DE69737218T2

DE69737218T2 - Adjuvant für transkutane Immunisation

Info

Publication number: DE69737218T2
Application number: DE69737218T
Authority: DE
Inventors: Gregory Giatherburg Glenn; Carl Bethesda Alving
Original assignee: US Department of Army
Current assignee: US Department of Army
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2017-11-15
Also published as: CN1241906A; KR100517028B1; US5980898A; AU744537B2; EP2272526A3; ATE349890T1; US7037499B1; WO1998020734A1; IL129919A; BR9712952A; JP4584361B2; IL129919A0; AU5265298A; AP9901540A0; DE69730534D1; ATE274805T1; CN1279976C; CA2272417C; DE69737218D1; EP1014787B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine transkutane Immunisierung und Adjuvantien, die dafür nützlich sind, um eine Antigen-spezifische Immunantwort auszulösen.
Die transkutane Immunisierung erfordert sowohl einen Transport eines Antigens durch die äußeren Schichten der Haut, die normalerweise für einen solchen Transport undurchlässig sind, und eine Immunantwort auf das Antigen. In der US-Anmeldung Nr. 08/749 164 wurde gezeigt, dass die Verwendung des Cholera-Toxins als Antigen eine starke Antikörper-Antwort auslöst, die in hohem Maße reproduzierbar ist; das Antigen konnte in einer Saline-Lösung auf die Haut aufgetragen werden, sei es mit oder ohne Liposomen. In der vorliegenden Anmeldung zeigen wir eine transkutane Immunisierung unter Verwendung von Adjuvantien, wie zum Beispiel bakteriellen Exotoxinen, ihren Untereinheiten und verwandten Toxinen.
Es gibt einen Bericht über eine transdermale Immunisierung mit Transferosomen von Paul et al., (1995). In dieser Veröffentlichung werden die Transferosomen als ein Träger für Proteine (Rinderserumalbumin und Gap-Junction-Proteine) verwendet, gegen welche die Komplement-vermittelte Lyse der Antigen-sensibilisierten Liposomen gerichtet ist. Eine Immunantwort wurde nicht herbeigeführt, wenn die das Protein enthaltende Lösung auf die Haut aufgetragen wurde; nur Transferosomen waren in der Lage, das Antigen durch die Haut zu transportieren und eine Immunisierung zu vollbringen. Wie in der US-Anmeldung Nr. 08/749 164 diskutiert, sind Transferosomen keine Liposomen.
Die 1 von Paul et al., (1995), zeigt, dass nur eine Formulierung von Antigen und Transferosomen eine Immunantwort herbeigeführt hat, die anhand der Lyse der Antigen-sensibilisierten Liposomen durch einen Assay bestimmt wurde. Die Formulierungen des Antigens in Lösung, des Antigens und der gemischten Mizellen, und des Antigens und der Liposomen (d.h. smektische Mesophasen), die auf die Haut aufgetragen wurden, führten keine Immunantwort herbei, die derjenigen gleichwertig ist, die durch eine subkutane Injektion herbeigeführt wird. Somit gab es eine positive Kontrolle (d.h. Antigen und Transferosomen), um ihre negative Schlussfolgerung zu bestätigen, dass eine Formulierung des Antigens und der Liposomen keine transdermale Immunisierung verursachte.
Paul et al., (1995), führten auf Seite 3521 aus, dass die Haut eine wirksame Schutzschicht sei, „die für Substanzen mit einem Molekulargewicht von höchstens 750 Da undurchdringbar sei", so dass eine nicht-invasive Immunisierung mit einem großen Immunogen durch die unversehrte Haut ausgeschlossen sei. Somit würde dieser Hinweis von der Verwendung eines Moleküls, wie zum Beispiel des Cholera-Toxins (das ein Molekulargewicht von 85.000 Dalton aufweist) wegführen, da man von solchen Molekülen nicht erwarten könne, die Haut zu durchdringen, und daher würde man nicht erwarten, eine Immunisierung zu erreichen. Somit stellt die Haut ein Hindernis dar, deren Durchdringung durch ein Adjuvans oder Antigen, wie zum Beispiel Cholera-Toxin, ohne die Offenbarung der vorliegenden Erfindung nicht erwartet werden würde.
Paul und Cevc, (1995), führten auf Seite 145 aus: „Große Moleküle gelangen normalerweise nicht durch die unversehrte Haut von Säugetieren. Es ist somit unmöglich, mit einfachen Lösungen eines Peptids oder Proteins epikutan zu immunisieren." Sie zogen den folgenden Schluss: „Die auf die Haut aufgetragenen liposomalen oder gemischt mizellaren Immunogene sind biologisch so inaktiv wie einfache Protein-Lösungen, unabhängig davon, ob sie mit dem als Immunoadjuvans dienenden Lipid A vereinigt werden oder nicht."
Wang et al., (1996), trugen eine Lösung von Ovalbumin (OVA) in Wasser auf die Haut von rasierten Mäusen auf, um eine Antwort vom allergischen Typ als ein Modell für eine atopische Dermatitis auszulösen. Die Mäuse wurden betäubt und mit einem abdeckenden Pflaster bedeckt, das bis zu 10 mg OVA enthielt, welches fortlaufend für 4 Tage auf die Haut aufgetragen wurde. Dieses Verfahren wurde nach 2 Wochen wiederholt.
In der 2 von Wang et al., (1996), zeigte ein ELISA-Assay, der durchgeführt wurde, um die Antwort des IgG2a-Antikörpers zu bestimmen, keine Antwort des IgG2a-Antikörpers gegenüber OVA. Jedoch konnten IgE-Antikörper, die mit allergischen Reaktionen in Beziehung stehen, nachgewiesen werden. In einem weiteren Experiment wurden die Mäuse noch ausgiebiger mit OVA in Lösung für 4 Tage alle 2 Wochen mit entsprechenden Pflastern versehen. Dieses Verfahren wurde fünfmal wiederholt, d.h., die Mäuse trugen Pflaster für insgesamt 20 Tage. Wiederum erbrachte die hohe Dosis von OVA keine erheblichen IgG2a-Antikörper. Erhebliche Mengen von IgG-Antikörpern wurden produziert.
Die Autoren führten auf Seite 4079 aus, dass „wir ein Tiermodell entwickelt haben, um zu zeigen, dass die epikutane Exposition gegenüber Protein-Antigen in Abwesenheit eines Adjuvans die Tiere sensibilisieren und eine dominante, Th2-ähnliche Antwort mit hohen Konzentrationen von IgE hervorrufen kann." Die ausgiebige epikutane Exposition gegenüber hohen Dosen von Protein-Antigen konnte keine wesentlichen Mengen von IgG-Antikörpern hervorbringen, jedoch konnte sie die Bildung von IgE-Antikörpern herbeiführen, die das Kennzeichen einer Reaktion vom allergischen Typ darstellen. Somit lehrt Wang et al., 1996, dass die Exposition von OVA, wie beschrieben, ein Modell für die atopische Dermatitis und nicht eine Art der Immunisierung darstellt. Wenn man der Lehre dieses Hinweises folgt, würde man daher erwarten, dass die transkutane Immunisierung mit einem Antigen hohe Konzentrationen von IgE-Antikörpern hervorrufen würde, falls sie durch die Haut hindurchdringen und eine Immunantwort auslösen würden. Stattdessen haben wir in unerwarteter Weise gefunden, dass das Antigen, das in einer Saline-Lösung mit einem Adjuvans auf die Haut aufgetragen wird, hohe Konzentrationen von IgG-Antikörpern und eine bestimmte Konzentration von IgA-Antikörpern, nicht jedoch von IgE-Antikörpern herbeiführt.
Im Gegensatz zu den genannten Quellen haben die Erfinder gefunden, dass die Auftragung von Antigen und Adjuvans auf die Haut ein transkutanes Transport-System für das Antigen darstellt, das eine Antigen-spezifische Immunantwort für IgG oder IgA auslösen kann. Das Adjuvans ist vorzugsweise ein ADP-ribosylierendes Exotoxin. Gegebenenfalls können Hydratations- oder Penetrations-Verstärker oder abdeckende Verbandsstoffe in dem transkutanen Transport-System verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung ist es, ein System für die transkutane Immunisierung bereitzustellen, das eine Immunantwort (zum Beispiel humorale und/oder zelluläre Effektoren) in einem Tier oder in einem Menschen herbeiführt.
Das System stellt eine einfache Auftragung einer Formulierung auf die unversehrte Haut eines Organismus' dar, welche Formulierung das Antigen und das Adjuvans umfasst, um eine spezifische Immunantwort gegenüber dem Antigen auszulösen.
Insbesondere kann das Adjuvans die Antigen-präsentierenden Zellen des Immunsystems (zum Beispiel Langerhans-Zellen in der Epidermis, dermale dendritische Zellen, dendritische Zellen, Makrophagen, B-Lymphozyten) aktivieren und/oder die Antigenpräsentierenden Zellen dazu veranlassen, das Antigen durch Phagozytose aufzunehmen. Die Antigen-präsentierenden Zellen präsentieren anschließend das Antigen gegenüber T- und B-Zellen. Im Falle der Langerhans-Zellen können die Antigen-präsentierenden Zellen von der Haut zu den Lymphknoten wandern, und das Antigen den Lymphozyten (zum Beispiel den B- und/oder T-Zellen) präsentieren, um dadurch eine Antigen-spezifische Immunantwort auszulösen.
Neben der Auslösung von Immunreaktionen, die zur Erzeugung von Antigen-spezifischen B-Lymphozyten und/oder T-Lymphozyten, einschließlich eines zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) führen, ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Bestandteile des Immunsystems in positiver und/oder negativer Weise zu regulieren, indem das transkutane Immunisierungs-System dazu verwendet wird, Antigen-spezifische T-Heifer-Lymphozyten (Th1, Th2 oder beide) zu erregen.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines Antigens und eines Adjuvans bei der Herstellung einer Formulierung für die transkutane Immunisierung eines Probanden, wobei die Formulierung eine Immunantwort auslöst, die spezifisch für das Antigen ist, und die auf die Anwendung der Formulierung auf der Haut des Probanden folgt, und wobei die Formulierung darüber hinaus keinen Penetrationsverstärker umfasst. Die Formulierung kann weitere Antigene umfassen, so dass die transkutane Anwendung der Formulierung eine Immunantwort gegenüber vielen verschiedenen Antigenen auslöst. In einem solchen Fall können die Antigene aus der gleichen Quelle stammen oder nicht, jedoch werden die Antigene unterschiedliche chemische Strukturen aufweisen, um damit Immunantworten auszulösen, die spezifisch für die unterschiedlichen Antigene sind. Antigen-spezifische Lymphozyten können an der Immunantwort beteiligt sein, und im Falle der Beteiligung von B-Lymphozyten können Antigen-spezifische Antikörper ein Teil der Immunantwort sein.
Das vorstehende Verfahren wird dazu verwendet, einen Organismus zu behandeln. Falls das Antigen von einem Pathogen stammt, immunisiert die Behandlung den Organismus im Sinne einer Impfung gegenüber einer Infektion durch das Pathogen oder gegenüber seinen pathogenen Wirkungen, wie zum Beispiel jene, die durch eine Absonderung eines Toxins verursacht werden. Eine Formulierung, die ein Tumor-Antigen umfasst, kann eine Krebs-Behandlung bereitstellen, eine Formulierung, die ein Autoantigen umfasst, kann eine Behandlung für eine Krankheit bereitstellen, die durch das eigene Immunsystem des Organismus' (zum Beispiel eine Autoimmun-Krankheit) verursacht wird, und eine Formulierung, die ein Allergen umfasst, kann in einer Immunotherapie verwendet werden, um eine allergische Krankheit zu behandeln.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Pflaster für die Verwendung in den vorstehenden Verfahren bereitgestellt. Das Pflaster umfasst einen Verbandsstoff und wirksame Mengen eines Antigens und eines Adjuvans. Der Verbandstoff kann abdeckend oder nicht-abdeckend sein. Das Pflaster kann weitere Antigene umfassen, so dass die Anwendung des Pflasters eine Immunantwort gegenüber vielen verschiedenen Antigenen auslöst. In einem solchen Fall können die Antigene von derselben Quelle stammen oder nicht, jedoch werden die Antigene unterschiedliche chemische Strukturen aufweisen, um damit eine Immunantwort auszulösen, die spezifisch für die unterschiedlichen Antigene ist. Für eine wirksame Behandlung können verschiedene Pflaster für verschiedene Zeiträume oder konstant über einen bestimmten Zeitraum verwendet werden.
Die Formulierung wird auf die unversehrte Haut aufgetragen, so dass sie auf mehr als einem Bereich von ableitenden Lymphknoten aufliegt, wobei entweder eine einzelne oder mehrfache Auftragungen verwendet werden. Die Formulierung kann weitere Antigene enthalten, so dass die Auftragung auf die unversehrte Haut eine Immunantwort gegenüber vielen verschiedenen Antigenen auslöst. In einem solchen Fall kann das Antigen von derselben Quelle stammen oder nicht, jedoch werden die Antigene unterschiedliche chemische Strukturen aufweisen, um damit eine Immunantwort auszulösen, die spezifisch für die unterschiedlichen Antigene ist.
Die Produkte und Verfahren der Erfindung können verwendet werden, um bereits eingetretene Krankheiten zu behandeln, um Krankheiten vorzubeugen, oder um den Schweregrad und/oder die Dauer einer Krankheit herabzusetzen. Jedoch ist das Auslösen einer Allergie, einer atopischen Krankheit, einer Dermatitis oder einer Kontakt-Überempfindlichkeit nicht bevorzugt.
Über das Antigen und das Adjuvans hinaus kann die Formulierung zusätzlich ein hydratisierendes Mittel (zum Beispiel Liposome), einen Penetrations-Verstärker oder beide umfassen. Zum Beispiel kann die Formulierung des Antigens und des Adjuvans darüber hinaus eine Emulsion, die mit AQUAPHOR (Mineralfett, Mineralöl, Mineralwachs, Wollwachs, Panthenol, Bisabolol und Glycerin) hergestellt ist, Emulsionen (zum Beispiel wässrige Cremes), Öl-in-Wasser-Emulsionen (zum Beispiel ölige Cremes), wasserfreie Lipide und Öl-in-Wasser-Emulsionen, wasserfreie Lipide und Wasser-in-Öl-Emulsionen, Fette, Wachse, Öle, Silikone, Feuchthaltemittel (zum Beispiel Glycerin), ein Gel (zum Beispiel SURGILUBE, KY Gel), oder eine Kombination derselben umfassen. Die Formulierung kann als eine wässrige Lösung bereitgestellt werden.
Die Formulierung umfasst vorzugsweise kein organisches Lösungsmittel. Die Formulierung kann auf die Haut aufgetragen werden, nachdem sie mit Alkohol abgewischt wurde. Jedoch ist die Entfernung der Keratinozyten-Schicht vor der Auftragung der Formulierung in dem Ausmaß, der mit einem Enthaarungsmittel erreicht wird, nicht bevorzugt.
Das Antigen kann von einem Pathogen, das den Organismus infizieren kann (zum Beispiel von einem Bakterium, Virus, Pilz oder Parasiten), oder von einer Zelle (zum Beispiel von einer Tumorzelle oder einer normalen Zelle) stammen. Das Antigen kann ein Tumor-Antigen oder ein Auto-Antigen sein. In chemischer Hinsicht kann das Antigen ein Kohlenhydrat, Glycolipid, Glycoprotein, Lipid, Lipoprotein, Phospholipid, Polypeptid oder ein chemisches oder rekombinantes Konjugat der vorstehend Genannten sein. Das Molekulargewicht des Antigens kann größer als 500 Da sein, vorzugsweise ist es größer als 800 Da, und stärker bevorzugt ist es größer als 1000 Da.
Das Antigen kann durch rekombinante Mittel, durch chemische Synthese oder durch Reinigung aus einer natürlichen Quelle erhalten werden. Bevorzugt sind proteinartige Antigene oder Konjugate mit einem Polysaccharid. Das Antigen kann zumindest teilweise in zeltfreier Form gereinigt werden. In alternativer Weise kann das Antigen in Form eines lebenden Virus', eines abgeschwächten lebenden Virus' oder eines inaktivierten Virus' bereitgestellt werden.
Die Einbeziehung eines Adjuvans kann eine Verstärkung oder eine Modulation der Immunantwort ermöglichen. Darüber hinaus kann die Auswahl eines geeigneten Antigens oder Adjuvans die bevorzugte Auslösung einer humoralen oder zellulären Immunantwort mit spezifischen Antikörper-Isotypen (zum Beispiel mit IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 oder einer Kombination derselben), und/oder mit spezifischen T-Zell-Untermengen (zum Beispiel mit CTL, Th1, Th2, T_DTH oder einer Kombination derselben) ermöglichen.
Vorzugsweise ist das Adjuvans ein ADP-ribosylierendes Exotoxin oder eine Untereinheit desselben. Gegebenenfalls kann ein Aktivator für die Langerhans-Zellen verwendet werden.
Gegebenenfalls können das Antigen, das Adjuvans oder beide in der Formulierung anhand einer Nukleinsäure (zum Beispiel DNA, RNA, cDNA, cRNA), die für das Antigen oder das Adjuvans kodiert, bereitgestellt werden, falls dies geeignet ist. Dieses Verfahren wird genetische Immunisierung genannt.
Der Ausdruck „Antigen", wie er in der Erfindung verwendet wird, soll eine Substanz beschreiben, die eine spezifische Immunantwort auslöst, wenn sie den Immunzellen eines Organismus' präsentiert wird. Ein Antigen kann ein einzelnes, immunogenes Epitop oder viele verschiedene immunogene Epitope umfassen, die von einem B-Zell-Rezeptor (d.h. einem Antikörper auf der Membran einer B-Zelle) oder von einem T-Zell-Rezeptor erkannt werden. Ein Molekül kann sowohl ein Antigen als auch ein Adjuvans darstellen (zum Beispiel Cholera-Toxin), und somit kann die Formulierung lediglich einen Bestandteil enthalten.
Der Ausdruck „Adjuvans", wie er in der Erfindung verwendet wird, soll eine Substanz beschreiben, die der Formulierung zugegeben wird, um die Auslösung einer Immunantwort gegenüber dem Antigen zu unterstützen. Eine Substanz kann nicht nur als Adjuvans sondern auch als Antigen wirken, indem sie sowohl eine Immunstimulation als auch eine spezifische Antikörper- oder T-Zell-Antwort auslöst.
Der Ausdruck „wirksame Menge", wie er in der Erfindung verwendet wird, soll eine Menge eines Antigens beschreiben, die eine Antigen-spezifische Immunantwort auslöst. Eine solche Auslösung einer Immunantwort kann eine Behandlung bereitstellen, wie zum Beispiel einen immunologischen Schutz, eine Desensibilisierung, eine Immunsuppression, die Modulation einer Autoimmunkrankheit, die Verstärkung der Kontrolle des Immunsystems im Falle von Krebs, oder eine therapeutische Impfung gegenüber einer bekannten Infektionskrankheit.
Der Ausdruck „Bereich von ableitenden Lymphknoten", wie er in der Erfindung verwendet wird, bezeichnet einen atomischen Bereich, in dem die gesammelte Lymphe durch einen definierten Satz von Lymphknoten gefiltert wird (zum Beispiel am Hals, an den Achseln, an der Leiste, am Ellbogen, am Knie, und jene des Bauch- und Brustraumes).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Cholera-Toxin (CT), das eine gesteigerte Expression der durch den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (MHC) kodierten Moleküle der Klasse II auf den Langerhans-Zellen (LC), Veränderungen in der Morphologie der Langerhans-Zellen und einen Verlust der Langerhans-Zellen (vermutlich durch Wanderung) herbeiführt. BALB/c-Mäuse (H-2^d) wurden transkutan mit 250 μg Cholera-Toxin (CT) oder dessen B-Untereinheit (CTB) in einer Saline-Lösung am Ohr immunisiert. Vorausgehende Experimente haben eröffnet, dass Mäuse leicht immunisiert werden, wenn die Haut des Ohrs verwendet wird (7000 ELISA-Einheiten von anti-CT-Antikörpern nach einer einzigen Immunisierung). Nach 16 Stunden wurden die epidermalen Hautschichten präpariert und in Bezug auf die durch den MHC kodierten Klasse II-Moleküle gefärbt (der Maßstab beträgt 50 μm). Die Felder zeigen (A) ausschließlich Saline als Negativkontrolle, (B) die transkutane Immunisierung mit CT in Saline, (C) die transkutane Immunisierung mit CTB in Saline, und (D) die intradermale Injektion mit Tumor-Nekrose-Faktor-α (10 μg) als eine Positivkontrolle.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein transkutanes Immunisierungssystem liefert Mittel für spezialisierte Zellen (zum Beispiel Antigen-präsentierende Zellen, Lymphozyten), die eine Immunantwort hervorbringen (Bos, 1997). Diese Mittel, als Klasse betrachtet, werden Antigene genannt. Das Antigen kann aus Chemikalien zusammengesetzt sein, zum Beispiel aus einem Kohlenhydrat, Glycolipid, Glycoprotein, Lipid, Lipoprotein, Phospholipid, Polypeptid, Protein, aus Konjugaten derselben, oder aus einem anderen Material, das für die Auslösung einer Immunantwort bekannt ist. Das Antigen kann als ein vollständiger Organismus bereitgestellt werden, wie zum Beispiel ein Bakterium oder ein Virion; das Antigen kann aus einem Extrakt oder Lysat erhalten werden, entweder aus ganzen Zellen oder ausschließlich aus einer Membran; oder das Antigen kann chemisch synthetisiert oder durch ein rekombinantes Verfahren oder durch Inaktivierung eines Virus' hergestellt werden.
Die Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung sind im Stand der Technik gut bekannt, wodurch das Antigen und das Adjuvans mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger bzw. Vehikel vereinigt werden. Geeignete Vehikel und deren Herstellung sind zum Beispiel beschrieben in: Remington's Pharmaceutical Sciences von E. W. Martin. Solche Formulierungen werden eine wirksame Menge eines Antigens und eines Adjuvans, zusammen mit einer geeigneten Menge eines Vehikels, enthalten, um pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen herzustellen, die für die Verabreichung an einen Menschen oder an ein Tier geeignet sind. Die Formulierung kann in Form einer Creme, einer Emulsion, eines Gels, einer Lotion, einer Salbe, einer Paste, einer Lösung, einer Suspension oder anderen, im Stand der Technik bekannten Formen aufgetragen werden. Insbesondere sind jene Formulierungen bevorzugt, welche die Hydratisierung oder die Penetration der Haut oder beides zugleich steigern. Es können ebenso andere, pharmazeutisch verträgliche Zusatzstoffe enthalten sein, welche zum Beispiel Verdünnungsmittel, Bindemittel, Stabilisatoren, Konservierungsmittel und Farbstoffe umfassen.
Die zunehmende Hydratation des Stratum corneum wird die Geschwindigkeit der perkutanen Absorption eines gegebenen, gelösten Stoffes steigern (Roberts und Walker, 1993). Der Begriff „Penetrationsverstärker", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfasst nicht Substanzen, wie zum Beispiel Wasser, physiologische Puffer, Saline-Lösungen und Alkohole, welche die Haut nicht peforieren würden.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Mittel zur Immunisierung durch die unversehrte Haut bereitzustellen, ohne die Notwendigkeit, die Haut zu perforieren. Das transkutane Immunisierungs-System stellt ein Verfahren bereit, wobei die Antigene und das Adjuvans zu dem Immunsystem transportiert werden können, insbesondere zu den spezialisierten Antigen-präsentierenden Zellen, die unterhalb der Haut liegen, wie zum Beispiel zu den Langerhans-Zellen.
Ohne sich auf eine besondere Theorie festzulegen, sondern lediglich, um eine Erklärung für unsere Beobachtungen zu geben, nimmt man an, dass das transkutane Transport-System für die Immunisierung ein Antigen zu den Zellen des Immunsystems trägt, wo eine Immunantwort ausgelöst wird. Das Antigen kann die normalen, schützenden, äußeren Schichten der Haut durchdringen (d.h. das Stratum corneum), und eine Immunantwort direkt oder durch eine Antigen-präsentierende Zelle (zum Beispiel Makrophage, Gewebe-Makrophage, Langerhans-Zelle, dendritische Zelle, dermale dendritische Zelle, B-Lymphozyt oder Kupffer-Zelle) auslösen, die das verarbeitete Antigen einem T-Lymphozyten präsentiert. Gegebenenfalls kann das Antigen das Stratum corneum über ein Haarfolikel oder über eine Haut-Organelle (zum Beispiel eine Schweißdrüse, Öldrüse) durchdringen.
Die transkutane Immunisierung mit bakteriellen, ADP-ribosylierenden Exotoxinen (bAREs) kann die epidermalen Langerhans-Zellen zum Ziel haben, die als eine der am meisten wirksamen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) bekannt sind (Udey, 1997). Wir haben gefunden, dass bAREs die Langerhans-Zellen aktivieren, wenn sie epikutan auf der Haut in Saline-Lösung angewendet werden. Die Langerhans-Zellen beeinflussen die spezifische Immunantwort durch Phagozytose der Antigene, und durch Migration zu den Lymphknoten, wo sie als Antigen-präsentierende Zellen wirken, um das Antigen den Lymphozyten zu präsentieren (Udey, 1997), und somit eine starke Antikörper-Antwort auslösen. Obwohl die Haut im Allgemeinen als ein Hindernis für das Eindringen von Organismen angesehen wird, wird die Unvollkommenheit dieses Hindernisses anhand der zahlreichen Langerhans-Zellen bestätigt, die über die gesamte Epidermis verteilt sind, welche dazu bestimmt sind, die Immunantwort gegenüber Organismen, die über die Haut eindringen, zu manipulieren (Udey, 1997).
In der Veröffentlichung von Udey (1997) heißt es: „Die Langerhans-Zellen sind Zellen, die aus dem Knochenmark stammen und in allen geschichteten, schuppenartigen Epithelien von Säugern vorkommen. Sie umfassen die gesamte akzessorische Zellaktivität, die in einer nicht-entzündeten Epidermis vorliegt, und sie sind im jetzigen Modell wesentlich für den Beginn und die Ausbreitung der Immunantworten, die gegen epikutan aufgetragene Antigene gerichtet sind. Die Langerhans-Zellen sind Mitglieder einer Familie von potenten akzessorischen Zellen („dendritische Zellen"), die weit verbreitet sind, jedoch in Epithelien und festen Organen sowie in lymphartigem Gewebe selten vertreten sind..."
„Es wurde nunmehr erkannt, dass die Langerhans-Zellen (und vermutlich andere dendritische Zellen) einen Lebenszyklus mit mindestens zwei unterschiedlichen Stadien aufweisen. Langerhans-Zellen, die in der Epidermis lokalisiert sind, stellen ein regelmäßiges Netzwerk von Antigen-einfangenden „Wächter"-Zellen dar. Epidermale Langerhans-Zellen können Teilchen aufnehmen, einschließlich Mikroorganismen, und sind wirksame Verarbeiter von komplexen Antigenen. Jedoch exprimieren sie lediglich geringe Mengen von Antigenen der MHC-Klassen I und II, sowie von costimulierenden Molekülen (ICAM-1, B7-1 und B7-2), und sie sind mangelhafte Stimulatoren von noch nicht kontaktierten T-Zellen. Nach dem Kontakt mit dem Antigen werden manche Langerhans-Zellen aktiviert, verlassen die Epidermis und wandern zu T-Zell-abhängigen Bereichen von regionalen Lymphknoten, wo sie sich als reife dendritische Zellen niederlassen. Im Verlauf des Verlassens der Epidermis und des Wanderns der Lymphknoten zeigen Antigen-tragende, epidermale Langerhans-Zellen (nunmehr als „Botenzellen") einschneidende Veränderungen in der Morphologie, des Oberflächen-Phenotyps und der Funktion. Im Gegensatz zu epidermalen Langerhans-Zellen sind lymphoide, dendritische Zellen im Wesentlichen nicht phagozytisch und verarbeiten Protein-Antigene unzureichend, jedoch exprimieren sie hohe Mengen von MHC-Klasse I und Klasse II Antigenen sowie von verschiedenen costimulierenden Molekülen, und sie sind die wirksamsten Stimulatoren von natürlichen T-Zellen, die identifiziert wurden."
Wir stellen uns vor, dass die starke Antigen-präsentierende Fähigkeit der epidermalen Langerhans-Zellen für transkutan zugeführte Impfstoffe ausgenutzt werden kann. Eine transkutane Immunantwort, welche das Immunsystem der Haut verwendet, würde lediglich den Transport des Impf-Antigens zu den Langerhans-Zellen im Stratum corneum, (die äußerste Schicht der Haut, die aus verhornten Zellen und Lipiden besteht), über eine passive Diffusion und eine nachfolgende Aktivierung der Langerhans-Zellen erfordern, um das Antigen aufzunehmen, um zu den B-Zell-Folikeln und/oder zu den T-Zell-abhängigen Bereichen zu wandern, und um das Antigen den B- und/oder T-Zellen zu präsentieren (Sting) et al., 1989). Falls die Antigene, die von den bAREs verschieden sind (zum Beispiel BSA), in einer Phagozytose durch die Langerhans-Zellen aufgenommen werden sollen, dann könnten diese Antigene ebenso an die Lymphknoten für die Präsentation gegenüber den T-Zellen übergeben werden und anschließend eine Immunantwort auslösen, die spezifisch für dieses Antigen ist (zum Beispiel BSA). Somit ist die Aktivierung der Langerhans-Zellen, vermutlich durch ein bakterielles, ADP-ribosylierendes Exotoxin, durch ADP-ribosylierende, Exotoxin-bindende Untereinheiten (zum Beispiel Cholera-Toxin B-Untereinheit), oder durch eine andere, die Langerhans-Zellen aktivierende Substanz ein Merkmal der transkutanen Immunisierung.
Der Mechanismus der transkutanen Immunisierung über die Aktivierung der Langerhans-Zellen, die Wanderung und die Präsentation des Antigens wird deutlich anhand der Steigerung der Expression der MHC-Klasse II-Moleküle in den epidermalen Langerhans-Zellen aus den epidermalen Hautschichten gezeigt, die mit CT oder CTB transkutan immunisiert wurden. Darüber hinaus wird die Größenordnung der Antikörper-Antwort, welche durch die transkutane Immunisierung ausgelöst wird, sowie der Wechsel des Isotyps auf vorwiegend IgG-Antikörper im Allgemeinen mittels T-Helferzellen, die durch die Antigen-präsentierende Zellen, wie zum Beispiel Langerhans-Zellen oder dendritische Zellen (Janeway und Travers, 1996) stimuliert werden, und durch die Aktivierung sowohl des Th1- als auch des Th2-Weges erreicht, wie es aufgrund der Bildung von IgG1-Antikörpern und IgG2a-Antikörpern nahegelegt wird (Paul und Seder, 1994; Seder und Paul, 1994). Darüber hinaus wird die Vermehrung der T-Zellen durch das Antigen OVA in Mäusen gezeigt, die mit CT + OVA immunisiert wurden. In alternativer Weise kann eine starke Antikörper-Antwort durch ein Thymus-unabhängiges Antigen vom Typ 1 (TI-1) ausgelöst werden, welches die B-Zelle direkt aktiviert (Janeway und Travers, 1996).
Das Spektrum von besser bekannteren Immunantworten der Haut wird durch Kontaktdermatitis und Atopie dargestellt. Die Kontaktdermatitis, eine pathogene Manifestation der Aktivierung von Langerhans-Zellen, wird durch Langerhans-Zellen gesteuert, welche das Antigen durch Phagozytose aufnehmen, zu Lymphknoten wandern, das Antigen präsentieren, und T-Zellen für eine intensive, zerstörende, zelluläre Antwort sensibilisieren, die an der betroffenen Hautstelle auftritt (Dahl, 1996; Leung, 1997). Im Falle der atopischen Dermatitis können die Langerhans-Zellen in einer ähnlichen Art beteiligt sein, jedoch wurde sie mit Th2-Zellen identifiziert, und sie geht im Allgemeinen mit hohen Konzentrationen von IgE-Antikörpern einher (Dahl, 1996; Leung, 1997).
Die transkutane Immunisierung mit Cholera-Toxin und verwandten bAREs ist auf der anderen Seite eine neue Immunantwort, wobei oberflächliche und mikroskopische Hautbefunde nach der Immunisierung fehlen (d.h. nicht-entzündete Haut), die durch das Fehlen der Lymphozyten-Infiltration 24, 48 und 120 Stunden nach der Immunisierung mit Cholera-Toxin gezeigt wird. Dies weist darauf hin, dass die Langerhans-Zellen „die gesamte akzessorische Zellaktivität umfassen, die in einer nicht-entzündeten Epidermis vorhanden ist, und die im derzeitigen Modell für den Beginn und die Ausbreitung der Immunantworten wesentlich sind, die gegen epikutan aufgetragene Antigene gerichtet sind" (Udey, 1997). Die Einzigartigkeit der transkutanen Immunantwort wird hier ebenso sowohl durch die hohen Konzentrationen von Antigen-spezifischen IgG-Antikörpern, als auch durch den Typ der produzierten Antikörper (zum Beispiel IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 und IgA) und durch das Fehlen des anti-CT-Antikörpers von Typ IgE gekennzeichnet.
Somit haben wir gefunden, dass die aus Bakterien stammenden Toxine, die auf die Oberfläche der Haut aufgetragen werden, die Langerhans-Zellen oder andere Antigenpräsentierende Zellen aktivieren, und eine starke Immunantwort auslösen können, die sich in Form hoher Konzentrationen von Antigen-spezifischen, zirkulierenden IgG-Antikörpern äußert. Solche Adjuvantien können bei der transkutanen Immunisierung verwendet werden, um die Antwort der IgG-Antikörper auf Proteine zu steigern, die andernfalls für sich genommen nicht immunogen sind, wenn sie auf die Haut aufgetragen werden.
Die transkutane Beeinflussung der als Ziel dienenden Langerhans-Zellen kann ebenso verwendet werden, um ihre Antigen-präsentierende Funktion zu deaktivieren, und somit eine Immunisierung oder Sensibilisierung zu verhindern. Die Verfahren zur Deaktivierung der Langerhans-Zellen umfassen zum Beispiel die Verwendung von Interleukin-10 (Peguet-Navarro et al., 1995), eines monoklonalen Antikörpers gegenüber Interleukin-1β (Enk et al., 1993) oder die Abreicherung über Superantigene, wie zum Beispiel die durch das Enterotoxin A aus Staphylokokken (SEA) induzierte Abreicherung der epidermalen Langerhans-Zellen (Shankar et al., 1996).
Die transkutane Immunisierung kann über die das Gangliosid GM1 bindende Aktivität von CT, LT oder Untereinheiten, wie zum Beispiel CTB, ausgelöst werden (Craig und Cuatrecasas, 1975). Das Gangliosid GM1 ist ein ubiquitäres Glykolipid aus der Zellmembran, das in allen Säugetierzellen gefunden wird (Plotkin und Mortimer, 1994). Wenn die Pentamere CT-B-Untereinheit an die Zelloberfläche bindet, wird eine hydrophile Pore gebildet, welche der A-Untereinheit erlaubt, die Lipid-Doppelschicht zu durchdringen (Ribi et al., 1988).
Wir haben gezeigt, dass die transkutane Immunisierung durch CT oder CTB eine Aktivität zur Bindung des Gangliosids GM1 erfordern kann. Wenn Mäuse transkutan mit CT, CTA und CTB immunisiert wurden, führten nur CT und CTB zu einer Immunantwort. CTA enthält die Aktivität des ADP-ribosylierenden Exotoxins, jedoch waren nur CT und CTB, welche die Bindungsaktivität enthalten, in der Lage, eine Immunantwort auszulösen, was darauf hinweist, dass die B-Untereinheit notwendig und ausreichend war, um durch die Haut zu immunisieren. Wir schließen daraus, dass die Langerhans-Zellen oder eine andere Antigen-präsentierende Zelle durch CTG-Bindung auf ihrer Zelloberfläche aktiviert werden können.
ANTIGEN
Das Antigen der Erfindung kann durch rekombinante Mittel exprimiert werden, vorzugsweise als ein Fusionsprotein mit einem Affinitäts- oder Epitop-Anhang (Summers und Smith, 1987; Goeddel, 1990; Ausubel et al., 1996); eine chemische Synthese eines Oligopeptids, das entweder frei oder an Trägerproteine konjugiert ist, kann dazu verwendet werden, um das Antigen der Erfindung zu erhalten (Bodanszky, 1993; Wisdom, 1994). Die Oligopeptide werden als eine Art von Polypeptiden angesehen.
Oligopeptide mit einer Länge von 6 Resten bis 20 Resten sind bevorzugt. Polypeptide können ebenso als verzweigte Strukturen synthetisiert werden, wie zum Beispiel solche, die in den US-Patenten Nr. 5 229 490 und 5 390 111 offenbart sind. Die antigenen Peptide umfassen zum Beispiel synthetische oder rekombinante B-Zell- und T-Zell-Epitope, universelle T-Zell-Epitope, sowie gemischte T-Zell-Epitope aus einem Organismus oder Krankheitserreger und B-Zell-Epitope aus einem anderen.
Das Antigen, das durch rekombinante Mittel oder Peptidsynthese erhalten wird, sowie das Antigen der Erfindung, das aus natürlichen Quellen oder Extrakten erhalten wird, kann anhand der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Antigens gereinigt werden, vorzugsweise durch Fraktionierung oder Chromatographie (Janson und Ryden, 1989; Deutscher, 1990; Scopes, 1993).
Eine multivalente Antigen-Formulierung kann verwendet werden, um eine Immunantwort gegenüber mehr als einem Antigen zur gleichen Zeit auszulösen. Es können Konjugate verwendet werden, um eine Immunantwort gegenüber vielen verschiedenen Antigenen auszulösen, um die Immunantwort zu verstärken, oder beide können verwendet werden. Darüber hinaus können Toxine in ihrer Wirkung durch den Einsatz von Toxoiden verstärkt werden, oder Toxoide können in ihrer Wirkung durch den Einsatz von Toxinen verstärkt werden. Die transkutane Immunisierung kann verwendet werden, um die Immunantworten zu verstärken, die anfänglich durch andere Arten der Immunisierung ausgelöst wurden, wie zum Beispiel durch Injektion, oder auf oralem oder intranasalem Weg.
Das Antigen umfasst zum Beispiel Toxine, Toxoide, Untereinheiten derselben oder Kombinationen derselben (zum Beispiel Cholera-Toxin, Tetanus-Toxoid).
Das Antigen kann in Wasser, in einem Lösungsmittel, wie zum Beispiel Methanol, oder in einem Puffer löslich gemacht werden. Geeignete Puffer umfassen Phosphat-gepufferte, Calcium- und Magnesium-freie Saline (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-freie PBS), normale Saline (150 mM NaCl in Wasser) und Tris-Puffer; sie sind jedoch nicht darauf beschränkt. Das Antigen, das in einem neutralen Puffer nicht löslich ist, kann in 10 mM Essigsäure löslich gemacht werden und anschließend auf das gewünschte Volumen mit einem neutralen Puffer, wie zum Beispiel PBS, verdünnt werden. Falls das Antigen lediglich bei einem sauren pH-Wert löslich ist, kann Acetat-PBS bei einem sauren pH-Wert als Verdünnungsmittel nach der Solubilisierung in verdünnter Essigsäure verwendet werden. Glycerin kann ein geeigneter, nicht-wässriger Puffer für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung sein.
Falls das Antigen, wie zum Beispiel der Hepatitis A Virus, nicht für sich betrachtet löslich ist, kann das Antigen in der Formulierung in einer Suspension oder auch als Aggregat vorliegen.
Ein hydrophobes Antigen kann durch ein grenzflächenaktives Mittel solubilisiert werden, zum Beispiel ein Polypeptid, das eine membranübergreifende Domäne enthält. Darüber hinaus kann im Falle von Formulierungen, die Liposomen enthalten, ein Antigen in einer Lösung eines grenzflächenaktiven Mittels (zum Beispiel ein Zellmembran-Extrakt) mit Lipiden gemischt werden, und die Liposomen können anschließend durch Entfernung des grenzflächenaktiven Mittels durch Verdünnung, Dialyse oder Säulenchromatographie gebildet werden. Bestimmte Antigene, wie zum Beispiel jene aus einem Virus (zum Beispiel Hepatitis A), brauchen nicht per se löslich zu sein, sondern sie können direkt in ein Liposom in Form eines Virosoms eingebaut werden (Morein und Simons, 1985).
Plotkin und Mortimer (1994) stellen Antigene bereit, die dazu verwendet werden können, um Tiere und Menschen zu impfen, um eine Immunantwort auszulösen, die für bestimmte Pathogene spezifisch ist, sowie Verfahren zur Herstellung eines Antigens, zur Bestimmung einer geeigneten Dosis des Antigens, zur Bestimmung der Auslösung einer Immunantwort mittels eines Assays, und zur Behandlung einer Infektion durch ein Pathogen (zum Beispiel Bakterium, Virus, Pilz oder Parasit).
Bakterien umfassen zum Beispiel: Anthrax, Campylobacter, Cholera, Diphtherie, enterotoxigener E. coli, Giardia, Gonokokken, Helicobacter pylori (Lee und Chef, 1994), Haemophilus influenzae B, nicht typisierbarer Haemophilus influenzae, Meningokokken, Keuchhusten (Pertussis), Pneumokokken, Salmonellen, Shigellen, Streptococcus B, Streptokokken der Gruppe A, Tetanus, Vibrio cholerae, Yersinia, Staphylokokken, Pseudomonas-Spezies und Clostridien-Spezies.
Viren umfassen zum Beispiel: Adenovirus, Dengue-Fieber-Virus Serotypen 1 bis 4 (Delenda et al., 1994; Fonseca et al., 1994; Smucny et al., 1995), Ebola-Virus (Jahrling et al., 1996), Enteroviren, Hepatitis-Viren Serotyp A bis E (Slum, 1995; Katkov, 1996; Lieberman und Greenberg, 1996; Mast, 1996; Shafara et al., 1995; Smedila et al., 1994; US-Patente Nr. 5 314 808 und 5 436 126), Herpes simplex Virus 1 oder 2, humaner Immunschwäche-Virus (Deprez et al., 1996), Influenza, japanische Pferde-Encephalitis, Masern, das Norwalk-Agenz, Papilloma-Viren, Parvovirus B19, Polio-Virus, Tollwut, Rota-Viren, Röteln, Rubeola, Kuhpocken-Viren, Konstrukte von Kuhpocken-Viren, die Gene enthalten, welche für andere Antigene kodieren, wie zum Beispiel Malaria-Antigene, Varicella und Gelbfieber.
Parasiten umfassen zum Beispiel: Entamoeba histolytica (Zhang et al., 1995), Plasmodium (Bathurst et al., 1993; Chang et al., 1989, 1992, 1994; Fries et al., 1992a, 1992b; Herrington et al., 1991; Khusmith et al., 1991; Malik et al., 1991; Migliorini et al., 1993; Pessi et al., 1991; Tam, 1988; Vreden et al., 1991; White et al., 1993; Wiesmüller et al., 1991), Leishmania (Frankenburg et al., 1996), Toxoplasmose und Würmer.
Die Antigene können ebenso jene umfassen, die in der biologischen Kriegsführung verwendet werden, wie zum Beispiel Ricin, für das Schutz durch Antikörper erhalten werden kann.
ADJUVANS
Die Formulierung kann ebenso ein Adjuvans enthalten, obwohl ein einzelnes Molekül sowohl die Eigenschaften eines Adjuvans als auch diejenigen eines Antigens enthalten kann (zum Beispiel das Cholera-Toxin) (Elson und Dertzbaugh, 1994). Die Adjuvantien sind Substanzen, die verwendet werden können, um eine Antigen-spezifische Immunantwort spezifisch oder nichtspezifisch zu verstärken. In üblicher Weise werden das Adjuvans und die Formulierungen vor der Präsentation des Antigens gemischt, jedoch können sie in alternativer Weise getrennt innerhalb eines kurzen Zeitintervalls präsentiert werden.
Die Adjuvantien umfassen zum Beispiel eine Öl-Emulsion (zum Beispiel vollständiges oder unvollständiges Freund'sches Adjuvans), ein Chemokin (zum Beispiel Defensine 1 oder 2, RANTES, MIP1-α, MIP-2, Interleukin-8) oder ein Zytokin (zum Beispiel Interleu kin-1β, -2, -6, -10 oder -12; γ-Interferon; Tumor-Nekrose-Factor-α; oder Granulozyten-Monozyten Kolonie-stimulierender Faktor) (Übersichtsartikel bei Nohria und Rubin, 1994), ein Derivat eines Muramyl-Dipeptids (zum Beispiel Murabutid, Threonyl-MDP oder Muramyl-Tripeptid), ein Hitzeschock-Protein oder ein Derivat, ein Derivat von Leishmania major LeIF (Skeiky et al., 1995), Cholera-Toxin oder Cholera-Toxin B, ein Derivat eines Lipopolysaccharids (LPS) (zum Beispiel Lipid A oder Monophosphoryl-Lipid A), oder ein Superantigen (Saloga et al., 1996). Bei Richards et al., (1995), sind ebenfalls Adjuvantien beschrieben, die nützlich für die Immunisierung sind.
Ein Adjuvans kann ausgewählt werden, um vorzugsweise die Bildung von Antikörpern oder von zellulären Effektoren, spezifischen Antikörper-Isotypen (zum Beispiel IgM, IgD, IgA1, IgA2, sekretorisches IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, und/oder IgG4) oder spezifischen T-Zell-Untermengen (zum Beispiel CTL, Th1, Th2 und/oder T_DTH) auszulösen (Glenn et al., 1995).
Das Cholera-Toxin ist ein bakterielles Exotoxin aus der Familie der ADP-ribosylierenden Exotoxine (bezeichnet als bAREs). Die meisten bAREs sind als A:B-Dimer mit einer bindenden 8-Untereinheit und einer A-Untereinheit organisiert, welche die ADP-Ribosyltransferase enthält. Solche Toxine umfassen das Diphtherie-Toxin, Pseudomonas Exotoxin A, das Cholera-Toxin (CT), das hitzelabile Enterotoxin aus E. coli (LT), das Pertussis-Toxin, das Toxin C2 aus C. botulinum, das Toxin C3 aus C. botulinum, das Exoenzym aus C. limosum, das Exoenzym aus B. cereus, das Exotoxin S aus Pseudomonas, EDIN aus Staphylococcus aureus und das Toxin aus B. sphaericus.
Das Cholera-Toxin ist ein Beispiel für ein bARE, das aus A- und B-Untereinheiten organisiert ist. Die B-Untereinheit ist die bindende Untereinheit und besteht aus einem Pentamer von B-Untereinheiten, das nicht kovalent an die A-Untereinheit gebunden ist. Das Pentamer der B-Untereinheit ist in einer symmetrischen Struktur mit der Gestalt eines Krapfens angeordnet, die an das GM₁-Gangliosid auf der Zielzelle bindet. Die A-Untereinheit dient dazu, die α-Untereinheit einer Untermenge des heterotrimeren GTP-Proteins (G-Proteins), einschließlich des Gs-Proteins, mit ADP zu ribosylieren, was zu erhöhten intrazellulären Werten von zyklischem AMP führt. Dies regt die Freisetzung von Ionen und Flüssigkeit aus den Darmzellen im Falle von Cholera an.
Das Cholera-Toxin (CT) und seine B-Untereinheit (CTB) besitzen Eigenschaften eines Adjuvans, wenn sie entweder als intramuskuläres oder als orales Immunogen verwendet werden (Elson und Dertzbaugh, 1994; Trach et al., 1997). Ein anderes Antigen, das hitzelabile Enterotoxin aus E. coli(LT) ist zu 80 % homolog auf dem Aminosäure-Niveau mit CT und besitzt ähnliche Bindungseigenschaften; es scheint ebenso an den GM₁-Gangliosid-Rezeptor im Darm zu binden, und besitzt ähnliche ADP-ribosylierende Exotoxin-Aktivitäten. Ein anderes bARE, das Exotoxin A aus Pseudomonas (ETA), bindet an das Protein, das mit dem α₂-Macroglobulin-Rezeptor und dem Rezeptor für Lipoproteine mit niedriger Dichte in Beziehung steht (Kounnas et al., 1992). Eine Übersicht über die bAREs geben Krueger und Barbieri, 1995.
Die Toxizität von CT, das auf oralem, nasalem und intramuskulärem Weg verabreicht wird, begrenzt die Dosis, mit der es als ein Adjuvans eingesetzt werden kann. In einem vergleichenden Versuch, bei dem CT intramuskulär injiziert wurde, wurde eine ausgedehnte Schwellung an der Stelle der Injektion ausgelöst. Im Gegensatz dazu verursachten äquivalente oder größere Dosen von CT, die auf die Haut aufgetragen wurden, keine Toxizität.
Die nachfolgenden Beispiele zeigen, dass das Cholera-Toxin (CT), seine B-Untereinheit (CTB), das hitzelabile Enterotoxin aus E. coli (LT) und das Pertussis-Toxin starke Adjuvantien für die transkutane Immunisierung darstellen, die zu hohen Konzentrationen von IgG-Antikörpern, jedoch nicht von IgE-Antikörpern führen. Ebenso wurde gezeigt, dass CTB ohne CT ebenso hohe Konzentrationen von IgG-Antikörpern herbeiführen kann. Somit können sowohl bAREs als auch ein Derivat derselben wirksam immunisieren, wenn sie epikutan auf die Haut in einer einfachen Lösung aufgetragen werden. Darüber hinaus zeigen diese Beispiele, dass CT, CTB und bAREs nicht nur als Adjuvans sondern auch als Antigen wirken können.
Wenn ein Adjuvans, wie zum Beispiel CT, mit BSA gemischt wird, welches ein Protein darstellt, das üblicherweise nicht immunogen ist, wenn es auf die Haut aufgetragen wird, wird die Bildung von anti-BSA-Antikörpern ausgelöst. Eine Immunantwort auf das Diphtherie-Toxoid wurde ausgelöst, indem das Pertussis-Toxin als Adjuvans verwendet wurde, jedoch nicht mit dem Diphtherie-Toxoid allein. Somit können bAREs als Adju vantien für nicht immunogene Proteine in einem transkutanen Immunisierungssystem wirken.
Andere Proteine können ebenso nicht nur als Adjuvans sondern auch als Antigen wirken. Zum Beispiel enthält das Präparat FLUZONE (Lederle), das heißt das chemisch gespaltene Virion eines Impfstoffs, wie Influenza A und B, die Proteine Neuraminidase und Hämagglutinin, die in hohem Maße immunogen sind, es trägt zum Schutz bei und kann wirksam durch die Haut immunisieren, wobei es als sein eigenes Adjuvans und Antigen wirkt. Die Toxoide, wie zum Beispiel das Diphtherie-Toxoid, welches unter Verwendung von Formalin zu einem Toxoid gemacht wurde, das Pertussis-Toxoid, welches unter Verwendung von Wasserstoffperoxid zu einem Toxoid gemacht wurde, oder mutierte Toxine, wie zum Beispiel das Cholera-Toxin oder das hitzelabile Enterotoxin aus E. coli; die unter Verwendung eines genetischen Verfahrens zu einem Toxoid gemacht wurden, um die Ribosyl-Transferase-Aktivität zu zerstören, können weiterhin Eigenschaften eines Adjuvans besitzen und nicht nur als Antigen sondern auch als Adjuvans wirken.
Der Schutz gegen die lebensbedrohenden Infektionen Diphtherie, Keuchhusten und Starrkrampf (diphtheria, Pertussis and tetanus; DPT) kann erreicht werden, indem hohe Konzentrationen von zirkulierenden anti-Toxin-Antikörpern herbeigeführt werden. Keuchhusten kann eine Ausnahme in dem Sinn darstellen, dass manche Forscher glauben, für den Schutz seien Antikörper nötig, die gegen andere Abschnitte des eindringenden Organismus gerichtet sind, obwohl dies umstritten ist (siehe Schneerson et al., 1996), und die neueste Generation der zellfreien Keuchhusten-Impfstoffe das Pertussis-Toxin als einen Bestandteil des Impfstoffes aufweisen (Krueger und Barbieri, 1995). Die pathologischen Erscheinungen der Krankheiten, die durch das Pertussis-Toxin verursacht werden, stehen in unmittelbarer Beziehung mit den Wirkungen ihrer Toxine, und die anti-Toxin-Antikörper können ganz gewiss eine Rolle beim Schutz spielen (Schneerson et al., 1996).
Im Allgemeinen können die Toxine chemisch inaktiviert werden, um Toxoide zu bilden, die weniger toxisch sind, jedoch immunogen bleiben. Wir stellen uns vor, dass das transkutane Immunisierungssystem, das Immunogene und Adjuvantien auf Basis eines Toxins verwendet, anti-Toxin-Konzentrationen erreichen kann, die für einen Schutz gegenüber diesen Krankheiten ausreichend sind. Die Bildung der anti-Toxin-Antikörper kann durch Immunisierung mittels Toxinen ausgelöst werden, oder durch die Toxoide selbst, die durch ein genetisches Verfahren weniger toxisch gemacht wurden, oder durch Toxoide und Adjuvantien, wie zum Beispiel CT, oder durch Toxoide allein. Die genetisch zu einem Toxoid gemachten Toxine, welche eine veränderte ADP-ribosylierende Exotoxin-Aktivität, jedoch keine bindende Aktivität aufweisen, stellt man sich so vor, als seien sie besonders nützlich als nichttoxische Aktivatoren der Antigen-präsentierenden Zellen, die in der transkutanen Immunisierung verwendet werden.
Wir stellen uns vor, dass CT ebenso als ein Adjuvans wirken kann, um Antigen-spezifische CTLs durch transkutane Immunisierung zu induzieren (siehe Bowen et al., 1994; Porgador et al., 1997, für die Verwendung von CT als Adjuvans bei der oralen Immunisierung).
Das bARE-Adjuvans kann chemisch mit anderen Antigenen konjugiert werden, einschließlich zum Beispiel mit Antigenen von Kohlenhydraten, Polypeptiden, Glykolipiden und Glykoproteinen. Von einer chemischen Konjugation mit Toxinen, ihren Untereinheiten oder Toxoiden mit diesen Antigenen würde man erwarten, dass die Immunantwort gegenüber diesen Antigenen gesteigert wird, wenn sie epikutan aufgetragen werden.
Um das Problem der Toxizität der Toxine zu überwinden (zum Beispiel ist Diphtherie-Toxin als so toxisch bekannt, dass ein Molekül eine Zelle abtöten kann), und um die Schwierigkeit des Arbeitens mit solch starken Toxinen, wie zum Beispiel Tetanus, zu überwinden, haben manche Wissenschaftler eine rekombinante Vorgehensweise eingeschlagen, um genetisch hergestellte Toxoide herzustellen. Dies beruht auf der Inaktivierung der katalytischen Aktivität der ADP-Ribosyl-Transferase durch genetische Deletion. Diese Toxine behalten die Bindungsfähigkeiten des natürlichen Toxins bei, jedoch fehlt ihnen deren Toxizität. Diese Vorgehensweise ist beschrieben von Burnette et al. (1994), Rappuoli et al. (1995) und Rappuoli et al. (1996). Solche Exotoxine, die genetisch zu Toxoiden gemacht wurden, können nützlich für das transkutane Immunisierungssystem sein, in dem Sinn, dass sie keine Sicherheitsbedenken hervorrufen, da die Toxoide nicht als toxisch angesehen werden würden. Sie können nicht nur als Antigene sondern auch als Adjuvantien wirken, die die Immunantwort gegenüber sich selbst oder zugegebenen Antigenen steigern. Darüber hinaus existieren einige Verfahren für Toxine, die chemisch zu Toxoiden gemacht wurden, welche sich dem gleichen Problem widmen (Schneerson et al., 1996). In alternativer Weise können Fragmente des Toxins oder der Toxoide verwendet werden, wie zum Beispiel das C-Fragment von Tetanus. Diese Verfahren könnten für bestimmte Anwendungen, insbesondere pädiatrische Anwendungen, wichtig sein, bei denen aufgenommene Toxine (zum Beispiel Diphtherie-Toxin) möglicherweise nachteilige Reaktionen hervorrufen können.
Gegebenenfalls kann ein Aktivator für die Langerhans-Zellen als ein Adjuvans verwendet werden. Beispiele für solche Aktivatoren umfassen: Induktoren des Hitzeschock-Proteins; Kontakt-Sensibilisatoren (zum Beispiel Trinitrochlorbenzol, Dinitrofluorbenzol, Stickstoff-Senfgas, Pentadecylkatechin); Toxine (zum Beispiel Shiga-Toxin, Staphylokokkus-Enterotoxin B); Lipopolysaccharide, Lipid A oder Derivate desselben; bakterielle DNA (Stacey et al., 1996); Zytokine (zum Beispiel Tumor-Nekrose-Faktor-α, Interleukin-1β, -10, -12) und Chemokine (zum Beispiel Defensine 1 oder 2, RANTES, MIP-1α, MIP-2, Interleukin-8).
Eine Kombination von verschiedenen Adjuvantien kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel könnte eine bakterielle DNA, die CpG-Nucleotid-Sequenzen enthält, und ein ADP-ribosylierendes Exotoxin verwendet werden, um die Antwort der T-Helferzellen auf die transkutan verabreichten Antigene zu steuern. Somit könnten die Th1- oder Th2-ähnlichen Antworten auf Antigene mit CT als Adjuvans durch die Verwendung von bakterieller DNA, die nicht-methylierte CpG-Bereiche enthält, oder von anderen Proteinen, wie zum Beispiel LeIF, oder Calciumkanal-Blocker, umgeschaltet werden.
CpG-Bereiche gehören zu einer Klasse von Strukturen, die Muster aufweisen, welche es dem Immunsystem ermöglichen, ihre pathogenen Ursprünge zu erkennen, um das angeborene Immunsystem zu stimulieren, so dass es zu adaptiven Immunantworten kommt (Medzhitov und Janeway, Curr. Opin. Immunol., 9, 4 – 9, 1997). Diese Strukturen werden Pathogen-assoziierte, molekulare Muster (pathogen-associated molecular Patterns; PAMPs) genannt, und sie umfassen Lipopolysaccharide, Teichonsäuren, nicht-methylierte CpG-Motive, doppelsträngige RNA und Mannine.
PAMPs induzieren endogene Signale, welche die entzündliche Antwort vermitteln können, wirken als Co-Stimulatoren der T-Zellfunktion und kontrollieren die Effektor-Funk tion. Die Fähigkeit der PAMPs, diese Antworten auszulösen, spielen eine Rolle in ihrem Potential als Adjuvantien, und ihre Ziele sind APCs, wie zum Beispiel Makrophagen und dendritische Zellen. Die Antigen-präsentierenden Zellen der Haut könnten in ähnlicher Weise durch PAMPs stimuliert werden, die durch die Haut übertragen wurden. Zum Beispiel könnten Langerhans-Zellen, ein Typ einer dendritischen Zelle, durch ein PAMP in Lösung auf der Haut mit einem Molekül, das bei der transkutanen Verabreichung schwach immunogen ist, aktiviert und zur Wanderung veranlasst werden, und sie könnten dieses schwach immunogene Molekül den T-Zellen in dem Lymphknoten präsentieren, und somit eine Antikörperantwort auf das schwach immunogene Molekül auslösen. PAMPs könnten ebenso in Verbindung mit anderen Haut-Adjuvantien verwendet werden, wie zum Beispiel Cholera-Toxin, um die Bildung unterschiedlicher costimulierender Moleküle auszulösen, und unterschiedliche Effektor-Funktionen zu kontrollieren, um die Immunantwort zu steuern, zum Beispiel von einer Th2- zu einer Th1-Antwort.
Falls ein immunisierendes Antigen ausreichende Eigenschaften zur Aktivierung einer Langerhans-Zelle aufweist, dann ist ein gesondertes Adjuvans nicht erforderlich, wie im Falle von CT, das sowohl ein Antigen als auch ein Adjuvans darstellt. Man möge sich vorstellen, dass Präparationen aus ganzen Zellen, lebenden Viren, abgeschwächten Viren, DNA-Plasmiden und bakterieller DNA ausreichend sein könnten, um eine transkutane Immunisierung zu bewirken. Es kann möglich sein, geringe Konzentrationen von Kontakt-Sensibilisatoren oder anderen Aktivatoren der Langerhans-Zellen zu verwenden, um eine Immunantwort auszulösen, ohne Hautverletzungen herbeizuführen.
LIPOSOMEN UND IHRE HERSTELLUNG
Liposomen sind abgeschlossene Bläschen, die einen inneren wässerigen Raum umgeben. Die innere Abteilung ist vom äußeren Medium durch eine Lipid-Doppelschicht getrennt, die aus einzelnen Lipidmolekülen zusammengesetzt ist. In der vorliegenden Erfindung kann das Antigen durch die unversehrte Haut den speziellen Zellen des Immunsystems zugeführt werden, wobei eine Antigen-spezifische Immunantwort ausgelöst wird. Die transkutane Immunisierung kann durch Verwendung von Liposomen bewirkt werden; wie jedoch in den Beispielen gezeigt, sind Liposomen nicht erforderlich, um eine Antigen-spezifische Immunantwort auszulösen.
Die Liposomen können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren und Membran-Lipiden hergestellt werden (Übersichtsartikel von Gregoriadis, 1993). Die Liposomen können im voraus gebildet und anschließend mit dem Antigen vermischt werden. Das Antigen kann gelöst oder suspendiert werden und anschließend zu den (a) vorgeformten Liposomen in einem lyophilisierten Zustand, (b) zu den getrockneten Lipiden als eine quellende Lösung oder Suspension oder (c) zu der Lösung der verwendeten Lipide gegeben werden, um Liposomen zu bilden. Sie können ebenso aus Lipiden gebildet werden, die aus dem Stratum corneum extrahiert wurden, einschließlich zum Beispiel Ceramid- und Cholesterin-Derivaten (Wertz, 1992).
Chloroform ist ein bevorzugtes Lösungsmittel für Lipide, jedoch kann es sich bei der Lagerung zersetzen. Daher wird in Abständen von 1 bis 3 Monaten das Chloroform vor seiner Verwendung als Lösungsmittel zur Bildung von Liposomen erneut destilliert. Nach der Destillation können 0,7% Ethanol als Konservierungsmittel zugegeben werden. Ethanol und Methanol sind andere geeignete Lösungsmittel.
Die Lipid-Lösung, welche verwendet wird, um Liposomen zu bilden, wird in einen Rundkolben gegeben. Birnenförmige Siedegefäße sind bevorzugt, insbesondere solche Gefäße, die von der Firma Lurex Scientific (Vineland, NJ, Kat. Nr. JM-5490) vertrieben werden. Das Volumen des Gefäßes sollte mehr als das Zehnfache des Volumens der vorweggenommenen wässerigen Suspension der Liposomen betragen, um ein geeignetes Rühren während der Liposomenbildung zu ermöglichen.
Unter Verwendung eines Rotationsverdampfers wird das Lösungsmittel bei 37°C unter Unterdruck für 10 Minuten mit einem Filter-Saugapparat entfernt, der mit einem Wasserstrahl verbunden ist. Das Gefäß wird darüber hinaus unter leichtem Vakuum getrocknet (d.h., weniger als 50 mm Hg) für 1 Stunde in einem Exsikkator.
Um das Antigen in Liposomen zu verkapseln, kann eine wässerige Lösung, die das Antigen enthält, zu den lyophilisierten Liposomen-Lipiden in einem Volumen gegeben werden, das zu einer Konzentration von annähernd 200 mM in Bezug auf die Liposomen-Lipide führt, und geschüttelt oder verwirbelt werden, bis alle getrockneten Liposomen-Lipide befeuchtet sind. Die Mischung aus Liposomen und Antigen kann anschließend für 18 Stunden bis 72 Stunden bei 4°C inkubiert werden. Die Liposomen-Antigen-Formulie rung kann unmittelbar verwendet werden oder für einige Jahre gelagert werden. Es ist bevorzugt, eine solche Formulierung unmittelbar im transkutanen Immunisierungssystem zu verwenden, ohne das nicht-verkapselte Antigen zu entfernen. Verfahren, wie zum Beispiel die Behandlung im Ultraschallbad, können verwendet werden, um die Größe der Liposomen herabzusetzen, welche die transkutane Immunisierung steigern kann.
Die Liposomen können wie vorstehend beschrieben gebildet werden, jedoch ohne Zugabe eines Antigens zu der wässerigen Lösung. Das Antigen kann anschließend zu den im Voraus gebildeten Liposomen gegeben werden, und daher würde das Antigen in Lösung vorliegen und/oder mit den Liposomen assoziiert sein, jedoch nicht durch diese verkapselt sein. Dieses Verfahren zur Herstellung einer Liposomen enthaltenden Formulierung ist aufgrund seiner Einfachheit bevorzugt. Die Verfahren, wie zum Beispiel die Behandlung in einem Ultraschallbad, können verwendet werden, um die Größe und/oder den schichtartigen Aufbau der Liposomen zu verändern, und so die Immunisierung zu steigern.
Obwohl die Hydratation des Stratum corneum für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, kann sie durch die Zugabe von Liposomen zu der Formulierung gesteigert werden. Die Liposomen wurden als Träger mit Adjuvantien verwendet, um die Immunantwort auf diejenigen Antigene zu steigern, welche mit Liposomen gemischt, darin verkapselt, damit verknüpft oder mit ihnen assoziiert sind.
TRANSKUTANER TRANSPORT EINES ANTIGENS
Eine wirksame Immunisierung kann mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden, da der transkutane Transport des Antigens die das Ziel darstellenden Langerhans-Zellen treffen kann. Diese Zellen werden im Überfluss in der Haut gefunden und sind effiziente Antigen-präsentierende Zellen, die zu einem T-Zell-Gedächtnis und zu starken Immunantworten führen (Udey, 1997). Aufgrund des Vorliegens einer großen Zahl von Langerhans-Zellen in der Haut kann die Wirksamkeit des transkutanen Transports mit der Oberfläche in Beziehung stehen, die dem Antigen und dem Adjuvans ausgesetzt war. Tatsächlich kann der Grund, weshalb die transkutane Immunisierung so wirksam ist, darin liegen, dass sie auf eine größere Zahl von diesen Zellen trifft, welche die Antigene wirksam präsentieren, als im Falle der intramuskulären Immunisierung. Jedoch kann auch eine geringe Zahl von Langerhans-Zellen oder dendritischen Zellen für die Immunisierung ausreichend sein.
Wir stellen uns vor, dass die vorliegende Erfindung den Zugang zur Immunisierung steigert, während sie eine starke Immunantwort herbeiführt. Da die transkutane Immunisierung keine Durchdringung der Haut und die damit verbundenen Komplikationen und Schwierigkeiten beinhaltet, können die Anforderungen an das ausgebildete Personal, die sterilen Verfahren und die sterile Ausrüstung gesenkt werden. Somit werden die Hindernisse für eine Immunisierung an vielen verschiedenen Stellen oder für viele verschiedene Immunisierungen gesenkt. Die Immunisierung durch eine einzelne Anwendung der Formulierung ist ebenso ins Auge gefasst.
Die Immunisierung kann erreicht werden, indem eine epikutane Anwendung einer einfachen Lösung des Antigens und des Adjuvans' vorgenommen wird, die in einer Gaze unter einem abdeckenden Pflaster imprägniert sind, oder indem andere Pflaster-Verfahren verwendet werden; Cremes, Tauch-Formulierungen, Salben und Sprays sind andere mögliche Verfahren der Anwendung. Die Immunisierung könnte von nicht ausgebildetem Personal vorgenommen werden, und sie ist auch für die Selbstanwendung zugänglich. Es könnte sich eine Immunisierung in einem großen Maßstab ergeben, wenn die leichte Zugänglichkeit der Immunisierung gegeben ist. Darüber hinaus würde ein einfaches Impfverfahren den Zugang zur Immunisierung für pädiatrische Patienten und ältere Personen verbessern, sowie für Bevölkerungen in den Ländern der Dritten Welt.
In ähnlicher Weise könnten Tiere unter Verwendung der vorliegenden Erfindung immunisiert werden. Die Auftragung an bestimmten anatomischen Bereichen, wie zum Beispiel dem Ohr, dem Bauch, der Pfote, der Bindehaut, der intertriginösen Bereiche oder dem Analbereich, oder das Eintauchen oder Untertauchen könnten verwendet werden.
Im Falle früherer Impfstoffe wurden ihre Formulierungen durch die Haut mit Kanülen injiziert. Die Injektion der Impfstoffe unter Verwendung von Kanülen bringt gewisse Nachteile mit sich, einschließlich des Schmerzes, der mit Injektionen einhergeht, des Bedürfnisses nach sterilen Kanülen und Spritzen, nach ausgebildetem medizinischen Personal, um den Impfstoff zu verabreichen, der Unannehmlichkeit durch die Injektion und mögliche Komplikationen, die sich aus der Punktierung der Haut mit der Kanüle ergeben. Die Immunisierung durch die Haut ohne die Verwendung von Kanülen (d.h., die transkutane Immunisierung) stellt einen großen Vorteil für den Transport des Impfstoffes unter Vermeidung der vorstehend erwähnten Nachteile dar.
Das transkutane Transport-System der Erfindung ist ebenso nicht mit der Durchdringung der unversehrten Haut durch Ultraschall oder elektrische Energie befasst. Ein solches System, welches ein elektrisches Feld benutzt, um einen dielektrischen Durchschlag des Stratum corneum herbeizuführen, ist in US-Patent Nr. 5 464 386 offenbart.
Darüber hinaus kann die transkutante Immunisierung einer Immunisierung unter Verwendung von Kanülen überlegen sein, da durch die Verwendung von mehreren Bereichen auf mehrere Immunzellen gezielt werden könnte, die auf große Oberflächenbereiche der Haut abzielen. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Antigens, die ausreichend ist, um eine Immunantwort herbeizuführen, kann transkutan entweder an einer einzelnen Stelle der Haut oder über eine Fläche der unversehrten Haut, die sich über einen Bereich von mehrfachen ableitenden Lymphknoten erstreckt, zugeführt werden (zum Beispiel am Hals, an den Achseln, an der Leiste, am Ellbogen, am Knie und jenen des Bauch- und Brustraums). Solche Stellen, die in der Nähe von zahlreichen unterschiedlichen Lymphknoten an Stellen über den gesamten Körper liegen, werden einen sehr weit verbreiteten Anreiz für das Immunsystem liefern, als wenn eine geringe Menge eines Antigens an einem einzelnen Ort durch eine intradermale subkutane oder intramuskuläre Injektion injiziert wird.
Das Antigen, das durch die Haut hindurch oder in diese eintritt, kann den Antigen-präsentierenden Zellen begegnen, welche das Antigen auf eine Weise verarbeiten, die eine Immunantwort hervorruft. Viele verschiedene Immunisierungsstellen können eine größere Zahl von Antigen-präsentierenden Zellen anziehen, und die größere Population der Antigen-präsentierenden Zellen, die angezogen wurden, würde zu einer größeren Induktion der Immunantwort führen. Die transkutane Immunisierung kann die Anwendung in enger Nachbarschaft zur Position eines ableitenden Lymphknotens ermöglichen, und dadurch die Wirksamkeit oder die Stärke der Immunisierung verbessern. Es ist vorstellbar, dass die Absorption durch die Haut das Antigen zu den phagozytischen Zellen der Haut transportieren kann, wie zum Beispiel zu den dermalen dendritischen Zellen, zu den Makrophagen und anderen Antigen-präsentierenden Zellen der Haut; das Antigen kann ebenso zu den phagozytischen Zellen der Leber, der Milz und des Knochenmarks transportiert werden, die dafür bekannt sind, als Antigen-präsentierende Zellen über den Kreislauf oder das lymphatische System zu dienen. Das Ergebnis würde eine ausgedehnte Verteilung des Antigens an die Antigen-präsentierenden Zellen in einem Ausmaß darstellen, welches durch herkömmliche Immunisierungspraktiken nur selten, wenn überhaupt, erreicht würde.
Das transkutane Immunisierungssystem kann unmittelbar auf die Haut aufgetragen werden, und man lässt es an der Luft trocknen; es kann in die Haut oder die Kopfhaut eingerieben werden, und an Ort und Stelle mit einem Verband, Pflaster oder einem absorbierenden Material gehalten werden; es kann in anderer Weise durch eine Vorrichtung, wie zum Beispiel durch einen Strumpf, einen Pantoffel, einen Handschuh oder ein Hemd, gehalten werden; oder es kann auf die Haut gesprüht werden, um den Kontakt mit der Haut zu maximieren. Die Formulierung kann in einem absorbierenden Verband oder in Form einer Gaze angewendet werden. Die Formulierung kann mit einem abdeckenden Verband bedeckt werden, wie zum Beispiel in einer Emulsion einer Antigen-Lösung und AQUAPHOR (Mineralfett, Mineralöl, Mineralwachs, Wollwachs, Panthenol, Bisabolol und Glycerin von der Firma Beiersdorf), mit einem Plastikfilm, einem imprägnierten Polymer, COMFEEL (Coloplast) oder mit Vaseline; oder mit einem nicht-abdeckenden Verband, wie zum Beispiel DUODERM (3M) oder OPSITE (Smith & Napheu). Ein abdeckender Verband schließt das Eindringen von Wasser vollständig aus. In alternativer Weise kann ein teilweise abdeckender Verband, wie zum Beispiel TEGADERM, verwendet werden, um eine Hydratation zu ergeben, und er kann eine längere Anwendung des Pflasters ermöglichen, oder er kann eine Mazeration der Haut verhindern.
Die Formulierung kann an einer einzelnen oder an vielen verschiedenen Stellen, an einzelnen oder verschiedenen Gliedmaßen oder auf große Bereiche von Hautoberfächen durch vollständiges Eintauchen aufgetragen werden. Die Formulierung kann unmittelbar auf die Haut aufgetragen werden.
Die genetische Immunisierung wurde beschrieben in den US-Patenten Nr. 5 589 466 und 5 593 972. Die Nucleinsäure(n), die in der Formulierung enthalten ist (sind), kann (können) für das Antigen, das Adjuvans oder für beide kodieren. Die Nucleinsäure kann zur Replikation in der Lage sein oder nicht; sie kann nicht-integrierend und nicht-infektiös sein. Die Nucleinsäure kann darüber hinaus einen regulatorischen Bereich umfassen (zum Beispiel einen Promotor, Verstärker, Silencer, Transkriptions-Start- und -Stopp-Stellen, Stellen für einen RNA-Splice-Akzeptor und -Donor, ein Polyadenylierungs-Signal, eine interne Ribosomen-Bindungsstelle, Translations-Start- und -Stopp-Stellen), der funktionell mit der Sequenz verknüpft ist, welche für das Antigen oder das Adjuvans kodiert. Die Nucleinsäure kann mit einem Mittel komplexiert sein, das die Transfektion fördert, wie zum Beispiel ein kationisches Lipid, Calciumphosphat, DEAE-Dextran, Polybren-DMSO oder eine Kombination derselben. Die Nucleinsäure kann Bereiche umfassen, die von viralen Genomen stammen. Solche Materialien und Verfahren wurden von Kriegler (1990) und Murray (1991) beschrieben.
Eine Immunantwort kann humorale (d.h., Antigen-spezifische Antikörper) und/oder zelluläre (d.h., Antigen-spezifische Lymphozyten, wie zum Beispiel B-Zellen, CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, CTL, Th1-Zellen, Th2-Zellen und/oder T_DTH-Zellen) Effektor-Waffen umfassen. Darüber hinaus kann die Immunantwort NK-Zellen umfassen, welche die Antikörper-abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC) vermitteln.
Die Immunantwort, die durch die Formulierung der Erfindung ausgelöst wird, kann die Auslösung der Bildung von Antigen-spezifischen Antikörpern und/oder zytotoxischen Lymphozyten umfassen (CTL, siehe den Übersichtsartikel von Alving und Wassef, 1994). Ein Antikörper kann mittels Immunoassay-Verfahren nachgewiesen werden, und der Nachweis von verschiedenen Isotypen (zum Beispiel IgM, IgD, IgA1, IgA2, sekretorisches IgA, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 oder IgG4) kann erwartet werden. Eine Immunantwort kann ebenso durch einen Neutralisierungs-Assay nachgewiesen werden.
Die Antikörper sind schützende Proteine, die von B-Lymphozyten produziert werden. Sie sind in hohem Maße spezifisch und sind im Allgemeinen gegen ein Epitop eines Antigens gerichtet. Häufig spielen Antikörper eine Rolle beim Schutz gegen eine Krankheit, indem sie mit den Antigenen spezifisch reagieren, die aus den die Krankheit verursachenden Pathogenen stammen. Die Immunisierung kann die Bildung von Antikörpern auslösen, die spezifisch für das immunisierende Antigen sind, wie zum Beispiel das Cholera-Toxin.
Die Bildung von Antigen-spezifischen Antikörpern wird ausgelöst, wenn das Antigen durch die Haut mittels Liposomen transportiert wird.
CTLs sind besondere schützende Immunzellen, die erzeugt werden, um gegenüber einer Infektion durch ein Pathogen zu schützen. Sie sind ebenso in hohem Maße spezifisch. Die Immunisierung kann die Bildung von CTLs auslösen, die spezifisch für das Antigen sind, wie zum Beispiel ein synthetisches Oligopeptid, das auf einem Malaria-Protein beruht, in Verbindung mit dem Selbst-Haupthistokompatibilitäts-Antigen. Die CTLs, deren Bildung durch die Immunisierung mit dem transkutanen Transport-System ausgelöst wurde, können die mit einem Pathogen infizierten Zellen töten. Die Immunisierung kann ebenso eine Gedächtnis-Antwort erzeugen, wie sie durch die Booster-Antworten bezüglich der Antikörper und CTLs, durch die Vermehrung der Lymphozyten durch die Kultur der mit dem Antigen stimulierten Lymphozyten, und durch die Hypersensibilisierungs-Antworten vom verzögerten Typ auf die intradermale Reizung der Haut nur durch das Antigen gekennzeichnet wird.
Man möge sich vergegenwärtigen, dass die Antwort der T-Helferzellen, die durch die transkutane Immunisierung herbeigeführt wird, durch die Verwendung von Calcium-Kanal-Blockern manipuliert werden kann (zum Beispiel durch Nifedipin und Verapamil), welche die Hypersensibilisierungs-Reaktion bei Kontakt unterdrücken, indem sie den Abbau des Antigens und die nachfolgende Präsentation durch die epidermalen Langerhans-Zellen hemmen. In Bezug auf die transkutane Anwendung der Calcium-Kanal-Blocker würde man erwarten, dass die Expression von co-stimulierenden Molekülen auf der Oberfläche (zum Beispiel die Familie, die mit B7 in Beziehung steht), sowie die Erzeugung einer anschließenden T-Helfer-Antwort beeinflusst wird. Man hat sich ebenso vorgestellt, dass die Zugabe eines Calcium-Kanal-Blockers die Hypersensibilisierungs-Antworten vom verzögerten Typ hemmen kann, und dazu verwendet werden könnte, um eine Immunantwort zu selektieren, die vorwiegend eine zelluläre oder eine humorale Antwort darstellt.
In einem viralen Neutralisierungs-Assay werden Reihenverdünnungen von Seren zu Wirtszellen gegeben, die dann in Bezug auf eine Infektion beobachtet werden, nachdem sie mit einem infektiösen Virus in Kontakt gebracht wurden. In alternativer Weise können Reihenverdünnungen von Seren mit infektiösen Titern von Viren vor der Impfung eines Tieres inkubiert werden, und die beimpften Tiere werden dann in Bezug auf Anzeichen für eine Infektion beobachtet.
Das transkutane Immunisierungssystem der Erfindung kann bewertet werden, wobei Testmodelle entweder in Tieren oder in Menschen verwendet werden, welche die Fähigkeit der Immunisierung mit dem Antigen bewerten, um den Probanden vor der Krankheit zu schützen. Ein solcher Schutz würde eine Antigen-spezifische Immunantwort zeigen. Anstelle des Tests wird das Erzielen eines gegen Diphtherie gerichteten Antikörpers mit einem Titer von 5 IU/ml oder mehr im allgemeinen als Kriterium vermutet, das einen optimalen Schutz kennzeichnet, und es dient ersatzweise als Kennzeichen für einen Schutz (Plotkin und Mortimer, 1994).
Darüber hinaus kann das Testmodell mit Plasmodium falciparum dazu verwendet werden, eine Antigen-spezifische Immunantwort in Menschen auszulösen. Freiwillige Personen können immunisiert werden, wobei das transkutane Immunisierungssystem verwendet wird, das Oligopeptide oder Proteine (Polypeptide) enthält, die von dem Malaria-Parasiten stammen, und anschließend werden sie der Malaria experimentell oder in einem natürlichen Rahmen ausgesetzt. Das Malaria-Testmodell für Mäuse mit Plasmodium yoelii kann verwendet werden, um den Schutz der Maus gegen Malaria zu bewerten (Wang et al., 1995).
Alving et al. (1986) injizierten Liposomen in Kaninchen, die Lipid A als ein Adjuvans für die Induktion einer Immunantwort gegenüber Cholera-Toxin (CT), und gegenüber einem synthetischen Protein, das aus einem Malaria-Oligopeptid besteht, das vier Tetra-Peptide (Asn-Ala-Asn-Pro) enthält, die an BSA konjugiert sind, umfassten. Die Autoren fanden, dass die Immunantwort gegenüber dem Cholera-Toxin oder gegenüber dem synthetischen Malaria-Protein ausgesprochen verstärkt war, wenn das Antigen mit den Liposomen verkapselt war, die Lipid A enthielten, im Vergleich mit ähnlichen Liposomen, die kein Lipid A enthielten. Einige Antigene, die entweder von dem Circumsporozoit-Protein (CSP) oder vom Merozoit-Oberflächenproteinen von Plasmodium falciparum stammen, wurden in Liposomen verkapselt, die Lipid A enthielten. Es wurde gezeigt, dass alle Malaria-Antigene, die in Liposomen verkapselt wurden, welche Lipid A enthielten, die Bildung humoraler Effektoren (d.h., von Antigen-spezifischen Antikörpern) auslösen, und im Falle einiger Antigene wurde es gezeigt, dass sie ebenso Zell-vermittelte Antworten auslösen. Die Erzeugung einer Immunantwort und eines Immunschutzes in einem Tier, das mit einem Malaria-Antigen geimpft wurde, kann durch Immunfluoreszenz gegenüber ganzen fixierten Malaria-Sporozoiten oder CTLs in einem Assay bestimmt werden, die die Zielzellen töten, welche mit CSP transfiziert wurden.
Mäuse, die transkutan mit Cholera-Toxin immunisiert wurden, können gegenüber einer intranasalen Exposition mit einer Dosis von 20 μg Cholera-Toxin geschützt werden. Mallet et al. (persönliche Mitteilung) haben gefunden, dass C57Bl/6-Mäuse eine tödliche hämorrhagische Lungenentzündung als Antwort auf eine intranasale Exposition mit CT entwickelten. In alternativer Weise können die Mäuse mit einer intraperitonealen Dosis von CT auf die Probe gestellt werden (Dragunsky et al., 1992). Ein IgG- oder ein IgA-Antikörper, der spezifisch für Cholera-Toxin ist, kann einen Schutz gegenüber einer Exposition von Cholera-Toxin bereitstellen (Pierce, 1978; Pierce und Reynolds, 1974).
Ähnliche schützende Wirkungen könnten bei Menschen erwartet werden, die mit LT oder CT immunisiert wurden, und die mit LT sezernierenden E. coli bzw. CT-sezernierenden Vibrio cholerae auf die Probe gestellt wurden. Darüber hinaus wurde ein kreuzweiser Schutz zwischen CT- und LT-immunen Probanden und CT- und LT-vermittelten Krankheiten gezeigt.
Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt, kann eine mucosale Immunität auf transkutanem Weg erreicht werden. Mucosale IgG-Antikörper und IgA-Antikörper können in Mäusen nachgewiesen werden, die mit CT transkutan immunisiert wurden. Dies ist wichtig für den Schutz bei Krankheiten, bei denen die Pathologie an den Schleimhäuten auftritt, wie zum Beispiel bei LT- oder CT-vermittelten Krankheiten, bei denen das Eintreten des pathogenen Organismus' an der Schleimhaut auftritt, oder bei dem eine Schleimhaut-Infektion für die Pathogenese wichtig ist.
Man würde erwarten, dass die transkutane Immunisierung gegenüber Krankheiten, wie zum Beispiel Influenza, wirksam sein könnte, entweder durch Herbeiführung einer mucosalen Immunität oder durch eine systemische Immunität oder durch eine Kombination einer humoralen, zellulären oder mucosalen Immunität.
Die Impfstoffe können gegenüber den Auswirkungen im Wirtsorganismus, wie zum Beispiel die Bindung von Erythrozyten an das Gefäßendothel in Malaria, durch Induktion von anti-Sequestrin-Antikörpern wirksam sein.
Schützende Antikörper, wie zum Beispiel gegen Hepatitis A, B oder Hepatitis E gerichtete Antikörper, können auf transkutanem Weg induziert werden, wobei das gesamte inaktivierte Virus, vom Virus stammende Untereinheiten oder rekombinante Produkte verwendet werden. Der Schutz gegenüber Wundstarrkrampf, Diphtherie oder andere, durch ein Toxin vermittelte Krankheiten kann durch transkutan induzierte anti-Toxin-Antikörper verliehen werden. Ein "Booster"-Pflaster für Tetanus könnte man sich in dem Sinn vorstellen, dass es ein Adjuvans, wie zum Beispiel CT, und Toxoide, wie zum Beispiel von Tetanus und Diphtherie, enthält, oder Fragmente, wie zum Beispiel das C-Fragment von Tetanus. Eine Verstärkung könnte nach einer ersten Immunisierung durch Injektion oder transkutane Immunisierung mit den gleichen oder ähnlichen Antigenen bewirkt werden. Für injizierbare Immunisierungen, die eine Immunität herbeiführen, jedoch mögliche Nebenwirkungen beim Bonstern aufweisen, kann ein transkutaner Boost bevorzugt sein. Die orale oder nasale Immunisierung kann unter Verwendung des transkutanen Weges in vorstellbarer Weise verstärkt werden. Die gleichzeitige Verwendung von injizierbaren und transkutanten Immunisierungen kann ebenso verwendet werden.
Die Impfung wurde ebenso als eine Behandlung für Krebs und Autoimmunkrankheiten verwendet. Zum Beispiel kann die Impfung mit einem Tumor-Antigen (zum Beispiel dem Prostata-spezifischen Antigen) eine Immunantwort in Form von Antikörpern, CTLs und der Vermehrung der Lymphozyten herbeiführen, welche es dem Immunsystem des Körpers ermöglichen, die Tumorzellen zu erkennen und zu töten. Es wurde gezeigt, dass das Zielen auf dendritische Zellen, von denen die Langerhans-Zellen eine spezifische Untermenge darstellen, eine wichtige Strategie bei der Immunotherapie von Krebs darstellt. Tumor-Antigene, die für die Impfung nützlich sind, wurden für das Melanom beschrieben (US-Patent Nr. 5 102 663, 5 141 742 und 5 262 177), für das Prostata-Karzinom (US-Patent Nr. 5 538 866) und für das Lymphom (US-Patent Nr. 4 816 249, 5 068 177 und 5 227 159). Die Impfung mit dem Oligopeptid des T-Zell-Rezeptors kann eine Immunantwort auslösen, die den Fortschritt der Autoimmunkrankheit aufhält (US-Patent Nr. 5 612 035 und 5 614 192; Antel et al., 1996; Vandenbark et al., 1996). Das US-Patent Nr. 5 552 300 beschreibt ebenfalls Antigene, die für die Behandlung einer Autoimmunkrankheit geeignet sind.
Die folgenden Beispiele sind so zu verstehen, als seien sie eine Erläuterung der vorliegenden Erfindung; jedoch ist die Praxis der Erfindung in keiner Weise durch die Beispiele begrenzt oder beschränkt.
BEISPIELE
Immunisierungsverfahren
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden mit einer Haarschneidemaschine Nr. 40 rasiert. Dieses Rasieren konnte ohne irgendwelche Anzeichen einer Verletzung der Haut durchgeführt werden. Die Rasur wurde vom mittleren Brustraum bis genau unterhalb des Halsgenicks durchgeführt. Die Mäuse ließ man anschließend für 24 Stunden ruhen. Vor dieser Maßnahme wurden die Mäuse mit einer Ohrmarke für die Identifikation versehen, und es wurde ihnen im voraus Blut abgenommen, um eine Probe eines Präimmunserums zu erhalten. Die Mäuse wurden ebenso transkutan ohne Rasur immunisiert, indem 50 μl der Immunisierungs-Lösung auf jedes Ohr aufgetragen wurden.
Die Mäuse wurden anschließend in der folgenden Weise immunisiert. Die Mäuse wurden mit 0,03 bis 0,06 ml einer Lösung von 20 mg/ml Xylazin und 0,5 ml einer Lösung von 100 mg/ml Ketamin betäubt; die Mäuse wurden durch diese anästhetische Dosis für annähernd 1 Stunde immobilisiert. Die Mäuse wurden mit der Bauchseite nach unten auf eine wärmende Decke gesetzt.
Die Immunisierungs-Lösung wurde anschließend auf die rasierte Rückenseite einer Maus in der folgenden Weise aufgetragen: eine 1,2 × 1,6 cm große Schablone aus Polystyrol wurde sanft über den Rücken gelegt, und eine mit Saline befeuchtete sterile Gaze wurde verwendet, um die Haut teilweise zu befeuchten (dies ermöglichte auch die Anwendung der Immunisierungs-Lösung), die Immunisierungs-Lösung wurde anschließend mit einer Pipette auf eine Fläche aufgetragen, die durch die Schablone abgegrenzt war, um ein 2 cm² großes Pflaster der Immunisierungs-Lösung zu ergeben. In alternativer Weise wurde ein festgelegtes Volumen der Immunisierungs-Lösung gleichmäßig auf die rasierte Fläche des Ohres aufgetragen. Es wurde sorgfältig vorgegangen, um nicht die Haut mit der Pipettenspitze zu kratzen oder zu reiben. Die Immunisierungs- Lösung wurde über die zu bedeckende Fläche mit der glatten Seite der Pipettenspitze verteilt.
Die Immunisierungs-Lösung (zwischen etwa 100 μl bis etwa 200 μl) wurde auf dem Rücken der Maus für 60 bis 180 Minuten belassen. Nach dem Verstreichen von 60 Minuten wurde die Maus sanft am Genick und am Schwanz gehalten, unter einen reichlichen Strom von lauwarmem Leitungswasser gehalten und für 10 Sekunden gewaschen. Die Maus wurde anschließend behutsam mit einem Stück steriler Gaze trocken getupft, und ein zweites Waschen wurde für 10 Sekunden durchgeführt; die Maus wurde anschließend ein zweites Mal trocken getupft und im Käfig belassen.
Die Mäuse scheinen keine nachteiligen Wirkungen aufgrund der Anästhesie, der Immunisierung, des Waschverfahrens oder der Toxizität der Exotoxine zu zeigen. Es wurde keine Hautreizung, Schwellung oder Rötung nach der Immunisierung beobachtet, und die Mäuse schienen zu gedeihen. Die Immunisierung unter Verwendung des Ohrs wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Fell vor der Immunisierung nicht entfernt wurde.
Antigen
Die folgenden Antigene wurden für die Immunisierung und den ELISA-Test verwendet, und sie wurden unter Verwendung von steriler PBS oder normaler Saline vermischt. Das Cholera-Toxin oder CT (List Biologicals, Kat. Nr. 101B, Char. Nr. 10149CB), die CT B-Untereinheit (List Biologicals, Kat. Nr. BT01, Char. Nr. CVXG-14E), die CT A-Untereinheit (List Biologicals, Kat. Nr. 102A, Char. Nr. CVXA-17B), die CT A-Untereinheit (Calbiochem, Kat. Nr. 608562); das Pertussis-Toxin, salzfrei (List Biologicals, Char. Nr. 181120a); das Tetanus-Toxoid (List Biologicals, Char. Nr. 1913a und Char. Nr. 1915a); das Pseudomonas Exotoxin A (List Biologicals, Char. Nr. ETA25a); das Diphtherie-Toxoid (List Biologicals, Char. Nr. 15151); das hitzelabile Enterotoxin von E. coli (Sigma, Char. Nr. 9640625); das Rinderserumalbumin oder BSA (Sigma, Kat. Nr. 3A-4503, Char. Nr. 31F-0116) und das Haemophilus influenzae B-Konjugat (Connaught, Char. Nr. 6381401).
ELISA-Test mit IgG (H+L)
Die Antikörper, die spezifisch für CT, LT, ETA, Pertussis-Toxin, Diphtherie-Toxoid, Tetanus-Toxoid, Haemophilus influenzae B-Konjugat, Influenza, Sequestrin und BSA sind, wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests in einem Verfahren bestimmt, das ähnlich dem von Glenn et al. (1995) ist. Alle Antigene wurden in steriler Saline bei einer Konzentration von 2 μg/ml gelöst. 50 μl dieser Lösung (0,1 μg) pro Vertiefung wurden in Polystyrol-Platten IMMULON-2 (Dynatech Laborstories, Chantilly, VA) gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit einer Pufferlösung zum Blockieren für 1 Stunde mit 0,5 % Casein und 0,05 % Tween 20 blockiert. Die Seren wurden mit einem Verdünnungsmittel aus 0,5 % Casein und 0,05 Tween 20 verdünnt; die Verdünnungsreihen wurden in Spalten auf der Platte durchgeführt. Die Inkubation erfolgte für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
Die Platten wurden anschließend mit einer Waschlösung von PBS und 0,05 % Tween 20 viermal gewaschen, und ein Sekundär-Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) verknüpft ist, gegen den IgG (H+L) aus der Maus gerichtet ist, und aus der Ziege stammt (Bio-Rad Laborstories, Richmond, CA, Kat. Nr. 170-6516), wurde im Casein enthaltenden Verdünnungsmittel bei einer Verdünnung von 1:500 verdünnt und auf den Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die Platten wurden anschließend viermal mit der Waschlösung aus PBS und Tween gewaschen. 100 μl eines Substrats von 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolon)sulfonsäure wurden zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platten wurden bei 405 nm nach 20 bis 40 Minuten Entwicklung abgelesen. Die Ergebnisse sind als das geometrische Mittel der einzelnen Seren und als Standardabweichung vom Durchschnitt der ELISA-Einheiten (die Serumverdünnung, bei der die Absorption gleich 1,0 war) oder als einzelne Antikörper-Antworten in ELISA-Einheiten dargestellt.
ELISA-Test mit IgG(γ), IgM(μ) und IgA(α)
Die Konzentrationen der gegen Cholera-Toxin gerichteten Antikörper der Klassen IgG(γ), IgM(μ) und IgA(α) wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests mit einem Verfahren bestimmt, das dem von Glenn et al. ähnlich ist. Das Cholera-Toxin wurde in steriler Saline bei einer Konzentration von 2 μg/ml gelöst. 50 μl dieser Lösung (0,1 μg) pro Vertiefung wurden auf Polystyrol-Platten IMMULON-2 (Dynatech Laborstories, Chantilly, VA) gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit einer Pufferlösung zum Blockieren aus 0,5 % Casein und 0,05 % Tween 20 für 1 Stunde blockiert. Die Seren wurden mit einem Casein enthaltenden Ver dünnungsmittel verdünnt, und die Verdünnungsreihen wurden auf der Platte durchgeführt. Diese wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Platten wurden anschließend mit einer Waschlösung von PBS und Tween viermal gewaschen, und ein Sekundär-Antikörper, der jeweils mit Meerrettich-Peroxidase verknüpft ist, der gegen Maus-IgG(γ) gerichtet ist (Bio-Rad-Laboratories, Richmond, CA, Kat. Nr. 172-1038), bzw. der gegen Maus-IgM(μ) gerichtet ist (Bio-Rad Laborstories, Richmond, CA, Kat. Nr. 172-1030) bzw. der gegen Maus IgA(α) gerichtet ist (Sigma, St. Louis, MO, Kat. Nr. 1158985), und der jeweils aus der Ziege stammt, wurde in einem Casein enthaltenden Verdünnungsmittel in einer Verdünnung von 1:1000 verdünnt und auf den Platten für 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Die Platten wurden anschließend viermal mit einer Waschlösung aus PBS und Tween gewaschen. 100 μl eines Substrats von 2,2'-Azino-di(3-ethylbenzthiazolon)sulfonsäure (von Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) wurden zu den Vertiefungen gegeben, und die Platten wurden bei 405 nm abgelesen. Die Ergebnisse sind als das geometrische Mittel einzelner Seren und als Standardabweichung vom Durchschnitt der ELISA-Einheiten (die Serumverdünnung, bei der die Absorption gleich 1,0 war) dargestellt.
ELISA-IgG-Subklassen
Antigen-spezifische Antikörper der IgG-Subklassen (IgG1, IgG2a, IgG2b und IgG3) gegen CT, LT, ETA und BSA wurden durchgeführt, wie von Glenn et al., (1995) beschrieben. Der Festphasen-ELISA wurde in Polystyrol-Platten IMMULON-2 durchgeführt (Dynatech Laborstories, Chantilly, VA). Die Vertiefungen wurden mit den jeweiligen Antigenen in Saline über Nacht (0,1 μg/50 μl) inkubiert, und mit 0,5 % Casein-Tween 20 blockiert. Die einzelnen Maus-Seren wurden in 0,5 % Casein-Losung der Reihe nach verdünnt, und bei Raumtemperatur für 4 Stunden inkubiert. Der Sekundär-Antikörper bestand aus einem mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem, aus der Ziege stammenden, Isotyp-spezifischen anti-Maus-Antikörper (IgG1-, IgG2a-, IgG2b-, und IgG3-Antikörper, The Binding Site, San Diego, CA). Eine Standardkurve für jede Subklasse wurde unter Verwendung des von IgG1-, IgG2a-, IgG2b- und IgG3-Antikörpern des Maus-Myeloms bestimmt. Die Standardvertiefungen wurden mit anti-Maus-IgG(H+L) aus der Ziege (BioRad Laborstories, Richmond, Ca, Kat. Nr. 172-1054) beschichtet, um die IgG-Subklassenstandards des Myeloms abzufangen, die in Reihenverdünnungen zugegeben wurden. Die Myelom-IgG-Subklassen wurden ebenso unter Verwendung der mit Peroxi dase konjugierten, aus der Ziege stammenden, Subklasse-spezifischen anti-Maus-Antikörper nachgewiesen. Sowohl die Testseren als auch die Myelom-Standards wurden unter Verwendung von 2,2'-Azino-di(3-ethyl-benzthiazolon)sulfonsäure (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) als Substrat nachgewiesen. Die Absorptionen wurden bei 405 nm abgelesen. Einzelne Antigen-spezifische Subklassen wurden unter Verwendung der Werte aus der linearen Titrationskurve quantitativ bestimmt, die gegen die Myelom-Standardkurve aufgetragen wurde, und als μg/ml angegeben.
ELISA – IgE
Die quantitative Bestimmung des Antigen-spezifischen IgE-Antikörpers wurde unter Verwendung eines Protokolls von Pharmingen Technical Protocols, Seite 541 des Katalogs für Forschungsprodukte 1996 – 1997 (Pharmingen, San Diego, CA) durchgeführt. 50 μl eines gereinigten anti-Maus-IgE mAb zum Abfangen mit einer Konzentration von 2 μg/ml (Pharmingen, Kat. Nr. 02111D) in 0,1 M NaHCO₃ (pH 8,2) wurden zu IMMUNO-Platten gegeben (Nunc, Kat. Nr. 12-565-136). Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, dreimal mit PBS-Tween 20 gewaschen, mit 3 % BSA in PBS für 2 Stunden blockiert, und dreimal mit PBS-Tween gewaschen. Die Seren wurden in 1 BSA in PBS verdünnt, bei Verdünnungen von 1:100 zugegeben, und der Reihe nach entlang der Spalten verdünnt (zum Beispiel 1:100, 1:200, und dergleichen). Gereinigte IgE-Standards aus der Maus (Pharmingen, Kat. Nr. 0312D) wurden mit einer Startlösung von 0,25 μg/ml zugegeben und der Reihe nach entlang der Spalten verdünnt. Die Platten wurden für 2 Stunden inkubiert und fünfmal mit PBS-Tween gewaschen.
Der biotinylierte anti-Maus-IgE mAB (Pharmingen, Kat. Nr. 02122D) wurde bei einer Konzentration von 2 μg/ml in 1 % BSA in PBS zugegeben, für 45 Minuten inkubiert und fünfmal mit PBS-Tween gewaschen. Avidin-Peroxidase (Sigma Kat. Nr. A3151, Verdünnung 1:400 von einer Lösung mit 1 mg/ml) wurde für 30 Minuten zugegeben, und die Platten wurden sechsmal mit PBS-Tween gewaschen. Sowohl die Testseren als auch die IgE-Standards wurden unter Verwendung von 2,2'-Azino-di(3-ethyl-benzthiazolon)-sulfonsäure (Kirkegaard und Perry, Gaithersburg, MD) als Substrat nachgewiesen. Die Absorptionen wurden bei 405 nm abgelesen. Die einzelnen Antigen-spezifischen Subklassen wurden unter Verwendung der Werte aus der linearen Titrationskurve quantitativ bestimmt, die gegen die IgE-Standardkurve aufgetragen wurde, und als μg/ml angegeben.
Liposomen-Herstellung
Wenn Liposomen bei der Formulierung für die transkutane Immunisierung verwendet wurden, wurden vielschichtige Liposomen, die aus Dimyristoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylglycerin und Cholesterin zusammengesetzt sind, entsprechend dem Verfahren von Alving et al., (1993), hergestellt. Dimyristoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylglycerin und Cholesterin wurden von Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL) erworben. Stammlösungen der Lipide in Chloroform wurden aus einem auf –20 °C gekühlten Kühlschrank entnommen, wo sie gelagert wurden.
Die Lipide wurden in einem molaren Verhältnis von 0,9 : 0,1 : 0,75 für Dimyristoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylglycerin und Cholesterin in einem birnenförmigen Gefäß gemischt. Unter Verwendung eines Rotationsverdampfers wurde das Lösungsmittel bei 37 °C unter vermindertem Druck für 10 Minuten entfernt. Das Gefäß wurde ferner unter leichtem Vakuum für 2 Stunden in einem Exsikkator getrocknet, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen. Die Liposomen wurden bei 37 mM Phospholipid unter Verwendung von sterilem Wasser gequollen, lyophilisiert und bei –20 °C gelagert. Diese Liposomen werden in ihrem lyophilisierten Zustand mit normaler Saline (pH 7,0) gemischt, um eine bestimmte Phospholipid-Konzentration in der Saline zu ergeben. In alternativer Weise wurden die getrockneten Phospholipide gequollen, um Liposomen mit normaler Saline (pH 7,0) herzustellen, und sie wurden nicht lyophilisiert.
Beispiel 1
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: Die Liposomen, welche wie vorstehend unter der Überschrift "Liposomen-Herstellung" beschrieben hergestellt wurden, wurden mit Saline gemischt, um die Liposomen zu bilden. Die im Voraus gebildeten Liposomen wurden anschließend entweder in Saline (für die Gruppe, in der nur Liposomen verwendet wurden) oder mit CT in Saline verdünnt, um eine Immunisierungs-Lösung zu ergeben, die Liposomen mit einer Konzentration von 10 – 150 mM Phospholipid mit 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung enthält. Das Cholera-Toxin (CT) wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg CT pro 100 μg Lösung enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich CT erhielt. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen transkutan immunisiert. Die Antikörper-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests wie vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben 3 Wochen nach der Booster-Immunisierung bestimmt, und mit den Prä-Immunseren verglichen. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, war die Konzentration der anti-CT-Antikörper, deren Bildung durch CT ohne Liposomen herbeigeführt wurde, nicht von der Konzentration der anti-CT-Antikörper verschieden, die unter Verwendung von Liposomen erzeugt wurden, mit der Ausnahme derjenigen Mäuse, bei denen 150 mM Liposomen verwendet wurden. Das Cholera-Toxin in Saline allein war in der Lage, die Mäuse gegen CT zu immunisieren und hohe Antikörper-Titer zu erzeugen. Tabelle 1: anti-CT-Antikörper

*erheblicher Unterschied von der Gruppe, in der CT alleine verwendet wurde (P < 0,05)

Beispiel 2
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: BSA wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 200 μg BSA pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich BSA erhielt; BSA und CT wurden mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 200 μg BSA und 100 μg CT pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die BSA und CT erhielt. Wenn die Liposomen verwendet wurden, wurden sie wie vorstehend unter der Überschrift „Liposomen-Herstellung" beschrieben hergestellt, und sie wurden zunächst mit Saline gemischt, um Liposomen zu bilden. Die Liposomen wurden anschließend mit BSA oder BSA und CT in Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung zu ergeben, die Liposomen bei 50 mM Phospholipid mit 200 μg BSA pro 100 μl Immunisierungs-Lösung enthält, oder 200 μg BSA + 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Antikörper-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, mit Seren durchgeführt, die 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung genommen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. BSA alleine, sei es mit oder ohne Liposomen, war nicht in der Lage, eine Antikörper-Antwort auszulösen. Jedoch stimulierte die Zugabe von CT eine Immunantwort gegenüber BSA. CT wirkte als ein Adjuvans für die Immunantwort gegenüber BSA, und anti-BSA-Antikörper mit hohem Titer wurden produziert. Tabelle 2: anti-BSA-Antikörper
Beispiel 3
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: LT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg LT pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich LT erhielt. Wenn Liposomen verwendet wurden, wurden sie wie vorstehend unter der Überschrift „Liposomen-Herstellung" beschrieben hergestellt, und sie wurden zunächst mit Saline gemischt, um Liposomen zu bilden. Die im Voraus gebildeten Liposomen wurden anschließend mit LT in Saline verdünnt, um eine Immunisierungs-Lösung zu ergeben, die Liposomen bei 50 mM Phospholipid mit 100 μg LT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung enthält. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die anti-LT-Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Das LT war deutlich immunogen, sowohl mit als auch ohne Liposomen, und es konnte kein erheblicher Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden. LT und CT sind Mitglieder der Familie von bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxinen (bAREs). Sie sind als A-B-Proenzyme organisiert, wobei die ADP-Ribosyltransferase-Aktivität in der A-Untereinheit enthalten ist, und die Bindung der Zielzellen eine Funktion der B-Untereinheit darstellt. LT ist zu 80 % homolog mit CT auf der Stufe der Aminosäuren und besitzt eine ähnliche Organisation von nicht-kovalent gebundenen Untereinheiten, nämlich die Stöchiometrie (A:B5), dasselbe Bindungsziel, das heißt das Gangliosid GM1, und es ist ähnlich in der Größe (MW ca. 80.000 Da). Die Ähnlichkeiten von LT und CT scheinen ihre Immunogenität bezüglich des transkutanen Wegs der Verabreichung zu beeinflussen, wie es die ähnliche Größenordnung der Antikörper-Antwort sowohl auf CT als auch auf LT widerspiegelt (Tabellen 1 und 3). Tabelle 3: anti-LT-Antikörper
Beispiel 4
C57BI/6-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden einmal unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: LT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg LT pro 100 μl Saline enthielt. Die Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die anti-LT-Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA-IgG(H+L)" beschrieben wurde, 3 Wochen nach der einzi gen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Das LT war deutlich immunogen im Falle einer einmaligen Immunisierung, und Antikörper wurden nach 3 Wochen produziert. Das rasche Ansteigen der Antikörper-Titer und der -Antworten auf die einzige Immunisierung würde einen nützlichen Gesichtspunkt des transkutanen Immunisierungsverfahrens darstellen. Es ist nachvollziehbar, dass eine rasche einmalige Immunisierung bei Epidemien, für Reisende und an Orten, an denen der Zugang zu medizinischer Versorgung mangelhaft ist, nützlich sein würde. Tabelle 4: anti-LT-Antikörper
Beispiel 5
C57BI/6-Mäuse im Alter von 8 bis 12 Wochen wurden in Gruppen zu 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden einmal unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: CT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg CT pro 100 μl Saline enthält. Die Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die anti-CT-Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA-IgG(H+L)" beschrieben wurde, 3 Wochen nach der einzigen Immunisierung bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. CT war hochgradig immunogen bei einer einmaligen Immunisierung. Das rasche Ansteigen der Antikörper-Titer und der -Antworten auf die einzige Immunisierung würde einen nützlichen Gesichtspunkt des transkutanen Immunisierungsverfahrens darstellen. Es ist nachvollziehbar, dass eine rasche einmalige Immunisierung bei Epidemien, für Reisende und an Orten, an denen der Zugang zu medizinischer Versorgung mangelhaft ist, nützlich sein würde. Tabelle 5: anti-CT-Antikörper
Beispiel 6
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von je 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: ETA wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg ETA pro 100 μl Saline enthält, für die Gruppe von Mäusen, die nur ETA erhält. Wenn Liposomen verwendet wurden, wurden sie wie vorstehend unter der Überschrift „Liposomen-Herstellung" beschrieben hergestellt, und sie wurden zunächst mit Saline vermischt, um die Liposomen zu bilden. Die im Voraus gebildeten Liposomen wurden anschließend mit ETA in Saline verdünnt, um eine Immunisierungs-Lösung zu ergeben, die Liposomen bei 50 mM Phospholipid mit 100 μg ETA pro 100 μl Immunisierungs-Lösung enthält. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, mit einem Serum bestimmt, das 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung genommen wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. ETA war deutlich immunogen, sowohl mit als auch ohne Liposomen, und es konnte kein erheblicher Unterschied zwischen den Gruppen nachgewiesen werden. ETA unterscheidet sich von CT und LT dadurch, dass es ein einzelnes Peptid mit 613 Aminosäuren mit A- und B-Domänen auf demselben Peptid darstellt, und dass es an einen gänzlich verschiedenen Rezeptor bindet, nämlich das Protein, welches mit dem Rezeptor für α2-Makroglobulin und dem Rezeptor für Lipoprotein von niedriger Dichte in Beziehung steht (Kounnas et al., 1992). Trotz der Verschiedenheiten zwischen ETA und CT bezüglich der Größe, der Struktur und des Bindungsziels induzierte ETA ebenso eine transkutane Antikörper-Antwort. Tabelle 6: anti-ETA-Antikörper
Beispiel 7
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: CT wurde mit Saline gemischt, um 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung herzustellen; LT wurde mit Saline gemischt, um 100 μg LT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung herzustellen; ETA wurde mit Saline gemischt, um 100 μg ETA pro 100 μl Immunisierungs-Lösung herzustellen; und CT und BSA wurden mit Saline gemischt, um 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung und 200 μg BSA pro 100 μl Immunisierungs-Lösung herzustellen. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen transkutan immunisiert, und die Antikörper-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG-Subklasse" beschrieben wurde, 3 Wochen nach der Booster-Immunisierung bestimmt und mit den Prä-Immunseren verglichen. Die IgG-Subklassen-Antwort gegenüber CT, BSA und LT erbrachte ähnliche Konzentrationen von IgG1 und IgG2a, was die Aktivierung der T-lielferzellen sowohl durch die Th1- als auch durch die Th2-Lymphozyten wiederspiegelt (Seder und Paul, 1994), während die Antwort der IgG-Subklasse gegenüber ETA nahezu ausschließlich aus IgG1- und IgG3-Antikörpern bestand, in Übereinstimmung mit einer Th2-ählichen Antwort (Tabelle 7). Somit erscheint es, dass alle IgG-Subklassen unter Verwendung einer transkutanen Immunisierung produziert werden können. Tabelle 7: IgG-Subklassen von induzierten Antikörpern
Beispiel 8
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden mit 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: LT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg LT pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die nur LT erhielt; CT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg CT pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die nur CT erhielt; ETA wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg ETA pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die nur ETA erhielt; und BSA und CT wurden mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg BSA und 100 μg CT pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die BSA und CT erhielt.
Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen transkutan immunisiert, und die Antikörper-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgE" beschrieben wurde, eine Woche nach der Booster-Immunisierung bestimmt und mit den Konzentrationen der Prä-Immunseren verglichen. Wie in Tabelle 8 gezeigt ist, wurden keine IgE-Antikörper gefunden, obwohl die Empfindlichkeit des Nachweises 0,003 μg/ml betrug. Die IgG-Antikörper wurden in derselben Maus mit einem Serum bestimmt, das drei Wochen nach der zweiten Immunisierung genommen wurde, wobei der Test mit der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" verwendet wurde. Die IgG-Antikörper-Antwort gegenüber LT, ETA, CT und BSA sind gezeigt, um darauf hinzuweisen, dass die Tiere erfolgreich immunisiert wurden und mit hohen Titern von Antikörpern gegenüber den jeweiligen Antigenen antworteten. Tabelle 8: IgE-Antikörper gegenüber LT, ETA, CT und BSA
Beispiel 9
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: CT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung enthielt. Die Immunisierungs-Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen transkutan immunisiert, und die Antikörper-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests bestimmt, der vorstehend unter den Überschriften „ELISA IgG(H+L)" bzw. „ELISA IgG (γ)" beschrieben wurde. Die Bestimmungen wurden zum Zeitpunkt von 1 und 4 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung durchgeführt, und mit den Prä-Immunseren verglichen. Wie in Tabelle 9 gezeigt ist, wurden hohe Konzentrationen von anti-CT-IgG(γ)-Antikörpern durch CT in Saline herbeigeführt. Geringe Mengen von IgM konnten durch Verwendung eines Sekundär-Antikörpers, der für IgM(μ) spezifisch ist, nachgewiesen werden. Nach 4 Wochen war die Antikörper-Antwort vorwiegend IgG. Die Daten werden in ELISA-Einheiten angegeben. Tabelle 9: IgG(γ) und IgM(μ)
Beispiel 10
BALB/c-Mause im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden einmal immunisiert, wobei 100 μl Immunisierungs- Lösung verwendet wurden, die wie folgt hergestellt wurde: CT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg CT pro 100 μl Saline enthält. Die Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen transkutan immunisiert. Die Antikörper-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, 5 Wochen nach der Booster-Immunisierung bestimmt, und mit den Prä-Immunseren verglichen. Wie in Tabelle 10 gezeigt ist, wurden anti-CT-IgA-Antikörper im Serum nachgewiesen. Tabelle 10: anti-CT-IgA Antikörper
Beispiel 11
BALB/c-Mäuse im Alter von 6 bis 8 Wochen wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden mit 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: CT wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 100 μg CT pro 100 μl Immunisierungs-Lösung enthält. Die Immunisierungs-Lösung wurde für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Mäuse wurden mit 100 μl Immunisierungs-Lösung zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen transkutan immunisiert, und die Antikörper-Konzentrationen wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests bestimmt, der vorstehend unter den Überschriften „ELISA IgG(H+L)" bzw. „ELISA IgG(γ)" beschrieben wurde. Die Antikörper-Bestimmungen wurden 8 Wochen nach der anfänglichen Immunisierung durchgeführt, und mit den Prä-Immunseren verglichen. Wie in Tabelle 11 gezeigt ist, wurde die Bildung von hohen Konzentrationen von anti-CT-Antikörpern im Serum durch CT in Saline herbeigeführt. Aus der Lunge gewaschene IgG-Antikörper konnten durch ELISA-Tests unter Verwendung von Antikörpern nachgewiesen werden, die für IgG(H+L) oder IgG(γ) spezifisch sind. Der Antikörper, der auf der Oberfläche der Lungenschleimhaut gefunden wurde, wird durch das Spülverfahren verdünnt, das verwendet wird, um den Antikörper der Schleimhaut zu sammeln, und somit sind die genauen Mengen des nachgewiesenen Antikörpers nicht so signifikant als das bloße Vorliegen eines nachweisbaren Antikörpers.
Die Waschungen der Lunge wurden durchgeführt, nachdem die Maus geopfert wurde. Die Luftröhre und die Lungen wurden durch sorgfältige Sektion freigelegt, und die Luftröhre wurde oberhalb der Gabelung durchschnitten. Eine Polypropylenröhre mit einem Maß von 22 wurde eingesetzt und auf der Luftröhre abgebunden, um einen dichten Verschluss an den Kanten zu bilden. 0,5 ml PBS wurden unter Verwendung einer 1 ml Spritze infundiert, die mit der Röhre verbunden war, und die Lungen wurden sorgfältig mit der Flüssigkeit aufgepumpt. Die Flüssigkeit wurde entfernt und für insgesamt 3 Runden der Spülung erneut infundiert. Das Waschwasser aus der Lungenwaschung wurde anschließend bei –20 °C eingeforen.
Die Tabelle 11 zeigt die Antikörper-Antwort von IgG(H+L) und IgG(γ) gegenüber Cholera-Toxin im Serum und im Lungenwaschwasser nach 8 Wochen. Die Daten sind in ELISA-Einheiten angegeben. Die Antikörper waren deutlich für alle Mäuse im Lungen-Waschwasser nachweisbar. Das Vorliegen der Antikörper in der Schleimhaut kann wichtig für den Schutz gegen Krankheiten sein, welche die Aktivität der Schleimhaut betreffen. Tabelle 11: Mucosale Antikörper gegenüber CT
Beispiel 12
BALB/c-Mäuse im wurden zum Zeitpunkt von 0 bis 3 Wochen in Gruppen von 4 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Liposomen wurden wie vorstehend unter der Überschrift „Liposomen-Herstellung" beschrieben hergestellt, und sie wurden zunächst mit Saline gemischt, um Liposomen zu bilden. Die im Voraus gebildeten Liposomen wurden anschließend entweder mit CT, CTA oder CTB in Saline verdünnt, um eine Immunisierungs-Lösung zu ergeben, die Liposomen bei 50 mM Phospholipid mit 50 μg Antigen (CT, CTA oder CTB) pro 100 μl Immunisierungs-Lösung enthält. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, 1 Woche nach der Booster-Immunisierung bestimmt, und mit den Prä-Immunseren verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. CT und CTB waren deutlich immunogen, während CTA nicht immunogen war. Somit ist die B-Untereinheit von CT notwendig und ausreichend, um eine starke Antikörper-Antwort auszulösen. Tabelle 12: Antikörper gegenüber CT, CTA und CTB
Beispiel 13
BALB/c-Mäuse wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen mit 100 μg Diphtherie-Toxoid und 10 μg Pertussis-Toxin pro 100 μl Saline-Losung immunisiert. Die Lösungen wurden für 10 Sekunden vor der Immunisierung verwirbelt.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests quantitativ bestimmt, der unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde. Die gegen das Diptherie-Toxoid gerichteten Antikörper wurden nur in denjenigen Tieren nachgewiesen, die sowohl mit dem Pertussis-Toxin als auch mit dem Diptherie-Toxoid immunisiert wurden.
Die höchsten Immun-Antworten wiesen die gegen das Diphtherie-Toxoid gerichteten Antikörper mit ELISA-Einheiten von 1.038 auf. Somit wirkt eine geringe Menge des Pertussis-Toxins als ein Adjuvans für das Antigen des Diphtherie-Toxoids. Das Toxoid alleine führte nicht zu einer Auslösung einer Immunantwort, was den Schluss nahelegt, dass das Verfahren, welches das Toxoid zum Toxoid macht, den Anteil des Moleküls beeinflusst, der für die unterstützenden Wirkungen verantwortlich ist, die in dem ADP-ribosylierenden Exotoxin gefunden werden. Tabelle 13: Antikörper gegen Diphtherie
Beispiel 14
BALB/c-Mause wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden einmal zum Zeitpunkt von 0, 8 und 20 Wochen mit 50 μg Pertussis-Toxin pro 100 μl Saline-Lösung immunisiert (List, Kat. Nr. 181, Char. Nr. 181-20a).
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests quantitativ bestimmt, der unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde. Die gegen das Pertussis-Toxin gerichteten Antikörper wurden 1 Woche nach der letzten Booster-Immunisierung in den Tieren nachgewiesen, die mit Pertussis immunisiert wurden. Alle 5 Tiere zeigten nach der letzten Immunisierung erhöhte Konzentrationen von Antikörpern, die gegen das Pertussis-Toxin gerichtet sind. Somit wirkt das Pertussis-Toxin als ein Adjuvans für sich selbst und induziert PT-spezifische IgG-Antikörper. Die unterstützende Wirkung von PT kann hilfreich bei der Kombination von Impfstoffen sein, wie zum Beispiel Diphtherie, Keuchhusten, Wundstarrkrampf, Hib, bei der Steigerung der Antikörper-Antwort auf gleichzeitig verabreichte Antigene, sowie für PT selbst. Tabelle 14: Antikörper-Antwort auf das Pertussis-Toxin
Beispiel 15
BALB/c-Mause wurden in Gruppen von 5 Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift „Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden einmal zum Zeitpunkt von 0 Wochen mit 50 μg Tetanus-Toxoid und 100 μg Cholera-Toxin pro 100 μl Saline-Lösung immunisiert.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests quantitativ bestimmt, wie vorstehend unter der Überschrift „ELISA IgG(H+L)" beschrieben. Die gegen das Tetanus-Toxoid gerichteten Antikörper wurden bei 8 Wochen im Tier 5173 mit 443 ELISA-Einheiten nachgewiesen.
Beispiel 16
Die Möglichkeit, dass durch das Putzen nach dem epikutanen Auftragen und dem anschließenden Waschen der Stelle der Anwendung eine orale Immunisierung auftrat, wurde unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem CT bewertet, um das Schicksal des Antigens und des Adjuvans zu verfolgen. Die Mäuse wurden betäubt, und wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungs-Verfahren" beschrieben, mit 100 μg ¹²⁵I-markiertem CT (150.000 Zerfälle pro Minute (counts per minute; cpm)/μg CT) transkutan immunisiert. Die Kontrollmäuse blieben für 6 Stunden betäubt, um deren Putzen auszuschließen, und die Mäuse für das Experiment wurden für 1 Stunde betäubt, und anschließend ließ man sie nach dem Waschen sich putzen. Die Mäuse wurden nach 6 Stunden geopfert, die Organe gewogen, und die ¹²⁵I-Zerfälle mit einem γ-Zähler der Firma Packard gezählt. Eine Gesamtmenge von 2 bis 3 μg CT wurde auf der rasierten Haut an der Stelle der Immunisierung nachgewiesen (14.600 Zerfälle pro Minute/μg Gewebe), während ein Maximum von 0,5 μg CT im Magen (661 Zerfälle pro Minute/μg Gewebe) bzw. im Darm (9 Zerfälle pro Minute/μg Gewebe) nachgewiesen wurde.
Die orale Immunisierung (n=5) mit 10 μg CT, falls dieses in einer Saline vorliegt, zum Zeitpunkt von 0 und 3 Wochen (ohne NaHCO₃) löste nach 6 Wochen eine durchschnittliche Antwort von IgG-Antikörpern von < 1.000 ELISA-Einheiten aus, während die transkutane Immunisierung mit 100 μg CT, wie vorstehend gezeigt, dazu führte, dass weniger als 5 μg CT in der Haut nach dem Waschen verblieben, so dass sich eine anti-CT-Antwort von 42.178 ELISA-Einheiten nach 6 Wochen ergab. Das Herbeiführen einer Immunantwort von oral zugeführtem CT erfordert die Zugabe von NaHCO₃ zu der Immunisierungs-Lösung (Piece, 1978; Lycke und Holmgren, 1986). Somit trägt die orale Immunisierung nicht in erheblichem Maß zu den Antikörpern bei, die nachgewiesen werden, wenn CT epikutan auf die Haut aufgetragen wird.
Beispiel 17
Ein in-vivo-Nachweis der Aktivierung der Langerhans-Zellen wurde erhalten, indem Cholera-Toxin (CT) in Saline epikutan auf die Haut aufgetragen wurde, insbesondere auf die Ohren der Maus, wobei große Populationen von Langerhans-Zellen leicht sichtbar gemacht werden können (Enk et al., 1993; Bacci et al., 1997), und indem das Gewebe in Bezug auf die durch den Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes (MHC) kodierten Klasse II-Moleküle gefärbt wurde, die in aktivierten Langerhans-Zellen in hohem Maße exprimiert werden (Shimada et al., 1987).
Die Ohren der BALB/c-Mause wurden auf der dem Rücken zugewandten Seite entweder mit 100 μg CT in Saline, mit 100 μg CTB in Saline, ausschließlich mit Saline für 1 Stunde bestrichen, oder es wurde eine intradermale Injektion zur Positivkontrolle mit 100 pg LPS oder 10 μg TNF-α durchgeführt, während die Maus betäubt wurde. Die Ohren wurden anschließend gründlich gewaschen, und nach 24 Stunden wurden die Ohren entfernt und die epidermalen Hautschichten wurden geerntet und in Bezug auf die Expression der durch den MHC kodierten Klasse II-Moleküle gefärbt, wie von Caughman et al. (1986) beschrieben. Die epidermalen Hautschichten wurden mit MKD6 (anti-I-A^d) oder der Negativkontrolle Y3P (anti-I-A^k) gefärbt, und der gegen Maus gerichtete, mit FITC konjugierte Antikörper F(ab)₂ aus der Ziege wurde als Reagens im zweiten Schritt eingesetzt. Es wurde zuvor gefunden, dass die transkutan auf dem Ohr immunisierten Mäuse (wie vorstehend beschrieben ohne Rasur) anti-CT-Antikörper von 7.000 ELISA-Einheiten 3 Wochen nach einer einmaligen Immunisierung aufweisen.
Die gesteigerte Expression der durch den MHC kodierten Klasse II-Moleküle, wie durch die Färbungs-Intensität nachgewiesen, die verminderte Zahl der Langerhans-Zellen (insbesondere mit Cholera-Toxin) und die Veränderungen der Morphologie der Langerhans-Zellen wurden in den epidermalen Schichten derjenigen Mäuse gefunden, die mit CT und CTB immunisiert wurden, die den Kontrollen (1) vergleichbar sind, was den Schluss nahe legt, dass die Langerhans-Zellen durch das epikutan aufgetragene Cholera-Toxin aktiviert wurden (Aiba und Katz, 1990; Enk et al., 1993).
Beispiel 18
Die Langerhans-Zellen stellen den epidermalen Anteil einer Familie von starken akzessorischen Zellen, genannt "dendritische Zellen", dar. Man glaubt, dass die Langerhans-Zellen (und vielleicht verwandte Zellen in der Dermis) für die Immunantworten erforderlich sind, die gegen fremde Antigene gerichtet sind, denen sie in der Haut begegnen. Der "Lebenszyklus" der Langerhans-Zellen wird durch mindestens zwei unterschiedliche Stadien gekennzeichnet. Die Langerhans-Zellen in der Epidermis (die "Wächter") können Teilchen aufnehmen und Antigene wirksam verarbeiten, sie sind jedoch schwache Stimulatoren von T-Zellen, die noch keinen Kontakt mit Antigenen hatten. Im Gegensatz dazu sind Langerhans-Zellen, die induziert wurden, um nach dem Kontakt mit dem Antigen in der Epidermis zu den Lymphknoten zu wandern (die "Boten"), schwach phagozytisch und besitzen begrenzte Antigen-verarbeitende Fähigkeiten, sie sind jedoch starke Stimulatoren von natürlichen T-Zellen. Falls die Langerhans-Zellen sowohl ihre Rollen als "Wächter" und als "Boten" verwirklichen sollen, müssen sie in der Lage sein, in der Epidermis fortzubestehen, und ebenso in der Lage sein, die Epidermis in einer kontrollierten Weise nach der Exposition gegenüber dem Antigen zu verlassen. Somit stellt die Regulation der Adhäsion der Langerhans-Zellen an die Keratinozyten einen entscheidenden Kontrollpunkt des Verkehrs und der Funktion der Langerhans-Zellen dar.
Die Langerhans-Zellen exprimieren E-Cadherin (Blauvelt et al., 1995), ein homophiles Adhäsionsmolekül, das in den Epithelien in bedeutender Weise vertreten ist. Die Keratinozyten exprimieren ebenso dieses Adhäsionsmolekül, und E-Cadherin vermittelt klar die Adhäsion der Langerhans-Zellen aus der Maus an die Keratinozyten in vitro. Es ist bekannt, dass E-Cadherin an der Lokalisation der Langerhans-Zellen in der Epidermis beteiligt ist. Siehe Stingl et al. (1989) für einen Übersichtsartikel zur Charakterisierung und den Eigenschaften der Langerhans-Zellen und der Keratinozyten.
Die Wanderung der epidermalen Langerhans-Zellen (LC) und ihr Transport des Antigens von der Haut zu den ableitenden Lymphknoten ist als wichtig bei der Induktion der kutanen Immunantworten bekannt, wie zum Beispiel der Kontakt-Sensibilisierung. Während des Überganges zu den Lymphknoten unterliegen die Langerhans-Zellen einer Vielzahl phänotypischer Veränderungen, die für ihre Bewegung von der Haut und für die Erlangung der Fähigkeit zur Antigen-Präsentation erforderlich sind. Zusätzlich zur gesteigerten Expression (upregulation) der durch den MHC kodierten Klasse II-Moleküle gibt es Veränderungen in der Expression der Adhäsionsmoleküle, die die Wechselwirkungen mit der umgebenden Gewebematrix und mit den T-Lymphozyten regulieren. Es ist bekannt, dass die Wanderung der Langerhans-Zellen mit einer deutlichen Herabsetzung der Expression von E-Cadherin (Schwarzenberger und Udey, 1996) und mit einer parallalen gesteigerten Expression von ICAM-1 (Udey, 1997) einhergeht.
Die transkutane Immunisierung mit bakteriellen ADP-ribosylierenden Exotoxinen (bARE's) zielt auf die Langerhans-Zellen in der Epidermis. Die bAREs aktivieren die Langerhans-Zellen und transformieren sie von ihrer Wächterrolle zu ihrer Botenrolle. Das aufgenommene Antigen wird anschließend zu den Lymphknoten mitgenommen, wo es den B- und T-Zellen präsentiert wird (Streilein und Grammer, 1989; Kripke et al., 1990; Tew et al., 1997). Bei diesem Prozess reifen die epidermalen Langerhans-Zellen zu einer Antigen-präsentierenden dendritischen Zelle im Lymphknoten (Schuler und Steinman, 1985); die Lymphozyten, welche in einen Lymphknoten eintreten, trennen sich in B-Zell-Follikel und T-Zell-Bereiche. Es ist bekannt, dass die Aktivierung einer Langerhans-Zelle, die zu einer wandernden Langerhans-Zelle wird, nicht nur mit einer merklichen Zunahme der Expression der durch den MHC kodierten Klasse II-Moleküle, sondern auch mit einer merklichen Abnahme in der Expression von E-Cadherin und einer gesteigerten Expression von ICAM-1 einhergeht.
Wir stellen uns vor, dass das Cholera-Toxin (CT) und seine B-Untereinheit (CTB) die Expression von ICAM-1 steigern und die Expression von E-Cadherin auf den Langer hans-Zellen herabsetzen, sowie die Expression der durch den MHC kodierten Klasse II-Moleküle auf den Langerhans-Zellen steigern. CT oder CTB wirkt als Adjuvans, indem es die als Wächter fungierenden Langerhans-Zellen davon befreit, die Antigene, wie zum Beispiel BSA oder das Diphtherie-Toxoid, die durch die Langerhans-Zellen phagozytiert wurden, am gleichen Ort und zur selben Zeit zu präsentieren, wenn sie dem CT oder CTB begegnen, und wenn sie als Adjuvans wirken. Die Aktivierung der Langerhans-Zellen, um die Expression von ICAM-1 nach oben zu regulieren, und die Expression von E-Cadherin nach unten zu regulieren, kann durch die Freisetzung von Zytokinen, einschließlich TNF-α und IL-1β, aus den epidermalen Zellen oder den Langerhans-Zellen selbst vermittelt werden.
Man stellt sich dieses Verfahren der Unterstützung für die transkutane Immunisierung so vor, als gelinge es, für eine beliebige Verbindung zu arbeiten, welche die Langerhans-Zellen aktiviert. Die Aktivierung könnte in einer solchen Weise auftreten, dass sie die Expression von E-Cadherin nach unten reguliert und die Expression von ICAM-1 nach oben reguliert. Die Langerhans-Zellen würden dann Antigene, die aus Mischungen von solchen, die Langerhans-Zellen aktivierenden Verbindungen und Antigenen (wie zum Beispiel Diphtherie-Toxoid oder BSA) bestehen, zu den Lymphknoten tragen, wo die Antigene den T-Zellen präsentiert werden, und eine Immunantwort hervorrufen. Somit kann die aktivierende Substanz, wie zum Beispiel bARE, als ein Adjuvans für ein Antigen verwendet werden, das andernfalls transkutan nicht immunogen wäre, wie zum Beispiel das Diphtherie-Toxoid, indem die Langerhans-Zelle dazu aktiviert wird, das Antigen, wie zum Beispiel das Diphtherie-Toxoid, zu phagozytieren, zu dem Lymphknoten zu wandern, zu einer dendritischen Zelle zu reifen, und das Antigen den T-Zellen zu präsentieren.
Die Antwort der T-Helfer-Zellen gegenüber Antigenen, die in der transkutanen Immunisierung verwendet werden, kann durch die Anwendung von Zytokinen und/oder Chemokinen beeinflusst werden. Zum Beispiel kann Interleukin-10 (IL-10) die Antikörper-Antwort in Richtung einer Th2-IgG1/IgE-Antwort beeinflussen, während anti-IL-10 die Produktion von IgG2a-Antikörpern steigern kann (Bellinghausen et al., 1996).
Beispiel 19
Sequestrin ist ein Molekül, das auf der Oberfläche von Malaria-infizierten Erythrozyten exprimiert wird, das als Anker der von Malaria befallenen roten Blutzellen auf dem Gefäßendothel fungiert. Dies ist wesentlich für das Überleben der Parasiten und trägt unmittelbar zur Pathogenese von Malaria aufgrund von P. falciparum in Kindern bei, die an zerebraler Malaria sterben. Bei zerebraler Malaria werden die Gehirn-Kapillaren mit einer großen Zahl von mit Parasiten befallenen roten Blutzellen aufgrund der spezifischen Wechselwirkung des Sequestrin-Moleküls mit dem Endothel-Rezeptor CD36 des Wirts verstopft. Ockenhouse et al. identifizierten sowohl den Wirtsrezeptor CD36 und das Parasitenmolekül (Sequestrin), das diese Wechselwirkung zwischen Rezeptor und Liganden vermittelt. Ockenhouse et al. haben die Domäne des Sequestrin-Moleküls, die mit dem CD36-Rezeptor wechselwirkt, kloniert und als ein rekombinantes Protein exprimiert, das in E. coli hergestellt wird. Ein trunkiertes, 79 Aminosäuren umfassendes Sequestrin-Produkt wurde im nachfolgenden Beispiel verwendet.
Die aktive Immunisierung mit rekombinantem Sequestrin oder einer DNA, die für das Gen des Sequestrins kodiert, sollte die Bildung von Antikörpern auslösen, welche die Haftung der von Malaria befallenen Erythrozyten an den endothelialen CD36-Rezeptor des Wirts blockiert, und somit die Vervollständigung des Lebenszyklus des Parasiten verhindert, und dadurch aufgrund von dessen Unfähigkeit, an das Endothel zu binden, zum Tod des Parasiten führt. Die Strategie besteht darin, ein Verfahren der Immunisierung zu entwickeln, das einen hohen Titer von blockierenden Antikörpern auslöst. Ein solches Verfahren ist der transkutane Transport des Impfstoffs. Die Messung sowohl der gesamten Antikörper-Titer als auch der blockierenden Wirkung und Opsonisierung bildet die Basis für diese Vorgehensweise der transkutanen Immunisierung. Das rekombinante Sequestrin-Protein, das in den vorliegenden Experimenten verwendet wird, ist 79 Aminosäuren lang (~ 18 kDa) und umfasst die CD36-bindende Domäne des Moleküls. Wir haben ebenso ein nacktes DNA-Konstrukt konstruiert, welches diese Domäne umfasst, und konnten die Bildung von Antikörpern auslösen, wobei das Gen mittels einer "Kanone" durch die Epidermis zugeführt wurde.
BALB/c-Mause (n=3) wurden transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 8 Wochen unter Verwendung von 120 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: Ein Plasmid, welches für Sequestrin aus P. falciparum kodiert, wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 80 μg Plasmid, 80 μg CT (List Biologicals) pro 100 μl Saline enthält. 120 μl wurden auf das nicht markierte Ohr aufgetragen, nachdem das Ohr mit einem Alkoholtupfer (Triad Alcohol pad, 70% Isopropylalkohol) sorgfältig gereinigt wurde. Die Immunisierungs-Lösung wurde nicht durch Waschen entfernt.
Die Antikörper gegenüber Sequestrin wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift "ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, mit Seren bestimmt, die aus der Schwanzvene nach 3, 4, 7 und 9 Wochen nach der ersten Immunisierung gesammelt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 gezeigt.
Die DNA des Sequestrins mit CT löste eine nachweisbare Antikörper-Antwort gegenüber dem exprimierten Protein nach der zweiten Booster-Immunisierung aus. Damit die Immunisierung auftritt, muss das Protein exprimiert und vom Immunsystem verarbeitet werden. Somit wirkte CT als ein Adjuvans für die Immunantwort gegenüber dem Sequestrin-Protein, das durch das für Sequestrin kodierende Plasmid exprimiert wurde.
Es wurde gezeigt, dass DNA-Impfstoffe die Bildung neutralisierender Antikörper und von CTLs in nicht-menschlichen Primaten gegenüber Krankheiten auslösen, wie zum Beispiel Malaria (Gramzinski, Vaccine, 15, 913 – 915, 1997) und HIV (Shriver et al., Vaccine, 15, 884 – 887, 1997), und es wurde gezeigt, dass sie gegenüber verschiedenen Schweregraden in manchen Modellen Schutz verleihen (McClements et al., Vaccine, 15, 857 – 860, 1997). Man könnte erwarten, dass die DNA-Immunisierung durch die Haut Antworten auslöst, die ähnlich zu jenen sind, die sich mit einer Gen-"Kanone" ergeben, welche das Immunsystem der Haut zum Ziel hat (Prayaga et al., Vaccine, 15, 1349 – 1352, 1997). Tabelle 15: Serum-Antikörper gegen Sequestrin-Protein (Seq) in Tieren, die mit einer Sequestrin-DNA und Cholera-Toxin (CT) immunisiert wurden
Beispiel 20
BALB/c-Mause wurden in Gruppen zu fünf Mäusen unter Verwendung von Sequestrin transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0, 2 und 8 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: Zum Zeitpunkt von 0 Wochen wurden die Mäuse mit 59 μg CT und 192 μg Sequestrin in 410 μl Saline immunisiert, für die Gruppe von Mäusen, die Sequestrin und CT erhält; 192 μg Sequestrin in 410 μl Saline, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich Sequestrin erhält; und 120 μg CTB und 250 μg Sequestrin in 520 μl Saline, für die Gruppe von Mäusen, die Sequestrin und CTB erhält. 2 Wochen später wurden die Mäuse mit 345 μl Saline geboostert, die entweder 163 μg Sequestrin enthält, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich Sequestrin erhält; 345 μl Saline, die 163 μg Sequestrin mit 60 μg CT enthält, für die Gruppe von Mäusen, die CT plus Sequestrin erhält; 345 μl Saline, die 163 μg Sequestrin und 120 μg CTB enthält, für die Gruppe von Mäusen, die Sequestrin plus CTB erhält. Im zweiten Boost wurden den Mäusen 120 μg Sequestrin gegeben, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich Sequestrin erhält; 120 μg Sequestrin und 120 μg CT für die Gruppe von Mäusen, die CT plus Sequestrin erhält; und 120 μg Sequestrin und 120 μg CTB für die Gruppe von Mäusen, die Sequestrin plus CTB erhält.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift "ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, mit den Seren bestimmt, die 3, 5, 7, 9, 10, 11 und 15 Wochen nach der ersten Immunisierung gesammelt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 16 gezeigt. Sequesterin allein löste eine kleine, jedoch nachweisbare Immunantwort aus. Die Zugabe von CT stimulierte jedoch eine weitaus stärkere Immunantwort gegenüber Sequestrin, und CTB löste eine Immunantwort aus, die derjenigen überlegen war, die ausschließlich mit Sequestrin erhalten wurde. CT und CTB wirkten als Adjuvantien für die Immunantwort gegenüber Sequestrin, einem rekombinanten Protein.
Beispiel 21
BALB/c-Mäuse wurden in Gruppen zu fünf Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: FLUSHIELD (Wyeth-Ayerst, gereinigtes Subvirion, 1997 – 98 Formel, Char. Nr. U0980-35-1) wurde lyophilisiert und mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung zu ergeben, die 90 μg FLUSHIELD Subvirion pro 100 μl Saline enthielt, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich Influenza erhält; Influenza und CT wurden mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 90 μg FLUSHIELD-Antigene und 100 μg CT pro 100 μl Saline enthält, für die Gruppe von Mäusen, die Influenza und CT erhält.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift "ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, mit den Seren bestimmt, die 3 Wochen nach der ersten Immunisierung gesammelt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt. Influenza allein löste keine Antikörper-Antwort aus. Die Zugabe von CT stimulierte jedoch eine weitaus stärkere Immunantwort, die derjenigen überlegen war, die ausschließlich mit Influenza beobachtet wurde. Somit wirkte CT als ein Adjuvans für die Immunantwort gegenüber FLUSHIELD, einem Impfstoff eines Influenza-Subvirions, einer Mischung von Antigenen, die aus Viren stammen. Tabelle 17: Serum Antikörper gegen Influenza (Inf) Typ A und B in Tieren, die nur mit Influenza oder mit Influenza + Cholera-Toxin (CT) immunisiert wurden
Beispiel 22
LT stammt aus der Familie der ADP-ribosylierenden Exotoxine und ist ähnlich dem CT in Bezug auf das Molekulargewicht, bindet an das Gangliosid GM1, ist zu 80% homolog mit CT und weist eine ähnliche Stöchiometrie von A:B5 auf. Somit wurde LT ebenso als ein Adjuvans für DT in der transkutanen Immunisierung verwendet. BALB/c-Mäuse (n=5) wurden wie vorstehend beschrieben zum Zeitpunkt von 0, 8 und 18 Wochen mit einer Saline-Lösung immunisiert, die 100 μg LT (Sigma, Kat. Nr. E-8015, Char. Nr. 17hH-12000) und 100 μg CT (List Biologicals, Kat. Nr. 101b) in 100 μl Saline enthielt. Das LT löste eine mäßige Antwort gegenüber DT aus, wie in Tabelle 18 gezeigt.
ETA (List Biologicals, Char. Nr. ETA 25A) stammt aus der Familie der ADP-ribosylierenden Exotoxine, ist jedoch ein einzelnes Polypeptid, das an unterschiedliche Rezeptoren bindet. 100 μg ETA wurden in 100 μl Saline-Lösung, die 100 μg CT enthielt, den BALB/c-Mäusen auf den Rücken, wie vorstehend beschrieben, zum Zeitpunkt von 0, 8 und 18 Wochen verabreicht. ETA verstärkte die Antwort gegenüber DT bei 20 Wochen. Somit waren andere ADP-ribosylierende Exotoxine in der Lage, als Adjuvantien für gleichzeitig verabreichte Proteine zu wirken (Tabelle 18). Tabelle 18: Kinetik der Titer des Antikörpers gegen Diohtherie- Toxoid (DT) in Tieren, die mit dem Exotoxin A aus Pseudomonas aeruginosa (ETA) und DT, oder mit dem hitzelabilen Enterotoxin aus E. coli (LT) und DT immunisiert wurden
Beispiel 23
BALB/c-Mäuse wurden in Gruppen von fünf Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 Wochen, 8 Wochen und 18 Wochen mit 100 μl Saline immunisiert, die 100 μg Cholera-Toxin (List Biologicals, Kat. Nr. 1018, Char. Nr. 10149CB), 50 μg Tetanus-Toxoid (List Biologicals, Kat. Nr. 191B, Char. Nr. 1913a und 1915b) und 83 μg Diphtherie-Toxoid (List Biologicals, Kat. Nr. 151, Char. Nr. 15151) enthielten.
Die Antikörper gegen CT, DT und TT wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests quantitativ bestimmt, wie unter der Überschrift "ELISA IgG (H+L)" beschrieben. Die anti-CT-, anti-DT- oder anti-TT-Antikörper wurden zum Zeitpunkt von 23 Wochen nach der ersten Immunisierung nachgewiesen. Die Antikörper gegen das Diphtherie-Toxoid und das Cholera-Toxin waren in allen immunisierten Mäusen erhöht. Die höchste Antwort mit 342 ELISA-Einheiten wies ein Antikörper gegen das Tetanus-Toxoid auf, der annähernd das 80-fache der Konzentration des Antikörpers aufwies, die in Seren von nicht immunisierten Tieren nachgewiesen wurden. Somit kann eine Kombination von Antigenen, die nicht miteinander verwandt sind (CT/TT/DT) dazu verwendet werden, gegen die einzelnen Antigene zu immunisieren. Dies zeigt, dass das Cholera-Toxin als ein Adjuvans für viele verschiedene Impfstoffe verwendet werden kann. Tabelle 19: Serum Antikörper in Tieren, die gleichzeitig mit Cholera-Toxin, Tetanus-Toxoid und Diphtherie-Toxoid immunisiert wurden
Beispiel 25
Die transkutane Immunisierung unter Verwendung von CT löste starke Immunantworten aus. Diese Immunantwort auf eine intramuskuläre Injektion oder eine orale Immunisierung wurde mit der transkutanen Immunisierung unter Verwendung von CT als Adjuvans und Antigen verglichen. 25 μg CT (List Biologicals, Kat. Nr. 101b), das in Saline gelöst wurde, wurde oral in 25 μl Saline an BALB/c-Mäuse (n=5) unter Verwendung einer 200 μl-Pipettenspitze verabreicht. Die Mäuse schluckten die Immunisierungs-Lösung leicht. 25 μl Saline mit einer Konzentration von 1 mg/ml CT wurde am Ohr wie beschrieben an die Gruppe verabreicht, die als transkutan markiert war. 25 μg CT in Saline wurden intramuskulär in den vorderen Oberschenkel im Falle der Gruppe injiziert, die als intramuskulär gekennzeichnet war.
Die Mäuse, denen intramuskulär CT injiziert wurde, entwickelten eine merkliche Schwellung und Spannungen an der Injektionsstelle, und entwickelten hohe Konzentrationen von anti-CT-Antikörpern. Die Mäuse, die transkutan immunisiert wurden, wiesen keine Rötung oder Schwellung an der Stelle der Immunisierung auf, und entwickelten hohe Konzentrationen von anti-CT-Antikörpern. Die Mäuse, die oral immunisiert wurden, entwickelten weitaus geringere Konzentrationen von Antikörpern im Vergleich zu den Mäusen, die transkutan immunisiert wurden. Dies weist darauf hin, dass die orale Immunisierung durch Putzen in den transkutan immunisierten Mäusen nicht für die hohen Konzentrationen der Antikörper verantwortlich ist, die durch die transkutane Immunisierung induziert werden. Insgesamt ist der transkutane Weg der Immunisierung sowohl der oralen als auch der intramuskulären Immunisierung überlegen, da hohe Konzentrationen von Antikörpern ohne nachteilige Reaktionen bei der Immunisierung erreicht werden. Tabelle 20: Kinetik der Titer des Antikörpers gegen Cholera-Toxin in Tieren, die auf transkutane, orale oder intramuskuläre Art immunisiert wurden
Beispiel 26
BALB/c-Mäuse wurden in Gruppen zu fünf Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungs-Verfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden vom Zeitpunkt von 0, 8 und 20 Wochen unter Verwendung von 100 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die wie folgt hergestellt wurde: Hib-Konjugat (Connaught, Char. Nr. 6381401, 86 μg/ml) wurde lyophilisiert, um das Antigen zu konzentrieren. Das lyophilisierte Produkt wurde mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 50 mg Hib-Konjugat pro 100 ml Saline-Lösung enthält, für die Gruppe von Mäusen, die ausschließlich das Hib-Konjugat erhält; Hib-Konjugat und CT wurden mit Saline gemischt, um eine Immunisierungs-Lösung herzustellen, die 50 μg Hib-Konjugat und 100 μg CT pro 100 μl Saline enthält, für die Gruppe von Mäusen, die Hib-Konjugat und CT erhält.
Die Antikörper wurden unter Verwendung eines ELISA-Tests, der vorstehend unter der Überschrift "ELISA IgG(H+L)" beschrieben wurde, mit Seren bestimmt, die 3 Wochen nach der zweiten Immunisierung genommen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt. Das Hib-Konjugat allein löste eine geringe, jedoch nachweisbare Antikörper-Antwort aus. Jedoch stimulierte die Zugabe von CT eine weitaus stärkere Immunantwort gegenüber Hib-Konjugat. CT wirkte als ein Adjuvans für die Immunantwort gegenüber dem Hib-Konjugat. Dies weist darauf hin, dass ein Antigen in Form eines Polysaccharid-Konjugats als transkutanes Antigen durch das beschriebene Verfahren verwendet werden kann. Tabelle 21: Antikörper gegen Haemophilus influenzae B (Hib)
Beispiel 27
Emulsionen, Cremes und Gele können praktische Vorteile für die bequeme Verteilung der immunisierenden Verbindung über die Hautoberfläche, über das Haar oder über die Körperfalten bereitstellen. Darüber hinaus können solche Zubereitungen Vorteile ergeben, wie zum Beispiel eine Abdeckung oder Hydratation, welche die Wirksamkeit der Immunisierung steigern können.
Das hitzelabile Enterotoxin (LT) aus E. coli (Sigma, Kat. Nr. E-8015, Char, Nr. 17hH1200) wurde verwendet, um die Wirksamkeit der transkutanen Immunisierung unter Verwendung einer einfachen Saline-Lösung und einer üblicherweise erhältlichen Salbe auf Mineralöl-Basis, nämlich AQUAPHOR, zu vergleichen, die "allein oder als Mischung mit nahezu allen Salben, die wässerige Lösungen verwenden, oder in Kombination mit anderen Öl-basierten Substanzen oder allen gewöhnlichen topischen Arzneimitteln verwendet werden kann". (Seite 507 PDR, für nicht verschreibungspflichtige Arzneimittel, 1994, 15. Auflage). Die Mäuse wurden mit einem Bereich von Dosen behandelt, um die relative Antikörper-Antwort auf abnehmende Dosen in den vergleichbaren Vehikeln zu bewerten.
Die BALB/c-Mäuse wurden wie vorstehend beschrieben immunisiert, mit der Ausnahme, dass die Immunisierungs-Lösung für 3 Stunden auf den Rücken aufgetragen wurde. Die Saline-Lösungen von LT wurden hergestellt, um eine 50 μl-Dosis einer Lösung und entweder 100 μg, 50 μg, 25 μg bzw. 10 μg des Antigens in der Lösung herzustellen, wobei eine Lösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml, 1 mg/ml, 0,5 mg/ml bzw. 0,2 mg/ml verwendet wurde. Nach 3 Stunden wurde der Rücken sorgfältig unter Verwendung einer feuchten Gaze abgewischt, um die Immunisierungs-Lösung zu entfernen.
Die Wasser-in-Öl-Zubereitung wurde wie folgt hergestellt: Gleiche Volumina von AQUAPHOR und Antigen in der Saline-Lösung wurden in 1 ml Glasspritzen für Tuberculin mit einem genormten Verbindungssystem (luer lock) gemischt, wobei eine emulgierende Kanüle mit der Kennzeichnung 15 verwendet wurde, die die beiden Spritzen verbindet, und wobei die Substanzen gemischt wurden, bis die Mischung homogen war. Eine Lösung mit einer Konzentration von 4 mg/ml, 2 mg/ml, 1 mg/ml bzw. 0,5 mg/ml von LT in Saline wurde verwendet, um sie mit einem gleichen Volumen von AQUAPHOR zu mischen. 50 μl dieser Mischung wurden auf den rasierten Rücken für 3 Stunden aufgetragen und anschließend sorgfältig durch Wischen mit einer Gaze entfernt. Die Dosis des Antigens für die Wasser-in-Öl-Emulsionen, die LT enthielten, wurden gewogen, um 50 μl zu verabreichen. Das Verhältnis des Gewichts pro Volumen wurde durch Addition des spezifischen Gewichts der Saline (1,00 g/ml) und von AQUAPHOR, 0,867 g/ml, sowie durch Teilung der Summe durch 2 berechnet, so dass sich eine endgültige spezifische Dichte von 0,9335 g/ml ergab. Annähernd 47 mg der Wasser-in-Öl-Emulsion, die LT enthielt, wurden den Mäusen zur Immunisierung verabreicht.
Eine Dosis-abhängige Beziehung war sowohl in dem Fall ersichtlich, in dem LT mit Saline verabreicht wurde, als auch in dem Fall, bei dem LT in einer Wasser-in-Öl-Emulsion verabreicht wurde (Tabelle 22). 100 μg führten zu der höchsten Konzentration von Antikörpern, und 10 μg führten zu einer geringeren, jedoch starken Immunantwort. Das in einer Wasser-in-Öl-Emulsion enthaltene LT führte zu einer ähnlichen Antwort, verglichen mit LT in Saline, und scheint einen bequemen Transport-Mechanismus für die transkutane Immunisierung anzubieten. In ähnlicher Weise könnten Gele, Cremes oder komplexere Formulierungen, wie zum Beispiel Öl-in-Wasser-in-Öl-Emulsionen dazu verwendet werden, um das Antigen für die transkutane Immunisierung zu verabreichen.
Solche Zusammensetzungen könnten in Verbindung mit Pflastern, abdeckenden Verbänden oder Reservoirs verwendet werden, und sie könnten eine Langzeit-Anwendung oder eine Kurzzeit-Anwendung des immunisierenden Antigens und Adjuvans ermöglichen. Tabelle 22: Serum-Antikörper gegen das hitzelabile Enterotoxin aus E. coli (LT) in Tieren, die mit verschiedenen Dosen von LT in einer Saline oder in einer AQUAPHOR-Emulsion immunisiert wurden
Beispiel 28
Die Mäuse wurden in Gruppen von fünf Mäusen transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0, 8 und 18 Wochen mit 100 μl Saline immunisiert, die 50 μg Tetanus-Toxoid (List Biologicals, Kat. Nr. 191B, Char. Nr. 1913a und Char. Nr. 1915b) und 83 μg Diphtherie-Toxoid (List Biologicals, Kat. Nr. 151, Char. Nr. 15151), sei es allein oder in Kombination mit 100 μg Cholera-Toxin (List Biologicals, Kat. Nr. 1018, Char. Nr. 10149C6), enthielten.
Die Antikörper gegen das Diphtherie-Toxoid wurden quantitativ unter Verwendung eines ELISA-Tests bestimmt, der unter der Überschrift "ELISA IgG (H+L)" beschrieben wurde. Die erhöhten Konzentrationen der gegen das Toxoid gerichteten Antikörper wurden in Tieren nachgewiesen, die entweder mit TT/DT oder mit CT/TT/DT immunisiert wurden. Jedoch waren die Antikörper-Titer bei weitem in denjenigen Tieren überlegen, in denen CT als ein Adjuvans enthalten war. Der anti-Toxoid-Titer nahm offensichtlich in beiden Gruppen nach jeder nachfolgenden Immunisierung (8 und 10 Wochen) zu. Während also DT eine geringe, jedoch erhebliche Antwort gegenüber sich selbst auslösen kann, kann die Größenordnung der Antwort gesteigert werden durch 1) die Einbeziehung des Cholera-Toxins als ein Adjuvans und 2) durch Bonstern mit dem Adjuvans Cholera-Toxin und dem Antigen (Diphtherie-Toxoid). Klassische Booster-Antworten sind vom T-Zell-Gedächtnis abhängig, und die Verstärkung der anti-DT-Antikörper in diesem Experiment weist darauf hin, dass die T-Zellen in die transkutane Immunisierung eingreifen.
Beispiel 29
C57BI/6-Mäuse wurden mit CT (Azid-frei, Calbiochem), wie vorstehend beschrieben, auf dem rasierten Rücken der Mäuse transkutan immunisiert. Die Mäuse wurden unter Verwendung eines letalen Testmodells 6 Wochen nach der Immunisierung getestet (Mallet et al., Immunoprophylactic efficacy of nontoxic mutants of Vibrio cholerae-Toxin (CTK63) and Escherichia coli heat-labile toxin (LTK63) in a mouse cholera toxin intranasal challenge model; zur Veröffentlichung eingereicht bei Immunology Letters). In dem Test wurde den Mäusen 20 μg CT (Calbiochem, Azid-frei), das in Saline gelöst wurde, intranasal über die Spitze einer Plastikpipette gegeben, während sie mit 20 μl Ketamin-Rompin betäubt wurden. In Versuch Nr. 1 überlebten 12 von 15 immunisierten Mäusen den Test nach 14 Tagen, und 1 von 9 nicht-immunisierten Kontrollmäusen überlebte. 5 Kontrollmäuse gingen vor dem Test aufgrund der Betäubung verloren. Die Mäuse in Test Nr. 1 wiesen ein Serum mit 15.000 ELISA-Einheiten von anti-CT-Antikörpern (geometrisches Mittel) auf, und 5 immunisierte Mäuse, die zur Zeit des Tests geopfert wurden, wiesen ein Waschwasser aus der Lunge auf, in dem in 5 von 5 Mäusen IgG-Antikörper nachgewiesen wurden. Das Waschwasser aus der Lunge wurde wie vorstehend beschrieben gesammelt.
Die Immunisierung und der Test wurden mit natürlichen C57BI/6-Mäusen wiederholt, und 7 von 16 immunisierten Mäusen überlebten den Test, während lediglich 2 von 17 nicht-immunisierten Mäusen den Test überlebten. Die immunisierten Mäuse im Test Nr. 2 wiesen anti-CT-IgG-Antikörper von 41.947 ELISA-Einheiten auf (geometrisches Mittel). Die jeweiligen Waschwasser aus der Lunge von fünf Mäusen, die zum Zeitpunkt des Tests geopfert wurden, zeigten sowohl anti-CT-IgG- als auch -IgA-Antikörper (Tabelle 24). Stuhlproben von 8 der 9 Mäuse zeigten sowohl anti-CT-IgG- als auch -IgA-Antikörper (Tabelle 25). Die Stuhlproben wurden frisch aus den Tieren gesammelt, die zum Zeitpunkt des Tests den Darm spontan entleerten. Die Stuhlproben wurden bei – 20°C eingefroren. Zum Zeitpunkt des ELISA-Tests wurden die Stuhlproben aufgetaut, in 100 μl PBS homogenisiert, zentrifugiert, und der ELISA-Test wurde mit dem Überstand durchgeführt. Die kombinierte Überlebensrate unter den immunisierten Mäusen betrug 19 von 31 oder 61 %, während die kombinierte Überlebensrate unter den nicht-immunisierten Mäusen 3 von 26 oder 12 % betrug. Tabelle 24: Titer der IgG- und der IgA Antikörper gegen Cholera-Toxin im Lungen-Waschwasser
Beispiel 30
Weibliche C57BI/6-Mäuse wurden von Charles River Laborstories erhalten. Die Mäuse wurden mit 200 μg Ovalbumin (OVA; Sigma, Char. Nr. 14117035, Stammlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml in PBS) und 50 μg Cholera-Toxin (List Biologicals, Char. Nr. 101481B, Stammlösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml) immunisiert. Ein γ-Zahler, Packard Cobra, wurde verwendet (laufende Nr. 102389), um die Menge des freigesetzten ⁵¹Cr zu messen.
C57BI/6-Mäuse wurden mit 0,03 ml Ketamin-Rompin betäubt und auf dem Rücken mit einer Haarschneidemaschine rasiert, ohne die Haut zu verletzen, und man ließ sie für 24 Stunden ruhen. Die Mäuse wurden betäubt und anschließend zum Zeitpunkt von 0 und 28 Tagen mit 150 μl Immunisierungs-Lösung immunisiert, die auf die rasierte Haut über eine Fläche von 2 cm² für 2 Stunden aufgebracht wurde. Die Mäuse wurden anschließend zweimal mit feuchter Gaze abgewischt. Die Mäuse zeigten keine nachteiligen Wirkungen, weder von der Betäubung, der Immunisierung, noch vom Wasch-Verfahren. Dieses Verfahren wurde wöchentlich für 3 Wochen wiederholt.
Milz-Lymphozyten wurden 1 Woche nach der Booster-Immunisierung gesammelt. Die Zellen wurden in vitro in RPMI-1640 und 10 % FBS (mit Penicillin-Streptomycin, Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat und 2-Mercaptoethanol) für 6 Tage unter Zugabe von 5 % Ratten-Concanavalin A-Überstand kultiviert, das als Quelle für IL-2 diente, sei es mit oder ohne Antigen. Die Zielzellen bestanden aus syngenen (H-2^b)-EL4-Zellen allein und EL4-Zellen, die mit dem CTL-Peptid SINFEKKL gepulst wurden, allogenen (H-2k)-L929-Zellen und EG7-Zellen. Die Zielzellen (1 ×10⁶ Zellen pro Vertiefung) wurden für 1 Stunde mit 0,1 mCi ⁵¹Cr pro Vertiefung (Quelle Na₂CrO₄, Amersham) markiert, und sie wurden zu den Effektor-Zellen in einem Verhältnis gegeben, das im Bereich von 3:1 bis 100:1 lag. Die Zellmischungen wurden in Gewebekulturplatten mit rundem Boden und 96 Vertiefungen (Costar, Kat. Nr. 3524) in 0,2 ml vollständigem RPMI-1640, 10 % FBS-Medium für 5 Stunden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre bei 5 % CO₂ inkubiert. Am Ende dieser Kultur von 5 Stunden wurden die Überstände von Baumwolldochten absorbiert und für die Bestimmung der Freisetzung von ⁵¹Cr verarbeitet. Die spezifische Lyse wurde wie folgt bestimmt:
% spezifische Lyse = 100 × [(experimentelle Freisetzung – spontane Freisetzung)/(maximale Freisetzung – spontane Freisetzung)]
Wie in Tabelle 26, Teil 1, gezeigt, wurden CTLs gegen die mit dem EL4-Peptid gepulsten Zellen bei einem E:T-Verhältnis von 100:1 für die mit CT + OVA immunisierte Gruppe nachgewiesen. CTL-Assays sind nicht positiv, falls die prozentuale spezifische Lyse nicht größer als 10% oder deutlich oberhalb des Hintergrunds der prozentualen Lyse, der von den durch das Medium stimulierten Effektoren bewirkt wird. Wie in Tabelle 26, Teil 2, gezeigt, wurden CTLs in ähnlicher Weise gegen EG7-Zellen (OVA-transfizierte Zellen) bei einem E:T-Verhältnis von 100:1 für die mit CT + OVA immunisierte Gruppe nachgewiesen. Somit unterstützte CT die Produktion von CTLs auf transkutanem Weg. Tabelle 26: OVA-spezifische CTL, die transkutan induziert wurden Teil 1 – Zielzellen: EL4 + Peptid
Teil 2 – Zielziellen: EG7 (OVA transfiziert)
Beispiel 31
C57BI/6-Mäuse (n=6) wurden transkutan immunisiert, wie vorstehend unter der Überschrift "Immunisierungsverfahren" beschrieben. Die Mäuse wurden zum Zeitpunkt von 0 und 4 Wochen mit 100 μl Saline immunisiert, die 100 μg Cholera-Toxin (List Biologicals, Kat. Nr. 101B, Char. Nr. 10149C6) und 250 μg Ovalbumin-Protein (Sigma, Albumin-Hühnerei, Grad V, Kat. Nr. A5503, Char. Nr. 14H7035) enthielt.
Einzelne Zell-Suspensionen wurden aus der Milz hergestellt, die aus den Tieren 8 Wochen nach der ersten Immunisierung geerntet wurden. Die Milzzellen wurden in einer Kultur bei 8 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 200 μl kultiviert, welche das OVA-Protein oder das unerhebliche Protein Conalbumin mit den angegebenen Konzentrationen enthielt. Die Kulturen wurden für 72 Stunden bei 37°C in einem CO₂-Inkubator inkubiert, und zu dieser Zeit wurden 0,5 μCi/Vertiefung ³H-Thymidin zu jeder Vertiefung gegeben. 12 Stunden später wurde die Vermehrung durch die Ernte der Platten und der quantitativen Bestimmung des eingebauten, radioaktiv markierten Thymidins durch Flüssig-Szintillationszählung festgestellt. Die Rohdaten des Einbaus von ³H sind in Zerfälle pro Minute (counts per minute; cpm) angegeben, und der Faktor der Zunahme (Zerfälle pro Minute im Experiment/Zerfälle pro Minute im Medium) ist rechts von jeder Probe angegeben. Ein Faktor der Zunahme von mehr als drei wird als erheblich angesehen.
Eine erhebliche Vermehrung wurde nur nachgewiesen, wenn die Milzzellen mit dem Protein Ovalbumin stimuliert wurden, mit welchem die Tiere in vivo immunisiert wurden; nicht dagegen, wenn sie mit dem unerheblichen Protein Conalbumin immunisiert wurden. Somit führt die transkutane Immunisierung mit Cholera-Toxin und Ovalbumin-Protein zu einer Antigen-spezifischen Vermehrung der Milzzellen in vitro, was darauf hinweist, dass eine zelluläre Immunantwort durch dieses Verfahren hervorgerufen wird. Tabelle 27: Antigen-spezifische Vermehrung von Milzzellen aus Tieren, die mit Cholera-Toxin (CT) und Ovalbumin (DVA) immunisiert wurden
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Claims

Verwendung eines Antigens und eines Adjuvans bei der Herstellung einer Formulierung für die transkutane Immunisierung eines Probanden, wobei die Formulierung eine Immunantwort auslöst, die spezifisch für das Antigen ist, und die auf die Anwendung der Formulierung auf der Haut des Probanden folgt, und wobei die Formulierung darüber hinaus keinen Penetrationsverstärker umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvans aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer bakteriellen DNA, Cytokinen, Chemokinen und Lipopolysacchariden, einem Molekül, das unmethylierte CpG-Motive enthält, einem Hitzeschockprotein, einem Derivat eines Hitzeschockproteins und Kombinationen derselben besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung darüber hinaus eine Zubereitung umfasst, um ein Pflaster für die transkutane Immunisierung zu bilden.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Zubereitung eine eingeschlossene Zubereitung ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine Menge eines Antigens, die für die Auslösung der Immunantwort wirksam ist, nicht in einem Liposom verkapselt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvans die Präsentation des Antigens gegenüber einem Lymphocyten verstärkt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvans eine antigen-präsentierende Zelle aktiviert.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die antigen-präsentierende Zelle eine Langerhans-Zelle oder eine dermale dentritische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvans die Expression des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplexes der Klasse II auf der antigen-präsentierenden Zelle steigert.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die antigen-präsentierende Zelle eine Langerhans-Zelle oder eine dermale dendritische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvans eine antigen-präsentierende Zelle, welche sich an der Stelle der Anwendung befindet, dazu veranlasst, zu einem drainierenden Lymphknoten zu wandern.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die antigen-präsentierende Zelle eine Langerhans-Zelle oder eine dermale dendritische Zelle ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adjuvans einer Langerhans-Zell signalisiert, zu einer dendritischen Zelle zu reifen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung im Wesentlichen aus dem Antigen und dem Adjuvans besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei ein einzelnes Molekül sowohl als Antigen als auch als Adjuvans wirkt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Formulierung im Wesentlichen aus lediglich einem Bestandteil besteht, der sowohl ein Antigen als auch ein Adjuvans ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei dem Antigen die Eigenschaften des Adjuvans fehlen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung eine wässrige Lösung ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung kein organisches Lösungsmittel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung als eine Creme, eine Emulsion, ein Gel, eine Lotion, eine Salbe, eine Paste oder eine Suspension formuliert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen zumindest teilweise gereinigt ist und von einem Pathogen stammt, das aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus einem Bakterium, einem Virus, einem Pilz oder einem Parasiten besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein mindestens teilweise gereinigtes Tumorantigen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein mindestens teilweise gereinigtes Autoantigen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein mindestens teilweise gereinigtes Allergen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen mindestens teilweise gereinigt ist und ein Molekulargewicht von mehr als 500 Dalton aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen mindestens teilweise gereinigt ist und ein Molekulargewicht von mehr als 800 Dalton aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen mindestens teilweise gereinigt ist und ein Molekulargewicht von mehr als 1000 Dalton aufweist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 25 – 27, wobei das Antigen proteinartig ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 25 – 27, wobei das Antigen ein Konjugat mit einem Polysaccharid ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen als eine ganze Zelle, ein Bakterium, ein Virion, ein lebender Virus, ein attenuierter Virus, ein inaktivierter Virus oder ein Virosom bereitgestellt wird.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Virus ein Tollwut-Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Virus ein Influenza-Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Bakterium ein Anthraxbakterium ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei das Bakterium ein enterotoxigenes E. coli ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung mindestens zwei verschiedene Antigene umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen als eine Nukleinsäure bereitgestellt wird, die eine für das Antigen codierende Sequenz umfasst, wobei das Adjuvans als eine Nukleinsäure bereitgestellt wird, die eine für das Adjuvans codierende Sequenz umfasst, oder wobei sowohl das Antigen als auch das Adjuvans als eine Nukleinsäure bereitgestellt werden, die für das jeweilige Molekül codierende Sequenzen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Nukleinsäure nicht integrierend und nicht replizierend ist.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Nukleinsäure darüber hinaus einen regulatorischen Bereich umfasst, der in funktioneller Weise mit der für das Antigen und/oder das Adjuvans codierenden Sequenz verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Formulierung kein virales Teilchen, Liposom oder geladenes Lipid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, welche darüber hinaus die Verwendung eines hydratisierenden Mittels umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, welche darüber hinaus die Verwendung eines Feuchthaltemittels umfasst.
Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Feuchthaltemittel Glycerin ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung eine Menge eines Antigens umfasst, die für die Auslösung einer Immunantwort wirksam ist, wobei das Antigen sich in Lösung befindet und/oder mit einem Liposom in Zusammenhang steht, jedoch nicht darin verkapselt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Antigen ein Kohlenhydrat, Glycolipid, Glycoprotein, Lipid, Lipoprotein, Phospholipid, Polypeptid, Protein oder Konjugat derselben ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 – 44, wobei das Adjuvans einen Rezeptor oder eine antigen-präsentierende Zelle bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 – 44, wobei das Adjuvans ein GM1-Gangliosid bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 – 44, wobei das Adjuvans ein Protein bindet, das mit dem α2-Macroglobulin-Rezeptor und dem Rezeptor für Lipoprotein mit niedriger Dichte in Beziehung steht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 – 44, wobei die Immunantwort keine allergische Reaktion, Dermatitis oder eine atopische Reaktion darstellt.
Pflaster für die Verwendung zur transkutanen Immunisierung, wobei das Pflaster ein Antigen und ein Adjuvans umfasst, und wobei die Anwendung des Pflasters auf der Haut des Probanden eine Immunantwort auslöst, die für das Antigen spezifisch ist.
Pflaster für die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 – 48.
Pflaster nach Anspruch 50, wobei die Anwendung dieses Pflasters die Formulierung hydratisiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 – 20, 28, 29, 35 und 40 – 44, wobei das Antigen durch rekombinante Mittel exprimiert wird.
Verwendung nach Anspruch 52, wobei das auf rekombinante Weise exprimierte Antigen ein Fusionsprotein ist, das einen Affinitäts-Anhang (affinity tag) oder einen Epitop-Anhang (epitope tag) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Virus ein Adeno-Virus ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Virus aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus dem Hepatitis-Virus mit dem Serotyp A, B, C, D, E oder aus Kombinationen derselben besteht.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Virus ein humanes Immunschwäche-Virus (HI-Virus) ist.
Verwendung nach Anspruch 30, wobei der Virus ein Papilloma-Virus ist.