren Rahmen 41, 42 nach Innen geschwenkt
werden, so dass sich die Elektroden 43 absenken, so sind
die Elektroden mit den Rinnen ausgerichtet. Die Breiten der Elektroden und
die Abstände
zwischen ihnen sind so gewählt, dass
sich in jede Rinne eine Leitung erstreckt und das Gel oder den IPG-Streifen kontaktiert,
das bzw. der in der betreffenden Rinne enthalten ist. Die Elektroden 43 und
die Trägerstange 44,
von dem aus sie sich erstrecken, können folglich so ähnlich wie
die Zähne
eines Kamms geformt werden.
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Um ein elektrisches Potential über die
Längen
der Gelstreifen in den Rinnen zu schaffen, wird jede der beiden
Elektrodengruppen getrennt mit zwei externen Steckern 23, 24 versorgt.
Dies lässt
sich auf verschiedene Weise erreichen. Bei der in den Zeichnungen
dargestellten Anordnung sind die Schienen 21, 22,
die drehbaren Trägerarme 25, 26,
die kleineren Rahmen 41, 42 und die Elektroden 43 (die Kammzähne) sämtlich elektrisch
leitend. Die verschieblichen Blöcke 46, 47, 48 und 49,
die die drehbaren Träger 25, 26 mit den
Schienen 21, 22 verbinden, sind nicht leitend.
An zwei der Gleitblöcke 33, 34 sind
bewegliche Paßstücke 50, 51 aus
elektrisch leitendem Werkstoff befestigt. Jedes dieser Paßstücke ist
in Pfeilrichtung 52, 53 verschieblich. Bei Verschiebung
nach Innen (quer zu den Schienen und in Richtung der Mittelachse
des Rahmens) kontaktieren die Paßstücke die beiden Schienen 21, 22 und
die vorstehenden Elemente 54, 55 des kleineren
Rahmens und bilden damit eine elektrische Verbindung zwischen jeder
Schiene und einem der kleineren Rahmen.
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Der in diesen Zeichnungen dargestellte
und oben beschriebene Aufbau lässt
sich auf verschiedene Weise abwandeln. Beispielsweise können externe elektrische
Leitungen direkt an den drehbaren Trägerarmen 25, 26 anstatt
an den Schienen 21, 22 angebracht werden, wobei
die Schienen dann aus einem nicht leitenden Werkstoff bestehen können. Die Drehung
der drehbaren Trägerarme 25, 26 ist
in 3 dargestellt, wobei
die ausgezogenen Linien die Trägerarme
und die Elektroden in einer abgesenkten Stellung zeigen, in der
die Elektroden in die Rinnen ragen, während die gestrichelten Linien
die Trägerarme
und Elektroden in einer angehobenen Stellung zeigen, in der die
Elektroden 43 von den Rinnen abgehoben sind. Eine Alternative
zu dieser Ausgestaltung ist die, bei der die Drehachse der drehbaren
Trägerarme 25, 26 durch
ein Ende jedes Stabs rechtwinklig zu dem Stab selbst verläuft. Eine vertikale
Drehachse kommt ebenfalls in Betracht. Das Vorspannen der Elektroden
in Richtung der Rinnen zur Gewährleistung
eines geeigneten und gleichförmigen
elektrischen Kontakts wird in der oben erläuterten Weise durch eine Federbelastung
der drehbaren Arme erreicht. Eine Alternative zu der Verwendung
von Federn oder ähnlichen
Einrichtungen ist die Nutzung der Schwerkraft unter Einsatz einer
vorbelasteten Gewichtsverteilung in dem drehbaren Arm.
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Obschon in diesen Zeichnungen nicht
dargestellt, können
die kleineren Rahmen 41, 42, an denen die Elektroden
gelagert sind, außerdem
Probenbehälter
tragen, jeweils einer ausgerichtet mit jeder Rinne, um den Rinnen
Probengemische zuzuführen.
Die Vorrichtung kann außerdem
einen Deckel oder Verschluß aufweisen,
um die Gele und Flüssigkeiten
zu schützen,
die sich in den Rinnen befinden, und eine Bedienungsperson vor der
Berührung
mit freiliegenden elektrischen Leitungen zu schützen. Außerdem kann der Behälter
11 in
den Außenrahmen
von oben her eingesetzt werden, oder kann durch einen seitlichen
Eingang in den Außenrahmen
in seine Lage geschoben werden. Darüber hinaus können die
Halteblöcke 13 ersetzt
werden durch irgendeine Struktur, die an dem äußeren Rahmen befestigt ist,
oder durch irgendeine Formgebung des Rahmens, die einem ähnlichen
Zweck der Stabilisierung der Lage des Behälters relativ zu den drehbaren
Trägerarmen dient.
Ferner können
die Rinnen herausziehbare Stifte oder andere Sperren aufweisen,
um eine korrekte Positionierung der Gele zu garantieren, insbesondere
dann, wenn die Gele kürzer
als die Rinnen sind.
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Andere strukturelle Abwandlungen
sind für den
Fachmann auf dem Gebiet der Entwicklung, des Aufbaus und des Betriebs
von Elektrophoresevorrichtungen ersichtlich.
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Während
die erfindungsgemäße Vorrichtung bei
jedem Typ von Gelstreifen verwendbar ist, eignet sich die Erfindung
besonders für
Gele mit immobilisierten Funktionsgruppen, die über die Länge zur isoelektrischen Fokussierung
verteilt sind. Die immobilisierten Gruppen bilden einen pH-Gradienten
aufgrund einer Ladungsverteilung, die sich bereits in den Gruppen
befindet, oder der Fähigkeit,
aufgeladen zu werden, um einen pH-Gradienten zu bilden. Alternativ lässt sich
der pH-Gradient ausbilden durch Träger- amphocyte, die in der
Streifenmatrix nicht immobilisiert sind.
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Streifen, die immobilisierte Gruppen
enthalten, sind bei Elektrophoresefachleuten bekannt und im Handel
erhältlich.
Die Streifen werden üblicherweise
als „IPG-Streifen" bezeichnet (Streifen
mit immobilisierten pH-Gradienten), Beispiele hierfür sind in
dem US-Patent 4 130 470 (Rosengren et al., Ausgabe am 9. Dezember
1978) offenbart. Die Matrix kann ein massives Trägermaterial sein, beispielsweise
ein granulatförmiges
oder faseriges oder membranähnliches
Material, es kann sich auch um ein Gel handeln. Beispiele für Matrixmaterialien
sind Polyacrylamid, Zellulose, Agarose, Dextran, Polyvinylalkohol,
Stärke,
Kiegelgur, Acryloylamino-ethoxylethanol (AAEE) und Polymere von
Styroldivinylbenzol sowie Kombinationen dieser Materialien.
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Beispiele für positiv geladene oder ladbare Gruppen
sind Aminogruppen und andere stickstoffhaltige Gruppen. Beispiele
für negativ
geladene oder ladbare Gruppen sind Carboxylsäuregruppen, Sulfonsäuregruppen,
Borsäuregruppen
sowie Phosphor- und Phosphorsäuregruppen
sowie Ester dieser Säuren.
Weitere Beispiele sind für
den Fachmann ersichtlich. Die Immobilisierung der Gruppen in der
Matrix lässt
sich erreichen durch kovalentes Binden oder andere Mittel, die die
Positionen der Gruppen sicherstellen und deren Migration unter dem
Einfluß eines elektrischen
Feldes oder aufgrund der Bewegung von Fluiden oder gelösten Stoffen
durch die Matrix verhindern. Ein bevorzugtes Mittel für den Einbau
geladener Gruppen in eine Polymer-Gelmatrix ist das Copolymerisieren
geladener Monomere oder geladener Vernetzungsmittel mit Gel-Monomeren.
Die Konzentration der Gruppen variiert vorzugsweise in monoton ansteigender
oder abnehmender Art, um einen immobilisierten pH-Gradienten zu
bilden, der sich zur isoelektrischen Fokussierung eignet.
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IPG-Streifen aus Gelen enthalten
häufig
eine Stütze
zum Aufrechterhalten der Dimensionsunversehrtheit des Gels. Das
Stützmaterial
ist im allgemeinen fluidundurchlässig
und elektrisch nicht leitend. Der IPG-Streifen wird im allgemeinen
in trockener Form geliefert und macht vor seinem Einsatz eine Rehydrierung
erforderlich. Dies wird üblicherweise dadurch
erreicht, dass der Streifen in Berührung mit einer Probenlösung gebracht
wird, die als Rehydriermittel dient. Das Rehydrieren kann in der
Vorrichtung gemäß der Erfindung
in den Rinnen selbst erfolgen, während
die elektrischen Elektroden aus den Rinnen hochgezogen sind. IPG-Streifen
mit Trägern
werden am besten in der Weise rehydriert, dass die Gelseite nach
unten weist (das heißt
mit dem Träger
nach oben weist). Die Rinnen des Behälters sind vorzugsweise ausreichend
tief, damit jeder IPG-Streifen mit einer anderen Probenlösung rehydriert
werden kann, ohne eine kreuzweise Verunreinigung aus benachbarten
Probenlösungen
zu riskieren. Im wieder hydrierten Zustand können die Streifen von den Behältern getrennt
und bis zu ihrem endgültigen
Einsatz gefroren gelagert werden.
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Nachdem der IPG-Streifen rehydriert
ist und sich an die Temperatur angepasst hat, bei der die Elektrophorese
stattfindet, wird der Streifen vorzugsweise umgedreht, um seine
Gel seite mit den Elektroden in Berührung gelangen zu lassen. Das
Erfordernis, die Streifen zu wenden, lässt sich vermeiden, wenn man
eine Hilfseinrichtung für
den elektrischen Kontakt zwischen dem Gel und der Elektrode vorsieht,
berücksichtigend,
dass das elektrische Potential sich nicht durch den Träger hindurch
erstreckt. Ein Mittel, um dies zu erreichen, besteht darin, jeden Streifen
mit einem Loch an jedem Ende zu versehen und darin einen Docht anzuordnen
in Form eines Stücks
weichen Papiers oder eines ähnlichen
absorbierenden Materials, welches mit einer leitenden Flüssigkeit
vollgesogen ist, wobei sich der Docht oben an dem Streifen oberhalb
des Lochs befindet. Das Loch in dem Streifen füllt sich mit leitender Flüssigkeit,
so dass der Docht einen elektrischen Kontakt zwischen der Elektrode
und der das Loch belegenden Flüssigkeit
gewährleistet
(und damit mit dem Gel auf der Unterseite des Streifens).
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Vor der Elektrophorese kann der verbleibende
Raum in den Rinnen oberhalb der Gelstreifen mit Paraffinöl oder einer ähnlichen
elektrisch nicht leitenden Flüssigkeit
gefüllt
werden, um ein Verdampfen von Feuchtigkeit aus dem Gel während der
Elektrophorese zu verhindern. Nachdem die Elektroden platziert sind,
wird elektrisches Potential auf die Leitungen gegeben, und jeder
gelöste
Stoff wandert längs
des Gels zu einer Stelle, an der der Gel-pH-Wert dem isoelektrischen
Punkt des gelösten Stoffs
gleicht. Nachdem die gelösten
Stoffe separiert sind, wird das elektrische Potential entfernt,
und die die Elektroden halternden Trägerarme werden von den Rinnen
weggeschwenkt. Dann wird der Behälter von
dem Rahmen gelöst,
das schützende
Paraffinöl wird
ausgegossen, und die Gelstreifen werden aus den Rinnen entnommen.
Alternativ können
die Gelstreifen in den Rinnen für
eine zweite Stufe der zweidimensionalen Separierung ausgeglichen
werden.
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4 zeigt
eine Variante der Erfindung, bei der Dauerelektroden 60 in
dem Wegwerfbehälter 11 eingebaut
sind. Die Vorrichtung, allgemein mit 70 bezeichnet, enthält einen
Rahmen oder Halter 80 zur Aufnahme des Behälters 11,
und die Elektrodenanschlüsse 82 sind
mit den Elektroden 60 an Kontaktpunkten 86 verbunden,
wie am besten aus 5 hervorgeht.
Die Elektrodenanschlüsse
sind mit den Steckern 84 für den Anschluß an eine
Stromversorgung verbunden.
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6 zeigt
eine noch weitere Ausführungsform,
bei der die Vorrichtung einen Stapel von Zellen 90 vorsieht,
die auf Rahmen 92 übereinander
gestapelt sind. Jede Zelle 90 ist von dem Stapel zur Bestückung abnehmbar
und wird einfach in einen Elektrodenanschluß 94 eingesteckt,
so dass eine einzige Stromversorgung für eine Reihe von Einheiten
möglich
ist.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich
gut zur Automatisierung, wobei Vorgänge wie das Einsetzen des Behälters, die
Zugabe des Paraffinöls,
das Absenken der Elektroden, das Anlegen des elektrischen Potentials
für eine
vorab ausgewählte
Zeitspanne, das Anheben der Elektroden und das Freigeben des Behälters sämtlich durch
eine programmierte Ablaufsteuerung gesteuert werden.