DE69736814T2

DE69736814T2 - Adipogenische differenzierung von humanen mesenchymalen stammzellen

Info

Publication number: DE69736814T2
Application number: DE69736814T
Authority: DE
Inventors: F. Mark Severna Park PITTENGER
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-07-21
Publication date: 2007-08-16
Anticipated expiration: 2017-07-22
Also published as: US6709864B1; EP0954565A1; CA2262014A1; DK0954565T3; EP0954565B1; ATE342349T1; US6322784B1; WO1998004682A1; JP2001523084A; US5827740A; AU3729097A; PT954565E; DE69736814D1; EP1659172A1; EP0954565A4; CA2262014C; ES2274547T3

Description

Bei der Anmeldung handelt es sich um eine Continuation-in-part-Anmeldung von US-SN 08/700,753, Anmeldetag 30. Juli 1996 (anhängig).
Die Erfindung betrifft Adipozyten und insbesondere die Herstellung von Adipozyten aus humanen mesenchymalen Stammzellen.
Adipöses Gewebe stellt eine Energiespeicherreserve für den Körper in Form von Triglyceriden dar. Dieses Gewebe kann freie Fettsäuren freisetzen, wenn die Kalorienaufnahme unter den Stoffwechselbedarf sinkt. In Reaktion auf eine erhöhte Nahrungsaufnahme erhöht der Körper normalerweise automatisch den Energieverbrauch durch Aktivität, um ein Energiegleichgewicht aufrechtzuerhalten. Energie kann auch als Wärme freigesetzt werden. Adipöses Gewebe ist eng an der Aufrechterhaltung der Körpertemperatur über braunes adipöses Gewebe und der Energiespeicherung über weißes adipöses Gewebe beteiligt. Es bestehen normale Wege der Energieregulierung, die ein Gleichgewicht zwischen Nahrungsaufnahme und Stoffwechselaktivität, die weitgehend über den Hypothalamus vermittelt wird, herstellen. Ferner hat es nunmehr den Anschein, dass die Adipozyten eine aktive Rolle bei diesem Vorgang spielen und vermutlich Moleküle freisetzen, die der Rückkopplung und Regelung des Triglycerid-Stoffwechsels dienen.
Die beiden Typen von adipösem Gewebe, braunes und weißes Gewebe, spielen im Körper recht unterschiedliche Rollen. Weißes adipöses Gewebe dient zur Lagerung von überschüssiger Kalorienaufnahme, während braunes adipöses Gewebes sich eines besonderen Systems bedient, um überflüssige Kalorien abzuführen und sie zur Erzeugung von Körperwärme zu verwenden. Die Wärme wird in den Mitochondrien von braunem adipösem Gewebe gebildet, wo eine Substratoxidation zur Erzeugung eines Wasserstoffionengradienten verwendet wird, der dann in regulierter Weise unter Erzeugung von Wärme anstelle von ATP zusammenbricht. Es wurde gezeigt, dass transgene Tiere, bei denen braunes adipöses Gewebe fehlt, einen wirksamen Stoffwechsel aufrechterhalten, fettleibig sind und die übermäßige Nahrungsaufnahme fortsetzen (Lowell et al., 1993). Weitere Studien an Nagern haben ferner eine Verbindung zwischen Fettleibigkeit, anhaltender übermäßiger Nahrungsaufnahme und Kälteempfindlichkeit gezeigt, was für eine Verbindung zum sympathischen Nervensystem spricht (Friedman und Leibel, 1992).
Ein Ungleichgewicht im Energiestoffwechsel im Körper führt zu mehreren Krankheitszuständen, insbesondere zu Fettleibigkeit und zu durch Fettleibigkeit herbeigeführtem Diabetes. Diese Krankheiten lassen sich als Dysfunktionen von Energiespeichergeweben beschreiben. Eine Mutation bei Mäusen, die zu Fettleibigkeit führt, wurde im Jahre 1950 identifiziert (Ingalls et al., 1950), und das entsprechende Gen wurde kürzlich durch Positionsklonierung identifiziert. Das Produkt des ob-Gens ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 16 000 mit der Bezeichnung Leptin oder OB-Protein. Leptin wird nur von Adipozyten gebildet und stellt ein Hormon dar, das den Hypothalamus reguliert. Eine Mutation wurde in der of-Maus identifiziert, die zu einer vorzeitigen Beendigung der mRNA-Translation führt, so dass kein funktionelles Leptin-Protein erzeugt wird (Zhang et al., 1994). Über die Rolle von Leptin bei der Regulierung des Lipidstoffwechsels wird intensiv geforscht. Zu neuerdings veröffentlichten Untersuchungen gehören Studien der strangaufwärtigen Promotorelemente, die sich neben dem ob-Gen finden, von denen gezeigt worden ist, dass sie C/EBP (oder CCAAT/Enhancer-Bindungsprotein) binden (Yeh et al., 1995, und Hwang et al., 1996). Stünde ein experimentelles Modellsystem für eine in vitro-Adipogenese von humanen Zellen bereit, würde dies den Weg für Entdeckungen in diesem Bereich ebnen.
Kürzlich wurde berichtet, dass Leptin möglicherweise als Hormon dient, das die Fruchtbarkeit reguliert, und möglicherweise das Verbindungsglied zwischen angemessenem Körpergewicht und reproduktiver Physiologie darstellt (Chehab et al., 1996). Sowohl untergewichtige als auch übergewichtige Frauen haben Schwierigkeiten bei der Empfängnis. Dies steht vermutlich im Zusammenhang mit einem hormonellen Ungleichgewicht im Körper dieser Personen. Ein Zusammenhang zwischen Körpergewicht, Fruchtbarkeit und dem durch Adipozyten erzeugten Leptin wird angenommen und derzeit an Mäusen getestet. Wenn fettleibige Mäuse, die normalerweise ohne Transplantation der Ovarien auf Ersatzweibchen keine Nachkommen hervorbringen, eine Injektion von Leptin erhielten, sank ihr Körpergewicht drastisch ab und sie waren dazu in der Lage, eigene Junge zur Welt zu bringen (Chehab et al., 1996).
Von einer Vielzahl von Zelltypen wurde gezeigt, dass sie unter spezifischen Züchtungsbedingungen lipidhaltige Vesikel erzeugen. Beispielsweise können Mäuse-3T3-Ll-Zellen, die sich von NIH-3T3, einer immortalisierten Mäusezelllinie, ableiten, als eine fibroblastische Zelle gezüchtet und in Kultur gehalten werden. Jedoch unterliegen die Zellen nach Einwirkung von Dexamethason und Methylisobutylxanthin einer Differenzierung, die zur Erzeugung von intrazellulären, lipidhaltigen Vakuolen führt (Spiegelman und Green, 1981). Von Ratten-Knochenmarkstromazellen wurde gezeigt, dass sie sowohl einer osteogenen als auch adipogenen Differenzierung unterliegen, wenn sie mit fötalem Kälberserum und Dexamethason gezüchtet werden, dass aber der vorherrschende Zelltyp je nach den Bedingungen variiert (Beresford et al., 1992). Speziell wenn das Steroidanaloge Dexamethason während der gesamten Züchtungszeit vorhanden war, wurde die Osteogenese bevorzugt; wenn aber Dexamethason nur während der sekundären Kultur vorhanden war, herrschte der adipogenetische Weg vor, wie sich durch spezifische Familienmarker (lineage marker) und durch zytologische Beobachtung zeigt. Von der Maus abgeleitete CH3-10T1/2-Zellen stellen eine multipotentielle Zelllinie dar, die bei Behandlung mit 5-Azacytidin einer terminalen Differenzierung zu Adipozyten, Myozyten und Chondrozyten unterliegt. Das 5-Azacytidin verursacht eine Hemmung der DNA-Methylierung und somit die Aktivierung einiger weniger Gene, die für die Beteiligung an diesen Familien (lineages) verantwortlich sind (Konieczny und Emerson, 1984).
Erfindungsgemäß werden eine Zusammensetzung nach Anspruch 1 und ein Verfahren nach Anspruch 4 bereitgestellt, um humane mesenchymale Stammzellen zu einer bevorzugten Differenzierung zur adipogenen Familie, d. h. zur Differenzierung zu Adipozyten, zu induzieren.
Die Anmelderin hat festgestellt, dass mesenchymale Stammzellen und insbesondere humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) in Richtung auf eine Differenzierung zu Adipozyten gebracht werden können, indem man die humanen mesenchymalen Stammzellen mit (i) einem Glucocorticoid und (ii) einer Verbindung, die die intrazellulären cAMP-Spiegel entweder durch Hochregulierung der cAMP-Bildung oder durch Hemmung des Abbaus von cAMP erhöht; insbesondere mit einer Verbindung, die eine oder mehrere Verbindungen, die cAMP abbauen, hemmt, behandelt.
Erfindungsgemäß werden die humanen mesenchymalen Stammzellen mit Dexamethason und mit Methylbutylxanthin, die die Aktivität einer Verbindung, die CAMP abbaut, hemmen, behandelt, insbesondere mit einem Phosphodiesterase-Inhibitor. Die Zellen werden anschließend in Medien, die Insulin und fötales Kälberserum enthalten, gezüchtet.
Humane mesenchymale Stammzellen sowie deren Isolierung und Expansion werden im US-Patent 5 486 359 beschrieben. Wie aus dem Stand der Technik bekannt ist, sind humane mesenchymale Stammzellen dazu befähigt, zwei oder mehr verschiedene Typen (Familien oder Linien) von mesenchymalen Zellen oder Geweben und insbesondere von Bindegewebe zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von Adipozyten aus primären humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) in einer vorhersagbaren und reproduzierbaren Weise bereit. Die Erfindung stellt insofern etwas Besonderes dar, als sie humane Zellen in primären und passagierten Kulturen anstelle von transformierten oder immortalisierten Zelllinien, die dazu vorgesehen sind, in den adipogenen Stoffwechselweg einzutreten, verwendet. hMSCs sind dazu befähigt, sich zu mehrfachen Typen (Familien) einschließlich osteozytischen, chondrozytischen, myozytischen, tendonozytischen und stromogenen Familien, zu entwickeln. Erfindungsgemäß werden ein Verfahren und eine Zusammensetzung bereitgestellt, um hMSCs zur Differenzierung zu Adipozyten zu induzieren. Gemäß einem bevorzugten Aspekt werden erfindungsgemäß hMSCs einer solchen Induktion unterzogen, dass sie im wesentlichen nur einer Differenzierung zu Adipozyten unterliegen, d. h. es liegen im wesentlichen keine Bildung oder Beteiligung von Zellen anderer mesenchymaler Typen (Familien) vor. Das Verfahren kann auch zur Erzeugung von Adipozyten aus MSCs von anderen Spezies, wie Kaninchen, Hund, Ratte und Maus, verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner Verfahren zur Reinigung der Adipozyten mit dem Ziel, eine hochgradig gereinigte Population zu erhalten, bereit.
Das erfindungsgemäße Verfahren für die in vitro-Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, die sich vorwiegend von Knochenmark ableiten, zur adipoblastischen oder adipozytischen Zellen eignet sich für Forscher, die dieses Entwicklungsprogramm in vitro in humanen Zellen untersuchen wollen. Ferner ergibt sich ein besseres Verständnis der Krankheiten des Energiestoffwechsels, einschließlich Fettleibigkeit und mit Fettleibigkeit im Zusammenhanf stehender Diabetes, aus Untersuchungen der Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu Adipozyten. Während man seit langem annimmt, dass eine zelluläre und biochemische Basis für Fettleibigkeit besteht, ergaben sich nur langsam Fortschritte, was auf einen Mangel an Modellsystemen mit biochemischen und molekularen Untersuchungswerkzeugen zurückzuführen ist. Die in letzter Zeit erzielten erheblichen Fortschritte in Bezug auf die molekulare Basis von Adipogenese haben neue Möglichkeiten zum Verständnis dieses Wegs der mesenchymalen Zelldifferenzierung eröffent, obgleich hier ein humanes Modellsystem, wie es vorstehend beschrieben worden ist, fehlt. Das Verfahren soll sich auch zur Isolierung und Herstellung von Adipozyten zur Implantation in einen Patienten eignen, um eine Gewebezunahme im Anschluss an eine Verletzung oder eine kosmetische Operation zu erreichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A-1B zeigen, dass humane MSCs, wenn sie erfindungsgemäß behandelt werden, einer Differenzierung zur adipogenen Familie unterliegen. 1A zeigt hMSCs (4X) bei Züchtung in normalem hMSC-Medium für die gleiche Zeitspanne wie in 1B. Es gibt keine Anzeichen für lipidhaltige Vakuolen und die Zellen halten das Erscheinungsbild von Fibroblasten in hoher Dichte aufrecht. In 1B lässt man hMSCs den konfluenten Zustand erreichen und hält sie dann 10 Tage in normalem Medium, bevor das adipogene Induktionsmedium (mit einem Gehalt an Methylisobutylxanthin und Dexamethason) zugesetzt wird und das Medium 48 Stunden belassen wird. Anschließend wird für weitere 2 Wochen eine Umstellung auf das insulinhaltige Adipozyten-Erhaltungsmedium vorgenommen. Die Lipidvakuolen treten erstmals nach etwa 5-7 Tagen auf, nehmen aber im zeitlichen Verlauf an Größe und Menge zu.
2A zeigt eine ähnliche Kontrollkultur wie 1A in einer höheren Vergrößerung (20X). 2B zeigt eine Kultur von konfluenten hMSCs, die 48 Stunden dem adipogenen Induktionsmedium ausgesetzt und sodann 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gehalten worden sind. Die zahlreichen lipidhaltigen Vakuolen von Adipozyten sind in einem großen Anteil der Zellen ersichtlich.
3 zeigt die Ergebnisse der Züchtung von hMSCs unter verschiedenen Bedingungen, von denen nur eine einen hohen Grad einer adipogenen Differenzierung zeigt. Sämtliche Aufnahmen zeigen eine 10X-Vergrößerung. 3A zeigt eine Kultur von hMSCs, die nur in normalem hMSC-Kulturmedium gehalten worden sind. Die Zellen wachsen mit einer fibroblastischen Morphologie. 3B zeigt eine ähnliche Kultur, die 48 Stunden mit adipogenen Induktionsmedium behandelt und sodann weitere 14 Tage mit adipogenem Erhaltungsmedium gehalten worden ist, wobei das Medium alle 3 Tage ausgetauscht worden ist. Die adipogenen Zellen, möglicherweise ein großer Anteil von 30-35 % der Zellen, sind erkennbar, da sie große, fraktile Lipidvakuolen enthalten. 3C zeigt eine Kultur von hMSCs, die 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gehalten worden sind, aber keiner Behandlung mit Dexamethason/Methylisobutylxanthin unterworfen worden sind. Die Zellen halten ein flaches morphologisches Erscheinungsbild ohne erkennbare Vakuolen aufrecht. 3D zeigt eine Kultur von hMSCs, die mit normalem hMSC-Medium mit einem Gehalt an 1 μM Dexamethason 48 Stunden behandelt und sodann 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gezüchtet worden sind. Die Zellen sind desorganisiert, zeigen aber (wenn überhaupt) sehr wenige Lipidvakuloen. 3E zeigt eine Kultur von hMSCs, die mit normalem hMSC-Medium mit einem Gehalt an 0,5 M Methylisobutylxanthin 48 Stunden behandelt und sodann 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gehalten worden sind. Die Zellen behalten einen flachen fibroblastischen Phänotyp. 3F zeigt eine Kultur von hMSCs, die mit Medium behandelt worden sind, das die Zellen zur Differenzierung entlang eines osteogenen Wegs induziert. Dieses Medium enthält 0,1 μM Dexamethason, 10 mM β-Glycerinphosphat und 50 μM Ascorbinsäure-2-phosphat. Die Anwesenheit von refraktilem, osteoidem Material ist erkennbar, es sind aber keine großen Lipidvakuolen zu sehen.
4A zeigt eine Kultur von hMSCs, die 48 Stunden dem adipogenen Induktionsmedium ausgesetzt worden sind und anschließend 14 Tage in adipogenem Erhaltungsmedium gezüchtet worden sind. In diesem Hellfeldbild sind die großen Lipidvakuolen sichtbar. Die Lipide können ferner unter Verwendung eines fluoreszierenden, lipidlöslichen Farbstoffes, wie Nilrot und durch Betrachtung unter Epifluoreszenzbeleuchtung sichtbar gemacht werden, wie in 4B dargestellt ist. Somit können die adipogenen Zellen auch unter Verwendung von für lebende Zellen geeigneten Farbstoffen und von histologischen Färbungen, die die Lipidvakuolen markieren, identifiziert werden.
5A zeigt hMSCs in Kultur, die nicht mit dem adipogenen Induktionsmedium behandelt wurden, die aber gleichzeitig wie die in 5B und 5C dargestellten adipogenen Kulturen gezüchtet, fixiert und gefärbt wurden.
5B zeigt hMSCs, die 1-mal 48 Stunden mit dem adipogenen Induktionsmedium behandelt und anschließend weitere 3 Wochen im adipogenen Erhaltungsmedium gezüchtet und sodann in neutral gepuffertem Formalin fixiert und mit Ölrot A, einem flüssigen, löslichen Farbstoff, der sich in Fetttröpfchen anreichert, gefärbt worden sind.
5C zeigt eine Schale von hMSCs, die erneut mit frischem adipogenen Induktionsmedium für eine zweite und dritte 48-stündige Periode behandelt worden sind, um mehr hMSCs zur Annahme einer adipogenen Beschaffenheit zu induzieren. Ein großer Anteil von 30-40 % der Zellen wurde durch die drei Induktionsbehandlungen in Adipozyten umgewandelt, wie sich bei Betrachtung 2 Wochen nach der dritten Behandlung feststellen ließ. Die Felder 5A-5C wurden alle mit Ölrot 0 gefärbt.
5D zeigt, dass das Transkriptionsfaktor-CAAT/Enhancer-Bindungsprotein (oder C/EBPα) in hohen Konzentrationen in adipogenen hMSCs exprimiert wird, wie in diesem Western-Blot unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch für die 34 kd-α-Isoform von C/EBP ist, gezeigt wird.
Gemäß 5E ergibt das Fettsäure bindende Protein aP2 hohe Expressionsgrade in den adipogenen hMSCs, wie durch diesen Western-Blot unter Verwendung eines Antikörpers, der für die adipozytenspezifische 14 kd-Form von P2 spezifisch ist, gezeigt wird.
6A zeigt die isolierten adipogenen hMSCs, die an der oberen Oberfläche haften. Die Population besteht zu mehr als 99 % aus adipogenen Zellen, wie durch die Lipidtröpfchen in jeder Zelle gezeigt wird.
6B zeigt die nicht-adipogenen hMSCs, die sich an der unteren Oberfläche des Kolbens abgesetzt haben. Sehr wenige Zellen mit einem Gehalt an Lipidtröpfchen waren an der unteren Oberfläche vorhanden. Diese nicht-adipogenen Zellen konnten mit Trypsin/EDTA behandelt und auf eine weitere Schale ausgestrichen werden. Es konnte gezeigt werden, dass sie ihr adipogenes Potential behalten (Daten nicht aufgeführt), was zeigt, dass sie mesenchymale Stammzellen bleiben, die zur Familienentwicklung (lineage progression) befähigt sind.
7 zeigt ein Beispiel für hMSCs, die in einer stabilen Kollagen-Gelmatrix stabilisiert und anschließend zur Differenzierung zu Adipozyten induziert worden sind. Die Zellen sind mit dem fluoreszierenden Farbstoff Nilrot gefärbt, der sich in den Lipidvakuolen anreichert, die dann durch UV-Beleuchtung sichtbar gemacht werden können. Nur die Lipidabscheidungen in den Zellen sind sichtbar und viele der Adipozyten befinden sich außerhalb der Brennpunktsebene in der dreidimensionalen Matrix.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Wie vorstehend erwähnt, betrifft ein Aspekt der Erfindung eine Zusammensetzung nach Anspruch 1, die eine isolierte, homogene Population von humanen mesenchymalen Stammzellen umfasst, die das Potential zur Differenzierung zu Zellen von mehr als einem mesenchymalen Bindegewebetyp besitzen, und eine Substanz, die die Zellen aus der mesenchymalen Stammzellpopulation zur Differenzierung zur adipogenen Familie induziert, umfasst.
Erfindungsgemäß werden mesenchymale Stammzellen zur Differenzierung zur adipogenen Familie induziert, indem man Dexamethason und Methylisobutylxanthin, eine Verbindung, die den Abbau von cAMP hemmt, insbesondere einen Phosphodiesterase-Inhibitor, verwendet.
Zu bevorzugten Beispielen für die Substanz, die die intrazellulären cAMP-Spiegel erhöht, oder die cAMP-Analoge darstellen, gehören Dibutyryl-cAMP, 8-CPT-cAMP (8-(4)-Chlorphenylthio)-adenosin-3',5'-cyclomonophosphat; 8-Brom-cAMP; Dioctanoyl-cAMP, Forskolin und dergl.
Die Substanz, die den cAMP-Abbau durch Hemmung der Aktivität von Phosphodiesterase hemmt, ist Methylisobutylxanthin. Die Verbindung, die die cAMP-Spiegel erhöht, und Dexamethason werden in Mengen verwendet, die eine Induktion von hMSCs zur Differenzierung zu Adipozyten bewirken. Die cAMP-regulierende Verbindung und Dexamethason können den hMSCs getrennt oder im Gemisch miteinander zugesetzt werden.
Im allgemeinen wird Dexamethason in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 μM und vorzugsweise von etwa 0,5 bis 2 μM zugesetzt. Methylisobutylxanthin, das den Abbau von cAMP hemmt, wird im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 mM und vorzugsweise von etwa 0,2 bis 2 mM verwendet.
Bei Verwendung einer Verbindung, die die cAMP-Bildung hochreguliert, wird diese Verbindung im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 100 μM und vorzugsweise von etwa 0,5 bis 10 μM verwendet.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die vorstehenden Mengen repräsentativ sind und der Schutzumfang der Erfindung dadurch nicht beschränkt wird.
Obgleich es sich bei einer der Verbindungen, die zur Induktion von hMSCs zur Differenzierung zu Adipozyten verwendet wird, um eine Verbindung handelt, die cAMP reguliert (entweder eine Verbindung, von der bekannt ist, dass sie die cAMP-Bildung hochreguliert, oder eine Verbindung, die den Abbau von cAMP verhindert), ist der Schutzumfang der Erfindung nicht auf einen speziellen Wirkungsmechanismus begrenzt. Somit ist aber dann, wenn eine der Verbindungen, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, einen Phosphodiesterase-Inhibitor darstellt, von dem bekannt ist, dass er den Abbau von CAMP durch Hemmung des Phosphodiesterase-Abbaus von cAMP hemmt, die Erfindung nicht auf einen Wirkungsmechanismus beschränkt, der von einer Verhinderung des Abbaus von CAMP abhängig ist. Somit kann beispielsweise ein Phosphodiesterase-Inhibitor eine Induktion der Differenzierung von hMSCs zu Adipozyten durch einen Wirkungsmechanismus bewirken, der sich von einer Hemmung des Abbaus von cAMP unterscheidet.
Zusätzlich zu (i) Dexamethason und (ii) Methylisobutylxanthin, ein cAMP-Regulator, können Verbindungen verwendet werden, um hMSCs zur Differenzierung zu Adipozyten zu induzieren. Somit wird erfindungsgemäß auch Insulin in Verbindung mit Methylisobutylxanthin und Dexamethason verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Zusammensetzung zur Induktion von hMSCs zur Differenzierung zu Adipozyten bereitgestellt, die (i) Dexamethason, (ii) eine Verbindung, die CAMP reguliert und Methylisobutylxanthin, eine Verbindung, die den cAMP-Abbau hemmt, z. B. ein Phosphodiesterase-Inhibitor, (iii) Insulin oder ein insulinartiger Wachstumsfaktor und (iv) Glucose umfasst.
Die Zugabe der vorstehend beschriebenen Verbindungen zur Induktion der Differenzierung von hMSCs zu Adipozyten gemäß der Erfindung erfordert nicht, dass sämtliche behandelten hMSCs zur Differenzierung zu Adipozyten induziert werden. Somit wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung hergestellt, die humane mesenchymale Stammzellen und Adipozyten umfasst, wobei auf der Grundlage der beiden Komponenten die Adipozyten in einer Menge von mindestens 5 Gew.-% und vorzugsweise mindestens 15 Gew.-% vorliegen. Die Menge an Adipozyten kann bis zu 50 Gew.-% oder mehr, bezogen auf die beiden Komponenten, betragen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die erzeugte Zusammensetzung im wesentlichen frei von beteiligten Zellen der mesenchymalen Familie, die von Adipozyten abweichen. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegen weniger als 1 % an beteiligten Zellen der mesenchymalen Familie, die von Adipozyten abweichen, vor und insbesondere weniger als 0,1 % und ganz besonders überhaupt keine beteiligten Zellen der mesenchymalen Familie, die von Adipozyten abweichen.
Obgleich die erfindungsgemäße Behandlung von hMSCs ein Gemisch von Adipozyten und undifferenzierten hMSCs erzeugt, können die gebildeten Adipozyten aus dem Gemisch unter Bildung einer isolierten Population von Adipozyten gewonnen werden. Repräsentative Verfahren zur Gewinnung von Adipozyten sind in den Beispielen, die einen Bestandteil der Anmeldung bilden, beschrieben.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können hMSCs so behandelt werden, dass eine Differenzierung zu Adipozyten in der Weise induziert wird, dass diese Differenzierung in vitro oder in vivo ausgeführt wird.
Somit können beispielsweise hMSCs mit Verbindungen der vorstehend beschriebenen Art vermischt werden, die eine Differenzierung zu hMSCs induzieren, und das erhaltene Gemisch kann in vivo zur Induktion der Differenzierung zu Adipozyten in vivo verwendet werden. So kann beispielsweise das Gemisch ohne Züchtung in vitro für eine Zeitspanne, die zur Induktion der in vitro-Differenzierung ausreicht, in einer geeigneten Matrix (beispielsweise des nachstehend beschriebenen Typs) verwendet werden, um die in vivo-Differenzierung der hMSCs zu Adipozyten zu induzieren.
Somit wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung bereitgestellt, die humane mesenchymale Stammzellen, Dexamethason, Methylisobutylxanthin und Insulin umfasst. Eine derartige Zusammensetzung kann zur in vitro-Erzeugung von Adipozyten oder zur Induktion der in vivo-Differenzierung von hMSCs verwendet werden.
Die Fähigkeit zur Erzeugung hoher prozentualer Anteile an adipogenen Zellen aus einer Population von hMSCs ermöglicht die Bildung einer größeren Anzahl von Zellen für Implantationszwecke oder Forschungsuntersuchungen. Es sind weniger hMSCs als Ausgangsmaterial erforderlich. Durch mehrmalige Wiederholung der adipogenen Induktionsstufe sollte es möglich sein, den Großteil der hMSCs in einer Population zur Bildung von Adipozyten zu induzieren. Für den Fall, dass ein Gemisch von Zellen vorliegt, lassen sich adipogene hMSCs leicht aufgrund ihrer Schwebedichte isolieren. Die Isolierung einer hochgradig angereicherten Population aus Adipozyten aus gezüchteten hMSCs ermöglicht eine ausführliche Charakterisierung des Adipozyten-Phänotyps.
Die Adipozyten können zusammen mit verschiedenen Materialien unter Bildung einer Zusammensetzung für Aufgaben, wie die rekonstruktive Chirurgie, verwendet werden. Die Zellen können je nach Bedarf mit einer Biomatrix unter Bildung eines zweidimensionalen oder dreidimensionalen Materials vereinigt werden. Chirurgen verwenden routinemäßig Fettpolster und Fettgewebe von entfernten Stellen, um einen Aufbau in einem Bereich, wo Gewebe entfernt worden ist, vorzunehmen. Dies beinhaltet häufig eine getrennte Vorgehensweise mit den damit verbundenen Risiken. Als eine Alternative können hMSCs vom Patienten isoliert und in Kultur gezüchtet werden. Die hMSCs können dann mit einem biologisch verträglichen Material, wie Kollagen, Kollagenschwamm, Alginat, Polymilchsäurematerial und dergl. unter Bildung eines Verbundstoffes vermischt werden. Der Verbundstoff wird dann so behandelt, dass eine adipogene in vitro-Differenzierung der MSCs für 1 bis 3 Wochen induziert wird, wonach je nach Bedarf eine Implantation vorgenommen wird. Beispielsweise können adipogene MSCs mit einem solubilisierten Kollagen oder einem anderen biologischen Material vermischt werden, das man dann einer Gelbildung zuführt, um einen dreidimensionalen Verbundstoff zu bilden, der für eine Brustvergrößerung im Anschluss an eine Mastektomie verwendet werden kann. Ein derartiger Verbundstoff kann sodann zur geeigneten Größe und Gestalt ausgebildet oder geformt werden. Eine weitere Zusammensetzung umfasst die Züchtung von hMSCs auf der azellulären Hautmatrix, die derzeit vertrieben wird, z. B. das Produkt der LifeCell Corporation. Bei diesem Format werden die Zellen zur Population der Matrix gezüchtet und sodann zur Differenzierung veranlasst, wie vorstehend beschrieben worden ist. Die Matrix mit den adipogenen Zellen kann sodann vom Chirurgen so zugeschnitten werden, dass sie in die Rekonstruktionsstelle passt. Als eine Alternative können hMSCs einer Induktion zur Entstehung von Adipozyten zugeführt werden, bevor sie in die biologisch verträglichen Materialien eingeführt werden. Als weitere Alternative können hMSCs in Kombination mit Verbindungen, die die Differenzierung zu Adipozyten fördern, zusammen mit einer Biomatrix gemäß der vorstehenden Beschreibung verwendet werden, ohne dass man eine Züchtung für eine zur Induktion der Differenzierung ausreichende Zeitspanne vornimmt, wobei die Differenzierung insgesamt oder teilweise in vivo induziert wird.
Ähnlich wie bei der Anwendung bei der rekonstruktiven Chirurgie werden adipogene hMSCs im wesentlichen auf die gleiche Weise bei der fakultativen kosmetischen Chirurgie eingesetzt, um unter der Haut ein darunter liegendes Gewebe mit einem Verbundstoff aus autologen Zellen und einem biologisch verträglichen Material aufzubauen.
Nachstehend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele näher beschrieben. Jedoch wird hierdurch der Schutzumfang in keiner Weise beschränkt. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich Prozent- und Teilangaben auf das Gewicht.
Biochemische Marker von Adipozyten
In der Literatur wird eine Anzahl von Molekülen beschrieben, die spezifische Marker von Adipozyten darstellen und sich zur Charakterisierung von hMSCs, die von Adipozyten abgeleitet sind, eignen. Hierzu gehören Enzyme, die bei der Umwandlung von Fettsäuren zu Triglyceriden beteiligt sind, wie Stearoyl-CoA-desaturase (SCDI) oder der insulinreaktive Glucose-Transporter (GLUT4). Das Produkt des ob-Gens, Leptin, ist ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 16 000, das nur in Präadiposezellen oder Adiposegewebe exprimiert wird. Es wurde gezeigt, dass die Expression des CCAAT-Enhancer-Bindungsproteins, C/EBP, der Expression von verschiedenen Markern der adipogenen Differenzierung vorausgeht, und es wird angenommen, dass dies eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Adipozyten spielt. Ein weiterer Marker ist 422-Adipose P2 (422/aP2), ein Protein, dessen Expression während der Adipozytendifferenzierung verstärkt wird (Cheneval, et al., 1991). Es wird angenommen, dass an diesem Differenzierungsweg auch der Peroxisom-Proliferations-aktivierte Rezeptor γ2 (PPAR γ2) beteiligt ist, der an der Initiation der Transkription von Adipozyten-Genen teilnimmt (Tontonoz, et al., 1994). Studien unter Verwendung dieser Marker und die beschriebenen Verfahren ermöglichen eine ausführlichere Analyse der Familienentwicklung von mesenchymalen Stammzellen unter Differenzierung zu Adipozyten.
Lipidlösliche Farbstoffe als Marker der Adipozytendifferenzierung
Lipidlösliche Farbstoffe zur Färbung von Lipidvakuolen in Adipozyten sind verfügbar. Hierzu gehören unter anderem Nilrot, Nilblau, Sudanschwarz und Ölrot O. Jeder dieser hydrophoben Farbstoffe hat die Neigung, sich in den lipidhaltigen Vakuolen der sich entwickelnden Adipozyten anzureichern und kann leicht die adipogenen Zellen in Populationen von sich differenzierenden MSCs identifizieren. Mindestens einer dieser Farbstoffe kann zur Isolierung von Adipozyten aus nicht-differenzierten Zellen unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortiergeräts (FACS) eingesetzt werden. Ein Beispiel der Verwendung von Nilrot zum Identifizieren von adipogenen hMSCs ist in 4 dargestellt.
Beispiel 1
Erzeugung von Adipozyten aus humanen MSCs
Humane MSCs werden aus dem roten Knochenmark von freiwilligen Spendern gemäß US-5 486 359 isoliert.
Die Zellen werden gezüchtet, bis deutliche Kolonien entstanden sind. Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen einer Subkultur (1 bis 3) unterzogen oder sie können zum Testen der in vitro-Adipogenese entnommen werden. Für den Test auf Adipogenese werden hMSCs in 35 mm-Gewebekulturschalen in einer Menge von 100 000 Zellen pro Schale einer Subkultur unterzogen und mit 2 ml normalem hMSC-Medium (gemäß Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 10 %ausgewähltes fötales Kälberserum (FBS) und ein Antibiotikum/Antimycotikum-Gemisch (1X) (Life Technologies, Inc.)) versorgt. Die Zellen werden bei 37 °C, 5 % CO₂ und 90 % Feuchtigkeit gehalten. Die Zellen werden an jedem dritten Tag mit frischem Medium versorgt und sie vermehren sich und erreichen den konfluenten Zustand. Nach Erreichen des konfluenten Zustands werden die Zellen durch Neuversorgung an jedem dritten Tag aufrechterhalten. Diese Zeitspanne der Züchtung nach Erreichen des konfluenten Zustands verstärkt die adipogene Reaktion in der nächsten Stufe (mindestens bis zu einem Zeitraum von 14 Tagen). Die Differenzierung zu Adipozyten wird initiiert, indem man das Medium auf 2 ml adipogenes Induktionsmedium (DMEM mit 10 fötalem Kälberserum mit einem Gehalt an 10 μg/ml Insulin (humanes, rekombinantes Produkt, Boehringer Mannheim Corp.), 0,5 mM Methylisobutylxanthin (MIX)(Sigma Chemical Co.), 1 μM Dexamethason (Dex)(Sigma Chemical Co.)) abändert. Dieses Medium lässt man 48 Stunden auf den Zellen, wobei die Zellen bei 37 °C, 5 % CO₂ und 90 % Feuchtigkeit gehalten werden. Anschließend wird das Medium durch adipogenes Erhaltungsmedium (DMEM mit einem Gehalt an 10 % FBS und 10 μg/ml Insulin) ersetzt. Das Medium wird alle 3 bis 4 Tage ausgetauscht. Die hMSCs bilden in den Tagen 3 bis 7 allmählich kleine Lipidvakuolen, die sich im Laufe der Zeit vergrößern und zahlreicher werden, mindestens bis zu einem Zeitraum von 30 Tagen. Dabei wurden mehrere Variationen mit Erfolg untersucht.
Wenn humane MSCs auf die vorstehend beschriebene Weise behandelt werden, unterliegen sie einer Differenzierung zur adipogenen Familie, wie in 1 dargestellt. 1A zeigt hMSCs (4X) bei Züchtung in normalem hMSC-Medium für die gleiche Zeitspanne wie in 1B. Es gibt keine Anzeichen für lipidhaltige Vakuolen und die Zellen behalten das Erscheinungsbild von Fibroblasten mit hoher Dichte. In 1B wurden hMSCs bis zum Erreichen des konfluenten Zustands belassen und sodann 10 Tage aufrechterhalten, bevor das adipogene Induktionsmedium für 48 Stunden zugesetzt wurde. Anschließend wurde das Medium gegen adipogenes Erhaltungsmedium für weitere 2 Wochen ausgetauscht. Die Lipidvakuolen treten erstmals nach etwa 3 bis 7 Tagen auf, nehmen aber im Laufe der Zeit an Größe und Anzahl zu. 2A zeigt eine ähnliche Kontrollkultur wie 1A in höherer Vergrößerung (20X). 2B zeigt eine Kultur von konfluenten hMSCs, die 48 Stunden in adipogenem Induktionsmedium belassen und sodann 14 Tage in adipogenem Erhaltungsmedium gehalten wurden. Die zahlreichen lipidhaltigen Vakuolen von Adipozyten sind in einem großen Anteil der Zellen ersichtlich.
3 zeigt die Ergebnisse der Züchtung von hMSCs unter verschiedenen Bedingungen, von denen nur eine einen hohen Grad der adipogenen Differenzierung ergibt. Sämtliche Aufnahmen sind mit einer 10-fachen Vergrößerung aufgenommen. 3A zeigt eine Kultur von hMSCs, die ohne Additive in normalem hMSC-Kulturmedium gehalten werden. Die Zellen wachsen mit einer fibroblastischen Morphologie. 3B zeigt eine ähnliche Kultur, die 48 Stunden mit adipogenem Induktionsmedium und sodann 14 Tage mit adipogenem Erhaltungsmedium unter Mediumaustausch alle 3 Tage behandelt wurden. Die adipogenen Zellen, vermutlich ein hoher Anteil von 30-35 % der Zellen, sind erkennbar, da sie eine große Anzahl an refraktilen Lipidvakuolen enthalten. 3C zeigt eine Kultur von hMSCs, die 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gehalten worden sind, jedoch nie einer Behandlung mit Dexamethason/Methylisobutylxanthin unterworfen worden sind. Die Zellen behalten ein flaches morphologisches Erscheinungsbild ohne erkennbare Vakuolen.
3D zeigt eine Kultur von hMSCs, die mit normalem hMSC-Medium mit einem Gehalt an 1 μM Dexamethason 48 Stunden behandelt und sodann 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gezüchtet worden sind. Die Zellen sind disorganisiert, zeigen aber sehr wenige (wenn überhaupt) Lipidvakuolen. 3E zeigt eine Kultur von hMSCs, die mit normalem hMSC-Medium mit einem Gehalt an 0,5 ml Methylisobutylxanthin während der Induktionsperiode behandelt worden sind und anschließend 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gehalten worden sind. Die Zellen behalten einen flachen fibroblastischen Phänotyp. 3F zeigt eine Kultur von hMSCs, die mit einem Medium behandelt worden sind, das die Zellen auf einem osteogenen Weg induziert. Dieses Medium enthält 0,1 uM Dexamethason, 10 mM β-Glycerinphosphat und 50 uM Ascorbinsäure-2-phosphat. Die Anwesenheit von refraktilem Osteoidmaterial ist erkennbar, jedoch keine großen Lipidvakuolen.
Die adipogenen Zellen können auch unter Verwendung von Farbstoffen für die Lebendfärbung und von histologischen Färbungen, die Lipidvakuolen markieren, identifiziert werden. 4A zeigt eine Kultur von hMSCs, die einer adipogenen Behandlung unterworfen und 14 Tage im adipogenen Erhaltungsmedium gezüchtet worden sind. Die großen Lipidvakuolen sind in diesem Hellfeldbild ersichtlich. Jedoch können die Lipide auch unter Verwendung eines fluoreszierenden, lipidlöslichen Farbstoffes, wie Nilrot (Greenspan et al., 1985) und durch Betrachtung unter Epifluoreszenzbelichtung aufgespürt werden, wie in 4B dargestellt ist.
Die hier dargestellten Ergebnisse wurden mehrmals mit hMSCs, die sich von verschiedenen Spendern ableiteten, wiederholt. Zusätzliche Informationen über dieses Verfahren werden hier gegeben. Ähnliche Ergebnisse wurden mit hMSCs von sämtlichen getesteten Individuen (4 oder mehr Spender) erhalten. Der prozentuale Anteil an Zellen, die zu 1ipidhaltigen Adipozyten werden, variiert je nach den Züchtungsbedingungen. Speziell zeigten die Zellen, die einen vollständig konfluenten Zustand erreicht hatten und auf diese Weise bis zu 2 Wochen vor der Induktion von Adipozyten aufrechterhalten wurden, einen wesentlich höheren prozentualen Anteil an Adipozyten im Laufe der Zeit, als Kulturen, die vor der Konfluenz oder bei Erreichen der Konfluenz induziert wurden. Ein hoher Anteil von 30-35 % der hMSCs zeigt offensichtlich eine adipogene Beschaffenheit 2 Wochen nach der Induktion, wenn sie auf die hier beschriebene Weise behandelt werden, wie in 1B dargestellt ist. hMSCs können mit dem gleichen Erfolg in verschiedenen Größen von Kulturgeräten gezüchtet werden, so dass die Gewinnung einer größeren Anzahl an Zellen keinerlei Problem darstellen sollte.
Beispiel 2
Verstärkung der adipogenen Differenzierung
Diese Experimente wurden durchgeführt, um festzustellen, ob eine Population von humanen mesenchymalen Stammzellen, die in Kultur wachsen, zur Induktion der adipogenen Differenzierung (die einen prozentualen Anteil von 5-10 % der Zellen zur Entwicklung zu Adipozyten induziert) behandelt und sodann zu einem späteren Zeitpunkt erneut behandelt werden können, um einen größeren Anteil der hMSCs zur Differenzierung zu veranlassen. Ferner wurden Experimente durchgeführt, um zu prüfen, ob es möglich ist, eine Population von induzierten adipogenen Zellen aus der Mischkultur von hMSCs und adipogenen MSCs, die sich aus der Behandlung mit adipogenen Mitteln ergeben, zu reinigen. Beide Versuchsreihen waren erfolgreich, wie sich aus der nachstehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren ergibt.
hMSCs wurden durch 48-stündige Züchtung im adipogenen Induktionsmedium gemäß der gegebenen Beschreibung zur Entwicklung des adipogenen Phänotyps induziert. Das Medium wurde sodann gegen adipogenes Erhaltungsmedium ausgetauscht und die Zellen würden 3 bis 6 Tage bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ gezüchtet, bis innerhalb der Zellen merkliche Lipidtröpfchen sichtbar wurden. Etwa 5-10 % der Zellen wurden adipogen, wie aus 5 ersichtlich ist. 5A zeigt hMSCs in Kultur, die mit keinem adipogenen Medium behandelt wurden, die aber gleichzeitig wie die in 5B und 5C dargestellten adipogenen Kulturen gezüchtet, fixiert und gefärbt wurden. In 5B wurde eine einmalige Behandlung mit adipogenem Induktionsmedium und anschließend eine Züchtung in adipogenem Erhaltungsmedium für weitere 3 Wochen durchgeführt. Anschließend wurde eine Fixierung in neutral gepuffertem Formalin und eine Färbung mit Ölrot 0, einem lipidlöslichen Farbstoff, der sich in Fetttröpfchen anreichert, vorgenommen. Eine Schale von hMSCs wurde auch einer erneuten Behandlung mit frischem adipogenen Induktionsmedium für eine zweite und dritte 48-stündige Periode unterzogen, um mehr hMSCs zur Annahme einer adipogenen Beschaffenheit zu induzieren, wie in 5C dargestellt ist. Ein großer Anteil von 30-40 % der Zellen wurde durch die drei Induktionsbehandlungen in Adipozyten umgewandelt, wie sich 2 Wochen nach der dritten Behandlung ergab. In den Feldern 5A-5C wurde durchweg eine Färbung mit Ölrot 0 vorgenommen.
Expression von adipogenen Proteinen in differenzierenden hMSCs
hMSCs exprimieren im Anschluss an die Differenzierung adipozytenspezifische Proteine. In den 5D und 5E wurden 10 g gesamtes Proteinlysat durch SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und mit Antikörpern für C/EPBa oder aP2 untersucht. Gemäß 5D wird das Transkriptionsfaktor-CAAT/Enhancer-Bindungsprotein (oder C/EPBa) in hohen Konzentrationen in den adipogenen hMSCs exprimiert, wie durch diesen Western-Blot unter Verwendung eines für die 34 kd-α-Isoform von C/EBP spezifischen Antikörpers gezeigt wird. Gemäß 5E zeigt das Fettsäure bindende Protein aP2 hohe Expressionsgrade in den adipogenen hMSCs, wie durch diesen Western-Blot unter Verwendung eines für die adipozytenspezifische 14 kd-Form des P2-spezifischen Antikörpers gezeigt wird.
Expression von adipogenen Genen in differenzierenden hMSCs
Die Expression von Transkriptionsfaktoren, von denen bekannt ist, dass sie an der adipogenen Differenzierung beteiligt sind, stellt ebenfalls ein Anzeichen dafür dar, dass hMSCs zu Adipozyten geworden sind. Eine Klasse von Verbindungen, die als Peroxisom-Proliferatoren bekannt sind, wozu einige klinisch eingesetzte hypolipdämische Mittel gehören, können nukleare Rezeptoren, die im Zusammenhang mit der adipogenen Differenzierung stehen, aktivieren. Insbesondere vom Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ2 (oder PPARγ2) wurde gezeigt, dass er mit der Adipogenese in Zusammenhang steht. Eine RNA-Blot-Analyse (Northern-Blotting) wurde zur Identifizierung der erhöhten Expression von PPAR-γ2-RNA in hMSCs, die der adipogenen Differenzierung unterliegen, herangezogen. Die gesamte RNA wurde aus Kontroll-hMSCs und adipogenen hMSCs isoliert, durch denaturierende Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Nitrocellulose übertragen und in Bezug auf die Expression von PPARγ2 untersucht: Kontroll-hMSCs (Bahn 1, 10 μg) oder adipogene hMSCs (Bahn 2, 10 μg; Bahn 3, 20 μg). Wie in 5F gezeigt, wird die PPARγ2-mRNA bei 1,7 kb nachgewiesen, wie durch den Pfeil angegeben ist. Die Expression ist in RNA aus den adipogenen hMSCs etwa 5-fach erhöht.
Die erhöhte Expression von RNA für Lipoprotein-lipase, ein Enzym, das für die Hydrolyse des Triglyceridkerns zu Monoacylglycerin und freien Fettsäuren verantwortlich ist, stellt ein Anzeichen für eine adipogene Differenzierung von hMSCs dar, wie in 5G gezeigt ist. Wie in 5F wurden 10 μg gesamte RNA aus Kontroll-hMSCs (Bahn 1) oder adipogenen hMSCs (Bahn 2) oder 20 μg RNA aus adipogenen hMSCs durch denaturierende Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrocellulose übertragen und auf die Expression von LPL-RNA untersucht. Die mRNA für LPL wird in Form von zwei Banden bei 3,3 und 3,7 kb in den Bahnen 2 und 3 gefunden (die Banden in Bahn 3 sind aufgrund der hohen Beladung geringfügig verschoben).
Beispiel 3
Isolierung von Adipozyten aus hMSCs
Die Erzeugung von Adipozyten aus humanen mesenchymalen Stammzellen unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen führt zur Bildung einer großen Anzahl von Adipozyten, vermutlich in einem hohen Anteil von 30-40 %der vorhanden Zellen. Für Anwendungen, bei denen eine reine Population benötigt wird, können die Adipozyten aus den nicht-adipogenen hMSCs durch mehrere Verfahren, die nachstehend aufgeführt sind, isoliert werden.
Das erste Verfahren zur Isolierung von adipogenen hMSCs bedient sich der Dichtegradientenzentrifugation und nützt die höhere Schwebedichte der 1ipidhaltigen adipogenen Zellen aus. Bei diesem Verfahren werden Kulturen, die hMSCs und von hMSCs abgeleitete Adipozyten enthalten, mit 0,05 % Trypsin/0,53 mM EDTA behandelt, um die Zellen von der Kulturschale zu entfernen. Die Zellen werden durch Zugabe von 10 ml normalem hMSC- Medium gewaschen und 10 Minuten bei 20 °C in der GS-6R-Zentrifuge (Beckman Instruments, Inc.) mit 1 000 U/min zentrifugiert. Die pelletisierten Zellen, die Adipozyten und hMSCs enthalten, werden in 2 ml adipogenem Erhaltungsmedium resuspendiert und sorgfältig oben auf 8 ml Percoll mit einer Dichte von 1,045 g/ml beschichtet. Die Röhrchen werden 20 Minuten bei 3 °C in einer Beckman-GS-6R-Zentrifuge mit 2 200 U/min (1100 × g) zentrifugiert. Die Adipozyten werden in den obersten 2 ml und an der Grenzfläche mit dem Percoll mit einer Dichte von 1,045 gewonnen. (Die nicht-adipogenen MSCs gelangen in das Percoll mit einer Dichte von 1,045 und können am Boden des Röhrchens gewonnen werden.) Die gewonnenen Adipozyten werden durch Zugabe von 10 ml adipogenem Erhaltungsmedium gewaschen und 10 Minuten bei 20 °C in der GS-6R-Zentrifuge mit 1 000 U/min zentrifugiert. Die Adipozyten werden erneut in einer Dichte von 150 000 Zellen pro 35 mm-Schale in adipogenem Erhaltungsmedium ausgestrichen und wieder in den Inkubator gebracht.
Das zweite Verfahren zur Isolierung von adipogenen hMSCs bedient sich der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS). Die einer Differenzierung zu Adipozyten unterliegenden hMSCs in einer Kultur können unter Verwendung eines lipidlöslichen, fluoreszierenden Farbstoffes, wie Nilrot (10-100 μg/ml), zur Färbung von Adipozyten mit einem Gehalt an Lipidvakuolen isoliert werden. Die Kultur wird sodann auf die vorstehend angegebene Weise mit Trypsin/EDTA behandelt, um die Zellen vom Kulturgefäß zu lösen und die Mischpopulation einer fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) zu unterziehen. Die Parameter der Vorrichtung werden so eingestellt, dass adipogene Zellen in der Population ausgewählt und gewonnen werden. Sie können direkt verwendet oder erneut ausgestrichen und im Inkubator gezüchtet werden.
Wie nachstehend ausgeführt, besteht das dritte Verfahren, mit dem adipogene Zellen in einer Mischkultur isoliert werden, in einer Behandlung mit Trypsin/EDTA und im Waschen der Zellen auf die vorstehend angegebene Weise. Anschließend werden die Zellen in einen Gewebekulturkolben gebracht und der Kolben wird mit Medium gefüllt. Der Kolben wird dicht verschlossen und umgekehrt aufgestellt, so dass die für die Zellhaftung behandelte Oberfläche sich oben befindet. Die Adipozyten mit einem Gehalt an Lipidtröpfchen steigen aufgrund des Auftriebs nach oben und haften an der Oberfläche des Kolbens. Am nächsten Tag wird das Medium entfernt, der Kolben wird mit frischem Medium gespült und wieder in die aufrechte Position gebracht. Der Kolben, der jetzt nur mehr eine zur Bedeckung der Zellschicht ausreichende Menge an Medium enthält, wird zur weiteren Aufrechterhaltung wieder in den Inkubator gebracht.
Adipogene hMSCs reichern Lipidtröpfchen an, was die Schwebedichte der Zellen verringert. Die adipogenen hMSCs werden sodann auf folgende Weise isoliert. Die Schale mit Zellen, die Adipozyten und nicht-adipogene hMSCs aus einer Kultur enthielt, die nur für eine einzige 48-stündige Induktionsperiode behandelt und sodann 3 Wochen gezüchtet worden war, wurde 3 bis 5 Minuten mit 0,05 % Trypsin und 5 mM EDTA behandelt, um die Zellen von der Schale zu lösen. Sodann wurden die Zellen von der Schale mit 10 ml frischem Medium abgespült und in einen 25 cm²-Kolben gebracht. Der Kolben wurde bis zum Rand mit frischem Medium gefüllt. Sodann wurde der Kolben umgekehrt so aufgestellt, dass die übliche Kulturoberfläche sich ganz oben befand. Anschließend wurde der Kolben über Nacht in einen Inkubator mit 37 °C gestellt. Die einen stärkeren Auftrieb aufweisenden adipogenen Zellen stiegen nach oben und hafteten an der Oberfläche, während sich die nicht-adipogenen hMSCs an der Bodenfläche absetzten und daran hafteten. Am nächsten Tag wurden die Zellen auf jeder Oberfläche photographiert. Die Aufnahmen sind in 6 wiedergegeben. 6A zeigt die adipogenen hMSCs, die an der obersten Oberfläche hafteten. Die Population besteht aus mehr als 99 % adipogenen Zellen, wie die Lipidtröpfchen in jeder Zelle zeigen. 6B zeigt die nicht-adipogenen hMSCs, die sich auf die untere Oberfläche des Kolbens abgesetzt hatten. Es waren sehr wenige Zellen mit einem Gehalt an Flüssigkeitströpfchen an der unteren Oberfläche vorhanden. Diese nicht-adipogenen Zellen konnten mit Trypsin/EDTA behandelt und erneut auf eine weitere Schale ausgestrichen werden. Es konnte gezeigt werden, dass sie ihr adipogenes Potential behalten (Daten nicht aufgeführt), was ein Anzeichen dafür darstellt, dass sie mesenchymale Stammzellen geblieben sind, die zu einer Fortentwicklung befähigt sind.
Beispiel 4
Adipogene MSCs in der Wiederherstellungschirurgie
Adipozyten können mit einer Vielzahl von Materialien unter Bildung einer Zusammensetzung für spezielle Zwecke, z. B. zur Wiederherstellungschirurgie, verwendet werden. MSCs können mit einer Biomatrix unter Bildung eines zweidimensionalen oder dreidimensionalen Materials, je nach Bedarf, vereinigt werden. Chirurgen verwenden routinemäßig Fettpolster und Fettgewebe aus entlegenen Stellen, um einen Aufbau an einem Bereich, wo Gewebe entfernt worden ist, vorzunehmen. Dies beinhaltet häufig eine getrennte Vorgehensweise, die naturgemäß mit Risiken verbunden ist. Als eine Alternative werden hMSCs vom Patienten isoliert und in Kultur gezüchtet. Die hMSCs werden sodann mit einem biologisch verträglichen Material, wie Kollagen, Kollagenschwamm, Alginat, Polymilchsäurematerial und dergl., unter Bildung eines Verbundstoffes vermischt. Der Verbundstoff wird sodann in vitro 1 bis 3 Wochen so behandelt, dass eine adipogene Differenzierung der MSCs induziert wird. Anschließend wird bei Bedarf eine Implantation vorgenommen. Beispielsweise werden adipogene MSCs mit in Lösung gebrachtem Kollagen oder einem anderen biologischen Material vermischt, das dann ein Gel unter Ausbildung eines dreidimensionalen Verbundstoffes bildet, der sich für die Brustvergrößerung im Anschluss an eine Mastektomie eignet. Ein derartiger Verbundstoff wird zur entsprechenden Größe und Gestalt ausgebildet oder geformt. 7 zeigt ein Beispiel für hMSCs, die in einer stabilisierten Kollagen-Gelmatrix gezüchtet und sodann zur Differenzierung zu Adipozyten induziert worden sind. Die Zellen werden mit dem fluoreszierenden Farbstoff Nilrot gefärbt. Dieser Farbstoff reichert sich in den Lipidvakuolen an, die dann unter UV-Beleuchtung sichtbar gemacht werden. Nur die Lipidabscheidungen in den Zellen sind sichtbar. Es befinden sich zahlreiche Adipozyten außerhalb der Brennpunktebene in der dreidimensionalen Matrix.
Eine weitere Zusammensetzung umfasst die Züchtung von hMSCs auf azellulären Hautmatrices, die derzeit auf dem Markt erhältlich sind. Bei diesem Format werden die Zellen so gezüchtet, dass sie die Matrix bevölkern. Anschließend werden sie, wie beschrieben, zur Differenzierung veranlasst. Die Matrix mit den adipogenen Zellen wird sodann vom Chirurgen so zugeschnitten, dass sie in die Rekonstruktionsstelle passt. Alternativ können hMSCs so induziert werden, dass sie zu Adipozyten werden, bevor sie in die biologisch verträglichen Materialien eingeführt werden. Ähnlich wie bei ihrer Verwendung bei der Wiederherstellungschirurgie werden adipogene hMSCs in der freiwilligen kosmetischen Chirurgie im wesentlichen auf die gleiche Weise eingesetzt, um ein unter der Haut liegendes Gewebe mit einem Verbundstoff aus autologen Zellen und einem biologisch verträglichen Material aufzubauen.
Beispiel 5
Verwendung von adipogenen hMSCs als eine Quelle für Leptin für ein Implantat bei Infertilität
Die Rolle von Leptin bei Fettleibigkeit wirft auch Fragen über dessen Rolle bei Frauen auf, die einen geringen Körperfettanteil aufweisen und einen unregelmäßigen Menstruationszyklus zeigen und häufig nicht schwanger werden können. Neuere Forschungen lassen darauf schließen, dass Leptin als metabolischer Regulator dienen kann, um dem Körper zu signalisieren, dass er eine ausreichende Fettmenge gespeichert hat, um eine Empfängnis und die Entwicklung des Fötus zu unterstützen (Chebab et al., 1996). In dem Ausmaß, in dem die adipogenen hMSCs eine gute Quelle für Leptin darstellen, können sie als ein Implantat für die Freisetzung von Leptin in den Körper dieser Frauen verwendet werden. Ein derartiges Implantat kann die Form von verkapselten adipogenen hMSCs oder einer Matrix mit einem Gehalt an adipogenen hMSCs annehmen, die dort implantiert werden können, wo die sezernierten Produkte Zugang zum Kreislauf haben.
Literaturverzeichnis

MacDougald, O.A., C-S. Hwang, H. Fan, and M.D. Lane. 1995. Regulated expression of the obese gene product (leptin) in white adipose tissue and 3T3-LI adipocytes. PNAS 92:9034-9037.
Hwang, C-S., S. Mandrup, O.A. MacDougald, D.E. Geiman and M.D. Lane. 1996. Transcriptional activation of the mouse obese (ob) gene by CCAAT/enhancer binding protein.α. PNAS 93:873-877.
Cornelius, P., O.A. MacDougald and M.D. Lane. 1994. Regulation of adipocyte development. Annu. Rev. Nutrition 14:99-129.
Yeh, W-C., Z. Cao, M. Classon and S.L. McKnight. 1995. Cascade regulation of terminal adipocyte differntiation by three members of the C/EBP family of leucine zipper proteins. Genes and Development 9:168-181.
Freytag, S.O., and T.J. Geddes. 1992. Reciprocal regulation of adipogenesis by Myc and C/EBPα. Science 256:379-382.
Bortell, R., T.A. Owen, R. Ignotz, G.S. Stein and J.L. Stein. 1994. TGFO, prevents the down-regulation of type I procollagen, fibronectin, and TGFO, gene expression associated with 3T3-LI pre-adipocyte differentiation. J. Cellular Biochem. 54:256-263.
Sadowski, H.B., T.T. Wheeler and D.A. Young. 1992. Gene expression during 3T3-L1 adipocyte differentiation. 3. Biological Chem. 266:722-4731.
Flier, S. 7. 1995. The adipocyte:storage depot or node o the energy information superhighway. Cell 80:15-18.
Greenspan, P., E.P. Mayer and S.D. Fowler. 1985. Nile red: A. selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biology 100: 965-973.
Smith, M.J. and W. Wharton. 1992. Differentiation of A31T6 proadipocytes to adipocytes: A flow cytometric analysis. Exper. Cell Research 199:29-38.
Gimble, J.M., K. Youkhana, X. Hua, H. Bass, K. Medina. 1992. Adipogenesis in a myeloid supporting bone marrow stroma cell line. 7. Cell. Biochem. 50:73-82.
Pietrangell, C.E., 5-1. Hayashi and P.W. Kincade. 1988. Stromal cell lines which support lymphocyte growth: characterization, sensitivity to radiation and responsiveness to growth factors, Europ. J. Immunolgy. 18:863-872.
Chehab, F.F., M. E. Lim and R. Lu. 1996. Correction of the sterility defect in homozygous obese female mice by treatment with the human recombinant leptin. Nature Genetics 12 318-320.
Beresford, J.H., J.H. Bennett, C. Devlin, P.S. Leboy and M.E. Owen. 1992. Evidence for an inverse relationship between the differentiation of adipocytic and osteogenic cells in rat marrow stromal cell cultures. J. Cell Science 102:341-351.
Bortell, R. T.A. Owen, R. Ignotz, G.S. Stein and J.L. Stein. 1994. TGF β₁ prevents the down regulation of type I procollagen, fibrinectin, and TGF β₁ geneexpression associated with 3T3-L1 pre-adipocvte differentiation. J. Cellular Biochem. X4:256-263.
Gimble, J.M., C. Morgan, K.Kelly, X.Wu, V.Dandapani, C.-S. Wang and V. Rosen. 1995. Bone Morphogenetic Proteins inhibit adipogenic differentiation by bone marrow stromal cells. J. Cellular Biochemistry 58:393-402.
Grigoriadis, A.E., J.N.M.Heersche and J.E. Aubin. 1988. Differentiation of muscle, fat, cartilagem and bone from progenitor cells present in a bone derived clonal cell population: effect of dexamethasone. J. Cell Biology 106:2139-2151.
Ibid., 1990. Continuosly growing bipotential and monopotential myogenic adipogenic and chondrogenic subclones isolated from the multipotential RCJ 3.1 clonal cell line. Developmental Biology 142:313-318.
Umezawa, A., K.Tachlbana, K. Harigaya, S. Kusaikarl, S. Kato, Y. Watanabe and T.Takano. 1991. Colony stimulating factor I expression is down-regulaced during the adipocyte differentiation oF H-1/A marrow stromal cells and induced by cachetin/tumor necrosis factor. Mol. Cell. Biol. 11:920-927.
Yamaguchi, A. and A.J. Kahn. 1991. Clonal osteogenic cell lines express myogenic and adipocytic developmental potential. Calcified Tissue International 44: 221-225.
Cheneval, D.R. J. Christy, D.Geiman, P.Cornelius, and M.D. Lane, 1991. Cell-free transcription directed by the 422 adipose P2 gene promoter: activation by the CCAAT/enhancer bindind protein. Proc. National Academy of Sciences USA 88:8465-69.
Ingalls, A.M., M.M. Dickie and G.D. Snetl. 1950, Obese, a new mutation in the house mouse, 3. Heredity 41:371-318.
Tontonoz, P.E., Hu, and B.M. Spiegelman. 1994. Stimulation of adipogenesis in fibroblasts by mPPARγ2, a lipid activated transcription factor. Cell 79:1147-1156.
Konieczny, S.F. and C.P. Emerson. 1984. 5-azacytidine induction of stable mesodermal stem cell lineages from 10T1/2 cells: evidence for regulatory genes controlling differentiation. Cell 38:791-800.
Spiegelman, B.M. and H. Green. 1980. Control of specific protein biosynthesis during the adipose conversion of 3T3 cells. 3. Biol. Chem. 255:8811-8818.
Zhang, Y. et al. 1994. Nature 372:425-432.
MacDougald. O.A. and M.D. Lane 1995. Transcriptional Regulation of gene expression during adipocyte differentiation. Annu. Rev. Biochem. 64:345-373.
Chehab, F.F., M. E. Lim and R. Lu. 1996. Correction of the sterility defect in homozygous obese female mice by treatment with the human recombinant leptin. Nature Genetics 12:318-320.

Claims

Zusammensetzung, umfassend mesenchymale Stammzellen, die von einem Menschen isoliert worden sind und die das Potential zur Differenzierung zu Zellen von mehr als einem Bindegewebstyp besitzen, und eine Substanz in einer Menge, die eine Induktion der Stammzellen zur Differenzierung zur adipogenen Linie bewirkt, wobei die Substanz, die die Zellen aus der mesenchymalen Stammzellpopulation zur Differenzierung zur adipogenen Familie induziert, Dexamethason, Methylisobutylxanthin und Insulin umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Erzeugung von Adipozyten, ferner umfassend isolierte humane mesenchymale Stammzellen in einer biologisch verträglichen Matrix, die die Differenzierung und Reifung von humamen mesenchymalen Stammzellen zu Adipozyten unterstützt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Matrix Collagen umfasst.
Verfahren zur Induktion von humanen mesenchymalen Stammzellen zur Differenzierung zu Adipozyten, umfassend das Kontaktieren von humanen mesenchymalen Stammzellen mit einer Substanz, die Dexamethason, Methylisobutylxanthin und Insulin umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, ferner umfassend das Isolieren der Adipozyten von verbleibenden hMSCs.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei Dexamethason und Methylisobutylxanthin im Gemisch miteinander vorliegen.