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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Gewebe- und Organkonservierung,
-erhaltung und -reparatur. Genauer stellt die vorliegende Erfindung
ein Verfahren bereit, wobei in einem ischämisch beschädigten Organ oder Gewebe unter
Benutzung einer darin bereitgestellten Zusammensetzung die Integrität, Funktion
und Lebensfähigkeit
wieder instand gesetzt wird.
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ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
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Es
besteht weiterhin ein extremer Mangel an Organen zur Transplantation.
Gegenwärtig
ist der Haupteinschränkungsfaktor
für klinische
Transplantation der Mangel an Organen. Zum Beispiel hängt die
Nierentransplantation weitgehend von der Verfügbarkeit von Organen ab, welche
von Kadaverspendern mit Herzschlag gewonnen werden. Des Weiteren
sind eine große
und bisher unerschlossene Quelle von Organen zur Transplantation
die Kadaver ohne Herzschlag. Kadaver ohne Herzschlag sind Unfallopfer,
die am Ort der Verletzung umkommen und jene, die kurze Posttrauma-Überlebenszeiten
haben. In derartigen Fällen
besteht der Grund, weshalb derartige Organe nicht benutzt werden,
darin, dass nachdem das Herz aufhört zu schlagen, der Mangel
an kreisender Blutzufuhr (warme Ischämie) in einer Verletzungs-Kaskade
resultiert.
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Ein
Organ, das geringfügig
aber funktionsgemäß durch
warme Ischämie
beschädigt
ist, kann keine weitere Beschädigung
tolerieren, die durch die Unterkühlung übermittelt
wird. Unter den Unterkühlungsbedingungen,
die benutzt werden, um Organe zu präservieren, die zur Transplantation
bestimmt sind, erfährt
die Lipid-Doppelschicht eine Phasenänderung und wird gelartig mit
stark reduzierter Fluidität.
Das im Wesentlichen gefrorene Lipid in den Zellmembranen negiert
die Benutzung von O2, selbst in Gegenwart
einer hohen O2- Spannung. Die metabolische Konsequenz
ist Glykose, die analog zum Zustand von Anoxie ist. Es wurde beschrieben,
dass Unterkühlung
unter 18°C
die tubuläre
Aktivität
der Niere inhibiert und dass bei 4°C die Benutzung von Sauerstoff
ungefähr
5% derjenigen von Normothermie entspricht.
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Unterkühlungslagerung
kann auch Vasospasmus und ein darauffolgendes Ödem in einem Organ erzeugen.
Hypothermisch präservierte
Organe können
glomeruloendotheliale Zellschwellung und Verlust an vaskulärer Integrität zusammen
mit tubulärer
Nekrose erfahren; ein Phänomen,
das den eingesetzten Unterkühlungsbedingungen
zugeschrieben werden kann. Unterkühlung kann auch die von Na/K
abhängigen
ATPase inhibieren und zum Verlust der Zellvolumen regulierenden
Kapazität
führen.
Genau der Verlust der Volumenregulierung bewirkt die Zellschwellung.
Eine ausreichende Zufuhr an Sauerstoff kann die Menge dieser Schwellung
aktive herabsetzen. Ohne angemessene Sauerstoffzufuhr führ die Anoxie
zur Disintegration der kleineren Gefäße nach mehreren Stunden Perfusion.
Der Mangel an Sauerstoff und die anschließende Verarmung an ATP-Vorräten bedeuten,
dass die anaerobe Glykose die Hauptquelle an Energie unter traditionellen Präservierungsbedingungen
darstellt. Der Mangel an molekularem Sauerstoff zur oxidativen Phosphorylierung,
welche bei der Ischämie
auftritt, führt
zu einer Ansammlung an NADH und der Verarmung an ATP-Vorräten innerhalb
der Mitochondrien. Der anschließende
Verlust an Nukleosiden ist wahrscheinlich ein sehr wichtiger Faktor
beim Versagen von Geweben, die warmer Ischämie und verlängerter
Zeiträume
kalter Ischämie ausgesetzt
wurden, um ATP nach der Wiederherstellung der Blutversorgung zu
regenerieren. Die Unfähigkeit, angemessenen
Sauerstoff zuzuführen,
führte
zum routinemäßigen Verlass
auf Unterkühlung
zur Organpräservierung.
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Ischämie (sei
es warme Ischämie
oder kalte Ischämie)
ist daher eine Verletzungskaskade von Ereignissen, die als eine präletale Phase
und eine letale Phase charakterisiert werden können. Die präletale Phase produziert
auf drei Arten schädliche
Auswirkungen: Hypoxie; Mangelernährung;
und die Versäumnis,
giftige Stoffwechselausscheidungen zu entfernen. Mit dem Mangel
an kreisendem Blut geht ein Mangel an molekularem Sauerstoff einher.
Die daraus resultierende Hypoxie induziert die Verarmung an Energievorräten, wie etwa
die Verarmung an ATP-Vorräten
bei den Mitochondrien. Die Verarmung an ATP führt zu Zellveränderungen,
umfassend Ödeme,
Verlust der normalen Zellintegrität und Verlust von Membranpolarität. Die Zellveränderungen
induzieren die letale Phase von Ischämie, was in einer Ansammlung
an Stoffwechselausscheidungen, der Aktivierung von Proteasen und
Zelltod resultiert.
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Die
gegenwärtige
Perfusatlösung,
welche bei der Unterkühlungs-Organpräservierung
den Stand der Technik darstellt und unter Unterkühlungsbedingungen optimierte
Organpräservation
bereitstellt, enthält
Komponenten, die Unterkühlung
induziertes Gewebeödem;
Metaboliten, welche die Organfunktion nach der Transplantation erleichtern;
Antioxidantien; Membranstabilisierungsmittel; Kolloiden; Ionen;
und Salze verhindern (Southard et al., 1990, Transpl. 49: 251; und
Southard, 1989, Transpl. Proc. 21: 1195). Die Formulierung dieses Perfusats
ist derart konzipiert, um die Organe durch Unterkühlung induzierte
Depression des Stoffwechsels. Während
sie das Ödem
und den Vasospasmus minimiert, welche normalerweise während der
Unterkühlungslagerung
angetroffen werden, stellt sie keine Benutzung einer im Wesentlichen
erweiterten Spendergemeinschaft bereit.
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Dies
rührt daher,
dass ein Organ oder ein Gewebe, das geringfügig aber funktionsgemäß durch
warme Ischämie
beschädigt
ist, keine weitere Beschädigung
tolerieren kann, die durch die Unterkühlung übermittelt wird. Selbst mit
lediglich 30 Minuten Ischämie,
kann die Nachtransplantationsfunktion eines Organs gefährdet werden.
Zum Beispiel wird bei der Benutzung von Organen von Kadavern mit
Herzschlag die unmittelbare Nichtfunktionsrate auf 25% geschätzt; und
innerhalb von lediglich 30 Minuten Ischämie erhöht sich die unmittelbare Nichtfunktionsrate
auf ungefähr
60%. 60% der Nieren von Kadavern ohne Herzschlag funktionieren somit
nicht unmittelbar aufgrund der präletalen Ischämieverletzung.
Ferner wird angenommen, dass irreversible Ischämiebeschädigung und -verletzung bei
Organen vorkommt, die bereits ein paar Stunden oder weniger keine
Durchblutung erfuhren (Klatz et al.,
US-Patentschrift
Nr. 5,395,314 ). Sofern keine neuen Organquellen entwickelt
werden können,
bleibt die Anzahl an Transplantationseingriffen konstant. Des Weiteren
kann die Spendergemeinschaft nicht im Wesentlichen erweitert werden,
da kein Vorgang/System verfügbar
ist, um präletale Ischämiebeschädigung in
warmen ischämisch
beschädigten
Organen oder Geweben zu reparieren.
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Neuste
Bemühungen
konzentrierten sich auf die Prävention
ischämischer
Beschädigung
durch die Wiederbelebung mit einer erneuten Perfusion mit einer
Lösung
unmittelbar nach Unterbrechung der Blutzufuhr. Zum Beispiel wird
eine schützende
Lösung,
offenbart in der
US-Patentschrift
Nr. 4,415,556 , während
chirurgischer Techniken oder für
Organe, die transplantiert werden sollen zur Verhinderung von ischämischer
Beschädigung
des Organs benutzt. Die schützende
Lösung
wird als Perfusat benutzt, um den aeroben Stoffwechsel währen der
Perfusion des Organs zu verbessern.
US-Patentschrift
Nr. 5,395,314 beschreibt ein Verfahren zur Wiederbelebung
eines Hirns, indem nach der Unterbrechung der Blutzufuhr eine hypothermische
Lösung durch
das Hirn zirkuliert wird (ungefähr
8–10°C), welche
dazu bestimmt ist, den Organstoffwechsel zu mindern, Sauerstoff
zuzuführen
und freie radikale Beschädigung
zu inhibieren.
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Obgleich
derartige Verfahren und Präservierungslösungen zur
Prävention
ischämischer
Beschädigung
in Organen nützlich sind,
werden diese nützlichen
Wirkungen von praktischen und funktionellen Einschränkungen überschattet.
Als Erstes müssen
zur Wirksamkeit dieser Verfahren und Lösungen bei der Prävention
ischämischer
Beschädigung
diese unmittelbar (einige Minuten) nach der Unterbrechung der Blutzufuhr angewandt
werden. Logistische Einschränkungen,
zum Beispiel im Falle eines Unfallopfers als Organspender, können die
Benutzung derartiger Verfahren und Lösungen stark schmälern, sodass
sie nur in einer Krankenhausumgebung praktisch sind. Als Zweites
wird angenommen, dass irreversible ischämische Beschädigung und
Verletzung in Organen vorkommt, die innerhalb von Minuten (z. B.
Hirn) oder innerhalb lediglich ein paar Stunden (Herz, Niere) keine
Blutzufuhr erhalten. Ein Organ oder Gewebe, das geringfügig aber
funktionsgemäß durch
warme Ischämie
beschädigt
ist, kann keine weitere Beschädigung
tolerieren, die durch die Unterkühlungslagerung
vor der Transplantation oder der Wiederinstandsetzung der Durchblutung
nach der Transplantation übermittelt
wird. Ein Grund dafür
besteht darin, dass die Wiederinstandsetzung des Kreislaufes nach der
erneuten Ischämie-Perfusion
paradoxerweise in weiterer Gewebebeschädigung resultiert (McCord et
al., 1985, N Engl J Med 312: 159–163). Die Wiederinstandsetzung
des Kreislaufes resultiert in einer erneuten Sauerstoffanreicherung
des verletzten Gewebes. Die erneute Sauerstoffanreicherung von ischämisch beschädigtem Gewebe
kann in einer weiteren Gewebeverletzung resultieren, die durch die
Bildung von sauerstofffreien Radikalen, der Verarmung von freien
Radikalfängern
und der Freisetzung von chemotaktischen Agenzien bewirkt wird.
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Daher
besteht der Bedarf an einem Verfahren und einer Lösung, welche
die Wirkungen von Ischämie in
Organen oder Geweben während
der präletalen
Phase beseitigen, anstatt lediglich inhibieren, und einen Reparaturvorgang
in Organen oder Geweben in den sehr frühen Stadien von letaler Ischämie unterstützen. Ein Verfahren
zur Induzierung der Reparatur von ischämisch beschädigten Organen oder Geweben
in dem Maße, dass
die Beeinträchtigung
der Funktion rückgängig werden
kann und die Prävention
weiterer Gewebebeschädigung
während
der Wiederinstandsetzung des Kreislaufes dazu führen kann, dass die Organspendergemeinschaft
im Wesentlichen erweitert wird.
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WO 95/31897 beschreibt
ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Überwachung der Lebensfähigkeit von
transplantierbaren Organen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Induzierung der Reparation
eines ischämisch
beschädigten
Organs in dem Maße,
dass eine Beeinträchtigung
der Organfunktion rückgängig gemacht
werden kann, wobei das Verfahren das Ausspülen des Organs bei einer Temperatur
von ungefähr
28°C bis
ungefähr 37°C mit einer
gepufferten physiologischen Lösung,
um Blut und azidotische Produkte zu entfernen, welche sich in dem
Organ während
des Durchblutungsentzugs angesammelt haben; und das Durchschwemmen
des Organs bei einer Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C mit einer gepufferten physiologischen
Lösung
umfasst, welches ferner einen Vasodilatator zur Erweiterung der
Blutgefäße innerhalb
des Organs, Nahrungsfaktoren zur Wiederherstellung der Zellintegrität, wodurch
die Organfunktion wieder instand gesetzt wird, und mindestens ein
chemisches Energiesubstrat umfasst, das aus der Gruppe, bestehend
aus AMP, UTP, Coenzym A, β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
(Nad*), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinukleotid
(FAD), Diphosphopyridin-Nukleotid, tri-Phosphopyridin-Nukleotid-Mononatrium
und -Cocarboxylase ausgewählt
ist, um den Oxidationsstoffwechsel im Organ beim neuen Anpassen
des Organs an eine sauerstoffhaltige Umgebung wiederherzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Wiederbelebungslösung zur
Hemmung ischämischen
Schadens und zur Induzierung der Reparation ischämischen Schadens in dem Maße, dass
die Beeinträchtigung der
Organfunktion in einem Organ, das einer Durchblutung entzogen wurde,
rückgängig gemacht
wird, wobei die Wiederbelebungslösung
eine gepufferte physiologische Lösung
umfasst und ferner umfasst: Vasodilatatoren in einer physiologisch
wirksamen Menge zur Erweiterung des Gefäßsystems des Organs; mindestens
ein chemisches Energiesubstrat, das aus der Gruppe, bestehend aus
AMP, UTP, Coenzym A, β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
(Nad*), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADPH), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD), Diphosphopyridin-Nukleotid,
tri-Phosphopyridin-Nukleotid-Mononatrium und -Cocarboxylase in einer
physiologisch wirksamen Menge, um den Oxidationsstoffwechsel wiederherzustellen,
der während
des Entzugs der Organdurchblutung verloren ging; und Nahrungsfaktoren
in einer physiologisch wirksamen Menge, um einen oder mehrerer Zellreparaturvorgänge bereitstellen,
um die Zellfunktion, die während
des Zeitraums des Durchblutungsentzugs verloren ging, wiederherzustellen.
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Die
vorliegende Erfindung behandelt, was bis zum Zeitpunkt der Erfindung
als irreversible ischämische Beschädigung und
Verletzung von Organen oder Geweben, die keine Durchblutung erhalten,
angesehen wurde. Das Verfahren und die Zusammensetzungen werden
nach ischämischer
Beschädigung
oder Verletzung benutzt, um die Reparatur von ischämisch beschädigten Organen
und Geweben zu induzieren und weitere Beschädigungen am Gewebe während der
Wiederherstellung des Kreislaufes zu verhindern. Dies unterscheidet das
Verfahren und die Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung
von gegenwärtig
benutzten Methoden und Zusammensetzungen, die auf die Benutzung
vor ischämischer
Beschädigung
und Verletzung, mit dem beabsichtigten Zweck, einen derartigen Schaden
zu verhindern oder zu inhibieren, gerichtet sind. Das Verfahren
nach der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, womit die Integrität und Funktion
eines ischämisch
beschädigten
Organs oder Gewebes wiederhergestellt werden kann, während mindestens
der präletalen
Phase der Ischämie,
indem eine Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung benutzt wird. Ferner soll das Verfahren
und die Lösung
nach der vorliegenden Erfindung weitere Gewebebeschädigung, welche
während
der Wiederinstandsetzung des Blutkreislaufes in einem Organ oder
Gewebe, das einem Durchblutungsentzug unterworfen wird, induziert
werden kann, verhindern oder inhibieren.
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Das
Verfahren nach der vorliegenden Erfindung umfasst das Ausspülen des
Organs durch das arterielle System bei einer warmen Temperatur von
ungefähr
28°C bis
ungefähr
37°C mit
der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung, um Blut und azidotische Produkte
zu entfernen, welche sich in dem Organ oder Gewebe während des
Durchblutungsentzugs angesammelt haben; und das Durchschwemmen des
Organs oder Gewebes mit der Wiederbelebungslösung, um (i) die Blutgefäße, insbesondere
die Mikrogefäße, innerhalb
des Organs oder des Gewebes zu erweitern, (ii) die Organ- oder Gewebefunktion
wieder instand gesetzt wird durch die Zufuhr von trophischen Faktoren,
(iii) die Zellintegrität
und Funktion hinsichtlich des ischämisch beschädigten Organs oder Gewebes
wieder herzustellen und (iv) den Oxidationsstoffwechsel durch das
neue Anpassen des ischämisch
beschädigten
Organs oder Gewebes wiederherzustellen, das mittels anaerober Atmung überlebt,
an eine sauerstoffhaltige Wiederbelebungslösung; durch das Organ oder
Gewebe, das zur Transplantation und/oder Wiederinstandsetzung des
Blutkreislaufes geeignet ist.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Flussdiagramm, das die Organvorgänge zeigt, welche von dem Wiederbelebungsverfahren
und der Lösung
nach der Erfindung betroffen sind.
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2 ist
eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Serum
Kreatinin), das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation
in einer Hunde-Allotransplantation unter Benutzung des Verfahrens und
der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
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3 ist
eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Harnkreatinin),
das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation in einer Hunde-Allotransplantation
unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
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4 ist
eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Serum
Kreatinin), das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation
in einer Hunde-Autotransplantation unter Benutzung des Verfahrens
und der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
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5 ist
eine grafische Darstellung eines Organfunktionsparameters (Harnkreatinin),
das mit der Anzahl an Tagen nach der Transplantation in einer Hunde-Autotransplantation
unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung in Verbindung steht.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Definitionen
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„Durchblutungsentzug" ist ein Begriff,
der im Folgenden zum Zweck der Beschreibung und der Ansprüche benutzt
wird, um auf die Einstellung des Blutkreislaufes durch ein Organ
oder ein Gewebe in einem beliebigen Umstand, in dem der Blutkreislauf
gestoppt werden kann und warme Ischämie auftritt, Bezug zu nehmen.
Dies beinhaltet das Anhalten des Herzschlags für chirurgische Eingriffe oder
aufgrund natür licher
Ursachen, wie etwa einem Herzinfarkt. „Ein Organ oder Gewebe" ist ein Begriff,
der im Folgenden zum Zweck der Beschreibung und der Ansprüche benutzt
wird, um auf ein „Organ" Bezug zu nehmen,
umfassend Niere, Herz, Leber, Lunge, Dünndarm, Bauchspeicheldrüse, Hirn,
Auge und Haut. „Wiederbelebungslösung" ist ein Begriff, der
im Folgenden zum Zweck der Beschreibung und der Ansprüche benutzt
wird, um auf eine gepufferte physiologische Lösung Bezug zu nehmen, die Mittel
zur Wiederherstellung der Integrität und Funktion in ischämisch beschädigten und
verletzten Organen, welchen die Durchblutung entzogen wurde, und
zur Prävention oder
Inhibierung weiterer Gewebebeschädigung,
die während
der Wiederinstandsetzung des Blutkreislaufes in einem Organ, dem
die Durchblutung entzogen wurde, bereitstellt.
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Das
Verfahren nach der vorliegenden Erfindung in ein Verfahren, wobei
die Integrität
und Funktion eines ischämisch
beschädigten
Organs während
mindestens der präletalen
Phase von Ischämie
unter Benutzung einer Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung wiederhergestellt werden kann. Die Wiederherstellung der
Organintegrität
und Funktion unter Benutzung des Verfahrens und von Zusammensetzungen
nach der vorliegenden Erfindung war unerwartet, da zum Zeitpunkt
der Erfindung angenommen wurde, dass ischämische Beschädigung und
Verletzung an Organen, denen lediglich ein paar Stunden oder weniger Durchblutung
entzogen wurde, nicht rückgängig gemacht
werden kann. Ferner sollen das Verfahren und die Lösung nach
der vorliegenden Erfindung weitere Gewebebeschädigung, welche während der
Wiederinstandsetzung des Blutkreislaufes in einem Organ induziert
werden kann, dem die Durchblutung entzogen wurde, verhindern oder
inhibieren.
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Das
Verfahren und die Lösung
nach der vorliegenden Erfindung stellt ein Mittel zur Entfernung
von Blut und azidotischen Produkten, welche sich während des
Zeitraums des Durchblutungsentzugs des Organs angesammelt haben;
ein Mittel zur Wiederherstellung der Zellintegrität und Funktion,
wodurch die Organfunktion wieder instand gesetzt wird; und ein Mittel
zur Wiederanpassung des Organs an eine sauerstoffangereicherte Umgebung
bereit. Die Fähigkeit,
die Funktion in einem Organ nach ischämischer Beschädigung und
Verletzung wieder herzustellen wurde als möglich festgestellt, vorausgesetzt
dass (1) Blut nicht koaguliert, während es mit lebensfähigen endothelialen
Zellen in Kontakt ist, und dadurch ischämisch beschädigte Organe erneut durchschwemmt
werden können,
sofern ein derartiges Endothelium immer noch lebensfähig und
intakt ist; (2) die Wiederherstellung der vaskulären Dynamik von der Bereitstellung
angemessener endothelialer zellabhängiger Vasodilatation abhängig ist,
um das Gewebe angemessen zu durchschwemmen und mit Sauerstoff anzureichern
und normale selbsttätige
Regulierungsmechanismen bereitzustellen; (3) die Mikrogefäße zur Wiederbelebung
angemessen erweitert sind, die normale Durchlässigkeit jedoch nicht verändert werden
kann, damit die Zellintegrität
wieder hergestellt ist; und (4) trophische Faktoren, die während der
Ischämie
verloren gingen, wieder instand gesetzt werden und die Zellpolarität hergestellt
wird, damit die Funktion wieder erlangt wird.
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Das
Verfahren und die Lösung
nach der vorliegenden Erfindung arbeiten zusammen, um ein ischämisch beschädigtes Organ
zum Zwecke der Wiederinstandsetzung der Organfunktion und zur Wiederanpassung
des Organs an eine sauerstoffangereicherte Umgebung wiederzubeleben. 1 ist
ein Flussdiagramm, das die Organvorgänge zeigt, die durch das Wiederbelebungsverfahren
und die Lösung
nach der vorliegenden Erfindung betroffen sind.
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Die
folgenden Beispiele stellen die bevorzugten Ausführungsformen der Umsetzung
der Erfindung dar. In den nachfolgenden Ausführungsformen, welche benutzt
werden, um die Erfindung darzustellen, ist es wichtig, das folgende
Konzept zu beachten. Das Rinder-Kalb-Modell und das Hunde- Modell sind zur Einschätzung der
Zusammensetzungen und Verfahren betreffend der Organtransplantation,
die für
Menschen gedacht ist, validiert worden, da die Modelle gezeigt haben,
dass sie eine physiologische Basis aufweisen. Während nun die Zusammensetzung
und das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung in diesen experimentellen
Modellen validiert wurden, sollen die Zusammensetzung und das Verfahren
hauptsächlich
beim Menschen angewandt werden. Dem Fachmann ist eine physiologische
Basis zur Vergrößerung von
den experimentellen Modellen zu Menschen bekannt und nimmt auf Unterschiede
wie etwa Organvolumen und Organdurchfluss Rücksicht (siehe zum Beispiel
Harrison et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66: 1679–1683). Es versteht sich, dass
diese Beispiele darstellend und nicht einschränkend sein sollen.
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BEISPIEL 1 – Das Verfahren
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Das
Verfahren nach der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Intervenieren
während
eines Zeitfensters von Durchblutungsentzug in einem Organ, bevor
ein wesentlicher Zelltod eintritt. Der Fachmann wird verstehen,
dass das Zeitfenster, währenddem
das Verfahren benutzt werden kann, je nach der Art von zu behandelndem
Organ variiert. Zum Beispiel kann das Zeitfenster zur Behandlung
eines Herzens unter Benutzung des Verfahrens nach der vorliegenden
Erfindung weniger als ungefähr
eine Stunde betragen; wohingegen eine Niere unter Benutzung des
Verfahrens innerhalb einer Zeitspanne von bis zu ungefähr 4 Stunden
Durchblutungsentzug behandelt werden kann. Um die ischämische Verletzungskaskade
anzuhalten, dass sie nicht zu Zelltod führt, und auf eine Weise, wie
in 1 dargestellt, umfasst das Verfahren der vorliegenden
Erfindung die Schritte:
- (1) Ausspülen des
ischämisch
beschädigten
Organs durch das Arteriensystem mit der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung bei einer warmen Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C, um (i)
Blut und azidotische Produkte zu entfernen, welche sich in dem Organ
wäh rend
des Durchblutungsentzugs angesammelt haben;
- (ii) Wiederinstandsetzen der Zellumgebung auf einen physiologischen
pH-Wert;
- (iii) Erweitern der Mikrogefäße auf angemessene
Weise;
- (iv) Unterstützen
des fortlaufenden anaeroben Stoffwechsels als Rettungsvorgang durch
die Bereitstellung von hohen Energieverbindungen und Unterstützen der
Glykose mit zusätzlichen
Substraten, die Glukose, Pyruvat und Uridin 5'-triphosphat
(UTP) umfassen können,
sich aber nicht darauf beschränken;
- (v) Initiieren einer Umwandlung vom anaeroben Stoffwechsel zum
oxidativen Stoffwechsel durch die Bereitstellung von Stoffwechselsubstraten,
um die Adeninverbindungsgemeinschaft wieder instand zu setzen, Unterstützen des
Zitronensäurezyklus
und Wiederherstellen der Kupplung der Elektronentransportkette, wodurch
der molekulare Sauerstoff langsam eingeführt wird, um eine erneute Perfusionsverletzung,
die durch Sauerstofftoxizität
vermittelt wird, zu verhindern;
- (vi) Bereitstellen eines Mechanismus zum angemessenen Blutgefäßerweitern
des endothelialen Mikrogefäßzellbetts
innerhalb eines stark eingeengten, ödematösen, ischämisch beschädigten Organs, ohne dass die
Durchlässigkeit
des Organs im Wesentlichen verändert
wird, und wobei die Blutgefäßerweiterung
die angemessene Perfusion des Organgewebes ermöglicht und einen stabilen Perfusionsdruck,
stabile Durchflüsse
und eine konstante Temperatur, einen konstanten pH-Wert und eine
konstante Sauerstoffanreicherung bereitstellt;
- (vii) Bereitstellen von trophischen Faktoren, um die Funktion
in dem ischämisch
beschädigten
Organ wieder herzustel len, wodurch Metaboliten zum Wiedergewinnen
der Zellintegrität
und Funktion bereitgestellt werden; und 2) Durch schwemmen des ischämisch beschädigten Organs
durch das Arteriensystem mit der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung bei einer warmen Temperatur von ungefähr 28°C bis ungefähr 37°C zum
- (i) Normalisieren der Sauerstoffanreicherung, Temperatur und
des pH-Wertes;
- (ii) Fortfahren mit der Bereitstellung eines Mechanismus zur
angemessenen Blutgefäßerweiterung
des Gefäßsystems
des Organs ohne die Durchlässigkeit
des Organs im Wesentlichen zu verändern, was in einem stabilen
Perfusionsdruck und stabilen Gefäßsystemdurchflüssen resultiert;
und
- (iii) Fortfahren mit der Bereitstellung von trophischen Faktoren
zur Wiederherstellung der Funktion in dem ischämisch beschädigten Organ, wobei Metaboliten
zur Wiedergewinnung der Zellintegrität und Funktion, wie etwa Festigen
der Zellverzweigung und Wiederherstellung der Membranpolarität bereitgestellt
werden.
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Es
versteht sich für
den Fachmann, dass einer oder mehrere Nutzen, die während des
Ausspülungsschritts
abgeleitet wurden, auch im Perfusionsschritt fortgeführt werden,
da die Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung während des ganzen Verfahrens
benutzt werden kann, d. h. umfassend sowohl der Ausspül- als auch
der Perfusionsschritt.
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Zu
Darstellungszwecken und nicht zur Einschränkung wird im Ausspülschritt
eine ausreichende Menge der Wiederbelebungslösung langsam durch Infusion über eine
Kanüle
in die Hauptarterien-Blutzufuhr für dieses bestimmte Organ eingeführt, bis
der Ausfluss frei von Blut ist. Auf diese Weise werden das ischämische Blut
und die azidotischen Produkte, die sich im Gefäßraum während des Zeitraums, während dem
das Organ einen Durchblutungsentzug erfährt, aus dem Gefäßraum entfernt.
Ferner wird der pH-Wert wieder hergestellt und es wird frisches
Substrat zugeführt,
um den anaeroben Stoffwechsel und andere Wege, die für die Zellintegrität und Funktion
nötig sind,
wieder instand zu setzen. Es versteht sich für den Fachmann, dass die Menge an
Wiederbelebungslösung,
die ausreicht, um in der Ausspülung
benutzt zu werden, von der bestimmten Art und Größe des Organs, das ausgespült werden
soll, abhängt,
sowie der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs. Zur Darstellung aber
nicht Einschränkung
können
200 bis 600 ml der Wiederbelebungslösung eine ausreichende Menge
sein, um eine menschliche Niere auszuspülen, die über einen Zeitraum von 1–3 Stunden
einem Durchblutungsentzug unterzogen wurde.
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Zu
Darstellungszwecken und nicht zur Einschränkung wird im Perfusionsschritt
eine ausreichende Menge an der Wiederbelebungslösung langsam durchschwemmt
bei einem systolischen Druck, der für das ischämisch beschädigte Organ, das wiederbelebt
wird, angemessen ist, bis ein Durchfluss erreicht wird, der annähernd normal
für jene
bestimmte Art von Organ ist. Darstellend aber nicht einschränkend, kann
eine menschliche Niere, die über
einen Zeitraum von 1–3
Stunden einem Durchblutungsentzug unterzogen wurde, langsam mit
der Wiederbelebungslösung
bei einem systolischen Druck von < 80
mmHg durchschwemmt werden, bis ein Durchfluss von > 50 ml/min erreicht
wird. Der pH-Wert wird in einen physiologischen Bereich normalisiert,
indem langsam über
einen Oxygenator oder über
eine Sauerstoff transportierende Verbindung als Komponente in der
Wiederbelebungslösung
molekularer Sauerstoff eingeführt
wird. Die Anreicherung des Organs mit Sauerstoff während der
Perfusion sowie die Normalisierung der Temperatur und des pH-Wertes
geschehen innerhalb ungefähr
der ersten 15–30
Minuten der Perfusion. Während
der langsamen Blutgefäßerweiterung
des Organs beginnen sich die Perfusionsdrücke und die Durchflüsse zu stabilisieren
und das Organ schaltet schnell zum oxidativen Stoffwechsel. Es versteht
sich für
den Fachmann, dass die Zeitdauer, die für die Perfusion nötig ist,
von der bestimmen Art und Größe des Organs,
das durchschwemmt wird, sowie von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs
abhängt.
Die Behandlung eines ischämisch
beschädigten
Organs mit dem Verfahren (Ausspülen
und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden kann
ausreichen zur Wiederbelebung der meisten Organe (z. B. Durchblutungsentzug
für zwischen
0,5 und 4 Stunden) zur Wiederaufnahme der Organfunktion. Wenn außerdem das
Organ ein Produkt produziert, wie etwa eine Niere, die Urin produziert,
kann das Verfahren in der Produktion eines normalen Produkts der
Organfunktion resultieren.
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Das
Verfahren nach der vorliegenden Erfindung wurde entwickelt, um ischämisch beschädigte Organe ex
vivo ohne traditionelle Unterkühlung
(4°–10°C) zu präservieren
und wiederzubeleben. Das Verfahren stellt die notwendige Sauerstoffzufuhr,
Nährstoffe
zum Stoffwechsel, onkotischen Druck, pH-Wert, Perfusionsdrücke und
Durchflüsse
zur Unterstützung
des Organstoffwechsels ex vivo bereit, am meisten innerhalb oder
in der Nähe
des jeweiligen Bereichs in vivo. Eine annähernd normale Stoffwechselrate
wird hierin als ungefähr 70%–90% des
Bereichs der normalen Stoffwechselraten definiert. Ferner unterstützt das
Verfahren nach der vorliegenden Erfindung einen Grad an Stoffwechsel
ex vivo, der ausreichend oxidativen Stoffwechsel bereitstellt, damit
es in dem normalen funktionellen Produkt des Organs resultiert.
Die Entwicklung dieses Verfahrens, das Organe ex vivo unterstützt, ohne
traditionelle Unterkühlung,
stellt die Möglichkeit
dar, eine annähernd normale
Stoffwechselrate zu unterstützen
und funktionelle Fähigkeiten
zu erstellen, die mit dem postoperativen oder Posttransplantations-Ablauf
korreliert werden können.
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In
einer weiteren Ausführungsform
kann das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung unter Benutzung
einer Vorrichtung durchgeführt
werden, umfassend ein laminares oder pulsierendes Pumpsystem, um
die Wiederbelebungslösung
zuzuführen
und die Perfusion und den Perfusionsdruck zu steuern; Mittel zur
Temperatursteuerung; und Mittel zur Bereitstellung und Steuerung
der Einführung
und Entlüftung
von Atmungsgasen. Eine derartige Vorrichtung ist vom betreffenden
Erfinder in
US-Patentschrift
5,699,793 beschrieben worden. Eine derartige Vorrichtung
kann auch ein Vorrichtungsmittel umfassen, um das Perfusat, das
bereits durch das Organ gekreist ist, zu testen und/oder zu sammeln,
um eine oder mehrere funktionelle Charakteristiken, wie etwa pH-Wert,
verschiedene Drücke,
Durchfluss, Gefäßwiderstand,
verschiedene chemische Konstituenten, Oxigenierung, Kohlendioxidkonzentration
und Sauerstoffverbrauch zu überwachen
und messen. Des Weiteren kann das Vorrichtungsmittel oder ein zweites
Vorrichtungsmittel zusammen mit der Vorrichtung benutzt werden,
um das Organprodukt, das von dem Organ abgelenkt wird, wie etwa
Urin von einer Niere, zu messen und/oder zu sammeln, wobei die anschließende Messung
der Parameter des Organproduktes mit der Organintegrität und Funktion
während
oder anschließend
an das Verfahren der vorliegenden Erfindung in Verbindung stehen.
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BEISPIEL 2 – Die Wiederbelebungslösung
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Organpräservierung
und Perfusatlösungen
sind auf dem Stand der Technik bekannt, dass sie eine Basislösung umfassen,
die aus einer gepufferten physiologischen Lösung, wie etwa einer Salzlösung oder
einem Zellkultur ähnlichen
Basismedium bestehen, der mehrere definierte Zusätze hinzugefügt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform
setzt die Wiederbelebungslösung
der vorliegenden Erfindung auch eine Basislösung ein, welche Aminosäuren, Ionen,
physiologische Salze, Impermeanzien, Serumproteine und/oder Faktoren
und Zuckerarten enthalten. Zusätzlich
zu den Komponenten der Basislösung
enthält
die Wiederbelebungslösung
der vorlie genden Erfindung eine neuartige Kombination aus Zusätzen, die
in mindestens 3 Komponentenkategorien unterteilt werden können. Es
versteht sich für
den Fachmann, dass die Komponenten in jeder Kategorie mit einer
funktionell entsprechenden Verbindung ersetzt werden können, um
dasselbe Ergebnis zu erhalten. Die folgenden aufgelisteten Spezies
der Komponenten in jeder Komponentenkategorie dienen daher der Darstellung
und nicht der Einschränkung.
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Eine
erste Komponentenkategorie, Vasodilatatoren, umfasst eine Kombination
aus Komponenten in einer physiologisch wirksamen Menge, welche ein
Mittel zur angemessenen Blutgefäßerweiterung
großer
Gefäße über glatte
Muskelzellenentspannung sowie zur angemessenen Erweiterung von Mikrogefäßen bereitstellen.
Zur Gewährleistung,
dass die normale Durchlässigkeit
des Gefäßsystems
aufrecht erhalten bleibt, wird der Vasodilatator auf eine endotheliale
zellenabhängige
Weise gesteuert. Eine derartige Kombination von Komponenten kann
umfassen: (i) Substrate zur endothelialen zellenvermittelten Gefäßerweiterung,
wie etwa Acetylcholin, Dopamin, Bradykinin und Arginin; (ii) Substrate
zur Mikrogefäßerweiterung,
wie etwa Prostacyclin (und Analoge, z. B. Carbacyclin) und Mg+; und (iii) Adenosin (und Analoge, z. B.
Cyclohexyladenosin) und Verapamil für ihre kombinierten Wirkungen
auf die Gefäßerweiterung,
die durch Kalziumkanalblockierung (andere Kalziumkanalblocker umfassen
Flunarizin, Nifedipin, SNX-11, Chlorpromazin, und Diltiazem) vermittelt
werden. Das Ergebnis der Benutzung einer derartigen Kombination
aus Vasodilatatoren besteht darin, dass das Gefäßsystem gut ausgeweitet ist,
während
gleichzeitig seine Integrität
und normale Grenzfunktion beibehalten wird. Vasodilatatoren umfassen
von 1 Vol.-% bis 50 Vol.-% (w/v) der neuartigen Kombination aus
Zusätzen, die
der Basislösung
hinzugefügt
werden, zur Bildung der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung.
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Eine
zweite Komponentenkategorie, chemische Energiesub strate, umfasst
eine Kombination von Komponenten in einer physiologisch wirksamen
Menge, welche ein Mittel zur Wiederherstellung des oxidativen Stoffwechsels
bereitstellen, die während
des Zeitraums des Durchblutungsentzugs verloren gingen. Während des
Durchblutungsentzugs führt
der resultierende Verlust der Membranintegrität zum Verlust von intrazellulären Komponenten,
wie etwa Ionen, Komponenten der Adeninverbindungsgemeinschaft, des
Zitronensäurenzyklus
und der gekoppelten Elektronentransportkette. Derartige chemische
Energiesubstrate, welche der Wiederbelebungslösung hinzugefügt wurden,
können
Pyruvat; Glukose; ATP; AMP; Coenzym A; β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid
(NAD*); β-Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
(NADP*); Flavin-Adenin-Dinukleotid
(FAD); Thiamin-Pyrophosphat-Chlorid (Cocarboxylase); Uridin 5' Triphosphat (UTP);
Chlorid; Adenosin; Magnesium; und eine Kombination daraus umfassen.
Wenn die Energiezufuhr in den Gewebezellen vor dem Eintreten des
Zelltodes wiederhergestellt wird, können Zellveränderungen
während
des Durchblutungsentzugszeitraumes rückgängig gemacht werden und das
Gewebezellvolumen normalisiert sich wieder. Das chemische Energiesubstrat
umfasst 0,01 Vol.-% bis 90 Vol.-% der neuartigen Kombination aus
Zusätzen,
die der Basislösung
beim Bilden der Wiederbelebungslösung
der vorliegenden Erfindung hinzugefügt werden.
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Eine
dritte Komponentenkategorie, trophische Faktoren, umfasst eine Kombination
von Komponenten eine einer physiologisch wirksamen Menge, die ein
Mittel zur Förderung
eines oder mehrerer Zellreparaturvorgänge bereitstellen, um die Zellfunktion,
die während
es Zeitraums des Durchblutungsentzugs verloren ging, wiederherzustellen.
Die Kombination von trophischen Faktoren stellt ein Mittel zur Förderung
der Proteinsynthese bereit, welche zur Wiederherstellung engerer
Zellverzweigungen und die Regenerierung der Membranpolarität führt, was
zur Wiedererlangung der Zellfunktion führt. Derartige trophische Faktoren,
die zu der Wiederbelebungslösung
hinzugefügt
werden, können
eine hohe Konzentration an Aminosäuren und Magnesium (z. B. 2
bis 6 Mal die typische Plasmakonzentration), Nukleinsäurederivate
und Ribonukleoside; und Wachstumsfaktoren mit Membranverstärkern, wie
etwa Säure-Fibroblaswachstumsfaktor
(FGF), Grund-FGF, Heparin und Chondroitinsulfat und Kombinationen
daraus umfassen. Die trophischen Faktoren umfassen 1 Vol.-% bis
90 Vol.-% der neuartigen Kombination von Zusätzen, die zu der Basislösung hinzugefügt und darin
aufgelöst
werden zur Bildung der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung.
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Es
versteht sich für
den Fachmann, dass Komponenten in einer oder mehreren der drei Komponentenkategorien
zusätzliche
Funktionen aufweisen können,
die für
das Verfahren der vorliegenden Erfindung zusätzliche wünschenswerte Funktionen aufweisen
können.
Zum Beispiel funktionieren Magnesiumionen (eingeführt als
Teil einer Magnesium tragenden Verbindung) als sowohl Vasodilatator
als auch ein chemisches Energiesubstrat; und Glukose funktioniert
als sowohl trophischer Faktor als auch chemisches Energiesubstrat. Ferner
umfassen in einer bevorzugten Ausführungsform die in der Wiederbelebungslösung enthaltenen
Aminosäuren
Cystin und Cystein in Mengen, die nebst dem Funktionieren als trophische
Faktoren auch als Antioxidantien bevorzugte freie Radikalfänger funktionieren,
welche freie Schadstoffradikale während des Ausspül- und Perfusionsschritts
des Verfahrens einfangen. Es können
weitere Antioxidantien, wie etwa Glutathion, Cyclodextrin, Superoxiddismutase
(SOD), Catalase, Chlorpromazin und Prostacyclin umfasst sein oder
als funktionell entsprechende Verbindungen in der Wiederbelebungslösung der
vorliegenden Erfindung benutzt werden. Derartige Antioxidantien
umfassen von 0,000 Vol.-% bis 10 Vol.-% der neuartigen Kombination
von Zusätzen,
die zu der Basislösung
hinzugefügt
und in dieser aufgelöst
werden, zum Bilden der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung.
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In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, bei der das Gewebe, das unter Benutzung
der Wiederbelebungslösung
nach der Erfindung wiederbelebt werden soll, neurologisches Gewebe
(z. B. Hirn) beinhaltet, kann die Wiederbelebungslösung ferner
neuroprotektive Arzneimittel wie etwa NMDA Rezeptor blockierende
Agenzien (NMDA Rezeptor Ionenkanalblocker, z. B. Aptiganel und Cerestat;
NMDA-Rezeptor Glyzinstellenblocker, z. B. ZD 9379 und GV 150-562A),
Stickoxidansammlungsblocker (NO) (z. B. Lubeluzol) und Natriumkanalblocker
zum Inhibieren des Einflusses von Natrium in die Zellen, welche
die Glutamat-Freisetzung auslösen
können
(z. B. BW619-C89, Fosphenytoin).
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung enthält
die Wiederbelebungslösung, anstatt
dass molekularer Sauerstoff über
einen Oxygenator im Verfahren eingeführt wird, eine oder mehrere Sauerstoff
transportierende Verbindungen („Sauerstoff tragende Agenzien"), welche derart
funktionieren, dass sie dem ischämisch
beschädigten
oder verletzten Organ molekularen Sauerstoff für den oxidativen Stoffwechsel
bereitstellen. Dem Fachmann ist bekannt, dass derartige Sauerstoff
tragende Agenzien Hämoglobin,
stabilisierte Hämoglobinderivate
(hergestellt aus hämolysierten
menschlichen Erythrozyten wie etwa pyridoxyliertes Hämoglobin),
Polyoxethylenkonjugate (PHP), rekombinante Hämoglobinprodukte, perfluorchemische (PFC)
Emulsionen und/oder perfluorchemische Mikrobläschen (zusammengefasst als „Perfluorchemikalie" bezeichnet) umfassen,
sich aber nicht darauf beschränken.
Derartige Sauerstoff tragende Agenzien umfassen 0,000 Vol.-% bis
50 Vol.-% der neuartigen Kombination von Zusätzen, die der Basislösung hinzugefügt und in ihr
aufgelöst
wurden, zum Bilden der Wiederbelebungslösung der vorliegenden Erfindung;
oder 0,000 Vol.-% bis 20 Vol.-% der gesamten Wiederbelebungslösung (v/v).
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PFC-Emulsionen,
die als Sauerstoff tragende Agenzien nützlich sein sollen, sind zum
Beispiel beschrieben in
US-Patentschriften
Nr. 5,403,575 ; 4,86S,318;
4,866,096 ;
4,865,836 ;
4,686,024 ;
4,534,978 ;
4,443,480 ;
4,423,077 ;
4,252,827 ;
4,187,252 ;
4,186,253 ;
4,110,474 ; und
3,962,439 . Derartige PFC-Emulsionen
umfassen Perfluorooctylbromid, Perfluorooctyldibromid, Bromfluorkohlenwasserstoffe,
Perfluorether, Fluosol-DA
TM, F-44E, 1,2-bisperfluorobutylethylen,
F-4-methyloctahydroquinolidizin, 9 bis 12 Kohlenstoffperfluoramine,
Perfluordecalin, Perfluorindan, Perfluortrimethylbicyclo[3,3,1]onan,
Perfluormethyladamant, Perfluordimethyladamantan. PFC-Mikrobläschen, die
als Sauerstoff tragende Agenzien nützlich sein können, sind
zum Beispiel beschrieben in
US-Patentschrift
Nr. 5,393,524 . PFCs, die als nützlich zur Erzeugung von Mikrobläschen offenbart
sind, umfassen Dodecafluorpentan (DDFP), Schwefelhexafluorid, Pentan,
Hexafluorpropylen, Octafluorpropan, Hexafluorethan, Octafluor-2-butyn,
Hexafluorbuta-1,3-dien, Isopren, Octafluorcyclobutan, Decafluorbutan,
Cis-2-penten, Dimethylsulfid, Ethylarsin, Bromchlorfluormethan,
Trans-2-penten,
2-Chlorpropan, Hexafluordisulfid, Ethylmercaptan, Diethylether,
Ethylvinylether, Valylen, Trisfluorarsin, Furfuylbromid, Cis-propenylchlorid,
Butylfluorid, 1,1 Dichlorethan, Isopropylmethylether, Isopropylamin,
Methylfomat, 2-Acetyl-furan, Ethylenfluorid, 1-Penten, Isopropylacetylen,
Perfluorpentan, Isopentan, Vinylether, 2-Butyn, 1,4-Pentadien, Tetramethylsilan,
Dimethylphosphin, Dibromdifluormethan, 2-chlor-propen, Difluriodmethan,
Acetaldehyd, Trimethylbor, 3-Methyl-2-buten, 1,1 Dimethylcyclopropan,
Aminoethan, Vinylbromid, Disilanmethan, Trichlorfluormethan, Bromfluormethan,
Trifluordichlorethan, Perfluorpenten und andere Fluor enthaltende
Kohlenwasserstoffe (
US-Patentschrift Nr.
5,409,688 ).
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In
einem Verfahren zur Herstellung der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung wird einer Basislösung eine neuartige Kombination
von Zusätzen
hinzugefügt
und darin aufgelöst,
welche in mindestens 3 Komponentenkategorien gruppiert werden können, umfassend
Vasodilatatoren, chemische Energiesubstrate und trophische Faktoren.
Obgleich die Zusammensetzung der Wiederbelebungslösung zur
Benutzung mit dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung von
Komponente zu Komponente variieren kann und diese wie vorher beschrieben
klassifiziert ist, ist eine bevorzugte Formulierung nachstehend
in Tabelle 1 zu Darstellungszwecken und nicht zur Einschränkung dargelegt
(es sei bemerkt, dass eine Komponente, die in mehr als einer der
mindestens 3 Komponentenkategorien funktionieren kann, der Klarheit
halber unten in einer Kategorie platziert ist). Tabelle 1 Zusatz zur Basislösung hinzugefügt (Mengen
in Milligramm pro Liter Basislösung)
Vasodilatatoren | Menge |
Arginin | 140 |
Acetylcholin | 2 |
Verapamil | 0,2 |
Prostacyclin | 0,06 |
Magnesium | 600 |
Chemische
Energiesubstrate | |
ATP | 2 |
AMP | 2 |
UTP | 4 |
Coenzym
A | 10 |
Diphosphopyridinnukleotid | 28 |
FAD | 4 |
Triphosphopyridinnukleotidmononatrium | 4 |
Cocarboxylase | 4 |
Trophische
Faktoren | |
Säure- u./oder
Base-FGFs | 200 |
Pyruvat | 220 |
Glukose | 2,000 |
Heparin | 180 |
Insulin | 10 |
(Nukleinsäurederivate) | |
Deoxyadenosin | 40 |
Deoxyguanosin | 40 |
Deoxycytidin | 40 |
Thymidin | 40 |
(Ribonukleotide) | |
Adenosin | 40 |
Cytidin | 40 |
Guanosin | 40 |
Uridin | 40 |
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Die
derart hergestellte Wiederbelebungslösung sollte eine Osmolarität von > 330 mOsm aber vorzugsweise
weniger als 600 mOsm aufweisen und in einem bevorzugten Bereich
von ungefähr
350 mOsm bis ungefähr
400 mOsm liegen. Der pH-Wert der Wiederbelebungslösung sollte
auf einen pH-Wert innerhalb eines pH-Wert-Bereiches von ungefähr 6,5 bis
ungefähr
7,5 und vorzugsweise in einem pH-Wert von 7,3 bis 7,45 eingestellt
werden.
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Wie
dargelegt kann die Wiederbelebungslösung in einer anderen Ausführungsform
ferner zusätzliche Antioxidantien
und eines oder mehrere Sauerstoff tragende Agenzien, wie folgt,
umfassen (pro Liter Basislösung):
Antioxidantien | Menge |
Glutathion | 0,1
mg |
Cyclodextrin | 500
mg |
Sauerstoff
tragendes Agens | |
Perfluorchemikalie | 20%
v/v |
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BEISPIEL 3 – Wirkung des Durchblutungsentzugs
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Es
wurden Experimente durchgeführt,
um die Wirkung warmer Ischämie
zu zeigen, die durch das Entziehen der Durchblutung von einem Organ
für ungefähr 30 Minuten
bewirkt wurde.
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Eine
derartige warme Ischämie
führt zur
schnellen Verschlechterung der Zellintegrität. Die ischämische Verletzungskaskade beginnt
mit dem Verlust der Adeninverbindungsgemeinschaft, was zum Ödem führt. Der
Verlust der Zellintegrität
und dem Vorkommen von einem Ödem
resultiert im Kollaps der Gefäßintegrität und dem
Verlust der normalen Durchlässigkeitsfunktion.
In einem Organ, wie etwa einer Niere, ist ersichtlich, dass die
ischämische
Verletzung, die durch den Entzug der Durchblutung von der Niere
für lediglich
30 Minuten zu starker Gefäßverengung
führen
kann. Die starke Gefäßverengung
resultiert in unangemessenen Durchflüssen zur angemessenen Durchschwemmung
der Niere. Der hohe Gefäßwiderstand
in gefäßverengten
Gefäßen führt zur
weiteren Verschlechterung mit sekundärer Anoxie, wobei dies zu einem
Verlust der funktionellen Fähigkeit
führt (d.
h. Verlust der Erzeugung von Urin). Tabelle 2 stellt einen Vergleich
der Perfusionscharakteristiken dar (Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand)
und Organfunktion (Erzeugung von Urin) in einem experimentellen
Tiermodellsystem, umfassend Rinderkalbsnieren, die keinem Durchblutungsentzug
unterzogen wurden („normal") und Rinderkalbsnieren,
die lediglich 30 Minuten einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden
(„ischämisch"). Der Gefäßwiderstand
ist mittlerer Druck/mittlerer Durchfluss. Tabelle 2
Parameter | Normal | Ischämisch |
Anzahl
Nieren | 25 | 5 |
mittlerer
Druck | 50/30 | 44/40 |
mittlerer
Durchfluss | > 95 cc/min | 12,9
cc/min |
mittlerer
Gefäßwiderstand | 0,4 | 3,26 |
Erzeugung
von Urin | ja | nein |
-
BEISPIEL 4 – Wirkungen des Wiederbelebungsverfahrens
und Lösung
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Es
wurden Experimente durchgeführt,
um die Fähigkeit
des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen zu bewältigen anstatt
lediglich zu inhibieren und einen Reparaturvorgang zu dem Maße zu unterstützen, dass
die Beeinträchtigung der
Organfunktion rückgängig gemacht
werden kann, aufzuzeigen. Es wurden eingeschläferten Rinderkälbern Nieren
entnommen. Nach 30 Minuten oder 60 Minuten Durchblutungsentzug wurden
die Nieren mittels Mittellinieneinschnitt entfernt. Vor der Entfernung
der Nieren wurde keine Behandlung gegeben, wie auch keine Verabreichung
von Antikoagulationsstoffen. Bei jeder Kontrolle erfuhr die Niere
30 Minuten Durchblutungsentzug, wodurch während dieses Zeitraums ischämische Verletzung
geschah. Die Kontrollnieren wurden nach der Entfernung mit 100 cc
eines Basiszellkulturmediums bei einer Temperatur von 32°C ausgespült, sodass
die Nieren hinsichtlich des Blutes ausgespült wurden, das in dem jeweiligen
Gefäßfach blieb.
Jede Testniere erfuhr 60 Minuten Durchblutungsentzug, wobei sie
für jenen
Zeitraum ischämische
Verletzung erlitt. Die Testnieren wurden nach der Entfernung mit
100 cc der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur von 32°C ausgespült. Nach
dem Ausspülen
wurden die jeweiligen Nieren auf einem abgewandelten MOX-100
TM Transportpräservierungssystem
gepumpt. Die Kontrollnieren wurden bei 32°C gepumpt, unter Benutzung von
früher
entwickelter Technologie, um Organe unter Benutzung von warmen Präservierungstechnologien
unter Benutzung des Basiszellkulturmediums als Perfusat zu präservieren.
Die Testnieren wurden unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung bei 32°C
gepumpt. Ein Vergleich der Perfusionscharakteristiken (Druck; Durchfluss;
und Gefäßwiderstand)
und Organfunktion (Erzeugung von Urin) der Kontrollgruppe (30 Minuten
ohne Erfindung) mit der Testgruppe (60 Minuten mit Erfindung) ist
in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3
Parameter | 30' ohne Erfindung | 60' mit Erfindung |
Anzahl
Nieren | 5 | 16 |
mittlerer
Druck | 44/40 | 54/25 |
mittlerer
Durchfluss | 12,9
cc/min | 97,4
cc/min |
mittlerer
Gefäßwiderstand | 3,26 | 0,47 |
Erzeugung
von Urin | keine | ja |
-
Die
Testnieren welchen dann, nachdem sie über einen Zeitraum von einer
Stunde ischämische
Beschädigung
erlitten haben, dann mit dem Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurden, zeigten Perfusionscharakteristiken
(Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand) und
Organfunktion (Erzeugung von Urin) innerhalb der funktionellen Bereiche
der normalen Nieren, die in Tabelle 2 dargestellt sind. Somit ist
also die Fähigkeit
des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung aufgezeigt, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen zu bewältigen anstatt
lediglich zu inhibieren, und einen Reparaturvorgang zu dem Maße zu unterstützen, dass
die Behinderung der Organfunktion rückgängig gemacht werden kann.
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BEISPIEL 5 – Wirkung mit variierenden
Verletzungszeiten
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Es
wurden Experimente durchgeführt,
um die Wirkungen des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung in Organen, die einem Durchblutungsentzug
für Zeiträume von
mehr als 1 Stunde unterzogen wurden, gemacht. Rinderkalbsnieren
wurden eingeschläferten
Kälbern
zu verschiedenen Zeitpunkten des Durchblutungsentzugs entnommen,
umfassend 60 Minuten, 90 Minuten, 2 Stunden oder 4 Stunden. Es wurde
vor der Entfernung der Nieren keine Behandlung gegeben und keine
Verabreichung von Antikoagulationsstoffen. Dann wurde jede Niere
mit 100 cc der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur von 32°C ausgespült. In keinem
Fall wurde bei den Nieren geronnenes Blut im Gefäßraum gefunden. Das Blut scheint
fluide zu bleiben, solange es mit dem lebensfähigen Gefäßendothelium in Kontakt ist.
Nach dem Ausspülen
wurden die jeweiligen Nieren mehrere Stunden unter Benutzung des
Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung bei 30°C
gepumpt. Ein Vergleich der mittleren Perfusionscharakteristiken
(Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand)
und Organfunktion (Urin Creatinin Konzentration – Creatinin Beseitigung; Histologie),
der Nieren, die 60 Minuten lang einem Durchblutungsentzug unterzogen
wurden (60'), der
Nieren, die 90 Minuten lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden
(90'), der Nieren,
die 2 Stunden lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden (120') und der Nieren,
die 4 Stunden lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden (240') ist in Tabelle
4 gezeigt. Tabelle 4
Parameter | 60'
(N = 16) | 90'
(N = 5) | 120'
(N = 5) | 240'
(N = 2) |
Druck
(mmHg) | 54/25 | 58/37 | 55/37 | 52/40 |
Durchfluss
(cc/min) | 97,4 | 72 | 68,6 | 36,5 |
Gefäßwiderstand | 0,47 | 0,67 | 0,73 | 1,27 |
Creatinin
(mg/dl) | 41,8 | 22,9 | 18,5 | 23,5 |
Histologie | gut
präserviert | gut
präserviert
mit fokaler Abflachung des Epithels | insgesamt gut;
fokales Ödem | frühe fokale Nekrose |
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Die
Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung ein ischämisch beschädigtes Organ zu Zeitpunkten
von mindestens bis zu 4 Stunden Durchblutungsentzug wiederbelebt
werden können.
Wenn zum Beispiel eine Niere, die 60 Minuten lang eine warme Ischämieverletzung
erfuhr, 2 Stunden lang unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung gepumpt
wird, entsprechen die Perfusionscharakteristiken jenen in normalen
Nieren, wie in Tabelle 1 aufgelistet. Histologische Schätzungen
unterstützen
die funktionellen Daten, wie Gewebeteilabschnitte, die untersucht wurden,
zeigen, dass die Morphologie und Integrität gut präserviert zu sein scheinen.
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Bei
90 Minuten und 120 Minuten Durchblutungsentzug widerspiegeln jene
Nieren eine weitgreifendere Zellbehinderung (d. h. erhöhte diastolische
Drücke
und reduzierte Durchflüsse)
als Nieren, die 60 Minuten lang Durchblutungsentzug unterzogen wurden.
Trotz einer derartigen Zellbehinderung erzeugten jene Nieren jedoch
immer noch Urin; und histologisch gesehen, schienen sie gut präserviert
zu sein. Außerdem
wurde in diesen Nieren keine Nekrose erfasst.
-
Nieren,
die 4 Stunden lang einem Durchblutungsentzug unterzogen wurden,
zeigten im Wesentlichen reduzierte Durchflüsse mit gleichzeitiger Erhöhung der
diastolischen Drücke
auf, wobei dies die Verengung in den Mikrogefäßbetten umfasst. Es ist jedoch
wichtig, anzumerken, dass jene Nieren trotzdem noch Organfunktion
aufwiesen. Urin wurde mit einer Urincreatininkonzentration von 23,5
mg/dL erzeugt. Histologisch gesehen, zeigten diese Nieren die ersten
Anzeichen von fokaler früher
Nekrose. Mitotische Charaktere wurden angrenzend an die Bereiche
der fokalen tubulären
Nekrose beobachtet, was darauf hindeutet, dass ein aktiver Reparationsvorgang
initiiert geworden zu sein scheint. Daher zeigte sich selbst nach
4 Stunden Durchblutungsentzug die Fähigkeit des Verfahrens und
der Wiederbe lebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen
zu bewältigen
anstatt lediglich zu inhibieren und einen Reparaturvorgang zu dem
Maße zu
unterstützen,
dass die Beeinträchtigung
der Organfunktion rückgängig gemacht
werden kann.
-
Es
ist wichtig, anzumerken, dass die Kontrollnieren (ohne Behandlung
mit dem Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung) nach entweder 2 oder 4 Stunden Durchblutungsentzug histologisch
evaluiert wurden, um den relativen Nutzen des Verfahrens und der
Wiederbelebungslösung
zu bestimmen. Die histologische Evaluierung der Kontrollnieren,
die 2 Stunden warmer Ischämie
erlitten, zeigte frühe
diffuse Röhrchennekrose.
Bei 4 Stunden warmer ischämischer
Beschädigung
zeigten die Kontrollnieren eine diffuse Zerlegung der tubulären Zellen.
Dahingegen zeigten Nieren, die 2 Stunden warme Ischämie erlitten
und dann mit dem Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung behandelt wurden, die Wiederherstellung
der Zellintegrität.
Ferner zeigten Nieren, die 4 Stunden warme Ischämie erlitten und dann mit dem
Verfahren und der Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung behandelt wurden, lediglich fokale Röhrchennekrose im Vergleich
zur weit verbreiteten Röhrchenbeschädigung in
den Kontrollnieren. Die histologischen Evaluierungen unterstützen ferner
die wesentliche Effizienz des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung beim Rückgängigmachen der Kaskade warmer Ischämieereignisse
nach dem Durchblutungsentzug.
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BEISPIEL 6 – In-Vivo-Funktion eines wiederbelebten
Organs
-
A. Allotransplantation
-
Ein
Organ, das unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, wurde auf die In-vivo-Funktion
nach der Wiederbelebung evaluiert. Eine Hunde-Allotransplantation
wurde durchgeführt,
wobei postmortal ein Zeitraum zum Durchblutungsentzug von 60 Minuten
gewährt
wurde, wobei eine Niere aus einem Hundespender entfernt wurde; das
Organ mit der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung ausgespült wurde; und das Organ 2 Stunden
lang durchschwemmt wurde, unter Benutzung des Verfahrens und der
Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung bei 30 bis 32°C. Nach dem Wiederbelebungsverfahren
wurde die Niere dann in einen Hundeempfänger mit einer gleichzeitigen
bilateralen Nephrektomie der Nieren des Empfängers allotransplantiert. Daher
war der Hundeempfänger
von der wiederbelebten Niere zum Überleben abhängig. Der
Vorgang nach der Transplantation des Hundeempfängers ist in 2 u. 3 gezeigt.
-
Die
Niere durchschwemmte sich gut erneut und erzeugte innerhalb von
zwei Stunden nach der Transplantation Urin. Die Niere erzeugte weiterhin
Urin durch die beobachtete Zeitspanne nach der Transplantation. Wie
in 2 gezeigt, erfuhr der Empfänger einen leichten Anstieg
im Serum Creatinin zu einem Grad über 2 mg/dl nach 24 Stunden
nach der Transplantation. Das Serum Creatinin kehrte zum normalen
Bereich innerhalb von 48 Stunden nach der Transplantation zurück. Die
Serumchemien blieben normal bis zum zehnten Tag nach der Transplantation,
als akute Organablehnung geschah (dem Hundeempfänger wurde unzureichendes Immunsuppressionsschema
verabreicht). Wie in 3 gezeigt, stieg der Urin-Creatininwert schnell
an und war innerhalb von 48 Stunden nach der Transplantation innerhalb
eines normalen Bereiches von ungefähr 70 mg/dl. Diese sehr milde
Episode akuter tubulärer
Nekrose (ATN), die anfänglich
geschah, wurde schnell innerhalb von 48 Stunden nach der Transplantation
rückgängig gemacht.
Die rückgängig machbare
Natur der akuten tubulären
Nekrose zusammen mit der Fähigkeit
der transplantierten Niere, das fortwährende Überleben des Empfängers zu
unterstützen,
zeigte die Lebensfähigkeit
und In-vivo-Funktion des transplantierten Organs, das mehr als 60
Minuten lang eine warme Ischämie
erlitt. Somit kann ein Organ, das unter Benutzung des Verfahrens
und der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, nach der Wiederbelebung
in vivo funktionieren.
-
B. Autotransplantation
-
In
einer anderen Ausführungsform
wurde ein Organ, das unter Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, auf In-vivo-Funktion nach der Wiederbelebung
evaluiert. Unter Benutzung zweier Hunde wurde eine Hunde-Autotransplantation
durchgeführt,
indem die linken Nieren entfernt, welche dann ischämisch beschädigt wurden
in einem 37°C
salinen Bad für
2 Stunden. Nach der Periode der warmen Ischämie wurden die Nieren kanüliert und
mit der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung ausgespült; und 2 Stunden lang unter
Benutzung des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung bei 30 bis 32°C durchschwemmt. Nach dem Wiederbelebungsverfahren
wurden die Nieren mit einer gleichzeitigen Nephrektomie der unbehandelten, kontralateralen
Niere autotransplantiert. Daher war jeder Empfängerhund alleine von der wiederbelebten
Niere zum Überleben
abhängig.
Der Vorgang nach der Transplantation des Empfängerhundes ist in 4 u. 5 gezeigt.
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Die
Nieren konnten gut erneut durchschwemmt warden und erzeugten innerhalb
von Stunden nach der Transplantation Urin während der gesamten beobachteten
Periode nach der Transplantation. Wie in 4 gezeigt,
erfuhren beide Hunde einen leichten Anstieg an Serum Creatinin,
was konsistent mit ATN war. In jedem Fall trat am dritten Tag nach
der Transplantation ein Höchstwert
an Serum Creatinin auf mit Werten von 3,5 mg/dl bzw. 2,8 mg/dl.
Die Serum Creatinin Niveaus normalisierten sich jedoch innerhalb
des zehnten Tages nach der Transplantation. Die Serumchemien blie ben
für den
Rest der beobachteten Periode nach der Transplantation normal. Wie
in 5 gezeigt, stieg der Urin-Creatinin-Wert schnell an und war mehrere
Tage vor der Normalisierung der Serumchemien innerhalb eines normalen
Bereichs. Nach der Einschläferung
ergaben sich aus den histologischen Funden im Wesentlichen normale
Nieren. Diese Funde deuten auf die Regenerierung des tubulären Epithels
hin. Die rückgängig machbare
Natur der akuten tubulären
Nekrose zusammen mit der Fähigkeit
der transplantierten Niere, das kontinuierliche Überleben des Empfängers zu
unterstützen,
demonstrierte die Lebensfähigkeit
und die In-vivo-Funktion
des transplantierten Organs, das mehr als 2 Stunden warme Ischämie erlitt.
Somit kann ein Organ, das unter Benutzung des Verfahrens und der
Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung wiederbelebt wurde, in vivo nach
der Wiederbelebung funktionieren.
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BEISPIEL 7 – Vergleich mit bekannten Präservierungslösungen
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Die
Organe wurden unter Benutzung entweder des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach der
vorliegenden Erfindung oder einer auf dem Stand der Technik bekannten
Präservierungslösung (entweder ein
Basiskulturmedium RSM-210
TM oder VIASPAN
TM) wiederbelebt und dann hinsichtlich Funktion
und Histologie verglichen. Jede Gruppe von Nieren, welche 60 Minuten
Durchblutungsentzug erlitten, wurde bei 32°C unter Benutzung der jeweiligen
Lösung
ausgespült
und dann 2 Stunden lang mit der jeweiligen Lösung durchschwemmt: VIASPAN
TM bei 4°C;
oder RSM-210
TM oder die Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung bei 30–32°C unter Benutzung desselben
Verfahrens zur Wiederbelebung. Ein Vergleich der mittleren Perfusionscharakteristiken
(Druck; Durchfluss; und Gefäßwiderstand)
und der Organfunktion (Urin Creatinin Konzentration; Histologie)
der Nieren, welche 60 Minuten Durchblutungsentzug unterzogen und
mit der jeweiligen Lösung
behandelt wurden, ist in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5
Parameter | Wiederbelebungslösung | RSM-210TM | ViaSpanTM |
Druck
(mmHg) | 54/25 | 44/40 | 54/46 |
Durchfluss
(cc/min) | 97,4 | 12,9 | 27 |
Gefäßwiderstand | 0,47 | 3,25 | 1,8 |
Creatinin
(mg/dl) | 41,8 | kein
Urin | kein
Urin |
HIstologie | gut
präserviert | gut
präserviert | Glomerula-Schwellung, frühe tubulare Nekrose |
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Die
in Tabelle 5 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass die Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung eine überstehende
Fähigkeit
aufweist im Vergleich zu RSM-210TM und VIASPANTM bei
der Wiederinstandsetzung der Gefäßcharakteristiken
sowie der Funktion in ischämisch
beschädigten
Organen. Zum Beispiel zeigten die Nieren, die unter Benutzung der
Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung im Wiederbelebungsverfahren durchschwemmt
wurden, wünschenswerterweise
reduzierte Gefäßverengung
und höhere
Durchflüsse
im Vergleich zu jenen, die mit RSM-210TM oder
VIASPANTM ausgespült und durchschwemmt wurden.
Auf ähnliche
Weise waren die Nieren, die unter Benutzung der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung ausgespült und durchschwemmt wurden,
die einzigen Nieren, in denen die Organfunktion wieder instand gesetzt
wurde, was zur Erzeugung von Urin mit gleichzeitiger Ausscheidung von
Creatinin führte.
Histologisch gesehen, wurden nur die Nieren, die unter Benutzung
der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung oder mit RSM-210TM ausgespült und durchschwemmt
wurden, ausreichend wieder instand gesetzt und präserviert,
wie durch die gut präservierte
renale Archi tektur gezeigt. Dahingegen zeigten die Nieren, die mit
VIASPATM ausgespült und durchschwemmt wurden,
Hinweise auf histologische Beschädigung,
umfassend Glomerula-Schwellung und tubuläre Nekrose. Die übergeordnete
Fähigkeit
im Vergleich zu den Präservierungslösungen,
die dem Fachmann bekannt sind, des Verfahrens und der Wiederbelebungslösung nach
der vorliegenden Erfindung, die Wirkungen warmer Ischämie in Organen
zu bewältigen und
einen Reparaturvorgang zu dem Maße zu unterstützen, dass
die Beeinträchtigung
der Organfunktion rückgängig gemacht
werden kann, wird veranschaulicht.
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BEISPIEL 8 – Sauerstoffzufuhr im Wiederbelebungsvorgang
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Wie
vorher in Einzelheiten erläutert,
besteht eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung darin, al seine Komponente in der Formulierung
der Wiederbelebungslösung
eines oder mehrere Sauerstoff tragende Agenzien einzuschließen. Evaluiert
wurden die Wirkungen der verschiedenen Sauerstoff tragenden Agenzien
als Komponente in der Wiederbelebungslösung und ihre relative Rolle
der molekularen Sauerstoffzufuhr; und die Fähigkeit des Verfahrens und
der Wiederbelebungslösung
nach der vorliegenden Erfindung, den fortlaufenden oxidativen Stoffwechsel
zu unterstützen.
Die Wiederbelebungslösung,
der kein Sauerstoff tragendes Agens zugesetzt wurde (in Tabelle
6 als „RS" bezeichnet), die
Wiederbelebungslösung,
der gewaschene rote Blutzellen zugesetzt wurde (in Tabelle 6 mit „RS-RBC"; 15% v/v bezeichnet),
die Wiederbelebungslösung, der
gereinigtes Hämoglobin
zugesetzt wurde (in Tabelle 6 als „RS-Hgb"; 60 cc/Liter im Handel erhältlicher
Lösung
bezeichnet) und die Wiederbelebungslösung, der eine perfluorchemische
Emulsion zugesetzt wurde (in Tabelle 6 als „Rs-Pf"; 20% v/v bezeichnet), wurden jeweils
benutzt, um Nieren wiederzubeleben, die 60 Minuten warme Ischämie erlitten.
Jede Gruppe an Nieren, welche 60 Minuten Durchblutungsentzug erlitten,
wurden bei 30 bis 32°C
unter Benutzung der jeweiligen Lösung
ausge spült
und dann bei 30 bis 32°C
2 Stunden lang mit der jeweiligen Lösung unter Benutzung desselben
Verfahrens zur Wiederbelebung durchschwemmt. Tabelle 6
Lösung | Druck (mmHg) | Durchfluss (cc/min) | Gefäßwid. | Creatinin | Histologie |
RS | 54/38 | 92,3 | 0,50 | 8,4 | gut
präserviert |
RS-RBC | 56/36 | 98,2 | 0,58 | 8,3 | gut
präserviert |
RS-Hgb | 58/42 | 66,67 | 0,75 | 18 | gut
präserviert |
RS-Pf | 54/25 | 97,4 | 0,47 | 41,8 | gut
präserviert |
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Die
in Tabelle 6 gezeigten Ergebnisse demonstrieren, dass während der
Zunahme der Konzentration an molekularem Sauerstoff in der Wiederbelebungslösung über ein
wirksameres Sauerstoff tragendes Agens als Komponente in der Wiederbelebungslösung die
Organfunktion infolge des Wiederbelebungsverfahrens verbessert wird.
Zum Beispiel resultieren wirksame Sauerstoff tragende Agenzien perfluorchemisches
oder gereinigtes Hämoglobin
in einer höheren
Konzentration an molekularem Sauerstoff, der während des Verfahrens zugeführt wird.
Die Funktion der Nieren, die mit der Wiederbelebungslösung, die
in einem dieser tragenden Agenzien enthalten sind, behandelt wurden,
verbesserte sich gegenüber
derjenigen von Nieren, die mit der Wiederbelebungslösung, die
kein zugesetztes Sauerstoff tragendes Agens oder ein weniger wirksames Sauerstoff
tragendes Agens enthalten, behandelt wurden. Die Benutzung der Wiederbelebungslösung mit
entweder gereinigtem Hämoglobin
oder der Perfluorchemikalie nach der vorliegenden Erfindung, zum
Beispiel, resultierte in einer mittleren Urin Creatinin Konzentration
von 18 mg/dl bzw. 41,8 mg/dl. Wenn dahingegen im Wiederbelebungsverfahren
nicht ein Oxygenator benutzt wird und die Wiederbelebungslösung kein
Sauerstoff tragendes Agens aufweist oder eine niedrige Konzentration
an gewaschenen rotten Blutzellen enthält, ist das mittlere Urin Creatinin
8,4 mg/dl bzw. 8,3 mg/dl. Veranschaulicht ist eine andere Ausführungsform
der Wiederbelebungslösung,
bei der durch die Zugabe von einem oder mehreren wirksamen Sauerstoff
tragenden Agenzien als Komponente in der Lösung eine verbesserte Organfunktion
in einem ischämisch
beschädigten
Organ, das mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt
wurde, bemerkt wurde.
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BEISPIEL 9
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Das
Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung können
benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einer Leber unter Durchblutungsentzug
zu bewältigen
und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass
eine Beeinträchtigung
der Leberfunktion rückgängig gemacht
werden kann. Während
die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer
des Durchblutungsentzugs abhängig
ist, kann die Behandlung einer ischämisch beschädigten Leber mit dem Verfahren (Ausspülen und
Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden
zur Wiederbelebung der meisten Lebern ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug
für zwischen
ungefähr
0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die
insgesamte Leberfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie
der Leber können
durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten Perfusat
und dem Leberprodukt (Galle) bestimmt werden. Die funktionellen
Charakteristiken der Leber können durch
das Messen von Parametern, umfassend aber nicht beschränkt auf
Gallenkonzentrationen von Gallensalzen, Cholesterol, alkaline Phosphatase;
Gallen-pH-Wert; und Lebergefäßdurchfluss,
Sauerstoffverbrauch und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen) eingeschätzt werden.
Gemäß dem Verfahren
und den Lösungen,
wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit eine ischämisch beschädigte Leber
behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion
eingeschätzt
werden.
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BEISPIEL 10
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Das
Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung können
benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einer Bauchspeicheldrüse unter
Durchblutungsentzug zu bewältigen
und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass
eine Beeinträchtigung
der Bauchspeicheldrüsenfunktion
rückgängig gemacht
werden kann. Während
die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer
des Durchblutungsentzugs abhängig
ist, kann die Behandlung einer ischämisch beschädigten Bauchspeicheldrüse mit dem
Verfahren (Ausspülen
und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden
zur Wiederbelebung der meisten Bauchspeicheldrüsen ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug
für zwischen
ungefähr
0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die
insgesamte Bauchspeicheldrüsenfunktion
sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie der Bauchspeicheldrüse können durch
das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten
Perfusat und der Bauchspeicheldrüse
bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken der Bauchspeicheldrüse umfassen
Bauchspeicheldrüsenenzymkonzentrationen
wie etwa Amylase, Lipase; das Hormon Insulin; Bauchspeicheldrüsenabsonderungs-pH-Wert,
Natrium und Kalium; und Bauchspeicheldrüsengefäß-Durchfluss, Sauerstoffverbrauch
und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen). Gemäß dem Verfahren und den Lösungen,
wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit eine ischämisch beschädigte Bauchspeicheldrüse behandelt
und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion eingeschätzt werden.
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BEISPIEL 11
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Das
Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung können
benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einem Herz unter Durchblutungsentzug
zu bewältigen
und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass
eine Beeinträchtigung
der Herzfunktion rückgängig gemacht
werden kann. Während
die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer
des Durchblutungsentzugs abhängig
ist, kann die Behandlung eines ischämisch beschädigten Herzens mit dem Verfahren (Ausspülen und
Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden
zur Wiederbelebung der meisten Herzen ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug
für zwischen
ungefähr
0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die
insgesamte Herzfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie
des Herzens können
durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten
Perfusat und des Herzens bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken
des Herzens können
durch das Messen von Parametern, umfassend aber nicht beschränkt auf
mechanische und elektrische Arbeit, Herzenzyme, wie etwa Transaminasen
(Aspartat-Aminotransferase, AST), Laktatdehydrogenase (LD), Fruktose 1,6-diphosphataldolase
(ALS), Malatdehydrogenase (MD), Glutathionreduktase (GR), Creatinphosphokinase (CPK),
Hydroxybutyratedehydrogenase (HBD); Herzgefäßdurchfluss, Sauerstoffverbrauch
und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen) eingeschätzt werden.
Gemäß dem Verfahren
und den Lösungen,
wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit ein ischämisch beschädigtes Herz
behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion
eingeschätzt
werden.
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BEISPIEL 12
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Das
Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung können
benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einem Dünndarm unter
Durchblutungsentzug zu bewältigen
und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass
eine Beeinträchtigung
der Dünndarmfunktion rückgängig gemacht
werden kann. Während
die Zeitdauer, die zur Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer des
Durchblutungsentzugs abhängig
ist, kann die Behandlung eines ischämisch beschädigten Dünndarms mit dem Verfahren (Ausspülen und
Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden zur
Wiederbelebung der meisten Dünndärme ausreichen
(z. B. unter Durchblutungsentzug für zwischen ungefähr 0,5 und
4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die insgesamte
Dünndarmfunktion
sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie des Dünndarms
können
durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten
Perfusat und des Dünndarms
bestimmt werden. Die funktionellen Charakteristiken des Herzens
können
durch das Messen von Parametern, umfassend aber nicht beschränkt auf
funktionelle Assays wie etwa Magensäure-Stimulationstests, und
Absorptionsassays unter Benutzung von Tracermolekülen; Dünndarmgefäßdurchfluss,
Sauerstoffverbrauch und Glukosenutzung (vom Perfusat gemessen) eingeschätzt werden.
Gemäß dem Verfahren
und den Lösungen,
wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit ein ischämisch beschädigter Dünndarm behandelt
und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion eingeschätzt werden.
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BEISPIEL 13
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Das
Verfahren und die Wiederbelebungslösung nach der vorliegenden
Erfindung können
benutzt werden, um die Wirkungen warmer Ischämie in einer Lunge unter Durchblutungsentzug
zu bewältigen
und ein Reparaturverfahren zu dem Maße zu unterstützen, dass
eine Beeinträchtigung
der Lungenfunktion rückgängig gemacht
werden kann. Es kann wünschenswert
sein, zunächst
das Lungentransplantat unmittelbar vor der erneuten Durchschwemmung
mit einem Tensid zu behandeln (siehe z. B. Erasmus et al., 1996,
Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153: 665–670). Während die Zeitdauer, die zur
Perfusion notwendig ist, von der Zeitdauer des Durchblutungsentzugs
abhängig
ist, kann die Behandlung einer ischämisch beschädigten Lunge mit dem Verfahren
(Ausspülen
und Durchschwemmen) nach der vorliegenden Erfindung für ungefähr 2 Stunden
zur Wiederbelebung der meisten Lungen ausreichen (z. B. unter Durchblutungsentzug
für zwischen
ungefähr
0,5 und 4 Stunden), um die Organfunktion wieder aufzunehmen. Die
insgesamte Lungenfunktion sowie die einzelnen Aspekte der Physiologie
der Lunge können
durch das Messen der Konzentrationen der Bestandteile in dem umkreisten
Perfusat, wie etwa Tensidprotein A (SP-A) Niveaus bestimmt werden.
Die funktionellen Charakteristiken der Lunge können durch das Messen von Parametern,
umfassend aber nicht beschränkt
auf FVC (forcierte Vitalkapazität),
FEV1 (forciertes exspiratorisches Volumen in 1 Sekunde), PEFR (höchster exspiratorischer
Fluss), VA (mittleres alveoläres
Volumen), TLC (totale Lungenkapazität) und DLCO (Transfer für Kohlenmonoxid)
eingeschätzt
werden. Gemäß dem Verfahren
und den Lösungen,
wie in Beispielen 1 und 2 dargestellt, kann somit eine ischämisch beschädigte Lunge
behandelt und dann auf die voraussichtliche Stoffwechselfunktion
eingeschätzt
werden.