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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Feld der Krebstherapie, insbesondere
die Behandlung von Bcl-2-Erkankungen. Diese Behandlungen beziehen
insbesondere die Verwendung von Antisense-Oligodesoxynukleotiden
und liposomale Formulierungen davon mit ein.
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Bcl-2
ist mit einer großen
Vielzahl an Erkrankungen wie hämatologische
bösartige
Tumoren, sowohl Leukämien
als auch Lymphome, einschließlich
follikulären
und nicht-follikulären
Lymphomen, chronischer lymphozytischer Leukämie, und Plasmazell-Dyskrasien
(Campos et al., Blood, 84:595, 1994), festen Tumoren wie jenen,
die mit Brust-, Prostata- und Darmkrebs assoziiert sind, und Immunstörungen in
Verbindung gebracht werden. Eine besondere mit Bcl-2 in Verbindung
stehende Erkrankung ist das follikuläre nicht-Hodgkin-Lymphom (FL).
FL ist der häufigste
lymphoide bösartige
Tumor in Europa und den Vereinigten Staaten. Typischerweise ist
es eine nicht-schmerzhafte Erkrankung geringen Stadiums, die aus
der Ansammlung von kleinen, ruhenden B-Zellen besteht. Obwohl die
Reaktion auf Chemotherapie anfänglich
gut ist, sind Rückfälle unvermeidlich
mit der Transformation in einen histologisch aggressiveren Typus
und die Entwicklung von Wirkstoffresistenz (Aisenberg, J. Clin.
Oncol., 13:2656, 1995; Johnson et al., J. Clin, Oncol., 13:140,
1995). In über
90 % der FL-Patienten findet man eine t(14;18)-Translokation, die das bcl-2-Gens von
Chromosom 18q21 in Nachbarschaft bringt zu dem Lokus der schweren
Immunglobulinkette auf Chromosom 14q323 (Tsujimoto et al., Science,
299:1390, 1985; Graninger et al., J. Clin. Invest., 80:1512, 1987).
Als Konsequenz davon kommt das bcl-2-Gen unter den Einfluss des Enhancers
der schweren Immunglobulinkette, und das Bcl-2-Protein wird überexprimiert
(Bakhshi et al., Cell, 41:899, 1985; Tsujimoto et al., Oncogene,
2:3, 1987). Das tumorogene Potenzial von Bcl-2 steht in Verbindung
mit seiner Kapazität
physiologische Todesreaktionen zu stören, wodurch die Langlebigkeit
der Zelle verstärkt
wird (Nunez et al., J. Immunol., 144:3602, 1990). Das Bcl-2-Protein
blockiert apoptotische Stimuli wie Wachstumsfaktorentzug, Strahlung,
Hitzeschock, Virus, und die meisten chemotherapeutischen Agenzien
(Reed, Hematol. Oncol. Clin. North Am., 9:451, 1995; Hockenbery
et al., Nature, 348:334, 1990). In bcl-2-Ig-transgenen Mäusen wird
anfänglich
eine polyklonale follikuläre
Lymphproliferation bestehend aus einer Expansion von reifen B-Lymphozyten
beobachtet (McDonnell et al., Cell, 57:79, 1989). Anschließend entwickeln
sich monoklonale hochgradige Lymphome vom großen immunblastischen Typ, wobei
50 % von diesen Umordnungen des C-MYCs aufweisen. Das legt nahe, dass
eine zweite genetische Veränderung
für die
Entwicklung und den Fortschritt des bösartigen Lymphoms notwendig
ist (McDonnell und Korsmeyer, Nature, 349:254, 1991).
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Kürzlich wurde
eine sich rasch vergrößernde Familie
an mit Bcl-2 in Verbindung stehenden Proteinen identifiziert. Diese
schließt
Bax, Bcl-XL, Bcl-XS,
Bad, Bak, Mcl-1, A-1 und mehrere offene Leseraster in DNA-Viren
mit ein (Oltvai et al., Cell, 74:609, 1993; Boise et al., Cell,
74:597, 1993; Yang et al., Cell, 80:285, 1995; Chittenden et al.,
Nature, 374:733, 1995; Kiefer et al., Nature, 374:736, 1995; Kozopas
et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA, 90:3516, 1993; Lin et al., J. Immunol., 151:1979,
1993; Pearson et al., Virology, 160:151, 1987; Neilan et al., J.
Virol., 67:4391, 1993). Die Mitgliedschaft in der Bcl-2-Proteinfamilie
ist im Prinzip durch Homologie mit den BH1- und BH2-Domänen definiert,
die helfen, die Dimerisierung zwischen den Mitgliedern zu regulieren
(Sato et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA, 91:9238, 1994). Bax, das mit Bcl-2 eine 21 %-ige
Aminosäureidentität teilt,
kann an das Bcl-2-Protein binden und seine Fähigkeit neutralisieren, den
Zelltod zu blockieren. Daher denkt man, dass das Verhältnis von
Bcl zu Bax die Anfälligkeit
der Zelle für
Tod infolge von apoptotischen Stimuli bestimmt (Oltvai et al., 1993;
Yin et al., Nature, 369:321, 1994).
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Phosphodiester-Antisense-Oligodesoxynukleotide,
die komplementär
zu spezifischen Sequenzen der Translations-Initiationsstelle der
Bcl-2-mRNA sind, sind in der Lage, die Herstellung des Bcl-2-Proteins
und das Wachstum der Zellen, die eine t(14;18)-Translokation tragen,
zu stören
(Kitada et al., Antisense Res. Dev., 3:157, 1993). Die therapeutische
Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden
wurde jedoch von ihrer geringen zellulären Aufnahme und ihrem raschem
Abbau durch Nukleasen und anderen Serum- oder zellulären Bestandteilen
erschwert. Für
Phosphorthioat-Oligonukleotide, die resistent gegenüber Nukleaseabbau
sind, wurde herausgefunden, dass sie FL-Zellwachstum in Konzentrationen
10 Mal niedriger als Phosphodiester-Oligonukleotide stören (Reed
et al., Cancer Research, 50:6565, 1990a; Cotter et al., Oncogene,
9:3049, 1994). Diese Herangehensweise leidet jedoch unter der geringen
zellulären
Aufnahme der Oligonukleotide. Beispielsweise mussten Reed et al.
Konzentrationen von mehr als 25 μM
an Phosphorthioaten verwenden, um eine 50 %-ige Wachstumsinhibition
von Zelllinien, die von B-Zell-Lymphomen abgeleitet sind, beispielsweise
697 und Su-Dhl-4-Zellen,
zu erreichen. Der liposomale Einbau führte zur verstärkten Aufnahme
von Oligonukleotiden in Leukämiezellen
(Akhtar et al., Nucleic Acids Res., 19:5551, 1991; Tari et al.,
Blood, 84:601, 1994). Die Verwendung von kanonischen Lipiden durch
Reed et al., um Phosphorthioat-Antisense-Oligonukleotide zuzuführen, erlaubte
es ihnen, die Konzentration an Oligonukleotiden auf 0,075 bis 0,3 μM zu verringern
und dennoch Wachstumsinhibition in Su-Dhl-4-Zellen zu induzieren.
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Es
besteht jedoch immer noch ein Bedarf an Verfahren und Zusammensetzungen
für die
Behandlung von Bcl-2-assoziierten Erkrankungen wie hämatologischen
bösartigen
Tumoren, sowohl Leukämien
als auch Lymphomen, einschließlich
follikulären
und nicht-follikulären
Lymphomen, chronischer lymphozytischer Leukämie, und Plasmazell-Dyskrasien,
festen Tumoren wie jenen, die mit Brust-, Prostata- und Darmkrebs
assoziiert sind, und Immunstörungen.
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Die
vorliegende Erfindung wurde entworfen, um die Nachteile des Stands
der Technik zu überwinden, indem
verbesserte Zusammensetzungen, die nützlich bei der Behandlung von
Bcl-2-assoziierten
Erkrankungen wie hämatologischen
bösartigen
Tumoren, sowohl Leukämien
als auch Lymphomen, einschließlich
follikulären
und nicht-follikulären
Lymphomen, chronischer lymphozytischer Leukämie, und Plasmazell-Dyskrasien,
festen Tumoren wie jenen, die mit Brust-, Prostata- und Darmkrebs
assoziiert sind, und Immunstörungen, zur
Verfügung
zu stellen. Diese Zusammensetzungen umfassen neue Antisense-Oligonukleotide
um spezifische Nukleinsäuren
in die Zellen von Patienten zu lenken.
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Daher
wird in einer Ausführungsform
eine Zusammensetzung zur Verfügung
gestellt, die ein erstes Polynukleotid umfasst, das mit einem zweiten
Bcl-2-kodierenden Polynukleotid unter intrazellulären Bedingungen
hybridisiert. Intrazelluläre
Bedingungen, wie hierin definiert, schließen monovalente Kationen in
einer Konzentration von ungefähr
160 mM (10 mM Na+; 150 mM K+)
und eine Konzentration von zweiwertigen Kationen zu ungefähr 20 mM
(18 mM Mg+; 2 mM Ca++ mit
ein. Die intrazellulären
Bedingungen können
auch eine Proteinkonzentration mit einschließen, die dazu dienen würde, das
Hybridisierungsvolumen zu verringern und daher die wirksame Konzentration
der Nukleinsäurespezies
auf ungefähr
150 mg/ml anzuheben. Weitere Inhaltsstoffe und Anforderungen solcher
Zusammensetzungen sind wie in Anspruch 1 definiert.
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Die
ersten Polynukleotide können
Oligonukleotide mit einer Länge
von ungefähr
8–50 Basen
sein. Die Polynukleotide können
Phosphodiester-Polynukleotide sein, wie sie in der Natur gefunden
werden, oder können
vorzugsweise abgeleitete Polynukleotide oder sogar Polynukleotidanaloga
sein. Beispielhafte Polymere wären
p-Ethoxy- oder Methylphosphonat-Polynukleotide.
Andere Analoga, die verwendet werden können, schließen ein,
sind aber nicht beschränkt
auf C-5 Propyne Pyrimidin-Polynukleotide (Wagner et al., Science, 260:1510–1513, 1993)
oder Polynukleotide wie in
US
5,138,045 oder EP-A 431,523 beschrieben. Bevorzugte Analoga
sind Nuklease-resistent, haben eine hohe Schmelztemperatur, (binden
stark an RNA), und in bestimmten Ausführungsformen sind bevorzugte
Polynukleotide hydrophob für
eine effizientere Assoziierung mit einer Lipidformulierung wie einem
Liposom.
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In
einer weiteren Ausführungsform
hybridisiert das Polynukleotid mit bcl-2 mRNA und vorzugsweise mit
der Translationsinitiationsstelle der Bcl-2 mRNA. Es versteht sich
jedoch, dass die Antisense-Moleküle
der vorliegenden Erfindung mit jedem Abschnitt des bcl-2-Transkripts
hybridisieren können,
der bewirken kann, dass die Expression des Bcl-2-Proteins herunterreguliert
wird. Es gibt bestimmte Vorteile das erste offene Leseraster anzusteuern,
und wie bereits erwähnt,
ist die Transkriptionsinitiationsstelle insbesondere bevorzugt. In
bestimmen spezifischen Ausführungsformen
kann das Polynukleotid ein Oligonukleotid mit der Sequenz 5' CAGCGTGCGCCATCCTTC
3' (SEQ ID NO:1).
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Die
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst ein Lipid wie
in Anspruch 1 spezifiziert. Das Lipid steht in Verbindung mit dem
ersten Polynukleotid. Ein Polynukleotid, das mit einem Lipid assoziiert ist,
kann als verkapselt im wässrigen
Inneren eines Liposoms, verteilt innerhalb der Lipiddoppelschicht
eines Liposoms, angeheftet an das Liposom über ein Verbindungsmolekül, das sowohl
mit dem Liposom als auch dem Polynukleotid assoziiert ist, komplexiert
mit einem Lipid, verteilt in einer Lösung, die ein Lipid enthält, gemischt
mit einem Lipid, kombiniert mit einem Lipid, als eine Suspension
in einem Lipid beinhaltet, in einer Mizelle beinhaltet oder mit
einer Mizelle komplexiert, oder auf andere Art und Weise mit einem
Lipid assoziiert beschrieben werden.
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Der
Ausdruck „Lipide", wie er in dieser
Beschreibung und den Ansprüchen
verwendet wird, bezeichnet jede Form sowohl natürlich vorkommender als auch
synthetischer Lipide oder Liposomen. Lipide sind fettige Substanzen
und sind dem Fachmann gut bekannt. Die Lipide gemäß der vorliegenden
Erfindung sind nicht beschränkt
auf irgendeine bestimmt Struktur in Lösung. Beispielsweise können sie
in einer Doppelschichtstruktur vorliegen, als Mizellen, oder als „kollabierte" Struktur. Sie können auch
einfach in einer Lösung verteilt
sein, eventuell Aggregate bilden, die entweder in Größe oder
Form nicht einheitlich sind. Die Lipide sind neutral in ihrer Nettoladung
und können
vorzugsweise sich aus Lipid- Dioleoylphosphatidylcholin
zusammensetzen, jedoch können
auch andere Lipide wie andere Phosphatidylcholine, Phosphatidylglyzerine,
und Phosphatidylethanolamine eingesetzt werden.
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In
noch einer weiteren Ausführungsform
wird eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt, die ein Expressionskonstrukt
umfasst, das für
ein erstes Polynukleotid kodiert, das mit einem zweiten für Bcl-2-kodierenden
Polynukleotid hybridisiert, wobei das erste Polynukleotid unter
der Kontrolle eines Promotors steht, der in eukaryotischen Zellen
aktiv ist. Weitere Inhaltsstoffe und Anforderungen solcher Zusammensetzung
sind in Anspruch 11 definiert.
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Diese
Erfindung umfasst auch die Verwendung solcher Zusammensetzungen
für die
Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Proliferation
einer Krebszelle, wobei ein solches Medikament vorteilhaft in Fällen einer
Vielzahl von Krebszellen wie in den Beispielen unten gezeigt angewandt
werden kann. Für
die Medikamente wird gezeigt, dass sie auf Krebszellen wirken, die
bcl-2 überexprimieren
oder auf hohen Niveaus exprimieren und auch das Bax-Protein exprimieren,
als auch in Zellen, in denen die Translokation von p53 in den Nukleos
nach gentoxischem Schaden durch bcl-2 inhibiert wird. Solche Zellen
würden
einschließen,
aber nicht beschränkt
sein auf, hämatologische
bösartige
Tumoren, sowohl Leukämien
als auch Lymphome, einschließlich
follikulären
und nicht-follikulären
Lymphomen, chronischer lymphozytischer Leukämie, und Plasmazell-Dyskrasien,
festen Tumoren wie jenen, die mit Brust-, Prostata- und Darmkrebs
assoziiert sind; und Immunstörungen.
Die Zusammensetzung kann ein neutrales Lipid umfassen, das mit dem
Polynukleotid assoziiert ist, beispielsweise ein Polynukleotid verkapselt
in einem Liposom. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Krebszelle
in einem Patienten und in bestimmten Ausführungsformen in einem menschlichen
Patienten. Die Zusammensetzung kann vorteilhaft an einen menschlichen
Patienten in einem Volumen von 0,50–10,0 ml pro Dosis zugeführt werden
oder in einer Menge von 5–30
mg Polynukleotid pro m2. In einem bestimmten
Verabreichungsschema wird die Zusammensetzung dreimal pro Woche
für 8 Stunden
verabreicht. Es können
jedoch verschiedene Dosierungen verwendet werden, wie durch den
behandelten Arzt bestimmt wird, ausgehend von der jeweiligen Erkrankung,
Alter und Zustand des Patienten und anderen Faktoren, die eine Entscheidung
des Arztes beeinflussen können.
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Diese
Erfindung betrifft die Antisense-Technologie, die angewendet werden
kann, um mit Bcl-2 assoziierte Erkrankungen zu behandeln. In einer
bevorzugten Ausführungsform
umfasst sie eine Zusammensetzung, die ein Polynukleotid umfasst,
das mit der Translationsinitiationsstelle der Bcl-2 mRNA hybridisiert.
Ein Beispiel für
ein nützliches
Polynukleotid ist ein Oligonukleotid, das die Sequenz CAGCGTGCGCCATCCTTC (SEQ
ID NR:1) umfasst.
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Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung schließen auch Zusammensetzungen
mit ein, wo aus dem Lipid Liposomen gebildet werden. In einigen
Fällen
kann es nützlich
sein, eine Zusammensetzung zu haben, in der das Polynukleotid im
Liposom verkapselt ist. Lipide, die ganz besonders nützlich bei
der vorliegenden Erfindung sind, schließen Phosphatidylcholine, Phosphatidylglyzerine,
und Phosphatidylethanolamine mit ein, wobei ein Beispiel das Lipid
Dioleoylphosphatidylcholin ist, obwohl alle annehmbaren neutralen
Lipide verwendet werden können.
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Ein
Verfahren, eine mit Bcl-2 assoziierte Erkrankung zu inhibieren,
umfasst die Schritte des Erhaltens eines Polynukleotids, das mit
einem für
Bcl-2 kodierenden Polynukleotid hybridisiert, Mischen des Polynukleotids
mit einem neutralen Lipid um eine Polynukleotid/Lipid-Assoziierung zu bilden,
und Verabreichen dieser Assoziierung an eine Zelle. Die Zelle kann
eine Krebszelle, beispielsweise eine follikuläre Lymphomzelle, sein. Dieses
Verfahren setzt ein Polynukleotid ein, das ein Oligonukleotid mit
einer Länge
von zwischen 8 und 50 Basen umfasst. Das Lipid kann ein Liposom
umfassen. Falls dem so ist, dann kann das Liposom zudem das Polynukleotid
verkapseln.
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Das
In-Kontakt-Bringen kann in einem Tier, beispielsweise einem Menschen,
stattfinden. Beispielsweise kann die Zusammensetzung an den Menschen
in einem Volumen von 0,50–10,0
ml pro Dosis oder in einer Menge von ungefähr 5 bis ungefähr 30 mg
Polynukleotid pro m2 zugeführt werden.
Sie kann auch dreimal pro Woche für 8 Wochen verabreicht werden.
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Die
folgenden Zeichnungen bilden einen Teil der vorliegenden Beschreibung
und wurden eingeschlossen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden
Erfindung noch weiter zu zeigen. Die Erfindung kann besser verstanden
werden mit Verweis auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination
mit der detaillierten Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen,
die hierin dargestellt werden:
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1:
Wachstumsinhibierung von lymphoiden Zellen mittels liposomalem bcl-2-Antisense-Oligonukleotiden
(„L-bcl-2"). Endkonzentrationen
von 3 μmol/L
(Punkte), 4 μmol/L
(horizontal), 5 μmol/L
(vertikal) und 6 μmol/L
(diagnonal) von L-bcl-2 wurden zu Johnson-, Jurkat-, Raji- und Daudi-Zellen
zugesetzt. Nach 5 Tagen wurde die Lebendigkeit der Tumorzellen mittels
alamarBlue-Farbstoff gemessen. Die Lebendigkeit wurde ausgedrückt als
Prozentsatz der unbehandelten Zellen.
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2:
Nicht-spezifische Toxizität
in 1 lymphoiden Zellen bei 6 μmol/L
an liposomalen Oligonukleotiden. Leere Liposomen (diagonal) und
zwei verschiedene liposomale Kontrolloligonukleotide („L-Kontroll-Oligos") (grau, schwarz)
wurden zu Johnson-, Jurkat-, Raji- und Daudi-Zellen zu 6 μmol/L als
Endkonzentration zugegeben. Nach 5 Tagen wurde die Lebendigkeit
der Tumorzellen mittels alamarBlue-Farbstoff gemessen. Die Lebendigkeit
wurde ausgedrückt
als Prozentsatz der unbehandelten Zellen.
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3:
Western-Blot-Analyse von Bcl-2-Protein in vier Zelllinien. Johnson-,
Jurkat-, Daudi- und
Raji-Zellen wurden in Probenpuffer lysiert und auf den Gesamtproteingehalt
normalisiert. Fünfundzwanzig Gramm
an Gesamtprotein wurden pro Spur geladen. Die Membranen wurden mit
einem monoklonalen Antikörper
aus Hamster gegen humanes Bcl-2 inkubiert. In Johnson-Zellen, eine Zelllinie,
die die t(14;18)-Translokation trägt, wurde die Überexpression
von Bcl-2-Protein
beobachtet. In Jurkat- und Raji-Zellen, denen die t(14;18)-Translokation
fehlt, ist die Expression von Bcl-2 niedrig. In Daudi-Zellen wurde
die Expression von Bcl-2 nicht beobachtet.
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4A & 4B:
Spezifische Inhibition des Bcl-2-Proteins in Johnson- und Jurkat-Zellen
mittels L-bcl-2.
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4A:
1 × 105 Johnson-Zellen/mL in 3 mL wurden mit 3
und 4 μmol/L
an L-bcl-2 oder L-Kontroll-Oligos
behandelt. Nach 3 Kulturtagen wurden Protein-enthaltende Lysate
zubereitet und 5 μg
an Gesamtprotein der SDS-PAGE unterworfen und auf Nitrozellulosemembranen übertragen.
Die Blots wurden in Abschnitte geschnitten und mit Antikörpern inkubiert,
die entweder für
Bcl-2 oder Aktin spezifisch sind (links). Um die Inhibition des
bcl-2-Proteins abzuschätzen,
wurden die Daten abgeschätzt
mittels Abtastungsdichtemessung quantifiziert und als Verhältnis von
Bcl-2:Aktin ausgedrückt
(rechts). L-bcl-2: gefüllte
Quadrate); L-Kontrolle: (offene Kreise).
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4B:
1 × 105 Jurkat-Zellen/mL in 3 mL wurden mit 3 und
4 μmol/L
an L-bcl-2 oder L-Kontroll-Oligonukleotiden
behandelt. Nach 3 Kulturtagen wurden Protein-enthaltende Lysate
zubereitet und 20 μg
an Gesamtprotein der SDS-PAGE unterworfen und auf Nitrozellulosemembranen übertragen.
Die Blots wurden in Abschnitte geschnitten und mit Antikörpern inkubiert,
die entweder für
Bcl-2 oder Aktin spezifisch sind (links). Um die Inhibition des
bcl-2-Proteins abzuschätzen,
wurden die Daten mittels Abtastungsdichtemessung quantifiziert und
als Verhältnis
von Bcl-2:Aktin ausgedrückt
(rechts). L-bcl-2: (gefüllte
Quadrate); L-Kontrolle: (offene Kreise).
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5:
Western-Blot-Analyse des Bax-Proteins in den vier Zelllinien. Johnson-,
Jurkat-, Daudi- und
Raji-Zellen wurden in Probenpuffer lysiert und auf Gesamtproteingehalt
normalisiert. Fünfzig μg an Gesamtprotein
wurden pro Spur geladen. Die Membranen wurden mit polyklonalem Antikörper aus
dem Kaninchen gegen humanes Bax inkubiert.
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6A & 6B:
Das Bcl-2/Bax-Verhältnis
wird in Johnson-Zellen durch L-bcl-2 verringert.
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6A:
1 × 105 Johnson-Zellen/mL in 3 mL wurden mit 2,
3 und 4 μmol/L
an L-bcl-2- oder L-Kontroll-Oligos
behandelt. Nach 3 Kulturtagen wurden die proteinhaltigen Lysate
SDS-PAGE unterworfen und auf Nitrozellulosemembranen übertragen.
Die Blots wurden in Abschnitte geschnitten und mit Antikörpern inkubiert,
die entweder für
Bax oder Aktin spezifisch waren. Dieses Experiment wurde durchgeführt unter
Verwendung der gleichen Lysate, die in dem in 4A und 4B gezeigten
Experiment erhalten wurden.
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6B:
Die Daten wurden mittels Abtastungsdichtemessung quantifiziert und
als Verhältnis
von Bcl-2:Bax ausgedrückt.
L-bcl-2: (gefüllte
Quadrate); L-Kontroll-Oligo: (offene Kreise).
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7:
DNA-Fragmentierung in Johnson-Zellen, die mit L-bcl-2 inkubiert
wurden. Johnson-Zellen
wurden mit 4 μmol/L
an L-bcl-2 und zwei L-Kontroll-Oligos inkubiert. Nach 3 Inkubationstagen
wurde die DNA extrahiert, durch ein 2 %-iges Agarosegel elektrophoretisch
aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Spuren 1, unbehandelte
Zellen; Spur 2, Zellen, die mit L-Kontroll-(durcheinander) Oligo
behandelt wurden; Spur 3, Zellen, die mit L-Kontroll-(Zufalls)Oligo behandelt
wurden; Spur 4, Zellen, die mit L-bcl-2 behandelt wurden.
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8A & 8B:
Apoptotische Johnson-Zellen, die mit L-bcl-2 inkubiert wurden.
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8A:
Fluoreszenzaufnahme von Johnson-Zellen, die mit dem DNA-Bindefarbstoff
Acridin Orange nach 3 Inkubationstagen mit 5 μmol/L an L-bcl-2 (rechts) oder
ohne liposomale Oligonukleotide („L-OS") (links) eingefärbt wurden.
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8B:
Apoptotischer Index von Johnson-Zellen, die mit 4 und 5 μM an L-bcl-2
(Punkte) L-Kontroll-Oligo
(horizontal) oder leeren Liposomen (durchgehend) behandelt wurden.
Apoptotischer Index = (Gesamtanzahl an Zellen mit apoptotischen
Nuklei/Gesamtanzahl an gezählten
Zellen) × 100
%.
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9A & 9B:
Bewertung des Zelltodes infolge von Bestrahlung einer LNCaP-Kontrolle
und bcl-2-transfizierter Zellen.
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9A:
Fluoreszenz-mikroskopische Bewertung der Zelltodinduktion infolge
von Bestrahlung einer LNCaP-Kontrolle und bcl-2-transfizierter Zellen
(LNCaP-bcl-2). Unbehandelte Kontrolle (oben links), LNCaP-bcl-2-Zellen
unbehandelt (unten links), Kontroll-Zellen 24 Stunden nach γ-Bestrahlung mit 20
Gy (oben rechts) und LNCaP-bcl-2-Zellen 24 Stunden nach Bestrahlung
(unten rechts). Die Zellen wiesen die charakteristischen Merkmale
der Apoptose auf, die im Allgemeinen in dieser Kontrolle beobachtet
werden, aber nicht in LNCaP-bcl-2-Zellen nach Bestrahlung.
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9B:
Durchflusszytrometrische Analyse der Zelltodinduktion infolge von
20 Gy an γ-Strahlung in LNCaP-Zellen.
Apoptotische Zellen umfassen ungefähr 30 % der LNCaP-Vektorkontrollzellpopulation
8 Stunden nach Bestrahlung und < 5
% der nicht-bestrahlten LNCaP-bcl-2-Zellen.
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10A & 10B & 10C: p53-Induktion, subzelluläre Lokalisation und Transkriptionskontrolle.
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10A: Western-Blot-Analyse der Induktion des p53-Proteins
und nukleärer
Import infolge von γ-Bestrahlung
in LNCaP-Kontrollzellen und LNCaP-bcl-2-Zellen. Subkonfluente Kulturen
von Kontroll-LNCaP- und LNCaP-bcl-2-Zellen wurden mit 20 Gy bestrahlt.
Gesamtzell- oder Kernextrakte, die aus ganzen Zellen isoliert wurden,
wurden 2 und 4 h nach Bestrahlung zubereitet. Äquivalente Mengen an Lysat
wurden mittels Immunblots mit p53-Antikörper (Santa Cruz) analysiert.
Entsprechende Abtastungsdichtemessungen zeigten an, dass die Menge
an p53- Protein,
die infolge von Bestrahlung induziert wurde, ungefähr äquivalent
der in Gesamtzellextrakten von LNCaP-Kontroll- und LNCaP-bcl-2-Zellen
ist. Die Kernakkumulation von p53-Protein wird jedoch nur in den
Kernen beobachtet, die von bestrahlten LNCaP-Kontrollzellen isoliert wurden.
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10B: Konfokale Mikroskopieanalyse der subzellulären Lokalisation
von p53 infolge von Bestrahlung. LNCaP-Kontroll-(links) und LNCaP-bcl-2-(rechts)Zellen
wurden mit 20 Gy bestrahlt, nach 4 Stunden fixiert, und das p53-Protein
wurde mittels abtastender Mikroskopie mit konfokalem Laser abgelichtet.
Die Kernlokalisation des p53-Proteins wird nur in den LNCaP-Kontrollzellen beobachtet.
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10C: Bcl-2-Inhibition der Transkriptionsaktivierung
durch wt-p53. NIH3T3-Zellen wurden mit dem Effektor-Wildtyp-(p53
WT) oder mutierten p53 (p53-MUT)-Plasmid (10 μg), Reporterplasmid P2mdm2-Luc
(4 μg) und β-Galaktosidase
(βgal) Expressionsplasmid
(3 μg) mit
oder ohne den bcl-2-Expressionsvektor (BCL-2) (20 μg) unter
Verwendung des Kalziumphosphatverfahrens transfiziert. Die Ko-Transfektion
mit leerem Effektorvektor (VECTOR) diente als eine Negativ-Kontrolle.
Die Daten stellen das Vielfache des Zuwachs an Luciferase-Aktivität dar. Bcl-2
inhibierte signifikant die Fähigkeit
des Wildtyp p53-Proteins, den mdm2-Promotor zu transaktivieren (*
p ≤ 0,02).
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11A & 11B: Herunterregulierung von bcl-2 in RKO-Darmkrebszellen
durch Antisense-Oligonukleotide und Lokalisierung von p53.
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11A: Selektive Herunterregulierung des bcl-2-Proteins
in RKO-Darmkrebszellen. Western-Blot von
Gesamtzellextrakten (40 μg)
wurden mittels Immunblot auf bcl-2-Protein analysiert. Eine gaphische
Darstellung der relativen Menge an bcl-2-Protein nach Normalisierung
auf die Proteinbeladung ist gezeigt. Behandlung mit Antisense-bcl-2-Oligonukleotiden,
aber nicht mit Kontroll-Oligonukleotiden oder leeren Liposomen resultierte
in einer Verringerung der Menge an bcl-2-Protein.
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11B: Konfokale Mikroskopie des p53-Proteins in
bestrahlten RKO-Zellen, die mit Kontroll-Oligonukleotiden (oben)
oder Antisense-bcl-2-Oligonukleotiden (unten) behandelt wurden.
Eine signifikante Kernlokalisation des p53-Proteins infolge von
Bestrahlung wird nur in den mit Antisense-bcl-2 behandelten RKO-Zellen
beobachtet.
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bcl-2
ist aufgrund seiner Eigenschaft den programmierten Zelltod zu blockieren
ein Onkogen mit tumorogenem Potenzial. Die vorliegende Erfindung
setzt liposomale Antisense-Oligodesoxynukleotide
ein, um die Herstellung von Bcl-2 zu inhibieren, so dass die Tumorzellen
die Eigenschaft, in den programmierten Zelltod einzutreten, zurückerhalten.
Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um hämatologische
bösartige
Erkrankungen, sowohl Leukämien
als auch Lymphome, einschließlich
follikulären
und nicht-follikullären Lymphomen,
chronisch lymphozytische Leukämie,
und Plasmazelldyskrasien, feste Tumoren, wie jene, die mit Brust-,
Prostata- und Darmkrebs assoziiert sind, und Immunstörungen,
die mit Bcl-2-Expression
assoziiert sind, zu behandeln. Solche Erkrankungen würde jene
einschließen,
die Zellen einbeziehen, die Bcl-2 überexprimieren, oder auf hohem
Niveau exprimieren, und die auch Bax exprimieren.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die Antisense-Oligonukleotide
und Polynukleotide, die gegen Teile des bcl-2-Gens gerichtet sind,
umfassen, und deren Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen,
die mit Bcl-2 in Verbindung stehen. Eine spezifische Krebsart, die
mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
behandelt werden kann, ist FL. Über
90 % der Patienten mit follikulärem
Lymphom haben eine t(14;18)-Translokation, die in der Translokation
des bcl-2-Gens von seinem normalen Ort auf Chromosom 18 in den Genlokus
der schweren Immunglobulinkette auf Chromosom 14 resultiert. Als
Konsequenz davon gerät
das bcl-2-Gen unter den Einfluss des Enhancers der schweren Immunglobulinkette,
und das Bcl-2-Protein
wird überexprimiert.
Da bcl-2 ein Onkogen mit tumorogenem Potenzial ist aufgrund seiner Eigenschaft,
den programmierten Zelltod zu blockieren, ist eine potenzielle Therapie
für diese
follikulären
Lymphome, die Herstellung des Bcl-2-Proteins zu inhibieren. Die
vorliegende Erfindung hofft erfolgreich zu sein, wo andere Herangehensweisen
versagt haben, indem stabile, Nuklease-resistente Antisense-Oligonukleotide, die
spezifisch für
das erste offene Leseraster, und noch spezifischer für die Translationsinitiationsstelle
der Bcl-2 mRNA sind, für
die Zufuhr an die Zelle in neutrale Liposomen eingebaut werden,
um die Herstellung des Bcl-2-Proteins zu inhibieren.
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Insbesondere
wird in Erwägung
gezogen, dass durch die Verwendung dieser Antisense-Moleküle, entweder
alleine oder in Verbindung mit anderen Antisense-Molekülen, es
möglich
ist, FL und möglicherweise
andere Bcl-2-Krebse wirksam zu behandeln. Beispielsweise inhibieren
liposomale bcl-2-Antisense-Oligonukleotide, wie hierin gezeigt (L-bcl-2),
das Wachstum von FL-Zellen und anderen Zellen, die das Bcl-2-Protein überexprimieren.
In der Ausübung
der Erfindung können
die Oligo- oder Polynukleotide selbst oder Expressionsvektoren,
die dafür
kodieren, eingesetzt werden. Das bevorzugte Verfahren der Zufuhr
dieser Nukleinsäuren ist über Liposomen,
und insbesondere über
Liposomen, die aus neutralen Lipiden bestehen. Die Erfindung wird,
in ihren verschiedenen Ausführungsformen,
unten in größerem Detail
beschrieben.
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A. Polynukleotide und
Oligonukleotide
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Der
Begriff „Antisense" soll sich auf Polynukleotidmoleküle beziehen,
die komplementär
zu einem Teil der Bcl-2-RNA oder der damit korrespondierenden DNA
komplementär
sind. „Komplementäre" Polynukleotide sind
jene, die in der Lage sind, gemäß den Standardkomplementaritätsregeln
von Watson-Crick Basenpaarungen einzugehen. Das bedeutet, das größere Purine
mit den kleineren Pyrimidinen Basenpaarungen eingehen, um Kombinationen
von Guanin gepaart mit Cytosin (G:C) und Adenin gepaart mit entweder
Thymin (A:T) im Fall von DNA oder Adenin gepaart mit Uracil (A:U)
im Fall von RNA zu bilden. Das Einbeziehen von weniger gebräuchlichen
Basen wie Inosin, 5-Methylcytosin, 6-Methyladenin, Hypoxanthin und
anderen hybridisierenden Sequenzen kann bestimmte Vorteile in einigen
Fällen
bieten und stört
nicht die Paarung.
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Das
Ansteuern von doppelsträngiger
(ds) DNA mit Polynukleotiden führt
zur Bildung einer Dreifach-Helix; das Ansteuern von RNA wird zur
Bildung einer Doppelhelix führen.
Antisense-Polynukleotide
binden, wenn sie in eine Zielzelle eingeführt werden, spezifisch an ihr
Zielpolynukleotid und stören
die Transkription, die RNA-Prozessierung, den Transport, die Translation
und/oder die Stabilität.
Antisense-RNA-Konstrukte, oder eine DNA, die solche Antisense-RNAs
kodiert, können
eingesetzt werden, um die Gentranskription oder translation oder
beides innerhalb einer Wirtszelle zu inhibieren, entweder in vitro
oder in vivo, beispielsweise in einem Wirtstier, einschließlich einem
Menschen.
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Die
intrazelluäre
Konzentration einwertiger Kationen beträgt ungefähr 160 mM (10 mM Na+; 150 mM K+. Die
intrazelluäre
Konzentration von zweiwertigen Kationen beträgt ungefähr 20 mM (18 mM Mg+;
2 mM Ca++). Die intrazelluäre Proteinkonzentration,
die dazu dienen würde,
das Hybridisierungsvolumen zu verringern und daher die wirksame
Konzentration der Nukleinsäurespezies
zu erhöhen,
beträgt
150 mg/ml. Die Konstrukte können
in vitro unter Bedingungen getestet werden, die diese in vivo-Bedingungen
nachahmen.
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Antisense-Konstrukte
können
entworfen werden, um an den Promotor und andere Kontrollbereich, Exons,
Introns oder sogar Exon-Intron-Grenzen eines Gens zu binden. Es
wird erwogen, dass die wirksamsten Antisense-Konstrukte für die vorliegende
Erfindung Bereiche einschließen
werden, die komplementär
zur mRNA-Startstelle sind. Man kann solche Konstrukte einfach testen,
indem man einfach die Konstrukte in vitro testet, um zu bestimmen,
ob die Konzentrationen des Zielproteins beeinflusst werden. Solch
eine Überprüfung kann
durchgeführt
werden mittels des Transfers nackter Polynukleinsäuremoleküle in die
Zelle über
verschiedene Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind, oder
indem zuerst die Nukleinsäuremoleküle mit einem
oder mehreren Lipiden assoziiert werden. In ähnlicher Weise kann auch die
nachteilige nicht-spezifische Inhibition der Proteinsynthese durch
Bestimmung der Lebendigkeit der Zielzellen in vitro gemessen werden.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnen die Begriffe „komplementär" oder „Antisense" Polynukleotide,
die im Wesentlichen über
ihre gesamte Länge
komplementär
sind und nur sehr wenige Basenfehlpaarungen aufweisen. Beispielsweise
können
Sequenzen mit einer Länge
von 15 Basen komplementär
genannt werden, wenn sie ein komplementäres Nukleotid für 13 oder
14 Positionen von 15 haben. Natürlich
werden Sequenzen, die „vollständig komplementär" oder „Komplementäre voller
Länge" sind, Sequenzen
sein, die über
ihre gesamte Länge
vollständig
komplementär
sind und keine Basenfehlpaarungen aufweisen.
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Andere
Sequenzen mit einem geringeren Homologiegrad werden ebenfalls erwogen.
Beispielsweise könnte
ein Antisense-Konstrukt entworfen werden, dass beschränkte Bereiche
hoher Homologie hat, aber ebenfalls einen nicht-homologen Bereich
(z.B. ein Ribozym) beinhaltet. Diese Moleküle würden, obwohl sie weniger als
50 % Homologie haben, an die Zielsequenzen unter geeigneten Bedingungen
binden.
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Die
oben beschriebenen Polynukleotide können ein bcl-2-Gen kodieren
oder einen Teil des Gens, der ausreichend ist, um die Antisense-Inhibierung
der Proteinexpression zu bewirken. Die Polynukleotide können von
genomischer DNA abgeleitet werden, d.h. direkt aus dem Genom eines
bestimmten Organismus kloniert werden. In anderen Ausführungsformen
können
die Polynukleotide jedoch komplementäre DNA (cDNA) sein. cDNA ist
DNA, die zubereitet wird unter Verwendung von Boten-RNA (mRNA) als
Matrize. Daher enthält
eine cDNA nicht alle unterbrochenen Kodierungssequenzen und enthält normalerweise
beinahe ausschließlich
den (die) kodierende Bereich(e) für das korrespondierende Protein.
In anderen Ausführungsformen
kann das Antisense-Polynukleotid synthetisch hergestellt werden.
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Es
kann vorteilhaft sein, Teile der genomischen DNA mit cDNA oder synthetischen
Sequenzen zu kombinieren, um spezifische Konstrukte zu erzeugen.
Beispielsweise wird man da, wo im Endkonstrukt ein Intron gewünscht ist,
einen genomischen Klon verwenden müssen. Die cDNA oder ein synthetisiertes
Polynukleotid kann praktischere Restriktionsschnittstellen für den verbleibenden
Teil des Konstrukts zur Verfügung stellen
und würde
daher für
den Rest der Sequenz verwendet werden.
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Die
DNA- und Proteinsequenzen für
Bcl-2 sind in der Literatur durch Tsujimoto und Croce veröffentlicht worden
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5214, 1986) (SEQ ID NO:4, SEQ ID
NO:5, SEQ ID NO:6 & SEQ
ID NO:7). Es wird erwogen, dass natürliche Varianten von Bcl-2
existieren, die andere Sequenzen haben, als die darin offenbarten.
Daher ist die vorliegende Erfindung nicht beschränkt auf die Verwendung der
zur Verfügung gestellten
Polynukleotidsequenz für
Bcl-2, sondern schließt
vielmehr die Verwendung aller natürlich vorkommenden Varianten
mit ein. In Abhängigkeit
von der bestimmten Sequenz solcher Varianten können sie zusätzliche
Vorteile hinsichtlich der Zielselektivität, d.h. dem Vermeiden von Antisense-Inhibition
verwandter Transkripte, zur Verfügung
stellen. Die vorliegende Erfindung umfasst auch chemisch synthetisierte
Mutanten dieser Sequenzen.
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Wie
oben festgehalten, können
die Antisense-Sequenzen, obwohl sie die genomische Information der vollen
Länge haben
oder cDNA-Kopien oder größere Fragmente
davon sein können„ auch
kürzere
Fragmente sein, oder „Oligonukleotide", die hierin als
Polynukleotide von 50 oder weniger Basen definiert sind. Obwohl kürzere Oligomere
(8-20) einfacher zu machen sind und die in vivo Zugänglichkeit
erhöhen,
sind zahlreiche andere Faktoren an der Bestimmung der Spezifität der Basenpaarung
beteiligt. Beispielsweise steigen sowohl die Bindungsaffinität als auch
die Sequenzspezifität
eines Olignukleotids für
sein komplementäres
Ziel mit zunehmender Länge.
Es wird erwogen, dass Oligonukleotide aus 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Basenpaaren
oder größer verwendet
werden können.
Während
die gesamte oder ein Teil der Gensequenz im Rahmen der Antisense-Konstruktion
eingesetzt werden kann, sollte statistisch jede Sequenz einer Länge von
17 Basen nur einmal im menschlichen Genom auftreten und daher ausreichend
sein, um eine einzigartige Zielsequenz zu spezifizieren.
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In
bestimmten Ausführungsformen
wird man wünschen,
Antisense-Konstrukte einzusetzen, die andere Elemente einschließen, beispielsweise
jene, die C-5 Propyne-Pyrimidin mit einschließen. Für Oligonukleotide, die C-5
Propyne-Analoga von Uridin und Cytidin enthalten, wurde gezeigt,
dass sie an RNA mit hoher Affinität binden und leistungsfähige Antisense-Inhibitoren
der Genexpression sind (Wagner et al., 1993). In der Ausübung der
Erfindung können
derivatisierte Polynukleotide oder Phosphodiester-Analoga wie p-Ethoxy- oder
Methylphosphonat-Oligonukleotide
verwendet werden. Solche Polynukleotide können bestimmte Vorteile bieten,
beispielsweise Nukleaseresistenz. Es ist die Entdeckung der vorliegenden
Erfinder, dass p-Ethoxy-Oligonukleotide,
die hydrophob sind, auch vorteilhaft darin sind, dass sie effizienter
in Liposomen eingebaut werden.
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Als
Alternative zur gezielten Antisense-Zufuhr können gezielt Ribozyme verwendet
werden. Der Ausdruck „Ribozym" bezieht sich auf
ein RNA-basiertes Enzym, das in der Lage ist, bestimmte Basensequenzen in
sowohl DNA als auch RNA anzusteuern und zu spalten. Ribozyme können entweder
direkt auf Zellen ausgerichtet werden in Form von RNA-Oligonukleotiden
mit eingebauten Ribozymsequenzen, oder in die Zelle als Expressionsvektor,
der für
die gewünschte
ribosomale RNA kodiert, eingeführt
werden. Ribozyme können
in nahezu der gleichen Weise wie für das Antisense-Polynukleotid
beschrieben verwendet und angewendet werden. Ribozymsequenzen können auch
in nahezu derselben Weise wie das Antisense-Polynukleotid modifiziert werden.
Beispielsweise könnte
man nicht-Watson-Crick-Basen einbauen, oder gemischte RNA/DNA-Oligonukleotide
machen, oder das Phophodiesterrückgrat
modifizieren.
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Alternativ
können
die Antisense-Oligo- und Polynukleotide, die oben beschrieben wurden,
auch als mRNA über
die Transkription von Expressionskonstrukten zur Verfügung gestellt
werden, die Nukleinsäuren tragen,
die für
die Oligo- oder Polynukleotide kodieren. Über diese ganze Anmeldung hinweg
soll der Ausdruck „Expressionskonstrukt" jeden Typ an genetischem
Konstrukt mit einschließen,
der eine Nukleinsäure
beinhaltet, der für
ein Antisense-Produkt kodiert, indem ein Teil oder die gesamte Nukleinsäuresequenz
in der Lage ist, transkribiert zu werden. Typische Expressionsvektoren
schließen
bakterielle Plasmide oder Phagen beispielsweise eines/einer aus
der pUC- oder BluescriptTM-Plasmidserie
oder wie weiter unter diskutiert wird, virale Vektoren, die für die Verwendung
in eukaryotischen Zellen angepasst wurden, mit ein.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
kodieren die Nukleinsäuren
ein Antisense-Oligo- oder Polynukleotid unter der transkriptionellen
Kontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die
von der synthetischen Maschinerie der Zelle erkannt wird, oder in
die synthetische Maschinerie eingeführt wird, was notwendig ist,
um die spezifische Transkription eines Gens zu initiieren. Der Ausdruck „unter
transkriptioneller Kontrolle" meint,
dass der Promotor am richtigen Ort und in der richtigen Orientierung
sich relativ zur Nukleinsäure
befindet, um die RNA-Polymeraseinitiation zu kontrollieren.
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Der
Begriff Promotor wird hier verwendet werden, um sich auf eine Gruppe
von transkriptionellen Kontrollmodulen zu beziehen, die rund um
die Initiationsstelle für
die RNA-Polymerase
II gehäuft
vorliegen. Viel von dem, wie man denkt, dass Promotoren organisiert
sind, leitet sich von Analysen von mehreren viralen Promotoren einschließlich jener
für die
HSV-Thymidinkinase (tk) und den frühen Transkriptionseinheiten
von SV40 ab. Diese Studien, verstärkt durch kürzliche Arbeiten, haben gezeigt,
dass sich Promotoren aus unabhängigen funktionalen
Modulen zusammensetzen, von denen jedes aus ungefähr 7-20
bp an DNA besteht, und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionelle
Aktivator- oder Repressorproteine enthält.
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Mindestens
ein Modul in jedem Promotor hat die Funktion, die Startstelle für die RNA-Synthese
zu positionieren. Das bekannteste Beispiel dafür ist die TATA-Box, aber in
einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, beispielsweise der
Promotor für
das terminale Deoxynukleotidyltransferase-Gen in Säugetieren und
der Promotor für
die späten
Gene von SV40, hilft ein einzelnes Element, das über der Startstelle selbst liegt,
den Platz für
die Initiation festzulegen.
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Zusätzliche
Promotorelemente regulieren die Frequenz der transkriptionellen
Initiation. Typischerweise befinden sich diese im Bereich 30-110
by stromaufwärts
der Startstelle, obwohl für
eine Anzahl von Promotoren kürzlich
gezeigt wurde, dass sie funktionelle Elemente stromabwärts der
Startstelle ebenfalls enthalten. Der Abstand zwischen den Promotorelementen
ist häufig
flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten wird, wenn die Elemente
invertiert oder relativ zu einander bewegt werden. Im tk-Promotor
kann der Abstand zwischen dem Promotorelementen auf 50 by voneinander
erhöht
werden, bevor die Aktivität
abzunehmen beginnt. In Abhängigkeit
vom Promotor erscheint es so, dass individuelle Elemente entweder
kooperativ oder unabhängig
voneinander wirken können,
um die Transkription zu aktivieren.
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Der
jeweilige Promotor, der eingesetzt wird, um die Expression einer
Nukleinsäure
zu kontrollieren, die für
ein inhibitorisches Peptid kodiert, wird nicht als wichtig erachtet,
solange er in der Lage ist, das Peptid in der angesteuerten Zelle
zu exprimieren. Daher ist es doch da, wo eine menschliche Zelle
angesteuert werden soll, bevorzugt, die Nukleinsäure, die für das inhibitorische Peptid
kodiert, benachbart zu und unter Kontrolle eines Promotors zu positionieren,
der in der menschlichen Zelle aktiv ist. Allgemein gesprochen könnte solch ein
Promotor entweder einen humanen oder einen viralen Promotor einschließen.
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In
verschiedenen Ausführungsformen
kann der Promotor des menschlichen Cytomegalievirus (CMV) für die unmittelbaren
frühen
Gene verwendet werden, der frühe
Promotor von SV40 und die lange terminale Wiederholung des Rous-Sarkomavirus,
um eine Expression verschiedener Proteine auf hohem Niveau zu erhalten.
Die Verwendung von anderen viralen oder Säugetier-, zellulären oder
bakteriellen Phagenpromotoren, die im Stand der Technik gut bekannt
sind, um Expression der oben beschriebenen Peptide zu erreichen,
wird ebenfalls in Erwägung
gezogen, vorausgesetzt, dass die Expressionsniveaus für einen
gegebenen Zweck ausreichend sind.
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Durch
das Einsetzen eines Promotors mit bekannten Eigenschaften, kann
das Niveau und Muster der Expression eines Antisense-Oligo- oder
Polynukleotids optimiert werden. Des Weiteren kann die Auswahl eines
Promotors, der in Reaktion auf spezifische physiologische Signale
reguliert wird, die induzierbare Expression eines inhibitorischen
Proteins erlauben. Beispielsweise resultiert eine Nukleinsäure unter
Kontrolle des humanen PAI-1-Promotors in einer Expression, die durch
Tumornekrosefaktor induzierbar ist. Die Tabellen 1 und 2 listen
mehrere Elemente/Promotoren auf, die im Rahmen der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden können,
um die Expression von Antisense-Konstrukten zu regulieren. Diese
Liste soll nicht erschöpfend
für alle möglichen
Elemente sein, die an der Förderung
der Expression beteiligt sind sondern bloß beispielhaft dafür sein.
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Enhancer
wurden ursprünglich
nachgewiesen als genetische Elemente, die die Transkription von
einem Promotor, der sich an einer entfernten Position auf demselben
DNA-Molekül
befindet, erhöhten.
Diese Eigenschaft, über
eine große
Distanz zu wirken, hatte wenig Präzedenz in den klassischen Studien
der prokaryotischen transkriptionellen Regulation. Sich daran anschließende Arbeiten
zeigten, dass der DNA-Bereich mit Enhanceraktivität sehr ähnlich wie
die Promotoren organisiert ist. D.h. sie setzen sich aus vielen
individuellen Elementen zusammen, von denen jedes an eines oder
mehrere transkriptionelle Proteine bindet.
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Die
Grundunterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist in der
Wirkung bedingt. Ein Enhancerbereich als Ganzes muss in der Lage
sein, die Transkription über
eine Distanz zu stimulieren; das muss nicht auf einen Promotorbereich
oder seine Bestandteilselemente zutreffen. Auf der anderen Seite
muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die die Initiation
der RNA-Synthese an eine bestimmte Stelle lenken und eine bestimmte
Orientierung, wohingegen Enhancern diese Spezifitäten fehlen.
Promotoren und Enhancer überlappen
oft und sind benachbart, wobei sie oft eine sehr ähnliche
modulare Organisation zu haben scheinen.
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Weiter
unten ist eine Liste an viralen Promotoren, zellulären Promotoren/Enhancern
und induzierbaren Promotoren/Enhancern, die in Kombination mit der
Nukleinsäure,
die für
ein NF-IL6-inhibitorisches
Peptid in einem Expressionskonstrukt kodiert, verwendet werden könnten (Tabelle
1 und Tabelle 2). Darüber
hinaus könnte
jede Promotor/Enhancer-Kombination (gemäß der Datenbank EPDB für eukaryotische
Promotoren) ebenfalls verwendet werden, um die Expression einer
oben beschriebenen Nukleinsäure
anzutreiben. Die Verwendung eines T3, T7 oder SP6 zytoplasmatischen
Expressionssystems ist eine weitere mögliche Ausführungsform. Eukaryotische Zellen
können
die zytoplasmatische Transkription von bestimmten bakteriellen Promotoren
unterstützen,
wenn die geeignete bakterielle Polymerase zur Verfügung gestellt
wird, entweder als Teil des Zufuhrkomplexes oder als zusätzliches
genetisches Expressionskonstrukt.
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In
bestimmten Ausführungsformen
dieser Erfindung kann die Zufuhr einer Nukleinsäure an eine Zelle in vitro
oder in vivo durch das Einbeziehen eines Markers in das Expressionskonstrukt
identifiziert werden. Der Marker würde in einer identifizierbaren
Veränderung
der transfizierten Zelle resultieren, was die einfache Identifizierung
der Expression gestattet. Enzyme wie die Thymidinkinase (tk) des
Herpes simplex Virus (eukaryotisch) oder die Chloramphenicolacetyltransferase
(CAT) (prokaryotisch) können
verwendet werden.
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Man
kann auch ein Polyadenylierungssignal mit einschließen, um
die richtige Polyadenylierung des Transkripts zu bewirken. Die Natur
des Polyadenylierungssignals wird nicht als kritisch für die erfolgreiche Durchführung der
Erfindung angesehen, und jede solche Sequenz kann eingesetzt werden.
Beispiele schließen
die Polyadenylierungssignale von SV40, Globin oder Adenovirus mit
ein. Ebenfalls als Element der Expressionskassette in Erwägung gezogen
wird ein Terminator. Diese Elemente können dazu dienen, die Konzentrationen
der Botschaft zu verstärken
und das Durchlesen aus der Kassette in andere Sequenzen zu minimieren.
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B. Lipidformulierungen
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Die
oben beschriebenen Antisense-Oligo- oder Polynukleotide und Expressionsvektoren
sind mit einem Lipid assoziiert. Ein Polynukleotid, das mit einem
Lipid assoziiert ist, kann in dem wässrigen Inneren eines Liposoms
verkapselt sein, innerhalb der Lipiddoppelschicht eines Liposoms
verteilt sein, an ein Liposom über ein
verbindendes Molekül,
das sowohl mit dem Liposom als auch dem Polynukleotid assoziiert
ist, angeheftet sein, in einem Liposom eingesperrt sein, innerhalb
eines Liposoms komplexiert sein, in einer Lösung, die ein Lipid enthält, verteilt
sein, mit einem Lipid gemischt sein, mit einem Lipid kombiniert
sein, in einer Suspension mit einem Lipid enthalten sein, enthalten
oder komplexiert sein mit einer Mizelle, oder auf andere Weise mit einem
Lipid assoziiert sein. Die Lipid- oder Lipid/Oligonukleotidassoziierten
Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind nicht beschränkt auf
irgendeine besondere Struktur in Lösung. Beispielsweise können sie
in einer Doppelschichtstruktur vorliegen, als Mizellen, oder in
einer „kollabierten" Struktur. Sie können auch
einfach in einer Lösung
verteilt sein, möglicherweise
Aggregate bilden, die entweder nach Größe oder Gestalt nicht einheitlich
sind. Die Lipide können
in Form von Liposomen, die im Stand der Technik bekannt sind als
multilamelare Vesikel, als kleine oder große unilamelare Vesikel oder
als andere Typen von im Stand der Technik bekannten Vesikeln vorliegen.
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Lipide
sind fettige Substanzen, die natürlich
auftretende oder synthetische Lipide sein können. Beispielsweise schließen Lipide
die fettigen Tropfen mit ein die natürlicherweise im Zytoplasma
auftreten, als auch die Verbindungsklassen, die dem Fachmann gut
bekannt sind, die langkettige aliphatische Kohlenwasserstoffe und
deren Derivate enthalten, beispielsweise Fettsäuren, Alkohol, Amine, Aminoalkohole,
und Aldehyde. Ein Beispiel ist das Lipid Dioleoylphosphatidylcholin.
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„Liposom" ist ein generischer
Ausdruck, der eine Vielzahl an Einzel- und multilamelaren Lipidvehikeln einschließt, die
durch die Generierung von geschlossenen Lipiddoppelschichten oder
Aggregaten gebildet werden. Liposomen können so charakterisiert werden,
dass sie vesikuläre
Strukturen mit einer Phospholipiddoppelschichtmembran und ein inneres
wässriges
Medium haben. Multilamelare Liposomen haben multipe Lipidschichten,
die durch wässriges Medium
von einander abgetrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide
in einem Überschuss
an wässriger
Lösung
suspendiert werden. Die Lipidbestandteile vollziehen eine Selbstneuanordnung
vor der Bildung von geschlossenen Strukturen und sperren Wasser
und gelöste
Substanzen zwischen den Lipiddoppelschichten ein (Ghosh und Bachhawat,
In: Wu G. Wu C Hrsg. Liver diseases, targeted diagnosis and therapy
using specificreceptors and ligands, New York: Marel Dekker, S.
87-104, 1991). Die vorliegende Erfindung umfasst jedoch auch Zusammensetzungen,
die andere Strukturen in Lösung
haben, als normale vesikuläre
Strukturen. Beispielsweise können
die Lipide eine Mizellenstruktur annehmen oder einfach nur als nichteinheitliche
Aggregate von Lipidmolekülen
existieren. Ebenfalls erwogen werden Lipofectamin-Nukleinsäurekomplexe.
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Liposomen-vermittelte
Polynukleotidzufuhr und Expression fremder DNA in vitro ist sehr
erfolgreich gewesen. Wong et al. (Gene, 10:87–94, 1980) zeigten die Machbarkeit
der Liposomen-vermittelten Zufuhr und Expression fremder DNA in
kultivierten Hühnerembryo-,
HeLa- und Hepatomenzellen. Nicolau et al., (Methods Enzymol., 149:157–176, 1987)
erreichten den erfolgreichen Liposomen-vermittelten Gentransfer
in Ratten nach intravenöser
Injektion.
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In
bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung kann das Lipid mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ)
assoziiert sein. Dafür
ist gezeigt worden, dass es die Fusion mit der Zellmembran erleichtert
und den Eintritt in die Zelle von Liposomen-verkapselter DNA fördert (Kaneda
et al., Science, 243:375–378,
1989). In anderen Ausführungsformen
kann das Lipid komplexiert sein oder in Verbindung mit nukleären nicht-Histon chromosomalen
Proteinen (HMG-1) eingesetzt werden (Kato et al., J. Biol. Chem.,
266:3361–3364,
1991). In noch weiteren Ausführungsformen
kann das Lipid komplexiert sein oder in Verbindung mit sowohl HVJ
als auch HMG-1 eingesetzt werden. Insofern solche Expressionsvektoren
erfolgreich beim Transfer und der Expression eines Polynukleotids
in vitro und in vivo eingesetzt wurden, sind sie auch für die vorliegende
Erfindung anwendbar. Wo ein Bakterienpromotor im DNA-Konstrukt eingesetzt
wird, wird es auch wünschenswert
sein, innerhalb des Liposoms eine geeignete Bakterienpolymerase
einzuschließen.
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Neutrale
Phospholipide werden für
die Zubereitung der Liposomen verwendet.
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Lipide,
die geeignet für
die Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung sind, können
von kommerziellen Quellen erhalten werden. Beispielsweise kann Dimyristylphosphatidylcholin („DMPC") von Sigma Chemical
Co. erhalten werden, Dicetylphosphat („DCP") erhält man von K & K Laboratories
(Plainview, NY); Cholesterin („Chol") erhält man bei
Calbiochem-Behring; Dimyristoylphosphatidylglycerin ("DMPG") und andere Lipide
können
von Avanti Polar Lipids. Inc. (Birmingham, Ala) erhalten werden.
Lipidvorratslösungen
in Chloroform oder Chloroform/Methanol können bei ungefähr 20°C gelagert
werden. Vorzugsweise wird Chloroform als das einzige Solvens verwendet,
da es leichter verdampfbar ist als Methanol.
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Phospholipide
aus natürlichen
Quellen wie das Phosphatidylcholin aus dem Ei oder der Sojabohne, phosphatidische
Säure („phosphatidic
acid") des Gehirns,
Phosphatidylinositol des Gehirns oder aus der Pflanze, Kardiolipin
des Herzens und Phosphatidylethanolamin aus Pflanzen oder Bakterien
werden vorzugsweise nicht als das primäre Phosphatid verwendet, d.h.
stellen 50 % oder mehr der Gesamtphosphatidzusammensetzung dar,
aufgrund der Instabilität
und Durchlässigkeit
der resultierenden Liposomen.
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Liposomen,
die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, können über verschiedene
Verfahren hergestellt werden. Die Größe der Liposomen variiert in
Abhängigkeit
vom Syntheseverfahren. Ein Liposom, das in einer wässrigen
Lösung
suspendiert ist, liegt im Allgemeinen in Gestalt eines spherischen
Vesikels vor, mit einer oder mehreren konzentrischen Schichten an
Lipiddoppelschichtmolekülen.
Jede Schicht besteht aus einer parallelen Anordnung von Molekülen dargestellt
durch die Formel XY, wobei X ein hydrophiler Anteil und Y ein hydrophober
Anteil ist. In der wässrigen
Suspension sind die konzentrischen Schichten so angeordnet, dass
die hydrophilen Anteile dazu tendieren, in Berührung mit der wässrigen
Phase zu bleiben und die hydrophoben Bereiche dazu tendieren, selbst
miteinander zu assoziieren. Beispielsweise können die Lipidmoleküle, wenn
sowohl innerhalb als auch außerhalb
des Liposoms wässrige
Phasen vorliegen, eine Doppelschicht der Anordnung XY-YX bilden,
die als Lamelle bekannt ist. Lipidaggregate können sich bilden, wenn die
hydrophilen und hydrophoben Teile von mehr als einem Lipidmolekül miteinander
assoziieren. Die Größe und Gestalt
dieser Aggregate wird von vielen verschiedenen Variablen abhängen, beispielsweise
der Natur des Lösungsmittels
und dem Vorliegen von anderen Verbindungen in der Lösung.
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Liposomen
im Rahmen der vorliegenden Erfindung können zubereitet werden in Übereinstimmung
mit bekannten Labortechniken. In einer bevorzugten Ausführungsform
werden Liposomen durch das Mischen von liposomalen Lipiden in einem
Solvens in einem Container z.B. einem Glas, einem birnenförmigen Fläschchen zubereitet.
Der Container sollte ein Volumen aufweisen, dass 10-mal größer ist
als das Volumen der erwarteten Liposomensuspension. Unter Verwendung
eines Rotationsverdampfers wird das Lösungsmittel bei ungefähr 40°C unter negativem
Druck entfernt. Das Lösungsmittel
wird normalerweise innerhalb von ungefähr 5 Min. bis 2 Stunden entfernt,
abhängig
vom gewünschten
Volumen der Liposomen. Die Zusammensetzung kann in einem Desikator
unter Vakuum noch weiter getrocknet werden. Aufgrund einer Tendenz,
mit der Zeit schlechter zu werden, werden die getrockneten Lipide
im Allgemeinen nach ungefähr
einer Woche weggeworfen.
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Getrocknete
Lipide können
bei ungefähr
25–50
mM Phospholipid in sterilem, Pyrogen-freiem Wasser durch Schütteln hydratisiert
werden, bis der gesamte Lipidfilm resuspendiert ist. Die wässrigen
Liposomen können
dann in Aliquots aufgetrennt werden, von denen jedes in ein Fläschchen
platziert wird, lyophylisiert wird und unter Vakuum versiegelt wird.
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Alternativ
können
Liposomen in Übereinstimmung
mit anderen bekannten Laborvorgehensweisen zubereitet werden: Das
Verfahren von Bangham et al., (J. Mol. Biol., 13:238, 1965), das
Verfahren von Gregoriadis, wie es in DRUG CARRIERS IN BIOLOGY AND
MEDICINE, G. Gregoriadis Hrsg. (1979) S. 287–341 beschrieben ist, das Verfahren
von Deamer und Uster, (LIPOSOMES, M. Ostro Hrsg. 1983), und das
Reversphasenevaporationsverfahren wie von Szoka und Papahadjopoulos
(Proc. Nat'l Acad.
Sci. U.S.A. 75:4194–98, 1978)
beschrieben. Die zuvor erwähnten
Verfahren unterscheiden sich in ihren entsprechenden Fähigkeiten wässriges
Material einzusperren und ihren entsprechenden Verhältnissen
des wässrigen
Raums gegenüber dem
Lipid.
-
Die
getrockneten Lipide oder lyophilisierten Liposomen, die wie oben
beschrieben zubereitet wurden, können
dehydriert werden und in einer Lösung
inhibitorischen Peptids rekonstitiuiert werden und auf eine geeignete
Konzentration mit einem geeigneten Lösungsmittel z.B., DPBS verdünnt werden.
Das Gemisch wird dann heftig in einem Vortexmischer geschüttelt. Nichtverkapselte
Nukleinsäure
wird durch Zentrifugation bei 29000 × g entfernt und die lipsomalen
Pellets werden gewaschen. Die gewaschenen Liposomen werden in einer
geeigneten Gesamtphospholipidkonzentration, z.B. ungefähr 50–200 mM,
resuspendiert. Die Menge an verkapselter Nukleinsäure kann
in Übereinstimmung
mit Standardverfahren bestimmt werden. Nach Bestimmung der Menge
an verkapselter Nukleinsäure
in der Liposomenzubereitung können
die Liposomen auf geeignete Konzentrationen verdünnt werden und bei 4°C bis zur
Verwendung gelagert werden.
-
P-Ethoxy-Oligonukleotide,
Nuklease-resistente Analoga von Phosphodiestern, sind bevorzugt,
weil sie in Serum stabil sind und effektiv in das zelluläre Zytoplasma
transportiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Lipid Dioleoylphosphatidylcholin
eingesetzt. Es können
jedoch auch andere Lipide wie andere Phosphatidylcholine, Phosphatidylglycerine
und Phosphatidylethanolamine nützlich
sein. Nuklease-resistente Oligonukleotide werden mit den Lipiden
in Anwesenheit eines Überschusses
an t-Butanol vermischt. Das Gemisch wird gevortext bevor es in einem
Aceton/Trockeneisbad gefroren wird. Das gefrorene Gemisch wird lyophylisiert
und mit Hepes-gepufferter Saline (1 mM Hepes, 10 mM NaCl, pH 7,5) über Nacht
hydriert, und dann werden die Liposomen in einem Ultraschallwasserbad
für 10–15 Minuten
mit Ultraschall behandelt. Die Größe der liposomalen Oligonukleotide
liegt typischerweise im Bereich zwischen 200–300 nm im Durchmesser, was
mittels des Submicron Particle Sizer Autodilute Model 370 (Nicomp,
Santa Barbara, CA) bestimmt wurde.
-
C. Alternative Zufuhrsysteme
-
Retroviren.
-
Die
Retroviren sind eine Gruppe an einzelsträngigen RNA-Viren dadurch gekennzeichnet,
dass sie eine Fähigkeit
haben ihre RNA in doppelsträngige
DNA in infizierten Zellen über
einen Prozess der reversen Transkription umzusetzen (Coffin, In:
Virology, Fields et al. (Hrsg.), New York: Raven Press, S. 1437–1500, 1990).
Die resultierende DNA integriert dann stabil in die zellulären Chromosomen
als ein Provirus und steuert die Synthese der viralen Proteine.
Die Integration resultiert in der Zurückhaltung der viralen Gensequenzen
in der Empfängerzelle
und ihren Nachkommen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene – gag, pol
und env – die für Kapsidproteine,
Polymeraseenzym bzw. Hüllbestandteile
kodieren. Eine Sequenz, die man stromaufwärts des gag-Gens findet, genannt Ψ, wirkt
als Signal für
das Verpacken des Genoms in Virionen. Zwei lange terminale Wiederholungs(LTR)-Sequenzen
liegen am 5'- und
an den 3'-Enden
des viralen Genoms vor. Diese enthalten starke Promotor- und Enhancersequenzen
und werden auch für
die Integration in das Genom der Wirtszelle benötigt (Coffin, 1990).
-
Um
einen retroviralen Vektor zu konstruieren wird eine Nukleinsäure, die
für ein
Bcl-2-Antisense-Konstrukt
kodiert, in das virale Genom an die Stelle bestimmter viraler Sequenzen
eingesetzt, um ein Virus herzustellen, das replikationsdefekt ist.
Um Virionen zu produzieren wird eine Verpackungszelllinie, die die
gag-, pol- und env-Gene, aber ohne die LTR- und Ψ- Bestandteile, enthält, konstruiert (Mann et al.,
Cell, 33:153–159, 1983).
Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine eingesetzte DNA enthält, zusammen
mit den retroviralen LTR- und Ψ-Sequenzen, in diese
Zelllinie eingeführt
wird (mittels Kalziumphosphatpräzipitierung
zum Beispiel), erlaubt die Ψ-Sequenz
dem RNA-Transkript des rekombinanten Plasmids in virale Partikel
verpackt zu werden, die dann in das Kulturmedium sekretiert werden
(Nicolas und Rubenstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning
vectors and their uses, Rodrigues und Denhardt, (Hrsg.), Stoneham:
Butterworth, S. 494–513, 1988;
Temin, In: Gen Transfer, Kucherlapati (Hrsg.), New York: Plenum
Press, S. 149–188,
1986; Mann et al., 1983). Die Medien, die die rekombinanten Retroviren
enthalten, werden dann gesammelt, ggf. aufkonzentriert und für den Gentransfer
verwendet. Retrovirale Vektoren sind in der Lage, eine breite Vielzahl
an Zelltypen zu infizieren. Die Integration und stabile Expression
benötigt
jedoch die Teilung der Wirtszellen (Paskind et al., Virology, 67:242–248, 1975).
-
Adenoviren:
-
Humane
Adenoviren sind doppelsträngige
DNA-Tumorviren mit Genomgrößen von
ungefähr
36 kB. Als Modellsystem für
die eukaryotische Genexpression sind Adenoviren in großem Umfang
untersucht und gut charakterisiert worden, was sie zu einem attraktiven
System für
die Entwicklung von Adenovirus als Gentransfersystem macht. Diese
Virengruppe ist einfach zu züchten
und zu manipulieren und sie weisen ein breites Wirtsspektrum in
vitro und in vivo auf. In lytisch infizierten Zellen sind Adenoviren
in der Lage, die Proteinsynthese des Wirts abzuschalten, die zellulären Maschinerien
so zu steuern, dass sie große
Mengen an viralen Proteinen synthetisieren und reichliche Mengen
an Virus herstellen.
-
Der
E1-Bereich des Genoms schließt
E1A und E1B mit ein, die Proteine kodieren, die für die Transkriptionsregulation
des viralen Genoms sowie für
einige wenige zelluläre
Gene verantwortlich sind. Die Expression von E2 einschließlich E2A
und E2B erlaubt die Synthese viraler Replikationsfunktionen, z.B.
DNA-Bindeprotein, DNA-Polymerase, und ein terminales Protein, das
grundlegend für
die Replikation ist. E3-Genprodukte verhindern Zytolyse durch zytotoxische
T-Zellen und Tumornekrosefaktor und scheinen wichtig für die virale Verbreitung
zu sein. Funktionen, die mit den E4-Proteinen assoziiert sind, schließen DNA-Replikation,
die Expression der späten
Gene und das Abschalten der Wirtszelle mit ein. Die späten Genprodukte
schließen
die meisten der Virionkapsidproteine mit ein, und diese werden nur
exprimiert, nachdem der Großteil
der Prozessierung eines einzelnen Primärtranskripts vom Hauptspätpromotor
stattgefunden hat. Der Hauptspätpromotor (major
late promoter; MLP) weist eine hohe Wirksamkeit während der
späten
Phase der Infektion auf (Stratford-Perricaudet und Perricaudet,
S. 51–61,
In: Human Gene Transfer, Hrsg., O. Cohen-Haguenauer und M. Boiron
Editions John Libbey Exrotext, Frankreich, 1991).
-
Da
nur ein kleiner Teil des viralen Genoms in cis benötigt zu
werden scheint, bieten Adenovirusabgeleitete Vektoren ein exzellentes
Potenzial für
das Ersetzen von großen
DNA-Fragmenten, wenn sie in Verbindung mit Zelllinien wie 293-Zellen
verwendet werden. Ad5-transformierte humane embryonale Nierenzelllinien (Graham
et al., J. Gen. Yirol., 36:59–72,
1977) sind entwickelt worden, um diese essentiellen viralen Proteine in
trans zur Verfügung
zu stellen.
-
Spezielle
Vorteile eines Adenovirussystems zur Zufuhr fremder Proteine an
eine Zelle schließen
ein (i) die Fähigkeit
relativ große
Teile der viralen DNA durch Fremd-DNA zu ersetzen; (ii) die strukturelle
Stabilität der
rekombinanten Adenoviren; (iii) die Sicherheit der adenoviralen
Verabreichung an den Menschen; und (iv) das Fehlen irgendeiner bekannten
Assoziation der adenoviralen Infektion mit Krebs oder anderen bösartigen Erkrankungen;
(v) die Fähigkeit
hohe Titer des rekombinanten Virus zu erhalten; und (vi) die hohe
Infektiösität des Adenovirus.
-
Weitere
Vorteile von Adenovirusvektoren gegenüber Retroviren schließen die
höheren
Niveaus an Genexpression mit ein. Darüber hinaus ist die Adenovirusreplikation
im Gegensatz zu retroviralen Sequenzen unabhängig von der Wirtsgenreplikation.
Weil Adenovirus transformierende Gene im E1-Bereich einfach entfernt werden
können
und immer noch effiziente Expressionsvektoren zur Verfügung stellen,
denkt man, dass das onkogene Risiko von Adenovirusvektoren vernachlässigbar
ist (Grunhaus & Horwitz,
Seminar in Virology, 3:237–252,
1992).
-
Im
Allgemeinen beruhen Adenovirusgentransfersysteme auf rekombinanten,
gentechnisch hergestelltem Adenovirus, das durch Deletion eines
Teils seines Genoms, beispielsweise E1, replikationsinkompetent gemacht
wurde und dennoch seine Kompetenz zur Infektion beibehält. Sequenzen,
die für
relativ große Fremdproteine
kodieren, können
exprimiert werden, wenn zusätzliche
Deletionen im Adenovirusgenom vorgenommen werden. Beispielsweise
ist Adenovirus, in dem sowohl die E1- als auch E3-Bereiche entfernt
worden sind, in der Lage, Fremd-DNA von bis zu 10 kB zu tragen und
kann in hohen Titern in 293-Zellen kultiviert werden (Stratford-Perricaudet
und Perricaudet, 1991). Überraschenderweise
ist auch von einer persistierenden Expression von Transgenen infolge
von adenoviraler Infektion berichtet worden.
-
Andere vitale Vektoren
als Expressionskonstrukte.
-
Andere
vitale Vektoren können
als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Vektoren, die von Viren wie Vaccinia-Virus (Ridgeway,Stoneham: Butterworth,
S. 467–492,
1988; Baichwal und Sugden, In: Kucherlapati R., (Hrsg.) Gene transfer.
New York: Plenum Press, S. 117–148,
1986; Coupar et al., Gene, 68:1–10,
1988), Adenovirus assoziiertes Virus (Ridgeway, 1988; Baichwal und
Sugden, 1986; Hermonat und Myzycska, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:6466–6470, 1984)
und Herpes Viren abgeleitet sind, können eingesetzt werden. Sie
bieten mehrere attraktive Merkmale für verschiedene Säugetierzellen (Friedmann
et al., Genes Devel. 3:1314, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal und
Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., J. Virol. 64:642–650, 1990).
-
Mit
der kürzlichen
Erkenntnis über
defekte Hepatitis B-Viren wurde ein neuer Einblick in die Struktur-Funktions-Beziehung
von verschiedenen viralen Sequenzen gewonnen. In vitro-Studien zeigten,
dass das Virus die Fähigkeit
beibehalten konnte, für
Helfer-abhängige
Verpackung und reverse Transkription, trotz der Deletion von bis
zu 80 % seines Genoms (Horwich et al., 1990). Das legte nahe, dass
große
Teile des Genoms gegen fremdes genetisches Material ausgetauscht
werden könnten.
Der Hepatotropismus und die Persistenz (Integration) war besonders
attraktive Eigenschaften für
den auf die Leber gerichteten Gentransfer. Chang et al. (Hepatology,
14:134A, 1991) führten
kürzlich
das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen in das Genom des
Hepatits B-Virus der Ente anstelle der für Polymerase, Oberfläche, und
Vor-Oberfläche
kodierenden Sequenzen ein. Es wurde mit Wildtyp-Virus in eine Hepatomvogelzelllinie
kotransfiziert. Kulturmedium, das hohe Titer des rekombinanten Virus
enthielt, wurde verwendet, um primäre Entenküken-Hepatozyten zu infizieren.
Stabile CAT-Genexpression wurde für mindestens 24 Tage nach Transfektion
nachgewiesen (Chang et al., 1991).
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Nicht-virale Verfahren.
-
Mehrere
nicht-virale Verfahren für
den Transfer von Expressionsvektoren in kultivierte Säugetierzellen werden
für die
vorliegende Erfindung ebenfalls erwogen. Diese schließen die
Kalziumphosphatpräzipitierung (Graham
und van der Eb, Virology, 52:456–467, 1973; Chen und Okayama,
Mol. Cell Biol., 7:2745–2752,
1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10;689–695, 1990), DEAE-Dextran (Gopal,
Mol. Cell Biol., 5:1188–1190,
1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716–718, 1986;
Potter et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA, 81:7161–7165,
1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, J. Cell Biol.,
101:1094–1099,
1985), mit DNA beladene Liposomen (Nicolau und Sene, Biochem. Biophys.
Acta, 721:185–190,
1982; Fraley et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA, 76:3348–3352, 1979)
und Lipofectamin-DNA-Komplexe, Ultraschallbehandlung der Zellen
(Fecheimer et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA, 76:3348–52,
1979), Genbombardierung unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsmikroprojektilen
(Yang et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA, 87:9568–9572,
1990), Polykationen und Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und
Wu, J. Biol. Chem. 262:4429–4432,
1987; Wu und Wu, Biochemistry, 27:887–892, 1988) mit ein. Einige
dieser Techniken können
erfolgreich für
die in vivo- oder ex vivo-Verwendung angepasst werden.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einfach aus einem nackten
rekombinanten Vektor bestehen. Der Transfer des Konstrukts kann
mittels jedes der oben erwähnten
Verfahren durchgeführt
werden, das physisch oder chemisch die Zellmembran permeabilisiert.
Beispielsweise haben Dubensky et al., (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7529-7533, 1984) erfolgreich
DNA des Poliomavirus in Form von CaPO4-Präzipitaten
in die Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen erfolgreich
injiziert, was aktive virale Replikation und akute Infektion beweist.
Benvenisty und Neshif (Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA, 83:9551, 1986) bewiesen ebenfalls, dass die direkte
intraperitoneale Injektion von mit CaPO4 präzipierten Plasmiden
in der Expression von transfizierten Genen resultiert. Man stellt
sich vor, dass die DNA, die für
ein Bcl-2-Konstrukt kodiert, ebenfalls in ähnlicher Art und Weise in vivo übertragen
werden kann.
-
Der
Transfer eines nackten DNA-Expressionvektors in Zellen kann Partikel
Bombardierung mit einbeziehen. Dieses Verfahren hängt von
der Fähigkeit
ab, DNA-umhüllte
Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen,
die es ihnen gestattet, die Zellmembranen zu durchdringen und in
die Zellen einzudringen ohne sie abzutöten (Klein et al., Nature,
327:70–73,
1987). Mehrere Vorrichtungen zum Beschleunigen kleiner Partikel
sind entwickelt worden. Eine solche Vorrichtung verlässt sich
auf eine Hochspannungsentladung, um einen elektrischen Strom zu
erzeugen, der wiederum die bewegliche Kraft zur Verfügung stellt
(Yang et al., 1990). Die verwendeten Mikroprojektile bestanden aus
biologisch inerten Substanzen wie Wolfram- oder Goldkügelchen.
-
Ausgewählte Organe
einschließlich
der Leber, der Haut und Muskelgewebe von Ratten und Mäusen sind
in vivo bombardiert worden (Yang et al., 1990; Zelenin et al., FEBS
Lett., 280:94-96,
1991). Das kann der chirurgischen Offenlegung des Gewebes oder der
Zellen bedürfen,
um jegliches dazwischen liegende Gewebe zwischen der Kanone und
dem Zielorgan zu eliminieren. Die DNA, die für ein Bcl-2-Konstrukt kodiert,
kann via dieses Verfahren zugeführt
werden.
-
D. Pharmazeutische Zusammensetzungen
und Verabreichungswege
-
Wo
die klinische Anwendung von Liposomen, die Antisense-Oligo- oder
Polynukleotide oder Expressionsvektoren enthalten, in Angriff genommen
wird, wird es notwendig sein, den Liposomenkomplex als pharmazeutische
Zusammensetzung zuzubereiten, die geeignet ist für die beabsichtigte Anwendung.
Im Allgemeinen wird das Zubereiten einer pharmazeutischen Zusammensetzung
mit sich bringen, dass sie im Wesentlichen frei von Pyrogenen, sowie
frei von jeglichen anderen Verunreinigungen ist, die schädlich für die Menschen
oder Tieren sein könnten.
Man wird sich ebenfalls im Allgemeinen wünschen, geeignete Puffer einzusetzen,
um den Komplex stabil zu machen und die Aufnahme durch die Zielzellen
zu ermöglichen.
-
Die
flüssigen
Zusammensetzungen von Anspruch 11 umfassen eine wirksame Menge des
Antisense-Expressionsvektors, der in einem Liposom wie oben diskutiert
verkapselt ist, des Weiteren verteilt in einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder wässrigen
Medium. Solche Zusammensetzungen werden auch als Inokulum bezeichnet.
Die Ausdrücke „pharmazeutisch" oder „pharmazeutisch
verträglich" beziehen sich auf Zusammensetzungen,
die keine nachteiligen, allergischen oder andere unpassenden Reaktionen
hervorrufen, wenn sie an ein Tier oder an einen Menschen, wie jeweils
anwendbar, verabreicht werden.
-
Wie
hierin verwendet, schließt „pharmazeutisch
verträglicher
Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien,
Beschichtungen, antibakterielle und antimykotische Agenzien, isotonische
und die Absorption verzögernde
Agenzien und dergleichen mit ein. Die Verwendung solcher Medien
und Agenzien für pharmazeutisch
aktive Substanzen ist im Stand der Technik gut bekannt. Insofern
jedes konventionelle Medium oder Agens nicht inkompatibel mit dem
aktiven Wirkstoff ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen
erwogen. Ergänzende
aktive Inhaltsstoffe können
ebenfalls in diese Zusammensetzungen aufgenommen werden.
-
Lösungen der
therapeutischen Zusammensetzungen können in Wasser zubereitet werden,
das geeigneterweise mit einem oberflächenaktiven Stoff gemischt
ist, beispielsweise Hydroxypropylzellulose. Dispersionen können ebenfalls
in Glyzerin, flüssigem
Polyethylenglykolen, Gemischen davon und in Ölen zubereitet werden. Unter
gewöhnlichen Lagerungsbedingungen
und -verwendungen enthalten diese Zubereitungen einen Konservierungsstoff,
um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
-
Die
therapeutischen Zusammensetzungen werden zweckmäßigerweise in Form von injizierbaren
Zusammensetzungen entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen verabreicht;
Feste Formen, die geeignet für
die Lösung
in einer Flüssigkeit
oder die Suspension in einer Flüssigkeit
vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls zubereitet werden.
Diese Zubereitungen können
auch emulgiert werden. Eine typische Zusammensetzung zu solchem
Zweck umfasst einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Beispielsweise kann die
Zusammensetzung 10 mg, 25 mg, 50 mg oder bis zu ungefähr 100 mg
an humanem Serumalbumin pro Milliliter an Phosphat-gepufferter Saline
enthalten. Andere pharmazeutisch verträgliche Träger schließen wässrige Lösungen, nicht-toxische Exzipienten,
einschließlich
Salzen, Konservierungsstoffen, Puffern und dergleichen mit ein.
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Beispiele
nicht-wässiger
Lösungsmittel
sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöl und injizierbare organische
Ester wie Ethyloleat. Wässrige
Träger
schließen
Wasser, alkoholische/wässrige
Lösungen, Saline-Lösungen,
parenterale Vehikel wie Natriumchlorid, Ringer-Dextrose, etc. mit
ein. Intravenöse
Vehikel schließen
Flüssigkeits-
und Nahrungsergänzungsmittel
mit ein. Konservierungsstoffe schließen antimikrobielle Agenzien,
Antioxidanzien, gelatierende Agenzien und inerte Gase mit ein. Der
pH und die exakte Konzentration der verschiedenen Komponenten der
pharmazeutischen Zusammensetzung werden gemäß allgemein bekannten Parametern
eingestellt.
-
Zusätzliche
Formulierungen sind für
die orale Verabreichung geeignet. Orale Formulierungen schließen solche
typische Exzipienten mit Arzneimittelqualität wie beispielsweise Mannitol,
Laktose, Stärke,
Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat
und dergleichen mit ein. Die Zusammensetzungen nehmen die Form von
Lösungen,
Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung
oder Pudern ein. Wenn der Weg topisch ist, kann die Form eine Creme,
eine Wundsalbe (Ointment), eine Salbe (Salve) oder ein Spray sein.
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Die
therapeutischen Zusammensetzungen können klassische pharmazeutische
Zubereitungen mit einschließen.
Die Verabreichung dieser therapeutischen Zusammensetzungen wird über irgendeinen
bekannten Weg erfolgen, solange das Zielgewebe über diesen Weg erreichbar ist.
-
Das
schließt
oral, nasal, bukal, rektal, vaginal oder topisch mit ein. Die topische
Verabreichung wäre insbesondere
zweckmäßig für die Behandlung
von Hautkrebsen, um Chemotherapieinduzierte Alopezie zu verhindern
oder andere hyperproliferative Erkankungen der Haut. Alternativ
kann die Verabreichung orthotopisch, intradermal subkutan, intramuskulär, intraperitoneal
oder intravenöse
Injektion sein. Solche Zusammensetzungen würden normalerweise als pharmazeutisch
verträgliche
Zusammensetzungen verabreicht werden, die physiologisch verträgliche Träger, Puffer
oder andere Exzipienten einschließen. Für die Behandlung von Krankheitszuständen der
Lunge ist der bevorzugte Weg die Aerosolzufuhr an die Lunge. Das
Volumen des Aerosols liegt zwischen ungefähr 0,01 ml und 0,5 ml. In ähnlicher
Weise ist ein bevorzugtes Verfahren für die Behandlung von Erkrankungen,
die mit dem Kolon assoziiert sind, eine Darmspülung. Das Volumen der Darmspülung liegt
zwischen ungefähr
1 ml und 100 ml.
-
Eine
wirksame Menge der therapeutischen Zusammensetzung wird bestimmt
ausgehend vom beabsichtigten Ziel. Der Ausdruck „Einheitsdosis" oder „Dosierung" bezieht sich auf
körperlich
getrennte Einheiten, die geeignet sind für die Verwendung an einem Patienten,
wobei jede Einheit eine vorbestimmte Quantität der therapeutischen Zusammensetzung
enthält,
die berechnet worden ist, um die gewünschten Reaktionen wie oben
diskutiert im Zusammenhang mit seiner Verabreichung, d.h. dem geeigneten
Weg und Behandlungsschema herzustellen. Die zu verabreichende Menge,
sowohl gemäß der Anzahl
an Behandlungen als auch bezüglich
der Einheitsdosis, hängt
vom beabsichtigten Schutz ab.
-
Die
exakten Mengen der therapeutischen Zusammensetzung hängen auch
von der Beurteilung des praktischen Arztes ab und sind besonders
für jedes
Individuum. Faktoren, die die Dosis beeinflussen, schließen den
physischen und klinischen Status des Patienten, den Verabreichungsweg,
das beabsichtigte Behandlungsziel (Linderung der Symptome gegenüber Heilung)
und die Stärke,
Stabilität
und Toxizität
der speziellen therapeutischen Substanz mit ein. Für die sofortige
Anwendung wird ins Auge gefasst, dass die Menge an therapeutischem
Peptid, die in einer Einheitsdosis eingeschlossen ist, im Bereich
von ungefähr
5–30 mg
an Polynukleotid liegen wird.
-
E. Beispiele
-
BEISPIEL 1: Synthese der
Oligonukleotide.
-
Nuklease-resistente
p-Ethoxy-Oligonukleotide, nicht-ionische Phosphodiesteranaloga,
wurden von Oligo Therapeutics (Willsonville, OR) gekauft. Ein Oligonukleotide,
das spezifisch für
die Translationsinitiationsstelle humaner Bcl-2 mRNA ist: 5'CAGCGTGCGCCATCCTTC3' (SEQ
ID NR:1), wurde als Antisense-Olignukleotid verwendet. Zwei verschiedene
Kontrolloligonukleotide wurden verwendet: 5' ACGGTCCGCCACTCCTTCCC 3' (SEQ ID NR:2) (durcheinander
gebrachte Version des Bcl-2 Antisense-Oligonukleotids) und die zufällig Sequenz
5' CTGAAGGGCTTCTTCC
3' (SEQ ID NR:3).
-
BEISPIEL 2: Zubereitung
der liposomalen Oligonukleotide (L-OS)
-
P-Ethoxy-Oligonukleotide,
die in destilliertem Wasser aufgelöst waren, wurden in Anwesenheit
eines Überschusses
an tert-Butanol (≥95
% nach Volumen) zu Phospholipiden hinzugefügt (Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL). Das Gemisch wurde in einem Trockeneis/Acetonbad gefroren, über Nacht
lyphoylisiert und schließlich
mit HEPES-gepufferter Saline (1 mmol/L Hepes und 10 mmol/L NaCl)
bei einer Oligoendkonzentration von 0,1 mmol/L hydratisiert. Liposomale
Oligonukleotide (L-OS) wurden mit Ultraschall für 12 Minuten in einem Ultraschallwasserbad
behandelt. Der durchschnittliche Durchmesser der Partikel betrug
100 nm + 50 nm, gemäß einer
Bestimmung in einem NICOMP-Partikelgrößenmesssystem (Santa Barbara,
CA).
-
BEISPIEL 3: Oligonukleotidinhibierung
der Proteinexpression
-
Zelllinien
-
Verwendet
wurden Johnson-Zellen, eine humane transformierte FL-Zelllinie,
die die t(14;18)-Translokation
trägt und
die Bcl-2-Protein überexprimiert.
Ebenfalls verwendet wurden Raji- und Jurkat-Zellen, eine humane
Burkitt-Lymphomzelllinie und eine humane akute T-Zell-Leukämie-Zelllinie. Beide
Linien exprimieren das Bcl-2-Protein, aber ihnen fehlt die t(14;18)-Translokation. Daudi-Zellen,
eine humane Burkitt-Lymphomzelllinie, die nicht das Bcl-2-Protein exprimiert,
wurde als eine Negativkontroll-Zelllinie verwendet. Johnson-, Raji-
und Jurkat-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (GIBCO, Grand Island,
NY, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war,
kultiviert. Die Daudi-Zellen wurden in RPMI 1640-Medium, das mit
20 % hitzeinaktiviertem FBS ergänzt
war, kultiviert.
-
Zufuhr der
L-OS an die Zellen
-
Zehntausend
Zellen/Loch wurden in einer 96-Lochplatte in 0,1 mL des entsprechenden
Mediums ausplattiert. Die Zellen wurden mit L-OS in einer Endkonzentration
von 2 bis 8 μmol/L
bei 37°C
in einem 5 % CO2-Inkubator inkubiert. Jede
Untersuchung wurde in 3-facher Ausführung durchgeführt und
mindestens 3-Mal wiederholt.
-
Assay zur
Lebendigkeit der Zellen
-
Die
Lebendigkeit der neoplastischen Zellen wurde mittels des AlamarBlue-Farbstoffs
gemessen (Alamar, Sacramento, CA). Nach 5-tägiger Inkubation mit L-OS wurden
40 μL der
Zellen/Loch aliquotiert und zu 140 μl an frischem Medium zugefügt. Zwanzig μL an AlamarBlue-Farbstoff
wurden zu jedem Loch zugesetzt. Nach Inkubation für 12 Stunden
bei 37°C
wurden die Platten direkt auf einem Mikroplattenlesegerät bei 570 und
595 nm ausgelesen (Molecular Devices, CA). Der Absorptionsunterschied
zwischen 570 und 595 nm wurde genommen als der Gesamtabsorptionswert
der Zellen. Alle Experimente wurden mittels t-Tests analysiert, indem
die Lebensfähigkeit
der Zellen, die mit den L-OS behandelt wurden, mit jenen der unbehandelten
Kontrollen verglichen wurden.
-
Western-Blots auf Bcl-2
und Bax-Protein
-
Einhunderttausend
Zellen/Loch wurden in einer 6-Lochplatte in 3 mL des entsprechenden
Mediums ausgesät,
mit 2, 3 und 4 μmol/L
an L-OS behandelt und bei 37°C
inkubiert. Unbehandelte Zellen wurden ebenfalls in Kultur gehalten.
Proben wurden am Tag 3 nach Zusatz der L-OS entfernt und in 100 μL an Lysepuffer (1
% Triton, 150 mmol/L NaCl und 25 mmol/L Tris pH 7,4) bei 0°C für 30 Minuten
lysiert. Nach Zentrifugation bei 12000 × g für 10 Minuten wurden die Überstände rückgewonnen
und auf den Gesamtproteingehalt normalisiert (5 μg/Spur an Johnson-Zelllysat
und 20 μg/Spur
an Jurkat-Zelllysat für
die Bcl-2-Analyse, und 25 μg/Spur an
Johnson-Zellen für
die Bax-Analyse). Die Lysate wurden mit dem Probenpuffer, der 1
% an Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1 % an 2-β-Mercaptoethanol enthielt, gemischt
und für
5 Minuten gekocht. Die SDS-PAGE wurde auf 10 %-igen Polyacrylamidgelen
laufen gelassen, elektrophoretisch auf Nitrozellulosemembranen transferiert
und in 10 % fett-freier Trockenmilch geblockt. Die Filter wurden
in zwei Teile geschnitten: Der untere Abschnitt wurde mit dem gegen
menschliches Bcl-2 gerichteten monoklonalen Antikörper 6C8
aus dem Hamster oder mit dem gegen humanes Bax gerichteten polyklonalen
Antikörper
aus dem Kaninchen (Hockenbery et al., Nature, 348:334, 1990) inkubiert,
und der obere Abschnitt wurde mit dem gegen Aktin gerichteten monoklonalen
Antikörper
der Maus (Amersham) bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Nach
dem Waschen und Inkubation mit Peroxidase-markiertem Zweitantikörper gegen
Hamster (Kirkegaar & Perry
Laboratories), gegen Kaninchen (Santa Cruz) oder gegen Maus (Amersham)
wurden die Blot mit Hilfe des verstärkten Chemilumineszenzsystems
(ECL, Amersham) entwickelt. Um die Inhibition des Bcl-2-Proteins
und das Verhältnis
der Bcl-2-/Bax-Proteine
zueinander abzuschätzen,
wurden Abtastungsdichtemessungen der Western-Blots auf einem Gelford
Response Gel Scanner (CIBA Corning, Medfield, MA) durchgeführt. Die
Flächenintegration
der Absorptionsspitzen bei 500 nm wurde verwendet, um das Verhältnis von
Bcl-2:Aktin und Bcl-2:Bax-Proteinen zu bestimmen.
-
Apoptoseanalyse
-
Um
qualitativ die internukleosomale DNA-Spaltung, die mit Apoptose
assoziiert ist, zu bestimmen, wurde eine DNA-Fragmentierungsanalyse
mit Hilfe von Agarosegelelektrophorese durchgeführt (Duke et al., In: Coligan
et al. (Hrsg.) Current protocols in immunology, Band 1., New York:
John Wiley & sons,
S. 3.17.1, 1991). Kurz gesagt, 1 × 106 Johnson-Zellen
wurden in 10 mL an Medium in einer 75 cm2-Gewebekulturflasche kultiviert,
mit 4 μmol/L
an L-OS behandelt und bei 37°C
inkubiert. Unbehandelte Zellen wurden ebenfalls in Kultur gehalten.
Die Proben wurden am Tag 3 nach der Behandlung entfernt, mit PBS
gewaschen und durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 200 × g pelletiert.
Die Pellets wurden in 0,5 mL an Lysepuffer (10 mmol/L Tris pH 7,4,
1 mmol/L EDTA pH 8,0 und 0,2 % Triton X-100) lysiert und die fragmentierte
DNA wurde von intaktem Chromatin durch Mikrozentrifugieren für 10 Minuten
bei 13000 × g
abgetrennt. Die DNA der Überstände wurde in
0,7 mL eiskalten Isopropanol über
Nacht bei –20°C präzipitiert,
in 30 μL
an TE-Puffer (10 mmol/L Tris pH 7,4, 1 mmol/L EDTA pH 8,0) resuspendiert
und in 10 μL
an RNase (10 μg/mL-Lösung) bei
60°C für 1 Stunde inkubiert.
20 μL an
Probe pro Loch wurden elektrophoretisch auf einem 2 %igen Agarosegel
aufgetrennt und mittels Ethidiumbromidfärbung visualisiert.
-
Um
quantitativ das Apoptoseausmaß zu
bestimmen wurde der fluoreszierende DNA-Bindefarbstoff Acridinorange verwendet
(Duke et al., 1991). Kurz gesagt, L-OS wurden in einer Endkonzentration
von 5 μmol/L
zu 1 × 105 Zellen/Loch zugefügt, ausplattiert in einer 24- Lochplatte in 1 mL
an Medium. Nach 3 Tagen der Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit PBS
gewaschen und zu 1 × 106 Zellen/mL resuspendiert. 25 μL der Zellsuspension
wurden mit 1 μL
an Acridinorange Farbstoff (100 μg/mL,
Sigma Chemicals, St. Louis, MO) gemischt und in einem Fluoreszenzmikroskop
beobachtet. Der Prozentsatz an apoptotischen Zellen (apoptotischer
Index) wurde unter Verwendung eines Hämozytometers erhalten. Apoptotischer
Index = (Gesamtzahl an Zellen mit apoptotischen Kernen/Gesamtzahl
an gezählten
Zellen) × 100
%.
-
Auswirkung von L-bcl-2
Antisense-Oligonukleotiden („L-bcl-2") auf das Wachstum
von Lymphomzellen
-
5
Tage nach dem Zusatz von L-bcl-2 zu den Zellen wurde die Lebendigkeit
der Tumorzellen bewertet. Das Zellwachstum wurde in Konzentrations-abhängiger Weise
in Johnson-Zellen inhibiert, die die t(14;18)-Translokation tragen
und sehr hohe Niveaus an Bcl-2 exprimieren. Eine Konzentration von
6 μmol/L L-bcl-2
resultierte im kompletten Verlust der Lebendigkeit der Johnson-Zellen
innerhalb von 5 Tagen (1). Eine ähnliche Dosis abhängige Verringerung
der Zelllebendigkeit konnte in 3 separaten Untersuchungen gesehen
werden. Im Gegensatz dazu verringerte sich die Lebendigkeit von
Jurkat-, Raji- und Daudi-Zellen nach der Behandlung mit 6 μmol/L ( )L-bcl-2
nur um 23 %, 0 % bzw. 35 % (1).
-
Auswirkung von liposomalen
Kontrolloligonukleotiden (L-Kontroll-Oligos) auf das Wachstum von
Lymphomzellen
-
Zwei
Kontrolloligonukleotide wurden verwendet, um die Spezifität der beobachteten
Inhibition zu bestimmen. Wenn L-Kontrolloligos oder leere Liposomen
zu Johnson-Zellen zugesetzt wurden, wurde keine Zellwachstumsinhibition
beobachtet. Jurkat-, Raji- und Daudi-Zellen wurden ebenfalls mit
L-Kontrolloligos und leeren Liposomen behandelt. Eine nicht-spezifische
Toxizität
konnte beobachtet werden, wenn mehr als 6 μmol/L an L-OS verwendet wurden,
aber nicht mit leeren Liposomen (2).
-
Selektive Inhibition des
Bcl-2-Proteins durch L-bcl-2-Antisense-Oligonukleotide
-
Um
zu bestimmen, ob der zytotoxische Effekt der L-bcl-2 in Johnson-Zellen
durch eine Verringerung an Bcl-2-Protein verursacht wurde, wurde
ebenfalls die Bcl-2-Proteinexpression in diesen Zellen nach der
Behandlung mit L-bcl-2 sowie die Auswirkungen von L-bcl-2 auf die
anderen Zelllinien, die Bcl-2-Protein überexprimieren (3),
ebenfalls bestimmt.
-
Wenn
Johnson-Zellen mit 2, 3 und 4 mmol/L an L-bcl-2 behandelt wurden,
wurden die Verhältnisse
an Bcl-2-/Aktiv-Protein um 28, 57 bzw. 64 % inhibiert. Die Bcl-2-Proteinexpression
wurde nicht in Zellen inhibiert, die mit denselben Dosen an L-Kontrolloligos
behandelt wurden.
-
Wenn
Jurkat-Zellen mit 3 und 4 mmol/L an L-bcl-2 behandelt wurden, wurden
die Verhältnisse
von Bcl-2-/Aktiv-Protein um 44 % bzw. 50 % inhibiert. Das Bcl-2-Protein
wurde nicht signifikant inhibiert, wenn dieselben Dosen an L-Kontrolloligos
verwendet wurden (4).
-
Die
Verhältnisse
an Bcl-2-/Bax-Protein in Johnson- und Jurkat-Zellen vor und nach
Behandlung mit L-bcl-2 und L-Kontrolloligos wurde ebenfalls bestimmt.
Johnson-, Raji- und Daudi-Zellen exprimierten Bax-Protein, aber
Jurkat-Zellen taten dies nicht (5). Wenn
Johnson-Zellen mit 2, 3 und 4 mmol/L an L-bcl-2 behandelt wurden,
wurde das Verhältnis
an Bax/Aktin nicht verändert,
aber das Verhältnis
an Bcl-2/Bax verringerte sich um 10 %, 40 % bzw. 50%. Diese Proteinverhältnisse
blieben nach Behandlung mit denselben Dosen an L-Kontroll-Oligos
(6) unverändert.
-
Inhibition des Bcl-2-Proteins
führt zu
Apoptose in den FL-Zellen
-
Es
wurde ebenfalls untersucht, ob die inhibitorischen Auswirkungen
auf das Wachstum, die für
Johnson-Zellen beobachtet werden, in Verbindung mit der Induktion
von Apoptose stehen. Nach 3 Tagen der Inkubation mit L-bcl-2 wurde
das typische internukleosomale DNA-Abbaumuster beobachtet, wohingegen
Zellen, die mit L-Kontroll-Oligos inkubiert wurden, nicht das internukleosomale
DNA-Muster zeigten (7). Im Anschluss daran wurde
die Quantität
an Apoptose mittels Acridinorange bewertet. Nach 3 Tagen der Exposition gegenüber 4 und
5 μmol/L
an L-bcl-2 waren apoptotische Zellen sichtbar. Der apoptotische
Index von unbehandelten Johnson-Zellen betrug 3 %, während der
von Johnson-Zellen, die mit 4 und 5 μmol/L an L-bcl-2 behandelt wurden,
43 % bzw. 61 % betrug. Ein signifikanter Zuwachs des apoptotischen
Index wurde in Zellen, die mit liposomalen Kontroll-Oligonukleotiden
oder leeren Liposomen behandelt worden waren, nicht beobachtet (8).
-
L-bcl-2 reguliert selektiv
die Expression von Bcl-2-Proteinen und Zellwachstum in einer Dosisabhängigen Weise
herunter
-
Die
Inhibition des Zellwachstums wurde nur in der FL-Zelllinie beobachtet,
die die t(14;18)-Translokation
trägt,
während
eine Zellwachstumsinhibition nicht für Zelllinien beobachtet wurde,
denen die Bcl-2-Expression (Daudi-Zellen) oder die t(14;18)-Translokation
(Raji- und Jurkat-Zellen) fehlt. Es gab keine unspezifische Toxizität in Johnson-Zellen,
die gegenüber
zwei verschiedenen Kontroll-Oligonukleotiden exponiert wurden. Die
inhibitorischen Auswirkungen auf das Wachstum konnten beginnend
bei einer Konzentration von 3 μmol/L an
L-bcl-2 beobachtet werden und die inhibitorischen Auswirkungen waren
am größten bei
einer Konzentration von 6 μmol/L.
Einer der Mechanismen, über
die L-bcl-2 die Wachstumsinhibition auf Johnson-Zellen ausübt, könnte durch
Induktion von Apoptose sein, da behandelte Zellen ein typisches
internukleosomales DNA-Abbaumuster und einen erhöhten apoptotischen Index, wie
mittels Acridinorange gemessen, zeigten. Am Tag 3 befanden sich
61 % der Johnson-Zellen, die mit 5 μmol/L an L-bcl-2 behandelt worden
waren, in der Apoptose im Vergleich zu 15 % an Zellen, die mit L-Kontroll-Oligos
behandelt wurden. Apoptose wurde in den anderen Zelltypen nicht
beobachtet.
-
Daher
führt die
Inhibition des Bcl-2-Proteins zur Inhibition des Zellwachstums in
Zellen, die, um die Lebensfähigkeit
zu beizubehalten, von der Anwesenheit des Bcl-Proteins abhängig sind.
Gentransfer-Experimente haben den Beweis erbracht, dass Bcl-2 eine
wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Überlebens von lymphoiden Zellen
in vitro zur Verfügung
stellt, obwohl andere autokrine Wachstumsfaktoren ebenfalls involviert
sein können
(Vaux et al., Nature (London), 355:440, 1988; Reed et al., Proc.
Nat'l Acad. Sci.
USA, 87:3660, 1990b; Blagosklonny und Neckers, Eur. Cytokine Network,
6:21, 1995). Unter Verwendung von Phosphorotionat-Antisense-Oligonukleotiden
beobachteten Cotter und Mitarbeiter eine Wachstumsinhibition in
der DoHH2-Zelllinie, die die t(14;18)-Translokation hat und Bcl-2-Protein überexprimiert,
aber nicht in der FC11-Zelllinie, die Bcl-2-Protein überexprimiert
ohne die t(14;18)-Translokation (Cotter et al., 1994). Zellen, die Bcl-2 überexprimieren
und denen die t(14;18)-Translokation fehlt, könnten evtl. eines apoptotischen
Stimulus bedürfen,
beispielsweise Wachstumsfaktorentzug oder Behandlung mit chemotherapeutischen
Wirkstoffen, um in die Apoptose und den Wachstumsarrest getrieben
zu werden (Reed, 1995). Antisense-Oligonukleotide können verwendet werden, um die
chemotherapeutische Resistenz jener Zellen umzukehren, die ohne
die t(14;18)-Translokation ebenfalls hohe Konzentrationen an Bcl-2 überexprimieren
(Kitada et al., Antisense Res. Dev., 4:71, 1994). Es versteht sich,
dass solch eine Kombination von L-Bcl-2 der vorliegenden Offenbarung
mit einem apoptotischen Stiumulus vom Geist und Rahmen der anhängigen Patentansprüche umfasst
wäre.
-
Bax,
ein Förderer
des apoptotischen Zelltods kann ein normaler Partner sein, der an
der Heterodimerisierung und Regulierung von Funktionen anderer Mitglieder
der Bcl-2-Familie beteiligt ist (Sedlak et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA,
92:7834, 1995). Es wurde vorgeschlagen, dass das Gleichgewicht in
der Bildung der Bcl-2:Bax-Heterodimere und von Bax:Bax-Homodimeren von zentraler
Bedeutung bei der molekularen Regulierung der Apoptose zu sein scheint
(Yin et al., 1994). Darüber
hinaus korrelierte in einer kürzlich
erschienen Studie das Verhältnis
von Bcl-2:Bax mit dem Zelltod in IL-3-abhängigen FL5.12-Zellen. Wenn
ungefähr
die Hälfte
oder mehr des Bax mit Bcl-2 heterodimerisierte, wurde die Apoptose
inhibiert (Yang et al., 1995). Der apoptotische Tod, der in Johnson-Zellen
nach Inkubation mit L-bcl-2 beobachtet wurde, könnte aufgrund der Verringerung
des Bcl-2:Bax-Verhältnis
und der Bildung von mehr Bax:Bax-Homodimeren auftreten.
-
Eine
weitere Erklärung
ist, dass andere Onkogene und Tumorsuppressorgene, wie beispielsweise C-MYC
und p53, am Überleben
der anderen Zelllinien beteiligt sind. C-MYC wird beispielsweise üblicherweise in
Burkitt-Lymphomen und einigen transformierten FL exprimiert (McDonnell
und Korsmeyer, 1991). Mutationen des p53-Gens, ein Suppressorgen,
das an zahlreichen menschlichen Tumoren beteiligt ist, kann auch
in diesen Zelllinien beteiligt sein; das p53-Gen kodiert für ein DNA-Bindeprotein,
das wenigstens zum Teil als Transkriptionsfaktor wirkt, um Zellzyklusarrest
und Apoptose durch Hochregulierung von Bax zu induzieren (Vogelstein
und Kinzler, Cell, 70:523, 1992; Miyashita et al., Oncogene, 9:1799,
1994; Miyashita und Reed, Cell, 80:293, 1995). Wahrscheinlich reicht
die Inhibition der Bcl-2-Expression
alleine nicht aus, um Apoptose und Wachstumsinhibierung in anderen
Zellen als jenen Zellen mit einem hohen Expressionsniveau an Bcl-2, beispielsweise
jene mit einer t(14;18)-Translokation, zu induzieren. Jedoch bildet,
wie hierin beschrieben, eine Verringerung im Verhältnis von
Bcl-2/Bax durch L-bcl-2 die Grundlage für eine molekulare Herangehensweise für die Therapie
follikulärer
Lymphome als auch anderer Bcl-2-Erkrankungen
in Zellen, in denen Bax exprimiert wird.
-
BEISPIEL 4: Bcl-2-Regulierung
des Kernimports von p53
-
Die
humane Prostatakarzinomzelllinie LNCaP, die ein Wildtyp p53-Gen
besitzt (Carroll et al., Prostate, 23, 123–134, 1993), wurde ausgewählt, um
die Inhibierung des p53-abhängigen
programmierten Zelltods durch bcl-2 zu untersuchen. LNCaP Prostatakarzinomzelllinien,
die stabil bcl-2 exprimieren, wurden erzeugt und mittels Western-Blot
bestätigt.
Die Expression von bcl-2 bewirkte eine deutliche Resistenz gegenüber der Apoptoseinduktion
infolge von γ-Bestrahlung im Vergleich
zu Kontrollklonen, was mittels morphologischer und durchflusszytometrischer
Analyse bewertet wurde (9A und 9B).
In LNCaP-Zellen, die bcl-2
exprimierten, wurde keine signifikante Induktion des Zelltods bis
zu 48 Stunden nach der Bestrahlung beobachtet. Darüber hinaus
gab es keinen Unterschied in der Zellzyklusverteilung zwischen LNCaP
und LNCaP-bcl-2-Zellen vor der Bestrahlung und keinen Beweis, dass
die Verteilung der Zellen innerhalb des Zellzyklus infolge von Bestrahlung
verändert
wurde. Ungefähr
60 % der nicht-bestrahlten Kontrollzellen befinden sich in G0/G1, 18 % in der
S-Phase und 22 % in G2/M im Vergleich zu
59 % an unbestrahlten LNCaP-bcl-2-Zellen in G0/G1, 21 % in der S-Phase und 20 % in der G2/M-Phase. Diese Werte unterschieden sich
nicht wesentlich von jenen, die nach 30 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden,
4 Stunden und 8 Stunden nach Bestrahlung beobachtet wurden.
-
Die
Apoptose, die als Reaktion auf genotoxischem Schaden induziert wird,
wird als p53 abhängig
erachtet. In LNCaP-Zellen wurde zelluläres p53-Gesamtprotein in ungefähr äquivalenten
Konzentrationen zu bcl-2-exprimierenden Klonen und Kontrolltransfektanten
innerhalb von 4 Stunden nach γ-Bestrahlung
mit 20 Gy induziert (10A). Eine Western-Blot-Analyse, die isolierte
Kerne verwendete, offenbarte, dass die Konzentrationen an p53-Protein
im Kern innerhalb von 2 Stunden nach der Bestrahlung sich in Kontroll-LNCaP erhöhten, aber
nicht in bcl-2-exprimierenden LNCaP-Zellen (10A).
Diese Beobachtung legt nahe, dass der Kernimport von p53 infolge
von DNA-Schaden im Kontext von hohen Konzentrationen des bcl-2-Proteins gestört sein
könnte.
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Abtastungskonfokallasermikroskopie
wurde verwendet, um den Kernimport von p53 infolge von Bestrahlung
weiter zu charakterisieren. Die Inhibierung des Kernimports von
p53 in den bcl-2-Zellen
wurde mittels konfokaler Mikroskopie unter Verwendung von Antikörpern, die
das p53-Protein
erkennen, bestätigt (10B). Daher wurde mittels zweier unabhängiger Techniken
gezeigt, dass der Kernimport von p53 in bcl-2-exprimierenden Zellen
nach der Zelltodinduktion mittels ionisierender Strahlung erheblich
inhibiert ist.
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Um
zu bestimmen, ob die transaktivierende Fähigkeit von p53 im Kontext
des bcl-2-Proteins beeinflusst wurde, wurden NIH3T3-Zellen transient
mit einem mdm-2-Promotor-Luziferase-Reportkonstrukt transfiziert, das funktionale
p53-Bindestellen besitzt. Die Luziferaseaktivität nahm ungefähr um das
8-fache nach Ko-Transfektion mit einem Wildtyp, aber nicht mutierten,
p53-Expressionsplasmid zu (10C).
Die Ko-Transfektion von bcl-2 und Wildtyp-p53-Expressionsplasmiden resultierte in
einer 2-4-fachen Abnahme der Luziferaseaktivität im Vergleich zu wildtypischem
p53 alleine (p≤ 0,02).
-
Zusätzliche
Studien wurden unter Verwendung der RKO-Kolonkarzinomzelllinie durchgeführt, um
einzuschätzen,
ob die Fähigkeit
von bcl-2, den Kernimport von wildtypischem p53 zu inhibieren, spezifisch
für die LNCaP-Prostatakrebszelllinie
ist. RKO-Zellen besitzen ein wildtypisches p53-Gen (Nagasawa et
al., Cancer Res., 55, 1842-1846, 1995) und exprimieren ebenfalls
bcl-2-Protein. Um die Expression von bcl-2 in RKO-Zellen herunterzuregulieren,
wurden bcl-2-spezifische Antisense-Oligonukleotide mittels Liposomen
zugeführt. Die
Bcl-2-Proteinniveaus
waren um das 3-fache reduziert im Vergleich zu RKO-Zellen, die mit
leeren Liposomen oder Liposomen, die Kontroll-Oligonukleotide enthielten,
behandelt wurden (11A). Konfokale Mikroskopie
wurde verwendet, um das p53-Protein von RKO-Zellen, die mit Antisense-bcl-2-Oligonukleotid-
oder Kontroll-Oligonukleotid enthaltenden Liposomen behandelt worden
waren, 4 Stunden nach γ-Bestrahlung
mit 10 Gy abzulichten. RKO-Zellen, die mit Kontroll-Oligonukleotiden
behandelt worden waren, zeigten, dass der Großteil des p53-Proteins sich nach
wie vor im Zytosol befand (11B).
Im Gegensatz dazu wiesen RKO-Zellen,
in denen bcl-2 mittels Antisense-Oligonukleotiden herunterreguliert
worden war, hohe Niveaus an p53-Protein innerhalb des Kerns auf
und wiesen eine deutliche (p ≤ 0,005)
Zelltodinduktion im Vergleich zu RKO-Zellen auf, die mit Kontrolloligonukleotiden
behandelt worden waren (11C). Diese
Befunde legen nahe, dass die Fähigkeit
von bcl-2, den Import von wildtypischem p53-Protein in Reaktion
auf DNA-Schaden zu modulieren, nicht Zelltypspezifisch ist.
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Bestrahlung und Kalzein-AM-Färbung
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Die
Zellen wurden zunächst
mit Kalzein-AM (Molecular Probes, Eugene, OR) zu 1 mg/ml für 20 Minuten
in RPMI, das 10 % FBS enthielt, beladen. Die Zellen wurden mit 20
Gy unter Verwendung einer 137Cs γ-Quelle bestrahlt
und die von Kalzein erzeugte Fluoreszenz wurde unter Verwendung
von Epifluoreszenzoptik und eines FITC-Filters (530 nm Emission) visualisiert.
Die Strahlungsdosis von 20 Gy wurde als die minimale Dosis ausgewählt, die
benötigt
wird, um maximale Apoptoseniveaus in LNCaP-Zellen zu induzieren.
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Durchflusszytometrieanalyse
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Die
Durchflusszytometrieanalyse des Zellzyklus und der Zelltodinduktion
in LNCaP-Zellen. Einzelzellsuspensionen wurden in 70 % Ethanol fixiert
und mit 50 mg/ml Propidiumiodid (PI) und 20 mg/ml RNAse für 15 Minuten
bei 37°C
inkubiert. Die Durchflussanalyse wurde mit einem EPICS Profile I
bei 488 nm-Anregung durchgeführt
und für
die PI-Fluoreszenz unter Verwendung von Elite Software 4,0 (Coulter
Corp., Miami, FL) und der Multizyklus-DNA-Analyseprogrammsoftware (Phoenix Flow
Systems, San Diego, CA) bearbeitet.
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Transfektionen
und Luziferaseassays
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LNCaP-Zellen
wurden mit dem Expressionsplasmid des Milzfokus-bildenden Virus
mit oder ohne (Kontrolle) dem bcl-2 cDNA-Einsatzstück wie zuvor
beschrieben (Marin, et al., Oncogene, 12, 2259-66, 1996; Tu et al.,
Cancer Lett., 93, 147-155, 1995) transfiziert. Die Effektorplasmide
LTRXA und LTRKH Expressionsplasmide sind bereits zuvor beschrieben
worden (Defile et al., 1993) und stellen wildtypisches bzw. mutiertes p53
dar. Das Reporterplasmid P2mdm2-Luc wurde durch Klonieren eines
1 Kb XhoI-Fragments, das auf p53 reagierende Element des mdm2-Gens der Maus enthielt,
in die SmaI-Stelle des pA3-Luziferaseplasmids hergestellt. NIH3T3-Zellen wurden in
einer Dichte von 0,5 × 106-Zellen pro Platte 24 Stunden vor der Transfektion ausplattiert.
Das wildtypische oder mutierte p53-Effektorplasmid (10 μg), das Reporterplasmid
P2mdm2-Luc (4 μg)
und das β-Galaktosidase
(β-Gal)-Expressionsplasmid
(3 μg) wurden
mit oder ohne bcl-2-Vektor (20 μg) gemäß dem Kalziumphosphatverfahren
ko-transfiziert. Die Gesamtmenge an transfizierter DNA wurde durch Hinzufügen von
p-GEM-Plasmid bis zu 37 μg
an Gesamt-DNA für
alle Transfektionen normalisiert. 48 Stunden nach der Transfektion
wurden die Zellen geerntet. Extrakte wurden gemacht und auf Luziferaseaktivität untersucht.
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Immunfluoreszenzfärbung und
konfokale Mikroskopie
-
LNCaP-Kontrolle-
und LNCaP-bcl-2-Zellen wurden auf mit Laminin beschichteten Deckgläschen gezüchtet und
mit 20 Gy bestrahlt. Nach 4 Stunden wurden die Zellen zweimal mit
PBS gewaschen, dann in 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert und zweimal
in PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 10 %-igen Ziegenserum in
PBS blockiert, mit p53-Antikörper (AB-2,
Calbiochem) in 10 %-igem Ziegenserum (1:75) inkubiert, zweimal gewaschen,
und mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)-markiertem Sekundärantikörper in
10 % Ziegenserum (1:200) inkubiert. Die Bildaufnahmen wurden unter
Verwendung eines abtastenden konfokalen Lasermikroskops von Zeiss
angefertigt.
-
Die
RKO-Zellen wurden auf Laminin beschichteten Deckgläschen kultiviert
und mit liposomalen Oligonukleotidformulierungen in einer Endkonzentration
von 10 μM
bei 37°C
in einem 5 % CO2-Inkubator für 3 Tage inkubiert.
4 Stunden nach der Bestrahlung mit 10 Gy wurden die Zellen zweimal
mit PBS gewaschen, dann mit 4 % Paraformaldehyd für 10 Minuten
fixiert und zweimal in PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 10 %
Ziegenserum in PBS blockiert, mit p53-Antikörper (AB-2, Calbiochem) in
10 %-igem Ziegenserum (1:75) inkubiert, zweimal gewaschen und mit
Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)-markiertem Sekundärantikörper in
10 %-igem Ziegenserum (1:200) inkubiert. Die konfokale Mikroskopie
wurde unter Verwendung eines konfokalen Abtastungslasermikroskops
von Zeiss durchgeführt.
-
Antisense & DNA-Verfahren
-
P-Ethoxy-Oligonukleotide,
ein nicht-ionisches und Nuklease-resistentes Phosphodiester-Analogon, wurden
von Oligo Therapeutics (Willsonville, OR) gekauft. Ein Oligonukleotid,
das spezifisch für
die Translationsinitiationsstelle der humanen bcl-2 mRNA ist: 5'CAGCGTGCGCCATCCTTC3' (SEQ ID NR:1) wurde
als Antisense-Oligonukleotid verwendet. Das Kontroll-Oligonukleotid,
das verwendet wurde, war eine durcheinander gebrachte Version des
Bcl-2-Antisense-Oligonukleotids 5'ACGGTCCGCCACTCCTTCCC 3' (SEQ ID NR:2). P-Ethoxy-Oligonukleotide,
in DMSO aufgelöst,
wurden zu Phospholipiden (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) in
Anwesenheit eines Überschusses
von tert.-Butanol hinzugefügt.
Das Gemisch wurde in einem Wasserbad aus Trockeneis/Aceton gefroren, über Nacht
lyophylisiert und mit 0,9 %-iger Saline in einer Oligonukleotidendkonzentration
von 0,1 mmol/L hydratisiert. Leere Liposomen wurden identisch wie
oben zubereitet, mit der Ausnahme, dass die Oligonukleotide nicht
bei der Zubereitung eingeschlossen wurden. 0,25 × 105-Zellen/mL wurden in 24-Lochplatten in
0,5 mL des entsprechenden Mediums ausgesät. Die Zellen wurden mit Antisense-,
Kontroll-Oligonukleotiden und leeren Liposomen in einer Endkonzentration
von 10 μM
bei 37°C
in einem 5 % CO2-Inkubator für
3 Tage inkubiert. Western-Blots der Gesamtzellextrakte (40 μg) der Kontroll-
und bcl-2-transfizierten Klone wurden mittels Immunblots auf bcl-2-Protein
unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen bcl-2 (Santa Cruz
Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA) analysiert.
-
Analyse der
Proteinexpression in Zell- und Kernextrakten
-
Western-Blot-Analyse
der Induktion des p53-Proteins und Kernimport infolge von γ-Bestrahlung. Subkonfluente
Kulturen von Kontroll-LNCaP- und LNCaP-bcl-2-Zellen wurden mit 20
Gy bestrahlt. Kernextrakte wurden durch Abschaben von Zelleinzelschichten
in hypotonischem Lysepuffer (100 mM Hepes, pH 7,4, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM β-Mercaptoethanol und 5 ng/ml Leupeptin)
zubereitet. Nach 10 Minuten auf Eis wurde NP-40 zu 0,625 % hinzugefügt und das
rohe Kernpellet durch Zentrifugation bei 2000 × g für 5 Minuten rückgewonnen.
Die Kernpellets wurden in SDS-PAGE-Probenladepuffer lysiert. Kernextrakte
und Gesamtzellextrakte wurden 2 und 4 h nach Bestrahlung zubereitet. Äquivalente
Mengen an Lysaten wurden mittels Immunblots mit p53-Antikörper (Santa
Cruz) analysiert.
-
Die
Kernextrakte wurden zubereitet durch Abschaben von Zelleinzelschichten
in hypotonischem Lysepuffer (100 mM Hepes, pH 7,4, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM β-Mercaptoethanol und 5 ng/ml
Leupeptin) zubereitet. Nach 10 Minuten auf Eis wurde NP-40 zu 0,625
hinzugefügt
und das rohe Kernpellet durch Zentrifugation bei 2000 × g für 5 Minuten
rückgewonnen.
Die Kernpellets wurden in SDS-PAGE-Probenladepuffer lysiert.
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BEISPIEL 5: In vivo-Test
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In
einer ursprünglichen
Runde von in vivo-Versuchen wurden 30 Nackt (nu/nu)-Mäuse im Alter
zwischen 5–6
Wochen jeweils intraperitoneal 3 Millionen Johnson-Zellen, follikuläre Lymphomzellen,
die die t(14;18)-Translokation tragen, injiziert. Drei Gruppen à 10 Mäuse wurden
verwendet: Unbehandelte Mäuse (Gruppe
I), mit liposomalem p53-Ethoxy-bcl-2-Antisense behandelte Mäuse (Gruppe
In und mit liposomalem Bcl-2-Kontroll behandelte Mäuse (Gruppe
III). Ab einer Woche nach der Tumorimplantation wurde den Mäusen der
Gruppen II und III alle 14 Tage („biweekly") eine intravenöse Injektion von liposomalen
Bcl-2-Antisense-Oligos
oder liposomalen Bcl-2-Kontroll-Oligos verabreicht. Die Oligo-Dosis
betrug 15 mg/kg Körpergewicht
der Maus.
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Für einige
Mäuse wurde
beobachtet, dass sie den Sterbestatus (der definiert ist als eine
Tumorgröße, die
1,5 cm3 übersteigt)
am Tag 50 erreichten. Am Tag 70 nach der Implantation (63 Tage der
Behandlung) hatten 6 Mäuse
(60 %) der Gruppen I und III den Sterbestatus erreicht und wurden
getötet,
während
nur 2 Mäuse (20
%) der Gruppe II den Sterbestatus erreicht hatten und getötet wurden.
Eine weitere Maus erreicht den Sterbestatus am Tag 77 (70 Behandlungstage).
Die Studie wurde am Tag 78 beendet. Gewebe von der Leber, der Niere,
der Milz, dem Herz, den Lungen, dem Magen, dem Darm und Knochenmark
wurden für
histopathologische Studien gesammelt. Daher geben die vorläufigen in
vivo-Ergebnisse an, dass die Antisense-Bcl-2 (-Oligos), die in neutralen
Liposomen zugeführt
worden waren, wirksam beim Inhibieren follikulärer Lymphome in Mäusen sind.
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BEISPIEL 6: Klinische
Versuche
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Dieses
Beispiel beschäftigt
sich mit der Entwicklung von humanen Behandlungsprotokollen unter
Verwendung der Lipid-assoziierten Oligo- und Polynukleotidzusammensetzungen.
Diese Lipidformulierungen werden von Nutzen für die klinische Behandlung
verschiedener bcl-2-überexprimierender
Krebsarten und Erkrankungen sein, in denen transformierte oder krebsartige
Zellen eine Rolle spielen. Solch eine Behandlung wird ein besonders
nützliches
Handwerkszeug bei der Anti-Tumortherapie, beispielsweise bei der
Behandlung von Patienten mit FL, sein. Diese Behandlung wird ebenfalls
nützlich
sein beim Behandeln anderer Zustände, die
durch bcl-2-Überexpression
vermittelt werden und resistent gegenüber konventionellen Kuren und
Behandlungen sind, beispielsweise hämatologische bösartige
Erkrankungen, sowohl Leukämien
als auch Lymphome, einschließlich
follikulären
und nicht-follikulären
Lymphomen, chronische Lymphozytenleukämie, und Plasmazelldyskrasien,
feste Tumore wie jene, die mit Brust-, Prostata- und Kolonkrebs
assoziiert sind und Immunstörungen.
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Die
verschiedenen Elemente des Durchführens von klinischen Versuchen
einschließlich
der Behandlung von Patienten und deren Überwachung wird dem Fachmann
im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Die folgende
Information wird als allgemeiner Leitfaden zur Verwendung bei der
Etablierung Lipid-assoziierter Oligo- und Polynukleotidzusammensetzungen
alleine oder in Kombinationen mit Anti-Krebswirkstoffen in klinischen
Versuchen dargelegt.
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Kandidaten
für die
klinischen Versuche der ersten Phase werden Patienten sein, bei
denen alle konventionellen Therapien versagt haben. Liposomale Bcl-2-Antisense-Oligos
werden an sie intravenös
auf einer vorläufig
wöchentlichen
Basis verabreicht. Um den Erkrankungsverlauf zu überwachen und die Anti-Tumorreaktionen
zu bewerten, wird erwogen, dass die Patienten auf geeignete Tumormarker
jeden Monat untersucht werden sollten. Um die Effektivität des Wirkstoffs
zu bewerten, werden die folgenden Parameter überwacht: Tumorgröße und Knochenmarksinfiltration
der Krebszellen. Tests, die verwendet werden, um den Fortschritt der
Patienten und die Wirksamkeit der Behandlungen zu überwachen,
schließen
ein: physische Untersuchung, Röntgenstrahlung,
Blutuntersuchungen und andere Methoden klinischer Labore. Darüber hinaus
wird peripheres Blut und Proben des Knochenmarks gezogen werden,
um die Modifikation der Zielproteinexpression zu bewerten. Die Dosen,
die in Untersuchungen der Phase I gegeben werden, werden erhöht werden,
wie es in standardmäßigen klinischen
Versuchen der Phase I gemacht wird, d.h. die Dosen werden erhöht werden,
bis die maximal erträglichen
Bereiche erreicht sind.
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Klinische
Reaktionen können
durch geeignete Maßnahmen
definiert werden. Beispielsweise kann eine vollständige Reaktion
definiert werden durch vollständiges
Verschwinden eines Beweises für
Krebszellen für
mindestens 2 Monate. Dem gegenüber
kann eine Teilreaktion als eine 50 %-ige Reduktion an Krebszellen für mindestens
2 Monate definiert werden.
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BEISPIEL 7: Behandlung
am Menschen und klinische Protokolle
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Dieses
Beispiel beschreibt ein Protokoll, um die Behandlung von bcl-2-vermittelten
Erkrankungen unter Verwendung von Lipid-assoziierten Oligo- oder
Polynukleotidzusammensetzungen alleine oder in Kombination mit Anti-Krebswirkstoffen
zu erleichtern.
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Typischerweise
sind Patienten, die Kandidaten für
die Behandlung sind, jene mit FL, obwohl Patienten mit hämatologischen
bösartigen
Erkrankungen, sowohl Leukämien
als auch Lymphomen, festen Tumoren wie jene, die mit Brust-, Prostata-
und Kolonkrebs assoziiert sind und Immunstörungen ebenfalls mit den Verfahren dieser
Erfindung behandelt werden können.
Der typische Behandlungsverlauf wird je nach dem individuellen Patienten
und der Erkrankung, die behandelt wird, in bestimmter, dem Fachmann
bekannter Weise variieren. Beispielsweise kann ein Patient mit FL
in Zyklen à 8
Wochen behandelt werden, obwohl eine längere Dauer verwendet werden
kann, wenn keine nachteiligen Wirkungen beim Patienten beobachtet
werden, und kürzere Behandlungszeiten
resultieren können,
wenn der Patient die Behandlung nicht wie erhofft verträgt. Jeder
Zyklus wird aus zwischen 20 und 35 individuellen Dosen, die gleichmäßig verteilt
sind, bestehen, obwohl dies ebenfalls in Abhängigkeit von der klinischen
Situation variiert werden kann.
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Ein
Patient, der eine bcl-2-vermittelte Erkrankung hat, wie FL, kann
unter Verwendung des folgenden Protokolls behandelt werden. Die
Patienten können,
müssen
aber nicht, ihre vorhergehende chemo-, radio- oder gentherapeutische
Behandlung erhalten haben. Optimalerweise wird der Patient eine
adäquate
Knochenmarksfunktion aufweisen (definiert als Anzahl peripherer
absoluter Granulozyten von > 2.000/mm3 und Anzahl der Blutplättchen von 100.000/mm3, adäquater
Leberfunktion (Bilirubin 1,5 mg/dl) und adäquater renaler Funktion (Kreatinin
1,5 mg/dl).
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Die Überexpression
von bcl-2 wird typischerweise vor, während und nach der Therapie überwacht. Eine
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird typischerweise oral
oder parenteral in Einheitsdosisformulierungen, die einen standardmäßigen, gut
bekannten nichttoxischen, physiologisch verträglichen Träger, Adjuvanzien und Vehikel
wie gewünscht
enthalten, verabreicht werden. Der Ausdruck parenteral, wie hierin verwendet,
schließt
subkutane Injektionen, intravenöse,
intramuskuläre,
intraarterielle Injektion oder Infusionstechniken mit ein. Die Lipid-assoziierten
Oligo- oder Polynukleotidzusammensetzungen können dem Patienten vor, nach
oder gleichzeitig mit anderen Anti-Krebswirkstoffen zugeführt werden.
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Ein
typischer Behandlungsverlauf kann ungefähr sechs Dosen, die über einen
Zeitraum von 7 bis 21 Tage zugeführt
werden, umfassen. Nach Auswahl des klinischen Arztes kann die Kur
fortgesetzt werden mit sechs Dosen alle drei Wochen oder auf einer
weniger häufigen
Basis (monatlich, alle 2 Monate, vierteljährlich etc.). Natürlich sind
dies bloß beispielhafte
Zeiten für
die Behandlung und der Fachmann wird einfach erkennen, dass viele
andere Zeitabläufe
möglich
sind.
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Um
bcl-2-überexprimierende
Krebszellen unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen, die
in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, abzutöten, wird
man im Allgemeinen eine Zielzelle mit den Lipid-assoziierten Formulierungen,
die zuvor beschrieben wurden, in Kontakt bringen. Diese Zusammensetzungen
werden in einer Menge zur Verfügung
gestellt werden, die wirksam ist, um die Proliferation der Zelle zu
inhibieren oder die Zelle abzutöten.
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Örtliche
Zufuhr der Lipid-assoziierten Formulierungen wird ein effizientes
Verfahren zur Zufuhr einer therapeutisch wirksamen Dosis sein, um
der klinischen Erkrankung entgegen zu wirken. Alternativ kann die systemische
Zufuhr geeignet sein. Die therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden
Erfindung kann an dem Patienten direkt an der Stelle des Tumors
verabreicht werden. Das ist im Prinzip eine topische Behandlung
der Oberfläche
des Krebs. Das Zusammensetzungsvolumen sollte normalerweise ausreichen,
um zu gewährleisten,
dass die gesamte Oberfläche
des Tumors in Kontakt gebracht wird mit der Lipid-assoziierten Oligo-
oder Polynukleotidzusammensetzung.
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In
einer Ausführungsform
bringt die Verabreichung einfach die Injektion der therapeutischen
Zusammensetzung in den Tumor mit sich. In einer anderen Ausführungsform
wird ein Katheter in die Tumorstelle eingesetzt und die Höhle kann
kontinuierlich für
einen gewünschten
Zeitraum gespült
werden.
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Natürlich können die
oben beschriebenen Behandlungsschemata in Übereinstimmung mit dem Wissen,
das man aus klinischen Versuchen, wie jenen, die in Beispiel 5 beschrieben
sind, erhält,
verändert
werden. Der Fachmann wird in der Lage sein, die Information, die
in dieser Beschreibung offenbart wird, zu nehmen und die Behandlungsschemata
ausgehend von den klinischen Versuchen, die in der Beschreibung
beschrieben sind, zu optimieren.
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