DE69810459T3 - Reagenzien zur impfung, die eine cd8 t-zell-immunantwort erzeugen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft die Erzeugung einer schützenden CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen Zielantigene unter Verwendung verschiedener Initialisierungs- und Verstärkungszusammensetzungen (Priming- und Booster-Zusammensetzungen) als Quellen für CD8+ T-Zell-Epitope.
  • Einleitung
  • Ein allgemeines Problem in der Impfungslehre war das Unvermögen, hohe Mengen an CD8 T-Zellen durch Immunisierung zu erzeugen. Dies hat die Entwicklung von Impfstoffen gegen mehrere Krankheiten, einschließlich Malaria, verhindert.
  • Plasmodium falciparum-Malaria verursachte hunderte Millionen Malariainfektionen jedes Jahr und ist für 1–2 Millionen Todesfälle jährlich verantwortlich. Die Entwicklung eines wirksamen Impfstoffes gegen Malaria ist somit ein Hauptanliegen des globalen öffentlichen Gesundheitswesens. Ein beträchtlicher Anteil der immunologischen Forschung über die letzten 20 Jahre führte zur Identifizierung sowohl von Kandidaten für Impstoffantigene aus dem Parasiten als auch von immunologischen Mechanismen bei dem Wirt, die wahrscheinlich gegen Infektion und Erkrankung schützen. Trotz dieses Fortschritts gibt es jedoch nach wie vor kein Mittel zur Impfung gegen Malariainfektion, von dem gezeigt wurde, daß es in Feldversuchen wirksam ist.
  • Ein Hauptproblem war die Identifizierung eines Mittels zur Induzierung einer ausreichend starken Immunantwort in geimpften Individuen zum Schutz gegen Infektion und Erkrankung. Obwohl viele Malariaantigene bekannt sind, die für eine Impfung gegen Malaria geeignet sein könnten, bestand das Problem daher darin, wie solche Antigene oder Fragmente davon, bekannt als Epitope, welche von Zellen des Immunsystems erkannt werden, in einer Weise verabreicht werden können, die eine ausreichend starke Immunantwort eines bestimmten Typs induzieren.
  • Es ist seit vielen Jahren bekannt, daß es möglich ist, Individuen zu schützen, indem man sie mit sehr hohen Dosen von bestrahlten Malariasporozoiten, die durch Bisse von infizierten Moskitos gegeben werden, immunisiert. Obwohl dies eine völlig impraktikable Methode zur Massenimpfung ist, lieferte sie ein Modell zum Analysieren der Immunantworten, welche eine schützende Immunität gegen Sporozoiteninfektion vermitteln könnten (Nardin und Nussenzweig, 1993).
  • Ein beträchtlicher Forschungsaufwand über das letzte Jahrzehnt oder länger hat gezeigt, daß eine wesentliche schützende Immunantwort gegen das frühe prä-erythrozytische Stadium von P. falciparum-Malaria durch T-Lymphozyten vom CD8+ ve-Typ (CD8+ T-Zellen) vermittelt wird. Von diesen Zellen wurde gezeigt, daß sie in Mausmodellen mit Malariainfektion einen Schutz direkt vermitteln (Nardin und Nussenzweig, 1993). Solche T-Zellen wurden auch in Individuen identifiziert, die auf natürliche Weise Malaria ausgesetzt waren, und in Freiwilligen, die mit bestrahlten Sporozoiten immunisiert worden waren (Hill et al., 1991; Aidoo et al., 1995; Wizel et al., 1995). Es gibt viele indirekte Beweise, daß solche CD8+ T-Zellen gegen Malariainfektion und -Erkrankung im Menschen schützen (Lalvani et al., 1994).
  • CD8+ T-Zellen können auf mehr als eine Art und Weise funktionieren. Die am besten bekannte Funktion ist das Töten oder die Lyse von Zielzellen, die ein Peptidantigen im Kontext eines MHC Klasse I-Moleküls tragen. Daher werden diese Zellen häufig als zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) bezeichnet. Jedoch ist eine weitere Funktion, die vielleicht von größerer schützender Relevanz bei Malariainfektionen ist, die Fähigkeit von CD8+ T-Zellen, Interferon Gamma (IFN-γ) auszuscheiden. Daher sind Tests der lytischen Aktivität und der IFN-γ-Freisetzung beide von Wert beim Messen einer CD8+ T-Zell-Immunantwort. Bei Malaria können diese CD8+ ve-Zellen durch Töten des Parasiten im frühen intrahepatischen Stadium einer Malariainfektion schützen, bevor irgendwelche Symptome einer Erkrankung erzeugt werden (Seguin et al., 1994).
  • Die Ursache für tödliche Malaria beim Menschen, P. falciparum, infiziert eine beschränkte Anzahl an Wirtsspezies: Menschen, Schimpansen und einige Spezies von Neuweltaffen. Das beste nichtmenschliche Modell für Malaria ist der Schimpanse, weil diese Spezies eng mit dem Menschen verwandt ist und eine Leberstadiuminfektion übereinstimmend beobachtet wird, anders als in den Affenwirten (Thomas et al., 1994). Aufgrund der Kosten und der begrenzten Verfügbarkeit von Schimpansen werden die meisten Laborstudien von Malaria in Mäusen durchgeführt, wobei man die Nagermalariaspezies P. berghei oder P. yoelii verwendet. Diese zwei letztgenannten Modelle sind gut untersucht, und es wurde in beiden gezeigt, daß CD8+ ve-Lymphozyten eine Schlüsselrolle bei der schützenden Immunität gegen eine Sporozoitenexposition spielen.
  • Frühere Untersuchungen haben eine große Vielfalt an Mitteln zur Induzierung von CD8+ T-Zell-Antworten gegen Malaria aufgedeckt. Einige von diesen haben ein gewisses Maß an CD8+ T-Zell-Antwort und teilweisen Schutz gegen Malariainfektion in den Nagermodellen gezeigt (z. B. Li et al., 1993; Sedegah et al., 1994; Lanar et al., 1996). Jedoch wurde ein wirksames Mittel zur Immunisierung mit Untereinheitenimpfstoffen durch die Induzierung ausreichend hoher Mengen an CD8+ T-Lymphozyten zum wirksamen Schutz gegen Malariasporozoiteninfektion zuvor nicht demonstriert.
  • In jüngeren Jahren wurden verbesserte Immunantworten, die auf potentielle Impfstoffe hervorgerufen werden, gesucht, indem man die Vektoren, die zur Auslieferung des Antigens verwendet wurden, variierte. Es gibt Anzeichen dafür, daß in einigen Fällen Antikörperreaktionen verbessert werden, indem man zwei verschiedene Vektoren verwendet, die aufeinanderfolgend als Initialisierer und Verstärker verabreicht werden. Eine Vielzahl an Kombinationen von Initialisierer und Verstärker wurde in verschiedenen möglichen Impfstoffschemas getestet.
  • Leong et al. (Vaccines, 1995, 327–331) beschreiben die Immunisierung von Mäusen zuerst mit DNA, welche das Influenza-Hämagglutinin-Antigen (HA) exprimiert, und anschließend mit einem rekombinanten Geflügelpockenvektor, der HA exprimiert. Eine erhöhte Antikörperreaktion wurde nach einer Verstärkung erhalten.
  • Richmond et al. (Virology, 1997, 230: 265–274) beschreiben Versuche, neutralisierende Antikörper gegen HIV-1 env zu richten, wobei sie DNA-Initialisierung und Verstärkung durch rekombinantes Vacciniavirus verwenden. Mit diesem Initialisierer-Verstärker-Schema wurden nur niedrige Mengen an Antikörperreaktionen beobachtet, und die Ergebnisse wurden als enttäuschend eingestuft.
  • Fuller et al. (Vaccine, 1997, 15: 924–926, und Immunol. Cell Biol., 1997, 75: 389–396) beschreiben eine Erhöhung von Antikörperreaktionen auf DNA-Immunisierung von Makaken unter Verwendung einer Verstärkerimmunisierung mit replizierenden, rekombinanten Vacciniaviren. Dies wurde jedoch nicht in eine erhöhte schützende Wirkung als eine stärkere Verminderung in der viralen Belastung umgesetzt, und man beobachtete eine Abschwächung des CD4 T-Zell-Verlustes in den mit DNA initiierten und verstärkten Tieren.
  • Hodge et al. (Vaccine, 1997, 15: 759–768) beschreiben die Induktion von lymphoproliferativen T-Zell-Antworten in einem Mausmodell für Krebs unter Verwendung von humanem karzinoembryonischem Antigen (CEA), das in einem rekombinanten Geflügelpockenvirus (ALVAC) exprimiert wird. Die Autoren initiierten eine Immunantwort mit CEA-rekombinanten, replikationskompetenten Vacciniaviren vom Wyeth- oder WR-Stamm und verstärkten die Antwort mit CEA-rekombinantem ALVAC. Dies führte zu einem Anstieg der T-Zell-Proliferation, aber es resultierte nicht in einer erhöhten schützenden Wirksamkeit, verglichen mit drei rekombinanten Wildtyp-Immunisierungen (100% Schutz), drei rekombinanten ALVAC-CEA-Immunisierungen (70% Schutz) oder WR-Initialisierung, gefolgt von zwei ALVAC-CEA-Immunisierungen (63% Schutz).
  • Somit haben einige Studien heterologer Initialisierungs-Verstärkungs-Kombination eine gewisse Erhöhung von Antikörper- und lymphoproliferativen Antworten gefunden, aber keinen signifikanten Effekt auf eine Schutzwirkung in einem Tiermodell. CD8 T-Zellen wurden in diesen Studien nicht gemessen. Die begrenzte Erhöhung der Antikörperantwort spiegelt wahrscheinlich einfach die Tatsache wider, daß Antikörper gegen das initialisierende Immunogen häufig die Immunogenizität einer zweiten Immunisierung mit dem gleichen Immunogen herabsetzen, wogegen ein Verstärken mit einem anderen Träger dieses Problem zum Teil überwindet. Man würde nicht erwarten, daß dieser Mechanismus durch die Reihenfolge der Immunisierung wesentlich beeinflußt wird.
  • Anzeichen dafür, daß ein heterologes Initialisierungs-Verstärkungs-Immunisierungsschema CD8 T-Zell-Antworten beeinflussen könnte, wurden von Li et al. (1993) geliefert. Sie beschreiben teilweise schützende Wirksamkeit, die in Mäusen gegen Malariasporozoiten-Exposition durch Verabreichung von zwei lebenden viralen Vektoren induziert wurde, nämlich einem rekombinanten, replizierenden Influenzavirus, gefolgt von einem rekombinanten, replizierenden Vacciniavirus, der ein Malariaepitop codiert. Eine Umkehrung der Reihenfolge der Immunisierung führte zu einem Verlust der gesamten schützenden Wirkung, und die Autoren schlu gen vor, daß dies mit einer Infektion von Leberzellen durch Vaccinia in Verbindung stehen könnte, was zu einer Lokalisierung von CTLs in der Leber zum Schutz gegen die hepatozytischen Stadien von Malariaparasiten führt.
  • Rodrigues et al. (J. Immunol. 1994, 4636–4648) beschreiben eine Immunisierung von Mäusen mit wiederholten Dosen eines rekombinanten Influenzavirus, der ein immunodominantes B-Zell-Epitop des Malaria-Circumsporozoiten-Proteins (CS) exprimiert, gefolgt von einem rekombinanten Vacciniavirus-Verstärker. Die Verwendung eines Wildtyp-Vacciniastammes und eines abgeschwächten, aber replikationskompetenten Vacciniastammes in dem Verstärker lieferte sehr ähnliche Niveaus von teilweisem Schutz. Jedoch war der abgeschwächte, aber replikationskompetente Stamm etwas weniger immunogen für eine Initialisierung von CD8 T-Zellen als der Wildtyp-Vacciniastamm.
  • Murata et al. (Cell. Immunol. 1996, 173: 96–107) berichteten von erhöhten CD8 T-Zell-Antworten nach Initialisierung mit replizierenden, rekombinanten Influenzaviren und Verstärkung mit einem replizierenden Stamm von Vacciniavirus und schlugen vor, daß der Teilschutz, der in den zwei früheren Studien beobachtet wurde, dieser erhöhten CD8 T-Zell-Induktion zuzuschreiben war.
  • Somit liefern diese drei Studien zusammen Anzeichen dafür, daß eine Verstärker-Immunisierung mit einem replizierenden, rekombinanten Vacciniavirus nach einer Initialisierung mit einem replizierenden, rekombinanten Influenzavirus CD8 T-Zell-Induktion bis zu einem gewissen Maße erhöhen kann. Jedoch gibt es zwei Einschränkungen dieser Erkenntnisse hinsichtlich ihrer potentiellen Brauchbarkeit. Erstens war die induzierte Immunogenizität gerade ausreichend, um teilweisen Schutz gegen Malaria zu erzielen, und sogar dieser war abhängig von einer hochgradig immunogenen initialisierenden Immunisierung mit einem ungewöhnlichen replizierenden, rekombinanten Influenzavirus. Zweitens, aufgrund der potentiellen und dokumentierten Nebenwirkungen der Verwendung dieser replizierenden Viren als Immunogene sind diese rekombinanten Vektoren für eine allgemeine Verwendung als Impfstoffe am Menschen nicht geeignet.
  • Modifizierter Vacciniavirus Ankara (MVA) ist ein Vacciniavirusstamm, welcher in den meisten Zelltypen, einschließlich normalen menschlichen Geweben, nicht repliziert. MVA wurde durch aufeinanderfolgende Passage > 500mal in Hühnchenembryofibroblasten (CEF) von Material erhalten, das aus einer Pockenläsion an einem Pferd in Ankara, Türkei, erhalten wurde (Mayr et al., 1975). Es wurde gezeigt, daß es bezüglich Replikation beeinträchtigt, jedoch in der Lage ist, schützende Immunität gegen veterinäre Pockenvirusinfektionen zu induzieren (Mayr, 1976). MVA wurde als ein humanes Vaccin in den Endstadien der Pockenausrottungskampagne verwendet, wobei es auf intrakutanen, subkutanen und intramuskulären Wegen > 120.000 Patienten in Süddeutschland verabreicht wurde. Es wurden keine signifikanten Nebenwirkungen registriert, trotz der bewußten Ausrichtung der Impfung auf Hochrisikogruppen, wie solchen mit Ekzemen (Mayr et al., 1978; Stickt et al., 1974; Mahnel et al., 1994). Die Sicherheit von MVA spiegelt die Avirulenz des Virus in Tiermodellen wider, einschließlich in bestrahlten Mäusen und nach intrakranieller Verabreichung an neonatale Mäuse. Die nicht stattfindende Replikation von MVA wurde mit der Produktion von proliferativen weißen Plaques auf Hühnerchorioallantoismembran, abortiver Infektion von nicht-Vogelzellen und dem Vorhandensein von sechs genomischen Deletionen, die insgesamt etwa 30 kb ausmachen, in Korrelation gebracht (Meyer et al., 1991). Die Avirulenz von MVA wurde teilweise Deletionen zugeschrieben, welche Wirtsbereichgene K1L und C7L beeinflussen, obwohl begrenzte virale Replikation nach wie vor auf menschlichen TK-143-Zellen und CV-1-Zellen von der afrikanischen grünen Meerkatze stattfindet (Altenburger et al., 1989). Wiederherstellung des K1L-Gens stellt den MVA-Wirtsbereich nur teilweise wieder her (Sutter et al., 1994). Die Wirtsbereichsbeschränkung scheint während der Reifung des Viruspartikels stattzufinden, wobei in menschlichen HeLa-Zellen in der Elektronenmikroskopie nur unreife Virionen beobachtet werden (Sutter et al., 1992). Die späte Blockierung der viralen Replikation verhindert nicht eine wirksame Expression von rekombinanten Genen in MVA. Rekombinante MVA, welche Influenza-Nukleoprotein, Influenza-Hämagglutinin und SIV-Proteine exprimieren, haben sich als immunogen erwiesen und liefern in variierendem Maße Schutz in Tiermodellen, obwohl dies nie CD8+ T-Lymphozyten alleine zugeschrieben wurde (Sutter et al., 1994; Hirsch et al., 1995; Hirsch et al., 1996). Rekombinantes MVA wird aufgrund dieser Eigenschaften bezüglich Sicherheit und Immunogenizität als ein vielversprechender Kandidat eines menschlichen Impfstoffs angesehen (Moss et al., 1995). Rekombinantes MVA, welches DNA enthält, die fremde Antigene codiert, ist in der US 5 185 146 (Altenburger) beschrieben.
  • Pockenviren haben Strategien zur Umgehung der Immunantwort des Wirtes entwickelt, welche die Produktion von ausgeschiedenen Proteinen umfassen, die als lösliche Rezeptoren für Tumornekrosefaktor, IL-1β, Interferon (IFN)-α/β und IFN-γ funktionieren, welche normalerweise eine Sequenzähnlichkeit zu der extrazellulären Domäne von zellulären Zytokinrezeptoren besitzen (Symons et al., 1995; Alcami et al., 1995; Alcami et al., 1992). Der zuletzt beschriebene Rezeptor dieser Art ist ein Chemokinrezeptor (Graham et al., 1997). Im allgemeinen hemmen oder unterminieren diese viralen Rezeptoren eine geeignete Wirtsimmunantwort, und deren Gegenwart geht mit erhöhter Pathogenizität einher. Der IL-1β-Rezeptor bildet eine Ausnahme: Seine Gegenwart vermindert die Fieberreaktion des Wirts und erhöht die Überlebensfähigkeit des Wirts in Anbetracht einer Infektion (Alcami et al., 1996). Wir haben entdeckt, daß MVA funktionale Zytokinrezeptoren für Interferon-γ, Interferon-αβ, Tumornekrosefaktor und CC-Chemokine fehlen, aber es verfügt über den potentiell vorteilhaften IL-1β-Rezeptor. MVA ist der einzige bekannte Stamm von Vaccinia, der dieses Zytokinrezeptorprofil besitzt, was ihn theoretisch sicherer und immunogener macht als andere Pockenviren. Ein weiterer, bezüglich Replikation beeinträchtigter und sicherer Stamm von Vaccinia, bekannt als NYVAC, ist ausführlich in Tartaglia et al. (Virology, 1992, 188: 217–232) beschrieben.
  • Es wurde schon lange erkannt, daß lebende Viren einige attraktive Eigenschaften als rekombinante Impfstoffvektoren besitzen, einschließlich einer hohen Kapazität für fremde Antigene und ziemlich gute Immunogenizität für zelluläre Immunantworten (Ellis, 1988, New technolo gies for making vaccines. In: Vaccines, Ed.: Plotkin S. A. und Mortimer E. A., W. B. Saunders, Philadelphia, S. 568; Woodrow G. C., 1977, in: New Generation Vaccines, 2. Aufl., Ed.: Levine, M. M., Woodrow, G. C., Kaper, J. B., Cobon, G., S. 33). Dies führte zu Versuchen, die Virulenz von solchen lebenden Vektoren auf verschiedene Weisen abzuschwächen, einschließlich einer Reduzierung ihrer Replikationskapazität (Tartaglia J. et al., 1992, Virology, 188: 217–232). Solch eine Reduzierung in der Replikation reduziert jedoch die Menge an Antigen, das von dem Virus produziert wird, und dabei würde man erwarten, daß die Impfstoffimmunogenizität vermindert würde. Tatsächlich wurde früher gezeigt, daß eine Abschwächung von Vacciniastämmen zu einigen wesentlichen Verringerungen der Antikörperreaktionen führt (Lee M. S. et al., 1992, J. Virology, 66: 2617–2630). Gleichermaßen wurde herausgefunden, daß der nichtreplizierende Geflügelpockenvektor für eine Antikörperproduktion weniger immunogen und weniger schützend ist als ein replizierender Wildtyp-Vacciniastamm in einer Tollwutstudie (Taylor J. et al., 1991, Vaccine, 9: 190–193).
  • Verschiedene Initialisierungs- und Verstärkungsprotokolle, welche rekombinantes Vacciniavirus und rekombinantes, nichtreplizierendes Geflügelpockenvirus zur Erhöhung der T-Zell-Immunität und von Anti-Tumor-Reaktionen verwendet wurden, wurden beschrieben (Hodge, J. et al., 1997, Vaccine, 15 (617): 759–768).
  • Es wird offenbart, daß nichtreplizierende und bezüglich Replikation beeinträchtigte Stämme des Pockenvirus Vektoren liefern, welche auf eine initialisierte CTL-Antwort eine äußerst gute Verstärkungswirkung liefern. Bemerkenswerterweise ist dieser Effekt signifikant stärker als eine Verstärkungswirkung durch Wildtyp-Pockenviren. Der Effekt wird mit Malaria- und anderen Antigenen, wie viralen und Tumorantigenen, beobachtet und ist schützend, wie es in Expositionsexperimenten in Mäusen und nichtmenschlichen Primaten gezeigt wurde. Man beobachtete mit dem neuen Immunisierungsschema eher vollständigen als teilweisen Schutz vor Sporozoitenexposition.
  • Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein wirksames Mittel zur Immunisierung gegen Malaria zu identifizieren. Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Mittel zur Immunisierung gegen andere Krankheiten zu identifizieren, in welchen CD8+ T-Zell-Antworten eine schützende Rolle spielen. Solche Krankheiten umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Infektion und Erkrankung, die von den Viren HIV, Herpes simplex, Herpes zoster, Hepatitis C, Hepatitis B, Influenza, Epstein-Barr-Virus, Masern, Denguefieber und HTLV-1, von den Bakterien Mycobacterium tuberculosis und Listeria sp. und von den Protozoenparasiten Toxoplasma und Trypanosoma und von bestimmten Formen von Krebs, z. B. Melanoma, Brustkrebs und Lungenkrebs, verursacht werden.
  • Wir beschreiben hierin ein neues Verfahren zur Immunisierung, das sehr hohe Mengen an CD8+ T-Zellen erzeugte und von dem herausgefunden wurde, daß es in der Lage ist, noch nie dagewesenen vollständigen Schutz gegen P. berghei-Sporozoitenexposition zu induzieren. Der gleiche Ansatz wurde in höheren Primaten getestet, und es wurde herausgefunden, daß er in diesen Spezies ebenfalls hochgradig immunogen war und teilweisen Schutz gegen P. falciparum-Exposition induzierte. Induktion von schützenden Immunantworten wurde auch in zwei zusätzlichen Mausmodellen von viraler Infektion und Krebs demonstriert.
  • Wir zeigen weiterhin, daß das neue Immunisierungsschema, welches hierin beschrieben wird, auch bei der Erzeugung von starken CD8+ T-Zell-Antworten gegen HIV-Epitope wirkungsvoll ist. Ein beachtliches Indiz zeigt, daß man erwarten kann, daß die Erzeugung solcher CD8+ T-Zell-Antworten für eine prophylaktische oder therapeutische Immunisierung gegen diese virale Infektion und Erkrankung wertvoll ist (Gallimore et al., 1995; Ada, 1996). Wir demonstrieren, daß starke CD8+ T-Zell-Antworten gegen Epitope sowohl von HIV als auch Malaria unter Verwendung eines Epitopstranges mit Sequenzen von beiden dieser Mikroorganismen erzeugt werden können. Der Erfolg bei der Erzeugung erhöhter Immunogenizität gegen sowohl HIV- als auch Malariaepitope und auch gegen Influenza- und Tumorepitope zeigt, daß dieses neue Immunisierungsschema allgemein gegen viele infektiöse Pathogene und auch bei nichtinfektiösen Krankheiten, wo die Erzeugung einer starken CD8+ T-Zell-Antwort wertvoll sein kann, wirksam kein kann.
  • Eine überraschende Erkenntnis ist die sehr hohe Wirksamkeit von nichtreplizierenden Mitteln sowohl bei der Initialisierung als auch insbesondere bei der Verstärkung einer CD8+ T-Zell-Antwort. Früher wurde herausgefunden, daß im allgemeinen die Immunogenizität von CD8+ T-Zell-Induktion durch lebende replizierende virale Vektoren höher war als von nichtreplizierenden Mitteln oder bezüglich Replikation beeinträchtigten Vektoren. Wie man es erwarten würde, liegt dies an der größeren Menge an Antigenen, die von Mitteln produziert werden, die in dem Wirt replizieren können. Hierin finden wir jedoch, daß die größte Immunogenizität und schützende Wirksamkeit überraschenderweise mit nichtreplizierenden Vektoren beobachtet wird. Die letztgenannten haben dahingehend einen zusätzlichen Vorteil für die Impfung, daß sie im allgemeinen für die Anwendung im Menschen sicherer sind als replizierende Vektoren.
  • Die vorliegende Erfindung liefert die Verwendung
    • (i) einer Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung), umfassend eine Quelle für ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope ein nicht-viraler Vektor oder ein nicht replizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter viraler Vektor ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, und
    • (ii) einer Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung), umfassend eine Quelle für ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens, einschließlich wenigstens eines CD8+ T-Zell-Epitops, welches das gleiche wie ein CD8+ T-Zell-Epitop der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ist, wobei die Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope ein nichtreplizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter rekombinanter Pockenvirusvektor ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger,
    für die Herstellung eines Impfkits gegen eine durch ein Pathogen verursachte Erkrankung oder gegen Krebs, bei der/dem CD8+ T-Zellreaktionen eine schützende Rolle spielen, wobei der Kit eine schützende CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen wenigstens ein Zielantigen des Pathogens oder des Krebses erzeugt;
    mit der Maßgabe, dass, wenn die Quelle für Epitope in (i) ein viraler Vektor ist, der virale Vektor in (ii) von einem anderen Virus als dem Virus in (i) abgeleitet ist.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt liefert die Erfindung einen rekombinanten Epitopstrang, der die CD8+ T-Zell-Epitope der Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 und 34 und weiterhin die Epitope der Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 26, 28, 36, 38 und 40 umfasst.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt liefert die Erfindung ein rekombinantes Ty-Virus-ähnliches Teilchen, welches den oben beschriebenen Epitopstrang umfasst, zur Immunisierung eines Tieres gegen Malaria.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt liefert die Erfindung rekombinantes DNA-Plasmid oder rekombinantes, nicht replizierendes oder bezüglich Replikation beeinträchtigtes Pockenvirus, welches den Epitopstrang wie oben beschrieben codiert, zur Immunisierung eines Tieres gegen Malaria.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt liefert die Erfindung ein bezüglich Replikation beeinträchtigtes Pockenvirus, welches das P. falciparum-Antigen TRAP codiert, zur Immunisierung eines Tieres gegen Malaria, wobei der Virus der Vacciniastamm Modified Virus Ankara (MVA) ist.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt liefert die Erfindung einen rekombinanten Epitopstrang, welcher die CD8+ T-Zell-Epitope der Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 42 bis 64 umfasst.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt liefert die Erfindung ein rekombinantes Polypeptid, welches ein ganzes oder ein im Wesentlichen ganzes P. falciparum-Proteinantigen und einen Strang aus zwei oder mehreren Malaria-CD8+ T-Zell-Epitopen, ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 und 34, umfasst.
  • Die Erfindung ist nützlich für die Herstellung eines Kits zur Erzeugung einer schützenden CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen wenigstens ein Zielantigen durch die Verabreichung von wenigstens einer Dosis der Komponente (i), gefolgt von wenigstens einer Dosis der Komponente (ii) des Kits gemäß der Erfindung.
  • Vorzugsweise ist die Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope in (i) in dem Verfahren gemäß der Erfindung ein nichtviraler Vektor oder ein nichtreplizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter viraler Vektor, obwohl auch replizierende virale Vektoren verwendet werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) eine Nukleinsäure, welche DNA oder RNA sein kann, insbesondere ein rekombinantes DNA-Plasmid. Die DNA oder RNA kann verpackt sein, z. B. in einem Lysosom, oder sie kann in freier Form vorliegen.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ein Peptid, ein Polypeptid, ein Protein, ein Polyprotein oder ein Teilchen, das zwei oder mehr CD8+ T-Zell-Epitope umfaßt, die in einem rekombinanten Strang von CD8+ T-Zell-Epitopen oder in einem Zielantigen vorliegen. Polyproteine umfassen zwei oder mehr miteinander verbundene Proteine, welche die gleichen oder vorzugsweise verschiedene sein können. Besonders bevorzugt ist in dieser Ausführungsform ein rekombinantes Proteinteilchen, wie ein Ty-Virus-ähnliches Teilchen (VIP) (Burns et al., Molec. Biotechnol. 1994, 1: 137–145).
  • Vorzugsweise ist die Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope in der Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung) ein Vacciniavirusvektor, wie MVA oder NYVAC. Besonders bevorzugt ist der Vacciniastamm modifiziertes Virus Ankara (MVA) oder ein davon abgeleiteter Stamm. Alternativen zu Vacciniavektoren umfassen Geflügelpockenvektoren, wie Hühnerpocken- oder Kanarienvogelpockenvektoren. Besonders geeignet als ein Geflügelpockenvektor ist ein Stamm von Kanarienvogelpocken, der als ALVAC bekannt ist (handelsüblich als Kanapox erhältlich) und davon abgeleitete Stämme.
  • Pockenvirengenome können eine große Menge an heterologer genetischer Information tragen. Andere Anforderungen an virale Vektoren für die Verwendung in Impfstoffen umfassen gute Immunogenizität und Sicherheit. MVA ist ein bezüglich Replikation beeinträchtigter Vacciniastamm mit einem guten Sicherheitsnachweis. In den meisten Zelltypen und in normalen menschlichen Geweben repliziert MVA nicht; begrenzte Replikation von MVA beobachtet man in ein paar transformierten Zelltypen, wie BHK21-Zellen. Es wurde nun anhand der hierin beschriebenen Ergebnisse gezeigt, daß rekombinantes MVA und andere nichtreplizierende oder bezüglich Replikation beeinträchtigte Stämme überraschenderweise und signifikant besser sind als herkömmliche rekombinante Vacciniavektoren bei der Erzeugung einer schützenden CD8+ T-Zell-Antwort, wenn sie in einer verstärkenden Zusammensetzung nach einer Initialisierung mit einem DNA-Plasmid, einem rekombinanten Ty-VLP oder einem rekombinanten Adenovirus verabreicht werden.
  • Es wird deutlich, daß Vacciniavirusstämme, die von MVA abgeleitet sind, oder unabhängig entwickelte Stämme mit den Eigenschaften von MVA, welche MVA für eine Verwendung in einem Impfstoff besonders geeignet machen, auch für eine Verwendung in der Erfindung geeignet sind.
  • MVA, welches einen eingefügten Epitopstrang (MVA-HM, welches in den Beispielen beschrieben ist) enthält, wurde bei der europäischen Sammlung für Tierzellkulturen, CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK, unter der Hinterlegungsnr. V97060511 am 5. Juni 1997 hinterlegt.
  • Der Begriff ”nichtreplizierend” oder ”bezüglich Replikation beeinträchtig”, wie er hierin verwendet wird, bedeutet nicht fähig zur Replikation in einem signifikanten Ausmaß in der Mehr zahl normaler Säugerzellen oder normaler menschlicher Zellen. Viren, die nichtreplizierend oder bezüglich Replikation beeinträchtigt sind, können auf natürliche Weise (d. h. sie können als solche aus der Natur isoliert worden sein) oder auf künstliche Weise, z. B. durch Züchtung in vitro oder durch genetische Manipulation, z. B. Entfernung eines Gens, welches für die Replikation kritisch ist, so geworden sein. Es wird im allgemeinen einen oder ein paar Zelltypen geben, in denen die Viren gezüchtet werden können, wie CEF-Zellen für MVA.
  • Replikation eines Virus wird im allgemeinen auf zwei Weisen gemessen: 1) DNA-Synthese und 2) Virentiter. Genauer bedeutet der Ausdruck ”nichtreplizierend oder bezüglich Replikation beeinträchtigt”, wie er hierin verwendet wird und wie er auf Pockenviren zutrifft, Viren, welche eines oder beide der nachfolgenden Kriterien erfüllen:
    • 1) Aufweisen einer 1 log (10-fachen) Verminderung der DNA-Synthese, verglichen mit dem Kopenhagen-Stamm von Vacciniavirus, in MRC-5-Zellen (einer menschlichen Zellinie);
    • 2) Aufweisen einer 2 log Verminderung des Virentiters in HeLa-Zellen (einer menschlichen Zellinie), verglichen mit dem Kopenhagen-Stamm von Vacciniavirus.
  • Beispiele für Pockenviren, welche unter diese Definition fallen, sind MVA, NYVAC und Geflügelpockenviren, wogegen ein Virus, welches aus der Definition herausfällt, der abgeschwächte Vacciniastamm M7 ist.
  • Alternative bevorzugte virale Vektoren für die Verwendung in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) gemäß der Erfindung umfassen eine Vielzahl verschiedener Viren, die genetisch deaktiviert wurden, so daß sie nichtreplizierend oder bezüglich Replikation beeinträchtigt sind. Solche Viren umfassen z. B. nichtreplizierende Adenoviren, wie E1-Deletionsmutanten. Genetische Inaktivierung von Viren zur Herstellung von nichtreplizierenden oder bezüglich Replikation beeinträchtigten Vektoren ist in weitem Maße in der Literatur beschrieben worden (z. B. McLean et al., 1994).
  • Andere geeignete virale Vektoren zur Verwendung in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) sind Vektoren, die auf Herpesvirus und auf venezolanischem pferdeähnlichem Enzephalitisvirus (VEE) basieren (Davies et al., 1996). Geeignete bakterielle Vektoren zur Initialisierung umfassen rekombinante BCG und rekombinante Salmonella und Salmonella, die mit Plasmid-DNA transformiert sind (Darji A. et al., 1997, Cell 91: 765–775).
  • Alternative geeignete nichtvirale Vektoren zur Verwendung in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) umfassen Peptide mit Lipidanhang, bekannt als Lipopeptide, Peptide, die mit Trägerproteinen wie KLH entweder als Fusionsproteine oder durch chemische Verbindung miteinander verbunden sind, ganze Antigene mit Adjuvans und andere ähnliche Systeme. Adjuvanzien, wie QS21 oder SBAS2 (Stoute J. A. et al., 1997, N. Engl. J. Medicine 226: 86–91), können mit Proteinen, Peptiden oder Nukleinsäuren zur Verstärkung der Induktion von T-Zell-Antworten verwendet werden. Diese Systeme werden manchmal eher als ”Immunogene” und nicht als ”Vektoren” bezeichnet, aber sie sind hierin in dem Sinne Vektoren, daß sie die relevanten CD8+ T-Zell-Epitope tragen.
  • Die CD8+ T-Zell-Epitope, die entweder in den Initialisierungs- und Verstärkungszusammensetzungen (Priming- und Booster-Zusammensetzungen) vorhanden sind oder von diesen codiert werden, können in einer Vielzahl verschiedener Formen bereitgestellt werden, wie als ein rekombinanter Strang aus einem oder zwei oder mehr Epitopen oder in dem Kontext des nativen Zielantigens oder einer Kombination von beidem davon. CD8+ T-Zell-Epitope wurden für viele verschiedene Krankheiten identifiziert und können in der Literatur gefunden werden. Es ist möglich, Epitopstränge zur Erzeugung einer CD8+ T-Zell-Antwort gegen jedes ausgewählte Antigen, das diese Epitope enthält, zu entwerfen. Vorteilhafterweise sind die Epitope in einem Strang aus mehreren Epitopen ohne störende Sequenzen miteinander verbunden, so daß unnötiges Nukleinsäure- und/oder Aminosäurematerial vermieden wird. Zusätzlich zu den CD8+ T-Zell-Epitopen kann es bevorzugt sein, eines oder mehrere Epitope einzubinden, die von T-Helferzellen erkannt werden, um die von dem Epitopstrang erzeugte Immunantwort zu verstärken. Besonders geeignete T-Helferzellepitope sind solche, die in Individuen von verschiedenen HLA-Typen aktiv sind, z. B. T-Helferepitope von Tetanus (gegen welche die meisten Individuen bereits initialisiert sein werden). In den hierin beschriebenen Beispielen wird eine geeignete Kombination aus drei T-Helferepitopen verwendet. Es kann auch nützlich sein, B-Zell-Epitope zur Stimulierung von B-Zell-Antworten und Antikörperproduktion einzuschließen.
  • Die beschriebenen Initialisierungs- und Verstärkungszusammensetzungen (Priming- und Booster-Zusammensetzungen) können vorteilhafterweise ein Adjuvans umfassen. Insbesondere kann eine Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung), die einen DNA-Plasmidvektor enthält, auch Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (GM-CSF) oder ein Plasmid, welches diesen codiert, für eine Wirkung als ein Adjuvans enthalten; vorteilhafte Wirkungen sieht man bei Verwendung von GM-CSF in Polypeptidform.
  • Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen können als therapeutische oder prophylaktische Impfstoffe verwendet werden. Ob prophylaktische oder therapeutische Immunisierung geeigneter ist, wird üblicherweise von der Art der Krankheit abhängen. Zum Beispiel wird erwartet, daß man gegen Krebs eher therapeutisch immunisiert als bevor man ihn diagnostiziert hat, wogegen Anti-Malaria-Impfstoffe bevorzugt, jedoch nicht notwendigerweise als ein Prophylaktikum verwendet werden.
  • Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen können über eine Vielzahl verschiedener Wege verabreicht werden. Bestimmte Wege können für bestimmte Zusammensetzungen bevorzugt sein, da sie zur Erzeugung einer wirksameren Antwort führen oder da es unwahrscheinlicher ist, daß sie Nebenwirkungen hervorrufen oder da sie für die Verabreichung einfacher sind. Es wurde gezeigt, daß die vorliegende Erfindung mit einer Genpistolenverabreichung, entweder auf Goldperlen oder als ein Pulver, wirksam ist.
  • Unter weiteren Gesichtspunkten ist hierin beschrieben:
    • – die Verwendung eines rekombinanten, nichtreplizierenden oder bezüglich Replikation beeinträchtigten Pockenvirusvektors bei der Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung einer CD8+ T-Zell-Immunantwort;
    • – die Verwendung eines MVA-Vektors bei der Herstellung eines Medikaments zur Verstärkung einer CD8+ T-Zell-Immunantwort;
    • – ein Medikament zur Verstärkung einer initialisierten CD8+ T-Zell-Antwort gegen wenigstens ein Zielantigen oder Epitop, welches eine Quelle für ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens umfaßt, wobei die Quelle für CD8+ T-Zell-Epitope ein nichtreplizierender oder ein bezüglich Replikation beeinträchtigter rekombinanter Pockenvirusvektor ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger; und
    • – die hierin beschriebenen Initialisierungs- und/oder Verstärkungszusammensetzungen (Priming- und/oder Booster-Zusammensetzungen) in partikulärer Form und geeignet zur Verabreichung mittels einer Genpistole und Verfahren zur Immunisierung, welche die Verabreichung der Zusammensetzung mittels einer Genpistole umfassen.
  • Beispielformulierungen und Immunisierungsprotokolle
  • Formulierung 1
    Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung): DNA-Plasmid 1 mg/ml in PBS
    Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung): rekombinantes M VA, 108 ffu in PBS
    • Protokoll: Verabreichung von zwei Dosen mit 1 mg Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) im. nach 0 und 3 Wochen, gefolgt von zwei Dosen Verstärker (Booster) intradermal nach 6 und 9 Wochen.
    Formulierung 2
    Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung): Ty-VLP 500 μg in PBS
    Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung): MVA, 108 ffu in PBS
    • Protokoll: Verabreichung von zwei Dosen Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) im. nach 0 und 3 Wochen, anschließend zwei Dosen Verstärker (Booster) nach 6 und 9 Wochen. Zur Tumorbehandlung wird MVA iv. als einer der wirksamsten Wege gegeben.
    Formulierung 3
    Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung): Protein 500 μg + Adjuvans (QS-21)
    Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung): rekombinantes MVA, 108 ffu in PBS
    • Protokoll: Verabreichung von zwei Dosen Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) nach 0 und 3 Wochen und zwei Dosen Verstärker (Booster) id. nach 6 und 9 Wochen.
    Formulierung 4
    Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung): Adenovirusvektor, 109 pfu in PBS
    Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung): rekombinantes MVA, 108 ffu in PBS
    • Protokoll: Verabreichung von einer oder zwei Dosen Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) intradermal nach 0 und 3 Wochen und von zwei Dosen Verstärker (Booster) id. nach 6 und 9 Wochen.
  • Die oben genannten Dosen und Protokolle können zur Optimierung des Schutzes variiert werden. Dosen können z. B. eher mit einem Abstand von 1 bis 8 Wochen als mit einem Abstand von 2 Wochen gegeben werden.
  • Die Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen beschrieben.
  • BEISPIELE
  • BEISPIEL 1
  • Material und Methoden
  • Erzeugung der Epitopstränge.
  • Der Malariaepitopstrang wurde aus einer Reihe von Kassetten aufgebaut, von denen jede drei Epitope codierte, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, mit Restriktionsenzymschnittstellen an jedem Ende der Kassette. Jede Kassette wurde aus vier synthetischen Oligonukleotiden aufgebaut, welche aneinander annealt, in einen Klonierungsvektor ligiert und anschließend zur Überprüfung, daß keine Fehler eingebracht worden waren, sequenziert wurden. Einzelne Kassetten wurden anschließend nach Erfordernis miteinander verbunden. Die BamHI-Stelle an dem 3'-Ende von Kassette C wurde mit der BglII-Stelle am 5'-Ende von Kassette A verbunden, wobei beide Restriktionsenzymschnittstellen zerstört und ein zwei Aminosäuren langer Abstandshalter (GS) zwischen den zwei Kassetten codiert wurde. Die Kassetten B, D und H wurden anschließend auf die gleiche Art und Weise mit dem Strang verbunden. Es wurde auf die gleiche Weise auch ein längerer Strang aufgebaut, der CABDHFE enthielt. Tabelle 1. CTL-Epitope des Malaria-(M-)Stranges
    Figure 00140001
  • Tabelle 1 Sequenzen, die in dem Malariaepitopstrang enthalten sind. Jede Kassette besteht aus den oben gezeigten Epitopen in der dargestellten Reihenfolge ohne eine zusätzliche Sequenz zwischen Epitopen innerhalb einer Kassette. Eine BglII-Schnittstelle wurde an dem 5'-Ende und eine BamHI-Schnittstelle an dem 3'-Ende hinzugefügt, so daß zwischen Kassetten in einem Epitopstrang die BamHI-BglII-Verbindung GS codiert. Alle Epitope stammen von P. falci parum-Antigenen, ausgenommen pb9 (P. berghei), BCG (M. tuberculosis) und TT (Tetanus). Die Aminosäure- und DNA-Sequenzen, die in der Tabelle gezeigt sind, haben in der Reihenfolge, in der sie erscheinen, die SEQ ID NO. 1 bis 40.
  • 1 zeigt das zur Expression von Ty-VLP verwendete Konstrukt mit der Malariaepitopkassette CABDHFE. CTL-Epitope stammen von P. falciparum STARP (Threonin- und Asparagin-reiches Sporozoitprotein) (st), LSA-1 (Leberstadiumantigen 1) (1s), CSP (Circumsporozoitprotein) (cp), TRAP (mit Thrombospondin verwandtes Haftprotein) (tr), LSA-3 (Leberstadiumantigen 3) (Ia) und Exp-1 (exportiertes Protein 1) (ex). Helferepitope stammen von dem P. falciparum CS-Protein, dem M. tuberculosis 38kD-Antigen und von Tetanus-Toxoid. NANP ist das Antikörperepitop von CS, und AM ist das Haftmotiv von P. falciparum TRAP (Muller et al., 1993). Die Länge des vollständigen Stranges beträgt 229 Aminosäuren, wie es in der Legende von Tabelle 1 gezeigt ist, mit der folgenden Aminosäuresequenz:
    Figure 00150001
  • Der HIV-Epitopstrang wurde auch durch Annealen von Oligonukleotiden synthetisiert. Am Ende wurden die HIV- und Malariaepitopstränge durch Verbinden der BamHI-Schnittstelle am 3'-Ende der HIV-Epitope mit der BglII-Schnittstelle am 5'-Ende der Kassetten CAB unter Bildung des HM-Strangs verbunden (Tabelle 2). Tabelle 2. CTL-Epitope des HIV/SIV-Epitopstrangs
    Epitop Beschränkung Ursprung
    YLKDQQLL A24, B8 HIV-1 gp41
    ERYLKDQQL B14 HIV-1 gp41
    EITPIGLAP Mamu-B*01 SIV env
    PPIPVGEIY B35 HIV-1 p24
    GEIYKRWII B8 HIV-1 p24
    KRWIILGLNK B*2705 HIV-1 p24
    IILGLNKIVR A33 HIV-1 p24
    LGLNKIVRMY Bw62 HIV-1 p24
    YNLTMKCR Mamu-A*02 SIV env
    RGPGRAFVTI A2, H-2Dd HIV-1 gp120
    GRAFVTIGK B*2705 HIV-1 gp120
    TPYDINQML B53 HIV-2 gag
    CTPYDINQM Mamu-A*01 SIV gag
    RPQVPLRPMTY B51 HIV-1 nef
    QVPLRPMTYK A*0301, A11 HIV-1 nef
    VPLRPMTY B35 HIV-1 nef
    AVDLSHFLK A11 HIV-1 nef
    DLSHFLKEK A*0301 HIV-1 nef
    FLKEKGGL B8 HIV-1 nef
    ILKEPVHGV A*0201 HIV-1 pol
    ILKEPVHGVY Bw62 HIV-1 pol
    HPDIVIYQY B35 HIV-1 pol
    VIYQYMDDL A*0201 HIV-1 pol
  • Tabelle 2 Sequenzen von Epitopen von HIV oder SIV, die in dem H-Epitopstrang enthalten sind und zusammengesetzt wurden, wie es in 2 gezeigt ist. Die Aminosäuren in der Tabelle haben die SEQ ID NO. 62 bis 64 in der Reihenfolge, in der sie erscheinen.
  • 2 zeigt eine schematische Übersicht der H-, M- und HM-Proteine. Die Balkenmuster auf den schematischen Darstellungen der Polyepitopproteine zeigen den Ursprung der Sequenz (siehe Tabellen 1 und 2). Die Positionen einzelner Epitope und deren MHC-Beschränkungen sind über und unter den Proteinen angegeben. Pb ist das einzige Epitop, das von dem Protein von P. berghei abgeleitet ist. Alle anderen Epitope in dem M-Protein stammen von Proteinen von P. falciparum: cs – Circumsporozoitprotein, st – STARP, ls – LSA-1 und tr – TRAP; BCG – 38kDa-Protein von M. tuberculosis; TT – Tetanustoxin.
  • Für den Anti-Tumor-Impfstoff wurde ein CTL-Epitope enthaltender Epitopstrang erzeugt, ähnlich dem Malaria- und HIV-Epitopstrang. In diesem Tumorepitopstrang wurden veröffentlichte Maus-CTL-Epitope miteinander verbunden, um den Tumorepitopstrang mit der folgenden Aminosäuresequenz zu erzeugen: MLPYLGWLVF-AQHPNAELL-KHYLFRNL-SPSYVYHQF-IPNPLLGLD [SEQ ID NO: 65]. Hierin gezeigte CTL-Epitope wurden miteinander verbunden. Die erste Aminosäure Methionin wurde zur Initiierung der Translation eingebracht.
  • Ty-Virus-artige Partikel (VLPs).
  • Der Epitopstrang, der die Kassette CABDH enthielt, wurde zur Herstellung einer C-terminalen Fusion im Leserahmen mit dem TyA-Protein in einen Hefe-Expressionsvektor eingebracht. Wenn TyA oder TyA-Fusionsproteine in Hefe von diesem Vektor exprimiert werden, bildet das Protein spontan virusartige Partikel, welche aus dem Zytoplasma der Hefe mittels Sucrose-Gradientenzentrifugation gereinigt werden können. Rekombinate Ty-VLPs wurden auf diese Art und Weise hergestellt und gegen PBS dialysiert, um die Sucrose vor einer Injektion zu entfernen (siehe Layton et al., 1996).
  • Adenoviren
  • Bezüglich Replikation defektes, rekombinantes Adenovirus mit einer Deletion der E1-Gene wurde in dieser Studie verwendet (McGrory et al., 1988). Das Adenovirus exprimierte E. coli-β-Galaktosidase unter der Kontrolle eines CMV-IE-Promotors. Für Immunisierungen wurden 107 pfu Virus intradermal in das Ohrläppchen verabreicht.
  • Peptide
  • Peptide wurden von Research Genetics (USA) bezogen, zu 10 mg/ml in DMSO (Sigma) gelöst und weiter auf 1 mg/ml in PBS verdünnt. Peptide, die CTL-Epitope enthielten, welche in den hierin beschriebenen Experimenten verwendet wurden, sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3. Sequenz von CTL-Peptidepitopen
    Sequenz Antigen MHC-Beschränkung
    LPYLGWLFV P1A-Tumor-Antigen Ld
    SYIPSAEKI P. berghei CSP Kd
    RGPGRAFVTI HIV gag Dd
    TPHPARIGL E. coli β-Galaktosidase Ld
    TYQRTRALV Influenza-A-Virus NP Kd
    SDYEGRLI Influenza-A-Virus NP Kk
    ASNENMETM Influenza-A-Virus NP Db
    INVAFNRFL P. falciparum TRAP Kb
  • Die Aminosäuresequenzen in Tabelle 3 haben die SEQ ID NO: 66 bis 73 in der Reihenfolge, in welcher sie in der Tabelle erscheinen.
  • Plasmid-DNA-Konstrukte
  • Eine Anzahl verschiedener Vektoren wurde zur Herstellung von DNA-Impfstoffen verwendet. Das Plasmid pTH enthält den CMV-IE-Promotor mit Intron A, gefolgt von einem Polylinker, um die Einbringung von Antigen codierenden Sequenzen zu erlauben, und die Rinderwachstumshormon-Transkriptionsterminierungssequenz. Das Plasmid trägt das Ampicillin-Resistenzgen und ist zur Replikation in E. coli, aber nicht in Säugerzellen in der Lage. Dieses wurde zur Herstellung von DNA-Impfstoffen verwendet, welche jeweils die folgenden Antigene exprimieren: P. berghei TRAP, P. berghei CS, P. falciparum TRAP, P. falciparum LSA-1 (nur 278 Aminosäuren des C-Terminus), den die Kassetten CABDH enthaltenden Epitopstrang und den HM-Epitopstrang (HIV-Epitope, gefolgt von Kassetten CAB). Das Plasmid pSG2 ist ähnlich wie pTH mit Ausnahme des Antibiotika-Resistenzgens. In pSG2 wurde das Ampicillin-Resistenzgen von pTH durch ein Kanamycin-Resistenzgen ersetzt pSG2 wurde zur Herstellung von DNA-Impfstoffen verwendet, welche die folgenden Antigene exprimieren: P. berghei PbCSP, einen Maus-Tumor-Epitopstrang, den Epitopstrang, der Kassetten CABDH enthält, und den HM-Epitopstrang. Das Plasmid V1J-NP exprimiert Influenza-Nukleoprotein unter der Kontrolle eines CMV-IE-Promotors. Die Plasmide CMV-TRAP und CMV-LSA-1 sind ähnlich wie pTH.TRAP und pTH.LSA-1, enthalten aber nicht Intron A des CMV-Promotors. Die Plasmide RSV.TRAP und RSV.LSA-1 enthalten den RSV-Promotor, die SV40-Transkriptionsterminierungssequenz und sind tetracyclinresistent. Zur Induktion von β-galaktosidasespezifischem CTL-Plasmid wurde pcDNA3/His/LacZ (Invitrogen) verwendet. Alle DNA-Impfstoffe wurden aus dem E. coli-Stamm DH5α unter Verwendung von Qiagen-Plasmidreinigungssäulen hergestellt.
  • Erzeugung von rekombinanten Vacciniaviren
  • Rekombinate MVAs wurden hergestellt, indem zuerst die Antigensequenz in einen Transportervektor mit einem viralen Promotor, wie das Plasmid pSC11, kloniert wurde (Chakrabarti et al., 1985; Morrison et al., 1989). P. berghei CS und P. falciparum TRAP, Influenza-Nukleoprotein und der HM- und Maus-Tumorepitop-Polyepitopstrang wurden jeweils unter Verwendung des P7.5-Promotors (Mackett et al., 1984) exprimiert, und P. berghei TRAP wurde unter Verwendung des starken synthetischen Promotors (SSP; Carroll et al., 1995) exprimiert. Die Transportervektoren pSC11 oder pMCO3 wurden dann verwendet, um Zellen, die mit Wildtyp-MVA infiziert waren, zu transformieren, so daß virale Sequenzen den Promotor flankierten, wobei Antigen codierende Sequenz und Markergen mit dem MVA rekombinieren und Rekombinanten produzieren konnten. Rekombinante Viren exprimieren das Markergen (β-Glucoronidase oder β-Galaktosidase), welches eine Identifizierung von Plaques, die rekombinantes Virus enthalten, erlaubt. Rekombinante wurden vor einer Verwendung in Immunisierungen wiederholt plaquegereinigt. Die Rekombinante NYVAC-PbCSP-Vaccinia wurde früher beschrieben (Lanar et al., 1996). Der Wildtyp- oder Western Reserve-(WR-)Strang von rekombinantem Vaccinia, welche PbCSP codieren, wurde früher beschrieben (Satchidanandam et al., 1991).
  • Zellen und Kulturmedium
  • Mauszellen und mit Epstein-Barr-Virus transformierte Schimpansen- und Makaken-B-Zellen (BCL) wurden in RPMI kultiviert, welches mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FCS) versetzt war. Splendozyten wurden mit den angegebenen Peptiden (Endkonzentration: 1 μg/ml) in MEM-Medium mit 10% FCS, 2 mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin, 50 μM 2-Mercaptoethanol und 10 mM Hepes, pH 7,2 (Gibco, UK) restimuliert.
  • Tiere
  • Mäuse der angegebenen Stämme im Alter von 6–8 Wochen wurden von Harlan Olac (Shaws Farm, Blackthorn, UK) bezogen. Schimpansen H1 und H2 wurden am biomedizinischen Primatenforschungszentrum in Rijswick, Niederlande, untersucht. Makaken wurden an der Universität von Oxford untersucht.
  • Immunisierungen
  • Plasmid-DNA-Immunisierungen von Mäusen wurden durch intramuskuläre Immunisierung der DNA in den musculus tibialis unter Betäubung durchgeführt. Der Mäusemuskel wurde in manchen Fällen 5–9 Tage vor der Immunisierung mit 50 μl 1 mM Kardiotoxin (Latoxan, Frankreich) vorbehandelt, wie von Davis et al. (1993) beschrieben, aber es wurde nicht gefunden, daß das Vorhandensein oder Fehlen solch einer Vorbehandlung irgendeine signifikante Auswirkung auf die Immunogenizität oder die schützende Wirkung hat. MVA-Immunisierung von Mäusen wurde entweder durch intramuskuläre (im.), intravenöse (in die seitliche Schwanzvene) (iv.), intradermale (id.), intraperitoneale (ip.) oder subkutane (sc.) Immunisierung durchgeführt. Plasmid-DNA- und MVA-Immunisierung der Schimpansen H1 und H2 wurde unter Betäubung durch intramuskuläre Immunisierung von Beinmuskeln durchgeführt. Für diese Schimpansenimmunisierungen wurde die Plasmid-DNA gemeinsam mit 15 μg humanem GM-CSF als ein Adjuvans verabreicht. Verabreichung von rekombinantem MVA an die Schimpansen wurde durch intramuskuläre Immunisierung unter tierärztlicher Aufsicht durchgeführt. Rekombinantes humanes GM-CSF wurde von Sandoz (Camberley, UK) bezogen. Für Plasmid-DNA-Immunisierungen unter Verwendung einer Genpistole wurde DNA auf Goldpartikel präzipitiert. Für intradermale Verabreichung wurden zwei verschiedene Typen von Genpistolen verwenden, die Acell- und die Oxford Bioscience-Vorrichtung (PowderJect Pharmaceuticals, Oxford, UK).
  • ELISPOT-Tests
  • CD8+ T-Zellen wurden in den Milzen von immunisierten Mäusen ohne in vitro Restimulierung unter Verwendung der angegebenen Peptidepitope und des ELISPOT-Tests, wie von Miyahara et al. (1993) beschrieben, quantifiziert. Kurz gesagt wurden Nitrozelluloseplatten mit 96 Reaktionsräumen (Miliscreen MAHA, Millipore, Redford, UK) mit 15 μg/ml des monoklonalen Anti-Maus-Interferon-γ-Antikbrpers R4 (EACC) in 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) beschichtet. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Reaktionsräume einmal mit PBS gewaschen und für eine Stunde bei Raumtemperatur mit 100 μl RPMI mit 10% FCS blockiert. Splenozyten von immunisierten Mäusen wurden auf 1 × 107 Zellen/ml resuspendiert und in Duplikaten in die mit Antikörper beschichteten Reaktionsräume gegeben und der Reihe nach verdünnt. Peptide wurden in jedem Reaktionsraum bis zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml hinzugefügt. Zusätzliche Reaktionsräume ohne Peptid wurden als eine Kontrolle für die Peptidabhängigkeit von Interferon-γ-Abscheidung verwendet. Nach Inkubation bei 37°C in 5% CO2 für 12–18 Stunden wurden die Platten sechsmal mit PBS und Wasser gewaschen. Die Reaktionsräume wurden dann für 3 Stunden bei Raumtemperatur mit einer Lösung von 1 μg/ml biotinyliertem monoklonalem Anti-Maus-Interferon-γ-Antikbrper XMG1.2 (Pharmingen, CA, USA) in PBS inkubiert.
  • Nach weiteren Waschschritten mit PBS wurde eine 1 μg/ml Lösung von Streptavidin-alkalische Phosphatase-Polymer (Sigma) für 2 Stunden bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Punkte wurden durch Zugabe von 50 μl alkalische Phosphatase-Konjugat-Substrat-Lösung (Biorad, Hercules, CA, USA) entwickelt. Nach dem Erscheinen von Punkten wurde die Reaktion durch Waschen mit Wasser gestoppt. Die Anzahl an Punkten wurde mit Hilfe eines Stereomikroskops bestimmt.
  • ELISPOT-Tests an den Schimpansen-Peripherblutlymphozyten wurden unter Verwendung einer sehr ähnlichen Methode durchgeführt, wobei der Test und die Reagenzien verwendet wurden, die zur Detektion von humanen CD8 T-Zellen entwickelt wurden (Mabtech, Stockholm).
  • CTL-Tests
  • CTL-Tests wurden unter Verwendung von mit Chrom markierten Zielzellen, wie angegeben, und mit kultivierten Maus-Milzzellen als Effektorzellen durchgeführt, wie von Allsopp et al. (1996) beschrieben. CTL-Tests unter Verwendung von Schimpansen- oder Makaken-Zellen wurden durchgeführt, wie es für die Detektion von humanem CTL von Hill et al. (1992) beschrieben ist, wobei EBV-transformierte autologe Schimpansen- oder Makaken-B-Zellinien als Zielzellen verwendet wurden.
  • P. berghei-Exposition
  • Mäuse wurden 2000 (BALB/c) oder 200 (C57BL/6) Sporozoiten des Stammes P. berghei ANKA in 200 μl RPMI durch intravenöse Inokulierung, wie beschrieben (Lanar et al., 1996) ausgesetzt. Diese Sporozoiten wurden aus den Speicheldrüsen von Anopheles stephensi-Moskitos, die bei 18°C für 20–25 Tage nach Verfüttern an infizierte Mäuse gehalten wurden, präpariert. Malariainfektion im Blutstadium, welche ein Versagen der Immunisierung anzeigte, wurde durch Beobachten des Erscheinens von Ringformen von P. berghei in Gimsa-gefärbten Blutausstrichen, die 5–12 Tage nach der Exposition genommen wurden, festgestellt.
  • P. falciparum-Exposition
  • Die Schimpansen wurden 20.000 P. falciparum-Sporozoiten des NF54-Stammes, der aus den Speicheldrüsen von Anopheles gambiae-Moskitos präpariert worden waren, durch intravenöse Inokulierung unter Betäubung ausgesetzt. Blutproben von diesen Schimpansen wurden täglich ab dem Tag 5 nach der Exposition durch Mikroskopie und Parasitenkultur untersucht, um das Auftreten geringer Mengen an P. falciparum-Parasiten in dem peripheren Blut festzustellen.
  • P815-Tumor-Expositionen
  • Mäuse wurden 1 × 105 P815-Zellen in 200 μl PBS durch intravenöse Inokulierung ausgesetzt. Das Überleben der Tiere wurde überwacht.
  • Influenzavirus-Expositionen
  • Mäuse wurden 100 hämagglutinierenden Einheiten (HA) von Influenzavirus A/PR/8/34 durch intranasale Inokulierung ausgesetzt. Nach der Exposition wurden die Tiere täglich gewogen und ihr Überleben beobachtet.
  • Bestimmung von peptidspezifischem CTL unter Verwendung von Tetrameren
  • Tetramere Komplexe, bestehend aus schwerer Kette von Mamu-A*01 und β2-Mikroglobulin wurden hergestellt, wie es von Ogg et al. (1998) beschrieben ist. DNA, welche den führungslosen extrazellulären Abschnitt der schweren Kette von Mamu-A*01-MHC-Klasse I codiert, wurde mittels PCR von cDNA vervielfältigt unter Verwendung des 5'-Primers MamuNdel: 5'-CCT GAC TCA GAC CAT ATG GGC TCT CAC TCC ATG [SEQ ID NO: 74] und des 3'-Primers: 5'-GTG ATA AGC TTA ACG ATG ATT CCA CAC CAT TTT CTG TGC ATC CAG AAT ATG ATG CAG GGA TCC CTC CCA TCT CAG GGT GAG GGG C [SEQ ID NO: 75]. Der erstgenannte Primer enthielt eine Ndel-Restriktionsschnittstelle, der letztgenannte umfaßte eine HindIII-Schnittstelle und codierte das Substratpeptid für das Biotinylierungsenzym BirA. PCR-Produkte wurden mit Ndel und HindIII verdaut und in die gleichen Schnittstellen des Polylinkers des bakteriellen Expressionsvektors pGMT7 ligiert. Das Rhesusaffengen, welches ein führungsloses β2-Mikroglobulin codiert, wurde mittels PCR von einem cDNA-Klon vervielfältigt unter Verwendung der Primer B2MBACK: 5'-TCA GAC CAT ATG TCT CGC TCC GTG GCC [SEQ ID NO: 76] und B2MFOR: 5'-TCA GAC AAG CTT TTA CAT GTC TCG ATC CCA C [SEQ ID NO: 77] und in gleicher Weise in die Ndel- und HindIII-Schnittstellen von pGMT7 kloniert. Beide Ketten wurden in dem E. coli-Stamm BL-21 exprimiert, von Einschlußkörpern gereinigt, in der Gegenwart des Peptids CTPYDINQM [SEQ ID NO: 54] erneut gefaltet, unter Verwendung des BirA-Enzyms (Avidity) biotinyliert und mit FPLC- und MonoQ-Ionenaustauschersäulen gereinigt. Die Menge an biotinylierten, erneut gefalteten MHC-Peptidkomplexen wurde in einem ELISA-Test abgeschätzt, wobei monomere Komplexe zuerst durch konformationssensitiven monoklonalen Antikörper W6/32 eingefangen und durch mit alkalischer Phosphatase (AP) konjugiertem Streptavidin (Sigma), gefolgt von kolorimetrischem Substrat für AP, detektiert wurden. Die Bildung von tetrameren Komplexen wurde durch Zugabe von mit Phycoerythrin (PE) konjugiertem Streptavidin (ExtrAvidin; Sigma) zu den erneut gefalteten, biotinylierten Monomeren in einem molaren Verhältnis von MHC-Peptid:PE-Streptavidin von 4:1 induziert. Die Komplexe wurden in der Dunkelheit bei 4°C gelagert. Diese Tetramere wurden dazu verwendet, die Häufigkeit von Mamu-A*01/gag-spezifischen CD8+ T-Zellen in Peripherblutlymphozyten (PBL) von immunisierten Makaken zu analysieren.
  • BEISPIEL 2
  • Immunogenizitätsstudien in Mäusen
  • Frühere Studien der Induktion von CTL gegen Epitope in dem Circumsporozoit-(CS-)Protein von Plasmodium berghei und Plasmodium yoelii haben variable Niveaus an CTL-Induktion bei verschiedenen Auslieferungssystemen gezeigt. Es wurde von teilweisem Schutz mit Plasmid-DNA (Sedegah et al., 1994), Influenzavirus, verstärkt durch replizierenden Vacciniavirus (Li et al., 1991), Adenovirus (Rodrigues et al., 1997) und Teilchenauslieferungssystemen (Schodel et al., 1994) berichtet. Intramuskuläre Immunisierung von Mäusen mit 50 μg eines Plasmides, welche das CS-Protein codiert, produzierte moderate Mengen an CD8+ -Zellen und CTL-Aktivität in den Milzen dieser Mäuse nach einer einzelnen Injektion (3, 4).
  • Zum Vergleich wurden Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 5) intravenös mit 106 ffu/pfu rekombinanten Vacciniaviren verschiedener Stämme (WR, NYVAC und MVA), welche alle P. berghei CSP exprimieren, injiziert. Die Häufigkeit peptidspezifischer CD8+ T-Zellen wurde 10 Tage später in einem ELISPOT-Test gemessen. MVA.PbCSP induzierte 181 ± 48, NYVAC 221 ± 27 und WR 94 ± 19 (Mittelwert ± Standardabweichung) peptidspezifische CD8+ T-Zellen pro 1 Million Splenozyten. Diese Ergebnisse zeigen, daß bezüglich Replikation beeinträchtigte Vacciniaviren gegenüber replizierenden Stämmen in der Initialisierung einer CD8+ T-Zell-Antwort überraschenderweise besser sind. Wir versuchten anschließend, diese moderaten CD8+ T-Zell-Antworten, die durch Induzieren entweder mit Plasmid-DNA oder mit MVA unter Verwendung homologer oder heterologer Vektoren induziert wurde, zu verstärken. Es wurde eine niedrige Menge an CD8+ T-Zellen nach zwei Immunisierungen mit CS-rekombinantem DNA-Impfstoff alleine, dem rekombinanten MVA-Impfstoff alleine oder dem rekombinanten MVA, gefolgt von rekombinanter DNA, beobachtet (3). Eine viel höhere Menge an CD8+ T-Zellen wurde durch Verstärken der durch DNA initialisierten Immunantwort mit rekombinantem MVA beobachtet. In einem zweiten Experiment unter Verwendung von zehn Mäusen pro Gruppe wurde die erhöhte Immunogenizität der DNA/MVA-Abfolge bestätigt: DNA/MVA 856 ± 201; MVA/DNA 168 ± 72; MVA/MVA 345 ± 90; DNA/DNA 92 ± 46. Daher lieferte die Abfolge einer ersten Immunisierung mit einem rekombinanten Plasmid, welches das CS-Protein codiert, gefolgt von einer zweiten Immunisierung mit dem rekombinanten MVA-Virus die höchsten Niveaus an CD8+ T-Lymphozyten-Antwort nach der Immunisierung.
  • 3 zeigt Malaria-CD8 T-Zell-ELISPOT-Daten nach verschiedenen Immunisierungsschemas. Ergebnisse sind als die Anzahl peptidspezifischer T-Zellen pro 1 Million Splenozyten wiedergegeben. Mäuse wurden entweder mit der PbCSP-Plasmid-DNA oder dem PbCSP-MVA-Virus oder Kombinationen der zwei, wie es auf der X-Achse gezeigt ist, in Intervallen von zwei Wochen immunisiert, und die Anzahl an Splenozyten, die für das pb9-Malariaepitop spezifisch waren, wurde zwei Wochen nach der letzten Immunisierung untersucht. Jeder Punkt repräsentiert die Anzahl an punktbildenden Zellen (SFCs), die in einer einzelnen Maus gemessen wurden. Die höchste Menge an CD8+ T-Zellen wurde durch Initialisieren mit der Plasmid-DNA und Verstärkung mit dem rekombinanten MVA-Virus induziert. Dies war immunogener als die umgekehrte Reihenfolge der Immunisierung (MVA/DNA), als zwei DNA-Immunisierungen (DNA/DNA) oder als zwei MVA-Immunisierungen (MVA/MVA). Es war auch immunogener als die gleichzeitig verabreichten DNA- und MVA-Immunisierungen (DNA + MVA 2w), als eine DNA-Immunisierung (DNA 4w) oder eine MVA-Immunisierung, die zu dem früheren oder späteren Zeitpunkt verabreicht wurde (MVA 2w und MVA 4w).
  • 4 zeigt, daß Malaria-CD8 T-Zell-ELISPOT und CTL-Mengen durch eine Immunisierung mit rekombinantem MVA nach Initialisierung mit einer Plasmid-DNA, welche das gleiche Antigen codiert, erheblich verstärkt werden. A und C. CD8+ T-Zell-Antworten wurden in BALB/c-Mäusen unter Verwendung des γ-Interferon-ELISPOT-Tests auf frischen Splenozyten, die für 18 Stunden mit dem Kd-beschränkten Peptid SYIPSAEKI [SEQ ID NO: 67] aus P. berghei CSP und dem Ld-beschränkten Peptid TPHPARIGL [SEQ ID NO: 69] aus E. coli β-Galaktosidase inkubiert worden waren, gemessen. Es sei angemerkt, daß die ELISPOT-Werte auf einem logarithmischen Maßstab angegeben sind. B und D. Splenozyten aus den gleichen Mäusen wurden auch in herkömmlichen 51Cr-Freisetzungstests bei einem Effektor:Ziel-Verhältnis von 100:1 nach sechs Tagen in vitro-Restimulierung mit den gleichen Peptiden (1 μg/ml) untersucht.
  • Die Mäuse wurden mit Plasmid-DNA immunisiert, welche entweder P. berghei CSP und TRAP, PbCSP alleine, die Malariaepitopkassette, welche das P. berghei CTL-Epitop (markiert mit pTH.M) enthielt, oder β-Galaktosidase exprimiert. ELISPOT- und CTL-Mengen, die in Mäusen 23 Tage nach einer DNA-Immunisierung gemessen wurden, sind in A bzw. B gezeigt. Die gleichen Tests wurden mit Tieren durchgeführt, die zusätzlich 1 × 107 ffu rekombinantes MVA, welches das (die) gleiche(n) Antigen(e) zwei Wochen nach der ersten Immunisierung exprimierten, erhielten. Die ELISPOT- und CTL-Mengen in diesen Tieren sind in C bzw. D gezeigt. Jeder Balken repräsentiert Daten von einem einzelnen Tier.
  • Es wurden auch Untersuchungen der Immunogenizität des Epitopstrangs HM durchgeführt, welcher sowohl HIV- als auch Malariaepitope in Tandemanordnung enthält. Unter Verwendung dieses Epitopstrangs wurden wiederum die höchsten Mengen an CD8+ T-Zellen und CTL in der Milz erzeugt, wenn eine Immunisierung mit DNA-Impfstoff, gefolgt von einer Immunisierung mit einem rekombinanten MVA-Impfstoff angewendet wurde (Tabelle 4, 5). Tabelle 4 – Immunogenizität verschiedener DNA/MVA-Kombinationen, bestimmt durch ELISPOT-Tests
    Immunisierung 1 Immunisierung 2 HIV-Epitop Malaria-Epitop
    DNA-HM DNA-HM 56 ± 26 4 ± 4
    MVA-HM MVA-HM 786 ± 334 238 ± 106
    MVA-HM DNA-HM 306 ± 78 56 ± 18
    DNA-HM MVA-HM 1000 ± 487 748 ± 446
    Keine DNA-HM 70 ± 60 100 ± 10
    Keine MVA-HM 422 ± 128 212 ± 94
  • Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse von ELISPOT-Tests, die durchgeführt wurden, um die Mengen an spezifischen CD8+ T-Zellen auf HIV- und Malariaepitope nach verschiedenen Immu nisierungsschemas mit Plasmid-DNA und MVA, wie es angegeben ist, zu messen. Die Zahlen bedeuten punktbildende Zellen pro 1 Million Splenozyten. Der HM-Epitopstrang ist in 2 erläutert. In allen Fällen wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Das Malariaepitop war pb9, wie in den 2 und 3. Das HIV-Epitop war RGPGRAFVTI [SEQ ID NO: 51]. Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg Plasmid-DNA oder 10 fokusbildende Einheiten (ffu) rekombinantes MVA. Alle Immunisierungen wurden intramuskulär durchgeführt. Das Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug in allen Fällen von 14–21 Tagen.
  • 5 zeigt die CTL-Antworten, die in BALB/c-Mäusen auf Malaria- und HIV-Epitope nach verschiedenen Immunisierungsschemas, welche Plasmid-DNA und rekombinantes MVA verwendeten, induziert wurden. Mäuse wurden intramuskulär immunisiert, wie es in der Legende zu Tabelle 3 und unter Methoden beschrieben ist. Hohe Mengen an CTL (> 30% spezifische Lyse bei Effektor/Ziel-Verhältnissen von 25:1) wurden sowohl für das Malaria- als auch das HIV-Epitop nur nach Initialisierung mit Plasmid-DNA und Verstärkung mit dem rekombinanten MVA beobachtet. Das in diesem Experiment verwendete Antigen ist der HIV-Malaria-Epitopstrang. Das rekombinante MVA ist als MVA.HM bezeichnet und die Plasmid-DNA, welche diesen Epitopstrang exprimiert, ist als pTH.HM bezeichnet. Ausmaße an spezifischer Lyse bei verschiedenen Effektor-zu-Ziel-Verhältnissen sind gezeigt. Diese wurden nach 5 Tagen in vitro-Restimulierung von Splenozyten mit den zwei Peptiden pb9 und RGPGRAFVTI [SEQ ID NO: 51] bestimmt.
  • Ein Vergleich vieler Auslieferungssysteme für die Induktion von CTL wurde von Allsopp et al. (1996) beschrieben. Rekombinante Ty-virusartige Teilchen (TyVLPs) und Malariapeptide mit Lipidschwanz lieferten beide eine gute CTL-Induktion, aber Ty-VLPs waren dahingehend besser, daß sie nur eine einzelne immunisierende Dosis für eine gute CTL-Induktion benötigten. Jedoch konnten, wie es hierin gezeigt ist, sogar zwei Dosen Ty-Partikel keinen signifikanten Schutz gegen eine Sporozoitenexposition induzieren (Tabelle 7, Zeile 1). Immunisierung mit einem rekombinanten, modifizierten Vaccinia-Ankara-Virus, welches das Circumsporozoitenprotein von P. berghei codierte, erzeugte auch gute Mengen an CTL. Jedoch erzielt man ein viel höheres Niveau an CD8+ T-Zell-Antwort durch eine erste Immunisierung mit dem Ty-VLP, gefolgt von einer zweiten Immunisierung mit dem MVA-CS-Impfstoff (Tabelle 5). Tabelle 5 – Immunogenizität verschiedener Ty-VLP/MVA-Kombinationen, bestimmt durch ELISPOT- und CTL-Tests
    Immunisierung 1 Immunisierung 2 ELISPOT Nr. % spezifische Lyse
    Ty-CABDH Ty-CABDH 75 15
    MVA.PbSCP MVA.PbCSP 38 35
    Ty-CABDH MVA.PbCSP 225 42
    Ty-CABDH MVA.HM 1930 nd
  • Tabelle 5: Ergebnisse von ELISPOT- und CTL-Tests, durchgeführt zur Messung der Mengen an spezifischen CD8+ T-Zellen auf das Malariaepitop pb9 gemäß verschiedenen Immunisierungsschemas mit Ty-VLPs und rekombinantem MVA-Virus, wie angegeben. Die CTL- und ELISPOT-Daten stammen aus verschiedenen Experimenten. Die ELISPOT-Mengen (Punkte pro 1 Million Splenozyten) werden an nicht-restimulierten Zellen und die CTL-Aktivität, angegeben als spezifische Lyse bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 40:1, an Zellen, die mit pb9-Peptid in vitro für 5–7 Tage restimuliert wurden, gemessen. Beide repräsentieren Mittelwertmengen von drei Mäusen. In allen Fällen wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg für Ty-VLP oder 107 ffu (focibildende Einheiten) rekombinantes MVA. Alle Immunisierungen wurden intramuskulär durchgeführt. Das Intervall zwischen Immunisierungen 1 und 2 betrug 14–21 Tage. MVA.HM umfaßt die Kassetten CAB.
  • Initialisierung einer Immunantwort mit DNA, verabreicht mittels einer Genpistole, und Verstärkung mit rekombinantem MVA
  • Immunogenizität und Exposition
  • Die Verwendung einer Genpistole zur intradermalen Verabreichung von Plasmid-DNA und die Initialisierung einer Immunantwort dabei, welche mit rekombinantem MVA verstärkt werden konnte, wurde untersucht. Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden nach dem folgenden Schema immunisiert:
    • I) Drei Genpistolen-Immunisierungen mit pTH.PbCSP (4 mg pro Immunisierung) in Intervallen von zwei Wochen;
    • II) zwei Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von MVA iv. zwei Wochen später;
    • III) eine intramuskuläre DNA-Immunisierung, gefolgt von MVA iv. zwei Wochen später.
  • Die Immunogenizität der drei Immunisierungsschemas wurde unter Verwendung des ELISPOT-Tests analysiert. Die höchste Häufigkeit spezifischer T-Zellen wurde mit zwei Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von einer Verstärkung mit MVA iv., und mit der intramuskulären DNA-Injektion, gefolgt von einer Verstärkung mit MVA iv., beobachtet (6).
  • 6 zeigt die Ergebnisse von ELISPOT-Tests, durchgeführt zur Messung der Mengen an spezifischen CD8+ T-Zellen auf das Malariaepitop pb9 nach verschiedenen Immunisierungsschemas. Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 3) wurden immunisiert, wie es angegeben ist (g. g. = Genpistole). Die Zeit zwischen allen Immunisierungen betrug 14 Tage. ELISPOT-Tests wurden zwei Wochen nach der letzten Immunisierung durchgeführt.
  • CTL-Induktion auf das gleiche Antigen in verschiedenen Mäusestämmen
  • Um die Frage anzusprechen, ob die oben in BALB/c-Mäusen beschriebene Verstärkungswirkung mit zwei CTL-Epitopen SYIPSAEKI [SEQ ID NO: 67], abgeleitet von P. berghei CSP, und RGPGRAFVTI [SEQ ID NO: 68], abgeleitet von HIV, ein universelles Phänomen ist, wurden zwei Sätze von Experimenten durchgeführt. CTL-Antworten auf das Influenza-Nukleoprotein wurden in fünf Inzucht-Mausstämmen untersucht. In einem ersten Experiment wurden drei veröffentlichte Maus-CTL-Epitope, abgeleitet von dem Influenza-Nukleoprotein, untersucht (siehe Tabelle 3). Es wurden Mäuse von drei verschiedenen H-2-Haplotypen, BALB/c und DBA/2 (H-2d), C57BL/6 und 129 (H-2b), CBA/J (H-2k) verwendet. Ein Satz von Tieren wurde zweimal in Intervallen von zwei Wochen mit dem Plasmid V1J-NP, welches das Influenza-Nukleoprotein codiert, immunisiert. Ein weiterer Satz identischer Tiere wurde mit V1J-NP initialisiert und zwei Wochen später intravenös mit 106 ffu von MVA.NP, welches das Influenzavirus NP exprimiert, verstärkt. Die Mengen an CTL in einzelnen Mäusen wurden in einem 51Cr-Freisetzungstest mit durch Peptid restimulierten Splenozyten bestimmt. Wie es in 7 gezeigt ist, induzierte das Immunisierungsschema der DNA-Initialisierung/MVA-Verstärkung höhere Niveaus an Lyse in allen der analysierten Mäusestämme und ist gegenüber zwei DNA-Injektionen besser.
  • 7 zeigt die CTL-Antworten gegen Influenza NP in verschiedenen Mäusestämmen. Mäuse von verschiedenen Stämmen wurden zweimal im Abstand von zwei Wochen mit einem DNA-Impfstoff V1J-NP, welcher das Influenza-Nukleoprotein codiert, immunisiert (offene Kreise) oder mit dem gleichen DNA-Impfstoff initialisiert und zwei Wochen später mit rekombinantem MVA, welches Influenzavirus-Nukleoprotein exprimiert, verstärkt (ausgefüllte Kreise). Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Splenozyten mit den jeweiligen Peptiden in vitro restimuliert (Tabelle 3). Die CTL-Aktivität wurde in einem Standard 51Cr-Freisetzungstest mit MHC Klasse I-kompatiblen Zielzellen bestimmt.
  • CTL-Induktion auf verschiedene Antigene in verschiedenen Mäusestämmen
  • Die Wirkung von MVA-Verstärkung auf mit Plasmid-DNA initialisierte Immunantworten wurde unter Verwendung verschiedener Antigene und verschiedener Inzucht-Mäusestämme weiter untersucht. Mäuse verschiedener Stämme wurden mit verschiedenen Antigenen unter Verwendung von zwei DNA-Immunisierungen immunisiert und mit DNA/MVA-Immunisierungen verglichen. Die verwendeten Antigene waren E. coli-Galaktosidase, der Malaria/HIV-Epitopstrang, ein Maus-Tumor-Epitopstrang und P. falciparum-TRAP. Verglichen mit zwei DNA-Immunisierungen, induzierte das Schema DNA-Initialisierung/MVA-Verstärkung höhere Niveaus an CTL in sämtlichen der getesteten verschiedenen Mausstämme und Antigenkombinationen (8).
  • 8 zeigt CTL-Antworten gegen verschiedene Antigene, welche in verschiedenen Inzucht-Mausstämmen induziert wurden. Mäuse wurden mit zwei DNA-Impfstoffimmunisierungen im Abstand von zwei Wochen immunisiert (offene Kreise) oder mit einem DNA-Impfstoff initialisiert und zwei Wochen später mit einem rekombinanten MVA, welches das gleiche Antigen exprimierte, verstärkt (ausgefüllte Kreise). Die Stämme und Antigene waren: C57BL/6; P. falcipa rum-TRAP in A. DBA/2; E. coli-β-Galaktosidase in B. BALB/c; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen Malariapeptid (pb9) in C. DBA/2; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen pb9 in D. BALB/c; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen HIV-Peptid in E. DBA/2; HM-Epitopstrang-CTL-Aktivität gegen HIV-Peptid in F. BALB/c; Tumorepitopstrang-CTL-Aktivität gegen von P1A abgeleitetes Peptid in G. DBA/2; Tumorepitopstrang-CTL-Aktivität gegen von P1A abgeleitetes Peptid in H. Sequenzen der Peptidepitope sind in Tabelle 3 gezeigt. Jede Kurve zeigt die Daten für eine einzelne Maus.
  • Sporozoiten können wirksam eine Immunantwort initialisieren, die durch MVA verstärkbar ist
  • Menschen, die in bezüglich Malaria endemischen Gebieten leben, sind kontinuierlich Sporozoitinokulierungen ausgesetzt. Malariaspezifisches CTL findet man in diesen natürlich exponierten Individuen in niedrigen Mengen. Um die Frage anzusprechen, ob niedrige Mengen an sporozoitinduzierten CTL-Antworten durch MVA verstärkt werden können, wurden BALB/c-Mäuse mit (zur Verhinderung einer Malariainfektion) bestrahlten P. berghei-Sporozoiten immunisiert und mit MVA verstärkt. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Splenozyten restimuliert und auf lytische Aktivität getestet. Zwei Injektionen mit 50 oder 300 + 500 Sporozoiten induzierten sehr niedrige oder nicht detektierbare Niveaus an Lyse. Verstärkung mit MVA induzierte hohe Mengen an peptidspezifischem CTL. MVA alleine induzierte nur mäßige Niveaus an Lyse (9).
  • 9 zeigt, daß sporozoiteninduzierte CTL-Antworten durch MVA erheblich verstärkt werden. Mäuse wurden mit zwei geringen Dosen (50 + 50) an bestrahlten Sporozoiten in A immunisiert, zwei hohen Dosen (300 + 500) an Sporozoiten in B; die Mäuse wurden mit MVA.PbCSP verstärkt nach Sporozoiteninitialisierung mit geringer Dosis in D; Sporozoiteninitialisierung mit hoher Dosis in E. CTL-Antworten nach Immunisierung mit MVA.PbCSP sind in C gezeigt.
  • Rekombinante Adenoviren als Initialisierungsmittel
  • Das Initialisierung-Verstärkung-Immunisierungsschema wurde beispielhaft dargestellt, wobei Plasmid-DNA und rekombinantes Ty-VLP als Initialisierungsmittel verwendet wurden. Hier wird ein Beispiel angegeben, bei dem nichtreplizierende Adenoviren als das Initialisierungsmittel verwendet werden. Es wurde bezüglich Replikation beeinträchtigtes, rekombinantes Adenovirus verwendet, welches E. coli-β-Galaktosidase (Adeno-GAL) exprimiert. Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden mit Plasmid-DNA immunisiert, gefolgt von MVA, oder mit Adenovirus, gefolgt von MVA. Alle verwendeten Antigen-Verabreichungsschemas codierten E. coli-β-Galaktosidase. Initialisierung einer CTL-Antwort mit Plasmid-DNA oder Adenovirus und Verstärkung mit MVA induziert ähnliche Niveaus an CTL (10).
  • 10 zeigt CTL-Antworten, die durch Plasmid-DNA oder rekombinantes Adenovirus initialisiert und mit MVA verstärkt wurden. Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 3) wurden mit Plasmid-DNA A oder rekombinantem Adenovirus, welches β-Galaktosidase exprimiert, B, initialisiert. Plasmid-DNA wurde intramuskulär verabreicht, MVA intravenös und Adenovirus intradermal. Splenozyten wurden mit dem Peptid TPHPARIGL [SEQ ID NO: 69] zwei Wochen nach der letzten Immunisierung restimuliert. CTL-Aktivität wurde mit peptidgepulsten P815-Zellen getestet.
  • Immunogenizität des DNA-Initialisierung/Vaccinia-Verstärkung-Schemas hängt von der Replikationskompetenz des verwendeten Vacciniavirusstammes ab
  • Die Initialisierungs-Verstärkungs-Strategie wurde unter Verwendung verschiedener Stämme rekombinanter Vacciniaviren getestet, um zu bestimmen, ob die verschiedenen Stämme mit Stämmen, die in ihrer Replikationskompetenz voneinander abweichen, sich bezüglich ihrer Fähigkeit unterscheiden, eine DNA-initialisierte CTL-Antwort zu verstärken. Verstärkung mit bezüglich Replikation beeinträchtigten rekombinanten Vacciniaviren, wie MVA und NYVAC, führten zu der Induktion stärkerer CTL-Antworten im Vergleich zu CTL-Antworten nach einer Verstärkung mit der gleichen Dosis von replikationskompetentem WR-Vacciniavirus (11).
  • 11 zeigt CTL-Antworten in BALB/c-Mäusen, die mit Plasmid-DNA initialisiert wurden, gefolgt von Verstärkung mit verschiedenen rekombinanten Vacciniaviren. Tiere wurden mit 50 μg/Maus pTH.PbCSP im. initialisiert und zwei Wochen später mit verschiedenen Stämmen rekombinanter Vacciniaviren (106 pfu pro Maus iv.), welche PbCSP exprimieren, verstärkt. Die verschiedenen rekombinanten Vacciniavirusstämme waren MVA in A, NYVAC in B und WR in C. Die Überlegenheit von bezüglich Replikation beeinträchtigen Vacciniastämmen gegenüber replizierenden Stämmen wurde in einem weiteren Experiment gefunden. Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 6) wurden mit 50 μg/Tier pSG2.PbCSP (im.) initialisiert und 10 Tage später iv. mit 106 ffu/pfu rekombinantem MVA, NYVAC und WR, welche PbCSP exprimierten, verstärkt. Die Häufigkeiten peptidspezifischer CD8+ T-Zellen wurden unter Verwendung des ELISPOT-Tests bestimmt. Die Häufigkeiten waren: MVA 1103 ± 438, NYVAC 826 ± 249 und WR 468 ± 135. Somit wurde sowohl unter Verwendung der CTL-Tests als auch der ELISPOT-Tests als ein Maß für CD8 T-Zell-Immunogenizität eine überraschende, erheblich höhere Immunogenizität der bezüglich Replikation beeinträchtigten Vacciniastämme im Vergleich zu dem replikationskompetenten Stamm beobachtet.
  • Die Verwendung rekombinanter Kanarienvogel- oder Geflügelpockenviren zur Verstärkung von CD8+ T-Zell-Antworten
  • Rekombinantes Kanarienvogelpockenvirus (rCPV) oder Geflügelpockenvirus (rFVP) werden unter Verwendung zuvor beschriebener Transportervektoren hergestellt (Taylor et al., Virology, 1992, 187: 321–328 und Taylor et al., Vaccine, 1988, 6: 504–508). Die Strategie für diese Transportervektoren besteht darin, das Gen einzusetzen, welches das interessierende Protein codiert und welchem ein vacciniaspezifischer Promotor zwischen zwei flankierenden Bereichen vorangestellt ist, welche Sequenzen umfassen, die von dem CPV- oder FPV-Genom abgeleitet sind. Diese flankierenden Sequenzen sind so ausgewählt, daß eine Insertion in wesentliche virale Gene verhindert wird. Rekombinantes CPV oder FPV wird durch in vivo-Rekombination in permissiven Vogelzellinien, d. h. primären Hühnerembryofibroblasten, erzeugt. Jede Proteinsequenz von Antigenen oder Epitopsträngen kann unter Verwendung von Geflügelpocken- oder Kanarienvogelpockenvirus exprimiert werden. Rekombinantes CPV oder FPV ist gekennzeichnet durch Expression des interessierenden Proteins unter Verwendung antigenspezifischer Antikörper oder unter Einschluß eines Antikörperepitops in das rekombinante Gen. Rekombinante Viren werden auf primären CEF gezüchtet. Eine Immunantwort wird unter Verwendung von Plasmid-DNA initialisiert, wie es in Material und Methoden beschrieben ist. Diese durch Plasmid-DNA initialisierte Immunantwort wird verstärkt, wobei 107 ffu/pfu rCPV oder rFPV, die intravenös, intradermal oder intramuskulär inokuliert werden, verwendet werden. CD8+ T-Zell-Antworten werden erfaßt, und Expositionen werden durchgeführt, wie es hierin beschrieben ist.
  • BEISPIEL 3
  • Malariaexpositionsstudien in Mäusen
  • Zur Untersuchung der Schutzwirkung der induzierten Niveaus an CD8+ T-Zell-Antwort wurden immunisierte BALB/c- oder C57BL/6-Mäuse durch intravenöse Injektion 2000 oder 200 P. berghei-Sporozoiten ausgesetzt. Dies führt zur Infektion von Leberzellen durch die Sporozoiten. Jedoch werden bei Vorhandensein einer ausreichend starken T-Lymphozyten-Antwort gegen den intrahepatischen Parasiten keine überlebensfähigen Parasiten die Leber verlassen, und es werden keine Parasiten im Blutstadium feststellbar sein. Blutfilme von exponierten Mäusen wurden daher 5–12 Tage nach der Exposition durch Mikroskopie auf Parasiten untersucht.
  • BALB/c-Mäuse, die zweimal mit einem Gemisch aus zwei Plasmid-DNAs immunisiert worden waren, welche das CS-Protein bzw. das TRAP-Antigen von P. berghei codierten, waren nicht gegen Sporozoitenexposition geschützt. Mäuse, die zweimal mit einem Gemisch aus rekombinanten MVA-Viren immunisiert worden waren, welche die gleichen zwei Antigene codierten, waren nicht gegen eine Sporozoitenexposition geschützt. Mäuse, die zuerst mit den zwei rekombinanten MVAs und zum zweiten mit den zwei rekombinanten Plasmiden immunisiert worden waren, waren ebenfalls nicht gegen Sporozoitenexposition geschützt. Jedoch waren alle 15 Mäuse, die zuerst mit den zwei Plasmid-DNAs und zum zweiten mit den zwei rekombinanten MVA-Viren immunisiert worden waren, vollständig resistent gegen Sporozoitenexposition (Tabelle 6A und B).
  • Zur Untersuchung, ob der beobachtete Schutz auf eine Immunantwort gegen das CS-Antigen oder gegen TRAP oder gegen beides zurückzuführen war, wurden Gruppen von Mäusen anschließend mit jedem Antigen separat immunisiert (Tabelle 6B). Alle 10 Mäuse, die zuerst mit der CS-Plasmid-DNA und zum zweiten mit dem CS-MVA-Virus immunisiert worden waren, waren vollständig gegen Sporozoitenexposition geschützt. Vierzehn von 16 Mäusen, die zuerst mit dem TRAP-Plasmid-DNA-Impfstoff und zum zweiten mit dem TRAP-MVA-Virus immunisiert worden waren, waren gegen Sporozoitenexposition geschützt. Daher ist das CS-Antigen alleine vollständig schützend, wenn das oben genannte Immunisierungsschema angewendet wird, und das TRAP-Antigen hat bei dem gleichen Schema eine erhebliche Schutzwirkung.
  • Die gute Korrelation zwischen dem induzierten Niveau an CD8+ T-Lymphozyten-Antwort und dem Ausmaß an beobachtetem Schutz legt in erheblichem Maße nahe, daß die CD8+ – Antwort für den beobachteten Schutz verantwortlich ist. In früheren angenommenen Transferexperimenten wurde gezeigt, daß CD8+ T-Lymphozyten-Klone gegen das Haupt-CD8+ T-Zell-Epitop in dem P. berghei-CS-Protein gegen Sporozoitenexposition schützen kann. Zur Bestimmung, ob der induzierte Schutz tatsächlich durch CD8+ T-Zellen gegen dieses Epitop vermittelt worden war, verwendeten wir anschließend eine Plasmid-DNA und ein rekombinantes MVA, welche nur diese neun Aminosäuren lange Sequenz von P. berghei als einen Teil eines Stranges von Epitopen codierten (Tabelle 6B). (Alle anderen Epitope stammten von anderen Mikroorganismen als P. berghei.) Immunisierung von 10 Mäusen zuerst mit einem Plasmid, welches solch einen Epitopstrang codierte, und zum zweiten mit einem rekombinanten MVA, welches auch einen Epitopstrang mit dem P. berghei-CTL-Epitop codierte, führte zu vollständigem Schutz vor Sporozoitenexposition (Tabelle 6B). Daher muß die induzierte schützende Immunantwort die CTL-Antwort sein, welche auf diese Nonamer-Peptidsequenz gerichtet ist. Tabelle 6 – Ergebnisse von Mäuseexpositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener Kombinationen von DNA- und MVA-Impfstoff
    Immunisierung 1 Immunisierung 2 Anz. infizierte/Anz. exponierte % Schutz
    A. verwendete Antigene: PbCSP + PbTRAP
    DNA DNA 5/5 0%
    MVA MVA 9/10 10%
    DNA MVA 0/5 100%
    MVA DNA 5/5 0%
    Mit β-Galaktosidase immunisierte Kontrollmäuse
    DNA DNA 5/5 0%
    MVA MVA 5/5 0%
    DNA MVA 5/5 0%
    MVA DNA 5/5 0%
    B.
    DNA (CSP + TRAP) MVA (CSP + TRAP) 0/10 100%
    DNA (CSP) MVA (CSP) 0/10 100%
    DNA (TRAP MVA (TRAP) 2/16 88%
    DNA (Epitop) MVA (Epitop) 0/11 100%
    DNA (beta-gal) MVA (beta-gal) 6/7 14%
    keine keine 9/10 10%
  • Tabelle 6 Ergebnisse von zwei Expositionsexperimenten (A und B) unter Verwendung verschiedener Immunisierungsschemas mit Plasmid-DNA und MVA, wie angegeben. In allen Fällen wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg Plasmid-DNA oder 106 ffu rekombinantes MVA. Das Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug in allen Fällen 14–21 Tage. Expositionen wurden 18–29 Tage nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion von 2000 P. berghei Sporozoiten durchgeführt, und Blutfilme wurden 5, 8 und 10 nach der Exposition untersucht. CSP und TRAP bedeuten das gesamte P. berghei-Antigen, und ”Epitop” bedeutet die in Tabelle 1 gezeigten Kassetten von Epitopen, welche nur ein einzelnes P. berghei-Kd-beschränktes Nonamer-CTL-Epitop enthalten. Man beachte, daß Immunisierung in Experiment B mit dem Epitopstrang alleine 100% Schutz liefert.
  • Mäuse, die zweimal mit pb9 codierenden rekombinanten Ty-VLPs immunisiert wurden, waren vollständig empfänglich für eine Infektion. In gleicher Weise waren Mäuse, die zweimal mit dem das vollständige CS-Protein codierenden rekombinanten MVA immunisiert wurden, vollständig empfänglich für eine Infektion. Jedoch zeigten die Mäuse, die einmal mit dem Ty-VLP und anschließend einmal mit dem rekombinanten MVA immunisiert wurden, eine 85%-ige Verringerung des Auftretens von Malaria, wenn mit das CS-Protein der vollen Länge exprimierendem MVA verstärkt wurde, und 95%, wenn zur Verstärkung das MVA verwendet wurde, welches den HM-Epitopstrang exprimiert, der pb9 umfaßt (Tabelle 7). Tabelle 7 – Ergebnisse von Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener Immunisierungsschemas mit Ty-VLPs und MVA
    Immunisierung 1 Immunisierung 2 Anz. infizierte/Anz. exponierte % Schutz
    Ty-CABDHFE Ty-CABDHFE 7/8 13%
    Ty-CABDH MVA.PbCSP 2/13 85%
    Ty-CABDHFE MVA-NP 5/5 0%
    MVA.PbCSP MVA.PbCSP 6/6 0%
    MVA.HM Ty-CABDHFE 14/14 0%
    Ty-CABDHFE MVA.HM 1/21 95%
    keine MVA.HM 8/8 0%
    keine keine 11/12 9%
  • Tabelle 7 Ergebnisse von Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener Immunisierungsschemas mit Ty-VLPs und MVA, wie angegeben. In allen Fällen wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Immunisierungen wurden mit 50 μg Ty-VLP oder 107 ffu rekombinantem MVA, welche intravenös verabreicht wurden, durchgeführt. Das Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug in allen Fällen 14–21 Tage. Expositionen wurden 18–29 Tage nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion von 2000 P. berghei-Sporozoiten durchgeführt, und Blutfilme wurden 5, 8 und 10 Tage nach der Exposition untersucht. CSP bedeutet das gesamte P. berghei-Antigen. Ty-VLPs trug die Epitopkassetten CABDH oder CABDHFE, wie es in Tabelle 1 beschrieben ist. MVA.HM umfaßt die Kassetten CAB.
  • Zur Bestimmung, ob die erhöhte Immunogenizität und Schutzwirkung, die bei Verstärkung mit einem rekombinanten MVA beobachtet wurden, für diesen bestimmten Vacciniavirusstamm einzigartig ist oder von anderen rekombinanten Vaccinias geteilt wird, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Mäuse wurden mit dem DNA-Impfstoff, welcher P. berghei-CS-Protein codiert, immunisiert und verstärkt mit entweder (i) rekombinantem MVA, welches dieses Antigen codiert; (ii) rekombinantem Wildtyp-Vacciniavirus (Western Reverse-Stamm), welches das gleiche Antigen codiert (Satchidanandam et al., 1991), oder (iii) rekombinantem NYVAC-(COPAK)Virus (Lanar et al., 1996), welches das gleiche Malariaantigen codiert. Das höchste Ausmaß an Schutz wurde bei Verstärkung mit der MVA-Rekombinanten beobachtet, 80% (Tabelle 8). Ein sehr niedriges Niveau an Schutz (10%) wurde durch Verstärkung mit dem rekombinanten Wildtyp-Vacciniavirus beobachtet, und ein signifikantes Niveau an Schutz von 60% durch Verstärkung mit der NYVAC-Rekombinanten. Daher induziert das Initialisierungs-Verstärkungs-Schema, welches wir beschreiben, eine Schutzwirkung mit jedem nichtreplizierenden Vacciniavirusstamm. Sowohl die MVA-Rekombinante als auch NYVAC waren signifikant (P < 0,05 für beide) besser als die Rekombinante des WR-Stammes. Tabelle 8 – Ergebnisse der Expositionsdaten für DNA, verstärkt mit verschiedenen Vacciniastamm-Rekombinanten
    Immunisierung 1 Immunisierung 2 Anz. infiziert/Anz. exponiert % Schutz
    CNA-beta gal. MVA.NP 8/8 0%
    DNA-CSP MVA-CSP 2/10 80%
    DNA-CSP WR-CSP 9/10 10%
    DNA-CSP NYVAC-CSP 4/10 60%
  • Tabelle 8 Ergebnisse eines Expositionsexperimentes unter Verwendung verschiedener Immunisierungsschemas mit Plasmid-DNA und verschiedenen Vacciniarekombinanten, wie angegeben. In allen Fällen wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg Plasmid-DNA oder 106 ffu/pfu rekombinantes MVA oder 104 ffu/pfu rekombinantes Wildtyp-(WR-)Vaccinia oder 106 ffu/pfu rekombinantes NYVAC. Weil der WR-Stamm in dem Wirt repliziert und die anderen Stämme nicht, wurde in diesem Experiment eine geringere Dosis an WR verwendet. Das Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug 23 Tage. Expositionen wurden 28 Tage nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion von 2000 P. berghei-Sporozoiten durchgeführt, und Blutfilme wurden 7, 9 und 11 Tage nach der Exposition untersucht. PbCSP bedeutet das gesamte P. berghei-Antigen und NP das Nukleoproteinantigen von Influenzavirus (das als ein Kontrollantigen verwendet wurde). Die erste Immunisierung der Mäuse der Gruppe A erfolgte mit dem Plasmid-DNA-Vektor, welcher β-Galaktosidase, aber kein Malariaantigen exprimierte.
  • In einem weiteren Experiment, das in Tabelle 8 gezeigt ist, wurden Mäuse mit dem P. berghei-CS-Protein codierenden DNA-Impfstoff immunisiert und verstärkt mit entweder (i) rekombinantem MVA, welches dieses Antigen codiert; (ii) rekombinantem WR-Vacciniavirus, welches das gleiche Antigen codiert, oder (iii) rekombinantem NYVAC-(COPAK)Virus, welches das gleiche Malariaantigen codiert, alle mit 106 ffu/pfu. Ein hohes und statistisch signifikantes Ausmaß an Schutz wurde bei Verstärkung mit rekombinantem NYVAC (80%) oder rekombinantem MVA (66%) beobachtet. Ein niedriges und nicht signifikantes Ausmaß an Schutz (26%) wurde bei Verstärkung mit dem rekombinanten WR-Vacciniavirus beobachtet (Tabelle 9). MVA- und NYVAC-Verstärkung lieferten jeweils signifikant mehr Schutz als WR-Verstärkung (P = 0,03 bzw. P = 0,001). Diese Daten unterstreichen erneut, daß nichtreplizierende Pockenvirenstämme bessere Verstärkungsmittel zur Induktion hoher Niveaus an Schutz sind. Tabelle 9 – Einfluß verschiedener rekombinanter Vacciniastämme auf den Schutz
    Immunisierung 1 DANN Immunisierung 2 Anz. infiziert/Anz. exponiert % Schutz
    CSP MVA.PbCSP 5/15 66
    CSP NYVAC.PbCSP 2/15 80
    CSP WR.PbCSP 11/15 26
    β-Galaktosidase MVA.NP 8/8 0
  • Tabelle 9 Ergebnisse von Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener Immunisierungsschemas mit Plasmid-DNA und bezüglich Replikation inkompetenten Vacciniarekombinanten zur Verstärkungsimmunisierung. In allen Fällen wurden BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierungsdosen betrugen 50 μg Plasmid-DNA oder 106 ffu/pfu rekombinantes MVA oder rekombinantes Wildtyp-(WR-)Vaccinia oder rekombinantes NYVAC. Das Intervall zwischen den Immunisierungen 1 und 2 betrug 23 Tage. Expositionen wurden 28 Tage nach der letzten Immunisierung durch iv. Injektion von 2000 P. berghei-Sporozoiten durchgeführt, und Blutfilme wurden 7, 9 und 11 Tage nach der Exposition untersucht. PbCSP bedeutet das gesamte P. berghei-Antigen und NP das Nukleoprotein-Antigen von Influenzavirus (das als ein Kontrollantigen verwendet wurde). Die Kontrollimmunisierung erfolgte mit einem Plasmid-DNA-Vektor, welcher β-Galaktosidase exprimierte, gefolgt von MVA.NP.
  • Alternative Wege zur Verstärkung von Immunantworten mit rekombinantem MVA
  • Intravenöse Injektion von rekombinantem MVA ist kein bevorzugter Weg zur Immunisierung von Menschen und in Massenimmunisierungen nicht durchführbar. Daher wurden verschiedene Wege der MVA-Verstärkung hinsichtlich ihrer Immunogenizität und Schutzwirkung getestet.
  • Mäuse wurden im. mit Plasmid-DNA initialisiert. Zwei Wochen später wurden sie mit MVA verstärkt, welches über die folgenden Wege verabreicht wurde: intravenös (iv.), subkutan (sc.), intraperitoneal (ip.), intramuskulär (im.) und intradermal (id.). Zwei Wochen nach dieser Verstärkung wurden peptidspezifische CD8+ T-Zellen in einem ELISPOT-Test bestimmt. Die effektivsten Wege, welche die höchsten Mengen induzierten, waren iv. und id. Inokulierung von MVA. Die anderen Wege lieferten mäßige bis schlechte Antworten (12).
  • 12 zeigt Häufigkeiten von peptidspezifischen CD8+ T-Zellen nach verschiedenen Wegen der MVA-Verstärkung. Ergebnisse sind als die Anzahl punktbildender Zellen (SFC) pro 1 Million Splenozyten gezeigt. Mäuse wurden mit Plasmid-DNA initialisiert und zwei Wochen später mit MVA über die angegebenen Wege verstärkt. Die Anzahl an Splenozyten, die für das Peptid SYIPSAEKI [SEQ ID NO: 67] spezifisch waren, wurde in INF-γ-ELISPOT-Tests zwei Wochen nach der letzten Immunisierung bestimmt. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert an SFCs von drei einzeln untersuchten Mäusen.
  • Verstärkung über den iv. Weg wurde mit dem id. und im. Weg in einem Expositionsexperiment verglichen. Der id. Weg lieferte hohe Ausmaße an Schutz (80% Schutz). In der Gruppe von Tieren, die über den im. Weg verstärkt wurden, waren 50% der Tiere geschützt. Vollständiger Schutz wurde mit iv. verabreichter MVA-Verstärkung erzielt (Tabelle 10). Tabelle 10 – Einfluß des Weges der MVA-Verabreichung auf die Schutzwirkung
    Immunisierung 1 DANN Immunisierung 2 MVA Anz. infiziert/Anz. exponiert % Schutz
    CSP CSP iv. *0/20 100
    CSP CSP id. 2/10 80
    CSP CSP im. 5/10 50
    Epitop Epitop iv. 1/10 90
    NP NP iv. 10/10 0
    • * kumulierte Daten aus zwei unabhängigen Experimenten
  • Tabelle 10 Ergebnisse aus Expositionsexperimenten unter Verwendung verschiedener Wege der MVA-Verstärkungsimmunisierung. Tiere wurden durch intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA initialisiert und zwei Wochen später mit dem angegebenen rekombinanten MVA (106 ffu/Maus), welches über die angegebenen Wege verabreicht wurde, verstärkt. Die Mäuse wurden 16 Tage nach der letzten Immunisierung 2000 P. berghei-Sporozoiten ausgesetzt und am Tag 8 und 10 nach der Exposition hinsichtlich Parasitenbefall im Blutstadium durchmustert. Epitop bedeutet den Polypeptidstrang HM.
  • Alternative Wege der DNA-Initialisierung: Verwendung einer Genpistole zur Initialisierung peptidspezifischer CD8+ T-Zellen
  • Gehpistolenverabreichung wird ausführlich z. B. bei Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 1993, 12: 791–797, und bei Degano et al., Vaccine, 1998, 16: 394–398, beschrieben.
  • Die bisher beschriebenen Maus-Malaria-Expositionsexperimente unter Verwendung von Plasmid-DNA zur Initialisierung einer Immunantwort verwendeten intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA. Intradermale Verabreichung von Plasmid-DNA unter Verwendung einer biolistischen Vorrichtung ist ein weiterer Weg zur Initialisierung spezifischer CTL-Antworten. Plasmid-DNA wird auf Goldpartikel aufgebracht und intradermal mit einer Genpistole verabreicht. Gruppen von Mäusen (n = 10) wurden dreimal in Intervallen von zwei Wochen mit der Genpistole alleine (4 μg/Immunisierung) immunisiert, zweimal mit der Genpistole, gefolgt von einer intravenösen MVA.PbCSP-Verstärkung immunisiert oder intramuskulär mit 50 μg pTH.PbCSP immunisiert und zwei Wochen später mit MVA.PbCSP intravenös verstärkt. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere 2000 Sporozoiten ausgesetzt, um die Schutzwirkung jedes Immunisierungsschemas zu untersuchen. In der Gruppe, welche die intravenöse MVA-Verstärkung nach zwei Genpistolen-Immunisierungen erhielten, entwickelte eines von zehn Tieren Parasitenbefall im Blutstadium (90% Schutz). Vollständiger Schutz wurde bei intramuskulärer DNA-Initialisierung, gefolgt von iv. MVA-Verstärkung, beobachtet. Sieben von 10 Tieren, welche dreimal mit der Genpistole immunisiert wurden, waren infiziert (30% Schutz) (Tabelle 11).
    Immunisierung 1 DNA Immunisierung 2 Immunisierung 3 Anz. infiziert/Anz. exponiert % Schutz
    Genpistole DNA Genpistole DNA Genpistole DNA 7/10 30
    Genpistole DNA Genpistole DNA MVA.PbCSP 1/10 90
    - DNA im. MVA.PbCSP 0/10 100
    Natürlich 10/10 0
  • Tabelle 11 Ergebnisse von Expositionsexperimenten, welche verschiedene Wege der DNA-Initialisierung vergleichen (intradermal mittels Genpistole gegenüber intramuskulärer Nadelinjektion). Gruppen von BALB/c-Mäusen (n = 10) wurden immunisiert, wie es angegeben ist. Jede Genpistolen-Immunisierung verabreichte 4 μg Plasmid-DNA intraepidermal. Für im. Immunisierungen wurden 50 μg Plasmid-DNA injiziert. 20 Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse exponiert, wie es zuvor beschrieben ist.
  • Hochgradig empfängliche C57BL/6-Mäuse werden geschützt
  • C57BL/6-Mäuse sind sehr empfänglich für P. berghei-Sporozoitenexposition. C57BL/6-Mäuse wurden unter Anwendung des DNA-MVA-Initialisierungs-Verstärkungs-Schemas mit beiden präerythrozytischen Antigenen PbCSP und PbTRAP immunisiert und entweder 200 oder 1000 infektiösen Sporozoiten pro Maus ausgesetzt. (200 Sporozoiten entsprechen mehr als der zweifachen Dosis, die zur Induktion einer Infektion in diesem Stamm erforderlich ist.) Alle 10 Mäuse, die 200 Sporozoiten ausgesetzt waren, zeigten sterile Immunität. Sogar in der Gruppe, die 1000 Sporozoiten ausgesetzt waren, waren 60% der Mäuse geschützt (Tabelle 12). Sämtliche der natürlichen C57BL/6-Mäuse waren nach der Exposition infiziert. Tabelle 12 – Schutz von C57BL/6-Mäusen vor Sporozoitenexposition
    Anz. infizierter Tiere/Anz. exponierter % Schutz
    1000 Sporozoiten
    DNA, gefolgt von MVA 4/10 60
    Natürlich 5/5 0
    200 Sporozoiten
    DNA, gefolgt von MVA 0/10 100
    Natürlich 5/5 0
  • Tabelle 12 Ergebnisse eines Expositionsexperiments unter Verwendung von C57BL/6-Mäusen. Tiere wurden mit PbCSP und PbTRAP unter Verwendung der DNA, gefolgt von MVA in einem Initialisierungs-Verstärkungs-Schema immunisiert. Vierzehn Tage später wurden die Mäuse P. berghei-Sporozoiten ausgesetzt, wie es angegeben ist.
  • BEISPIEL 4
  • Schutzwirkung des DNA-Initialisierungs-/MVA-Verstärkungs-Schemas in zwei weiteren Krankheitsmodellen in Mäusen
  • Nach den Immunogenizitätsstudien wurde die Schutzwirkung des DNA-Initialisierungs-MVA-Verstärkungs-Schemas in zwei zusätzlichen Maus-Expositionsmodellen getestet. Die zwei Expositionsmodelle waren das P815-Tumormodell und das Influenza A-Virus-Expositionsmodell. In beiden Modellsystemen wurde gezeigt, daß CTL Schutz vermittelt.
  • P815-Tumorexpositionen:
  • Gruppen (n = 10) von DBA/2-Mäusen wurden mit einer Kombination aus DNA, gefolgt von MVA, welche einen Tumorepitopstrang oder den HM-Epitopstrang exprimierten, immunisiert. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse intravenös 105 P815-Zellen ausgesetzt. Nach dieser Exposition wurden die Mäuse regelmäßig hinsichtlich der Entwicklung von mit Tumor in Verbindung stehenden Anzeichen und hinsichtlich Überleben kontrolliert.
  • 13 zeigt die Überlebensrate der zwei Gruppen von Mäusen. Sechzig Tage nach der Exposition waren acht von zehn Mäusen in der Gruppe, die mit dem Tumorepitopstrang immunisiert worden war, am Leben. In der Gruppe, die mit dem HM-Epitopstrang immunisiert worden war, überlebten nur zwei Tiere. Dieses Ergebnis ist statistisch signifikant: 2/10 vs. 8/10 chi2 = 2,2. P = 0,007. Das Einsetzen des Sterbens in den Gruppen von Tieren, die mit dem Tumorepitopstrang immunisiert worden waren, ist im Vergleich zu den Gruppen, die mit dem HM-Epitopstrang immunisiert worden waren, verzögert.
  • Influenzavirus-Expositionen:
  • Gruppen von BALB/c-Mäusen wurden mit drei Genpistolen-Immunisierungen mit Plasmid-DNA, zwei intramuskulären Plasmid-DNA-Injektionen, einer im. DNA-Injektion, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv., oder zwei Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv. immunisiert. Plasmid-DNA und rekombinantes MVA exprimierten das Influenzavirus-Nukleoprotein. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse intranasal 100 HA von Influenza-A/PR/8/34-Virus ausgesetzt. Die Tiere wurden nach der Exposition täglich hinsichtlich des Überlebens kontrolliert.
  • Vollständiger Schutz wurde in den folgenden Gruppen von Tieren beobachtet:
    • • zwei DNA-Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv.,
    • • eine im. DNA-Injektion, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv.,
    • • zwei im. DNA-Injektionen.
  • In der Gruppe von Tieren, die dreimal mit der Genpistole immunisiert worden waren, überlebten 71% der Tiere (5/7), und dieser Unterschied gegenüber der Kontrollgruppe war statistisch nicht signifikant (P > 0,05). In der natürlichen Gruppe überlebten 25% der Tiere (14), und diese Gruppe unterschied sich signifikant (P < 0,05) von den zwei vollständig geschützten Gruppen.
  • 14 zeigt Ergebnisse eines Influenzavirus-Expositionsexperiments. BALB/c-Mäuse wurden immunisiert, wie es angegeben ist. GG = Genpistolen-Immunisierungen, im. = intramus kuläre Injektion, iv. = intravenöse Injektion. Das Überleben der Tiere wurde täglich nach der Exposition kontrolliert.
  • In einem zweiten Experiment wurden Gruppen von zehn BALB/c-Mäusen mit MVA.NP iv. alleine, dreimal mit der Genpistole, zweimal mit der Genpistole, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung iv. und zwei im. Injektionen von V1J-NP, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung immunisiert. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Mäuse 100 HA-Einheiten Influenza-A/PR/8/34-Virus ausgesetzt.
  • Vollständiger und statistisch signifikanter Schutz wurde in den folgenden Gruppen von Tieren beobachtet:
    • • zwei Genpistolen-Immunisierungen, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung,
    • • zwei im. Injektionen von V1J-NP, gefolgt von einer MVA.NP-Verstärkung.
  • In der Gruppe, die einmal MVA.NP iv. erhielt, überlebten 30% (3 von 10) der Tiere. In der Gruppe, die mit einem DNA-Impfstoff immunisiert worden war, der mittels der Genpistole dreimal verabreicht worden war, waren 70% der Tiere geschützt, aber dieser Schutz unterschied sich nicht signifikant von den natürlichen Kontrollen. In diesem Expositionsexperiment überlebten 40% (4 von 10) der natürlichen Tiere die Exposition.
  • BEISPIEL 5
  • Immunogenizitätsstudien in nicht-menschlichen Primaten
  • Immunogenizität und Schutzwirkung des Initialisierungs-Verstärkungs-Schemas in nicht-menschlichen Primaten
  • Um zu zeigen, daß die starke Immunogenizität des DNA-Initialisierungs-/MVA-Verstärkungs-Schemas, das in Mäusen beobachtet wird, zu starker Immunogenizität in Primaten führt, wurde das Schema in Makaken getestet. Der Impfstoff bestand aus einem Strang von CTL-Epitopen, die von HIV- und SIV-Sequenzen abgeleitet waren (2), in Plasmid-DNA oder MVA, bezeichnet als DNA.H bzw. MVA.H. Die Verwendung definierter CTL-Epitope in einem Polyepitopstrang erlaubt eine Untersuchung hinsichtlich SIV-spezifischen CTL in Makaken. Aufgrund der MHC Klasse I-Beschränkung der antigenen Peptide wurden Makaken hinsichtlich ihres MHC Klasse I-Haplotyps durchmustert und bezüglich Mamu-A*01 positive Tiere wurden für die beschriebenen Experimente ausgewählt.
  • Drei Tiere (CYD, DI und DORIS) wurden nach diesem Immunisierungsschema immunisiert:
    Woche 0 DNA (8 μg, id., Genpistole)
    Woche 8 DNA (8 μg, id., Genpistole)
    Woche 17 MVA (5 × 108 pfu, id.)
    Woche 22 MVA (5 × 108 pfu, id.)
  • Blut von jedem Tier wurde in den Wochen 0, 2, 5, 8, 10, 11, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24 und 25 des Experimentes abgenommen. Die Tiere wurden hinsichtlich Induktion von CTL unter Anwendung von zwei verschiedenen Methoden kontrolliert. PBMC, isoliert aus jeder Blutentnahme, wurden in vitro mit einem Peptid, welches in dem Epitopstrang codiert wurde, restimuliert und hinsichtlich ihrer Fähigkeit, autologe Peptid-beladene Zielzellen in einem Chromfreisetzungs-Zytotoxizitätstest zu erkennen, getestet. Zusätzlich wurden frisch isolierte PBMC hinsichtlich antigenspezifischer CD8+ T-Zellen unter Verwendung von Tetrameren gefärbt.
  • Nach zwei Genpistolen-Immunisierungen wurden unter Verwendung von Tetramerfärbung sehr niedrige Mengen an CTL festgestellt (15). Zwei Wochen nach der ersten MVA-Verstärkung entwickelten alle drei Tiere peptidspezifische CTL, was durch Tetramerfärbung festgestellt wurde (15). Dies wurde durch die Feststellung mäßiger CTL-Antworten nach in vitro-Restimulierung widergespiegelt (16, Woche 19). Die zweite Verstärkung mit MVA.H induzierte sehr hohe Mengen an antigenspezifischen CD8+ T-Zellen (15) und auch sehr hohe Mengen an peptidspezifischen zytotoxischen T-Zellen (16, Woche 23).
  • 15 zeigt eine Detektion von SIV-spezifischen, MHC Klasse I-beschränkten CD8+ T-Zellen unter Verwendung von Tetrameren. Drei bezüglich Mamu-A*01 positive Makaken wurden mit Plasmid-DNA (Genpistole) immunisiert, gefolgt von MVA-Verstärkung, wie es angegeben ist. Häufigkeiten von bezüglich Mamu-A*A01/CD8 doppelt positiven T-Zellen wurden nach FACS-Analyse identifiziert. Jeder Balken repräsentiert den Prozentsatz an CD8+ T-Zellen, die für das Mamu-A*01/gag-Epitop spezifisch sind, bei dem angegebenen Zeitpunkt. Ein Prozent CD8 T-Zellen entspricht etwa 5000/106 Peripherblutlymphozyten. Somit sind die Mengen an epitopspezifischen CD8 T-Zellen in dem Peripherblut dieser Makaken wenigstens so hoch wie die Mengen, die man in den Milzen immunisierter und geschützter Mäuse in den Malariauntersuchungen beobachtet.
  • 16 zeigt eine CTL-Induktion in Makaken nach einer DNA/MVA-Immunisierung. TBMC von drei verschiedenen Makaken (CYD, DI und DORIS) wurden in den Wochen 18, 19 und 23 isoliert und mit dem Peptid CTPYDINQM [SEQ ID NO: 54] in vitro restimuliert. Nach zwei Restimulierungen mit dem Peptid CTPYDINQM [SEQ ID NO: 54] wurden die Kulturen hinsichtlich ihrer lytischen Aktivität auf peptidgepulste, autologe Zielzellen getestet. Es wurde starke CTL-Aktivität beobachtet.
  • BEISPIEL 6
  • Immunogenizitäts- und Expositionsuntersuchungen in Schimpansen
  • Um zu zeigen, daß ein ähnliches Schema einer anfänglichen Immunisierung mit Plasmid-DNA und einer anschließenden Immunisierung mit rekombinantem MVA in höheren Primaten gegen Plasmodium falciparum-Malaria wirksam sein kann, wurde eine Immunisierungs- und Expositionsuntersuchung mit zwei Schimpansen durchgeführt. Schimpanse H1 erhielt eine anfängliche Immunisierung mit 500 μg eines Plasmides, das Plasmodium falciparum TRAP von dem CMV-Promotor ohne Intron A exprimiert, CMV-TRAP. Schimpanse H2 erhielt die gleiche Dosis CMV-LSA-1, welches den C-terminalen Abschnitt des LSA-1-Gens von P. falciparum exprimiert. Beide Schimpansen erhielten drei weitere Immunisierungen über die nächsten zwei Monate, jedoch mit drei Plasmiden bei jeder Immunisierung. H1 erhielt CMV-TRAP, wie zuvor, plus pTH-TRAP, welches TRAP unter Verwendung des CMV-Promotors mit Intron A exprimiert, was zu einem höheren Expressionsniveau führt. H1 erhielt auch RSV-LSA-1, welches den C-terminalen Abschnitt von LSA-1 unter dem RSV-Promotor exprimiert. H2 erhielt CMV-LSA-1, pTH-LSA-1 und RSV-TRAP bei den zweiten, dritten und vierten Immunisierungen. Die Dosis betrug immer 500 μg von jedem Plasmid.
  • Es wurde anschließend entdeckt, daß die RSV-Plasmide die darin enthaltenen Antigene nicht exprimierten, so daß H1 nur mit Plasmiden immunisiert wurde, die TRAP exprimierten, und H2 mit Plasmiden, die LSA-1 exprimierten.
  • Zwischen und nach diesen DNA-Immunisierungen wurden Tests auf zelluläre Immunantworten zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, wobei der letzte Test drei Monate nach der vierten DNA-Immunisierung durchgeführt wurde, jedoch waren weder in ELISPOT-Tests noch in CTL-Tests hinsichtlich CD8+ T-Zellen malariaspezifische T-Zellen feststellbar.
  • Beide Tiere wurden anschließend mit drei Dosen von 108 ffu eines rekombinanten MVA-Virus, welches das P. falciparum-TRAP-Antigen codierte, über einen Zeitraum von 6 Wochen immunisiert. Unmittelbar vor und auch nach der dritten Immunisierung mit rekombinantem MVA waren T-Zell-Antworten auf das TRAP-Antigen in beiden Schimpansen unter Verwendung eines ELISPOT-Tests auf gesamtes TRAP-Protein, gebunden an Latexperlen, feststellbar. Dieser Test detektiert sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zell-Antworten. Hinsichtlich spezifischer CD8+ T-Zell-Antworten wurde mit einer Reihe von kurzen, 8–11 Aminosäuren langen Peptiden in beiden immunisierten Schimpansen gesucht. Diese Analyse hinsichtlich CD8+ T-Zell-Antworten zeigte, daß CD8+ T-Zellen nur in dem Schimpansen H1 feststellbar waren. Das Zielepitop dieser CD8+ T-Lymphozyten war ein 11 Aminosäuren langes Peptid von TRAP, tr57, mit der Sequenz KTASCGVWDEW [SEQ ID NO: 78]. Diese CD8+ T-Zellen von H1 besaßen lytische Aktivität gegen autologe Zielzellen, die mit dem tr57-Peptid gepulst waren, und gegen autologe Zielzellen, die mit dem rekombinanten PbTRAP-MVA-Virus infiziert waren. Eine hohe Vorläuferhäufigkeit dieser spezifischen CD8+ T-Zellen von etwa 1 pro 500 Lymphozyten wurde in dem Peripherblut dieses Schimpansen H1 unter Verwendung eines ELISPOT-Tests zwei Monate nach der letzten MVA-Immunisierung festgestellt. Es wurde keine spezifische CD8+ T-Zell-Antwort in dem Schimpansen H2, welcher nicht mit einer TRAP exprimierenden Plasmid-DNA initialisiert worden war, deutlich festgestellt.
  • Zwei Monate nach der dritten PbTRAP-MVA-Immunisierung wurde eine Exposition von H1 und H2 mit 20.000 Sporozoiten durchgeführt, einer Anzahl, von der zuvor gefunden worden war, daß sie 7 Tage nach einer Exposition in Schimpansen eine zuverlässig feststellbare Infektion im Blutstadium lieferte (Thomas et al., 1994 und unveröffentlichte Daten). Die Exposition wurde mit dem NF54-Stamm von Plasmodium falciparum durchgeführt. Dies ist wichtig, weil die TRAP-Sequenz in der Plasmid-DNA und in dem rekombinanten MVA von dem T9/96-Stamm von P. falciparum stammt, welche zahlreiche Aminosäureunterschiede gegenüber der NF54-TRAP-Allele aufweist (Robson et al., 1990). Daher wurde diese Sporozoitenexposition eher mit einem heterologen als einem homologen Parasitenstamm durchgeführt. In dem Schimpansen H1 waren Parasiten in Peripherblut erwartungsgemäß 7 Tage nach der Sporozoitenexposition unter Verwendung von in vitro-Parasitenkulturdetektion feststellbar. In H1 war jedoch das Auftreten von Parasiten im Blutstadium in einer Kultur von den Tag 7-Blutproben um drei Tage verzögert, was mit einer gewissen schützenden Immunwirkung gegen die Leberstadiuminfektion in Einklang ist. In Untersuchungen früherer Malariaimpfstoff-Kandidaten in Menschen wurde angenommen, daß eine Verzögerung des Auftretens von Parasiten im Peripherblut einer erheblichen Verminderung der Parasitendichte in der Leber entspricht (Davis et al., 1989). Somit zeigte der Schimpanse H1, der zuerst mit P. falciparum-TRAP-Plasmid-DNA und anschließend mit dem gleichen Antigen, welches von einem rekombinanten MVA-Virus exprimiert wurde, eine starke CD8+ T-Lymphozyten-Antwort und Anzeichen für einen gewissen Schutz gegen Exposition an heterologe Sporozoiten.
  • DISKUSSION
  • Diese Beispiele zeigen ein neues Schema zur Immunisierung gegen Malaria von einer menschlichen Malariainfektion, welches hohe Mengen an schützenden CD8+ T-Zellen in Nagermodellen induziert. Es wird auch ein beispielloser vollständiger Schutz gegen Sporozoitenexposition unter Verwendung von Untereinheitenimpfstoffen demonstriert (36 von 36 Mäusen wurden gemäß Tabelle 6 unter Verwendung von DNA-Initialisierung und MVA-Verstärkung mit den das CS-Epitop enthaltenden Impfstoffen geschützt). Induktion von schützenden Immunantworten unter Verwendung des DNA-Initialisierungs-/MVA-Verstärkungs-Schemas wurde in zwei zusätzlichen Mausmodellen eines Modells viraler Infektion mit Influenza A und Krebs (P815-Tumormodell) gezeigt. Wichtiger für Impfstoffe für eine Verwendung im Menschen ist dieses Immunisierungsschema auch hochgradig immunogen für CD8+ T-Zellen in Primaten. Starke SIV-gag-spezifische CTL wurden in 3 von 3 Makaken mit Plasmid-DNA und MVA exprimierenden Epitopsträngen induziert. Die induzierten Mengen sind vergleichbar mit denjenigen, die man in SIV-infizierten Tieren findet. Die Daten aus den Schimpansenstudien zeigen, daß das gleiche Immunisierungsschema eine starke CD8+ T-Lymphozyten-Antwort gegen P. falciparum in höheren Primaten induzieren kann mit Anzeichen für einen Schutz gegen P. falciparum-Sporozoitenexposition.
  • Von Ty-VLPs wurde zuvor berichtet, daß sie gute Mengen an CD8+ T-Zell-Antworten gegen die P. berghei-Nagermalaria induzieren (Allsopp et al., 1995), aber alleine dieses Konstrukt ist nicht schützend. Es wurde nun herausgefunden, daß eine anschließende Immunisierung mit rekombinantem MVA die CD8+ T-Zell-Antwort sehr erheblich verstärkt und ein hohes Maß an Schutz erzeugt (Tabelle 7).
  • Rekombinante MVA-Viren wurden zuvor nicht hinsichtlich ihrer Wirksamkeit als Malariaimpfstoffe untersucht. Rekombinantes MVA alleine war nicht signifikant schützend und auch nicht Initialisierung mit rekombinantem MVA, gefolgt von einer zweiten Immunisierung mit rekombinanter Plasmid-DNA. Jedoch lieferte eine zweite Immunisierung mit dem rekombinanten MVA nach einer anfänglichen Immunisierung entweder mit Ty-VLPs oder mit Plasmid-DNA beeindruckende Niveaus an Schutz. Nichtrekombinantes MVA-Virus wurde in sicherer Weise zur Impfung tausender Menschen gegen Pocken verwendet und scheint ein ausgezeichnetes Sicherheitsprofil zu besitzen. Die molekulare Grundlage für die erhöhte Sicherheit und Immunogenizität dieses Stammes von Vacciniavirus wird durch ausführliche molekulare Studien beleuchtet (Meyer et al., 1991; Sutter et al., 1994).
  • Plasmid-DNA wurde zuvor als ein Malariaimpfstoff gegen die P. yoelii-Nagermalaria getestet. Hohe Niveaus, aber keinen vollständigen Schutz findet man in einigen Stämmen, aber in anderen Mausstämmen wurde sogar nach mehreren Immunisierungen geringer oder kein Schutz beobachtet (Doolan et al., 1996). Obwohl Plasmid-DNA als eine Methode zur Immunisierung gegen P. falciparum vorgeschlagen wurde, wurde zuvor kein Erfolg erzielt. Der hierin gelieferte Beweis ist der erste Beweis, der zeigt, daß Plasmid-DNA in einem Immunisierungsschema zur Induktion schützender Immunität gegen den menschlichen Malariaparasiten P. falciparum verwendet werden kann.
  • Ein zu dem hierin gezeigten Schema ähnliches Immunisierungsschema kann erwarten lassen, daß es brauchbare schützende Immunität gegen P. falciparum im Menschen induziert. Es sollte angemerkt werden, daß fünf der Impfstoffkonstrukte, die in diesen Untersuchungen zur Induktion schützender Immunität in Nagern oder Schimpansen verwendet wurden, P. falciparum-Sequenzen enthalten und daher zur Immunisierung des Menschen gegen P. falciparum verwendet werden könnten. Diese sind: 1. Der P. falciparum-TRAP-Plasmid-DNA-Impfstoff. 2. Das rekombinante P. falciparum-TRAP-MVA-Virus. 3. Das Ty-VLP, welches einen Epitopstrang einer Anzahl von P. falciparum-Epitopen sowie das einzelne P. berghei-CTL-Epitop codiert. 4. Die Plasmid-DNA, welche den gleichen Epitopstrang wie 3. codiert. 5. Das rekombinante MVA, welches den längeren HM-Epitopstrang codiert, der viele der Malariaepitope in 3 und 4 umfaßt. In ähnlicher Weise könnten die Plasmid-DNAs und MVA, welche HIV-Epitope für menschliche Klasse I-Moleküle codieren, entweder in. der prophylaktischen oder therapeutischen Immunisierung gegen HIV-Infektion verwendet werden.
  • Diese Untersuchungen haben ein klares Anzeichen dafür geliefert, daß ein neues sequentielles Immunisierungsschema, welches ein nichtreplizierendes oder ein bezüglich Replikati on beeinträchtigtes Pockenvirus als eine Verstärkung einsetzt, in der Lage ist, eine starke schützende CD8+ T-Zell-Antwort gegen den Malariaparasiten zu induzieren. Die Beispiele zeigen deutlich eine überraschende und erhebliche Verbesserung von CD8+ T-Zell-Antworten und des Schutzes, verglichen mit replizierenden Stämmen von Pockenviren. Da es keinen Grund gibt anzunehmen, daß die Immunogenizität von CD8+ T-Zell-Epitopen von dem Malariaparasiten sich wesentlich von CD8+ T-Zell-Epitopen in anderen Antigenen unterscheiden sollten, wird erwartet, daß das hierin beschriebene Immunisierungsschema sich als wirkungsvoll bei der Erzeugung wertvoller CD8+ T-Zell-Antworten gegen andere Krankheiten erweisen wird. Die kritische Stufe in diesem Immunisierungsschema ist die Verwendung nichtreplizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter rekombinanter Pockenviren zur Verstärkung einer vorher existierenden CTL-Antwort. Wir haben gezeigt, daß CTL-Antworten unter Verwendung verschiedener Antigenauslieferungssysteme, wie einem DNA-Impfstoff id. und im., einem rekombinanten Ty-VLP, einem rekombinanten Adenovirus und bestrahlter Sporozoiten, initiiert werden können. Dies wird durch die Daten gestützt, die bezüglich der Erzeugung einer CD8+ T-Zell-Antwort gegen HIV, Influenzavirus und Tumore präsentiert werden. Unter mehreren bekannten Beispielen anderer Krankheiten, gegen welche eine CD8+ T-Zell-Immunantwort wichtig ist, sind die folgenden: Infektion und Erkrankung, verursacht durch die Viren HIV, Herpes simplex, Herpes zoster, Hepatitis C, Hepatitis B, Influenza, Epstein-Barr-Virus, Masern, Dengue und HTLV-1; durch die Bakterien Mycobacterium tuberculosis und Listeria sp.; und durch die Protozoenparasiten Toxoplasma und Trypanosoma. Induktion von schützenden CTL-Antworten gegen Influenza A-Virus wurde in 14 gezeigt. Darüber hinaus wird erwartet, daß das hierin beschriebene Immunisierungsschema bei einer Immunisierung gegen Formen von Krebs, bei denen CD8+ T-Zell-Antworten eine schützende Rolle spielen, wertvoll sind. Die Induktion schützender CTL-Antworten unter Verwendung des DNA-Induktions-MVA-Verstärkungs-Schemas gegen Tumore ist in 12 gezeigt. Spezielle Beispiele im Menschen umfassen Melanome, Brustkrebs und Lungenkrebs.
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Claims (28)

  1. Verwendung (i) einer Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung), umfassend eine Quelle für ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope ein nicht-viraler Vektor oder ein nicht replizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter viraler Vektor ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger; und ii) einer Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung), umfassend eine Quelle für ein oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope des Zielantigens, einschließlich wenigstens eines CD8+ Zell-Epitops, welches das gleiche wie ein CD8+ T-Zell-Epitop der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ist, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope ein nicht replizierender oder bezüglich Replikation beeinträchtigter rekombinanter Pockenvirusvektor ist, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, für die Herstellung eines Impfkits gegen eine durch ein Pathogen verursachte Erkrankung oder gegen Krebs, bei dem CD8+ T-Zellreaktionen eine schützende Rolle spielen, wobei der Kit eine schützende CD8+ T-Zell-Immunantwort gegen wenigstens ein Zielantigen des Pathogens oder des Krebses erzeugt; mit der Maßgabe, dass, wenn die Quelle für Epitope in (i) ein viraler Vektor ist, der virale Vektor in (ii) von einem anderen Virus als dem Virus in (i) abgeleitet ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) DNA oder RNA ist.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Quelle der Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ein rekombinantes DNA-Plasmid ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 2 oder 3, des Weiteren umfassend GM-CSF als Adjuvans für die Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung).
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) das Zielantigen codiert.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Quelle der Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ein einzelnes CD8+ T-Zell-Epitop oder einen rekombinanten Strang aus zwei oder mehreren CD8+ T-Zell-Epitopen codiert.
  7. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Quelle der Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ein Peptid, Polypeptid, Protein, Polyprotein oder ein Teilchen ist, umfassend zwei oder mehrere CD8+ T-Zell-Epitope, die in einem rekombinanten Strang aus CD8+ T-Zell-Epitopen oder in einem Zielantigen vorhanden sind.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ein rekombinantes Proteinteilchen wie ein Ty-Virus-ähnliches Teilchen ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Quelle der Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ein nicht replizierender rekombinanter Adenovirusvektor ist.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope in der Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung) ein rekombinanter Vacciniavirusvektor ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der rekombinante Vacciniavirusvektor von dem Vacciniavirusstamm Modified Virus Ankara (MVA) oder einem davon abgeleiteten Stamm stammt.
  12. Verwendung nach Anspruch 10, wobei der rekombinante Vacciniavirusvektor vom Stamm NYVAC stammt.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Quelle der CD8+ T-Zell-Epitope in der Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung) Geflügelpocken oder ALVAC ist.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Erzeugung einer schützenden Immunantwort gegen ein Malariapathogen wie Plasmodium falciparum.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope, die in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) sind oder durch die Initialisierungszu sammensetzung (Priming-Zusammensetzung) codiert werden, ein oder mehrere Malariaepitope umfassen, die aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 und 34 ausgewählt sind.
  16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) sämtliche dieser Malariaepitope umfassen.
  17. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Erzeugung einer Immunantwort gegen HIV.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope, die in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) sind oder durch die Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) codiert werden, ein oder mehrere HIV-Epitope umfassen, welche aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 42 bis 64 ausgewählt sind.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die CD8+ T-Zell-Epitope, die in der Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) sind oder durch die Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) codiert werden, sämtliche dieser HIV-Epitope umfassen.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Initialisierungszusammensetzung (Priming-Zusammensetzung) ein rekombinantes Protein oder Teilchen umfasst, das wenigstens ein Epitop oder Antigen des Pathogens oder des Krebses umfasst, und die Verstärkungszusammensetzung (Booster-Zusammensetzung) einen rekombinanten MVA-Vektor umfasst, der das gleiche Epitop oder Antigen codiert.
  21. Rekombinanter Epitopstrang, der die CD8+ T-Zell-Epitope der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 und 34 und des Weiteren die Epitope der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 26, 28, 36, 38 und 40 umfasst.
  22. Rekombinantes Ty-Virus-ähnliches Teilchen, welches den Epitopstrang nach Anspruch 21 umfasst, zur Immunisierung eines Tieres gegen Malaria.
  23. Rekominantes DNA-Plasmid oder rekombinantes, nicht replizierendes oder bezüglich Replikation beeinträchtigtes Pockenvirus, welches den Epitopstrang nach Anspruch 21 codiert, zur Immunisierung eines Tieres gegen Malaria.
  24. Bezüglich Replikation beeinträchtigtes Pockenvirus, welches das P. falciparum-Antigen TRAP codiert, zur Immunisierung eines Tieres gegen Malaria, wobei das Virus der Vacciniastamm Modified Virus Ankara (MVA) ist.
  25. Rekombinantes Pockenvirus nach Anspruch 23, wobei das Virus der Vacciniastamm Modified Virus Ankara (MVA) ist.
  26. Rekombinanter Epitopstrang, welcher die CD8+ T-Zell-Epitope der Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 42 bis 64 umfasst.
  27. Rekombinantes Polypeptid, welches ein ganzes oder im Wesentlichen ganzes P. falciparum-Proteinantigen und einen Strang aus zwei oder mehreren Malaria-CD8+ T-Zell-Epitopen ausgewählt aus den Aminosäuresequenzen von SEQ ID Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32 und 34 umfasst.
  28. Rekombinantes Polypeptid nach Anspruch 27, wobei das ganze oder im Wesentlichen ganze Proteinantigen TRAP ist.
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