DE69738206T2 - DNA-Diagnostik mittels Massenspektrometrie - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Nachweis von Mutationen
  • Die genetische Information aller lebenden Organismen (z. B. Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen) ist in der Desoxyribonukleinsäure (DNA) codiert. Bei Menschen besteht das gesamte Genom aus etwa 100.000 Genen, die sich auf 24 Chromosomen befinden (The Human Genome, T. Strachan, BIOS Scientific Publishers, 1992). Jedes Gen codiert für ein spezifisches Protein, das nach seiner Expression über Transkription und Translation eine spezifische biochemische Funktion in einer lebenden Zelle erfüllt. Änderungen in einer DNA-Sequenz sind als Mutationen bekannt und können zu Proteinen mit veränderten oder in einigen Fallen sogar verloren gegangenen biochemischen Aktivitäten führen; dies kann wiederum eine genetische Erkrankung verursachen. Mutationen beinhalten Nukleotiddeletionen, -insertionen oder -veränderungen (d. h. Punktmutationen). Punktmutationen können entweder Missense-Mutationen sein, die zu einer Änderung in der Aminosäuresequenz eines Proteins führen oder Nonsense-Mutationen, die für ein Stopp-Codon codieren und somit zu einem verkürzten Protein führen.
  • Mehr als 3000 genetische Erkrankungen sind zur Zeit bekannt (Human Genome Mutations, D. N. Cooper und M. Krawczak, BIOS Publishers, 1993), einschließlich Hämophilien, Thalassämien, Duchenne-Muskeldystrophie (DMD), Huntington-Erkrankung (HD), Alzheimer-Erkrankung und Zystische Fibrose (CF). Neben mutierten Genen, die zu genetischen Erkrankungen führen, sind bestimmte Geburtsdefekte das Ergebnis von Chromosomen-Anomalien, wie Trisomie 21 (Down-Syndrom), Trisomie 13 (Patau-Syndrom), Trisomie 18 (Edward-Syndrom), X-Monosomie (Turner-Syndrom) und andere Geschlechtschromosonen-Aneuploidien, wie etwa Klinefelter-Syndrom (XXY). Ferner gibt es zunehmende Hinweise darauf, dass bestimmte DNA-Sequenzen ein Individuum möglicherweise für irgendeine Erkrankung aus einer Reihe von Erkrankungen prädisponieren, wie etwa für Diabetes, Arteriosklerose, Fettleibigkeit, verschiedene Autoimmunerkrankungen und Krebs (z. B. Colorektal-, Brust-, Gebärmutter-, Lungen-Krebs).
  • Viren, Bakterien, Pilze und andere infektiöse Organismen enthalten eigene Nukleinsäuresequenzen, die sich von den in der Wirtszelle enthaltenen Sequenzen unterscheiden. Daher können infektiöse Organismen auch auf Grundlage ihrer spezifischen DNA-Sequenzen nachgewiesen und identifiziert werden.
  • Da die Sequenz von etwa 16 Nukleotiden aus statistischen Gründen selbst für die Größe des menschlichen Genoms spezifisch ist, können relativ kurze Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um normale und defekte Gene in höheren Organismen nachzuweisen und um infektiöse Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Pilze, Protisten und Hefe) und Viren nachzuweisen. DNA-Sequenzen können sogar als Fingerabdruck zum Nachweis verschiedener Individuen innerhalb der gleichen Spezies dienen (siehe Thompson, J. S., und M. W. Thompson, Hrsg., Genetics in Medicine, W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1991)).
  • Mehrere Verfahren zum Nachweis von DNA werden derzeit angewendet. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen durch einen Vergleich der Beweglichkeit eines amplifizierten Nukleinsäurefragments mit einem bekannten Standard durch Gelelektrophorese oder durch Hybridisierung mit einer Sonde, die zu der Sequenz, die identifiziert werden soll, komplementär ist, identifiziert werden. Die Identifizierung kann jedoch nur erfolgen, wenn das Nukleinsäurefragment mit einer sensitiven Reporterfunktion markiert ist (z. B. radioaktiv (32P, 35S), fluoreszent oder chemilumineszent). Radioaktive Markierungen können gefährlich sein, und die Signale, welche sie erzeugen, klingen mit der Zeit ab. Nicht-isotopische Markierungen (z. B. fluoreszente) leiden an mangelnder Sensitivität und Verblassen des Signals, wenn Hochintensitätslaser verwendet werden. Außerdem sind die Durchführung der Markierung, Elektrophorese und des anschließenden Nachweises arbeitsaufwändige, zeitintensive und fehleranfällige Vorgänge. Die Elektrophorese ist besonders fehleranfällig, da die Größe oder das Molekulargewicht der Nukleinsäure nicht direkt mit der Beweglichkeit in der Gelmatrix korreliert werden können. Es ist bekannt, dass Sequenz-spezifische Effekte, Sekundärstruktur und Wechselwirkungen mit der Gelmatrix Artefakte verursachen.
  • Verwendung von Massenspektrometrie zum Nachweis und zur Identifizierung von Nukleinsäuren
  • Die Massenspektrometrie stellt ein Mittel zum "Wiegen" einzelner Moleküle bereit, indem die Moleküle im Vakuum ionisiert werden und durch Verdampfen "fliegen" gelassen werden. Unter dem Einfluss von Kombinationen elektrischer und magnetischer Felder folgen die Ionen in Abhängigkeit ihrer individuellen Masse (m) und Ladung (z) Flugbahnen. Im Bereich von Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht ist die Massenspektrometrie seit langem Teil des physikalischorganischen Standardrepertoires zur Analyse und Charakterisierung organischer Moleküle durch Bestimmung der Masse des Ausgangsmolekülions. Zusätzlich wird das Molekülion fragmentiert, indem Zusammenstöße dieses Ausgangsmolekülions mit anderen Teilchen (z. B. Argon-Atomen) verursacht werden, sodass durch die so genannte Stoß-induzierte Dissoziation (collision induced dissociation (CID) Sekundärionen gebildet werden. Das Fragmentierungsmuster/der Fragmentierungsweg erlaubt sehr häufig die Gewinnung ausführlicher Strukturinformationen. Im Fachbereich sind zahlreiche Anwendungen massenspektrometrischer Verfahren bekannt, insbesondere in den Biowissenschaften (siehe z. B. Methods in Enzymol. Bd. 193: "Mass Spectrometry" (J. A. McCloskey, Herausgb.), 1990, Academic Press, New York).
  • Aufgrund der offensichtlichen analytischen Vorteile der Massenspektrometrie bei der Bereitstellung hoher Nachweisempfindlichkeit, Genauigkeit der Massenmessungen, detaillierter Strukturinformation durch CID in Verbindung mit einer MS/MS-Konfiguration und Schnelligkeit sowie online-Datenübertragung an einen Computer bestand Interesse an der Verwendung von Massenspektrometrie zur Strukturanalyse von Nukleinsäuren. Aktuelle Übersichten, in denen dieses Gebiet zusammengefasst wird, sind u. a. K. H. Schram "Mass Spectrometry of Nucleic Acid Components, Biomedical Applications of Mass Spectrometry" 34, 203–287(1990); und P. F. Cram "Mass Spectrometric Techniques in Nucleic Acid Research", Mass Spectrometry Reviews 9, 505–554 (1990); siehe auch US-Patent Nr. 5,547,835 und US-Patent Nr. 5,622,824 ).
  • Nukleinsäuren sind jedoch hoch polare Biopolymere, die sich sehr schwer verdampfen lassen. Folglich war der massenspektrometrische Nachweis auf niedermolekulargewichtige synthetische Oligonukleotide beschränkt, um eine bereits bekannte Oligonukleotidsequenz durch Bestimmung der Masse des Ausgangsmolekülions zu bestimmen oder alternativ um eine bekannte Sequenz durch Herstellung von Sekundärionen (Fragment-Ionen) über CID in einer MS/MS-Konfiguration zu bestätigen, wobei insbesondere zur Ionisierung und Verdampfung das Verfahren des schnellen Atombeschusses (FAB-Massenspektrometrie) oder der Plasmadesorption (PD-Massenspektrometrie) eingesetzt wurde. Beispielsweise wurde die Anwendung von FAB auf die Analyse geschützter dimerer Blöcke für die chemische Synthese von Oligodesoxynukleotiden beschrieben (Köster et al. (1987) Biomed. Environ. Mass Spectrometry 14, 111–116).
  • Andere Ion isations-/Desorptionstechniken sind u. a. Elektronenspray-/Ionenspray(ES)- und Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisationsverfahren (MAIDI). ES-Massenspektrometrie wurde von Fenn et al. eingeführt (J. Phys. Chem. 88:4451–59 (1984); PCT-Anmeldung Nr. WO 90/14148 ) und heutige Anwendungen sind in Übersichtsartikeln zusammengefasst (siehe z. B. Smith et al. (1990), Anal. Chem. 62:882–89; und Ardrey (1992) Electrospray Mass Spectrometry, Spectroscopy Europe 4:10–18). Die Molekulargewichte eines Tetradekanukleotids (siehe Covey et al. (1988) "The Determination of Protein, Oligonukleotide and Peptide Molecular Weights by Ionspray Mass Spectrometry", Rapid Commun. in Mass Spectrometry 2:249–256) und eines 21-mers (Methods in Enzymol., 193, "Mass Spectrometry" (McCloskey, Herausgb.), S. 425, 1990, Academic Press, New York) sind veröffentlicht worden. Als Massenanalysegerät meist ein Quadrupol eingesetzt. Aufgrund des Vorliegens von Mehrfach-Ionenpeaks, die alle zur Massenberechnung verwendet werden könnten, ist die Bestimmung von Molekulargewichten bei femtomolaren Mengen einer Probe sehr exakt.
  • Die MALDI-Massenspektrometrie kann dagegen attraktiv sein, wenn eine Flugzeit(time-of-flight-, TOF-) Konfiguration als Massenanalysegerät verwendet wird (siehe Hillenkamp et al. (1990), S. 49–60 in "Matrix Assisted UV-Laser Desorption/Ionization: A New Approach to Mass Spectrometry of Large Biomolecules", Biological Mass Spectrometry, Burlingame und McCloskey, Herausgb., Elsevier Science Publishers, Amsterdam). Da in den meisten Fällen mit dieser Technik keine Mehrfach-Molekülionenpeaks erzeugt werden, sehen die Massenspektren im Vergleich zu der ES-Massenspektrometrie prinzipiell einfacher aus.
  • Obwohl DNA-Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 410.000 Dalton desorbiert und verdampft wurden (Williams et al. "Volatilization of High Molecular Weight DNA by Pulsed Laser Ablation of Frozen Aqueous Solutions", Science 246, 1585–87 (1989)), zeigte diese Technik nur eine sehr geringe Auflösung (Oligothymidylsäuren bis zu 18 Nukleotiden Länge, Huth-Fehre et al., Rapid Commun. in Mass Spectrom. 6, 209–13 (1992); DNA-Fragmente bis zu einer Länge von 500 Nukleotiden, K. Tang et al. (1994), Rapid Commun. in Mass Spectrom. 8, 727–730 ; und eine doppelsträngige DNA aus 28 Basenpaaren (Williams et al (1990). "Time-of-Flight Mass Spectrometry of Nucleic Acids by Laser Ablation and Ionization from a Frozen Aqueous Matrix", Rapid Commun. in Mass Spectrom. 4, 348–351). Das Japanische Patent Nr. 59-131909 beschreibt ein Instrument, mit dem Nukleinsäurefragmente nachgewiesen werden, die entweder durch Elektrophorese, Flüssigchromatographie oder Hochgeschwindigkeits-Gelfiltration aufgetrennt wurden. Der massenspektrometrische Nachweis wird durch den Einbau von Atomen, die normalerweise in DNA nicht vorkommen, wie etwa S, Br, I oder Ag, Au Pt, Os, Hg, in die Nukleinsäuren erzielt.
  • Das US-Patent Nr. 5,622,824 derselben Inhaberin beschreibt Verfahren zur DNA-Sequenzierung auf Grundlage von massenspektrometrischem Nachweis. Um dies zu erreichen, wird die DNA mittels Schützen, Spezifität der Enzymaktivität oder Immobilisierung schrittweise in einer Richtung durch Exonuklease-Verdau abgebaut, und die Nukleotide oder Derivate werden durch Massenspektrometrie nachgewiesen. Vor dem enzymatischen Abbau können Sätze von geordneten Deletionen, die ein kloniertes DNA-Fragment überspannen, erzeugt werden. Auf diese Weise können massenmodifizierte Nukleotide unter Verwendung einer Kombination aus Exonuklease und DNA-/RNA-Polymerase eingebaut werden. Dies erlaubt entweder den massenspektrometrischen Multiplex-Nachweis oder die Modulation der Exonukleaseaktivität, um so den Abbauprozess zu synchronisieren.
  • Die US-Patente Nr. 5,605,798 und 5,547,835 derselben Inhaberin stellen Verfahren zum Nachweis einer bestimmten Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe bereit. Abhängig von der nachzuweisenden Sequenz können die Verfahren beispielsweise in Diagnoseverfahren eingesetzt werden. Diese Verfahren, die weithin nützlich und auf zahlreiche Ausführungsformen anwendbar sind, stellen die erste Offenbarung solcher Anwendungen dar und können verbessert werden.
  • WO 96/29431 offenbart schnelle und sehr genaue Massenspektrometrie-basierte Verfahren zum Nachweis einer bestimmten Nukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe. Abhängig von der nachzuweisenden Sequenz können die Verfahren des Patents beispielsweise eingesetzt werden, um eine genetische Erkrankung oder chromosomale Anomalie; eine Prädisposition für eine Erkrankung oder einen Zustand, eine Infektion durch einen pathogenen Organismus zu diagnostizieren, oder um die Identität oder Vererbung zu bestimmen.
  • WO 94/16101 offenbart ein Verfahren zur Sequenzierung von DNA unter Verwendung der Sanger-Sequenzierung und die Assemblierung der Sequenzinformation durch Analyse der verschachtelten Fragmente, die durch Basen-spezifische Kettenbeendigung erhalten werden, über ihre unterschiedlichen Molekülmassen unter Verwendung von Massenspektrometrie.
  • WO 96/32504 offenbart ein Verfahren zum Nachweis und zur Sequenzierung von Ziel-Nukleinsäuresequenzen. Das Verfahren beinhaltet die Hybridisierung von Nukleinsäuren, die komplementär eine homologe Sequenz zu einem Ziel einer Anordnung von Nukleinsäuresonden darstellen. Die Molekulargewichte der hybridisierten Nukleinsäuren können durch Massenspektrometrie ermittelt werden und die Sequenz kann aus dem Molekulargewicht bestimmt werden.
  • WO 97/42348 offenbart Verfahren und Kits zur gleichzeitigen Amplifizierung und Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen und die Durchführung von Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung.
  • Daher ist das Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung verbesserter Verfahren zur Sequenzierung und zum Nachweis von DNA-Molekülen in biologischen Proben. Es ist außerdem ein Ziel, verbesserte Verfahren zur Diagnose von genetischen Erkrankungen, Prädispositionen für bestimmte Erkrankungen, Krebsarten und Infektionen bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäure an einem festen Träger entweder direkt oder über einen Linker und/oder eine Perle immobilisiert.
  • In bestimmten Ausführungsformen wird die DNA an dem Träger über einen selektiv spaltbaren Linker immobilisiert. Selektiv spaltbare Linker beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf photospaltbare Linker, chemisch spaltbare Linker und enzymatisch spaltbare Linker (wie etwa eine Restriktionsstelle (Nukleinsäurelinker), eine Proteasestelle). Durch den Einbau eines selektiv spaltbaren Linkers werden die Möglichkeiten der MALDI-TOF MS-Analyse erweitert, da er für alle Ausgestaltungen der Immobilisierung von DNA für die MALDI-TOF-MS die DNA-Verknüpfung an den Träger über das 3'- oder 5'-Ende einer Nukleinsäure ermöglicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der selektiv spaltbare Linker ein chemisch spaltbarer oder photospaltbarer Linker, der während des Ionisierungsschrittes der Massenspektrometrie gespalten wird. Beispiele für Linker sind u. a. Linker, die eine Disulfidgruppe, eine Leuvinylgruppe, eine säurelabile Tritylgruppe und eine hydrophobe Tritylgruppe enthalten. In anderen Ausführungsformen kann der enzymatisch spaltbare Linker eine Nukleinsäure sein, die ein RNA-Nukleotid ist oder eine Restriktionsendonukeasestelle codiert. Andere enzymatisch spaltbare Linker sind u. a. Linker, die eine Pyrophosphat-Gruppe, eine Arginin-Arginin-Gruppe und eine Lysin-Lysin-Gruppe enthalten. Andere Linker sind hier beispielhaft erwähnt.
  • Verfahren zum Ordnen von DNA-Fragmenten werden bereitgestellt Um dieses Ordnen durchzuführen, werden mit bestimmten Basen terminierte Fragmente von einer Ziel-Nukleinsäure erzeugt. Die Analyse von Fragmenten anstelle der Vollängen-Nukleinsäure verschiebt die zu bestimmende Masse der Ionen in einen Bereich niedrigerer Masse, der im Allgemeinen für den massenspektrometrischen Nachweis besser zugänglich ist. Beispielsweise wird durch die Verschiebung zu niedrigeren Massen die Massenauflösung, die Massengenauigkeit und insbesondere die Empfindlichkeit für den Nachweis verbessert. Hybridisierungsereignisse und die tatsächlichen Molekulargewichte der Fragmente, gemäß Bestimmung durch Massenspektrometrie, liefern Sequenzinformationen (z. B. das Vorliegen und/oder die Identität einer Mutation). In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fragmente vor der Hybridisierung und/oder dem massenspektrometrischen Nachweis an einem festen Träger festgehalten. Die erzeugten Fragmente werden geordnet, um die Sequenz der größeren Nukleinsäure bereitzustellen.
  • Das Verfahren zur Herstellung basenspezifisch terminierter Fragmente einer Nukleinsäure wird durchgeführt, indem eine geeignete Menge einer Ziel-Nukleinsäure mit einer geeigneten Menge einer spezifischen Endonuklease zusammengebracht wird, was zu einem partiellen Verdau der Ziel-Nukleinsäure führt. Endonukleasen bauen typischerweise eine Sequenz zu Stücken mit nicht mehr als etwa 50–70 Nukleotiden ab, selbst dann, wenn die Umsetzung nicht bis zur Vollständigkeit durchgeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure eine Ribonukleinsäure, und die Endonuklease ist eine Ribonuklease (RNase), die ausgewählt ist aus: der G-spezifischen RNase T1, der A-spezifischen RNase U2, der A/U-spezifischen RNase PhyM, der U/C-spezifischen RNase A, der C-spezifischen Hühnerleber-RNase (RNase CL3) oder Crisavitin. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Endonuklease ein Restriktionsenzym, das mindestens eine Stelle spaltet, die in der Ziel-Nukleinsäure enthalten ist. Durch den Einbau einer Markierung an dem 5'- und/oder 3'-Ende einer Zielnukleinsäure kann das Ordnen von Fragmenten erleichtert werden.
  • Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer unbekannten Nukleinsäure, wobei das 5'- und/oder 3'-Ende der Ziel-Nukleinsäure eine Markierung enthalten kann, werden offenbart. Der Einbau einer nicht-natürlichen Markierung am 3'-Ende eignet sich auch zum Ausschluss oder zur Kompensierung des Einflusses von 3'-Heterogenität, vorzeitiger Terminierung und unspezifischer Verlängerung. Die Markierung kann eine Affinitätsmarkierung sein (z. B. Biotin oder eine Nukleinsäure, die an eine Einfangnukleinsäure hybridisiert). Die Affinitätsmarkierung erleichtert die Anbindung der Nukleinsäure an einen festen Träger. Alternativ ist die Markierung ein Massenmarker (d. h. ein Marker mit einer Masse, die nicht der Masse eines der vier Nukleotide entspricht). Die Markierung kann auch eine natürliche Markierung sein, wie etwa ein Poly-A-Schwanz oder die natürliche 3'-Heterogenität, die beispielsweise aus einer Transkriptionsreaktion herrühren kann.
  • Verfahren zur Sequenzanalyse werden offenbart, wobei Nukleinsäuren, die aus einem Nukleinsäuremolekül repliziert wurden, das aus einer biologischen Probe erhalten wurde, unter Verwendung einer oder mehrerer Nukleasen (Desoxyribonukleasen für DNA und Ribonukleasen für RNA) spezifisch verdaut werden. Die Fragmente werden auf einem festen Träger eingefangen, der die entsprechenden komplementären Sequenzen trägt. Die Hybridisierungsereignisse und die tatsächlichen Molekulargewichte der eingefangenen Zielsequenzen liefern Informationen über Mutationen im Gen. Die Anordnung kann Punkt für Punkt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden. Ferner können die hergestellten Fragmente geordnet werden, um die Sequenz des größeren Zielfragments bereitzustellen.
  • In bevorzugten Ausführungsformen beinhaltet die Matrix 3-Hydroxypicolinsäure.
  • Andere Merkmale und Vorteile der hier bereitgestellten Verfahren werden anhand der nachstehenden Figuren, der ausführlichen Beschreibung und der Ansprüche weiter erläutert.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1A ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Durchführung der massenspektrometrischen Analyse an einer Ziel-Nachweisstelle (TDS) zeigt, die in einem Ziel-Nukleinsäuremolekül (T) enthalten ist, das aus einer biologischen Probe erhalten wurde. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Spacer (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Die Einfangsequenz ist so gewählt, dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz im Ziel-Nukleinsäuremolekül (T) hybridisiert, die als die Zieleinfangstelle (TCS) bekannt ist. Der Spacer (S) erleichtert die ungehinderte Hybridisierung. Eine Nachweis-Nukleinsäuresequenz (D), die zu der TDS komplementär ist, wird dann mit der TDS in Kontakt gebracht. Die Hybridisierung zwischen D und TDS kann mittels Massenspektrometrie nachgewiesen werden.
  • 1B ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse an mindestens einer Ziel-Nachweisstelle (hier TDS 1 und TDS 2) über direkte Verknüpfung an einen festen Träger zeigt. Die Zielsequenz (T), welche die Zielnachweisstelle (TDS 1 und TDS 2) enthält, ist an einem festen Träger über die Bildung einer reversiblen oder irreversiblen Bindung immobilisiert, die zwischen einer geeigneten Funktionalität (L') im Ziel-Nukleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten Funktionalität (L) am festen Träger gebildet wird. Nachweis-Nukleinsäuresequenzen (hier D1 und D2), die komplementär zu einer Ziel-Nachweisstelle (TDS 1 oder TDS 2) sind, werden dann mit der TDS in Kontakt gebracht. Die Hybridisierung zwischen TDS 1 und D1 und/oder TDS 2 und D2 kann nachgewiesen und aufgrund von Molekulargewichtsunterschieden unterschieden werden.
  • 1C ist ein Diagramm, das ein Verfahren zum Nachweis einer Wildtyp- (DWT) und/oder einer Mutanten-(Dmut) Sequenz in einem Ziel-(T-)Nukleinsäuremolekül zeigt. Wie in 1A ist eine spezifische Einfangsequenz (C) über einen Spacer (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Außerdem wird die Einfangsequenz so gewählt, dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz in der Zielsequenz (T), der Zieleinfangstelle (TCS) die durch Hybridisierung nachgewiesen werden soll, wechselwirkt. Wenn die Ziel-Nachweisstelle (TDS) eine Mutation, X, enthält, so können die Nachweisstellen durch Massenspektrometrie vom Wildtyp unterschieden werden. Vorzugsweise ist das Nachweis-Nukleinsäuremolekül (D) so konzipiert, dass sich die Mutation in der Mitte des Moleküls befindet und daher nicht zu einem stabilen Hybrid führen würde, wenn das Wildtyp-Nachweisoligonukleotid (DWT) mit der Zielnachweissequenz, z. B. als Kontrolle, in Kontakt gebracht wird. Die Mutation kann auch nachgewiesen werden, wenn das mutierte Nachweis-Oligonukleotid (Dmut) mit der passenden Base an der mutierten Position zur Hybridisierung verwendet wird. Wenn ein aus einer biologischen Probe erhaltenes Nukleinsäuremolekül für die bestimmte Sequenz heterozygot ist (d. h. DWT und Dmut enthält), so werden DWT und Dmut an den app und Dmut gebunden, sodass sie gleichzeitig nachgewiesen werden.
  • 2 ist ein Diagramm, das ein Verfahren zeigt, bei dem mehrere Mutationen gleichzeitig in einer Zielsequenz nachgewiesen werden, wobei die Molekulargewichtsunterschiede zwischen den Nachweis-Oligonukleotiden D1, D2 und D3 groß genug sein müssen, damit der gleichzeitige Nachweis (Multiplexierung) möglich ist. Dies kann entweder durch die Sequenz selbst (Zusammensetzung oder Länge) oder durch Einfügen massenmodifizierender Funktionalitäten M1–M3 in das Nachweis-Oligonukleotid erreicht werden.
  • 3 ist ein Diagramm, das ein anderes Multiplex-Nachweisformat zeigt. In dieser Ausführungsform wird die Unterscheidung durch Einsatz verschiedener spezifischer Einfangsequenzen erzielt, die positionsspezifisch auf einer flachen Oberfläche (z. B. einer "Chip-Anordnung") immobilisiert sind. Wenn unterschiedliche Zielsequenzen T1–Tn vorliegen, so Wechselwirken ihre Zieleinfangsequenzen TCS1–TCSn mit komplementären immobilisierten Einfangsequenzen C1–Cn. Der Nachweis wird durch Einsatz geeigneter Nachweis-Oligonukleotide D1–Dn mit unterschiedlicher Masse erzielt, deren Masse entweder durch ihre Sequenzen oder durch massenmodifizierende Funktionalitäten M1–Mn unterscheidbar ist.
  • 4 ist ein Diagramm, das ein Format zeigt, in dem eine vorkonzipierte Zieleinfangsequenz (TCS) unter Verwendung von Nukleinsäure-(d. h. PCR-)-Amplifikation in die Zielsequenz eingeführt worden ist. Nur ein Strang wird eingefangen, der andere wird entfernt (z. B. auf Grundlage der Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin-beschichteten Magnetperlen). Wenn das Biotin an Primer 1 gebunden ist, so kann der andere Strang geeigneterweise durch eine TCS markiert werden. Der Nachweis erfolgt, wie oben beschrieben, durch die Wechselwirkung eines spezifischen Nachweis-Oligonukleotids D mit der entsprechenden Ziel-Nachweisstelle TDS mittels Massenspektrometrie.
  • 5 ist ein Diagramm, das zeigt, wie die Amplifikations-(hier Ligasekettenreaktions-(LCR-))Produkte hergestellt und durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden können. Die Massenunterscheidung kann durch die massenmodifizierenden Funktionalitäten (M1 und M2) erreicht werden, die an die Primer (P1 bzw. P4) gebunden sind. Der Nachweis durch Massenspektrometrie kann direkt (d. h. ohne Einsatz von Immobilisierung und Zieleinfangstellen (TCS)) erreicht werden. Mehrfache LCR-Reaktionen können parallel durchgeführt werden, indem eine geordnete Anordnung von Einfangsequenzen (C) bereitgestellt wird. Dieses Format ermöglicht die Trennung der Ligationsprodukte und die Punkt-für-Punkt-Identifizierung über Massenspektrometrie oder die Multiplexierung, wenn die Massenunterscheidung ausreichend ist.
  • 6A ist ein Diagramm, das die massenspektrometrische Analyse eines Nukleinsäuremoleküls zeigt, das durch einen Transkriptionsamplifikationsvorgang amplifiziert worden ist. Eine RNA-Sequenz wird über ihre TCS-Sequenz eingefangen, so dass die Wildtyp- und Mutanten-Ziel-Nachweisstellen wie oben durch Einsatz geeigneter Nachweis-Oligonukleotide (D) nachgewiesen werden können.
  • 6B ist ein Diagramm, das die Multiplexierung zum Nachweis von zwei verschiedenen (mutierten) Stellen in der gleichen RNA auf gleichzeitige Weise unter Verwendung von massenmodifizierten Nachweis-Oligonukleotiden M1–D1 und M2–D2 zeigt.
  • 6C ist ein Diagramm eines anderen Multiplexierungsverfahrens zum Nachweis spezifischer Mutationen durch Einsatz massenmodifizierter Didesoxynukleosid- oder 3'-Desoxynukleosid-Triphosphate und einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase. Alternativ können eine DNA-abhängige RNA-Polymerase und Ribonukleotidphosphate eingesetzt werden. Dieses Format ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis aller vier Basenmöglichkeiten an der Stelle einer Mutation (X).
  • 7A ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse an einer Ziel-Nachweisstelle (TDS) zeigt, die in einem Ziel-Nukleinsäuremolekül (T) enthalten ist, das aus einer biologischen Probe erhalten wurde. Eine spezifische Einfangsequenz (C) ist über einen Spacer (S) an einen festen Träger (SS) gebunden. Die Einfangsequenz ist so gewählt, dass sie spezifisch mit einer komplementären Sequenz in T hybridisiert, die als die Zieleinfangsequenz (TCS) bekannt ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das zu einem Abschnitt der TDS komplementär ist, wird 5' von der Stelle einer Mutation (X) innerhalb der TDS an die TDS hybridisiert. Die Zugabe eines vollständigen Satzes von Didesoxynukleosid- oder 3'-Desoxynukleosid-Triphosphaten (z. B. pppAdd pppTdd, pppCdd und pppGdd) und einer DNA-abhängigen DNA- oder RNA-Polymerase erlaubt die Zugabe nur des einen Didesoxynukleosid- oder 3'-Desoxynukleosid-Triphosphats, das komplementär zu X ist.
  • 7B ist ein Diagramm, das ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse zur Bestimmung des Vorliegens einer Mutation an einer möglichen Mutationsstelle (M) innerhalb eines Nukleinsäuremoleküls zeigt. Dieses Format ermöglicht die gleichzeitige Analyse der Allele (A) und (B) eines doppelsträngigen Ziel-Nukleinsäuremoleküls, so dass eine Diagnose von homozygot normal, homozygot mutiert oder heterozygot bereitgestellt werden kann. Allel A und Allel B werden jeweils mit komplementären Oligonukleotiden ((C) bzw. (L)) hybridisiert, die an A und B in einem Bereich hybridisieren, der M beinhaltet. Jede Heteroduplex wird dann mit einer Einzelstrang-spezifischen Endonuklease in Kontakt gebracht, so dass eine fehlende Übereinstimmung („Mismatch") bei M, die auf das Vorliegen einer Mutation hinweist, zur Spaltung von (C) und/oder (D) führt, was dann durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden kann.
  • 8 ist ein Diagramm, das zeigt, wie beide Stränge einer Ziel-DNA zum Nachweis unter Verwendung von Transkriptionsvektoren mit zwei verschiedenen Promotoren an entgegengesetzten Stellen (z. B. dem SP6- und dem T7-Promotor) präpariert werden können. Dieses Format eignet sich insbesondere zum Nachweis heterozygoter Ziel-Nachweisstellen (TDS). Durch Einsatz der SP6- oder der T7-RNA-Polymerase könnten beide Stränge separat oder gleichzeitig transkribiert werden. Die transkribierten RNA-Moleküle können spezifisch eingefangen und gleichzeitig unter Verwendung geeigneter Nachweis-Oligonukleotide mit unterscheidbarer Masse nachgewiesen werden. Dies kann entweder direkt in Lösung oder durch parallele Verarbeitung vieler Zielsequenzen an einer geordneten Anordnung spezifisch immobilisierter Einfangsequenzen erreicht werden.
  • 9 ist ein Diagramm, das zeigt, wie RNA, die wie in den 6, 7 und 8 beschrieben hergestellt wurde, spezifisch unter Verwendung einer oder mehrerer Ribonukleasen verdaut werden kann und wie die Fragmente an einem festen Träger, der die entsprechenden komplementären Sequenzen trägt, eingefangen werden können. Hybridisierungsereignisse und die tatsächlichen Molekulargewichte der eingefangenen Zielsequenzen liefern Informationen darüber, ob und wo Mutationen im Gen vorliegen. Die Anordnung kann Punkt für Punkt unter Verwendung von Massenspektrometrie analysiert werden. DNA kann ebenso unter Verwendung eines Nukleasencocktails, der Restriktionsendonukleasen einhält, gespalten werden. Mutationen können durch unterschiedliche Molekulargewichte spezifischer einzelner Fragmente, im Vergleich zu den Molekulargewichten der Wildtypfragmente, nachgewiesen werden.
  • 10A zeigt UV-Spektren, die aus dem im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultieren. Feld i) zeigt die Absorption des 26-mers vor der Hybridisierung. Feld ii) zeigt das Filtrat der Zentrifugation nach Hybridisierung. Feld iii) zeigt die Ergebnisse nach dem ersten Waschen mit 50 mM Ammoniumcitrat. Feld iv) zeigt die Ergebnisse nach dem zweiten Waschen mit 50 mM Ammoniumcitrat.
  • 10B zeigt ein Massenspektrum, das aus dem im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment nach drei Wasch-/Zentrifugationsschritten resultiert.
  • 10C zeigt ein Massenspektrum, das aus dem im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultiert und die erfolgreiche Desorption des hybridisierten 26-mers von den Perlen gemäß dem schematisch in 1B dargestellten Format zeigt.
  • 11 zeigt ein Massenspektrum, das aus dem im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Experiment resultiert und zeigt, dass ein Experiment, wie schematisch in 1B dargestellt, die erfolgreiche Desorption des hybridisierten 40-mers beweist. Die Nachweiseffizienz deutet darauf hin, dass Fragmente, die viel länger als 40-mere sind, ebenfalls desorbiert werden können.
  • 12 zeigt ein Massenspektrum, das aus dem im nachstehenden Beispiel 2 beschriebenen Experiment resultiert und die erfolgreiche Desorption und Unterscheidung eines 18-mers und eines 19-mers durch Elektronenspray-Massenspektrometrie zeigt, das Gemisch (oben), vom 18-mer stammende Peaks hervorgehoben (Mitte) und vom 19-mer stammende Peaks hervorgehoben (unten).
  • 13 ist eine graphische Darstellung des Verfahrens zum Nachweis der Cystische-Fibrose-Mutation ΔF508, wie in Beispiel 3 beschrieben.
  • 14 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts eines für ΔF508 homozygot Normalen gemäß Beispiel 3.
  • 15 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 heterozygoten Mutante gemäß Beispiel 3.
  • 16 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts eines für ΔF508 homozygot Normalen gemäß Beispiel 3.
  • 17 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 homozygoten Mutante gemäß Beispiel 3.
  • 18 ist ein Massenspektrum des DNA-Extensionsprodukts einer für ΔF508 heterozygoten Mutante gemäß Beispiel 3.
  • 19 ist eine graphische Darstellung verschiedener Verfahren zur Durchführung von Apolipoprotein-E-Genotypisierung des Beispiels 4.
  • 20 zeigt die Nukleinsäuresequenz von normalem Apolipoprotein E (codiert durch das E3-Allel, 20B) und von anderen Isotypen, die von den E2- und E4-Allelen codiert werden (20A).
  • 21A zeigt ein zusammengesetztes Restriktionsmuster für verschiedene Genotypen von Apolipoprotein E unter Verwendung der Restriktionsendonuklease Cfol.
  • 21B zeigt das in einem 3,5%-igen MetPhor Agarosegel erhaltene Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein-E-Genotypen.
  • 21C zeigt das in einem 12%-igen Polyacrylamidgel erhaltene Restriktionsmuster für verschiedene Apolipoprotein-E-Genotypen.
  • 22A ist ein Diagramm, das die Molekulargewichte der Fragmente mit 91, 83, 72, 48 und 35 Basenpaaren zeigt, die durch Restriktionsenzym-Spaltung der Allele E2, E3 und E4 von Apolipoprotein E erhalten werden.
  • 22B ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines homozygoten E4-Apolipoprotein-E-Genotyps.
  • 23A ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines homozygoten E3-Apolipoprotein-E-Genotyps.
  • 23B ist das Massenspektrum des Restriktionsprodukts eines E3/E4-Apolipoprotein-E-Genotyps.
  • 24 ist ein Autoradiogramm gemäß Beispiel 5 eines 7,5%-igen Polyacrylamidgels, auf das 10% (5μl) jeder amplifizierten Probe aufgetragen wurden: Probe M: pBR322, Alul-gespalten; Probe 1: HBV-positiv in serologischer Analyse; Probe 2: ebenfalls HBV-positiv; Probe 3: ohne serologische Analyse, aber mit erhöhtem Transaminasen-Spiegel, was auf Lebererkrankung hindeutet; Probe 4: HBV-negativ, HCV enthaltend; Probe 5: HBV-positiv (–) negative Kontrolle; (+) positive Kontrolle. Die Anfärbung erfolgte mit Ethidiumbromid.
  • 25A ist ein Massenspektrum der Probe 1, die HBV-positiv ist. Das Signal bei 20754 Da stellt das HBV-bezogene Amplifikationsprodukt dar (67 Nukleotide, berechnete Masse: 20735 Da). Das Massensignal bei 10390 Da stellt das [M + 2H]2+ Molekülion dar (berechnet: 10378 Da).
  • 25B ist ein Massenspektrum von Probe 3, die gemäß dem Nukleinsäure-Test- (d. h. PCR), dem serologischen Test und dem Test auf Dot-Blot-Basis HBV-negativ ist. Das amplifizierte Produkt wird nur in Spuren erzeugt. Dennoch wird es zweifelsfrei bei 20751 Da nachgewiesen (berechnete Masse: 20735 Da). Das Massensignal bei 10397 Da stellt das [M + 2H]2 +-Molekülion dar (berechnet: 10376 Da).
  • 25C ein Massenspektrum von Probe 4, die HBV-negativ, aber HCV-positiv ist. Es wurden keine HBV-spezifischen Signale beobachtet.
  • 26 zeigt einen Teil des E.-coli-lacI-Gens mit Bindungsstellen der komplementären Oligonukleotide, die in der Ligasekettenreaktion (LCR) von Beispiel 6 verwendet wurden. Hier ist die Wildtypsequenz dargestellt. Die Mutante enthält eine Punktmutation bei bp 191, was auch die Ligationsstelle ist (fett). Die Mutation ist eine C nach T-(bzw. G nach A-)Transition. Dies führt zu einem T-G-Mismatch mit Oligo B (bzw. einem A-C-Mismatch mit Oligo C).
  • 27 ist ein mit Ethidiumbromid angefärbtes 7,15%-iges Polyacrylamidgel von Beispiel 6. M: Kettenlängenstandard (pUC19-DNA, MspI-verdaut). Bahn 1: LCR mit Wildtyp-Matrize. Bahn 2: LCR mit Mutanten-Matrize. Bahn 3: (Kontrolle) LCR ohne Matrize. Das Ligierungsprodukt (50 bp) wurde nur in der positiven Reaktion gebildet, welche die Wildtyp-Matrize enthielt.
  • 28 ist ein HPLC-Chromatogramm von zwei vereinigten positiven LCRs.
  • 29 zeigt ein HPLC-Chromatogramm unter denselben Bedingungen, wobei aber Mutanten-Matrize verwendet wurde. Das kleine Signal des Ligierungsprodukts ist entweder auf die matrizenfreie Ligation der Edukte oder auf eine Ligierung an einem (G-T, A-C)-Mismatch zurückzuführen. Das "falsch positive" Signal ist signifikant kleiner als das in 28 dargestellte Signal des Ligationsprodukts mit Wildtyp-Matrize. Die Analyse der Ligierungsedukte führt zu "Doppelpeaks", da zwei der Oligonukleotide 5'-phosphoryliert sind.
  • 30: In (b) ist das durch MALDI-TOF-MS-Analyse der Pfu-DNA-Ligaselösung gemäß Beispiel 6 erhaltene komplexe Signalmuster abgebildet. In (a) ist ein MALDI-TOF-Spektrum einer ungereinigten LCR gezeigt. Das Massensignal 67569 Da stellt wahrscheinlich die Pfu-DNA-Ligase dar.
  • 31 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum von zwei vereinigten positiven LCRs (a). Das Signal bei 7523 Da stellt unligiertes Oligo A dar (berechnet: 7521 Da), wohingegen das Signal bei 15449 Da das Ligationsprodukt darstellt (berechnet: 15450 Da). Das Signal bei 3774 Da ist das [M + 2H]2+ Signal von Oligo A. Die Signale im Massenbereich unter 2000 Da sind auf die Matrix-Ionen zurückzuführen. Das Spektrum entspricht Bahn 1 in 27 und dem Chromatogramm in 28. In (b) ist ein Spektrum von zwei vereinigten negativen LCR (Mutanten-Matrize) gezeigt. Das Signal bei 7517 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da).
  • 32 zeigt ein Spektrum von zwei vereinigten Kontrollreaktionen (mit Lachssperma-DNA als Matrize). Die Signale im Massenbereich um 2000 Da sind auf Tween 20 zurückzuführen; wie erwartet konnte nur Oligo A nachgewiesen werden.
  • 33 zeigt ein Spektrum von zwei vereinigten positiven LCRs (a). Die Reinigung wurde mit einer Kombination von Ultrafiltration und Streptavidin-Dynabeads durchgeführt, wie im Text beschrieben. Das Signal bei 15448 Da stellt das Ligierungsprodukt dar (berechnet: 15450 Da). Das Signal bei 7527 stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da). Das Signal bei 3761 Da ist das [M + 2H]2 +-Signal von Oligo A, wohingegen das Signal bei 5140 Da das [M + 3H]2+-Signal des Ligierungsprodukts darstellt. In (b) ist ein Spektrum von zwei vereinigten negativen LCR (ohne Matrize) gezeigt. Das Signal bei 7514 Da stellt Oligo A dar (berechnet: 7521 Da).
  • 34 ist eine schematische Darstellung der Oligo-Basen-Extension des Mutationsnachweisprimers, wie in Beispiel 7 beschrieben, unter Verwendung von ddTTP (A) bzw. ddCTP (B) im Reaktionsgemisch. Die theoretisch berechnete Masse ist in Klammern angegeben. Die gezeigte Sequenz ist ein Teil des Exons 10 des CFTR-Gens, der die häufigste Cystische-Fibrose-Mutation ΔF508 und die selteneren Mutationen Δ1507 und Ile506Ser enthält.
  • 35 ist ein MALDI-TOF-Spektrum, das direkt von präzipitierten Oligo-Basenextendierten Primern zum Mutationsnachweis aufgenommen wurde. Das Spektrum in (A) bzw. (B) zeigt den annelierten Primer (CF508) ohne weitere Extensionsreaktion. Feld C zeigt das MALDI-TOF-Spektrum des Wildtyps unter Verwendung von pppTdd in der Extensionsreaktion und D ein heterozygotes Extensionsprodukt, das die 506S-Mutation trägt, bei Verwendung von pppCdd als Terminator. Die Felder E und F zeigen eine Heterozygote mit der ΔF508-Mutation mit pppTdd und pppCdd als Terminatoren in der Extensionsreaktion. Die Felder G und H stellen eine homozygote ΔF508-Mutation mit entweder pppTdd oder pppCdd als Terminatoren dar. Die Diagnosematrize ist unter jedem Spektrum gezeigt, und die beobachteten/erwarteten Molekülmassen sind in Klammem dargestellt.
  • 36 zeigt einen Abschnitt einer pRFc1-DNA-Sequenz, der als Matrize zur Nukleinsäureamplifikation gemäß Beispiel 8 von unmodifizierten und 7-Deazapurinhaltigen 99-mer- und 200-mer-Nukleinsäuren verwendet wurde, sowie die Sequenzen des 19-mer-Vorwärtsprimers und der beiden 18-mer-Rückwärtsprimer.
  • 37 zeigt den Abschnitt der Nukleotidsequenz von M13mp18-RFI-DNA, der in Beispiel 8 zur Nukleinsäureamplifikation von unmodifizierten und 7-Deazapurinhaltigen 103-mer-Nukleinsäuren verwendet wurde. Ebenfalls gezeigt sind die Nukleotidsequenzen der in der Nukleinsäureamplifikationsreaktion eingesetzten 17-mer-Primer.
  • 38 zeigt das Ergebnis einer Polyacrylamidgelelektrophorese der in Beispiel 8 beschriebenen, für die MALDI-TOF-Analyse gereinigten und aufkonzentrierten amplifizierten Produkte. M: Kettenlängenmarker, Bahn 1: 7-Deazapurin-haltiges 99-mer-Amplifikationsprodukt, Bahn 2: unmodifiziertes 99-mer, Bahn 3: 7-Deazapurinhaltiges 103-mer und Bahn 4: unmodifiziertes 103-mer-Amplifikationsprodukt.
  • 39: Ein Autoradiogramm der Polyacrylamidgelelektrophorese von Nukleinsäure-(d. h. PCR-)Reaktionen, die mit den 5'[31P]-markierten Primern 1 und 4 durchgeführt wurden. Bahnen 1 und 2: unmodifiziertes und 7-Deazapurinmodifiziertes 103-mer-Amplifikationsprodukt (53321 und 23520 Impulse), Bahnen 3 und 4: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 200-mer (71123 und 39582 Impulse) sowie Bahnen 5 und 6: unmodifiziertes und 7-Deazapurin-modifiziertes 99-mer (173216 und 94400 Impulse).
  • 40: a) MALDI-TOF-Massenspektrum der unmodifizierten 103-mer-Amplifikationsprodukte (Summe von zwölf einzeln aufgenommenen Spektren). Der Mittelwert der Massen, berechnet für die zwei Einzelstränge (31768 u und 31759 u), ist 31763 u. Massenauflösung: 18. b) MALDI-TOF-Massenspektrum des 7-Deazapurin-haltigen 103-mer-Amplifikationsprodukts (Summe dreier einzeln aufgenommener Spektren). Der Mittelwert der Massen, berechnet für die zwei Einzelstränge (31727 u und 31719 u) ist 31723 u. Massenauflösung: 67.
  • 41: a) MALDI-TOF-Massenspektrum des unmodifizierten 99-mer-Amplifikationsprodukts (Summe von zwanzig einzeln aufgenommenen Spektren). Werte der für die zwei Einzelstränge berechneten Massen: 30261 u und 30794 u. b) MALDI-TOF-Massenspektrum des 7-Deazapurin-haltigen 99-mer-Amplifikationsprodukts (Summe von zwölf einzeln aufgenommenen Spektren). Werte der für die beiden Einzelstränge berechneten Massen: 30224 u und 30750 u.
  • 42: a) MALDI-TOF-Massenspektrum des unmodifizierten 200-mer-Amplifikationsprodukts (Summe von 30 einzeln aufgenommenen Spektren). Der Mittelwert der Massen, berechnet für die zwei Einzelstränge (61873 u und 61595 u), ist 61734 u. Massenauflösung: 28. b) MALDI-TOF-Massenspektrum des 7-Deazapurin-haltigen 200-mer-Amplifikationsprodukts (Summe von 30 einzeln aufgenommenen Spektren). Der Mittelwert der Massen, berechnet für die zwei Einzelstränge (61772 u und 61714 u) ist 61643 u. Massenauflösung: 39.
  • 43: a) MALDI-TOF-Massenspektrum des 7-Deazapurin-haltigen 100-mer-Amplifikationsprodukts mit Ribo-modifizierten Primern. Der Mittelwert der Massen, berechnet für die zwei Einzelstränge (3052911 und 31095 u) ist 30812 u. b) MALDI-TOF-Massenspektrum des amplifizierten Produkts nach hydrolytischer Primer-Spaltung. Der Mittelwert der Massen, berechnet für die zwei Einzelstränge (25104 u und 25229 u) ist 25167 u. Der Mittelwert der gespaltenen Primer (5437 u und 5918 u) ist 5677 u.
  • 44A–D zeigt das MALDI-TOF-Massenspektrum der vier Sequenzierungsleitern, die von einer 39-mer-Matrize (SEQ ID Nr. 23), die über eine 3-Biotinylierung an Streptavidin-Perlen immobilisiert war, erhalten wurden. Ein 14-mer-Primer (SEQ ID Nr. 24) wurde zum Sequenzieren gemäß Beispiel 9 verwendet.
  • 45 zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum einer Festphasensequenzierung einer 78-mer-Matrize (SEQ ID Nr. 25), die an Streptavidin-Perlen über eine 3'-Biotinylierung immobilisiert war. Ein 18-mer-Primer (SEQ ID Nr. 26) und ddGTP wurden zum Sequenzieren verwendet.
  • 46 zeigt ein Schema, bei dem Duplex-DNA-Sonden mit einzelsträngigem Überhang spezifische DNA-Matrizen einfangen und auch als Primer zur Festphasensequenzierung dienen.
  • 47A–D zeigt MALDI-TOF-Massenspektren, erhalten aus einer Sequenzierungsreaktion unter Verwendung eines 5'-fluoreszenzmarkierten 23-mers (SEQ ID Nr. 29) hybridisiert an ein 3'-biotinyliertes 15-mer (SEQ ID Nr. 30), wobei ein 5-Basen-Überhang verbleibt, der eine 15-mer-Matrize (SEQ ID Nr. 31) einfing, wie in Beispiel 9 beschrieben.
  • 48 zeigt ein Stapelfluorogramm derselben, aus der in 47 beschriebenen Reaktion erhaltenen Produkte, die aber auf einen üblichen DNA-Sequenzierautomaten aufgetragen wurden.
  • 49 zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum der Sequenzierungsleiter unter Verwendung von Cycle Sequencing, wie in Beispiel 1 beschrieben, die aus einem biologischen Amplifikationsprodukt als Matrize und einem 12-mer (5'-TGC ACC TGA CTC-3' (SEQ ID Nr. 34)) als Sequenzierungsprimer hergestellt wurde. Die von Depurinierungen herrührenden Peaks und Peaks, die nicht mit der Sequenz in Zusammenhang stehen, sind durch ein Sternchen markiert. Die MALDI-TOF-MS-Messungen wurden auf einem Reflektron-TOF-MS aufgenommen. A.) Mit ddATP gestoppte Sequenzierungsleiter; B.) Mit ddCTP gestoppte Sequenzierungsleiter; C.) Mit ddGTP gestoppte Sequenzierungsleiter; D.) Mit ddTTP gestoppte Sequenzierungsleiter.
  • 50 zeigt eine schematische Darstellung der in 49 erzeugten Sequenzierungsleiter mit den entsprechenden berechneten Molekülmassen bis zu 40 Basen nach dem Primer. Zur Berechnung wurden die folgenden Massen verwendet: 3581,4 Da für den Primer, 312,2 Da für 7-Deaza-dATP, 304,2 Da für dTTP, 289,2 Da für dCTP und 328,2 Da für 7-Deaza-dGTP.
  • 51 zeigt die Sequenz des amplifizierten 209-bp-Amplifikationsprodukts im β-Globin-Gen, das als Matrize zur Sequenzierung verwendet wurde. Die Sequenzen des entsprechenden Amplifikationsprimers und die Stelle des 12-mer-Sequenzierungsprimers sind ebenfalls gezeigt. Diese Sequenz stellt eine homozygote Mutante an der Position 4 Basen hinter dem Primer dar. In der Wildtypsequenz wäre dieses T durch ein A ersetzt.
  • 52 zeigt eine Sequenz, die Teil des Introns 5 des Interferonrezeptor-Gens ist und den AluVpA-Polymorphismus, wie in Beispiel 11 weiter beschrieben, trägt. Das Schema stellt die Primer-Oligo-Basen-Extension (PROBE) unter Verwendung von ddGTP, ddCTP bzw. beiden zur Termination dar. Der Polymorphismusnachweis-Primer (IFN) ist unterstrichen, die Terminationsnukleotide sind fett markiert. Die Werte für die theoretische Masse der in 28 unabhängigen Individuen gefundenen Allele und einer Familie mit fünf Mitgliedern sind in der Tabelle angegeben. Beide Sekundärstellenmutationen, die in den meisten, aber nicht in allen der 13 Einheitsallele gefunden wurden, sind angedeutet.
  • 53 zeigt die MALDI-TOF-MS-Spektren, die direkt von präzipitierten verlängerten Cyklus-PROBE-Reaktionsprodukten aufgezeichnet wurden. Familienstudie unter Verwendung des AluVpA-Polymorphismus im Intron 5 des Interferon-α-Rezeptorgens (Beispiel 11).
  • 54 zeigt die Massenspektren von PROBE-Produkten unter Verwendung von ddC als Terminationsnukleotid im Reaktionsgemisch. Das Allel mit der Molekülmasse von etwa 11650 Da von der DNA der Mutter und von Kind 2 ist ein Hinweis auf eine Sekundärstellenmutation in einer der Wiederholungseinheiten.
  • 55 zeigt eine schematische Darstellung des PROBE-Verfahrens zum Nachweis verschiedener Allele im Poly-T-Trakt am 3'-Ende von Intron 8 des CFTR-Gens mit pppCdd als Terminator (Beispiel 11).
  • 56 zeigt die MALDI-TOF-MS-Spektren, die direkt von den präzipitierten verlängerten PROBE-Reaktionsprodukten aufgenommen wurden. Nachweis aller drei üblichen Allele des Poly-T-Trakts am 3'-Ende des Introns 8 des CFTR-Gens. (a) T5/T9-heterozygot, (b) T7/T9-heterozygot (Beispiel 11).
  • 57 zeigt ein Massenspektrum der Spaltung eines 252-mer-ApoE-Gen-Amplifikationsproduktes (ε3/ε3-Genotyp), wie in Beispiel 12 beschrieben, unter Verwendung von a) nur Cfol und b) Cfol plus Rsal. Sternchen: Depurinierungspeaks.
  • 58 zeigt ein Massenspektrum des ApoE-Gen-Amplifikationsprodukts (ε3/ε3-Genotyp), verdaut durch Cfol und gereinigt durch a) einfache und b) doppelte Ethanol/Glykogen- und c) doppelte Isopropylalkohol/Glykogen-Prazipitation.
  • 59 zeigt ein Massenspektrum der Cfol/Rsal-Verdau-Produkte der Genotypen a) ε2/ε3, b) ε3/ε3, c) ε3/ε4 und c) ε4/ε4. Die gestrichelten Linien sind durch diagnostische Fragmente gezeichnet.
  • 60 zeigt ein Schema zur schnellen Identifizierung unbekannter ApoE-Genotypen nach gleichzeitiger Spaltung eines 252-mer-ApoE-Gen-Amplifikationsprodukts durch die Restriktionsenzyme Cfol und Rsal.
  • 61 zeigt die Multiplexierungs-(Codons 112 und 158)Massenspektrum-PROBE-Ergebnisse für die Genotypen a) ε2/ε3, b) ε3/ε3, c) ε3/ε4 und c) ε4/ε4. E: Extensionsprodukte; P: nicht verlängerter Primer. Oben: Bereiche von Codon 112 und 158 mit polymorphen Stellen fett und Primersequenzen unterstrichen.
  • 62 zeigt ein Massenspektrum eines TRAP-Tests zum Nachweis von Telomeraseaktivität (Beispiel 13). Das Spektrum zeigt zwei der Primersignale des amplifizierten Produkts des TS-Primers bei 5.497,3 Da (ber. 5523 Da) und des biotinylierten bioCX-Primers bei 7.537,6 Da (ber. 7.537 Da) und das erste Telomerase-spezifische Testprodukt mit drei Telomer-Repeats bei 12.775,8 Da (ber. 12.452 Da), seine Masse ist aufgrund der Extendaseaktivität der Taq-DNA-Polymerase um ein dA-Nukleotid größer (12.765 Da).
  • 63 zeigt den höheren Massenbereich von 62, d. h. der Peak bei 12.775,6 Da stellt die Produkte mit diesen Telomer-Wiederholungen dar. Die Peaks bei 20.322,1 Da sind das Ergebnis einer Telomeraseaktivität unter Bildung von sieben Telomer-Repeats (ber. 20.395 Da einschließlich der Verlängerung um 1 dA-Nukleotid). Die mit 1, 2, 3 und 4 bezeichneten Peaks enthalten vier Telomer-Repeats bei 14.674 Da sowie ein Sekundärionenprodukt.
  • 64 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum des RT-amplifizierten Produktes der menschlichen Tyrosinhydroxylase-mRNA, welches das Vorhandensein von Neuroblastomzellen anzeigt (Beispiel 14). Das Signal bei 18.763,8 Da stellt das nicht-biotinylierte einzelsträngige 61-mer des geschachtelt amplifizierten Produkts dar (ber. 18.758,2 Da).
  • 65(a) zeigt eine schematische Darstellung einer PROBE-Reaktion für das RET-Proto-Onkogen mit einem Gemisch von dATP, dCTP, dGTP und ddTTP (Beispiel 15). B bedeutet Biotin, durch das der Sense-Matrizenstrang über Streptavidin an einen festen Träger gebunden ist.
  • 65(b) zeigt die erwarteten PROBE-Produkte für ddT- und ddA-Reaktionen für den Wildtyp-, den C→T- und den C→A-Antisense-Strang.
  • 66 zeigt die PROBE-Produkt-Massenspektren für (a) negative Kontrolle, (b) heterozygoter Patient 1 (Wt/C→T) und (c) heterozygoter Patient 2 (Wt/C→A), wobei die durchschnittlichen Mr-Werte angegeben sind.
  • 67 zeigt die MALDI-FTMS-Spektren für synthetische Analoga, die ribogespaltene RET-Proto-Onkogen-Amplifikationsprodukte von (a) Wildtyp, (b) G→A und (c) G→T-Homozygoten und (d) Wildtyp/G→A-, (e) Wildtyp/G→T- und (f) G→A/G→T-Heterozygoten darstellen, wobei die Massen der häufigsten Isotopenpeaks angegeben sind.
  • 68 ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäureimmobilisierung über kovalente bifunktionelle Trityl-Linker.
  • 69 ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäureimmobilisierung über hydrophobe Trityl-Linker.
  • 70 zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum eines Überstands der matrixbehandelten Dynabeads, die gebundenes Oligo (5'-Iminobiotin-TGCACCTGACTC, SEQ ID Nr. 56) enthalten. Ein interner Standard (CTGTGGTCGTGC, SEQ ID Nr. 57) war in der Matrix enthalten.
  • 71 zeigt das MALDI-TOF-Massenspektrum eines Überstands der matrixbehandelten Dynabeads, die gebundenes Oligo (5'-Iminobiotin-TGCACCTGACTC, SEQ ID Nr. 56) enthalten. Ein interner Standard (CTGTGGTCGTGC, SEQ ID Nr. 57) war in der Matrix enthalten.
  • 72 zeigt schematisch die an der Loop-Primer-Oligo-Basen-Extensions(LoopProbe-) Reaktion beteiligten Schritte.
  • 73A zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum eines Überstands nach Cfol-Verdau eines Stem-Loops. Die 73B–D zeigen MALDI-TOF-Massenspektren verschiedener Genotypen: HbA der Wildtyp-Genotyp (74B), HbC eine Mutation von Codon 6 des β-Globin-Gens, die Sichelzellen-Erkrankung verursacht (74C) und HbS eine andere Mutation von Codon 6 des β-Globin-Gens, die Sichelzellen-Erkrankung verursacht (74D).
  • 74 zeigt die Nukleinsäuresequenz des amplifizierten Bereichs von CKR-5. Die unterstrichene Sequenz entspricht der zu den Amplifikationsprimern homologen Region. Der gepunktete Bereich entspricht der 32-bp-Deletion.
  • 75 zeigt den Sense-Primer ckrT7f, Dieser ist so konzipiert, dass er die Bindung von T7-RNA-Polymerase und die Amplifikation der zu analysierenden CKR-5-Region erleichtert, und er beginnt mit einer zufällig ausgewählten Sequenz von 24 Basen, der T7-Promotorsequenz von 18 Basen und der zu CKR-5 homologen Sequenz von 19 Basen.
  • 76 ist ein MALDI-TOF-Massenspektrum des CKR-5-Amplifikationsprodukts, das wie im nachstehenden Beispiel 21 beschrieben erzeugt wurde.
  • 77 zeigt Positiv-Ionen-UV-MALDI-Massenspektren eines synthetischen RNA 25-mers (5'-UCCGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGAC-3', SEQ ID Nr. 62), das mit ausgewählten RNAsen verdaut wurde. Für jedes Enzym wurden zur Analyse 0,6 μl-Aliquote des 4,5 μl-Tests, der insgesamt ca. 20 pMol der RNA enthielt, mit 1,5 μl Matrix (3-HPA) fixiert. Fragmente mit beibehaltenem 5'-Terminus sind durch verschiedene Pfeile markiert, spezifisch für die verschiedenen RNAsen (Hahner et al. (1996), Proceedings of the 44th ASMS Conference an Mass Spectrometry and Allied Topics, S. 983).
  • 78 ist eine Untersuchung der Spezifität der RNAsen CL3 und Cusativin durch Positiv-Ionen-UV-MALDI-Massenspektren eines synthetischen RNA-20-mers. Erwartete und/oder beobachtete Spaltstellen sind durch Pfeile angezeigt. A, B, C geben richtige Spaltstellen und entsprechende einzeln gespaltene Fragmente an. Fehlende Spaltungen sind mit einem Fragezeichen (?), unspezifische Spaltungen mit einem X markiert.
  • 79 zeigt die Trennung eines Gemischs von DNA-Molekülen (12-mer, 5'-biot. 19-mer, 22-mer und 5'-biot. 27-mer) mit Streptavidin-beschichteten Magnetperlen. a) Positiv-Ionen-UV-MALDI-Massenspektrum von 0,6 μl eines Gemischs, das ca. 2–4 pMol jeder Spezies, gemischt mit 1,5 μl Matrix (3-HPA), enthält. b) Gleich wie a), aber Inkubation des Gemischs mit Magnetperlen und anschließende Freisetzung der eingefangenen Fragmente.
  • 80: Elution des immobilisierten 5'-biotinylierten 49-nt-in vitro-Transkripts von den Streptavidin-beschichteten Magnetperlen. Positiv-UV-MALDI-Massenspektrum des Transkripts vor Inkubation mit den Magnetperlen (a). Spektren des immobilisierten RNA-Transkripts nach Elution mit 95% Formamid allein und (b) mit verschiedenen Additiven, wie etwa 10 mM EDTA (c), 10 mM CDTA (d) und 25%-iges Ammoniumhydroxid (e); EDTA und CDTA wurden mit 25%-igem Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 8 eingestellt.
  • 81: Positiv-UV-MALDI-Massenspektren des 5'-biotinylierten 49-nt-in vitro Transkripts nach RNAse U2 Verdau für 15 Minuten. a) Spektrum des 25 μl-Tests, der ca. 100 pMol der Ziel-RNA enthält, vor der Trennung; b) Spektrum nach der Isolierung der 5'- biotinylierten Fragmente mit Magnetperlen. Die eingefangenen Fragmente wurden durch eine 95%-ige Formamidlösung, die 10 mM CDTA enthielt, freigesetzt. In beiden Fällen wurden 1 μl-Aliquote der Proben mit 1,5 μl Matrix (3-HPA) gemischt.
  • 82 zeigt schematisch den parallel durchgeführten Nachweis mutmaßlicher Mutationen im menschlichen β-Globin-Gen bei Codon 5 und 6 und bei Codon 30 bzw. in der IVS-1-Donorstelle. 82A zeigt die Amplifikation genomischer DNA unter Verwendung der Primer β2 und β11. Die Lokalisierung der Primer und Identifikationsmarkierungen sowie Hinweise auf die Wildtyp- und die Mutantensequenzen sind angegeben. 82B zeigt die Analyse beider Stellen in einer einfachen Primer-Reaktions-Oligo-Basen-Extension (PROBE) unter Verwendung der Primer β-TAG1 (der stromaufwärts von Codon 5 und 6 bindet) und β-TAG2 (der stromaufwärts von Codon 30 und der IVS-1-Donorstelle bindet). Die Reaktionsprodukte werden unter Verwendung von an Streptavidin-beschichtete paramagnetische Partikel gebundenen biotinylierten Einfangprimern (cap-tag-1 bzw. cap-tag-2) eingefangen, die am 5'-Ende 6 Basen aufweisen, die komplementär zu dem 5'-Ende von β-TAG1 bzw. β-TAG2 sind, und einen Abschnitt, der an einen Universalprimer bindet.
  • 83 zeigt ein Massenspektrum der PROBE-Produkte einer DNA-Probe von einem Individuum, die wie schematisch in 82 beschrieben analysiert wurde.
  • 84 zeigt ein Massenspektrum der an cap-tag-2 gebundenen Sequenz.
  • 85 zeigt ein Massenspektrum, das erhalten wurde, indem die Primer β-TAG1 und β-TAG2 in einer Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von ddATP zur Termination verwendet wurden, wobei anschließend gemäß dem in 82 dargestellten Verfahren aufgetrennt wurde.
  • 86 zeigt ein Massenspektrum, das erhalten wurde, indem die Primer β-TAG1 und β-TAG2 in einer Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von ddATP zur Termination eingesetzt wurden, und anschließend gemäß dem in 82 dargestellten Verfahren aufgetrennt wurde.
  • 87A zeigt die Wildtyp-Sequenz eines Fragments des Chemokin-Rezeptor-CKR-5-Gens mit den für die Amplifikation verwendeten Primern (fett). Die 32-Basenpaar-(bp)Deletion in dem CKR-5-Allel ist unterstrichen und die Stopp-Nukleotide sind kursiv. In 87B sind die Wildtyp-Stränge mit und ohne ein hinzugefügtes Adenosin dargestellt, und ihre Länge und Molekülmassen sind angegeben. 87C gibt das Gleiche für die 32-bp-Deletion an. 87D zeigt die PROBE-Produkte für das Wildtypgen und 87E zeigt das mutierte Allel.
  • 88 zeigt die Amplifikationsprodukte verschiedener nicht verwandter Individuen, die durch native Polyacrylamid-Gelelektrophoresen (15%) und Silberanfärbung analysiert wurden. Die einem Wildtyp-CKR-5 entsprechende Bande läuft bei 75 bp und die Bande des Gens mit der Deletion läuft bei 43 bp. Größere Banden als 75 bp sind auf eine unspezifische Amplifikation zurückzuführen.
  • 89A zeigt ein Spektrogramm von DNA, die von einem heterozygoten Individuum gewonnen wurde: Der Peak mit einer Masse von 23319 Da entspricht dem Wildtyp-CKR5 und die Peaks mit Massen von 13137 Da und 13451 Da entsprechen dem Deletionsallel mit bzw. ohne ein zusätzliches Adenosin. 89B zeigt ein Spektrogramm von DNA, die von demselben Individuum wie in 89A erhalten wurde, die DNA wurde aber mit T4-DNA- Polymerase behandelt, um das hinzugefügte Adenosin zu entfernen. Die 89C und 89D sind Spektrogramme, die von homozygoten Individuen gewonnen wurden und in 89D wurde das Adenosin entfernt. Alle Peaks mit kleineren Massen als 13.000 Da sind auf mehrfach geladene Moleküle zurückzuführen.
  • 90A zeigt das Massenspektrum der Ergebnisse einer PROBE-Reaktion, die an DNA die von einem heterozygoten Individuum gewonnen wurde durchgeführt wurde. 90B zeigt ein Massenspektrum der Ergebnisse einer PROBE-Reaktion an einem homozygoten Individuum. Die Peaks mit Massen von 6604 Da bzw. 6607 Da entsprechen dem Wildtyp-Allel, und der Peak mit einer Masse von 6275 Da entspricht dem Deletionsallel. Der Primer wird mit einer Masse von 5673 bzw. 5676 Da detektiert.
  • 91 zeigt MALDI-TOF-MS-Spektren einer Thermocycling-Primer-Oligo-Basen-Extensions-(tc-PROBE-)Reaktion, wie in Beispiel 24 beschrieben, wobei drei verschiedene Matrizen und 5 unterschiedlichen PROBE-Primer gleichzeitig in einer Reaktion verwendet wurden.
  • 92 zeigt schematisch ein Einzel-Röhrchen-Verfahren zur Amplifikation und Sequenzierung der Exons 5–8 des p53-Gens, wie in Beispiel 25 beschrieben. Das Massenspektrum ist die A-Reaktion der 93.
  • 93 zeigt die übereinander angeordnete graphische Darstellung von vier getrennten Reaktionen zur Sequenzierung eines Abschnitts von Exon 7 des p53-Gens, wie in Beispiel 25 beschrieben.
  • 94 zeigt das Massenspektrum, das von der A-Reaktion zur Sequenzierung eines Abschnitts von Exon 7 des p53-Gens, wie in Beispiel 25 beschrieben, erhalten wurde.
  • 95 zeigt das Massenspektrum einer p53-Sequenzierungsleiter, wofür 5 nl jeder Reaktion in Wells auf einem Chip übertragen und mittels MALDI-TOF gemessen wurden.
  • 96A zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum eines synthetischen 50-mers (15,34 kDa), gemischt mit 27-mernc (nicht-komplementär, 8,30 kDa).
  • 96B zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum eines synthetischen 50-mers(15,34 kDa), gemischt mit einem 27-merc (komplementär, 8,34 kDa). Die Endkonzentration jedes Oligonukleotids betrug 10 μM. Das Signal bei 23,68 kDa in 96B entspricht WC-spezifischer dsDNA.
  • 97A zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum von Cfol/Rsal-Verdauprodukten aus einer Region von Exon 4 des Apolipoprotein E-Gens (ε3-Genotyp) unter Verwendung der Probenherstellung wie in 96.
  • 97B ist dieselbe wie 97A, außer, dass die Proben für die MALDI-TOF-Analyse bei 4°C hergestellt wurden.
  • 98 zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum von mit Cfal/Rsal gleichzeitig doppelt verdauten Produkten aus einer 252-Basenpaar-Region von Exon 4 des Apolipoprotein E-Gens (ε4-Genotyp), wobei die Proben bei 4°C hergestellt wurden.
  • 99 zeigt die aus einer Studie an einer kleinen Population von 15 Patienten mit einer 16-Elemente-Anordnung von Diagnoseprodukten, die mittels einer Nadel-Mikrodosiervorrichtung auf ein MALDI-Ziel übertragen wurden, erhaltenen Massenspektren.
  • 100 ist ein MALDI-Massenspektrum eines Aliquots, das nach T1-Verdau einer synthetischen 20-mer-RNA entnommen wurde.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen
  • Wenn nicht anders festgelegt, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie ein Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung für gewöhnlich versteht. Sofern gestattet ist der Gegenstand aller parallelen Patentanmeldungen und des Patents hierin in seiner Gesamtheit inbegriffen.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „biologische Probe" auf jegliches Material, das von irgendeiner lebenden Quelle erhalten wurde (z. B. Mensch, Tier, Pflanze, Bakterien, Pilze, Protisten, Viren). Für die vorliegenden Zwecke enthält die biologische Probe typischerweise ein Nukleinsäuremolekül. Beispiele für geeignete biologische Proben beinhalten, sind u. a. aber nicht begrenzt auf: feste Materialien (z. B. Gewebe, Zellsedimente, Biopsien) und biologische Flüssigkeiten (Urin, Blut, Speichel, Fruchtwasser, Mundwäsche, Cerebrospinalfluid und andere Körperflüssigkeiten).
  • Wie hierin verwendet, werden die Formulierungen „kettenverlängernde Nukleotide" und „kettenterminierende Nukleotide" entsprechend ihrer im Fachbereich anerkannten Bedeutung verwendet. Beispielsweise sind für DNA kettenverlängernde Nukleotide u. a. 2'-Desoxyribonukleotide (z. B. dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und kettenterminiende Nukleotide sind u. a. 2',3'-Didesoxyribonukleotide (z. B. ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP). Für RNA sind kettenverlängernde Nukleotide u. a. Ribonukleotide (z. B. ATJP, CTP, GTP und UTP) und kettenterminierende Nukleotide sind u. a. 3'-Desoxyribonukleotide (z. B. 3'dA, 3'dC, 3'dG und 3'dU). Ein vollständiger Satz von kettenverlängernden Nukleotiden bezieht sich auf dATP, dCTP, dGTP, dTTP. Der Begriff „Nukleotid" ist im Fachbereich ebenfalls gut bekannt.
  • Wie hierin verwendet umfassen Nukleotide Nukleosidmono-, -di- und -triphosphate. Nukleotide schließen außerdem modifizierte Nukleotide, wie etwa Phosphorthioat-Nukleotide und Deazapurin-Nukleotide ein. Ein vollständiger Satz kettenverlängernder Nukleotide bezieht sich auf vier verschiedene Nukleotide, die an jede der vier verschiedenen Basen hybridisieren können, die die DNA-Matrize ausmachen.
  • Wie hierin verwendet, bezeichnet das hochgestellte 0-i i + 1 Nukleotide, Primer oder Markierungen mit unterscheidbarer Masse. In einigen Fällen kann das hochgestellte 0 eine unmodifizierte Spezies eines bestimmen Recktanten bezeichnen und das hochgestellte i kann die i-te massenmodifizierte Spezies dieses Reaktanten bezeichnen. Wenn beispielsweise mehr als eine Art von Nukleinsäuren gleichzeitig bestimmt werden soll, so können i + 1 verschiedene massenmodifizierte Detektoroligonukleotide (D0, D1, ... Di) verwendet werden, um jede Spezies der massenmodifizierten Detektoroligonukleotide (D) von den anderen mittels Massenspektrometrie zu unterscheiden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich „multiplex" auf die gleichzeitige Detektion von mehr als einen Analyten, wie etwa von mehr als einem (mutierten) Locus an einem bestimmten eingefangenen Nukleinsäurefragment (auf einem Punkt eines Arrays).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Nukleinsäure" auf einzelsträngige und/oder doppelsträngige Polynukleotide, wie etwa Desoxyribonukleinsäure (DNA) und Ribonukleinsäure (RNA), sowie Analoga oder Derivate von entweder RNA oder DNA. Ebenfalls in dem Begriff „Nukleinsäure" inbegriffen sind Analoga von Nukleinsäuren, wie etwa Peptidnukleinsäuren (PNA), Phosphorthioat-DNA und andere solche Analoga und Derivate.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „konjugiert" auf eine stabile Anbindung, vorzugsweise eine ionische oder kovalente Anbindung. Bevorzugte Arten der Konjugation sind u. a.: Streptavidin- oder Avidin-Biotin-Wechselwirkung; hydrophobe Wechselwirkung, magnetische Wechselwirkung (z. B. unter Verwendung funktionalisierter Magnetperlen, wie etwa DYNA-BEADS, bei denen es sich um Streptavidin-beschichtete Magnetperlen handelt, die von Dynal, Inc. Great Neck, NY und Oslo Norway vertrieben werden); polare Wechselwirkungen, wie etwa „Benetzungs"wechselwirkungen zwischen zwei polaren Oberflächen oder zwischen Oligo/Polyethylenglycol; Bildung einer kovalenten Bindung, wie etwa einer Amidbindung, Disulfidbindung, Thioetherbindung, oder über Quervernetzungsmittel und über einen säurelabilen oder photolytisch spaltbaren Linker.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet äquivalent bei der Bezugnahme auf zwei Sequenzen von Nukleinsäuren, dass die beiden fraglichen Sequenzen dieselbe Sequenz von Aminosäuren oder äquivalente Proteine kodieren. Wenn „äquivalent" unter Bezugnahme auf zwei Proteine oder Peptide verwendet wird, so bedeutet dies, dass die beiden Proteine oder Peptide im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz aufweisen, mit ausschließlich konservativen Aminosäuresubstitutionen, durch welche die Aktivität oder Funktion des Proteins oder Peptids nicht wesentlich verändert wird.
  • Wenn sich „äquivalent" auf eine Eigenschaft bezieht, so braucht diese Eigenschaft nicht in demselben Ausmaß vorhanden zu sein [z. B. können zwei Peptide ein unterschiedliches Maß derselben Art von enzymatischer Aktivität aufweisen], aber die Aktivitäten sind vorzugsweise im Wesentlichen gleich. „Komplementär" bedeutet bei der Bezugnahme auf zwei Nukleotidsequenzen, dass die beiden Sequenzen von Nukleotiden zur Hybridisierung in der Lage sind, vorzugsweise mit weniger als 25%, weiter bevorzugt mit weniger als 15%, noch weiter bevorzugt mit weniger als 5%, am meisten bevorzugt ohne Mismatch zwischen gegenüber liegenden Nukleotiden.
  • Vorzugsweise hybridisieren die beiden Moleküle unter Bedingungen hoher Stringenz.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet Stringenz der Hybridisierung bei der Bestimmung der prozentualen Mismatchs die dem Fachmann bekannten Bedingungen und entspricht typischerweise Folgendem:
    1) hohe Stringenz: 0,1 × SSPE, 0,1% SDS, 65°C
    2) mittlere Stringenz: 0,2 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
    3) niedrige Stringenz: 1,0 × SSPE, 0,1% SDS, 50°C
  • Es versteht sich, dass eine gleichwertige Stringenz unter Verwendung anderer Puffer, Salze und Temperaturen erreicht werden kann.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Primer bei der Angabe in den Patentansprüchen auf einen Primer, der für die massenspektrometrischen Verfahren, die Immobilisierung, Hybridisierung, Strangverschiebung erfordern, geeignet ist; Sequenzierungsmassenspektrometrie bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die eine ausreichende Masse besitzen muss, typischerweise etwa 70 Nukleotide oder weniger als 70, und eine ausreichende Größe, so dass sie für die hierin beschriebenen massenspektrometrischen Verfahren geeignet ist, die auf der massenspektrometrischen Detektion beruhen. Diese Verfahren beinhalten Primer für die Detektion und Sequenzierung von Nukleinsäuren, die eine ausreichende Zahl von Nukleotiden für die Bildung einer stabilen Duplex erfordern, typischerweise etwa 6–30, vorzugsweise etwa 10–25, weiter bevorzugt etwa 12–20. Somit ist für die vorliegenden Zwecke ein Primer eine Sequenz von Nukleotiden, die etwa 6–70, weiter bevorzugt 12–70, weiter bevorzugt mehr als etwa 14 bis zu einer Obergrenze von 70 Nukleotiden umfasst, abhängig von Sequenz und Anwendung des Primers. Die vorliegenden Primer, beispielsweise für die Mutationsanalysen, sind so gewählt, dass sie stromaufwärts von für die Diagnose geeigneten Loci liegen, so dass bei der Durchführung unter Anwendung von Sequenzierung bis zu der oder über die Stelle von Interesse das resultierende Fragment eine Masse besitzt, die ausreichend und nicht zu groß ist, um durch Massenspektrometrie nachgewiesen zu werden. Für massenspektrometrische Verfahren sind vorzugsweise Massenmarkierungen oder Modifikationen am 5'-Ende angefügt und der Primer ist ansonsten unmarkiert.
  • Wie hierin verwendet bezieht sich „konditionieren" einer Nukleinsäure auf die Modifikation des Phosphodiester-Gerüsts des Nukleinsäuremoleküls (z. B. Kationenaustausch) mit dem Zweck, eine Peakverbreiterung aufgrund einer Heterogenität der pro Nukleotideinheit gebundenen Kationen zu verhindern. Durch Inkontaktbringen eines Nukleinsäuremoleküls mit einem Alkylierungsmittel, wie etwa Alkyliodid, Iodacetamid, β-Jodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol, können die Monothiophosphodiesterbindungen eines Nukleinsäuremoleküls in eine Phosphotriesterbindung umgewandelt werden. Ebenso können Phosphodiesterbindungen unter Verwendung von Trialkylsilylchloriden in ungeladene Derivate umgewandelt werden. Weiter schließt die Konditionierung die Aufnahme von Nukleotiden ein, welche die Empfindlichkeit gegenüber einer Depurinierung (Fragmentierung während MS) verringern, z. B. ein Purin-Analogon, wie etwa N7- oder N9-Deazapurin-Nukleotide oder RNA-Bausteine oder die Verwendung von Oligonukleotidtriestem oder der Einbau von Phosphorthioatfunktionen, die alkyliert sind, oder die Verwendung von Oligonukleotidmimetika, wie etwa Peptidnukleinsäuren (PNA).
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich Substrat auf einen unlöslichen Träger, auf dem eine Probe entsprechend den hierin beschriebenen Materialien abgelagert ist. Beispiele für geeignete Substrate sind unter anderem Perlen (z. B. Silicagel, Glas mit kontrollierten Poren, Magnete, Agarosegele und quervernetzte Dextrosen (d. h. Sepharose und Sephadex, Zellulose und andere Materialien, von denen der Fachmann weiß, dass sie als feste Trägermatrizen dienen. Beispielsweise können Substrate aus beliebigen der folgenden oder Kombinationen davon gebildet werden: Silicagel, Glas, Magnet, Polystyrol/1% Divinylbenzolharze, wie etwa Wang-Harze, welche Fmoc-Aminosäure-4-(Hydroxymethyl)phenoxymethylcopoly(styrol-1% divinylbenzol (DVD)) Harz, Chlortrityl (2-Chlortritylcloridcopolystyrol-DVB-Harz) Harz sind, Merrifield (chlormethyliertes Copolystyrol-DVB)-Harz, Metall, Kunststoff, Zellulose, quervernetzte Dextrane, wie etwa solche, die unter dem Handelsnamen Sephadex vertrieben werden (Pharmacia), und Agarosegel, wie etwa Gele, die unter dem Handelsnamen Sepharose (Pharmacia) vertrieben werden, wobei es sich um Argarosegele vom Polysaccharidtyp mit Wasserstoffbindungen handelt, und andere derartige Harze und Festphasenträger, die einem Fachmann bekannt sind. Die Trägermatrizen können in beliebiger Gestalt oder Form vorliegen, einschließlich aber nicht eingeschränkt auf: Kapillaren, flache Träger wie etwa Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silizium), Kunststoffmaterialien einschließlich Multiwellplatten oder -membranen (z. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Stifte (z. B. Anordnungen von Stiften, die für die kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind oder Perlen in Vertiefungen flacher Oberflächen wie etwa von Wafern (z. B. Siliziumwafer) mit oder ohne Platten und Perlen.
  • Wie hierin verwendet, ist ein selektiv spaltbarer Linker ein Linker, der unter bestimmten Bedingungen gespalten wird, wie etwa ein photospaltbarer Linker, ein chemisch spaltbarer Linker und ein enzymatisch spaltbarer Linker (d. h. eine Restriktionsendonukleasestelle oder ein Ribonukleotid/RNaseverdau). Der Linker ist zwischen dem Träger und immobilisierter DNA positioniert.
  • Isolierung von Nukleinsäuremolekülen
  • Nukleinsäuremoleküle können aus einer bestimmten biologischen Probe unter Verwendung einer Reihe von Verfahren, die im Fachbereich bekannt sind, isoliert werden, wobei das bestimmte ausgewählte Isolierungsverfahren für die bestimmte biologische Probe geeignet ist. Beispielsweise können Gefriertrocknen und alkalische Lyseverfahren nützlich sein, um Nukleinsäuremoleküle aus festen Materialien zu erhalten; Hitze und alkalische Lyseverfahren können nützlich sein, um Nukleinsäuremoleküle aus Urin zu erhalten und Proteinase K-Extraktion kann verwendet werden, um Nukleinsäure aus Blut zu erhalten (siehe z. B. Rolff et al. (1994) PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer).
  • Um eine geeignete Menge an Nukleinsäuremolekülen zu erhalten, an denen Massenspektrometrie durchgeführt werden soll, ist möglicherweise eine Amplifikation erforderlich. Beispiele für geeignete Amplifikationsverfahren, die hierin verwendet werden können sind u. a.: Klonierung (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989), Polymerasekettenreaktion (PCR) (C. R. Newton und A. Graham, PCR, BIOS Publishers, 1994), Ligasekettenreaktion (LCR) (siehe z. B. Weidmann et. al. (1994) PCR Methods Appl. Band 3, S. 57–64; F. Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:189–93), Strangaustauschamplifikation (SDA) (siehe z. B. Walker et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2670–77) und Variationen wie etwa RT-PCR (siehe z. B. Higuchi et al. (1993) Bio/Technology 11:1026–1030), Allel-spezifische Amplifikation (ASA) und transkriptionsbasierte Verfahren.
  • Immobilisierung von Nukleinsäuremolekülen an festen Trägern
  • Um die massenspektrometrische Analyse zu erleichtern, kann ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die nachgewiesen werden soll, an einem unlöslichen (d. h. einem festen) Träger immobilisiert werden. Beispiele für geeignete feste Träger sind u. a. Perlen (z. B. Silikagel, Glas mit kontrollierten Poren, Magnete, Sephadex/Sepharose, Cellulose), Kapillaren, flache Träger wie etwa Glasfaserfilter, Glasoberflächen, Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silizium), Kunststoffmaterialien einschließlich Multiwellplatten oder -membranen (z. B. aus Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinylidendifluorid), Stifte (z. B. Arrays von Stiften, die für die kombinatorische Synthese oder Analyse geeignet sind oder Perlen in Vertiefungen flacher Oberflächen wie etwa Wafer (z. B. Siliziumwafer) mit oder ohne Filterplatten. Proben, welche Ziel-Nukleinsäuren enthalten, können durch beliebige zahlreicher Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, auf feste Träger übertragen werden. Beispielsweise können Nukleinsäureproben in einzelne Wells eines Substrats, z. B. eines Siliziumchips, übertragen werden, manuell oder unter Verwendung eines Nadel-Mikrodosiergeräts, wie hierin beschrieben. Alternativ kann hierzu ein piezoelektrisches Pipettiergerät zur Übertragung kleiner Nanoliter-Proben an Substrat verwendet werden, was die Durchführung von miniaturisierten Hochdurchsatzanalysen auf einem Chip ermöglicht.
  • Die Immobilisierung kann beispielsweise auf Grundlage einer Hybridisierung zwischen einer Einfang-Nukleinsäuresequenz, die bereits an dem Träger immobilisiert ist und einer komplementären Nukleinsäuresequenz, die ebenfalls in dem Nukleinsäuremolekül, welches die nachzuweisende Nukleinsäuresequenz enthält, enthalten ist, erfolgen (1A). Damit die Hybridisierung zwischen den komplementären Nukleinsäuremolekülen nicht durch den Träger behindert wird, kann die Einfang-Nukleinsäure z. B. eine Spacer-Region mit einer Länge von wenigstens etwa fünf Nukleotiden zwischen dem festen Träger und der Einfang-Nukleinsäuresequenz enthalten. Die gebildete Duplex wird unter dem Einfluss des Laserpulses gespalten und die Desorption kann ausgelöst werden. Das an den festen Träger gebundene Nukleinsäuremolekül kann durch natürliche Oligoribo- oder Oligodesoxyribonukleotide sowie Analoga (z. B. mit Thio-modifiziertem Phosphodiester- oder Phosphotriestergerüst) oder durch Einsatz von Oligonukleotidmimetika wie etwa PNA-Analoga (siehe z. B. Nielsen et al. (1991), Science 254:1497) welche die Basensequenz weniger empfindlich gegenüber einem enzymatischen Abbau machen, und eine gebundene Einfangbasensequenz dargestellt werden.
  • Linker
  • Eine Ziel-Nachweisstelle kann direkt über eine reversible oder irreversible Bindung zwischen einer geeigneten Funktionalität (L') im Zielnukleinsäuremolekül (T) und einer geeigneten Funktionalität (L) im Einfangmolekül an einen festen Träger gebunden sein (1B). Eine reversible Verknüpfung kann derart sein, dass sie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten wird (d. h. eine photospaltbare Bindung wie etwa ein Chargetransfer-Komplex oder eine labile Bindung, die zwischen relativ stabilen organischen Resten gebildet ist).
  • Photospaltbare Linker sind Linker, die bei Einwirkung von Licht gespalten werden (siehe z. B. Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104–107), wodurch das als Ziel gesetzte Mittel bei Einwirkung von Licht freigesetzt wird. Photospaltbare Linker, die bei Einwirkung von Licht gespalten werden, sind bekannt (siehe z. B. Hazum et. al. (1981) in Pept. Proc. Eur. Pept. Symp., 16., Brunfeldt, K (Hrsg.), S. 105–110, welche die Verwendung einer Nitrobenzylgruppe als photospaltbare Schutzgruppe für Cystein beschreiben; Yen et al. (1989) Makromol. Chem. 190:69–82, welcher wasserlösliche photospaltbare Copolymere einschließlich Hydroxypropylmethacrylamid-Copolymer, Glycin-Copolymer, Fluorescein-Copolymer und Methylrhodamin-Copolymer beschreibt; Goldmacher et al. (1992) Bioconj. Chem. 3:104–107, welcher ein Vernetzungsmittel und Reagenz beschreibt, das bei Einwirkung von nahem UV-Licht (350 nm) einem photolytischen Abbau unterliegt; und Senter et al. (1985) Photochem. Photobiol 42:231–237, welcher Nitrobenzyloxycarbonylchlorid-Quervernetzungsreagenzien, die photospaltbare Verknüpfungen bilden, beschreibt), wodurch das als Ziel gesetzte Mittel bei Einwirkung von Licht freigesetzt wird. In bevorzugten Ausführungen wird die Nukleinsäure unter Verwendung der photospaltbaren Linkergruppe, die während der Massenspektrometrie gespalten wird, immobilisiert. Hier bevorzugte photospaltbare Linker sind in den Beispielen genannt.
  • Außerdem kann die Verknüpfung gebildet werden, wenn L' eine quaternäre Ammoniumgruppe ist, wobei in diesem Fall die Oberfläche des festen Trägers vorzugsweise negative Ladungen trägt, die das negativ geladene Nukleinsäuregerüst abstoßen, und so die zur Analyse mittels Massenspektrometer erforderliche Desorption erleichtern. Die Desorption kann entweder durch die von dem Laserpuls erzeugte Wärme und/oder abhängig von L' durch spezifische Absorption von Laserenergie, welche in Resonanz mit dem L' Chromophor ist, erfolgen.
  • Somit kann die L-L'-Chemie vom Typ einer Disulfidbindung sein (chemisch spaltbar, beispielsweise durch Mercaptoethanol oder Dithioerythrol), eines Biotin/Streptavidin-Systems, eines heterobifunktionalen Derivats einer Tritylethergruppe (siehe z. B. Köster et. al. (1990) „A Versatile Acid-Labile Linker for Modification of Synthtic Biomolecules, Tetrahedron Letters 31:7095), die unter schwach sauren Bedingungen sowie unter den Bedingungen der Massenspektrometrie gespalten werden kann, einer Levulinyl-Gruppe, die unter fast neutralen Bedingungen mit Hydrazinium/Azetat-Puffer gespalten werden kann, einer Arginin/Arginin- oder Lysin/Lysin-Bindung, die durch ein Endopeptidase-Enzym wie etwa Trypsin gespalten werden kann oder einer Pyrophosphatbindung, die durch eine Pyrophosphatase gespalten werden kann oder einer Ribonukleotidbindung innerhalb der Oligodesoxynukleotidsequenz, die beispielsweise durch eine Ribonuklease oder Alkali gespalten werden kann.
  • Die Funktionalitäten L und L' können auch einen Chargetransfer-Komplex bilden und dadurch die zeitweilige L-L'-Verknüpfung bilden. Da in vielen Fällen die „Chargetransfer-Bande" durch UV/vis-Spektrometrie nachgewiesen werden kann (siehe z. B. Organic Charge Transfer Complexes by R. Foster, Academic Press, 1969), kann die Laserenergie auf die entsprechende Energie der Chargetransfer-Wellenlänge eingestellt werden und somit kann eine spezifische Desorption von dem festen Träger ausgelöst werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass verschiedene Kombinationen diesem Zweck dienen können und dass die Donor-Funktionalität entweder an den festen Träger oder an das nachzuweisende Nukleinsäuremolekül gekoppelt sein kann oder umgekehrt.
  • Bei noch einem weiteren Ansatz kann eine reversible L-L'-Verknüpfung durch homolytische Bildung relativ stabiler Radikale erzeugt werden. Unter dem Einfluss des Laserpulses erfolgt Desorption (wie oben diskutiert) sowie Ionisierung am Ort der Radikalposition. Ein Fachmann wird erkennen, dass andere organische Radikale gewählt werden können, und dass eine Laserwellenlänge gewählt werden kann, die den für die homolytische Spaltung der Bindung zwischen ihnen benötigten Dissoziationsenergien entspricht (siehe z. B. Reactive Molecules von C. Wentrup, John Wiley & Sons, 1984).
  • Eine Ankerfunktion L' kann auch in eine Zieleinfangsequenz (TCS) unter Verwendung geeigneter Primer während eines Am plifikationsverfahrens eingebaut werden, wie etwa PCR (4), LCR (5) oder Transkriptionsamplifikation (6A).
  • Wenn die Exonuklease-Sequenzierung unter Verwendung von MALDI-TOF MS durchgeführt wird, so wird ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das über sein 5'-Ende an einen festen Träger immobilisiert ist, in einer Richtung mit einer 3'-prozessierenden Exonuklease abgebaut und das Molekulargewicht des abgebauten Nukleotids wird sequenziell bestimmt. Reverse Sanger-Sequenzierung ergibt die Nukleotidsequenz der immobilisierten DNA. Durch Hinzufügen eines selektiv spaltbaren Linkers kann nicht nur die Masse der freien Nukleotide bestimmt werden, sondern bei Entfernung der Nukleotide durch Waschen kann auch die Masse des verbleibenden Fragments nach der Spaltung der DNA vom festen Träger durch MALDI-TOF bestimmt werden. Unter Verwendung selektiv spaltbarer Linker wie etwa der hierin bereitgestellten photospaltbaren und chemisch spaltbaren Linker kann diese Spaltung so gewählt werden, dass sie während der Ionisierungs- und Verdampfungsschritte der MALDI-TOF erfolgt. Dasselbe Grundprinzip trifft für einen 5'-immobilisierten Strang einer doppelsträngigen DNA zu, der abgebaut wird, während er als Duplex vorliegt. Ebenso trifft dies auch zu, wenn eine 5'-prozessierende Exonuklease verwendet wird und die DNA über das 3'-Ende an den festen Träger immobilisiert ist.
  • Wie angemerkt, sind hier wenigstens drei Arten der Immobilisierung vorgesehen: 1) die Zielnukleinsäure wird amplifiziert oder gewonnen (die Zielsequenz oder umgebende DNA-Sequenz muss bekannt sein, um Primer herzustellen, zur Amplifikation oder Isolierung); 2) die Primer-Nukleinsäure wird an dem festen Träger immobilisiert und die Zielnukleinsäure wird daran hybridisiert (dies dient zum Nachweis des Vorliegens von oder zur Sequenzierung einer Zielsequenz in einer Probe); oder 3) eine doppelsträngige DNA (amplifiziert oder isoliert) wird durch Verknüpfung mit einem vorbestimmten Strang immobilisiert, die DNA wird denaturiert, um die Duplex zu beseitigen und dann wird eine hohe Konzentration an komplementärem Primer oder einer DNA mit Identität stromaufwärts der Zielstelle hinzugefügt, es erfolgt ein Strangaustausch und der Primer wird an den immobilisierten Strang hybridisiert.
  • In den Ausführungsformen, bei denen die Primer-Nukleinsäure an dem festen Träger immobilisiert ist und die Zielnukleinsäure daran hybridisiert wird, ermöglicht der Einbau des spaltbaren Linkers, dass die Primer-DNA an dem 5'-Ende immobilisiert wird, so dass freies 3'-OH für die Nukleinsäuresynthese (Extension) verfügbar ist und die Sequenz der „hybridisierten" Ziel-DNA bestimmt werden kann, da die hybridisierte Matrize durch Denaturierung entfernt werden kann und die verlängerten DNA-Produkte für die MALDI-TOF MS von dem festen Träger abgespalten werden können. Ebenso kann bei 3) der immobilisierte Strang verlängert werden, wenn er an die Matrize hybridisiert ist, und von dem Träger abgespalten werden. Somit können durch Sanger-Sequenzierung und die oben erläuterten Primer-Oligo-BasenExtension (PROBE) Extensionsreaktionen unter Verwendung eines immobilisierten Primers mit bekannter Stromaufwärts-DNA-Sequenz, die komplementär zu einer invariablen Region einer Zielsequenz ist, durchgeführt werden. Die Nukleinsäure von der Person wird gewonnen und die DNA-Sequenz einer variablen Region (Deletion, Insertion, Missense-Mutation, welche genetische Prädispositionen oder Erkrankungen hervorrufen oder das Vorhandensein viraler/bakterieller oder Pilz-DNA) wird nicht nur nachgewiesen, sondern die tatsächliche Sequenz und Position der Mutation werden auch bestimmt.
  • In anderen Fällen muss die Ziel-DNA immobilisiert und der Primer hybridisiert werden. Dies erfordert die Amplifikation einer längeren DNA auf Grundlage einer bekannten Sequenz und dann die Sequenzierung der immobilisierten Fragmente (d. h. die verlängerten Fragmente werden an den Träger hybridisiert, aber nicht wie oben beschrieben daran immobilisiert). In diesen Fällen ist es nicht wünschenswert, einen Linker einzubauen, da das MALDI-TOF-Spektrum von der hybridisierten DNA stammt.
  • Es ist nicht erforderlich, die immobilisierte Matrize abzuspalten. Ein beliebiger Linker, von dem ein Fachmann weiß, dass er Nukleinsäuren an feste Träger immobilisiert, kann hier verwendet werden, um die Nukleinsäure an einen festen Träger zu verknüpfen. Die hier bevorzugten Linker sind die selektiv spaltbaren Linker, insbesondere solche, die hierin beispielhaft genannt sind. Andere Linker sind u. a. Säure-spaltbare Linker wie etwa Bismaleimidethoxypropan, säurelabile Trityllinker.
  • Säure-spaltbare Linker, photospaltbare Linker und wärmeempfindliche Linker können ebenfalls verwendet werden, insbesondere dann, wenn es erforderlich sein kann, die angesteuerte Substanz abzuspalten, damit sie leichter für Reaktionen zugänglich ist. Säure-spaltbare Linker sind u. a., sind aber nicht beschränkt auf; Bismaleimidethoxypropan; Adipinsäuredihydrazid-Linker (siehe z. B. Fattom et al. (1992) Infecion & Immun. 60:584–589) sowie säurelabile Transferrin-Konjugate, die einen ausreichenden Abschnitt des Transferrins enthalten, damit ein Eintritt in den intrazellulären Transferrinkreislaufweg ermöglicht ist (siehe z. B. Welhöner et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:4309–4314).
  • Photospaltbare Linker
  • Photospaltbare Linker werden bereitgestellt. Insbesondere werden photospaltbare Linker in Form ihrer Phosphoramidit-Derivate bereitgestellt, zur Verwendung bei der Festphasensynthese von Oligonukleotiden. Die Linker enthalten O-Nitrobenzylgruppen und Phosphatverknüpfungen, die eine vollständige photolytische Abspaltung der Konjugate innerhalb von Minuten bei UV-Bestrahlung ermöglichen. Die verwendeten UV-Wellenlängen werden so gewählt, dass die Oligonukleotide durch die Bestrahlung nicht beschädigt werden und sie liegen vorzugsweise bei etwa 350–380 nm, weiter bevorzugt bei 365 nm. Die hierin bereitgestellten photospaltbaren Linker besitzen eine vergleichbare Kopplungseffizienz zu üblicherweise verwendeten Phosphoamidit-Monomeren (siehe Sinha et al. (1983) Tetrahedron Lett. 24:5843–5846; Sinha et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539–4557; Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49:6123–6194; und Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185–3191).
  • In einer Ausführungsform besitzen die photospaltbaren Linker die Formel I:
    Figure 00420001
    worin R20 ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl oder ω-Hydroxyalkyl ist; R21 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl und Carboxy; R22 Wasserstoff oder (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist; t 0–3 ist und R50 Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform haben die photospaltbaren Linker Formel II:
    Figure 00430001
    worin R20 ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl, ω-Hydroxyalkyl oder Alkyl ist; R21 ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Aryl, Alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl und Carboxy; R22 Wasserstoff oder (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist; und X20 Wasserstoff, Alkyl oder OR20 ist.
  • In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist R20 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy) propyl, 3-Hydroxypropyl oder Methyl; R21 ist ausgewählt aus Wasserstoff, Methyl und Carboxy; R22 ist Wasserstoff oder (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X20 ist Wasserstoff, Methyl oder OR20.
  • In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist R20 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy) propyl; R21 ist Methyl; R22 ist (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X20 ist Wasserstoff. In einer anderen weiter bevorzugten Ausführungsform ist R20 Methyl; R21 ist Methyl, R22 ist (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und X20 ist 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
  • In einer weiteren Ausführungsform haben die photospaltbaren Linker Formel III:
    Figure 00430002
    worin R23 Wasserstoff oder (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist; und R24 ausgewählt ist aus ω-Hydroxyalkoxy, ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkoxy, ω-Hydroxyalkyl und ω- (4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl und unsubstituiert oder an der Alkyl- oder Alkoxykette- mit einer oder mehreren Alkylgruppen substituiert ist; r und s jeweils unabhängig 0–4 sind und R50 Alkyl, Alkoxy, Aryl oder Aryloxy ist. In bestimmten Ausführungsformen ist R24 ω-Hydroxyalkyl oder ω-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)alkyl und an der Alkylkette mit einer Methylgruppe substituiert.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist R23 Wasserstoff oder (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; und R24 ist ausgewählt aus 3-Hydroxypropoxy, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy, 4-Hydroxybutyl, 3-Hydroxy-1-propyl, 1-Hydroxy-2-propyl, 3-Hydroxy-2-methyl-1-propyl, 2-Hydroxyethyl, Hydroxymethyl, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-1-propyl, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-1-propyl und 4,4'-Dimethyloxytrityloxymethyl.
  • In stärker bevorzugten Ausführungsformen ist R23 (Diisopropylamino)(2-cyanoethoxy)P-; r und s sind 0; und R24 ist ausgewählt aus 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-propoxy, 4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl, 2-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)ethyl, 1-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-propyl, 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)-2-methyl-1-propyl und 4,4'-Dimethyloxytrityloxymethyl. R24 ist am meisten bevorzugt 3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propoxy.
  • Herstellung der photospaltbaren Linker
  • A. Herstellung photospaltbarer Linker der Formel I oder II.
  • Photospaltbare Linker der Fomel I oder II können durch die nachstehend beschriebenen Verfahren, durch kleinere Veränderungen der Verfahren, durch Auswahl der geeigneten Ausgangsmaterialien oder durch beliebige andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Ausführliche Vorgehensweisen zur Synthese photospaltbarer Linker der Formel II sind in den Beispielen bereitgestellt.
  • In den photospaltbaren Linkern der Formel II, worin X20 Wasserstoff ist, können die Linker auf folgende Weise hergestellt werden. Alkylierung von 5-Hydroxy-2- nitrobenzaldehyd mit ω-Hydroxyalkylhalogenid, z. B. 3-Hydroxypropylbromid, gefolgt von Schützen des resultierenden Alkohols als z. B. Silylether ergibt einen 5-(ω-Silyloxyalkoxy)-2-nitrobenzaldehyd. Das Hinzufügen einer organometallischen Substanz zu dem Aldehyd liefert einen Benzylalkohol. Organometallische Substanzen, die verwendet werden können, sind u. a. Trialkylaluminium (für Linker, in denen R21 Alkyl ist) wie etwa Trimethylaluminium, Borhydride (für Linker, bei denen R21 Wasserstoff ist) wie etwa Natriumborhydrid oder Metallcyanide (für Linker, bei denen R21 Carboxy- oder Alkoxycarbonyl ist) wie etwa Kaliumcyanid. Bei Metallcyaniden würde das Reaktionsprodukt, ein Cyanhydrin, anschließend unter entweder sauren oder basischen Bedingungen in Gegenwart von entweder Wasser oder einem Alkohol hydrolysiert, um die Verbindungen von Interesse zu erhalten.
  • Die Silylgruppe an der Seitenkette der resultierenden Benzylalkohole kann dann gegen eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe ausgetauscht werden, mittels Desilylierung mit z. B. Tetrabutylamoniumfluorid, um den entsprechenden Alkohol zu erhalten und anschließende Umsetzung mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid. Umsetzung mit z. B. 2-Cyanoethyldiisopropylchlorphosphoramidit liefert Linker, in denen R22 (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
  • Ein spezifisches Beispiel einer Synthese eines photospaltbaren Linkers der Formel II ist in dem folgenden Schema gezeigt, welches auch die Verwendung des Linkers bei der Oligonukleotidsynthese zeigt. Dieses Schema soll nur der Veranschaulichung dienen und in keiner Weise den Rahmen der Erfindung einschränken. Experimentelle Einzelheiten dieser synthetischen Umwandlungen sind in den Beispielen bereitgestellt.
  • Figure 00460001
  • Bei der Synthese der Linker der Formel II, worin X20 OR20 ist, wird 3,4-Dihydroxyacetophenon selektiv an dem 4-Hydroxyl durch Umsetzung mit z. B. Kaliumcarbonat und einem Silylchlorid geschützt. Anstelle des Acetophenons können Benzoatester, Propiophenone, Butyrophenone, etc. verwendet werden. Das resultierende 4-Silyloxy-3-hydroxyacetophenon wird dann an dem 3-Hydroxyl mit einem Alkylhalogenid (für Linker, bei denen R20 Alkyl ist) alkyliert und desilyliert mit z. B. Tetrabutylamoniumfluorid, um ein 3-Alkoxy-4-hydroxyacetophenon zu erhalten. Diese Verbindung wird dann an dem 4-Hydroxyl alkyliert, durch Umsetzung mit einem ω-Hydroxyalkylhalogenid, z. B. 3-Hydroxypropylbromid, um ein 4-(ω-Hydroxyalkoxy)-3-alkoxyacetophenon zu erhalten. Der Seitenkettenalkohol wird dann als Ester, z. B. Acetat, geschützt. Diese Verbindung wird dann an der 5-Position nitriert, z. B. mit konzentrierter Salpetersäure, um die entsprechenden 2-Nitroacetophenone zu erhalten. Die Verseifung des Seitenkettenesters mit z. B. Kaliumcarbonat und Reduktion des Ketons z. B. mit Natriumborhydrid in beliebiger Reihenfolge ergibt einen 2-Nitro-4-(ω-hydroxyalkoxy)-5-alkoxybenzylalkohol.
  • Selektives Schützen des Seitenkettenalkohols als entsprechender 4,4'-Dimethoxytritylether wird dann durch Umsetzung mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid bewerkstelligt. Die weitere Umsetzung mit z. B. 2-Cyanoethyl-diisopropylchlorphosphoramidit liefert Linker, bei denen R22 (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
  • Ein spezifisches Beispiel für die Synthese eines photospaltbaren Linkers der Formel II ist in dem nachstehenden Schema gezeigt. Dieses Schema soll nur der Veranschaulichung dienen und in keiner Weise den Rahmen der Erfindung einschränken. Ausführliche experimentelle Vorgehensweisen für die gezeigten Umwandlungen sind in den Beispielen zu finden.
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • B. Herstellung photospaltbarer Linker der Formel III
  • Photospaltbare Linker der Formel III können durch die nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden, durch kleine Veränderungen der Verfahren durch Auswahl geeigneter Ausgangsmaterialien oder durch andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Im Allgemeinen werden photospaltbare Linker der Formel III aus ω-Hydroxyalkyl- oder Alkoxyarylverbindungen, insbesondere ω-Hydroxyalkyl- oder -alkoxybenzolen hergestellt. Diese Verbindungen sind kommerziell erhältlich oder können aus einem ω-Hydroxyalkylhalogenid (z. B. 3-Hydroxypropylbromid) und entweder Phenyllithium (für die ω-Hydroxyalkylbenzole) oder Phenol (für die ω-Hydroxyalkoxybenzole) hergestellt werden. Acylierung der ω-Hydroxylgruppe (z. B. als Acetatester) und anschließende Friedel-Craft-Acylierung des aromatischen Rings mit einem 2-Nitrobenzoylchlorid liefert ein 4-(ω-Acetoxyalkyl oder Alkoxy)-2-nitrobenzophenon. Die Reduktion des Ketons mit z. B. Natriumborhydrid und die Verseifung des Seitenkettenesters werden in beliebiger Reihe durchgeführt, um ein 2-Nitrophenyl-4-(hydroxyalkyl oder -alkoxy)phenylmethanol zu erhalten. Das Schützen der terminalen Hydroxylgruppe als entsprechender 4,4'-Dimethoxytritylether wird durch Umsetzung mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid erreicht. Die Benzylhydroxylgruppe wird dann umgesetzt mit z. B. 2-Cyanoethyl-diisopropylchlorphosphoamidit, um Linker der Formel II zu bilden, bei denen R23 (Dialkylamino)(ω-cyanoalkoxy)P- ist.
  • Andere photospaltbare Linker der Formel III können hergestellt werden, indem die ω-Hydroxyalkyl- oder -alkoxybenzole der obigen Synthese durch 2-Phenyl-1-propanol oder 2-Phenylmethyl-1-propanol ersetzt werden. Diese Verbindungen sind kommerziell erhältlich, sie können aber auch durch Umsetzung von z. B. Phenylmagnesiumbromid oder Benzylmagnesiumbromid mit dem erforderlichen Oxiran (d. h. Propylenoxid) in Gegenwart katalytischer Kupferionen hergestellt werden.
  • Chemisch spaltbare Linker
  • Eine Vielfalt chemisch spaltbarer Linker kann verwendet werden, um eine spaltbare Bindung zwischen die immobilisierte Nukleinsäure und den festen Träger einzubringen. Säure-labile Linker sind hier vorzugsweise chemisch spaltbare Linker für die Massenspektrometrie, insbesondere MALDI-TOF MS, da die säurelabile Bindung während der Konditionierung der Nukleinsäure bei Zugabe der 3-HPA-Matrixlösung gespalten wird. Die säurelabile Bindung kann als eine separate Linkergruppe eingefügt werden, z. B. die säurelabilen Tritylgruppen (siehe 68, Beispiel 16) oder sie kann in einen synthetischen Nukleinsäurelinker eingebaut werden, indem ein oder mehrere Silyl-Internukleosidbrücken unter Verwendung von Diisopropylsilyl eingefügt werden, wobei Diisopropylsilyl-verknüpfte Oligonukleotid-Analoga gebildet werden. Die Diisopropylsilyl-Brücke ersetzt Diphosphodiesterbindungen im DNA-Gerüst und führt unter schwach sauren Bedingungen wie etwa 1,5% Trifluoressigsäure (TFA) oder 3-HPA/1% TFA MALDI-TOF-Matrixlösung zur Einfügung einer oder mehrerer Intrastrangbrüche in dem DNA-Molekül. Verfahren zur Herstellung von Diisopropylsilyl-verknüpften Oligonukleotid-Vorläufern und Analoga sind dem Fachmann bekannt (siehe z. B. Saha et al. (1993) J. Org. Chem. 58:7827–7831). Diese Oligonukleotid-Analoga können leicht unter Verwendung von Festphasenoligonukleotid-Syntheseverfahren unter Verwendung Diisopropylsilyl-derivatisierter Desoxyribonukleoside hergestellt werden.
  • Nukleinsäurekonditionierung
  • Vor der massenspektrometrischen Analyse kann es nützlich sein, Nukleinsäuremoleküle zu „konditionieren", beispielsweise, um die für das Verdampfen erforderliche Laserenergie zu verringern und/oder um Fragmentierung zu minimieren. Die Konditionierung wird vorzugsweise durchgeführt, während eine Zieldetektionsstelle immobilisiert ist. Ein Beispiel der Konditionierung ist die Modifikation des Phosphodiestergerüsts des Nukleinsäuremoleküls (z. B. Kationenaustausch), was nützlich sein kann, um eine Peakverbreiterung aufgrund von Heterogenität der pro Nukleotid-Einheit gebundenen Kationen zu vermeiden. Durch Inkontaktbringen eines Nukleinsäuremoleküls mit einem Alkylierungsmittel wie etwa Alkyliodid, Iodacetamid, β-Jodethanol oder 2,3-Epoxy-1-propanol können die Monothiophosphodiesterbindungen eines Nukleinsäuremoleküls in eine Phosphotriesterbindung umgewandelt werden. Ähnlich können Phosphodiesterbindungen eines Nukleinsäuremoleküls in eine Phosphotriesterbindung umgewandelt werden. Ähnlich können Phosphodiesterbindungen unter Verwendung von Trialkylsilylchloridenin ungeladene Derivate umgewandelt werden. Weiter umfasst die Konditionierung den Einbau von Nukleotiden, welche die Empfindlichkeit gegenüber Depurinierung (Fragmentierung während MS) verringern, z. B. ein Purin-Analogon wie etwa N7- oder N9-Desazapurin-Nukleotide oder RNA-Baublöcke oder durch Verwendung von Oligonukleotidtriestern oder Einbau von Phosphorthioatfunktionen, die alkyliert sind oder durch Verwendung von Oligonukleotidmimetika wie etwa PNA.
  • Multiplexreaktionen
  • Für bestimmte Anwendungen kann es nützlich sein, gleichzeitig mehr als einen (mutierten) Lokus an einem bestimmten eingefangenen Nukleinsäurefragment (auf einem Punkt eines Arrays) zu bestimmen oder es kann nützlich sein, eine parallele Verarbeitung durchzuführen, indem Oligonukleotid- oder Oligonukleotidmimetika-Anordnungen auf verschiedenen festen Trägern verwendet werden. „Multiplexen" kann durch verschiedene unterschiedliche Methoden erreicht werden. Beispielsweise können mehrere Mutationen gleichzeitig an einer Zielsequenz bestimmt werden, indem entsprechende Detektor (Sonden)-Moleküle verwendet werden (z. B. Oligonukleotide oder Oligonukleotidmimetika). Die Molekulargewichtsunterschiede zwischen den Detektor-Oligonukleotiden D1, D2 und D3 müssen ausreichend groß sein, so dass eine gleichzeitige Detektion (Multiplexen) möglich ist. Dies kann entweder über die Sequenz selbst (Zusammensetzung oder Länge) erzielt werden oder indem massenverändernde Funktionalitäten M1–M3 in das Detektoroligonukleotid eingefügt werden (siehe 2).
  • Massenveränderung von Nukleinsäuren
  • Massenmodifizierende Gruppen können angebracht werden, beispielsweise entweder an das 5'-Ende des Oligonukleotids (M1), an die Nukleobase (oder -basen) (M2, M7), an das Phosphatgerüst (M3) und an die 2'-Position des Nukleosids (der Nukleoside) (M4, M6) und/oder an die terminale 3'-Position (M5). Beispiele massenmodifizierender Gruppen sind u. a. beispielsweise ein Halogen, ein Azid oder eine Gruppe vom Typ XR, worin X eine Verknüpfungsgruppe ist und R eine massenverändernde Funktionalität ist. Die massenmodifizierende Funktionalität kann somit eingesetzt werden, um definierte Masseninkremente in das Oligonukleotid einzubringen.
  • Die massenverändernde Funktionalität kann sich an unterschiedlichen Positionen innerhalb der Nukleotid-Gruppe befinden (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,547,835 und internationale PCT-Anmeldung Nr. WO 94/21822 ). Beispielsweise kann die massenverändernde Gruppe M entweder an der Nukleobase angebracht sein, M2 (im Fall der c7-Desazanukleoside auch an C-7, M7), an die Triphosphatgruppe an dem alpha-Phosphat, M3, oder an die 2'-Position des Zuckerrings des Nukleosidtriphosphats, M4 und M6. An der Phosphodiesterbindung eingefügte Modifikationen (M4) wie etwa mit alpha-Thionukleosidtriphosphaten haben den Vorteil, dass diese Modifikationen eine exakte Watson-Crick-Basenpaarung nicht beeinträchtigen und außerdem die einstufige post-synthetische ortsspezifische Modifikation des vollständigen Nukleinsäuremoleküls z. B. über Alkylierungsreaktionen ermöglichen (siehe z. B. Nakamaye et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:9947–59). Besonders bevorzugte massenmodifizierende Funktionalitäten sind Bor-modifizierte Nukleinsäuren, da sie durch Polymerasen besser in Nukleinsäuren eingefügt werden (siehe z. B. Porter et al. (1995) Biochemistry 34: 11963–11969; Hasan et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24:2150–2157; Li et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:4495–4501).
  • Außerdem kann die massenmodifizierende Funktionalität derart hinzugefügt werden, dass die Kettenbeendigung beeinflusst wird, wie etwa indem sie an der 3'-Position des Zuckerrings in dem Nukleosidtriphosphat angebracht wird, M5. Für den Fachmann ist erkennbar, dass viele Kombinationen in den hier bereitgestellten Verfahren eingesetzt werden können. Ebenso wird der Fachmann erkennen, dass kettenverlängernde Nukleosidtriphosphate ebenfalls auf ähnliche Weise massenmodifiziert werden können, mit zahlreichen Variationen und Kombinationen der Funktionalitäten und Anbringungspositionen.
  • Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, kann die Massenmodifikation M für X in XR eingefügt werden, sowie unter Verwendung von Oligo/Polyethylenglykolderivaten für R. Das massenmodifizierende Inkrement in diesem Fall ist 44, d. h. es können fünf verschiedene massenmodifizierende Spezies erzeugt werden, indem nur M von 0 bis 4 variiert wird, so dass Masseneinheiten von 45 (m = 0), 89 (m = 1), 133 (m = 2), 177 (m = 3) und 221 (m = 4) an das Nukleinsäuremolekül hinzugefügt werden (z. B. Detektoroligonukleotid (D) bzw. Nukleosidtriphosphate (6(C)). Die Oligo/Ethylenglykole können auch monoalkyliert sein, durch ein Niederalkyl wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl und dergleichen. Eine Auswahl von verknüpfenden Funktionalitäten, X, wird ebenfalls veranschaulicht. Weitere Chemikalien können in den massenmodifizierten Verbindungen verwendet werden (siehe beispielsweise solche, die in Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein, Herausgeber, IRL Press, Oxford, 1991 beschrieben sind).
  • In noch einer weiteren Ausführungsform können verschiedene andere massenmodifizierende Funktionalitäten R als Oligo/Polyethylenglykole ausgewählt und über geeignete Verknüpfungschemikalien X angebunden werden. Eine einfache Massenmodifikation kann erzielt werden, indem H gegen Halogene wie etwa F, Cl, Br und/oder I oder Pseudohalogene wie etwa CN, SCN, NCS ausgetauscht wird oder indem verschiedene Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen wie etwa Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, t-Butyl, Hexyl, Phenyl, substituiertes Phenyl, Benzyl oder funktionelle Gruppen wie etwa CH2F, CHF2, CF3, Si(CH3)3, Si(CH3)2(C2H5), Si(CH3)(C2H5)2, Si(C2H5)3 verwendet werden. Noch eine weitere Massenmodifikation kann erhalten werden, indem Homo- oder Heteropeptide über das Nukleinsäuremolekül (z. B. Detektor (D)) oder Nukleosidtriphosphate angebracht werden. Ein Beispiel, das zur Erzeugung massenmodifizierender Spezies mit einem Masseninkrement von 57 nützlich ist, ist das Anbringen von Oligoglycinen, z. B. werden Massenmodifikationen von 74 (r = 1, m = 0), 131 (r = 1, m = 1), 188 (r = 1, m = 2), 245 (r = 1, m = 3) erzielt. Einfache Oligoamide können verwendet werden, z. B. sind Massenmodifikationen von 74 (r = 1, m = 0), 88 (r = 2, m = 0), 102 (r = 3, m = 0), 116 (r = 4, m = 0) etc. erhältlich. Variationen zu den hierin beschriebenen Hinzufügungen sind für einen Fachmann offensichtlich.
  • Verschiedene massenmodifizierte Nachweisoligonukleotide können verwendet werden, um gleichzeitig alle möglichen Varianten/Mutanten nachzuweisen (6B). Alternativ können alle 4 Basen Permutationen an der Stelle einer Mutation nachgewiesen werden, indem ein Nachweis-Oligonukleotid entworfen und positioniert wird, so dass es als Primer für eine DNA/RNA-Polymerase dient, mit unterschiedlichen Kombinationen von verlängernden und terminierenden Nukleosidtriphosphaten (6C). Beispielsweise können Massenmodifikationen auch während des Amplifikationsverfahrens eingefügt werden.
  • 3 zeigt eine anderes Multiplexdetektionsformat, bei dem eine Differenzierung bewerkstelligt wird, indem verschiedene spezifische Einfangsequenzen eingesetzt werden, die positonsspezifisch auf einer flachen Oberfläche (z. B. einem „Chip-Array") immobilisiert sind. Wenn verschiedene Zielsequenzen T1–Tn vorhanden sind, so Wechselwirken ihre Zieleinfangstellen TCS1–TCSn spezifisch mit komplementären immobilisierten Einfangsequenzen C1–Cn. Der Nachweis wird erzielt, indem Nachweis-Oligonukleotide D1–Dn mit geeignetem Massenunterschied eingesetzt werden, wobei es sich um massenmodifizierende Funktionalitäten M1–Mn handelt.
  • Massenspektrometrische Verfahren für DNA
  • Verfügbare massenspektrometrische Formate, die hier verwendet werden können, sind u. a. die Ionisations-(I-) Techniken, wie etwa Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Ionisation (MALDI), Elektronenspray (ESI) (z. B. kontinuierlich oder gepulst) und verwandte Methoden (z. B. Ionenspray, Thermospray, Schneller Atombeschuss (FAB)) und Massiver Cluster-Stoß (massive cluster impact, MCI); diese Ionenquellen können in Verbindung mit Nachweisformaten, einschließlich Linearfeldern, Flugzeit (TOF), Einzel- oder Mehrfachquadrupol, Einzel- oder Mehrfachmagnetsektor, FourierTransformations-Ionen-Cyclotron-Resonanz (FTICR), Ionenfalle oder Kombinationen davon verwendet werden, um einen Hybriddetektor zu erhalten (z. B. Ionenfalle-Flugzeit). Für die Ionisierung können zahlreiche Kombinationen von Matrix/Wellenlänge einschließlich der Herstellung eines gefrorenen Analyten (MALDI) oder Kombinationen von Lösungsmitteln (ESI) eingesetzt werden.
  • Da ein normales DNA-Molekül vier Nukleotid-Einheiten (A, T, C, G) enthält und deren jeweilige Masse einzigartig ist (monoisotope Massen 313,06, 304,05, 289,05 bzw. 329,05 Da), kann durch eine exakte Massenbestimmung die mögliche Basenzusammensetzung dieser DNA definiert oder eingegrenzt werden. Erst über 4900 Da hat jedes Einheitsmolekulargewicht mindestens eine zulässige Zusammensetzung; unter allen 5-meren gibt es nur ein nicht-einzigartiges Nominal-Molekulargewicht, unter den 8-meren gibt es 20. Für diese und größere Oligonukleotide können diese Massenüberlappungen mit der Massengenauigkeit von ca. 1/105 (etwa 10 Teile pro Million, ppm) aufgelöst werden, die mit hochauflösender FTICR MS zur Verfügung steht. Für das 25-mer A5T20 verringern sich die 20 degenerierten Zusammensetzungen bei einer Messung mit ±0,5 Da auf drei (A5T20, T4C12G9, AT3C4G16), wenn mit einer Genauigkeit von 2 ppm gemessen wird. Durch gegebene Einschränkungen der Zusammensetzung (z. B. das Vorhandensein oder Fehlen einer der vier Basen in dem Strang) können diese weiter verringert werden (siehe nachstehend).
  • Instrumente mit mittlerer Auflösung, einschließlich, aber nicht ausschließlich Krumm-Feld-Reflektron-Instrumente oder Flugzeit-MS-Instrumente mit verzögerter Extraktion können ebenfalls zu einer verbesserten DNA-Detektion für die Sequenzierung oder Diagnostik führen. Diese sind jeweils dazu in der Lage, eine 9 Da-(Δm (A-T)) Verschiebung in ≥ 30-mer- Strängen nachzuweisen, die beispielsweise durch Primer-Oligo-Basen-Extension (PROBE) oder Kompetitive Oligonukleotid-Einzelbasen-Extension (COSBE) Sequenzierung erzeugt wurden oder zum direkten Nachweis kleiner amplifizierter Produkte.
  • Sequenzierung durch Erzeugung spezifisch endender Fragmente
  • Eine genaue Sequenzbestimmung einer relativ großen Ziel-Nukleinsäure kann erreicht werden, indem spezifisch endende Fragmente der Ziel-Nukleinsäure erzeugt werden, die Masse jedes Fragments durch Massenspektrometrie bestimmt wird und die Fragmente geordnet werden, um die Sequenz der größeren Ziel-Nukleinsäure zu bestimmen. Die spezifisch endenden Fragmente sind partielle basenspezifisch terminierte Fragmente.
  • Ein Verfahren zur Herstellung basenspezifisch terminierter Fragmente beinhaltet die Verwendung einer basenspezifischen Ribonuklease nach beispielsweise einer Transkriptionsreaktion. Bevorzugte basenspezifische Ribonukleasen sind auswählt aus: T1-Ribonuklease (G-spezifisch), U2-Ribonuklease (A-spezifisch), PhyM-Ribonuklease (U-spezifisch) und Ribonuklease A (U/C-spezifisch). Andere effiziente und basenspezifische Ribonukleasen können unter Verwendung des in Beispiel 21 beschriebenen Tests identifiziert werden. Vorzugsweise werden modifizierte Nukleotide zur Transkriptionsreaktion mit unmodifizierten Nukleotiden gegeben. Am stärksten bevorzugt werden die modifizierten Nukleotide und unmodifizierte Nukleotide zur Transkriptionsreaktion in geeigneten Konzentrationen gegeben, sodass beide Einheiten in einer bevorzugten Rate von etwa 1:1 eingebaut werden. Alternativ können zwei separate Transkriptionen der Ziel-DNA-Sequenz, eine mit den modifizierten und eine mit den unmodifizierten Nukleotiden, durchgeführt und die Ergebnisse verglichen werden. Bevorzugte modifizierte Nukleotide sind u. a.: Bor- oder Brom-modifizierte Nukleotide (Porter et al. (1995) Biochemistry 34:11963–1196 Hasan et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24:2150–2157; Li et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:4495–4501), α-Thio-modifizierte Nukleotide sowie massenmodifizierte Nukleotide, wie vorstehend beschrieben.
  • Noch ein weiteres Verfahren zur Erzeugung basenspezifisch terminierter Fragmente umfasst das Inkontaktbringen einer geeigneten Menge der Ziel-Nukleinsäure mit einer spezifischen Endonuklease. Vorzugsweise wird das ursprüngliche 5- und/oder 3'-Ende der Nukleinsäure markiert, um das Ordnen der Fragmente zu erleichtern. Die Markierung des 3'-Endes ist besonders dann bevorzugt, wenn in vitro-Nukleinsäuretranskripte analysiert werden, so dass der Einfluss von 3'-Heterogenität, vorzeitiger Terminierung und unspezifischer Verlängerung minimiert werden kann. 5'- und 3'-Markierungen können natürlich (z. B. ein 3'-Poly-A-Schwanz oder 5'- oder 3'-Heterogenität) oder künstlich sein. Bevorzugte 5'- und/oder 3'-Markierungen werden aus den vorstehend für die Massenmodifikation beschriebenen Molekülen ausgewählt.
  • Die hier bereitgestellten Verfahren werden durch die nachstehenden Beispiele 21 und 27 weiter veranschaulicht, die nicht als in irgendeiner Weise einschränkend zu verstehen sind. Die übrigen Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung.
  • BEISPIEL 1
  • MALDI-TOF-Desorption von Oligonukleotiden direkt auf festen Trägern
  • 1 g CPG (Glas mit kontrollierten Poren) wurde mit 3-(Triethoxysilyl)epoxypropan funktionalisiert, um OH-Gruppen auf der Polymeroberfläche zu bilden. Eine standardmäßige Oligonukleotidsynthese mit 13 mg des OH-CPG wurde in einem DNA-Synthesegerät (Milligen, Modell 7500) durchgeführt, wobei β-Cyanoethylphosphoramidite (Köster et al. (1994) Nucleic Acids Res. 12:4539) und TAC-N-Schutzgruppen (Köster et al. (1991) Tetrahedron 37:362) eingesetzt wurden, um eine 3'-T5-50-mer-Oligonukleotidsequenz zu synthetisieren, in der 50 Nukleotide komplementär zu einer „hypothetischen" 50-mer- Sequenz sind. T5 dient als Spacer. Die Entfernung der Schutzgruppe mit gesättigtem Ammoniak in Methanol bei Raumtemperatur für 2 Stunden lieferte gemäß der Bestimmung der DMT-Gruppe CPG, die etwa 10 umol 55-mer/g CPG enthielten. Dieses 55-mer diente als Matrize für Hybridisierungen mit einem 26-mer (mit 5'-DMT-Gruppe) und einem 40-mer (ohne DMT-Gruppe). Das Reaktionsvolumen beträgt 100 μl und enthält etwa 1 nmol CPG-gebundenes 55-mer als Matrize, eine äquimolare Menge an Oligonukleotid in Lösung (26-mer oder 40-mer) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 und 25 mM NaCl. Das Gemisch wurde für 10 min bei 65°C erhitzt und während 30' auf 37°C abgekühlt (Annealing). Das Oligonukleotid, das nicht an die polymergebundene Matrize hydridisiert hatte, wurde durch Zentrifugation und drei anschließende Wasch-/Zentrifugationsschritte mit jeweils 100 ul eiskaltem 50 mM Ammoniumcitrat entfernt. Die Perlen wurden luftgetrocknet und mit Matrixlösung (3-Hydroxypicolinsäure/10 mM Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser 1:1) gemischt und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse sind in den 10 und 11 gezeigt.
  • BEISPIEL 2
  • Elektronenspray- (ES) Desorption und Unterscheidung eines 18-mers und eines 19-mers
  • DNA-Fragmente mit einer Konzentration von 50 pMol/ul in 2-Propanol/10 mM Ammoniumcarbonat (1/9 v/v) wurden gleichzeitig mittels eines Elektronenspray-Massenspektrometers analysiert.
  • Die erfolgreiche Desorption und Unterscheidung eines 18-mers und eines 19-mers durch Elektronenspray-Massenspektrometrie ist in 12 gezeigt.
  • BEISPIEL 3
  • Nachweis der Cystische-Fibrose-Mutation ΔF508 durch Ei nschritt-Didesoxy-Extension und Analyse durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Kompetitive-Oligonukleotid-Einzel-Basen-Extension = COSBE)
  • Das Prinzip des COSBE-Verfahrens ist in 13 gezeigt, wobei N der Normal- bzw. M der Mutanten-Nachweisprimer ist.
  • MATERIALIEN und METHODEN
  • PCR-Amplifikation und Strangimmobilisierung. Die Amplifikation wurde mit Exon10-spezifischen Primern unter Verwendung von Standard-PCR-Bedingungen (30 Zyklen: 1' bei 95°C, 1' bei 55°C, 2' bei 72°C) durchgeführt; der reverse Primer war in 5' mit Biotin markiert und säulengereinigt (Oligopurification Cartridge, Cruachem). Nach der Amplifikation wurden die amplifizierten Produkte durch Säulentrennung (Qiagen Quickspin) aufgereinigt und an Streptavidin-beschichteten Magnetperlen (Dynabeads, Dynal, Norwegen) gemäß deren Standardprotokoll immobilisiert; DNA wurde unter Verwendung von 0,1 M NaOH denaturiert und mit 0,1 M NaOH, 1 × B + W-Puffer und TE-Puffer gewaschen, um den nicht-biotinylierten Sense-Strang zu entfernen.
  • COSBE-Bedingungen. Die Perlen, welche den ligierten Antisense-Strang enthielten wurden in 18 μl Reaktionsmix 1 (2 μl 10X Taq-Puffer, 1 μl (1 Einheit) Taq-Polymerase, 2 μl 2 mM dGTP und 13 μl H2O) resuspendiert und bei 80°C für 5' inkubiert, bevor Reaktionsmix 2 (100 ng jedes der COSBE-Primer) zugegeben wurde. Die Temperatur wurde auf 60°C verringert, und die Gemische wurden für einen Hybridisierungs-/Extensionszeitraum von 5' inkubiert; die Perlen wurden dann in 25 mM Triethylammoniumacetat (TEAA) und anschließend in 50 mM Anmmoniumcitrat gewaschen.
  • Primer-Sequenzen. Alle Primer wurden auf einem Perseptive-Biosystems Expedite 8900-DNA-Synthesegerät unter Verwendung von herkömmlicher Phosphoramidit-Chemie (Sinha et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 4539) hergestellt. Die COSBE-Primer (die jeweils einen absichtlichen Mismatch eine Base vor dem 3'-Terminus enthielten) waren diejenigen, die in einer früheren ARMS-Studie verwendet wurden (Ferrie et al. (1992) Am. J. Hum. Genet. 51:251–262), mit der Ausnahme, dass zwei Basen vom 5'-Ende des normalen entfernt waren:
    Figure 00600001
  • Massenspektrometrie. Nach dem Waschen wurden die Perlen in 1 μl 18 Mohm/cm H2O resuspendiert. Jeweils 300 nl der Matrix-(Wu et al. (1993), Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:142–146) Lösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,7 M zweibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O/CH3CN) und der resuspendierten Perlen (Tang et al. (1995), Rapid Commun. Mass Spectrom. 8:727–730) wurden auf einem Probenziel gemischt und an Luft trocknen gelassen. Bis zu 20 Proben wurden punktförmig auf eine Sondenzielscheibe aufgetragen, die in den Quellenbereich eines unmodifizierten Thermo Bioanalysis (früher Finnigan) Visions 2000 MALDI-TOF eingebracht wurde, das im Reflektronmodus mit 5 bzw. 20 kV an der Ziel- bzw. der Umwandlungsdynode betrieben wurde. Die theoretischen durchschnittlichen Molekulargewichte (Mr(ber.)) wurden aus den Atomzusammensetzungen berechnet. Vom Händler bereitgestellte Software wurde verwendet, um die Peakflächenmittelpunkte unter Verwendung von externer Kalibrierung zu bestimmen; 1,08 Da wurden davon abgezogen, um auf die Masse des ladungstragenden Protons zu korrigieren, wobei die Text-Mr(exp.) Werte erhalten wurden.
  • Schema. Nach dem Anlagern an die gebundene Matrize wurde den N- und M-Primern (8508,6 bzw. 9148,0 Da) dGTP angeboten; nur Primer mit richtiger Watson-Crick-Basenpaarung an der variablen Position (V) werden durch die Polymerase verlängert. Wenn also V mit der 3'-terminalen Base von N paart, so wird N zu einem 8837,9 Da-Produkt (N + 1) verlängert. Ebenso wird dann, wenn V richtig an den M-Terminus passt, M auf ein 9477,3 Da M + 1-Produkt verlängert.
  • Ergebnisse
  • Die 14–18 zeigen die repräsentativen Massenspektren von COSBE-Reaktionsprodukten. Bessere Ergebnisse wurden erhalten, wenn die amplifizierten Produkte gereinigt wurden, bevor der biotinylierte Antisense-Strang gebunden wurde.
  • BEISPIEL 4
  • Unterscheidung von menschlichen Apolipoprotein E-Isoformen durch Massenspektrometrie
  • Apolipoprotein E (Apo E), eine Proteinkomponente von Lipoproteinen, spielt eine wesentliche Rolle im Lipidstoffwechsel. Beispielsweise ist es am Cholesterintransport, am Stoffwechsel von Lipoprotein-Partikeln, an der Immunregulation und an der Aktivierung mehrerer lipolytischer Enzyme beteiligt.
  • Es gibt drei übliche Isoformen von menschlichem Apo E (codiert durch die Allele E2, E3 und E4). Das häufigste ist das E3-Allel. Es wurde gezeigt, dass das E2-Allel den Cholesterinspiegel im Plasma verringert und daher eine Schutzwirkung gegen die Entwicklung von Atherosklerose besitzen kann. Die DNA, die einen Abschnitt des E2-Allels codiert, ist in SEQ ID Nr. 130 dargestellt. Die E4-Isoform schließlich wurde mit erhöhten Cholesterinspiegeln in Verbindung gebracht, was zu einer Prädisposition für Atherosklerose führt. Daher ist die Identität des Apo E-Allels eines bestimmten Individuums eine wichtige Risikodeterminante für die Entwicklung einer kardiovaskulären Erkrankung.
  • Wie in 19 gezeigt ist, kann eine Probe einer DNA, die Apolipoprotein E kodiert, von einem Subjekt erhalten und amplifiziert werden (z. B. mittels PCR); und das amplifizierte Produkt kann unter Verwendung eines geeigneten Enzyms (z. B. Cfol) verdaut werden. Der erhaltene Restriktionsverdau kann dann durch eine Vielfalt von Mitteln analysiert werden. Wie in 20 gezeigt ist, weisen die drei Isotypen von Apolipoprotein E (E2, E3 und E4) unterschiedliche Nukleinsäuresequenzen auf und haben daher auch unterscheidbare Molekulargewichtswerte.
  • Wie in 21A–C gezeigt ist, zeigen unterschiedliche Apolipoprotein E-Genotypen unterschiedliche Restriktionsmuster in einem 3,5%-igen MetPhor-Agarosegel oder einem 12%-igen Polyacrylamidgel Wie in den 22 und 23 gezeigt ist, können die verschiedenen Apolipoprotein E-Genotypen auch genau und schnell durch Massenspektrometrie bestimmt werden.
  • BEISPIEL 5
  • Nachweis des Hepatitis-B-Virus in Serumproben
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Probenherstellung
  • Die Phenol/Chloroform-Extraktion viraler DNA und die abschließende Ethanol-Präzipitation wurden gemäß Standardprotokollen durchgeführt.
  • Erste PCR
  • Jede Reaktion wurde mit 5 μl der DNA-Präparation aus Serum durchgeführt. 15 pmol jedes Primers und 2 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Weiterstadt, Deutschland) wurden verwendet. Die Endkonzentration jedes dNTPs betrug 200 μMM, das Endvolumen der Reaktion betrug 50 μl. 10 × PCR-Puffer (Perkin Elmer, Weiterstadt, Deutschland) enthielt 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 0,01% Gelatine (w/v). Primer-Sequenzen:
    Figure 00630001
  • Geschachtelte PCR:
  • Jede Reaktion wurde entweder mit 1 μl der ersten Reaktion bzw. mit einer 1:10-Verdünnung der ersten PCR als Matrize durchgeführt. 100 pMol jedes Primers, 2,5 u Pfu(exo-)DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), eine Endkonzentration von 200 μM jedes dNTPs und 5 μl 10 × Pfu-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,75, 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 1% Triton X-100, 1 mg/ml BSA, (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) wurden in einem Endvolumen von 50 μl verwendet. Die Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) unter Verwendung des folgenden Programms durchgeführt: 92°C für 1 Minute, 60°C für 1 Minute und 72°C für 1 Minute mit 20 Zyklen. Sequenz der Oligodesoxynukleotide (HPLC-gereinigt bezogen von MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland):
    Figure 00630002
  • Reinigung der amplifizierten Produkte:
  • Zur Aufzeichnung jedes Spektrums wurde eine PCR, 50 μl, (durchgeführt wie oben beschrieben) verwendet. Die Reinigung erfolgte nach folgendem Verfahren: Ultrafiltration wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC-Filtrationseinheiten (Millipore, Eschborn, Deutschland) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit einer Zentrifugation bei 8000 U/min für 20 Minuten durchgeführt. 25 μl (10 μg/μl) Streptavidin-Dynabeads (Dynal, Hamburg, Deutschland) wurden gemäß den Angaben des Herstellers hergestellt und in 25 μl B/W-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) resuspendiert. Diese Suspension wurde zu den noch in der Filtrationseinheit befindlichen PCR-Proben zugegeben, und das Gemisch wurde unter leichtem Schütteln für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Suspension wurde in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen überführt, und der Überstand wurde mit Hilfe eines Magnet-Partikel-Sammlers, MPC, (Dynal, Hamburg, Deutschland) entfernt. Die Perlen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitrat-Lösung, pH 8,0, gewaschen (der Überstand wurde jedesmal unter Verwendung des MPC entfernt). Die Abspaltung von den Perlen kann unter Verwendung von Formamid bei 90°C erzielt werden. Der Überstand wurde für etwa eine Stunde in einer Speedvac getrocknet und in 4 μl ultrareinem Wasser (MilliQ UF plus, Millipore, Eschborn, Deutschland) resuspendiert. Diese Präparation wurde für die MALDI-TOF MS-Analyse verwendet.
  • MALDI-TOF MS:
  • Ein halber Mikroliter der Probe wurde in den Probenhalter pipettiert, dann sofort mit 0,5 μl Matrixlösung (0,7 M3-Hydroxypicolinsäure, 50% Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) vermischt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur getrocknet und in das Massenspektrometer eingeführt. Alle Spektren wurden im Positiv-Ionen-Modus unter Verwendung eines Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland), ausgestattet mit einem Reflektron (5 keV Ionenquelle, 20 keV Nachbeschleunigung) und einem 337-nm-Stickstofflaser, aufgenommen. Die Kalibrierung erfolgte mit einem Gemisch aus einem 40-mer und einem 100-mer. Jede Probe wurde mit unterschiedlichen Laserenergien gemessen. In den negativen Proben wurde das amplifizierte Produkt weder mit niedrigeren noch mit höheren Laserenergien nachgewiesen. In den positiven Proben wurde das amplifizierte Produkt an verschiedenen Stellen des Probenpunktes und auch mit unterschiedlichen Laserenergien nachgewiesen.
  • ERGEBNISSE
  • Ein geschachteltes PCR-System wurde zum Nachweis von HBV-DNA in Blutproben verwendet, wobei Oligonukleotide eingesetzt wurden, die zum c-Bereich des HBV-Genoms komplementär sind (Primer 1: beginnend an der Kartenposition 1763, Primer 2 beginnend an der Kartenposition 2032 des komplementären Strangs), die das HBV-Nukleocapsid-Antigen (HBVcAg) codieren. Die DNA wurde aus Patientenserum gemäß Standardprotokollen isoliert. Eine erste PCR wurde mit der DNA aus diesen Präparationen unter Verwendung eines ersten Satzes von Primern durchgeführt. Wenn HBV-DNA in der Probe vorlag, so wurde ein DNA-Fragment mit 269 bp gebildet.
  • In der zweiten Reaktion wurden Primer verwendet, die komplementär zu einem Bereich innerhalb des in der ersten PCR gebildeten PCR-Fragrnents waren. Wenn HBV-verwandte amplifizierte Produkte in der ersten PCR vorlagen, so wurde in dieser geschachtelten PCR ein DNA-Fragment mit 67 bp gebildet (siehe 25A). Die Verwendung eines geschachtelten PCR-Systems zum Nachweis stellt eine hohe Empfindlichkeit bereit und dient außerdem als Spezifitätskontrolle für die externe PCR (Rolfs et al. (1992) PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer, Heidelberg). Ein weiterer Vorteil ist, dass die Menge der in der zweiten PCR erzeugten Fragmente groß genug ist, um einen unproblematischen Nachweis zu gewährleisten, auch wenn Reinigungsverluste nicht vermieden werden können.
  • Die Proben wurden unter Verwendung von Ultrafiltration an Restreptavidin Dynabeads gereinigt. Diese Reinigung wurde durchgeführt, da die kürzeren Primer-Fragmente aus sterischen Gründen in höherem Maß an den Perlen immobilisiert waren. Die Immobilisierung wurde direkt an der Ultrafiltrationsmembran durchgeführt, um Substanzverluste aufgrund von unspezifischer Absorption an die Membran zu vermeiden. Nach der Immobilisierung wurden die Perlen mit Ammoniumcitrat gewaschen, um einen Kationenaustausch durchzuführen (Pieles et al. (1993) Nucl. Acids Res. 21:3191–3196). Die immobilisierte DNA wurde unter Verwendung von 25%-igem Ammoniak von den Perlen abgespalten, was die Abspaltung der DNA von den Perlen innerhalb sehr kurzer Zeit ermöglicht, aber nicht zur Einführung von Natrium- oder anderen Kationen führt.
  • Die geschachtelten PCRs und die MALDI-TOF-Analyse wurden durchgeführt, ohne die Ergebnisse der serologischen Analyse zu kennen. Aufgrund des unbekannten Virustiters wurde jede Probe der ersten PCR unverdünnt als Matrize bzw. in einer 1:10-Verdünnung eingesetzt.
  • Probe 1 wurde von einem Patienten mit chronischer aktiver HBV-Infektion genommen, der in den Hbs- und Hbe-Antigen-Tests positiv war, aber negativ in einer Dot-Blot Analyse. Probe 2 war eine Serumprobe von einem Patienten mit einer aktiven HBV-Infektion und einer massiven Virämie, der in einer Dot-Blot-Analyse HBV-positiv war. Probe 3 war eine denaturierte Serumprobe, daher konnte keine serologische Analyse durchgeführt werden, ein nachgewiesener erhöhter Spiegel an Transaminasen wies auf eine Lebererkrankung hin. In einer Autoradiogramm-Analyse (24) war die erste PCR dieser Probe negativ. Dennoch gab es einige Hinweise auf eine HBV-Infektion. Diese Probe ist für die MALDI-TOF-Analyse von Interesse, da sie zeigt, dass sogar geringe Mengen an amplifizierten Produkten nach dem Reinigungsverfahren nachgewiesen werden können. Probe 4 stammte von einem Patienten, der von einer HBV-Infektion geheilt worden war. Die Proben 5 und 6 wurden von Patienten mit einer chronischen aktiven HBV-Infektion entnommen.
  • 24 zeigt die Ergebnisse einer PAGE-Analyse der geschachtelten PCR-Reaktion. Ein amplifiziertes Produkt ist in den Proben 1, 2, 3, 5 und 6 deutlich zu erkennen. In Probe 4 wurde kein amplifiziertes Produkt gebildet, sie ist tatsächlich gemäß der serologischen Analyse HBV-negativ. Die negativen und positiven Kontrollen sind mit + bzw. -bezeichnet. Amplifikationsartefakte sind sichtbar in den Bahnen 2, 5, 6 und +, wenn unverdünnte Matrize verwendet wurde. Diese Artefakte wurden nicht gebildet, wenn die Matrize in einer 1:10-Verdünnung eingesetzt wurde. In Probe 3 war das amplifizierte Produkt kaum nachweisbar, wenn die Matrize nicht verdünnt wurde Die Ergebnisse der PAGE-Analyse stimmen mit den durch serologische Analyse erhaltenen Daten überein, mit Ausnahme von Probe 3, wie vorstehend erläutert.
  • 25A zeigt ein Massenspektrum eines geschachtelt amplifizierten Produkts von Probe Nummer 1, das wie vorstehend beschrieben erzeugt und gereinigt wurde. Das Signal bei 20754 Da stellt das einzelsträngige amplifizierte Produkt dar (berechnet: 20735 Da als durchschnittliche Masse beider Stränge des von den Perlen abgespaltenen amplifizierten Produkts). Der Massenunterschied von berechneter und erhaltener Masse beträgt 19 Da (0,09%). Wie in 25A gezeigt ist, lieferte Probe Nummer 1 eine große Menge an amplifiziertem Produkt, was zu einem zweifelsfreien Nachweis führte.
  • 25B zeigt ein Spektrum, das von Probe Nummer 3 erhalten wurde. Wie in 24 dargestellt, ist die Menge des in diesem Abschnitt gebildeten, amplifizierten Produkts signifikant geringer als die von Probe Nummer 1. Trotzdem wird das amplifizierte Produkt deutlich mit einer Masse von 20751 Da (berechnet 20735) nachgewiesen. Der Massenunterschied beträgt 16 Da (0,08%). Das in 25C gezeigte Spektrum wurde von Probe Nummer 4 erhalten, die HBV-negativ ist (wie ebenfalls in 24 gezeigt). Wie erwartet, konnten keine dem amplifizierten Produkt entsprechenden Signale nachgewiesen werden. Alle in 25 gezeigten Proben wurden mit MALDI-TOF-MS analysiert, wobei amplifiziertes Produkt in allen HBV-positiven Proben, aber nicht in den HBV-negativen Proben nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse wurden in mehreren unabhängigen Experimenten bestätigt.
  • BEISPIEL 6
  • Analyse von Ligasekettenreaktionsprodukten durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Oligodesoxynukleotide
  • Mit Ausnahme des biotinylierten Oligonukleotids wurden alle anderen Oligonukleotide in einem 0,2 μmol-Maßstab an einem MilliGen 7500 DNA-Synthesegerät (Millipore, Redford, MA, USA) unter Verwendung des β-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahrens (Sinha, N. D. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:4539–4577) synthetisiert. Die Oligodesoxynukleotide wurden RP-HPLC-gereinigt und die Schutzgruppen wurden gemäß Standardprotokollen entfernt. Das biotinylierte Oligodesoxynukleotid wurde (HPLC-gereinigt) von Biometra, Göttingen, Deutschland bezogen. Sequenzen und berechnete Massen der verwendeten Oligonukleotide:
    Figure 00670001
  • 5'-Phosphorylierung der Oligonukleotide A und D
  • Dies wurde mit Polynukleotidkinase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) gemäß veröffentlichten Verfahren durchgeführt, die 5'-phosphorylierten Oligonukleotide wurden ungereinigt für die LCR verwendet.
  • Ligasekettenreaktion
  • Die LCR wurde mit Pfu-DNA-Ligase und einem Ligasekettenreaktionskit (Stratagene, Heidelberg, Deutschland), das zwei verschiedene pBluescript-KII Phagemide enthielt, durchgeführt. Eines trägt die Wildtypform des E. coli-lacI-Gens und das andere eine Mutante dieses Gens mit einer einzelnen Punktmutation bei bp 191 des lacI-Gens.
  • Die nachstehenden LCR-Bedingungen wurden für jede Reaktion verwendet: 100 pg Matrizen-DNA (0,74 fmol) mit 500 pg Ultraschall-behandelter Lachssperma-DNA als Träger, 25 ng (3,3 pmol) von jedem 5'-phosphorylierten Oligonukleotid, 20 ng (2,5 pMol) von jedem nicht-phosphorylierten Oligonukleotid, 4 E Pfu-DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 μl, gepuffertes ss-50-mer (1 fMol) wurde als Matrize verwendet, in diesem Fall war Oligo C ebenfalls biotinyliert. Alle Reaktionen wurden in einem Thermocycler (OnmiGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) mit dem folgenden Programm durchgeführt: 4 Minuten 92°C, 2 Minuten 60°C und 25 Zyklen von 20 Sekunden 92°C, 40 Sekunden 60°C. Außer für die HPLC-Analyse wurde das biotinylierte Ligationsedukt C verwendet. In einem Kontrollexperiment lieferten biotinylierte und nicht-biotinylierte Oligonukleotide die gleichen gelelektrophoretischen Ergebnisse. Die Reaktionen wurden auf 7,5%-igen Polyacrylamidgels analysiert. Ligationsprodukt 1 (Oligo A und B) berechnete Masse: 15450 Da, Ligationsprodukt 2 (Oligo C und D) berechnete Masse: 15387 Da.
  • SMART-HPLC
  • Ionenaustausch-HPLC (IE-HPLC) wurde auf dem SMART-System (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) unter Verwendung einer Pharmacia-MonoQ, PC 1,6/5-Säule durchgeführt. Die Elutionsmittel waren Puffer A (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 0,3 M NaCl bei pH 8,0) und Puffer B (wie A, aber 1 M NaCl). Ausgehend von 100% A für 5 Minuten bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 μl/min wurde ein Gradient von 0 auf 70% B innerhalb von 30 Minuten angelegt, dann wurde in 2 Minuten auf 100% B erhöht und 5 Minuten bei 100% B gehalten. Zwei vereinigte LCR-Volumina (40 μl), die entweder mit Wildtyp- oder Mutantenmatrize durchgeführt worden waren, wurden injiziert.
  • Probenherstellung für MALDI-TOF MS
  • Herstellung von immobilisierter DNA: Zur Aufnahme jedes Spektrums wurden zwei LCRs (durchgeführt wie vorstehend beschrieben) vereinigt und 1:1 mit 2 × B/W-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) verdünnt. Zu den Proben wurden 5 μl Streptavidin-DynaBeads (Dynal, Hamburg, Deutschland) zugegeben, und man ließ das Gemisch unter leichtem Schütteln für 15 Minuten bei Umgebungstemperatur binden. Der Überstand wurde unter Verwendung eines Magnet-Partikel-Sammlers, MPC, (Dynal, Hamburg, Deutschland) entfernt, und die Perlen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitrat-Lösung (pH 8,0) gewaschen (der Überstand wurde jedes mal unter Verwendung des MPC entfernt). Die Perlen wurden in 1 μl ultrareinem Wasser (MilliQ, Millipore, Redford, Mabelow) resuspendiert.
  • Kombination von Ultrafiltration und Streptavidin-DynaBeads: Zur Aufnahme des Spektrums wurden zwei LCRs (durchgeführt wie vorstehend beschrieben) vereinigt, 1:1 mit 2 × B/W-Puffer verdünnt und mit einer 5000-NMWL-Ultrafree-MC-Filtereinheit (Millipore, Eschborn, Deutschland) nach den Angaben des Herstellers aufkonzentriert. Nach dem Aufkonzentrieren wurden die Proben mit 300 μl 1 × B/W-Puffer gewaschen, und Streptavidin-DynaBeads wurden zugegeben. Die Perlen wurden einmal in der Ultrafree-MC-Filtrationseinheit mit 300 μl 1 × B/W-Puffer gewaschen und wie vorstehend beschrieben weiterverarbeitet. Die Perlen wurden in 30 bis 50 μl 1 × B/W-Puffer resuspendiert und in ein 15 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt. Der Überstand wurde entfernt, und die Perlen wurden zweimal mit 50 μl 0,7 M Ammoniumcitrat (pH 8,0) gewaschen. Schließlich wurden die Perlen einmal mit 30 μl Aceton gewaschen und in 1 μl ultrareinem Wasser resuspendiert. Das Ligierungsgemisch wurde nach der Immobilisierung an Perlen wie nachstehend beschrieben für die MALDITOF-MS Analyse verwendet.
  • MALDI-TOF MS
  • Eine Suspension von Streptavidin-beschichteten Magnetperlen mit der immobilisierten DNA wurde auf den Probenhalter pipettiert, dann sofort mit 0,5 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure in 50% Acetonitril, 70 mM Ammoniumcitrat) vermischt. Dieses Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur getrocknet und in das Massenspektrometer eingebracht. Alle Spektren wurden im Positiv-Ionen-Modus unter Verwendung eines Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland), ausgestattet mit einem Reflektron (5 keV Ionenquelle, 20 keV Nachbeschleunigung) und einem Stickstofflaser (337 nm), aufgenommen. Für die Analyse von Pfu-DNA-Ligase wurden 0,5 μl der Lösung auf dem Probenhalter mit 1 μl der Matrixlösung vermischt und wie oben beschrieben präpariert. Für die Analyse von ungereinigten LCRs wurde 1 μl einer LCR mit 1 μl Matrixlösung gemischt.
  • ERGEBNISSE
  • Das E. coli-lacI-Gen diente als einfaches Modellsystem, um die Eignung von MALDI-TOF-MS als Nachweisverfahren für Produkte, die in Ligasekettenreaktionen hergestellt worden waren, zu untersuchen. Dieses Matrizensystem enthält ein E. coli lacI-Wildtypgen in einem pBluescript-KII-Phagemid und ein E. coli-lacI-Gen, das eine einzelne Punktmutation bei bp 191 trägt (C-nach-T-Transition; SEQ ID. Nr. 131) im selben Phagemid. Vier verschiedene Oligonukleotide wurden verwendet, die nur ligiert wurden, wenn das E. coli-lacI-Wildtypgen vorlag (26).
  • Die LCR-Bedingungen wurden unter Verwendung von Pfu-DNA-Ligase optimiert, um mindestens 1 pmol Ligierungsprodukt in jeder positiven Reaktion zu erhalten. Die Ligierungsreaktionen wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) und HPLC auf dem SMART-System analysiert (27, 28 und 29). 27 zeigt eine PAGE einer positiven LCR mit Wildtyp-Matrize (Bahn 1), einer negativen LCR mit Mutantenmatrize (1 und 2) und eine negative Kontrolle, die Enzym, Oligonukleotide und keine Matrize, aber Lachssperma-DNA enthält. Die Gelelektrophorese zeigt deutlich, dass das Ligierungsprodukt (50 bp) nur in der Reaktion mit Wildtyp-Matrize hergestellt wurde, wohingegen weder die Matrize welche die Punktmutation trägt, noch die Kontrollreaktion mit Lachssperma-DNA Amplifikationsprodukte erzeugten. In 28 wurde HPLC eingesetzt, um zwei vereinigte LCRs mit Wildtypmatrize, die unter den selben Bedingungen durchgeführt wurden, zu analysieren. Das Ligierungsprodukt wurde deutlich nachgewiesen. 29 zeigt die Ergebnisse einer HPLC, bei der zwei vereinigte negative LCRs mit Mutantenmatrize analysiert wurden. Diese Chromatogramme bestätigen die in 27 gezeigten Daten, und zusammengenommen zeigen die Ergebnisse deutlich, dass das System nur dann Ligierungsprodukte in einer signifikanten Menge erzeugt, wenn die Wildtyp-Matrize bereitgestellt wird.
  • Geeignete Kontroll-Läufe wurden durchgeführt, um die Retentionszeiten der verschiedenen, an den LCR-Experimenten beteiligten Verbindungen zu bestimmen. Diese enthalten die vier Oligonukleotide (A, B, C und D), ein synthetisches ds-50-mer (mit derselben Sequenz wie das Ligierungsprodukt), die Wildtypmatrizen-DNA, Schall-behandelte Lachssperma-DNA und die Pfu-DNA-Ligase in Ligationspuffer.
  • Um zu testen, welches Reinigungsverfahren verwendet werden sollte, bevor eine LCR-Reaktion durch MALDI-TOF-MS analysiert werden kann, wurden Aliquote einer ungereinigten LCR (30A) und Aliquote der Enzymstammlösung (30B) mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Es stellte sich heraus, dass eine geeignete Probenpräparation absolut notwendig ist, da alle Signale in der ungereinigten LCR Signalen entsprechen, die in der MALDI-TOF-MS-Analyse der Pfu-DNA-Ligase erhalten werden. Die berechneten Massenwerte des Oligos A und des Ligierungsprodukts betragen 7521 Da bzw. 15450 Da. Die Daten in 30 zeigen, dass die Enzymlösung zu Massensignalen führt, welche die erwarteten Signale der Ligierungsedukte und -produkte stören und daher eine eindeutige Signalzuweisung unmöglich machen. Außerdem zeigten die Spektren Signale des Detergens Tween 20, das Bestandteil des Enzymlagerpuffers ist und das Kristallisationsverhalten des Analyt/Matrix-Gemischs in ungünstiger Weise beeinflusst.
  • In einem Reinigungsformat wurden Streptavidin-beschichtete Magnetperlen verwendet. Wie in einer aktuellen Veröffentlichung gezeigt wurde, ist die direkte Desorption von DNA, die durch Watson-Crick-Basenpaarung an ein kovalent an die Perlen gebundenes komplementäres DNA-Fragment immobilisiert ist möglich, und ausschließlich der nicht biotinlyierte Strang desorbiert (Tang et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:3126–3131). Dieser Ansatz der Verwendung immobilisierter ds-DNA gewährleistet, dass nur der nicht-biotinylierte Strang desorbiert wird. Wenn nicht-immobilisierte ds-DNA analysiert wird, so werden beide Stränge desorbiert (Tang et al. (1994) Rapid Comm. Mass Spectrom. 7 183–186), was zu breiten Signalen führt, die vom Massenunterschied der beiden Einzelstränge abhängen. Daher werden bei der Anwendung dieses Systems für die LCR nur das unligierte Oligonukleotid A mit einer berechneten Masse von 7521 Da und das Ligierungsprodukt von Oligo A und Oligo B (berechnete Masse: 15450 Da) desorbiert, wenn Oligo C am 5'-Ende biotinyliert und an Streptavidin-beschichteten Perlen immobilisiert ist. Dies führt zu einer einfachen und zweifelsfreien Identifizierung der LCR-Edukte und -Produkte.
  • 31A zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum, das von zwei vereinigten LCRs erhalten wurde (durchgeführt wie vorstehend beschrieben), die an Streptavidin-DynaBeads aufgereinigt und direkt von den Perlen desorbiert wurden, und es zeigt, dass das verwendete Reinigungsverfahren effizient war (verglichen mit 30). Ein Signal, welches das unligierte Oligo A darstellt, und ein Signal, das dem Ligierungsprodukt entspricht, konnten nachgewiesen werden. Die Übereinstimmung zwischen den berechneten und den experimentell gefundenen Massenwerte ist bemerkenswert und ermöglicht eine zweifelsfreie Peakzuordnung und den genauen Nachweis des Ligierungsprodukts. Im Gegensatz dazu in dem Spektrum, das von zwei vereinigten LCRs mit mutierter Matrize erhalten wurde, kein Ligierungsprodukt, sondern nur Oligo A im Spektrum nachgewiesen werden (31B). Die Spezifität und Selektivität der LCR-Bedingungen und die Empfindlichkeit des MALDI-TOF-Nachweises werden weiter demonstriert, wenn die Ligierungsreaktion in Abwesenheit einer spezifischen Matrize durchgeführt wird. 32 zeigt ein Spektrum, das aus zwei vereinigten LCRs erhalten wurde, in denen nur Lachssperma-DNA als negative Kontrolle verwendet wurde; wie erwartet konnte nur Oligo A nachgewiesen werden.
  • Während die in 31A gezeigten Ergebnisse mit Bahn 1 des Gels in 27 korreliert werden können, ist das in 31B gezeigte Spektrum äquivalent zu Bahn 2 in 27, und schließlich entspricht auch das Spektrum in 32 der Bahn 3 in 27. Die Ergebnisse sind in Einklang mit der in den 28 und 29 gezeigten HPLC-Analyse. Während Gelelektrophorese (27) und HPLC (28 und 29) entweder einen Überschuss oder eine fast gleiche Mengen an Ligierungsprodukt im Vergleich zu den Ligierungsedukten zeigen, liefert die Analyse durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie für das Ligierungsprodukt ein kleineres Signal (31A).
  • Die geringere Intensität des Ligierungsprodukt-Signals könnte auf unterschiedliche Desorptions-/Ionisationseffizienzen des 24- und des 50-mers zurückzuführen sein. Da der Tm-Wert einer Duplex mit 50 im Vergleich zu 24 Basenpaaren signifikant höher ist, könnte mehr 24-mer desorbiert sein. Eine Verringerung der Signalintensität kann auch von einem höheren Fragmentierungsgrad im Fall von längeren Oligonukleotiden herrühren.
  • Ungeachtet der Reinigung mit Streptavidin-DynaBeads, zeigt 32 Spuren von Tween 20 im Bereich um 2000 Da. Substanzen mit viskoser Konsistenz beeinflussen das Kristallisationsverfahren negativ und können daher für die massenspektrometrische Analyse schädlich sein. Tween 20 und auch Glyzerin, die Bestandteil von Enzymlagerungspuffern sind, sollten daher vor der massenspektrometrischen Analyse vollständig entfernt werden. Aus diesem Grund wurde ein verbessertes Reinigungsverfahren untersucht, das vor der Behandlung mit DynaBeads einen zusätzlichen Ultrafiltrationsschritt beinhaltet. Tatsächlich führte diese Probenreinigung zu einer signifikanten Verbesserung der Leistung der MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
  • 33 zeigt Spektren, die von zwei vereinigten positiven (33A) bzw. negativen (33B) LCRs erhalten wurden. Die positive Reaktion wurde mit einem chemisch synthetisierten einzelsträngigen 50-mer als Matrize durchgeführt, mit einer Sequenz, die äquivalent zum Ligierungsprodukt der Oligos C und D war. Das Oligo C war 5'-biotinyliert. Daher wurde die Matrize nicht nachgewiesen. Wie erwartet, konnte nur das Ligierungsprodukt der Oligos A und B (berechnete Masse 15450 Da) von den immobilisierten und ligierten Oligos C und D desorbiert werden. Dieses neu erzeugte DNA-Fragment wird durch das Massensignal bei 15448 Da in 33A wiedergegeben. Verglichen mit 32A zeigt dieses Spektrum deutlich, dass dieses Verfahren der Probenherstellung Signale mit verbesserter Auflösung und Intensität erzeugt.
  • BEISPIEL 7
  • Mutationsnachweis durch Festphasen-Oligo-Basen-Extension eines Primers und Analyse durch MALDI-TOF Massenspektrometrie (Primer-Oligo-Basen-Extension = PROBE)
  • Zusammenfassung
  • Durch das Festphasen-Oligo-Basen-Extensions-Verfahren werden Punktmutationen und kleine Deletionen sowie kleine Insertionen in amplifizierter DNA nachgewiesen. Das Verfahren beruht auf der Extension eines Nachweisprimers, der neben einer variablen Nukleotidposition an eine affinitätsgefangene amplifizierte Matrize hybridisiert, unter Verwendung einer DNA-Polymerase, eines Gemischs von drei dNTPs und des einen fehlenden Didesoxynukleotids. Die resultierenden Produkte werden durch MALDI-TOF Massenspektrometrie ohne weitere Markierungsverfahren bestimmt und aufgelöst. Das Ziel des folgenden Experiments war die Bestimmung von Mutanten- und Wildtyp-Allelen auf eine schnelle und verlässliche Weise.
  • Beschreibung des Experiments
  • Bei dem Verfahren wurde ein einzelner Nachweisprimer verwendet, gefolgt von einem Oligonukleotid-Extensionsschritt, um Produkte zu erhalten, die sich in der Länge um einige, für Mutanten- oder Wildtyp-Allele spezifische Basen unterscheiden und die leicht durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie aufgelöst werden können. Das Verfahren ist unter Verwendung von Exon 10 des CFTR-Gens als Beispiel beschrieben. Das Exon 10 dieses Gens trägt die in vielen ethnischen Gruppen am weitesten verbreitete Mutation (ΔF508), die im homozygoten Zustand zum klinischen Phänotyp der Cystischen Fibrose führt.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Genomische DNA
  • Genomische DNA wurde von gesunden Individuen, Individuen, die homozygot oder heterozygot für die ΔF508-Mutation waren, und von einem Individuum, das heterozygot für die 1506S-Mutation war, gewonnen. Das Wildtyp- und das Mutantenallel wurden durch standardmäßige Sanger Sequenzierung -bestätigt.
  • PCR-Amplifizierung von Exon 10 des CFTR-Gens
  • Die Primer für die PCR-Amplifizierung waren CFEx10-F (5'-GCAAGTGAATCCTGAGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 13), der sich im Intron 9 befand und biotinyliert war) und CFEx10-R (5'-GTGTGAAGGGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 14), der sich im Intron 10 befand). Die Primer wurden in einer Konzentration von 8 pmol eingesetzt. TagPolymerase einschließlich 10×-Puffer wurde von Boehringer-Mannheim bezogen, und dNTPs wurden von Pharmacia erhalten. Das Gesamt-Reaktionsvolumen betrug 50 μl. Die Zyklusbedingungen für die PCR waren anfangs 5 min bei 95°C, gefolgt von 1 min bei 94°C, 45 sek bei 53°C und 30 sek bei 72°C für 40 Zyklen mit einer abschließenden Extensionszeit von 5 min bei 72°C.
  • Reinigung der amplifizierten Produkte
  • Die Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung des PCR-Reinigungskits von Qiagen (Nr. 28106) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Die Elution der gereinigten Produkte von der Säule wurde in 50μl TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) durchgeführt.
  • Affinitäts-Einfang und Denaturieren der doppelsträngigen DNA
  • 10 μl-Aliquote des gereinigten amplifizierten Produkts wurden in ein Well einer Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte (Nr. 1645684, Boehringer-Mannheim, oder Nr. 95029262, Labsystems) übertragen. Anschließend wurden 10 μl Inkubationspuffer (80 mM Natriumphosphat, 400 mM NaCl, 0,4% Tween 20, pH 7,5) und 30 l Wasser zugegeben. Nach Inkubation für 1 Stande bei Raumtemperatur wurden die Wells dreimal mit 200 μl Waschpuffer(40 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 8,8) gewaschen. Um die doppelsträngige DNA zu denaturieren, wurden die Wells für 3 min mit 100 μl einer 50 mM NaOH-Lösung behandelt und die Wells wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer gewaschen.
  • Oligo-Basen-Extensions-Reaktion
  • Die Anlagerung von 25 pmol des Nachweisprimers (CF508: 5'-CTATATTCATCATAGGAAACACCA-3' (SEQ ID Nr. 15) wurde in 50 μl Hybridisierungspuffer (20 mM Tris, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 1% Triton X-100, pH 8) bei 50°C für 10 min durchgeführt. Die Wells wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer und einmal in 200 μl TE-Puffer gewaschen. Die Extensionsreaktion wurde unter Verwendung einiger Komponenten des DNA-Sequenzierungs-Kits von USB (Nr. 70770) und von dNTPs oder ddNTPs von Pharmacia durchgeführt. Das Gesamt-Reaktionsvolumen betrug 45 μl und enthielt 21 μl Wasser, 6 μl Sequenase-Puffer, 3 μl 10 mM DTT-Lösung, 4,5 μl 0,5 mM von drei dNTPs, 4,5 μl 2 mM des fehlenden ddNTPs, 5,5 μl Glyzerin-Enzymverdünnungspuffer, 0,25 μl Sequenase 2.0 und 0,25 Pyrophosphatase. Die Reaktion wurde auf Eis pipettiert und dann für 15 min bei Raumtemperatur und 5 min bei 37°C inkubiert. Dann wurden die Wells dreimal mit 200 μl Waschpuffer und einmal mit 60 μl einer 70 mM NH4-Citrat-Lösung gewaschen.
  • Denaturierung und Präzipitation des verlängerten Primers
  • Der verlängerte Primer wurde in 50 μl 10% DMSO (Dimethylsulfoxid) in Wasser bei 80°C für 10 min denaturiert. Zur Fällung wurden 10 μl NH4-Acetat (pH 6,5), 0,5 μl Glykogen (10 mg/ml Wasser, Sigma Nr. G1765) und 100 μl absolutes Ethanol zum Überstand zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zentrifugation bei 13.000 g für 10 min wurde das Sediment in 70%-igem Ethanol gewaschen und in 1 μl 18 Mohm/cm H2O Wasser resuspendiert.
  • Probenherstellung und Analyse mit MALDI-TOF Spektrometrie
  • Die Probenherstellung erfolgte, indem jeweils 0,3 μl der Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M zweibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O/CH3CN) und des resuspendierten DNA/Glykogen-Sediments auf einem Probenziel gemischt und an Luft trocknen gelassen wurden. Bis zu 20 Proben wurden punktförmig auf einer Sondenzielscheibe aufgetragen, die in den Quellenbereich eines unmodifizierten Thermo Bioanalysis (früher Finnigan) Visions 2000 MALDI-TOF eingebracht wurde, das im Reflektronmodus mit 5 bzw. 20 kV an der Ziel- bzw. der Umwandlungsdynode betrieben wurde. Die theoretischen durchschnittlichen Molekulargewichte (Mr(ber.)) wurden aus den Atomzusammensetzungen berechnet; die angegebenen experimentellen Mr-Werte Mr(exp.) sind diejenigen der einfach protonierten Form, die unter Verwendung von externer Kalibrierung bestimmt wurden.
  • ERGEBNISSE
  • Das Ziel des Experiments lag darin, ein schnelles und verlässliches Verfahren zu entwickeln, das unabhängig von den genauen Stringenzen für den Mutationsnachweis ist und zu hoher Qualität und hohem Durchsatz bei der Diagnose genetischer Erkrankungen führt. Daher wurde eine spezielle Art der DNA-Sequenzierung (Oligo-Basen-Extension eines Mutationsnachweisprimers) mit der Bestimmung der erhaltenen Mini-Sequenzierungsprodukte durch Matrix-gestützte Laserdesorptions/Ionisations-(MAIDI-)Massenspektrometrie (MS) kombiniert. Die Flugzeit-(TOF-)Reflektron-Anordnung wurde als mögliches Massenmesssystem gewählt. Um diese Hypothese zu beweisen, wurde die Untersuchung mit Exon 10 des CFTR-Gens durchgeführt, in dem einige Mutationen zum klinischen Phänotyp der Cystischen Fibrose, der häufigsten monogenetischen Erkrankung in der kaukasischen Population, führen können.
  • Die schematische Darstellung, wie in 34 angegeben, zeigt die erwarteten kurzen Segenzierungsprodukte mit der theoretisch berechneten Molekülmasse des Wildtyps und verschiedene Mutationen des Exons 10 des CFTR-Gens (SEQ ID Nr. 132). Die kurzen Sequenzierungsprodukte wurden unter Verwendung von entweder ddTTP (34A; SEQ ID Nr. 133–135) oder ddCTP (34B; SEQ ID Nr. 136–139) erzeugt, um einen definitiven, Sequenz-bezogenen Stopp in den naszierenden DNA-Strang einzuführen. Die MALDI-TOF-MS-Spektren von gesunden, für die Mutation heterozygoten und für die Mutation homozygoten Individuen sind in 35 dargestellt. Alle Proben wurden durch standardmäßige Sanger-Sequenzierung bestätigt, die keine Diskrepanz zu der massenspektrometrischen Analyse zeigte. Die Genauigkeit der experimentellen Messungen der verschiedenen Molekülmassen lagen innerhalb eines Bereich von minus 21,8 und plus 87,1 Dalton (Da) im erwarteten Bereich. Dies ermöglicht in jedem Fall eine definitive Interpretation der Ergebnisse. Ein weiterer Vorteil dieser Vorgehensweise ist der unzweideutige Nachweis der ΔI507-Mutation. In der ddTTP-Reaktion würde das Wildtyp-Allel nachgewiesen, wohingegen in der ddCTP-Reaktion die Drei-Basenpaar-Deletion offenbart würde.
  • Das beschriebene Verfahren ist bestens zum Nachweis einzelner Punktmutationen oder Mikroläsionen von DNA geeignet. Die sorgfältige Auswahl der Mutationsnachweisprimer eröffnet das Fenster für die Multiplexierung und führt zu einem hohen Durchsatz, einschließlich hoher Qualität bei der genetischen Diagnose, ohne dass die in vergleichbaren Allel-spezifischen Verfahren notwendigen exakten Stringenzen erforderlich sind. Aufgrund der Einzigartigkeit der genetischen Information ist die Oligo-Basen-Extension eines Mutationsnachweisprimers bei jedem Erkrankungsgen oder jedem polymorphen Bereich im Genom anwendbar, wie etwa bei einer variablen Anzahl an Tandem-Wiederholungen (VNTR) oder anderen Einzelnukleotid-Polymorphismen (z. B. Apolipoprotein E-Gen), wie hier ebenfalls beschrieben.
  • BEISPIEL 8
  • Nachweis von Polymerasekettenreaktionsprodukten, die 7-Deazapurin-Einkeiten enthalten, mit Matrix-gestützter Laserdesorptions-/Ionisations-Flugzeit-(MALDI-TOF-)Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Nukleinsäreamplifikationen
  • Die folgenden Oligodesoxynukleotid-Primer wurden entweder gemäß Standard Phosphoramiditchemie (Sinha, N. D., et al. (1983) Tetrahedron Let. Bd. 24 S. 5843–5846; Sinha, N. D., et al. (1984) Nucleic Acids Res. Bd. 12 S. 4539–4557) an einem MilliGen 7500 DNA-Synthesegerät (Millipore, Redford, MA, USA) im 200 nmol-Maßstab synthetisiert oder von MWG-Biotech (Ebersberg, Deutschland, Primer 3) und Biometra (Göttingen, Deutschland, Primer 6–7) bezogen.
  • Figure 00780001
  • Der 99-mer- (SEQ ID Nr. 141) und der 200mer-DNA-Strang (SEQ ID Nr. 140; modifiziert und unmodifiziert) sowie das Ribo- und das 7-Deaza-modifizierte 100-mer wurden von pRFc1-DNA (10 ng, freundlicherweise zur Verfügung gestellt von S. Feyerabend, Universität Hamburg) in 100 μl Reaktionsvolumen amplifiziert, welches 10 mmol/l KCl, 10 mmol/l (NH4)2SO4, 20 mmol/l Tris-HCl (pH 8,8), 2 mmol/l MgSO4, (exo(–) Pseudococcus furiosus-(Pfu)Puffer, Pharmacia, Freiburg, Deutschland), 0,2 mmol/l jedes dNTPs (Pharmacia, Freiburg, Deutschland), 1 μmol/l jedes Primers und 1 Einheit exo(–) Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, Heidelberg, Deutschland) enthielt. Für das 99-mer wurden die Primer 1 und 2, für das 200-mer die Primer 1 und 3 und für das 100-mer die Primer 6 und 7 verwendet. Um 7-Deazapurinmodifizierte Nukleinsäuren zu erhalten wurden während der PCR-Amplifikation dATP und dGTP durch 7-Deaza-dATP und 7-Deaza-dGTP ersetzt. Die Reaktion wurde in einem Thermocycler (OmniGene, MWG-Biotech, Ebersberg, Deutschland) unter Verwendung des Zyklus: Denaturieren bei 95°C für 1 mm, Anlagern bei 51°C für 1 min und Extension bei 72°C für 1 min durchgeführt. Für alle PCRs betrug die Anzahl der Reaktionszyklen 30. Nach dem letzten Zyklus ließ man die Reaktion weitere 10 min bei 72°C verlängern.
  • Die 103-mer-DNA-Stränge (modifiziert und unmodifiziert; SEQ ID Nr. 245) wurden aus M13mp18 RFI-DNA (100 ng, Pharmacia, Freiburg, Deutschland) in 100 μl Reaktionsvolumen unter Verwendung der Primer 4 und 5 amplifiziert, wobei alle anderen Konzentrationen unverändert blieben. Die Reaktion wurde unter Verwendung des Zyklus: Denaturieren bei 95°C für 1 mm, Hybridisieren bei 40°C für 1 min und Extension bei 72°C für 1 min durchgeführt. Nach 30 Zyklen für das unmodifizierte bzw. 40 Zyklen für das modifizierte 103-mer wurden die Proben weitere 10 min bei 72°C inkubiert.
  • Synthese von 5'-[32-P]-markierten PCR-Primern
  • Die Primer 1 und 4 wurden 5'-[32-P]-markiert, wobei T4-Polynukleotidkinase (Epicentre Technologies) und (γ-32P)-ATP (BLU/NGG/502A, Dupont, Deutschland) gemäß den Protokollen des Herstellers verwendet wurden. Die Reaktionen wurden durchgeführt, indem 10% der Primer 1 und 4 in der PCR unter ansonsten unveränderten Reaktionsbedingungen durch die markierten Primer ersetzt wurden. Die amplifizierten DNAs wurden durch Gelelektrophorese auf einem 10%-igen Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die entsprechenden Banden wurden ausgeschnitten und auf einem Packard-TRI-CARS 460C-Flüssig-Szintillationssystem (Packard, CT, USA) gezählt.
  • Primer-Abspaltung von dem ribo-modifizierten PCR-Produkt
  • Die amplifizierte DNA wurde unter Verwendung von Ultrafree-MC-Filtereinheiten (30.000 NMWL) gereinigt, dann wurde sie in 100 μl 0,2 mol/l NaOH gelöst und für 25 Minuten auf 95°C erhitzt. Die Lösung wurde dann mit HCl (1 mol/l) angesäuert und für die MALDI-TOF-Analyse weiter gereinigt, wobei Ultrafree-MC-Filtereinheiten (10.000 NMWL) wie nachstehend beschrieben eingesetzt wurden.
  • Reinigung amplifizierter Produkte
  • Alle Proben wurden unter Verwendung von Ultrafree-MC-Einheiten, 30.000 NMWL, (Millipore, Eschborn, Deutschland) gemäß der Beschreibung des Herstellers gereinigt und aufkonzentriert. Nach der Lyophilisierung wurden die amplifizierten Produkte in 5 μl (3 μl für das 200-mer) ultrareinem Wasser gelöst. Diese Analytlösung wurde direkt für die MALDI-TOF Messungen verwendet.
  • MALDI-TOF MS
  • Aliquote von 0,5 μl der Analytlösung und 0,5 μl Matrixlösuug (0,7 mol/l 3-HPA und 0,07 mol/l Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser (1:1, v/v)) wurden auf einem flachen metallischen Probenträger gemischt. Nach dem Trocknen bei Umgebungstemperatur wurde die Probe zur Analyse in das Massenspektrometer eingebracht. Das verwendete MALDI-TOF Massenspektrometer war ein Finnigan MAT Vision 2000 (Finnigan MAT, Bremen, Deutschland). Die Spektren wurden im Positiv-Ionen-Reflektor-Modus mit einer 5 keV Ionenquelle und 20 keV Nachbeschleunigung aufgenommen. Das Instrument war mit einem Stickstoff-Laser (Wellenlänge 337 nm) ausgestattet. Das Vakuum des Systems betrug 3–4 × 10–8 hPa im Analysatorbereich und 1–4 × 10–7 hPa im Quellenbereich. Die Spektren der modifizierten und unmodifizierten DNA-Proben wurden mit derselben relativen Laserstärke erhalten; die externe Kalibrierung wurde mit einem Gemisch synthetischer Oligodesoxynukleotide (7-mer bis 50-mer) durchgeführt.
  • ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • Enzymatische Synthese von 7-Deazapurin-Nukleotid-haltigen Nukleinsäuren durch PCR
  • Um die Anwendbarkeit der MALDI-TOF MS zur schnellen gelfreien Analyse von kurzen amplifizierten Produkten zu demonstrieren und um die Wirkung der 7-Deazapurin-Modifikation der Nukleinsäuren unter MALDI-TOF-Bedingungen zu untersuchen, wurden zwei verschiedene Primer-Matrize-Systeme zur Synthese der DNA-Fragmente verwendet. Die Sequenzen sind in den 36 und 37 dargestellt. Während zwei Einzelstränge des 103-mer-Amplifikationsprodukts nahezu gleiche Massen hatten (Δm = 8 u), unterschieden sich die beiden Einzelstränge des 99-mers um 526 u. Berücksichtigt man, dass 7-Deazapurin-Nukleotidbausteine für die chemische DNA-Synthese etwa 160 mal teurer sind als reguläre Nukleotidbausteine (Produktinformation, Glen Research Corporation, Sterling, VA) und dass ihre Anwendung in der Standard-β-Cyano-Phosphoramidit-Chemie nicht einfach ist (Produktinformation, Glen Research Corporation, Sterling, VA; Schneider et al. (1995), Nucl. Acids Res. 23:1570), so wären die Kosten von 7-Deazapurinmodifizierten Primern sehr hoch. Daher wurden alle PCRs, zur Verbesserung der Anwendbarkeit und Erhöhung des Verfahrensumfangs, unter Verwendung von unmodifizierten Oligonukleotid-Primern durchgeführt, die standardmäßig erhältlich sind. Der Austausch von dATP und dGTP durch c7-dATP und c7-dGTP in der Polymerasekettenreaktion führte zu Produkten, die ungefähr 80% 7-Deazapurinmodifizierte Nukleoside für das 99-mer und das 103-mer bzw. etwa 90% für das 200-mer enthielten. Die Tabelle II zeigt die Basenzusammensetzung aller PCR-Produkte. Tabelle II Basenzusammensetzung des 99-mer-, des 103-mer- und des 200-mer-PCR-Amplifikationsprodukts (unmodifiziert und 7-Deazapurin-modifiziert)
    DNA-Fragmente1 C T A G c7-Deaza-A c7-Deaza-6 rel. Mod.2
    200-mer s 54 34 56 56
    modifiziertes 200-mer s 54 34 6 5 50 51 90%
    200-mer a 56 56 34 54
    modifiziertes 200-mer a 56 56 3 4 31 50 92%
    103-mer s 28 23 24 28
    modifiziertes 103-mer s 28 23 6 5 18 23 79%
    103-mer a 28 24 23 28
    modifiziertes 103-mer a 28 24 7 4 16 24 78%
    99-mer s 34 21 24 20
    modifiziertes 99-mer s 34 21 6 5 18 15 75%
    99-mer a 20 24 21 34
    modifiziertes 99-mer a 20 24 3 4 18 30 87%
    • 1 „s" und "a" beschreiben "Sense-" und "Antisense-" Stränge des doppelsträngigen Amplifikationsprodukts.
    • 2 gibt die relative Modifikation als Prozentsatz der 7-Deazapurin-modifizierten Nukleotide an der Gesamtmenge der Purin-Nukleotide an.
  • Es blieb zu bestimmen, ob eine 80–90%-ige 7-Deazapurin-Modifikation für einen exakten massenspektrometrischen Nachweis ausreichend ist. Daher war es wichtig zu bestimmen, ob alle Purin-Nukleotide während des enzymatischen Amplifikationsschrittes ersetzt werden konnten. Dies war nicht trivial, da gezeigt worden war, dass c7-dATP in der PCR dATP nicht vollständig ersetzen kann, wenn Taq-DNA-Polymerase eingesetzt wird (Seela, F. und A. Roelling (1992), Nucleic Acids Res. 20, 55–61). Glücklicherweise wurde gefunden, dass exo(–)-Pfu DNA-Polymerase tatsächlich c7-dATP und c7-dGTP in Abwesenheit unmodifizierter Purin-Nukleosidtriphosphate akzeptieren konnte. Der Einbau war weniger effizient, was zu einer geringeren Ausbeute an Amplifikationsprodukt führte (38).
  • Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Amplifikationen mit [32P]-markierten Primern wiederholt. Das Autoradiogramm (39) zeigt deutlich niedrigere Ausbeuten für die modifizierten PCR-Produkte. Die Banden wurden aus dem Gel geschnitten und gezählt. Für alle Amplifikationsprodukte betrug die Ausbeute der modifizierten Nukleinsäuren etwa 50%, bezogen auf das entsprechende unmodifizierte Amplifikationsprodukt. Weitere Experimente zeigten, dass auch exo(–)-DeepVent- und Vent-DNA-Polymerase c7-dATP und c7-dGTP während der PCR einbauen konnten. Es zeigte sich jedoch, dass die Gesamtleistung für die exo(–)Pfu-DNA-Polymerase am besten war, die während der Amplifikation die wenigsten Nebenprodukte ergab. Bei Verwendung aller drei Polymerasen wurde gefunden, dass solche PCRs, die c7-dATP und c7-dGTP anstelle ihrer Isostere einsetzten, weniger Nebenreaktionen zeigten und ein saubereres PCR-Produkt ergaben. Das verringerte Auftreten von Amplifikationsnebenprodukten kann durch die Verringerung von Primer-Mismatches aufgrund einer Ling-Matrize, die während der PCR synthetisiert wird, erklärt werden. Für DNA-Doppelstränge, die 7-Deazapurin enthalten, wurde ein niedrigerer Schmelzpunkt beschrieben (Mizusawa, S., et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14 1319–1324). Zusätzlich zu den drei vorstehend beschriebenen Polymerasen (exo(–)-DeepVent-DNA-Polymerase, 5Vent-DNA-Polymerase und exo(–)-Pfu-DNA-Polymerase) wird angenommen, dass andere Polymerasen, wie etwa das große Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase, Sequenase, Taq-DNA-Polymerase und U-AmpliTaq-DNA-Polymerase, verwendet werden können. Wenn RNA die Matrize ist, so müssen außerdem RNA-Polymerasen, wie etwa die SP6- oder die T7-RNA-Polymerase, verwendet werden.
  • MALDI-TOF-Massenspektrometrie von modifizierten und unmodifizierten Amplifikationsprodukten
  • Die 99-mer-, 103-mer- und 200-mer-Amplifikationsprodukte wurden mittels MALDI-TOF-MS analysiert. Auf Grundlage früherer Experimente war bekannt, dass der Grad der Depurinierung von der Laserenergie abhängt, die zur Desorption und Ionisation des Analyten verwendet wird. Da der Einfluss der 7-Deazapurin-Modifikation auf die Fragmentierung aufgrund von Depurinierung untersucht werden sollte, wurden alle Spektren bei derselben relativen Laserenergie gemessen.
  • Die 40a und 40b zeigen die Massenspektren der modifizierten und unmodifizierten 103-mer-Nukleinsäuren. Im Fall des modifizierten 103-mers verursacht die Fragmentierung ein breites (M + H)+-Signal. Das Maximum des Peaks ist zu niedrigeren Massen verschoben, sodass die zugewiesene Masse eher einen Mittelwert des (M + H)+-Signals und der Signale fragmentierter Ionen, als das (M + H)+-Signal selbst wiedergibt. Obwohl das modifizierte 103-mer noch etwa 20% A und G aus den Oligonukleotid-Primern enthält, zeigt es weniger Fragmentierung, was sich durch sehr viel schmalere und symmetrischere Signale auszeichnet. Insbesondere das Auslaufen der Peaks auf der Seite der niedrigeren Masse aufgrund von Depurinierung ist erheblich verringert. Daher ist der Unterschied zwischen der gemessenen und der berechneten Masse stark verringert, obwohl sie noch unter der erwarteten Masse liegt. Für die unmodifizierte Probe wurde ein (M + H)+-Signal von 31670 beobachtet, was einen Unterschied von 97 u oder 0,3% zu der berechneten Masse darstellt. Im Fall der modifizierten Probe verringerte sich dieser Massenunterschied dagegen auf 10 u oder 0,03% (31713 u gefunden, 31723 u berechnet). Diese Beobachtungen werden durch eine signifikante Zunahme der Massenauflösung des (M + H)+-Signals der beiden Signalstränge bestätigt (n/Δm = 67, im Gegensatz zu 18 für die unmodifizierte Probe, mit Δm = volle Breite bei halbem Maximum, fwhm). Aufgrund des geringen Massenunterschieds zwischen den beiden Einzelsträngen (8 u) wurden ihre einzelnen Signale nicht aufgelöst.
  • Mit den Ergebnissen der 99-Basenpaar-DNA-Fragmente werden die Wirkungen der erhöhten Massenauflösung für 7-Deazapurin-haltige DNA sogar noch deutlicher. Die beiden Einzelstränge in der unmodifizierten Probe wurden nicht aufgelöst, obwohl der Massenunterschied zwischen den beiden Strängen des Amplifikationsprodukts mit 526 u aufgrund einer ungleichen Verteilung von Purinen und Pyrimidinen sehr hoch war (41a). Im Gegensatz dazu zeigte die modifizierte DNA getrennte Peaks für die zwei Einzelstränge (41b), was die Überlegenheit dieses Ansatzes der Bestimmung von Molekulargewichten gegenüber gelelektrophoretischen Verfahren sogar noch deutlicher zeigt. Obwohl keine Grundlinienauflösung erhalten wurde, konnten die einzelnen Massen mit einer Genauigkeit von 0,1% zugewiesen werden: Δm = 27 u für den leichteren (ber. Masse 30224 u) und Δm = 14 u für den schwereren Strang (ber. Masse = 30750 u). Es wurde wiederum gefunden, dass die volle Breite bei halbem Maximum für die 7-Deazapurin-haltige Probe wesentlich verringert war.
  • Im Fall des 99-mers und des 103-mers scheinen die 7-Deazapurin-haltigen Nukleinsäuren eine höhere Empfindlichkeit zu ergeben, obwohl sie noch etwa 20% unmodifizierte Purin-Nukleotide enthalten. Um ein vergleichbares Signal-Rausch-Verhältnis bei ähnlichen Intensitäten für die (M + H)+-Signale zu erhalten, waren bei dem unmodifizierten 99-mer 20 Laserstöße erforderlich, im Gegensatz zu 12 Laserstößen für das modifizierte, und bei dem 103-mer waren 12 Stöße für die unmodifizierte Probe erforderlich, im Gegensatz zu drei Stößen für das 7-Deazapurinnukleosid-haltige Amplifikationsprodukt.
  • Beim Vergleich der Spektren des modifizierten und des unmodifizierten 200-mer-Amplikons wurde wiederum eine verbesserte Massenauflösung für die 7-Deazapurinhaltige Probe sowie verbesserte Signalintensitäten gefunden (42A und 42B). Während das Signal der Einzelstränge im Spektrum der modifizierten Probe überwiegt, ergaben der DNA-Doppelstrang und Dimere der Einzelstränge das stärkste Signal für die unmodifizierte Probe.
  • Eine vollständige 7-Deazapurin-Modifikation von Nukleinsäuren kann entweder unter Verwendung von modifizierten Primern in der PCR oder durch Spalten der unmodifizierten Primer vom teilweise modifizierten Amplifikationsprodukt erzielt werden. Da mit modifizierten Primern Nachteile verbunden sind, wie vorstehend beschrieben, wurde ein 100-mer unter Verwendung von Primern mit einer Ribo-Modifikation synthetisiert. Die Primer wurden hydrolytisch mit NaOH nach einem zuvor in unserem Labor entwickelten Verfahren gespalten (Koester, H., et al. Z. Physiol. Chem. 359, 1570–1589). Die 43A und 43B zeigen die Spektren des amplifizierten Produkts vor und nach der Primerabspaltung. 43b zeigt, dass die Hydrolyse erfolgreich war: Das hydrolysierte Amplifikationsprodukt sowie die beiden freigesetzten Primer konnten zusammen mit einem kleinen Signal von restlichem ungespaltenem 100-mer nachgewiesen werden. Diese Vorgehensweise eignet sich besonders für die MALDI-TOF-Analyse von sehr kurzen PCR-Produkten, da der Anteil an unmodifizierten Purinen, der von dem Primer stammt, mit abnehmender Länge der amplifizierten Sequenz zunimmt.
  • Die bemerkenswerten Eigenschaften von 7-Deazapurin-modifizierten Nukleinsäuren können entweder durch eine effektivere Desorption und/oder Ionisation, durch eine erhöhte Ionenstabilität und/oder durch eine niedrigere Denaturierungsenergie der doppelsträngigen Purin-modifizierten Nukleinsäure erklärt werden. Der Austausch des N-7 gegen eine Methylgruppe führt zum Verlust eines Akzeptors für eine Wasserstoffbindung, wodurch die Fähigkeit der Nukleinsäure zur Ausbildung von Sekundärstrukturen aufgrund von Nicht-Watson-Crick-Basenpaarung beeinflusst wird (Seela, F., und A. Kehne (1987), Biochemistry 26, 2232–2238). Zusätzlich dazu besitzt das aromatische System von 7-Deazapurin eine geringere Elektronendichte, die die Watson-Crick Basenpaarung schwächt, was zu einem verringerten Schmelzpunkt des Doppelstrangs führt (Mizusawa, S. et al. (1986), Nucleic Acids Res. 14, 1319–1324). Dieser Effekt kann die für die Denaturierung der Duplex im MALDI-Verfahren benötigte Energie verringern. Diese Gesichtspunkte sowie der Verlust einer Stelle, die vermutlich eine positive Ladung am N-7-Stickstoffatom trägt, machen die 7-Deazapurin-modifizierte Nukleinsäure weniger polar und können die Effektivität der Desorption verbessern.
  • Aufgrund der Abwesenheit von N-7 als Protonenakzeptor und der geringeren Polarisierung der C-N-Bindung in 7-Deazapurin-Nukleosiden wird die Depurinierung nach den für die Hydrolyse in Lösung etablierten Mechanismen verhindert. Obwohl eine direkte Korrelation von Reaktionen in Lösung und in der Gasphase problematisch ist, ist aufgrund von Depurinierung der modifizierten Nukleinsäuren im MALDI-Verfahren eine verringerte Fragmentierung zu erwarten. Die Depurinierung kann entweder von einem Ladungsverlust begleitet sein, wodurch die Gesamtausbeute an geladenen Spezies verringert wird, oder es können geladene Fragmentierungsprodukte erzeugt werden, wodurch die Intensität des Signals für das unfragmentierte Molekülion verringert wird.
  • Die Beobachtung einer erhöhten Empfindlichkeit und eines verringerten Peakauslaufens der (M + H)+-Signale auf der Seite der geringeren Masse aufgrund von verringerter Fragmentierung der 7-Deazapurin-haltigen Proben zeigt, dass das N-7-Atom tatsächlich für den Mechanismus der Depurinierung im MALDI-TOF-Verfahren wesentlich ist. Folglich zeigen 7-Deazapurin-haltige Nukleinsäuren eine eindeutig erhöhte Ionenstabilität und Empfindlichkeit unter MALDI-TOF-Bedingungen und stellen daher eine höhere Massengenauigkeit und Massenauflösung bereit.
  • BEISPIEL 9
  • Festphasensequenzierung und massenspektrometrischer Nachweis
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Oligonukleotide wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) in ungereinigter Form bezogen. Die Sequenzierungsreaktionen wurden an einer festen Oberfläche durchgeführt, wobei Reagenzien aus dem Sequenzierkit für Sequenase Version 2.0 (Amersham, Arlington Heights, Illinois) verwendet wurden. Sequenzierung eines 39-mer-Ziels Sequenzierkomplex:
    Figure 00870001
  • Um die Festphasen-DNA-Sequenzierung durchzuführen, wurde die Matrizenstrang-DNA 11683 durch terminale Desoxynukleotidyl-Transferase 3'-biotinyliert. Eine 30 μl-Reaktion, die 60 pmol DNA11683, 1,3 nmol Biotin-14-dATP (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 30 Einheiten Terminale Transferase (Amersham, Arlington Heights, Illinois) und 1 × Reaktionspuffer (bezogen mit dem Enzym) enthielt, wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die Reaktion wurde durch Hitze-Inaktivierung der Terminalen Transferase bei 70°C für 10 min beendet. Das resultierende Produkt wurde mittels Durchleiten durch eine TE-10-Zentrifugiersäule (Clontech) entsalzt. Mehr als ein Molekül des Biotin-14-dATP konnte an das 3'-Ende der DNA116S3 angefügt werden. Die biotinylierte DNA11683 wurde mit 0,3 mg Dynal Streptvidinperlen in 30 μl 1 × Bindungs- und Waschpuffer bei Umgebungstemperatur für 30 min inkubiert. Die Perlen wurden zweimal mit TE gewaschen und in 30 μl TE gelöst, ein 10 μl-Aliquot (das 0,1 mg Perlen enthielt) wurde für Sequenzierungsreaktionen verwendet.
  • Die 0,1 mg Perlen aus dem vorhergehenden Schritt wurden in einem Volumen von 10 μl resuspendiert, das 2 μl 5 × Sequenase-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2 und 250 mM NaCl) aus dem Sequenasekit und 5 pmol des entsprechenden Primers PNA 16/DNA enthielt. Das Anlagerungsgemisch wurde auf 70°C erhitzt und dann langsam über einen Zeitraum von 20–30 min auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Dann wurden 1 μl 0,1 M Dithiothreitol-Lösung, 1 μl Mn-Puffer (0,15 M Natriumisocitrat und 0,1 M MgCl2) und 2 μl verdünnte Sequenase (3,25 Einheiten) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde in vier Aliquote mit jeweils 3 μl aufgeteilt und mit den Terminationsgemischen vermischt (jeder enthält 3 μl des entsprechenden Terminationsgemischs: 32 μM c7-dATP, 32 μM dCTP, 32 μlM c7-dGTP, 32 μM dTTP und 3,2 μM eines der vier ddTNPs in 50 mM NaCl). Die Reaktionsgemische wurden für 2 min bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Extension wurden die Perlen präzipitiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Perlen wurden zweimal gewaschen, in TE resuspendiert und bei 4°C belassen. Sequenzierung eines 78-mer Ziels Sequenzierkomplex:
    Figure 00880001
  • Das Ziel TNR·PLASM2 wurde biotinyliert und unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben (Sequenzierung eines 39-mer-Ziels), sequenziert. Sequenzierung eines 15-mer Ziels mit teilweiser Duplex-Sonde Sequenzierkomplex:
    Figure 00880002
  • CM1B3B wurde an Dynabeads M280 mit Streptavidin (Dynal, Norwegen) immobilisiert, indem 60 pmol CM1B3B mit 0,3 Magnetperlen in 30 μl 1 M NaCl und TE (1 × Bindungs- und Waschpuffer) bei Raumtemperatur 30 min inkubiert wurden.
  • Die Perlen wurden zweimal mit TE gewaschen und in 30 μl TE gelöstt, ein 10 oder 20 μl-Aliquot (das 0,1 bzw. 0,2 mg Perlen enthielt) wurde für Sequenzierungsreaktionen verwendet.
  • Der Doppelstrang wurde durch Anlagerung eines entsprechenden Aliquots an Perlen aus dem vorhergehenden Schritt mit 10 pMol DF11a5F (oder 20 pMol DF11a5F für 0,2 mg Perlen) in einem Volumen von 9 μl hergestellt, das 2 μl 5 × Sequenase-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2 und 250 mM NaCl) aus dem Sequenasekit enthielt. Das Anlagerungsgemisch wurde auf 65°C erhitzt und langsam über einen Zeitraum von 20–30 min auf 37°C abkühlen gelassen. Der Duplexprimer wurde dann mit 10 pmol TS10 (20 pMol TS10 für 0,2 mg Perlen) in einem Volumen von 1 μl gemischt, und das resultierende Gemisch wurde weiter 5 min bei 37°C, 5–10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 1 μl 0,1 M Dithiothreitol-Lösung, 1 μl Mn-Puffer (0,15 M Natriumisocitrat und 0,1 M MnCl2) und 2 μl verdünnte Sequenase (3,25 Einheiten) hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde in vier Aliquote mit jeweils 3 μl aufgeteilt und mit den Terminationsgemischen (jeder enthält 4 μl des entsprechenden Terminationsgemischs: 16 μM dATP, 16 μM dCTP, 16 μM dGTP 16 μM dTTP und 1,6 μM eines der vier ddNTPs in 50 mM NaCl) vermischt. Die Reaktionsgemische wurden 5 min bei Raumtemperatur und 5 min bei 37°C inkubiert. Nach Beendigung der Extension wurden die Perlen präzipitiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Perlen wurden in 20 μl TE resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Ein 2 μl-Aliquot (von 20 μl) wurde aus jedem Röhrchen entnommen und mit 8 μl Formamid gemischt, die resultierenden Proben wurden bei 90–95°C für 5 min denaturiert, und 2 μl (von insgesamt 10 μl) wurden auf ein ALF-DNA-Sequenziergerät (Pharmacia, Piscataway, NJ) aufgetragen, wobei ein 10%-iges Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff und 0,6 × TBE verwendet wurde. Das verbleibende Aliquot wurde zur MALDI-TOF-MS-Analyse verwendet.
  • MALDI-Probenherstellung und -Instrumente
  • Vor der MALDI-Analyse wurden die mit der Sequenzierleiter beladenen Magnetperlen zweimal unter Verwendung von 50 mM Ammoniumcitrat gewaschen und in 0,5 μl reinem Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde dann auf das Probenziel des Massenspektrometers geladen, und 0,5 μl gesättigte Matrix-Lösung (3-Hydroxypicolinsäure (HPA):Ammoniumcitrat 10:1 Molverhältnis in 50% Acetonitril) wurden zugegeben. Das Gemisch ließ man vor der mässenspektrometrischen Analyse trocknen.
  • Das Reflektron-TOF-MS-Massenspektrometer (Vision 2000, Finnigan MAT, Bremen, Deutschland) wurde für die Analyse verwendet. 5 kV wurden an der Ionenquelle angelegt, und 20 kV wurden für die Nachbeschleunigung angelegt. Alle Spektren wurden im Positiv-Ionen-Modus aufgenommen, und ein Stickstofflaser wurde verwendet. Normalerweise wurde jedes Spektrum über mehr als 100 Stöße gemittelt, und es wurde eine Standard-25-Punkt-Glättang angewendet.
  • ERGEBNISSE UND DISKUSSION
  • Herkömmliche Festphasensequenzierung
  • Bei herkömmlichen Sequenzierverfahren wird ein Primer direkt an die Matrize hybridisiert und dann verlängert und in einer Sanger-Didesoxy-Sequenzierung terminiert. Üblicherweise wird ein biotinylierter Primer verwendet, und die Sequenzierleitern werden durch Streptavidin-beschichtete Magnetperlen gefangen. Nach dem Waschen werden die Produkte unter Verwendung von EDTA und Formamid von den Perlen eluiert. Frühere Befunde deuteten an, dass nur der angelagerte Strang des Doppelstranges desorbiert wird und dass der immobilisierte Strang auf den Perlen verbleibt. Daher ist es vorteilhaft, die Matrize zu immobilisieren und den Primer zu verlängern. Nach der Sequenzierreaktion und dem Waschen können die Perlen mit der immobilisierten Matrize und der hybridisierten Sequenzierleiter direkt auf das Massenspektrometerziel geladen und mit Matrix gemischt werden. Bei der MALDI wird nur die angelagerte Sequenzierleiter desorbiert und ionisiert, und die immobilisierte Matrize verbleibt auf dem Ziel.
  • Eine 39-mer-Matrize (SEQ ID Nr. 23) wurde zunächst am 3'-Ende biotinyliert, indem Biotin-14-dATP mit terminaler Transferase zugegeben wurde. Mehr als ein Biotin-14-dATP-Molekül konnte durch das Enzym hinzugefügt werden. Da die Matrize immobilisiert war und während der MALDI auf den Perlen verblieb, werden die Massenspektren nicht durch die Anzahl an Biotin-14-dATP beeinflusst. Ein 14-mer-Primer (SEQ ID Nr. 24) wurde zur Festphasensequenzierung verwendet, um die nachstehenden DNA-Fragmente 3–27 (SEQ ID Nr. 142–166) zu erzeugen. Die MALDI-TOF-Massenspektren der vier Sequenzierleitern sind in 44 gezeigt, und die erwarteten theoretischen Werte sind in Tabelle III gezeigt. TABELLE III
    Figure 00910001
    TABELLE III (Fortsetzung)
    A-Reaktion C-Reaktion G-Reaktion T-Reaktion
    1.
    2. 4223.8 4223.8 4223.8 4223.8
    3. 4521.1
    4. 4809.2
    5. 5133.4
    6. 5434.6
    7. 5737.8
    8. 6051.1
    9 . 6379.2
    10. 6704.4
    11. 6995.6
    12. 7284.8
    13. 7574.0
    14. 7878.2
    15. 8207.4
    16. 8495.6
    17. 8808.8
    18. 9097.0
    19. 9386.2
    20. 9699.4
    21. 10027.6
    22. 10355.8
    23. 10644.0
    24. 10933.2
    25. 11246.4
    26. 11574.6
    27. 11886.8
  • Die Sequenzierreaktion führte zu einer relativ homogenen Leiter, und die Vollängensequenz wurde leicht bestimmt. Ein Peak um 5150 erschien in allen Reaktionen und wurde nicht identifiziert. Eine mögliche Erklärung ist, dass ein kleiner Anteil der Matrize eine Art Sekundärstruktur bildete, wie etwa eine Schleife, die die Sequenase-Extension behinderte. Der Falscheinbau ist von geringer Bedeutung, da die Intensität dieser Peaks viel geringer war, als die der Sequenzierleitern. Obwohl in der Sequenzierreaktion 7-Deazapurine verwendet wurden, die die N-glykosidische Bindung stabilisieren und eine Depurinierung verhindern konnten, wurden dennoch geringe Basenverluste beobachtet, da der Primer nicht durch 7-Deazapurine substituiert war. Die Vollängenleiter mit ddA am 3'-Ende erschien in der A-Reaktion mit einer scheinbaren Masse von 11899,8. Ein intensiverer Peak bei 12333 erschien in allen vier Reaktionen und ist wahrscheinlich auf die Hinzufügung eines zusätzlichen Nukleotids durch das Sequenase-Enzym zurückzuführen.
  • Dieselbe Technik konnte verwendet werden, um längere DNA-Fragmente zu sequenzieren. Eine 78-mer-Matrize, die einen CTG-Repeat enthielt (SEQ ID Nr. 25), wurde 3'-biotinyliert, indem Biotin-14-dATP mit Terminaler Transferase angefügt wurde. Ein 18-mer-Primer (SEQ ID Nr. 26) wurde gerade außerhalb des CTG-Repeats hybridisiert, so dass der Repeat unmittelbar nach der Primerextension sequenziert werden konnte. Die vier Reaktionen wurden gewaschen und wie üblich durch MALDI-TOF-MS analysiert. Ein Beispiel der G-Reaktion ist in 45 gezeigt (SEQ ID Nr. 167–220), und die erwartete Sequenzierleiter ist in der Tabelle IV mit den theoretischen Massenwerten für jede Leiterkomponente gezeigt. Alle Sequenzierpeaks wurden gut aufgelöst, mit Ausnahme der letzten Komponente, (theoretischer Wert 20577,4) die nicht vom Hintergrund unterschieden werden konnte. Zwei benachbarte Sequenzierpeaks (ein 62-mer und ein 63-mer) wurden ebenfalls getrennt, was darauf hindeutet, dass diese Sequenzieranalyse auf längere Matrizen angewendet werden könnte. In diesem Spektrum wurde wiederum die Hinzufügung eines zusätzlichen Nukleotids durch das Sequenase-Enzym beobachtet. Diese Hinzufügung ist nicht matrizenspezifisch und erschien in allen vier Reaktionen, sodass sie leicht identifiziert werden kann. Verglichen mit den Primerpeaks lagen die Sequenzierpeaks im Fall der langen Matrize bei einer viel geringeren Intensität. TABELLE IV
    Figure 00940001
    Figure 00950001
    Figure 00960001
    Figure 00970001
    TABELLE IV (Fortsetzung)
    ddATP ddCTP ddGTP ddTTP
    1. 5491.6 5491.6 5491.6 5491.6
    2. 5764.8
    3. 6078.0
    4. 6407.2
    5. 6696.4
    6. 7009.6
    7. 7338.8
    8. 7628.0
    9. 7941.2
    10. 8270.4
    11. 8559.6
    12. 8872.8
    13. 9202.0
    14. 9491.2
    15. 9804.4
    16. 10133.6
    17. 10422.88
    18. 10736.0
    19. 11065.2
    20. 11354.4
    21. 11667.6
    22. 11996.8
    23. 12286.0
    24. 12599.2
    25. 12928.4
    26. 13232.6
    27. 13521.8
    28. 13835.0
    29. 14124.2
    30. 14453.4
    31. 14742.6
    32. 15046.8
    33. 15360.0
    34. 15673.2
    35. 15962.4
    36. 16251.6
    37. 16580.8
    38. 16894.0
    39. 17207.2
    40. 17511.4
    41. 17800.6
    42. 18189.8
    43. 18379.0
    44. 18683.2
    45. 19012.4
    46. 19341.6
    47. 19645.8
    48. 19935.0
    49. 20248.2
    50. 20577.4
    51. 20890.6
    52. 21194.4
    53. 21484.0
    54. 21788.2
    55. 22092.4
  • Sequenzierung unter Verwendung von Duplex-DNA-Sonden zum Einfangen und Primen
  • Es wurde gezeigt, dass Duplex-DNA-Sonden mit einzelsträngigem Überhang spezifische DNA-Matrizen einfangen und auch als Primer zur Festphasensequenzierung dienen können. Das Schema ist in 46 gezeigt.
  • Stacking-Wechselwirkungen zwischen einer Duplex-Sonde und einer einzelsträngen Matrize ermöglichen, dass nur ein 5'-Überhang zum Einfangen ausreichend ist. Auf Basis dieses Formats wurde ein 5'-fluoreszenzmarkiertes 23-mer (5'-GAT GAT CCG ACG CAT CAC AGC TC-3') (SEQ ID Nr. 29) an ein 3'-biotinyliertes 18-mer (5'-GTG ATG CGT CGG ATC ATC-3') (SEQ ID Nr. 30) hybridisiert, wobei ein 5-Basen-Überhang verblieb. Eine 15-mer-Matrize (5'-TCG GTT CCA AGA GCT-3') (SEQ ID Nr. 31) wurde durch den Doppelstrang eingefangen, und Sequenzierreaktionen wurden durch Extension des 5-Basen-Überhangs durchgeführt. Die MALDI-TOF-Massenspektren der Reaktionen sind in 47A–D gezeigt. Alle Sequenzierpeaks wurden aufgelöst, wenn auch bei relativ niedrigen Intensitäten. Der letzte Peak in jeder Reaktion ist auf eine unspezifische Hinzufügung eines Nukleotids an das Vollängen-Extensionsprodukt durch das Sequenase-Enzym zurückzuführen. Zum Vergleich wurden die gleichen Produkte auf ein herkömmliches DNA-Sequenziergerät aufgetragen, und das Stacking-Fluorogramm der Ergebnisse ist in 48 gezeigt. Wie aus der Figur ersichtlich ist, hatten die Massenspektren das gleiche Muster wie das Fluorogramm, wobei die Sequenzierpeaks im Vergleich zu dem 23-mer-Primer bei viel niedrigeren Intensitäten lagen.
  • BEISPIEL 10
  • Thermo-Sequenase-Zyklus-Sequenzierung
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • PCR-Amplifikation. Genomische DNA aus menschlichen Leukozyten wurde für die PCR-Amplifikation verwendet. Die PCR-Primer zur Amplifikation eines 209-bp-Fragments des β-Globin-Gens waren der β2-Vorwärts-Primer (5'-CAT TTG CTT CTG ACA CAA CTG-3', SEQ ID Nr. 32) und der β11-Rückwärts-Primer (5'-CTT CTC TGT CTC CAC ATG C-3', SEQ ID Nr. 33). Taq-Polymerase und 10 × Puffer wurden von Boehringer Mannheim (Deutschland) und dNTPs von Pharmacia (Freiburg, Deutschland) bezogen. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 50 μl, einschließlich 8 pmol jedes Primers mit etwa 200 ng als Matrize verwendeter genomischer DNA und einer dNTP-Endkonzentration von 200 μM. Die PCR-Bedingungen waren: 5 min bei 94°C, gefolgt von 40 Zyklen mit 30 sek bei 94°C, 45 sek bei 53°C, 30 sek bei 72°C und einer abschließenden Extensionszeit von 2 min bei 72°C. Das erzeugte Amplifikationsprodukt wurde gereinigt und mit dem Qiagen-"Qiaquick" PCR-Reinigungskit (Nr. 28106) aufkonzentriert (2×) und in H2O gelagert.
  • Zyklus-Sequenzierung. Sequenzierleitern wurden durch Primerextension mit ThermoSequenaseTM-DNA-Polymerase (Amersham LIFE Science, Nr. E79000Y) unter den folgenden Bedingungen hergestellt: 7 pmol HPLC-gereinigter Primer (Cod5 12-mer: 5'- TGC ACC TGA CTC-3', SEQ ID Nr. 34) wurden zu 6 μl des gereinigten und aufkonzentrierten Amplifikationsprodukts (d. h. 12 μl des ursprünglichen Amplifikationsprodukts), 2,5 Einheiten Thermo Sequenase und 2,5 ml Thermo-Sequenase-Reaktionspuffer in einem Gesamtvolumen von 25 μl zugegeben. Die Nukleotid-Endkonzentrationen betrugen 30 μM des entsprechenden ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP; Pharmacia Biotech, #27-2045-01) und 210 μM jedes dNTPs (7-Deaza-dATP, dCTP, 7-Deaza-GTP, dTTP; Pharmacia Biotech).
  • Die Zyklusbedingungen waren: Denaturieren für 4 min bei 94°C, gefolgt von 35 Zyklen mit 30 sek bei 94°C, 30 sek bei 38°C, 30 sek bei 55°C und einer abschließenden Extension von 2 min bei 72°C.
  • Probenherstellung und Analyse durch MALDI-TOF MS. Nach Beendigung des Zyklusprogramms wurde das Reaktionsvolumen durch Zugabe von 25 μl H2O auf 50 μl erhöht. Die Entsalzung wurde erreicht, indem 30 μl Ammonium-gesättigte DOWEX (Fluka #44485) Kationenaustauschperle mit 50 μl des Analyten für 2 min bei Raumtemperatur geschüttelt wurden. Die in protonierter Form bezogenen Dowex-Perlen wurden mit 2 M NH4OH vorbehandelt, um sie in die Ammoniumform umzuwandeln, dann mit H2O gewaschen, bis der Überstand neutral war, und schließlich zum Gebrauch in 10 mM Ammoniumcitrat gegeben. Nach dem Kationenaustausch wurde die DNA durch Ethanolpräzipitation gereinigt und aufkonzentriert, indem 5 μl 3 M Ammoniumacetat (pH 6,5), 0,5 μl Glycogen (10 mg/ml, Sigma) und 110 μl absolutes Ethanol zum Analyten zugegeben wurden und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Nach 12-minütiger Zentrifugation bei 20.000 × g wurde das Sediment in 70%-igem Ethanol gewaschen und in 1 μl 18 MOhm/cm H2O Wasser resuspendiert.
  • Für die MALDI-TOF-MS-Analyse wurden 0,35 μl der resuspendierten DNA mit 0,35–1,3 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), 0,07 M Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) auf einer Edelstahl-Probenzielscheibe gemischt und trocknen gelassen, bevor das Spektrum unter Verwendung eines im Reflektron-Modus betriebenen Thermo Bioanalysis Vision 2000-MALDI-TOF mit 5 bzw. 20 kV an der Ziel- bzw. Umwandlungsdynode aufgenommen wurde. Die aus acht Peaks (3000–18.000 Da) gebildete externe Kalibrierung wurde für alle Spektren verwendet.
  • ERGEBNISSE
  • 49 zeigt ein MALDI-TOF-Massenspektrum der Sequenzierleiter, die aus einem biologischen Amplifikationsprodukt als Matrize und einem 12-mer (5'-TGC ACC TGA CTC-3', SEQ ID Nr. 34) als Sequenzierprimer erzeugt wurde. Die auf Depurinierungen zurückzuführenden Peaks und solche Peaks, die nicht mit der Sequenz zusammenhängen, sind mit einem Sternchen markiert. Die MALDI-TOF MS-Messungen wurden an einem Reflektron-TOF MS aufgenommen. A.) Sequenzierleiter gestoppt mit ddATP; B.) Sequenzierleiter gestoppt mit ddCTP; C.) Sequenzierleiter gestoppt mit ddGTP; D.) Sequenzierleiter gestoppt mit ddTTP. 50 zeigt eine schematische Darstellung der in 49 hergestellten Sequenzierleiter mit den entsprechenden berechneten Molekülmassen bis zu 40 Basen nach dem Primer (SEQ ID Nr. 221–260). Für die Berechnung wurden die folgenden Massen verwendet: 3581,4 Da für den Primer, 312,2 Da für 7-Deaza-dATP, 304,2 Da für dTTP, 289,2 Da für dCTP und 328,2 Da für 7-Deaza-dGTP.
  • 51 zeigt die Sequenz des amplifizierten 209-bp-Amplifikationsprodukts im β-Globin-Gen (SEQ ID Nr. 261), das als Matrize für die Sequenzierung verwendet wurde. Die Sequenzen des entsprechenden Amplifikationsprimers und die Stelle des 12-mer-Sequenzierprimers sind ebenfalls gezeigt. Diese Sequenz stellt eine homozygote Mutante an der Position 4 Basen hinter dem Primer dar. In der Wildtypsequenz wäre dieses T durch ein A ersetzt.
  • BEISPIEL 11
  • Mikrosatellitenanalyse unter Verwendung von Primer-Oligo-Basen-Extension (PROBE) und MALDI-TOF-Massenspektrometrie
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Das Verfahren verwendet einen einzelnen Nachweisprimer, gefolgt von einem Oligonukleotid-Extensionsschritt, um Produkte zu erhalten, die sich in ihrer Länge um eine Anzahl von Basen unterscheiden, die spezifisch für die Anzahl der Wiederholungs-Einheiten oder für Sekundärstellen-Mutationen innerhalb des wiederholten Bereichs sind, die leicht durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie aufgelöst werden können. Das Verfahren wird unter Verwendung des AluVpA-Polymorphismus im Intron 5 des Interferon-α-Rezeptorgens, das sich auf dem menschlichen Chromosom 21 befindet, und des Poly-T-Trakts der Spleißakzeptorstelle des Introns 8 des CFTR-Gens, das sich auf dem menschlichen Chromosom 7 befindet, als Modellsystem demonstriert.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Genomische DNA wurde von 18 nicht verwandten Individuen und von einer Familie mit Mutter, Vater und drei Kindern erhalten. Der wiederholte Bereich wurde auf herkömmliche Weise durch denaturierende Gelelektrophorese bestimmt, und die erhaltenen Ergebnisse wurden durch Standard-Sanger-Sequenzierung bestätigt.
  • Die Primer für die PCR-Amplifikation (jeweils 8 pmol) waren IFNAR-1VS5-5': (5'-TGC TTA CTT AAC CCA GTG TG-3', SEQ ID Nr. 35) und IFNAR-1VS5-3'.2: (5'-CAC ACT ATG TAA TAC TAT GC-3', SEQ ID Nr. 36) für einen Teil des Introns 5 des Interferon-α-Rezeptor-Gens und CFEx9-F: (5'-GAA AAT ATC TGA CAA ACT CAT C-3', SEQ ID Nr. 37) (5'-biotinyliert) und CFEx9-R: (5'-CAT GGA CAC CAA ATT AAG TTC-3', SEQ ID Nr. 38) für das CFTR-Exon 9 mit flankierenden Intronsequenzen des CFTR-Gens. Taq-Polymerase, einschließlich 10×-Puffer, wurde von Boehringer-Mannheim bezogen, und die dNTPs wurden von Pharmacia erhalten. Das Gesamtreaktionsvolumen betrug 50 μl. Die PCR-Bedingungen waren 5 min bei 94°C, gefolgt von 40 Zyklen: 1 min bei 94°C, 45 sek bei 53°C und 30 sek bei 72°C, sowie einer abschließenden Extensionsdauer von 5 min bei 72°C.
  • Die Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung des PCR-Reinigungs-Kits von Qiagen (Nr. 28106) gemäß den Herstellerangaben gereinigt. Die gereinigten Produkte wurden aus der Säule in 50 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) eluiert.
  • A) Die Primer-Oligo-Basen-Extension (Thermocycling-Verfahren CyclePROBE) wurde mit 5 pMol des geeigneten Nachweis-Primers (IFN: 5'-TGA GAC TCT GTC TC-3', SEQ ID Nr. 39) in einem Gesamtvolumen von 25 μl, einschließlich 1 pMol gereinigter Matrize, 2 Einheiten Thermosequenase (Amersham Life Science, Kat. Nr. E79000Y), 2,5 μl Thermosequenase-Puffer, jeweils 25 μmol Desoxynukleotid (7-Deaza-dATP, dTTP und in einigen Experimenten zusätzlich dCTP) und 100 μmol Didesoxyguanin und in einigen Experimenten zusätzlich ddCTP durchgeführt. Zyklusbedingungen: anfängliche Denaturierung bei 94°C für 5 min, gefolgt von 30 Zyklen 30 sek bei 44°C Hybridisierungstemperatur und 1 min bei 55°C Extensionstemperatur.
  • Primer-Oligo-Basen-Extension (isothermes Verfahren)
  • 10 μl-Aliquote des gereinigten doppelsträngigen Amplifikationsprodukts (~ 3 pMol) wurden in ein Streptavidin-beschichtetes Well einer Mikrotiterplatte (~ 16 pMol Kapazität pro 50 μl-Volumen; Nr. 1645684, Boehringer-Mannheim) überführt, gefolgt von der Zugabe von 10 μl Inkubationspuffer (80 mM Natriumphosphat, 400 mM NaCl, 0,4% Tween 20, pH 7,5) und 30 μl Wasser. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Wells dreimal mit 200 μl Waschpuffer A (40 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 8,8) gewaschen und mit 100 μl 50 mM NaOH 3 min inkubiert, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren. Anschließend wurden die Wells dreimal mit 200 μl 70 mM Ammoniumcitrat-Lösung gewaschen.
  • Das Anlagern von 100 pmol Nachweis-Primer (CFpT: 5'-TTC CCC AAA TCC CTG-3', SEQ ID Nr. 40) erfolgte in 50 μl Hybridisierungspuffer (50 mM Ammoniumphosphat-Puffer, pH 7,0 und 100 mM Ammoniumchlorid) für 2 min bei 65°C, 10 min bei 37°C und 10 min bei Raumtemperatur. Die Wells wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer B (40 mM Tris, 1 mM EDTA, 50 mM NH4Cl, 0,1% Tween 20, pH 8,8) und einmal in 200 μl TE-Puffer gewaschen. Die Extensionsreaktion wurde unter Verwendung einiger Komponenten des DNA-Sequenzier-Kits von USB (Nr. 70770) und dNTPs oder ddNTPs von Pharmacia durchgeführt. Das Gesamt-Reaktionsvolumen betrug 45 μl, worin 21 μl Wasser, 6 μl Sequenase-Puffer, 3 μl 100 mM DTT-Lösung, 50 μl 7-Deaza-dATP, 20 μmol ddCTP, 5,5 μl Glycerin-Enzymverdünnungspuffer, 0,25 μl Sequenase 2.0 und 0,25 μl Pyrophosphatase enthalten waren. Die Reaktion wurde auf Eis pipettiert und 15 min bei Raumtemperatur sowie 5 min bei 37°C inkubiert. Die Wells wurden abschließend dreimal mit 200 μl Waschpuffer B gewaschen.
  • Der verlängerte Primer wurde durch 10-minütiges Erhitzen in 50 μl einer 50 mM Ammoniumhydroxid-Lösung bei 80°C vom Matrizenstrang denaturiert.
  • Zur Präzipitation wurden 10 μl 3 M NH4-Acetat (pH 6,5), 0,5 μl Glykogen (10 mg/ml Wasser, Sigma Kat. Nr. G1765) und 110 μl absolutes Ethanol zum Überstand zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 g wurde das Sediment in 70%-igem Ethanol gewaschen und in 1 μl Wasser mit 18 MOhm/cm H2O Wasser resuspendiert.
  • Die Probenherstellung erfolgte durch Mischen von 0,6 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M dibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) mit 0,3 μl des resuspendierten DNA/Glycogen-Sediments auf einem Probenziel und Trocknen lassen an Luft. Bis zu 20 Proben wurden punktförmig auf eine Probenzielscheibe zum Einbringen in den Quellenbereich eines Thermo-Bioanalysis (früher Finnigan) Visions 2000 MALDITOF-Gerätes, welches im Reflektron-Modus mit 5 und 20 kV an der Ziel- bzw. an der Umwandlungsdynode betrieben wurde, aufgetragen. Die theoretische durchschnittliche Molekülmasse (Mr(ber.)) wurde aus den atomaren Zusammensetzungen berechnet, die aufgezeichneten experimentellen Mr-Werte (Mr(exp.)) sind diejenigen der einfach-protonierten Form, die unter Verwendung externer Kalibrierung bestimmt wurden.
  • ERGEBNISSE
  • Das Ziel der Experimente bestand darin, ein schnelles und zuverlässiges Verfahren zur exakten Bestimmung der Anzahl von Repeat-Einheiten in Mikrosatelliten oder der Länge eines Mononukleotid-Abschnittes zu entwickeln, welches das Potential besitzt, Sekundärstellenmutationen innerhalb des polymorphen Bereiches nachzuweisen. Daher wurde eine bestimmte Art der DNA-Sequenzierung (Primer Oligo Basen Extension, PROBE) mit der Beurteilung der resultierenden Produkte durch Matrix-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisations-(MALDI)-Massenspektrometrie (MS) kombiniert. Die Flugzeit (TOF)-Reflektron-Anordnung wurde als mögliches Massenmessungssystem ausgewählt. Als anfänglicher Eignungstest wurde zunächst eine Untersuchung am AIuVpA Repeat-Polymorphismus durchgeführt, der sich im Intron 5 des menschlichen Interferon-α-Rezeptor-Gens befindet (cyclePROBE-Reaktion) und als zweites am poly-T-Trakt, der sich im Intron 8 des menschlichen CFTR-Gens befindet (isotherme PROBE-Reaktion).
  • In 52 ist das cyclePROBE-Experiment für den AluVpA-Repeat-Polymorphismus schematisch dargestellt. Die Verlängerung des Antisense-Strangs (SEQ ID Nr. 262) wurde mit dem Sense-Strang durchgeführt, der als Matrize diente. Der Nachweisprimer ist unterstrichen. In einer Familien-Untersuchung konnte eine co-dominante Segregation der verschiedenen Allele durch das Elektrophorese-Verfahren sowie durch das cyclePROBE-Verfahren und anschließende Massenspektrometrie-Analyse gezeigt werden (53). Die Allele von der Mutter und von Kind 2, bei denen eine direkte Elektrophorese des amplifizierten Produktes ergab, dass eine der beiden Kopien 13 Wiederholungseinheiten besaß, wiesen gemäß cyclePROBE stattdessen nur 11 Einheiten auf, wobei ddG als Terminator verwendet wurde. Der Austausch von ddG durch ddC führte zu einem weiteren, unerwarteten kurzen Allel mit einer Molekülmasse von etwa 11.650 in der DNA der Mutter und von Kind 2 (54). Die Sequenzanalyse bestätigte das Vorliegen von zwei Sekundärstellenmutationen in dem Allel mit 13 Wiederholungseinheiten. Die erste ist eine C-zu-T-Transition in der dritten Wiederholungseinheit, und die zweite Mutation ist eine T-zu-G-Transversion in der neunten Wiederholungseinheit. Die Untersuchung von 28 nicht verwandten Individuen mittels cyclePROBE ergab, dass das Allel mit 13 Einheiten in ein normales Allel und ein verkürztes Allel gespleißt wird. Eine statistische Auswertung zeigt, dass sich der Polymorphismus bei beiden Verfahren in einem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht befindet, bei Anwendung von cyclePROBE als Nachweisverfahren ist der Polymorphismus-Informationsgehalt jedoch auf 0,734 erhöht.
  • PROBE wurde auch als isothermes Verfahren zum Nachweis der 3 üblichen Allele an der Spleißakzeptorstelle von Intron 8 des CFTR-Gens (SEQ ID Nr. 263) verwendet. 55 zeigt eine schematische Darstellung der erwarteten diagnostischen Produkte (SEQ ID Nr. 264–266) mit den theoretischen Massenwerten. Die Reaktion wurde auch in der Antisense-Richtung durchgeführt.
  • 56 zeigt, dass alle drei üblichen Allele (T5, T7 bzw. T9) an diesem Locus mit diesem Verfahren zuverlässig offenbart werden konnten. Die 56 zeigt, dass die Massengenauigkeit und -präzision mit der in dieser Untersuchung verwendeten Reflektron-Laufzeit im Bereich von 0–0,4% lag, wobei die relative Standardabweichung 0,13% betrug. Dies ist weitaus besser als die Einzelbasengenauigkeit für die im IFNAR-System erzeugten < 90-mer-Diagnoseprodukte. Eine derart hohe analytische Sensitivität reicht aus, um in der Wiederholungseinheit oder ihren flankierenden Bereichen Einzel- oder Mehrfach-Insertions-/Deletions-Mutationen aufzuspüren, die bei einem 90-mer Massenabweichungen von > 1% hervorrufen würden. Dies ist analog zur polyT-Trakt-Analyse in 56. Andere Mutationen (d. h. eine A-zu-T- oder eine T-zu-A-Mutation im A3T-Repeat des IFNAR-Gens), die keine frühzeitige Produkttermination verursachen, sind bei keiner dNTP/ddNTP-Kombination mit PROBE und Niederleistungs-MS-Geräten nachweisbar; eine 9-Da-Verschiebung in einem 90-mer entspricht einer 0,03%-igen Massenabweichung. Es ist gezeigt worden, dass sich die zum Nachweis so geringer Massenabweichungen erforderliche Genauigkeit und Präzision mit leistungsfähigeren Geräten erreichen lässt, wie etwa Fourier-Transform (FT)-MS, bei der eine Einzel-Da-Genauigkeit bis zu 100-meren erzielt wird. Es ist außerdem gezeigt worden, dass Punktmutationen in Produkten mit vergleichbarer Größe mittels Tandem-FTMS, bei der ein Fragment mit Massenabweichung innerhalb des Gerätes isoliert und zur Erzeugung sequenzspezifischer Fragmente dissoziiert werden kann, auf die Base genau lokalisieren können. Die Kombination von PROBE mit einer leistungsfähigeren Ausrüstung wird somit eine Analyse-Empfindlichkeit besitzen, die ansonsten nur durch umständliches Sequenzieren des gesamten Wiederholungsbereiches erreicht werden kann.
  • BEISPIEL 12
  • Verbesserte Genotyp-Bestimmung von Apolipoprotein E mittels Primer-Oligo Basen-Extension (PROBE) und MALDI-TOF-Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • PCR-Amplifikation.
  • Menschliche genomische Leukozyten-DNA aus 100 anonymen Individuen einer zuvor veröffentlichten Untersuchung (Braun, A. et al. (1992), Human Genet. 89, 401–406) wurde unter Verwendung konventioneller Verfahren auf Apolipoprotein-E-Genotypen gescreent. PCR-Primer für die Amplifikation eines Abschnittes des Exons 4 des apo-E-Gens wurden entsprechend der veröffentlichten Sequenz (Das, HK et al. (1985), J. Biol. Chem. 260:6240–6247) abgeleitet (Vorwärts-Primer, apo-E-F: 5'-GGC ACG GCT GTC CAA GGA G-3', SEQ ID Nr. 41; Rückwärts-Primer, apo-E-R: 5'-AGG CCG CGC TCG GCG CCC TC-3', SEQ ID Nr. 42). Taq-Polymerase und 10×-Puffer wurden von Boehringer-Mannheim (Deutschland) bezogen, und die dNTPs von Pharmacia (Freiburg, Deutschland). Das Gesamt-Reaktionsvolumen betrug 50 μl, einschließlich 8 pmol jedes Primers und 10% DMSO (Dimethylsulfoxid, Sigma) mit etwa 200 ng genomischer DNA, die als Matrize verwendet wurde. Die Lösungen wurden auf 80°C erhitzt, bevor 1 E Polymerase zugegeben wurde; die PCR-Bedingungen waren: 2 min bei 94°C, gefolgt von 40 Zyklen 30 sek bei 94°C, 45 sek bei 63°C, 30 sek bei 72°C und einer abschließenden Extensionsdauer von 2 min bei 72°C.
  • Restriktionsenzymverdau und Polyacrylamid-Elektrophorese
  • Cfol und RsaI und Reaktionspuffer L wurden von Boehringer-Mannheim bezogen und Hhal von Pharmacia (Freiburg, Deutschland). Für einen Verdau mit Cfol allein und für einen gleichzeitigen Cfol/Rsal-Verdau wurden 20 pl amplifizierte Produkte mit 15 μl Wasser und 4 pl Puffer L von Boehringer-Mannheim verdünnt; nach Zugabe von 10 Einheiten des geeigneten Restriktionsenzyms/der geeigneten Restriktionsenzyme wurden die Proben 60 min bei 37°C inkubiert. Die Vorgehensweise für einen gleichzeitigen Hhal/Rsal-Verdau erforderte zunächst einen Verdau durch Rsal in Puffer L für eine Stunde, und die anschließende Zugabe von NaCl (50mM Endkonzentration) und Hhal und weitere Inkubation für eine Stunde. 20 pl des Restriktionsverdaus wurden auf einem 12%-igen Polyacrylamidgel, wie an anderer Stelle beschrieben (Hixson (1990) J. Lipid Res. 31 545–548), analysiert. Die Erkennungssequenzen von Rsal und Cfol (Hhal) sind GT/AC bzw. GCG/C, die Massen der erwarteten Verdaufragmente aus dem amplifizierten 252-mer-Produkt mit Cfol allein und aus dem gleichzeitigen Doppelverdau mit Cfol (oder Hhal) und Rsal sind in Tabelle V angegeben.
  • Thermo-PROBE
  • Die PCR-Amplifikation wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt, wobei die Produkte jedoch zur Entfernung nicht eingebauter Primer mit dem "Qiaquick"-Kit von Qiagen gereinigt wurden. Multiplex-Thermo-PROBE erfolgte mit 35 μl amplifiziertem Produkt und jeweils 8 pmol der Nachweis-Primer für Codon 112 (5'-GCG GAC ATG GAG GAC GTG-3', SEQ ID Nr. 43) und 158 (5'-GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3', SEQ ID Nr. 44) in 20 μl, einschließlich ~ 1 pmol gereinigter biotinylierter Antisense-Matrize, immobilisiert auf Streptavidin-beschichteten Magnetperlen, 2,5 Einheiten Thermosequenase, 2 μl Thermosequenasepuffer, 50 μM jedes dNTPs und 200 μM ddXTP, wobei die Basenidentität von N und X wie im Text erläutert ist. Die Zyklus-Bedingungen waren: Denaturierung (94°C, 30 sek), gefolgt von 30 Zyklen bei 94°C (10 min) und 60°C (45 sek).
  • Probenherstellung und Analyse durch MALDI-TOF-MS
  • Für die Präzipitation (Stults et al. (1991), Rapid Commun. Mass Spectrom. 5:359–363) beider Verdaus sowie der PROBE-Produkte wurden 5 μl 3 M Ammoniumacetat (pH 6,5), 0,5 μl Glykogen (10 mg/ml, Sigma) und 110 μl absolutes Ethanol zu 50 μl der Analytlösungen zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur gelagert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 × g wurde das Sediment in 70%-igem Ethanol gewaschen und in 1 μl Wasser mit 18 MOhm/cm H2O gewaschen. Wenn im Text angegeben erfolgte zusätzliches Entsalzen durch Schütteln von 10–20 μl Ammonium-gesättigten DOWEX (Fluka Nr. 44485) Kationenaustauschperlen in 40 μl Analyt. Die in protonierter Form bezogenen Perlen wurden mit drei 5-minütigen Zentrifugations-Dekantierschritten in 2 M NH4OH, gefolgt von H2O und 10 mM Ammoniumcitrat, vorbehandelt.
  • 0,35 μl resuspendierte DNA wurden auf einer Edelstahl-Probenzielscheibe mit 0,35–1,3 μl Matrixlösungen (Wu el al. (1993) Rapid Commun. Mass Spectrom. 7:142–146), (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), 0,07 M Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) gemischt und an der Luft trocknen gelassen, bevor die Spektralanalyse unter Verwendung eines Thermo-Bioanalysis Vision 2000 MALDI-TOF erfolgte, der im Reflektron-Modus mit 5 und 20 kV an der Ziel- bzw. der Umwandlungsdynode betrieben wurde. Die theoretischen durchschnittlichen Molekülmassen (Mr(ber.)) der Fragmente wurden aus den atomaren Zusammensetzungen berechnet; die Masse eines Protons (1,08 Da) wird bei der Aufzeichnung der experimentellen Molekülmassen (Mr(exp.)) von den Rohdatenwerten als neutrale Grundlage subtrahiert. Auf alle Spektren wurde eine externe Kalibrierung angewendet, die aus acht Peaks (3000 bis 18.000 Da) gebildet wurde.
  • ERGEBNISSE
  • Verdau mit Cfol allein
  • Die Nebendarstellung in 57a zeigt eine elektrophoretische Auftrennung eines ε3/ε3-Genotyps nach Verdau des 252 bp großen amplifizierten apo-E-Produktes mit Cfol, auf einem 12%igen Polyacrylamidgel. Der Vergleich der Elektrophoresebanden mit einer Molekulargewichtsleiter zeigt, dass das Spaltungsmuster überwiegend so ist, wie für den ε3/ε3-Genotyp erwartet (Tabelle V). Unterschiede sind, dass eine schwache Bande von etwa 25 bp nicht erwartet wurde, und dass die kleinsten Fragmente nicht beobachtet wurden. Das begleitende Massenspektrum der präzipitierten Verdauprodukte zeigt ein ähnliches Muster, wenngleich mit höherer Auflösung. Der Vergleich mit Tabelle V zeigt, dass die beobachteten Massen mit denen von einzelsträngiger DNA im Einklang sind; es ist bekannt, dass kurze ds-DNA-Abschnitte unter normalen MALDI-Bedingungen durch die Kombination einer sauren Matrixumgebung (3-HPA, pKa 3) und der Absorption von Wärmeenergie über Wechselwirkungen mit dem bei 337 nm absorbierenden 3-HPA bei Ionisierung denaturiert werden (Tang, K. et al. (1994), Rapid Commun Mass Spectrom. 8:183–186).
  • Die ungefähr 25-mere, die durch Elektrophorese nicht aufgetrennt werden, werden durch MS in drei einzelsträngige Fragmente aufgetrennt; das größte von ihnen (7427 Da) kann ein doppelt geladenes Ion der 14,8 kDa Fragmente darstellen (m = 14850, z = 2; m/z = 7425) die 6715 und 7153 Da großen Fragmente könnten von PCR-Artefakten oder Primer-Verunreinigungen herrühren; alle drei Peaks werden nicht beobachtet, wenn die amplifizierten Produkte vor der Spaltung mit Qiagen Reinigungs-Kits aufgereinigt werden. Das in Tabelle V erwähnte 8871 Da große 3'-terminale 29-mer-Sensestrang-Fragment wird nicht beobachtet; die bei 9186 Da gefundene Spezies entspricht der Addition einer zusätzlichen Base (9187 – 8871 = 316, entspricht einem A) durch die Taq-Polymerase bei der PCR-Amplifikation (Hu, G. et al. (1993), DNA and Cell Biol. 12:763–779). Die individuellen Einzelstränge jedes Doppelstrangs mit < 35 Basen (11 kDa) werden als einzelne Peaks aufgelöst; die 48 Basen großen Einzelstränge (Mr(ber.)) 14845 und 14858) werden jedoch als nicht aufgelöster Einzelpeak bei 14850 Da beobachtet. Seine Auftrennung in einzelne Peaks würde eine Massenauflösung (m/⌂m, Verhältnis der Masse zur Peakbreite bei halber Höhe) von 14850/13 = 1140 erfordern, was fast eine Größenordnung höher ist, als es bei den in dieser Untersuchung eingesetzten Standard-Reflektron-Flugzeitgeräten Routine ist; die Auflösung so kleiner Massenunterschiede mit Hochleistungsgeräten, wie Fourier-Transform-MS, die in diesem Massenbereich eine um bis zu drei Größenordnungen höhere Auflösung bereitstellt, wurde gezeigt. Die 91-mer-Einzelstränge (Mr(ber.) 27849 und 28436) werden ebenfalls nicht aufgelöst, obwohl dafür eine Auflösung von nur < 50 erforderlich ist. Die drastische Abnahme der Peak-Qualität bei höheren Massen ist auf die metastabile Fragmentierung (d. h. Depurinierung) zurückzuführen, die von überschüssiger innerer Energie herrührt, die während und nach der Laserbestrahlung absorbiert wird.
  • Gleichzeitiger Verdau mit Cfol und Rsal
  • 57b (Nebenschaubild) zeigt eine Gelelektrophorese-Auftrennung von ε3/ε3-Doppelverdau-Produkten auf einem 12%-igen Polyacrylamidgel, wobei Banden mit dsDNA mit einer Größe von 24, 31, 36, 48 und 55 Basenpaaren übereinstimmen, nicht aber mit kleineren Fragmenten. Obwohl mehr Peaks als mit Cfol allein erzeugt werden (Tabelle V), ist das entsprechende Massenspektrum dennoch leichter interpretierbar und reproduzierbar, da alle Fragmente < 60 Basen enthalten, ein Größenbereich, der für MALDI-MS viel besser geeignet ist, wenn verlässlich genaue Mr-Werte (z. B. 0,1%) gewünscht sind. Für Fragmente in diesem Massenbereich beträgt die Massen-Messgenauigkeit unter Verwendung externer Kalibrierung –0,1% (d. h. ≥ ± 10 Da bei 10 kDa). Eine signifikante Depurinierung (in der Figur durch Sternchen angezeigt) wird bei allen Peaks oberhalb von 10 kDa beobachtet, aber selbst der größte Peak bei 17171 Da wird eindeutig von seinem Depurinierungspeak aufgetrennt, so dass ein exakter Mr gemessen werden kann. Obwohl die molaren Konzentrationen der Verdauprodukte identisch sein sollten, wird eine gewisse Vernachlässigung von Fragmenten mit ≤ 11 Basen beobachtet, vermutlich aufgrund ihres Verlust im Ethanol/Glykogen-Fällungsschritt. Die Qualität der MS-Ergebnisse aus dem Doppelverdau mit Cfol (oder Hhal) und Rsal ist besser als bei Cfol (oder Hhal) allein, da die erzeugten kleineren Fragmente gut für Messungen mit höherer Massengenauigkeit geeignet sind, und bei keinem der Genotypen besteht die Möglichkeit, dass Dimer-Peaks mit Hochmassen-Diagnose-Peaks überlappen. Da die Spaltungen mit Rsal/Cfol und Rsal/Hhal die gleichen Restriktionsfragmente erzeugen, erstere aber gleichzeitig erfolgen können, weil ihre Pufferbedingungen gleich sind, wurde dieses Enzymgemisch für alle nachfolgenden Genotyp-Bestimmungen mittels Restriktionsverdau-Protokollen verwendet. Tabelle V Masse und Kopienzahl erwarteter Restriktionsverdau-Produkte Tabelle Va Cfol-Verdaua
    (+) (–) e2/e2 e2/e2 e2/e2 e2/e2 e2/e2 e2/e2
    5781, 5999 - -- 1 -- 1 2
    10752, 10921 -- 1 1 2 2 2
    14845, 14858 -- 1 1 2 2 2
    22102, 22440 - -- 1 -- 1 2
    25575, 25763 2 1 1 - - --
    27849, 28436 2 2 1 2 1 --
    Tabelle Vb Cfol/Rsal-Verdaub
    (+) (–) e2/e2 e2/e3 e2/e4 e3/e3 e3/e4 e4/e4
    3428, 4025 -- 1 1 2 2 2
    5283, 5880 - -- 1 -- 1 2
    5781, 5999 - -- 1 -- 1 2
    11279, 11627 2 2 1 2 1 --
    14845, 14858 -- 1 1 2 2 2
    18269, 18848 2 2 1 - - -
    • aCfol-invariante Fragment-Massen: 1848, 2177, 2186, 2435, 4924, 5004, 5412, 5750, 8871, 9628 Da.
    • bCfol-invariante Fragment-Massen: 1848, 2177, 2186, 2436, 4924, 5004, 5412, 5750,6745, 7510, 8871, 9628, 16240, 17175 Da.
    Tabelle VI
    ddT Mr(ber.) ddT Mr(exp.) ddC M5(ber.) ddC Mr(exp.)
    e2/e2 85918, 6768 -- a86536, b7387 --
    2/e3 a5918, b6768, b7965 5919, 6769, 7967 a6536, b6753, b7387 6542, 6752, 7393
    2/e4 a5918, b6768, b7965 a8970 - a5903, b6536, b6753, a7387 -
    e3/e3 a5918, b7965 5918, 7966 a6536, b6753 6542, 6756
    3/e4 a5918, b7965, a8970 5914,7959, 8965 a5903, b6536 b6753 5898, 6533, 6747
    e4/e4 b7965, a8970 7966, 8969 a5903, b6753 5900, 6752
    • avon Codon 112-Nachweisprimer (unverlängert 5629,7 Da).
    • bvon Codon 158-Nachweisprimer (unverlängert 6480,3 Da).
    • Gestrichelte Linien: Dieser Genotyp war aus dem analysierten Pool von 100 Patienten nicht erhältlich.
  • 58a–c zeigt den ApoE-ε3/ε3-Genotyp nach Verdau mit Cfol und eine Vielfalt von Präzipitations-Schemata; Aliquote mit gleichem Volumen wurden jeweils vom gleichen Amplifikationsprodukt verwendet. Die Probe, die mit einer einzigen Präzipitation (58a) aus einer Ammoniumacetat/Ethanol/Glykogen-Lösung behandelt wurde, ergibt ein Massenspektrum, das sich insbesondere bei hoher Masse durch breite Peaks auszeichnet. Die Massen für intensive Peaks bei 5,4, 10,7 und 14,9 kDa sind um 26 Da (0,5%), 61 Da (0,6%) bzw. 45 Da (0,3%) höher als die erwarteten Werte; die Auflösung (das Verhältnis von Peak-Breite bei der Hälfte seiner Gesamtintensität zur gemessenen Masse des Peaks) beträgt jeweils –50 und nimmt mit steigender Masse ab. Diese Beobachtungen sind im Einklang mit einem hohen Ausmaß an Adduktion nichtflüchtiger Kationen; bei dem 10,8 kDa-Fragment entspricht die beobachtete Massenverschiebung einem Verhältnis von adduzierten zu nicht-adduzierten Molekülionen, das größer als das Einheitsverhältnis ist.
  • MS-Peaks einer Probe, die erneut gelöst und ein zweites Mal präzipitiert wurde sind viel schärfer (58b), wobei die Auflösungswerte fast doppelt so groß sind, wie diejenigen der entsprechenden Peaks aus 58a. Die Massengenauigkeitswerte sind ebenfalls beachtlich verbessert; jeder liegt innerhalb von 0,07% seines jeweils berechneten Wertes, nahe an den unabhängig bestimmten Gerätegrenzen für die DNA-Messung unter Verwendung von 3-HPA als Matrix. Einzel- (nicht gezeigt) und Doppel-Fällungen (58C) mit Isopropylalkohol (IPA) anstelle von Ethanol führen zu einer Auflösung und Massengenauigkeitswerten, die denen der entsprechenden Ethanolfällungen entsprechen, es werden jedoch hohe Dimerisierungsgrade beobachtet, was die Messungen wiederum potentiell stört, wenn diese Dimere mit den in der Lösung vorhandenen "diagnostischen" Monomeren höherer Masse überlappen. Die EtOH/Ammoniumacetat-Präzipitation mit Glykogen als Fällungshilfe führt zu einer nahezu quantitativen Gewinnung von Fragmenten mit Ausnahme der 7-mere, und dient als gleichzeitiger Aufkonzentrations- und Entsalzungsschritt vor dem MS-Nachweis. Die Präzipitation aus den gleichen EtOH/Ammoniumacetat-Lösungen ohne Glykogen führt zu einer weit schlechteren Ausbeute, besonders bei niedriger Masse.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass zur Gewinnung genauer (Mr(exp.)-Werte nach IPA und EtOH-Präzipitationen eine zweite Präzipitation erforderlich ist, um eine hohe Massengenauigkeit und -Auflösung zu erhalten.
  • Das Verhältnis von Matrix:Verdauprodukt beeinflusst auch die Qualität der Spektren; eine starke Unterdrückung von Fragmenten höherer Masse (nicht gezeigt), die bei einem Volumenverhältnis 1:1 von Matrix:Verdauprodukt (erneut aufgelöst in 1 μl) beobachtet wird, wird durch Verwendung eines 3–5 fachen Volumenüberschusses an Matrix abgeschwächt.
  • Apa-E-Genotyp-Bestimmung durch enzymatischen Verdau. Die Codon-112- und -158-Polymorphismen liegen innerhalb der Cfol- (nicht aber der Rsal-) Erkennungssequenzen. Im hier untersuchten amplifizierten 252-bp-Produkt erzeugen invariante Stellen (d. h. Solche, die in sämtlichen Genotypen gespalten werden) Schnitte nach den Basen 31, 47, 138, 156, 239 und 246. Die Spaltstelle hinter Base 66 ist nur bei ε4 vorhanden, wohingegen diejenige hinter Base 204 in ε3 und ε4 vorhanden ist; der ε2- Genotyp wird an keiner dieser Stellen gespalten. Diese Unterschiede im Restriktionsmuster lassen sich als Variationen in den Massenspektren zeigen. 59 zeigt Massenspektren mehrerer ApoE-Genotypen, die aus einem Pool von 100 Patienten erhältlich sind (Braun, A. et al. (1992), Hum. Genet. 89:401–406). Senkrechte, gestrichelte Linien sind durch diejenigen Massen gezogen, die den gemäß Tabelle V erwarteten diagnostischen Fragmenten entsprechen; andere markierte Fragmente sind invariant. Man beachte in Bezug auf Tabelle V, dass ein Fragment nur dann als "invariant" angesehen wird, wenn es für ein bestimmtes Allel in doppelten Kopien vorkommt; um dieses Erfordernis zu erfüllen muss ein solches Fragment in jedem der ε2, ε3 und ε4-Allele erzeugt werden.
  • Das Spektrum in 59a enthält sämtliche erwarteten invarianten Fragmente über 3 kDa, sowie diagnostische Peaks bei 3428 und 4021 (beide schwach), 11276 und 11627 (beide intensiv), 14845, 18271 und 18865 Da. Das Spektrum in 59b ist nahezu identisch, außer dass das Peak-Paar bei 18 kDa nicht nachgewiesen wird, und dass die relativen Peak-Intensitäten, am deutlichsten bei den 11–18 kDa-Fragmenten, unterschiedlich sind. Das Spektrum in 59c weist auch keine 18 kDa-Fragmente auf, stattdessen jedoch neue Peaks geringer Intensität zwischen 5–6 kDa. Die Intensitätsverhältnisse für Fragmente über 9 kDa ähneln denen der 59b, abgesehen von einem relativ niedrigeren 11 kDa-Fragment-Paar: 59d, die wiederum die Anhäufung von 5–6 kDa-Peaks aufweist, ist das einzige Spektrum ohne 11 kDa-Fragmente, und hat wie die beiden zuvor genannten kein 18 kDa-Fragment.
  • Trotz der unzähligen Peaks in jedem Spektrum kann jeder Genotyp durch das Vorliegen oder Fehlen von nur wenigen diagnostischen Peaks der Tabelle Vb identifiziert werden. Aufgrund der begrenzten Auflösung der verwendeten MALDI-TOF Geräte sind die am schwierigsten zu differenzierenden Genotypen diejenigen, die auf dem Vorhandensein oder Fehlen der vier diagnostischen Fragmente zwischen 5,2 und 6,0 kDa beruhen, welche für das ε4-Allel charakterisisch sind, da diese Fragmente mit einigen invarianten Peaks fast überlappen. Es ist hier gefunden worden, dass das diagnostische 5283-Da-Fragment mit einem Depurinierungs-Peak des invarianten 5412-Da-Fragmentes überlappt, und dass der diagnostische 5781 Da-Peak üblicherweise vom invarianten 5750 Da-Fragment nicht vollständig getrennt werden kann. Die Unterscheidung zwischen einem ε2/ε4- und einem ε2/ε3- oder zwischen einem ε3/ε4- und einem ε3/ε3-Alle) beruht somit auf dem Vorliegen oder Fehlen der 5880 und 5999 Da-Fragmente. Diese sind jeweils in den 59c und 59d, aber nicht in 59a oder 59b, vorhanden.
  • Der Genotyp jedes Patienten in 59 lässt sich schneller anhand des Flußdiagramms in 60 bestimmen. Dem Spektrum der 59a zufolge schließt das intensive Peak-Paar bei 11 kDa die Möglichkeit eines homozygoten ε4 aus, unterscheidet jedoch nicht zwischen den anderen fünf Genotypen. Ähnlich stimmt das Vorliegen der nicht-aufgelösten 14,8 kDa-Fragmente nicht mit einem homozygoten ε2 überein, lässt jedoch vier Möglichkeiten übrig (ε2/ε3, ε2/ε4, ε3/ε3, ε3/ε4). Von diesen entsprechen nur ε2/ε3 und ε2/ε4 den 18 kDa-Peaks; das Fehlen der Peaks bei 5283, 5879, 5779 und 5998 Da zeigt, dass die Probe in 59a ε2/ε3 ist. Mit dem gleichen Verfahren lassen sich die Genotypen der 59b–d als ε3/ε3, ε3/ε4 bzw. ε4/ε4 identifizieren. Bisher stimmten sämtliche nach diesem Verfahren erfolgten Allel-Identifizierungen mit denjenigen aus herkömmlichen Verfahren überein und ließen sich in vielen Fällen leichter interpretieren. Die Zuordnung kann weiter abgesichert werden, indem sichergestellt wird, dass die Verhältnisse der Fragmentintensitäten mit den Kopienzahlen aus Tabelle V übereinstimmen. Die 14,8 kDa-Fragmente haben beispielsweise eine geringere Intensität als diejenigen bei 16–17 kDa in 59a, jedoch zeigen die 59b–d das Gegenteil. Dies entspricht der Erwartung, da die 14,8 kDa-Fragmente bei den letzteren drei Genotypen doppelt vorliegen, jedoch ist ersteres eine ε2-haltige Hetereozygote, sodass die Hälfte der amplifizierten Produkte nicht zum 14,8 kDa-Signal beiträgt. Der Vergleich der Intensität des 11 kDa-Fragmentes mit derjenigen bei 9,6 und 14,8 kDa zeigt, dass dieses Fragment in den 59a und d in zwei, zwei, einer bzw. keiner Kopie vorliegt. Diese Daten bestätigen, dass MALDI unter diesen Bedingungen auf semi-quantitativem Wege erfolgen kann.
  • ApoE-Genozyp-Bestimmung durch Primer-Oligo-Basen-Extension (PROBE).
  • Die PROBE-Reaktion wurde auch als Mittel zum gleichzeitigen Nachweis des Codon-112- und -158-Polymorphismus untersucht. Ein Nachweisprimer wird an eine einzelsträngige PCR-amplifizierte Matrize hybridisiert, sodass sich sein 3'-Terminus direkt hinter der variablen Stelle befindet. Die Verlängerung dieses Primers durch eine DNA-Polymerase in Gegenwart von drei dNTPs und einem ddXTP (welches nicht als dNTP vorliegt) führt zu Produkten, deren Länge und Masse von der Identität der polymorphen Base abhängen. Im Gegensatz zur Standard-Sanger-Sequenzierung, bei der ein bestimmtes basenspezifisches Röhrchen –99% dXTP und –1% ddXTP, enthält, enthält das PROBE-Gemisch 100% eines bestimmten ddXTP, kombiniert mit den anderen drei dNTPs. Mit PROBE wird somit ein vollständiger Abbruch sämtlicher Nachweisprimer erzielt, nachdem die erste Base erreicht worden ist, die zum ddXTP komplementär ist.
  • Beim ε2/ε3-Genotyp verursacht die PROBE-Reaktion (Gemisch von ddTTP, dATP, dCTP und dGTP) eine Mr(exp.)-Verschiebung des Codon-112-Primers zu 5919 Da und des Codon-158-Primers zu 6769 und 7967 Da (Tabelle VI); ein Paar von Extensionsprodukten resultiert aus dem einzigen Codon-158-Primer, da der ε2/ε3-Genotyp an dieser Stelle heterozygot ist. Drei Extensionsprodukte (eines von Codon 158, zwei von 112) werden auch beim heterozygoten ε3/ε4 beobachtet (61c und Tabelle VI), wohingegen nur zwei Produkte (eines von jedem Primer) bei den homozygoten Allelen der 61b (ε3/ε3) und 59d (ε4/ε4) beobachtet werden. Tabelle VI zufolge führen sämtliche verfügbaren Allele zu allen erwarteten ddT-Reaktionsproduktmassen innerhalb von 0,1% der theoretischen Masse, und sind somit jeweils zweifelsfrei allein durch diese Daten charakterisiert. Eine weitere Konfiguration der Allel-Identitäten lässt sich durch Wiederholen der Umsetzung mit ddCTP (plus dATP, dTTP, dGTP) erhalten; diese Ergebnisse, die ebenfalls in Tabelle VI zusammengefasst sind, bestätigen zweifelsfrei die ddT-Ergebnisse.
  • Eignung der Verfahren. Der Vergleich der 59 (Restriktionsverdau) und 61 (PROBE) zeigt, dass das PROBE-Verfahren viel leichter interpretierbare Spektren für die Multiplex-Analyse der Codon-112- und -158-Polymorphismen bereitstellen, als die Restriktionsverdau-Analyse. Während bei den Verdaus bis zu –25 Peaks pro Massenspektrum, und in einigen Fällen diagnostische Fragmente erzeugt werden, die mit invarianten Fragmenten überlappen, erzeugt die PROBE-Reaktion nur höchstens zwei Peaks pro Nachweis-Primer (d. h. Polymorphismus). Ein automatischer Peaknachweis, Spektralanalyse und Allel-Identifizierung wäre für die letztere Methode eindeutig zielgerichteter. Spektren für eine stark multiplexe PROBE, in der mehrere polymorphe Stellen von den gleichen oder unterschiedlichen amplifizierten Produkten aus einem Röhrchen bestimmt werden, sind ebenfalls potentiell einfach zu analysieren. Unterstreicht man ihre Flexibilität, so lässt sich die PROBE-Daten-Analyse durch überlegte Vorauswahl der Primerlängen vereinfachen, die so konzipiert sein können, dass keine Primer oder Produkte in ihrer Masse überlappen können.
  • PROBE ist zwar das Verfahren der Wahl für klinische Untersuchungen von bereits gut charakterisierten Polymorphismus-Stellen in großem Maßstab, die Restriktionsverdau-Analyse, wie hier beschrieben, ist aber zur Durchmusterung auf neue Mutationen ideal geeignet. Die Identität beider in dieser Untersuchung diskutierten Polymorphismen beeinflusst das Fragment-Muster; wenn dies die einzige verwendete Information ist, so ist der MS-Nachweis eine schnellere Alternative im Vergleich zu der herkömmlichen elektrophoretischen Auftrennung der Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Produkte. Die genaue Messung der Mr-Werte der Fragmente kann zudem Informationen über Stellen liefern, die von der Enzymerkennungsstelle weit entfernt sind, da andere einzelne Punktmutationen notwendigerweise die Masse jedes Einzelstrangs des doppelsträngigen Fragmentes, das die Mutation enthält, verändern. Das amplifizierte 252-bp-Produkt könnte auch allelische Varianten enthalten, die beispielsweise die zuvor beschriebenen Substitutionen Gly127-Asp (Weisgraber, K. H. et al. (1984), J. Clin. Invest. 73:1024–1033), Arg136-Ser (Wardell, M. R. et al. (1987), J. Clin. Invest. 80:483–490), Arg142-Cys (Horie, Y. et al. (1992), J. Biol. Chem. 267:1962–1968), Arg145-Cys (Rall, SC. Jr et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4696–4700), Lys146-Glu (Mann, W. A. et al. (1995), J. Clin. Invest. 96:1100–1107) oder Lys146-Gln (Smit, M. et al. (1990), J. Lipid Res. 31:45–53) ergeben. Die G→A Basensubstitution, die die Aminosäuresubstitution Gly127-Asp codiert, würde eine –16 Da-Verschiebung im Sense-Strang, und eine +15 Da-Verschiebung (C→T) im Antisense-Strang, jedoch keine Änderung des Restriktionsmusters hervorrufen. Eine so geringe Änderung wäre bei der Elektrophorese praktisch unsichtbar; die Substitution könnte aber mit genauer Massenbestimmung festgestellt werden; das invariante 55-mer-Fragment bei 16240 (Sense) und 17175 Da würde zu 16224 bzw. 17190 Da verschoben. Eine Erzielung der Massengenauigkeit, die bei Verwendung der üblichen MALDI-TOF-Geräte zur Ermittlung so geringer Massenabweichungen selbst bei interner Kalibrierung erforderlich ist, erfolgt nicht routinemäßig, da kleinere nicht-aufgelöste Addukte und/oder kaum definierte Peaks die Fähigkeit zur genauen Massenbestimmung einschränken. Mittels Hochleistungs-Elektronenspray-Ionisations-Fourier-Transformation (ESI-FTMS) ist bei synthetischen Oligonukleotiden eine Einzel-Da-Genauigkeit (Little, D. P., et al. (1995), Proc. Natl. Acad, Sci. USA 92:2318–2322) bis zu 100-meren erzielt worden (Little, D. P., et al (1994). J. Am. Chem. Soc. 116:4893–4897), und ähnliche Ergebnisse sind vor kurzem mit bis zu 25-meren unter Verwendung von MALDI-FTMS erzielt worden (Li, Y. et al. (1996) Anal. Chem. 68:2090–2096).
  • BEISPIEL 13
  • Verfahren zum massenspektrometrischen Nachweis von DNA-Fragmenten, assoziiert mit Telomerase-Aktivität
  • EINFÜHRUNG
  • Ein Viertel aller Todesfälle in den Vereinigten Staaten beruht auf malignen Tumoren (R. K. Jain, (1996) Science 271:1079–1080). Für diagnostische und therapeutische Zwecke besteht ein starkes Interesse an zuverlässigen und empfindlichen Verfahren zur Tumorzellbestimmung.
  • Maligne Zellen lassen sich über verschiedene Eigenschaften von normalen Zellen unterscheiden. Eine davon ist die Immortalisierung maligner Zellen, die eine unkontrollierte Zellproliferation ermöglicht. Normale diploide Säugerzellen durchlaufen eine begrenzte Anzahl von Populationsverdopplungen in Kultur, bevor sie altern. Man nimmt an, dass die Anzahl von Populationsverdopplungen bei jeder Zellteilung im Zusammenhang mit einer Verkürzung der Chromosomenenden, den so genannten Telomeren, steht. Der Grund für diese Verkürzung beruht auf den Eigenschaften der herkömmlichen semi-konservativen Replikationsmaschinerie. DNA-Polymerasen arbeiten nur in 5'-zu-3'-Richtung, und benötigen einen RNA-Primer.
  • Man nimmt an, dass die Immortalisierung mit der Expression aktiver Telomerase einhergeht. Die Telomerase ist ein Ribonukleoprotein, das die repetitive Verlängerung von Matrizen katalysiert. Diese Aktivität kann in einem nativen Proteinextrakt Telomerase-haltiger Zellen mit einem speziellen PCR-System (N. W. Kim et al. (1994), Science 266:2011–2015), das als Telomer-Repeat-Amplifikations-Protokoll (TRAP) bekannt ist, nachgewiesen werden. Der Test, wie hier verwendet, beruht auf der Telomerase-spezifischen Verlängerung eines Substratprimers (TS) und einer nachfolgenden Amplifikation der Telomerase-spezifischen Extensionsprodukte mit einem PCR-Schritt, bei dem ein zweiter Primer eingesetzt wird, der zu der Repeat-Struktur komplementär ist (bioCX). Die charakteristischen Leiterfragmente dieser Tests werden für gewöhnlich durch Verwendung von Gelelektrophorese- und Markierungs- oder Anfärbesystemen nachgewiesen. Diese Verfahren können durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie ersetzt werden, was zu einem schnelleren, genauen und automatischen Nachweis führt.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Präparation von Zellen
  • 1 × 106 gezüchtete Telomerase-positive Zellen wurden sedimentiert, einmal mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4·7 H2O, 1,4 mM KH2PO4 in sterilem DEPC-Wasser) gewaschen. Die präparierten-Zellen können bei –75°C aufbewahrt werden. Gewebeproben müssen vor der Extraktion nach im Fachgebiet bekannten Verfahren homogenisiert werden.
  • Telomerase-Extraktion
  • Das Sediment wurde in 200 μl CHAPS-Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1 mM Benzamidin, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,5% CHAPS, 10% Glycerin) resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Die Probe wurde 30 min bei 4°C und 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt und bis zum Gebrauch bei –75°C aufbewahrt.
  • TRAP-Test
  • 2 μl Telomerase-Extrakt wurden zu einem Gemisch aus 10×-TRAP-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl2, 630 mM KCl, 0,05% Tween 20, 10 mM EGTA), 50× dNTP-Gemisch (jeweils 2,5 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP), 10 pMol TS-Primer und 50 pMol bio CX-Primer in einem Endvolumen von 50 μl zugegeben. Das Gemisch wurde 10 min bei 30°C und 5 min bei 94°C inkubiert, 2 Einheiten Taq-Polymerase wurden zugegeben, und eine PCR wurde mit 30 Zyklen 94°C für 30 sek, 50°C für 30 sek und 72°C für 45 sek durchgeführt.
  • Reinigung der TRAP-Test-Produkte
  • Für jeden zu reinigenden TRAP-Test wurden 50 μl Streptavidin M-280-Dynabeads (10 mg/ml) zweimal mit 1 × BW-Puffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) gewaschen. Zum PCR-Gemisch wurden 50 μl 2 × BW-Puffer zugegeben, und die Perlen wurden in diesem Gemisch resuspendiert. Die Perlen wurden unter vorsichtigem Schütteln für 15 min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Perlen wurden zweimal mit 1 × BW-Puffer gewaschen. Die Perlen wurden mit 50 μl 25%-igem Ammoniumhydroxid versetzt und 10 min bei 60°C inkubiert. Der Überstand wurde aufbewahrt, das Verfahren wiederholt, beide Überstände wurden vereinigt und mit 300 μl Ethanol (100%) versetzt. Nach 30 min wurde die DNA bei 13.000 U/min für 12 min sedimentiert, das Sediment wurde an Luft getrocknet und in 600 nl ultrareinem Wasser resuspendiert.
  • MALDI-TOF-MS von TRAP-Test-Produkten
  • 300 nl Proben wurden mit 500 nl gesättigter Matrixlösung (3-HPA:Ammoniumcitrat = 10:1 Molverhältnis in 50%-igem wässrigem Acetonitril) gemischt, bei Umgebungstemperatur getrocknet und in das Massenspektrometer (Vision 2000, Finigan MAT) eingebracht. Sämtliche Spektren wurden im Reflektormodus unter Verwendung externer Kalibrierung aufgenommen.
  • Sequenzen und Massen
    • bioCX: d(bio-CCC TTA CCC TTA CCC TTA CCC TAA; SEQ ID Nr. 45), Masse: 7540 Da.
    • TS: d(AAT CCG TGC AGC AGA GTT; SEQ ID Nr. 46), Masse: 5523 Da. Telomer-Repeat-Strukur: (TTAGGG), Masse einer Wiederholung: 1909,2
  • Amplifikationsprodukte:
    • TS, verlängert durch drei Telomer-Wiederholungen (erstes Amplifikationsprodukt): 12452 Da (N3)
    • TS, verlängert durch vier Telomer-Wiederholungen: 14361 Da (N4)
    • TS, verlängert durch sieben Telomer-Wiederholungen: 20088 Da (N7)
  • ERGEBNISSE
  • Die 62 zeigt einen Abschnitt eines TRAP-Test-MALDI-TOF Massenspektrums. Die Primer TS und bioCX sind bei 5497 und 7537 Da zugeordnet (berechnet 5523 und 7540 Da). Das mit einem Sternchen markierte Signal steht für das n-1 Primerprodukt der chemischen DNA-Synthese. Das erste Telomerase-spezifische TRAP-Test-Produkt ist bei 12775 Da zugeordnet. Dieses Produkt stellt ein 40-mer dar, das drei Telomer-Wiederholungen enthält. Aufgrund der Primersequenzen ist dies das erste erwartete Amplifikationsprodukt eines positiven TRAP-Tests. Das Produkt wird aufgrund der Extendase-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase um ein zusätzliches Nukleotid verlängert (berechnetes nicht-verlängertes Produkt: 12452 Da, um A verlängertes Produkt: 12765 Da). Das Signal bei 6389 Da stellt das doppelt geladene Ion dieses Produktes dar (berechnet 6387 Da). 63 zeigt einen Abschnitt höherer Massen des gleichen Spektrums, wie in 62 gezeigt, daher ist das Signal bei 12775 Da identisch zu dem in 62. Das TRAP-Test-Produkt mit sieben Telomer-Wiederholungen, das ein ebenfalls um ein zusätzliches Nukleotid verlängertes 64-mer darstellt, wird bei 20.322 Da (berechnet: 20.395 Da) nachgewiesen. Die mit 1, 2, 3 und 4 bezeichneten Signale lassen sich nicht von der Grundlinie auflösen. Dieser Bereich besteht aus: 1. Signal von dimerem n-1-Primer, 2. zweites TRAP-Test-Amplifikationsprodukt, das 4 Telomer-Repeats enthält und somit ein 46-mer darstellt (berechnet: 14341 Da/14674 Da Extendase-verlängertes Produkt) und 3. dimeres Primer-Ion und außerdem all ihre entsprechenden Depurinierungssignale. Zwischen den Signalen des zweiten und fünften Verlängerungsproduktes wird eine Lücke beobachtet. Diese Signallücke entspricht den verringerten Bandenintensitäten, die in einigen Fällen für das dritte und vierte Verlängerungsprodukt in autoradiographischen Analysen von TRAP-Tests beobachtet werden (N. W. Kim et al. (1994), Science 266:2013).
  • Die vorstehend genannten Probleme, die von dem dimeren Primer und verwandten Signalen hervorgerufen werden, können durch Einsatz eines Ultrafiltrationsschrittes bewältigt werden, bei dem eine Molekulargewichts-Ausschlussmembran für die Primer-Entfernung vor der MALDI-TOF-MS-Analyse verwendet wird. Dies ermöglicht eine eindeutige Zuordnung des zweiten Amplifikationsprodukts
  • BEISPIEL 14
  • Verfahren zum Nachweis Neuroblastom-spezifischer, geschachtelt RT-amplifizierter Produkte mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie
  • EINFÜHRUNG
  • Das Neuroblastom ist vorwiegend ein Tumor der frühen Kindheit, wobei 66% der Fälle Kinder betreffen, die jünger als 5 Jahre alt sind. Die häufigsten Symptome sind solche aufgrund von Tumormasse, Knochenschmerzen oder solche, die durch eine übermäßige Catecholamin-Sekretion hervorgerufen werden. In seltenen Fällen lässt sich ein Neuroblastom pränatal identifizieren (R. W. Jennings et al. (1993), J. Ped. Surgery 28:1168–1174). Etwa 70% aller Patienten mit Neuroblastom weisen bei der Diagnose eine Metastasen-Erkrankung auf. Die Prognose ist abhängig vom Alter bei Diagnosestellung, vom klinischen Zustand und anderen Parametern.
  • Für Diagnosezwecke besteht ein großes Interesse an zuverlässigen und empfindlichen Verfahren zum Tumorzell-Nachweis z. B. bei der Überwachung autologer Knochenmarks-Transplantationen oder bei der Nachfolgetherapie.
  • Da die Catecholamin-Synthese eine charakteristische Eigenschaft von Neuroblastom-Zellen ist und den Knochenmarkszellen diese Aktivität fehlt (H. Naito et al. (1991), Eur. J. Cancer 27:762–765), können Neuroblastom-Zellen oder Metastasen im Knochenmark identifiziert werden, indem menschliche Tyrosin-3-Hydroxylasen (E. C. 1.14,16.2, hTH) identifiziert werden, welche den ersten Schritt in der Biosynthese von Catecholaminen katalysieren.
  • Die Expression von htH kann mit einer reversen Transkriptions-(RT)-Polymerasekettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden, und das amplifizierte Produkt kann durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert werden.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Zell- oder Gewebe-Behandlung
  • Gezüchtete Zellen wurden sedimentiert (10 min 8000 U/min) und zweimal mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4·7 H2O, 1,4 mM KH2PO4 in sterilem PEPC-Wasser) gewaschen. Das Sediment wurde in 1 ml Lyse-/Bindungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% Li-Dodecylsulfat, 5 mM DTT) resuspendiert, bis die Lösung viskos wurde. Die Viskosität wurde durch einen DNA-Scherschritt mit einer 1 ml-Spritze erniedrigt. Das Lysat kann bei –75°C aufbewahrt werden oder sofort weiter verarbeitet werden. Feste Gewebe (z. B. Patientenproben) müssen vor der Lyse homogenisiert werden.
  • Herstellung magnetischer Oligo-dT(25)-Perlen
  • 100 μl Perlen je 1 × 106 Zellen wurden aus dem Lagerungspuffer abgetrennt und zweimal mit 200 μl Lyse-/Bindungspuffer gewaschen.
  • Isolierung von polyA+-RNA
  • Das Zell-Lysat wurde zu den präparierten Perlen zugegeben und 5 min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Perlen wurden 2–5 min magnetisch abgetrennt und zweimal mit 0,5 ml LDS gewaschen (1.0 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LiDS).
  • Festphasen-Erststrang-cDNA-Synthese
  • Die polyA+-RNA-haltigen Perlen wurden in 20 μl Reverse-Transkriptions-Mischung (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 8 mM MgCl2, 30 mM KCl, 10 mM DTT, 1,7 mM dNTPs, 3 E AMV reverse Transkriptase) resuspendiert und 1 Stunde bei 45°C (mit einem Resuspensionsschritt alle 10 mm) inkubiert. Die Perlen wurden aus der Reverse-Transkriptions-Mischung abgetrennt, in 50 μl Elutionspuffer (2 mM EDTA pH 8,0) resuspendiert und zur Elution der RNA 1 min bei 95°C erhitzt. Die Perlen mit der Erststrang-cDNA können zur weiteren Verarbeitung in TB (0,089 M Tris-Base, 0,089 M Borsäure, 0,2 mM EDTA, pH 8,0), TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) oder 70%-igem Ethanol aufbewahrt werden.
  • Geschachtelte Polymerasekettenreaktion
  • Die Perlen mit der Erststrang-cDNA wurden zweimal mit 1 × PCR-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,75, 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0,1% Triton-X-100, 0,1 mg Rinderserumalbumin) gewaschen und in PCR-Mix (mit jeweils 100 pMol der Außenprimer, 2,5 E Pfu(Exo-)-DNA-Polymerase, jeweils 200 μM dNTPs und PCR-Puffer in einem Endvolumen von 50 μl) resuspendiert. Das Gemisch wurde 1 min bei 72°C inkubiert und für 30 Zyklen mittels PCR amplifiziert. Für die geschachtelte Reaktion: 1 μl der ersten PCR wurden als Matrize zu einem PCR-Mix d (wie oben, jedoch anstelle der Außenprimer mit weiter innen liegenden Primern) zugegeben und dem folgenden Temperaturprogramm unterworfen: 1 min 94°C, 1 min 65°C und 1 min 72°C für 20 Zyklen.
  • Reinigung der geschachtelt amplifizierten Produkte
  • Die Primer und die niedermolekularen Reaktionsnebenprodukte wurden mit einer 10.000-Da-Ausschluss-Ultrafiltrationseinheit entfernt. Die Ultrafiltration wurde 25 min bei 7500 × g durchgeführt. Für jede zu reinigende PCR wurden 50 μl Streptavidin M-280-Dynabeads (10 mg/ml) zweimal mit 1 × BW-Puffer (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) gewaschen, der zur Ultrafiltrationsmembran zugegeben und unter leichtem Schütteln 15 min bei Umgebungstemperatur inkubiert wurde. Der Überstand wurde entfernt, und die Perlen wurden zweimal mit 1 × BW-Puffer gewaschen. Die Perlen wurden mit 50 μl 25%-igem Ammoniumhydroxid versetzt und 10 min bei Umgebungstemperatur inkubiert. Der Überstand wurde aufbewahrt, das Verfahren wiederholt, beide Überstände wurden vereinigt und mit 300 μl Ethanol (100%) versetzt. Nach 30 min wurde die DNA 12 min bei 13.000 U/min sedimentiert, das Sediment wurde an der Luft getrocknet und in 600 nl ultrareinem Wasser resuspendiert.
  • MALDI-TOF-MS der geschachtelt amplifizierten Produkte
  • 300 nl Probe wurden mit 500 nl gesättigter Matrixlösung (3-HPA:Ammoniumcitrat = 10:1 Molverhältnis in 50%igem wässrigem Acetonitril) gemischt, bei Umgebungstemperatur getrocknet und in das Massenspektrometer (Vision 2000, Finigan MAT) eingebracht. Sämtliche Spektren wurden im Reflektormodus unter Verwendung externer Kalibrierung aufgenommen. Äußere Primer
    Figure 01260001
    Geschachtelte Primer:
    Figure 01260002
    Masse des biotinylierten, einzelsträngigen Amplifikationsprodukts: 19253,6 Da
    Masse des nicht-biotinylierten, einzelsträngigen Amplifikationsprodukts: 18758,2 Da
  • Ergebnisse
  • Ein MALDI-TOF-Massenspektrum eines für menschliche Tyrosin-3-Hydroxylase (hTH) spezifischen, geschachtelt amplifizierten Produktes (61-mer) ist in 64 gezeigt. Das Signal bei 18763 Da entspricht einem nicht-biotinylierten Strang des amplifizierten Produktes (berechnet: 18758,2 Da, Massenfehler: 0,02 Da). Die Signale unter 10.000 und über 35.000 Da beruhen auf mehrfach geladenen bzw. dimerisch amplifizierten Produkt-Ionen.
  • Das Produkt wurde aus einer Festphasen-cDNA gewonnen, die aus einer reversen Transkriptionsreaktion aus 1 × 106 Zellen einer Neuroblastom-Zelllinie (L-A-N-1) wie vorstehend beschrieben, stammte. Der cDNA-Erststrang wurde einer ersten PCR unter Verwendung von äußeren Primern (hTH1 und hTH2) unterworfen, ein Aliquot dieser PCR wurde als Matrize in einer zweiten PCR verwendet, wobei geschachtelte Primer (biohTH und hTH6) verwendet wurden. Das geschachtelt amplifizierte Produkt wurde gereinigt und mittels MALDI-TOF-MS analysiert:
    Das Spektrum in 64 zeigt die Möglichkeit einer Neuroblastom-Zellbestimmung mittels geschachtelter RT-PCR und Analyse durch MALDI-TOF-MS.
  • BEISPIEL 15
  • Schnellnachweis der Mutation des Codon 634 des RET-Proto-Onkogens unter Verwendung von Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • PROBE
  • Die Identität von Codon 634 in jedem der drei Allele wurde durch Rsal-Enzymverdau, Einzelstrang-Konformationspolymorphismus- oder Sanger-Sequenzierung bestätigt. Das Exon 11 des RET-Gens wurde aus genomischer DNA PCR-amplifiziert (40 Zyklen), wobei Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim) mit jeweils 8 pMol des 5'-biotinylierten Vorwärts-Primers (5'-biotin-CAT GAG GCA GAG CAT ACG CA 3' SEQ ID Nr. 51) und des unmodifizierten Rückwärts-Primers (5'-GAC AGC AGC ACC GAG ACG AT-3', SEQ ID Nr. 52) je Röhrchen verwendet wurden; die amplifizierten Produkte wurden mit dem QIAquick-Kit von Qiagen zur Entfernung nicht eingebauter Primer gereinigt. 15 μl des amplifizierten Produktes wurden auf 10 μl (10 mg/ml) Dynal-Streptavidin-beschichteten Magnetperlen immobilisiert, gemäß dem Herstellerprotokoll denaturiert, und der Überstand, der den Antisense-Strang enthielt, wurde verworfen, die PROBE-Reaktion wurde mittels ThermoSequenase (TS)-DNA-Polymerase (Amersham) und Pharmacia dNTP/ddNTPs durchgeführt. 8 pMol Verlängerungsprimer (5'-CGG CTG CGA TCA CCG TGC GG-3', SEQ ID Nr. 53) wurden zu 13 μl H2O, 2 μl TS-Puffer, 2 μl 2mM ddATP (oder ddTTP) und 2 μl 0,5 mM dGTP/dCTP/dTTP (oder dGTP/dCTP/dATP) zugegeben, und das Gemisch wurde 30 sek bei 94°C erhitzt, gefolgt von 30 Zyklen zu je 10 sek bei 94°C und 45 sek bei 50°C; nach einer 5-minütigen Inkubation bei 95°C wurde der Überstand dekantiert, und die Produkte wurden durch Ethanolpräzipitation unter Zugabe von 0,5 μl 10 mg/ml Glykogen entsalzt. Das erhaltene Sediment wurde in 70%-igem Ethanol gewaschen, an Luft getrocknet und in 1 μl H2O suspendiert. 300 μl davon wurden mit der MALDI-Matrix (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) auf einem Edelstahlprobenhalter gemischt und an Luft getrocknet. Die Massenspektren wurden mit einem Thermo Bioanalysis Vision 2000 MALDI-TOF aufgenommen, der im Reflektronmodus mit 5 und 20 kV an der Ziel- bzw. der Umwandlungsdynode betrieben wurde. Die beschriebenen experimentellen Massen (Mr(exp.)) sind diejenigen von neutralen Molekülen, wie sie mit externer Kalibrierung gemessen werden.
  • Direkte Messung diagnostischer Produkte
  • Die PCR-Amplifikationsbedingungen für einen 44 bp-Bereich, der Codon 634 enthielt, waren die gleichen wie oben, jedoch wurde Pfu-Polymerase verwendet; der Vorwärts-Primer enthielt ein Ribonukleotid am 3'-Terminus (Vorwärts, 5'-GAT CCA CTG TGC GAC GAG C, (SEQ ID Nr. 54)-ribo; Rückwärts, 5'-GCG (3CT GCG ATC ACC GTG C (SEQ ID Nr. 55)). Nach Immobilisierung des Produkt und Waschen wurden 80 μl 12,5%-iges NH4OH zugegeben und über Nacht bei 80°C erhitzt, um die Primer vom 44-mer (Sense-Strang) abzuspalten, wobei ein 25-mer erhalten wurde. Der Überstand wurde noch im heißen Zustand abpipettiert, getrocknet, in 50 μl H2O resuspendiert, gefällt, resuspendiert und wie vorstehend mittels MALDI-TOF gemessen. Die MALDI-FTMS Spektren der synthetischen 25-mer-Analoga wurden wie zuvor beschrieben aufgenommen (Li, Y. et al. (1996), Anal Chem. 68:2090–2096). Zusammengefasst wurden 1–10 pMol DNA 1:1 mit Matrix auf einer direkten Insertionssonde gemischt, in die externe Ionenquelle (positiver Ionen-Modus) eingelassen, durch Bestrahlung mit einem Laserimpuls mit 337 nm Wellenlänge ionisiert und mittels Nur-Hochfrequenz-Quadrupol-Stäben in ein Magnetfeld mit 6,5 Tesla überführt, wo sie durch Stoß gefangen wurden. Nach einer 15 sek Verzögerung wurden die Ionen mit einem Breitband-Chirp-Impuls angeregt und mittels 256K Datenpunkten nachgewiesen, was Zeitbereichs-Signale von 5 sek Dauer erzeugte. Die aufgezeichneten (neutralen) Massen sind diejenigen des häufigsten Isotopenpeaks nach Subtraktion der Masse des ladungstragenden Protons (1,01 Da).
  • Ergebnisse
  • Das erste dargestellte Schema nutzt die in 65 schematisch dargestellt PROBE-Reaktion. Ein 20-mer-Primer ist so konzipiert, dass er spezifisch an einen Bereich auf der komplementären Matrize bindet, der stromabwärts der Mutationsstelle liegt; beim Anlagern an die Matrix, die mit Biotin markiert ist und an Streptavidinbeschichteten Magnetperlen immobilisiert ist, wird der PROBE-Primer mit einem Gemisch der drei Desoxynukleotid-triphosphate (dNTPs), einem di-dNTP (ddNTP) und einer DNA-Polymerase (65) versetzt. Der Primer wird durch eine Reihe von Basen verlängert, die für die Identität der variablen Base in Codon 634 spezifisch ist; für ein beliebiges Reaktionsgemisch (z. B. ddA + dT + dC + dG) sind drei Extensionsprodukte, die für die drei Allele stehen, möglich (65).
  • Für die negative Kontrolle (66) verursacht die Probe-Reaktion mit ddATP + dNTPs (N = T, C, G) eine Mr(exp.)-Verschiebung des Primers von 6135 zu 6726 Da (Δm + 591). Das Fehlen eines Peaks bei 6432 schließt eine C-A-Mutation aus (65); die Masse des einzigen beobachteten Peaks entspricht eher der Verlängerung um C-ddA (Mr(ber.) 6721, +0,07% Fehler) als um T-ddA (Mr(ber.) 6736, –0,15% Fehler) oder als A3TC2G, was für eine C→A-Mutante erwartet wird. Kombiniert man die ddA- und ddT-Reaktionsdaten, so wird klar, dass die negative Kontrolle an Codon 634 wie erwartet homozygot normal ist.
  • Die ddA-Reaktion für Patient 1 ergibt ebenfalls einen einzigen Peak (Mr(exp.) 6731) zwischen den erwarteten Werten für den Wildtyp und die C→→T-Mutation (65b). Die ddT-Reaktion ergibt jedoch zwei eindeutig aufgelöste Peaks, die mit einem heterozygoten Wildtyp vereinbar sind (Mr(exp.) 8249, +0,04% Massenfehler)/C→T-Mutante (Mr(exp.) 6428 Da, +0,08% Massenfehler). Für Patient 2 stellt das ddA-Produktpaar der 66c ein heterozygotes C→A (Mr(exp) 6431, –0,06% Massenfehler)/normales (Mr(exp.) 6719, –0,03% Massenfehler)-Allel dar. Die ddT-Reaktion bestätigt dies, wobei der einzige, bei 8264 Da gemessene Peak mit den nicht-aufgelösten Wildtyp- und C→A-Allelen im Einklang ist. Der Wert der Doppelexperimente ist aus einem Vergleich der 66a und 66b ersichtlich; während für Patient 1 der Peak bei 6726 aus der ddA-Reaktion nur eine Spezies darstellt, ist ein ähnlicher Peak bei Patient 1 tatsächlich ein nicht-aufgelöstes Paar von Peaks, deren Massen sich um 15 Da unterscheiden.
  • Bin alternatives Schema für den Nachweis von Punktmutationen ist die Unterscheidung der Allele durch direkte Messung der diagnostischen Produktmassen. Ein 44-mer, das die RET634-Stelle enthält, wurde durch PCR erzeugt, und der 19-mer-Sense-Primer wurde durch NH4OH-Spaltung an einem Ribonukleotid an seinem 3'-Terminus entfernt.
  • 67 zeigt eine Reihe von MALDI-FTMS-Spektren synthetischer Analoga von kurzen amplifizierten Produkten, die die RET634-Mutantenstelle enthalten. Die 67a–c und 67d–f sind homozygote bzw. heterozygote Genotypen. Eine interne Kalibrierung wurde durchgeführt, wobei der häufigste Isotopenpeak für das Wildtyp-Allel verwendet wurde; die Anwendung dieser (externen) Kalibrierung auf die fünf anderen Spektren ergab jeweils eine Massengenauigkeit von besser als 20 ppm. Die Unterscheidung der Allele allein über die Masse ist eindeutig, selbst für Gemische von Heterozygoten, deren Komponenten sich um 16,00 (67d), 2501 (67e) oder 9,01 Da (65f) unterscheiden. Der Wert der Hochleistungs-MS ist eindeutig, wenn die Erkennung kleiner DNA-Massenverschiebungen die Grundlage für die Diagnose des Vorliegens oder Fehlens einer Mutation ist. Die aktuelle Wiedereinführung einer verzögerten Extraktions-(DB)Technik hat die Leistung von MALDI-TOF mit kurzen DNAs verbessert (Roskey, M. T. et al. (1996), Anal Chem. 68:941–946); eine auflösende Kraft (RP) von > 103 ist für ein Mischbasen-50-mer berichtet worden, und ein Paar von 31-meren mit einem C oder einem T (Δm 15 Da) an einer variablen Position wurde fast bis zur Grundlinie aufgelöst. Somit hat DE-TOF-MS die zur Auftrennung der einzelnen Komponenten von Heterozygoten nötige RP gezeigt. Jedoch selbst mit DB beträgt die Genauigkeit der DNA-Massenbestimmung mit TOF gewöhnlich 0,1% (8 Da bei 8 kDa) bei externer Kalibrierung, was hoch genug ist, dass unrichtige Diagnosen gestellt werden. Trotz der Möglichkeit von raumladungsinduzierten Frequenzverschiebungen (Marshall, A. G. et al. (1991) Anal. Chem. 63:215A–229A) betragen MALDI-FTMS-Massenfehler selten soviel wie 0,005% (0,4 Da bei 8 kDa), was eine interne Kalibrierung unnötig macht.
  • Die hier vorgestellten Verfahren für DNA-Punktmutation lassen sich nicht nur für die Analyse von Einzelbasenmutationen, sondern auch für den weniger anspruchsvollen Nachweis von einzelnen oder mehreren Baseninsertionen oder -deletionen und für die Quantifizierung von Tandem-Wiederholungen mit zwei, drei oder vier Basen einsetzen. Die PROBE-Reaktion ergibt Produkte, die der Analyse durch ESI- oder MALDI-Geräte mit relativ geringer Leistung zugänglich sind; die direkte Messung kurzer amplifizierter Produktmassen ist eine noch direktere Maßnahme zum Mutationsnachweis, und wird sich wahrscheinlich mit zunehmendem Interesse an Hochleistungs-MS, die mit FTMS verfügbar ist, stärker verbreiten.
  • BEISPIEL 16
  • Immobilisierung der Nukleinsäuren an festen Trägern über einen Säure-labilen kovalenten bifunktionellen Trityl-Linker
  • Amino-verknüpfte DNA wurde nach Standard-Verfahren hergestellt und gereinigt. Ein Teil (10 Eq.) wurde in einer Speedvac bis zur Trockne eingedampft und in wasserfreiem DMF/Pyridin (9:1; 0,1 ml) resuspendiert. Dazu wurde das Chlortrityl-Choridharz (1 Eq. 1,05 μmol/mg Beladung) zugegeben, und das Gemisch wurde 24 Stunden geschüttelt. Die Beladung wurde überprüft, indem eine Harzprobe entnommen wurde, diese mit 80%-igem AcOH detrityliert wurde und die Extinktion bei 260 nm gemessen wurde. Die Beladung betrug etwa 150 pMol/mg Harz.
  • In 80%-iger Essigsäure beträgt die Halbwertszeit der Spaltung wesentlich weniger als 5 min – im Vergleich zu Ansätzen auf Tritylether-Basis mit Halbwertszeiten von 105 und 39 min für para- bzw. meta-substituierte bifunktionelle Dimethoxytrityl-Linker. Vorläufige Ergebnisse haben ebenfalls gezeigt, dass die Hydroxypicolinsäure-Matrix allein ausreicht, um die DNA vom Chlortritylharz abzuspalten.
  • BEISPIEL 17
  • Immobilisierung von Nukleinsäuren an festen Trägern über hydrophobe Trityl-Linker
  • Der Primer enthielt eine 5'-Dimethoxytritylgruppe, die routinemäßig unter Verwendung einer Trityl-on-DNA-Synthese angebunden wurde.
  • Cl8-Perlen aus einer Oligo-Reinigungs-Kartusche (0,2 mg) wurden in eine mit Acetonitril gewaschenen Filterspitze gegeben, und anschließend wurde die DNA-Lösung (50 ng in 25 μl) hindurch gespült. Dies wurde dann mit 5% Acetonitril in Ammoniumcitrat-Puffer (70 mM, 250 μl) gewaschen. Zur Entfernung der DNA vom Cl8 wurden die Perlen mit 40%-igem Acetonitril in Wasser (10 μl) gewaschen und in einer Speedvac auf etwa 2 μl aufkonzentriert. Die Probe wurde dann einer MALDI unterzogen.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass Acetonitril/Wasser in Mengen von ca. > 30% zur Dissoziierung der hydrophoben Wechselwirkung ausreichen. Da die bei MALDI verwendete Matrix 50% Acetonitril enthält, kann die DNA vom Träger gelöst werden und erfolgreich mit MALDI-TOF-MS nachgewiesen werden (wobei die Tritylgruppe während des MALDI-Verfahrens entfernt wird).
  • 69 ist eine schematische Darstellung der Nukleinsäure-Immobilisierung mittels hydrophober Trityl-Linker.
  • BEISPIEL 18
  • Immobilisierung von Nukleinsäuren auf festen Trägern über Streptavidin-Iminobiotin
  • Experimentelles Verfahren
  • 2-Iminobiotin-N-hydroxy-succinimid-Ester (Sigma) wurde mit einem 3'- oder 5'-Amino-Linker an die Oligonukleotide konjugiert, wobei die vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen eingehalten wurden. Die Beendigung der Reaktion wurde durch MALDI-TOF-MS-Analyse bestätigt, und das Produkt wurde durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt.
  • Für jede Reaktion wurden 0,1 mg Streptavidin-beschichtete Magnetperlen (Dynabeads M-280 Streptavidin von Dynal) mit 80 pMol des entsprechenden Oligonukleotids in Gegenwart von 1 M NaCl und 50 mM Ammoniumcarbonat (pH 9,5) 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen mit gebundenen Oligonukleotiden wurden zweimal mit 50 mM Ammoniumcarbonat (pH 9,5) gewaschen. Dann wurden die Perlen in 2 μl 3-HPA-Matrix bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Ein Aliquot von 0,5 μl 50 mM Ammoniumcitrat wurde zu den Perlen zugegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1 μl 3-HPA-Matrix zugegeben und 0,5 μl Überstand wurden für die MALDI-TOF MS verwendet. Um die Gewinnung des gebundenen Iminobiotin-Oligos zu maximieren, wurden die Perlen aus der vorstehenden Behandlung erneut mit 2 μl 3-HPA-Matrix inkubiert und 0,5 μl Überstand wurden zur MALDI-TOF MS verwendet. Bei der Matrix allein und bei der Behandlung nur mit Biotin wurde quantitativ Iminobiotin-Oligo von den Streptavidin-Perlen freigesetzt, wie in den 70 und 71 gezeigt ist.
  • BEISPIEL 19
  • Mutationsanalyse unter Verwendung von Schleifen-Primer-Oligo-Basen-Extension
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Genomische DNA. Genomische DNA wurde von gesunden Individuen und von Patienten, die an Sichelzellanämie leiden, erhalten. Die Wildtyp-Sequenzen und die mutierten Sequenzen wurden auf herkömmliche Weise mittels Standard Sanger-Sequenzierung beurteilt.
  • PCR-Amplifikation. PCR-Amplifikationen eines Teils von β-Globin wurden durchgeführt und optimiert, um das Reaktionsprodukt ohne weiteren Reinigungsschritt für den Einfang mit Streptavidin-beschichteten Perlen zu verwenden. Die Ziel-Amplifikationen für LOOP-PROBE-Reaktionen wurden mit loop cod5 d(GAG TCA GGT GCG CCA TGC CTC AAA CAG ACA CCA TGG CGC, SEQ ID Nr. 58) als Forwärtsprimer und β-11-bio d(TCT CTG TCT CCA CAT GCC CAG, SEQ ID Nr. 59) als biotinylierter Rückwärtsprimer durchgeführt. Das unterstrichene Nukleotid in dem loop-cod5 Primer ist mutiert, um eine invariante Cfol-Restriktionsstelle in das Amplikon einzuführen, und die kursiven Nukleotide sind komplementär zu einem Teil des amplifizierten Produkts. Das PCR-Gesamtvolumen betrug 50 μl einschließlich 200 ng genomischer DNA, 1 E Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1596594), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1277 49) und 10 pmol jedes Primers. Ein spezifisches Fragment des β-Globin-Gens wurde unter Verwendung folgender Zyklisierungsbedingungen amplifiziert: 5 min 94°C, gefolgt von 40 Zyklen mit: 30 sek bei 94°C, 30 sek bei 56°C, 30 sek bei 72°C und einer abschließenden Extension für 2 Minuten bei 72°C.
  • Einfangen und Denaturieren der biotinylierten Matrizen. 10 μl paramagnetische Streptavidin-beschichtete und mit 5 × Bindungslösung (5 M NH4Cl, 0,3 M NH4OH) behandelte Perlen (10 mg/ml; Dynal, Dynabeads M-280 Streptavidin Kat. Nr. 112.06) wurden zu 40 μl PCR-Volumen (10 μl des amplifizierten Produktes wurden zur Überprüfung mittels Elektrophorese aufbewahrt) zugegeben. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C wurde der Überstand verworfen. Die eingefangenen Matrizen wurden mit 50 μl 100 mM NaOH für 5 min bei Umgebungstemperatur denaturiert, dann einmal mit 50 μl 50 mM NH4OH und dreimal mit 100 μl 10 mM Tris·Cl, pH 8,0 gewaschen. Die einzelsträngige DNA diente als Matrizen für die PROBE-Reaktionen.
  • Primer-Oligo-Basen-Extensions-(PROBE)-Reaktion. Die PROBE-Reaktionen wurden mit Sequenase 2.0 (USB Kat. Nr. E70775Z, einschließlich Puffer) als Enzym und dNTPs und ddNTPs, bezogen von Boehringer-Mannheim (Kat. Nr. 1277049 und 1008382), durchgeführt. Das Verhältnis zwischen den dNTPs (dCTP, dGTP, dTTP) und ddATP betrug 1:1 und die von jedem Nukleotid eingesetzte Gesamtkonzentration betrug 50 μM. Nach Zugabe von 5 μl 1-fach Sequenase-Puffer wurden die Perlen 5 min bei 65°C und 10 min bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit lagerten sich die partiell selbst-komplementären Primer an die Zielstelle an. Die Enzymreaktion begann nach Zugabe von 0,5 μl 100 mM Dithiothreitol (DTT), 3,5 μl dNTP/ddNTP-Lösung und 0,5 μl Sequenase (0,8 U) und wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Perlen einmal in 1-fach TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) gewaschen.
  • Cfol-Restriktionsverdau. Der Restriktionsenzymverdau wurde in einem Gesamtvolumen von 5 μl unter Verwendung von 10 E Cfol in 1-fach Puffer L, der von Boehringer-Mannheim bezogen wurde, durchgeführt. Die Inkubationszeit bei 37°C betrug 20 min.
  • Konditionierung der diagnostischen Produkte zur massenspektrometrischen Analyse
  • Nach dem Restriktionsverdau wurde der Überstand in 45 μl H2O, 10 μl 3 M NH4-Acetat (pH 6,5), 0,5 μl Glykogen (10 mg/ml in Wasser, Sigma, Kat. Nr. G1765) und 110 μl absolutem Ethanol für 1 Stunde bei Raumtemperatur präzipitiert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 × g wurde das Sediment in 70% Ethanol gewaschen und in 2 μl 18 MOhm/cm H2O resuspendiert. Die Perlen wurden in 100 μl 0,7 M NH4-Citrat und danach in 100 μl 0,05 M NH4-Citrat gewaschen. Die diagnostischen Produkte wurden durch 2-minütiges Erhitzen der Perlen in 2 μl 50 mM NH4OH bei 80°C erhalten.
  • Probenpräparation und Analyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
  • Die gleiche Präparation wurde durch Mischen von 0,6 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M dibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) mit 0,3 μl des resuspendierten DNA/Glykogen-Sediments oder des Überstandes nach Erhitzen der Perlen in 50 mM NH4OH auf einem Probenziel durchgeführt und an der Luft trocknen gelassen. Das Probenziel wurde automatisch in den Quellenbereich eines unmodifizierten Perspective Voyager MALDI-TOF-Gerätes eingebracht, das im Linearmodus mit verzögerter Extraktion mit 5 und 20 kV an der Ziel- bzw. Umwandlungsdynode betrieben wurde. Die theoretischen Molekülmassen (Mr(ber.)) wurden aus den atomaren Zusammensetzungen berechnet. Die aufgezeichneten experimentellen Werte (Mr(exp.)) sind diejenigen der einfach protonierten Form.
  • ERGEBNISSE
  • Die LOOP-PROBE wurde auf den Nachweis der häufigsten Mutation des Codons 6 des menschlichen β-Globin-Gens; die eine Sichelzellenanämie hervorruft, angewendet. Die einzelnen Schritte des Verfahrens sind schematisch in 72 dargestellt. Zur Analyse von Codon 6 wurde ein Teil des β-Globingens mittels PCR unter Verwendung des biotinylierten Rückwärts-Primers β11 bio und des Primers loop-cod5 amplifiziert, der so modifiziert ist, dass eine Cfol-Erkennungsstelle eingebracht wird (72a). Das amplifizierte Produkt ist 192 bp lang. Nach der PCR wurde das Amplifikationsprodukt wie vorstehend beschrieben an Streptavidinbeschichtete paramagnetische Teilchen gebunden. Der Einzelstrang wurde durch Denaturieren des doppelsträngigen amplifizierten Produktes (72b) Isoliert. Die intramolekulare Anlagerung des komplementären 3'-Endes erfolgte durch einen kurzen Hitze-Denaturierungsschritt und Inkubation bei 37°C. Das 3'-Ende des Antisense-Stranges ist nun partiell doppelsträngig (72c). Zur Analyse der DNA stromabwärts des selbst-angelagerten 3'-Endes des Antisense-Strangs wurde die Primer-Oligo-Basen-Extension (PROBE) mittels ddATP, dCTP, dGTP, dTTP (72d) durchgeführt. Dies erzeugt unterschiedlich lange Produkte, die für den Genotyp des analysierten Individuums spezifisch sind. Vor der Bestimmung der Länge dieser diagnostischen Produkte wurde die DNA mit Cfol-Restriktionsendonuklease inkubiert, die 5' des verlängerten Produktes spaltet. Dieser Schritt befreit den Stem-Loop von der Matrizen-DNA, wohingegen das verlängerte Produkt weiter an der Matrize gebunden bleibt. Die verlängerten Produkte werden dann durch Erhitzen vom Matrizen-Strang denaturiert und mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert.
  • Da die MALDI-TOF-Analysen mit einem nicht-kalibrierten Gerät durchgeführt wurden, war die Massenabweichung zwischen den beobachteten und den erwarteten Werten um etwa 0,6% höher als theoretisch berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse waren jedoch in wiederholten Experimenten schlüssig und reproduzierbar. Bei allen analysierten Überstanden konnte nach dem Restriktionsverdau der Stem-Loop nachgewiesen werden. Der Stem-Loop hatte unabhängig vom Genotyp bei sämtlichen Analysen Molekülmassen von etwa 8150 Da (erwartet 8111 Da). Ein Beispiel ist in 73a gezeigt. Der zweite Peak in dieser Figur mit einer Masse von 4076 Da ist ein doppelt geladenes Ion des Stem-Loops. Die 73b bis 73d zeigen die Analysen der unterschiedlichen Genotypen, wie in den entsprechenden Nebenschaubildern gezeigt ist. HbA ist der Wildtyp-Genotyp und HbC und HbS sind zwei unterschiedliche Mutationen in Codon 6 des β-Globingens, die Sichelzellerkrankung hervorrufen. In der Wildtyp-Situation werden ein einzelner Peak mit einer Molekülmasse von 4247 Da und ein weiterer mit 6696 Da nachgewiesen (73b). Der letztere entspricht dem in der PCR-Reaktion nicht verwendeten biotinylierten PCR-Primer (β-11-bio), der in einigen Experimenten auch entfernt wurde. Der erstere entspricht dem diagnostischen Produkt für HbA. Die Analysen der zwei individuellen DNA-Moleküle mit HbS-Eigenschaft sowie Compound-Heterozygotie (HbS/HbC) für die Sichelzellenstörung ergeben zudem zweifelsfrei erwartete Ergebnisse (73c und 73d).
  • Die LOOP-PROBE ist folglich ein leistungsfähiges Mittel zum Nachweis von Mutationen, insbesondere vorwiegenden erkrankungsverursachenden Mutationen oder allgemeinen Polymorphismen. Die Technik eliminiert ein spezifisches Reagenz zum Mutationsnachweis und vereinfacht somit das Verfahren und macht es für eine Automatisierung zugänglich. Das analysierte spezifische verlängerte Produkt wird vom Primer abgespalten und ist daher verglichen mit dem herkömmlichen Verfahren kürzer. Die Anlagerungseffizienz ist außerdem gegenüber der Anlagerung eines zugegeben Primers höher und sollte daher mehr Produkt erzeugen. Das Verfahren ist mit der Multiplexierung und verschiedenen Nachweisschemata (z. B. Einzelbasen-Extension, Oligo-Basen-Extension und Sequenzierung) kompatibel. Die Verlängerung des LoopPrimers kann bspw. zur Erzeugung kurzer diagnostischer Sequenzierleitern in stark polymorphen Bereichen verwendet werden, um beispielsweise eine HLA-Typisierung oder Resistenz sowie Artentypisierung (z. B. Mycobacterium tuberculosis) durchzuführen.
  • BEISPIEL 20
  • T7-RNA-Polymerase-abhängige Amplifikation von CKR-5 und Nachweis mittels MALDI-MS
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Genomische DNA. Menschliche genomische DNA wurde von gesunden Individuen erhalten.
  • PCR-Amplifikation und Reinigung. Die PCR-Amplifikation eines Teils des CKR5-Gens erfolgte mit ckrT7f als Sense-Primer d(ACC TAG CGT TCA GTT CGA CTG AGA TAA TAC GAC TCA CTA TAG CAG CTC TCA TTT TCC ATA C, SEQ ID Nr. 60). Die unterstrichene Sequenz entspricht der zu CKR-5 homologen Sequenz, die fett gedruckte Sequenz entspricht der Promotorsequenz der T7-RNA-Polymerase und die kursiv gedruckte Sequenz wurde zufällig gewählt. ckr5r wurde als Antisense-Primer d(AAC TAA GCC ATG TGC ACA ACA, SEQ ID Nr. 61) verwendet. Die Reinigung des amplifizierten Produktes und die Entfernung nicht-eingebauter Nukleotide erfolgte mit dem QIAquick-Reinigungs-Kit (Qiagen, Kat. Nr. 28104). Im endgültigen PCR-Volumen von 50 μl befanden sich 200 ng genomische DNA, 1 E Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1596594), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs (Bochringer-Mannheim, Kat. Nr. 1277049) und je 10 pMol Primer. Das spezifische Fragment des CKR-5-Gens wurde unter den nachstehenden Amplifikationsbedingungen amplifiziert: 5 min bei 94°C, gefolgt von 40 Zyklen mit jeweils 45 sek bei 94°C, 45 sek bei 52°C, 5 sek bei 72°C und einer endgültigen Verlängerung von 5 min bei 72°C.
  • T7-RNA-Polymerase-Bedingungen. Ein Drittel der gereinigten DNA (etwa 60 ng) wurde in der T7-RNA-Polymerase-Reaktion eingesetzt (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 881767). Die Reaktion erfolgte für etwa 2 Stunden bei 37°C gemäß den Herstellerbedingungen unter Verwendung des beigefügten Puffers. Das endgültige Reaktionsvolumen betrug 20 μl, 0,7 μl RNasin (33 E/μl) wurden zugegeben. Nach der Verlängerungsreaktion wurde das Enzym durch Inkubation für 5 min bei 65°C inaktiviert.
  • DNA-Verdau und Konditionierung der diagnostischen Produkte für die Massenspektrometrie-Analyse
  • Die Matrizen-DNA wurde durch Zugabe RNase-freier DNase I (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 776758) zum inaktivierten T7-Gemisch und 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur gespalten. Die Fällung erfolgte durch Zugabe von 1 μl Glykogen (10 mg/nil, Sigma, Kat. Nr. G1765), 1/10 Volumen 3 M NH2-Acetat (pH 6,5) und 3 Volumina absolutem Ethanol und Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 g wurde das Sediment mit 70%-igem Ethanol gewaschen und in 3 μl 18 MOhm/cm H2O resuspendiert. 1 μl wurde auf einem Agarosegel untersucht.
  • Probenpräparation und Analyse durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie
  • Die Probenpräparation wurde durchgeführt, indem 0,6 μl Matrix-Lösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M dibasisches Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) mit 0,3 μl resuspendiertem DNA/Glykogen auf einem Probenziel gemischt wurde und an der Luft trocknen gelassen wurde. Das Probenziel wurde in den Quellenbereich eines unmodifizierten Finnigan VISION 2000 MALDI-TOF-Gerätes eingebracht, das im Reflektron-Modus mit 5 kV betrieben wurde. Die theoretische Molekülmasse wurde aus der atomaren Zusammensetzung berechnet; die aufgezeichneten experimentellen Werte sind diejenigen der einfach protonierten Form.
  • ERGEBNISSE
  • Der Chemokin-Rezeptor CKR-5 wurde als der Haupt-Corezeptor bei HIV-1 identifiziert (siehe z. B. WO 96/39437 von Human Genome Sciences; Cohen, J. et al. Science 275:1261). Ein Mutanten-Allel, das durch eine 32bp-Deletion charakterisiert ist, wird in 16% der HIV-seronegativen Population vorgefunden, wohingegen die Häufigkeit dieses Allels bei der HIV-1-seropositiven Population um 35% niedriger ist. Man nimmt an, dass Individuen, die für dieses Allel homozygot sind, gegen HIV-1 resistent sind. Die T7-RNA-Polymerase-abhängige Amplifikation wurde angewendet, um diesen spezifischen Bereich des Chemokin-Rezeptors CKR-5 (74) zu identifizieren. Menschliche genomische DNA wurde mit herkömmlicher PCR amplifiziert. Der Sense-Primer war so modifiziert, dass er eine zufällige Sequenz von 24 Basen, die die Bindung der Polymerase erleichterte, und die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz enthielt (75). Der mutmaßliche Start der Transkription erfolgt an der ersten Base 5' der Promotorsequenz. ckr5r wurde als Antisense-Primer eingesetzt. Die PCR-Bedingungen sind vorstehend aufgeführt. Das von den Wildtyp-Allelen abstammende amplifizierte Produkt ist 75 bp lang. Die Primer und die Nukleotide wurden mit dem QIAquick-Reinigungs-Kit von Qiagen vom Amplifikationsprodukt abgetrennt. Ein Drittel des gereinigten Produktes wurde einer in-vitro-Transkription mit T7-RNA-Polymerase unterworfen. Um einen Einfluss der Matrizen-DNA zu umgehen, wurde diese mit RNase-freier DNase I gespalten. Die RNA wurde präzipitiert, und bei diesem Schritt bleibt die abgebaute DNA ebenfalls im Überstand. Ein Teil der gelösten RNA wurde auf einem Agarosegel analysiert, und der Rest der Probe wurde zur MALDI-TOF-Analyse präpariert. Die erwartete berechnete Masse des Produktes beträgt 24560 Da. Ein dominanter Peak, der einer ungefähren Masse von 25378,5 Da entspricht, kann beobachtet werden. Da der Peak sehr breit ist, war eine genaue Bestimmung der Molekülmasse nicht möglich. Der Peak entspricht nicht der verbliebenen DNA-Matrize. Erstens wird die Matrizen-DNA gespalten und zweitens hätten die DNA-Stränge eine Masse von 23036,0 bzw. 23174 Da.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die T7-RNA-Polymerase effizient Ziel-DNA amplifizieren kann. Die erzeugte RNA kann durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Zusammen mit modifizierten (z. B. 3'-Desoxy)-Ribonukleotiden, die spezifisch durch RNA-Polymerase eingebaut, aber nicht weiter verlängert werden, kann dieses Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Matrizen-DNA verwendet werden.
  • BEISPIEL 21
  • MALDI-Massenspektrometrie von RNA-Endonuklease-Spaltungen
  • MATERIALIEN
  • Synthetische RNA-Proben (Probe A: 5'-UCCGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGAC-3' (SEQ ID Nr. 62); Probe B: 5'-GUCACUACAGGUGAGCUCCA-3' (SEQ ID Nr. 63) Probe C: 5'-CCAUGCGAGAGUAAGUAGUA-3' (SEQ ID Nr. 64)) wurden von DNA-Technology (Aahus, Dänemark) erhalten und auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel gereinigt (Shaler, T. A. et al. (1996), Anal. Chem. 63:576–579). Die RNasen T1 (Eurogentec), U2 (Calbiochem), A (Boehringer-Mannheim) und PhyM (Pharmacia) wurden ohne zusätzliche Reinigung verwendet. Streptavidinbeschichtete Magnet-Perlen (Dynabeads M-280 Streptavidin, Dynal) wurden als Suspension von 6–7 × 108 Perlen/ml (10 mg/ml), gelöst in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,1% BSA und 0,02% NaN3 bereitgestellt. 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA) (Aldrich) wurde durch einen gesonderten Entsalzungsschritt vor der Verwendung gereinigt, wie an anderer Stelle ausführlicher beschrieben ist (Little, D. P. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2318–2322).
  • METHODEN
  • In vitro-Transkriptionsreaktion. Das 5'-biotinylierte 49 nt in-vitro-Iranskript (SEQ ID Nr. 65):
    AGGCCUGCGGCAAGACGGAAAGACCAUGGUCCCUNAUCUGCCGCAGGAUC wurde durch Transkription des Plasmids pUTMS2 (linearisiert mit dem Restriktionsenzym BamHI) mit T7-RNA-Polymerase (Promega) hergestellt. Für die Transkriptionsreaktion wurden 3 μl Matrizen-DNA und 50 E T7-RNA-Polymerase in einem 50 μl-Volumen aus 1 E/μl RNA-Guard (Rnax-Inhibitor, Pharmacia), 0,5 mM dNTPs, 1,0 mM 5'-Biotin-ApG-Dinukleotid, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 6 mM MgCl2, 2 mM Spermidin und 10 mM DTT eingesetzt. Die Inkubation erfolgte 1 Stunde bei 37°C, dann wurde ein weiteres Aliquot von 50 Einheiten T7-RNA-Polymerase zugegeben, und die Inkubation wurde eine weitere Stunde lang fortgesetzt. Das Gemisch wurde auf 2 M NH4-Acetat eingestellt, und die RNA wurde durch Zugabe eines Volumens Ethanol und eines Volumens Isopropanol gefällt. Die präzipitierte DNA wurde durch 9-minütige Zentrifugation bei 20.000 × g und 4°C gewonnen, das Sediment wurde mit 70%-igem Ethanol gewaschen, getrocknet und bei 8M Harnstoff erneut gelöst. Die weitere Reinigung erfolgte durch Elektrophorese durch ein denaturierendes Polyacrylamid-Gel, wie an anderer Stelle beschrieben (Shaler, T. A. et al. (1996) Anal. Chem. 68:576–579). Das Verhältnis von 5'-biotinylierten zu nicht-biotinylierten Iranskripten betrug etwa 3:1.
  • Ribonuklease-Test. Für den teilweisen Verdau mit ausgewählten RNasen wurden unterschiedliche Enzymkonzentrationen und Testbedingungen wie in Tabelle VII zusammengefasst eingesetzt. Die Lösungsmittel für jedes Enzym wurden gemäß den Herstellerangaben ausgewählt. Die Konzentrationen der synthetischen RNA-Proben und des in-vitro-Iranskripts wurden auf 5–10 × 10–6 M eingestellt. TABELLE VII Übersicht und Testbedingungen der RNasen
    RNase Quelle Konzentration [Einheiten Rnase/μg RNA] Bedingungen Inkubationszeit (max. Anzahl Fragmente) Literaturstellen
    T1 Aspergillus oryzae 0,2 20 mM Tris-HCl, pH 5,7, 37°C 5 min Danis-Keller, H. et al. (1977), Nucl. Acids Res. 4:2527–2537
    U2 Ustilago Sphaerogena 0,01 20 mM DAC, pH 5,0, 50°C 15 min Danis-Keller, H. et al. (1977), Nucl. Acids Res. 4:2527–2537
    PhyM Physarum polycephalum 20 20 mM DAC, pH 5,0, 50°C 15 min Danis-Keller, H. et al. (1980), Nucl. Acids Res. 8:3133–3142
    A Rinder-pankreas 4 × 10–9 10mM Tris-HCl, pH 7,5, 37°C 30 min Breslow, R. und R. Xu. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1201–1207
    CL3 Hühnerleber 0,01 10mM Tris-HCl, pH 6,5, 37°C 30 min Boguski et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2160–2163
    Cusativin Cucumis sativus L. 0,05 ng 10mM Tris-HCl, pH 6,5, 37°C 30 min Rojo, M. A. et al. (1994) Plants 194:328–338
  • Die Reaktion wurde zu ausgewählten Zeiten gestoppt, indem 0,6 μl-Aliquote des Tests mit 1,5 μl 3-HPA-Lösung vermischt wurden. Das Lösungsmittel wurde anschließend in einem kalten Luftstrom für die MALDI-MS-Analyse verdampft.
  • Es wurde eine eingeschränkte alkalische Hydrolyse durchgeführt, indem gleiche Volumina (2,0 μl) 25%-iges Ammoniumhydroxid und RNA-Probe (5–10 × 10–6M) bei 60°C vermischt wurden. Zu bestimmten Zeiten wurden 1 μl-Aliquote entnommen und in einem kalten Luftstrom getrocknet. Es stellte sich heraus, dass es für diese Proben wichtig ist, zuerst die Spaltprodukte in einem kalten Luftstrom zu trocknen, bevor 1,5 μl der Matrix-Lösung und 0,7 μl NH4 +-beladene kationengetauschte Polymerperlen zugegeben wurden.
  • Die Reaktion wurde zu ausgewählten Zeiten gestoppt, indem 0,6 μl-Aliquote des Tests mit 1,5 μl 3HPA-Lösung vermischt wurden. Das Lösungsmittel wurde anschließend in einem kalten Luftstrom für die MALDI-MS-Analyse verdampft.
  • Es wurde eine begrenzte alkalische Hydrolyse durchgeführt, indem gleiche Volumina (2,0 μl) an 25%-igem Ammoniumhydroxid und RNA-Probe (5–10 × 10–6 M) bei 60°C vermischt wurden. Zu bestimmten Zeiten wurden 1 μl-Aliguote entnommen und in einem kalten Luftstrom getrocknet. Es stellte sich heraus, dass es für diese Proben wichtig ist, zuerst die Spaltprodukte in einem kalten Luftstrom zu trocken, bevor 1,5 μl der Matrix-Lösung und 0,7 μl einer Suspension von NH4 +-beladenen kationengetauschten Polymerperlen zugegeben wurden.
  • Abtrennung der 5'-biotinylierten Fragmente. Streptavidin-beschichtete Magnetperlen wurden verwendet, um 5'-biotinylierte Fragmente des in vitro Trankriptes nach partiellem RNase-Verdau abzutrennen. Die Biotin-Einheit in der Probe wurde während der Transkriptionsreaktion eingebracht, die durch das 5'-Biotin-pApG-Dinukleotid gestartet wurde. Vor dem Gebrauch wurden die Perlen zweimal mit 2 × Bindungs- und Waschpuffer (b&w) (20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, pH 8,2) gewaschen und bei 10 mg/ml in 2 × b&w-Puffer resuspendiert. Etwa 25 pMol des in vitro RNA-Transkriptes wurden mit RNase U2 gemäß dem vorstehend beschriebenen Protokoll gespalten. Die Spaltung wurde durch Zugabe von 3 μl 95%-igem Formamid, das 10 mM trans-1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (CDTA) enthielt, bei 90°C für 5 mm, und anschließendes Kühlen auf Eis, beendet. Anschließend wurde das Einfangen der biotinylierten Fragmente durch 15-minütige Inkubation von 6 μl des Verdaus mit 6 μl der Perlensuspensien und 3 μl des b&w-Puffers bei Raumtemperatur erzielt. Bei einer gegebenen Bindungskapazität der Perlen von 200 pMol biotinyliertem Oligonukleotid pro mg Perlen, wie vom Hersteller angegeben, wurde ein fast 2-facher Überschuss an Oligonukleotid verwendet, damit eine vollständige Beladung der Perlen gewährleistet war. Der Überstand wurde entfernt, und die Perlen wurden zweimal mit 6 μl H2O gewaschen. Das CDTA und 95%-iges Formamid bei 90°C für 5 min. Nach Verdampfen des Lösungsmittels und des Formamids wurden ≤2,5 pMol der Fragmente in 2 μl H2O resuspendiert und wie vorstehend beschrieben durch MALDI-MS untersucht.
  • Proben-Präparation für MALDI-MS. 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA) wurde in ultrareinem Wasser in einer Konzentration von etwa 300 mM gelöst. Metallkationen wurden, wie vorstehend ausführlich beschrieben, gegen NH4 + ausgetauscht (Little, D. P. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2318–2322). Aliquote von 0,6 μl der Analyt-Lösung wurden mit 1,5 μl 3-HPA auf einem flachen inerten Metallsubstrat gemischt. Die verbliebenen Alkalikationen, die in der Probenlösung sowie auf der Substratoberfläche vorhanden waren, wurden durch Zugabe von 0,7 μl der Lösung NH4 +-beladener Kationenaustausch-Polymerperlen entfernt. Während der Verdampfung des Lösungsmittels sammelten sich die Perlen in der Mitte des Präparates an, wurden nicht für die Analyse verwendet und wurden leicht mit einer Pipettenspitze entfernt.
  • Gerät. Ein Prototyp des Vision 2000 (ThermoBioanalysis, Hemel, Hempstead UK)-Reflektron-Flugzeit-Massenspektrometers wurde für die Massenspektrometrie eingesetzt. Ionen wurden durch Bestrahlung mit einem Dreifach-Frequenz-ND:YAG-Laser (355 nm, 5 ns; Spektrum GmbH, Berlin, Deutschland) erzeugt und auf 10 keV beschleunigt. Eine verzögerte Ionenextraktion wurde zur Aufnahme der gezeigten Spektren eingesetzt, da sich herausstellte, dass dadurch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis und/oder die Signalintensität wesentlich verstärkt wurde. Die Äquivalent-Flugstreckenlänge des Systems beträgt 1,7 m, der Basisdruck beträgt 10–4 Pa. Die Ionen wurden mit einem gesonderten Sekundär-Elektronen-Dynoden-Multiplier (R 2362, Hamamatsu Photonics), ausgestattet mit einer Umwandlungs-Dynode für effektiven Nachweis von Ionen hoher Masse, nachgewiesen. Die gesamte Stoßenergie der Ionen an der Umwandlungs-Dynode wurde abhängig von der nachzuweisenden Masse auf Werte im Bereich von 16 bis 25 keV eingestellt. Das voramplifizierte Ausgangssignal der SEM wurde mit einem LeCroy 9450 Transient-Recorder (LeCroy, Chestnut Ridge, NY, USA) mit einer Abfragefrequenz von bis zu 400 MHz digitalisiert. Für die Aufbewahrung und weitere Bewertung wurden die Daten in einen PC übertragen, der mit eigens angefertigter Software (ULISSES) ausgerüstet war. Alle gezeigten Spektren wurden im Positiv-Ionen-Modus aufgenommen. Zwischen 20 und 30 Einzelspektren wurden für jedes Spektrum gemittelt.
  • ERGEBNISSE
  • Spezifität der RNasen. Für die Kombination basenspezifischer RNA-Spaltung mit MALDI-MS sind Reaktionsbedingungen erforderlich, die so optimiert sind, dass die Aktivität und Spezifität der ausgewählten Enzyme einerseits erhalten bleiben und sich andererseits nach den Rahmenbedingungen für MAlDI richten. Vorwiegend führt dies zu einer Inkompatibilität, da die Alkaliionen-Puffer, die üblicherweise in der beschriebenen Reaktion verwendet werden, wie etwa Na-Phosphat, Na-Citrat oder Na-Acetat sowie EDTA die MALDI-Probenpräparation beeinträchtigen; sie stören vermutlich die Matrix-Kristallisation und/oder den Analyten-Einbau. Tris-HCl oder Ammoniumsalz-Puffer sind dagegen MALDI-kompatibel (Shaler, T. A. et al. (1996) Anal. Chem. 68:576–579). Alkalische Salze in der Probe bewirken außerdem die Bildung eines heterogenen Gemisches von mehrfachen Analytsalzen, ein Problem, das mit steigender Anzahl der Phosphatgruppen zunimmt. Diese Gemische führen zu einem Verlust an Massenauflösung und Genauigkeit sowie zu einem schlechteren Signal-zu-Rausch-Verhältnis (Little, D. P. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2315–2322; Nordhoff E., Cramer, R., Karas, M., Hillenkamp, F., Kirpekar, F., Kristiansen, K. und Roepstorff, P. (1993), Nucleic Acids Res. 21:3347–3357). Die RNase-Verdaus erfolgten daher unter Bedingungen, die im Vergleich zu den in der Literatur beschriebenen Bedingungen etwas modifiziert sind. Diese sind in der vorstehenden Tabelle VII zusammengefasst. Für RNase T1, A, CL3 und Cusativin wurde Tris-HCl (pH 6–7,5) als Puffer verwendet. 20 mM DAC liefert einen pH-Wert von 5, der für eine maximale Aktivität der RNasen U2 und PhyM empfohlen wird. Es hat sich herausgestellt, dass eine Konzentration dieser Verbindungen von 10–20 mM die MALDI-Analyse nicht signifikant beeinträchtigt. Um die Spezifität der ausgewählten Ribonukleasen unter diesen Bedingungen zu untersuchen, wurden drei synthetische 20–25-mer RNA-Moleküle mit unterschiedlichen Nukleotid-Sequenzen verdaut.
  • Die MALDI-MS-Spektren der 77 zeigen fünf unterschiedliche Spaltungsmuster (A–E) einer 25 nt RNA, die nach teilweisem Verdau mit den RNasen T1, U2, PhyM, A und alkalischer Hydrolyse erhalten wurden. Diese Spektren wurden von Aliquoten aufgenommen, die vom Test nach empirisch ermittelten Inkubationszeiten entnommen wurden, die so gewählt wurden, dass die Sequenz optimal abgedeckt war. Da die resultierenden Proben nicht vor der Massenspektrometrie-Analyse fraktioniert wurden, enthielten sie sämtliche Fragmente, die zu diesem Zeitpunkt von den entsprechenden RNasen erzeugt wurden. In der Praxis lässt sich die Einheitlichkeit der Spaltungen durch einen bevorzugten Angriff auf spezifische Phosphodiester-Bindungen beeinflussen (Donis-Keller, H., Maxam, A. M. und Gilbert, W. (1977), Nucleic Acids Res. 4:1951–1978; Donis-Keller, H. (1980), Nucleic Acids Res. 8:3133–3124). Die Mehrheit der erwarteten Fragmente wird tatsächlich in den Spektren beobachtet. Es ist ebenfalls bemerkenswert, dass für die Reaktionsprotokolle, die verwendet wurden, eine korrekte Zuordnung aller Fragmentmassen nur dann möglich ist, wenn man eine 2',3'-cyclische Phosphatgruppe annimmt. Es ist gut bekannt, dass solche zyklischen Phosphate Zwischenprodukte der Spaltungsreaktion sind und in einem zweiten unabhängigen und langsameren Reaktionsschritt, an dem das Enzym beteiligt ist, hydrolysiert werden (Richards, F. M. und Wycoff, H. W. in The Enzymes Bd. 4, 3. Aufl. (Hrsg. Boyer, P. D.) 746–806 (1971, Academic Press, New York); Heinemann, U. und W. Saenger (1985) Pure Appl. Chem. 57:417–422; Ikehara, M. et al. (1987), Pure Appl. Chem. 59:965–968; Vreslow, R. und Xu, R. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1201–1207). In einigen Fällen besitzen unterschiedliche Fragmente gleiche Massen oder unterscheiden sich nur um 1 Dalton. In diesen Fällen können die Massenpeaks nicht eindeutig dem einen oder anderen Fragment zugeordnet werden. Daher wurde der Verdau von zwei zusätzlichen unterschiedlichen 20 nt RNA-Proben durchgeführt (Hahner, S., Kirpekar, F., Nordoff, E., Kristiansen, K., Roepstorff P. und Hillenkamp, F., (1996) Proceedings of the 44th ASMS Conference an Mass Spectrometry, Portland, Oregon), um diese Zweifel auszuräumen. Für sämtliche untersuchten Proben scheinen die ausgewählten Ribonukleasen ausschließlich an den bestimmten Nukleotiden zu spalten, die zu Fragmenten führen, die von Einzel- sowie Mehrfach-Spaltungen herrühren.
  • In 77 sind diejenigen Peaks, welche Fragmente mit dem ursprünglichen 5`-Terminus anzeigen, mit Pfeilen markiert. Sämtlichen nicht-markierten Peaks können interne Sequenzen oder solche mit zurückbleibendem 3'-Terminus zugeordnet werden. Für eine vollständige Sequenz würden alle möglichen Fragmente, die ausschließlich entweder den 5'- oder 3'-Terminus der ursprünglichen RNA tragen, ausreichen. In der Praxis sind die 5'-Fragmente besser für diesen Zweck geeignet, da die Spektren, die nach der Inkubation aller drei synthetischen RNA-Proben erhalten wurden, fast den gesamten Satz der ursprünglichen 5'-Ionen für alle unterschiedlichen RNasen enthalten (Hahner, S., Kirpekar, F., Nordoff E., Kristiansen, K., Roepstorff und Hillenkamp, F. (1996) Proceedings of the 44th ASMS Conference an Mass Spectrometry, Portland, Oregon). Innere Fragmente sind etwas weniger häufig und Fragmente, die den ursprünglichen 3'-Terminus enthalten, scheinen in den Spektren unterdrückt zu sein. In Übereinstimmung mit den in der Literatur beschriebenen Beobachtungen (Gupta, R. C. und Randerath, K. (1977) Nucleic Acids Res. 4:1957–1978) wurden die Spaltungen nahe am 3'-Terminus in teilweisen Verdaus des RNA-25-mers durch RNase T1 und U2 teilweise unterdrückt (sogar wenn sie sich innen befinden oder den ursprünglichen 5'-Terminus aufweisen). Fragmente aus diesen Spaltungen erscheinen in den Massenspektren als schwache und schlecht aufgelöste Signale.
  • Bei größeren RNA-Molekülen ist bekannt, dass die Sekundärstruktur die Gleichmäßigkeit der enzymatischen Spaltungen beeinflusst (Donis-Keller, H. Maxam, A. M. und Gilbert, W. (1977), Nucleic Acids Res. 8, 3133–3142). Dies lässt sich prinzipiell durch veränderte Reaktionsbedingungen bewältigen. In Testlösungen mit 5–7 M Harnstoff bleibt die Aktivität der RNasen, wie T2, U2, A, Cl3 und PhyM bekanntlich erhalten (Donis-Keller, H: Maxam, A. M. und Gilbert, W. (1977), Nucleic Acids Res. 4:2527–2537); Boguski, M. S. Hieter, P. A. und Levy, C. C (1980), J. Biol. Chem., 255:2160–2163; (Doni-Keller, H. (1980), Nucleic Acids Res. 8, 3133–3142), wobei die RNA ausreichend denaturiert wird. Die UV-MALDI-Analyse mit 3-HPA als Matrix ist bei so hohen Harnstoffkonzentrationen in der Probe nicht möglich. Die MALDI-Analyse der Proben war bis zu einer Konzentration von 2 M Harnstoff im Reaktionspuffer noch möglich, obwohl signifikante Änderungen in der Matrix-Kristallisation beobachtet wurden. Die Spektren des RNA-20-mers (Probe B), verdaut in Gegenwart von 2 M Harnstoff, ähnelten noch denjenigen, die unter den in Tabelle VII aufgeführten Bedingungen erhalten wurden.
  • Die Spaltung mit RNasen, die ausschließlich eine Nukleobase erkennen, ist zur Verringerung der Komplexität der Fragmentierungsmuster wünschenswert und erleichtert somit die Kartierung der entsprechenden Nukleobase. Die RNasen CL3 und Cursavitin sind Enzyme, von denen berichtet wurde, dass sie an Cytidylsäureresten spalten. Bei eingeschränktem RNase-CL3- und Cursativin-Verdau des RNA-20-mers (Probe B) unter nicht-denaturierenden Bedingungen wurden Fragmente, die den Spaltungen an den Cytidyl-Resten entsprechen, tatsächlich beobachtet (78). Dies entspricht etwa den bisher beschriebenen Daten (Boguski, M. S., Hieter, P. A. und Levy, C. C. (1980), J. Biol. Chem. 255:2160–2163; Rojo, M. A., Arias, F. L., Iglesias, R., Ferreras, J. M., Munoz, R., Escarmis, C., Soriano, F., Llopez-Fando, Mendez, E., und Girbes, T. (1994), Planta 194:328–338). Das Degradierungsmuster in 78 zeigt jedoch, dass nicht jeder Cytidinrest erkannt wird, insbesondere benachbarte C-Reste. Es wird ebenfalls beschrieben, dass RNase CL3 für den Einfluss der Sekundärstruktur empfindlich ist (Boguski, M. S., Mieter, P. A. und Levy, C. C. (1980), J. Biol. Chem. 255:2160–2163), jedoch sollte für RNA der in dieser Untersuchung eingesetzten Größe ein solcher Einfluss zu vernachlässigen sein. Daher können nicht erkannte Spaltungsstellen in diesem Fall auf ein Fehlen von Spezifität dieses Enzyms zurückgeführt werden. Zur Bestätigung dieser Daten wurde ein weiterer RNase CL3-Verdau mit dem RNA-20-mer (Probe C) durchgeführt. Als Ergebnis der Sequenz dieses Analyten wurden alle drei Verknüpfungen, die Cytidylsäure enthielten, leicht hydrolysiert, es wurden aber auch zusätzliche Spaltungen an Uridylsäureresten beobachtet. Da veränderte Reaktionsbedingungen, wie erhöhte Temperaturen (90°C), verschiedene Enzym-zu-Substrat-Verhältnisse und die Zugabe von 2 M Harnstoff keinen Verdau der erwarteten Spezifität bewirkten, wurde eine Anwendung dieses Enzyms zur Sequenzierung nicht weiter in Betracht gezogen. Die Einbringung einer neuen Cytidin-spezifischen Ribonuklease, Cusativin, isoliert aus trockenen Samen von Cucumis sativus L., sah für die RNA-Sequenzierung vielversprechend aus (Rojo, M. A., Arias, F. J., Iglesias, R., Ferraras, J. M., Munoz, R., Escarmis, C., Soriano, F., Llopez-Fando, J., Mendez, E., und Girbes, T. (1994), Planta 194:328–338). Wie in 78 gezeigt, wurde nicht jeder Cytidin-Rest hydrolysiert und zusätzliche Spaltungen traten bei der empfohlenen Enzymkonzentration an Uridylsäureresten auf. Die RNasen CL3 und Cusativin ergeben daher nicht die gewünschte Sequenzinformation für die Kartierung von Cytidinresten, und ihre Verwendung wurde nicht weiter in Betracht gezogen. Die Unterscheidung von Pyrimidinresten lässt sich jedoch unter Verwendung von RNasen mit mehrfachen Spezifitäten, wie Physarum polycephalum-RNase (spaltet ApN, UpN) und Pankreas-RNase A (spaltet UpN, CpN) bewerkstelligen (siehe 77). Alle 5'-terminalen Fragmente, die durch die monospezifische RNase U2 erzeugt wurden und im Spektrum der 77C erschienen, waren auch im Spektrum des RNase-PhyM-Verdaus (77D) erkennbar. Fünf der sechs Uridyl-Spaltungsstellen konnten auf diese Weise durch dieses indirekte Verfahren einheitlich identifiziert werden. In einem nächsten Schritt wurde die Kenntnis der Uridin-Spaltstellen verwendet, um die Spaltstellen der Cytidylsäurereste im Spektrum zu identifizieren, welches nach der Inkubation mit RNase A aufgenommen wurde (77E), wobei wiederum ausschließlich Ionen mit dem ursprünglichen 5'- Terminus verwendet wurden. Zwei der vier erwarteten Spaltstellen wurden auf diese Weise identifiziert. Einige Einschränkungen sind aus diesen Spektren ersichtlich, wenn nur die Fragmente, die den ursprünglichen 5'-Terminus enthalten, zur Sequenzbestimmung verwendet werden. Die ersten beiden Nukleotide entziehen sich gewöhnlich der Analyse, da ihre Signale im Niedrigmasse-Matrixhintergrund verloren gehen. Aus diesem Grund fehlen die entsprechenden Fragmente in den Spektren der U- und C-spezifischen Spaltungen. Große Fragmente mit Spaltungsstellen in der Nähe des 3'-Terminus sind, insbesondere bei einem Verdau mit den RNasen T1 und U2, aufgrund ihrer geringen Ausbeute (siehe oben) und des oft starken nahegelegenen Signals des unverdauten Transkriptes oft schwierig zu identifizieren. Dementsprechend tauchen die Spaltungen an Position 22 und 23 im Spektrum der G-spezifischen RNase T nicht auf (77A), und die Spaltstelle 24 kann nicht aus den Spektren der U2- und PhyM-Verdaus identifiziert werden (77 C und D). Die Stellen 16 und 17 mit zwei benachbarten Cytidylsäuren können im RNase-A Spektrum der 77E ebenfalls nicht bestimmt werden. Diese Beobachtungen zeigen, dass eine Bestimmung von ausschließlich 5'-Terminus-Fragmenten nicht immer ausreichen kann, und die in den inneren Fragmenten enthaltene Information für eine vollständige Sequenzanalyse notwendig sein kann.
  • Schließlich lieferte die eingeschränkte alkalische Hydrolyse ein Kontinuum von Fragmenten (77B), das zur Vervollständigung der Sequenzdaten verwendet werden kann. Das Spektrum wird wiederum von Fragment-Ionen beherrscht, die den 5'-Terminus enthalten, obwohl die Hydrolyse für alle Phosphodiester-Bindungen gleich sein sollte. Wie aus den enzymatischen Spaltungen hervorgeht, drängen korrekte Massenzuordnungen die Annahme auf, dass alle Fragmente ein 2',3'-zyklisches Phosphat aufweisen. Die Verteilung der Peaks ähnelt daher derjenigen, die nach einem 3'-Exonuklease-Verdau erhalten wird (Pieles, U., Zurcher, W., Schar, M. und Moser, H. E. (1993), Nucleic Acids Res. 21:3191–3196; Nordhoff, E. et al. (1993), Book of Abstracts, 13th Internat. Mass Spectrom. Conf. Budapest, S. 218; Kirpekar, F., Nordhoff, E., Kristiansen, K., Roepstorff, P., Lezius, A., Hahner, S., Karas, M. und Hillenkamp, F. (1994), Nucleic Acids Res. 22, 3866–3870). Grundsätzlich könnte die alkalische Hydrolyse allein daher für eine vollständige Sequenzierung verwendet werden. Dies ist jedoch nur für relativ kleine Oligoribonukleotide möglich, da größere Fragment-Ionen, die sich in der Masse nur um einige Masseneinheiten unterscheiden, in den Spektren nicht aufgelöst werden und die Masse größerer Ionen nicht mit der nötigen Genauigkeit von besser als 1 Da aufgelöst werden kann, selbst wenn die Peaks teilweise oder vollständig aufgelöst sind. Die Interpretation der Spektren insbesondere aus einem Verdau unbekannter RNA-Proben wird wesentlich vereinfacht, wenn nur die Fragmente, die den ursprünglichen 5'-Terminus enthalten, vor der massenspektrometrischen Analyse abgetrennt werden. Ein Verfahren für diesen Ansatz ist im nachstehenden Abschnitt beschrieben.
  • Trennung der 5'-biotinylierten Fragmente. Streptavidin-beschichtete Magnetperlen (Dynal) wurden auf die Extraktion von Fragmenten untersucht, die den ursprünglichen 5'- Terminus aus den Verdaus enthielten. Die Hauptmerkmale, die für diesen Festphasenansatz überprüft werden müssen, sind die selektive Immobilisierung und die effiziente Elution der biotinylierten Spezies. In vorausgehenden Experimenten wurden eine 5'-biotinylierte DNA (19 nt) und Streptavidin inkubiert und nach Standard-Präparation mittels MALDI analysiert. Trotz der hohen Affinität der Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung wurde der intakte Komplex nicht in den MALDI-Spektren gefunden. Stattdessen wurden Signale der monomeren Untereinheit von Streptavidin und der biotinylierten DNA nachgewiesen. Es ist nicht bekannt, ob der Komplex in der sauren Matrixlösung (pKa 3) oder während des MALDI-Desorptionsverfahrens dissoziiert. Überraschenderweise werden die gleichen Ergebnisse nicht beobachtet, wenn Streptavidin auf einer festen Oberfläche, wie etwa Magnetperlen, immobilisiert wird. Ein Gemisch aus zwei 5'-biotinylierten DNA-Proben (19 nt und 27 nt) und zwei unmarkierten DNA-Sequenzen (12 nt und 22 nt) wurde mit den Perlen inkubiert. Die Perlen wurden extrahiert und vor der Inkubation in der 3-HPA-MALDI-Matrix sorgfältig gewaschen. Aus diesen Proben konnten keine Analytsignale erhalten werden. Zur Untersuchung, ob die biotinylierten Spezies an die Perlen gebunden hatten, wurde eine Elution der extrahierten und gewaschenen Perlen durchgeführt, indem in Gegenwart von 95% Formamid bei 90°C erhitzt wurde. Man erwartet, dass dieses Verfahren Streptavidin denaturiert, wodurch der Streptavidin/Biotin-Komplex aufbricht. 79B zeigt die erwarteten Signale der beiden biotinylierten Spezies, was beweist; dass die Loslösung der gebundenen Moleküle im MALDI-Verfahren das Problem ist und nicht die Bindung der Perlen; 79A zeigt ein Spektrum der gleichen Probe nach Standard-Präparation, welches Signale aller vier Analyten als Bezug zeigt. Eine vollständige Entfernung des Formamids nach der Elution und vor der Massenspektrometrie-Analyse wurde für wichtig befunden, ansonsten wird die Kristallisation der Matrix beeinträchtigt. Die Massenauflösung und das Signal-zu-Rausch-Verhältnis im Spektrum der 79B sind mit denen des Vergleichsspektrums vergleichbar. Diese Ergebnisse bestätigen die Spezifität der Streptavidin-Biotin-Wechselwirkung, da keine oder nur geringe Signale des nicht-biotinylierten Analyten nach Inkubation mit den Dynal-Perlen nachgewiesen wurden. Eine verstärkte Unterdrückung der unspezifischen Bindung wurde durch Zugabe des Detergenzes Tween 20 zum Bindungspuffer beobachtet (Tong, X. und Smith, L. M (1992) Anal. Chem. 64, 2672–2677). Obwohl dieser Effekt in dieser Untersuchung bestätigt werden konnte, beeinflusste eine Peak-Verbreiterung die Qualität der Spektren aufgrund der übrig gebliebenen Menge Detergens. Die Notwendigkeit eines Elutionsschrittes als Voraussetzung für den Nachweis der gefangenen biotinylierten Spezies lässt sich auf einen Stabilisierungs-Effekt des Komplexes durch Immobilisierung des Streptavidins an die Magnetperlen zurückführen.
  • Für die praktische Anwendung dieses Festphasenverfahrens zur Sequenzierung ist eine maximale Effizienz von Bindung und Elution der biotinylierten Spezies von herausragender Bedeutung. Unter einer Vielzahl von bisher untersuchten Bedingungen ergab die Zugabe von Salzen, wie EDTA, die besten Ergebnisse im Fall der DNA-Sequenzierung, indem der Puffer Ionenstärke erhielt (Tong, X. und Smith, L. M. (1992), Anal. Chem. 64, 2672–2677). Um einen solchen Effekt auf das Festphasenverfahren zu untersuchen, wurden mehrere Salzadditive auf die Bindung und Elution des 5'- biotinylierten RNA-in-vitro-Transkripts (49 nt) untersucht. Die Ergebnisse sind in 80 gezeigt. Die Beurteilung der relativen Intensität, des Signal-Rausch-Verhältnisses und der Auflösung der entsprechenden Signale ergab, dass eine 95%-ige Formamid-Lösung mit 10 mM CDTA (80D) für die Bindung/Elution am wirksamsten ist. Da CDTA als Chelator für zweiwertige Kationen fungiert, wird die Bildung einer korrekten Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA verhindert. Eine verbesserte Empfindlichkeit und spektrale Auflösung ist unter diesen Bedingungen für die Analyse von RNA-Proben durch Elektronenspray-Massenspektrometrie gezeigt worden (Limbach, P. A., Crain, P. F. und McCloskey, J. A. (1995), J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 6, 27–39). Die Verbesserung der MALDI-Analyse ist tatsächlich nicht sehr signifikant, im Vergleich zu dem Spektrum, das für die Lösung, die nur Formamid enthält, erhalten wird (81b), jedoch wurde die Reproduzierbarkeit für Spektren guter Qualität für die CDTA/Formamid-Lösung wesentlich verbessert. Zusätzlich zur verbesserten Bindung/Elution kann dieses Additiv auch den Einbau des Analyten in die Matrixkristalle verbessern. Unglücklicherweise wurde auf der Hochmasse-Seite eine auffällige Signalverbreiterung bei Formamid-Lösungen beobachtet, die EDTA, CDTA oder 25% Ammoniumhydroxid enthielten. Da dieser Effekt mit 25% Ammoniumhydroxid am auffälligsten ist und dieses Mittel auch zum Einstellen des optimalen pH-Wertes bei EDTA und CDTA verwendet wurde, kann eine ausgeprägte NH3-Adduktionenbildung angenommen werden.
  • Die Verwendbarkeit der Abtrennung mit Streptavidin-beschichteten Magnetperlen für die RNA-Sequenzierung wurde für die RNase U2-Spaltung des 5'-biotinylierten RNA-in-vitro-Transkripts (49 nt) gezeigt (81). Das gesamte Fragmentmuster, das nach Inkubation mit RNase 132 erhalten wurde, ist in Spektrum 81A gezeigt. Durch die Abtrennung der biotinylierten Fragmente wird die Komplexität des Spektrums verringert (81B), da nur 5'-terminale Fragmente von den Perlen gefangen werden. Die Signale im Spektrum sind verbreitert, und die erhöhte Anzahl der Signale im Niedrigmassenbereich zeigt, dass selbst nach stringentem Waschen der Perlen eine gewisse Menge Puffer und Detergenz, die zur Bindung und Elution verwendet werden, zurückbleibt. Weitere Verbesserungen des Verfahrens sind daher vonnöten Eine weitere mögliche Strategie zur Anwendung der Magnetperlen ist die Immobilisierung der Ziel-RNA vor der RNase-Spaltung durch Elution der übrig gebliebenen Fragmente zur weiteren Analyse. Die Spaltung der RNA war in diesem Fall behindert, wie durch eine verlängerte Reaktionszeit für die Spaltung unter ansonsten identischen Reaktionsbedingungen bewiesen wurde.
  • BEISPIEL 22
  • Parallele DNA-Sequenzierungs-Mutationsanalyse und Mikrosatelliten-Analyse unter Verwendung von Primern mit Markierungen und Massenspektrometrie-Nachweis
  • Dieses Beispiel beschreibt den spezifischen Einfang von DNA-Produkten, die in der DNA-Analyse erzeugt werden. Das Einfangen wird durch eine spezifische Markierung (5 bis 8 Nukleotide lang) am 5'-Ende des Analyseproduktes vermittelt, die an eine komplementäre Sequenz bindet. Die Einfangsequenz kann durch ein partiell doppelsträngiges Oligonukleotid, das an einen festen Träger gebunden ist, bereitgestellt werden. Eine andere DNA-Analyse (z. B. Sequenzierung, Mutation, Diagnose, Mikrosatelliten-Analyse) kann parallel durchgeführt werden, wobei beispielsweise ein herkömmliches Röhrchen oder eine Mikrotiterplatte (MTP) verwendet wird. Die Produkte werden dann spezifisch eingefangen und mittels der komplementären Identifikationssequenz auf dem Markierungs-Oligonukleotid sortiert. Das Einfang-Oligonukleotid kann über eine chemische oder biologische Bindung an einen festen Träger (z. B Silizium-Chip) gebunden sein. Die Identifikation der Probe wird durch die vordefinierte Position des Haupt-Oligonukleotids bereitgestellt. Die Reinigung, Konditionierung und Analyse durch Massenspektrometrie erfolgen auf einem festen Träger. Dieses Verfahren wurde zum Einfangen spezifischer Primer mit einer 6-Basen-Markierungssequenz angewendet.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Genomische DNA.
  • Genomische DNA wurde von gesunden Individuen erhalten.
  • PCR-Amplifikation
  • Die PCR-Amplifikationen eines Teils des β-Globin-Gens wurde unter Verwendung von β-2 d(CATTTGCTTCTGACACAACT, SEQ ID Nr. 66) als Vorwärts-Primer und β11 d(TCTCTGTCTCCACATGCCCAG, SEQ ID Nr. 67) als Rückwärts-Primer durchgeführt. Das PCR-Gesamtvolumen betrug 50 μl, einschließlich 200 ng genomischer DNA; 1 E Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 159594); 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1277049) und 10 pMol jedes Primers. Ein spezifisches Fragment des β-Globin-Gens wurde unter Verwendung der nachfolgenden Zyklusbedingungen amplifiziert: 5 min bei 94°C, gefolgt von 40 Zyklen zu je 30 sek bei 94°C, 45 sek bei 53°C, 30 sek bei 72°C und einer abschließenden Verlängerung von 2 min bei 72°C. Die Reinigung des amplifizierten Produktes und die Entfernung nicht-eingebauter Nukleotide erfolgte mit dem QIAquick-Reinigungs-Kit (Qiagen, Kat. 28104). Ein Fünftel des gereinigten Produktes wurde zur Primer-Oligo-Basen-Extension (PROBE) bzw. für Sequenzierungsreaktionen verwendet.
  • Primer Oligo-Basen-Extension (PROBE) und Sequenzierungsreaktionen
  • Der Nachweis der mutmaßlichen Mutationen im menschlichen β-Globin-Gen bei Codon 5 und 6 und bei Codon 30 bzw. in der IVS-1-Donor-Stelle erfolgte parallel (82A). β-TAG1 (GTCGTCCCATGGTGCACCTGACTC, SEQ ID Nr. 68) diente als Primer zur Analyse des Codons 5 und 6 und β-TAG2 (CGCTGTGGTGAGGCCCTGGGCA, SEQ ID Nr. 69) für die Analysen des Codons 30 und der IVS-1-Donorstelle. Die Primer-Oligo-Basen-Extensions (PROBE)-Reaktion erfolgte durch Cycling wobei die nachstehenden Bedingungen angewendet wurden: das endgültige Reaktionsvolumen betrug 20 μl, β-TAG1-Primer (5 pMol), β-TAG2-Primer (5 pMol), dCTP, dGTP, dTTP (Endkonzentration jeweils 25 μM), ddATP (Endkonzentration 100 μM) (die dNTPs und ddNTPs wurden von Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1277049 und 1008382 bezogen), 2 μl 10 × ThermoSequence-Puffer und 25 E ThermoSequenase (Amersham, Kat. Nr. E79000Y). Das Zyklusprogramm war wie folgt: 5 min bei 94°C, 30 sek bei 53°C, 30 sek bei 72°C und ein abschließender Verlängerungsschritt bei 72°C für 8 min. Die Sequenzierung erfolgte unter den gleichen Bedingungen, außer dass das Reaktionsvolumen 25 μl betrug und die Konzentration der Nukleotide für ddNTP 250 μM betrug.
  • Einfangen mittels der TAG-Sequenz und Probenpraparation
  • Die Einfang-Oligonukleotide cap-tag1 d(GACGACGACTGCTACCTGACTCCA, SEQ ID Nr. 70 bzw. cap-tag2 d(ACAGCGGACTGCTACCTGACTCCA, SEQ ID Nr. 71) wurden an äquimolare Mengen von uni-as d(TGGAGTCAGGTAGCAGTC, SEQ ID Nr. 72 hybridisiert (82A). Jedes Oligonukleotid hatte eine Konzentration von 10 pMol/μl in ddH2O und wurde 2 min bei 80°C und 5 min bei 37°C inkubiert. Diese Lösung wurde bei –20°C aufbewahrt, und Aliquote wurden entnommen. 10 pMol angelagerte Einfang-Oligonukleotide wurden durch Inkubation für 30 min bei 37°C an 10 μl paramagnetische Perlen gebunden, die mit Streptavidin beschichtet waren (10 mg/ml; Dynal, Dynabeads M-280 Streptavidin Kat. Nr. 112.06). Die Perlen wurden eingefangen und die PROBE- bzw. Sequenzierungsreaktion wurde zu den Einfang-Oligonukleotiden zugegeben. Zur Erleichterung der Bindung von β-TAG1 bzw. β-TAG2 wurde die Reaktion 5 min bei 25°C und 30 min bei 16°C inkubiert. Die Perlen wurden zweimal mit eiskaltem 0,7 M NH4-Citrat gewaschen, um unspezifisch gebundene Extensionsprodukte und Primer weg zu waschen. Die gebundenen Produkte wurden durch Zugabe von 1 μl DDH2O und Inkubation für 2 min bei 65°C sowie Kühlen auf Eis gelöst. 0,3 μl der Probe wurden mit 0,3 μl Matrixlösung gemischt (gesättigte 3-Hydroxypicolinsäure, 10%-Molverhältnis Ammoniumcitrat in Acetonitril/Wasser (50/50, (v/v)) und an der Luft trocknen gelassen. Das Probenziel wurde automatisch in den Quellenbereich eines unmodifizierten Perspective Voyager MALDI-TOF eingebracht, das im Linearmodus mit verzögerter Extraktion mit 5 und 20 kV an der Ziel- bzw. der Umwandlungs-Dynode betrieben wurde. Die theoretischen durchschnittlichen Molekülmassen (Mr(ber.)) wurden aus den atomaren Zusammensetzungen berechnet; die beschriebenen experimentellen Mr(exp.) Werte waren diejenigen der einfach protonierten Form.
  • ERGEBNISSE
  • Spezifisches Einfangen eines Gemisches von Extensionsprodukten durch eine kurze komplementäre Sequenz wurde zur Isolation von Sequenzierungs- und Primer-Oligo-Basen-Extensions-(PROBE)-Produkten angewendet. Dieses Verfahren wurde zum Nachweis mutmaßlicher Mutationen im menschlichen β-Globin-Gen in Codon 5 und 6 und in Codon 30 bzw. der IVS-1-Donorstelle verwendet (82A). Genomische DNA wurde mit den Primer β2 und β11 amplifiziert. Das Amplifikationsprodukt wurde gereinigt, und die Nukleotide wurden abgetrennt. Ein Fünftel des gereinigten Produktes wurde für Analysen durch Primer-Oligo-Basen-Extension verwendet. Um beide Seiten in einer einzigen Reaktion zu untersuchen, wurden die Primer β-TAG1 bzw. β-TAG2 verwendet. β-TAG1 bindet stromaufwärts der Codons 5 und 6 und β-TAG2 stromaufwärts des Codons 30 und der IVS-1-Donorstelle. Die Verlängerung dieser Primer erfolgte durch Cycling in Gegenwart von ddATP und dCTP, dGTP und dTTP, was abhängig vom Phänotyp des Individuums zu spezifischen Produkten führte. Die Reaktionen wurden dann mit den Einfang-Oligonukleotiden vermischt. Die Einfang-Oligonukleotide umfassen den biotinylierten Einfang-Primer cap-tag1 bzw. cap-tag2. Sie weisen 6 Basen am 5'-Ende auf, die zum 5'-Ende von β-TAG1 bzw. β-TAG2 komplementär sind. Sie können daher diese Primer und die verlängerten Produkte spezifisch einfangen. Durch Anlagern eines universellen Oligonukleotids (uni-as) an das Einfang-Oligonukleotid wird der Einfang-Primer in ein partiell doppelsträngiges Molekül umgewandelt, bei dem nur die Einfang-Sequenz einzelsträngig bleibt (82). Dieses Molekül wird dann an Streptavidinbeschichtete paramagnetische Teilchen gebunden, zu denen die PROBE- bzw. Sequenzierungsreaktion zugegeben wird. Das Gemisch wurde gewaschen, damit nur die spezifisch hybridisierten Oligonukleotide gebunden wurden. Die eingefangenen Oligonukleotide werden gelöst und durch Massenspektrometrie analysiert.
  • Die PROBE-Produkte eines Individuums (83) zeigen einen kleinen Peak mit einer Molekülmasse von 7282,8 Da. Dies entspricht dem nicht-verlängerten β-TAG1, der eine berechnete Masse von 7287,8 Da besitzt. Der Peak bei 8498,6 Da entspricht einem um 4 Basen verlängerten Produkt. Dies entspricht der Wildtyp-Situation. Die berechnete Masse dieses Produktes beträgt 8500,6 Da. Es gibt keinen signifikanten Peak, der eine heterozygote Situation anzeigt. Zudem wurde nur β-TAG1 und nicht β-TAG2 eingefangen, was die hohe Spezifität dieses Verfahrens anzeigt.
  • Analysen dessen, was an cap-tag2 gebunden hatte (84), zeigen nur einen vorherrschenden Peak mit einer Molekülmasse von 9331,5 Da. Dies entspricht einer Verlängerung von 8 Nukleotiden. Dies zeigt eine homozygote Wildtyp-Situation an, wobei die berechnete Masse des erwarteten Produktes 9355 Da beträgt. Es gibt keine signifikante Menge an nicht-verlängertem Primer, und es wurde lediglich β-TAG2 eingefangen.
  • Zum Beweis, dass dieser Ansatz ebenfalls zum Einfangen spezifischer Sequenzprodukte geeignet ist, wurden die beiden gleichen Primer β-TAG1 bzw. β-TAG2 verwendet. Die Primer wurden gemischt, in einer Sequenzierungsreaktion verwendet und dann unter Verwendung des vorstehend erläuterten Verfahrens sortiert. Mit diesen Primern wurden zwei unterschiedliche Terminationsreaktionen mittels ddATP und ddCTP durchgeführt (85 bzw. 86). Alle in den Spektrogrammen beobachteten Peaks entsprechen den berechneten Massen in einer Wildtyp-Situation.
  • Wie vorstehend gezeigt, ist nun die Parallelanalyse unterschiedlicher Mutationen (z. B. unterschiedlicher PROBE-Primer) möglich. Das beschriebene Verfahren eignet sich zudem zum Einfangen spezifischer Sequenzierungsprodukte. Das Einfangen kann zur Abtrennung verschiedener Sequenzier-Primer aus einem Reaktionsröhrchen/Well, zur Isolation spezifischer multiplex-amplifizierter Produkte, PROBE-Produkte usw. verwendet werden. Herkömmliche Verfahren, wie Zyklus-Sequenzierung, und gebräuchliche Volumina können eingesetzt werden. Eine universelle Chip-Gestaltung ermöglicht die Verwendung verschiedener Anwendungen. Dieses Verfahren kann zudem für einen hohen Durchsatz automatisiert werden.
  • BEISPIEL 23
  • Deletions-Nachweis durch Massenspektrometrie
  • Für den massenspektrometrischen Nachweis einer Deletion in einem Gen lassen sich verschiedene Formate verwenden. Beispielsweise kann die Molekülmasse eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts bestimmt werden, oder einer oder beide Stränge des doppelsträngigen Produktes können isoliert werden, und die Masse kann, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, gemessen werden.
  • Wie hier beschrieben, kann alternativ eine spezifische Enzymreaktion durchgeführt werden, und die Masse des entsprechenden Produktes kann durch Massenspektrometrie bestimmt werden. Die Deletionsgröße kann bis zu mehreren zehn Basen Länge betragen, was noch den gleichzeitigen Nachweis des Wildtyps und des mutierten Allels ermöglicht. Durch gleichzeitigen Nachweis der spezifischen Produkte lässt sich in einer einzigen Reaktion identifizieren, ob das Individuum für ein spezifisches Allel oder für eine spezifische Mutation homozygot oder heterozygot ist.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Genomische DNA
  • Genomische Leukozyten-DNA wurde von nicht-verwandten gesunden Individuen erhalten.
  • PCR-Amplifikation
  • Die PCR-Amplifikation der Ziel-DNA wurde so etabliert und optimiert, dass die Reaktionsprodukte ohne weiteren Reinigungsschritt zum Einfangen mit Streptavidinbeschichteten Perlen verwendet werden konnten. Die Primer für die Ziel-Amplifikation und für die PROBE-Reaktionen waren wie folgt:
    CKRΔ-F: d(CAG CTC TCA TTT TCC ATA C, SEQ ID Nr. 73) und CKRΔ-R bio: d(AGC CCC AAG ATG ACT ATC, SEQ ID Nr. 74). CKR-5 wurde mit dem nachstehenden Programm amplifiziert: 2 min bei 94°C, 45 sek bei 52°C, 5 sek bei 72°C, und eine abschließende Verlängerung von 5 min bei 72°C. Das Endvolumen betrug 50 μl, einschließlich 200 ng genomischer DNA, 1 E Taq-Polymerase (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1596594), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM DNTPS (Boehringer-Mannheim, Kat. Nr. 1277049), 10 pMol unmodifizierter Vorwärts-Primer und 8 pMol biotinylierter Rückwärts-Primer.
  • Einfangen und Denaturieren der biotinylierten Matrizen
  • 10 μl paramagnetische Perlen, beschichtet mit Streptavidin (10 mg/ml; Dynal, Dynabeads M-280 Streptavidin, Kat. Nr. 112.06) in 5 × Bindungslösung (5 M NH4Cl, 0,3 M NH4OH) wurden zu 45 μl PCR-Reaktion (5 μl PCR-Reaktion wurden zur Elektrophorese aufbewahrt) zugegeben. Nach Bindung durch Inkubation für 30 min bei 37°C wurde der Überstand verworfen. Die eingefangenen Matrizen wurden mit 50 μl 100 mM NaOH für 5 min bei Umgebungstemperatur denaturiert, einmal mit 50 μl 50 mM NH4OH und dreimal mit 100 μl 10 mM Tris/Cl, pH 8,0, gewaschen. Die einzelsträngige DNA diente als Matrize für PROBE-Reaktionen.
  • Primer-Oligo-Basen-Extensions-(PROBE)-Reaktion
  • Die PROBE-Reaktion wurde mit Sequenase 2.0 (USB Kat. Nr. E70775Z, einschließlich Puffer) durchgeführt. dATP/dGTP und ddTTP wurden von Boehringer-Mannheim (Kat. Nr. 1277049 und 1008382) bezogen. d(CAG CTC TCA TTT TCC ATA C (SEQ ID Nr. 73) wurde als PROBE-Primer (87) verwendet. Die nachstehenden Lösungen wurden zu den Perlen zugegeben: 3,0 μl H2O, 1,0 μl Reaktionspuffer, 1,0 μl PROBE-Primer (10 pMol), und bei 65°C für 5 min, gefolgt von 10 min bei 37°C, inkubiert. Dann wurden 0,5 μl DTT, 3,5 μl dNTPs/ddNTP, jeweils 50 μM, und 0,5 μl Sequenase (0,8 E) zugegeben und 10 min bei 37°C inkubiert.
  • T4-Behandlung der DNA
  • Zur Herstellung stumpf-endiger DNA wurden die Amplifikationsprodukte mit T4-DNA-Polymerase (Boehringer-Mannheim Kat. Nr. 1004786) behandelt. Die Reaktionen wurden gemäß dem Hersteller-Protokoll für 20 min bei 11°C durchgeführt.
  • Direkte Größenbestimmung der verlängerten Produkte
  • Zur Bestimmung der Größe des amplifizierten Produktes wurde MALDI-TOF bei einem Strang des Amplifikationsprodukts angewendet. Die Proben wurden wie vorstehend beschrieben an die Perlen gebunden und wie nachstehend beschrieben konditioniert und denaturiert.
  • DNA-Konditionierung
  • Nach der PROBE-Reaktion wurde der Überstand verworfen, und die Perlen wurden zuerst in 50 μl 700 mM NH4-Citrat und als zweites in 50 μl 50 mM NH4-Citrat gewaschen. Die erzeugten diagnostischen Produkte wurden von der Matrize entfernt, indem die Perlen 2 min bei 80°C in 2 μl H2O erhitzt wurden. Der Überstand wurde zur MALDI-TOF-Analyse verwendet.
  • Proben-Präparation und Analyse mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie
  • Spektrometrie
  • Die Proben-Präparation erfolgte durch Mischen von 0,6 μl Matrix-Lösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure, 0,07 M dibasisches Citrat in 1:1 H2O:CH3CN) mit 0,3 μl diagnostischen PROBE-Produkten in Wasser auf einem Probenziel und Trocknenlassen an Luft. Bis zu 100 Proben wurden zum Einbringen in den Quellenbereich eines unmodifizierten Perspective Voyager MALDI-TOF-Gerätes, das im Linear-Modus mit verzögerter Extraktion und 5 und 30 kV an der Ziel- bzw. Umwandlungsdynode betrieben wurde, punktförmig auf eine Probenzielscheibe aufgetragen. Theoretische durchschnittliche Molekülmassen (Mr(ber.)) der Analyten wurden aus den atomaren Zusammensetzungen berechnet, die aufgezeichneten experimentellen Mr(exp.)-Werte waren diejenigen der einfach protonierten Form, die mittels interner Kalibrierung mit unverlängerten Primern im Fall der PROBE-Reaktionen bestimmt wurden.
  • Herkömmliche Analysen
  • Die herkömmlichen Analysen erfolgten durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese gemäß Standard-Protokollen. Die diagnostischen Produkte wurden vor dem Auftragen auf die Gels mit Formamid denaturiert und mit Ethidiumbromid bzw. Silber angefärbt.
  • ERGEBNISSE
  • Der CKR-5-Status der 10 zufällig ausgewählten DNA-Proben gesunder Individuen wurde analysiert. Leukozyten-DNA wurde durch PCR amplifiziert, und ein Aliquot des amplifizierten Produktes wurde durch Standard-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung der DNA (88) analysiert. Vier Proben zeigten zwei Banden, die möglicherweise Heterozygotie für CKR-5 anzeigen, wohingegen die anderen 6 Proben eine Bande zeigten, was einem homozygoten Gen entspricht (88). In dem Fall, in dem zwei Banden beobachtet wurden, entsprechen diese der erwarteten Größe von 75 bp für das Wildtyp-Gen und 43 bp für das Allel mit der Deletion (87). Wo eine Bande beobachtet wurde, betrug die Größe etwa 75 bp, was ein homozygotes Wildtyp-CKR-5-Alle) anzeigte. Eine DNA-Probe, die von einem mutmaßlich heterozygoten Individuum stammte, und eine von einem homozygoten Individuum wurden für alle weiteren Analysen verwendet. Zur Bestimmung der Molekülmasse des amplifizierten Produktes wurde die DNA einer Matrix-unterstützten Laser-Desorption/Ionisation, gekoppelt mit Flugzeit-Analyse (MALDI-TOF) unterworfen. Doppelsträngige DNA, gebunden an Streptavidin-beschichtete paramagnetische Teilchen, wurde denaturiert, und der in den Überstand abgegebene Strang wurde analysiert. Die 89A zeigt ein Spektrogramm einer DNA-Probe, die gemäß dem Ergebnis, das aus der Polyacrylamid-Gelelektrophorese (88) hergeleitet wurde, als heterozygot angesehen wurde. Die berechnete Masse des Sense-Stranges für ein Wildtyp-Gen beträgt 23036 Da und die des Sense-Stranges, der das Deletions-Allel trägt, 13143 (87 und Tabelle VI). Da viele thermostabile Polymerasen unspezifisch ein Adenosin an das 3'-Ende des Produktes anhängen, wurden diese Massen ebenfalls berechnet. Sie betragen 23349 und 13456 Da. Die Massen der beobachteten Peaks (89A) sind 23119 Da, was der berechneten Masse eines Wildtyp-DNA-Stranges mit angefügtem Adenosin entspricht (23349 Da). Da kein Peak mit einer Masse von etwa 23036 Da beobachtet wurde, muss die Polymerase qualitativ Adenosin angefügt haben. Zwei sehr nahe beieinander liegende Peaks haben eine Masse von 13451 und 13137 Da. Dies entspricht den berechneten Massen des Allels mit der 32 bp-Deletion. Der Peak für die höhere Masse entspricht dem Produkt mit angehängtem Adenosin, und der Peak für die geringere Masse entspricht demjenigen ohne unspezifisches Adenosin. Beide Peaks sind etwa gleich hoch, was zeigt, dass etwa bei der Hälfte des Produktes Adenosin angefügt worden war. Der Peak mit einer Masse von 11.682 Da ist ein doppelt geladenes Molekül der DNA, die 23.319 Da entspricht (2 × 11.682 Da = 23.364 Da). Die Peaks mit Massen von 6732 und 6575 Da sind doppelt geladene Moleküle derjenigen DNA mit Massen von 13.451 und 13.137 Da, und der Peak mit 7794 Da entspricht dem dreifach geladenen Molekül von 23.319 Da. Mehrfach geladene Moleküle werden routinemäßig durch Berechnung identifiziert. Amplifizierte DNA, die von einem homozygoten Individuum stammte, zeigt im Spektrogramm (89C) einen Peak mit einer Masse von 23.349,6 und einen viel kleineren Peak mit einer Masse von 23.039,9 Da. Der Peak mit der höheren Masse entspricht der DNA, die von einem Wildtyp-Alle) mit angefügtem Adenosin herrührt, die eine berechnete Masse von 23.349 Da hat. Der Peak mit der geringeren Masse entspricht dem gleichen Produkt ohne Adenosin. Drei weitere Peaks mit einer Masse von 11.686, 7804,6 und 5852,5 Da entsprechen zweifach, dreifach und vierfach geladenen Molekülen.
  • Das unspezifisch angefügte Adenin kann durch Behandlung der DNA mit T4-DNA-Polymerase von der amplifizierten DNA entfernt werden. DNA, die von einem heterozygoten und einem homozygoten Individuum stammte, wurde nach der T4-DNA-Polymerase-Behandlung analysiert. 89B zeigt das von heterozygoter DNA stammende Spektrogramm. Der Peak, der dem Wildtyp-Strang entspricht, hat eine Masse von 23008 Da, was zeigt, dass das angefügte Adenin vollständig entfernt worden war. Das gleiche wird für den Strang mit einer Masse von 13140 Da beobachtet.
  • Die anderen drei Peaks sind mehrfach geladene Moleküle der Ausgangspeaks. Das Massenspektrogramm für die homozygote DNA zeigt einen Peak einer Masse von 23.004 Da, was dem Wildtyp-DNA-Strang ohne zusätzlich angefügtes Adenin entspricht. Sämtliche anderen Peaks stammen von mehrfach geladenen Molekülen dieser DNA. Die amplifizierten Produkte können durch direkte Bestimmung ihrer Massen analysiert werden, wie vorstehend beschrieben, oder durch Messen der Massen von Produkten, die vom amplifizierten Produkt in einer weiteren Reaktion stammen. In dieser Primer-Oligo-Basen-Extensions-(PROBE)-Reaktion wird ein Primer, der intern sein kann, wie bei der geschachtelten PCR, oder zu einem der PCR-Primer identisch ist, nur um einige Basen verlängert, bevor das Terminations-Nukleotid eingebaut wird. In Abhängigkeit von der Extensionslänge kann der Genotyp bestimmt werden. CKRΔ-F wurde als PROBE-Primer verwendet und dATP/dGTP und ddTP als Nukleotide. Die Primerextension ist im Falle einer Wildtyp-Matrize AGT und im Falle der Deletion AT (87). Die entsprechenden Massen sind 6604 Da für den Wildtyp bzw. 6275 Da für die Deletion. PROBE wurde an zwei Standard-DNAs eingesetzt. Das Spektrogramm (90A) zeigt Peaks mit Massen von 6604 Da, die der Wildtyp-DNA entsprechen, und mit 6275 Da, die dem CKR-5-Deletions-Allel entsprechen (Tabelle VIII). Der Peak bei einer Masse von 5673 Da entspricht CKRΔ-F (berechnete Masse 5674 Da). Weitere Proben wurden auf analoge Weise analysiert (90B). Die Identifizierung ergibt eindeutig homozygote DNA, da der Peak mit einer Masse von 6607 Da dem Wildtyp-Allel und der Peak mit einer Masse von 5677 Da dem nicht-verlängerten Primer entspricht. Es wurden keine weiteren Peaks beobachtet.
  • Das Beispiel zeigt, dass die Deletionsanalyse durch Massenspektrometrie durchgeführt werden kann. Wie hier gezeigt, kann die Deletion durch direkten Nachweis der einzelsträngigen amplifizierten Produkte, oder durch Analyse spezifisch erzeugter diagnostischer Produkte (PROBE) analysiert werden. Wie im nachstehenden Beispiel 26 gezeigt ist, können außerdem amplifizierte doppelsträngige DNA-Produkte analysiert werden.
    Größe berechnete Masse gemessene Masse
    Wildtyp ohne A 23036 23039/23009/23004
    Wildtyp mit A 23349 23319/23350
    Deletion ohne A 13143 13137/13139
    Deletion mit A 13456 13451
    PROBE
    Wildtyp 6604 6604/6608
    Deletion 6275 6275
  • Sämtliche Massen sind in Dalton angegeben.
  • BEISPIEL 24
  • Pentaplex-tc-PROBE
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Der Multiplex-Betrieb der Thermocycling-Primer-Oligo-Basen-Extension (tcPROBE) erfolgte mit fünf polymorphen Stellen in drei unterschiedlichen Apolipoprotein-Genen, von denen man annimmt, dass sie an der Pathogenese von Arteriosklerose beteiligt sind. Das Apolipoprotein-A-IV-Gen (Codons 347 und 360), das Apolipoprotein-E-Gen (Codons 112 und 158) und das Apolipoprotein-B-Gen (Codon 3500) wurden untersucht. Alle Massenspektren waren hinsichtlich der fünf polymorphen Stellen leicht zu interpretieren.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • PCR-Amplifikation
  • Menschliche genomische Leukozyten-DNA wurde für die PCR verwendet. Im folgenden sind die Primer aufgelistet, die für die gesonderte Amplifikation von Abschnitten der Apo-A-IV-, Apo-E- und Apo-B-Gene verwendet wurden:
    Figure 01630001
    Figure 01640001
  • Taq-Polymerasc und 10×-Puffer wurden von Boehringer-Mannheim (Deutschland) bezogen und dNTPs von Pharmacia (Freiburg, Deutschland). Das gesamte Volumen der PCR-Reaktion betrug 50 μl, einschließlich 10 pmol jedes Primers und 10% DMSO (Dimethylsulfoxid, Sigma) (kein DMSO für die PCR des Apo-B-Gens), wobei ca. 200 mg genomische DNA als Matrize und eine dNTP-Endkonzentration von 200 μM verwendet wurden. Die Lösungen wurden auf 80°C erhitzt, bevor 1 E Taq-Polymerase zugegeben wurde; die PCR-Bedingungen waren; 5 min bei 95°C, anschließend 2 Zyklen mit 30 sek bei 94°C, 30 sek bei 62°C, 30 sek bei 72°C, 2 Zyklen mit 30 s bei 94°C, 30 sek bei 58°C, 30 sek bei 72°C, 35 Zyklen mit 30 sek bei 94°C, 30 sek bei 56°C, 30 sek bei 72°C, und einer abschließenden Extensionszeit von 2 min bei 72°C. Um nicht-eingebaute Primer und Nukleotide zu entfernen wurden die amplifizierten Produkte mit dem „QIAquick"-Kit (Qiagen, Deutschland) gereinigt, wobei die gereinigten Produkte in 50 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 80) eluiert wurden.
  • Bindung der amplifizierten Produkte an Perlen
  • 10 μl jedes gereinigten amplifizierten Produktes wurden an 5 μl DynaBeads (Dynal, M-280 Streptavidin) angebunden, und gemäß des Dynal-Protokolls denaturiert. Für die Pentaplex-tc-PROBE-Reaktion wurden die drei verschiedenen amplifizierten Produkte (gebunden an die Perlen) zusammengefasst.
  • Tc-PROBE
  • Für die PROBE-Reaktion wurden die folgenden Primer verwendet:
    Figure 01650001
  • Die tc-PROBE wurde in einem Endvolumen von 25 μl durchgeführt, worin 10 pmol jedes der oben genannten Primer, 2,5 E Thermoquenase (Amersham), 2,5 μl Thermoquenase-Puffer und 50 μM dTTP (Endkonzentrationen) und 200 μM ddA/C/GTP enthalten waren. Die Röhrchen, die das Gemisch enthielten, wurden in einen Thermocycler gegeben und den folgenden Cycling-Bedingungen unterworfen: Denaturierung (94°C): der Überstand wurde sorgfältig von den Perlen entfernt und durch Ethanolpräzipitation 'entsalzt', um nichtflüchtige Kationen, wie etwa Na+ und K+ gegen NH4 + auszutauschen, welches während des Ionisationsvorgangs verdampfte; 5 μl 3 M Ammoniumacetat (pH 6,5), 0,5 μl Glykogen (10 mg/ml, Sigma), 25 μl H2O und 110 μl absolutes Ethanol wurden zu 25 μl PROBE-Überstand zugegeben und für 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 13.000 × g wurde das Sediment in 70%-igem Ethanol gewaschen und in 1 μl 18 MOhm/cm H2O resuspendiert. Ein 0,35 μl-Aliquot der resuspendierten DNA wurde mit 0,35 μl Matrix-Lösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), 0,07 M Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) auf einer Edelstahl-Probenzielscheibe vermischt und an Luft trocknen gelassen, bevor das Spektrum mit dem Thermo-Bioanalysis Version 2000 MALDI-TOF-Gerät, das im Reflektron-Modus mit 5 und 20 kV an der Ziel- bzw. der Umwandlungsdynode betrieben wurde, aufgenommen wurde. Die theoretischen durchschnittlichen Molekülmassen (Mr(ber.) der Fragmente wurden aus den atomaren Zusammensetzungen berechnet. Eine externe Kalibrierung wurde mit einem synthetischen (ATCG)n-Oligonukleotid (3,6–1,8 kDa) vorgenommen. Positive Ionenspektren von 1 bis 37.500 Da wurden aufgenommen.
  • ERGEBNISSE
  • Tabelle VIII zeigt die berechneten Molekülmassen aller möglichen Extensionsprodukte, einschließlich der Masse des Primers selbst. 91 zeigt ein entsprechendes MALDI-TOF-MS-Spektrum einer tc-PROBE unter gleichzeitiger Verwendung von drei verschiedenen Matrizen und 5 verschiedenen PROBE-Primern in einer Reaktion. Der Vergleich der beobachteten und berechneten Massen (siehe Tabelle VIII) erlaubt eine schnelle genetische Profilbestimmung verschiedener polymorpher Stellen in einer individuellen DNA-Probe. Die in 91 dargestellte Probe ist homozygot für Threonin und Glutamin an Position 347 bzw. 360 in dem Apolipoprotein A-IV-Gen, trägt das Epsilon-3-Allel homozygot im Apolipoprotein E-Gen und ist auch am Codon 3500 für Arginin in dem Apolipoprotein B-Gen homozygot. TABELLE VIII
    Figure 01660001
  • BEISPIEL 25
  • Sequenzierung der Exons 5 bis 8 des p53-Gens durch Massenspektrometrie
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • 35 Zyklen von PCR-Reaktionen wurden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt, wobei jedes Well ein Gesamtvolumen von 50 μl enthielt, einschließlich 200 ng genomischer DNA, 1 Einheit Taq-DNA-Polymerase, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPx, 10 pMol des Vorwärts-Primers und 6 oder 8 des biotinylierten Rückwärts-Primers. Die Sequenzen der PCR-Primer, die nach üblicher Chemie hergestellt wurden (N. D. Sinha, J. Biernat, H. Kter, Tetrahed. Lett. 24:5843–5846 (1983)), sind wie folgt:
    Figure 01670001
  • Zu jedem Well der 96-Well-Mikrotiterplatte, welche ungereinigtes amplifiziertes Produkt enthielt, wurden 0,1 mg paramagnetische Streptavidin-Perlen (Dynal) in 10 μl 5 × Bindungslösung (5 M NH4OH) zugegeben und für 30 min bei 37°C inkubiert.
  • Anschließend wurden die Perlen mit 0,1 M NaOH bei Raumtemperatur für 5 min behandelt, und danach einmal für 5 min bei Raumtemperatur mit 50 mM NH4OH und dann einmal mit 50 mM Tris-HCl gewaschen.
  • Vier Didesoxy-Terminationsreaktionen wurden in separaten Wells der Mikrotiterplatte durchgeführt. Insgesamt 84 Reaktionen (21 Primer × 4 Reaktionen/Primer) können in einer einzigen Mikrotiterplatte durchgeführt werden. Zu jedem Well, das immobilisierte einzelsträngige Matrize enthielt, wurde ein Gesamtvolumen von 10 μl Reaktionsgemisch zugegeben, das 1 × Reaktionspuffer, 10 pMol Sequenzierungs-Primer, 250 mM dNTPs, 25 mM eines der ddNTPs und 1 ~ 2 Einheiten Thermosequenase (Amersham) beinhaltete. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit einem Thermal Cycier unter nicht-Cycling-Bedingungen durchgeführt: 1 min bei 80°C, 1 min bei 50°C, mit 0,1°C/sek ansteigend von 50°C auf 72°C und 5 min bei 72°C. Die Perlen wurden dann mit 0,7 M Ammoniumcitrat und anschließend mit 0,05 M Ammoniumcitrat gewaschen. Die Sequenzierungsprodukte wurden dann von den Perlen entfernt, indem die Perlen in 2 μl 50 mM NH4OH für 2 min auf 80°C erhitzt wurden. Der Überstand wurde für die MALDI-TOF MS-Analyse verwendet.
  • Die Matrix wurde hergestellt wie von Kter et al. beschrieben (Kter, H. et al. Nature Biotechnol, 14:1123–1128 (1996)). Diese gesättigte Matrix-Lösung wurde dann mit reinem Wasser 1,52-fach verdünnt, bevor sie verwendet wurde. 0,3 μl der verdünnten Matrix-Lösung wurden dann vor der Verwendung mit reinem Wasser 1,52 fach verdünnt. 0,3 μl der verdünnten Matrix-Lösung wurden auf das Probenziel aufgetragen und kristallisieren gelassen, anschließend wurden 0,3 μl des wässrigen Analyten zugegeben. Ein Perseptive Voyager DE-Massenspektrometer wurde für die Experimente verwendet, und die Proben wurden üblicherweise im manuellen Modus analysiert. Das Ziel und die Mittelplatte wurden nach jedem Laser-Schuss für 200 Nanosekunden bei +18,2 kV gehalten, und dann wurde die Zielspannung auf +20 kV erhöht. Der Ionen-Führungsdraht im Flugrohr wurde bei ca. 2 V gehalten. Normalerweise wurden für jede Probe 250 Laser-Schüsse akkumuliert. Das Originalspektrum wurde bei einer 500 MHz Digitalisierungsfrequenz aufgenommen, und das Endspektrum wurde durch ein 455 Punkt-Mittel geglättet (Savitsky und Golay (1964), Analytical Chemistry 36:1627). Eine Standard-Kalibrierung des Massenspektrometers wurde zur Identifizierung jedes Peaks und zur Zuordnung der Sequenzen verwendet. Zur Rekalibrierung jedes Spektrums wurden die theoretischen Massenwerte von zwei Sequenzierungspeaks verwendet (D. P. Little, T. L. Cornish, M. J. O'Donnel, A. Braun, R. J. Cotter, H. Kter, Anal. Chem., eingereicht).
  • ERGEBNISSE
  • Abweichungen des p53-Gens wurden als entscheidender Schritt bei der Entwicklung zahlreicher menschlicher Krebserkrankungen angesehen (Greenblatt et al. (1994) Cancer Res 54, 4855–4878; C. C. Harns (1996), J. Cancer 73 261–269; und D. Sidransky und M. Hollstein (1996), Annu. Res. Med. 47:285–301). Mutationen können als molekulare Indikatoren für die Klonalität oder als frühe Marker für einen Rückfall bei einem Patienten mit einer zuvor identifizierten Mutation in einem Primärtumor dienen (Hainaut et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:151–157). Die Krebsprognose kann je nach der Art der vorhandenen p53-Mutationen variieren (H. S. Goh et al. (1995), Cancer Res. 55:5217–5221). Seit der Entdeckung des p53-Gens wurden mehr als 6000 verschiedene Mutationen entdeckt. Die Exons 5–8 wurden als Sequenzierungs-Ziele ausgesucht, wo sich die meisten Mutationen anhäufen (Hainaut et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:151–157).
  • 96 zeigt schematisch das Einzelröhrchen-Verfahren für die Ziel-Amplifikation und -Sequenzierung, die wie ausführlich in Materialien und Methoden beschrieben, durchgeführt wurde. Jedes der Exons 5–8 des p53-Gens wurde mittels PCR amplifiziert, wobei flankierende Primer im Intronbereich verwendet wurden; der stromabwärts gelegene Primer war biotinyliert. Die Amplifikationen der verschiedenen Exons wurden für die Verwendung desselben Cycing-Profils optimiert, und die Produkte wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Die PCR-Reaktionen wurden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt, und das in einem Well erzeugte Produkt wurde als Matrize für eine Sequenzierungsreaktion verwendet. Streptavidin-beschichtete Magnet-Perlen wurden zu derselben Mikrotiterplatte zugegeben, und die amplifizierten Produkte wurden immobilisiert. Die Perlen wurden dann mit NaOH behandelt, um immobilisierte einzelsträngige DNA als Sequenzierungs-Matrize zu erzeugen. Die Perlen wurden ausgiebig mit Tris-Puffer gewaschen, da zurückbleibende Base die Aktivität des Sequenzierungs-Enzyms verringern würde.
  • Insgesamt 21 Primer wurden ausgewählt, um die Exons 5–8 des p53-Gens mittels Primer-Walking zu sequenzieren. Das Nukleotid am 3'-Ende sämtlicher Primer befindet sich an einer Stelle, an der keine bekannte Mutation existiert. Vier Terminationsreaktionen wurden separat durchgeführt, was insgesamt 84 Sequenzierungsreaktionen auf derselben PCR-Mikrotiterplatte ergab. Für die Sequenzierung wurden Nicht-Cycling Bedingungen verwendet, da Streptavidin beschichtete Perlen die wiederholte Einwirkung hoher Temperatur nicht aushalten. Die Sequenzierungsreaktionen wurden so konzipiert, dass die mt-terminierten Fragmente weniger als 70 Nukleotide aufwiesen, ein Größenbereich der für MALDI-TOF-MS leicht zugänglich ist und dennoch ausreichend lang ist, um in die nächste Primer-Bindungsstelle hinein zu sequenzieren. Thermoquenase war das Enzym der Wahl, da es in der Lage war, reproduzierbar eine hohe Ausbeute an Sequenzierungsprodukten in dem gewünschten Massenbereich zu erzeugen. Nach den Sequenzierungsreaktionen wurden die Perlen mit Ammoniumionenpuffern gewaschen, um alle anderen Kationen zu ersetzen. Die Sequenzleitern wurden dann von den Perlen durch Erhitzen in Ammoniumhydroxid-Lösung oder einfach in Wasser entfernt.
  • Ein Sub-Mikroliter-Aliquot jeder der 84 Sequenzierungsreaktionen wurde auf einen MS-Probenhalter gegeben, der mit Matrix vorbeladen war. 94 zeigt ein Beispiel für Sequenzierungsdaten, die mit einem Primer erzeugt wurden; vier Spektren sind übereinandergelegt.
  • Sämtliche Sequenzierungspeaks waren in dem Massenbereich, der zum Einlesen in die nächste Sequenzierungs-Primerstelle erforderlich war, gut aufgelöst. Manchmal wurden doppelt geladene Peaks beobachtet, die leicht identifiziert werden konnten, indem die Masse mit der eines einfach geladenen Ions korreliert wurde. Falsche Abbrüche, die durch eine frühzeitige Termination der Enzymextension hervorgerufen werden, können in der Nähe der Primer-Stelle beobachtet werden. Da die Massenauflösung hoch genug ist, können die Peaks der falschen Abbrüche leicht von echten Sequenzierungspeaks unterschieden werden, indem der Massenunterschied der benachbarten Peaks berechnet wird und die vier Spektren verglichen werden. Außerdem lieferten mt-Primer nachweisbare Daten über den Bereich der stromabwärts gelegenen Primer-Bindungsstelle, sodass der Bereich der falschen Abbrüche abgedeckt wurde.
  • Unter Verwendung optimierter Amplifikations-, Sequenzierungs- und Konditionierungs-Verfahren wurden die Exons 5–8 des p53-Gens erfolgreich sequenziert. Die korrekten Wildtyp-Sequenzdaten wurden von allen Exons mit einer Massenauflösung von etwa 300 bis 800 über den gesamten Massenbereich erhalten. Die Gesamtmassengenauigkeit beträgt 0,05% oder besser. Die durchschnittliche Menge jedes auf einen MS-Probenhalter aufgetragenen Sequenzierungsfragmentes wird auf 50 fmol oder weniger geschätzt.
  • Dieses Beispiel zeigt die Machbarkeit der Sequenzierung von Exons eines menschlichen Gens durch MALDI-TOF-MS. Im Vergleich zu einer automatischen Fluoreszenz-DNA-Sequenzierung auf Gel-Basis sind die Leselängen kürzer. Es kann eine Mikrochip-Technologie eingesetzt werden, die ein paralleles Verarbeiten ermöglicht. Die in der Mikrotiterplatte erzeugten Sequenzierprodukte können direkt auf einen Mikrochip übertragen werden, der als Startplattform für die MALDI-TOF-MS-Analyse dient. Roboter-betriebene serielle und parallele Nanoliter-Dosierungssysteme werden verwendet, um Anordnungen von 100–1000 DNA-Proben auf Chips mit < 1 Zoll2 mit flacher oder geometrisch veränderter Oberfläche (z. B. mit Wells) zur schnellen Massenspektrometrie-Analyse unterzubringen.
  • 94 zeigt ein MS-Spektrum, das auf einem Chip erhalten wurde, bei dem die Probe mit einer Stift-Vorrichtung von einer Mikrotiterplatte übertragen wurde. Die geschätzte Menge jedes aufgetragenen Terminationsproduktes beträgt 5 fMol oder weniger, was in dem Mengenbereich liegt, der bei der konventionellen Sanger-Sequenzierung mit Radioaktiv- oder Fluoreszenz-Nachweis verwendet wird (0,5–1 fMol pro Fragment). Das Auftragen geringer Volumina von MALDI-Proben besitzt die Vorteile der Miniaturisierung (verringerter Verbrauch an Reagenzien), verbesserte Reproduzierbarkeit und automatische Signalaufnahme.
  • BEISPIEL 26
  • Direkter Nachweis von synthetischer und biologisch erzeugter doppelsträngiger DNA durch MALDI-TOF-MS
  • Einleitung
  • Typischerweise ergibt die Matrix-unterstützte Laser-Desorptionsionisation (Karas et al. (1989), Int. J. Mass Spectrom, Ion Processes 92, 231) Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOFMS) von DNA-Molekülen, die in Lösung doppelsträngig (ds) sind, molekulare Ionen, die die beiden einzelsträngigen Komponenten repräsentieren (Tang et al. (1994), Rapid Commun. Mass Spectrom. 8:183; Tang et al. (1995), Nucleic Acids Res. 23:3126; Renner et al. (1995), Rapid Commun. Mass Spectrom. 9:537; Liu et al. (1995), Anal. Chem. 67:3482; Siegert et al. (1996), Anal. Biochem. 243:55 und Doktycz et al. (1995), Anal. Biochem. 230:205); dies wurde in mehreren Berichten beobachtet, die sich mit biologisch erzeugter DNA aus einer Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifikation beschäftigen (Tang et al. (1994), Rapid Commun. Mass Spectrom. 8:183; Liu et al. (1995), Anal. Chem. 67:3482; Siegert et al. (1996), Anal. Biochem. 243:55 und Doktycz et al. (1995), Anal. Biochem. 230:205). Es ist nicht klar, ob der Doppelstrang wegen des verringerten pH-Wertes in der Matrix-Umgebung destabilisiert wird oder wegen der Absorbtion des Doppelstranges während der Desorption/Ionisation/Beschleunigung mit einer Energie, die ausreichend ist, um die anziehenden van der Waals- und die „Stacking"-Stabilisierungs-Kräfte zu überwinden (Cantor und Shimmel, Biophysical Chemistry Teil 1: The conformation of Biomolecules, W. H. Freeman, New York (1980) 176). Wenn der Analyt in hohen Konzentrationen vorliegt, so ist die Bildung nicht-spezifischer Gasphasen-DNA-Multimere wie bei Proteinen (Kares et al. (1989), Int. J. Mass. Spectrom. Ion Processes 92:231) üblich; Lecchi und Pannell (Lecchi et al. (1995) J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 6:972) haben jedoch einen starken Beweis dafür geliefert, dass eine spezifische Watson Crick-(WC)-Basenpaarung in der Gasphase beibehalten wird. Sie entdeckten diese spezifischen Dimere bei der Verwendung von 6-Aza-2-thiothymin als Matrix, beobachteten diese aber nicht mit einer 3-Hydroxypicolinsäure (3-DPA)- oder 2,4,6-Hydroxyacetophenon-MatriX. Wie nachstehend beschrieben, ist bei Verwendung einer geringen Beschleunigungsspannung der Ionen und durch Herstellung von Proben für die MALDI-Analyse bei niedrigeren Temperaturen, ein routinemäßiger Nachweis von dsDNA möglich.
  • MATERIALIEN UND METHODEN
  • Synthetische DNA. Oligonukleotide wurden auf einem Perspective Expedite DNA-Synthesegerät synthetisiert (Sinha et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 4539) und im Haus durch Reversephasen-HPLC gereinigt. Die Sequenzen waren: 50-mer (15337 Da): 5'-TTG CGT ACA CAC TGG CCG TCG TTT TAC AAC GTC GTG ACT GGG AAA ACC CT-3' (SEQ ID Nr. 109); 27-merc (komplementär, 8343 Da): 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GTG TGT ACG CAA-3' (SEQ ID Nr. 110); 27- mernc (nicht-komplementär, 8293 Da): 5'-TAC TGG AAG GCG ATC TCA GCA ATC AGC-3' (SEQ ID Nr. 111). 100 μM Stammlösungen wurden unter Verwendung von 18 MOhm/cm H2O auf 20, 10, 5 und 2,5 μM verdünnt. Jeweils 2 μl der äquimolaren Lösungen des 50-mers und entweder des 27-mersc oder des 27-mersnc wurden vermischt und man ließ sie für 10 min bei Raumtemperatur annelieren. 0,5 μl dieser Gemische wurden direkt auf einem Probenziel mit 1 μl Matrix (0,7 M 3-HPA, 0,07 M Ammoniumcitrat in 50%-igem Acetonitril) vermischt und an der Luft trocknen gelassen.
  • Biologische DNA. Es wurde eine enzymatische Spaltung menschlicher genomischer Leukozyten-DNA durchgeführt. Die PCR-Primer (Vorwärts, 5'-GGC ACG OCT GTC CAA GGA G-3 (SEQ ID Nr. 112); Rückwärts, 5'-AGG CCG CGC TCG GCG CCC TC-3' (SEQ ID Nr. 113)) zur Amplifikation eines Teils von Exon 4 des Apolipoprotein-E-Gens wurden aus der veröffentlichten Sequenz (Das et al. (1985), J. Biol. Chem. 260:6240) abgeleitet. Taq-Polymerase und 10×-Puffer wurden von Boehringer-Mannheim (Deutschland) bezogen und die dNTPs von Pharmacia (Freiburg, Deutschland). Das Gesamt-Reaktionsvolumen betrug 50 μl einschließlich 20 pMol jedes Primers und 10% DMSO (Dimethylsulfoxid, Sigma) mit ungefähr 200 ng genomischer DNA als Matrize. Die Lösungen wurden vor der Zugabe von IU-Polymerase auf 80°C erhitzt. Die PCR-Bedingungen waren: 2 min bei 94°C, gefolgt von 40 Zyklen mit 30 sek bei 94°C, 45 sek bei 63°C, 30 sek bei 72°C, und einer abschließenden Extensionszeit von 2 min bei 72°C. Es wurden keine quantitativen Daten zur Bestimmung der endgültigen Ausbeute an amplifiziertem Produkt gesammelt, es jedoch wurde geschätzt, dass –2pmol für den enzymatischen Verdau verfügbar waren.
  • Cfol und Rsal und Reaktionspuffer L wurden von Boehringer-Mannheim bezogen. 20 μl der amplifizierten Produkte wurden mit 15 μl Wasser und 4 μl Puffer L verdünnt; nach Zugabe von 10 Einheiten der Restriktionsenzyme wurden die Proben für 60 min bei 37°C inkubiert. Zur Präzipitation der Verdauprodukte wurden 5 μl 3 M Ammoniumacetat (pH 6,5), 5 μl Glykogen (Braun et al. (1997), Clin. Chem. 43, 1151) (10 mg/ml, Sigma) und 110 μl absolutes Ethanol zu 50 μl der Analyt-Lösungen zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur gelagert. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 13.000 × g wurde das Sediment in 70%igem Ethanol gewaschen und in 1 μl 18 MOhm/cm H2O resuspendiert.
  • Probenpräparation und Analyse durch MALDI-TOF-MS. 0,35 μl der resuspendierten DNA wurden mit 0,35–1,3 μl Matrixlösung (0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure (3-HPA), 0,07 M Ammoniumcitrat in 1:1 H2O:CH3CN) (Wu et al. (1993), Rapid Commun. Mass Spectrom. 7142) auf einer Edelstahl-Probenzielscheibe gemischt und vor der Aufnahme des Spektrums mit einem Thermo Bioanalysis Vision 2000 MALDI-TOF Gerät, das im Positiv-Ionen-Reflektron-Modus mit 5 und 20 kV an der Ziel- bzw. der Umwandlungsdynode betrieben wurde, an der Luft getrocknet. Die theoretischen durchschnittlichen Molekülmassen (Mr(ber.)) der Fragmente wurden aus den atomaren Zusammensetzungen berechnet; die Masse eines Protons (1,08 Da) wurde von den Rohdaten-Werten bei der Aufzeichnung experimenteller Molekülmassen (Mr(exp)) als neutrale Grundlage subtrahiert. Die aus acht Peaks (2000–18.000) erhaltene externe Kalibrierung wurde für sämtliche Spektren verwendet.
  • Ergebnisse und Diskussion
  • 96A ist ein MALDI-TOF-Massenspektrum eines Gemisches des synthetischen 50-mers mit dem (nicht-komplementären) 27-mernc (jeweils 10 μM, die höchste in dieser Untersuchung verwendete Endkonzentration); die Laser-Energie wurde auf wenig oberhalb der Schwellenbestrahlung für die Ionisation eingestellt. Die Peaks bei 8,30 und 15,34 kDa veranschaulichen einzeln geladene Ionen, die von den 27-mer- bzw. 50-mer-Einzelsträngen herrühren. Schlecht aufgelöste schwache Signale bei –16,6 und –30,7 kDa stellen Homodimere des 27- bzw. 50-mers dar; dasjenige bei 23,6 kDa stimmt mit einem Heterodimer überein, das einen 27-mer- und einen 50-mer-Strang enthält. Somit wurden wenig intensive Dimer-Ionen beobachtet, die sämtliche möglichen Kombinationen der beiden nicht-komplementären Oligonukleotide darstellen (27 + 27; 27 + 50; 50 + 50). Ein Erhöhen der Bestrahlung sogar bis zu einem Punkt, an dem die Depurinierungs-Peaks das Spektrum beherrschten, ergab etwas höhere Intensitäten für diese Dimer-Peaks. Man beachte, dass die Hybridisierung bei Raumtemperatur und mit einer sehr geringen Salzkonzentration durchgeführt wurde, d. h. unter Bedingungen, bei denen eine nicht-spezifische Hybridisierung erfolgen kann.
  • 96 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum des gleichen 50-mers im Gemisch mit dem (komplementären) 27-merc; die Endkonzentration jedes Oligonukleotids betrug wiederum 10 μM. Unter Verwendung der gleichen Laserenergie wie in 96A wurden wieder intensive Signale bei 88,34 und 15,34 kDa beobachtet, die dem einzelsträngigen 27- bzw. 50-mer entsprachen. Homodimer-Peaks (27 + 27; 50 + 50) waren im Hintergrundrauschen kaum wahrzunehmen; jedoch herrschten die einzeln (23,68 kDa) und doppelt (11,84 kDa) geladenen Heterodimer-Peaks (27 + 50) vor. Der 23,68 kDa-Dimer-Peak konnte zwar aus allen Bestrahlungspositionen nachgewiesen werden, seine Intensität im Verhältnis zu den Monomer-Peaks variierte jedoch leicht von Punkt zu Punkt. Die Wiederholung des Experimentes mit einzelnen Oligonukleotid-Konzentrationen von 5, 2,5 und 1,25 μM ergab abnehmende Mengen des 27-/50-mer-Watson-Crick-Dimer-Peaks im Verhältnis zu den 27- und 50-mer-Einzelstrang-Peaks. Bei den niedrigsten Konzentrationen war die Beobachtung des Dimers „kristallabhängig", d. h. die Bestrahlung einiger Kristalle erzeugte ein signifikantes 27-/50-mer-Dimer-Signal, wohingegen andere Kristalle reproduzierbar nur ein sehr schwaches oder kein Signal ergaben. Dies zeigt, dass der Einbau von dsDNA in die Matrix-Kristalle oder die Wirksamkeit, mit der diese Wechselwirkung während des Ionisations-/Desorptions-Verfahrens aufrechterhalten wird, von den mikroskopischen Eigenschaften der Kristalle abhängt, und/oder dass starke Konzentrationsgradienten des Doppelstrangs in der Probe vorliegen.
  • Die Spektren in 96 liefern somit einen starken Beweis dafür, dass spezifische WC-Basen-gepaarte dsDNA unter Verwendung schwacher Laser-Bedingungen mit höheren Oligonukleotid-Konzentrationen in diesem Massenbereich beobachtet werden kann – das erste Mal, dass dies unter Verwendung einer 3-HPA-Matrix beschrieben wird. Die Untersuchung wurde auf ein komplexes Gemisch aus dsDNA ausgedehnt, das aus einem enzymatischen Verdau (Rsal/Cfol) eines Bereichs von Exon 4 des Apolipoprotein-E-Gens stammte (Das et al. (1985), J. Biol. Chem. 260, 6240; die erwarteten Fragmentmassen sind in Tabelle IX angegeben. Tabelle IX Cfol/Rsal-Verdauprodukte von Exon 4 des ApoE-Gens
    Basenb ssDNA (Da) dsDNA (Da)-
    (+) (–) (+) (–)
    11 13 3428 4025 7453
    16 5004 4924 9928
    18 5412 5750 11162
    17 19 5283 5880 11163
    19 5999 5781 11780
    24 22 7510 6745 14225
    31 29 9628 9185 18813
    36 38 11279 11627 22906
    48 14845 14858 29703
    55 53 17175 16240 33415
    • aDas ε3-Allel hat keine 17/19- oder 19/19-Paare; das ε4-Allel enthält kein 36/38-Paar.
    • b(+) Sense-Strang, (–) Antisense-Strang.
  • Nach dem Verdauschritt wurden die Proben gereinigt und durch Ethanolfällung aufkonzentriert und in 1 μl H2O resuspendiert, bevor sie bei Raumtemperatur mit der Matrix auf dem Probenziel gemischt wurden. Etwa 20 Peaks, deren Masse im Bereich von 3,4–17,2 kDa lag, wurden im MALDI-Spektrum der Produkte aufgelöst (97A), die alle mit denaturierten einzelsträngigen Komponenten des Doppelstrangs übereinstimmten (Tabelle IX). Viele solcher Analysen ähnlicher biologischer Produkte über einen Zeitraum von Monaten ergaben auch Spektren mit vernachlässigbarer dsDNA, was mit früheren Berichten übereinstimmt (Tang el al. (1994), Rapid Commun. Mass Spectrom. 8:183; Liu et al. (1995), Anal. Chem. 67: 3482; Siegert et al. (1996), Anal. Biochem. 243:55; und Doktycz et al. (1995), Anal. Biochem. 230:205); im Gegensatz dazu wurden intakte Doppelstränge unter ähnlichen Bedingungen für die synthetische DNA (96A) beobachtet. Die Strangkonzentration, die nach den biologischen Reaktionen verfügbar war, lässt sich schwer abschätzen, sie ist jedoch wahrscheinlich weitaus geringer als diejenige, bei der die Dimerisierung synthetischer Proben vorlag. Außerdem kann die Aufrechterhaltung spezifischer Hybride innerhalb des synthetischen Zweikomponenten-Gemischs gegenüber dem viel komplexeren Gemisch von 20 einzelsträngigen DNA-Komponenten aus der Spaltung kinetisch begünstigt sein.
  • Die Wirkung einer niedrigeren Temperatur auf die Aufrechterhaltung von dsDNA wurde untersucht. Ein Aliquot der verdauten DNA-Lösung, die Matrix, Pipette, Pipettenspitzen und das Edelstahl-Probenziel wurden in einer "Kältekammer" bei 4°C für 15 min gelagert; wie bei normalen Präparationen wurden die Matrix und dann der Analyt punktförmig auf das Ziel aufgetragen und unter Trocknen an der Luft cokristallisieren gelassen. Die Kristallisation für die Gemische von 300 nl 3-HPA (50% Acetonitril) mit 300 nl Analyt benötigte ~ 1 min bei Raumtemperatur, aber 15 min bei niedrigerer Temperatur. Proben-Punkte, hergestellt in der Kältekammer-Umgebung, enthielten gewöhnlich einen hohen Anteil an großen transparenten Kristallen.
  • Die MALDI-TOF-Analyse eines bei verringerter Temperatur hergestellten ApoE-Verdau-Aliquots ergab das Spektrum in 97B. Der Niedrigmasse-Bereich schien dem in 97A qualitativ ähnlich zu sein, jedoch wurden oberhalb von 8 kDa drastische Unterschiede beobachtet. In 97A wurden nur Signale, die mit den Einzelsträngen (Tabelle IX) in Einklang waren, beobachtet, die in der Kältekammer präparierten Proben der 97B ergaben jedoch keine Signale für die gleichen Massen, ausgenommen unterhalb von 8 kDa. Sogar noch auffälliger waren die zusätzlichen Hochmasse-Peaks in 97B; diese repräsentieren eindeutig Dimer-Peaks, die Komponenten geringerer Masse enthalten. Genauso wie bei der synthetischen DNA war es wichtig zu bestimmen, ob es sich dabei um nicht-spezifische Heterodimere, spezifische WC-Heterodimere oder nicht-spezifische Homodimere handelt. Man betrachte zunächst das 33,35 kDa-Fragment. Ignoriert man die unwahrscheinliche Möglichkeit, dass das Hochmasse-Fragment ein Trimer oder ein höheres Multimer ist, so darf es als Dimer nur die ssDNA-Komponenten der höchsten Masse enthalten, d. h. > 16 kDa. Die Homodimerisierung der 15,24 und 17,18 kDa-Fragmente würde 32,49 bzw. 34,35 kDa-Peaks ergeben; entsprechende Massenfehler für diese unrichtigen Zuordnungen, im Verhältnis zu den beobachteten 33,35 kDa wären –2,6% bzw. +3,0%. Eine weitaus bessere Übereinstimmung wird erzielt, wenn dieser Peak von einem Heterodimer der beiden Einzelstrang-Fragmente der höchsten Masse stammt; ihre addierte Masse (16,24 + 17,18 = 33,42 kDa) unterschied sich um 0,2% von der beobachteten Dimermasse 33,35 kDa, ein annehmbarer Massenfehler für die MALDI-TOF-Analyse großer DNA-Fragmente mittels externer Kalibrierung. Das 29,66 kDa-Fragment wurde entsprechend nur um 0,13% niedriger als die 29,70 kDa gemessen, die für ein Heterodimer aus 48-meren erwartet wurde; die Summe anderer möglicher Homodimere oder Heterodimere lag nicht innerhalb eines angemessenen Bereichs dieser Masse. Ähnliche Argumente könnten für die 22,89- und 18,83 kDa-Fragmente vorgebracht werden, die 36-/38-mer- bzw. 31-/29-Heterodimere darstellen; das Signal bei 14,86 kDa entspricht dem einfach geladenen einzelsträngigen und dem doppelt geladenen doppelsträngigen 48-mer. Die Übereinstimmung der Massen in 97B über 15 kDa mit derjenigen von dsDNA, die bei dieser Spaltung erwartet wird, und das Fehlen von Homodimeren und nicht-spezifischen Heterodimeren bei Zufallsmassen, zeigte, dass die Basenpaarungen tatsächlich sehr spezifisch waren und lieferte einen weiteren Beweis dafür, dass Gasphasen-WC-Wechselwirkungen in MALDI-erzeugten Ionen aufrecht erhalten werden können.
  • 98 zeigt ein MALDI-TOF-Spektrum eines ε4-Allels, von dem im Gegensatz zum ε3-Allel erwartet wurde, dass es bei der Cfol/Rsal-Spaltung kein 36-/38-mer-Paar ergibt. Die ε3- und ε4-Massenspektren waren ähnlich, ausgenommen, dass das abundante 22,89 kDa-Fragment in 97B in 98 nicht vorhanden war; mit dieser Information allein (Tabelle IX) ließen sich die ε3- und ε4-Allele leicht unterscheiden, was eine Genotyp-Bestimmung durch direkte Messung von dsDNA durch MALDI-TOF-MS zeigt. Entsprechend konnte dsDNA ionisiert, in die Gasphase überführt und durch MALDI-TOF-MS nachgewiesen werden. Die an unserem Gerät üblicherweise eingestellte Beschleunigungsspannung betrug nur –5 kV, entsprechend 1,5 kV/mn bis zu –2 mm vom Probenziel, wobei die elektrische Feldstärke rasch mit der Entfernung vom Probenziel abnahm. Die meisten früheren Arbeiten verwendeten eine Beschleunigung von mindestens 20 kV (Lecchi et al. (1995), J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 6;972); bei einer Ausnahme wurde eine 27-mer-dsDNA mittels einer gefrorenen Matrixlösung und 100 V Beschleunigung nachgewiesen (Nelson et al. (1990), Rapid Commun. Mass Spectrom. 4:348). Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann die MALDI-induzierte "Denaturierung" der dsDNA auf die Gasphasen-Kollisionsaktivierung zurückzuführen sein, die die WC-Paarung bei Verwendung von Hochbeschleunigungsfeldern unterbricht, analog zur Denaturierung, die für den ersten Schritt in der Fragmentierung angenommen wird, die zur Sequenzierung der einzelsträngigen Komponenten der dsDNA unter Verwendung von Elektronenspray-Ionisation verwendet wird (McLafferty et al. (1996), Int. J. Mass Spectrom., Ion Processes). Es scheint, dass die Hochsalzbedingungen (typischerweise > 10 mM NaCl oder KCl), die zur Stabilisierung von WC-gepaarter dsDNA in Lösung nötig sind, für die MALDI-Analyse ungeeignet sind (Nordhoff et al. (1993), Nucleic Acids Res. 21:3347); eine Erniedrigung der Konzentration solcher nicht-flüchtiger Kationen ist notwendig, um Kationen-adduzierte MALDI-Signale zu vermeiden, destabilisiert jedoch die Doppelstränge in Lösung. Die niedrigen pH-Bedingungen der Matrix-Umgebung sollten die Duplex ebenfalls destabilisieren. Wie in den 97B und 98 gezeigt, sollte das Aufbewahren und Herstellen sogar geringer Konzentrationen der biologischen Proben bei reduzierter Temperatur diese denaturierenden Wirkungen zumindest zum Teil ausgleichen, insbesondere bei längeren Strängen, bei denen die Schmelztemperaturen aufgrund eines ausgedehnteren Wasserstoffbindungs-Netzwerks höher sind. Die hier eingesetzten Bedingungen werden als sehr nicht-stringente Anlagerungsbedingungen angesehen.
  • Die Niedrigmasse-Schwänze an Hochmasse-dsDNA-Peaks (z. B. 97B, 232 kDa) sind mit der Depurinierung im Einklang, die in stärkerem Ausmaß erfolgt als die Summe der Depurinierungen aus jedem der kombinierten Einzelstränge. Obwohl die Depurinierung in Lösung eine säurekatalysierte Reaktion ist, induzieren die schwach sauren Bedingungen in der 3-HPA-Matrix keine signifikante Depurinierung; an den Molekül-Ionensignalen aus einem mittels De-MALDI-TOF gemessenen Mischbasen-50-mer waren nur wenige Depurinierungs-Peaks beteiligt (Juhaz et al. (1996), Anal. Chem 68:941). Die Depurinierung aus den einzelsträngigen Komponenten der Gasphasen-dsDNA wird beobachtet, auch wenn man erwartet, dass diese Basen über Wasserstoffbrücken an die komplementäre Base des begleitenden Strangs gebunden sind, was darauf hindeutet, dass die kovalenten Bindungen aufgebrochen werden, bevor der Strang denaturiert wird.
  • BEISPIEL 27
  • Effizienz- und Spezifitäts-Test für besenspezifische Ribonukleasen
  • Aliquote, die während der Spaltung der ausgewählten synthetischen 20- bis 25-mere in regelmäßigen Zeitabständen entnommen wurden, wurden mittels Massenspektrometrie untersucht. Drei der RNasen wurden für effizient und spezifisch befunden. Dazu gehören: die G-spezifische T1, die A-spezifische U2 und die A/U- spezifische PhyM. Die Ribonukleasen, die für C-spezifisch angesehen wurden, waren weniger zuverlässig, z. B. spalteten sie nicht an jedem C oder spalteten auch in nicht vorhersehbarer Weise an U. Die drei vielversprechenden RNasen spalteten an allen vorbestimmten Positionen, und die Sequenz wurde vollständig abgedeckt. Das Vorliegen von Spaltungsprodukten, die ein oder mehrere ungespaltene Stellen enthielten (kurze Inkubationszeiten), ermöglichte außerdem die Aneinanderreihung von Spaltungsprodukten. Ein Beispiel des MALDI-Spektrums eines Aliquots, das nach der T1- Spaltung einer synthetischen 20-mer-RNA [SEQ ID Nr. 114] entnommen wurde, ist in 100 gezeigt.
  • BEISPIEL 28
  • Immobilisierung von amplifizierten DNA-Zielen an Silizium-Wafer
  • Herstellung der Silizium-Oberfläche
  • Silizium-Wafer wurden mit Ethanol gewaschen, über dem Bunsenbrenner abgeflammt und 3 Stunden in eine wasserfreie Lösung von 25 Vol.-% 3-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol getaucht. Die Silan-Lösung wurde dann entfernt, und die Wafer wurden dreimal mit Toluol und dreimal mit Dimethylsulfoxid (DMSO) gewaschen. Die Wafer wurden dann in einer wasserfreien 10 mM Lösung von N-Succinimidyl-(4-iodacetyl)-aminobenzoat (SIAB) (Pierce Chemical, Rockford, IL) in wasserfreiem DMSO inkubiert. Nach der Reaktion wurde die SIAB-Lösung entfernt und die Wafer wurden dreimal mit DMSO gewaschen. In allen Fällen wurden die Iodacetamido-funktionalisierten Wafer direkt zur Minimierung der Hydrolyse der labilen Iodacetamido-Funktionalität verwendet. Sämtliche weiteren Manipulationen an dem Wafer erfolgten im Dunkeln, da die Iodacetamido-Funktionalität lichtempfindlich ist.
  • Immobilisierung der amplifizierten Thiol-haltigen Nukleinsäuren
  • Die SIAB-konjugierten Silizium-Wafer wurden zur Analyse spezifischer freier Thiolhaltiger DNA-Fragmente einer bestimmten amplifizierten DNA-Zielsequenz verwendet. Ein 23-mer Oligodesoxynukleotid, das eine 5'-Disulfidbindung enthielt [gekauft von Operon Technologies; SEQ ID Nr. 117] und zum 3'-Bereich einer 112 bp menschlichen genomischen DNA-Matrize komplementär war [Genebank Zugangs-Nr.: Z52259, SEQ ID Nr. 118] wurde als Primer zusammen mit einem kommerziell erhältlichen 49-mer-Primer, der zu einem Abschnitt des 5'-Endes der genomischen DNA [gekauft von Operon Technologies; SEQ ID Nr. 119] komplementär war, in PCR-Reaktionen verwendet, um ein 135 bp DNA-Produkt zu amplifizieren, das eine 5'- Disulfidbindung enthielt, die nur an einen Strang der DNA-Duplex [SEQ ID Nr. 120] gebunden war.
  • Die PCR-Amplifikationsreaktionen wurden mit dem Amplitaq GoldKit [Perkin Elmer Katalog-Nr. N808-0249] durchgeführt. Es wurden kurz gesagt 200 ng 112 bp menschliche genomische DNA-Matrize mit 10 μM des 23-mer-Primers und 8 μM des kommerziell erhältlichen 49-mer-Primers, 10 mM dNTPs, 1 Einheit Amplitaq Gold-DNA-Polymerase im Puffer, der vom Hersteller bereitgestellt wird, inkubiert, und die PCR wurde in einem Thermocycler durchgeführt.
  • Die 5'-Disulfidbindung des resultierenden amplifizierten Produktes wurde mittels 10 mM Tris-(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)(Pierce Chemical, Rockford, IL) vollständig reduziert, so dass eine freie 5'-Thiolgruppe gebildet wurde. Die Disulfid-Reduktion des modifizierten Oligonukleotids wurde aufgezeichnet, indem eine Verschiebung der Retentionszeit in einer Umkehrphasen-FPLC beobachtet wurde. Es wurde festgestellt, dass das Disulfid nach fünf Stunden in Gegenwart von 10 mM TCEP vollständig zu einem freien Thiol reduziert worden war. Direkt nach der Disulfid-Spaltung wurde das modifizierte Oligonukleotid mit den Iodacetamidofunktionalisierten Wafern inkubiert und über die SIAB-Linker an die Oberfläche des Silizium-Wafers konjugiert. Zur Gewährleistung einer vollständigen Thiol-Deprotonierung, wurde die Kupplungsreaktion bei pH 8,0 durchgeführt. Mit 10 mM TCEP zur Spaltung des Disulfids und den anderen oben beschriebenen Reaktionsbedingungen war es möglich, reproduzierbar eine Oberflächendichte von 250 fmol pro mm2 der Oberfläche zu erhalten.
  • Hybridisierung und MALDI-TOF-Massenspektrometrie
  • Der mit der 135 bp Thiol-haltiger DNA konjugierte Silizium-Wafer wurde mit einem komplementären 12-mer-Oligonukleotid [SEQ ID Nr. 121] inkubiert, und spezifisch hybridisierte DNA-Fragmente wurden mittels MALDI-TOF-MS-Analyse nachgewiesen. Das Massenspektrum ergab ein Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 3618,33; das theoretische Masse-zu-Ladungs-Verhältnis der 12-mer Oligomersequenz beträgt 3622,4 Da.
  • Spezifische DNA-Zielmoleküle, die eine 5'-Disulfidbindung enthalten, können somit amplifiziert werden. Die Moleküle werden bei einer hohen Dichte an einen SIAB-derivatisierten Silizium-Wafer immobilisiert, wobei die hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, und spezifische komplementäre Oligonukleotide können an diese Zielmoleküle hybridisiert werden und mittels MALDI-TOF-MS-Analyse nachgewiesen werden.
  • BEISPIEL 29
  • Verwendung hochdichter Nukleinsäure-Immobilisierung zur Erzeugung von Nukleinsäure-Anordnungen
  • Unter Verwendung des in Beispiel 28 beschriebenen Hochdichte-Befestigungsverfahrens, wurde eine Anordnung von für die MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse zugänglichen DNA-Oligomeren auf einem Silizium-Wafer mit einer Vielzahl von Stellen, z. B. Vertiefungen oder Flecken, auf seiner Oberfläche erzeugt. Zur Herstellung der Anordnung wurde ein Oligonukleotid-Primer, der freies Thiol enthielt, nur an den ausgewählten Stellen des Wafers [siehe z. B. Beispiel 28] immobilisiert. Jede Stelle der Anordnung enthielt eines von drei unterschiedlichen Oligomeren. Zum Nachweis, dass die unterschiedlichen immobilisierten Oligomere gesondert nachgewiesen und unterschieden werden können, wurden drei bestimmte unterschiedlich lange Oligonukleotide, die zu einem der drei Oligomere komplementär waren, an die Anordnung auf dem Wafer hybridisiert und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert.
  • Oligodesoxynukleotide
  • Drei Sätze komplementärer Oligodesoxynukleotid-Paare wurden synthetisiert, wobei ein Element des komplementären Oligonukleotid-Paares eine 3'- oder 5'-Disulfidbindung enthält [bezogen von Operon Technologies oder Oligos, usw.]. Beispielsweise enthält Oligomer 1 [d(CTGATGCGTCGGATCATCTTTTTT-SS), SEQ ID Nr. 122] eine 3'-Disulfidbindung, wohingegen Oligomer 2 [d(SS CCTCTTGGGAACTGTGTAGTATT) ein Disulfidderivat von SEQ ID Nr. 117] und Oligomer 3 [d(SS-GAATTCGAGCTCGGTACCCGG), ein 5'-Disulfidderivat von SEQ ID Nr. 115] jeweils eine 5'-Disulfidbindung enthalten.
  • Die Oligonukleotide, die komplementär zu den Oligomeren 1–3 sind, wurden so konzipiert, dass sie verschieden lang sind, sodass sie während der MALDI-TOF-Analyse leicht voneinander unterschieden werden konnten. Es wurde beispielsweise ein 23-mer Oligonukleotid [SEQ ID Nr. 123] komplementär zu einem Abschnitt des Oligomers 1 synthetisiert, ein 12-mer Oligonukleotid [SEQ ID Nr. 121] wurde komplementär zu einem Abschnitt des Oligomers 2 synthetisiert, und ein 21-mer [SEQ ID Nr. 116] wurde komplementär zu einem Abschnitt des Oligomers 3 synthetisiert. Außerdem wurde ein viertes 29-mer Oligonukleotid [SEQ ID Nr. 124] synthetisiert, das zu keinem der drei Oligomere komplementär war. Dieses vierte Oligonukleotid wurde als negative Kontrolle verwendet.
  • Silizium-Oberflächenchemie und DNA-Immobilisierung
  • (a) 4 × 4 (16-Stellen)-Anordnung
  • Ein 2 × 2 cm2 Silizium-Wafer mit 256 einzelnen Vertiefungen oder Welts in Form einer 16 × 16-Well-Anordnung wurde von einem kommerziellen Anbieter [Accelerator Technology Corp., College Station, Texas) bezogen. Die Wells maßen 800 × 800 μm2, waren 120 μm tief; und hatten 1,125 Abstand. Der Silizium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan umgesetzt, so dass eine einheitliche Schicht primärer Amine auf der Oberfläche gebildet wurde, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, was zu Iodacetamido-Funktionalitäten auf der Oberfläche führte [siehe z. B. Beispiel 28].
  • Zur Herstellung der Oligomere für die Kopplung an verschiedene Stellen der Silizium-Anordnung wurde die Disulfid-Bindung jedes Oligomers vollständig mit 10 mM TCEP wie in Beispiel 28 beschrieben reduziert, und die DNA wurde in einer Endkonzentration von 10 μM in einer Lösung von 100 mM Phosphatpuffer, pH 8,0 resuspendiert. Unmittelbar nach der Reduktion der Disulfid-Bindung wurde die freie Thiolgruppe des Oligomers an die Iodacetamido-Funktionalität an 16 Stellen auf dem Wafer gekoppelt, wobei die Test-Kopplungs-Bedingungen verwendet wurden, die im wesentlichen wie in Beispiel 28 waren. Um die separate Kopplung an 76 einzelnen Stellen auf dem Wafer zu bewerkstelligen, wurde die gesamte Oberfläche des Wafers nicht mit einer Oligonukleotid-Lösung gespült, sondern stattdessen wurde ein ~ 30 nl-Aliquot eines vorbestimmten modifizierten Oligomers parallel zu jeder der 16 Stellen (d. h. Vertiefungen) der 256 Wells auf dem Wafer gegeben, so dass unter Verwendung einer Roboter-Stiftvorrichtung eine 4 × 4-Anordnung immobilisierter DNA hergestellt wurde.
  • Die Roboter-Stiftvorrichtung besteht aus 16 Sonden, die sich in einem Sondenblock befinden und auf einem X, Y, Z-Robotertisch befestigt sind. Der Robotertisch war ein Brückensystem, das die Platzierung von Probeneinsätzen unter die Roboterarme ermöglichte. Die Brückeneinheit selbst besteht aus X- und Y-Armen, die sich 250 bzw. 400 mm bewegen und von bürstenlosen linearen Servomotoren mit Positions-Feedback, welcher von linear-optischen Code-Umsetzern bereitgestellt wurde, betrieben wurde. Eine Verstellschraubenspindel-getriebene Z-Achse (50 mm Vertikalbewegung) ist an der xy-Achsen-Schiene der Brückeneinheit befestigt und wird durch einen In-Line-Drehservo-Motor mit Positions-Feedback von einem am Motor befestigten dreh-optischen Code-Umsetzer gesteuert. Die Arbeitsfläche des Systems ist mit einer herausziehbaren Geräteplatte ausgerüstet, die fünf Mikrotiterplatten hält (meist 2 Platten mit Waschlösung und 3 Probenplatten für maximal 1152 unterschiedliche Oligonukleotid-Lösungen) und bis zu zehn 20 × 20 mm-Wafer. Die Wafer werden genau in der Platte gegen zwei Anschlagstifte untergebracht und sicher durch Vakuum gehalten. Das gesamte System ist zur Sicherheit von einem Plexiglas-Gehäuse umgeben und auf einem Stahlträgerrahmen zur Wärme- und Vibrationsdämpfung befestigt. Die Bewegungssteuerung wird durch Einsatz eines kommerziellen Bewegungssteuerungsgerätes bewerkstelligt, bei dem es sich um ein 3-Achsen-Servo-Steuergerät handelt und das an einen Computer angeschlossen ist; der Programmiercode für spezifische Anwendungen wird bei Bedarf geschrieben.
  • Zur Erzeugung einer DNA-Anordnung wurde eine Stiftvorrichtung mit Bauteilen, die feste Stiftelemente aufwiesen, in 16 Wells einer Mehr-Loch-DNA-Quellenplatte, die Lösungen der Oligomere 1–3 enthielten, getaucht, so dass die distalen Enden der Stifte benetzt wurden, das Roboter-Gefüge bewegt die Stift-Bauteile zum Silizium- Wafer, und die Probe wird durch Oberflächenkontakt punktförmig aufgetragen. Eines der modifizierten Oligonukleotide 1–3 wurde an jedem der 16 gesonderten Wells der 256 Wells auf dem Silizium-Wafer kovalent immobilisiert, wodurch eine 4 × 4-Anordnung von immobilisierter DNA erzeugt wurde.
  • Bei der Durchführung der Hybridisierungsreaktion wurden die drei komplementären Oligonukleotide und das negative Kontroll-Oligonukleotid in einer Endkonzentration von 10 μM für jedes Oligonukleotid in 1 ml TE-Puffer [10 mM TrisHCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), der mit 1 M NaCl angereichert war, gemischt, und die Lösung wurde 10 min bei 65°C erhitzt. Direkt im Anschluss wurde die gesamte Oberfläche des Silizium-Wafers mit 800 μl der erhitzten Oligonukleotid-Lösung gespült. Die komplementären Oligonukleotide wurden an die immobilisierten Oligomere hybridisiert, indem die Silizium-Anordnung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert wurde, gefolgt von Inkubation bei 4°C für mindestens 10 min. Alternativ kann die Oligonukleotid-Lösung zum Wafer zugegeben werden, der dann erhitzt wird und zur Hybridisierung abkühlen gelassen wird.
  • Die hybridisierte Anordnung wurde dann mit einer Lösung von 50 mM Ammoniumcitrat-Puffer zum Kationenaustausch gewaschen, um Natrium- und Kaliumionen am DNA-Gerüst zu entfernen (Pieles et al. (1993), Nucleic Acids Res. 21:3191–3196). Ein 6-nl Aliquot einer Matrix-Lösung von 3-Hydroxypicolinsäure [0,7 M 3-Hydroxypicolinsäure-10% Ammoniumcitrat in 50% Acetonitril; siehe Wu et al. (1993), Rapid. Commun. Mass Spectrom. 7, 142–146] wurde reihenweise zu jeder Stelle der Anordnung zugegeben, wobei ein serieller piezoelektrischer Roboter-Verteiler (d. h. ein piezoelektrisches Pipettensystem) verwendet wurde.
  • Das piezoelektrische Pipettensystem ist auf einem System aufgebaut, das von der Microdrop GmbH, Norderstedt, Deutschland bezogen wird, und enthält einen Antrieb mit piezoelektrischem Element, der ein gepulstes Signal an ein piezoelektrisches Element sendet, das an einer Glaskapillare, die die zu verteilende Lösung enthält, befestigt ist und diese umgibt; einen Druckwandler zur Aufnahme (durch negativen Druck) oder Entleerung (durch positiven Druck) der Kapillare; ein xyz-Robotertisch und Roboterantrieb, mit dem die Kapillare zum Auffüllen, Entleeren, Verteilen und Reinigen manövriert wird, ein Stroboskop und ein Antrieb, der bei der Frequenz des Piezoelementes gepulst wird, so dass ein Betrachten der "suspendierten" Tröpfcheneigenschaften ermöglicht wird; gesonderte Stufen für Quellen, und Kennzeichnungs-Platten oder Probenziele (d. h. Si-Chip); eine am Roboterarm befestigte Kamera, mit der die Beschickung der Kennzeichnungs-Platte überwacht wird; sowie eine Datenstation, die die Druckeinheit, den xyz-Roboter und den piezoelektrischen Antrieb steuert.
  • Man ließ die 3-HPA-Lösung bei Umgebungstemperatur trocknen, und anschließend wurde mit der piezoelektrischen Pipette an jede Stelle ein 6 nl Aliquot Wasser zugegeben, um den getrockneten Matrix-DNA-Komplex zu resuspendieren, so dass der Matrix-DNA-Komplex beim Trocknen bei Umgebungstemperatur eine einheitliche kristalline Oberfläche an der Bodenfläche jeder Stelle ausbildet.
  • MALDI-TOF-MS-Analyse
  • Die MALDI-TOF-MS-Analyse wurde reihenweise an jeder der 16 Stellen der in 6 gezeigten und im wesentlichen in Beispiel 28 beschriebenen Hybridisierungs-Anordnung durchgeführt. Das resultierende Massenspektrum der Oligonukleotide, die spezifisch an jede der 16 Stellen der DNA-Hybridisierung hybridisierten, ergaben an jeder Stelle ein spezifisches Signal, das das beobachtete experimentelle Masse-zu-Ladungs-Verhältnis widerspiegelt, das der spezifischen komplementären Nukleotid-Sequenz entspricht.
  • Beispielsweise an den Stellen, an denen nur Oligomer 1 konjugiert ist, ergab das Massenspektrum ein vorherrschendes Signal mit einem beobachteten experimentellen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 7072,4, das etwa gleich dem des 23-mers ist; das theoretische Masse-zu-Ladungs-Verhältnis des 23-mers beträgt 7072,6 Da. Eine spezifische Hybridisierung des 12-mer Oligonukleotids an die Anordnung, mit einem beobachteten experimentellen Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 3618,33 Da (theoretisch 3622,4 Da) wurde nur an solchen Stellen nachgewiesen, die mit Oligomer 2 konjugiert waren, wohingegen eine spezifische Hybridisierung von MJM6 (beobachtetes experimentelles Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 6415,4) nur an solchen Stellen der Anordnung nachgewiesen wurde, die mit Oligomer 3 [theoretisch 6407,2 Da] konjugiert waren.
  • Keine der Stellen dieser Anordnung ergab ein Signal, das vom Negativ-Kontroll-29-mer-Oligonukleotid (theoretisches Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 8974,8) stammt, was zeigt, dass spezifische Ziel-DNA-Moleküle an Oligomere hybridisiert werden können, die kovalent an bestimmte Stellen auf der Oberfläche der Silizium-Anordnung immobilisiert sind, und eine Vielzahl von Hybridisierungstests kann einzeln mittels MALDI-TOF-MS-Analyse überwacht werden.
  • (b) 8 × 8 (64-Stellen)-Anordnung
  • Ein 2 × 2 cm2 Silizium-Wafer mit 256 einzelnen Vertiefungen oder Wells in Form einer 16 × 16-Well-Anordnung wurde von einem kommerziellen Anbieter [Accelerator Technology Corp. College Station, Texas] bezogen. Die Löcher maßen 800 × 800 μm2, waren 120 μm tief und hatten 1,125 Abstand. Der Silizium-Wafer wurde mit 3-Aminopropyltriethoxysilan umgesetzt, so dass eine einheitliche Schicht primärer Amine auf der Oberfläche hergestellt wurde, und dann dem heterobifunktionellen Vernetzungsmittel SIAB ausgesetzt, was wie vorstehend beschrieben zu Iodacetamido-Funktionalitäten auf der Oberfläche führte.
  • Zur Herstellung einer Anordnung aus 64 Elementen wurde eine Stiftvorrichtung gemäß der vorstehend beschriebenen Verfahren verwendet. Die Stiftvorrichtung wurde in 16 Wells einer 384-Well-DNA-Quellenplatte getaucht, die Lösungen der Oligomere 1–3 enthielt, zum Silizium-Wafer befördert, und die Probe wurde durch Oberflächenkontakt punktförmig aufgetragen. Anschließend wurde die Vorrichtung in Waschlösung getaucht, dann in die gleichen 16 Wells der Quellenplatte getaucht und um 2,25 mm vom anfänglichen Satz aus 16 Spots versetzt auf das Ziel gepunktet; der gesamte Zyklus wurde wiederholt, so dass eine 2 × 2-Anordnung von jedem Stift hergestellt wurde und so eine 8 × 8-Anordnung von Punkten (2 × 2 Elemente/Stift × 16 Stifte = 64 insgesamt gepunktete Elemente) erzeugt wurde.
  • Die an die 64 Stellen immobilisierten Oligomere 1–3 wurden an die komplementären Oligonukleotide hybridisiert und durch MALDI-TOF-MS-Analyse untersucht. Wie für die 16-Stellen-Anordnung beobachtet, wurde an allen Stellen der DNA-Anordnung eine spezifische Hybridisierung des komplementären Oligonukleotids zu jedem der immobilisierten Thiol-haltigen Oligomere beobachtet.
  • BEISPIEL 30
  • Verlängerung der hybridisierten DNA-Primer, die an auf einem Silizium-Wafer immobilisierten DNA-Matrizen gebunden sind
  • Die SIAB-derivatisierten Silizium-Wafer können auch für die Primer-Extensionsreaktionen der immobilisierten DNA-Matrize eingesetzt werden, wobei im wesentlichen die in Beispiel 7 beschriebenen Verfahren verwendet werden.
  • Ein 27-mer-Oligonukleotid [SEQ ID Nr. 125], das eine freie 3'-Thiolgruppe enthielt, wurde an einen SIAB-derivatisierten Silizium-Wafer, wie vorstehend z. B. in Beispiel 28 beschrieben, gekoppelt. Ein 12-mer Oligonukleotid-Primer [SEQ ID Nr. 126] wurde an das immobilisierte Oligonukleotid hybridisiert, und der Primer wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit [z. B. Sequenase oder ThermoSequenase, US. Biochemical Corp.) verlängert. Die Zugabe von Sequenase-DNA-Polymerase oder ThermoSequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart von drei Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP) und Didesoxyribonukleosid-Thymidintriphospbat (ddTTP) in Puffer gemäß den Herstellerangaben ergab eine 3-Basen-Extension des noch an den Silizium-Wafer gebundenen 12-mer-Primers. Der Wafer wurde dann durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie wie vorstehend beschrieben analysiert. Die Ergebnisse des Massenspektrums unterscheiden eindeutig das 15-mer [SEQ ID Nr. 127) vom ursprünglichen unverlängerten 12-mer, was somit zeigt, dass auf der Oberfläche eines Silizium-Wafers eine spezifische Extension durchgeführt und mittels MALDI-TOF-MS-Analyse nachgewiesen werden kann.
  • BEISPIEL 31
  • Einfluss der Linkerlänge auf die Polymerasenextension hybridisierter DNA-Primer, gebunden an auf einem Silizium-Wafer immobilisierten DNA-Matrizen
  • Die Auswirkung des Abstandes zwischen der SIAB-konjugierten Silizium-Oberfläche und der Duplex-DNA, die durch Hybridisierung der Ziel-DNA an die immobilisierte Oligomer-Matrize gebildet wurde, und die Auswahl des Enzyms wurden untersucht.
  • Zwei SIAB-derivatisierte Silizium-Wafer wurden an das 3'-Ende zweier Oligonukleotide der identischen DNA-Sequenz, die freies Thiol enthielten, konjugiert, außer, dass eine 3 Basen lange poly-dT-Spacersequenz am 3'-Ende eingebaut wurde:
    Figure 01890001
  • Diese Oligonukleotide wurden synthetisiert und über den SIAB-Vernetzer [siehe z. B. Beispiel 28] jeweils gesondert an die Oberfläche eines Silizium-Wafers immobilisiert. Jeder Wafer wurde mit einem 12 mer-Oligonukleotid inkubiert:
    Figure 01890002
    das zu Abschnitten der Nukleotidsequenzen komplementär ist, die beiden Oligonukleotiden gemeinsam sind, indem bei 75°C inkubiert wurde und der Silizium-Wafer langsam abgekühlt wurde. Die Wafer wurden dann durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie wie vorstehend beschrieben analysiert.
  • Wie in Beispiel 30 oben beschrieben, wurde eine spezifische 3-Basen-Extension des gebundenen 12-mer-Oligonukleotids mit dem Oligomer-Primer beobachtet, wenn sich ein 9-Basen-Spacer zwischen der Duplex und der Oberfläche befand [SEQ ID Nr. 125]. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn die DNA-Spacer-Länge zwischen der SIAB-Einheit und der DNA-Duplex 0, 3,6 und 12 betrug. Die Extensionsreaktion kann außerdem mit einer Vielzahl von DNA-Polymerasen, wie Sequenase und ThermoSequenase (US Biochemical) durchgeführt werden. Der SIAB-Linker kann direkt an die DNA-Matrize gekoppelt werden oder er kann eine Linkersequenz umfassen, die die Primerextension der hybridisierten DNA nicht beeinflusst.
  • BEISPIEL 32
  • Spektrochip-Mutanten-Nachweis im ApoE-Gen
  • Diese Beispiel beschreibt die Hybridisierung einer immobilisierten Matrize, die Primer-Extension und Massenspektrometrie zum Nachweis des Wildtyp- und des mutanten Apolipoprotein-E-Gens für diagnostische Zwecke. Dieses Beispiel zeigt, dass immobilisierte DNA-Moleküle, die eine spezifische Sequenz enthalten, mittels Primerextension nicht-markierter Allel-spezifischer Primer und Analyse der Extensionsprodukte mittels Massenspektrometrie nachgewiesen und unterschieden werden können.
  • Eine zur codierenden Sequenz von Allel 3 des Wildtyp-Apolipoprotein-E-Gens komplementäre 50-Basen lange synthetische:
    5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCGCTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-3' [SEQ ID Nr. 280] oder zum mutanten Apolipoprotein-E-Gen mit einer G→A-Transition an Codon 158 komplementäre:
    5'-GCCTGGTACACTGCCAGGCACTTCTGCAGGTCATCGGCATCGCGGAGGAG-3' [SEQ ID Nr. 281]
  • DNA-Matrize die eine freie 3'-Thiolgruppe enthielt, wurde an gesonderte SIAB-derivatisierte Silizium-Wafer wie in Beispiel 28 beschrieben gekoppelt.
  • Ein 21-mer Oligonukleotid-Primer:
    5'-GAT GCC GAT GAC CTG CAG AAG-3' [SEQ ID Nr. 282] wurde an jede der immobilisierten Matrizen hybridisiert, und der Primer wurde mit einem kommerziell erhältlichen Kit [z. B. Sequenase oder ThermoSequenase, US. Biochemical Corp.] verlängert. Die Zugabe von Sequenase-DNA-Polymerase oder ThermoSequenase-DNA-Polymerase in Gegenwart von drei Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP) und Didesoxyribonukleosid-Cytosintriphosphat (ddCTP) in Puffer gemäß den Herstellerangaben ergab eine Einzelbasenextension des an die immobilisierte Matrize, codierend das Wildtyp-Apolipoprotein-E-Gen, gebundenen 21-mer-Primers und eine Dreibasenextension des an die immobilisierte Matrize, codierend die mutante Form des Apolipoprotein-E-Gens, gebundenen 21-mer-Primers.
  • Die Wafer wurden durch Massenspektrometrie, wie hier beschrieben, analysiert. Die Wildtyp-Apolipoprotein-E-Sequenz ergibt ein Massenspektrum, das den Primer mit der Einzelbasenextension (22-mer) mit einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 6771,17. Da (das theoretische Masse-zu-Ladungs-Verhältnis beträgt 6753,5 Da) vom ursprünglichen 21-mer-Primer mit einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 6499,64 Da unterscheidet. Die mutante Apolipoprotein-E-Sequenz ergibt ein Massenspektrum, das den Primer mit der Dreibasenextension (24-mer) mit einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 7386,9 (das theoretische Masse-zu-Ladungs-Verhältnis beträgt 7386,9) vom ursprünglichen 21-mer-Primer mit einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 649964 Da unterscheidet.
  • BEISPIEL 33
  • Nachweis von doppelsträngigen Nukleinsäure-Molekülen über Strang-Austausch und Hybridisierung an eine immobilisierte komplementäre Nukleinsäure
  • Dieses Beispiel beschreibt die Immobilisierung eines 24-mer-Primers und die spezifische Hybridisierung eines Stranges eines Duplex-DNA-Moleküls, wodurch die Amplifikation eines ausgewählten Zielmoleküls in einer Lösungsphase und der Nachweis des doppelsträngigen Moleküls ermöglicht werden. Dieses Verfahren eignet sich zum Nachweis von Einzelbasenänderungen und insbesondere zum Durchmustern genomischer Banken doppelsträngiger Fragmente.
  • Ein 24-mer DNA-Primer CTGATGCGTC GGATCATCTT TTTT, SEQ ID Nr. 122, der eine freie 3'-Thiolgruppe enthielt, wurde an einen SIAB-derivatisierten Silizium-Wafer, wie in Beispiel 29 beschrieben, gekoppelt.
  • Ein synthetisches 18-mer-Oligonukleotid:
    5'-CTGATGCGTCGGATCATC-3' [SEQ ID Nr. 286] wurde mit einem 12-mer 5'-GATGATCCGACG-3' [SEQ ID Nr. 285], dessen Sequenz komplementär zu einem 12-Basen-Abschnitt des 18-mer-Oligonukleotids war, vorgemischt. Das Oligonukleotid-Gemisch wurde auf 75°C erhitzt und langsam auf Raumtemperatur gekühlt, so dass die Bildung eines Duplex-Moleküls erleichtert wurde:
    Figure 01910001
  • Die spezifische Hybridisierung des 12-mer-Stranges des Duplex-Moleküls des immobilisierten 24-mer-Primers wurde durchgeführt, indem 1 M des Duplex-Moleküls unter den in Beispiel 30 beschriebenen Hybridisierungsbedingungen gemischt wurden.
  • Die Wafer wurden durch Massenspektrometrie wie vorstehend beschrieben analysiert. Eine spezifische Hybridisierung wurde in einem Massenspektrum des 12-mers mit einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 3682,78 Da nachgewiesen.
  • BEISPIEL 34
  • 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)diisopropylaminophosphino)ethan
  • A. 2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd
  • 3-Brom-1-propanol (3,34 g, 24 mmol) wurde über Nacht (15 h) in 80 ml wasserfreiem Acetonitril mit 5-Hydroxy-2-nitrobenzaldehyd (3,34 g, 20 mMol), K2CO3 (3,5 g) und KI (100 mg) unter Rückfluss belassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, und 150 ml Methylenchlorid wurden hinzugegeben. Das Gemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte organische Lösung wurde bis zur Trockene eingedampft und in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfid getrocknet. 4,31 g (96%) des gewünschten Produktes wurden nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum erhalten.
    Rf = 0,33 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
    UV(Methanol)-Maximum: 313,240 (Schulter); 215 nm; Minimum: 266 nm.
    1H-NMR. (DMSO-d6) δ 10,28 (s, 1H), 8,17 (d, 1H), 7,35 (d, 1H), 7,22 (s, 1H), 4,22 (t, 2H), 3,54 (t, 2H), 1,90 (m, 2H).
    13CNMR (DMSO-d6) δ 189,9, 153,0, 141,6, 134,3, 127,3, 118,4, 114,0, 66,2, 56,9, 31,7.
  • B. 2-Nitro-5-(3-O-tert.-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd
  • 2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)benzaldehyd (1 g, 4,44 mMol) wurde in 50 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1 ml Triethylamin, 200 mg Imidazol und 0,8 g (5,3 mmol) tBDMSCl zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Methanol (1 ml) wurde zur Beendigung der Umsetzung hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der feste Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst Die resultierende Lösung wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohgemisch wurde einer raschen Säulenchromatographie mit Methylenchlorid unterworfen, so dass 1,44 g (96%) 2-Nitro-5-(3-O-tert.-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd erhalten wurden.
    Rf = 0,67 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
    UV(Methanol), Maximum: 317, 243, 215 nm: Minimum: 235, 267 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 10,28 (s, 1H), 8,14 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,20 (s, 1H), 4,20 (t, 2H), 3,75 (t, 2H), 1,90 (m, 2H), 0,85 (s, 9H), 0,02 (s, 6H).
    13C-NMR (DMSO-d6) δ 189,6, 162,7, 141,5, 134,0, 127,1, 118,2, 113,8, 65,4, 58,5, 31,2, 25,5, –3,1, –5,7.
  • C. 1-(2-Nitro-5-(3-O-tert.-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)ethanol
  • Im Hochvakuum getrocknetes 2-Nitro-5-(3-O-tert.-butyldimethylsilylpropoxy)benzaldehyd (1,02 g, 3 mmol) wurde in 50 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. 2M Trimethylaluminium in Toluol (3 ml) wurden tropfenweise innerhalb von 10 min zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur belassen. Es wurde für 10 min weiter gerührt, und das Gemisch wurde in 10 ml eiskaltes Wasser gegossen. Die Emulsion wurde von der Wasserphase getrennt und über 100 g Natriumsulfat getrocknet, um restliches Wasser zu beseitigen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und das Gemisch wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Methanolgradienten in Methylenchlorid aufgetragen. 0,94 g (86%) des gewünschten Produktes wurden isoliert.
    Rf = 0,3 75 (Hexan/Ethylacetat, 5/1).
    UV(Methanol), Maximum: 306, 233, 206 nm: Minimum: 255, 220 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,36 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,49 (b, OH), 5,31 (q, 1H), 4,19 (m, 2H), 3,77 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,37 (d, 3H), 0,86 (s, 9H), 0,04 (s, 6H).
    13C-NMR (DMSO-d6) δ 162,6, 146,2, 139,6, 126,9, 112,9, 112,5, 64,8, 63,9, 58,7, 31,5, 25,6, 24,9, –3,4, –5,8.
  • D. 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol
  • 1-(2-Nitro-5-(3-O-tert.-butyldimethylsilylpropoxy)phenyl)ethanol (0,89 g, 2,5 mmol) wurde in 30 ml THF gelöst, und 0,5 mmol nBu4NF wurde unter Rühren hinzugegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der restliche Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Methanol-Gradienten in Methylenchlorid aufgetragen. 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,6 g, (99%)) wurde erhalten.
    Rf = 0,17 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
    UV(Methanol), Maximum: 304, 232, 210 nm: Minimum: 255, 219 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,00 (d, 1H), 5,50 (d, OH), 5,28 (t, OH), 4,59 (t, 1H), 4,17 (t, 2H), 3,57 (m, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,36 (d, 2H).
    13C-NMR (DMSO-d6) δ 162,8, 146,3, 139,7, 127,1, 113,1, 112,6, 65,5, 64,0, 57,0, 31,8, 25,0.
  • E. 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol
  • 1-(2-Nitro-5-(3-hydroxypropoxy)phenyl)ethanol (0,482 g, 2 mmol) wurde zweimal mit wasserfreiem Pyridin coverdampft und in wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde im Eiswasserbad gekühlt, und 750 mg (2,2 mmol) DMTCl wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und 0,5 ml Methanol wurden zur Beendigung der Umsetzung hinzugegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zweimal mit Toluol verdampft, um Pyridinspuren zu entfernen. Der endgültige Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Methanol-Gradienten in Methylenchlorid aufgetragen, welches Triethylamin-Tropfen enthielt, so dass 0,96 g (89%) des gewünschten Produktes 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol erhalten wurden.
    Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
    UV(Methanol), Maximum: 350 (Schulter), 305, 283, 276 (Schulter), 233, 208 nm; Minimum: 290, 258, 220 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 8,00 (d, 1H), 6,82-7,42 (ArH), 5,52 (d, OH), 5,32 (m, 1H), 4,23 (t, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,17 (t, 2H), 2,00 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
    13C-NMR (DMSO-d6) δ 162,5, 157,9, 157,7, 146,1, 144,9, 140,1, 139,7, 135,7, 129,5, 128,8, 127,6, 127,5, 127,3, 126,9, 126,4, 113,0, 112,8, 112,6, 85,2, 65,3, 63,9, 59,0, 54,8, 28,9, 24,9.
  • F. 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytrilylpropoxy)phenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)diisopropylaminophosphino)ethan
  • 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)ethanol (400 mg, 0,74 mMol) wurde unter Hochvakuum getrocknet und in 20 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,3 ml (1,34 mMol) 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und 0,5 ml Methanol wurde zur Beendigung der Reaktion hinzugegeben. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt eine rasche Silicagel-Säule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Triethylamin-Tropfen enthielt, ergab 510 mg (93%) des gewünschten Phosphoramidits.
    Rf = 0,87 (Dichlormethan/Methanol, 99/1)
  • BEISPIEL 35
  • 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan
  • A. 4(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
  • 3-Brom-1-propanol (53 ml, 33 mmol) wurde über Nacht (15 h) in 100 ml wasserfreiem Acetonitril mit 4-Hydroxy-3-methoxyacetophenon (5 g, 30 mMol), K2CO3 (5g) und KI unter Rückfluss belassen. Das Reaktionsgemisch wurde nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit 150 ml Methylenchlorid versetzt. Das Gemisch wurde filtriert, und der feste Rückstand wurde mit Methylenchlorid gewaschen. Die vereinigte organische Lösung wurde bis zu Trockne eingedampft und in 100 ml Methylenchlorid gelöst. Die erhaltene Lösung wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. 6,5 g (96,4%) des gewünschtem Produktes wurden nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum erhalten.
    Rf = 0,41 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
    UV (Methanol) Maximum: 304, 273, 227, 210 nm; Minimum: 291, 244, 214 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 7,64 (d, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,04 (d, 1H), 4,58 (b, OH), 4,12 (t, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,56 (t, 2H), 2,54 (s, 3H), 1,88 (m, 2H).
    13C-NMR (DMSO-d6) δ 196,3, 152,5, 148,6, 129,7, 123,1, 111,5, 110,3, 65,4, 57,2, 55,5, 31,9, 26,3.
  • B. 4.(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon
  • 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,5 g, 15,6 mmol) wurde getrocknet und in 80 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst. Zu diesem Gemisch wurden 6 ml Triethylamin und 6 ml Essigsäureanhydrid gegeben. Nach 4 Stunden wurde 6 ml Methanol zugegeben, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml Dichlormethan gelöst, und die Lösung wurde mit verdünnter Natriumbicarbonat-Lösung und dann mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der feste Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule mit Methylenchlorid aufgetragen, so dass 4,1 g 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (98,6%) erhalten wurden.
    Rf 0,22 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
    UV(Methanol), Maximum: 303, 273, 227, 210 nm; Minimum: 290, 243, 214 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 7,62 (d, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,08 (4, 1H), 4,12 (m, 4H), 3,82 (s, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,04 (m, 2H), 2,00 (s, 3H).
    13C-NMR (DMSO-d6) δ 196,3, 170,4, 152,2, 148,6, 130,0, 123,0, 111,8, 110,4, 65,2, 60,8, 55,5, 27,9, 26,3, 20,7.
  • C. 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon
  • 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxyacetophenon (3,99 g, 15 mMol) wurde portionsweise zu 15 ml 70%-igem HNO3 im Wasserbad zugegeben, und die Reaktionstemperatur wurde bei Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur belassen, und 30 g Eisstücke wurden hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde mit 100 ml Dichlormethan extrahiert, und die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das Rohgemisch wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Methanol-Gradienten in Methylenchlorid aufgetragen, so dass 3,8 g (81,5%) des gewünschten Produktes 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon und 0,38 g (8%) des ipso-substituierten Produktes 5-(3-Acetopropoxy)-4-methoxy-1,2-dinitrobenzol erhalten wurden.
  • Ipso-substituiertes Nebenprodukt 5-(3-Acetopropoxy)-4-methoxy 1,2-dinitrobenzol:
    Rf = 0,47 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
    UV (Methanol), Maximum: 334, 330, 270, 240, 212 nm; Minimum: 310, 282, 263, 223 nm.
    1H-NMR (CDCl3) δ 7,36 (s, 1H), 7,34 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,18 (t, 2H), 4,02 (s 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
    13C-NMR (CDCl3) δ 170,9, 152,2, 151,1, 117,6, 111,2, 107,9, 107,1, 66,7, 60,6, 56,9, 28,2, 20,9.
  • Gewünschtes Produkt 4-(3-Acetoxypropoxy)3-methoxy-6-nitroacetophenon:
    Rf = 0,29 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
    UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 246, 213 nm; Minimum: 320, 270, 227 nm.
    1H-NMR (CDCl3) δ 37,62 (s, 1H), 6,74 (s, 1H), 4,28 (t, 2H), 4,20 (t, 2H), 3,96 (s, 3H), 2,48 (8, 3H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (s, 3H).
    13C-NMR (CDCl3) δ 200,0, 171,0, 154,3, 148,8, 138,3, 133,0, 108,8, 108,0, 66,1, 60,8, 56,6, 30,4, 28,2, 20,9.
  • D. 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
  • 4-(3-Acetoxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon (3,73 g, 12 mMol) wurde zu 150 ml Ethanol und 6,5 g K2CO3 gegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und DSC mit 5% Methanol in Dichlormethan zeigte die Beendigung der Reaktion. Zu diesem gleichen Reaktionsgemisch wurden 3,5 g NaHB4 gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Aceton (10 ml) wurde zugegeben und mit dem restlichen NaBH4 umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 50 g Silicagel aufgenommen. Das Silicagel-Gemisch wurde oben auf eine Silicagel-Säμle mit 5% Methanol in Methylenchlorid aufgetragen, so dass 3,15 g (97%) des gewünschten Produktes 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol erhalten wurden.
  • Zwischenprodukt 4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitroacetophenon nach Abspaltung der Schutzgruppe:
    Rf = 0,60 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
    Endprodukt: 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
    Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
    UV (Methanol), Maximum: 344, 300, 243, 219 nm; Minimum: 317, 264, 233 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 7,54 (s, 1H), 7,36 (s, 1H), 5,47 (d, OH), 5,27 (m, 1H), 4,55 (t, OH), 4,05 (t, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,55 (q, 2H), 1,88 (m, 2H), 1,37 (d, 3H).
    13C-NMR (DMSO-d6) δ 153,4, 146,4, 138,8, 137,9, 109,0, 108,1, 68,5, 65,9, 57,2, 56,0, 31,9, 29,6.
  • E. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol
  • 1-(4-(3-Hydroxypropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol (0,325 g, 1,2 mMol) wurde mit wasserfreiem Pyridin zweimal coverdampft und in 15 ml Pyridin gelöst. Die Lösung wurde im Eiswasserbad gekühlt, und 450 mg (1,33 mMol) DMTCI wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, und 0,5 ml Methanol wurden zur Beendigung der Umsetzung zugegeben. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde zweimal mit Toluol coverdampft, um die Pyridinspuren zu entfernen. Der endgültige Rückstand wurde auf eine Silicagel-Säule mit einem Methanol-Gradienten in Methylenchlorid, das Triethylamintropfen enthielt, aufgetragen, so dass 605 mg (88%) des gewünschten Produktes 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)ethanol erhalten wurden.
    Rf = 0,50 (Dichlormethan/Methanol, 95/5).
    UV (Methanol), Maximum, 354, 302, 282, 274, 233, 209 nm; Minimum: 322, 292, 263, 222 nm.
    1H-NMR (DMSO-d6) δ 7,54 (s, 1H), 6,8-7,4 (ArH), 5,48 (d, OH), 5,27 (m, 1H), 4,16 (t, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,72 (s, 6H), 3,15 (t, 2H), 1,98 (t, 2H), 1,37 (d, 3H).
    13C-NMR (DMSO-d6) 157,8, 153,3, 146,1, 144,9, 138,7, 137,8, 135,7, 129,4, 128,7, 127,5, 127,4, 126,3, 112,9, 112,6, 108,9, 108,2, 85,1, 65,7, 63,7, 59,2, 55,8, 54,8, 29,0, 25,0.
  • F. 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan
  • 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-mothoxy-6-nitrophenyl)ethanol (200 mg, 3,5 mMol) wurde unter Hochvakuum getrocknet und in 15 ml wasserfreiem Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 0,5 ml N,N-Diisopropylethylamin und 0,2 ml (0,89 mMol) 2-Cyanoethyl-NN-diisopropylchlorphosphoramidit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt, und 0,5 ml Methanol wurde zur Reaktion zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Das Gemisch wurde mit gesättigter Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und eine rasche Silicagel-Säule mit 1% Methanol in Methylenchlorid, das Triethylamintropfen enthielt, ergab 247 mg (91,3%) des gewünschten Phosphoramidits 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)diisopropylaminophosphino)ethan.
    Rf = 087 (Dichlormethan/Methanol, 99/1).
  • BEISPIEL 36
  • Oligonukleotid-Synthese
  • Die Oligonukleotid-Konjugate, die photospaltbare Linker enthalten, wurden durch Festphasen-Nukleinsäure-Synthese (siehe Sinha et al. (1983), Tetrahedron Lett. 24: 5843–5846; Sinha et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12:4539–4557; Beaucage et al. (1993), Tetrahedron 49, 6123–6194 und Matteuci et al. (1981), J. Am. Chem.. Soc. 103:3185–3191) unter Standard-Bedingungen hergestellt. Für den Einbau der photospaltbaren Einheit und der 5'-terminalen Aminogruppe wurde außerdem eine längere Kopplungsdauer verwendet. Die Kopplungseffizienz wurde durch Messen der Extinktion des freigesetzten DMT-Kations ermittelt, und die Ergebnisse zeigten eine vergleichbare Kopplungseffizienz von Phosphoramidit-1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylamino phosphino)ethan oder 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphino)ethan mit denen gewöhnlicher Nukleosid-Phosphoramidite. Die Abspaltung der Basenschutzgruppe und Freisetzung der Konjugate aus dem festen Träger erfolgte mit konzentriertem Anmmonium über Nacht bei 55°C. Die Abspaltung der Basenschutzgruppe von anderen Konjugaten erfolgte durch schnelle Abspaltung mit AMA-Reagenzien. Die Reinigung der MMT-On-Konjugate erfolgte durch HPLC (Trityl-On), wobei 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0, und ein Acetonitrilgradient (5% bis 25% in 20 Minuten) verwendet wurde. Das aufgefangene MMT- oder DMT-geschützte Konjugat wurde eingeengt, mit 80%-iger wässriger Essigsäure (40 min, 0°C) detrityliert, entsalzt und bei –20°C aufbewahrt.
  • BEISPIEL 37
  • Photolyse-Untersuchung
  • In einem typischen Fall wurden 2 nMol Oligonukleotid-Konjugat, das photospaltbaren Linker enthielt, in 200 μl destilliertem Wasser mit einer langweiligen UV-Lampe (Blak Ray XX-15 UV-Lampe, Ultraviolet products, San Gabriel, CA) aus 10 cm Entfernung bestrahlt (Emissions-Peak 365 nm, Lampenstärke = 1,1 mW/cm2 bei 31 cm Entfernung). Das erhaltene Gemisch wurde durch HPLC (Trityl-Off) unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0, und einem Acetonitril-Gradienten analysiert. Die Analyse zeigte, dass das Konjugat bei der UV-Bestrahlung innerhalb von Minuten vom Linker abgespalten wurde.

Claims (18)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Reihenfolge von basenspezifisch endenden Nukleinsäurefragmenten eines Zielnukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: a) Erhalten eines Nukleinsäuremoleküls, welches die Zielnukleinsäuresequenz und, an einem Ende, eine Markierung umfasst; b) Erzeugen von partiellen basenspezifisch endenden Nukleinsäurefragmenten aus der Zielnukleinsäure unter Verwendung einer Endonuklease; und c) Analysieren der Fragmente durch ein massenspektrometrisches Format, um massenspektrometrische Daten zu erhalten, Verwenden der Daten; und d) Bestimmen der Reihenfolge der basenspezifisch endenden Nukleinsäurefragmente in dem Zielnukleinsäuremolekül.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nuklease ein Restriktionsenzym ist, das wenigstens eine Restriktionsstelle in der Zielnukleinsäure erkennen und spalten kann.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zielnukleinsäure eine Desoxyribonukleinsäure ist und die Nuklease eine Desoxyribonuklease ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zielnukleinsäure eine Ribonukleinsäure ist und die Nuklease eine Ribonukease ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Ribonuklease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: der G-spezifischen T1-Ribonuklease, der A-spezifischen U2-Ribonuklease, der A/U-spezifischen PhyM-Ribonuklease, der U/C-spezifischen Ribonuklease A, der C-spezifischen Hühnerleber-Ribonuklease und Crisavitin.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die in Schritt b) erzeugten basenspezifisch endenden Nukleinsäurefragmente Nukleotide mit veränderter Masse beinhalten.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Markierung eine 3'-Markierung umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Markierung eine 5'-Markierung umfasst.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin die Markierung eine nicht-natürliche Markierung ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, worin die nicht-natürliche Markierung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: einer Affinitätsmarkierung und einem Massen-Marker.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Affinitätsmarkierung die Immobilisierung der Nukleinsäure an einem festen Träger erleichtert.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Affinitätsmarkierung Biotin ist oder eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, an eine Einfangnukleinsäuresequenz, die an einen festen Träger gebunden ist, zu binden.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, worin eine Nukleinsäure über einen selektiv spaltbaren Linker an einem festen Träger immobilisiert ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Linker thermisch spaltbar, enzymatisch spaltbar, photospaltbar oder chemisch spaltbar ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Linker ein Trityl-Linker ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Linker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 1-(2-Nitro-5-(3-O-4,4'-dimethoxytritylpropoxy)phenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan und 1-(4-(3-O-4,4'-Dimethoxytritylpropoxy)-3-methoxy-6-nitrophenyl)-1-O-((2-cyanoethoxy)-diisopropylaminophosphin)ethan.
  17. Verfahren nach Anspruch 1, worin die markierten Fragmente von den nicht-markierten Fragmenten getrennt werden, bevor die Fragmente durch Massenspektrometrie analysiert werden.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, worin die markierten Fragmente von den nicht-markierten Fragmenten getrennt werden, die markierten Fragmente durch ein massenspektrometrisches Format analysiert werden, und die Reihenfolge der markierten Fragmente bestimmt wird.
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