DE69808661T3

DE69808661T3 - Sequenzanalyse von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69808661T3
Application number: DE69808661T
Authority: DE
Inventors: Daniel Densham
Original assignee: Gen Probe Inc
Current assignee: Gen Probe Inc
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2012-05-03
Anticipated expiration: 2018-07-25
Also published as: EP1017848A2; US20100316999A1; HK1031130A1; IS5360A; PT1017848E; DE69808661T2; US20080014592A1; EP2267165A3; EP2267164A3; KR100664331B1; EP1229133B1; CA2294962C; WO1999005315A3; CN1265158A; ES2183394T3; EP1229133A3; EP2267165B1; ATE225858T1; EP1017848B2; AU8455998A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids.
Hintergrund der Erfindung
Die Möglichkeit zur Bestimmung der Sequenz eines Polynukleotids ist von großer wissenschaftlicher Bedeutung. Beispielsweise ist das Humangenom-Projekt eine ambitiöse internationale Anstrengung, um die drei Milliarden Basen DNA, die im menschlichen Genom kodiert sind, zu kartieren und sequenzieren. Nach Vervollständigung wird die resultierende Sequenz-Datenbank ein Werkzeug von unvergleichlichem Leistungsvermögen für die biomedizinische Forschung sein. Das Haupthindernis für die erfolgreiche Beendigung dieses Projekts betrifft die beim Sequenzierungsverfahren verwendete Technologie.
Das hauptsächliche Verfahren, das allgemein zur DNA-Sequenzierung in großem Maßstab eingesetzt wird, ist das Kettenabbruchverfahren. Dieses Verfahren wurde zuerst von Sanger und Coulson (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, 74: 5463–5467) entwickelt und beruht auf der Verwendung von Didesoxy-Derivaten der vier Nukleosidtriphosphate, welche in einer Polymerase-Reaktion in die entstehende Polynukleotidkette inkorporiert werden. Nach der Inkorporation beenden die Didesoxy-Derivate die Polymerase-Reaktion und die Produkte werden dann durch Gelelektrophorese aufgetrennt und analysiert, um die Position zu offenbaren, an der das spezielle Didesoxy-Derivat in die Kette inkorporiert wurde.
Obwohl dieses Verfahren in großem Umfang eingesetzt wird und verlässliche Ergebnisse produziert, ist anerkannt, dass es langsam, arbeitsintensiv und kostspielig ist.
Ein alternatives Sequenzierverfahren wird in EP-A-0471732 vorgeschlagen, welches spektroskopische Mittel einsetzt, um die Inkorporation eines Nukleotids in einen entstehenden Polynukleotidstrang, der komplementär zu einem Zielstrang ist, nachzuweisen. Das Verfahren beruht auf einem immobilisierten Komplex von Matrize und Primer, welcher einem Strom ausgesetzt wird, der nur eines der verschiedenen Nukleotide enthält. Spektroskopische Techniken werden dann eingesetzt, um ein zeitabhängiges Signal zu messen, welches das Ergebnis des Polymerase-katalysierten Wachstums der Matrizenkopie ist. Die beschriebenen spektroskopischen Techniken sind Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)-Spektroskopie, welche Veränderungen in einem Analyten innerhalb eines evaneszenten Wellenfeldes misst, und Fluoreszenz-Meßtechniken. Jedoch sind Beschränkungen dieses Verfahrens bekannt; die schwerwiegendste für die SPR-Technik liegt darin, dass mit wachsender Größe des Kopienstrangs die absolute Größe des Signals aufgrund der Bewegung des Stranges aus dem evaneszenten Wellenfeld hinaus ebenfalls wächst, was es schwieriger macht, Zunahmen nachzuweisen. Die Fluoreszenz-Meßtechniken haben den Nachteil einer zunehmenden Hintergrund-Interferenz von den Fluorophoren, welche in die wachsende entstehende Polynukleotidkette inkorporiert sind. Mit wachsender Kette nimmt das Hintergrund „rauschen” zu und die erforderliche Zeit, um jede Nukleotid-Inkorporation nachzuweisen, muß erhöht werden. Dies beschränkt die Anwendung des Verfahrens zur Sequenzierung großer Polynukleotide ernsthaft.
Es besteht deshalb Bedarf für ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der Sequenz von Polynukleotiden, welches die Geschwindigkeit, mit der ein Polynukleotid sequenziert wird, signifikant erhöht und welches vorzugsweise mit einem automatischen Verfahren durchgeführt wird, was die Komplexität und Kosten, die mit vorhandenen Methoden verbunden sind, verringert.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die Messung von elektromagnetischer oder anderer Strahlung dazu eingesetzt werden kann, eine Konformationsänderung und/oder Massenänderung bei einem Polymerase-Enzym nachzuweisen, welche auftritt, wenn ein Nukleotid in einen entstehenden Polynukleotidstrang inkorporiert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Sequenzierung eines Polynukleotids die Schritte:

(i) Umsetzen eines Ziel-Polynukleotids mit einem Polymerase-Enzym, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, und den verschiedenen Nukleotiden unter ausreichenden Bedingungen für die Polymerase-Reaktion, und
(ii) Nachweisen der Inkorporation eines spezifischen Nukleotids, das zu dem Ziel-Polynukleotid komplementär ist, durch Messung einer Veränderung in, oder der Absorption von, angewandter Strahlung während der Wechselwirkung zwischen dem Nukleotid und dem Enzym, wobei die Schritte (i) und (ii) mit jedem der verschiedenen Nukleotide der Reihe nach durchgeführt werden, bis die Inkorporation nachgewiesen wird, und dann wiederholt werden, oder wobei Schritt (i) mit allen vorhandenen Nukleotiden durchgeführt wird, wobei die Nukleotide eine 3'-Blockierungsgruppe umfassen, die nach der Polymerase-Reaktion entfernt wird.

Die Strahlung kann einer Probe zugeführt werden unter Anwendung einer Vielzahl von Techniken, einschließlich oberflächensensitiver Nachweistechniken, wobei eine Veränderung der optischen Reaktion auf einer festen optischen Oberfläche eingesetzt wird, um eine bindende Wechselwirkung auf der Oberfläche anzuzeigen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich bei der verwendeten Technik um eine Spektroskopie mit einer evaneszenten Welle, insbesondere Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)-Spektroskopie.
In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die in dem Verfahren verwendeten Nukleotide eine Blockierungsgruppe an der 3'-Position und gegebenenfalls an der 5'-Position, welche die Inkorporation der Nukleotide in den Polynukleotidstrang verhindern. Die Blockierungsgruppen können jedoch selektiv entfernt werden, um das Stattfinden der Inkorporation zu erlauben. Durch Verwendung der blockierten Nukleotide ist es möglich, dass das Verfahren unter Verwendung aller zu irgendeinem Zeitpunkt in der Reaktion vorhandenen Nukleotide durchgeführt wird. Die selektive Entfernung der Blockierungsgruppen wird in einer Weise durchgeführt, welche den Nachweis eines jeden inkorporierten Nukleotids sicherstellt. Das Verfahren kann deshalb auf einer „Echtzeit”-Basis ablaufen, um eine hohe Geschwindigkeit der Sequenzanalyse zu erreichen.
Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird lediglich beispielhaft unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen beschrieben, worin:
1 eine schematische Darstellung der Polynukleotid-Sequenzanalyse unter Einsatz von SPR-Spektroskopie ist; und
2 die unterschiedlichen Antwortsignale zeigt, die für die Polymerisation eines jeden der verschiedenen Nukleotide nachgewiesen werden;
3 das Syntheseverfahren für die doppelt blockierten Nukleotide erläutert.
Beschreibung der Erfindung
Das vorliegende Verfahren zur Sequenzierung eines Polynukleotids beinhaltet die Analyse der kinetischen Wechselwirkung zwischen einem Polymerase-Enzym, einem Ziel-Polynukleotid und einem komplementären Nukleotid. Die Messung der kinetischen Wechselwirkung erfolgt durch Überwachung der Absorption von elektromagnetischer oder anderer Strahlung oder der Veränderungen dabei, welche stattfindet/n, wenn die Reaktion abläuft.
Der Begriff „Polynukleotid”, wie hier verwendet, ist breit auszulegen und umfaßt DNA und RNA, einschließlich modifizierter DNA und RNA, sowie andere hybridisierende Nukleinsäure-ähnliche Moleküle, z. B. Peptid-Nukleinsäure (PNA).
Typischerweise wird das Verfahren durch Zuführung von elektromagnetischer Strahlung unter Anwendung der Techniken von Oberflächen-Plasmon-Resonanz oder magnetischer Kernresonanz durchgeführt. Jedoch können andere Techniken, welche Strahlungsänderungen messen, in. Betracht kommen, beispielsweise Spektroskopie der Fluoreszenz durch innere Totalreflexion („total internal reflectance fluorescence”; TIRF), der abgeschwächten Totalreflexion („attenuated total reflection”; ATR), verhinderten Totalreflexion („frustrated total reflection”; FTR), Brewster-Winkel-Reflektrometrie, gestreuten inneren Totalreflexion („scattered total internal reflection”; STIR), oder Ellipsometrie evaneszenter Wellen.
Andere Techniken als diejenigen, welche elektromagnetische Strahlung erfordern, werden ebenfalls in Betracht gezogen, insbesondere photochemische Techniken wie Chemolumineszenz und gravimetrische Techniken, einschließlich Resonanzsysteme wie Techniken akustischer Oberflächenwellen (SAW) und Quarzkristall-Mikrowaagen-(QCM)-Techniken.
Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)-Spektroskopie ist ein bevorzugtes Verfahren und misst die Eigenschaften einer Lösung durch Nachweis der Unterschiede im Brechungsindex zwischen der Hauptphase der Lösung und dem Bereich der evaneszenten Welle. Einfallendes monochromatisches Licht wird in einem speziellen Winkel von einer festen optischen (Sensor-Chip)-Oberfläche weg auf die entgegengesetzte Seite zu einer untersuchten Probe reflektiert. Das Licht dringt eine sehr kurze Distanz in die Probe ein und wird durch eine Wechselwirkung an der Oberfläche beeinflusst.
Geeignete Sensor-Chips sind im Stand der Technik bekannt. Typischerweise umfassen sie ein optisch transparentes Material, z. B. Glas, und einen dünnen reflektierenden Film, z. B. Silber oder Gold. Hinsichtlich eines Überblicks über die SPR-Spektroskopie siehe die europäische Patentveröffentlichung Nr. 0648328 (deren gesamte Offenbarung hier durch die Bezugnahme mit eingeschlossen ist).
Magnetische Kernresonanz (NMR)-Spektroskopie ist ein weiteres bevorzugtes Verfahren und misst die magnetischen Eigenschaften von Verbindungen. Die Kerne von Verbindungen werden durch die Kombination von einem angelegten Magnetfeld und Radiofrequenzstrahlung energetisch orientiert. Wenn die einem Kern zugeführte Energie der Energiedifferenz zwischen Spinzuständen (dem Unterschied zwischen einer Orientierung parallel oder antiparallel zur Richtung der angelegten Felder) entspricht, wird ein Zustand erreicht, der als Resonanz bekannt ist. Die Absorption und anschließende Emission von Energie, die mit dem Übergang von einem Spinzustand zum anderen verbunden ist, wird mit einem Radiofrequenzempfänger nachgewiesen.
Ein wichtiger Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Polymerase-Enzyms, das auf einem festen Träger immobilisiert ist. Die Immobilisierung der Polymerase bietet mehrere wichtige Vorteile hinsichtlich des Erfolgs dieses Verfahrens. Zuerst wird das Problem des statistischen „Rauschens”, das mit der Messung von Energieabsorption in löslichen Molekülen verbunden ist, beträchtlich verringert. Zweitens ist das Problem des Rauschens aufgrund der Wechselwirkung irgendeines Substrats (z. B. Nukleotide), das nicht direkt mit der Polymerase verbunden ist, verringert, da die Polymerase innerhalb eines speziell definierten Gebiets in Bezug auf das Messgebiet gehalten werden kann. Dies ist besonders relevant, falls die zur Messung der Strahlungsänderungen eingesetzte Technik die Messung von Fluoreszenz erfordert, wie z. B. in TIRF, wo die Hintergrundfluoreszenz zunimmt, wenn die entstehende Kette wächst. Ebenso werden, falls SPR-Spektroskopie eingesetzt wird, die Polymerasereaktionen innerhalb des evaneszenten Wellenfelds gehalten und so können genaue Messungen unabhängig von der Größe des Polynukleotids durchgeführt werden. Schließlich ist es, nachdem weder das Ziel-Polynukleotid noch der Oligonukleotid-Primer irreversibel mit der festen Oberfläche verknüpft sind, relativ einfach, die Oberfläche zu regenerieren, um das Stattfinden weiterer Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung der gleichen immobilisierten Polymerase zu erlauben.
Die Immobilisierung kann unter Anwendung von im Stand der Technik bekannten Standardverfahren durchgeführt werden. Insbesondere kann eine Immobilisierung unter Anwendung von Standard-Amin-Kopplungsverfahren eingesetzt werden, unter Bindung von Liganden-assoziierten Aminen an beispielsweise eine Dextran- oder N-Hydroxysuccinimidester-aktivierte Oberfläche. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Polymerase auf einer SPR-Sensorchip-Oberfläche immobilisiert, welche die Polymerase in enger Nachbarschaft zu der Sensoroberfläche hält, wo Veränderungen im Brechungsindex gemessen werden können. Beispiele von verwendeten Verfahren zur Immobilisierung von Biomolekülen an optische Sensoren sind in EP-A-0589867 und Löfas et al., Biosens. Bioelectron. (1995) 10: 813–822, offenbart.
Die in der Erfindung eingesetzte Polymerase kann irgendein bekannter Typ sein. Beispielsweise kann die Polymerase irgendeine DNA-abhängige DNA-Polymerase sein. Falls das Ziel-Polynukleotid ein RNA-Molekül ist, so kann die Polymerase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, d. h., reverse Transkriptase, oder eine RNA-abhängige RNA-Polymerase, d. h., eine RNA-Replikase, sein. in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Polymerase Taq-Polymerase. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Polymerase entweder E. coli-Polymerase III-Holoenzym (McHenry, Ann. Rev. Biochem. 1988; 57: 519), T7 Polymerase (Schwager et al., Methods in Molecular and Cellular Biology (1989/90); Bd. 1(4): 155–159, oder Bakteriophagen T7-Gen-5-Polymerase, komplexiert mit E. coli-Thioredoxin (Tabor et al., J. Biol. Chem. (1987); 262: 1612–1623). Jedes dieser Polymerase-Enzyme ermöglicht das Statttfinden einer Bindung mit dem Ziel-Polynukleotid mit hoher Standorttreue und hält deshalb einen Polymerase-Polynukleotidkomplex auch dann aufrecht wenn die Polymerisation nicht aktiv stattfindet.
Das Polymerase III-Holoenzym ist aus drei Subanordnungen aufgebaut, welche zur Bildung des prozessiven Enzyms zusammenwirken: (I) der Polymerasekern, einschließlich der Polymeraseuntereinheit α, (II) die β-Dimer-Untereinheit, welche als Armband-ähnliche Struktur um DNA wirkt, und (III) eine Subanordnung von zwei Untereinheiten, τ und γ, welche zur Bindung und Hydrolyse von ATP zur Bildung des β-Dimers um die DNA eingesetzt werden.
Als erster Schritt beim Sequenzierungsverfahren kann das Ziel-Polynukleotid mit einem geeigneten Primer in Hybridisierungs/Polymerisierungs-Puffer in Kontakt gebracht werden. Typischerweise wird der Puffer bei einer ausreichend hohen Temperatur vorliegen, um etwaige Sekundärstrukturen, die bei dem Ziel-Polynukleotid vorliegen, aufzubrechen (oder zu schmelzen). Nach dem Abkühlen wird der Primer mit seinem Gegenstück auf dem Ziel verschmelzen. Diese Probe kann dann mit der immobilisierten Polymerase in Kontakt gebracht werden, um den Ziel-Polynukleotid/Polymerase-Komplex zu bilden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Zugabe der Nukleotide so kontrolliert, dass die verschiedenen Nukleotide nacheinander dem Polymerase/Ziel-Komplex zugegeben werden. Beispielsweise kann dGTP zugesetzt werden und gestattet werden, über den Polymerase/Polynukleotid-Komplex zu fließen; eine etwaige Inkorporation wird dann nachgewiesen. Ungebundenes dGTP fließt aus der Reaktionsstelle und ein weiteres Nukleotid wird eingeführt. Auf diese Weise kann der Nachweis einer kinetischen Wechselwirkung mit dem speziellen Nukleotid korreliert werden, das zu diesem Zeitpunkt vorhanden ist, und die Polynukleotidsequenz kann somit bestimmt werden.
Das Verfahren kann auch durchgeführt werden, wenn alle verschiedenen Nukleotide anwesend sind. Um dies erfolgreich durchzuführen, ist es erforderlich, dass die Nukleotide eine Blockierungsgruppe mindestens an der 3'-Position, vorzugsweise jedoch an den 3'- und 5'-Positionen, inkorporieren. Die Blockierungsgruppen können lichtempfindlich sein und können durch Zufuhr von Licht einer definierten Wellenlänge entfernt werden, um das aktive Molekül freizusetzen. Falls die Nukleotide Blockierungsgruppen an sowohl den 3'- als auch den 5'-Positionen inkorporieren, sollten die Blockierungsgruppen in der Lage sein, auf Grundlage ihrer spektralen Extinktion unterschieden zu werden, d. h., es sollte möglich sein, selektiv eine der Blockierungsgruppen zu entfernen, indem eine spezielle Wellenlänge von Licht zugeführt wird, welche die andere Blockierungsgruppe nicht entfernt. Es ist auch wünschenswert, dass die Blockierungsgruppe an der 3'-Position es erfordert, dass das Licht für eine längere Zeitdauer zugeführt wird als erforderlich ist, um die Blockierungsgruppe an der 5'-Position zu entfernen. Dies erlaubt es, dass die Blockierungsgruppen sowohl mit Hilfe des Spektrums als auch zeitlich unterschieden werden.
Im allgemeinen erfahren die lichtempfindlichen Blockierungsgruppen eine Photolyse bei Wellenlängen im Bereich von 200 nm bis 450 nm. Die Blockierungsgruppen werden sich typischerweise von einer Verbindung der Formel R¹-[O-CO-]X ableiten, worin R¹ eine photolabile Gruppe ist und X eine Austrittsgruppe ist. Beispielsweise ist R¹ o-Nitrobenzyl. Besonders bevorzugte Blockierungsgruppen schließen die o-Nitrobenzyl-Schutzgruppen ein, die in WO-A-92/10092 und WO-A-97/39151 beschrieben werden. Diese Gruppen schließen Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), Nitropiperonyloxycarbonyl (NPOC), α-Methylnitroveratryloxycarbonyl (MeNVOC), α-Methylnitropiperonyloxycarbonyl (MeNPOC) und 1-Pyrenylmethyloxycarbonyl (PYMOC) ein.
Eine geeignete 3'-Blockierungsgruppe ist eine (4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl)oxycarbonylgruppe, welche gebildet werden kann durch Umsetzung des Nukleotids mit einer Verbindung der Formel (I):
worin R eine geeignete Veresterungsgruppe ist, z. B. Methyl. Diese Blockierungsgruppe kann durch einen Lichtpuls mit einer Wellenlänge von 360 nm selektiv entfernt werden.
Eine geeignete Blockierungsgruppe an der 5'-Position ist die 1-(2-Nitrophenyl)ethylgruppe (II):
worin R irgendeine geeignete funktionelle Gruppe ist, z. B. Halogen. Diese Blockierungsgruppe kann bei einer Wellenlänge von 260 nm selektiv entfernt werden.
Beispielsweise werden doppelt blockierte Nukleotide über das geprimte Ziel-Polynukleotid (das in Verbindung mit einem Polymerase-Komplex großer Standorttreue gehalten wird) gespritzt und monochromatisches Licht wird stromaufwärts der Polymerase bei einer ausreichenden Wellenlänge fokussiert, um die Blockierungsgruppe von dem terminalen Phosphat eines jeden Nukleotids freizusetzen. Die Nukleotide sind dann in der Lage, über die gebundene Polymerase zu fließen, und eine Inkorporation in den entstehenden Polynukleotidstrang kann stattfinden. Nachdem die Blockierungsgruppe an der 3'-Position gebunden bleibt, wird jedoch nur ein Nukleotid inkorporiert. Eine Messung der kinetischen Wechselwirkung wird deshalb Information bezüglich des speziellen Nukleotids liefern, welches in die entstehende Kette inkorporiert wird. Die verwendete Polymerase kann eine sehr standorttreue Polymerase sein, welche nicht leicht von dem Ziel abdissoziiert, wenn die Reaktion stoppt. Alternativ kann ein kompetitiver Inhibitor eingesetzt werden, um die Dissoziation der Polymerase vom Ziel zu verhindern.
Nach Bestimmung des inkorporierten Nukleotids wird ein Puls von monochromatischem Licht auf die Blockierungsgruppe innerhalb der katalytischen Stelle der Polymerase fokussiert, um die Blockierungsgruppe an der 3'-Position zu entfernen. Das monochromatische Licht kann für eine längere Zeitdauer gepulst werden als für die Entfernung an der 5'-Position erforderlich ist und so wird nur die Blockierungsgruppe, welche mit dem Nukleotid in dem Polymerase-Komplex assoziiert ist, entfernt werden. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit der Addition von Nukleotiden, die nicht mit dem Polymerase-Komplex assoziiert sind.
Sobald die 3'-Blockierungsgruppe freigesetzt ist, wird der Polymerase-Reaktion die Fortsetzung ermöglicht, wenn weitere Nukleotide an der Polymerase-Reaktionsstelle eintreffen. Eine unkontrollierte Polymerisation wird durch Alternierung der erforderlichen Lichtpulse, um die Blockierungsgruppen zu entfernen, verhindert.
Obwohl es bevorzugt ist, die doppelt blockierten Nukleotide wie oben beschrieben einzusetzen, kann das Verfahren auch unter Verwendung von Nukleotiden durchgeführt werden, die nur eine Blockierungsgruppe an der 3'-Position aufweisen. in diesem Fall ist es wünschenswert, einen kompetitiven Inhibitor der Polymerase einzusetzen, welcher die Wahrscheinlichkeit verringern wird, dass ein Nukleotid, dem eine Blockierungsgruppe an der 3'-Position fehlt, in die entstehende Kette inkorporiert wird. Ein geeigneter kompetitiver Inhibitor von Polymerase ist Carbonyldiphosphonat (COMDP).
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen.
BEISPIEL
Die folgende Analyse wurde mit einem modifizierten BIAcore 2000-System (BIAcore AB, Uppsala, Schweden) mit einem Sensorchip CM5 (Forschungsgrad, BIAcore AB) als optischer Sensoroberfläche durchgeführt. Das Instrument war mit einer integrierten μm-Fluidkartusche (IFC) versehen, welche die Analyse in vier Zellen durch eine einzige Probeninjektion erlaubt.
Herstellung von Polymerase
E. coli-Polymerase III-Holoenzym wurde gemäß Millard et al., Methods Enzymol. (1995), 262: 22, unter Einsatz von hydrophober Chromatographie auf Valyl-Sepharose zur Reinigung des Holoenzyms bei hohen Salzkonzentrationen hergestellt. Nach der Reinigung wurde das Holoenzym mittels der von Kirkegaard et al., Anal. Biochem. (1972) 50: 122, beschriebenen Ionenfiltrationstechnik konzentriert.
Immobilisierung der Polymerase
Die Immobilisierung der Polymerase auf der Sensorchip-Oberfläche wurde gemäß Jönsson et al., Biotechniques (1991) 11: 620–627, durchgeführt. In Kürze, die Umgebung des Sensorchips wurde mit Hepes-Puffer (10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,05% Tensid P20 (BIAcore AB, Uppsala, Schweden), pH 7,4) äquilibriert. Gleiche Volumina an N-Hydroxysuccinimid (0,1 M in Wasser) und N-Ethyl-n'-(dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) (0,1 M in Wasser) wurden zusammengemischt und über die Chip-Oberfläche (CM5) gespritzt, um das carboxymethylierte Dextran zu aktivieren. Der Polymerase III-Subanordnungskern (160 μl, 500 E) wurde mit 10 mM Natriumacetat (100 μl, pH 5) gemischt und über die aktivierte Oberfläche gespritzt. Schließlich wurden restliche N-Hydroxysuccinimidester auf der Sensorchip-Oberfläche mit Ethanolamin (35 μl, 1 M in Wasser, pH 8,5) umgesetzt und nicht gebundene Polymerase wurde von der Oberfläche gewaschen. Die Immobilisierungsprozedur wurde mit einem kontinuierlichen Strom von Hepes-Puffer (5 μl/min) bei einer Temperatur von 25°C durchgeführt.
Oligonukleotide
Es wurden zwei Oligonukleotide unter Anwendung von Standard-Phosphoramidit-Chemie synthetisiert. Das als SEQ-ID-Nr. 1 identifizierte Oligonukleotid wurde als das Ziel-Polynukleotid eingesetzt und das als SEQ-ID-Nr. 2 identifizierte Oligonukleotid wurde als Primer eingesetzt.
Die beiden Oligonukleotide wurden unter Hybridisierungsbedingungen umgesetzt, um den Ziel-Primer-Komplex zu bilden.
Die geprimte DNA wurde dann in Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl₂, 4% (Vol./Vol.) Glycerin, 5 mM Dithiothreit (DTT), 40 μg Rinderserumalbumin), enthaltend 21 μg ssDNA-bindendes Protein und die DNA-Polymerase III-Subanordnung, welche erforderlich ist, um die Armband-ähnliche Struktur zu bilden (1,6 pMol β-Dimer und 195 fMol γ-Untereinheiten), suspendiert. 0,5 mM ATP lag zusammen mit 60 μM Carbonyldiphosphonat (COMDP) vor. Bei dieser Reaktion wirkt die γ-Untereinheit als molekularer Vermittler, welcher ATP hydrolysiert, um die β-Dimer-Untereinheiten auf die DNA zu platzieren, um die Polymerase-Subanordnung zu bilden (Studwell et al., UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. New Ser. 1990; 127: 153).
Der geprimte DNA/Subanordnungs-Komplex wurde dann über die Polymerase III auf der Sensorchip-Oberfläche mit einer Durchflussrate von 5 μm/min gespritzt und durch die Wirkung der γ-Untereinheiten an die Polymerase binden gelassen.
In diesem Experiment sind Magnesium und ATP für die Polymerase III erforderlich, um an die geprimte DNA zu binden. Magnesium fördert jedoch auch die Entfernung des Primers durch die korrigierende 3' → 5'-Exonuklease-Aktivität. Dieses Problem wird durch Einschluß des Carbonyldiphosphonats umgangen, welches ein kompetitiver Inhibitor der Polymerase-Aktivität ist (eine Polymerase III, welcher die 3' → 5'-Exonuklease-Aktivität fehlt, könnte eingesetzt werden, um dieses spezielle Problem zu vermeiden).
Ein kontinuierlicher Strom von 60 μM Carbonyldiphosphonat wurde über der Chip-Oberfläche aufrechterhalten, um die Exonuklease-Aktivität von der Entfernung des Primers von der Ziel-DNA abzuhalten.
Nukleotide, die zwei Blockierungsgruppen inkorporieren
Jedes Nukleotid (dCTP, dTTP, dGTP und dATP) enthielt eine 1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Blockierungsgruppe an der 5'-Position und eine (4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl)oxycarbonyl-Blockierungsgruppe an der 3'-Position wie in 3 gezeigt. Die Synthese der doppelt blockierten Nukleotide war wie folgt:
Stufe 1: Synthese von (4,5-Dimethoxynitrobenzyl)oxycarbonyl-Nukleosidtriphosphat
Dasselbe Gesamtverfahren wurde auf dGTP, dCTP und dTTP angewandt. Eine Mischung von dATP-Dihydrat (0,4 mMol) und etwa 3 mMol 4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyldiazomethan, frisch hergestellt aus 900 mg (4 mMol) 4,5-Dimethoxy-2-nitrophenylhydrazon (synthetisiert durch Behandlung von 6-Nitroveraldehyd mit Hydrazin-Monohydrat in Chloroform nach dem Verfahren von Wootton und Trentham, Photochemical Probes in Biochemistry (Nielsen, P. E., Hrsg.) NATO ASI Ser. C., Bd. 272, S. 277–296 (1989), wurde in 15 ml DMSO bei Raumtemperatur 40 h lang im Dunkeln gerührt. Die Überwachung der Reaktion durch DC in einem Lösungsmittelsystem von Chloroform/Methanol (5:1 Vol./Vol.) zeigte das Auftreten eines Flecks mit einem Rf-Wert von 0,54, was dem eingeschlossenen Nukleotid entspricht. DMSO, nicht umgesetzte Diazo-Verbindung und Reaktionsprodukte mit niedriger Polarität wurden durch wiederholte Extraktion mit 60 ml Ether entfernt. Das restliche Material, welches neben anderen Substanzen nicht umgesetztes Nukleotid und das gewünschte Produkt enthielt, wurde in einer minimalen Menge an Chloroform gelöst und durch Flash-Chromatographie auf einer Silica-Säule (3 × 30 cm) aufgetrennt. Die Elution unter Verwendung von 100%igem Chloroform und Methanol/Chloroform (95:5 Vol./Vol.) entfernte die hydrophoben Nebenprodukte von 4,5-Dimethoxy-2-nitrophenyldiazomethan von der Säule. Die Fraktionen wurden auf einem Rotationsverdampfer getrocknet. 78 mg des eingeschlossenen Produkts wurden dann lyophilisiert. Die Gesamtausbeute betrug 45%. Das 3'-blockierte 4,5-Dimethyloxy-2-nitrobenzyloxycarbonyl-dATP wurde mit einer höheren Reinheit durch präparative Umkehrphasen-HPLC direkt aus dem Rohprodukt isoliert.
Stufe 2: Addition der 5'-1-(2-Nitrophenyl)ethylgruppe an das 3'-4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyloxycarbonyl-blockierte dATP
Eine Mischung von 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyloxycarbonyl-5'-dATP (0,4 mMol) und etwa 3 mMol 1-(2-Nitrophenyl)diazoethan, frisch hergestellt aus 716,7 mg (4 mMol) Hydrazon von 2-Nitroacetophenon (synthetisiert durch Behandlung von 2-Nitroacetophenon mit Hydrazin-Monohydrat in Ethanol) und 2,9 g (30 mMol) MnO₂ (90%) in 20 ml Chloroform nach dem Verfahren von Walker et al. (Walker et al., Methods Enzymol. 1989; 172: 288–301), wurde in 15 ml DMSO bei Raumtemperatur im Dunkeln 40 h lang gerührt. Die Überwachung der Reaktion durch DC in einem Lösungsmittelsystem von Chloroform/Methanol (5:1 Vol./Vol.) offenbarte das Auftreten eines Paars von Flecken mit Rf-Werten von 0,68 und 0,58, entsprechend den beiden Diastereoisomeren der axialen Form bzw. den beiden Diastereoisomeren der äquatorialen Form des 1-(2-Nitrophenyl)ethylesters von 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyloxycarbonyl-5'-dATP. DMSO, nicht umgesetzte Diazo-Verbindung und Reaktionsprodukte mit niedriger Polarität wurden durch wiederholte Extraktion mit 50 ml Ether entfernt.
Das restliche Material, welches neben anderen Substanzen nicht umgesetztes 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyloxycarbonyl-5'-dATP und das gewünschte doppelt blockierte dATP enthielt, wurde in einer minimalen Menge an Chloroform gelöst und durch Flash-Chromatographie auf einer Silicasäule, 3 × 30 cm, aufgetrennt. Die Elution unter Verwendung von 100%igem Chloroform entfernte hydrophobe Nebenprodukte von 1-(2-Nitrophenyl)diazoethan von der Säule. Das Produkt wurde auf einem Rotationsverdampfer getrocknet. Lyophilisierung ergab 74 mg der eingeschlossenen Verbindung. Die Gesamtausbeute betrug 57%.
0,2 mM eines jeden Nukleotids lagen in dem Polymerisationspuffer (1 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM KCl, 0,15 mM MgCl₂, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine) vor.
DNA-Sequenzierung
1 zeigt ein SPR-Sensorsystem und eine Durchflusszelle (7) mit einer Vorrichtung zur Zuführung von elektromagnetischer Strahlung (1) zu einem Sensorchip (2) mit einem immobilisiertem Polymerase-Enzym (3) auf der Sensoroberfläche, einem Einlaß (4) zur Einführung der verschiedenen Nukleotide in die Zelle und zwei Fokussierungsanordnungen (5) und (6) für die gepulste Abgabe von monochromatischem Licht in die Zelle.
Die verschiedenen Nukleotide werden bei einer Durchflussrate von 30 μl/min., einer Temperatur von 25°C und einer Datensammelrate von 10 Hz in die Durchflusszelle (7) eingeführt. Wenn die Nukleotide die Fokussierungsanordnung (5) passieren, wird monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge von 260 nm gepulst, um die Blockierungsgruppe an der 5'-Position zu entfernen. Die Nukleotide fließen dann über den Sensorchip (2) und kontaktieren den Ziel-Polynukleotid/Polymerase-Komplex (3), welcher durch die β-Dimer-Subanordnung am Putz gehalten wird. Nachdem die 3'-Position auf der Primersequenz zur Reaktion frei ist, kann die Polymerisation stattfinden, wenn ein Nukleotid auf seinem Gegenstück auf dem Ziel-Polynukleotid inkorporiert wird. Diese Inkorporation wird dann durch das monochromatische p-polarisierte Licht der SPR-Vorrichtung nachgewiesen. Es findet keine weitere Polymerisation statt, da das inkorporierte Nukleotid eine Blockierungsgruppe an der 3'-Position aufweist. Monochromatisches Licht der Wellenlänge 360 nm wird dann an der Stelle der Polymerisation durch die Fokussierungsanordnung (6) als Puls zugeführt. Die hohe Durchflussrate in der Durchflusszelle stellt sicher, dass nicht an die Polymerase gebundene Nukleotide aus der Zelle entfernt werden, bevor ausreichend Energie absorbiert wurde, um deren 3'-Blockierungsgruppen freizusetzen.
Sobald die 3'-Blockierungsgruppe von dem polymerisierten Nukleotid freigesetzt wurde, kann die weitere Polymerisation stattfinden.
2 zeigt die Ergebnisse aus dem Sequenzierungsexperiment, wobei jedes Nukleotid, welches in die nachzuweisende entstehende Kette inkorporiert wurde, nachgewiesen wurde. Die Ergebnisse zeigen eine Sequenz, die komplementär zu derjenigen von SEQ-ID-Nr. 1 ist.

Claims

Verfahren zur Sequenzierung eines Polynukleotids, umfassend die Schritte: (i) Umsetzen eines Ziel-Polynukleotids mit einem Polymerase-Enzym, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, und den verschiedenen Nukleotiden unter ausreichenden Bedingungen für die Polymerase-Reaktion, und (ii) Nachweisen der Inkorporation eines spezifischen Nukleotids, das zu dem Ziel-Polynukleotid komplementär ist, wobei der Nachweis erfolgt durch Messung einer Veränderung in, oder der Absorption von, angewandter Strahlung während der Wechselwirkung zwischen dem Nukleotid und dem Enzym, wobei die Schritte (i) und (ii) mit jedem der verschiedenen Nukleotide der Reihe nach durchgeführt werden, bis die Inkorporation nachgewiesen wird, und dann wiederholt werden, oder wobei Schritt (i) mit allen vorhandenen Nukleotiden durchgeführt wird, wobei die Nukleotide eine 3'-Blockierungsgruppe umfassen, die nach der Polymerase-Reaktion entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Blockierungsgruppe selektiv durch gepulstes monochromatisches Licht entfernt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Nukleotide eine weitere Blockierungsgruppe an der terminalen Phosphatgruppe der Trisphosphatkette umfassen und die weitere Blockierungsgruppe vor der Entfernung der 3'-Blockierungsgruppe entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die weitere Blockierungsgruppe durch gepulstes monochromatisches Licht unter anderen Bedingungen als zur Entfernung der 3'-Blockierungsgruppe erforderlich selektiv entfernt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die weitere Blockierungsgruppe durch einen Puls des monochromatischen Lichts für eine andere Zeitdauer als der zur Entfernung der 3'-Blockierungsgruppe erforderlichen Dauer entfernt wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin Schritt (i) ferner die Einführung eines kompetitiven Inhibitors des Polymerase-Enzyms umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Ziel-Polynukleotid von Schritt (i) durch einen β₂-Dimer-Komplex an das Polymerase-Enzym gebunden ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Polymerase E. coli-DNA-Polymerase III oder T7-Polymerase ist.
Verfahren nach Irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Polymerase Taq-Polymerase ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Polymerase reverse Transkriptase ist.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin Schritt (ii) den Nachweis einer Veränderung im Resonanzsignal über die Zeit umfasst.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Strahlung elektromagnetisch ist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die elektromagnetische Strahlung im Infrarotspektrum hegt.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin Schritt (ii) die Anwendung von Oberflächen-Plasmon-Resonanz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die elektromagnetische Strahlung im Radiofrequenzspektrum liegt.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Inkorporation eines Nukleotids durch Anwendung von NMR nachgewiesen wird.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Polynukleotid DNA ist.