DE69737071T2

DE69737071T2 - Integrierte mikrofluidische vorrichtungen

Info

Publication number: DE69737071T2
Application number: DE69737071T
Authority: DE
Inventors: J Robert Alameda Nelson; H Herbert Belmont Hooper; K Alan Hauser; P Alexander Sassi
Original assignee: Aclara Biosciences Inc
Current assignee: Monogram Biosciences Inc
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: DE69737071D1; US6007690A; JP3989964B2; ATE347692T1; CA2261869A1; EP1007953A1; US5770029A; JP2000515978A; EP1007953A4; EP1007953B1; AU3968097A; WO1998004909A1; AU744264B2; CA2261869C

Description

Diese Erfindung betrifft die Mikrofluidtechnologie, und insbesondere betrifft sie Mikrokanalvorrichtungen, bei denen Fluide zumindest teilweise durch Anlegen elektrischer Felder manipuliert werden.
Elektrophorese wurde zu einem unabdingbaren Werkzeug in der Biotechnologie und anderen Industrien, und sie wird bei einer Vielzahl von Anwendungen umfangreich verwendet, einschließlich der Trennung, Identifizierung und Präparierung reiner Proben von Nukleinsäuren, Proteinen, Kohlenwasserstoffen, der Identifizierung eines speziellen Analyten in einem komplexen Gemisch und dergleichen. Von zunehmendem Interesse auf dem erweiterten Gebiet der Elektrophorese ist Kapillarelektrophorese (CE), bei der spezielle Einheiten und Spezies durch ein Medium in einer Elektrophoresekammer von Kapillarabmessungen unter dem Einfluss eines angelegten elektrischen Felds bewegt werden. Zu Vorteilen von CE gehören kurze Laufzeiten, hohe Trenneffizienz, kleine Probenvolumina usw. Obwohl CE ursprünglich in Kapillarröhrchen ausgeführt wurde, ist die Vorgehensweise von zunehmendem Interesse, Mikrokanäle oder Mikrogräben mit Kapillarabmessung auf einem ebenen Substrat zu verwenden, was als Mikrokanalelektrophorese (MCE) bekannt ist. CE und MCE finden zunehmende Verwendung bei einer Anzahl verschiedener Anwendungen sowohl in der Grundlagenforschung als auch bei Industrieprozessen, einschließlich analytischen, biomedizinischen, pharmazeutischen, Umwelt-Molekular-biologischen, Nahrungsmittel- und klinischen Anwendungen.
Trotz der vielen Vorteile von CE und MCE ist der mögliche Nutzen dieser Techniken aus verschiedenen Gründen noch nicht vollständig realisiert. Wegen der Art der bei CE und MCE verwendeten Elektrophoresekammern sind bei Proben mit Analytkonzentrationen von unter ungefähr 10^-6 M im Allgemeinen keine guten Ergebnisse erzielbar. Diese untere Erkennungsgrenze betreffend die Analytkonzentration hat die möglichen Anwendungen von CE und MCE deutlich eingeschränkt. Beispielsweise fanden CE und MCE bei klinischen Anwendungen keine breite Anwendung, bei denen häufig ein interessierender Analyt mit einer Kon zentration von Femtomol bis Nanomol in einer komplexen Probe, wie Blut oder Urin, vorhanden ist.
Um die Erkennungsgrenzen von CE zu verbessern, wurden verschiedene Techniken entwickelt, einschließlich verbesserter Probeninjizierprozeduren, wie Analytschichtung (Beckers % Ackermans, "The Effect of Sample Stacking for High Performance Capillary Electrophoresis", J. Chromatogr. (1993) 629: 371–378), Feldverstärkung (Chien & Burgi, "Field Amplified Sample Injection in High-Performance Capillary Electrophoresis", J. Chromatogr. (1991) 559: 141–152) und transiente Isotachophorese (Stegehuis et al., "Isotachophoresis as an On-Line Concentration Pretreatment Technique in Capillary Electrophoresis", J. Chromatogr. (1991) 538: 393–402), wie auch verbesserte Probenerkennungsprozeduren und "Off-line"-Probenpräparationsprozeduren.
Eine andere Technik, die dazu entwickelt wurde, die bei CE erzielbare Erfassungsgrenze zu verbessern, bestand darin, eine Analytvorkonzentriervorrichtung zu verwenden, die direkt stromaufwärts gegenüber der Kapillare positioniert ist, d. h. in "On-line"- oder "Einzelströmungspfad"-Beziehung. So wie hier verwendet, sollen die Begriffe "on-line" und "Einzelströmungspfad" die Beziehung kennzeichnen, bei der das gesamte in eine Analytvorkonzentrierkomponente eingeleitete Fluid, d. h. die angereicherte Fraktion und die Restabfallfraktion des ursprünglichen Probenvolumens, notwendigerweise durch den Elektrophorese-Hauptabschnitt der Vorrichtung fließen, d. h. das Kapillarröhrchen mit dem Trennmedium. Ein Überblick über die verschiedenen verwendeten Konfigurationen ist von Tomlinson et al. in "Enhancement of Concentration Limits of Detection in CE and CE-MS: A Review of On-Line Sample Extraction, Cleanup, Analyte Preconcentration, and Microreactor Technology", J. Cap. Elec. (1995) 2: 247–266, und den dort vorhandenen Figuren angegeben.
Obwohl diese letztere Vorgehensweise für verbesserte Ergebnisse hinsichtlich der Analyterfassungsgrenzen sorgen kann, insbesondere hinsichtlich der Konzentrationsgrenze bei der Erfassung, kann sie einen schädlichen Einfluss auf andere Aspekte bei CE haben und dadurch die erzielbare Gesamtfunktion schmälern. Beispielsweise können Analytpeakbreiten bei On-line- oder Einzelströmungspfadvorrichtungen mit Analytvorkonzentratoren breiter sein.
Demgemäß besteht andauerndes Interesse an der Entwicklung verbesserter CE-Vorrichtungen, die bei Proben mit niedrigen Analytkonzentrationen, insbesondere solchen im Femtomol- und Nanomolbereich, gute Ergebnisse liefern können.
MCE-Vorrichtungen sind in US 5,126,022 ; US 5,296,114 , US 5,180,480 ; US 5,132,012 und US 4,908,112 offenbart. Zu anderen Literaturstellen, die MCE-Vorrichtungen beschreiben, gehören Harrison et al., "Micromachining a Miniaturized Capillary Electrophoresis-Based Chemical Analysis System on a Chip", Science (1992) 261: 895; Jacobson et al., "Precolumn Reactions with Electrophoretic Analysis Integrated on a Microchip", Anal. Chem. (1994) 66: 2949; Effenhauser et al., "High-Speed Separation of Antisense Oligonucleotides on a Micromachined Capillary Electrophoresis Device", Anal. Chem. (1994) 66: 2949; und Woolley & Mathies, "Ultra-High-Speed DNA Fragment Separations Using Capillary Array Electrophoresis Chips", P:N.A.S. USA (1994) 91: 11348.
Zu Patenten, die Vorrichtungen und Verfahren zur Analytvorkonzentrierung in einer Probe auf "On-line"-Weise vor CE offenbaren, gehören US 5,202,010 ,; US 5,246,577 und US 5,340,452 . Ein Überblick über verschiedene Verfahren der bei CE verwendeten Analytvorkonzentrierung ist von Tomlinson et al., in "Enhancement of Concentration Limits of Detection in CE and ME-MS: A Review of On-Line Sample Extraction, Cleanup, Analyte Preconcentration, and Microreactor Technology", J. Cap. Elec. (1995) 2: 247–266 angegeben.
Die internationale Patentanmeldung WO96/04547 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Ausführen von Mikrofluidmanipulationen zur chemischen Analyse oder Synthese. Mikrofluidkanäle werden unter Verwendung von Standardphotolithographieprozeduren und chemischem Nassätzen auf einem Mikrochip ausgebildet. Dann wird unter Verwendung eines Direktbondvorgangs eine Deckplatte mit dem Mikrochip verbunden. In den Mikrokanälen können Elektrophorese und Elektrochromatographie ausgeführt werden. Beispielsweise können Analyte durch elektrokinetisches Pumpen derselben durch eine Kreuzungsstelle in eine Vierwegekreuzung von Kanälen gefüllt werden, gefolgt von einem Schalten von Potentialen, um einen Analytpfropfen in einen Trennkanal zu drücken.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es sind integrierte Elektrophorese-Mikrovorrichtungen mit mindestens einem Anreichungskanal und einem Elektrophorese-Hauptströmungspfad sowie Verfahren zur Verwendung bei Elektrophoreseanwendungen geschaffen.
Gemäß einer ersten Erscheinungsform ist eine Mikrofluidvorrichtung zum Analysieren einer Probe mit einem Analytanteil und einem Abfallanteil geschaffen, wobei diese Mikrofluidvorrichtung ein Substrat mit einer Oberfläche sowie ferner Folgendes aufweist:
eine mikrofluidische Vorrichtung zum Analysieren einer einen Analytanteil und einen Abfallanteil aufweisenden Probe, mit einem eine Oberfläche aufweisenden Substrat sowie ferner:
mindestens einem Mikrokanal,
einem Einlass in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal zur Zuführung der Probe an diesen,
einer Anreicherungseinrichtung in dem mindestens einen Mikrokanal zum Trennen mindestens eines Teils des Analytanteils von dem Abfallanteil,
einem Erfassungsbereich, der in dem mindestens einen Mikrokanal stromabwärts von der Anreicherungseinrichtung angeordnet und für den Detektor zum Analysieren eines charakteristischen Merkmals der Probe zugänglich ist,
einem Abfallauslass in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal,
einer Transporteinrichtung zum Bewegen der Probe von dem Einlass zu der Anreicherungseinrichtung und des Abfallanteils von der Anreicherungseinrichtung zu dem Abfallauslass, und
mindestens einer ersten und einer in Abstand davon angeordneten zweiten Elektrode zur Herstellung von elektrischem Kontakt mit einer in der mikrofluidischen Vorrichtung vorhandenen Probe, um den Analytanteil mittels Elektrophorese von der Anreicherungseinrichtung zu dem Erfassungsbereich zu bewegen,
dadurch gekennzeichnet, dass der Abfallauslass stromaufwärts von dem Erfassungsbereich angeordnet ist und die Anreicherungseinrichtung ein Material aufweist, das ein selektives Zurückhalten des Analytanteils der Probe gestattet, so dass der besagte Teil des Analytanteils, nicht jedoch der Abfallanteil, zu dem Erfassungsbereich bewegbar ist, um eine genaue Analyse des Teils des Analytanteils in dem Erfassungsteil durch den Detektor zu ermöglichen.
Gemäß einer zweiten Erscheinungsform ist durch die Erfindung zum Analysieren einer Substanz mit einem ersten und einem zweiten Anteil unter Verwendung eines Substrats mit einer Oberfläche und mindestens einem mit einem Anreicherungsbereich und einem stromabwärts in Bezug auf diesen positionierten Erfassungsbereich versehenen Mikrokanal geschaffen, das die folgenden Schritte aufweist:
die Substanz wird über einen mit dem Mikrokanal in Fluidverbindung stehenden Einlass in den Mikrokanal eingeleitet,
in dem Anreicherungsbereich wird mindestens ein Teil des ersten Anteils von dem zweiten Anteil getrennt, wobei der zweite Anteil den Erfassungsbereich nicht durchläuft,
der zweite Anteil der Substanz wird über einen mit dem Anreicherungsbereich in Fluidverbindung stehenden Abfallauslass abgegeben, und
der besagte Teil des ersten Anteils wird durch Elektrophorese zu dem Erfassungsbereich transportiert,
dadurch gekennzeichnet, dass
(a) der Abfallauslass stromaufwärts von dem Erfassungsbereich angeordnet wird,
(b) der Anreicherungsbereich ein Anreicherungsmedium mit einem Material enthält, das ein selektives Zurückhalten des ersten Anteils der Substanz gestattet, und
(c) zum Transport durch Elektrophorese der von dem Anreicherungsmedium zurückgehaltene Teil des ersten Anteils zu dem Erfassungsbereich transportiert wird, wobei der besagte Teil des ersten Anteils, nicht aber der zweite Anteil, zu dem Erfassungsbereich bewegt wird, um in dem Erfassungsbereich eine genaue Analyse des besagten Teils des ersten Anteils durch den Detektor zu gestatten.
Der Anreicherungskanal dient dazu, eine spezielle Fraktion einer flüssigen Probe für anschließende Bewegung durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad anzureichern. Bei den betreffenden Vorrichtungen sind der Anreicherungskanal und der Elektrophoreseströmungspfad so positioniert, dass Abfallfluide vom Anreicherungskanal nicht durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad, sondern stattdessen durch einen Abtransportauslass strömt. Die betreffenden Vorrichtungen finden Anwendung bei einer Vielzahl von Elektrophoreseanwendungen, bei denen Objekte auf ein angelegtes elektrisches Feld hin durch ein Medium bewegt werden. Die betreffenden Vorrichtungen können beim Screening mit hohem Durchsatz für Genom- und pharmazeutische Anwendungen, wie Genentdeckung, Medikamentenentdeckung und -entwicklung sowie klinische Entwicklung; für In-vitro-Diagnose am Ort einer Pflegemaßnahme; für molekulare Genanalyse und Nukleinsäurediagnose; für Zelltrennvorgänge einschließlich Zellisolierung und Zellerfassung; und allgemein für biologische Forschung von besonderem Nutzen sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 liefert eine schematische Ansicht eines Anreicherungskanals zur Verwendung bei einer Vorrichtung gemäß der betrachteten Erfindung.
2 liefert eine schematische Ansicht einer alternativen Ausführungsform eines Anreicherungskanals, der ebenfalls zur Verwendung bei der betrachteten Vorrichtung geeignet ist.
3A liefert eine schematische Draufsicht einer Vorrichtung gemäß dem Gegenstand der Erfindung.
3B liefert eine Seitenansicht der Vorrichtung der 3A.
4 liefert eine schematische Draufsicht einer anderen Ausführungsform der betrachteten Erfindung.
5 liefert eine schematische Ansicht einer Ausführungsform der betrachteten Erfindung, bei der der Anreicherungskanal über einen einzelnen Fluideinlass und -auslass verfügt.
6 liefert eine schematische Ansicht einer Vorrichtung gemäß der betrachteten Erfindung, bei der der Anreicherungskanal über ein Elektrophoresegelmedium anstelle des Chromatographiematerials, wie in den 1 und 2 dargestellt, verfügt.
7 liefert eine schematische Draufsicht einer scheibenförmigen Vorrichtung gemäß der betrachteten Erfindung.
8 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 1 oder 2.
9 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in den 3A, 3B.
10 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 4.
11 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 5.
12 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 6.
13 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 7.
14 ist ein Flussdiagramm eines Teils einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das mehrere Einlässe in den Trennkanal zeigt.
15 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das eine alternative Konfiguration der Kreuzungsstelle zwischen dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad und einem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad zeigt.
16 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das mehrere Analysezonen zeigt, die der Reihe nach stromabwärts in Bezug auf den Anreicherungskanal angeordnet sind.
17 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das mehrere Analysezonen zeigt, die parallel stromabwärts in Bezug auf den Anreicherungskanal angeordnet sind.
18 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das mehrere Elektrophorese-Hauptströmungspfade stromabwärts in Bezug auf den Anreicherungskanal zeigt.
19 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das mehrere parallel angeordnete Anreicherungskanäle zeigt.
20 und 21 sind Flussdiagramme von Ausführungsformen einer Vorrichtung gemäß der Erfindung ähnlich denen in der 15 bzw. 16, wobei zusätzlich ein Reagensströmungspfad zum Transportieren eines Reagens von einem Reservoir direkt zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad vorhanden ist.
22 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung ähnlich dem in der 17 dargestellten, wobei zusätzlich mehrere Reagensströmungspfade zum Transportieren eines Reagens von einem Reservoir direkt zu stromabwärtigen Zweigen des Elektrophorese-Hauptströmungspfads vorhanden sind.
23 ist ein Flussdiagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, bei der ein Anreicherungsmedium über beschichtete Magnetkügelchen verfügt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Es sind integrierte Elektrophorese-Mikrovorrichtungen mit mindestens einem Anreicherungskanal und einem Elektrophorese-Hauptströmungspfad geschaffen. Der Anreicherungskanal dient zum Anreichern eines speziellen Analyten mit einer Fraktion einer flüssigen Probe. Der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad sind so in der Vorrichtung positioniert, dass Abfallfluid aus dem Anreicherungskanal nicht durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad fließt, sondern stattdessen von diesem durch einen Abtransportauslass abfließt. Die betrachteten Vorrichtungen können bei einer Vielzahl von Elektrophoreseanwendungen genutzt werden, einschließlich klinischen Untersuchungsanwendungen. Bei der weiteren Beschreibung der Erfindung werden als erstes die Vorrichtungen in allgemeinen Begriffen beschrieben, gefolgt von einer Erörterung repräsentativer, spezieller Ausführungsformen der betrachteten Vorrichtungen, wozu auf die Figuren Bezug genommen wird.
Die betrachtete Vorrichtung ist eine integrierte Elektrophorese-Mikrovorrichtung. Unter integriert ist zu verstehen, dass alle Komponenten der Vorrichtung, beispielsweise der Anreicherungskanal, der Elektrophorese-Hauptströmungspfad usw., in einer einzelnen, kompakten, leicht handhabbaren Einheit, wie einem Chip, einer Scheibe oder dergleichen, vorhanden sind. Da die Vorrichtungen mit Elektrophorese arbeiten, sind sie bei einer Vielzahl von Anwendungen von Nutzen, bei denen Objekte wie Moleküle, Teilchen, Zellen und dergleichen unter dem Einfluss eines angelegten elektrischen Felds durch ein Medium bewegt werden. Abhängig von der Art der Objekte, beispielsweise ob sie eine elektrische Ladung tragen oder nicht, sowie der Oberflächenchemie der Elektrophoresekammer, in der die Elektrophorese ausgeführt wird, können die Objekte unter direktem Einfluss des angelegten elektrischen Felds oder als Ergebnis dessen durch das Medium bewegt werden, dass ein sich aus dem angelegten elektrischen Feld ergebender Fluidvolumenstrom durch den Pfad vorliegt, beispielsweise eine elektroosmotische Strömung (EOF). Die Mikrovorrichtungen verfügen als Elektrophorese-Hauptströmungspfad über einen Mikrokanal. Unter Mikrokanal ist es zu verstehen, dass die Elektrophoresekammer des Elektrophorese-Hauptströmungspfads, in dem das Medium vorhanden ist, eine Leitung, beispielsweise ein Graben oder ein Kanal, mit einer Querschnittsfläche ist, die für eine Kapillarströmung durch die Kammer sorgt, wobei die Kammer auf einem ebenen Substrat vorhanden ist, wie es unten detaillierter beschrieben wird.
Kritisch für die betrachtete Vorrichtung ist ein Anreicherungskanal mit einem Probeneinlass, einem Abfallfluidauslass, einem internen Anreicherungsmedium zum Anreichern einer speziellen Fraktion einer Probe, und, optional, einem Fluidauslass für die angereicherte Fraktion. Der Zweck des Anreicherungskanals besteht im Verarbeiten der Anfangsprobe zum Anreichern einer speziellen Fraktion derselben, wobei die spezielle, angereicherte Fraktion den interessierenden Analyt oder die Analyte enthält. Der Anreicherungskanal dient so zum selektiven Zurückhalten und Trennen der den Zielanalyt enthaltenden Fraktion aus den Restkomponenten oder dem Abfallanteil des anfänglichen Probenvolumens. Abhängig von der speziellen Anwendung, bei der die Vorrichtung verwendet wird, kann der Anreicherungskanal einer Anzahl verschiedener Funktionen dienen. Der Anreicherungskanal kann dazu dienen, den interessierenden Analyten in einem kleineren Volumen als dem anfänglichen Probenvolumen zu platzieren, d. h., er kann als Analytkonzentrator dienen. Ferner kann er dazu dienen, zu verhindern, dass möglicherweise störende Probenkomponenten in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad eindringen und durch diesen fließen, d. h., er kann als Proben"reinigungs"einrichtung dienen. Außerdem kann der Anreicherungskanal als Mikroreaktor für Präparationsprozesse an einem in einer Fluidprobe vorhandenen Zielanalyten sorgen, wie für chemische, immunologische und enzymatische Prozesse, beispielsweise Markierung, Proteinverdauung, DNA-Verdauung oder -Fragmentierung, DNA-Synthese und dergleichen.
Der Anreicherungskanal kann mit einer Anzahl von Konfigurationen, abhängig vom in ihm untergebrachten speziellen Anreicherungsmedium, in der Vorrichtung vorhanden sein. Das Innenvolumen des Kanals liegt im allgemeinen im Bereich von ungefähr 1 pl bis 1 µl, im allgemeinen von ungefähr 1 pl bis 100 nl, wobei seine Länge im wesentlichen im Bereich von ungefähr 1 µm bis 5 mm, im allgemeinen 10 µm bis 1 mm liegt, und seine Querschnittsabmessungen (beispielsweise Breite, Höhe) im Bereich von ungefähr 1 µm bis 200 µm, üblicherweise von ungefähr 10 µm bis 100 µm, liegen. Die Querschnittsform des Signals kann kreisförmig, elliptisch, rechteckig, trapezförmig, quadratisch oder von anderer zweckdienlicher Konfiguration sein.
Im Anreicherungskanal können mehrere verschiedene Anreicherungsmedien vorhanden sein. Zu repräsentativen Anreicherungsmedien oder -maßnahmen gehören solche Maßnahmen, wie sie für die Analytvorkonzentriervorrichtungen beschrieben sind, die in US 5,202,010 ; US 5,246,577 und US 5,340,452 sowie von Tomlinson et al. offenbart sind.
Zu speziellen Anreicherungsmaßnahmen, wie sie in der Technik bekannt sind und wie sie zur Verwendung bei den betrachteten integrierten Elektrophorese-Mikrokanalvorrichtungen anpassbar sind, gehören: diejenigen, wie sie in von Kasicka & Prusik, in "Isotachophoretic Electrodesorption of Proteins from an Affinity Adsorbent on a Microscale", J. Chromatogr. 81983) 273: 117128 beschriebenen Vorkonzentriervorrichtungen verwendet sind; Kapillarbündel mit einem Affinitätsadsorbenten, wie in US 5,202,101 und WO 93/05390 beschrieben; mit Oktadodecylsilan beschichtete Festphasen wie von Cai & El Rassi in "On-Line Preconcentration of Triazine Herbicides with Tandem Octadecyl Capillaries-Capillary Zone Electrophoresis", J. Liq. Chromatogr. (1992) 15: 1179–1192 beschrieben; mit einer Metallchelatschicht beschichtete Festphasen, wie von Cai & El Rassi in "Selective On-Line Preconcentration of Proteins bei Tandem Metal Chelate Capillaries-Capillary Zone Electrophoresis", J. Liq. Choromatogr. (1993) 16: 2007–2024 beschrieben; Umkehrphase-HPLC-Feststoff-Füllmaterialien, wie in US 5,246,577 beschrieben; mit Protein G beschichteten Festphasen, wie von Cole & Kennedy in "Selective Preconcentration for Capillary Zone Electrophoresis Using Protein G Immunoaffinity Capillary Chromatography", Electrophoresis (1995) 16: 549–556 beschrieben; schmelzbare Agarosegels, wie in US 5,423,966 beschrieben; Affinitätsabsorbensmaterialien, wie von Guzman in "Biomedical Applications of On-Line Preconcentration – Capillary Electrophoresis Using an Analyte Concentrator: Investigation of Design Options", in J. Liq. Chromatogr. (1995) 18: 3751–3568) beschrieben; und Festphase-Reaktormaterialien, wie in US 5,318,680 beschrieben.
Eine Klasse von Anreicherungsmedien oder Materialien, die als Anreicherungsmedium Anwendung finden können, sind Chromatographiemedien oder -materialien, insbesondere Materialien einer Sorptionsphase. Zu derartigen Materialien gehören: Umkehrphasenmaterialien, beispielsweise mit C8- oder C18-Verbundmaterial beschichtete Teilchen; Ionenaustauschmaterialien; Affinitätschromatographiematerialien, bei denen ein Bindungselement kovalent an eine unlösliche Matrix gebunden ist, wobei ein Bindungselement gruppenspezifisch sein kann, z. B. ein Lectin, ein Enzymkofaktor, Protein A und dergleichen, oder substanzspezifisch sein kann, z. B. ein Antikörper oder ein zugehöriges Bindungsfragment, ein Antigen für einen speziellen interessierenden Antikörper, ein Oligonukleotid und dergleichen, wobei die unlösliche Matrix, an die das Bindungselement gebunden ist, aus Teilchen bestehen kann, wie porösem Glas, Polymerkügelchen, Magnetkügelchen, Netzen von Glassträngen oder -fasern, einer Anzahl schmaler Stäbe oder Kapillaren, der Wand des Kanals und dergleichen. Abhängig von der Art des als Anreicherungsmaßnahme verwendeten Chromatographiematerials kann es erforderlich sein, eine Zurückhalteeinrichtung zu verwenden, um das Chromatographiematerial im Anreicherungskanal zu halten. Zweckdienlicherweise können Glasfritten oder Pfropfen aus Agarosegel dazu verwendet werden, die Fluidauslässe oder -einlässe der Kammer abzudecken, wobei die Fritten oder Pfropfen einen Fluidfluss aus dem Anreicherungskanal, jedoch keinen Fluss von Teilchen oder einer anderen unlöslichen Matrix aus ihm zulassen. Bei Ausführungsformen, bei denen die Anreicherungseinrichtung ein Chromatographiematerial ist, wird eine typische Probe in den Anreicherungskanal eingeleitet und kann durch diesen fließen. Wenn die Probe durch den Anreicherungskanal fließt, wird die den Analyt enthaltende Fraktion im Anreicherungskanal zurückgehalten, jedoch fließen das Chromatographiematerial und der verbliebene Abfallanteil der Probe durch den Abfallauslass aus dem Kanal heraus.
Bei Ausführungsformen, bei denen die Anreicherungseinrichtung ein Bett aus Polymerkügelchen oder paramagnetischen Kügelchen oder Teilchen ist, können die Kügelchen mit Antikörpern oder einer anderen zielspezifischen Affinitätsbindungskomponente beschichtet sein, wozu die folgenden gehören: affinitätsgereinigte, monoklonale Antikörper für beliebige einer Anzahl von Säugezellenmarkern, speziellen Menschenzellenmarkern, einschließlich Markern für T-Zellen, T-Zellenuntergruppen, B-Zellen, Monozyten, Stammzellen, Myeloidzellen, Leukozyten sowie positive Zellen der HLA-Klasse II; sekundäre Antikörper beliebiger verschiedener Nagezellen-Marker, insbesondere Maus-, Ratten- oder Kaninchen-Immunglobulinen zur Isolierung von B-Zellen, T-Zellen und T-Zellenuntergruppen, unbeschichteten oder tosylaktivierten Formen für eine fallange passte Beschichtung mit einem beliebigen vorgegebenen Biomolekül; und mit einer Streptavidinbeschichtung zur Verwendung bei biotinylierten Antikörpern. Paramagnetische Kügelchen oder Teilchen können durch Anlegen eines Magnetfelds im Anreicherungskanal zurückgehalten werden.
Alternativ, oder zusätzlich zu Festphasenmaterialien wie beschichteten Teilchen oder anderen unlöslichen Matrizen als Anreicherungseinrichtung, kann eine beschichtete und/oder imprägnierte Membran verwendet werden, die für ein selektives Zurückhalten der den Analyt enthaltenden Fraktion der Probe sorgt, während der Rest der Probe durch die Membran und durch den Abfallauslass aus der Anreicherungseinrichtung herausfließen kann. Es wurde eine Anzahl hydrophiler, hydrophober und Ionenaustauschmembranen zur Verwendung bei einer Festphasenextraktion verwendet, die bei der betrachteten Erfindung Anwendung finden können. Siehe z. B. Tomlinson et al. in "Novel Modifications and Clinical Applications of Preconcentration Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry", J. Cap. Elect. (1995) 2: 97–104; und Tomlinson et al. in "Improved On-line Membrane Preconcentration-Capillary Electrophoresis (mPC-CE)", J. High Res. Chromatogr. (1995) 18: 381-3.
Alternativ oder zusätzlich kann der Anreicherungskanal oder das Anreicherungsmedium eine poröse Membran oder ein Filter enthalten. Zu geeigneten Materialien zum Zurückhalten von Genom-DNAs und viralen Nukleinsäuren gehören solche, die von QIAGEN unter dem Namen QIAmp zur Analyse von Blut, Gewebe und viralen RNAs verwendet werden; und zu geeigneten Materialien zum Zurückhalten von DNAs aus Pflanzenzellen und -geweben gehören solche, wie sie von QIAGEN unter dem Namen DNeasy vermarktet werden.
Abhängig von der Konfiguration der Vorrichtung kann durch eine Anzahl verschiedener Maßnahmen und Kombinationen von Maßnahmen dafür gesorgt werden, dass die Probe durch den Anreicherungskanal fließt. Bei einigen Vorrichtungskonfigurationen kann es ausreichen, es zu ermöglichen, dass die Probe als Ergebnis der Schwerkräfte an ihr durch die Vorrichtung fließt; bei einigen Konfigurationen kann die Vorrichtung um eine ausgewählte Achse gedreht werden, um eine Zentrifugalkraft in einer gewünschten Richtung auszuüben. Bei anderen Ausführungsformen kann eine aktive Pumpeinrichtung dazu verwendet werden, die Probe durch den Anreicherungskanal und die darin aufgenommene Anreicherungseinrichtung zu bewegen. Bei anderen Ausführungsformen können Magnetkräfte angelegt werden, um die Probe zu bewegen oder einen paramagnetischen Kügelchen- Ziel-Komplex während Wasch- und Eluierungsschritten festzuhalten oder zu immobilisieren. Bei noch anderen Ausführungsformen der betrachteten Erfindung können Elektroden dazu verwendet werden, ein elektrisches Feld anzulegen, das dafür sorgt, dass sich ein Fluid durch den Anreicherungskanal bewegt. Dann wird dafür gesorgt, dass sich eine Eluierungsflüssigkeit durch das Anreicherungsmedium bewegt, um die angereicherte Probenfraktion aus dem Material freizusetzen und sie zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad zu transportieren. Im allgemeinen wird ein angelegtes elektrisches Feld dazu verwendet, die Eluierungsflüssigkeit durch den Anreicherungskanal zu bewegen.
Als Anreicherungseinrichtung können bei den betrachteten Anwendungen auch Elektrophoresegelmedien verwendet werden. Es sind Gelmedien bekannt, die für eine Anzahl verschiedener Siebfähigkeiten sorgen. Durch Variieren der Porengröße der Medien, durch Verwenden von zwei oder mehr Gelmedien mit verschiedener Porosität und/oder durch Bereitstellen eines Gradienten der Porengröße und durch Auswählen der geeigneten Beziehung zwischen dem Anreicherungskanal und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad kann dafür gesorgt werden, dass nur die interessierende, den Analyten enthaltende Fraktion der anfänglichen Probe in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad eintritt. Beispielsweise könnte eine Vorrichtung mit einem Anreicherungskanal vorliegen, der den Elektrophorese-Hauptströmungspfad schneidet, wobei der Anreicherungskanal, in der Richtung des Probenflusses, über ein Schichtungsgel großer Porosität und ein zweites Gel feiner Porosität verfügt, wobei die Grenze zwischen den Gelen an der Kreuzungsstelle zwischen dem Anreicherungskanal und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad vorliegt. Bei dieser Ausführungsform bewegen sich, nachdem die Probe in das Schichtgel eingeleitet wurde und ein elektrisches Feld an die Gele im Anreicherungskanal angelegt wurde, Probenkomponenten durch das Schichtgel, und sie kondensieren an der Gelgrenzfläche an der Kreuzungsstelle zwischen dem Anreicherungskanal und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad zu einem schmalen Band. Dann kann ein zweites elektrisches Feld an den Elektrophorese-Hauptströmungspfad angelegt werden, damit sich das schmale Band der angereicherten Probenfraktion in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad und durch diesen bewegt. Alternativ könnte der Anreicherungskanal über ein Gel mit Porositätsgradient verfügen. Bei dieser Ausführungsform kann, wenn das mindestens eine interessierende Band die Kreuzungsstelle zwischen dem Anreicherungskanal und dem Elektrophoreseströmungspfad erreicht, dieses mindestens eine interessierende Band in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad und diesen entlang bewegt werden.
Zu Anreicherungsmedien, die zur Anreicherung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren besonders nützlich sein können, gehören sequenzspezifische Festhaltemedien sowie generische Festhaltemedien. Zu generischen Festhaltemedien gehören beispielsweise Ionenaustausch- und Silikatharze oder Membranen, die Nukleinsäuren unspezifisch binden und von denen erwartet werden kann, dass sie im wesentlichen die gesamte DNA in einer Probe zurückhalten; Bindungsprotein für immobilisierte, einsträngige DNA (SSB-Protein), von dem erwartet werden kann, dass es im wesentlichen die gesamte einsträngige DAN in einer Probe bindet, mit Poly-dT modifizierte Kügelchen, von denen erwartet werden kann, dass sie im Wesentlichen die gesamte mRNA in einer Probe binden. Zu sequenzspezifischen Festhaltemedien gehören Kügelchen, Membranen oder Flächen, auf denen beliebige einer Anzahl von Festhaltemolekülen immobilisiert sind, wie beispielsweise: Oligonukleotidsonden, von denen erwartet werden kann, dass sie Nukleinsäuren mit Komplementärsequenzen in der Gruppe binden; Streptaviden, von dem erwartet werden kann, dass es biotynilierte Sonden in der Lösungsphase bindet, die mit Komplementärsequenzen in der Probe hybridisiert wurden. Zu geeigneten Kügelchen zur Immobilisierung von Festhaltemolekülen gehören chemisch oder physikalisch vernetzte Gele und poröse oder nichtporöse Harze wie Polymerharze oder solche auf Silikatbasis.
Zu geeigneten Festhaltemedien für Proteine gehören die folgenden. Zu geeigneten Festhaltemedien für Proteine gehören: Ionenaustauschharze, einschließlich Anion-(z. B. DEAE)- und Kation-Austausch; Verbundstoffe für hydrophobe Wechselwirkung (z. B. Verbundstoffe C4, C8 und C18); Sulfhydryle; Heparine; von Natur aus aktive Oberflächen (z. B. Kunststoffe, Nitrozellulose-Löschpapiere); aktivierte Kunststoffflächen; aromatische Farbstoffe wie Cibacronblau, Remazolorange und Procionrot. Für Kohlenwasserstoffkomponenten von Proteinen können Lektine, immobilisierte, hydrophobe Octyl- und Phenylalkanderivate geeignet sein. Für Enzyme können Analoge eines spezifischen Enzymsubstrat-Produkt-Übergangszustandsvermittlers geeignet sein; für Chinasen kann Calmodulin geeignet sein. Zu geeigneten Festhaltemedien für Rezeptoren gehören Rezeptor-Ligand-Affinitätsverbundstoffe.
Wie oben angegeben, verfügt der Anreicherungskanal über mindestens einen Einlass und mindestens einen Auslass. Selbstverständlich muss, wenn ein einzelner Einlass vorhanden ist, dieser dazu dienen, in einer Anreicherungsphase des Prozesses eine Probe in den Anreicherungskanal einzulassen und während einer Eluierungsphase des Prozesses ein Eluierungsmedium einzulassen. Wenn ein einzelner Auslass vorhanden ist, muss dieser dazu dienen, denjenigen Teil der Probe auszulassen, der an der durch das Anreicherungsmedium festgehaltenen Fraktion verarmt ist, um in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad die während der Eluierungsphase angereicherte Fraktion durchzulassen. Abhängig von der speziellen, im Anreicherungskanal untergebrachten Anreicherungseinrichtung, sowie abhängig von der speziellen Vorrichtungskonfiguration, kann der Anreicherungskanal über mehr als einen Fluideinlass verfügen, der beispielsweise als Probeneinlass und Eluierungspuffereinlass dient; oder der Anreicherungskanal kann über mehr als einen Auslass verfügen, der beispielsweise als Abfallauslass und Auslass für das Fluid mit der angereicherten Fraktion dient. Wenn der Anreicherungskanal in direkter Fluidverbindung mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad steht, d. h., wenn der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad verbunden sind, so dass Fluid vom Anreicherungskanal direkt in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad fließt, verfügt der Anreicherungskanal zusätzlich zum Abfallauslass über einen Auslass für das Fluid mit der angereicherten Fraktion, durch den die angereicherte Fraktion der Probe in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad fließt. Wenn es zweckdienlich ist, beispielsweise zum Einleiten eines Wasch- und/oder Eluierungslösungsmittels in den Anreicherungskanal, können ein oder mehrere zusätzliche Fluideinlässe vorhanden sein, um derartige Lösungsmittel aus Fluidreservoirs in den Anreicherungskanal zu leiten. Um den Fluidvolumenfluss durch den Anreicherungskanal zu kontrollieren, beispielsweise um zu verhindern, dass Probenabfall in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad fließt, können Fluidkontrolleinrichtungen, beispielsweise Ventile, Membranen usw. jedem der Einlässe und Auslässe zugeordnet sein. Wo es zum Bewegen von Fluiden und Objekten durch den Anreicherungskanal, beispielsweise Probe, Eluierungspuffer, Reagenzien, Reaktanten, Wasch- oder Spüllösungen usw., erwünscht ist, können Elektroden vorhanden sein, die ein elektrisches Feld an das Material und das Fluid anlegen können, wie sie im Anreicherungskanal vorhanden sind.
Die nächste Komponente der betrachteten Vorrichtungen ist der Elektrophorese-Hauptströmungspfad. Der Elektrophorese-Hauptströmungspfad kann über eine Anzahl von Konfigurationen verfügen, einschließlich rohrförmig, grabenförmig oder von anderer zweckdienlicher Konfiguration, wobei die Querschnittsform des Strömungspfads kreisförmig, elliptisch, quadratisch, rechteckig, dreieckig und dergleichen sein kann, so dass er an der Oberfläche des planaren Substrats, in der er vorhanden ist, einen Mikrokanal bildet. Der Mikrokanal verfügt über eine Querschnittsfläche, die für einen Kapillarfluidfluss durch ihn sorgt, wobei mindestens eine der Querschnittsabmessungen, beispielsweise die Breite, die Höhe, der Durchmesser, mindestens ungefähr 1 µm beträgt, im allgemeinen mindestens ungefähr 10 µm, wobei jedoch ungefähr 200 µm nicht überschritten werden und im allgemeinen ungefähr 100 µm nicht überschritten werden. Abhängig von der speziellen Art der integrierten Vorrichtung kann der Elektrophorese-Hauptströmungspfad gerade, gekrümmt oder von einer anderen zweckdienlichen Konfiguration an der Oberfläche des planaren Substrats vorhanden sein.
Der Elektrophorese-Hauptströmungspfad sowie beliebige zusätzliche Elektrophoreseströmungspfade verfügen über mindestens ein zugeordnetes Paar von Elektroden zum Anlegen eines elektrischen Felds an das im Strömungspfad vorhandene Medium. Wenn ein einzelnes Paar von Elektroden verwendet wird, ist typischerweise ein Element des Paars an jedem Ende des Pfadverlaufs vorhanden. Wo es zweckdienlich ist, können mehrere Elektroden dem Elektrophoreseströmungspfad zugeordnet sein, wie es in US 5,126,022 beschrieben ist, wobei die mehreren Elektroden für eine genaue Bewegung der Objekte den Elektrophoreseströmungspfad entlang sorgen können. Die bei der betrachteten Vorrichtung verwendeten Elektroden können von jedem beliebigen zweckdienlichen Typ sein, der ein geeignetes elektrisches Feld an das Medium anlegen kann, das im Elektrophoreseströmungspfad vorhanden ist, dem sie zugeordnet sind.
Kritisch für die betrachtete Erfindung ist es, dass der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad so in der Vorrichtung positioniert sind, dass im wesentlichen alleine die angereicherte Fraktion der Probe durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad fließt. Zu diesem Zweck verfügt die Vorrichtung ferner über einen Abtransportauslass zum Auslassen eines anderen Anteils der Probe als die angereicherte Fraktion, beispielsweise den Abfallanteil, weg vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad. Demgemäß steht dann, wenn der Anreicherungskanal in direkter Fluidverbindung mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad steht, der Abfallfluid-Strömungspfad durch den Anreicherungskanal in einer Schnittbeziehung zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad. Bei anderen Ausführungsformen der betrachteten Erfindung, bei denen der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad durch einen zweiten Elektrophoreseströmungspfad verbunden sind, so dass sie in indirekter Fluidverbindung stehen, muss der Abfallströmungspfad durch den Anreicherungskanal nicht notwendigerweise in einer Schnittbeziehung zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad stehen; der Abfallströmungspfad und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad könnten parallel zueinander verlaufen.
Die betrachteten Vorrichtungen verfügen auch über eine Einrichtung zum Transferieren der angereicherten Fraktion aus dem Anreicherungskanal in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad. Abhängig von der speziellen Konfiguration der Vorrichtung kann die Transfereinrichtung für die angereicherte Fraktion ein Fluidauslass für diese, ein Elektrophorese-Sekundärströmungspfad oder eine andere geeignete Transfereinrichtung sein. Wenn ein zweiter Elektrophoreseströmungspfad zusätzlich zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad vorliegt, besteht die Möglichkeit, diesen zweiten Elektrophoreseströmungspfad als Leitung für die angereicherte Probenfraktion aus dem Anreicherungskanal zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad zu verwenden. Bei denjenigen Ausführungsformen, bei denen der Abfallauslass der einzige Fluidauslass ist, ist das Vorliegen eines Elektrophorese-Sekundärströmungspfads wesentlich, so dass der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad in indirekter Fluidverbindung stehen.
Zusätzlich zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad und beliebigen Elektrophorese-Sekundärströmungspfaden, die als Transfereinrichtung für die angereicherten Proben dienen, können die betrachteten Vorrichtungen ferner über einen oder mehrere zusätzliche Elektrophoreseströmungspfade verfügen, die über Kapillarabmessungen verfügen können, was jedoch nicht der Fall sein muss, und die einer Anzahl von Zwecken dienen können. Bei der Vorrichtung mit mehreren Elektrophoreseströmungspfaden ist eine Anzahl von Konfigurationen möglich, wie eine Verzweigungskonfiguration, bei der mehrere Elektrophoreseströmungspfade in Fluidverbindung mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad stehen. Siehe US 5,126,022 .
Der Elektrophorese-Hauptströmungspfad und/oder beliebige Elektrophorese-Sekundärströmungspfade, wie sie in der Vorrichtung vorhanden sind, können wahlweise über Fluidreservoire an einem oder beiden Anschlüssen, d. h. an jedem Ende, der Strömungspfade verfügen, und dies wird im allgemeinen der Fall sein. Wenn Reservoire vorhanden sind, können sie einer Anzahl von Zwecken dienen, wie als Maßnahme zum Einleiten eines Puffers, einer Eluierungslösung, eines Reagens, von Spül- und Waschlösungen und dergleichen in den Elektropho rese-Hauptströmungspfad, und zum Aufnehmen von Abfallfluid aus dem Elektrophoreseströmungspfad, und dergleichen.
Eine andere Komponente, die wahlweise in den betrachteten Vorrichtungen vorhanden sein kann, ist ein Abfallfluidreservoir zum Aufnehmen und Lagern des Analytanteils des anfänglichen Probenvolumens aus dem Anreicherungskanal, wobei das Abfallreservoir in Fluidverbindung mit dem Abtransportauslass stehen wird. Abhängig von der speziellen Vorrichtungskonfiguration kann der Abtransportauslass der Abfallauslass sein, oder er kann von ihm getrennt vorliegen, und er kann in ein Abfallreservoir geöffnet sein oder einen Auslass aus der Vorrichtung bilden. Das Abfallreservoir kann in der Vorrichtung als Kanal, Kammer oder mit anderer zweckdienlicher Konfiguration vorhanden sein, die die anderen Komponenten der Vorrichtung nicht stört.
Die betrachtete Vorrichtung kann wahlweise auch über eine Schnittstelleneinrichtung verfügen, um die Einleitung der Probe in die Probenpräpariereinrichtung zu unterstützen. Wenn beispielsweise die Probe durch eine Spritze in die Vorrichtung einzuleiten ist, kann die Vorrichtung über eine Spritzenschnittstelle verfügen, die als Führung für die Spritzennadel in die Vorrichtung dient, wie als Abdichtung und dergleichen.
Abhängig von der speziellen Konfiguration und der Art der Materialien, aus denen die Vorrichtung hergestellt ist, existiert zumindest in Zuordnung zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad ein Erfassungsbereich zum Erfassen des Vorliegens einer speziellen Spezies im Elektrophoreseströmungspfad enthaltenen Medium. Mindestens ein Bereich des Elektrophorese-Hauptströmungspfads im Erfassungsbereich wird aus einem Material hergestellt, das optisch transparent ist, wobei es im wesentlichen Licht mit Wellenlängen im Bereich von 180 bis 1500 nm, üblicherweise 220 bis 800 nm, noch üblicher 250 bis 800 nm so durchlässt, dass geringe Übertragungsverluste vorliegen. Zu geeigneten Materialien gehören Kieselglas, Kunststoffe, Quarzglas und dergleichen.
Die integrierte Vorrichtung kann über jede beliebige zweckdienliche Konfiguration verfügen, die über den Anreicherungskanal und den Elektrophorese-Hauptströmungspfad sowie beliebige zusätzliche Komponenten verfügen kann. Da die Vorrichtungen Elektrophoresevorrichtungen mit Mikrokanal sind, sind an der Oberfläche des planaren Substrats die Elektrophoreseströmungspfade vorhanden, wobei das Substrat üblicherweise, jedoch nicht notwendigerweise, mit einer ebenen Abdeckplatte abgedeckt ist, um die an der Oberfläche vorhandenen Mikrokanäle gegen die Umgebung abzudichten. Im Allgemeinen sind die Vorrichtungen klein, wobei die längste Abmessung in der Oberflächenebene nicht mehr als ungefähr 200 mm, üblicherweise nicht mehr als 100 mm, beträgt, so dass die Vorrichtungen leicht handhabbar und manipulierbar sind. Wie oben erörtert, können die Vorrichtungen über eine Anzahl von Konfigurationen verfügen, einschließlich quaderförmig, beispielsweise kreditkarten- oder chipförmig, scheibenförmig, spritzenförmig oder irgendeine andere kompakte zweckdienliche Konfiguration.
Die betrachteten Vorrichtung können aus einer großen Anzahl von Materialien hergestellt werden, einschließlich Glas, Kieselglas, Acrylen, thermoplastischen Stoffen und dergleichen. Die verschiedenen Komponenten der integrierten Vorrichtung können aus denselben oder verschiedenen Materialien hergestellt werden, was von der speziellen Anwendung der Vorrichtung, wirtschaftlichen Gesichtspunkten, der Verträglichkeit mit Lösungsmitteln, der optischen Klarheit, der Farbe, der mechanischen Festigkeit und dergleichen abhängt. Beispielsweise können sowohl das ebene Substrat mit den Elektrophoreseströmungspfaden in Form von Mikrokanälen als auch die Deckplatte aus demselben Material, beispielsweise Polymethylmethacrylat (PMMA) oder verschiedenen Materialien, beispielsweise einem Substrat aus PMMA und einer Abdeckplatte aus Glas, hergestellt sein. Für Anwendungen, bei denen es wünschenswert ist, über eine wegwerfbare integrierte Vorrichtung zu verfügen, wird die Vorrichtung wegen einfacher Herstellung und der Kosten der Materialien typischerweise aus einem Kunststoff hergestellt. Zur einfachen Erfassung und Herstellung kann die gesamte Vorrichtung aus einem Kunststoffmaterial hergestellt werden, das optisch transparent ist, im Sinn des oben definierten Begriffs. Auch sind bei bestimmten Anwendungen Kunststoffe mit niedriger Oberflächenladung unter Elektrophoresebedingungen von Interesse. Zu speziellen Kunststoffen, die Anwendung finden, gehören Polymethylacrylat, Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyren oder Styrencopolymere und dergleichen.
Die Vorrichtungen können unter Verwendung jeder zweckdienlichen Maßnahme hergestellt werden, einschließlich herkömmlichen Formungs- und Gießtechniken. Beispielsweise kann für aus einem Kunststoffmaterial hergestellten Vorrichtungen ein Quarzformmaster, der ein Negativ für die Kanalstruktur im ebenen Substrat der Vorrichtung bildet, durch Ätzen oder Lasermikrobearbeitung hergestellt werden. Zusätzlich dazu, dass eine erhöhte Rippe vorliegt, die den Kanal im Substrat bildet, kann die Quarzform über ein erhöhtes Gebiet verfügen, das für einen Hohlraum im ebenen Substrat sorgt, um den Anreicherungskanal aufzunehmen. Weiterhin kann ein Polymervorläuferansatz zwischen dem Quarzmaster und einer ebenen Halteplatte, wie eine Glasplatte, thermisch ausgehärtet oder durch Licht polymerisiert werden. Wenn es zweckdienlich ist, können die in US 5,110,514 beschriebenen Prozeduren verwendet werden. Nachdem das ebene Substrat hergestellt wurde, kann der Anreicherungskanal im Hohlraum in ihm platziert werden, und es werden Elektroden dort eingesetzt, wo es erwünscht ist. Schließlich kann eine Deckplatte auf der Oberfläche des Substrats platziert und gegen sie abgedichtet werden, um dadurch eine integrierte Vorrichtung aufzubauen. Die Abdeckplatte kann unter Verwendung jeder zweckdienlichen Maßnahme, einschließlich Ultraschallschweißen, Klebern usw., gegen das Substrat abgedichtet werden.
Im allgemeinen wird vor der Verwendung der betrachteten Vorrichtung ein geeignetes erstes oder Elektrophoresemedium in die Elektrophoreseströmungspfade oder die Mikrokanäle der Vorrichtung eingegeben, wobei sich das erste Medium vom im Anreicherungskanal vorhandenen Anreicherungsmedium unterscheidet. Elektrophoresemedien, wie hier verwendet, bezeichnen beliebige Medien, an die ein elektrisches Feld angelegt wird, um Spezies durch es zu bewegen. Die Elektrophoresemedien können zweckdienlicherweise mittels der an den Enden der Elektrophoreseströmungspfade vorhandenen Reservoirs oder vor dem Abdichten der Abdeckplatte gegen das Substrat direkt in die Kanäle oder Kammern der Elektrophoreseströmungspfade eingebracht werden. Es kann jedes beliebige zweckdienliche Elektrophoresemedium verwendet werden. Zu Elektrophoresemedien, die für die Verwendung geeignet sind, gehören, abhängig von der speziellen Anwendung, vernetzte und unvernetzte Polymermedien, organische Lösungsmittel, Detergenzien und dergleichen, wie es von Barren & Blanch in "DNA Separations by Slab Gel and Capillary Electrophoresis: Theory and Practice", Separation and Purification Methods (1995) 24: 1–118 sowie in den US-Patentanmeldungen mit den Serien-Nr. 08/241,048, 08/636,599 und 08/589,150 offenbart ist. Von speziellem Interesse als Elektrophoresemedien sind Cellulosederivate, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyethylenoxide und dergleichen.
Nun wird die betrachtete Erfindung anhand der Figuren näher beschrieben. Die 1 liefert eine schematische Ansicht eines Anreicherungskanals, der bei den Vorrichtungen der betrachteten Erfindung Verwendung finden kann. Der An reicherungskanal 10 verfügt über Seitenwände 1, die ein C18-Umkehrphasenmaterial 2 einschließen. Der Kanal 10 verfügt ferner über Fluideinlässe 7 und 4 sowie Fluidauslässe 5 und 6. Um den Fluidfluss durch die Kanaleinlässe und -auslässe zu steuern, sind Ventile 8, 9 und 10 vorhanden. Glasfritten 3 erlauben einen Fluidfluss durch den Einlass 4 und den Auslass 5, jedoch halten sie das Umkehrphasenmaterial 2 im Kanal fest. Unter Verwendung dieses Anreicherungskanals wird eine Probe in der Richtung des Strömungspfads 12 durch den Probeneinlass 7 eingeleitet. Wenn sich die Probe durch den Kanal 10 bewegt, wird die den Analyt enthaltende Fraktion am Umkehrphasenmaterial 2 festgehalten, während die restliche Abfallfraktion der Probe entlang dem Strömungspfad 13 aus dem Abfallauslass 6 ausfließt. Ventile 8 und 9 sind geschlossen, um zu verhindern, dass die Probe aus dem Einlass 4 oder dem Auslass 5 ausströmt oder "ausblutet". Nachdem die Probe durch den Kanal 10 strömte, wird das Ventil 11 geschlossen, und die Ventile 8 und 9 werden geöffnet. Dann wird durch die Glasfritte 3 und den Einlass 4 ein Eluierungspuffer in der Richtung des Strömungspfads 14 in den Kanal 10 eingeleitet. Während sich der Eluierungspuffer durch das Material 2 bewegt, wird die festgehaltene Probenfraktion freigesetzt und mit dem Eluierungspuffer durch die Fritte 3 entlang dem Strömungspfad 15 aus dem Auslass 5 für die angereicherte Fraktion transportiert.
In der 2 ist derselbe Anreicherungskanal, wie er in der 1 dargestellt ist, mit der Ausnahme dargestellt, dass das Umkehrphasenmaterial 2 durch ein Netz vernetzter Glasfasern 16 ersetzt ist, an die ein Bindungspaarelement kovalent gebunden ist.
Die 3A liefert eine schematische Draufsicht einer kreditkartenförmigen (quaderförmigen) Vorrichtung gemäß der betrachteten Erfindung. Die Vorrichtung 30 verfügt über einen Elektrophorese-Hauptströmungspfad 31 mit einem Reservoir 32 an einem ersten Ende und einem Reservoir 33 an einem zweiten Ende. In direkter Fluidverbindung mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 31 befindet sich ein Anreicherungskanal 34 (von oben her gesehen). Es sind Elektroden 35 und 36 vorhanden, um an das im Elektrophoreseströmungspfad 31 vorhandene Medium ein elektrisches Feld anzulegen. Über dem Elektrophoreseströmungspfad 31 ist ein Erfassungsbereich 37 zum Betrachten des Analyten positioniert, der im im Strömungspfad enthaltenen Medium vorhanden ist. Ein Erfassungsbereich kann auch über dem Anreicherungskanal 34 vorhanden sein. Obwohl die in der 3A dargestellte Vorrichtung über einen einzelnen Anreiche rungskanal verfügt, könnten im Strömungspfad, einschließlich dem Erfassungsbereich, zusätzliche Anreicherungskanäle vorhanden sein.
Die 3B liefert eine schematische Seitenansicht der in der 3A dargestellten Vorrichtung. Unter Verwendung dieser Ausführungsform der betrachteten Erfindung wird eine Probe durch eine Spritzenschnittstelle 38 in den Anreicherungskanal 34 eingeleitet, wo die den Analyt enthaltende Fraktion der Probe zurückgehalten wird, während der Abfallanteil durch den Abfallauslass 39 aus dem Anreicherungskanal 34 und der Vorrichtung herausfließt. Dann wird ein Eluierungspuffer durch die Öffnung 40 in das Reservoir 32 eingeleitet. Dann wird zwischen Elektroden 35 und 36 ein elektrisches Feld gelegt, das dafür sorgt, dass sich der Eluierungspuffer durch den Anreicherungskanal 34 und den Elektrophoreseströmungspfad 31 entlang vom Reservoir 32 zum Reservoir 33 bewegt. Während sich der Eluierungspuffer durch den Anreicherungskanal 34 bewegt, gibt er die festgehaltene, den Analyt enthaltende Fraktion des anfänglichen Probenvolumens frei und transportiert sie in den Elektrophoreseströmungspfad 31.
Die 4 zeigt eine schematische Ansicht einer Ausführungsform der betrachteten Erfindung, bei der der Anreicherungskanal 62 durch einen Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 55 vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad 52 getrennt ist. Bei der Vorrichtung 50 wird eine Probe durch die Spritzenschnittstelle 66 in den Anreicherungskanal 62 eingeleitet. Während die Probe durch den Anreicherungskanal 62 fließt, fließt die Abfallprobe durch den Abtransportauslass 64 in das Abfallreservoir 63. Dann wird ein elektrisches Feld zwischen die Elektroden 61 und 60 gelegt, was dafür sorgt, dass sich der im Reservoir 57 vorhandene Eluierungspuffer durch den Anreicherungskanal 62 bewegt, was zum Freisetzen des Analyten führt. Der Analyt wird dann gemeinsam mit dem Eluierungspuffer den Elektrophorese-Sekundärströmungspfad entlang transportiert. Wenn der Analyt die Kreuzungsstelle 51 erreicht, wird das elektrische Feld zwischen den Elektroden 60 und 61 durch ein elektrisches Feld zwischen Elektroden 59 und 58 ersetzt. Bei dieser und anderen analogen Ausführungsformen der betrachteten Erfindung kann die Zeit, in der der Analyt die Kreuzungsstelle 51 erreicht, dadurch bestimmt werden, dass das Vorliegen desselben an der Kreuzungsstelle ermittelt wird, oder durch empirisches Bestimmen der Zeit, in der er die Kreuzungsstelle erreichen sollte, was auf Grundlage der speziellen Art des Analyten, des Mediums im Strömungspfad, der Stärke des elektrischen Felds und dergleichen erfolgt. Folgend auf das An legen des elektrischen Felds zwischen den Elektroden 59 und 58, die im Reservoir 54 bzw. 53 platziert sind, bewegt sich der Analyt von der Kreuzungsstelle 51 den Elektrophoreseströmungspfad 52 entlang zum Reservoir 53 und durch den Erfassungsbereich 65.
Die 5 liefert eine schematische Draufsicht noch einer anderen Ausführungsform der betrachteten Erfindung, bei der der Anreicherungskanal über einen einzelnen Fluideinlass und -auslass verfügt. Die Vorrichtung 70 verfügt über einen Elektrophorese-Hauptströmungspfad 71 in schneidender Beziehung zum Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 73. Stromaufwärts in Bezug auf die Kreuzungsstelle 82 befindet sich entlang dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 73 ein Anreicherungskanal 72. Wenn diese Ausführungsform verwendet wird, wird eine Probe durch die Spritzenschnittstelle 80 in den Anreicherungskanal 72 eingeleitet, wodurch die den Analyt enthaltende Fraktion der Probe eine reversible Bindung an das im Anreicherungskanal vorhandene Material erfährt. Dann wird zwischen Elektroden 81 und 79 ein elektrisches Feld gelegt, wodurch die nicht reversibel gebundene oder Abfallfraktion der Probe den Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 73 entlang, über die Kreuzungsstelle 82 hinweg und aus dem Analytanteil 84 in das Abfallreservoir 78 bewegt wird. Dann wird ein Eluierungspuffer durch die Spritzenschnittstelle 80 in den Anreicherungskanal 72 eingeleitet, und ein elektrisches Feld wird zwischen die Elektroden 81 und 79 gelegt, was dafür sorgt, dass der Eluierungspuffer durch den Anreicherungskanal 72 in den Attributwertstabilisator 73 fließt, wobei er den Analyt mit sich nimmt. Wenn der Analyt die Kreuzungsstelle 82 erreicht, wird das elektrische Feld zwischen den Elektroden 79 und 81 durch ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden 76 und 77 ersetzt, was dafür sorgt, dass sich der Analyt den Elektrophoreseströmungspfad 71 entlang durch den Erfassungsbereich 99 zum Reservoir 74 bewegt.
Die in der 6 schematisch dargestellte Vorrichtung verfügt über einen Anreicherungskanal mit einer Elektrophorese-Anreicherungseinrichtung anstelle der Chromatographie-Anreicherungseinrichtung bei den Vorrichtungen der 1 bis 5. Bei der Vorrichtung 90 wird eine Probe in das Reservoir 96 eingeleitet, und ein elektrisches Feld wird zwischen Elektroden 87 und 88 gelegt, was dafür sorgt, dass die Probe zum Reservoir 98 wandert. Wenn sich die Probe zum Reservoir 98 bewegt, tritt sie in ein Schichtgel 93 mit relativ großer Porengröße ein und läuft zu einem Sekundärgel 92 mit relativ feiner Porengröße. An der Grenzfläche 94 werden die Probenkomponenten zu einem engen Band zusammen gedrückt. An diesem Punkt wird das elektrische Feld zwischen den Elektroden 87 und 88 durch ein elektrisches Feld zwischen Elektroden 89 und 90 ersetzt, das dafür sorgt, dass das schmale Band der Probenkomponenten an der Grenzfläche 94 in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 95, durch den Erfassungsbereich 91 und zum Reservoir 85 wandert. In der Vorrichtung 90 könnte anstelle der Schichtgelkonfiguration eine Membran für Molekülgrößen im Bereich der Grenzfläche 94 vorhanden sein, die für ein selektives Durchlaufen von Probenkomponenten unterhalb einer Schwellenmasse und ein Zurückhalten an der Membranfläche für Komponenten über dieser Schwellenmasse sorgen könnte. Bei noch einer anderen Modifizierung bei der in der 6 dargestellten Vorrichtung könnte am Ort der Grenzfläche 94 eine Elektrode vorhanden sein, durch die ein geeignetes elektrisches Potential angelegt werden könnte, um eine interessierende Probenkomponente im Bereich 93 zu halten, um dadurch für eine Komponentenkonzentration im Bereich 93 zu sorgen. Beispielsweise wandert bei einem interessierenden anionischen Analyt beim Einleiten einer Probe in das Reservoir 96 und beim Anlegen eines elektrischen Felds zwischen 93 und 87, wobei 93 die positive Elektrode ist und 87 die Masse ist, der ionische Analyt zum Bereich 93 und wird dort konzentriert. Nachdem der Analyt im Bereich der Elektrode 93 konzentriert wurde, kann dann ein elektrisches Feld zwischen 89 und 90 gelegt werden, was dafür sorgt, dass der anionische Analyt zum Reservoir 85 wandert.
Die 7 liefert eine schematische Draufsicht einer scheibenförmigen Ausführungsform der betrachteten Vorrichtung, im Gegensatz zu der kreditkartenförmigen Ausführungsformen der 3 bis 6. Bei der Vorrichtung 100 wird als erstes eine Probe in den Anreicherungskanal 102 eingeleitet. Dann wird zwischen Elektroden 108 und 109 ein elektrisches Feld gelegt, um den Eluierungspuffer 103 durch den Anreicherungskanal 102 zu bewegen, wodurch ein im Anreicherungskanal 102 festgehaltener Analyt freigesetzt wird und mit dem Eluierungspuffer zur Kreuzungsstelle 114 transportiert wird. Dann wird das elektrische Feld zwischen 108 und 109 durch ein elektrisches Feld zwischen 110 und 111 ersetzt, was dafür sorgt, dass sich der Analyt von der Kreuzungsstelle 114 den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 112 entlang, durch den Erfassungsbereich 113 und zum Reservoir 107 bewegt.
Andere Ausführungsformen werden unter Bezugnahme auf die Flussdiagramme in den 8 bis 19 verständlich, von denen einige Ausführungsformen entsprechen, wie sie in den Skizzen in den 1 bis 7 dargestellt sind. Es wird beispielsweise auf die 8 Bezug genommen, in der ein Flussdiagramm eines Anreicherungskanals dargestellt ist, wie er in der 1 oder der 2 dargestellt ist, wobei entsprechende Bezugszahlen vorhanden sind. Demgemäß tritt, wie es unter Bezugnahme auf die 1 und 2 beschrieben wurde, eine Probe durch den Probeneinlass 7 über den Strömungspfad 12 in den Anreicherungskanal 10 ein. Wenn sich die Probe durch den Anreicherungskanal 10 bewegt, wird die Fraktion, die die interessierende Fraktion enthält, an einem Anreicherungsmedium festgehalten, das beispielsweise ein C18-Umkehrphasenmaterial sein kann (wie es unter Bezugnahme auf die 1 beschrieben wurde), oder bei dem es sich um Bindungspaarelemente handeln kann, die kovalent an ein Netz aus Glasfasern gebunden sind (wie es unter Bezugnahme auf die 2 beschrieben wurde), während die restliche Abfallfraktion durch den Abfallauslass 6 den Strömungspfad 13 entlang herausfließt. Nachdem eine geeignete Probenmenge durch den Anreicherungskanal 10 floss, wird der Fluss durch den Einlass 7 und den Auslass 6 gestoppt, und ein Eluierungspuffer tritt durch den Einlass 4 über den Strömungspfad 14 in den Anreicherungskanal 10. Im Anreicherungskanal 10 wird die festgehaltene, interessierende Fraktion in den über das Anreicherungsmedium laufenden Eluierungspuffer freigesetzt, und sie läuft über den Strömungspfad 15 durch den Auslass 5 für die angereicherte Fraktion heraus.
Weiterhin wird auf die 9 Bezug genommen, in der ein Flussdiagramm der Ausführungsform einer Vorrichtung 30 dargestellt ist, wie sie skizzenhaft in den 3A, 3B dargestellt ist und unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde. In den Flussdiagrammen ist der Anreicherungskanal (34 in der 3A, 3B, 9) durch ein Quadrat dargestellt; die verschiedenen Reservoire (beispielsweise 32, 33 in den 3A, 3B, 9) sind durch kleine Kreise an den Enden der Strömungspfade (Kanäle) dargestellt, die durch Linien dargestellt sind (beispielsweise der Elektrophorese-Hauptströmungspfad 31 in den 3A, 3B, 9); Elektroden (35, 36 in den 3A, 3B, 9) sind durch dünne Linien dargestellt, die zu den Zentren der Reservoirkreise verlaufen; eine Schnittstelle für Spritzeneinleitung (wo eine solche vorhanden sein kann; beispielsweise 38 in den 3B, 9) ist durch ein Trapez am Ende des Probeneinlass-Strömungspfads dargestellt, und der Erfassungsbereich (37 in den 3A, 3B, 9) ist durch einen fetten Pfeil repräsentiert, der den Elektrophorese-Hauptströmungspfad berührt. In ähnlicher Weise ist in der 12 ein Flussdiagramm der Ausführungsform der in der 6 skizzierten Vorrichtung 90 dargestellt, die unter Bezugnahme darauf oben beschrieben wurde. Bei dieser Aus führungsform wirkt der Anreicherungskanal (120 in der 12) durch Elektrophoreseanreicherung, was zu einer Ansammlung der interessierenden Fraktion am Punkt führt, an dem der Anreicherungskanal 120 vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad 95 geschnitten wird. Eine Bewegung des Probenmaterials durch den Anreicherungskanal kann dadurch bewerkstelligt werden, dass zwischen die Elektroden 87, 88 eine elektrische Potentialdifferenz gelegt wird; und ein Eluieren der interessierenden Fraktion aus dem Anreicherungskanal durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad und zum Erfassungsbereich 91 kann dadurch bewerkstelligt werden, dass zwischen die Elektrode 89, 90 eine elektrische Potentialdifferenz gelegt wird. Wie es oben unter Bezugnahme auf die 6 beschrieben ist, kann der Ansammlungspunkt die Grenzfläche 94 zwischen einem Schichtgel 93 und einem Sekundärgel 92 sein; und bei einer weiteren Modifizierung kann ein geeignetes elektrisches Potential an eine Elektrode (121 in der 12) am Ort der Grenzfläche 93 gelegt werden, um für eine Komponentenkonzentration in diesem Bereich des Anreicherungskanals zu sorgen.
Die 10 ist ein Flussdiagramm der Ausführungsform einer Vorrichtung, bei der der Anreicherungskanal 62 durch einen Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 55 vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad 52 getrennt ist, wie es in der 4 skizziert ist und oben unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde. In ähnlicher Weise ist die 13 ein Flussdiagramm der scheibenförmigen Ausführungsform einer Vorrichtung 100, wie sie in der 7 skizziert ist und unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde. Die 13 zeigt den Probeneinlass-Strömungspfad, durch den die Probe von der Spritzenschnittstelle 66 in den Anreicherungskanal 102 eingeleitet wird, und den Abtransportauslass 64, durch den Abfall zu einem Abfallreservoir 63 herausläuft, während die interessierende Fraktion am Zurückhaltemedium im Anreicherungskanal festgehalten wird. Diese Merkmale sind in den Draufsichten der 7 oder der 4 nicht dargestellt.
In der 11 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung 70 dargestellt, bei der nur ein Fluideinlass in den Anreicherungskanal 72 hinein und ein Fluidauslass aus ihm heraus vorhanden ist, wie es in der 5 skizziert ist und unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde. Während der Probeninjektion durch die Spritzenschnittstelle dient der Fluideinlass 116 als Probeneinlass, und der Probenauslass 118 dient als Abfallauslass. Während die interessierende Fraktion durch das Zurückhaltemedium im Anreicherungskanal festgehalten wird, strömt die Abfallfraktion durch den Elektrophorese-Sekundärströmungs pfad 73 stromabwärts über die Kreuzungsstelle 82 desselben mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 71, und in den Abtransportauslass 84, wo der Abfall vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad 71 zum Abfallreservoir 78 weggelenkt wird. Während des Eluierens wird der Eluierungspuffer über die Spritzenschnittstelle eingeleitet. Der Fluideinlass 116 dient als Einlass für den Eluierungspuffer, und der Fluidauslass 118 dient als Auslass für die angereicherte Fraktion zum Elektrophorese-Sekundärströmungspfad. Die interessierende Fraktion bewegt sich in den Eluierungspuffer, in dem sie elektrokinetisch in einem durch Anlegen einer Spannung an Elektroden 79, 81 erzeugtes Feld zur Kreuzungsstelle zwischen dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad angetrieben wird. Wenn einmal die interessierende Fraktion die Kreuzungsstelle erreicht hat, wird eine Spannung an die Elektroden 76, 77 gelegt, um den Analyt oder die Analyten in der interessierenden Fraktion in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad und diesen entlang zur Erfassungszone 99 zu ziehen.
Wie es unter Bezugnahme auf die 5 angegeben wurde, kann die Abfallfraktion (Material, das nicht an das Anreicherungsmedium gebunden wird) aus dem Anreicherungskanal heraus und weg vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad dadurch ausgewaschen werden, dass ein elektrisches Feld zwischen Elektroden stromaufwärts in Bezug auf den Anreicherungskanal und stromabwärts in Bezug auf den Abtransportauslass angelegt wird. D, h., dass vor dem Einleiten des Eluierungspuffers in den Anreicherungskanal ein flüssiges Waschmedium über das Anreicherungsmedium geleitet und durch den Abtransportauslass ausgelassen wird, um Abfallfraktionskomponenten abzutransportieren. Jedes beliebige einer Anzahl von Materialien kann als Waschmedium geeignet sein, solange es die interessierende Fraktion nicht wesentlich aus dem Anreicherungsmedium eluiert. Darüber hinaus kann das Waschmedium so gewählt werden, dass es ein selektives Freisetzen oder Entfernen, vor dem Eluieren, unerwünschter Komponenten erleichtert, die an das Anreicherungsmedium gebunden oder ihm auf andere Weise zugeordnet sein können. Wenn beispielsweise die interessierenden Komponenten DNA-Fragmente sind, kann das Waschmedium Enzyme enthalten, die Proteine oder Polypeptide selektiv zerlegen oder RNAs selektiv zerlegen, was das Entfernen dieser Verunreinigungen aus der interessierenden Fraktion vor dem Eluieren erleichtert. Andernfalls kann, wenn die interessierenden Komponenten beispielsweise Proteine sind, das Waschmedium DNAs und RNAs enthalten.
Eine sequenzielle Bewegung der verschiedenen Flüssigkeiten in den Anreicherungskanal und durch ihn hindurch kann dadurch leicht gesteuert werden, dass ein Reservoir und ein Elektrophoreseströmungspfad am stromaufwärtigen Teil des Anreicherungskanals für jede derartige Flüssigkeit angebracht werden. Wie es im Flussdiagramm der 14 dargestellt ist, wird beispielsweise ein Eingang 212 in den Anreicherungskanal 210 durch einen von einem Probenreservoir 218 her verlaufenden Probenzuführ-Strömungspfad 220, einen von einem Waschmediumreservoir 214 verlaufenden Waschmedium-Strömungspfad 218 und einen von einem Eluierungsmediumreservoir 215 verlaufenden Eluierungsmedium-Strömungspfad 216 versorgt. Die Bewegung dieser Materialien kann dadurch selektiv gesteuert werden, dass elektrische Potentiale an Elektroden (in der Figur nicht dargestellt) an den jeweiligen Reservoiren und an geeigneten Punkten (wie hier für verschiedene Konfigurationen beschrieben) stromabwärts in Bezug auf den Auslass 214 des Anreicherungskanals angelegt werden. Zu geeigneten Waschmedien für Proteine gehören beispielsweise im pH-Wert eingestellte Puffer und organische Lösungsmittel; und der Waschvorgang kann beispielsweise dadurch eingestellt werden, dass die Ionenstärke oder die Temperatur des Waschmediums eingestellt wird.
Es können auch andere Materialien in den Eingangsströmungspfad eingeleitet werden, und insbesondere können ein oder mehrere Reagenzströme zur Vorbehandlung der Probe selbst, bevor sich diese in den Anreicherungskanal bewegt, vorhanden sein. Eine Rohprobe eines Körperfluids (beispielsweise Blut, Lymphflüssigkeit, amniotische Flüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit oder Urin) kann dadurch vorbehandelt werden, dass die Probe im Probenströmungspfad mit einem Reagens kombiniert wird. Beispielsweise kann DNA aus Zellen in einer Rohprobe von Gesamtblut dadurch freigesetzt werden, dass ein Reagens zugemischt wird, das ein Enzym oder ein Detergens enthält.
Es können andere Strömungspfadkonfigurationen stromabwärts in Bezug auf den Anreicherungskanal verwendet werden, und bestimmte derselben können zu Vorteilen für spezielle Arten einer stromabwärtigen Behandlung oder Analyse der Komponenten der interessierenden Fraktion sorgen. In der 15 schneidet beispielsweise der Elektrophorese-Sekundärströmungspfad nicht den Elektrophorese-Hauptströmungspfad; vielmehr ist der Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 an einer T-Kreuzungsstelle mit dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 verbunden (siehe die 12). Bei dieser Konfiguration läuft der stromaufwärtige Arm des Elektrophorese-Hauptströmungspfads in denselben Kanal wie der Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236. Bei anderen Konfigurationen, wie sie hier beschrieben sind, tritt die Probe über einen Probenströmungspfad 234 vom Probenreservoir 233 in den Anreicherungskanal 230 ein; während des Anreicherungsstadiums läuft das Abfallfluid aus dem Anreicherungskanal 230 über den Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236, dann über die T-Kreuzungsstelle 237 und durch den Abtransportauslass 240 hindurch zum Abfallreservoir 241 heraus. Wenn einmal das Anreicherungsstadium abgeschlossen ist, kann ein Waschmedium durch den Anreicherungskanal und auch durch den Abtransportauslass hindurch geschickt werden. Das Waschmedium kann über den Probenzuführ-Strömungspfad eingeleitet werden, oder wahlweise über einen getrennten Strömungspfad für das Waschmedium, wie es oben unter Bezugnahme auf die 14 beschrieben wurde. Für eine Bewegung der Probe und des Waschmediums kann dadurch gesorgt werden, dass ein elektrisches Feld an Elektroden (in der Figur nicht dargestellt) am Abfallreservoir 241 bzw. am Probenreservoir 233 (und wahlweise an einem Waschreservoir) gelegt wird. Dann kann ein Eluierungsmedium von einem Eluierungspufferreservoir 230 in den Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 und durch diesen hindurch bewegt werden. Medien stromabwärts in Bezug auf die Eluierungsfraktionskomponenten können aus dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 und den Abfallauslass-Strömungspfad 240 herausgeleitet werden, bis die am weitesten stromabwärts vorhandene interessierende Komponente die Kreuzungsstelle 237 erreicht hat. Dann kann ein elektrisches Potential an das Reservoir 239 angelegt werden, um die Komponenten aus dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 durch die Kreuzungsstelle 237 und im Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 zum Erfassungsbereich 242 und diesen hindurch zu ziehen.
Eine Kreuzungsstelle des Elektrophorese-Hauptströmungspfads und des Elektrophorese-Sekundärströmungspfads an einer "Einleitkreuzung", wie sie beispielsweise in den 5, 12 dargestellt ist, kann dort von Vorteil sein, wo eine genaue Zumessung des Probenpfropfens erwünscht ist, wie beispielsweise dann, wenn der Elektrophorese-Hauptströmungspfad zur elektrophoretischen Trennung verwendet wird. Eine derartige Einleitkreuzung kann für das Einleiten eines geometrisch definierten Pfropfens von Probenkomponenten aus der interessierenden Fraktion von der Kreuzungsstelle her führen.
Wenn andererseits eine genaue Kontrolle eines Probenpfropfens nicht wünschenswert ist und insbesondere dann, wenn es wünschenswert ist, die gesamte eluierte Probe durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad zu bewegen, kann eine T-Kreuzungsstelle bevorzugt sein. Eine derartige Konfiguration kann beispielsweise dann von Vorteil sein, wenn die Komponenten dadurch analysiert werden, dass im wesentlichen die gesamte eluierte Fraktion durch ein Array von Affinitätszonen stromabwärts von der Kreuzungsstelle geschickt wird.
Beispielsweise ist die 16 ein Diagramm, das den Fluss bei einer Konfiguration mit einem seriellen Array von Affinitätszonen 244, 246, 248, 250 zeigt. Jede Affinitätszone ist mit einem Anreicherungsmedium versehen, das spezifische Affinität zu einer ausgewählten Komponente der interessierenden Fraktion zeigt. Beispielsweise kann die interessierende Fraktion aus DNA in einem Rohzellenlysat bestehen, wobei das Lysat stromabwärts in Bezug auf den Anreicherungskanal 230 gebildet sein kann und im Anreicherungskanal 230 konzentriert und/oder gereinigt wurde, so dass die eluierte Fraktion, die in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 gelaufen ist, hauptsächlich aus einem komplexen Gemisch von DNA-Fragmenten verschiedener Längen und Basenzusammensetzungen besteht. Jede Hybridisierungszone ist selbst ein Anreicherungskanal, in dem das Anreicherungsmedium eine immobilisierte oligonukleotide Sonde mit einer Sequenz komplementär zu der in einer Ziel-DNA enthält. Wenn die eluierte Fraktion seriell durch die Affinitätszonen 244, 246, 248, 250 läuft, wird jede Ziel-DNA, die in der Fraktion vorhanden ist und komplementär zur Sonde in einer der Affinitätszonen ist, in dieser Affinitätszone gebunden. Die Affinitätszonen sind mit Detektoren 243, 245, 247, 249 versehen, die so konfiguriert sind, dass sie ein Signal (wie Fluoreszenz oder Elektrochemielumineszenz) von interessierenden Komponenten, die in den Affinitätszonen gebunden sind, erfassen und, wahlweise, quantifizieren. Es kann jede beliebige Art einer Biomolekülerkennung als Festhalteprinzip in den Affinitätszonen verwendet werden, wie es dem Fachmann bekannt ist. Zu nützlichen Affinitätstypen gehören Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen; das Binden von Poly-dT durch adenylierte DNA; Oligonukleotidsonden für RNA, DNA, PNA; Streptavidin-Biotin-Bindung; Protein-DNA-Wechselwirkungen wie DNA bindendes Protein G oder Protein A; und Moleküle mit gruppenspezifischen Affinitäten wie Arginin, Genzamidin, Heparin und Lectinen. Andere Beispiele sind für den Fachmann ersichtlich.
Demgemäß kann beispielsweise zum Festhalteprinzip Rezeptor-Liganden-Bindung, Antikörper-Antigen-Bindung usw. gehören, und so können Verfahren und Vorrichtungen gemäß der Erfindung nützlich sein, um Immunoassays, Rezeptorbindung sassays und dergleichen auszuführen, und auch für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays.
Alternativ kann, wie oben angegeben, der Elektrophorese-Hauptströmungspfad stromabwärts in Bezug auf die Kreuzungsstelle mit dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad verzweigen, um ein paralleles Array von Elektrophorese-Hauptströmungspfaden zu bilden, wie es beispielsweise in der 17 dargestellt ist. Der Elektrophoreseströmungspfad 238 ist als doppelt verzweigt dargestellt, so dass vier Elektrophorese-Hauptströmungspfade stromabwärts in Bezug auf ihre jeweiligen Abfallreservoire 262, 264, 266, 268 verlaufen. Die Zweige sind bei diesem Beispiel mit Affinitätszonen 254, 256, 258, 260 mit Detektoren 253, 255, 257, 259 versehen. Einschlägige Eigenschaften des Milieus (wie beispielsweise die Temperatur, der pH-Wert, Pufferbedingungen und dergleichen) können in vorteilhafter Weise in jedem Strömungspfadzweig unabhängig von den anderen kontrolliert werden, wie es unten unter Bezugnahme auf die 22 detaillierter angegeben ist.
Wenn die Affinitätszonen parallel angeordnet sind, wie beispielsweise in der 17, kann jede Affinitätszone eine Teilmenge der gesamten an den Elektrophorese-Hauptkanal gelieferten Probe empfangen. Bei dieser Ausführungsform erscheinen Probenkomponenten, die durch zwei oder mehr der Affinitätsmedien festgehalten werden können, in den jeweiligen zwei oder mehr Affinitätszonen. Beispielsweise wird ein Nukleinsäurefragment, das eine oder beide von zwei Sequenzen enthält, die komplementär zu zwei der Sondensequenzen sind, in der Parallelanordnung, in den zwei Affinitätszonen festgehalten, die diese zwei Sonden enthalten. Wenn andererseits die Affinitätszonen seriell angeordnet sind, wie beispielsweise in der 16, wird jede stromabwärtige Affinitätszone nur durch Probenkomponenten erreicht, die nicht durch eine Affinitätszone stromaufwärts in Bezug auf sie festgehalten wurden. Hierbei wird beispielsweise ein Nukleinsäurefragment, das beide von zwei Sequenzen enthält, die komplementär zu Sondensequenzen in zwei der Affinitätszonen sind, nur in der weiter stromaufwärts liegenden zwei Affinitätszonen festgehalten. Diese Anordnung kann dann von Vorteil sein, wenn es wünschenswert ist, Probenkomponenten zu identifizieren, die eine aber nicht eine andere Komponentenart oder Sequenz enthalten.
Außerdem können alternativ, wie oben angegeben, mehrere Elektrophorese-Hauptströmungspfade zur Behandlung der angereicherten, eluierten Probe vorhanden sein. Wie es in der 18 beispielhaft dargestellt ist, können die Elektrophorese-Hauptströmungspfade 270 die eluierte Probenfraktion aus dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 über eine Reihe von Kreuzungsstellen 272 transportieren. Jeder Elektrophorese-Hauptströmungspfad 270 ist mit Reservoiren stromaufwärts (274) und stromabwärts (276) versehen, und jeder ist mit einem Detektor 278 versehen. Diese Konfiguration kann dazu verwendet werden, eine Gruppe von Tests oder Assays laufen zu lassen oder Messungen an Teilmengen einer einzelnen angereicherten Probenfraktion auszuführen, und dies ist dann besonders nützlich, wenn, wie oben angegeben, eine genaue Zumessung der Analytmenge wünschenswert ist. Wie ersichtlich, kann jeder der Elektrophorese-Hauptströmungspfade 270 mit einer Affinitätszone oder einem Array von Affinitätszonen (wie in der 18 dargestellt) versehen sein, wie es oben unter Bezugnahme auf die 16, 17 beschrieben wurde.
Andernfalls kann, wie es beispielhaft in der 19 dargestellt ist, eine Anzahl von Anreicherungskanälen 280 eine Probe aus einem verzweigenden Probenzuführverteiler 281 empfangen. Jeder Anreicherungskanal 280 kann während des Eluierungsstadiums eine angereicherte Fraktion an eine Kreuzungsstelle 288 mit einem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 284 liefern. Während des Anreicherungsstadiums (und wahlweise während eines Waschstadiums) wird die Abfallfraktion über einen verzweigten Auslassverteiler 283 von den Kreuzungsstellen 288 weg und durch den Abtransportauslass 240 hindurch zum Abfallreservoir 241 transportiert. Eine derartige Anordnung kann mit besonderem Vorteil beispielsweise dann verwendet werden, wenn die interessierende Fraktion ein Gemisch von DNA ist und wenn es wünschenswert ist, sowohl Sequenzinformation als auch Größeninformation zu den DNAs zu erhalten. Die Konfiguration der 19 kann beispielsweise für eine Durchflussanalyse analog zu einer Southern-Blot-Analyse verwendet werden. Bei der herkömmlichen Southern-Blot-Analyse werden als erstes DNA-Fragmente an einem Gel getrennt, und dann werden sie zu einer Membran transferiert, an der Sonden komplementäre Fragmente binden können. Die Southern-Blot-Analyse wird hauptsächlich als hochstehende, manuelle Laborprozedur ausgeführt, und sie ist sehr arbeitsintensiv, da sie zur Fertigstellung einige Tage benötigt. Die Durchflussanalyse gemäß der Erfindung kann im Wesentlichen automatisiert werden, und sie kann viel schneller abgeschlossen werden.
Bei der Durchflussanalyse ist jeder bis auf einer der Anreicherungskanäle mit einem sequenzspezifischen Festhaltemedium versehen, wie einer sequenzspezifi schen, immobilisierten Oligonukleotidsonde, und dieser mindestens eine der Anreicherungskanäle ist mit einem generischen Festhaltemedium versehen, das alle DNA-Fragmente in der Probe bindet. Diese verschiedenen angereicherten Fraktionen werden im Eluierungsstadium an die Kreuzungsstellen 288 geliefert, und dann werden sie elektrophoretisch im jeweiligen Elektrophorese-Hauptströmungspfad 284, von denen jeder mit einem Detektor 286 versehen ist, bewegt. Die angereicherte Fraktion aus dem Anreicherungskanal, der ein generisches Festhaltemedium enthält, enthält ein Gemisch aller Größen von DNAs in der Probe, mit einem Bereich elektrophoretischer Beweglichkeiten, die sequenziell am Detektor vorbeilaufen, was zu einer Reihe von Signalpeaks führt. Die angereicherte Fraktion von jedem der anderen Anreicherungskanälen enthält nur DNAs, die komplementär zum spezifischen Festhaltemedium im jeweiligen Anreicherungskanal sind.
Bei einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, ein oder mehrere Reagenzien mit der angereicherten Fraktion stromabwärts in Bezug auf die Kreuzungsstelle zwischen dem Sekundärströmungspfad und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad zu kombinieren. Die 20 ist ein Flussdiagramm, das ähnlich dem in der 15 dargestellten ist. In der 20 transportiert ein Reagenzströmungspfad 300 ein Reagens (oder mehrere Reagenzien) von einem Reservoir 301 zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238, wo das Reagens mit einem oder mehreren Analyten in der angereicherten Fraktion kombinieren und reagieren kann. Außerdem kann, wie es ersichtlich ist, wenn der Elektrophorese-Hauptströmungspfad stromabwärts in Bezug auf die Kreuzungsstelle mit dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad verzweigt, wodurch in den Zweigen Unterfraktionen gebildet werden, jeder derartige stromabwärtige Zweig mit einem Reagenzströmungspfad versehen sein, der ein Reagens von einem Reservoir transportiert. Eine derartige Konfiguration kann entweder für eine wiederholte Behandlung der Unterfraktionen mit einem einzelnen Reagens oder für eine Behandlung jeder Unterfraktion mit einem anderen Reagens oder für eine gleichzeitige Behandlung von Unterfraktionen mit zwei oder mehreren Reagenzien sorgen, wobei jeweils aufgrund der Wechselwirkung mit dem mindestens einen Analyt in der angereicherten Unterfraktion ein spezielles gewünschtes Ergebnis erzeugt wird.
Die 21 und 22 sind Flussdiagramme, die denen ähnlich sind, wie sie in den 16 und 17 dargestellt sind, wobei mehrere verzweigte Elektrophorese-Hauptströmungspfade vorliegen, wobei jeder Zweig mit einer Affinitätszone versehen ist. In der 21 transportiert der Reagenzströmungspfad 300 ein Reagens (oder mehrere Reagenzien) von einem Reservoir 301 zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238, wo es mit einem oder mehreren Analyten in der angereicherten Fraktion kombinieren und reagieren kann. Bei dieser Ausführungsform sorgt, da der Reagenzströmungspfad 300 den Eingriffsabschnitt 238 an einem Punkt stromabwärts von der ersten Gabelung schneidet, das durch das Reservoir 301 zugeführte Reagens für eine wiederholte Behandlung aller Unterfraktionen, die in den stromabwärtigen Zweigen behandelt werden und in den jeweiligen Affinitätszonen erfasst werden. In der 22 ist jeder der stromabwärtigen Zweige des Elektrophorese-Hauptströmungspfads 238 mit einem Reagenzströmungspfad (302, 304, 306, 308) versehen, von denen jeder ein Reagens von einem separaten Reagenzreservoir (303, 305, 307, 309) transportiert. Eine derartige Konfiguration kann für verschiedene Behandlungen der Unterfraktionen sorgen, um beispielsweise für eine unabhängige Stringenzkontrolle paralleler Hybridisierungszonen zu sorgen.
Beispielsweise können zum DNA-Profiling Vorrichtungen verwendet werden, die mit Strömungspfaden gemäß einer beliebigen der 18 bis 22 oder einer Kombination derselben versehen sind. Genauer gesagt, kann beispielsweise eine Restriktionsfragmentpolymorphie("RFLP")-Analyse dadurch ausgeführt werden, dass mehrere verschiedene Einzelort-RFLP-Sonden in Reservoiren 303, 305, 307 und 309 verwendet werden, wie es in der 22 dargestellt ist. Durch paralleles Betreiben einer Anzahl von Sonden sollte die sich ergebende Verteilung von Allelen zu einem schnellen und repräsentativen DNA-Profil führen, während die Möglichkeit zufälliger Übereinstimmung deutlich minimiert wird.
Die betrachteten Vorrichtungen können bei einer Anzahl von Anwendungen verwendet werden, bei denen ein oder mehrere elektrische Felder an ein Medium angelegt werden, um Objekte durch dieses zu bewegen. Zu repräsentativen Anwendungen gehören Elektrophorese-Trennanwendungen, Nukleinsäurehybridisierung, Ligandenbindung, Präparationsanwendungen, Sequenzieranwendungen, Syntheseanwendungen, Analytidentifizieranwendungen, einschließlich klinischen, umweltbezogenen, Qualitätskontrollanwendungen und dergleichen. So kann abhängig von der speziellen Anwendung eine Anzahl verschiedener Fluidproben in die betrachtete Vorrichtung eingeleitet werden, wobei zu repräsentativen Proben Körperfluide, Fluidproben aus der Umwelt, beispielsweise Wasser und dergleichen, oder andere Fluidproben gehören, bei denen die Identifizierung und/oder Isolierung eines speziellen Analyten erwünscht ist. Abhängig von der speziel len Anwendung kann eine Anzahl verschiedener Analyten von Interesse sein, einschließlich Medikamenten, Toxinen, natürlich auftretenden Verbindungen wie Peptiden und Nukleinsäuren, Proteinen, Glycoproteinen, organischen und anorganischen Ionen, Steroiden und dergleichen. Von speziellem Interesse ist die Verwendung der betrachteten Vorrichtungen bei klinischen Anwendungen, wo die zu analysierenden Proben Blut, Urin, Plasma, Cerebrospinalfluid, Tränen, Nasen- oder Ohrausfluss, Gewebelysat, Speichel, Okularabschabungen, Feinnadelbiopsien und dergleichen enthalten können, wobei die Probe wiederbehandelt, beispielsweise mit einem Lösungsmittel kombiniert, werden kann, was jedoch nicht der Fall sein muss, um die Viskosität zu senken, die Ionenstärke zu verringern oder die Löslichkeit zu erhöhen oder auf einen speziellen pH-Wert zu puffern, und dergleichen, bevor eine Einleitung in die Vorrichtung erfolgt. Bei klinischen Anwendungen gehören zu den interessierenden Analyten Anionen, Kationen, kleine organische Moleküle einschließlich Stoffwechselprodukten von Medikamenten oder Xenobiotika, Peptide, Proteine, Glycoproteine, Oligosaccharide, Oligonukleotide, DNA, RNA, Lipide, Steroide, Cholesterole und dergleichen.
Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben.
BEISPIELE
Beispiel 1
Trennung hoher Effizienz von organischen Analyten in einer wässrigen Probe
Bei der Trennung organischer Analyte in einer wässrigen Probe wird eine Karte, wie sie in der 4 dargestellt ist, wie folgt in Verbindung mit einer Vorrichtung verwendet, die für das Anlegen geeigneter elektrischer Felder durch Einführen von Elektroden in jedes Reservoir der Karte sorgt, sowie für Maßnahmen zum Erfassen eines Analyten sorgt, wenn dieser durch einen Erfassungsbereich 35 läuft. Bei der Karte 50 verfügt der Anreicherungskanal 62 über poröse Kügelchen, die mit einer C18-Phase bedeckt sind, während die Reservoire und Kanäle, mit Ausnahme des Abfallreservoirs, einen Boratpuffer von 20 Millimol enthalten. In jeden Anreicherungskanal 62 werden über eine Schnittstelle 66 100 µl einer wässrigen Probe injiziert. Im Wesentlichen der gesamte organische Analyt in der Probe bindet reversibel an die porösen, mit C18 beschichteten Kügelchen, während die restlichen Probenkomponenten aus dem Anreicherungskanal 32 in das Abfallreservoir 63 fließen. 100 µl eines Eluierungspuffers (90% Methanol/10% Boratpuffer von 20 Millimol mit dem pH-Wert 8,3) werden dann durch die Schnittstelle 66 in den Anreicherungskanal 62 eingeleitet, wobei der reversibel gebundene organische Analyt in den Eluierungspuffer hinein freigesetzt wird. Wegen des kleinen verwendeten Volumens des Eluierungspuffers ist die Konzentration des Analyten im Volumen des Eluierungspuffers im Vergleich zur Analytkonzentration in der ursprünglichen Probe auf das 100- bis 1000-fache erhöht. Dann werden die Abdichtungen über den Reservoiren 57 und 56 entfernt, und es wird ein elektrisches Feld zwischen die Elektroden 61 und 60 gelegt, was dafür sorgt, dass sich der in 57 vorhandene Puffer zu 56 hin bewegt, wobei die Bewegung der Pufferfront den Eluierungspfropfen mit dem konzentrierten Analyten zur Kreuzungsstelle 51 hin bewegt. Dann wird zwischen Elektroden 58 und 59 ein Spannungsgradient gelegt, was dafür sorgt, dass sich das schmale Band des im Volumen des Eluierungspuffers vorhandenen Analyten durch den Trennkanal 52 bewegt, was zu einer Trennung der organischen Analyten mit hoher Effizienz führt.
Der obige Versuch wird auch bei einer modifizierten Version der in der 4 dargestellten Vorrichtung ausgeführt. Bei der modifizierten Vorrichtung verfügt diese, zusätzlich zum Reservoir 57, über ein Eluierungspufferreservoir, das ebenfalls in Fluidverbindung mit dem Anreicherungskanal 62 steht. Bei diesem Versuch wird die Probe in den Anreicherungskanal 62 eingeleitet, wodurch die im Eluierungspuffer vorhandenen organischen Analyte reversibel an die im Anreicherungskanal vorhandenen mit der C18-Phase beschichteten Kügelchen binden. Ein elektrisches Feld wird zwischen eine im Eluierungspufferreservoir vorhandene Elektrode und die Elektrode 60 für eine begrenzte Zeitperiode angelegt, die dazu ausreicht, dafür zu sorgen, dass sich 10 µl des Eluierungspuffers durch den Anreicherungskanal bewegen und jeglichen reversibel gebundenen organischen Analyten freisetzen. Nachdem sich der Eluierungspuffer in den Anreicherungskanal bewegt hat, wird zwischen die Elektroden 61 und 60 ein Spannungsgradient gelegt, was zu einer Bewegung des Puffers von 57 nach 56 sorgt, wodurch das definierte Volumen des organischen Analyten mit dem Eluierungspuffer zur Kreuzungsstelle 51 transportiert wird, wie oben beschrieben.
Beispiel 2
Probenanreicherung unter Verwendung paramagnetischer Kügelchen zur Anreicherung innerhalb einer integrierten Mikrofluidvorrichtung
Als Ausführungsformen der aktuellen Erfindung werden Versuchsprotokolle aufgrund biomagnetischer Trennverfahren angegeben. Bei einer Mikrofluidvorrichtung, die so konfiguriert ist, wie es allgemein in der 23 dargestellt ist und unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde, wird eine Rohprobe aus einem speziellen Ziel unter Verwendung von mit einem Affinitätsmedium behandelten Magnetkügelchen behandelt, um ein Ziel mit Bindungsaffinität für das spezielle Affinitätsmedium festzuhalten. Derartige Magnetkügelchen werden beispielsweise von Dynal, Inc., New York unter dem Namen Dynabeads^® vermarktet. Dynabeads sind superparamagnetische, monodisperse Polystyrol-Mikrokügelchen, die mit Antikörpern oder anderen Bindungsobjekten beschichtet sind, die selektiv an ein Ziel binden, das aus Zellen, Genen, Bakterien oder anderen Biomolekülen bestehen kann oder solche enthalten kann. Der Ziel-Dynabead-Komplex wird dann unter Verwendung eines Magnets isoliert. Die sich ergebende biomagnetische Trennprozedur ist einfach, schnell und zuverlässig, wobei die Dynabeads als generisches Anreicherungsmedium zum Isolieren spezieller Ziele aus komplexen, heterogenen, biologischen Gemischen dienen. Derartige magnetische Anreicherungsmedien können gemäß der Erfindung bei einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich beispielsweise der Zellbiologie, der Molekularbiologie, der HLA-Gewebetypisierung und der Mikrobiologie. Hier werden zwei veranschaulichende Beispiele speziell angegeben, nämlich Verfahren zur DNA-Reinigung und zur Zellenisolierung.
Als erstes wird die auf einem Mikrokanal basierende Vorrichtung allgemein beschrieben, und dann wird das Verfahren unter Verwendung von Kügelchen von Dynal zur biomagnetischen Trennung allgemein beschrieben.
Die integrierte Mikrofluidvorrichtung, wie sie beispielhaft in der 23 dargestellt ist, verfügt über einen Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 in Verbindung mit einem Anreicherungskanal, der über eine Festphasentrenn(SPE)kammer 380 verfügt, die mit einem stromabwärtigen Abfallreservoir 391 verbunden ist. Der Elektrophorese-Hauptströmungspfad, der aus einem Erfassungsbereich 393 für die angereicherte Probe und einem Fluidauslassreservoir 395 besteht, ist an einer T-Kreuzungsstelle 388 mit dem Elektropho rese-Sekundärströmungspfad 384 verbunden. Bei dieser Konfiguration erfolgt ein einfaches Handhaben auf elektrokinetische Weise durch Steuern des elektrischen Potentials an den geeigneten Elektroden, die in den Einlassreservoirs für den Waschpuffer 373 und den Eluierungspuffer 375 sowie den Auslassreservoirs 391 und 395 platziert sind.
Die Dynabeads und dann die interessierende Probe werden durch einen jeweiligen Einspritzeinlassport 379 bzw. 377 in die Vorrichtung eingeleitet. Innerhalb der Anreicherungskammer kommt es zu einer Inkubation der heterogenen Suspension der Probe und der für ein vorgegebenes Ziel spezifischen Dynabeads, wodurch diese durch spezifische Absorption an den speziellen Festhalteobjekten an der Oberfläche der Kügelchen mit dem Ziel binden können. Die Immobilisierung des Ziel-Kügelchen-Komplexes seitens der Anreicherungskammer 380 erfolgt magnetisch. Dies ist manuell dadurch möglich, dass ein Seltenerd-Permanentmagnet benachbart zur Anreicherungskammer platziert wird. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein automatisiertes Protokoll unter Verwendung einer elektromagnetischen Einrichtung dazu verwendet, das angelegte, auf die SPE-Kammer wirkende Magnetfeld zu kontrollieren.
Bei Abschluss des Schritts zur magnetischen Immobilisierung kann ein im Waschpufferreservoir 373 enthaltenes Waschmedium über den Pfad 374 in den Anreicherungskanal 380 und durch diesen bewegt werden. Während des Spülens der Probe läuft das Abfallfluid über den Elektrophoreseströmungspfad 384 aus der Anreicherungskammer 380 heraus, dann durch die T-Kreuzungsstelle 388, und dann durch den Abtransportauslass 392 zum Abfallreservoir 391 heraus. So wird der Überstand aus den Waschschritten aus dem System entfernt, ohne dass der Abfall durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 geleitet werden müsste. Diese Ausführungsform der Erfindung bildet eine vorteilhafte Maßnahme zum Isolieren und Anreichern eines Zielbiomoleküls aus einer Rohprobe, ohne dass zunächst der Erfassungsbereich 393 verschmutzt würde.
Beispiel 3
DNA-Reinigung aus Gesamtblut
Es ist ein Versuchsverfahren unter Verwendung einer Elektrophoresemikrovorrichtung, wie sie schematisch in der 23 dargestellt ist, geschaffen, bei der biomagnetische Kügelchen von Dynal^® als Anreicherungsmedium zum Extrahie ren und Reinigen von Genom-DNA aus Gesamtblut verwendet werden. Die Blutquelle kann eine kleine, getrocknete, forensische Probe auf einem Objektträger (beispielsweise in der Größenordnung eines Nanogramms), eine Teilmenge von frisch entnommenem Arterienblut (kleine Menge von 10 µl) oder Knochenmark (ungefähr 5 µl) sein. Es wird ein Protokoll, das auf schnelle DNA-Isolierung und -Eluierung anwendbar ist, angegeben, um eine automatisierte Prozedur zum Behandeln von Gesamtblut auf der Vorrichtung der 23 zu demonstrieren, die Teilmengen von DNA zur Verstärkung und Analyse oder zur direkten Analyse ohne Verstärkung liefert. Der Prozess beinhaltet die folgenden Schritte:

1. Laden des Reagens und der Probe;
2. Zelllysis/Festhalten der DNA;
3. Wiederholte DNA-Waschvorgänge; und
4. Eluierung der DNA.

Jeder dieser Schritte wird nun detaillierter erörtert.
Bei dieser Ausführungsform, bei der kommerziell abgepackte Reagenzien verwendet werden, erfolgt das Beladen mit den biomagnetischen Trennmedien, der Lysislösung und der Probe mittels speziell konzipierter Einfüllports, um Unterschiede bei den Reagenzien und der Probe zu berücksichtigen. Die Reagenzien DIRECT^TM von Dynal, zu denen die Lysislösung und Magnetkügelchen gehören, werden zunächst direkt in die Festphase-Extraktionskammer 380 durch den manuellen Injektionsport 379 eingefüllt, gefolgt von einem manuellen Einfüllen der Blutprobe in die SPE-Kammer über den Einfüllport 377. Alternativ können andere kommerzielle Reagenzien verwendet werden, bei denen die Nukleinsäuren-Lysislösung und die Kügelchen nicht gemeinsam als Materialsatz verpackt sind, sondern die stattdessen getrennt zugeführt werden. In diesem Fall kann eine Lysislösung elektrokinetisch vom Einlassreservoir 371 aus in die SPE-Kammer 380 geladen werden. Magnetkügelchen, wie sie beispielsweise von Japan Synthetic Rubber geliefert werden, werden als nächstes entweder vom Einfüllort 379 oder elektrokinetisch vom Einlassreservoir 369 aus geladen. Bei der letzteren Vorgehensweise werden die Kügelchen durch elektromagnetisches Festhalten, mechanische Einrichtungen (z. B. Membran, Maschengitter oder Agarosegelpfropfen), die unmittelbar stromabwärts von der SPE-Kammer im Strömungspfad 384 platziert ist oder beides, in die Kammer eingegrenzt. Wenn die Kammer einmal mit Kügelchen und Lysislösung gefüllt ist, wird die DNA-Probe über den Einfüllport 377 oder kinetisch über ein Probeneinlassreservoir zugesetzt, das mit einer Elektrode versehen ist, die als Paar mit einer Elektrode stromabwärts von der Kammer vorliegt.
Innerhalb der Anreicherungskammer können die Blutprobe, die Lysislösung und die Dynabeads für fünf Minuten inkubieren, in welcher Zeit die Zellen lysieren. Dann können freigesetzte Nukleinsäuren an den Festhalteobjekten absorbieren, die immobilisiert an der Oberfläche der Mikroteilchen vorhanden sind, um einen DNA-Kügelchen-Komplex zu bilden. Um die Zelllysis zu verbessern, kann ein Mischvorgang beispielsweise dadurch erzielt werden, dass die Zuführkanäle so angeordnet werden, dass die Ströme der Kügelchen, der Probe und der Lysislösung sich vermischen. Das Mischen kann elektrokinetisch durch eine vernünftige Kontrolle der angelegten elektrischen Felder unterstützt werden. Durch periodisches Umkehren der Polarität der im Einlass- und Auslassreservoir 271 und 391 platzierten Elektroden ist es möglich, das Blut-Lysispuffer-Gemisch elektrisch auf schwingende Weise in der SPE-Kammer zu bewegen. Um die auf die Zellen ausgeübte mechanische Scherung weiter zu erhöhen, können in das SPE-Kammergehäuse öffnungsartige Strukturen eingeformt werden.
Folgend auf die magnetische Isolierung und das Festhalten des DNA-Kügelchen-Komplexes seitens der SPE-Kammer erfolgt ein Spülen durch elektrokinetischen Transport der im Reservoir 373 enthaltenen Waschpufferlösung durch die Kammer und aus dem Abfallreservoir 391 heraus. Nach diesem Spülen für 45 Sekunden werden die Kügelchen dadurch wieder in der Lösung suspendiert, dass das Magnetfeld aufgehoben wird und dann eine Inkubation für eine Minute im Waschpuffer erfolgen kann. Gemäß demselben Protokoll wird das Spülen zwei weitere Male wiederholt, wodurch das Zelllysat und der Überstand aus jedem der Waschschritte aus dem System entfernt werden können, ohne dass der Abfall, einschließlich PCR-Inhibitoren, durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 laufen müsste.
Der abschließende Schritt des Reinigungsprozesses ist eine Eluierung der DNA. Wiederum werden die Festhaltekügelchen mit der gebundenen DNA elektromagnetisch immobilisiert, bevor der Eluierungspuffer elektrokinetisch vom Reservoir 373 in die SPE-Kammer transportiert wird. Um eine quantitative Eluierung zu erzielen, ist eine genaue Manipulation der Elektrodenpotentiale erforderlich, damit der Puffer nicht durch die Kammer laufen kann und so die gereinigte DNA vorzeitig auswaschen kann. Alternativ kann ein Eluierungspufferpfropfen durch Verwenden einer Einfüllkreuzungsstelle (in der 23 nicht dargestellt) in die Kammer bewegt werden, wie es von D. Benvegnu et al. im am 4. Mai 1999 und am 18. Juni 1997 (Attorney Docket No. A-64739/RFT/BK) eingereichten US-Patent Nr. 5,900,130 beschrieben ist. Wenn sich der Eluierungspuffer in der SPE-Kammer befindet, werden die Kügelchen durch Aufheben des Magnetfelds wieder suspendiert, und dann kann eine Inkubation im Eluierungspuffer für zwei Minuten erfolgen, was eine abschließende DNA-Desorptionskinetik erlaubt. Nach Abschluss der Eluierung der DNA werden die Kügelchen in der SP-Kammer elektromagnetisch immobilisiert, und die gereinigte DNA wird elektrokinetisch als Pfropfen zur Analyse in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 eingeleitet. Der Elektrophoreseströmungspfad 395 kann ein ausgeklügeltes Mikrofluidsystem (in der 23 nicht dargestellt) bilden, das aus mehreren Mikrokanälen für eingeschränkte Enzymverdauung, Blot-Hybridisierungen, einschließlich Southern- und Schlitz/Punkt-Blots, elektroforetische Fragmentsortierung und quantitative PCR-Analyse, u. a. bestehen kann. Diese Ausführungsformen der Erfindung werden jedoch bei diesem Beispiel nicht weiter erörtert.
Zusammengefasst gesagt, erlaubt es das obige Protokoll, für PCR bereitstehende Teilmengen gereinigter DNA in weniger als zehn Minuten und ohne Eingriff durch den Benutzer zu isolieren, wenn einmal die Rohprobe in die Mikrofluidvorrichtung eingebracht wurde. Zu anderen Vorteilen des Verfahrens gehören die winzigen Reagensmengen, die bei einem vorgegebenen Versuch verbraucht werden, zusätzlich dazu, dass nicht mehr arbeitsintensive Ausfäll- oder Zentrifugierschritte erforderlich sind.
Beispiel 4
Zollanreicherung unter Verwendung immunomagnetischer Isolation
Es wird ein Versuchsprotokoll angegeben, bei dem biomagnetische Kügelchen von Dynal^® als Anreicherungsmedium zum Isolieren von Zielzellen verwendet sind. Die Prozedur ist derjenigen ähnlich, die oben zur DNA-Reinigung beschrieben wurde. Wie beim Beispiel 3 wird das Ziel selektiv durch Kügelchen festgehalten, die mit speziellen Bindungsobjekten beschichtet sind, die sich immobilisiert an der Oberfläche der paramagnetischen Mikroteilchen befinden. Dynabeads sind in verschiedenen Formen zubereitet wie folgt verfügbar:

1. Vorbeschichtet mit affinitätsgereinigten monoklonalen Antikörpern zu vielen menschlichen Zellmarkern, einschließlich T-Zellen, T- Zellenuntergruppen, B-Zellen, Monozyten, Stammzellen, Myeloidzellen, Leukozyten und positiven Zellen der HLA-Klasse II;
2. beschichtet mit Sekundärantikörpern auf Maus-, Ratten- oder Kaninchenimmunoglobuline zur Isolierung von B-Zellen, T-Zellen und T-Zellenuntergruppen von Nagetieren;
3. in unbeschichteter oder tosylaktivierter Form für eine anwendungsspezifische Beschichtung mit irgendeinem vorgegebenen Biomolekül; oder
4. in Streptavidin-beschichteter Form zur Verwendung bei biotinylierten Antikörpern.

In einer Mikrofluidvorrichtung, die im wesentlichen so konfiguriert ist, wie es in der 23 dargestellt ist, wird eine homogene Zellensuspension unter Verwendung elektrokinetischer und magnetischer Manipulationsmethoden behandelt, um gereinigte Teilmengen von Zellen zur weiteren Verarbeitung und Analyse zu präparieren. Eine biomagnetische Trennung ist manuell oder gemäß einem automatisierten Format unter Verwendung einer elektromagnetischen Steuerung des an die SPE-Kammer gelegten Magnetfelds möglich. Das folgende Protokoll mit vier Schritten wird als repräsentative Ausführungsform der Erfindung angegeben.

1. Laden der Zielzellen und der Reagenzien, einschließlich biomagnetischer Trennmedien: Laden der Lösung von Magnetkügelchen in die SPE-Kammer 380, entweder direkt über den Einfüllport 379 oder elektrokinetisch vom Einlassreservoir 371 aus, das eine Lösung von für ein vorgegebenes Ziel spezifischen Dynal-Kügelchen enthält; oder direktes Zusetzen der Probe in die SPE-Kammer, die mit einer Lösung von Dynabeads gefüllt ist, was mittels des Probeneinlassports 377 erfolgt.
2. Festhalten von Zellen unter Verwendung von Dynabeads, die an ein spezielles Ziel binden können: die Probe und die Kügelchen können in der SPE-Kammer für 2,5 Minuten inkubieren, die Adsorption wird unter Verwendung eines elektrokinetischen Mischschritts verbessert, und Zielzellen binden an Dynabeads, um einen Ziel-Kügelchen-Komplex zu bildeln.
3. Waschen der Zielzellen durch Immobilisieren des Kügelchen-Zielzelle-Komplexes: Die festgehaltenen Kügelchen, die das Bindungsziel enthalten, werden elektromagnetisch immobilisiert, und es erfolgt ein Spülen mit Waschpufferlösung durch elektrokinetische Manipulation: Entfernen des Überstands durch Kontrollieren von Elektrodenpotentialen in solcher Weise, dass Waschpuffer vom Einlassreservoir 373 durch die SP-Kammer zum Abfallauslass 391 geleitet wird; Stoppen des Flusses nach 45 Sekunden und erneutes Suspendieren des Ziel-Kügelchen-Komplexes in Lösung durch Aufheben des Magnetfelds; Inkubieren des Ziel-Kügelchen-Komplexes im Waschpuffer für eine Minute; Wiederholen der obigen Waschschritte für zwei weitere Male.
4. Eluierung der Zielzellen unter Verwendung von Reagenzien DETACHaBEAD^TM von Dynal: elektromagnetisches Immobilisieren der Festhaltekügelchen und Einfüllen der Lösung DETACHaBEAD^TM in die SP-Kammer 380: elektrokinetisches Bewegen des auf einem Antikörper basierenden Reagens von Dynal aus dem Eluierungspufferreservoir 373 durch Manipulieren durch Elektrodenpotentialen in solcher Weise, dass vermieden wird, dass der Eluierungspuffer durch die Kammer laufen kann, oder alternativ kann eine Einfüllkreuzungsstelle (in der 22 nicht dargestellt) dazu verwendet werden, einen Eluierungspufferpfropfen in die SP-Kammer zu füllen; erneutes Suspendieren der Kügelchen durch Aufheben des Magnetfelds; Inkubieren der im Eluierungspuffer suspendierten Kügelchen für zwei Minuten, um eine endliche Desorptionskinetik zu ermöglichen; nach Abschluss der Zieleluierung werden Kügelchen elektromagnetisch immobilisiert, isolierte Zielzellen können zur weiteren Behandlung und Analyse elektrokinetisch aus der SPE-Kammer in den Elektrophorese-Hauptkanal transportiert werden.

Zelltrennvorgänge unter Verwendung von Mikrofluidvorrichtungen und -verfahren sorgen für eine kostengünstige Alternative zu herkömmlichen Strömungszytometrietechniken. Außerdem ermöglichen es Mikrofluidvorgehensweisen, wenn sie mit einer biomagnetischen Trenntechnologie kombiniert werden, eine Anreicherung und Erkennung von Zellen, die zu erhöhter Empfindlichkeit und verringertem Hintergrundrauschen führen. Auf Mikrofluiden basierende, magnetische Iso lierverfahren unterziehen die Zielsubstanzen einer minimalen Belastung, und sie können demgemäß Zellen intakt und lebensfähig halten, bereit zur direkten Verwendung bei Umkehrtranskription in Verbindung mit Polymerasekettenreaktionsverstärkung (RT-PCR).
Verfahren auf Mikrofluidbasis verwenden keine Phenolextraktionsvorgänge, Ethanolausfällvorgänge oder Zentrifugiervorgänge, und sie verwenden wenig toxische Reagenzien. Trennvorgänge werden ohne Verwendung teurer Anlagen ausgeführt, und sie sind stark skalierbar.
Beispiel 5
Werkzeuge zum kosteneffektiven Krankheitsmanagement
Wenn Gentherapien vom Labor zum Krankenbett übergehen, werden Therapien und Diagnosen enger gekoppelt. Demgemäß wird das Überwachen der Wirksamkeit von Pharmazeutika auf DNA-Basis unter Verwendung biologischer Instrumente am Krankenbett entscheidend dafür, den Erfolg dieser Behandlungen zu gewährleisten. Genauer gesagt, ist eine Vorrichtung auf Mikrofluidbasis zum Integrieren der Zellensammlungs- und Isolierprozesse mit aufstrebenden Molekularverfahren zur DNA-Verstärkung und -Erfassung vielversprechend, um diesen Markterfordernissen zu genügen. So ist es durch Kombinieren von Verfahren, wie sie in dieser Anmeldung beschrieben sind (insbesondere die Beispiele 3 und 4), möglich, in einem Instrument über die Fähigkeit einer kosteneffizienten Krankheitsprognose und eine Überwachung zu verfügen, um den Arzt dabei zu unterstützen, die Geeignetheit einer vorgegebenen Gentherapie zu bewerten. Derartige effektive Krankheitsmanagementstrategien haben, zusätzlich zu anderen pharmakogenetischen Vorgehensweisen, das Potential einer weiten Verbreitung, da die Postgenomära schnell näher kommt.
Um diese Ausführungsform der Erfindung zu veranschaulichen, wird ein System zum Verwalten von blutbasierten Erkrankungen angegeben.
Als Hintergrund sei angegeben, dass ererbte Blutstörungen die üblichsten Gendefekte sind, die Menschen beeinträchtigen. Die World Health Organization schätzt, dass ungefähr 5 % der Weltbevölkerung Träger verschiedener Typen von Hämoglobinstörungen sind und dass jedes Jahr ungefähr 300.000 Fälle diagnostiziert werden. Sichelzellenanämie und β-Thallasämie sind die zwei üblichs ten Hämoglobinerkrankungen, die unter Verwendung von Gentherapien behandelt werden können.
Von speziellem Interesse bei der Behandlung von Hämoglobinerkrankungen sowie bei der Überwachung des Fortschritts ihrer Behandlung sind die Sammlung und Isolierung hämatopoetischer Stammzellen. Unter Verwendung der in der 23 dargestellten Mikrofluidvorrichtung ist in Kombination mit der Verwendung von Dynal-Reagenzien zur Selektion menschlicher hämatopoetischer Progenitorzellen, wie es beim Beispiel 4 beschrieben ist, ein schnelles und einfach verwendbares Verfahren möglich, um die gewünschte Stammzellenisolierung zu bewerkstelligen. Beispielsweise isoliert 1 ml an Dynabeads M-450 CD34 ungefähr 8 × 10⁷ Zellen. 100 μl (eine Einheit) von DETACHaBEAD CD 34 wird dazu verwendet, 4 × 10⁷ (100 μl) Dynabeads M-450 CD 34 loszulösen. Durch dieses Selektionssystem für Progenitorzellen isolierte Zellen sind rein (95 % aus Knochenmark, 90 % aus Kapillar- und Aderblut) und phänotypisch unverändert. Mit derselben Vorrichtung ist eine DNA-Analyse, einschließlich einer Genexpressionsüberwachung, unter Verwendung molekulargenetischer Verfahren möglich, wenn einmal die Stammzellen isoliert und analysiert sind. So sollten sich bioanalytische Vorrichtungen und Verfahren auf Mikrofluidbasis, wie bei dieser Ausführungsform der Erfindung beschrieben, als wertvolle Werkzeuge zum Krankheitsmanagement an dieser aufstrebenden Schnittstelle zwischen der Molekularmedizin und der Diagnose erweisen.
Beispiel 6
Festphasenisolation und Anreicherung
Eine Festphasenextraktion (SP) eines speziellen Ziels aus einer heterogenen Mischung erfolgt bei der folgenden Ausführungsform der Erfindung unter Verwendung der selektiven Oberflächeneigenschaften zielspezifischer Mikropartikel und mechanischer Maßnahmen zum Zurückhalten der Kügelchen innerhalb der SP-Kammer. Obwohl biomagnetische Trennverfahren derzeit attraktiv sind, da kommerzielle Reagenzien für eine große Anzahl von Bioforschungsanwendungen leicht verfügbar sind, sind andere Vorgehensweisen auf Basis unmagnetischer Mikrofluide möglich, um vergleichbare Trennungen zu erzielen. Bei ähnlichen Ausführungsformen wie den obigen erfolgt eine Festphasenanreicherung auf Mikrofluidformat. Kügelchen mit zielspezifischen Bindungsobjekten können unter Verwendung mechanischer Maßnahmen, einschließlich Filtriermembranen oder Maschensieben, in der Anreicherungskammer zurückgehalten werden. Außerdem kann ein Agarosegel (vor dem Versuch aus dem Abfallreservoir 391) am Auslass der Anreicherungskammer 380 in den Kanal 384 injiziert werden, um zu verhindern, dass die Kügelchen entweichen, wobei jedoch immer noch die Wasch- und Eluierungspuffer durch die stark porösen Medien laufen können. So kann jede der beim Beispiel 2 zur Zielisolierung und -reinigung aus komplexen Mischungen beschriebenen Ausführungsformen, zumindest dem Prinzip nach, realisiert werden, ohne dass die Verwendung von Magnetfeldern erforderlich wäre.
Aus den obigen Ergebnissen und der Erörterung ist es ersichtlich, dass zweckdienliche, integrierte Elektrophoresevorrichtungen mit Mikrokanal offenbart sind, die für deutliche Vorteile gegenüber aktuell verfügbaren CE- und MCE-Vorrichtungen sorgen. Da die betrachteten Vorrichtungen Mikrokanäle als Elektrophoreseströmungspfade enthalten, sorgen sie für alle Vorteile von CE- und MCE-Vorrichtungen, einschließlich kurzer Laufzeiten, der Fähigkeit, kleine Probenvolumina zu verwenden, hoher Trenneffizienz und dergleichen. Da die betrachteten integrierten Vorrichtungen über einen Anreicherungskanal verfügen, können sie zur Analyse komplexer Probenmatrizen verwendet werden, die Analytkonzentrationen im Bereich von Femtomol bis Nanomol enthalten. Jedoch treten wegen der speziellen Positionsbeziehung des Anreicherungskanals und des Elektrophorese-Hauptströmungspfads die Mängel von Onlinekonfigurationen, wie eine Bandverbreiterung und dergleichen, bei den betrachteten Vorrichtungen nicht auf. Da die betrachteten Vorrichtungen integriert und kompakt sind, sind sie leicht handhabbar, und sie können leicht mit automatisierten Vorrichtungen verwendet werden. Schließlich können die Vorrichtungen, durch geeignete Auswahl der Materialien, als wegwerfbar hergestellt werden. Wegen ihrer Vielseitigkeit und der Empfindlichkeit, die sie zeigen, sind die betrachteten Vorrichtungen zur Verwendung bei einer großen Anzahl von Anwendungen geeignet, einschließlich klinischen Elektrophoreseassays.
Nach dem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, ist es für den Fachmann ersichtlich, dass an ihr viele Änderungen und Modifizierungen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen.

Claims

Mikrofluidische Vorrichtung (30, 50, 70, 90, 100) zum Analysieren einer einen Analytanteil und einen Abfallanteil aufweisenden Probe, mit einem eine Oberfläche aufweisenden Substrat sowie ferner: mindestens einem Mikrokanal, einem Einlass in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal zur Zuführung der Probe an diesen, einer Anreicherungseinrichtung (10, 34, 62, 72, 92, 93, 102) in dem mindestens einen Mikrokanal zum Trennen mindestens eines Teils des Analytanteils von dem Abfallanteil, einem Erfassungsbereich (37, 65, 91, 99, 113), der in dem mindestens einen Mikrokanal stromabwärts von der Anreicherungseinrichtung angeordnet und für einen Detektor zum Analysieren eines charakteristischen Merkmals der Probe zugänglich ist, einem Abfallauslass (6) in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal, einer Transporteinrichtung zum Bewegen der Probe von dem Einlass zu der Anreicherungseinrichtung und des Abfallanteils von der Anreicherungseinrichtung zu dem Abfallauslass, und mindestens einer ersten und einer in Abstand davon angeordneten zweiten Elektrode (35, 36; 58, 59, 60, 61; 76, 77, 79, 81; 87, 88, 89, 90; 108, 109, 110, 111) zur Herstellung von elektrischem Kontakt mit einer in der mikrofluidischen Vorrichtung vorhandenen Probe, um den Analytanteil mittels Elektrophorese von der Anreicherungseinrichtung zu dem Erfassungsbereich zu bewegen, dadurch gekennzeichnet, dass der Abfallauslass stromaufwärts von dem Erfassungsbereich angeordnet ist und die Anreicherungseinrichtung ein Material aufweist, das ein selektives Zurückhalten des Analytanteils der Probe gestattet, so dass der besagte Teil des Analytanteils, nicht jedoch der Abfallanteil, zu dem Erfassungsbereich bewegbar ist, um eine genaue Analyse des Teils des Analytanteils in dem Erfassungsteil durch den Detektor zu ermöglichen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Anreicherungseinrichtung ein chromatographisches Material enthält.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Anreicherungseinrichtung ein elektrophoretisches Gelmedium (92, 93) enthält.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Substrat mit einem zusätzlichen Einlass (9) in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal stromaufwärts von der Anreicherungseinrichtung sowie mit einer Einrichtung zum Einleiten einer Lösung in den zusätzlichen Einlass versehen ist, um die Anreicherungseinrichtung zu kontaktieren und den besagten Teil des Analytanteils von der Anreicherungseinrichtung zu trennen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Abfallauslass (6) in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal an der Anreicherungseinrichtung steht, so dass der Abfallanteil den mindestens einen Mikrokanal an der Anreicherungseinrichtung verlässt.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Mikrokanal einen von dem Einlass zu dem Abfallauslass führenden ersten Mikrokanalabschnitt sowie einen zweiten Mikrokanalabschnitt (95) aufweist, der den ersten Mikrokanalabschnitt an einer Kreuzung trifft und zu dem Erfassungsbereich (91) verläuft, wobei sich die Anreicherungseinrichtung (92, 93) mindestens teilweise an der Kreuzung befindet.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Abfallauslass zwischen der Anreicherungseinrichtung und dem Erfassungsbereich in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal steht.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, mit einem in dem mindestens einen Mikrokanal in der Nähe des Erfassungsbereichs angeordneten Elektrophoresemedium, wobei der Abfallauslass zwischen der Anreicherungseinrichtung und dem Elektrophoresemedium in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal steht.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Transporteinrichtung eine dritte und eine in Abstand davon angeordnete vierte Elektrode (58, 59; 76, 77; 89, 90; 110, 111) aufweist, die in elektrischem Kontakt mit der in der mikrofluidischen Vorrichtung vorhandenen Probe steht.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Mikrokanal einen ersten Mikrokanalabschnitt (55, 73, 105) stromabwärts von der Anreicherungseinrichtung (62, 72, 102) sowie einen zweiten Mikrokanalabschnitt (52, 71, 112) aufweist, der den ersten Mikrokanalabschnitt an einer Kreuzung (51, 82, 114) trifft und zu dem Erfassungsbereich (65, 99, 113) verläuft, wobei zu der mindestens einen und in Abstand davon angeordneten zweiten Elektrode eine erste und eine von dieser in Abstand angeordnete zweite Elektrode (60, 61; 79, 81; 108, 109) gehören, um den besagten Teil des Analytanteils von der Anreicherungseinrichtung durch den ersten Mikrokanalabschnitt zu der Kreuzung zu bewegen, sowie eine dritte und eine in Abstand davon angeordnete vierte Elektrode (58, 59; 76, 77; 110, 111), um den besagten Teil des Analytanteils von der Kreuzung durch den zweiten Mikrokanalabschnitt zu dem Erfassungsbereich zu bewegen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Substrat mit einem zusätzlichen Einlass (231) in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal versehen ist und der mindestens eine Mikrokanal einen von dem Einlass (233) zu der Anreicherungseinrichtung (230) führenden ersten Mikrokanalabschnitt (234) aufweist, und wobei von dem zusätzlichen Einlass ein den ersten Mikrokanalabschnitt kreuzender zweiter Mikrokanalabschnitt (235) ausgeht, so dass sich ein von der Probe verschiedenes Strömungsmittel über den zusätzlichen Einlass dem mindestens einen Mikrokanal zuführen lässt.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Substrat mit mehreren zusätzlichen Einlässen (215, 217) in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal versehen ist, wobei der mindestens eine Mikrokanal einen von dem Einlass (233) zu der Anreicherungseinrichtung (210) verlaufenden ersten Mikrokanalabschnitt (220) aufweist, und wobei von den zusätzlichen Einlässen mehrere zusätzliche den ersten Mikrokanalabschnitt kreuzende Mikrokanalabschnitte (216, 218) ausgehen, so dass sich mehrere von der Probe verschiedene Strömungsmittel über die zusätzlichen Einlässe dem mindestens einen Mikrokanal zuführen lassen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der mindestens eine Mikrokanal mit einem zusätzlichen Erfassungsbereich (243, 245, 247, 249, 253, 255, 257, 259, 278, 286) versehen ist und der Abfallauslass (240) stromaufwärts von dem zusätzlichen Erfassungsbereich in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal steht.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei der Analytanteil mehrere verschiedene interessierende Fraktionen enthält und die Vorrichtung eine zusätzliche Anreicherungseinrichtung (244, 246, 248, 250, 254, 256, 258, 260) in dem mindestens einen Mikrokanal sowohl an dem erstgenannten als auch den zusätzlichen Erfassungsbereichen aufweist, und wobei jede zusätzliche Anreicherungseinrichtung eine andere interessierende Fraktion in dem Analytanteil anreichert.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 14, wobei der Analytanteil mehrere unterschiedliche Nukleinsäurefragmente enthält und wobei jede der zusätzlichen Anreicherungseinrichtungen eine Molekularsonde zum Aufnehmen jeweils einer der unterschiedlichen Nukleinsäurefragmente aufweist.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei der erstgenannte und die zusätzlichen Erfassungsbereiche (243, 245, 247, 249) längs des mindestens einen Mikrokanals hintereinander angeordnet sind.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei der erstgenannte und die zusätzlichen Erfassungsbereiche (253, 255, 257, 259, 278, 286) längs des mindestens einen Mikrokanals parallel angeordnet sind.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei der mindestens eine Mikrokanal einen verzweigten Mikrokanalabschnitt mit mehreren Mikrokanalzweigen (238) aufweist und in jedem der Mikrokanalzweige einer der erstgenannten und zusätzlichen Erfassungsbereiche (253, 255, 257, 259) vorgesehen ist.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei der mindestens eine Mikrokanal einen ersten Mikrokanalabschnitt (236) und mehrere zweite Mikrokanalabschnitte (270) aufweist, die den ersten Mikrokanalabschnitt jeweils an längs des ersten Mikrokanalabschnitts in Abstand voneinander angeordneten Kreuzungen (272) treffen, wobei in jedem der mehreren zweiten Mikrokanalabschnitte einer der erstgenannten und zusätzlichen Erfassungsbereiche (278) vorgesehen ist.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei zu der ersten und der in Abstand davon angeordneten zweiten Elektrode eine erste und eine in Abstand davon angeordnete zweite Elektrode für jeden der zweiten Mikrokanal abschnitte gehören, um den besagten Teil des Analytanteils durch den erstgenannten bzw. die zusätzlichen Erfassungsbereiche zu bewegen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1 zum Analysieren einer einen ersten und einen zweiten Analytanteil aufweisenden Probe, wobei der mindestens eine Mikrokanal einen verzweigten Mikrokanalabschnitt (238) mit einem ersten und einem zweiten Mikrokanalzweig aufweist, der Einlass (231) stromaufwärts von dem verzweigten Mikrokanalabschnitt in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal steht, die Anreicherungseinrichtung in dem ersten Mikrokanalzweig angeordnet ist, um mindestens einen Teil des ersten Analytanteils von dem zweiten Analytanteil zu trennen, der Erfassungsbereich Teil des ersten Mikrokanalzweigs ist und der Abfallauslass stromaufwärts von dem Erfassungsbereich in Fluidverbindung mit dem ersten Mikrokanalzweig steht, wobei die erste und die in Abstand davon angeordnete zweite Elektrode den besagten Teil des ersten Analytanteils von der Anreicherungseinrichtung zu dem Erfassungsbereich bewegt, wobei in dem zweiten Mikrokanalzweig eine zusätzliche Erfassungseinrichtung vorgesehen ist, um mindestens einen Teil des zweiten Analytanteils von dem ersten Analytanteil zu trennen, wobei der zweite Mikrokanalzweig stromaufwärts von der zusätzlichen Anreicherungseinrichtung einen zusätzlichen Erfassungsbereich aufweist, das Substrat stromaufwärts von dem zusätzlichen Erfassungsbereich einen zusätzlichen Auslass in Fluidverbindung mit dem zweiten Mikrokanalzweig aufweist, und wobei mindestens eine dritte Elektrode vorhanden ist, um den besagten Teil des zweiten Analytanteils der zusätzlichen Anreicherungseinrichtung zu dem zusätzlichen Erfassungsbereich zu bewegen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei sowohl der erste als auch der zweite Mikrokanalzweig ein erstes Mikrokanalsegment stromabwärts von der jeweiligen Anreicherungseinrichtung und ein zweites Mikrokanalsegment aufweist, das das erste Mikrokanalsegment an einer Kreuzung trifft und zu dem betreffenden Erfassungsbereich verläuft, wobei zu der ersten und der von ihr getrennten zweiten Elektrode eine erste und eine von dieser getrennte zweite Elektrode gehören, um den besagten Teil des ersten Analytanteils von der erstgenannten Anreicherungseinrichtung durch das erste Mikrokanalsegment zu der Kreuzung zu bewegen, sowie mindestens eine erste zusätzliche Elektrode, um den besagten Teil des ersten Analytanteils von der Kreuzung durch das zweite Segment zu dem erstgenannten Erfassungsbereich zu bewegen, wobei zu der dritten Elektrode mindestens eine dritte Elektrode gehört, um den besag ten Teil des zweiten Analytanteils von der zusätzlichen Anreicherungseinrichtung durch das erste Mikrokanalsegment zu der Kreuzung zu bewegen, sowie mindestens eine zweite zusätzliche Elektrode, um den besagten Teil des zweiten Analytanteils von der Kreuzung durch das zweite Segment zu dem zusätzlichen Erfassungsbereich zu bewegen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Anreicherungseinrichtung mit Affinitätsbindung arbeitende Aufnahme- und Freigabemoleküle enthält, um mindestens einen Teil des Analytanteils aufzunehmen und dadurch mindestens einen Teil des Analytanteils von dem Abfallanteil zu trennen.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei die mit Affinitätsbindung arbeitenden Aufnahme- und Freigabemoleküle an mehrere ein Magnetfeld erzeugende Körper gebunden sind.
Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 24 mit einem Magnet zum magnetischen Ankoppeln an mindestens einige der ein Magnetfeld erzeugenden Körper.
Verfahren zum Analysieren einer einen ersten Analytanteil und einen zweiten Abfallanteil aufweisenden Substanz unter Verwendung eines eine Oberfläche und mindestens einen Mikrokanal aufweisenden Substrats, wobei der Mikrokanal mit einem Anreicherungsbereich (10, 34, 62, 72, 92, 93, 102) und einem stromabwärts davon gelegenen Erfassungsbereich (37, 65, 91, 99, 113) versehen ist, wobei die Substanz über einen mit dem Mikrokanal in Fluidverbindung stehenden Einlass in den Mikrokanal eingeleitet wird, in dem Anreicherungsbereich mindestens ein Teil des ersten Anteils von dem zweiten Anteil getrennt wird, wobei der zweite Anteil den Erfassungsbereich nicht durchläuft, der zweite Anteil der Substanz über einen mit dem Anreicherungsbereich in Fluidverbindung stehenden Abfallauslass abgegeben wird, und der besagte Teil des ersten Anteils durch Elektrophorese zu dem Erfassungsbereich transportiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass (a) der Abfallauslass stromaufwärts von dem Erfassungsbereich angeordnet wird, (b) der Anreicherungsbereich ein Anreicherungsmedium mit einem Material enthält, das ein selektives Zurückhalten des ersten Anteils der Substanz gestattet, und (c) zum Transport durch Elektrophorese der von dem Anreicherungsmedium zurückgehaltene Teil des ersten Anteils zu dem Erfassungsbereich transportiert wird, wobei der besagte Teil des ersten Anteils, nicht aber der zweite Anteil, zu dem Erfassungsbereich bewegt wird, um in dem Erfassungsbereich eine genaue Analyse des besagten Teils des ersten Anteils durch den Detektor zu gestatten.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Substanz aus Zellen besteht, die unter Bildung eines lysierten Gemisches mit einem Nukleinsäureanteil und einem Abfallanteil lysiert werden, wobei zum Trennen in dem Anreicherungsbereich mindestens ein Teil des Nukleinsäureanteils von dem Abfallanteil des lysierten Gemisches getrennt wird, wobei der Abfallanteil des lysierten Gemisches den Erfassungsbereich nicht durchläuft, und wobei zum Transport der besagte Teil des Nukleinsäureanteils zu dem Erfassungsbereich transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei zum Trennen das lysierte Gemisch in dem Anreicherungsbereich mit mehreren ein Magnetfeldes erzeugenden Körpern in Kontakt gebracht wird, deren jeder eine Nukleinsäure-Aufnahmemenge aufweist, um mindestens einen Teil des Nukleinsäureanteils aufzunehmen und dadurch mindestens einen Teil des Nukleinsäureanteils von dem Abfallanteil zu trennen, woraufhin die Körper von dem Abfallanteil des lysierten Gemisches getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei der besagte Teil des Nukleinsäureanteils von den Körpern eluiert wird und wobei zum Transportieren der besagte Teil des Nukleinsäureanteils elektrokinetisch transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei zum Lysieren eine Lysierlösung und die Zellen elektrokinetisch gemischt werden, wobei während des Mischvorgangs die Körper in dem Anreicherungsbereich magnetisch zurückgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei der besagte Teil des Nukleinsäureanteils vor dem Transportieren von den Körpern getrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Körper während des Transports in dem Anreicherungsbereich magnetisch zurückgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Körper in dem Anreicherungsbereich magnetisch zurückgehalten werden, während sie von dem Abfallanteil des lysierten Gemisches getrennt werden.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei zum Lysieren die Zellen mit einer Lysierlösung kontaktiert werden.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei zum Kontaktieren ein elektrisches Potential an den mindestens einen Mikrokanal angelegt wird, um die Lysierlösung elektrokinetisch durch den mindestens einen Mikrokanal in Kontakt mit den Zellen zu bewegen.
Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Lysierlösung und die Zellen elektrokinetisch gemischt werden, um die Lysierung der Zellen zu verstärken.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei der besagte Teil des Nukleinsäureanteils mittels Elektrophorese kalibriert wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei an dem besagten Teil des Nukleinsäureanteils eine PCR-Analyse durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Substanz eine heterogene Suspension von Zellen ist und wobei der erste und der zweite Teil ein erster und ein zweiter Zelltyp der heterogenen Zellensuspension sind.
Verfahren nach Anspruch 39, wobei zum Trennen die Zellensuspension in dem Anreicherungsbereich mit mehreren ein Magnetfeld erzeugenden Körpern in Kontakt gebracht wird, die jeweils eine Bindungsmenge aufweisen, um mindestens einen Teil der Zellen des ersten Typs aufzunehmen und die Körper von den Zellen des zweiten Typs zu trennen.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der Teil der Zellen des ersten Typs von den Körpern eluiert wird und dieser Teil der Zellen des ersten Typs elektrokinetisch transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Substanz ein Gemisch, der erste Anteil ein Nukleinsäureanteil des Gemisches und der zweite Anteil ein Abfallanteil des Gemisches ist, und wobei zum Trennen das Gemisch in dem Anreicherungsbereich mit mehreren eine Aufnahme und Freigabe durch Affinitätsbindung bewirkenden Molekülen in Kontakt gebracht wird, um mindestens einen Teil des Nukleinsäureanteils aufzunehmen und dadurch diesen Teil des Nukleinsäureanteils von dem Abfallanteil zu trennen, wobei der Abfallanteil den Erfassungsbereich nicht durchläuft.
Verfahren nach Anspruch 42, wobei die eine Aufnahme und Freigabe mittels Affinitätsbindung bewirkenden Moleküle an mindestens einen festen Träger gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei der mindestens eine feste Träger mehrere magnetische Körper aufweist.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei der mindestens eine feste Träger mehrere paramagnetische Körper aufweist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Substanz eine heterogene Suspension ist und der erste und der zweite Anteil erste und zweite biologische Mengen in der heterogenen Suspension sind, und wobei zum Trennen die Suspension in dem Anreicherungsbereich mit mehreren eine Aufnahme und Freigabe mittels Affinitätsbindung bewirkenden Molekülen in Kontakt gebracht wird, um mindestens einen Teil der ersten biologischen Mengen aufzunehmen, wobei die zweiten biologischen Mengen den Erfassungsbereich nicht durchlaufen.
Verfahren nach Anspruch 46, wobei die mehreren, eine Aufnahme und Freigabe mittels Affinitätsbindung bewirkenden Moleküle an mindestens einen festen Träger gebunden werden.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei der mindestens eine feste Träger mehrere magnetische Körper aufweist.
Verfahren nach Anspruch 47, wobei der mindestens eine feste Träger mehrere paramagnetische Körper aufweist.