DE69736331T2 - Immunstimulierende nukleinsaeuremolekuele - Google Patents

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Description

  • Die Arbeiten, die zu dieser Erfindung führten, wurden teilweise durch das National Institute of Health mit Beihilfe Nr. R29-AR42556-01 unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten hat möglicherweise Anspruch auf bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Oligonukleotide und spezieller solche Oligonukleotide, deren Sequenz mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, und die immunstimulierend sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • In den 1970er Jahren berichteten mehrere Forscher, dass DNA-Moleküle mit hohem Molekulargewicht an Zellmembrane binden (Lerner, R.A., et al. 1971. „Membrane-associated DNA in the cytoplasm of diploid human lymphocytes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 68:1212; Agrawal, S.K., R.W. Wagner, P.K. McAllister und B. Rosenberg. 1975. „Cell-surfaceassociated nucleic acid in tumorigenic cells made visible with platinum-pyrimidine complexes by electron microscopy". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:928). 1985 legten Bennett et al. den ersten Beleg dafür vor, dass die DNA-Bindung an Lymphozyten einer Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung ähnlich ist: sie ist saturierbar, kompetitiv und führt zu DNA-Endozytose und zum Abbau zu Oligonukleotiden (Bennett, R.M., G.T. Gabor und M.M. Merritt. 1985. „DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA". J. Clin. Invest. 76:2182). Wie DNA können Oligodesoxyribonkleotide (ODNs), aber in Zellen in einer saturierbaren, sequenzunabhängigen und temperatur- und energieabhängigen Weise eindringen (im Überblick dargstellt von Jaroszewski, J.W., und J. S. Cohen. 1991. „Cellular uptake of antisense Oligodesoxynucleotides". Advanced Drug Delivery Reviews 6.235; Akhtar, S., Y. Shoji, und R.L. Juliano. 1992. "Pharmaceutical aspects of the biological stability and membrane transport characteristics of antisense oligonucleotides". In: Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA. R.P. Erickson und J.G. Izant, Herausgeber Raven Press, Ltd. New York, S. 133; und Zhao, Q., T. Waldschmidt, E. Fisher, C.J. Herrera und A.M. Krieg., 1994. „Stage specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow B cell precursors". Blood, 84:3660). Bisher ist noch kein Rezeptor für die Aufnahme von DNA oder ODNs kloniert worden und man weiß noch nicht, ob die Bindung von ODN und ihre Aufnahme durch Zellen durch den gleichen oder einen anderen Mechanismus erfolgt wie bei DNA mit hohem Molekulargewicht.
  • Es konnte gezeigt werden, dass die Aufnahme von ODN durch Lymphozyten durch Zellaktivierung gesteuert wird. Milzzellen, die mit dem B-Zell-Mitogen LPS stimuliert wurden, zeigten in der B-Zell-Population eine dramatisch erhöhte Aufnahme von ODN, wohingegen Milzzellen, die mit dem T-Zell-Mitogen Con A behandelt waren, eine erhöhte ODN-Aufnahme durch T-Zellen, nicht aber durch B-Zellen, zeigten (Krieg, A.M., F. Gmelig-Meyling, M.F. Gourley, W.J. Kisch, L.A. Chrisey und A.D. Steinberg. 1991. „Uptake of Oligodesoxyribonucleotides by lymphoid cells is heterogenous and inducible". Antisense Research and Development 1:161).
  • Mehrere Polynukleotide wurden ausführlich als Modifikatoren biologischer Reaktionen evaluiert. Das vielleicht beste Beispiel ist Poly (I,C), das ein wirksamer Induktor der IFN-Produktion, aber auch ein Makrophagenaktivator und Induktor von NK-Aktivität ist (Talmadge, J.E., J. Adams, H. Phillips, M. Collins, B. Lenz, M. Schneider, E. Schlick, R. Ruffmann, R. H. Wiltrout und M.A. Chirigos. 1985. „Immunomodulatory effects in mice of polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose". Cancer Res. 45:1058; Wiltrout, R.H., R.R. Salup, T.A. Twilley und J.E. Talmadge. 1985. "Immunomodulation of natural killer activity by polyribonucleotides". J. Biol. Resp. Mod. 4:512; Krown, S.E. 1986. "Interferons and interferon inducers in cancer treatment". Sem. Oncol. 13:207; und Ewel, C.H., S.J. Urba, W.C. Kopp, J.W. Smith II, R.G. Steis, J.L. Rossio, D.L. Longo, M.J. Jones, W.G. Alvord, C.M. Pinsky, J.M. Beveridge, K.L. McNitt und S.P. Creekmore. 1992. "Polyinosinic-polycytidylic acid complexed with poly-L-lysine and carboxymethylcellulose in combination with interleukin-2 in patients with cancer: clinical and immunological effects". Canc. Res. 52:3005). Es scheint, als ob diese murine NK-Aktivierung möglicherweise ausschließlich auf die Induktion der IFN-β-Sekretion zurückzuführen ist (Ishikawa, R. und C.A. Biron. 1993. "IFN induction and associated changes in splenic leukocyte distribution". J. Immunol. 150:3713). Diese Aktivierung war für den Ribosezucker spezifisch, da Desoxyribose keine Wirkung zeigte. Seine starke in vitro Antitumor-Aktivität führte zu verschiedenen klinischen Studien mit Poly (I,C) komplexiert mit Poly-L-Lysin und Carboxymethylcellulose (um den Abbau durch RNAse zu reduzieren) (Talmadge, J.E., et al., 1985, oben zitiert; Wiltrout, R.H. et al., 1985. oben zitiert); Krown, S.E., 1986. oben zitiert); und Ewel, C.H. et al., 1992. oben zitiert). Leider haben toxische Nebenwirkungen bisher verhindert, dass Poly (I,C) ein nützliches therapeutisches Agens werden konnte.
  • Guaninribonukleotide, die an der C8-Position entweder mit einer Brom- oder einer Thiolgruppe substituiert sind, sind B-Zell-Mitogene und können B-Zell-Differenzierungsfaktoren ersetzen (Feldbush, T.L. und Z.K. Ballas. 1985. „Lymphokine-like activity of 8-mercaptoguanosine: induction of T and B cell differentiation". J. Immunol. 134:3204; und Goodman, M.G. 1986. "Mechanism of synergy between T cell signals and C8-substituted guanine nucleosides in humoral immunity: B lymphotropic cytokines induce responsiveness to 8-mercaptoguanosine". J. Immunol. 136:3335). 8-Mercaptoguanosin und 8-Bromguanosin können auch die für die Erzeugung von MHC-beschränkten CTL notwendigen Zytokine ersetzen (Feldbush, T.L., 1985, oben zitiert), die murine NK-Aktivität erhöhen (Koo, G.C., M.E. Jewell, C.L. Manyak, N.H. Sigal und L.S. Wicker. 1988. „Activation of murine natural killer cells and macrophages by 8-bromoguanosine". J. Immunol. 140:3249), und bei der Induktion von muriner LAK-Erzeugung synergistisch mit IL-2 wirken (Thompson, R.A. und Z.K. Ballas 1990. „Lymphokine-activated killer (LAK) cells. V. 8-Mercaptoguanosine as an IL-2-sparing agent in LAK generation". J. Immunol. 145: 3524). Die NK- und LAK-vermehrende Aktivität dieser C8-substituierten Guanosine scheint durch ihre Induktion von IFN bewirkt zu werden (Thompson, R.A., et al. 1990. oben zitiert). Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass ein durch ein Mycobakterium produziertes 5'-triphosphoryliertes Thymidin bei einer Untergruppe der humanen γδ-T-Zellen mitogen ist (Constant, P., F. Davodeau, M.-A. Peyrat, Y. Poquet, G. Puzo, M. Bonneville und J.-J. Fournie. 1994. „Stimulation of human γδ T cells by nonpeptidic mycobacterial ligands" Science 264:267). Diese Veröffentlichung zeigte die Möglichkeit, dass das Immunsystem im Verlauf der Evolution möglicherweise Wege entwickelt hat, bevorzugt auf mikrobielle Nukleinsäuren zu reagieren.
  • Mehrere Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass bestimmte DNA-Strukturen ebenfalls das Potential aufweisen, Lymphozyten zu aktivieren. Zum Beispiel haben Bell et al. berichtet, dass nukleosomale Protein-DNA-Komplexe (nicht aber nackte DNA) in Milzzellüberständen eine B-Zell-Proliferation und Immunglobulin-Sekretion verursachten (Bell, D.A., B. Morrison und P. VandenBygaart. 1990. „Immunogenic DNA-related factors". J. Clin. Invest. 85:1487). In anderen Fällen wurde berichtet, dass nackte DNA Wirkungen auf das Immunsystem hat. Zum Beispiel haben Messina et al. kürzlich berichtet, dass 260 bis 800 by lange Fragmente von Poly (dG)·(dC) und Poly (dG)·(dC) für B-Zellen mitogen waren (Messina, J.P., G.S. Gilkeson und D.S. Pisetsky. 1993. „The influence of DNA structure on the in vitro stimulation of murine lymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens". Cell. Imunol. 147:148). Tokunaga et al. haben berichtet, dass dG·dC γ-IFN- und NK-Aktivität induziert (Tokunaga, S. Yamamoto und K. Namba. 1988. „A synhetic singlestranded DNA, poly(dG, dC), induces interferon-α/b and -g, augments natural killer activity, and suppresses tumor growth" Jpn. J. Cancer Res. 79:682). Neben derartigen künstlichen Homopolymer-Sequenzen berichteten Pisetsky et al., dass reine Säugetier-DNA keine nachweisbaren Wirkungen auf das Immunsystem hatte, aber dass die DNA von bestimmten Bakterien eine B-Zell-Aktivierung und Immunglobulinsekretion induziert (Messina, J.P., G.S. Gilkeson und D.S. Pisetsky. 1991. "Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA". J. Immunol. 147:1759). Wenn man annimmt, dass diese Ergebnisse nicht die Folge einer ungewöhnlichen Kontamination sind, dann legen diese Studien nahe, dass eine besondere Struktur oder sonstige Eigenschaft von bakterieller DNA sie dazu befähigt, eine B-Zell-Aktivierung auszulösen. Untersuchungen an mycobakteriellen DNA-Sequenzen haben gezeigt, dass ODN, die bestimmte palindromische Sequenzen enthalten, NK-Zellen aktivieren können (Yamamoto, S., T. Yamamoto, T. Kataoka, E. Kuramoto, O. Yano und T. Tokunaga. 1992. "Unique palindromic sequences in synthetic oligonucleotides are required to induce INF and augment INF-mediated natural killer activity". J. Immunol. 148:4072; Kuramoto, E., O. Yano, Y. Kimura, M. Baba, T. Makino, S. Yamamoto, T. Yamamoto, T. Yamamoto, T. Kataoka und T. Tokunaga. 1992. "Oligonucleotide sequences required for natural killer cell activation". Jpn. J. Cancer Res. 83:1128).
  • Von mehreren Phosphothioat-modifizierten ODN wurde berichtet, dass sie in der Lage sind, in vitro oder in vivo eine B-Zell-Stimulierung zu induzieren (Tanaka, T., C.C. Chu und W.E. Paul. 1992 "An antisense oligonucleotide complementary to a sequence in Ig2b increases g2b germline transcripts, stimulates B cell DNA synthesis, and inhibits immunoglobulin secretion". J. Exp. Med. 175:597; Branda, R.F., A.L. Moore, L. Mathews, J.J. McCormack und G. Zon. 1993. "Immune stimulation by an antisense oligomer complementary to the rev gene of HIV-1". Biochem. Pharmacol. 45:2037; McIntyre, K.W., K. Lombard-Gillooly, J.R. Perez, C. Kunsch, U.M. Sarmiento, J.D. Larigan, K.T. Landreth und R. Narayanan. 1993. "A sense phosphothioate oligonucleotide directed to the initiation codon of transcription factor NF-κB T65 causes sequence-specific immune stimulation". Antisense Res. Develop. 3:309; und Pisetsky, D.S., und C. F. Reich. 1993. „Stimulation of murine lymphocyte proliferation by a phosphothioate oligonucleotide with antisense activity for herpes simplex virus". Life Sciences 54:101). Diese Berichte legen kein gemeinsames Strukturmotiv oder Sequenzelement in diesen ODN nahe, das ihre Wirkungen erklären könnte.
  • Das das cAMP response element-bindende Protein (CREB) und der aktivierende Transkriptionsfaktor (ATF) oder die CREB/ATF-Familie von Transkriptionsfaktoren sind eine Klasse ubiquitär exprimierter Transkriptionsfaktoren, von denen bisher 11 Mitglieder kloniert worden sind (siehe Überblick von de Groot, R.P. und P. Sassone-Corsi: „Hormonal control of gene expression: Multiplicity and versatility of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-responsive nuclear regulators". Mol. Endocrin. 7:145, 1993; Lee, K.A.W. und N. Masson: "Transcriptional regulation by CREB and its relatives". Biochim. Biophys. Acta 1174:221, 1993). Sie gehören alle zu der basische Region/Leucin-Zipper (bZip)-Klasse von Proteinen. Alle Zellen scheinen ein oder mehrere CREB/ATF-Proteine zu exprimieren, aber die exprimierten Mitglieder und die Regulation des mRNA-Splicings scheinen gewebespezifisch zu sein. Das differenzielle Splicen von Aktivierungsdomänen kann bestimmen, ob ein bestimmtes CREB/ATF-Protein ein Transkriptionsinhibitor oder -aktivator sein wird. Viele CREB/ATF-Proteine aktivieren die virale Transkription, aber einige Splice-Varianten, denen die Aktivierungsdomäne fehlt, sind inhibierend. CREB/ATF-Proteine können DNA als Homo- oder Heterodimere durch das cAMP-responsive element, das CRE, binden, dessen Konsensform die unmethylierte Sequenz TGACGTC ist (die Bindung wird aufgehoben, wenn das CpG methyliert ist) (Iguchi-Ariga, S.M.M. und W. Schaffner: "CpG methylation of the cAMP-responsive enhancer/promoter sequence TGACGTCA abolishes specific factor binding as well as transcriptional activation". Genes & Develop. 3:612, 1989).
  • Die Transkriptionsaktivität des CRE ist während der B-Zell-Aktivierung erhöht (Xie, H. T.C. Chiles und T.L. Rothstein: "Induction of CREB activity via the surface Ig receptor of B cells". J. Immunol. 151:880, 1993). CREB/ATF-Proteine scheinen die Expression zahlreicher Gene durch CRE zu regulieren, einschliesslich immunologisch wichtiger Gene wie fos, jun B, Rb-1, IL-6, IL-1 (Tsukada, J., K. Saito, W.R. Waterman, A.C. Webb und P.E. Auron: "Transcription factors NF-IL6 and CREB recognize a common essential site in the human prointerleukin 1 gene". Mol. Cell. Biol. 14:7285, 1994; Gray, G.D., O.M. Hernandez, D. Hebel, M. Root, J.M. Pow-Sang und E. Wickstrom: "Antisense DNA inhibition of tumor growth induced by c-Ha-ras oncogene in nude mice". Cancer Res. 53:577, 1993), IFN- (Du, W. und T. Maniatis: "An ATF/CREB binding site protein is required for virus induction of the human interferon B gene". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2150, 1992), TGF-1 (Asiedu, C.K., L. Scott, R.K. Assoian, M. Ehrlich: Binding of AP-1/CREB proteins and of MDBP to contiguous sites downstream of the human TGF-B1 gene". Biochim. Biophys. Acta 1219:55, 1994), TGF-2, Klasse II MHC (Cox, P.M. und C.R. Goding: "AnATF/CREB binding motif is required for aberrant constitutive expression of the MHC class II DRa promoter and activation by SV40 T-antigen". Nucl. Acids. Res. 20:4881, 1992), E-Selektin, GM-CSF, CD-8, das Gen der Keimbahn für die konstante Region von Ig, das TCR V-Gen und das nukleäre Antigen proliferierender Zellen (Huang, D., P.M. Shipman-Appasamy, D.J. Orten, S.H. Hinrichs und M.B. Prystowsky: "Promoter activity of the proliferating-cell nuclear antigen gene is associated with inducible CRE-binding proteins in interleukin 2-stimulated T lymphocytes". Mol. Cell. Biol. 14:4233, 1994). Zusätzlich zur Aktivierung durch den cAMP-Signalweg kann CREB auch transkriptionelle Antworten auf Änderungen der intrazellulären Ca-Konzentration vermitteln (Sheng, M., G. McFadden und M.E. Greenberg: "Membrane depolarization and calcium induce c-fos transcription via phosphorylation of transcription factor CREB". Neuron 4.571, 1990).
  • Die Rolle der Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkriptionsaktivierung durch CREB/ATF-Proteine scheint außerordentlich wichtig zu sein. Es gibt mehrere veröffentlichte Arbeiten, in denen von direkten oder indirekten Wechselwirkungen zwischen NFKB-Proteinen und CREB/ATF-Proteinen berichtet wird (Whitley, et al., (1994) Mol. & Cell. Biol. 14:6464; Cogswell, et al. (1994) J. Immun. 153:712; Hines, et al., (1993) Oncogene 8:3189; und Du, et al., (1993) Cell 74:887. Die Aktivierung von CREB durch den zyklischen AMP-Signalweg erfordert die Proteinkinase A (PKA), die ser133 auf CREB341 phosphoryliert und ihm erlaubt, an CBP, ein kürzlich kloniertes Protein, zu binden (Kwok, R.P.S., J.R. Lundblad, J.C. Chrivia, J.P. Richards, H.P. Bachinger, R.G. Brennan, S.G.E. Roberts, M.R. Green und R.H. Goodman: „Nuclear protein CBP is a coactivator for the transcription factor CREB". Nature 370:223, 1994; Arias, J., A.S. Alberts, P. Brindle, F.X. Claret, T. Smea, M. Karin, J. Feramisco und M. Montminy: "Activation of cAMP and mitogen responsive genes relies on a common nuclear factor". Nature 370:226, 1994). CBP wiederum interagiert mit dem basalen Transkriptionsfaktor TFIIB, was zu erhöhter Transkription führt. Es wurde auch berichtet, dass CREB auch mit dTAFII 110 interagiert, einem TATA-bindenden Protein-assoziierten Faktor, dessen Bindung möglicherweise die Transkription reguliert (Ferreri, K., G. Gill und M. Montminy: „The cAMP-regulated transcription factor CREB interacts with a component of the TFIID complex". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1210, 1994). Zusätzlich zu diesen Wechselwirkungen können CREB/ATF-Proteine spezifisch zahlreiche andere nukleäre Faktoren binden (Hoeffler, J.P., J.W. Lustbader und C.-Y. Chen: „Identification of multiple nuclear factors that interact with cyclic adenosine 3',5'-monophosphate response elementbinding protein and activating transcription factor-2 by protein-protein interactions". Mol. Endocrinol. 5:256, 1991), die biologische Bedeutung der meisten dieser Wechselwirkungen ist aber unbekannt. Nach allgemeiner Auffassung bindet CREB DNA entweder als ein Homodimer oder als ein Heterodimer mit mehreren anderen Proteinen. Überraschenderweise aktivieren CREB-Monomere die Transkription konstitutiv (Krajewski, W. und K.A.. W. Lee: "A monomeric derivative of the cellular transcription factor CREB functions as a constitutive activator". Mol. Cell. Biol. 14:7204, 1994).
  • Es konnte kürzlich gezeigt werden, dass CREB/ATF-Proteine neben ihrer entscheidenden Rolle bei der Regulierung der zellulären Transkription von einigen infektiösen Viren und Retroviren vereinnahmt werden, die sie für die virale Replikation benötigen. Beispielsweise enthält der immediate early Promoter des Cytomegalievirus, einer der stärksten bekannten Säugetierpromotoren, elf Kopien von CRE, die für die Promotorfunktion notwendig sind (Chang, Y.-N., S. Crawford, J. Stall, D.R. Rawlins, K.-T. Jeang und G.S. Hayward: „The palindromic series I repeats in the simian cytomegalovirus major immediate-early promoter behave as both strong basal enhancers and cyclic AMP response elements". J. Virol. 64:264, 1990). Mindestens einige der Transkriptions-aktivierenden Wirkungen des adenoviralen E1A-Proteins, das zahlreiche Promotoren induziert, sind auf seine Bindung an die DNA-bindende Domäne des CREB/ATF-Proteins, ATF-2, zurückzuführen, das die E1A-induzierbare Transkriptionsaktivierung vermittelt (Liu, F. und M.R. Green: „Promoter targeting by adenovirus E1a through interaction with different cellular DNA-binding domains". Nature 368:520, 1994). Es wurde auch vorgeschlagen, dass E1A an das CREB-bindende Protein, CBP, bindet (Arany, Z., W.R. Sellers, D.M. Livingston und R. Eckner: „E1A-associated p300 and CREB-associated CBP belong to a conserved family of coactivators". Cell 77:799, 1994). Das humane T-lymphotrope Virus-I (HTLV-1), das Retrovirus, das die menschliche T-Zell-Leukämie und die tropische spastische Parese verursacht, benötigt ebenfalls CREB/ATF- Proteine für die Replikation. In diesem Fall produziert das Retrovirus ein Protein, Tax, das an CREB/ATF-Proteine bindet und sie von ihren normalen zellulären Bindungsstellen zu anderen DNA-Sequenzen (von G- und C-reichen-Sequenzen flankierten) umlenkt, die sich innerhalb des HTLV transcriptional enhancer befinden (Paca-Uccaralertkun, S., L.-J. Zhao, N. Adya, J.V. Cross, B.R. Cullen, I.M. Boros und C.-Z. Giam: „In vitro selection of DNA elements highly responsive to the human T-cell lymphotropic virus type I transcriptional activator, Tax". Mol. Cell. Biol. 14:456, 1994; Adya, N., L.-J. Zhao, W. Huang, I. Boros und C.-Z. Giam: "Expansion of CREB's DNA recognition specificity by Tax results from interaction with Ala-Ala-Arg at positions 282–284 near the conserved DNA-binding domain of CREB". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5642, 1994).
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass bestimmte Nukleinsäuren, die unmethylierte Cytosin-Guanin-(CpG)-Dinukleotide enthalten, in einem LebewesenLymphozyten aktivieren und die Immunantwort dieses Lebewesens von Th2 nach Th1 umlenken (z.B. dadurch, dass monozytische Zellen und andere Zellen induziert werden, Th1-Zytokine, darunter IL-12, IFN-y und GM-CSF, zu produzieren). Ausgehend von diesem Ergebnis stellt die Erfindung neuartige Verwendungen von immunstimulierenden Oligonukleotide bereit.
  • In einem Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder die Vorbeugung von Asthma vor, wobei das immunstimulierende Oligonukleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierendes Oligonukleotid, das mindestens ein unmethylieres CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines oral zu verabreichenden Medikamentes zur Behandlung oder Vorbeugung von Asthma vor.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung oder Verhinderung von Allergien vor, wobei das immunstimulierende Oligonukleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikaments für die orale Einnahme zur Behandlung oder Vorbeugung von Allergien vor.
  • In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung eines immunstimulierenden Oligonukleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Ekzemen, allergischer Rhinitis, Nasenkatarrh, Heuschnupfen, Nesselausschlag oder Lebensmittelallergien vor.
  • In einer Ausführungsform ist das immunstimulierende Oligonukleotid eine isolierte immunstimulierende Nukleinsäuresequenz, die ein CpG-Motiv umfasst, das durch die Formel: 5'N1X1CGX2N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinanderfolgende CpGs trennt; X1 Adenin, Guanin oder Thymin ist; X2 Cytosin oder Thymin ist; N irgendein Nukleotid ist und N1 + N2 etwa 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten; und dass die Nukleinsäuresequenz etwa 8–30 Basen lang ist.
  • In einer anderen Ausführungsform ist das immunstimulierende Oligonukleotid eine isolierte immunstimulierende Nukleinsäuresequenz, die ein CpG-Motiv enthält, das durch die folgende Formel: 5'N1X1X2CGX3X4N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nukleotid aufeinanderfolgende CpG trennt; X1X2 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA, ApT und ApA; X3X4 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT oder CpT; N irgendein Nukleotid ist und N1 + N2 etwa 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten; und dass die Nukleinsäuresequenz etwa 8–30 Basen lang ist.
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind bei der Stimulierung der Immunaktivierung in einem Lebewesen, insbesondere einem Menschen, nützlich. Die Immunaktivierung kann vorwiegend ein Th1-Muster der Immunaktivierung bewirken.
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide der Erfindung können ebenfalls dazu benutzt werden, andere Störungen (z.B. einen Tumor oder Krebs oder eine virale, Pilz-, bakterielle oder Parasiten-Infektion) zu behandeln, vorzubeugen, oder sie zu lindern. Zusätzlich können die immunstimulierenden Oligonukleotide verabreicht werden, um die Antwort eines Lebewesens auf einen Impfstoff zu stimulieren. Weiterhin können die immunstimulierenden Oligonukleotide der Erfindung dadurch, dass sie die Immunantwort eines Lebewesens von Th2 nach Th1 umlenken, einem Lebewesen in Verbindung mit einem bestimmten Allergen als eine Art Desensibilisierungstherapie verabreicht werden, um das Auftreten einer allergischen Reaktion, die mit einer asthmatischen Störung zusammenhängt, zu behandeln oder zu verhindern.
  • Weiterhin unterstützt die Fähigkeit der Nukleinsäuresequenzen der hierin beschriebenen Erfindung, Leukämiezellen dazu zu veranlassen, in den Zellzyklus einzutreten, ihre Verwendung bei der Behandlung von Leukämie durch Erhöhung der Empfindlichkeit von chronischen Leukämiezellen gefolgt von einer konventionellen ablativen Chemotherapie oder durch die Kombination der Nukleinsäuresequenzen mit anderen Therapien des Immunsystems.
  • Andere Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden aus der folgenden genauen Beschreibung und den Ansprüchen deutlicher werden.
  • Kurzbeschreibung der Figuren
  • 1A–C sind Kurven, die die dosisabhängige IL-6-Produktion als Reaktion auf verschiedene DNA-Sequenzen in Milzzellkulturen mit vermindertem T-Zell-Gehalt graphisch darstellen.
  • 1A. E. coli-DNA (1) und Kalbsthymus-DNA (n) Sequenzen und LPS (10 × höher konzentriert als E. coli- und Kalbsthymus-DNA (u).
  • 1B. Kontroll-Phosphodiester-Oligodesoxynukleotide (ODN) 5'ATGGAAGGTCCAGTGTTCTC3' (SEQ ID No: 1) (n) und zwei Phosphodiester-CpG-ODN 5'ATCGACCTACGTGCGTTCTC3' (SEQ ID No: 2) (u) und 5'TCCATAACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 3) (1).
  • 1C. Kontroll-Phosphothioat-ODN 5'GCTAGATGTTAGCGT3' (SEQ ID No: 4) (n) und zwei Phosphothioat-CpG-ODN 5'GAGAACGTCGACCTTCGAT3' (SQ ID No: 5) (u) und 5'GCATGACGTTGAGCT3' (SEQ ID No: 6) (1). Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert einer Dreifachbestimmung + Standardabweichung.
  • 2 ist eine Kurve, die die durch CpG-DNA in vivo induzierte IL-6-Produktion darstellt, wie sie 1–8 Std. nach der Injektion bestimmt wurde. Die Ergebnisse zeigen den Mittelwert einer Zweifachbestimmung von Seren von zwei Mäusen. BALB/c-Mäuse (zwei Mäuse/Gruppe) erhielten eine i.v. Injektion von 100 μl PBS (o) oder 200 μg CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 7) (n) oder nicht-CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (SEQ ID No: 8) (u).
  • 3 ist ein Autoradiogramm, das die durch reverse transcription polymerase chain reaction bestimmte IL-6 mRNA-Expression in Leber, Milz und Thymus nach verschiedenen Zeitspannen nach in vivo-Stimulierung von BALB/c-Mäusen (zwei Mäuse/Gruppe) zeigt, denen i.v. 100 μl PBS, 200 μg CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 7) oder nicht-CpG-Phosphothioat-ODN 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (SEQ ID No: 8) injiziert wurden.
  • 4A ist eine Kurve, die die dosisabhängige Inhibierung von CpG-induzierter IgM-Produktion durch anti-IL-6 darstellt. B-Zellen der Milz von DBA/2-Mäusen wurden mit CpG ODN 5'TCCAAGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 9) in Anwesenheit der angegebenen Konzentrationen von neutralisierendem anti-IL-6 (u) oder Isotyp-Kontrolle Ab (1) stimuliert und die IgM-Titer in Kultwüberständen durch ELISA bestimmt. In Abwesenheit von CpG ODN zeigte der anti-IL-6 Ab keine Wirkung auf die IgM-Sekretion (n).
  • 4B ist eine Kurve, die den Stimulierungsindex von CpG-induzierten B-Zellen der Milz darstellt, die mit anti-IL-6 und CpG-S-ODN 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3' (SEQ ID No: 7) (u) oder nur mit anti-IL-6-Antikörper (n) inkubiert wurden. Die Daten zeigen den Mittelwert von Dreifachmessungen + Standardabweichung.
  • 5 ist ein Balkendiagramm, das die Chloramphenicolacetyltransferase (CAT)-Aktivität von WEHI-231-Zellen zeigt, die mit einem CAT-Konstrukt ohne Promotor (pCAT), einem positiven Kontrollplasmid (RSV) oder einem IL-6 Promotor-CAT-Konstrukt alleine transfiziert oder mit CpG 5'TCCATGACGTTCCTGATGCT3'- (SEQ ID No: 7) oder nicht-CpG 5'TCCATGAGCTTCCTGAGTCT3' (SEQ ID No: 8)-Phosphothioat-ODN bei der angegebenen Konzentrationen inkubiert wurden. Die Daten zeigen den Mittelwert von Dreifachmessungen.
  • 6 ist ein schematischer Überblick über die Immunwirkungen der immunstimulierenden, unmethylierten, CpG enthaltenden Nukleinsäwen, die wie abgebildet sowohl direkt B-Zellen als auch monozytische Zellen (einschliesslich Makrophagen und dendritische Zellen) direkt aktivieren können. Die immunstimulierenden Oligonukleotide aktivieren gereinigte NK-Zellen nicht direkt, aber verleihen ihnen die Fähigkeit, auf IL-12 mit einem deutlichen Anstieg ihrer IFN-γ-Produktion zu reagieren. Durch die Induktion der IL-12-Produktion und die nachfolgend erhöhte IFN-γ-Sekretion durch NK-Zellen fördern die immunstimulierenden Nukleinsäwen eine Immunantwort des Th1-Typs. Es konnte keine direkte Aktivierung der Vermehrung der Zytokinsekretion durch hochgereinigte T-Zellen festgestellt werden. Allerdings fördert die Induktion der Th1-Zytokinsekretion durch die immunstimulierenden Oligonukleotide die Entwicklung einer zytotoxischen Lymphozyten-Reaktion.
  • 7 ist ein Autoradiogramm, das die NFkB-mRNA-Induktion bei Monozyten, die mit E. coli (EC)-DNA (die unmethylierte CpG-Motive enthält), Kontroll-(CT)-DNA (enthält keine unmethylierten CpG-Motive) und Lipopolysaccharid (LPS) behandelt wurden, zu verschiedenen gemessenen Zeiten, 15 und 30 Minuten nach dem Kontakt, zeigt.
  • 8A zeigt die Ergebnisse einer Durchflusszytometrie-Studie unter Verwendung von Maus-B-Zellen mit dem Farbstoff Dihydrorhodamin 123, um die Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies zu bestimmen. Die Probe in Feld A der Figur, die nur den Farbstoff enthält, zeigt, dass die Hintergrundkonzentration an Zellen, die positiv auf den Farbstoff reagieren, bei 28,6% liegt. Bei Zellen, die 20 Minuten mit PMA und Ionomycin, einer Positiv-Kontrolle (Feld B), behandelt wurden, war diese Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies stark auf 80% erhöht. Die Zellen, die mit dem CpG-Oligo (TCCATGACGTTCCTGACGTT SEQ ID No. 10) behandelt wurden, zeigten auch eine Erhöhung der Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies, so dass mehr als 50% der Zellen positiv wurden (Feld D). Hingegen zeigten Zellen, die mit einem Oligonukleotid mit – abgesehen davon, dass die CpGs umgedreht waren – identischer Sequenz behandelt wurden, (TCCATGAGCTTCCTGAGTGCT SEQ ID NO. 11), diese erhebliche Zunahme der Konzentration reaktive Sauerstoffspezies nicht (Feld E).
  • 8B zeigt die Ergebnisse einer Durchflusszytometrie-Studie unter Verwendung von Maus-B-Zellen mit dem Farbstoff Dihydrorhodamin 123 zur Bestimmung der Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies in Anwesenheit von Chloroquin. Chloroquin erniedrigt die Hintergrundkonzentration an reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen leicht, so dass von den unbehandelten Zellen in Feld A nur 4,3% positiv sind. Chloroquin hebt die Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies in den mit CpG-DNA behandelten Zellen völlig auf (Feld B), reduziert aber nicht die Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies in Zellen, die mit PMA und Ionomycin behandelt wurden (Feld E).
  • 9 stellt eine Auftragung der bei Lungenspülung erhaltenen Zellzahlen gegen die Zeit dar. Die Kurve zeigt, dass viele Entzündungszellen in den Lungen vorhanden sind, wenn den Mäusen zunächst Schistosoma mansoni-Eier „Ei" injiziert werden, was eine Th2-Immunreaktion induziert, und sie anschließend Schistosoma mansoni-Ei-Antigen „SEA" inhalieren (offene Kreise). Wenn den Mäusen jedoch zusammen mit dem Ei zunächst CpG-Oligo (SEQ ID No: 10) gegeben wird, nimmt die Zahl der Entzündungszellen in der Lunge durch die anschließende Inhalation von SEA nicht zu (offene Dreiecke).
  • 10 stellt eine Auftragung der bei Lungenspülung erhaltenen Eosinophilenzahlen gegen die Zeit dar. Die Kurve zeigt erneut, dass viele Eosinophile in den Lungen vorhanden sind, wenn den Mäusen zunächst Ei eingespritzt wird und sie anschließend SEA inhalieren (offener Kreis). Wenn den Mäusen jedoch zunächst zusammen mit dem Ei auch CpG-Oligo (SEQ ID NO. 10) verabreicht wird, wird die Zahl der Entzündungszellen durch die nachfolgende Inhalation von SEA nicht erhöht (offene Dreiecke).
  • 11 zeigt ein Balkendiagramm, das die durch die Einwirkung von Salzlösung ohne weitere Zugaben; Ei, dann SEA; Ei und SEQ ID No. 11, dann SEA; und Ei und Kontroll-Oligo (SEQ ID No. 11), dann SEA, induzierte Wirkung auf den Prozentanteil von Makrophagen, Lymphozyten, Neutrophilen und Eosinophilen zeigt. Wenn die Mäuse zur Zeit der ersten Einwirkung des Eis mit dem Kontroll-Oligo behandelt werden, kann man nach der Inhalation von SEA kaum eine Wirkung auf den nachfolgenden Einstrom von Eosinophilen in die Lungen feststellen. Demnach entwickeln die Mäuse eine akute Entzündungsreaktion in den Lungen, wenn sie die Eier an den Tagen 14 oder 21 inhalieren. Jedoch hebt die Gabe eines CpG-Oligos zusammen mit den Eiern zur Zeit der ersten Antigeneinwirkung an den Tagen 0 und 7 die Zunahme an Eosinophilen fast komplett auf, wenn die Mäuse das Ei-Antigen am 14. Tag inhalieren.
  • 12 zeigt ein Balkendiagramm, das die Eosinophilenzahlen als Reaktion auf die Injektion verschiedener Mengen des Schutz-Oligos SEQ ID No. 10 zeigt.
  • 13 stellt eine Auftragung der Interleukin 4 (IL-4)-Produktion (pg/ml) von Mäusen gegen die Zeit als Reaktion auf die Injektion von Ei, dann SEA (offene Raute); Ei und SEQ ID No. 10, dann SEA (offener Kreis); oder Salzlösung, dann Salzlösung (offenes Quadrat) dar. Die Kurve zeigt, dass die resultierende Entzündungsreaktion mit den Konzentrationen des Th2-Zytokins IL-4 in der Lunge korreliert.
  • 14 ist ein Balkendiagramm, das die Interleukin 12 (IL-12)-Produktion (pg/ml) in Mäusen über die Zeit als Reaktion auf die Einspritzung von Salzlösung; Ei, dann SEA; oder SEQ ID No. 10 und Ei, dann SEA, zeigt. Die Kurve zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotids, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, tatsächlich die Zytokinantwort der Lunge auf die Produktion von IL-12 umlenkt, was eine Th1-Typ Immunantwort anzeigt.
  • 15 ist ein Balkendiagramm, das die Interferon gamma (IFN-γ)-Produktion (pg/ml) in Mäusen über der Zeit als Reaktion auf die Injektion von Salzlösung; Ei, dann Salzlösung; oder SEQ ID No. 10 und Ei, dann SEA, zeigt. Die Kurve zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotids, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, ebenfalls die Zytokinreaktion der Lunge zur Produktion von IFN-g umlenkt, was eine Th1-Typ-Immunantwort anzeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen
  • Hierin sollen die folgenden Begriffe und Formulierungen die folgenden Bedeutungen haben:
    Als „Allergen" wird eine Substanz bezeichnet, die in einem empfindlichen Lebewesen eine allergische oder asthmatische Reaktion hervorrufen kann. Die Liste von Allergenen ist enorm und kann Pollen, Insektengifte, Tierstaub und -schuppen, Pilzsporen und Medikamente (z.B. Penicillin) umfassen. Beispiele für natürliche, tierische und pflanzliche Allergene umfassen Proteine, die für die folgenden Gattungen spezifisch sind: Canine (Canis familiaris); Dermatophagoides (z.B. Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia) Lolium (z.B. Lolium perenne oder Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinosa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artermisia (Artermisia vulgaris); Plantago (z.B. Plantago lanceolata); Parietaria (z.B. Parietaria officinalis oder Parietaria judaica); Blattella (z.B. Blattella germanica); Apis (z.B. Apis multiflorum); Cupressus (Cupressus sempervirens, Cupressus arzonica und Cupressus macrocarpa); Juniperus (z.B. Juniperus sabinoides, Juniperus virginia, Juniperus communis und Juniperus ashei); Thuya (z.B. Thuya orientalis); Chamaecyparis (z.B. Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (z.B. Periplaneta americana); Agropyron (z.B. Agropyron repens); Secale (z.B. Secale cereale); Triticum (z.B. Triticum aestivum); Dactylis (z.B. Dactylis glomerata); Festuca (z.B. Festuca elatior); Poa (Poa pratensis oder Poa compressa); Avena (z.B. Agena sativa); Holcus (z.B. Holcus lanatus); Antoxanthum (z.B. Anthxanthum odoratum); Arrhenatherum (z.B. Arrhenatherum elatius); Agrostis (z.B. Agrostis alba); Phleum (z.B. Phleum pratense); Phalaris (z.B. Phalaris arundinacea); Paspalum (z.B. Paspalum notatum); Sorghum (z.B. Sorghum halepensis); und Bromus (z.B. Bromus inermis).
  • Als „Allergie" wird eine erworbene Überempfindlichkeit gegen eine Substanz (Allergen) bezeichnet. Allergischen Zuständen umfassen Ekzeme, allergische Rhinitis oder Nasenkatarrh, Heuschnupfen, bronchiale Asthma, Uritcaria (Nesselsucht) und Lebensmittelallergien und andere atopische Zustände.
  • Als „Asthma" bezeichnet man eine Störung des Atmungssystems, die durch Entzündung, Verengung der Luftwege und eine erhöhte Reaktivität der Luftwege auf inhalierte Substanzen gekennzeichnet ist. Asthma ist häufig, aber nicht ausschließlich mit atopischen oder allergischen Symptomen verbunden.
  • Eine „Defizienz des Immunsystems" soll eine Krankheit oder Störung bezeichnen, bei der das Immunsystem des Lebewesens nicht in im normalen Ausmass funktioniert, oder bei der es nützlich wäre, die Immunreaktion des Lebewesens zu stärken, um beispielsweise ein Tumor- oder Krebsgeschwür zu beseitigen (z.B. Tumore des Gehirns, der Lunge (z.B. kleinzellig oder nicht-kleinzellig), der Eierstöcke, der Brust, der Prostata, des Dickdarms, genauso wie andere Karzinome und Sarkome) oder um eine Infektion des Lebewesens zu beseitigen.
  • Beispiele von infektiösen Viren umfassen: Retroviridae (z.B. menschliche Immundefizienzviren, wie HIV-1 (auch bezeichnet als HTLV-III, LAV oder HTLV-III/LAV oder HIV-III; und andere Isolate, wie HIV-LP); Picornaviridae (z.B. Polioviren, Hepatitis A-Virus; Enteroviren, menschliche Coxsackie-Viren, Rhinoviren, Echoviren); Calciviridae (z.B. Stämme, die Gastroenteritis verursachen); Togaviridae (z.B. Pferdeenzephalitisviren, Rubellaviren); Flaviridae (z.B. Dengue-Viren, Enzephalitisviren, Gelbfieberviren); Coronaviridae (z.B. Coronaviren); Rhabdoviridae (z.B. vesikuläre Stomatitisviren, Tollwut-Viren); Filoviridae (z.B. Ebolaviren); Paramyxoviridae (z.B. Parainfluenzaviren, Mumpsvirus, Masernvirus, Atmungs-syncytial-Virus); Orthomyxoviridae (z.B. Grippeviren); Bungaviridae (z.B. Hantaan-Viren, Bungaviren, Phleboviren und Nairo-Viren); Arenaviridae (hämorrhagische Fieberviren); Reoviridae (z.B. Reoviren, Orbiviren und Rotaviren); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus); Parvoviridae (Parvoviren); Papovaviridae (Papillomaviren, Polyomaviren); Adenoviridae (die meisten Adenoviren); Herpesviridae (Herpes simplex-Virus (HSV) 1 und 2, Varizella Zoster-Virus, Cytomegalievirus (CMV), Herpesviren); Poxviridae (Variolaviren, Impfpockenviren, Pockenviren); und Iridoviridae (z.B. Afrikanischer Schweinefiebervirus); und unklassifizierte Viren (z.B. die ätiologischen Agentien der spongiformen Enzephalopathien, das Agens der Delta-Hepatitis-Krankheiten (man glaubt, dass es sich um einen defekten Satellit des Hepatitis B-Virus handelt), die Agentien der nicht-A-, nicht-B-Hepatitis (Klasse 1 = innerlich übertragen; Klasse 2 = parenteral übertragen (d. h. Hepatitis C); Norwalk- und verwandte Viren und Astroviren).
  • Beispiele für infektiöse Bakterien umfassen: Heliobacter pyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps. (z.B. M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Gruppe A-Streptococcen), Streptococcus agalacidae (Gruppe B-Streptococcen), Streptococcus (viridans-Gruppe), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobe sps.), Streptococcus pneumoniae, pathogene Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus antracis, Corynebacterium diphterheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacer aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira und Actinomyces israelli.
  • Beispiele für infektiöse Pilze umfassen: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Andere infektiöse Organismen (d. h. Protisten) umfassen: Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii.
  • Als „immunstimulierendes Nukleinsäuremolekül" bezeichnet man ein Nukleinsäuremolekül, das eine unmethylierte Cytosin, Guanin-Dinukleotidsequenz enthält (d. h. „CpG-DNA" oder DNA, die ein Cytosin enthält, dem ein Guanosin folgt, und das durch eine Phosphatbindung verbunden ist) und einen Wirbeltier-Lymphozyten stimuliert (z.B. eine mitogene Wirkung aufweist oder durch dessen Zytokin-Expression induziert oder erhöht). Ein immunstimulierendes Nukleinsäuremolekül kann doppel- oder einzelsträngig sein. Im Allgemeinen sind doppelsträngige Moleküle in vivo stabiler, wohingegen einzelsträngige Moleküle eine erhöhte Immunaktivität aufweisen.
  • Bevorzugterweise enthält das immunstimulierende Oligonukleotid dieser Erfindung X1X2, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA und ApA, und X3X4, das aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT, CpT und GpT (siehe z.B. Tabelle 5). Um die Aufnahme in die Zellen zu erleichtern, sind die CpG enthaltenden immunstimulierenden Oligonukleotide vorzugsweise ungefähr 8 bis 30 Basen lang. Allerdings sind Nukleinsäuren jeder Größe (selbst viele kb lang) immunstimulierend, wenn genügend immunstimulierende Motive vorhanden sind, da solche größeren Nukleinsäuren im Inneren der Zelle zu Oligonukleotiden abgebaut werden. Bevorzugte synthetische Oligonukleotide enthalten kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer am oder nahe des 5'- und/oder des 3'-Endes, und/oder das mitogene Konsens-CpG-Motiv ist kein Palindrom. Eine verlängerte Immunstimulierung kann erreicht werden, wenn man stabilisierte Oligonukleotide benutzt, wobei in das Oligonukleotid eine Phosphatrückgratmodifikation eingebaut ist. Diese Modifikation ist zum Beispiel eine Phosphothioat- oder Phosphodithioat-Modifikation. Insbesondere tritt die Phosphatrückgrat-Modifikation am 5'-Ende der Nukleinsäure auf, zum Beispiel an den ersten beiden Nukleotiden des 5'-Endes der Nukleinsäure. Weiterhin kann die Phosphatrückgratmodifikation am 3'-Ende der Nukleinsäure auftreten, zum Beispiel an den letzten fünf Nukleotiden des 3'-Endes der Nukleinsäure.
  • Bevorzugterweise bewegt sich die Größe der immunstimulierenden CpG-DNA im Bereich von 8 bis 30 Basen, wenn es sich um ein Oligonukleotid handelt. Alternativ können CpG-Dinukleotide in großem Maßstab in Plasmiden produziert werden, die nach Verabreichung an ein Lebewesen zu Oligonukleotiden abgebaut werden. Bevorzugte immunstimulierende Oligonukleotide (z.B. zur Verwendung für die Erhöhung der Wirksamkeit einer Impfung oder für die Behandlung einer Defizienz des Immunsystems, indem die Antikörper (d. h. die humorale) -Reaktion in einem Lebewesen stimuliert wird) haben einen hohen Stimulierungsindex bezüglich der Reaktionen von B-Zellen, Monozyten und/oder natürlichen Killerzellen (z.B. Zytokine, proliferative, lytische oder andere Reaktionen).
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide der Erfindung stimulieren zum Beispiel die Zytokinproduktion in einem Lebewesen. Diese Zytokinen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α und GM-CSF. Beispielhafte Sequenzen umfassen:
    Figure 00180001
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind auch nützlich bei der Stimulierung der lytischen Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) in einem Lebewesen wie einem Menschen. Spezifische, aber nicht beschränkende Beispiele solcher Sequenzen sind:
    Figure 00190001
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind auch nützlich bei der Stimulierung der B-Zell-Proliferation in einem Lebewesen wie einem Menschen. Spezifische, aber nicht beschränkende Beispiele solcher Sequenzen umfassen:
    Figure 00190002
  • Die immunstimulierenden Oligonukleotide dieser Erfindung sind als Adjuvans zur Verwendung während der Antikörperproduktion in einem Säugetier nützlich. Spezifische, aber nicht erschöpfende Beispiele solcher Sequenzen umfassen: TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO. 10), GTCG(T/C)T und TGTCG(T/C)T. Weiterhin können die immunstimulierenden Oligonukleotide verabreicht werden, um Symptome einer asthmatischen Fehlfunktion zu behandeln oder verhindern, indem sie die Immunantwort des Lebewesens von Th2 nach Th1 umlenken. Eine beispielhafte Sequenz umfasst
    TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 10).
  • Der Stimulierungsindex einer bestimmten immunstimulierenden CpG-DNA kann in verschiedenen Immunzelltests getestet werden. Bevorzugterweise beträgt der Stimulierungsindex der immunstimulierenden CpG-DNA bezüglich der B-Zell-Proliferation mindestens ungefähr 5, bevorzugter mindestens ungefähr 10, bevorzugterer mindestens ungefähr 15 und am bevorzugtesten mindestens ungefähr 20, wie durch Einbau von 3H-Uridin in einer murinen B-Zellkultur, die 20 Stunden lang bei 37 °C mit 20 μM ODN in Kontakt war, mit 1 μCi 3H-Uridin gepulst wurde und 4 Std. später geerntet und gezählt wurde, bestimmt wurde, wie es im Detail in Beispiel 1 beschrieben ist. Für die Verwendung in vivo, beispielsweise um eine Immunsystem-Defizienz zu behandeln, indem eine Zell-vermittelte (lokale) Immunantwort in einem Lebewesen stimuliert wird, ist es wichtig, dass die immunstimulierende CpG-DNA in der Lage ist, die Zytokinsekretion durch monozytische Zellen und/oder die Zell-lytische Aktivität natürlicher Killer (NK)-Zellen wirksam zu induzieren.
  • Bevorzugte immunstimulierende CpG-Nukleinsäuren sollten abhängig von der therapeutischen Indikation und nach Bestimmung durch die Tests, die in Beispiel 12 beschrieben sind, eine Wirkung von mindestens ungefähr 500 pg/ml TNF-α, 15 pg/ml IFN-γ, 70 pg/ml GM-CSF, 275 pg/ml IL-6, 200 pg/ml IL-12 haben. Andere bevorzugte immunstimulierende CpG-DNAs sollten, wie durch den Test bestimmt, der im Detail in Beispiel 4 beschrieben wird, die Wirkung einer mindestens 10 %igen, bevorzugt mindestens 15 %igen und am bevorzugtesten mindestens 20 %igen YAC-1-Zell-spezifischen Lyse haben, oder die einer mindestens ungefähr 30, bevorzugt mindestens ungefähr 35 und am bevorzugtesten mindestens ungefähr 40 %igen 2C11-Zell-spezifischen Lyse haben.
  • Eine „Nukleinsäure" oder „DNA" bedeutet mehrere Nukleotide (d. h. Moleküle, die einen Zucker (z.B. Ribose oder Desoxyribose) enthalten, der an eine Phosphatgruppe und an eine austauschbare organische Base, die entweder ein substituiertes Pyrimidin (z.B. Cytosin (C), Thymin (T) oder Uracil (U)) oder ein substituiertes Purin (z.B. Adenin (A) oder Guanin (G)) ist, gebunden ist. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff genau so auf Ribonukleotide wie auf Oligodesoxyribonukleotide. Der Begriff soll außerdem Polynukleoside (d. h. ein Polynukleotid minus der Phosphatgruppe) und ein jedes andere Polymer umfassen, das organische Basen enthält. Nukleinsäure-Moleküle können von existierenden Nukleinsäurequellen (z.B. genomischer oder cDNA) erhalten werden, sind aber vorzugsweise synthetisch (z.B. durch Oligonukleotid-Synthese produziert).
  • Ein „Nukleinsäure-Abgabekomplex" soll ein Nukleinsäuremolekül bedeuten, das mit einem Mittel zum Zielen (z.B. ein Molekül, das zu einer höheren Bindungsaffinität an Zielzellen (z.B. B-Zellen und natürliche Killerzellen (NK)) -Oberflächen und/oder erhöhte zelluläre Aufnahme durch die Zielzellen führt) verbunden ist (z.B. durch ionische oder kovalente Bindung; oder darin verkapselt). Beispiele für Nukleinsäure-Abgabekomplexe umfassen Nukleinsäuren, die verbunden sind mit: einem Sterol (z.B. Cholesterin), einem Lipid (z.B. ein kationisches Lipid, Virosom oder Liposom) oder einer Substanz, die Zielzellen spezifisch bindet (z.B. ein Ligand, der von einem für die Zielzelle spezifischen Rezeptor erkannt wird). Bevorzugte Komplexe müssen in vivo ausreichend stabil sein, um einen erheblichen Zerfall vor der Aufnahme durch die Zielzelle zu verhindern. Der Komplex sollte jedoch unter geeigneten Bedingungen in der Zelle spaltbar sein, so dass die Nukleinsäure in einer funktionellen Form freigesetzt wird.
  • Eine „palindromische Sequenz" soll eine seitenverkehrte Wiederholung bedeuten (d. h. eine Sequenz wie ABCDEE'D'C'B'A', bei der A und A' Basen sind, die gewöhnliche Watson-Crick-Basenpaare zu bilden in der Lage sind). Solche Sequenzen können in vivo möglicherweise doppelsträngige Strukturen bilden.
  • Ein „stabilisiertes Nukleinsäuremolekül" soll ein Nukleinsäuremolekül bedeuten, das relativ resistent gegen den Abbau in vivo ist (z.B. durch eine Exo- oder Endonuklease). Die Stabilisierung kann eine Funktion der Länge oder der Sekundärstruktur sein. Nukleinsäuremoleküle, die unmethyliertes CpG enthalten, und die mehrere zehn bis hundert kb lang sind, sind relativ resistent gegen in vivo-Abbau. Bei kürzeren immunstimulierenden Nukleinsäuremolekülen kann die Sekundärstruktur stabilisieren und ihre Wirkung erhöhen. Wenn zum Beispiel das 3'-Ende eines Nukleinsäuremoleküls selbst-komplementär zu einer stromaufwärtigen Region des gleichen Moleküls ist, so dass es rückfalten und eine Art Stem-Loop-Struktur bilden kann, dann ist das Nukleinsäuremolekül stabilisiert und zeigt deshalb mehr Aktivität.
  • Bevorzugte stabilisierte Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung haben ein modifiziertes Rückgrat. Zur Verwendung für die Immunstimulierung sind besonders bevorzugt stabilisierte Nukleinsäuremoleküle Phosphothioat- (d. h. mindestens eines der Phosphat-Sauerstoffatome der Nukleinsäuremoleküle ist durch ein Schwefelatom ersetzt) oder Phosphodithioat-modifizierte Nukleinsäuremoleküle. Insbesondere tritt die Phosphat-Rückgrat-Modifikation zum Beispiel am 5'-Ende der Nukleinsäuren auf, an den ersten beiden Nukleotiden des 5'-Endes der Nukleinsäure. Weiterhin kann die Phosphat-Rückgrat-Modifikation zum Beispiel am 3'-Ende der Nukleinsäure auftreten, an den letzten fünf Nukleotiden des 3'-Endes der Nukleinsäure. Zusätzlich zur im Folgenden hierin beschriebenen Stabilisierung des Nukleinsäuremoleküls können Phosphothioat-modifizierte Nukleinsäuremoleküle (darunter Phosphodithioat-modifizierte) das Ausmass der Immunstimulierung durch das Nukleinsäuremolekül, das wie hierin gezeigt ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthält, erhöhen. In der internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 95/26204 und dem Titel „Immunstimulierung durch Phosphothioatoligonukleotid-Analoga" wird auch über die nicht-sequenzspezifische immunstimulierende Wirkung von Phosphothioat-modifizierten Oligonukleotiden berichtet. Wie hierin berichtet wird, wurde festgestellt, dass Nukleinsäuremoleküle, die unmethylierte CpGs und ein Phosphothioat-Rückgrat enthalten, bevorzugterweise die B-Zell-Aktivität erhöhen, wohingegen festgestellt wurde, dass Nukleinsäuremoleküle, die unmethyliertes CpG enthalten und ein Phosphodiester-Rückgrat enthalten, vorzugsweise Monozyten (Makrophagen, dendritische Zellen und Monozyten) und NK-Zellen aktivieren. Phosphothioat-CpG-Oligonukleotide mit bevorzugten menschlichen Motiven sind ebenfalls starke Aktivatoren von Monozyten und NK-Zellen.
  • Andere stabilisierte Nukleinsäuremolekülen umfassen: nicht-ionische DNA-Analoga, wie Alkyl- und Arylphosphonate (bei denen der geladene Phosphonat-Sauerstoff durch eine Alkyl- oder Arylgruppe ersetzt wurde), Phosphodiester und Alkylphosphotriester, bei denen der geladene Sauerstoffrest alkyliert ist. Es wurde auch gezeigt, dass Nukleinsäuremoleküle mit einem Diol wie Tetraethylenglykol oder Hexaethylenglykol besonders resistent gegen den Abbau durch Nukleasen sind.
  • Ein „Lebewesen" soll ein Mensch oder Wirbeltier sein einschließlich eines Hundes, einer Katze, eines Pferdes, einer Kuh, eines Schweines, eines Schafes, einer Ziege, eines Huhns, eines Affen, einer Ratte oder einer Maus.
  • Hierin bezieht sich der Begriff „Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, an die es gekoppelt worden ist, zu transportieren. Bevorzugte Vektoren sind solche, die zur autonomen Replikation und zur Expression von an sie gekoppelten Nukleinsäuren in der Lage sind (z.B. ein Episom). Vektoren, die in der Lage sind, die Expression von funktionsfähig mit ihnen verbundenen Genen zu steuern, werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die für rekombinante DNA-Methoden nützlich sind, oft in der Form von „Plasmiden" vor, womit man im Allgemeinen ringförmige, doppelsträngige DNA-Ringe bezeichnet, die, in ihrer Vektorform, nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid" und „Vektor" in austauschbarer Weise benutzt, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form des Vektors ist. Es ist jedoch beabsichtigt, dass Erfindung auch andere Formen von Expressionsvektoren umfasst, die gleiche Aufgaben erfüllen und auf diesem Gebiet nachträglich bekannt werden.
  • Bestimmte Nukleinsäuren, die unmethyliertes CpG enthalten, haben B-Zell-stimulierende Aktivität, wie in vitro und in vivo gezeigt
  • Im Verlauf von Untersuchungen der Lymphozyten-stimulierenden Wirkungen von zwei Antisense-Oligonukleotiden, die für endogene retrovirale Sequenzen spezifisch sind, bei denen in den beigefügten Beispielen 1 und 2 beschriebene Protokolle verwendet wurden, wurde überraschend herausgefunden, dass zwei von vierundzwanzig „Kontrollen" (unter ihnen verschiedene durcheinandergemischte, Sinn- und Mismatch-Kontrollen für einen Satz von „Antisense"-ODNs) ebenfalls die B-Zellen-Aktivierung und IgM-Sekretion vermittelten, wohingegen die anderen „Kontrollen" keine Wirkung zeigten.
  • Zwei Beobachtungen legten die Annahme nahe, dass Antisense-Effekte an dem Mechanismus dieser B-Zell-Aktivierung durch die „Kontroll"-ODN möglicherweise nicht beteiligt sind: 1) Ein Vergleich mit in Genbank augelisteten Wirbeltier-DNA-Sequenzen zeigte keine größere Homologie als die mit nicht-stimulierenden ODNs gefundene und 2) die beiden Kontrollen zeigten keine Hybridisierung bei Northern blots mit 10 μg Poly A + RNA aus Milz. Die Neusynthese dieser ODNs mit einem anderen Synthesizer oder die ausführliche Reinigung durch Polyacrylamidgelelektrophorese oder Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie ergaben eine identische Stimulierung, was die Möglichkeit einer Unreinheit ausschließt. Eine ähnliche Stimulierung wurde beobachtet, wenn B-Zellen von C3H/HeJ-Mäusen benutzt wurden, was die Möglichkeit ausschließt, dass eine Lipopolysaccharid (LPS)-Kontamination für diese Ergebnisse verantwortlich ist.
  • Aufgrund der Tatsache, dass zwei „Kontroll"-ODNs eine B-Zell-Aktivierung verursachten, die der durch zwei „Antisense"-ODN verursachten ähnlich war, bestand die Möglichkeit, dass alle vier ODNs B-Zellen durch einen Nicht-Antisense-Mechanismus stimulierten, an dem ein Sequenzmotiv beteiligt war, das in allen anderen nicht-stimulierenden Kontroll-ODNs fehlte. Bei einem Vergleich dieser Sequenzen wurde entdeckt, dass alle vier stimulierenden ODNs CpG-Dinukleotide enthielten, deren Sequenzkontext sich von dem der nicht-stimulierenden Kontrolle unterschied.
  • Um zu bestimmen, ob das in den stimulierenden ODNs vorhandene CpG-Motiv für die beobachtete Stimulierung verantwortlich war, wurden über 300 ODNs synthetisiert, deren Länge von 5 bis 42 Basen reichte, und die methylierte, unmethylierte oder keine CpG-Dinukleotide in zahlreichen Sequenz-Zusammenhängen enthielten. Diese ODNs, unter ihnen die beiden ersten „Kontrollen" (ODN 1 und 2) und zwei ursprünglich als „Antisense" synthetisierte ODNs (ODN 3D und 3M; Krieg, A.M. J. Immunol. 143:2448 (1989)) wurden anschließend auf in vitro Wirkungen auf Milzzellen untersucht. (repräsentative Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgelistet). Mehrere ODNs, die CpG-Dinukleotide enthielten, induzierten B-Zell-Aktivierung und IgM-Sekretion; die Größenordnung dieser Stimulierung konnte typischerweise durch die Zugabe von mehr CpG-Dinukleotiden erhöht werden (Tabelle 1; vergleichen Sie ODN 2 mit 2a oder 3D mit 3Da und 3Db). Die Stimulierung schien nicht das Ergebnis eines Antisense-Mechanismus oder einer Verunreinigung zu sein. ODNs verursachten keine nachweisbare Proliferation von γδ- oder anderen T-Zell-Populationen.
  • Mitogene ODN-Sequenzen wurden einheitlich nicht-stimulierend, wenn das CpG-Dinukleotid mutiert wurde (Tabelle 1; vergleichen Sie ODN 1 mit 1a; 3D mit 3Dc; 3M mit 3Ma; und 4 mit 4a), oder wenn das Cytosin des CpG-Dinukleotides durch 5-Methylcytosin ersetzt wurde (Tabelle 1; ODN 1b, 2b, 3Dd und 3Mb). Eine partielle Methylierung des CpG-Motivs verursachte einen teilweisen Verlust der stimulierenden Wirkung (vergleichen Sie 2a mit 2c, Tabelle 1). Dagegen reduzierte die Methylierung anderer Cytosine die ODN-Aktivität nicht (ODN 1c, 2d, 3De und 3Mc). Diese Daten bestätigten, dass ein CpG-Motiv das wesentliche Element in ODN ist, die B-Zellen aktivieren.
  • Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde klar, dass die das CpG-Dinukleotid flankierenden Basen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der durch ein ODN induzierten Aktivität von murinen B-Zellen spielten. Es wurde bestimmt, dass das optimale stimulierende Motiv aus einem CpG besteht, das von zwei 5'-Purinen (vorzugsweise ein GpA-Dinukleotid) und von zwei 3'-Pyrimidinen (vorzugsweise ein TpT- oder TpC-Dinukleotid) flankiert wird. Mutationen des ODN, um das CpG-Motiv an diesess Ideal näherzubringen, verbesserten die Stimulierung (z.B. Tabelle 1, vergleichen Sie ODN 2 mit 2e; 3M mit 3Md), wohingegen Mutationen, die das Motiv störten, die Stimulierung verringerten (z.B. Tabelle 1, vergleichen Sie ODN 3D mit 3Df 4 mit 4b, 4c und 4d). Andererseits verringerten Mutationen außerhalb des CpG-Motivs die Stimulierung nicht (z.B. Tabelle 1, vergleichen Sie ODN 1 mit 1d; 3D mit 3Dg; 3M mit 3Me). Für die Aktivierung von menschlichen Zellen sind die besten flankierenden Basen leicht unterschiedlich (siehe Tabelle 5).
  • Von denen, die getestet wurden, waren ODNs, die kürzer als 8 Basen waren, nicht stimulierend (z.B. Tabelle 1, ODN 4e). Unter den 48 getesteten ODNs mit 8 Basen wurde eine hochstimulierende Sequenz als TCAACGTT (ODN 4) identifiziert, die das selbstkomplementäre „Palindrom" AAACGTT enthält. Bei der weiteren Optimierung dieses Motives wurde herausgefunden, dass ODNs mit Gs an beiden Enden eine erhöhte Stimulierung zeigten, insbesondere wenn das ODN durch Phosphothioat-Modifikationen der terminalen Internukleotidbindungen Nuklease-resistent gemacht wurde. ODN 1585 (5' GGGGTCAACGTTCAGGGGGG 3' (SEQ ID NO: 12)), bei dem die ersten zwei und letzten fünf Internukleotidbindungen Phosphothioat-modifiziert sind, bewirkte durchschnittlich eine 25,4-fache Zunahme der Maus-Milzzellenproliferation. Im Vergleich dazu bewirkte ODN 1638, das, abgesehen davon, dass die 10 Gs an den beiden Enden durch 10 As ersetzt sind, dieselbe Sequenz wie ODN 1585 hat, eine durchschnittliche 3,2-fache Zunahme der Proliferation. Die Wirkung der G-reichen Enden ist cis; die Zugabe eines ODN mit poly-G-Enden ohne CpG-Motiv zu Zellen zusammen mit 1638 ergab keine erhöhte Proliferation. Für Nukleinsäuremolekülen mit einer Länge von mehr als 8 Basenpaaren wurde herausgefunden, dass nicht-palindromische Motive, die ein unmethyliertes CpG enthielten, immunstimulierender wirken.
  • Andere Oktamer-ODN, die ein 6-Basen-Palindrom mit einem TpC-Dinukleotid am 5'-Ende enthalten, waren ebenfalls aktiv (z.B. Tabelle 1, ODN 4b, 4c). Andere Dinukleotide am 5'-Ende ergaben eine verringerte Stimulierung (z.B. ODN 4f; alle sechzehn möglichen Dinukleotide wurden getestet). Die Anwesenheit eines 3'-Dinukleotids reichte nicht aus, um das Fehlen eines 5'-Dinukleotids auszugleichen (z.B. Tabelle 1, ODN 4g). Die Zerstörung des Palindroms beendete die Stimulierung bei Oktamer-ODNs (z.B. Tabelle 1, ODN 4h), aber bei längeren ODNs waren Palindrome nicht notwendig. Tabelle 1: Stimulierung von Maus-B-Zellen durch Oligonukleotide
    Figure 00270001
    • 'Stimulierungsindizes sind die Mittelwerte und Standardabweichungen abgeleitet aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten und werden mit Näpfen verglichen, die ohne zugegebene ODNs kultiviert sind.
    • ND = nicht ausgeführt.
    • CpG-Dinukleotide sind unterstrichen.
    • Punkte stehen für Identität; Striche stehen für Deletionen.
    • Z steht für 5 Methylcytosin.
    Tabelle 2. Identifizierung des optimalen CpG-Motivs für die murine IL-6-Produktion und B-Zellen-Aktivierung
    Figure 00280001
    • Punkte stehen für Identität; CpG-Dinukleotide sind unterstrichen; ND = nicht ausgeführt
    • a Das Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen ausgeführt. Die Konzentration von IL-6 in unstimulierten Kontrollkulturen von sowohl CH12.LX als auch Milz-B-Zellen betrug ≤ 10 pg/ml. Die IgM-Konzentration in unstimulierten Kulturen betrug 547 ± 82 ng/ml. CpG-Dinukleotide sind unterstrichen, und Punkte stehen für Identität.
    • b [3H]-Uridinaufnahme wurde als vielfache Erhöhung (SI: Stimulierungsindex) gegenüber der unstimulierten Kontrolle (2322,67 ± 213,68 cpm) angegeben. Die Zellen wurden durch Zugabe von 20 μM verschiedener CpG O-ODN stimuliert. Die angegebenen Werte sind die Mittelwerte ± Standardabweichung dreifacher Messungen.
    • c Durch ELISA bestimmt.
  • Die Kinetiken der Lymphozyten-Aktivierung wurden unter Verwendung von Maus-Milzzellen untersucht. Wenn die Zellen gleichzeitig mit der ODN-Zugabe gepulst und nur vier Stunden später geerntet wurden, gab es schon einen zweifachen Anstieg des 3H-Uridineinbaus. Die Stimulierung erreichte ihren Höhepunkt zwischen 12–48 Std. und ließ dann nach. Nach 24 Stunden wurden keine intakten ODNs nachgewiesen, was vielleicht das folgende Nachlassen der Stimulierung erklärt. Wenn gereinigte B-Zellen mit oder ohne anti-IgM (submitogene Dosis) zusammen mit CpG-ODNs inkubiert wurden, stellte man fest, dass die Proliferation durch die Kombination der beiden Mitogene nach 48 Std. ungefähr 10-fach synergistisch erhöht war. Die Größenordnung der Stimulierung war konzentrationsabhängig und übertraf in konsistenter Weise die von LPS unter für beide optimalen Bedingungen. Oligonukleotide, die ein Nuklease-resistentes Phosphothioat-Rückgrat enthielten, waren ungefähr 200-fach wirksamer als unmodifizierte Oligonukleotide.
  • Der Anteil an durch CpG-ODN aktivierten B-Zellen wurde mit Hilfe der Zellzyklus-Analyse ermittelt. CpG-ODN induzierten den Zyklus bei mehr als 95% der B-Zellen. Durch Flusszytometrie nach CD23– (marginale Zone) und CD23+ (follikuläre) Subpopulationen sortierte Milz-B-Lymphozyten reagierten gleichermaßen auf die ODN-induzierte Stimulierung, genauso wie ruhende und aktivierte Populationen von B-Zellen, die durch Fraktionierung über Percoll-Gradienten isoliert wurden. Diese Arbeiten zeigen, dass CpG-ODN im Wesentlichen alle B-Zellen dazu veranlaßt, in den Zellzyklus einzutreten.
  • Immunstimulierende Nukleinsäuremoleküle blockieren die Apoptose von murinen B-Zellen
  • Als Reaktion auf die Vernetzung ihrer Antigenrezeptoren durch Anti-IgM wird bei bestimmten B-Zell-Linien wie WEHI-231 Wachstumsstop und/oder Apoptose ausgelöst (Jakway, J.P. et al., „Growth regulation of the B lymphoma cell line WEHI-231 by antiimmunoglobulin, lipopolysaccharide and other bacterial products" J. Immunol. 137:2225 (1986); Tsubata, T., J. Wu und T. Honjo: B-cell apoptosis induced by antigen receptor crosslinking is blocked by a T-cell signal through CD40." Nature 364:645 (1993)). Vor diesem Wachstumsstop werden WEHI-231-Zellen durch bestimmte Stimuli wie LPS und durch den CD40-Liganden gerettet. Es wurde festgestellt, dass auch das CpG-Motiv enthaltende ODNs WEHI-231 vor dem anti-IgM-induzierten Wachstumsstop retten konnten, was zeigt, dass keine zusätzlichen Zellpopulationen für diese Wirkung benötigt werden. Nachfolgende Arbeiten zeigen, dass CpG-ODN Bcl-x- und myc-Expression induzieren, was den Schutz vor Apoptose erklären könnte. Es wurde auch herausgefunden, dass CpG-Nukleinsäuren Apoptose in menschlichen Zellen blockieren können. Diese Inhibition der Apoptose ist wichtig, da sie die Immunaktivierung durch CpG-DNA verstärken und verlängern sollte.
  • Identifizierung des für die Induktion der murinen IL-6- und IgM-Sekretion und B-Zell-Proliferation optimalen CpG-Motivs
  • Um zu evaluieren, ob das für die B-Zellen stimulierende optimale CpG-Motiv identisch mit dem für die IL-6-Sekretion optimalen CpG-Motiv ist, wurde eine Reihe von ODNs untersucht, bei denen die Basen, die das CpG-Dinukleotid flankieren, zunehmend substituiert waren. Diese Reihe von ODNs wurde hinsichtlich ihrer Wirkung auf B-Zell-Proliferation, Ig-Produktion und IL-6-Sekretion, sowohl unter Verwendung von Milz-B-Zellen als auch CH12.LX-Zellen untersucht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, enthält das optimale stimulierende Motiv ein unmethyliertes CpG, das von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist. Im Allgemeinen reduziert eine Mutation entweder des 5'-Purins zu einem Pyrimidin oder des 3'-Pyrimidins zu einem Purin seine Wirkungen erheblich. Änderungen der 5'-Purine zu C waren besonders schädlich, aber Änderungen der 5'-Purine zu T oder 3'-Pyrimidine zu Purinen hatten eine weniger ausgeprägte Wirkung. Ausgehend von der Analyse von diesen und Werten von anderen ODNs wurde bestimmt, dass das optimale CpG-Motiv für die Induktion der IL-6-Sekretion TGACGTT ist, was identisch mit dem optimalen mitogenen und IgM-induzierenden CpG-Motiv ist (Tabelle 2). Dieses Motiv war stimulierender als alle anderen palindromhaltigen Sequenzen, die untersucht wurden (1639, 1707 und 1708).
  • Induktion der murinen Cytokin-Sekretion durch CpG-Motive in bakterieller DNA oder Oligonukleotiden
  • Wie in Beispiel 9 beschrieben, wurde die Menge an IL-6, die nach CpG-DNA-Stimulierung durch Milzzellen sekretiert wurde, mit Hilfe eines ELISA-Tests bestimmt. Milzzellkulturen mit vermindertem T-Zell-Gehalt wurden statt Ganzmilzzellen für die in vitro-Studien verwendet, nachdem vorausgehende Studien gezeigt hatten, dass T-Zellen wenig oder gar nichts zu dem IL-6 beitragen, das von CpG-DNA-stimulierten Milzzellen produziert wird. Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die IL-6-Produktion in Zellen, die mit E. coli-DNA inkubiert wurden, aber nicht in Zellen, die mit Kalbsthymus-DNA kultiviert wurden, deutlich erhöht. Um zu bestätigen, dass die mit E. coli-DNA beobachtete erhöhte IL-6-Produktion nicht durch die Verunreinigung mit anderen bakteriellen Produkten verursacht wurde, wurde die DNA vor der Analyse mit DNAse verdaut. Die DNAse-Vorbehandlung hob die durch E. coli-DNA induzierte IL-6-Produktion auf (Tabelle 3). Zusätzlich produzierten Milzzellen von LPS-nichtreaktiven C3H/HeJ-Mäusen als Reaktion auf bakterielle DNA ähnliche IL-6-Konzentrationen. Um herauszufinden, ob die IL-6-Sekretion, die durch E. coli-DNA induziert wurde, durch die unmethylierten CpG-Dinukleotide in bakterieller DNA vermittelt wurde, wurde methylierte E. coli-DNA und eine Reihe von synthetischen ODN überprüft. Tabelle 3 zeigt, dass CpG-ODN die IL-6-Sekretion erheblich induzieren (ODN 5a, 5b, 5c), wohingegen CpG-methylierte E. coli-DNA oder ODN mit methylierten CpG (ODN 5 f) oder ohne CpG (ODN 5d) dies nicht taten. Änderungen an anderen Stellen als den CpG-Dinukleotiden (ODN 5b) oder die Methylierung von anderen Cytosinen (ODN 5g) verringerten die Wirkung von CpG-ODN nicht. Die Methylierung von einem einzigen CpG in einem ODN mit drei CpGs führte zu einer teilweisen Reduzierung der Stimulierung (vergleiche ODN 5c mit 5e; Tabelle 3). Tabelle 3. Induktion der murinen IL-6-Sekretion durch CpG-Motive in bakterieller DNA oder Oligonukleotiden
    Figure 00320001
    • Milzzellen mit vermindertem T-Zell-Gehalt von DBA/2-Mäusen wurden mit Phosphodiestermodifizierten Oligonukleotiden (O-ODN) (20 μM), Kalbsthymus-DNA (50 μg/ml) oder E. coli-DNA (50 μg/ml), mit oder ohne Enzymbehandlung, oder LPS (10 μg/ml) 24 Std. lang stimuliert. Die Werte zeigen den Mittelwert von Dreifachmessungen (pg/ml) ± Standardabweichung. CpG-Dinukleotide sind unterstrichen und Punkte zeigen Identität an. Z steht für 5-Methylcytosin.
  • CpG-Motive können als ein künstliches Adjuvans benutzt werden.
  • Nicht-spezifische Stimulatoren der Immunantwort nennt man Adjuvantien. Die Benutzung von Adjuvantien ist wesentlich, um eine starke Antikörper-Reaktion auf lösliche Antigene auszulösen (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring harbor, N.Y. Current Edition). Die Gesamtwirkung von Adjuvantien ist dramatisch und ihre Wichtigkeit kann nicht überschätzt werden. Die Wirkung eines Adjuvans erlaubt die Benutzung viel geringerer Dosen von Antigen und ruft eine länger andauernde Antikörperreaktion hervor. Die nicht spezifische Aktivierung der Immunantwort entscheidet häufig über den Erfolg bei der Hervorrufung einer Immunantwort. Adjuvantien sollten für die ersten Injektionen verwendet werden, wenn es nicht einen sehr spezifischen Grund gibt, dies zu vermeiden. Die meisten Adjuvantien beinhalten zwei Bestandteile. Ein Bestandteil wurde entwickelt, um das Antigen vor dem schnellen Abbau zu schützen (z.B. Liposomen oder synthetische oberflächenaktive Stoffe (Hunter et al. 1981)). Liposomen sind nur dann wirksam, wenn das Immunogen in die äußere Lipidschicht eingebaut ist; eingeschlossene Moleküle werden vom Immunsystem nicht erkannt. Der andere Bestandteil ist eine Substanz, die die Immunantwort nicht-spezifisch stimulieren wird. Diese Substanzen wirken dadurch, dass sie die Konzentration an Lymphokinen erhöhen. Lymphokine stimulieren die Aktivität der Antigenverarbeitenden Zellen direkt und verursachen eine lokale Entzündungsreaktion an der Injektionsstelle. Bei den frühen Arbeiten verließ man sich ausschließlich auf durch Hitze getötete Bakterien (Dienes 1936) oder Lipopolysaccharide (LPS) (Johnson et al. 1956). LPS ist ziemlich toxisch und durch die Analyse seiner Strukturkomponenten konnte man zeigen, dass die meisten seiner Adjuvans-relevanten Eigenschaften in einem Teil liegen, den man Lipid A nennt. Lipid A ist in einer Reihe von synthetischen und natürlichen Formen verfügbar, die sehr viel weniger toxisch als LPS sind, behält aber dennoch die meisten der wichtigen Adjuvans-relevanten Eigenschaften des Eltern-LPS-Moleküls bei. Lipid A-Komponenten werden häufig unter Verwendung von Liposomen abgegeben.
  • Kürzlich führte eine starke Bewegung, wirkungsvolle Adjuvantien mit annehmbareren Nebenwirkungen zu finden, zur Produktion neuer synthetischer Adjuvantien. Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Oligonukleotids mit der Sequenz 1826 TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO: 10) bereit, das ein Adjuvans mit CpG enthaltenden Nukleinsäuren ist. Die Sequenz ist eine stark immunaktivierende Sequenz und ein hervorragendes Adjuvans, dessen Wirksamkeit der von vollständigen Freund'schem Adjuvans vergleichbar oder ihr überlegen ist, aber keine offenkundige Toxizität aufweist.
  • Titration der Induktion der murinen ILO-6-Sekretion durch CpG-Motive
  • Bakterielle DNA und CpG-ODN induzierten die IL-6-Produktion in murinen Milzzellen mit vermindertem T-Zell-Gehalt in einer dosisabhängigen Weise, aber Wirbeltier-DNA und Nicht-CpG-ODN taten dies nicht (1). Bei ungefähr 50 μg/ml bakterieller DNA oder 40 μM CpG O-ODN erreichte die IL-6-Produktion ein Plateau. Die höchsten durch bakterielle DNA bzw. CpG-ODN induzierten Konzentrationen an IL-6 waren 1–1,5 ng/ml bzw. 2–4 ng/ml. Diese Konzentrationen waren erheblich höher als die, die nach der Stimulierung durch LPS (0,35 ng/ml) beobachtet werden konnten (1A). Um zu evaluieren, ob CpG-ODN mit einem Nuklease-resistenten DNA-Rückgrat ebenfalls die IL-6-Produktion induzieren würde, wurden S-ODN zu murinen Milzzellen mit vermindertem 7-Zell-Gehalt gegeben. CpG-S-ODN induziernen die IL-6-Produktion ebenfalls in einer dosisabhängigen Weise auf ungefähr das gleiche Niveau wie CpG-O-ODN, während Nicht-CpG-S-ODN IL-6 nicht induzierte (1C). Eine Konzentration von 0,05 μM CpG-S-ODN konnte die Maximalproduktion an IL-6 in diesen Zellen induzieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass bei der Nuklease-resistenten DNA-Rückgrat-Modifikation die sequenzspezifische Fähigkeit von CpG-DNA, die IL-6-Sekretion zu induzieren, beibehalten wird, und dass CpG-S-ODN in diesem Testsystem mehr als 80-fach wirksamer sind als CpG-O-ODN.
  • Induktion der murinen IL-6-Sekretion durch CpG-DNA in vivo.
  • Um die Fähigkeit von bakterieller DNA und CpG-S-ODN, die IL-6-Sekretion in vivo zu induzieren, zu evaluieren, wurden BALB/c-Mäusen intravenös 100 μg E. coli-DNA, Kalbsthymus-DNA oder CpG oder nicht stimulierende S-ODN gespritzt, und 2 Std. nach der Stimulierung ihnen Blut abgenommen. Die Konzentration an IL-6 in den Seren der Gruppe, die E. coli-DNA injiziert bekommen hatte, betrug ungefähr 13 ng/ml, während kein IL-6 in den Seren der Gruppen nachgewiesen wurde, die Kalbsthymus-DNA oder PBS injiziert bekommen hatten (Tabelle 4). CpG-S-ODN induzierte die IL-6-Sekretion in vivo ebenfalls. Die IL-6-Konzentration in den Seren der Gruppen, denen CpG-S-ODN injiziert wurden waren, betrug ungefähr 20 ng/ml. Dagegen wurde IL-6 in den Seren der Gruppe mit nicht stimulierenden S-ODN nicht nachgewiesen (Tabelle 4). Tabelle 4. Durch CpG-DNA stimulierte Sekretion von murinem IL-6 in vivo.
    Figure 00340001
    • Mäuse (2 Mäuse/Gruppe) erhielten eine intravenöse Injektion von 100 μl PBS, 200 μg E. coli-DNA oder Kalbsthymus-DNA oder 500 μg CpG-S-ODN oder Nicht-CpG-Kontroll-S-ODN. Den Mäusen wurde 2 Std. nach der Injektion Blut abgenommen und eine 1:10-Verdünnung von jedem Serum wurde mit IL-6-ELISA analysiert. Die Empfindlichkeitsgrenze des IL-6-ELISA betrug 5 pg/ml. Die Sequenz des CpG-S-ODN lautet 5'GCATGACGTTGAGCT3' (SEQ. ID. No: 48) und die des nicht-stimulierenden S-ODN lautet 5'GCTAGATGTTAGCGT3' (SEQ. ID. No: 49). Beachten Sie, dass zwar ein CpG in Sequenz 48 enthalten ist, dieses aber zu nahe am 3'-Ende ist, um eine Stimulierung zu bewirken, wie hierin erklärt wird. Alle Werte zeigen Mittelwerte von Zweifachmessungen ± Standardabweichung an. Jedes Experiment wurde mindestens zweimal mit ähnlichem Ergebnis durchgeführt.
  • Kinetiken der murinen IL-6-Sekretion nach Stimulierung durch CpG-Motive in vivo.
  • Um die Kinetiken der Induktion der IL-6-Sekretion durch CpG-DNA in vivo zu evaluieren, erhielten BALB/c-Mäuse eine intravenöse Injektion mit CpG oder Kontroll-nicht-CpG-S-ODN. Die Serumkonzentrationen von IL-6 erhöhten sich innerhalb von 1 Std. erheblich und erreichten in der CpG-S-ODN-injizierten Gruppe nach 2 Std. einen Spitzenwert von ungefähr 9 ng/ml. (2). Die Konzentration von IL-6-Protein in den Sera nahm nach 4 Std. schnell ab und ging auf den Grundspiegel 12 Std. nach der Stimulierung zurück. Im Gegensatz zu den Gruppen; die durch CpG-DNA stimuliert wurden, konnte keine signifikante Zunahme an IL-6 in den Seren von den Gruppen festgestellt werden, die nicht-stimulierende S-ODN oder PBS injiziert bekommen hatten (2).
  • Gewebeverteilung und Kinetiken der durch CpG-Motive induzierten IL-6 mRNA-Expression in vivo.
  • Wie in 2 gezeigt, nahm die Konzentration von Serum-IL-6 nach der CpG-DNA-Stimulierung rapide ab. Um den möglichen Gewebeursprung dieses Serum-IL-6 und die Kinetiken der IL-6-Genexpression in vivo nach der CpG-DNA-Stimulierung zu untersuchen, erhielten BALB/c-Mäuse eine intravenöse Injektion mit CpG oder Nicht-CpG-S-ODN, und RNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulierung aus Leber, Milz, Thymus und Knochenmark extrahiert. 3A zeigt, dass die Konzentration von IL-6-mRNA in Leber, Milz und Thymus innerhalb von 30 Min. nach der Injektion von CpG-S-ODN zunahm. Die Konzentration an Leber-IL-6-mRNA erreichte ihren Spitzenwert 2 Std. nach der Injektion und nahm schnell ab und kehrte 8 Std. nach der Stimulierung zum Grundniveau zurück (3A). Die Milz-IL-6-mRNA erreichte ihren Höchstwert 2 Std. nach der Stimulierung und nahm dann allmählich ab (3A). Die Thymus-IL-6-mRNA-Konzentration erreichte ihren Spitzenwert 1 Std. nach der Injektion und nahm dann allmählich ab (3A). Im Knochenmark nahm die Konzentration der IL-6-mRNA innerhalb 1 Std. nach der CpG-S-ODN-Injektion erheblich zu, kehrte aber dann zum Grundniveau zurück. Als Reaktion auf CpG-S-ODN zeigten Leber, Milz und Thymus einen stärkeren Anstieg der IL-6-mRNA-Expression als das Knochenmark.
  • Muster der durch CpG-DNA induzierten murinen Cytokin-Expression
  • Innerhalb der ersten sechs Stunden konnte in vivo oder in Ganzmilzzellen kein signifikanter Anstieg des Proteinniveaus der folgenden Interleukine festgestellt werden: IL-2, IL-3, IL-4, IL-5 oder IL-10 (Klinman, D.M. et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2879–2883). Allerdings stieg im Serum von Mäusen, die eine Injektion von CpG-ODN erhielten, die Konzentration von TNF-α innerhalb von 30 Minuten und die Konzentration von IL-6 innerhalb von 2 Stunden erheblich. In den ersten zwei Stunden wurde auch eine erhöhte Expression von IL-12 und Interferon-gamma (IFN-γ)-mRNA in den Milzzellen festgestellt. Tabelle 5. Induktion der menschlichen PBMC-Cytokin-Sekretion durch Cpg-Oligos
    Figure 00370001
    • Punkte zeigen Identität an; CpG-Dinukleotide sind unterstrichen 1bestimmt durch ELISA mit Hilfe von Quantikin-Kits von R&D Systems (pg/ml). Die Zellen wurden in 10 %igem autologen Serum mit den angegebenen Oligodesoxynukleotiden (12 μg/ml) im Fall von TNF-α 4 Std. lang und bei den anderen Cytokinen 24 Std. inkubiert, bevor der Überstand gewonnen und getestet wurde. Die Daten sind angegeben als der Cytokin-Titer oberhalb desjenigen in Näpfen ohne hinzugesetztem Oligodesoxynucleotid.
  • CpG-DNA induziert die Cytokin-Sekretion durch humane PBMC, insbesondere Monozyten
  • Der gleiche Satz von ODN, der benutzt wurde, um die Mäuse-Cytokin-Expression zu untersuchen, wurde verwandt, um zu bestimmen, ob menschliche Zellen durch CpG-Motive ebenfalls induziert werden, Cytokine zu exprimieren (oder zu proliferieren) und um das/die verantwortliche(n) CpG-Motive) zu identifizieren. Der beste Induktor der TNF-α- und IFN-γ-Sekretion war Oligonukleotid 1619 (GTCGTT), dicht gefolgt von einem fast identischen Motiv in Oligonukleotid 1634 (GTCGCT) (Tabelle 5). Die Motive in den Oligodesoxynukleotiden 1637 und 1614 (GCCGGT und GACGGT) führten zu einer starken IL-6-Sekretion mit relativ geringer Induktion anderer Cytokine. Es scheint daher, dass menschliche Lymphozyten wie Mäuse-Lymphozyten, Cytokine differenziell als Reaktion auf CpG-Dinukleotide in Abhängigkeit von den umgebenden Basen sekretieren. Weiterhin unterscheiden sich die Motive, die die Mäusezellen am besten stimulieren, von denen, die bei den menschlichen Zellen am wirksamsten sind. Bestimmte CpG- Oligodesoxynukleotide sind schlechte Aktivatoren menschlicher Zellen (Oligodesoxynukleotide 1707 bzw. 1708, die die Palindrom-bildenden Sequenzen GACGTC bzw. CACGTG enthalten). Tabelle 6. CpG-DNA induziert die Cytokin-Sekretion durch menschliche PBMC
    Figure 00380001
    • 1 Die Konzentration aller Cytokine wurde wie bei der vorherigen Tabelle beschrieben durch ELISA mit Hilfe von Quantikin-Kits von R&D Systems bestimmt. Die Ergebnisse sind repräsentativ bei Verwendung von PBMC von verschiedenen Spendern.
    • 2 Die Zellen wurden 15 Min. lang mit L-Leucyl-L-Leucinmethylester (M-LME) vorbehandelt, um zu bestimmen, ob die Cytokin-Produktion unter diesen Bedingungen von Monozyten (oder von anderen L-LME-empfindlichen Zellen) stammte.
    • 3 EC-DNA wurde mit Hilfe von 2U/μg DNA CpG-Methylase (New England Biolabs) nach der Vorschrift des Herstellers methyliert und die Methylierung durch Verdau mit Hpa-II und Msp-I bestätigt. Als Negativkontrolle wurden Proben mit einbezogen, die die doppelte Höchstmenge an LPS enthielten, die in der höchsten Konzentration von EC-DNA enthalten war, was unter diesen experimentellen Bedingungen keine nachweisbare Cytokin-Produktion auslöste.
    • ND = nicht ausgeführt
  • Die auf die DNA reagierenden Zellen scheinen Monozyten zu sein, da die Cytokin-Sekretion durch Behandlung der Zellen mit L-Leucyl-L-Leucinmethylester (L-LME) aufgehoben wird, das selektiv toxisch auf Monozyten (aber auch auf cytotoxische T-Lymphozyten und NK-Zellen wirkt) wirkt, und die Ig-Sekretion durch B-Zellen nicht beeinträchtigt (Tabelle 6). Die die L-LME-Behandlung überlebenden Zellen hatten nach dem Ausschlusstest mit Trypanblau eine Lebensfähigkeit von >95%, was zeigt, dass das Fehlen einer Cytokin-Antwort bei diesen Zellen nicht einfach ein Zeichen eines unspezifischen Todes aller Zelltypen war. Die Cytokin-Sekretion als Reaktion auf E. coli (EC)-DNA erfordert unmethylierte CpG-Motive, da sie durch die Methylierung von EC-DNA aufgehoben wird (siehe Tabelle 6, neben der untersten Reihe). Eine LPS-Verunreinigung der DNA kann die Ergebnisse nicht erklären, da das Ausmaß der Verunreinigung bei der nativen und der methylierten DNA identisch war und da die Zugabe des Doppelten der Höchstmenge an verunreinigendem LPS keine Wirkung zeigte (nicht gezeigt).
  • Der Verlust der Cytokin-Produktion in den PBMC, die mit L-LME behandelt worden waren, legte nahe, dass möglicherweise Monozyten für die Cytokin-Produktion als Reaktion auf CpG-DNA verantwortlich sein könnten. Um diese Hypothese direkter zu testen, wurden die Wirkungen von CpG-DNA auf hoch gereinigte menschliche Monozyten und Makrophagen getestet. Wie vermutet, aktivierte CpG-DNA die Produktion der Cytokine IL-6, GM-CSF und TNF-α durch menschliche Makrophagen direkt, wohingegen Nicht-CpG-DNA dies nicht tat (Tabelle 7). Tabelle 7. CpG-DNA induziert die Cytokin-Expression in gereinigten menschlichen Makrophagen
    Figure 00400001
  • Biologische Rolle von IL-6 bei der Induktion der murinen IgM-Produktion in Reaktion auf CpG-Motive.
  • Die kinetischen Studien, die oben beschrieben wurden, zeigten, dass die Induktion der IL-6-Sekretion, die innerhalb von 1 Std. nach der CpG-Stimulierung stattfindet, der IgM-Sekretion vorausgeht. Da das optimale CpG-Motiv für die ODN, die die Sekretion von IL-6 induzieren, das gleiche ist wie für IgM (Tabelle 2), wurde überprüft, ob die CpG-Motive die IgM- und IL-6-Produktion unabhängig induzieren oder ob die IgM-Produktion abhängig von einer vorherigen IL-6-Sekretion ist. Die Zugabe von neutralisierenden anti-IL-6-Antikörpern inhibierte die in vitro IgM-Produktion, die durch CpG-ODN vermittelt wurde, in einer dosisabhängigen Weise, aber ein Kontroll-Antikörper hatte diese Wirkung nicht (4A). Dagegen hatte die Zugabe von anti-IL-6 keinen Einfluss auf den Basistiter oder die CpG-induzierte B-Zell-Proliferation (4B).
  • Erhöhte Transkriptionsaktivität des IL-6-Promotors in Reaktion auf CpG-DNA
  • Die erhöhte Konzentration von IL-6-mRNA und -Protein nach der CpG-DNA-Stimulierung könnte das Ergebnis transkriptioneller oder post-transkriptioneller Regulierung sein. Um zu bestimmen, ob die transkriptionelle Aktivität des IL-6-Promotors in mit CpG-ODN inkubierten B-Zellen hoch-geregelt war, wurde eine murine B-Zelllinie, WEHI-231, die IL-6 in Reaktion auf CpG-DNA produziert, mit einem IL-6-Promotor-CAT-Konstrukt transfiziert (pIL-6/CAT) (Pottratz, S.T. et al., 17B-estradiol) inhibits expression of human interleukin-6-promoter-reporter constructs by a receptor-dependent mechanism. J. Clin. Invest. 93:944). CAT-Tests wurden nach Stimulierung mit verschiedenen Konzentrationen von CpG- oder Nicht-CpG-ODN durchgeführt. Wie 5 zeigt, induziert CpG-ODN eine erhöhte CAT- Aktivität in einer dosisabhängigen Weise, wohingegen Nicht-CpG-ODN keine CAT-Aktivität induzierte. Dies bestätigt, dass CpG die Transkriptionsaktivität des IL-6-Promotors induziert.
  • Abhängigkeit der B-Zell-Aktivierung durch CpG-ODN von der Anzahl der 5'- und 3'-Phosphothioat-Internukleotid-Bindungen.
  • Um zu bestimmen, ob eine teilweise Schwefelmodifikation des ODN-Rückgrates ausreichend ist, um die B-Zell-Aktivierung zu verstärken, wurden die Wirkungen einer Reihe von ODN mit der gleichen Sequenz aber unterschiedlichen Anzahlen von S-Internukleotid-Bindungen an den 5'- und 3'-Enden getestet. Im Rahmen von früheren Arbeiten zum Nuklease-Abbau von ODN wurde bestimmt, dass mindestens zwei Phosphothioat-Bindungen am 5'-Ende der ODN benötigt wurden, um optimalen Schutz des ODN gegen Abbau durch intrazelluläre Exo- und Endo-Nukleasen zu gewährleisten. Daher wurden ausschließliche chimäre ODN mit zwei 5'-Phosphothioat-modifizierten Bindungen und einer variablen Anzahl von 3'-modifizierten Bindungen untersucht.
  • Die Lymphozyten-stimulierenden Wirkungen dieser ODN wurde bei drei Konzentrationen (3,3, 10 und 30 μM) gemessen, indem die Gesamtmenge an RNA-Synthese (durch 3H-Uridin-Einbau) oder DNA-Synthese (durch 3H-Thymidin-Einbau) in behandelten Milzzellkulturen gemessen wurde (Beispiel 10). O-ODN (0/0-Phosphothioat-Modifikationen) mit einem CpG-Motiv verursachten keine Stimulierung von Milzzellen, wenn sie nicht in einer Konzentration von mindestens 10 μM zu den Kulturen gegeben wurden (Beispiel 10). Wenn diese Sequenz jedoch mit zwei S-Verknüpfungen am 5'-Ende und mindestens drei S-Verknüpfungen am 3'-Ende modifiziert waren, wurde eine erhebliche Stimulierung bei einer Dosis von 3,3 μM beobachtet. Bei dieser geringen Dosis nahm die Stimulierung fortschreitend zu, wenn die Anzahl der 3'-modifizierten Basen erhöht wurde, bis diese den Wert sechs erreichte oder übertraf, wobei an diesem Punkt der Stimulierungsindex zu sinken begann. Im Allgemeinen betrug die optimale Anzahl der 3'-S-Verknüpfungen bei der Milzzellen-Stimulierung fünf. Bei allen drei Konzentrationen, die bei diesen Experimenten untersucht wurden, war das S-ODN weniger stimulierend als die optimalen chimären Verbindungen.
  • Abhängigkeit der CpG-vermittelten Lymphozyten Aktivierung von der Art der Rückgrat-Modifikation.
  • Phosphothioat-modifizierte ODN (S-ODN) sind bei weitem Nuklease-resistenter als Phosphodiester-modifizierte ODN (O-ODN). Daher könnte die im Vergleich zu O-ODN erhöhte Immunstimulierung durch S-ODN und S-O-ODN (d. h. chimäre Phosphothioat-ODN, bei denen die zentralen Verknüpfungen Phosphodiester sind, die aber zwei 5'- und fünf 3'-Verknüpfungen Phosphothioat-modifiziert sind) das Ergebnis der Nukleaseresistenz der ersten beiden sein. Um die Rolle der ODN-Nukleaseresistenz bei der Immunstimulierung durch CpG-ODN zu bestimmen, wurden die stimulierenden Wirkungen von chimären ODN getestet, bei denen die 5'- und 3'-Enden durch entweder Methylphosphonat (MP-), Methylphosphothioat (MPS-)-, Phosphothioat (S-)- oder Phosphodithioat (S2-)-Internukleotid-Verknüpfungen nukleaseresistent gemacht wurden (Beispiel 10). Diese Arbeiten zeigten, dass MP-O-ODN trotz ihrer Nukleaseresistenz tatsächlich weniger immunstimulierend als O-ODNs waren. Wurden jedoch die MP- und S-Modifikationen zusammengebracht, indem beide nicht -verbindenden O-Moleküle durch 5'- und 3'-MPS-Internukleotid- Verknüpfungen ersetzt wurden, dann wurde die Immunstimulierung wiederhergestellt und erreichte ein etwas höheres Niveau als das, das durch O-ODN ausgelöst wurde.
  • Zumindest bei Konzentrationen von 3,3 μM waren S-O-ODN bei weitem mehr stimulierend als O-ODN und sogar noch stimulierender als S-ODN. Bei Konzentrationen unter 3 μM war das S-ODN mit der 3M-Sequenz wirksamer als das entsprechende S-O-ODN, wohingegen das S-ODN mit der 3D-Sequenz weniger wirksam war als das entsprechende S-O-ODN (Beispiel 10). Beim Vergleich der stimulierenden CpG-Motive der beiden Sequenzen wurde festgestellt, dass die 3D-Sequenz genau dem stimulierenden Motiv entspricht, bei dem das CpG von zwei 5'-Purinen und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert ist. Jedoch sind die Basen, die das CpG in ODN 3D unmittelbar flankieren, nicht optimal; es weist ein 5'-Pyrimidin und ein 3'-Purin auf. Bei weiteren Tests wurde herausgefunden, dass die Sequenzbedingung für die Immunstimulierung bei S-ODN zwingender ist als für S-O- oder O-ODN. S-ODN, die kaum mit dem optimalen CpG-Motiv übereinstimmen, verursachen wenig oder keine Lymphozyten-Aktivierung (z.B. Sequenz 3D). Jedoch sind S-ODN, die gut mit dem Motiv übereinstimmen, insbesondere an den Stellen, die das CpG unmittelbar flankieren, wirksamer als die entsprechenden S-O-ODN (z.B. Sequenz 3M, Sequenzen 4 und 6), wenngleich bei höheren Konzentrationen (höher als 3 μM) die Spitzenwirkung von S-O-ODN höher ist (Beispiel 10).
  • S2-O-ODN waren bemerkenswert stimulierend und verursachten bei jeder getesteten Konzentration eine erheblich größere Lymphozyten-Aktivierung als die entsprechenden S-ODN oder S-O-ODN.
  • Die erhöhte B-Zell-Stimulierung, die mit S- oder S2-Substitutionen tragenden CpG-ODN beobachtet wurde, könnte das Ergebnis von jedem oder allen der folgenden Effekte sein: Nukleaseresistenz, erhöhte zelluläre Aufnahme, zunehmende Bindung an Proteine und veränderte intrazelluläre Lokalisation. Jedoch kann Nukleaseresistenz nicht die einzige Erklärung sein, da die MP-O-ODN tatsächlich weniger stimulierend als die O-ODN mit CpG-Motiven waren. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Aufnahme von ODN durch Lymphozyten erheblich durch die Rückgrat-Chemie beeinflusst wird (Zhao et al., (1993) Comparison of cellular binding and uptake of antisense phosphodiester, phosphothioate, and mixed phosphothioate and methylphosphonate oligonucleotides. (Antisense Research and Development 3, 53–66; Zhao et al., (1994) Stage specific oligonucleotide uptake in murine bone marrow B cell precursors. Blood 84, 3660–3666). Die höchste Bindung an Zellmembranen und die höchste Aufnahme wurden mit S-ODN beobachtet, gefolgt von S-O-ODN, O-ODN und MP-ODN. Diese unterschiedliche Aufnahme korreliert gut mit dem Ausmaß der Immunstimulierung.
  • Unmethylierte CpG-enthaltende Oligos weisen NK-Zellen-stimulierende Aktivität auf
  • Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob Oligonukleotide, die CpG enthalten, zusätzlich zu B-Zellen die Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) stimulieren. Wie Tabelle 8 zeigt, wurde eine deutliche Induktion der NK-Aktivität bei Milzzellen, die mit CpG-ODN 1 und 3Dd inkubiert wurden, beobachtet. Im Gegensatz dazu gab es im Vergleich keine Induktion bei Effektoren, die mit Nicht-CpG-Kontroll-ODN behandelt worden waren. Tabelle B. Induktion von NK-Aktivität durch CpG-Oligodesoxynukleotide (ODN)
    Figure 00440001
  • Induktion der NK-Aktivität durch DNA mit CpG-Motiven, aber nicht durch Nicht-CpG-DNA.
  • Bakterielle DNA, die 18 Std. bei 37 °C inkubiert worden war und dann auf ihre abtötende Aktivität auf K562 (Mensch)- oder Yac-1 (Maus)-Zielzellen getestet wurde, induzierte NK-lytische Aktivität sowohl in Mausmilzzellen mit vermindertem B-Zell-Gehalt als auch bei menschlichen PBMC, aber Wirbeltier-DNA hatte diese Wirkung nicht (Tabelle 9). Um zu bestimmen, ob die stimulierende Aktivität bakterieller DNA möglicherweise eine Folge ihres erhöhten Gehaltes an unmethylierten CpG-Dinukleotiden ist, wurden die aktivierenden Eigenschaften von mehr als 50 synthetischen ODN, die unmethylierte, methylierte oder gar keine CpG-Dinukleotide enthalten, getestet. Die in Tabelle 9 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass synthetische ODN eine erhebliche NK-Aktivität stimulieren können, solange sie mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthalten. Zwischen den stimulierenden Wirkungen von ODN, in denen sich das CpG innerhalb von einem Palindrom befindet (wie ODN 1585, das das Palindrom AACGTT enthält), und den ODN ohne Palindrome (wie 1613 oder 1619), konnte unter dem Vorbehalt, dass die optimale Stimulierung im Allgemeinen mit ODN beobachtet wurde, bei denen das CpG von zwei 5'-Purinen oder einem 5'-GpT-Dinukleotid und zwei 3'-Pyrimidinen flankiert wurde, kein Unterschied festgestellt werden. Kinetische Experimente zeigten, dass die NK-Aktivität ihren Spitzenwert ungefähr 18 Std. nach der Zugabe der ODN erreichte. Diese Ergebnisse zeigen, dass die murine NK-Reaktion von der vorherigen Aktivierung von Monozyten durch CpG-DNA abhängt, was zur Produktion von IL-12, TNF-α und IFN-α/b führt (Beispiel 11). Tabelle 9. Induktion von NK-Aktivität durch DNA, die CpG-Motive enthält, aber nicht durch Nicht-CpG-DNA
    Figure 00450001
    • CpG-Dinukleotide in ODN-Sequenzen sind durch Unterstreichung gekennzeichnet; Z steht für Methylcytosin. Kleingeschriebene Buchstaben stehen für Nuklease-resistente Phosphothioat-modifizierte Internukleotidverknüpfungen, die, je nach den flankierenden Basen, in Titrationsexperimenten mehr als 20 Mal so wirksam wie nicht-modifizierte ODN waren. Bei einigen ODN wurden Poly G-Enden (g) verwendet, da sie die Menge an aufgenommenem ODN erheblich erhöhen.
  • Aus all diesen Studien wurde ein vollständigeres Verständnis der Immunwirkungen von CpG-DNA entwickelt, das in 6 zusammengefasst ist.
  • Die Immunaktivierung durch CpG-Motive kann von den Basen, die das CpG flankieren, und von der Anzahl und vom räumlichen Abstand der innerhalb eines ODN vorhandenen CpGs abhängen. Obwohl ein einzelnes CpG in einem idealen Basenkontext ein sehr starker und nützlicher Immunaktivator sein kann, können überlegene Wirkungen mit ODN festgestellt werden, die mehrere CpGs in geeignetem räumlichen Abstand und mit geeigneten flankierenden Basen enthalten. Das optimale CpG-Motiv für die Aktivierung von murinen B-Zellen ist TGACGTT.
  • Die folgenden Arbeiten wurden durchgeführt, um optimale ODN-Sequenzen für die Stimulierung von humanen Zellen zu identifizieren, indem die Wirkungen von Änderungen der Anzahl, des räumlichen Abstandes und der flankierenden Basen von CpG-Dinukleotiden untersucht wurden.
  • Identifizierung von Phosphothioat-ODN mit optimalen CpG-Motiven für die Aktivierung, von menschlichen NK-Zellen
  • Um einen klinischen Nutzen zu haben, müssen ODN einem Lebewesen in einer Form verabreicht werden, die sie gegen Nuklease-Abbau schützt. Verfahren, um dieses mit Phosphodiester-ODN zu erreichen, sind auf diesem Gebiet wohlbekannt, und umfassen das Einkapseln in Lipide oder Abgabesysteme wie Nanopartikel. Dieser Schutz kann auch durch chemische Substitutionen der DNA wie modifizierte DNA-Rückgrate erreicht werden, die solche umfassen, bei denen die Internukleotid-Verbindungen Nuklease-resistent sind. Manche Modifikationen können zusätzliche wünschenswerte Eigenschaften wie erhöhte zelluläre Aufnahme verleihen. Beispielsweise kann die Phosphodiester-Bindung durch Ersatz eines der nicht-verbrückenden Sauerstoffatome mit einem Schwefel modifiziert sein, was eine Phosphothioat-DNA ergibt. Phosphothioat-ODN weisen eine erhöhte zelluläre Aufnahme (Krieg et al., Antisense Res. Dev. 6:133, 1996.) und verbesserte B-Zell-Stimulierung auf, wenn sie auch ein CpG-Motiv aufweisen. Da die NK-Aktivierung stark mit den in vivo-Adjuvans-Wirkungen korreliert, ist die Identifikation von Phosphothioat-ODN, die humane NK-Zellen aktivieren werden, sehr wichtig.
  • Die Wirkungen von verschiedenen Phosphothioat-ODNs – die CpG-Nukleotide in verschiedenen Basenkontexten enthalten – auf die menschliche NK-Aktivierung (Tabelle 10) wurden untersucht. ODN 1840, das 2 Kopien des TGTCGTT-Motivs enthielt, wies eine erhebliche NK-lytische Aktivität auf (Tabelle 10). Um weiter zusätzliche, für die NK-Aktivierung optimale ODNs zu identifizieren, wurden ungefähr 100 ODN mit verschiedenen Anzahlen und räumlichen Abständen der CpG-Motive getestet, wobei ODN 1982 als Kontrolle diente. Tabelle 11 zeigt die Ergebnisse.
  • Wirksame ODNs begannen mit einem TC oder TG am 5'-Ende, aber diese Bedingung war nicht zwingend. ODNs mit internen CpG-Motiven (z.B. ODN 1840) sind im Allgemeinen weniger wirksamere Stimulatoren als solche, bei denen ein GTCGCT-Motiv unmittelbar dem 5'-TC folgt (z.B. ODN 1967 und 1968). ODN 1968, das ein zweites GTCGTT-Motiv in seiner 3'-Hälfte besitzt, war in Übereinstimmung damit stimulierender als ODN 1967, dem dieses zweite Motiv fehlt. ODN 1967 war jedoch in den Experimenten 1 und 3, aber nicht im Experiment 2 etwas wirksamer als ODN 1968. ODN 2005, das ein drittes GTCGTT-Motiv aufweist, induzierte im Durchschnitt eine leicht höhere NK-Aktivität als 1968. Jedoch war ODN 2006, bei dem der räumliche Abstand zwischen den GTCGTT-Motiven durch das Hinzufügen von zwei Ts zwischen jedem Motiv erhöht wurde, dem ODN 2005 und auch dem ODN 2007 gegenüber überlegen, in dem nur eines der Motive zusätzlich die abstandsbedingenden zwei Ts aufwies. Der minimale akzeptable räumliche Abstand zwischen CpG-Motiven ist ein Nukleotid, solange das ODN zwei Pyrimidine (bevorzugterweise T) am 3'-Ende (z.B. ODN 2015) aufweist. Überraschenderweise konnte man auch durch das Verbinden von zwei GTCGTT-Motiven an ihren Enden mit einem 5'-T ebenfalls einen akzeptabel starken Induktor für NK-Aktivität erzeugen (z.B. ODN 2016). Die Wahl eines Thymins (T) zur Trennung aufeinanderfolgender CpG-Dinukleotide ist nicht absolut, da ODN 2002 trotz der Tatsache, dass Adenin (A) seine CpGs trennte (d. h. CGACGTT), eine nennenswerte NK-Aktivierung induzierte. Es sollte auch festgestellt werden, dass ODNs, die keine CpG (z.B. ODN 1982), lange Abfolgen von CpGs oder CpGs in ungeeigneten Sequenzkontexten (z.B. ODN 2010) enthielten, keine stimulierende Wirkung auf die NK-Aktivierung hatten. Tabelle 10 ODN-Induktion von NK-lytischer Aktivität (LU)
    Figure 00480001
    • 1 Lytische Einheiten (LU) wurden gemessen wie beschrieben (8). Kurz gefasst wurden PBMC von normalen Spendern gesammelt und über Ficoll abzentrifugiert, dann mit oder ohne die angegebenen ODN (die zu einer Konzentration von 6 μg/ml zu den Kulturen hinzugegeben wurden) 24 Std. lang inkubiert. Danach wurde ihre Fähigkeit bestimmt, 51Cr-markierte K562-Zellen zu lysieren. Die gezeigten Ergebnisse sind typisch für solche, die mit mehreren verschiedenen normalen menschlichen Spendern erhalten wurden. 2Dieser Oligomix enthielt eine zufällige Auswahl an allen 4 Basen an jeder Position.
    Tabelle 11. Induktion der NK-LU durch Phosphothioat-CpG-ODN mit guten Motiven
    Figure 00490001
    • 1 PBMC wie im Wesentlichen hierin beschrieben. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 6 getrennte Experimente; jedes Experiment steht für einen unterschiedlichen Spender. 2Dies ist die methylierte Version von ODN 1840; Z=5-Methylcytosin, LU sind lytische Einheiten; ND = nicht ausgeführt; CpG-Dinukleotide sind der Anschaulichkeit halber unterstrichen
  • Identifizierung von Phosphothioat-ODN mit optimalen CpG-Motiven für die Aktivierung der Proliferation von menschlichen B-Zellen
  • Die Fähigkeit eines CpG-ODN, die Proliferation von B-Zellen zu induzieren, ist ein gutes Maß für sein Potenzial als Adjuvans. Tatsächlich induzieren ODNs mit starken Adjuvanswirkungen im Allgemeinen auch die B-Zellen-Proliferation. Um zu bestimmen, ob die optimalen CpG-ODN für die Induktion der B-Zellen-Proliferation die gleichen sind wie für die Induktion der NK-Zellen-Aktivität, wurden ähnliche Sätze von ODN (Tabelle 12) getestet. Die konsistenteste Stimulierung trat bei ODN 2006 auf (Tabelle 12). Tabelle 12. Induktion der Proliferation humaner B-Zellen durch Phosphothioat-CpG-ODN
    Figure 00500001
    • 1 Zellen = humane Milzzellen, die nach der Gewinnung mittels Chirurgie bei –70 °C gelagert wurden, oder PBMC, die von normalen Spendern gesammelt wurden und über Ficoll abzentrifugiert wurden. Die Zellen wurden in Microtiter-Platten mit 96 Näpfen mit U-förmigem Boden mit oder ohne die angegebenen ODN inkubiert (die zu den Kulturen zu 6 μml gegeben wurden). N = 12 Experimente. Die Zellen wurden 4–7 Tage inkubiert, erhielten 18 Std. vor der Ernte und der Szintillationszählung einen 1 μCi 3H-Thymidin- Puls. Stimulierungsindex = das Verhältnis der cpm in Näpfen ohne ODN zu den Näpfen, in denen während der Inkubationsdauer mit den angezeigten ODN stimuliert wurde (es gab keine weiteren Zugaben von ODN, nachdem die Kulturen vorbereitet worden waren). ND = nicht ausgeführt
  • Identifizierung von Phosphothioat-ODN, die humane IL-12-Sekretion induzieren
  • Die Fähigkeit eines CpG-ODN, IL-12-Sekretion zu induzieren, ist ein gutes Maß für sein Potential als Adjuvans, besonders im Hinblick auf seine Fähigkeit, eine Th1-Immunantwort zu induzieren, die in hohem Maße von IL-12 abhängt. Daher wurde die Fähigkeit von einer Reihe von Phosphothioat-ODN untersucht, die IL-12-Sekretion von humanen PBMC in vitro zu induzieren (Tabelle 13). Diese Experimente zeigten, dass die meisten CpG-ODN in einigen menschlichen PBMC die IL-12-Sekretion induzieren konnten (z.B. Experiment 1). Jedoch reagierten andere Donoren nur auf einige CpG-ODN (z.B. Experiment 2). ODN 2006 war ein konsistenter Induktor der IL-12-Sekretion bei den meisten Individuen (Tabelle 13). Tabelle 13. Induktion der menschlichen IL-12-Sekretion durch Phosphothioat-CpG-ODN
    Figure 00510001
    • 1 PBMC von normalen Spendern gewonnen und über Ficoll abzentrifugiert, dann bei einer Konzentration von 106 Zellen/Napf in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit oder ohne die angegebenen ODN, die zu den Kulturen zu einer Konzentration von 6 μg/ml gegeben wurden, inkubiert. Überstände wurden nach 24 Std. gesammelt und durch ELISA wie im Methodenteil beschrieben auf ihre IL-12-Konzentrationen getestet. Für jedes Experiment wurde eine Standardkurve angefertigt, die für einen unterschiedlichen Spender steht.
  • Identifizierung von B-Zell- und Monocyten/NK Zellen-spezifischen Oligonukleotiden
  • Wie in 6 gezeigt, kann CpG-DNA direkt hoch gereinigte B-Zellen und Monozyten aktivieren. Bei den Mechanismen, durch die CpG-DNA diese Zellarten aktivieren, gibt es viele Ähnlichkeiten. Zum Beispiel benötigen beide die NFκB-Aktivierung, wie weiter unten erklärt wird.
  • Bei weiteren Studien zu verschiedenen Immunwirkungen von CpG-DNA wurde gezeigt, dass es mehr als eine Art von CpG-Motiv gibt. Insbesondere ist Oligo 1668, mit dem besten Maus-B-Zellen-Motiv, ein starker Induktor von sowohl der B-Zellen- als auch der natürlichen Killerzellen (NK)-Aktivierung, wohingegen Oligo 1758 ein schwacher B-Zellen-Aktivator ist, aber dennoch hervorragende NK-Reaktionen induziert (Tabelle 14). Tabelle 14. Verschiedene Cpg-Motive stimulieren in optimaler Weise die murine B-Zellen- und NK-Aktivierung
    Figure 00520001
    • CpG-Dinukleotide sind unterstrichen; Oligonukleotide wurden mit Phosphothioatmodifizierten Rückgraten synthetisiert, um ihre Nukleaseresistenz zu verbessern. 1Gemessen durch H-Thymidin-Einbau nach 48 Std. Inkubation mit Oligodesoxynukleotiden bei einer Konzentration von 200 nM wie in Beispiel 1 beschrieben. 2Gemessen in lytischen Einheiten.
  • Teleologische Basis der immunstimulierenden Nukleinsäuren
  • Wirbeltier-DNA ist in hohem Maße methyliert und CpG-Dinukleotide sind unterrepräsentiert. Das stimulierende CpG-Motiv ist in mikrobieller genomischer DNA jedoch weit verbreitet, aber in Wirbeltier-DNA durchaus selten. Darüber hinaus wurde berichtet, dass bakterielle DNA die Proliferation von B-Zellen und die Immunglobulin (Ig)-Produktion induziert, wohingegen Säugetier-DNA dies nicht tut (Messing, J.P. et al., J. Immunol. 147:1759 (1991)). In Beispiel 3 weiter beschriebene Experimente, bei denen herausgefunden wurde, dass die Methylierung von bakterieller DNA durch CpG-Methylase die mitogene Wirkung aushebt, zeigen, dass der Unterschied im CpG-Status der Grund für die B-Zellen-Stimulierung durch bakterielle DNA ist. Diese Ergebnisse stützen die folgende Schlussfolgerung: dass unmethylierte CpG-Dinukleotide innerhalb der bakteriellen DNA für die stimulierenden Wirkungen der bakteriellen DNA verantwortlich sind.
  • Vom teleologischen Standpunkt scheint es wahrscheinlich, dass die Lymphozyten-Aktivierung durch das CpG-Motiv einen Verteidigungsmechanismus des Immunsystems darstellt, der auf diese Weise bakterielle DNA von Wirts-DNA unterscheiden kann. Wirts-DNA, die üblicherweise in zahlreichen anatomischen Entzündungsregionen und -bereichen aufgrund von Apoptose (Zelltod) vorhanden wäre, würde im Allgemeinen aufgrund von CpG-Unterdrückung und -Methylierung wenig oder keine Lymphozyten-Aktivierung induzieren. Jedoch kann die Anwesenheit von bakterieller DNA, die unmethylierte CpG-Motive enthält, genau in infizierten anatomischen Regionen eine Lymphozyten-Aktivierung bewirken, wo sie nützlich ist. Dieser neue Aktivierungsweg stellt eine schnelle Alternative zur T-Zellenabhängigen Antigen-spezifischen B-Zellen-Aktivierung bereit. Da der CpG-Weg mit der B-Zellen-Aktivierung durch den Antigen-Rezeptor synergistisch wirkt, würden Antigen-Rezeptor-tragende B-Zellen mit Spezifität für bakterielle Antigene ein Aktivierungssignal durch Zellmembran-Ig erhalten und ein zweites Signal durch bakterielle DNA, und würden daher dazu neigen, bevorzugt aktiviert zu werden. Die wechelseitigen Beziehungen dieses Weges mit anderen Wegen, die zur B-Zellen-Aktivierung führen, stellen einen physiologischen Mechanismus bereit, der ein polyklonales Antigen verwendet, um Antigenspezifische Reaktionen zu induzieren.
  • Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die 8-Zellen-Aktivierung nicht völlig unspezifisch wäre. B-Zellen, die einen für bakterielle Produkte spezifischen Antigen-Rezeptor tragen, könnten ein Aktivierungssignal durch Zellmembran-Ig und ein zweites von bakterieller DNA erhalten, wodurch sie Antigen-spezifische Immunantworten energischer auslösen könnten. Wie bei anderen Verteidigungsmechanismen des Immunsystems könnte die Reaktion auf bakterielle DNA in einigen Konstellationen unerwünschte Folgen haben. Zum Beispiel würden Autoimmun-Reaktionen auf körpereigene Antigene ebenfalls dazu neigen, bevorzugt durch bakterielle Infektionen ausgelöst zu werden, da Autoantigene ebenfalls ein zweites Aktivierungssignal an durch bakterielle DNA aktivierte autoreaktive B-Zellen liefern könnten. Tatsächlich ist die Induktion der Autoimmunität durch bakterielle Infektion eine übliche klinische Beobachtung. Ein Beispiel ist die Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes, der: i) durch die Produktion von anti-DNA-Antikörpern gekennzeichnet ist; ii) durch Medikamente, die DNA-Methyltransferase inhibieren, induziert wird (Cornacchia, E.J. et al., J. Clin. Invest. 92:38 (1993)); und iii) mit reduzierter DNA-Methylierung verbunden ist (Richardson, B., L. et al., Arth. Rheum 35:647 (1992)), und der wahrscheinlich zumindest teilweise durch die Aktivierung von DNA-spezifischen B-Zellen durch stimulierende Signale, die von CpG-Motiven bereitgestellt werden, genauso wie durch die Bindung von bakterieller DNA an Antigen-Rezeptoren ausgelöst wird.
  • Weiterhin wird Sepsis, die durch hohe Morbidität und Mortalität infolge massiver und nichtspezifischer Aktivierung des Immunsystems gekennzeichnet ist, möglicherweise durch bakterielle DNA und andere, aus sterbenden Bakterien freigesetzte Produkte initiiert, die Konzentrationen erreichen, die ausreichend sind, um viele Lymphozyten direkt zu aktivieren. Weitere Belege für die Rolle von CpG-DNA beim Sepsis-Syndrom sind beschrieben in Cowdery, J., et al., (1996) The Journal of Immunology 156:4570–4575.
  • Anders als Antigene, die B-Zellen durch ihren Oberflächen-Ig-Rezeptor aktivieren, induzieren CpG-ODN keinen messbaren Ca2+-Strom, Veränderungen bei der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung oder IP 3-Erzeugung. Flusszytometrie mit FITC-konjugierten ODN mit oder ohne CpG-Motiv wurde wie beschrieben in Zhao, Q. et al., (Antisense Research and Development 3:53–66 (1993)) ausgeführt, und zeigte äquivalente Membranbindung, zelluläre Aufnahme, Ausstrom und intrazelluläre Lokalisation. Dies legt nahe, dass es möglicherweise keine Zellmembranproteine gibt, die spezifisch für CpG-ODN sind. Die Daten lassen vermuten, dass Oligonukleotide mit unmethylierten CpGs die zelluläre Aufnahme für ihre Aktivität benötigen, anstatt durch die Zellmembran zu wirken: ODN, die kovalent an eine feste Teflonschicht gebunden waren, waren nicht-stimulierend, genau so wie biotinylierte ODN, die entweder an Avidin-Kügelchen oder an mit Avidin beschichteten Petrischalen immobilisiert waren. Mit FITC oder Biotin konjugierte CpG-ODN behielt ihre vollen mitogenen Eigenschaften, was die Abwesenheit von sterischer Hinderung anzeigt.
  • Kürzlich erhaltene Daten zeigen an, dass der Transkriptionsfaktor NFκB als direkter oder indirekter Vermittler der CpG-Wirkung beteiligt ist. Zum Beispiel nimmt das Ausmaß der NFκB-Bindeaktivität innerhalb von 15 Minuten nach der Behandlung von B-Zellen oder Monozyten mit CpG-DNA zu (7). Sie wird jedoch nicht durch DNA, die keine CpG-Motive enthält, erhöht. Weiterhin wurde herausgefunden, dass zwei verschiedene Inhibitoren der NFκB-Aktivierung, PDTC und Gliotoxin, die Lymphozytenstimulierung durch CpG-DNA völlig blockieren, wie anhand der B-Zellen-Proliferation oder Monozyten-Cytokin-Sekretion bestimmt wurde, was nahe legt, dass die NFκB-Aktivierung für beide Zelltypen benötigt wird.
  • Es gibt mehrere mögliche Mechanismen, durch die NFκB aktiviert werden kann. Diese umfassen die Aktivierung durch verschiedene Proteinkinasen oder die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies. Es wurden keine Hinweise auf eine unmittelbar nach CpG-DNA-Behandlung von B-Zellen oder Monozyten induzierte Proteinkinase-Aktivierung gefunden, und Inhibitoren von Proteinkinase A, Proteinkinase C und Protein-Tyrosin-Kinasen hatten keine Wirkungen auf die CpG-induzierte Aktivierung. Allerdings verursachte CpG-DNA eine schnelle Induktion der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies sowohl in B-Zellen als auch Monozyten, wie durch den empfindlichen fluoreszierenden Farbstoff Dihydrorhodamin 123, beschrieben in Royall, J.A., und Ischiropoulos, H. (Archives of Biochemistry and Biophysics 302:348–355 (1993)) nachgewiesen wurde. Darüber hinaus blockieren Inhibitoren der Erzeugung dieser reaktiven Sauerstoffspezies komplett die Induktion von NFκB und die spätere Induktion der Zellproliferation und Cytokin-Sekretion durch CpG-DNA.
  • Rückwärts blickend war die nächste Frage, wie CpG-DNA so schnell zur Erzeugung der reaktiven Sauerstoffspezies führte. Vorherige Arbeiten der Erfinder zeigten, dass Oligonukleotide und Plasmide oder bakterielle DNA von den Zellen in Endosomen aufgenommen werden. Diese Endosomen werden im Inneren der Zelle schnell angesäuert. Um zu bestimmen, ob dieser Ansäuerungsschritt für den Mechanismus, durch den CpG-DNA reaktive Sauerstoffspezies aktiviert, wichtig ist, wurde der Ansäuerungsschritt mit spezifischen Inhibitoren der Endosomansäuerung, die Chloroquin, Monensin und Bafilomycin umfassen und die durch verschiedene Mechanismen wirken, blockiert. 8A zeigt die Ergebnisse einer Flusszytometrie-Studie, bei der murine B-Zellen mit dem Farbstoff Dihydrorhodamin 123 verwendet wurden, um die Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies zu bestimmen. Die nur Farbstoff enthaltende Probe in Feld A der Figur zeigt, dass der Hintergrund an Zellen, die positiv auf den Farbstoff reagieren, bei 28,6% liegt. Wie erwartet wurde diese Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies auf 80% erheblich erhöht, wenn die Zellen 20 Minuten lang mit PMA und Ionomycin, einer Positivkontrolle, behandelt wurden (Feld B). Die mit dem CpG-Oligo behandelten Zellen zeigten ebenfalls eine Erhöhung der Konzentration reaktiver Sauerstoffspezies, so dass mehr als 50% der Zellen positiv wurden (Feld D). Hingegen zeigten Zellen, die mit einem Oligonukleotid behandelt wurden, das abgesehen davon, dass das CpG vertauscht war, die gleiche Sequenz aufwies, diesen erheblichen Anstieg des Titers reaktiver Sauerstoffspezies nicht (Feld E).
  • In Anwesenheit von Chloroquin sehen die Ergebnisse völlig anders aus (8B). Chloroquin erniedrigt den Hintergrund an reaktiven Sauerstoffspezies in den Zellen leicht, so dass von den unbehandelten Zellen in Feld A nur 4,3% positiv sind. Cloroquin hebt die Induktion reaktiver Sauerstoffspezies in mit CpG-DNA behandelten Zellen völlig auf (Feld B), reduziert aber nicht die Konzentration an reaktiven Sauerstoffspezies in mit PMA und Ionomycin behandelten Zellen (Feld E). Dies zeigt, dass anders als bei PMA plus Ionomycin die Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies nach der Behandlung mit CpG-DNA es erforderlich macht, dass die DNA in den Endosomen einem Ansäuerungsschritt unterzogen wird. Dies ist ein völlig neuartiger Mechanismus der Leukozyten-Aktivierung. Chloroquin, Monensin und Bafilomycin scheinen auch die Aktivierung von NFkB durch CpG-DNA ebenso wie die folgende Proliferation und Induktion der Cytokin-Sekretion zu blockieren.
  • Chronische Immunaktivierung durch Cpg-DNA und Autoimmunerkrankungen
  • Die B-Zellen-Aktivierung durch CpG-DNA wirkt synergistisch mit Signalen durch den B-Zellen-Rezeptor. Daher besteht die Möglichkeit, dass DNA-spezifische B-Zellen möglicherweise durch die durch das gleichzeitige Binden von bakterieller DNA an ihren Antigen-Rezeptor und durch co-stimulierende CpG-vermittelte Signale aktiviert werden. Darüber hinaus induziert CpG-DNA bei B-Zellen Resistenz gegen Apoptose, ein Mechanismus, von dem man glaubt, dass er wichtig für die Verhinderung von Immunantworten gegen körpereigene Antigene wie DNA wichtig ist. Tatsächlich kann die Einwirkung von bDNA die Produktion von anti-DNA-Ab auslösen. Im Hinblick auf diese mögliche Fähigkeit von CpG-DNA, Autoimmunität zu fördern, ist es deshalb wert, festzustellen, dass Patienten mit der Autoimmunkrankheit systemischer Lupus erythematodes hartnäckig erhöhte Titer von im Plasma zirkulierender DNA aufweisen, bei der hypomethylierte CpGs angereichert sind. Diese Erkenntnisse legen eine mögliche Rolle für die chronische Immunaktivierung durch CpG-DNA bei der Lupus-Ätiopathogenese nahe.
  • Eine Klasse von Medikamenten, die bei der Behandlung von Lupus wirken, sind Anti-Malaria-Medikamente wie Chloroquin. Während der therapeutische Mechanismus dieser Medikamente unklar gewesen ist, ist bekannt, dass sie die endosomale Ansäuerung inhibieren. Die Leukozyten-Aktivierung durch CpG-DNA wird nicht durch die Bindung an einen Oberflächenrezeptor der Zelle vermittelt, sondern erfordert die Aufnahme durch die Zelle, was durch adsorptive Endozytose in ein angesäuertes Chloroquin-empfindliches intrazelluläres Kompartiment geschieht. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Leukozyten-Aktivierung durch CpG-DNA in Verbindung mit angesäuerten Endosomen erfolgt und sogar pH-abhängig sein könnte. Um diese Annahme zu testen, wurden spezifische Inhibitoren der DNA-Ansäuerung verwendet, um zu bestimmen, ob B-Zellen oder Monozyten auf CpG-DNA reagieren könnten, wenn die endosomale Ansäuerung verhindert war.
  • Das früheste Leukozyten-Aktivierungsereignis, das als Reaktion auf CpG-DNA nachgewiesen wurde, ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die in primären Milzzellen und sowohl B- als auch Monozyten-Zelllinien innerhalb von fünf Minuten induziert wird. Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung, einschließlich Chloroquin, Bafilomycin A und Monensin, die unterschiedliche Wirkmechanismen aufweisen, blockierten die CpG-induzierte Erzeugung von ROS, hatten aber keine Wirkung auf die ROS-Erzeugung, die durch PMA oder Ligation von CD40 oder IgM vermittelt wurde. Diese Studien zeigen, dass die ROS-Erzeugung ein übliches Ereignis bei der Leukozyten-Aktivierung durch diverse Signalwege ist. Die ROS-Erzeugung ist im Allgemeinen unabhängig von der endosomalen Ansäuerung, die nur für die ROS-Reaktion auf CpG-DNA benötigt wird. Die ROS-Erzeugung als Reaktion auf CpG wird nicht durch den NFκB-Inhibitor Gliotoxin inhibiert, was bestätigt, dass sie gegenüber der NFκB-Aktivierung nicht sekundär ist.
  • Um zu bestimmen, ob die endosomale Ansäuerung durch CpG-DNA auch für ihre anderen immunstimulierenden Wirkungen benötigt wurde, wurden durchgeführt. Sowohl LPS als auch CpG-DNA induzierten eine ähnliche schnelle NFκB-Aktivierung, Erhöhung der Konzentationen proto-onkogener mRNA und Cytokin-Sekretion. Die Aktivierung von NFκB durch DNA war abhängig von CpG-Motiven, da sie nicht durch mit CpG-Methylase behandelte bDNA induziert wurde und auch nicht durch ODN, bei denen Basen vertauscht waren, um die CpGs zu unterbrechen. Supershift-Experimente unter Verwendung von spezifischen Antiköpern zeigten, dass die aktivierten NFκB-Komplexe die p50- und p65-Bestandteile umfasst. Nicht unerwartet, wurde die NFκB-Aktivierung in LPS- oder CpG- behandelten Zellen vom Abbau von IκBα und IκBβ begleitet. Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung blockierten jedoch selektiv alle CpG-induzierten, aber keine der LPS-induzierten zellulären Aktivierungsereignisse. Die sehr geringe Konzentration von Chloroquin (<10 μM), von der gezeigt werden konnte, dass sie die CpG-vermittelte Leukozyten-Aktivierung inhibiert, ist bemerkenswert, da sie weit unter der Konzentration liegt, die für die anti-Malaria-Aktivität und andere veröffentlichte Immunwirkungen benötigt wird (z.B. 100–1000 μM). Diese Experimente stützen die Rolle eines pH-abhängigen Signalmechanismus bei der Vermittlung der stimulierenden Wirkungen von CpG-DNA. Tabelle 15. Spezifische Blockade der CpG-induzierten TNF-α- und IL-12-Expression durch Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung oder NFκB-Aktivierung
    Figure 00580001
    • Legende von Tabelle 15 IL-12- und TNF-α-Tests: Die murine Monozyten-Zelllinie J774 (1 × 105 Zellen/ml bei IL-12 oder 1 × 106 Zellen/ml bei TNF-α) wurden mit oder ohne die angegebenen Inhibitoren bei den gezeigten Konzentrationen 2 Std. lang inkubiert und dann mit einer Konzentration von 2 μM des CpG-Oligodesoxynukleotids (ODN) 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT SEQ ID NO: 10) oder durch LPS (10 μg/ml) für 4 Std. (TNF-α) oder 24 Std. (IL-12) stimuliert und nach dieser Zeit der Überstand geerntet. ELISA zur Bestimmung von IL-12 oder TNF-α (pg/ml) wurden mit den Überständen durchgeführt wie im Wesentlichen beschrieben (A. K. Krieg, A.-K. Yi, S. Matson, T.J. Waldschmidt, G. A. Bishop, R. Teasdale, G. Koretzky und D. Klinman, Nature 374, 546 (1995); Yi, A.-K., D. M. Klinman, T. L. Martin, S. Matson und A. M. Krieg, J. Immunol., 157, 5394–5402 (1996); Krieg, A.M., J. Lab. Clin. Med., 128, 128–133 (1996). Die Zellen, die mit ODNs, denen die CpG-Motive fehlten, inkubiert wurden, zeigten keine induzierte Cytokin-Sekretion. Eine ähnliche spezifische Inhibition der CpG-Reaktionen wurde bei IL-6-Tests festgestellt, und bei Experimenten unter Verwendung von primären Milzzellen oder den B-Zelllinien CH12.LX und WEHI-231. 2,5 μg/ml Chloroquin ist äquivalent <5 μM. Andere Inhibitoren der NFκB-Aktivierung, einschließlich PDTC und die Calpain-Inhibitoren I und II, ergaben ähnliche Ergebnisse wie die gezeigten Inhibitoren. Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für die in zehn getrennten Experimenten erhaltenen Ergebnisse.
  • Eine übermäßige Immunaktivierung durch CpG-Motive trägt möglicherweise zur Pathogenese der Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes bei, die mit erhöhten Konzentrationen zirkulierender hypomethylierter CpG-DNA verbunden ist. Chloroquin und verwandte anti-Malaria-Verbindungen sind wirksame therapeutische Agenzien für die Behandlung von systemischem Lupus erythematodes und anderer Autoimmunerkrankungen, obwohl ihr Wirkmechanismus unklar war. Das Aufzeigen der Fähigkeit extrem geringer Chloroquin-Konzentrationen durch uns, die CpG-vermittelte Leukozyten-Aktivierung spezifisch zu inhibieren, legt einen möglichen neuen Mechanismus für seine nützliche Wirkung nahe. Es ist bemerkenswert, dass die Auslösung von wieder auftretendem Lupus häufig mikrobiellen Infektionen zugeschrieben wird. In infizierten Geweben vorhandene bDNA-Konzentrationen können ausreichend sein, um eine lokale Entzündungsreaktion auszulösen. Zusammen mit der wahrscheinlichen Rolle von CpG-DNA als Vermittler des Sepsis-Syndroms und von anderen Krankheiten schlagen unsere Arbeiten neue therapeutische Anwendungen für anti-Malaria-Medikamente vor, die als Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung wirken.
  • Die CpG-induzierte ROS-Erzeugung könnte eine zufällige Folge der Zellaktivierung oder von einem Signal sein, das diese Aktivierung vermittelt. Der ROS-Fänger N-Acetyl-L-Cystein (NAC) blockiert die CpG-induzierte NFκB-Aktivierung, die Cytokin-Produktion und die B-Zellen-Proliferation, was eine kausale Rolle für die ROS-Erzeugung in diesen Stoffwechselwegen vorschläge. Diese Ergebnisse passen zu früheren Belegen, die eine Rolle der ROS bei der Aktivierung von NfκB stützen. WEHI-231-B-Zellen (5 × 105 Zellen/ml) wurden 30 Minuten lang mit oder ohne Chloroquin (5 μg/ml [<10 μM]) oder Gliotoxin (0,2 μg/ml) vorinkubiert. Zellaliquots wurden dann wie oben 10 Minuten lang in RPMI-Medium mit oder ohne CpG-ODN (1826) oder Nicht-CpG-ODN (1911) bei einer Konzentration von 1 μM oder Phorbolmyristatacetat (PMA) plus Ionomycin (iono) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Dihydrorhodamin-123 gefärbt und durch Flusszytometrie auf intrazelluläre ROS-Produktion wie beschrieben analysiert (A. K. Krieg, A.-K. Yi, S. Matson, T. J. Waldschmidt, G. A. Bishop, R. Teasdale, G. Koretzky und D. Klinman, Nature 374, 546 (1995); Yi, A.-K., D. M. Klinman, T. L. Martin, S. Matson und A. M. Krieg, J. Immunol., 157, 5394–5402 (1996); Krieg, A. M., J. Lab. Clin. Med., 128, 128–133 (1996)). J774-Zellen, eine monozytische Zelllinie, zeigte ähnliche, pH-abhängige, CpG-induzierte ROS-Reaktionen. Dagegen induzierte CpG-DNA nicht die Erzeugung von extrazellulären ROS oder anderen nachweisbaren Neutrophilen-ROS. Diese Konzentrationen von Chloroquin (und die, die mit anderen Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung benutzt wurden) verhinderten die Ansäuerung internalisierter CpG-DNA unter Verwendung von Fluorescein-konjugierten ODN, wie beschrieben von Tonkinson, et al. (Nucl. Acids. Res. 22, 4268 (1994); A. M. Krieg, In: Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics. Herausgeber, S. Akhtar, CRC Press, Inc., S. 177 (1995)). Bei höheren Konzentrationen als denen, die zur Inhibierung der endosomalen Ansäuerung benötigt wurden, wurden nicht -spezifische inhibitorische Wirkungen beobachtet. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
  • Während NFκB bekanntermaßen ein wichtiger Regulator der Genexpression ist, war seine Rolle bei der transkriptionellen Reaktion auf CpG-DNA unklar. Um zu bestimmen, ob diese NFκB-Aktivierung für die CpG-vermittelte Induktion der Genexpression benötigt wurde, wurden Zellen mit CpG-DNA in Anwesenheit oder Abwesenheit von Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC), einem Inhibitor der IκB-Phosphorylierung, aktiviert. Diese Inhibitoren der NFκB-Aktivierung hemmten die durch CpG-induzierte Expression von Protooncogen- und Cytokin-mRNA und Protein vollständig, was die essentielle Rolle von NFκB als Vermittler dieser Ereignisse zeigt. Keiner dieser Inhibitoren reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen unter den in diesen Arbeiten verwendeten experimentellen Bedingungen. A J774, eine murine Monozytenzelllinie, wurde in Anwesenheit von Kalbsthymus (CT)-, E. coli (EC)- oder methylierter E. coli (mEC)-DNA (wie beschrieben4 mit CpG-Methylase methyliert), bei 5 μg/ml, oder einem CpG-Oligodesoxynukleotid (ODN 1826; Tabelle 15) oder einem Nicht-CpG-ODN (ODN 1745; TCCATGAGCTTCCTGAGTCT) bei 0,75 μM 1 Std. lang inkubiert; danach wurden die Zellen lysiert und Kernextrakte zubereitet. Ein doppelsträngiges ODN, das eine Konsens-NFκB-Stelle enthielt, wurde am 5'-Ende radiomarkiert und im Wesentlichen wie beschrieben (J. D. Dignam, R. M. Lebovitz und R. G. Roeder, Nucleic Acids Res. 11, 1475 (1983); M. Briskin, M. Damore, R. Law, G. Lee, P. W. Kincade, C. H. Sibley, M. Kuehl und R. Wall, Mol. Cell. Biol. 10, 422 (1990)) als Sonde für EMSA verwendet. Die Position des p50/p65-Heterodimers wurde durch Supershifting mit den für p65- und p50-spezifischen Antikörpern bestimmt (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Die Chloroquin-Inhibierung der CpG-induzierten, aber nicht der LPS-induzierten NFκB-Aktivierung wurde mit J774-Zellen geklärt. Die Zellen wurden für 2 Std. in Anwesenheit oder Abwesenheit von Chloroquin (20 μg/ml) vorinkubiert und dann 1 Std. lang wie oben entweder mit ED-DNA, CpG-ODN, Nicht-CpG-ODN oder LPS (1 μg/ml) stimuliert. In einer B-Zelllinie, WEHI-231, und primären Milzzellen wurde eine ähnliche Chloroquin-empfindliche CpG-induzierte Aktivierung von NFκB beobachtet. Diese Experimente wurden dreimal mit einer Bandbreite der Chloroquin-Konzentrationen von 2,5 bis 20 μg/ml durchgeführt und ergaben ähnliche Ergebnisse.
  • Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die CpG-stimulierte mRNA-Expression in B-Zellen und Monozyten die endosomale Ansäuerung und NFκB-Aktivierung benötigt. J774-Zellen (2 × 106 Zellen/ml) wurden 2 Std. lang in Anwesenheit oder Abwesenheit von Chloroquin (2,5 μg/ml [< 5 μM]) oder N-Tosyl-L-Phenylalaninchlormetrylketon (TPCK; 50 μM) inkubiert, einem Serin-/Threonin-Proteaseinhibitor, der die IκB-Proteolyse verhindert und daher die NFκB-Aktivierung blockiert. Die Zellen wurden dann durch die Zugabe von E. coli-DNA (EC; 50 μg/ml), Kalbsthymus-DNA (CT; 50 μg/ml), LPS (10 μg/ml), CpG-ODN (1826; 1 μM), oder Kontroll-nicht-CpG-ODN (1911; 1 μM) 3 Std. lang stimuliert. WEHI-231-B-Zellen (5 × 105 Zellen/ml) wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit von Gliotoxin (0,1 μg/ml) oder Bisgliotoxin (0,1 μg/ml) 2 Std. lang inkubiert und mit CpG-ODN (1826) oder Kontroll-nicht-CpG-ODN (1911; TCCAGGACTTTCCTCAGGTT) bei 0,5 μM für 8 h stimuliert. In beiden Fällen wurden die Zellen geerntet und die RNA wurde mit Hilfe von RNAzol nach Anweisung des Herstellerprotokolls dargestellt. Ein mehrere Sonden umfassender RNase Schutztest wurde wie beschrieben durchgeführt (A.-K. Yi, P. Hornbeck, D.E. Lafrenz und A.M. Krieg, J. Immunol, 157, 4918–4925 (1996). Vergleichbare Mengen von RNA wurden unter Verwendung von ribosomaler mRNA als Ladekontrolle (L32) auf jede Spur geladen. Diese Experimente wurden dreimal mit ähnlichen Ergebnissen ausgeführt.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass Leukozyten auf CpG-DNA über einen neuen Signalweg reagieren, der die pH-abhängige Erzeugung von intrazellulären ROS umfasst. Der pH-abhängige Schritt kann der Transport oder die Verarbeitung der CpG-DNA, die ROS-Erzeugung oder ein anderes Ereignis sein. Viele halten ROS für sekundäre Botenstoffe in Signalwegen in diversen Zelltypen, aber es wurde bisher noch nicht gezeigt, dass sie ein stimulierendes Signal in B-Zellen vermitteln.
  • Vermutlich gibt es ein Protein in oder nahe den Endosomen, das spezifisch CpG-Motiveenthaltende DNA erkennt und zur Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies führt. Um jedes Protein im Zellzytoplasma nachzuweisen, das möglicherweise spezifisch an CpG-DNA bindet, wurden electrophoretic mobility shift assays (EMSA) mit 5'-radioaktiv markierten Oligonukleotiden mit oder ohne CpG-Motiven benutzt. Es wurde eine Bande gefunden, die anscheinend ein Protein zeigt, das spezifisch an einzelsträngige Oligonukleotide mit CpG-Motiven bindet, aber nicht an Oligonukleotide, denen CpG-Motive fehlen oder an Oligonukleotide, bei denen das CpG-Motiv methyliert wurde. Diese Bindungsaktivität wird blockiert, wenn ein Überschuss an Oligonukleotiden zugegeben wurde, die die NFkB-Bindungsstelle enthalten. Dies schlägt vor, dass ein NFkB oder ein verwandtes Protein einen Bestandteil des Proteins oder Proteinkomplexes ist, der an die stimulierenden CpG-Oligonukleotide bindet.
  • Zu Zeiten, an denen NFkB stark aktiviert war, wurde keine Aktivierung von CREB/ATF-Proteinen festgestellt. Diese Daten stellen deshalb keinen Beweis dafür dar, dass NFkB-Proteine tatsächlich an die CpG-Nukleinsäuren binden, sondern eher dafür, dass diese Proteine auf irgendeine Weise für die CpG-Aktivität benötigt werden. Es ist möglich, dass ein CREB/ATF oder verwandtes Protein auf irgendeine Weise mit NFkB-Proteinen oder anderen Proteinen wechselwirkt, was die bemerkenswerte Ähnlichkeit der Bindungsmotive für CREB-Proteine und dem optimalen CpG-Motiv erklären könnte. Es besteht weiterhin die Möglichkeit, dass die Oligos an CREB/ATF- oder ein verwandtes Protein binden, und dass dies zur NFkB-Aktivierung führt.
  • Alternativ ist es sehr gut möglich, dass die CpG-Nukleinsäuren an eines der TRAF-Proteine binden, die an die cytoplasmatische Region von CD40 binden und die NFkB-Aktivierung vermitteln, wenn CD40 quervernetzt wird. Beispiele für solche TRAF-Proteine umfassen TRAF-2 und TRAF-5.
  • Verfahren zur Herstellung immunstimulierender Nukleinsäuren
  • Zur Verwendung für die vorliegende Erfindung können Nukleinsäuren de novo unter Verwendung von einer Anzahl von Verfahrensweisen synthetisiert werden, die in der Technik wohlbekannt sind. Zum Beispiel das b-Cyanoethylphosphoramidit-Verfahren (S.L. Beaucage und M.H. Caruthers, (1981) Tet. Let. 22:1859); das Nukleosid-H-Phosphonat-Verfahren (Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4051–4054; Froehler et al., (1986) Nucl. Acid. Res. 14:5399–5407; Garegg et al., (1986) Tet. Let. 27:4055–4058, Gaffney et al., (1988) Tet. Let. 29:2619–2622). Diese Reaktionen können von einer Vielzahl auf dem Markt erhältlicher automatischer Oligonukleotidsyntheseapparate ausgeführt werden. Alternativ können Oligonukleotide ausgehend von vorhandenen Nukleinsäuresequenzen (z.B. genomischer oder cDNA) mit Hilfe von bekannten Techniken, wie denjenigen, die von Restriktionsenzymen, Exonukleasen oder Endonukleasen Gebrauch machen, hergestellt werden.
  • Zur Benutzung in vivo sollten Nukleinsäuren vorzugsweise relativ resistent gegen Abbau (z.B. durch Endo- und Exo-Nukleasen) sein. Sekundärstrukturen wie Stem loops können Nukleinsäwen gegen Abbau stabilisieren. Alternativ kann eine Nukleinsäure-Stabilisierung durch Phosphat-Rückgrat-Modifikationen erreicht werden. Eine bevorzugte stabilisierte Nukleinsäure hat zumindest ein teilweise Phosphothioat-modifiziertes Rückgrat. Phosphothioate können mit Hilfe von automatischen Techniken synthetisiert werden, die entweder von der Phosphoramidat- oder H-Phosphonat-Chemie Gebrauch machen. Aryl- und Alkyl-Phosphonate können z.B. wie in U.S. Patent Nr. 4,469,863 beschrieben hergestellt werden; und Alkylphosphotriester (bei denen der geladene Sauerstoffteil alkyliert ist, wie in U.S. Patent Nr. 5,023,243 und dem Europäischen Patent Nr. 092,574 beschrieben) können durch automatische Festphasensynthese unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien hergestellt werden. Verfahren zum Ausbilden anderer DNA-Rückgrat-Modifikationen und Substitutionen sind beschrieben worden (Uhlmann, E. und Peyman, A. (1990) Chem. Rev. 90:544; Goodchild, J. (1990) Bioconjugate Chem. 1:165). 2'-O-Methyl-Nukleinsäuren mit CpG-Motiven verursachen ebenfalls eine Immunaktivierung, genauso wie Ethoxy-modifizierte CpG-Nukleinsäuren. Tatsächlich wurde keine Rückgrat-Modifikation gefunden, die die CpG-Wirkung vollständig aufhebt, auch wenn sie erheblich reduziert wird, wenn das C durch ein 5-Methyl-C ersetzt ist.
  • Zur Verabreichung in vivo können Nukleinsäuren mit einem Molekül verbunden sein, das zu einer höheren Bindungsaffinität zu Zielzellen- (z.B. B-Zellen, Monozyten und natürliche Killerzellen (NK))-Oberflächen und/oder erhöhten zellulären Aufnahme durch Zielzellen führt, um einen „Nukleinsäure-Abgabekomplex" auszubilden. Nukleinsäuren können mit geeigneten Molekülen ionisch oder kovalent unter Verwendung von Techniken verbunden werden, die in der Technik gut bekannt sind. Eine Vielzahl von Kopplungs- oder Vernetzungs-Reagenzien, wie z.B. Protein A, Carbodiimid und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP), können verwendet werden. Alternativ können Nukleinsäuren in Liposomen oder Virosomen unter Verwendung von wohlbekannten Techniken eingekapselt werden.
  • Therapeutische Anwendungen immunstimulierender Nukleinsäuremoleküle
  • Auf der Grundlage ihrer immunstimulierenden Eigenschaften können Nukleinsäuremoleküle mit mindestens einem unmethylierten CpG-Dinukleotid einem Lebewesenin vivo verabreicht werden, um eine „Defizienz des Immunsystems" zu behandeln. Alternativ können Nukleinsäuremoleküle, die mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinukleotid enthalten, mit Lymphozyten (z.B. B-Zellen, Monozyten- oder NK-Zellen) von einem Lebewesen mit einer Defizienz des Immunsystems ex vivo in Kontakt gebracht werden, und aktivierte Lymphozyten können anschließend in das Lebewesen erneut implantiert werden.
  • Wie hierin berichtet sekretieren eine erhöhte Anzahl von Milzzellen als Reaktion auf Nukleinsäuremoleküle, die unmethyliertes CpG enthalten, IL-6, IL-12, IFN-y, IFN-α, IFN-β, IL-1, IL-3, IL-10, TNF-α, TNF-β, GM-CSF, RANTES und vermutlich weitere. Es wurde festgestellt, dass die zunehmende IL-6-Expression bei B-Zellen, CD4+-T-Zellen und Monozyten auftrat.
  • Immunstimulierende Oligonukleotide können einem Lebewesen auch in Verbindung mit einer Impfung verabreicht werden, um das Immunsystem des Lebewesens aufzufrischen und auf diese Weise eine bessere Wirkung des Impfserums zu bewirken. Bevorzugterweise wird das immunstimulierende Oligonukleotid kurz vor oder zeitgleich mit dem Impfstoff verabreicht. Ein konventionelles Adjuvans kann optional zusammen mit dem Impfstoff, der mindestens aus einem Antigen besteht, verabreicht werden, da das konventionelle Adjuvans die Impfwirkung durch Verstärkung der Antigen-Absorption weiter verbessern kann.
  • Wenn der Impfstoff ein DNA-Impfstoff ist, bestimmen mindestens zwei Komponenten seine Wirksamkeit. Erstens bestimmt das durch den Impfstoff codierte Antigen die Spezifität der Immunantwort. Zweitens wirkt das Rückgrat des Plasmides als Adjuvans für die Impfung, wenn es CpG-Motive enthält. Demnach wirkt CpG-DNA als ein wirksames „Gefahrensignal" und bewirkt, dass das Immunsystem auf neue Antigene in dem Gebiet energisch reagiert. Diese Wirkungsweise ist vermutlich primär das Ergebnis der stimulierenden lokalen Wirkungen der CpG-DNA auf dendritische Zellen und andere „professionelle" Antigenpräsentierende Zellen, genauso wie das der co-stimulierenden Wirkungen auf B-Zellen.
  • Immunstimulierende Oligonukleotide und Impfstoffe, die unmethylierte CpG enthalten, die Lymphozyten direkt aktivieren und eine Antigen-spezifische Reaktion co-stimulieren, unterscheiden sich grundlegend von herkömmlichen Adjuvantien (z.B. Aluminium-Präzipitaten), die bei der alleinigen Injektion inert sind und von denen man glaubt, dass sie dadurch wirken, dass sie das Antigen absorbieren und es auf diese Weise den Immunzellen wirksamer präsentieren. Weiterhin funktionieren konventionelle Adjuvantien nur bei bestimmten Antigenen, induzieren nur eine Antikörper (humorale)-Immunantwort (Th2), und sind sehr schlechte Induktoren der zellulären Immunantworten (Th1). Bei vielen Pathogenen trägt die humorale Antwort wenig zum Schutz bei und kann sogar schädlich sein.
  • Zusätzlich kann ein immunstimulierendes Oligonukleotid vor, zusammen mit oder nach der Verabreichung einer Chemotherapie oder Immunotherapie zur Erhöhung der Reaktionsfähigkeit der malignen Zellen auf nachfolgende Chemotherapie oder Immunotherapie oder zur Beschleunigung der Erholung des Knochenmarks durch Induktion der stärkenden Cytokine wie GM-CSF verabreicht werden. CpG-Nukleinsäuren erhöhen auch die Zell-lytische Aktivität natürlicher Killerzellen und die Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC). Die Induktion der NK-Aktivität und ADCC kann alleine oder in Verbindung mit anderen Behandlungen ebenfalls bei einer Krebs-Immunotherapie nützlich sein.
  • Eine andere Anwendung der beschriebenen immunstimulierenden Oligonukleotide ist die Desensibilisierungstherapie gegen Allergien, die im Allgemeinen durch die IgE-Antikörper-Produktion gegen harmlose Allergene verursacht werden. Die durch unmethylierte CpG-Nukleinsäuren induzierten Cytokine gehören vorwiegend zu einer „Th1" genannten Klasse, die am deutlichsten bei einer zellulären Immunantwort ist und die mit IL-12 und IFN-γ zusammenhängt. Die andere wichtige Art der Immunantwort nennt man Th2-Immunantwort, und diese hängt eher mit einer Antikörper-Immunantwort und mit der Produktion von IL-4, IL-5 und IL-10 zusammen. Im Allgemeinen scheinen allergische Krankheiten durch Th2-Typ-Immunantworten vermittelt zu werden und Autoimmunkrankheiten durch Th1-Immunantworten. Aufgrund der Fähigkeit der immunstimulierenden Oligonukleotide, die Immunantwort eines Lebewesens von einer Th2-Antwort (die mit der Produktion von IgE-Antikörpern und Allergien verbunden ist) zu einer Th1-Antwort (die vor allergischen Reaktionen schützt) umzulenken, kann einem Lebewesen zur Behandlung oder Verhinderung einer Allergie eine wirksame Dosis eines immunstimulierenden Oligonukleotids (oder eines Vektors, der eine Nukleinsäure enthält) alleine oder in Verbindung mit einem Allergen verabreicht werden.
  • Nukleinsäuren, die unmethylierte CpG-Motive enthalten, haben möglicherweise auch einen erheblichen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von Asthma. Die Konzentrationen von Th2-Cytokinen, insbesondere IL-4 und IL-5, sind in den Luftwegen von asthmatischen Lebewesen erhöht. Diese Cytokine fördern wichtige Aspekte der asthmatischen Entzündungsreaktion, die den Wechsel von IgE-Isotypen, die Chemotaxis und die Aktivierung von Eosinophilen und das Wachstum von Mastzellen umfassen. Th1-Cytokine, insbesondere IFN-γ und IL-12, können die Bildung von Th2-Klonen und die Produktion von Th2-Cytokinen unterdrücken.
  • Wie im Detail im folgenden Beispiel 12 beschrieben, verhinderten Oligonukleotide, die ein unmethyliertes CpG-Motiv (d. h. TCCATGACGTTCCTGACGTT; SEQ ID NO. 10) enthalten, nicht aber ein Kontroll-Oligonukleotid (TCCATGAGCTTCCTGAGTCT; SEQ ID NO 11), die Entwicklung eines entzündlichen zellulären Infiltrates und Eosinophilie in einem murinen Asthmamodell. Weiterhin war die Unterdrückung der eosinophilen Entzündung mit einer Unterdrückung einer Th2-Antwort und einer Induktion einer Th2-Antwort verbunden.
  • Für die Verwendung zur Behandlung kann eine wirksame Menge eines geeigneten immunstimulierenden Nukleinsäuremoleküls einem Lebewesen alleine oder in Form von einem Abgabekomplex auf jede Weise verabreicht werden, die erlaubt, dass das Oligonukleotid durch die geeignete Zielzelle (z.B. B-Zellen und Monozyten) aufgenommen wird. Bevorzugte Arten der Verabreichung sind orale und transdermale Verabreichung (z.B. über ein Pflaster). Beispiele für andere Arten der Verabreichung umfassen Injektionen (subkutan, intravenös, parenteral, intraperitoneal, intrathecal etc.). Die Injektion kann eine Bolusinjektion oder eine Dauerinfusion sein.
  • Eine Nukleinsäure alleine oder als Nukleinsäure-Abgabekomplex kann zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht werden. Wie hierin verwendet, soll die Formulierung „pharmazeutisch akzeptabler Träger" Substanzen umfasst, die zusammen mit einer Nukleinsäure oder einem Nukleinsäure-Abgabekomplex verabreicht werden können und die den Nukleinsäuren erlauben, ihre angegebenen Funktionen zu erfüllen. Beispiele solcher Träger umfassen Lösungen, Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Verzögermittel, Emulsionen u.ä. Die Benutzung solcher Medien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf diesem Gebiet wohlbekannt. Ein jeglicher anderer herkömmlicher Träger, der für die Verwendung mit den Nukleinsäwen geeignet ist, fällt in den Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Der Begriff „wirksame Menge" eines Nukleinsäuremoleküls bezeichnet die Menge, die notwendig oder ausreichend ist, um eine erwünschte biologische Wirkung zu realisieren. Zum Beispiel könnte eine wirksame Menge eines Nukleinsäwemoleküls, das mindestens ein unmethyliertes CpG enthält, zur Behandlung einer Defizienz des Immunsystems die Menge sein, die notwendig ist, um einen Tumor, Krebs oder eine bakterielle, virale oder Pilzinfektion zu beseitigen. Eine wirksame Menge für die Verwendung als Impfstoffadjuvans könnte die Menge sein, die nützlich ist, um die Immunantwort eines Lebewesens auf einen Impfstoff zu verstärken. Eine „wirksame Menge" zur Behandlung von Asthma kann die Menge sein, die dafür nützlich ist, eine Immunantwort vom Typ Th2, die mit Asthma verbunden ist, zu einer Antwort vom Typ Th1 umzulenken. Die wirksame Menge für eine jegliche Anwendung kann in Abhängigkeit von Faktoren wie der Krankheit oder dem Zustand, der behandelt wird, der besonderen Nukleinsäure, die verabreicht wird (z.B. die Anzahl an unmethylierten CpG-Motiven oder ihre Stelle innerhalb der Nukleinsäure), die Größe des Lebewesens oder der Schwere der Krankheit oder des Zustandes, schwanken. Der Durchschnittfachmann kann die wirksame Menge eines speziellen Oligonukleotides empirisch bestimmen, ohne dass unangemessene Versuche notwendig sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, die in keiner Weise als weiter einschränkend ausgelegt werden sollten.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Wirkungen von ODNs auf die Gesamt-RNA-Synthese und den Zellzyklus von B-Zellen
  • B-Zellen wurden aus Milzgewebe gereinigt, das von 6–12 Wochen alten spezifisch pathogen-freien DBA/2- oder BXSB-Mäusen (gezüchtet in den Tierställen der University of Iowa; es wurden keine besonderen Unterschiede zwischen den Stämmen bemerkt), die hinsichtlich 7-Zellen verarmt waren durch anti-Thy-1.2 und Komplement und Zentrifugation über Lymphocyte M (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada) („B-Zellen"). Die B-Zellen enthielten weniger als 1% CD4+- oder CD8+-Zellen. 8 × 104 B-Zellen wurden dreifach in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit 100 μl RPMI, das 10% FBS (bei 65 °C 30 Min. lang hitzeinaktiviert), 50 μM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 ug/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamat enthielt, gegeben. Zu Beginn der 20-stündigen Kultur bei 37 °C wurden 20 μM ODN hinzugegeben, die Zellen mit 1 μCi 3H-Uridin gepulst und 4 Std. später geerntet und gezählt. Ig-sekretierende B-Zellen wurden mit Hilfe des ELISA Spot Tests nach 48-stündiger Kultur der Ganzmilzzellen bei einer Konzentration von 20 μM der ODN gezählt. Die in Tabelle 1 gezeigten Daten zeigen den Stimulierungsindex im Vergleich zu Zellen, die ohne ODN inkubiert wurden. 3H-Thymidin-Einbau-Tests ergaben ähnliche Ergebnisse, aber etwas nicht-spezifischer Inhibition durch von abgebautem ODN freigesetztem Thymidin (Matson. S und A.M. Krieg (1992) Nonspecific suppression of 3H-thymidine incorporation by control oligonucleotides. Antisense Research and Development 2:325).
  • Beispiel 2: Wirkungen von ODN auf die Produktion von IgM durch B-Zellen
  • Einzelzell-Suspensionen aus den Milzen frisch getöteter Mäuse wurden nach dem Verfahren von Leibson et al., J. Exp. Med. 154:1681 (1981)) mit anti-Thyl, anti-CD4, anti-CD8 und Komplement behandelt. Ruhende B-Zellen (<02% T-Zellen-Kontamination) wurden nach dem Verfahren von DeFranco et al., J. Exp. Med. 155:1523 (1982) aus der 63–70% Bande eines diskontinuierlichen Percoll-Gradienten isoliert. Diese wurden 48 Std. lang wie oben beschrieben in 30 μM ODN oder 20 μg/ml LPS inkubiert. Mit Hilfe des ELIspot-Tests (Klinman, D.M. et al., J. Immunol. 144:506 (1990)) wurde bestimmt, dass die Zahl der aktiv IgM sekretierenden Zellen zu diesem Zeitpunkt maximal war. Bei diesem Test wurden B-Zellen 6 Std. lang auf mit anti-Ig beschichteten Mikrotiterplatten inkubiert. Das von ihnen produzierte Ig (>99% IgM) wurden unter Verwendung von Phosphatase-markiertem anti-Ig nachgewiesen (Southern Biotechnology Associated, Birmingham, AL). Die von individuellen B-Zellen produzierten Antikörper wurden durch Zugabe von BCIP (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) sichtbar gemacht, das in Anwesenheit von Phosphatase ein unlösliches blaues Präzipitat bildet. Die Verdünnung der Zellen, die 20–40 Punkte/Napf ergab, wurde verwendet, um die Gesamtzahl der Antikörper-produzierenden B-Zellen/Probe zu bestimmen. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt (Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt). Bei einigen Experimenten wurden die Kulturüberstände durch ELISA auf IgM getestet, und zeigten als Reaktion auf CpG-ODN ähnliche Zunahmen.
  • Beispiel 3: Stimulierung von B-Zellen durch bakterielle DNA
  • DBA/2 B-Zellen wurden ohne DNA oder mit 50 μg/ml DNA von a) Micrococcus lysodeikticus; b) NZB/N-Mausmilz; und c) genomische Milz-DNAs der NFS/N-Maus 48 Std. lang inkubiert, und danach 4 Stunden vor der Zellernte mit 3H-Thymidin gepulst. Doppelte DNA-Proben wurden 30 Minuten lang bei 37 °C vor der Zugabe zu den Zellkulturen mit DNASE I verdaut. Auch E. coli-DNA induzierte nach 48 Std. ebenfalls eine 8,8-fache Zunahme der IgM-sekretierenden B-Zellen, wie unter Verwendung des ELISA-Spot Tests gezeigt werden konnte.
  • DBA/2 B-Zellen wurden entweder ohne Zusatz, 50 μg/ml LPS oder dem ODN 1; 1a; 4; oder 4a bei einer Konzentration von 20 μM inkubiert. Die Zellen wurden inkubiert und nach 4, 8, 24 und 48 Stunden geerntet. BXSB-Zellen wurden wie in Beispiel 1 mit 5, 10, 20, 40 oder 80 μM-Konzentrationen des ODN 1; 1a; 4; oder 4a oder LPS inkubiert. Bei diesem Experiment zeigten Näpfe ohne ODN 3833 cpm. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Die Standardabweichungen von drei verschiedenen Näpfen waren <5%.
  • Beispiel 4: Wirkungen von ODN auf natürliche Killer (NK)-Aktivität
  • 10 × 106 C57BL/6-Milzzellen wurden in zwei ml RPMI (mit Zusätzen wie in Beispiel 1 beschrieben) mit oder ohne 40 μM CpG- oder Nicht-CpG-ODN 48 Std. lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und dann als Effektorzellen für einen Kurzzeit-51Cr-Freisetzungstest mit YAC-1 und 2C11, zwei NK-empfindlichen Zielzelllinien, verwendet (Ballas, Z. K. et al. (1993) J. Immunol. 150:17). Verschiedene Konzentrationen der Effektorzellen wurden zu 104 51Cr-markierten Zielzellen in Mikrotiterplatten mit V-förmigem Boden mit einem Volumen von 0,2 ml gegeben und 4 Std. lang bei 37 °C in 5% CO2 inkubiert. Die Platten wurden anschließend abzentrifugiert und die Radioaktivität eines Aliquots des Überstandes gemessen. Die spezifische Lyse in Prozent wurde bestimmt als das Verhältnis des in Anwesenheit der Effektorzellen freigesetzten 51Cr minus des 51Cr, das freigesetzt wurde, wenn die Zielzellen alleine inkubiert wurden, und den Gesamt-Zählern, die freigesetzt wurden, wenn die Zellen in 2 %-iger Essigsäure lysiert wurden, minus den freigesetzten 51Cr cpm, wenn die Zellen alleine inkubiert werden.
  • Beispiel 5: In vivo-Studien mit CpG-Phosphothioat-ODN
  • Die Mäuse wurden gewogen und erhielten eine IP-Injektion von 0,25 ml steriler PBS oder den in PBS gelösten angegebenen Phosphothioat-ODN. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Milzzellen geerntet, gewaschen und unter Verwendung von mit Phycoerythrin konjugiertem 6B2 für Flusszytometrie gefärbt, um zusammen mit Biotin-konjugiertem anti-Ly-6A/E oder anti-Iad (Pharmingen, San Diego, CA) oder anti-Bla-1 (Hardy, R.R. et al., J. Exp. Med. 159:1169 (1984) auf B-Zellen zu gaten. Für jede Bedingung wurden zwei Mäuse untersucht und individuell analysiert.
  • Beispiel 6: Titration von Phosphothioat-ODN zur B-Zellen-Stimulierung
  • B-Zellen wurden mit Phosphothioat-ODN mit der Sequenz des Kontroll-ODN 1a oder der CpG-ODN 1d und 3Db inkubiert und dann entweder nach 20 Std. mit 3H-Uridin oder nach 44 Std. mit 3H-Thymidin gepulst, bevor sie geerntet und die cpm gemessen wurden.
  • Beispiel 7: Rettung der B-Zellen vor Apoptose
  • WEHI-231-Zellen (5 × 104/Napf) wurden vor der Zugabe von anti-IgM (1 μ/ml) 1 Std. lang bei 37 °C in Anwesenheit oder Abwesenheit von LPS oder des Kontroll-ODN 1a oder der CpG-ODN 1d und 3Db inkubiert. Die Zellen wurden weitere 20 Std. inkubiert, bevor sie einen 4-stündigen Puls mit 2 μCi/Napf 3H-Thymidin erhielten. Bei diesem Experiment zeigten Zellen ohne ODN oder anti-IgM einen Einbau von 90,4 × 103 cpm 3H-Thymidin durch die Zugabe von anti-IgM. Das in Tabelle 1 gezeigte Phosphodiester-ODN ergab einen ähnlichen Schutz, wenn auch mit etwas unspezifischer Unterdrückung infolge ODN-Abbaus. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
  • Beispiel 8: In vivo-Induktion von murinem IL-6
  • Weibliche DBA/2-Mäuse (2 Monate alt) erhielten eine IP-Injektion von 500g CpG- oder Kontroll-Phosphothioat-ODN. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion wurde den Mäusen Blut abgenommen. Für jeden Zeitpunkt wurden zwei Mäuse untersucht. IL-6 wurde durch Elisa gemessen, und die IL-6-Konzentration durch Vergleich mit einer Standardkurve, die mit rekombinantem IL-6 aufgenommen wurde, ermittelt. Die Empfindlichkeit dieses Tests betrug 10 pg/ml. Nach 8 Std. waren die Konzentrationen nicht messbar.
  • Beispiel 9: Systemische Induktion der murinen IL-6-Transkription
  • Mäuse und Zelllinien. DBA/2-, BALB/c- und C3H/HeJ-Mäuse im Alter von 5–10 Wochen wurden als Lymphozytenquelle verwendet. Alle Mäuse wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten und gezüchtet und unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen in den Tierställen der University of Iowa gehalten. Die Maus-B-Zelllinie CH12.LX wurde freundlicherweise von Dr. G. Bishop zur Verfügung gestellt (University of Iowa, Iowa City).
  • Zellpräparation. Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet. Einzelzellsuspensionen wurden aseptisch aus dem Milzgewebe der Mäuse hergestellt. Maus-Splenozyten mit vermindertem T-Zellen-Gehalt wurden unter Verwendug von anti-Thy-1.2 und Komplement und Zentrifugation über Lymphocyte M (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada) wie beschrieben (Krieg, A.M. et al., (1989) A role for endogenous retroviral sequences in the regulation of lymphocyte activation. J. Immunol. 143:2448) hergestellt.
  • ODN und DNA. Phosphodiester-Oligonukleotide (O-ODN) und Rückgrat-modifizierte Phosphothioat-Oligonukleotide (S-ODN) wurden von der DNA Core facility der Universität Iowa oder von Operon Technologies (Alameda, CA) erhalten. E. coli-DNA (Stamm B) und Kalbsthymus-DNA wurden bei Sigma gekauft (St. Louis, MO). Alle DNA und ODN wurden durch Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und/oder Ethanolpräzipitation gereinigt. E. coli- und Kalbsthymus-DNA wurden vor der Verwendung durch 10-minütiges Aufkochen und anschließende 5-minütige Kühlung auf Eis einzelsträngig gemacht, bevor sie benutzt wurden. Bei einigen Experimenten wurden E. coli- und Kalbsthymus-DNA 2 Std. lang bei 37 °C in 1 × SSC mit 5 mM MgCl2 mit DNase I (2 U/μg DNA) verdaut. Um das Cytosin in CpG-Dinukleotiden in E. coli-DNA zu methylieren, wurde E. coli-DNA in NEB-Puffer 2, der mit 160 μM S-Adenosylmethionin supplementiert war, mit CpG-Methylase (M. SssI; 2 U/μg DNA) behandelt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Methylierte DNA wurde wie oben gereinigt. Die Effizienz der Methylierung wurde durch Hpa II-Verdau und anschließende Analyse durch Gelelektrophorese bestätigt. Alle Enzyme wurden bei New England Biolabs (Beverly, MA) gekauft. Die LPS-Konzentration in ODN war kleiner als 12,5 ng/mg und E. coli- und Kalbsthymus-DNA enthielten weniger als 2,5 ng LPS/mg DNA, wie durch den Limulus-Test bestimmt wurde.
  • Zellkultur. Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO2 24 Std. lang (für die IL-6-Produktion) oder 5 Tage lang (für die IgM-Produktion) in einem befeuchteten Inkubator in RPMI-1640 ergänzt mit 10% (v/v) Hitze-inaktiviertem fötalen Kalbsserum (FCS), 1,5 mM L-Glutamin, 50 μg/ml), CpG oder Nicht-CpG-Phosphodiester-ODN (O-ODN (20 μM), Phosphothioat-ODN (S-ODN) (0,5 μM) oder E. coli- oder Kalbsthymus-DNA (50 μg/ml) inkubiert. Die Konzentrationen von Stimulanzien wurden auf der Grundlage von vorläufigen Arbeiten mit Titrationen gewählt. In einigen Fällen wurden Zellen 5 Tage lang mit CpG-O-ODN zusammen mit verschiedenen Konzentrationen (1–10 μg/ml) neutralisierendem Ratten-IgGI-Antikörper gegen murines IL-6 (Hybridoma MP5-20F3) oder Kontroll-Ratten-IgG1 mAb gegen E. coli b-Galactosidase (Hybridoma GL113; ATCC, Rockville, MD) (20) behandelt. Am Ende der Inkubation wurden Fraktionen des Kulturüberstandes wie unten durch ELISA analysiert.
  • In vivo-Induktion von IL-6 und IgM. BALB/c-Mäuse erhielten intravenöse (iv) Injektionen von PBS, Kalbsthymus-DNA (200 μg/100 μl PBS/Maus), E. coli-DNA (200 μg/100 μl PBS/Maus) oder CpG- oder Nicht-CpG-S-ODN (200 μg/100 μl PBS/Maus). Mäusen (zwei/Gruppe) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten durch retroorbitale Punktierung Blut abgenommen, und sie wurden zu verschiedenen Zeitpunkten durch Genickbruch getötet. Leber, Milz, Thymus und Knochenmark wurden entfernt, und aus diesen Organen mit Hilfe von RNAzol B (Tel-Test, Friendswood, TX) nach dem Protokoll des Herstellers RNA hergestellt.
  • ELISA. Immun 1-Platten mit flachem Boden (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) wurden mit 100 μl/Napf anti-Maus-IL-6 mAb (MP5-20F3) (2 μg/ml) oder anti-Maus-IgM μ-Ketten-spezifisch (5 μg/ml; Sigma, St. Louis, MO) in Carbonat-Bicarbonatpuffer, pH 9,6 (15 nM Na2CO3, 35 mM NaHCO3) über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden anschließend mit TPBS (0,5 mM MgCl2o6H2O, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,14 M NaCl, 6,6 mM K2HPO4, 0,5% Tween 20) gewaschen und 2 Std. lang bei Raumtemperatur mit 10% FCS in TPBS geblockt und erneut gewaschen. Kulturüberstände, Mausseren, rekombinantes Maus-IL-6 (Pharmingen, San Diego, CA) oder gereinigter Maus-IgM (Calbiochem, San Diego, CA) wurden in geeigneter Weise in 10% FCS verdünnt und dreifach in Näpfen bei Raumtemperatur 6 Std. lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und 100 μl/Napf biotinylierte monoklonale Ratten-anti-Maus-IL-6-Antikörper (MP5-32C11, Pharmingen, San Diego, CA) (1 μg/ml in 10% FCS) oder biotinyliertes anti-Maus Ig (Sigma, St. Louis, MO) hinzugegeben und 45 Min. lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von mehrmaligem Waschen mit TPBS. 1:4000 in 10% FCS (100 μl/Napf) verdünnte, mit Avidin (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA) konjugierte Mehrrettich-Peroxidase (HRP) wurden hinzugegeben und bei Raumtemperatur 30 Min. lang inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 30 Min. lang mit O-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD; Sigma, St. Louis, MO) in 0,05 M Phosphat-Citrat-Puffer, pH 5,0, entwickelt. Die Reaktion wurde mit 0,67 N H2SO4 abgestoppt, und die Platten bei 490–600 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Cambridge Technology, Inc., Watertown, MA) ausgelesen. Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 gezeigt.
  • RT-PCR. Ein Sense-Primer, ein Antisense-Primer und eine interne Oligonukleotidsonde für IL-6 wurden unter Verwendung veröffentlichter Sequenzen (Montgomery, RA. und M.S. Dallman (1991), Analysis of cytokine gene expression during fetal thymic ontogeny using the polymerase chain reaction (J. Immunol.) 147:554) synthetisiert. Die cDNA-Synthese und IL-6-PCR wurden im Wesentlichen ausgeführt wie beschrieben von Montgomery und Dallman (Montgomery, RA. und M.S. Dallman (1991), Analysis of cytokine gene expression during fetal thymic ontogeny using the polymerase chain reaction (J. Immunol.) 147:554) unter Verwendung von RT-PCR-Reagenzien der Perkin-Elmer Corp. (Hayward, CA). Nach 30 Amplifikationszyklen wurden Proben durch Gelelektrophorese und anschließende Unblot-Analyse (Stoye, J.P. et al., (1991) DNA hybridization in dried gels with fragmented probes: an improvement over blotting techniques, Techniques 3:123) analysiert. Kurz gesagt wurde das Gel bei Raumtemperatur 30 Min. lang in Denaturierungspuffer (0,05 M NaOH, 1,5 M NaCl) hybridisiert und anschließend 30 Min. lang in Renaturierungspuffer (1,5 M NaCl, 1 M Tris, pH 8) inkubiert und 30 Min. lang in doppelt destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel wurde getrocknet und 2 Std. lang bei 47 °C in Hybridisierungspuffer (5 × SSPE, 0,1% SDS) mit 10 μg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA prähybridisiert. Das Gel wurde mit 2 × 106 cpm/ml g32[P]ATP-endmarkierter interner Oligonukleotidsonde gegen IL-6 (5'CATTTCCACGATTTCCCA3') SEQ ID No. 56) über Nacht bei 47 °C hybridisiert, 4 Mal gewaschen (2 × SSC, 0,2% SDS) und zur Anfertigung eines Autoradiogramms verwendet. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
  • Zell-Proliferationstest. DBA/2-Maus-Milz-B-Zellen (5 × 104 Zellen/100 μl/Napf) wurden 24 Std. lang bei 37 °C mit Medien, CpG oder Nicht-CpG-S-ODN (0,5 μM) oder O-ODN (20 μM) behandelt. Die Zellen wurden die letzten vier Std. entweder mit [3H]-Thymidin oder [3H]-Uridin (1 μCi/Well) gepulst. Die Mengen an eingebautem [3H] wurden mit einem Liquid Scintillation Analyzer (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL) gemessen.
  • Transfektionen und CAT-Tests. WEHI-231-Zellen (107 Zellen) wurden mit 20 μg Kontrolle oder menschlichem IL-6-Promotor-CAT-Konstrukt (freundlicherweise von S. Manolagas, Univ. von Arkansas zur Verfügung gestellt) (Pottratz, S.t. et al., (1994) 17B-estradiol inhibits expression of human interleukin-6 promoter-reporter constructs by a receptor-dependent mechanism. J. Clin. Invest. 93:944) bei 250 mV und 960 μF elektroporiert. Nach der Elektroporation wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an CpG- oder Nicht-CpG-ODN stimuliert. Die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Aktivität wurde mit einem Lösungstest (Seed, B. und J.Y. Sheen (1988) A single phase-extraction assay for chloramphenicol acetyl transferase activity. Gene 76:271) 16 Std. nach der Transfektion gemessen. Die Ergebnisse werden in 5 gezeigt.
  • Beispiel 10: Oligodesoxynukleotid-Modifikationen bestimmen die Größenordnung der B-Zellen-Stimulierung durch CpG-Motive
  • ODN wurden auf einem Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA) Modell 380A, 380B oder 394 DNA-Synthesizer unter Verwendung von Standardprozeduren (Beacage und Caruthers (1981) Deoxynucleoside phosphoramidites – A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. Tetrahedron Letters 22, 1859–1862) synthetisiert. Phosphodiester-ODN wurden unter Verwendung von Standard-beta-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie synthetisiert. Phosphothioat-Bindungen wurden durch Oxidation der Phosphit-Bindung mit elementarem Schwefel anstatt der Standard-Iod-Oxidierung eingefügt. Die vier gewöhnlichen Nukleosid-Phosphoramidite wurden von Applied Biosystems gekauft. Die Schutzgruppen von allen Phosphodiester- und Thioatenthaltenden ODN wurden durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniak für 12 Std. bei 55 °C entfernt. Die ODN wurden durch Gel-Ausschluss-Chromatographie gereinigt und vor der Benutzung bis zur Trockne lyophilisiert. Phosphodithioat-Bindungen wurden unter Verwendung von Desoxynukleosid-S-(b-Benzoylmercaptoethyl)-pyrrolidinothiophosphoramiditen eingefügt (Wiesler, W.T. et al., (1993) In Methods in Molecular Biology: Protocols for Oligonucleotides and Analogs – Synthesis and Properties, Agrawal, S. (Hrsg.), Humana Press, 191–206). Die Schutzgruppen von ODN, die Dithioate enthielten, wurden durch 12-stündige Behandlung mit konzentriertem Ammoniak bei 55 °C und anschließender Umkehrphasen-HPLC-Reinigung entfernt.
  • Um Oligomere, die bei jeder erwünschten Internukleotid-Bindung Methylphosphonothioate oder Methylphosphonate genauso wie Phosphodiester enthielten, wurden zwei verschiedene synthetische Zyklen benutzt. Die wesentlichen Syntheseunterschiede bei den beiden Zyklen sind das Kopplungsmittel, wo Dialkylaminomethylnukleosidphosphine verwendet werden, und die Oxidationsmittel im Falle von Methylphosphonothioate. Um beide Derivate zu synthetisieren, wurde aufgrund der langsameren Kopplungskinetik für die Dialkylaminomethylnukleosidphosphine die Kondensationszeit erhöht (Jager und Engels, (1984) Synthesis of deoxynucleoside methylphosphonates via a phosphonamidite approach. Tetrahedron Letters 24, 1437–1440). Nach Abschluss des Kupplungsschrittes wird der Methylphosphinodiester mit dem Schwefelungsmittel (5% elementarer Schwefel, 100 millimolar N,N-Diamethylaminopyridin in Kohlenstoffdisulfid/Pyridin/Triethylamin) behandelt, und zwar vier Mal hintereinander für jeweils 450 Sekunden, um Methylphosphonothioate zu produzieren. Um Methylphosphonat-Bindungen zu erzeugen, wird der Methylphosphinodiester mit Standardoxidationsmittel (0,1 M Iod in Tetrahydrofuran/2,6-Lutidin/Wasser) behandelt.
  • Das an das Silicagel gebundene Oligomer wurde vier Tage lang bei 4 Grad Celsius mit destilliertem Pyridin/konzentriertem Ammoniak, 1:1, (v/v) behandelt. Der Überstand wurde in Vakuum getrocknet, in Wasser gelöst und mit einer G50/50-Sephadex-Säule chromatographiert.
  • Wie hierin verwendet bezeichnet O-ODN auf ODN, die Phosphodiester sind; S-ODN sind vollständig Phosphothioat-modifiziert; S-O-ODN sind chimäre ODN, bei denen die zentralen Bindungen Phosphodiester sind, aber die zwei 5'- und fünf 3'-Bindungen Phosphothioatmodifiziert sind; S2-O-ODN sind chimäre ODN, bei denen die zentralen Bindungen Phosphodiester sind, aber die zwei 5'- und fünf 3'-Bindungen Phosphodithioat-modifiziert sind; und MP-O-ODN sind chimäre ODN, bei denen die zentralen Bindungen Phosphodiester, aber die zwei 5'- und die fünf 3'-Bindungen Methylphosphonat-modifiziert sind. Die untersuchten ODN-Sequenzen (CpG-Dinukleotide sind durch Unterstreichung angezeigt) umfassen
    Figure 00760001
  • Diese Sequenzen stehen im wahrsten Sinne des Wortes für Hunderte von CpG- und Nicht-CpG-ODN, die im Verlauf dieser Arbeiten getestet wurden.
  • Mäuse. DBA/2- oder BXSB-Mäuse, die von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten und unter spezifischen Pathogen-freien Bedingungen gehalten wurden, wurden im Alter von 5–10 Wochen mit im Wesentlichen identischen Ergebnissen als Lymphozytenquelle verwendet.
  • Zell-Proliferationstest. Bei Zell-Proliferationstests wurden Maus-Milzzellen (5 × 104 Zellen/100 μl/Napf) wie angegeben 24 oder 48 Std. lang bei 37 °C und 5% CO2 in einem angefeuchteten Inkubator in RPMI-1640 ergänzt mit 10% (v/v) Hitze-inaktiviertem fötalem Kälberserum (erhitzt auf 65 °C für Experimente mit O-ODN oder 56 °C für Experimente nur mit modifizierten ODN), 1,5 μM L-Glutamin, 50 μM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin inkubiert. Zu jedem Napf wurden 1 μCi 3H-Uridin oder – Thymidin (wie angegeben) gegeben, und die Zellen wurden nach vier weiteren Stunden Inkubation geerntet. Die Filter wurden durch Szintillationszählung gezählt. Die Standardabweichungen von Dreifachnäpfen waren < 5%. Die Ergebnisse werden in den 6–8 gezeigt.
  • Beispiel 11: Induktion der NK-Aktivität
  • Phosphodiester-ODN wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) gekauft. Phosphothioat-ODN wurden von der DNA core facility, University of Iowa, oder von The Midland Certified Reagent Company (Midland TX) erworben. E. coli (Stamm B)-DNA und Kalbsthymus-DNA wurden von Sigma gekauft (St. Louis, MO). Alle DNA und ODN wurden durch Extraktion mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1) und/oder Ethanolfällung gereinigt. Die Konzentration von LPS in ODN war geringer als 12,5 ng/mg und E. coli- und Kalbsthymus-DNA enthielten weniger als 2,5 ng LPS/mg DNA, wie durch den Limulus-Test bestimmt wurde.
  • Virusfreie, 4–6 Wochen alte DBA/2-, C57BL/6 (B6)- und kongenital thymuslose BALB/C-Mäuse wurden per Vertrag durch the Veterans Affairs from the National Cancer Institute (Bethesda, MD) erhalten. C57BL/6-SCID-Mäuse wurden in der SPF barrier facility der Tierställe der University of Iowa gezüchtet.
  • Menschliche periphäre mononukleäre Blutleukozyten (PBMC) wurden wie früher beschrieben (Ballas, Z.K. et al., (1990) J. Allergy Clin. Immunol. 85:453; Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1990) J. Immunol. 145:1039; Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1993) J. Immunol. 150:17) erhalten. Humane oder murine Zellen wurden bei einer Konzentration von 5 × 106/Napf 24 Std. lang bei 37 °C in einer angefeuchteten 5% CO2-Atmosphäre in Platten mit 24 Näpfen (Ballas, Z.K. et al., (1990) J. Allergy Clin. Immunol. 85:453; Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1990) J. Immunol. 145:1039; und Ballas, Z.K. und W. Rasmussen (1993) J. Immunol. 150:17) inkubiert, entweder mit Medium alleine oder mit CpG- oder Nicht-CpG-ODN bei den angezeigten Konzentrationen oder mit E. coli oder Kalbsthyms (50 μg/ml). Alle Kulturen wurden nach 18 Std. geerntet, und die Zellen wurden in einem Standard 4 Std. 51Cr-Freisetzungstest wie früher beschrieben als Effektoren gegen K562 (menschlich) oder YAC-1 (Maus)-Zielzellen benutzt. Bei der Berechnung der lytischen Einheiten (LU) wurde 1 LU als die Zahl von Zellen definiert, die benötigt wird, um 30% spezifische Lyse zu bewirken. Wo angegeben wurden neutralisierende Antikörper gegen IFN-β (Lee Biomolecular, San Diego, CA) oder IL-12 (C15.1, C15.6, C17.8 und C17.15; zur Verfügung gestellt von Dr. Giorgio Trinchieri, The Wistar Institute, Philadelphia, PA) oder ihre Isotypen-Kontrollen zu Beginn der Kulturen mit einer Konzentration von 10 μg/ml hinzugefügt. Bei der anti-IL-12-Zugabe wurden jeweils 10 μg von jeder der 4 MAB (oder Isotypenkontrollen) gleichzeitig hinzugefügt. Die Konzentration des verwendeten rekombinanten menschlichen IL-2 betrug 100 U/ml.
  • Beispiel 12: Verhinderung der Entwicklung eines zellulären Entzündungs-Infiltrats und von Eosinophilie in einem Mäusemodell für Asthma
  • 6–8 Wochen alte C56BL/6-Mäuse (von The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) wurden durch intraperitoneale (i.p.) Injektion an den Tagen 0 und 7 mit 5000 Schistosoma mansoni-Eiern immunisiert. Schistosoma mansoni-Eier enthalten ein Antigen (Schistosoma mansoni Ei-Antigen (SEA)), das eine Th2-Immunantwort (z.B. Produktion von IgE-Antikörper) induziert. Die IgE-Antikörper-Produktion ist als eine wichtige Ursache von Asthma bekannt.
  • Die immunisierten Mäuse wurden anschließend mit Oligonukleotiden (30 μg in 200 μl Saline durch i.p.-Injektion) behandelt, die entweder ein unmethyliertes CpG-Motiv (d. h. TCCATGACGTCCTGACGTT; SEQ ID NO. 10) enthielten oder es nicht enthielten (d. h. Kontrolle TCCATGAGCTTCCTGAGTCT; SEQ ID NO. 11). Lösliches SEA (10 μg in 25 μl Saline) wurden an den Tagen 14 und 21 durch intranasale Einträufelung verabreicht. Als Kontrolle wurde Saline benutzt.
  • Die Mäuse wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Exposition der Luftwege geopfert. Eine Spülung der gesamten Lunge wurde durchgeführt, um Entzündungszellen der Luftwege und Lungenbläschen zu ernten. Die Cytokinkonzentrationen wurden in der Spülflüssigkeit durch ELISA gemessen. RNA wurde aus der ganzen Lunge unter Verwendung von CsCl-Gradienten für die Northern Analyse und RT-PCR-Studien isoliert. Die Lungen wurden aufgepumpt und für die histologische Untersuchung mit 4% Paraformaldehyd durchgespült.
  • 9 zeigt, dass viele Entzündungszellen in den Lungen vorhanden sind, wenn Mäuse zunächst eine i.p.-Injektion von den Eiern erhalten und anschließend das Ei-Antigen (offene Kreise) inhalieren. Wenn die Mäuse zunächst jedoch eine Nukleinsäure, die ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, zusammen mit den Eiern erhalten, wird die Zahl der Entzündungszellen in der Lunge durch die nachfolgende Inhalation des Ei-Antigens (offene Dreiecke) nicht erhöht.
  • 10 zeigt, dass die gleichen Ergebnisse erhalten werden, wenn nur Eosinophile, die in der Lungenspülung vorhanden sind, gemessen werden. Eosinophile sind der Typ von Entzündungszellen, der am engsten mit Asthma verbunden ist.
  • 11 zeigt, dass es wenig Wirkung auf das nachfolgende Einströmen von Eosinophilen in die Lungen nach der Inhalation von SEA hat, wenn die Mäuse zur Zeit der ersten Exposition mit den Eiern mit einem Kontroll-Oligo behandelt werden. Dementsprechend entwickeln die Mäuse eine akute Entzündungsreaktion in den Lungen, wenn sie die Eier an den Tagen 14 und 21 inhalieren. Gibt man ihnen jedoch ein CpG-Oligo zusammen mit den Eiern zur Zeit der ersten Exponierung mit dem Antigen an den Tagen 0 und 7, so wird die Zunahme an Eosinophilen fast komplett aufgehoben, wenn die Mäuse das Ei-Antigen am Tage 14 inhalieren.
  • 12 zeigt, dass sehr geringe Dosen des Oligonukleotids (< 10 μg) diesen Schutz verleihen können.
  • 13 zeigt, dass die folgende Entzündungsreaktion mit den Konzentrationen des Th2-Cytokins IL-4 in der Lunge korreliert.
  • 14 zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotides, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, die Cytokin-Reaktion der Lunge tatsächlich zur Produktion von Il-12 umlenken kann, was eine Immunreaktion vom Typ Th1 anzeigt.
  • 15 zeigt, dass die Verabreichung eines Oligonukleotides, das ein unmethyliertes CpG-Motiv enthält, ebenfalls die Cytokin-Reaktion der Lunge zur Produktion von IFN-γ umlenken kann, was eine Immunreaktion vom Typ Th1 anzeigt.
  • Beispiel 13: CpG-Oligonukleotide induzieren die Sekretion von Cytokinen durch menschliche PBMC
  • Humane PBMC wurden durch Standardzentrifugation von Vollblut über Ficoll Hypaque hergestellt. Die Zellen (5 × 105/ml) wurden im Fall von TNF-α 4 Std. lang und im Fall der anderen Cytokine 24 Std. lang in 10 %-igem autologen Serum in Mikrotiterplatten mit 96 Näpfen mit CpG- oder Kontroll-Oligodesoxynukleotiden (24 μg/ml bei Phosphodiesteroligonukleotiden; 6 μg/ml bei Nuklease-resistenten Phosphothioatoligonukleotiden) inkubiert, bevor der Überstand gewonnen und getestet wurde, wobei die Bestimmung mittels ELISA unter Verwendung von Quantikin-Kits oder Reagenzien von R&D Systems (pg/ml) oder Cytokin-ELISA-Kits von Biosource (für den IL- 12-Test) erfolgte. Die Tests wurden nach Anweisung des Herstellers durchgeführt. Die Daten sind in Tabelle 6 als die Cytokin-Konzentration gezeigt, die über die in Näpfen ohne zugefügte Oligodesoxynukleotide gemessene Konzentration hinausgeht.

Claims (32)

  1. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Asthma, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  2. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die orale Verabreichung für die Behandlung oder Verhinderung von Asthma.
  3. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Allergie, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid nicht in Verbindung mit einem verabreichten Allergen verabreicht wird.
  4. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die orale Verabreichung für die Behandlung oder Verhinderung von Allergie.
  5. Verwendung eines immunstimulierenden Oligonucleotids, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung von Ekzem, allergischer Rhinitis, Nasenkatarrh, Heuschnupfen, Nesselausschlag oder Nahrungsmittelallergie.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid eine Sequenz aufweist umfassend ein CpG-Motiv, das durch die Formel: 5'N1X1CGX2N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nucleotid aufeinanderfolgende CpG trennt; X1 Adenin, Guanin oder Thymin ist; X2 Cytosin oder Thymin ist; N irgendein Nucleotid ist und N1 und N2 ca. 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten und das Oligonucleotid ca. 8–30 Basen lang ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid ein CpG-Motiv umfasst, das durch die Formel: 5'N1X1X2CGX3X4N23' dargestellt ist, wobei mindestens ein Nucleotid aufeinanderfolgende CpG trennt; X1X2 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA, ApT und ApA; X3X4 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT oder CpT; N irgendein Nucleotid ist und N1 und N2 ca. 0–26 Basen betragen, unter der Voraussetzung, dass N1 und N2 kein CCGG-Quadmer oder nicht mehr als ein CCG- oder CGG-Trimer enthalten und die Oligonucleotidsequenz ca. 8–30 Basen lang ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei X1X2 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus GpT, GpG, GpA und ApA und X3X4 aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus TpT, CpT und GpT.
  9. Verwendung nach Anspruch 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid Folgendes ist: i. TCCATGTCGCTCCTGATGCT; ii. TCCATGTCGTTCCTGATGCT; oder iii. TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT.
  10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid TCCATGACGTTCCTGACGTT ist.
  11. Verwendung nach Anspruch 6, wenn das Medikament für die Behandlung von Asthma bestimmt ist, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid: (a) GTCG(T/C)T oder TGACGTT; (b) TGTCG(T/C)T; (c) TCCATGTCGTTCCTGTCGTT; (d) TCCTGACGTTCCTGACGTT ist.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, im Bereich von 8–30 Basen lang ist.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8 und 12, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, ein TC oder TG am 5'-ende aufweist.
  14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–8, 12 und 13, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, mindestens zwei aufeinanderfolgende CpG enthält, die durch mindestens ein Thymin getrennt sind.
  15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, einstrangig ist.
  16. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, kein palindromisches CpG-Motiv enthält.
  17. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, kein modifiziertes Phosphatrückgrat umfasst.
  18. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, ein Phosphodiesteroligonucleotid ist.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–16, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, eine Phosphatrückgratmodifikation enthält.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Phosphatrückgratmodifikation an den ersten beiden Nucleotiden des 5'-Endes der Nucleinsäure auftritt.
  21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, wobei die Phosphatrückgratmodifikation an den letzten fünf Nucleotiden des 3'-Endes der Nucleinsäure auftritt.
  22. Verwendung nach einem der Ansprüche 19–21, wobei die Phosphatrückgratmodifikation eine Phosphorthionat modifizierte Verknüpfung ist.
  23. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die zentralen Verknüpfungen in dem immunstimulierenden Oligonucleotid Phosphodiesterverknüpfungen sind und die beiden 5'- und die fünf 3'-Verknüpfungen Phosphorthionat modifizierte Verknüpfungen sind.
  24. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament für einen Menschen bestimmt ist.
  25. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–23, wobei das Medikament für einen Hund, eine Katze, ein Pferd, eine Kuh, ein Schaf, eine Ziege, ein Huhn, einen Affen, eine Ratte oder Mause bestimmt ist.
  26. Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 3 und 5–23, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, oral, transdermal oder durch subkutane, intravenöse, parenterale, intraperitoneale oder intrathekale Einspritzung verabreicht wird.
  27. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, mit einem Sterol, kationischen Lipid, Virosom oder einem Liposom assoziiert ist, um einen Oligonucleotidabgabekomplex zu bilden.
  28. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
  29. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament im Wesentlichen aus einem immunstimulierenden Oligonucleotid besteht, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält.
  30. Verwendung nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, ein Ribonucleotid oder eine Desoxyribonucleotid ist.
  31. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, synthetisch ist.
  32. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das immunstimulierende Oligonucleotid, das mindestens ein unmethyliertes CpG-Dinucleotid enthält, stabilisiert ist.
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Families Citing this family (834)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL105325A (en) * 1992-04-16 1996-11-14 Minnesota Mining & Mfg Immunogen/vaccine adjuvant composition
US6498147B2 (en) * 1992-05-22 2002-12-24 The Scripps Research Institute Suppression of nuclear factor-κb dependent processes using oligonucleotides
CA2110946A1 (en) * 1992-12-09 1994-06-10 Elazar Rabbani Induction of immunocompatibility by nucleic acid
US20030109469A1 (en) * 1993-08-26 2003-06-12 Carson Dennis A. Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen
US5849719A (en) * 1993-08-26 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Method for treating allergic lung disease
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7422902B1 (en) * 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) * 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US6825174B2 (en) * 1995-06-07 2004-11-30 East Carolina University Composition, formulations & method for prevention & treatment of diseases and conditions associated with bronchoconstriction, allergy(ies) & inflammation
US7034007B1 (en) * 1995-06-07 2006-04-25 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide, compositions, kit & method for treatment of airway disorders associated with bronchoconstriction, lung inflammation, allergy(ies) & surfactant depletion
DK0909323T3 (da) 1996-01-04 2007-05-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Helicobacter pylori-bakterioferritin
US20030078223A1 (en) * 1996-01-30 2003-04-24 Eyal Raz Compositions and methods for modulating an immune response
EP0879284B1 (de) * 1996-01-30 2009-07-29 The Regents of The University of California Expressionsvektoren, die eine antigen-spezifische immunantwort induzieren, und methoden für ihre verwendung.
US7812149B2 (en) 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
WO2005121371A2 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
US20050119470A1 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040171031A1 (en) * 1996-06-06 2004-09-02 Baker Brenda F. Sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US9096636B2 (en) 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
EP0930893B1 (de) 1996-10-11 2005-04-13 The Regents of The University of California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
JP4391592B2 (ja) 1996-10-25 2009-12-24 スリーエム カンパニー Ｔｈ２介在性および関連疾患治療のための免疫応答修飾化合物
EP0855184A1 (de) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmazeutisches Präparat das ein Polynukleotid und ein Antigen enthält, insbesondere zur Impfung
US6884435B1 (en) * 1997-01-30 2005-04-26 Chiron Corporation Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof
PT991403E (pt) * 1997-01-30 2003-08-29 Chiron Corp Uso de microparticulas com antigenio adsorvido para estimular respostas imunes
JP2001513776A (ja) * 1997-02-28 2001-09-04 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
DE69841122D1 (de) * 1997-03-10 2009-10-15 Coley Pharm Gmbh Verwendung von nicht-methyliertem CpG Dinukleotid in Kombination mit Aluminium als Adjuvantien
US6426334B1 (en) * 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
US20030104044A1 (en) * 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
ATE370740T1 (de) 1997-05-20 2007-09-15 Ottawa Health Research Inst Verfahren zur herstellung von nukleinsäurekonstrukten
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
EP1003850B1 (de) * 1997-06-06 2009-05-27 The Regents of the University of California Inhibitoren von immunstimulatorischen dna sequenz aktivität
EP1374894A3 (de) * 1997-06-06 2004-09-22 Dynavax Technologies Corporation Immunstimulierende Oligonukleotide, Zusammensetzungen und Verwendungen davon
WO1999001154A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
CA2302805A1 (en) * 1997-09-05 1999-03-11 The Regents Of The University Of California Use of immunostimulatory oligonucleotides for preventing or reducing antigen-stimulated, granulocyte-mediated inflammation
AU2003203948B2 (en) * 1997-09-05 2005-12-22 The Regents Of The University Of California Use of immunostimulatory oligonucleotides for preventing or reducing antigen-stimulated, granulocyte-mediated inflammation
AU760549B2 (en) * 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
JP2002513763A (ja) * 1998-05-06 2002-05-14 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション Ｃｐｇオリゴヌクレオチドを使用して寄生生物感染および関連する疾患を予防および処置するための方法
WO1999058118A2 (en) * 1998-05-14 1999-11-18 Cpg Immunopharmaceuticals Gmbh METHODS FOR REGULATING HEMATOPOIESIS USING CpG-OLIGONUCLEOTIDES
WO1999059578A1 (en) 1998-05-19 1999-11-25 Research Development Foundation Triterpene compositions and methods for use thereof
ES2628744T3 (es) * 1998-05-22 2017-08-03 Ottawa Hospital Research Institute Métodos y productos para inducir inmunidad en mucosas
KR19990086271A (ko) * 1998-05-27 1999-12-15 손경식 면역세포의 신규한 엔도뉴클레아제 및 이를 사용한 면역보조제
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
US6693086B1 (en) * 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US20030022854A1 (en) * 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US20040247662A1 (en) * 1998-06-25 2004-12-09 Dow Steven W. Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
EP1100807A1 (de) * 1998-07-27 2001-05-23 University Of Iowa Research Foundation Stereoisomere von cpg oligonukleotiden und verwandte verfahren
DK1104306T3 (da) 1998-08-10 2006-05-22 Antigenics Inc Præparater af CpG- og saponinadjuvanser og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CA2343052A1 (en) * 1998-09-18 2000-03-30 Dynavax Technologies Corporation Methods of treating ige-associated disorders and compositions for use therein
WO2000021556A1 (en) * 1998-10-09 2000-04-20 Dynavax Technologies Corporation Anti hiv compositions comprising immunostimulatory polynucleotides and hiv antigens
US6867289B1 (en) * 1998-10-26 2005-03-15 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Thio-modified aptamer synthetic methods and compositions
JP2002532547A (ja) * 1998-12-22 2002-10-02 パナシーア ファーマスーティカルズ エルエルシー 皮膚の病変の治療
US6558951B1 (en) * 1999-02-11 2003-05-06 3M Innovative Properties Company Maturation of dendritic cells with immune response modifying compounds
EP2204186B1 (de) * 1999-02-17 2016-04-06 CSL Limited Immunogene Komplexe und damit zusammenhängende Verfahren
US8206749B1 (en) 1999-02-26 2012-06-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
ATE279943T1 (de) * 1999-02-26 2004-11-15 Chiron Srl Verbesserung der bakterizidaktivität von neisseria antigenen mit cg enthaltende oligonukleotiden
GB2348132B (en) * 1999-03-02 2004-08-04 Nedaa Abdul-Ghani Nasif Asthma/allergy therapy that targets t-lymphocytes and/or eosinophils
FR2790955B1 (fr) 1999-03-19 2003-01-17 Assist Publ Hopitaux De Paris Utilisation d'oligonucleotides stabilises comme principe actif antitumoral
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
EP1176966B1 (de) 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynukleotide und deren verwendung zur induktion einer immunreaktion
US6562801B1 (en) 1999-04-15 2003-05-13 Board Of Regents, The University Of Texas System PpGpp and pppGpp as immunomodulatory agents
GB9908885D0 (en) * 1999-04-19 1999-06-16 Smithkline Beecham Biolog Vccine
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
CZ303515B6 (cs) 1999-04-19 2012-11-07 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Adjuvantní prostredek
AU762857B2 (en) * 1999-04-20 2003-07-10 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccine
US20050002958A1 (en) * 1999-06-29 2005-01-06 Smithkline Beecham Biologicals Sa Vaccines
ES2250151T3 (es) * 1999-06-29 2006-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Uso de cpg como adyuvante de vacuna contra vih.
US6514948B1 (en) 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
FR2795963A1 (fr) * 1999-07-08 2001-01-12 Pasteur Merieux Serums Vacc Polynucleotide immunostimulant
DE19935756A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-08 Mologen Forschungs Entwicklung Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation
US20050226890A1 (en) * 1999-08-12 2005-10-13 Cohen David I Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same
MXPA02001610A (es) * 1999-08-13 2003-07-21 Hybridon Inc Modulacion de estimulacion inmune mediada por oligonucleotido cpg mediante la modificacion posicional de nucleosidos.
EP1204425B1 (de) * 1999-08-19 2009-01-07 Dynavax Technologies Corporation Methode zur modulierung eines immunantwortes mit immunstimulierenden sequencen und zusammensetzungen dafür
US20050249794A1 (en) * 1999-08-27 2005-11-10 Semple Sean C Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
EP1212085B1 (de) * 1999-08-27 2007-10-31 INEX Pharmaceuticals Corp. Zusammensetzungen zur stimulation der zytokin sekretion und zur induktion einer immunantwort
SK287400B6 (sk) * 1999-09-25 2010-08-09 University Of Iowa Research Foundation Prostriedok s obsahom imunostimulačnej nukleovej kyseliny a jeho použitie na stimuláciu imunitnej reakcie
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
ES2265980T5 (es) * 1999-09-27 2010-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Metodos relacionados con interferón inducido por ácidos nucleicos inmunoestimuladores.
EP1688147A1 (de) * 1999-09-27 2006-08-09 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Verfahren mittels durch Nukleinsäuren induziertes immunstimulatorisches Interferon
DK2275552T3 (en) 1999-10-29 2015-12-07 Glaxosmithkline Biolog Sa Neisserial antigenic peptides
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
EP1322655B1 (de) * 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
WO2001095935A1 (en) * 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
WO2001055341A2 (en) * 2000-01-31 2001-08-02 The Regents Of The University Of California Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US20030130217A1 (en) * 2000-02-23 2003-07-10 Eyal Raz Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation
AU2001241751B2 (en) 2000-02-23 2005-09-01 Tel Aviv Sourasky Medical Center Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation
WO2001062092A1 (en) * 2000-02-25 2001-08-30 Thomas Jefferson University Formulations and methods for using the same to elicit an immune response
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US7157437B2 (en) 2000-03-10 2007-01-02 Dynavax Technologies Corporation Methods of ameliorating symptoms of herpes infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20020098199A1 (en) 2000-03-10 2002-07-25 Gary Van Nest Methods of suppressing hepatitis virus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20010046967A1 (en) 2000-03-10 2001-11-29 Gary Van Nest Methods of preventing and treating respiratory viral infection using immunomodulatory polynucleotide
AU2001251407A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-23 The Regents Of The University Of California Synergistic improvements to polynucleotide vaccines
PT1278761E (pt) * 2000-05-01 2005-08-31 Hybridon Inc Modulacao da estimulacao imunitaria mediada por oligonucleotidos de cpg, por modificacao posicional de nucleosidos
US6696064B2 (en) * 2000-06-20 2004-02-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods of protecting vasculature from damage by diphtheria toxin-and pseudomonas toxin-based immunotoxins during therapy
ES2332444T3 (es) * 2000-06-22 2010-02-05 University Of Iowa Research Foundation Combinacion de cpg y anticuerpos dirigidos contra cd19, cd20, cd22 o cd40 para el tratamiento o prevencion de cancer.
EP1315672A4 (de) 2000-06-22 2006-04-26 Rxkinetix Inc Verabreichungsträgerzusammensetzung und verfahren zur verabreichung von antigenen und anderen wirkstoffen
BRPI0111830B8 (pt) * 2000-06-23 2021-05-25 American Cyanamid Co método de produção de partículas semelhantes ao vírus da influenza (vlps), vlps da influenza, vlps quiméricas, composições imunogênica e farmacêutica, e, usos de vlps da influenza e de vlps quiméricas
WO2002002172A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Univ Jefferson Dna palindrome - oligoguanylic acid compositions and uses thereof
KR100917101B1 (ko) * 2000-08-04 2009-09-15 도요 보세키 가부시키가이샤 플렉시블 금속적층체 및 그 제조방법
WO2005090392A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Inist Inc. Tat-based tolerogen compositions and methods of making and using same
CA2420499A1 (en) * 2000-08-25 2002-02-28 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of treatment or prevention of autoimmune diseases with cpg-containing polynucleotide
WO2002022809A2 (en) 2000-09-15 2002-03-21 Coley Pharmaceutical Gmbh PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST
EP1322656B1 (de) * 2000-09-26 2008-01-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation der immunostimulatorischen aktivität von immunostimulierenden oligonukleotidanaloga durch positionelle chemische veränderungen
CA2881568C (en) 2000-10-27 2019-09-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b
ATE398175T1 (de) * 2000-12-08 2008-07-15 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
US6677347B2 (en) * 2000-12-08 2004-01-13 3M Innovative Properties Company Sulfonamido ether substituted imidazoquinolines
JP2008531580A (ja) * 2000-12-08 2008-08-14 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 免疫応答修飾因子の標的化送達のための組成物および方法
KR100881923B1 (ko) * 2000-12-27 2009-02-04 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 그것의 사용 방법
CN1496267A (zh) * 2001-01-12 2004-05-12 ������ҩ��ʽ���� 微生物感染防御剂
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
WO2002060476A2 (de) * 2001-01-31 2002-08-08 Mologen Forschungs-, Entwicklungs- Und Vertriebs Gmbh Tumorvakzine
US20030050268A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US20070128229A1 (en) * 2002-04-12 2007-06-07 Wyeth Surface proteins of Streptococcus pyogenes
EP1421098A4 (de) * 2001-04-13 2006-03-15 Wyeth Corp Oberflächenproteine von streptococcus pyogenes
EP2258842A1 (de) 2001-04-16 2010-12-08 Wyeth Holdings Corporation Polypeptidantigene codierende offene Leseraster aus Streptococcus Pneumoniae und Verwendungen davon
US7034140B2 (en) * 2001-04-24 2006-04-25 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes involved in isoprenoid compound production
AU2002320762B2 (en) 2001-05-21 2006-09-21 Intercell Ag Immunostimulatory oligodeoxynucleic molecules
US6818787B2 (en) * 2001-06-11 2004-11-16 Xenoport, Inc. Prodrugs of GABA analogs, compositions and uses thereof
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
CN100334228C (zh) 2001-06-21 2007-08-29 戴纳瓦克斯技术公司 嵌合免疫调制化合物及其使用方法
US7785610B2 (en) * 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
CZ20033515A3 (cs) * 2001-06-29 2005-01-12 Chiron Corporation Kompozice vakcíny HCV E1E2
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
US20030148316A1 (en) * 2001-08-01 2003-08-07 Lipford Grayson B. Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
JP2005518343A (ja) * 2001-08-03 2005-06-23 メダレックス， インク． 新規なｐｇｃ−１イソフォームおよびその使用媒介型免疫治療を向上させるためのその使用
US20030133988A1 (en) * 2001-08-07 2003-07-17 Fearon Karen L. Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
US7354909B2 (en) * 2001-08-14 2008-04-08 The United States Of America As Represented By Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
ATE411054T1 (de) * 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharm Gmbh Kombinations-motif-immunstimulierende oligonukleotide mit verbesserter wirkung
ES2542888T3 (es) 2001-08-24 2015-08-12 Uvic Industry Partnerships Inc. Proaerolisina que contiene secuencias de activación de proteasa y métodos de uso para el tratamiento del cáncer de próstata
CA2458876A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-13 3M Innovative Properties Company Methods of maturing plasmacytoid dendritic cells using immune response modifier molecules
IL160561A0 (en) * 2001-09-07 2004-07-25 Univ Boston Method and composition for treating immune complex associated disorders
CA2492826C (en) * 2001-09-14 2016-12-13 Cytos Biotechnology Ag Encapsulation of unmethylated cpg-containing oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
EP1425040A2 (de) * 2001-09-14 2004-06-09 Cytos Biotechnology AG Steigerung der durch virusähnliche partikel hervorgerufenen immunantwort durch in-vivo aktivierung von antigen-präsentierenden zellen
US7514414B2 (en) 2001-09-24 2009-04-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Suppressors of CpG oligonucleotides and methods of use
US20030119774A1 (en) * 2001-09-25 2003-06-26 Marianna Foldvari Compositions and methods for stimulating an immune response
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
WO2003031573A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
CN100438908C (zh) * 2001-10-06 2008-12-03 梅瑞尔有限公司 CpG制剂及相关方法
DK1455593T3 (da) 2001-10-06 2013-08-26 Merial Ltd Fremgangsmåder og sammensætninger til fremme af vækst og medfødt immunitet hos unge dyr
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
US20030139364A1 (en) * 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003039595A2 (en) * 2001-11-07 2003-05-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
WO2003039592A2 (de) * 2001-11-09 2003-05-15 Medigene Aktiengesellschaft Zelluläre impfstoffe mit adjuvanzien
ATE416771T1 (de) * 2001-11-16 2008-12-15 3M Innovative Properties Co N-ä4-(4-amino-2-ethyl-1h-imidazoä4,5-cüchinolin 1-yl)butylümethanesulfonamide, diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzung und deren verwendung
US7179798B2 (en) * 2001-11-16 2007-02-20 Russell R. Roby Methods and compositions for the treatment of pain and other hormone-allergy-related symptoms using dilute hormone solutions
AU2002358616A1 (en) * 2001-12-07 2003-06-17 Intercell Ag Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
AU2002366710A1 (en) 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
CA2365732A1 (en) * 2001-12-20 2003-06-20 Ibm Canada Limited-Ibm Canada Limitee Testing measurements
US8466116B2 (en) 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
JP5153990B2 (ja) * 2001-12-21 2013-02-27 シーエスエル、リミテッド 免疫反応性試薬およびサポニンを含有する組成物、およびその使用方法
JP2005526497A (ja) * 2002-02-04 2005-09-08 ビオミラ，インコーポレーテッド 免疫刺激性、共有結合性脂質化オリゴヌクレオチド
US8088388B2 (en) * 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
AU2003215316A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
JP2005518433A (ja) * 2002-02-22 2005-06-23 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー Ｕｖｂ−誘導免疫抑制を軽減し治療する方法
US6923958B2 (en) * 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
KR100981471B1 (ko) * 2002-03-15 2010-09-10 더 큐레이터스 오브 더 유니버시티 오브 미주리 효소 활성이 감소된 형별불능 헤모필러스 인플루엔자의ｐ4 변형 단백질
EP1485403A4 (de) * 2002-03-15 2007-08-08 Multicell Immunotherapeutics I Zusammensetzungen und verfahren zur einleitung bzw. verstärkung von antikörper- und haupthistokompatibilität-klasse-i- oder -klasse-ii-beschränkten t-zell-reaktionen unter anwendung von immunmodulierenden, nicht-codierenden rna-motiven
EP2258712A3 (de) * 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Zusammensetzungen und Verfahren zur Einleitung bzw. Verstärkung von Antikörper- und Haupthistokompatibilität-Klasse-I- oder-Klasse-II-beschränkten T-Zell-Reaktionen unter Anwendung von Immunmodulierenden, nicht-codierenden RNA-Motiven
EP1499187B1 (de) 2002-04-04 2015-06-17 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatorische g,u-haltige oligoribonucleotide
US20030224013A1 (en) * 2002-04-19 2003-12-04 Cole Garry T. Methods for protection against Coccidioides spp. infection using Coccidioides spp. urea amidohydrolase (Ure) protein
US20040013649A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-22 Inex Pharmaceuticals Corporation Cancer vaccines and methods of using the same
US20040009944A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
US20040009943A1 (en) * 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Pathogen vaccines and methods for using the same
US9045727B2 (en) 2002-05-17 2015-06-02 Emory University Virus-like particles, methods of preparation, and immunogenic compositions
WO2004042001A2 (en) * 2002-05-17 2004-05-21 Emory University Virus-like particles, methods of preparation, and immonogenic compositions
KR100456681B1 (ko) * 2002-05-22 2004-11-10 주식회사 대웅 박테리아의 염색체 ｄｎａ 파쇄물과 비독성리포폴리사카라이드를 포함하는 면역강화 및 조절 조성물
CA2388049A1 (en) * 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
WO2003103586A2 (en) * 2002-06-05 2003-12-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
CN1662253A (zh) * 2002-06-20 2005-08-31 赛托斯生物技术公司 用作佐剂的包装的病毒样颗粒:制备方法与用途
US7807803B2 (en) * 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
SG167667A1 (en) * 2002-07-03 2011-01-28 Coley Pharm Group Inc Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7605138B2 (en) * 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) * 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
US20060270620A1 (en) * 2002-07-23 2006-11-30 University Of South Florida Method of Enhancing Therapeutic Effect of Nucleic Acids
AU2003254585A1 (en) 2002-07-24 2004-02-16 Intercell Ag Antigens encoded by alternative reading frame from pathogenic viruses
EP1575504A4 (de) 2002-08-01 2009-11-04 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur behandlung von entzündlichen arthropathien mit suppressoren der cpg-oligonucleotide
AU2003299863B2 (en) 2002-08-15 2009-09-24 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory compositions and methods of stimulating an immune response
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US7785608B2 (en) * 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
US7595303B1 (en) * 2002-09-05 2009-09-29 University Of South Florida Genetic adjuvants for immunotherapy
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
CN1694959B (zh) * 2002-09-13 2013-09-18 雷普利瑟公司 非序列互补的抗病毒寡核苷酸
JP2006504687A (ja) 2002-09-13 2006-02-09 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト Ｃ型肝炎ウイルスペプチドの単離方法
US8263091B2 (en) * 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
US7301554B2 (en) * 2002-09-20 2007-11-27 Ricoh Company, Ltd. Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method
AU2003268737A1 (en) * 2002-10-02 2004-04-23 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Novel method of constructing monoclonal antibody
US8043622B2 (en) 2002-10-08 2011-10-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating inflammatory lung disease with suppressors of CpG oligonucleotides
DK2353608T3 (da) 2002-10-11 2020-02-10 Novartis Vaccines And Diagnostics S R L Polypeptid-vacciner til bred beskyttelse mod hypervirulente meningokok-linjer
CA2503457A1 (en) * 2002-10-25 2004-05-06 University Of Connecticut Health Center Apparatus and method for immunotherapy of a cancer through controlled cell lysis
BR0315810A (pt) 2002-10-29 2005-09-13 Coley Pharmaceutical Group Ltd Uso de oligonucleotìdeos cpg no tratamento de infecção por vìrus da hepatite c
CA2504493C (en) * 2002-11-01 2015-12-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of preventing infections from bioterrorism agents with immunostimulatory cpg oligonucleotides
AU2003290598A1 (en) * 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
WO2004046177A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Chiron Srl Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis
US8039443B2 (en) * 2002-11-21 2011-10-18 Archemix Corporation Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
EP2329827A3 (de) * 2002-11-21 2011-07-13 Bayhill Therapeutics, Inc. Verfahren und immunmodulierende Nukleinsäurekomponenten zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten
US10100316B2 (en) * 2002-11-21 2018-10-16 Archemix Llc Aptamers comprising CPG motifs
US8853376B2 (en) 2002-11-21 2014-10-07 Archemix Llc Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US20050124565A1 (en) * 2002-11-21 2005-06-09 Diener John L. Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
WO2004052293A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Hawaii Biotech, Inc. Recombinant vaccine against flavivirus infection
AU2003287316A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-30 3M Innovative Properties Company Assays relating to toll-like receptor activity
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
WO2004053057A2 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 3M Innovative Properties Company Gene expression systems and recombinant cell lines
NZ541027A (en) * 2002-12-23 2008-04-30 Dynavax Tech Corp Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
JP2006516099A (ja) * 2002-12-23 2006-06-22 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法
AU2003299994A1 (en) 2002-12-27 2004-07-29 Chiron Corporation Immunogenic compositions containing phospholpid
WO2004060319A2 (en) * 2002-12-30 2004-07-22 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory combinations
EP2289546A3 (de) 2003-01-30 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Injizierbarer Impfstoff gegen multiple Meningokokken-Serogruppen
US7354907B2 (en) * 2003-02-07 2008-04-08 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
WO2004071459A2 (en) * 2003-02-13 2004-08-26 3M Innovative Properties Company Methods and compositions related to irm compounds and toll-like receptor 8
JP4976848B2 (ja) 2003-02-20 2012-07-18 ユニバーシティー オブ コネティカット ヘルス センター アルファ（２）マクログロブリン−抗原分子複合体を用いる癌および感染性疾患の治療のための方法および組成物
GB2398783A (en) 2003-02-26 2004-09-01 Antonio Lanzavecchia A method for producing immortalised human B memory lymphocytes
JP2006519020A (ja) * 2003-02-27 2006-08-24 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー Ｔｌｒ介在生物活性の選択的調節
WO2004078138A2 (en) 2003-03-04 2004-09-16 3M Innovative Properties Company Prophylactic treatment of uv-induced epidermal neoplasia
CN100439386C (zh) * 2003-03-05 2008-12-03 长春华普生物技术有限公司 增强蛋白类疫苗免疫效果的含CpG单链脱氧寡核苷酸
EP1603476A4 (de) 2003-03-13 2010-01-13 3M Innovative Properties Co Verfahren zur entfernung von tätowierungen
JP4891066B2 (ja) * 2003-03-13 2012-03-07 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 皮膚の質を改善する方法
ATE485056T1 (de) 2003-03-24 2010-11-15 Intercell Ag Verbesserte impfstoffe
US20040192585A1 (en) * 2003-03-25 2004-09-30 3M Innovative Properties Company Treatment for basal cell carcinoma
US20060210588A1 (en) * 2003-03-26 2006-09-21 Cytos Biotechnology Ag Hiv-peptide-carrier-conjugates
WO2004087877A2 (en) * 2003-03-26 2004-10-14 Astral Inc. Selected rna motifs to include cell death and/or apoptosis
AU2004224762B2 (en) 2003-03-26 2009-12-24 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
US7537767B2 (en) 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
CA2521050A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations and related methods of use
WO2004108072A2 (en) * 2003-04-10 2004-12-16 3M Innovative Properties Company Delivery of immune response modifier compounds using metal-containing particulate support materials
US20040265351A1 (en) * 2003-04-10 2004-12-30 Miller Richard L. Methods and compositions for enhancing immune response
NZ543467A (en) 2003-04-10 2008-07-31 Novartis Vaccines & Diagnostic The severe acute respiratory syndrome coronavirus
WO2004094614A2 (en) 2003-04-21 2004-11-04 Archemix Corp. Stabilized aptamers to platelet derived growth factor and their use as oncology therapeutics
US7871984B2 (en) * 2003-04-23 2011-01-18 Yukio Sato Methylated CpG polynucleotide
US20050250106A1 (en) * 2003-04-24 2005-11-10 David Epstein Gene knock-down by intracellular expression of aptamers
CA2523266A1 (en) * 2003-04-25 2004-11-11 Chiron Corporation Compositions comprising cationic microparticles and hcv e1e2 dna and methods of use thereof
US20040214851A1 (en) * 2003-04-28 2004-10-28 3M Innovative Properties Company Compositions and methods for induction of opioid receptors
CA2527756C (en) * 2003-05-15 2014-05-06 Japan Science And Technology Agency Immunostimulating agents
US8080642B2 (en) * 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
CA2528007C (en) 2003-06-02 2012-03-27 Chiron Corporation Immunogenic compositions based on microparticles comprising adsorbed toxoid and a polysaccharide-containing antigen
US7803386B2 (en) 2003-06-05 2010-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Poly-gamma-glutamic conjugates for eliciting immune responses directed against bacilli
MXPA05013658A (es) * 2003-06-11 2006-03-02 Hybridon Inc Oligonucleotidos inmunomoduladores estabilizados.
JP2007524615A (ja) * 2003-06-20 2007-08-30 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 低分子トール様レセプター（ｔｌｒ）アンタゴニスト
JP2009513532A (ja) * 2003-07-10 2009-04-02 サイトス バイオテクノロジー アーゲー パッケージ化ウイルス様粒子
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
AU2004261987A1 (en) * 2003-07-31 2005-02-10 3M Innovative Properties Company Compositions for encapsulation and controlled release
WO2005016273A2 (en) * 2003-08-05 2005-02-24 3M Innovative Properties Company Infection prophylaxis using immune response modifier compounds
WO2005018556A2 (en) * 2003-08-12 2005-03-03 3M Innovative Properties Company Hydroxylamine substituted imidazo-containing compounds
US20060035242A1 (en) 2004-08-13 2006-02-16 Michelitsch Melissa D Prion-specific peptide reagents
US20050065136A1 (en) * 2003-08-13 2005-03-24 Roby Russell R. Methods and compositions for the treatment of infertility using dilute hormone solutions
US8071652B2 (en) * 2003-08-21 2011-12-06 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method of treating irritable bowel syndrome
WO2005020912A2 (en) * 2003-08-25 2005-03-10 3M Innovative Properties Company Delivery of immune response modifier compounds
CA2551075A1 (en) * 2003-08-25 2005-03-03 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory combinations and treatments
RU2006105101A (ru) * 2003-08-27 2007-10-10 3М Инновейтив Пропертиз Компани (US) Арилокси и арилалкиленокси замещенные имидазохинолины
AU2004268665A1 (en) * 2003-09-02 2005-03-10 3M Innovative Properties Company Methods related to the treatment of mucosal associated conditions
AU2004270201A1 (en) * 2003-09-05 2005-03-17 3M Innovative Properties Company Treatment for CD5+ B cell lymphoma
EP1670507A4 (de) 2003-09-12 2007-10-17 Antigenics Inc Vakzine zur behandlung und prävention von herpes simplex-virusinfektion
EP1663316A2 (de) * 2003-09-25 2006-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleinsäure-lipophile konjugate
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
PT1670506E (pt) 2003-10-02 2013-01-28 Novartis Ag Vacinas líquidas para serogrupos meningocócicos múltiplos
US7544697B2 (en) * 2003-10-03 2009-06-09 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pyrazolopyridines and analogs thereof
KR101154101B1 (ko) * 2003-10-03 2012-06-11 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 알콕시 치환된 이미다조퀴놀린
US20090075980A1 (en) * 2003-10-03 2009-03-19 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pyrazolopyridines and Analogs Thereof
WO2005034979A2 (en) * 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
GB0323965D0 (en) * 2003-10-13 2003-11-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic compositions
UA88457C2 (ru) * 2003-10-30 2009-10-26 Коли Фармасьютикал Гмбх Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью
US20050239733A1 (en) * 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050096259A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-05 3M Innovative Properties Company Neutrophil activation by immune response modifier compounds
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
CN1906192A (zh) * 2003-11-14 2007-01-31 3M创新有限公司 羟胺取代的咪唑环化合物
JP2007511527A (ja) 2003-11-14 2007-05-10 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー オキシム置換イミダゾ環化合物
NZ547467A (en) * 2003-11-25 2010-06-25 3M Innovative Properties Co Substituted imidazo ring system and methods
US20050277127A1 (en) * 2003-11-26 2005-12-15 Epitomics, Inc. High-throughput method of DNA immunogen preparation and immunization
US20050287118A1 (en) * 2003-11-26 2005-12-29 Epitomics, Inc. Bacterial plasmid with immunological adjuvant function and uses thereof
EP1689361A4 (de) * 2003-12-02 2009-06-17 3M Innovative Properties Co Therapeutische kombinationen und verfahren mit irm-verbindungen
US20050226878A1 (en) * 2003-12-02 2005-10-13 3M Innovative Properties Company Therapeutic combinations and methods including IRM compounds
US9090673B2 (en) 2003-12-12 2015-07-28 City Of Hope Synthetic conjugate of CpG DNA and T-help/CTL peptide
MXPA06006821A (es) 2003-12-17 2006-08-23 Elan Pharm Inc Conjugados de peptido inmunologenico a??-vehiculo y metodo para su produccion.
EP1701968B1 (de) 2003-12-17 2015-06-03 Wyeth LLC Immunogene peptid-träger-konjugate und verfahren zu deren herstellung
JP4817599B2 (ja) * 2003-12-25 2011-11-16 独立行政法人科学技術振興機構 免疫活性増強剤とこれを用いた免疫活性の増強方法
EP1701955A1 (de) * 2003-12-29 2006-09-20 3M Innovative Properties Company Arylalkenyl- und arylalkinylsubstituierte imidazochinoline
EP1699398A4 (de) * 2003-12-30 2007-10-17 3M Innovative Properties Co Verbesserung der immunantworten
EP1699788A2 (de) * 2003-12-30 2006-09-13 3M Innovative Properties Company Imidazochinolinyl-, imidazopyridinyl- und imidazonaphthyridinylsulfonamide
KR100558851B1 (ko) * 2004-01-08 2006-03-10 학교법인연세대학교 면역조절능력이 증가된 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드변형체
WO2005072290A2 (en) * 2004-01-23 2005-08-11 Joslin Diabetes Center Methods of treating, reducing, or preventing autoimmune conditions
US20050181035A1 (en) * 2004-02-17 2005-08-18 Dow Steven W. Systemic immune activation method using non CpG nucleic acids
AU2005230938A1 (en) * 2004-02-19 2005-10-20 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
WO2005080567A1 (de) * 2004-02-20 2005-09-01 Mologen Ag Substituiertes, nicht-kodierendes nukleinsäuremolekül zur therapeutischen und prophylaktischen immunstimulation in menschen und höheren tieren
US20060193821A1 (en) * 2004-03-05 2006-08-31 Diener John L Aptamers to the human IL-12 cytokine family and their use as autoimmune disease therapeutics
EP1722815A1 (de) 2004-03-09 2006-11-22 Chiron Corporation Influenza-virus-vakzine
US8569474B2 (en) 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US7927580B2 (en) * 2004-03-16 2011-04-19 Nanirx, Inc. Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use
EP1734975B1 (de) 2004-03-19 2015-06-10 Herbs Spring, LLC Pflanzliche therapie zur behandlung von nahrungsmittelallergien
US8697873B2 (en) * 2004-03-24 2014-04-15 3M Innovative Properties Company Amide substituted imidazopyridines, imidazoquinolines, and imidazonaphthyridines
TWI235440B (en) * 2004-03-31 2005-07-01 Advanced Semiconductor Eng Method for making leadless semiconductor package
WO2005111057A2 (en) * 2004-04-02 2005-11-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses
US20050260755A1 (en) * 2004-04-06 2005-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sequential delivery of oligomeric compounds
WO2005105107A2 (en) * 2004-04-21 2005-11-10 Roby Russell R Hormone treatment of multiple sclerosis
WO2005105106A2 (en) * 2004-04-21 2005-11-10 Roby Russell R Hormone treatment of macular degeneration
US7579450B2 (en) * 2004-04-26 2009-08-25 Archemix Corp. Nucleic acid ligands specific to immunoglobulin E and their use as atopic disease therapeutics
EP1755665A4 (de) * 2004-04-28 2010-03-03 3M Innovative Properties Co Zusammensetzungen und verfahren für mukosale impfungen
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
EP1740217B1 (de) 2004-04-30 2011-06-15 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Meningokokken-konjugat-impfung
US8895521B2 (en) * 2004-05-06 2014-11-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for the treatment of uveitis
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
CN1296378C (zh) * 2004-05-17 2007-01-24 中国人民解放军第三军医大学 高免疫活性 CpG－S ODN 和拮抗 CpG－S ODN 作用的 CpG－N ODN 的基因序列及其应用
EP1766094A4 (de) 2004-05-18 2009-11-25 Vical Inc Grippevirusimpfstoffzusammensetzung und verwendungsverfahren
CN1953991A (zh) 2004-05-21 2007-04-25 惠氏公司 变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白
JP4896021B2 (ja) 2004-05-21 2012-03-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 呼吸器系病原体ワクチンのためのアルファウイルスベクター
US20050267145A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-01 Merrill Bryon A Treatment for lung cancer
AU2005294805B2 (en) 2004-05-28 2012-02-16 Oryxe A mixture for transdermal delivery of low and high molecular weight compounds
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
WO2006080946A2 (en) * 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
US8017779B2 (en) * 2004-06-15 2011-09-13 3M Innovative Properties Company Nitrogen containing heterocyclyl substituted imidazoquinolines and imidazonaphthyridines
TW200613554A (en) 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
US7897609B2 (en) * 2004-06-18 2011-03-01 3M Innovative Properties Company Aryl substituted imidazonaphthyridines
US7915281B2 (en) * 2004-06-18 2011-03-29 3M Innovative Properties Company Isoxazole, dihydroisoxazole, and oxadiazole substituted imidazo ring compounds and method
WO2006009826A1 (en) * 2004-06-18 2006-01-26 3M Innovative Properties Company Aryloxy and arylalkyleneoxy substituted thiazoloquinolines and thiazolonaphthyridines
WO2006009832A1 (en) * 2004-06-18 2006-01-26 3M Innovative Properties Company Substituted imidazo ring systems and methods
US7482158B2 (en) * 2004-07-01 2009-01-27 Mathison Brian H Composite polynucleic acid therapeutics
EP2484374A1 (de) 2004-07-18 2012-08-08 CSL Limited Immunstimulierender Komplex und Oligonucleotidformulierungen zur Induzierung verbesserter Interferon-Gamma-Antworten
US20060025390A1 (en) * 2004-07-28 2006-02-02 Roby Russell R Treatment of hormone allergy and related symptoms and disorders
JP2008508320A (ja) 2004-07-29 2008-03-21 カイロン コーポレイション Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅのようなグラム陽性細菌に対する免疫原性組成物
EP2412728B1 (de) 2004-08-03 2015-01-07 Innate Pharma Therapeutische Zusammensetzungen Targeting von 4IG-B7-H3 exprimierenden Tumoren
US20060045886A1 (en) * 2004-08-27 2006-03-02 Kedl Ross M HIV immunostimulatory compositions
US20090270443A1 (en) * 2004-09-02 2009-10-29 Doris Stoermer 1-amino imidazo-containing compounds and methods
US7884086B2 (en) * 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
EP1791858B1 (de) 2004-09-24 2010-04-21 Intercell AG Verändertes vp-1capsidprotein von parvovirus b19
JP2008000001A (ja) * 2004-09-30 2008-01-10 Osaka Univ 免疫刺激オリゴヌクレオチドおよびその医薬用途
KR101230187B1 (ko) 2004-10-06 2013-02-07 메디뮨 엘엘씨 냉장 온도 안정성 인플루엔자 백신 조성물
WO2006042254A2 (en) * 2004-10-08 2006-04-20 3M Innovative Properties Company Adjuvant for dna vaccines
US8846051B2 (en) 2004-10-08 2014-09-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Modulation of replicative fitness by deoptimization of synonymous codons
MY159370A (en) * 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
US8445000B2 (en) 2004-10-21 2013-05-21 Wyeth Llc Immunogenic compositions of Staphylococcus epidermidis polypeptide antigens
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
EP2436391A3 (de) 2004-11-02 2012-07-04 Archemix LLC Stabilisierte Aptamere für einen aus Plättchen gewonnenen Wachstumsfaktor und ihre Verwendung als Krebstherapiemittel
WO2006065549A2 (en) 2004-12-03 2006-06-22 Medical University Of Ohio Attenuated vaccine useful for immunizations against coccidioides spp. infections
EP1819364A4 (de) * 2004-12-08 2010-12-29 3M Innovative Properties Co Immunmodulatorische zusammensetzungen, kombinationen und verfahren
US9809824B2 (en) * 2004-12-13 2017-11-07 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services CpG oligonucleotide prodrugs, compositions thereof and associated therapeutic methods
US8197817B2 (en) 2004-12-17 2012-06-12 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Regulation of mink in thymocytes and T lymphocytes
EP2351577A1 (de) * 2004-12-29 2011-08-03 Mannkind Corporation Verfahren zum Auslösen, Beibehalten und Manipulieren von Immunantworten durch gezielte Verabreichung von Modifikationsmitteln der biologischen Reaktion in lymphatische Organe
JP5543068B2 (ja) * 2004-12-30 2014-07-09 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー キラル縮合［１，２］イミダゾ［４，５−ｃ］環状化合物
EP1830876B1 (de) 2004-12-30 2015-04-08 Meda AB Verwendung von imquimod für die behandlung von hautmetastasen stammend aus einem brustkrebs
AU2005326708C1 (en) 2004-12-30 2012-08-30 3M Innovative Properties Company Substituted chiral fused [1,2]imidazo[4,5-c] ring compounds
JP4993750B2 (ja) 2005-01-27 2012-08-08 チルドレンズ ホスピタル アンド リサーチ センター アット オークランド 髄膜炎菌に起因する疾患に対する広域防御のための、ｇｎａ１８７０を基にした小胞ワクチン
WO2006080596A1 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Hyung-Joo Kwon Oligonucleotides derived from mycobacterium for stimulating immune function, treating immune-related diseases, atopic dermatitis and/or protecting normal immune cell
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
WO2006084251A2 (en) 2005-02-04 2006-08-10 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Aqueous gel formulations containing immune reponse modifiers
US7968563B2 (en) 2005-02-11 2011-06-28 3M Innovative Properties Company Oxime and hydroxylamine substituted imidazo[4,5-c] ring compounds and methods
AU2006216844B2 (en) 2005-02-18 2012-11-08 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Immunogens from uropathogenic escherichia coli
EP1858920B1 (de) 2005-02-18 2016-02-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Proteine und nukleinsäuren von meningitis-/sepsis-assoziierten escherichia coli
CA2598992A1 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
WO2006096497A2 (en) * 2005-03-04 2006-09-14 Dynavax Technologies Corporation Vaccines comprising oligonucleotides having immunostimulatory sequences (iss) wherein the iss are conjugated to antigens and stabilized by buffer conditions and further excipients
US8101345B1 (en) 2005-03-25 2012-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Proinflammatory nucleic acids
EP1863814A1 (de) 2005-04-01 2007-12-12 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 1-substitutierte pyrazolo-(3,4-c)-ringverbindungen als cytokinbiosynthese-modulatoren für die behandlung viraler infektionen und neoplastischer erkrankungen
WO2006107853A2 (en) 2005-04-01 2006-10-12 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pyrazolopyridine-1,4-diamines and analogs thereof
WO2006110655A2 (en) 2005-04-08 2006-10-19 Chimerix, Inc. Compounds, compositions and methods for the treatment of poxvirus infections
CN102716480B (zh) 2005-04-08 2023-03-21 惠氏有限责任公司 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物
US7709001B2 (en) 2005-04-08 2010-05-04 Wyeth Llc Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate composition
KR20080008350A (ko) * 2005-04-08 2008-01-23 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 감염성 질환에 의해 악화된 천식의 치료 방법
WO2006110656A2 (en) * 2005-04-08 2006-10-19 Chimerix, Inc. Compounds, compositions and methods for the treatment of viral infections and other medical disorders
CA2604683C (en) 2005-04-12 2019-04-30 Duke University Method of inducing neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus
EP2329843A3 (de) 2005-04-18 2011-09-14 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Expression des Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigens zur Impfstoffherstellung
AU2006241166A1 (en) * 2005-04-25 2006-11-02 3M Innovative Properties Company Immunostimulatory compositions
US20090075342A1 (en) * 2005-04-26 2009-03-19 Sharon Cload Metabolic profile directed aptamer medicinal chemistry
US20060241076A1 (en) * 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
DE602006020867D1 (de) 2005-06-14 2011-05-05 Protox Therapeutics Inc Verfahren zur behandlung oder prävention gutartiger prostatahyperplasie unter verwendung modifizierter porenbildender proteine
CN101495504A (zh) 2005-06-30 2009-07-29 阿切埃米克斯有限公司 用于生产全2’-修饰的核酸转录产物的材料和方法
US8101385B2 (en) 2005-06-30 2012-01-24 Archemix Corp. Materials and methods for the generation of transcripts comprising modified nucleotides
PT2179737E (pt) 2005-07-01 2013-12-05 Index Pharmaceuticals Ab Método para modular a capacidade de resposta aos esteróides
DK2380584T3 (da) 2005-07-01 2014-01-20 Index Pharmaceuticals Ab Immunstimulerende fremgangsmåde
EA200800268A1 (ru) * 2005-07-07 2008-06-30 Коли Фармасьютикал Груп, Инк. КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ АНТИТЕЛОМ ПРОТИВ CTLA-4 И СОДЕРЖАЩИМ CpG-МОТИВ СИНТЕТИЧЕСКИМ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ
US20080206276A1 (en) * 2005-07-08 2008-08-28 Michael Otto Targeting Poly-Gamma-Glutamic Acid to Treat Staphylococcus Epidermidis and Related Infections
CA2615626A1 (en) 2005-07-18 2007-01-25 Novartis Ag Small animal model for hcv replication
WO2007012285A1 (fr) * 2005-07-28 2007-02-01 Changchun Huapu Biotechnology Co., Ltd. Desoxynucleosides monocatenaires resistant aux infections virales
WO2007088423A2 (en) * 2005-09-16 2007-08-09 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
BRPI0616069A2 (pt) * 2005-09-16 2011-06-07 Coley Pharm Gmbh modulação de propriedades imunomoduladoras de ácido ribonucléico interferente pequeno (sirna) através de modificação de nucleotìdeo
US20070081972A1 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 The University Of Iowa Research Foundation Polymer-based delivery system for immunotherapy of cancer
CN101355960A (zh) 2005-10-18 2009-01-28 诺华疫苗和诊断公司 使用α病毒复制子颗粒进行粘膜和全身免疫
WO2007050034A1 (en) 2005-10-28 2007-05-03 Index Pharmaceuticals Ab Composition and method for the prevention, treatment and/or alleviation of an inflammatory disease
EP1951299B1 (de) 2005-11-04 2012-01-04 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Grippeimpfstoffe mit kombinationen aus teilchenförmigen adjuvantien und immunverstärkern
US20090304742A1 (en) 2005-11-04 2009-12-10 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Influenza vaccines with reduced amount of emulsion adjuvant
JP2009514839A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル サイトカイン誘導剤を含むアジュバントインフルエンザワクチン
JP2009514838A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル 細胞培養物において増殖されたインフルエンザウイルスから調製された非ビリオン抗原を含むアジュバントワクチン
CN102864152B (zh) * 2005-11-07 2015-11-18 艾德拉药物股份有限公司 包含经修饰的免疫刺激性二核苷酸的基于寡核苷酸的化合物之免疫刺激特性
JP5215865B2 (ja) 2005-11-22 2013-06-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
BRPI0618857B1 (pt) 2005-11-25 2022-07-19 Zoetis Belgium S.A Oligonucleotídeo de rna isolado, e método para regular negativamente células reguladoras cd4+ imunossupressoras
AU2006325225B2 (en) 2005-12-14 2013-07-04 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
KR20110110853A (ko) 2006-01-27 2011-10-07 노파르티스 파르마 아게 적혈구응집소 및 기질 단백질을 함유한 인플루엔자 백신
ES2526879T3 (es) 2006-02-15 2015-01-16 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Composiciones y procedimientos para formulaciones de oligonucleótidos
EP3085373A1 (de) 2006-02-22 2016-10-26 3M Innovative Properties Company Konjugate zur modifizierung von immunreaktionen
EP2005184A2 (de) 2006-03-14 2008-12-24 Oregon Health and Science University Verfahren zum nachweis einer infektion mit mycobacterium tuberculosis
US8063063B2 (en) * 2006-03-23 2011-11-22 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
EP2357184B1 (de) 2006-03-23 2015-02-25 Novartis AG Imidazochinoxalinverbindungen als Immunmodulatoren
CA2646349A1 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg Storage of influenza vaccines without refrigeration
WO2007126825A2 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Novartis Ag Combined mucosal and parenteral immunization against hiv
EP2017281A4 (de) 2006-04-14 2012-03-14 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Agonisten am toll-like receptor 9
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
KR101065760B1 (ko) * 2006-05-31 2011-09-19 오사카 유니버시티 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 그 의약 용도
WO2007143582A2 (en) * 2006-06-05 2007-12-13 Baylor College Of Medicine Reversal of the suppressive function of specific t cells via toll-like receptor 8 signaling
WO2008020335A2 (en) 2006-06-09 2008-02-21 Novartis Ag Immunogenic compositions for streptococcus agalactiae
US8541559B2 (en) 2006-06-12 2013-09-24 Cytos Biotechnology Ag Process for producing aggregated oligonucleotides
WO2007147529A2 (en) 2006-06-20 2007-12-27 Transgene S.A. Recombinant viral vaccine
US8153116B2 (en) 2006-07-11 2012-04-10 University Of Connecticut Use of conditional plasmodium strains lacking an essential gene in malaria vaccination
US8128921B2 (en) * 2006-07-11 2012-03-06 University Of Connecticut Use of conditional plasmodium strains lacking nutrient transporters in malaria vaccination
WO2008008432A2 (en) * 2006-07-12 2008-01-17 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Substituted chiral fused( 1,2) imidazo (4,5-c) ring compounds and methods
GB0614460D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Novartis Ag Vaccines
JP2010500399A (ja) 2006-08-16 2010-01-07 ノバルティス アーゲー 尿路病原性大腸菌由来の免疫原
AU2007297178B2 (en) 2006-09-11 2014-07-24 Novartis Ag Making influenza virus vaccines without using eggs
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
DE102006050655A1 (de) * 2006-10-24 2008-04-30 Halmon Beheer B.V. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung allergischer Erkrankungen
EP2104738A2 (de) * 2006-10-26 2009-09-30 Coley Pharmaceuticals GmbH Oligoribonukleotide und ihre verwendung
DK2444807T3 (da) 2006-11-01 2014-08-11 Ventana Med Syst Inc Mono- og dinitropyrazolhaptenkonjugater
WO2008057529A2 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (cetp)
JP5714818B2 (ja) 2006-11-09 2015-05-07 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫刺激性オリゴヌクレオチドを使用する長期疾患修飾
WO2008140571A2 (en) * 2006-11-15 2008-11-20 Functional Genetics, Inc. Methods and compositions for treating influenza
AU2007330494B2 (en) 2006-12-06 2014-03-13 Seqirus UK Limited Vaccines including antigen from four strains of influenza virus
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
US20080149123A1 (en) 2006-12-22 2008-06-26 Mckay William D Particulate material dispensing hairbrush with combination bristles
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
EP2918598B1 (de) 2007-02-28 2019-01-30 The Govt. Of U.S.A. As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Brachyurie-Polypeptide und Verwendungsverfahren
WO2008127651A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Duke University Method of inducing neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus
US8518903B2 (en) 2007-04-19 2013-08-27 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Use of toll-like receptor-9 agonists
EP2377952A1 (de) 2007-04-26 2011-10-19 Ludwig Institute For Cancer Research Verfahren zur Diagnostizierung und Behandlung von Astrozytoma
US20100285041A1 (en) 2007-05-17 2010-11-11 Eugen Uhlmann Class A Oligonucleotides with Immunostimulatory Potency
PL2170353T3 (pl) * 2007-05-18 2015-10-30 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Modyfikowane fosforanami analogi oligonukleotydów wykazujące aktywność immunostymulującą
EP3561513A1 (de) * 2007-05-23 2019-10-30 Ventana Medical Systems, Inc. Polymere träger für immunhistochemie und in-situ-hybridisierung
US20090035360A1 (en) * 2007-05-24 2009-02-05 Dominique Ingrid Lemoine Lyophilised antigen composition
NZ582595A (en) 2007-06-27 2012-07-27 Novartis Ag Low-additive influenza vaccines
GB0713880D0 (en) * 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
US7879812B2 (en) 2007-08-06 2011-02-01 University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides and methods of use therefor
WO2009026465A2 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Dynavax Technologies Corporation Composition and methods of making and using influenza proteins
CA2699513C (en) 2007-09-12 2018-03-13 Novartis Ag Gas57 mutant antigens and gas57 antibodies
RU2010112771A (ru) * 2007-10-09 2011-11-20 Коули Фармасьютикал ГмбХ (DE) Иммуностимулирующие аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированные сахарные группировки
WO2009060440A1 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Mor Research Applications Ltd. Anti-measles cancer immunotherapy
EP2902494A1 (de) 2007-11-09 2015-08-05 The Salk Institute for Biological Studies Verwendung von Tam-Rezeptor-Inhibitoren als Antimikrobielle Mittel
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
WO2009076158A1 (en) 2007-12-07 2009-06-18 Novartis Ag Compositions for inducing immune responses
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
BRPI0821558A2 (pt) * 2007-12-21 2015-11-03 Wyeth Llc virus da estomatite vesicular atenuado geneticamente modificado, ecomposições e métodos de uso dessas
PL2235046T3 (pl) 2007-12-21 2012-12-31 Novartis Ag Zmutowane formy streptolizyny O
JP5562255B2 (ja) * 2008-01-25 2014-07-30 キメリクス，インコーポレイテッド ウイルス感染を治療する方法
HUE025027T2 (en) * 2008-01-31 2016-07-28 Curevac Gmbh (NuGiXmGnNv) nucleic acids and derivatives of the formula as immunostimulants / adjuvants
EP3263591B1 (de) 2008-02-21 2019-03-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Meningokokken-fhbp-polypeptide
AU2009223613B2 (en) 2008-03-10 2014-09-25 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHBP) containing a heterologous B domain and methods of use
EP2268309B1 (de) 2008-03-18 2015-01-21 Novartis AG Verbesserungen der herstellung von grippevirus-impstoff-antigenen
US8815817B2 (en) * 2008-05-15 2014-08-26 Dynavax Technologies Corporation Long term disease modification using immunostimulatory oligonucleotides
EP2278979A4 (de) 2008-05-21 2012-09-26 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur behandlung von pneumokoniose mit oligodesoxynukleotiden
DK2995925T3 (da) 2008-06-05 2022-02-21 Ventana Med Syst Inc Sammensætning til histokemisk processering
CA2728308A1 (en) 2008-06-20 2009-12-23 Wyeth Llc Compositions and methods of use of orf1358 from beta-hemolytic streptococcal strains
DK3056214T3 (da) 2008-06-27 2019-05-13 Zoetis Services Llc Hidtil ukendte adjuvanssammensætninger
TWI351288B (en) * 2008-07-04 2011-11-01 Univ Nat Pingtung Sci & Tech Cpg dna adjuvant in avian vaccines
US20110136897A1 (en) * 2008-08-14 2011-06-09 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Toll-like receptor 9 agonists for the treatment of anxiety-related disorders and inflammatory disorders
WO2010027818A2 (en) 2008-08-25 2010-03-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Conserved hemagglutinin epitope, antibodies to the epitope, and methods of use
KR20110061611A (ko) 2008-09-18 2011-06-09 노파르티스 아게 백신 보조제 조합
AU2009294850B2 (en) 2008-09-22 2015-07-02 Oregon Health & Science University Methods for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection
US9061001B2 (en) * 2008-10-16 2015-06-23 University Of Saskatchewan Combination adjuvant formulation
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
WO2010053986A1 (en) 2008-11-05 2010-05-14 Wyeth Multicomponent immunogenic composition for the prevention of beta-hemolytic streptococcal (bhs) disease
AU2009314091B2 (en) 2008-11-12 2015-05-14 Theraclone Sciences, Inc. Human M2e peptide immunogens
EP2370451B1 (de) 2008-12-02 2016-11-16 Wave Life Sciences Japan, Inc. Verfahren zur synthese von am phosphoratom modifizierten nukleinsäuren
RU2477753C2 (ru) 2008-12-09 2013-03-20 Коули Фармасьютикал Груп, Инк. Иммуностимулирующие олигонуклеотиды
PE20142330A1 (es) 2008-12-09 2015-01-14 Pfizer Vaccines Llc Vacuna de peptido ch3 de ige
US8552165B2 (en) * 2008-12-09 2013-10-08 Heather Davis Immunostimulatory oligonucleotides
US8425922B2 (en) 2009-01-05 2013-04-23 EpitoGenesis, Inc. Adjuvant compositions and methods of use
US20100233270A1 (en) 2009-01-08 2010-09-16 Northwestern University Delivery of Oligonucleotide-Functionalized Nanoparticles
MX2011007456A (es) 2009-01-12 2011-08-03 Novartis Ag Antigenos del dominio de proteina de superficie de union a colageno tipo b (can_b) en vacunas contra bacteria gram positiva.
US8664183B2 (en) 2009-02-27 2014-03-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services SPANX-B polypeptides and their use
CN102438650A (zh) 2009-03-06 2012-05-02 诺华有限公司 衣原体抗原
BRPI1009215B1 (pt) 2009-03-23 2019-10-29 Nanirx Inc composição farmacêutica compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada da proteína trans-ativadora de transcrição (tat) do vírus da imunodeficiência humana (hiv) e uso de um polipeptídeo derivado de tat para tratar câncer
CN104548082A (zh) 2009-03-24 2015-04-29 诺华股份有限公司 为脑膜炎球菌因子h结合蛋白添加佐剂
KR101856462B1 (ko) 2009-03-25 2018-05-10 보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 병원체에 대한 포유동물의 선천성 면역 저항성의 자극을 위한 조성물
EP2413953B1 (de) 2009-04-03 2017-11-08 Agenus Inc. Methoden zur herstellung und verwendung von multichaperon-antigen-komplexen
EP2413951A4 (de) * 2009-04-03 2015-05-20 Univ Duke Formulierung zur herbeiführung einer breit reaktiven neutralisierung von hiv-antikörpern
WO2010119343A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Novartis Ag Compositions for immunising against staphylococcus aureus
EA201101530A1 (ru) * 2009-04-21 2012-03-30 Селекта Байосайенсиз, Инк. ИММУНОНАНОТЕРАПИЯ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ Th1-СМЕЩЕННЫЙ ОТВЕТ
CA2757620C (en) 2009-04-30 2016-04-26 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
EA201890311A1 (ru) 2009-05-27 2018-10-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Полимерные соединения - иммуномодулирующие средства
WO2010146414A1 (en) 2009-06-15 2010-12-23 National University Of Singapore Influenza vaccine, composition, and methods of use
ES2959890T3 (es) 2009-06-22 2024-02-28 Wyeth Llc Composiciones y procedimientos para preparar composiciones inmunogénicas de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8 de Staphylococcus aureus
EP2445522B1 (de) 2009-06-22 2017-08-09 Wyeth LLC Immunogene staphylococcus aureus-antigenzusammensetzungen
SG177564A1 (en) 2009-07-06 2012-02-28 Ontorii Inc Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
HRP20220756T1 (hr) 2009-07-15 2022-09-02 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteinski pripravci rsv f i postupci za izradu istih
MX2012000734A (es) 2009-07-16 2012-01-27 Novartis Ag Inmunogenos destoxificados de escherichia coli.
JP5646620B2 (ja) 2009-07-17 2014-12-24 インダストリー アカデミック コーポレーション ファウンデーション， ハルリム ユニバーシティー リポソームに被包されたオリゴヌクレオチド及びエピトープを含む免疫増強用組成物
WO2011011519A1 (en) 2009-07-21 2011-01-27 Chimerix, Inc. Compounds, compositions and methods for treating ocular conditions
RU2518291C2 (ru) 2009-07-30 2014-06-10 Пфайзер Вэксинс ЭлЭлСи Антигенные tau-пептиды и их применения
US20110033515A1 (en) * 2009-08-04 2011-02-10 Rst Implanted Cell Technology Tissue contacting material
US8598327B2 (en) 2009-08-18 2013-12-03 Baxter International Inc. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
CA2770762A1 (en) * 2009-08-18 2011-02-24 Baxter International Inc. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
KR20120059572A (ko) 2009-08-26 2012-06-08 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. Ｔ－세포 도움을 유도하는 조성물
BR112012004276A2 (pt) 2009-08-27 2017-10-24 Novartis Ag adjuvante compreendendo alumínio, oligonucleotídeo e policátion
JP2013502918A (ja) 2009-08-27 2013-01-31 ノバルティス アーゲー 髄膜炎菌ｆＨＢＰ配列を含むハイブリッドポリペプチド
WO2011026111A1 (en) 2009-08-31 2011-03-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Oral delivery of a vaccine to the large intestine to induce mucosal immunity
JP2013503623A (ja) 2009-09-03 2013-02-04 ファイザー バクシーンズ エルエルシー Ｐｃｓｋ９ワクチン
CN102695523A (zh) 2009-09-10 2012-09-26 诺华有限公司 针对呼吸道疾病的组合疫苗
GB0917003D0 (en) 2009-09-28 2009-11-11 Novartis Vaccines Inst For Global Health Srl Purification of bacterial vesicles
GB0917002D0 (en) 2009-09-28 2009-11-11 Novartis Vaccines Inst For Global Health Srl Improved shigella blebs
US8974799B2 (en) 2009-09-30 2015-03-10 Novartis Ag Conjugation of Staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides
US20130022639A1 (en) 2009-09-30 2013-01-24 Novartis Ag Expression of meningococcal fhbp polypeptides
WO2011041886A1 (en) 2009-10-07 2011-04-14 University Of Victoria Innovation And Development Corporation Vaccines comprising heat-sensitive transgenes
WO2011047340A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine
GB0918392D0 (en) 2009-10-20 2009-12-02 Novartis Ag Diagnostic and therapeutic methods
MX2012004850A (es) 2009-10-27 2012-05-22 Novartis Ag Polipeptidos fhbp meningococicos modificados.
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
CN102713629B (zh) 2009-11-20 2016-02-24 俄勒冈健康科学大学 用于检测结核分枝杆菌感染的方法
CN107412754A (zh) 2009-12-22 2017-12-01 塞尔德克斯医疗公司 疫苗组合物
HUE032860T2 (en) 2010-02-12 2017-11-28 Chimerix Inc A method for treating a virus infection
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
US8685416B2 (en) 2010-03-02 2014-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions and methods for the treatment of cancer
EP2542670A2 (de) 2010-03-05 2013-01-09 President and Fellows of Harvard College Zusammensetzungen aus induzierten dentritischen zellen und ihre verwendung
WO2011112599A2 (en) 2010-03-12 2011-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary. Department Of Health & Human Services Immunogenic pote peptides and methods of use
JP2013522287A (ja) 2010-03-18 2013-06-13 ノバルティス アーゲー 血清群ｂ髄膜炎菌のためのアジュバント添加ワクチン
ES2910199T3 (es) 2010-03-30 2022-05-11 Childrens Hospital & Res Center At Oakland Proteínas de unión al factor H (fHbp) con propiedades alteradas y métodos de uso de las mismas
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
EP2556151A1 (de) 2010-04-07 2013-02-13 Novartis AG Verfahren zur erzeugung von virusähnlichen parvovirus-b19-partikeln
CA2796314A1 (en) 2010-04-13 2011-10-20 Novartis Ag Benzonapthyridine compositions and uses thereof
AU2011248620B2 (en) 2010-04-26 2015-11-26 Chimerix, Inc. Methods of treating retroviral infections and related dosage regimes
ES2788198T3 (es) 2010-05-14 2020-10-20 Univ Oregon Health & Science Vectores de CMVH y CMVRh recombinantes que codifican un antígeno heterólogo aislado del virus de la hepatitis B y usos de los mismos
KR20180099900A (ko) 2010-05-26 2018-09-05 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 애주번트가 결합된 합성 나노담체의 용량 선택
JP2013532008A (ja) 2010-05-28 2013-08-15 テトリス オンライン インコーポレイテッド 対話式ハイブリッド非同期コンピュータ・ゲーム・インフラストラクチャ
BR112012030337B1 (pt) 2010-05-28 2021-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc Vacina compreendendo um ou mais oligonucleotídeo(s) de cpg isolado(s) ou um agonista de tlr e colesterol, e uso da mesma
MY191929A (en) 2010-06-03 2022-07-18 Pharmacyclics Llc The use of inhibitors of bruton's tyrosine kinase (btk)
CN102933229A (zh) 2010-06-04 2013-02-13 惠氏有限责任公司 疫苗制剂
EP2942061A3 (de) 2010-06-07 2016-01-13 Pfizer Vaccines LLC Ige-ch3-peptidimpfstoff
GB201009861D0 (en) 2010-06-11 2010-07-21 Novartis Ag OMV vaccines
AU2011268507B2 (en) 2010-06-25 2014-08-14 Novartis Ag Combinations of meningococcal factor H binding proteins
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
CN103154242B (zh) 2010-07-06 2015-09-30 诺华股份有限公司 诺如病毒衍生的免疫原性组合物和方法
HUE052850T2 (hu) 2010-08-23 2021-05-28 Wyeth Llc Neisseria meningitidis RLP2086 antigéneket tartalmazó stabil készítmények
MY166172A (en) 2010-09-10 2018-06-07 Wyeth Llc Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens
US8883171B2 (en) 2010-09-14 2014-11-11 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for influenza
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
US10668092B2 (en) 2010-09-24 2020-06-02 The John Hopkins University Compositions and methods for treatment of inflammatory disorders
US9072760B2 (en) 2010-09-24 2015-07-07 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education TLR4 inhibitors for the treatment of human infectious and inflammatory disorders
GB201017519D0 (en) 2010-10-15 2010-12-01 Novartis Vaccines Inst For Global Health S R L Vaccines
US9994443B2 (en) 2010-11-05 2018-06-12 Selecta Biosciences, Inc. Modified nicotinic compounds and related methods
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
EP2468866A1 (de) * 2010-12-21 2012-06-27 Index Pharmaceuticals AB Biologisch aktive Oligonukleotide zur Modulation des Immunsystems
US20130295167A1 (en) 2010-12-22 2013-11-07 Bayer Intellectual Property Gmbh Enhanced immune response in bovine species
AU2011346535B2 (en) 2010-12-22 2015-09-24 Wyeth Llc Stable immunogenic compositions of Staphylococcus aureus antigens
WO2012088425A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Gap junction-enhancing agents for treatment of necrotizing enterocolitis and inflammatory bowel disease
GB201021867D0 (en) 2010-12-23 2011-02-02 Mologen Ag Non-coding immunomodulatory DNA construct
WO2012085668A2 (en) 2010-12-24 2012-06-28 Novartis Ag Compounds
EP2471926A3 (de) * 2010-12-30 2012-07-11 Intervet International BV Immunstimulierende Oligodeoxynukleotide
EP4159232A1 (de) 2011-01-26 2023-04-05 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Rsv-immunisierungstherapie
CA2827160A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Baxter Healthcare S.A. Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics
US20140004142A1 (en) 2011-03-02 2014-01-02 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
WO2012141984A1 (en) 2011-04-08 2012-10-18 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
US9452212B2 (en) 2011-04-14 2016-09-27 Dynavax Technologies Corporation Methods and compositions for eliciting an immune response against hepatitis B virus
US20120288515A1 (en) 2011-04-27 2012-11-15 Immune Design Corp. Synthetic long peptide (slp)-based vaccines
HUE034673T2 (en) 2011-05-13 2018-02-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pre-fusion Rsv F antigens
FR2975600B1 (fr) 2011-05-24 2013-07-05 Assist Publ Hopitaux De Paris Agents pour le traitement de tumeurs
CA2834440A1 (en) * 2011-05-26 2012-11-29 Intervet International B.V. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides
WO2012167053A1 (en) 2011-06-01 2012-12-06 Janus Biotherapeutics, Inc. Novel immune system modulators
CN109912602A (zh) 2011-06-01 2019-06-21 贾纳斯生物治疗有限公司 新型免疫系统调节剂
WO2012167088A1 (en) 2011-06-03 2012-12-06 3M Innovative Properties Company Heterobifunctional linkers with polyethylene glycol segments and immune response modifier conjugates made therefrom
AU2012261959B2 (en) 2011-06-03 2015-12-03 Solventum Intellectual Properties Company Hydrazino 1H-imidazoquinolin-4-amines and conjugates made therefrom
CA2838981C (en) 2011-06-17 2020-09-08 University Of Tennessee Research Foundation Group a streptococcus multivalent vaccine
CN103732749B (zh) 2011-06-20 2017-03-29 高等教育联邦系统-匹兹堡大学 计算优化的宽反应性的h1n1流感抗原
ITMI20111182A1 (it) 2011-06-28 2012-12-29 Canio Buonavoglia Vaccino per coronavirus canino
EP3508219A1 (de) 2011-07-06 2019-07-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Selbst-replizierende rna-prime - protein boost impfstoffe
EP3854413A1 (de) 2011-07-06 2021-07-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogene kombinationszusammensetzungen und ihre verwendung
EP2729178A1 (de) 2011-07-08 2014-05-14 Novartis AG Tyrosinverbindungsverfahren
WO2013007703A1 (en) * 2011-07-08 2013-01-17 Universität Zürich CLASS A CpG OLIGONUCLEOTIDES FOR PREVENTION OF VIRAL INFECTION IN CATS
RU2014105311A (ru) 2011-07-19 2015-08-27 Уэйв Лайф Сайенсес Пте. Лтд. Способы синтеза функционализованных нуклеиновых кислот
US20130023736A1 (en) 2011-07-21 2013-01-24 Stanley Dale Harpstead Systems for drug delivery and monitoring
ES2687129T3 (es) 2011-07-25 2018-10-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composiciones y métodos para evaluar la inmunogenicidad funcional de vacunas contra parvovirus
US20130039954A1 (en) 2011-07-29 2013-02-14 Selecta Biosciences, Inc. Control of antibody responses to synthetic nanocarriers
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
WO2013039792A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunogens based on an hiv-1 gp120 v1v2 epitope
EP2755994A2 (de) 2011-09-14 2014-07-23 Novartis AG Impfstoffkombination gegen escherichia coli
TR201909110T4 (tr) 2011-09-14 2019-07-22 Glaxosmithkline Biologicals Sa Sakarit-protein glikokonjugatları yapmaya yönelik yöntemler.
US20140234360A1 (en) 2011-09-30 2014-08-21 The United States of America, as represented by the Secretary, Dept.of Health and Human Services Influenza vaccine
AU2012318694B2 (en) 2011-10-04 2016-12-22 Janus Biotherapeutics, Inc. Novel imidazole quinoline-based immune system modulators
EP3269728B1 (de) 2011-10-20 2020-12-16 The Government of The United States of America as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services E-glycoprotein-polypeptide des dengue-virus mit mutationen zur eliminierung von immundominanten kreuzreaktiven epitopen
JP6170932B2 (ja) 2011-11-07 2017-07-26 ノバルティス アーゲー ｓｐｒ００９６抗原およびｓｐｒ２０２１抗原を含むキャリア分子
MX2014006630A (es) 2011-12-08 2014-07-09 Novartis Ag Vacuna a base toxina clostridium difficile.
EA201491081A1 (ru) 2012-01-16 2016-11-30 Элизабет Маккенна Композиции и способы для лечения заболеваний и расстройств печени
US20140086849A1 (en) 2012-09-21 2014-03-27 Elizabeth McKenna Naturally-Occurring CpG Oligonucleotide Compositions and Therapeutic Applications Thereof
WO2013108272A2 (en) 2012-01-20 2013-07-25 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Blood stage malaria vaccine
MX2014009148A (es) 2012-02-07 2014-09-22 Univ Pittsburgh Antigenos ampliamente reactivos computacionalmente optimizados para virus de influenza h3n2, h2n2 y b.
IN2014DN05695A (de) 2012-02-13 2015-05-15 Univ Pittsburgh
CN104321335A (zh) 2012-02-24 2015-01-28 诺华股份有限公司 菌毛蛋白质和组合物
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
BR112014021658A2 (pt) 2012-03-09 2017-07-11 Pfizer composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
US9421250B2 (en) 2012-03-23 2016-08-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pathogenic phlebovirus isolates and compositions and methods of use
US9597385B2 (en) 2012-04-23 2017-03-21 Allertein Therapeutics, Llc Nanoparticles for treatment of allergy
US10279026B2 (en) 2012-04-26 2019-05-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigens and antigen combinations
CN108671228A (zh) 2012-04-26 2018-10-19 诺华股份有限公司 抗原和抗原组合
CA2871490C (en) 2012-04-27 2022-10-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Use of cpg oligonucleotides co-formulated with an antibiotic to accelerate wound healing
SI2844282T1 (sl) 2012-05-04 2019-08-30 Pfizer Inc. S prostato povezani antigeni in na cepljenju osnovan imunoterapevtski režim zdravljenja
SG10201608675YA (en) 2012-05-22 2016-12-29 Novartis Ag Meningococcus serogroup x conjugate
WO2013177291A1 (en) 2012-05-23 2013-11-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Salmonella typhi ty21a expressing yersinia pestis f1-v fusion protein and uses thereof
WO2013177397A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Multivalent meningococcal conjugates and methods for preparing cojugates
RU2621450C2 (ru) 2012-06-19 2017-06-06 Вольво Ластвагнар Аб Устройство регулирования газового потока, система последующей обработки отработавших газов и движительная установка транпортного средства
US9687542B2 (en) 2012-06-19 2017-06-27 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Rift valley fever virus replicon particles and use thereof
KR102057217B1 (ko) 2012-06-20 2020-01-22 에스케이바이오사이언스 주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US20150140068A1 (en) 2012-07-06 2015-05-21 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
SG11201500243WA (en) 2012-07-13 2015-04-29 Shin Nippon Biomedical Lab Ltd Chiral nucleic acid adjuvant
US9982257B2 (en) 2012-07-13 2018-05-29 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
US20150190499A1 (en) 2012-07-19 2015-07-09 Zoetis Llc Bovine influenza c virus compositions
KR20150032340A (ko) 2012-07-24 2015-03-25 파마시클릭스, 인코포레이티드 브루톤 티로신 키나제(btk)의 억제제에 대한 내성과 관련된 돌연변이
AU2013295770A1 (en) 2012-07-27 2015-01-29 Zoetis Services Llc Tick toxin compositions
NZ704490A (en) 2012-08-16 2017-07-28 Pfizer Glycoconjugation processes and compositions
WO2014037124A1 (en) 2012-09-04 2014-03-13 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing vaccine immune responses
US20150224181A1 (en) 2012-09-14 2015-08-13 The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Se Brachyury protein, non-poxvirus non-yeast vectors encoding brachyury protein, and their use
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
CA2882382A1 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Novartis Ag Outer membrane vesicles
WO2014052453A1 (en) * 2012-09-25 2014-04-03 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oral therapy of necrotizing enterocolitis
AR092896A1 (es) 2012-10-03 2015-05-06 Novartis Ag Composiciones inmunogenicas
KR20150080592A (ko) 2012-11-02 2015-07-09 파마시클릭스, 인코포레이티드 Tec 패밀리 키나제 억제제 애쥬번트 요법
WO2014074785A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Methods of predicting outcome and treating breast cancer
KR20140075196A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
KR20140075201A (ko) 2012-12-11 2014-06-19 에스케이케미칼주식회사 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
TWI465241B (zh) 2012-12-19 2014-12-21 Ind Tech Res Inst 圓柏（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）萃取物或木酚素（ｌｉｇｎａｎ）用於製造抑制血管新生之藥物的用途
CA2893343C (en) 2012-12-20 2019-05-14 Pfizer Inc. Glycoconjugation process
EP2948469A4 (de) 2013-01-23 2016-11-02 Univ Leland Stanford Junior Stabilisiertes hepatitis-b-kern-polypeptid
CA2900008A1 (en) 2013-02-07 2014-08-14 Children's Medical Center Corporation Protein antigens that provide protection against pneumococcal colonization and/or disease
CA2903716C (en) 2013-03-08 2019-04-09 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
EA201591761A1 (ru) 2013-03-14 2016-03-31 Президент Энд Феллоуз Оф Гарвард Колледж Композиции на основе наночастиц
WO2014151401A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Zoetis Llc CROSS-PROTECTION OF BOVINES AGAINST B. trehalosi INFECTION BY A MULTI-VALENT VACCINE
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
CA2907915C (en) 2013-04-03 2023-03-07 Allertein Therapeutics, Llc Immunomodulatory nanoparticle compositions comprising a plurality of nanoparticles comprising biodegradable or biocompatible polymers and hydrophilic and hydrophobic cellular components
US20160083698A1 (en) 2013-04-19 2016-03-24 The Regents Of The University Of California Lone star virus
AR095882A1 (es) 2013-04-22 2015-11-18 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra csf-1r humano con un agonista de tlr9
CN103550783A (zh) * 2013-04-27 2014-02-05 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种核酸类药物靶向递送系统及其制备方法
US20210145963A9 (en) 2013-05-15 2021-05-20 The Governors Of The University Of Alberta E1e2 hcv vaccines and methods of use
WO2014201245A1 (en) 2013-06-12 2014-12-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Tlr-9 agonist with tlr-7 and/or tlr-8 agonist for treating tumors
CN112263675B (zh) * 2013-07-19 2024-02-27 财团法人卫生研究院 CpG寡脱氧核苷酸、包含其的免疫组合物及制备组合物并通过其刺激免疫反应的方法
US10894963B2 (en) 2013-07-25 2021-01-19 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
US9919029B2 (en) 2013-07-26 2018-03-20 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of bacterial infections
KR101905278B1 (ko) 2013-09-08 2018-10-08 화이자 인코포레이티드 나이세리아 메닌지티디스 조성물 및 그의 방법
AR097584A1 (es) 2013-09-12 2016-03-23 Hoffmann La Roche Terapia de combinación de anticuerpos contra el csf-1r humano y anticuerpos contra el pd-l1 humano
NZ733383A (en) 2013-09-19 2022-12-23 Zoetis Services Llc Oil-based adjuvants
WO2015048635A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Duke University Mper-liposome conjugates and uses thereof
WO2015048785A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Los Alamos National Security, Llc Mosaic conserved region hiv immunogenic polypeptides
AU2014329393B2 (en) 2013-10-04 2020-04-30 Pin Pharma, Inc. Immunostimulatory HIV Tat derivative polypeptides for use in cancer treatment
JP2016535989A (ja) 2013-11-01 2016-11-24 ファイザー・インク 前立腺関連抗原を発現させるためのベクター
EP2870974A1 (de) 2013-11-08 2015-05-13 Novartis AG Salmonella-Konjugatimpfstoffe
UA127337C2 (uk) 2013-11-28 2023-07-26 Баваріан Нордік А/С Рекомбінантний поксвірус для індукції посиленої імунної відповіді та його застосування
WO2015126502A2 (en) * 2013-12-03 2015-08-27 Northwestern University Liposomal particles, methods of making same and uses thereof
WO2015089469A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Multi-epitope tarp peptide vaccine and uses thereof
US11708411B2 (en) 2013-12-20 2023-07-25 Wake Forest University Health Sciences Methods and compositions for increasing protective antibody levels induced by pneumococcal polysaccharide vaccines
JPWO2015108046A1 (ja) * 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗アレルギー作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗アレルギー剤
US10149905B2 (en) 2014-01-15 2018-12-11 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having antitumor effect and antitumor agent
JPWO2015108047A1 (ja) * 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
DK3094728T3 (da) 2014-01-16 2022-05-16 Wave Life Sciences Ltd Kiralt design
AU2015208820B2 (en) 2014-01-21 2020-05-14 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
CA2937190A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Pfizer Inc. Streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides and conjugates thereof
RU2771293C2 (ru) 2014-01-21 2022-04-29 Пфайзер Инк. Иммуногенные композиции, содержащие конъюгированные капсульные сахаридные антигены, и их применение
MA39228A1 (fr) 2014-01-21 2017-06-30 Immune Design Corp Compositions à utiliser pour le traitement d'états allergiques
US11160855B2 (en) 2014-01-21 2021-11-02 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2016130569A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Mj Biologics, Inc. A composition comprising pedv antigens and methods for making and using the composition
US10279019B2 (en) 2014-02-11 2019-05-07 Stc.Unm PCSK9 peptide vaccine conjugated to a Qbeta carrier and methods of using the same
JP2017505792A (ja) 2014-02-14 2017-02-23 ファイザー・インク 免疫原性糖タンパク質コンジュゲート
GB2523187A (en) 2014-02-18 2015-08-19 Mologen Ag Covalently closed non-coding immunomodulatory DNA construct
EP3110401A4 (de) 2014-02-25 2017-10-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipidnanopartikel-impfstoffadjuvanzien und antigenfreisetzungssysteme
AU2015222102B2 (en) 2014-02-28 2021-08-19 Bayer Animal Health Gmbh Immunostimulatory plasmids
US10034934B2 (en) 2014-03-11 2018-07-31 Regents Of The University Of Minnesota Porcine epidemic diarrhea virus vaccines and methods of use thereof
EP3119910A4 (de) 2014-03-20 2018-02-21 Pharmacyclics LLC Phospholipase c gamma 2 und resistenzassoziierte mutationen
PL3122378T3 (pl) 2014-03-26 2020-06-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Zmutowane antygeny gronkowcowe
US9549914B2 (en) 2014-04-03 2017-01-24 The Johns Hopkins University Treatment of human cytomegalovirus by modulating Wnt
US10111948B2 (en) 2014-04-25 2018-10-30 Tria Bioscience Corp. Synthetic hapten carrier compositions and methods
US20150335731A1 (en) * 2014-05-23 2015-11-26 Gregory Cauchon Coating Method and Materials
CA2986096A1 (en) 2014-05-30 2015-12-03 Sanofi Pasteur Inc. Expression and conformational analysis of engineered influenza hemagglutinin
JP6581604B2 (ja) 2014-06-04 2019-09-25 イグジキュア, インコーポレーテッドExicure, Inc. 予防的または治療的適用のためのリポソーム球状核酸による免疫調節物質の多価送達
WO2015200728A1 (en) 2014-06-25 2015-12-30 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for treatment with synthetic nanocarriers and immune checkpoint inhibitors
CA2955015A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Immune Design Corp. Prime-boost regimens with a tlr4 agonist adjuvant and a lentiviral vector
JP2017525711A (ja) 2014-08-22 2017-09-07 ジャナス バイオセラピューティクス，インク． 新規なｎ２，ｎ４，ｎ７，６−四置換プテリジン−２，４，７−トリアミンおよび２，４，６，７−四置換プテリジン化合物ならびにその合成方法および使用
WO2016044839A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections through stimulated innate immunity in combination with antiviral compounds
KR20170063949A (ko) 2014-10-06 2017-06-08 엑시큐어, 인크. 항-ｔｎｆ 화합물
US20160129097A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 Jeremy Delk Method of processing a veterinary tumor vaccine and a veterinary tumor vaccine processing kit
CN107106493A (zh) 2014-11-21 2017-08-29 西北大学 球形核酸纳米颗粒缀合物的序列特异性细胞摄取
JP6536964B2 (ja) * 2014-12-26 2019-07-03 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 免疫賦活活性を有する核酸多糖複合体の抗腫瘍薬としての応用
PL3240801T3 (pl) 2014-12-31 2021-06-14 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Skojarzona immunoterapia nowotworów
AU2016207820B2 (en) 2015-01-15 2020-12-17 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
PL3244920T3 (pl) 2015-01-16 2023-09-25 Zoetis Services Llc Szczepionka przeciw pryszczycy
US20180036334A1 (en) 2015-02-13 2018-02-08 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Rna containing compositions and methods of their use
BR112017017460A2 (pt) 2015-02-19 2018-04-10 Pfizer Inc. composições de neisseria meningitidis e métodos das mesmas
EP3268380B1 (de) 2015-03-12 2018-12-26 Zoetis Services LLC Pyolysinverfahren und -zusammensetzungen
SG10202101887WA (en) 2015-05-04 2021-03-30 Pfizer Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
WO2016180852A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for preparing antigen-specific t cells from an umbilical cord blood sample
IL293135A (en) 2015-05-13 2022-07-01 Agenus Inc A preparation containing at least two different complexes of purified stress protein linked to an antigenic peptide
WO2016183371A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Methods for the treatment or prevention of ischemic tissue damage
US10584148B2 (en) 2015-06-02 2020-03-10 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
US11305002B2 (en) 2015-06-09 2022-04-19 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Compositions and treatments for Haemophilus influenzae
CN108291210B (zh) 2015-06-10 2022-03-11 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 生产和纯化含核酸组合物的方法
AU2016281904B2 (en) 2015-06-26 2022-08-11 Seqirus UK Limited Antigenically matched influenza vaccines
US10449212B2 (en) 2015-07-09 2019-10-22 National Institute For Materials Science Immunostimulating oligonucleotide complex
TWI684460B (zh) 2015-07-21 2020-02-11 美商輝瑞股份有限公司 包含經共軛之莢膜糖抗原的致免疫性組成物、包含該致免疫性組成物之套組及彼等之用途
CN108025062A (zh) 2015-07-31 2018-05-11 拜耳动物保健有限责任公司 猪科动物物种中增强的免疫应答
BR112018002919B1 (pt) 2015-08-14 2024-02-27 Zoetis Services Llc Composição imunogênica eficaz compreendendo uma cepa de mycoplasma bovis e usos da mesma para prevenção de doenças causadas por mycoplasma bovis
EP3344276B1 (de) 2015-09-03 2020-04-22 The Board of Regents of the University of Oklahoma Peptidinhibitoren von clostridium-difficile-toxin tcdb
LU92821B1 (en) 2015-09-09 2017-03-20 Mologen Ag Combination comprising immunostimulatory oligonucleotides
BR112018005315A2 (pt) 2015-09-17 2018-10-09 Jrx Biotechnology Inc abordagens para aprimorar hidratação ou umidificação de pele
GB2542425A (en) 2015-09-21 2017-03-22 Mologen Ag Means for the treatment of HIV
WO2017059280A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel pan-tam inhibitors and mer/axl dual inhibitors
WO2017062246A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Human rota virus g9p[6] strain and use as a vaccine
WO2017075570A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 The United States Of America, As Represented By Secretary, Department Of Health And Human Sevices Compositions and methods for the treatment of her2-expressing solid tumors
EP3377098A1 (de) 2015-11-20 2018-09-26 Pfizer Inc Immunogene zusammensetzungen zur verwendung in pneumokokkenimpfstoffen
AU2016367712B2 (en) 2015-12-09 2021-10-07 Jingang Medicine (Australia) Pty Ltd Immunomodulating composition for treatment
EP3402878A1 (de) 2016-01-11 2018-11-21 Zoetis Services LLC Neuartige impfstoffzusammensetzungen mit kreuzschutz für das porzine epidemische diarrhoevirus
DK3407910T3 (da) 2016-01-29 2022-07-18 Bavarian Nordic As Rekombinant modificeret vaccinia virus ankara (mva)-vaccine mod hesteencephalitisvirus
WO2017189448A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bivalent immunogenic conjugate for malaria and typhoid
US20190298824A1 (en) 2016-05-04 2019-10-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Albumin-binding immunomodulatory compositions and methods of use thereof
US11173207B2 (en) 2016-05-19 2021-11-16 The Regents Of The University Of Michigan Adjuvant compositions
WO2017210215A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Zika virus vaccine and methods of production
WO2017210599A1 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
MX2018014887A (es) 2016-06-03 2019-06-06 Sanofi Pasteur Inc Modificación de polipéptidos de hemaglutinina de influenza transformados por ingeniería genética.
BR112018075513A2 (pt) 2016-06-13 2019-10-01 Us Health ácidos nucleicos que codificam as partículas seme-lhantes ao vírus da zika e seu uso nas vacinas e no ensaio de diagnóstico do vírus da zika
EP3474890A1 (de) 2016-06-22 2019-05-01 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. Pneumokokken-polysaccharid-proteinkonjugat-zusammensetzung
EP3269385A1 (de) 2016-07-12 2018-01-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pneumokokken-polysaccharid-proteinkonjugatzusammensetzung
US11344615B2 (en) 2016-07-08 2022-05-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nucleic acids encoding chimeric dengue/Zika viruses optimized for growth and stability in vero cells
WO2018009603A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 The United State of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Service Chimeric west nile/zika viruses and methods of use
BR112019001971A2 (pt) 2016-08-05 2019-05-07 Sanofi Pasteur, Inc. composição conjugada de polissacarídeo-proteína pneumocócica multivalente
KR102467074B1 (ko) 2016-08-05 2022-11-11 사노피 파스퇴르 인코포레이티드 다가 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물
US10182146B2 (en) * 2016-08-22 2019-01-15 Nice Ltd. System and method for dynamic redundant call recording
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
JP7138094B2 (ja) 2016-08-25 2022-09-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト マクロファージ活性化剤と組み合わせた抗ｃｓｆ－１ｒ抗体の間欠投与
US10172933B2 (en) 2016-10-31 2019-01-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Mosaic vaccines for serotype a foot-and-mouth disease virus
US10751402B2 (en) 2016-11-09 2020-08-25 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
JP7304287B2 (ja) 2016-12-22 2023-07-06 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｐｄ－ｌ１／ｐｄ１治療の不成功後の、抗ｐｄ－ｌ１抗体との組み合わせでの抗ｃｓｆ－１ｒ抗体を用いた腫瘍の治療
BR112019014833A2 (pt) 2017-01-20 2020-04-14 Pfizer composições imunogênicas para uso em vacinas pneumococais
US20200222550A1 (en) 2017-01-31 2020-07-16 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for production of capsular polysaccharide protein conjugates from streptococcus pneumoniae serotype 19f
IL303108B1 (en) 2017-01-31 2024-03-01 Pfizer NEISSERIA MENINGITIDIS preparations and methods therefor
AU2018214451B2 (en) 2017-02-06 2022-02-03 Meat & Livestock Australia Limited Immunostimulating compositions and uses therefore
GB201703529D0 (en) 2017-03-06 2017-04-19 Cambridge Entpr Ltd Vaccine composition
WO2018183666A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Boston Medical Center Corporation Methods and compositions using highly converved pneumococcal surface proteins
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
SG11201911930SA (en) 2017-06-11 2020-01-30 Molecular Express Inc Methods and compositions for substance use disorder vaccine formulations and uses thereof
EP4327876A2 (de) 2017-06-23 2024-02-28 Affinivax, Inc. Immunogene zusammensetzungen
BR112020001255A2 (pt) 2017-07-21 2020-07-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services composições imunogênicas de neisseria meningitidis
AU2018328037B2 (en) 2017-09-07 2024-03-07 Merck Sharp & Dohme Llc Pneumococcal polysaccharides and their use in immunogenic polysaccharide-carrier protein conjugates
WO2019048632A1 (en) 2017-09-08 2019-03-14 Mina Therapeutics Limited STABILIZED COMPOSITIONS OF SMALL ACTIVATORY RNA (PARNA) OF HNF4A AND METHODS OF USE
WO2019066571A2 (ko) 2017-09-28 2019-04-04 연세대학교 산학협력단 골수유래 면역반응 억제세포의 제조방법, 이에 의해 제조된 골수유래 면역반응 억제세포 및 그 용도
US11235046B2 (en) 2017-11-04 2022-02-01 Nevada Research & Innovation Corporation Immunogenic conjugates and methods of use thereof
KR20230130153A (ko) 2017-12-06 2023-09-11 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법
WO2019126197A1 (en) 2017-12-18 2019-06-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bacterial polysaccharide-conjugated carrier proteins and use thereof
EP3727447A1 (de) 2017-12-19 2020-10-28 Massachusetts Institute of Technology Reagenzien zur kopplung von antigen-adjuvans und verfahren zur verwendung
US11369675B2 (en) 2018-01-22 2022-06-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly protective inactivated influenza virus vaccine
RU2020128440A (ru) 2018-02-28 2022-03-28 Пфайзер Инк. Варианты il-15 и их применения
MA52435A (fr) * 2018-03-02 2021-01-06 Elicio Therapeutics Inc Composés contenant une séquence kras mutante et un lipide et leurs utilisations
US11633471B2 (en) 2018-03-06 2023-04-25 Unm Rainforest Innovations Compositions and methods for reducing serum triglycerides
CN112189019A (zh) 2018-03-28 2021-01-05 圣诺菲·帕斯图尔公司 产生包含血凝素的广泛保护性疫苗组合物的方法
JP2021519598A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 サノフイＳａｎｏｆｉ 抗原性エプスタインバーウイルスポリペプチド
JP2021519597A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 サノフイＳａｎｏｆｉ 抗原性呼吸器合胞体ウイルスポリペプチド
JP2021519599A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 サノフイＳａｎｏｆｉ 抗原性ｏｓｐａポリペプチド
JP2021519596A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 サノフイＳａｎｏｆｉ フェリチンタンパク質
CN112512565A (zh) 2018-04-03 2021-03-16 赛诺菲 抗原性流感-铁蛋白多肽
US11525010B2 (en) 2018-05-23 2022-12-13 Pfizer Inc. Antibodies specific for GUCY2c and uses thereof
PE20210127A1 (es) 2018-05-23 2021-01-19 Pfizer Anticuerpos especificos para cd3 y sus usos
EP3574915A1 (de) 2018-05-29 2019-12-04 Neovacs Immunogenes produkt mit il-4 und/oder il-13 zur behandlung von erkrankungen im zusammenhang mit aberranter il-4- und/oder il-13-expression oder -aktivität
CN110004150B (zh) * 2018-08-01 2023-03-10 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种具有免疫增强活性的CpG寡聚核苷酸序列及其应用
US11260119B2 (en) 2018-08-24 2022-03-01 Pfizer Inc. Escherichia coli compositions and methods thereof
CA3120324A1 (en) 2018-12-04 2020-06-11 The Rockefeller University Hiv vaccine immunogens
US20220023413A1 (en) 2018-12-12 2022-01-27 The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Recombinant mumps virus vaccine expressing genotype g fusion and hemagglutinin-neuraminidase proteins
EP3893926A1 (de) 2018-12-12 2021-10-20 Pfizer Inc. Immunogene multiple hetero-antigen-polysaccharid-protein-konjugate und deren verwendung
EP3894429B1 (de) 2018-12-14 2024-02-21 University of Georgia Research Foundation, Inc. Replikon-partikel des krim-kongo-fiebervirus und deren verwendung
BR112021011961A8 (pt) 2018-12-19 2023-02-07 Merck Sharp & Dohme Composições compreendendo conjugados de polissacarídeo-proteína de streptococcus pneumoniae e métodos de uso dos mesmos
WO2020128893A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Pfizer Inc. Combination treatments of cancer comprising a tlr agonist
JP2022525431A (ja) 2019-04-02 2022-05-13 サノフイ 抗原性多量体呼吸器合胞体ウイルスポリペプチド
WO2020208502A1 (en) 2019-04-10 2020-10-15 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens, kits comprising the same and uses thereof
CN114072506A (zh) * 2019-05-10 2022-02-18 中天(上海)生物科技有限公司 用于调节免疫应答的二聚CpG寡核苷酸
AU2020290969A1 (en) * 2019-06-14 2022-02-03 G Tech Bio Llc Activated lymphocytic cells and methods of using the same to treat cancer and infectious conditions
EP3999093A4 (de) 2019-07-19 2023-11-22 Merck Sharp & Dohme LLC Antigene glykoprotein-e-polypeptide, zusammensetzungen und verfahren zu deren verwendung
MX2022001190A (es) 2019-07-30 2022-02-22 Phibro Animal Health Corporation Una composicion para administracion en la mucosa para aves.
US20220265803A1 (en) 2019-07-31 2022-08-25 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate compositions and methods of using the same
EP4021894A1 (de) 2019-08-30 2022-07-06 University of Rochester Septininhibitoren zur behandlung von krebs
CN110646557A (zh) * 2019-10-12 2020-01-03 北京航空航天大学 携带idh基因突变的胶质母细胞瘤患者的尿液代谢标志物及其用途
IL292494A (en) 2019-11-01 2022-06-01 Pfizer Preparations of Escherichia coli and their methods
KR20220114049A (ko) 2019-12-17 2022-08-17 화이자 인코포레이티드 Cd47, pd-l1에 특이적인 항체, 및 그의 용도
WO2021127271A1 (en) 2019-12-17 2021-06-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Live attenuated leishmania parasite vaccines with enhanced safety characteristics
WO2021154745A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Oregon State University Gonorrhea subunit vaccine
EP4103225A2 (de) 2020-02-13 2022-12-21 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Impfstoff und verfahren zum detektieren und vorbeugen von filariasis
BR112022014555A2 (pt) 2020-02-23 2022-09-20 Pfizer Composições de escherichia coli e métodos das mesmas.
JP2023515829A (ja) 2020-02-28 2023-04-14 サノフィ パスツール インコーポレイテッド 小児対象のための高用量インフルエンザワクチン
US11213482B1 (en) 2020-03-05 2022-01-04 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth System of Higher Educat SARS-CoV-2 subunit vaccine and microneedle array delivery system
US20230146256A1 (en) 2020-04-17 2023-05-11 Regents Of The University Of Minnesota SARS-CoV-2 SPIKE RECEPTOR BINDING DOMAIN AND COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
EP3900739A1 (de) 2020-04-21 2021-10-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthetische streptococcus-pneumoniae-saccharid-konjugate zum konservierten membranprotein
EP4149440A1 (de) 2020-05-11 2023-03-22 Erytech Pharma Erythrozyten-extrazellularvesikel (rbevs) mit frachten sowie verfahren zur verwendung und herstellung davon
PE20231565A1 (es) 2020-07-17 2023-10-04 Pfizer Anticuerpos terapeuticos y sus usos
WO2022043855A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Pfizer Inc. Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
WO2022058571A1 (en) 2020-09-17 2022-03-24 Neovacs IMMUNOGENIC PRODUCT COMPRISING AN IgE FRAGMENT FOR TREATING IgE-MEDIATED INFLAMMATORY DISORDERS
WO2022066973A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting pbk or oip5 antigens
WO2022066965A2 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Immunotherapy targeting sox2 antigens
IL302362A (en) 2020-10-27 2023-06-01 Pfizer ESCHERICHIA COLI preparations and their methods
IL302413A (en) 2020-11-04 2023-06-01 Pfizer Immunogenic preparations for use in pneumococcal vaccines
JP2023549736A (ja) 2020-11-10 2023-11-29 ファイザー・インク コンジュゲートさせた莢膜糖抗原を含む免疫原性組成物およびその使用
US20220202923A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Pfizer Inc. E. coli fimh mutants and uses thereof
WO2022147373A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody-guided pcsk9-mimicking immunogens lacking 9-residue sequence overlap with human proteins
EP4288087A1 (de) 2021-02-03 2023-12-13 The Board of Trustees of the University of Illinois Impfstoff und verfahren zur vorbeugung von filariasis und dirofilariasis
US20220387613A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
US20220387576A1 (en) 2021-05-28 2022-12-08 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2022261251A1 (en) 2021-06-08 2022-12-15 Glyde Bio Inc. Immunogenic compositions comprising tumour-associated antigen
EP4104830A1 (de) 2021-06-16 2022-12-21 Burghardt Wittig Sequentielle angeborene und adaptive immunmodulation zur krebsbehandlung
CA3226187A1 (en) 2021-07-16 2023-01-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Universal vaccine for influenza virus based on tetrameric m2 protein incorporated into nanodiscs
WO2023018817A1 (en) 2021-08-11 2023-02-16 Sanofi Pasteur Inc. Truncated influenza neuraminidase and methods of using the same
CA3233926A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines
WO2023079113A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Hybrid multivalent influenza vaccines comprising hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
WO2023081798A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Pasteur Inc. Multivalent influenza vaccines comprising recombinant hemagglutinin and neuraminidase and methods of using the same
TW202346593A (zh) 2021-11-05 2023-12-01 法商賽諾菲公司 呼吸道融合病毒rna疫苗
WO2023102388A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Sanofi Pasteur Inc. Human metapneumovirus viral vector-based vaccines
AR127808A1 (es) 2021-11-30 2024-02-28 Sanofi Pasteur Inc Vacunas contra el metapneumovirus humano
WO2023111262A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sanofi Lyme disease rna vaccine
WO2023135515A1 (en) 2022-01-13 2023-07-20 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
WO2023144206A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 Sanofi Pasteur Modified vero cells and methods of using the same for virus production
WO2023161817A1 (en) 2022-02-25 2023-08-31 Pfizer Inc. Methods for incorporating azido groups in bacterial capsular polysaccharides
WO2023177579A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Sanofi Pasteur Inc. Machine-learning techniques in protein design for vaccine generation
WO2023201109A1 (en) 2022-04-15 2023-10-19 Yale University Exatecan formulation
WO2023214082A2 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Sanofi Signal sequences for nucleic acid vaccines
WO2023218322A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Pfizer Inc. Process for producing of vaccine formulations with preservatives
WO2024003239A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN
WO2024069420A2 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Pfizer Inc. Immunogenic compositions comprising an rsv f protein trimer

Family Cites Families (524)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2005A (en) * 1841-03-16 Improvement in the manner of constructing molds for casting butt-hinges
US2004A (en) * 1841-03-12 Improvement in the manner of constructing and propelling steam-vessels
US2002A (en) * 1841-03-12 Tor and planter for plowing
US2010A (en) * 1841-03-18 Machine foe
US2003A (en) * 1841-03-12 Improvement in horizontal windivhlls
US3521637A (en) * 1967-11-28 1970-07-28 Nelson J Waterbury Tampon or similar sanitary napkin containing vitamin a
US3627874A (en) 1969-07-16 1971-12-14 Merck & Co Inc Vaccine preparation
US3761585A (en) 1971-04-05 1973-09-25 Beecham Group Ltd Vaccines containing modified allergenic material
US3906092A (en) 1971-11-26 1975-09-16 Merck & Co Inc Stimulation of antibody response
DE2643213C2 (de) 1976-09-25 1985-02-21 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zum Abschwächen oder Inaktivieren von Mikroorganismen
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
JP2547714B2 (ja) 1981-10-23 1996-10-23 モルキユラ− バイオシステムズ インコ−ポレテツド オリゴヌクレオチド治療剤及びその製法
US5023243A (en) * 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
ES8301593A1 (es) 1981-11-16 1983-01-01 Union Ind Y Agro Ganader S A U Procedimiento de obtencion de una leche humanizada adiciona-da de nucleotidos con destino a la alimentacion infantil.
US5766920A (en) * 1982-08-11 1998-06-16 Cellcor, Inc. Ex vivo activation of immune cells
SE8205892D0 (sv) 1982-10-18 1982-10-18 Bror Morein Immunogent membranproteinkomplex, sett for framstellning och anvendning derav som immunstimulerande medel och sasom vaccin
US4452775A (en) * 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
SE8405493D0 (sv) 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
US5308626A (en) * 1985-06-28 1994-05-03 Toni N. Mariani Lymphokine activated effector cells for antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) treatment of cancer and other diseases
EP0231039B1 (de) 1986-01-14 1992-01-08 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Verfahren zur Herstellung immunologischer Komplexe und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung
US4806463A (en) 1986-05-23 1989-02-21 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of HTLV-III by exogenous oligonucleotides
US5194428A (en) 1986-05-23 1993-03-16 Worcester Foundation For Experimental Biology Inhibition of influenza virus replication by oligonucleotide phosphorothioates
US5059519A (en) 1986-07-01 1991-10-22 University Of Massachusetts Medical School Oligonucleotide probes for the determination of the proclivity for development of autoimmune diseases
US5075109A (en) * 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
ES2007350A6 (es) 1987-05-29 1989-06-16 Ganadera Union Ind Agro Productos alimenticios enriquecidos con nucleosidos yno nucleotidos para la nutricion infantil y de adultos, y procedimiento para su preparacion.
CA1339596C (en) 1987-08-07 1997-12-23 New England Medical Center Hospitals, Inc. Viral expression inhibitors
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
US5004810A (en) 1988-09-30 1991-04-02 Schering Corporation Antiviral oligomers
US5087617A (en) * 1989-02-15 1992-02-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides
US5112605A (en) * 1989-03-17 1992-05-12 Genentech, Inc. Temporal gamma-interferon administration for allergies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5629158A (en) * 1989-03-22 1997-05-13 Cemu Bitecknik Ab Solid phase diagnosis of medical conditions
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US4981684A (en) * 1989-10-24 1991-01-01 Coopers Animal Health Limited Formation of adjuvant complexes
US5178860A (en) * 1989-09-01 1993-01-12 Coopers Animal Health Limited Adjuvant complexes and vaccine made therefrom
US5399676A (en) * 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5786189A (en) 1989-11-29 1998-07-28 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5514788A (en) * 1993-05-17 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of cell adhesion
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5248670A (en) 1990-02-26 1993-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses
US5514577A (en) * 1990-02-26 1996-05-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide therapies for modulating the effects of herpes viruses
US5166195A (en) 1990-05-11 1992-11-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides
ES2259800T3 (es) 1990-06-11 2006-10-16 Gilead Sciences, Inc. Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US5245022A (en) * 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
EP0544713B1 (de) 1990-08-16 1997-07-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonukleotide zur modulation der effekte von cytomegalovirusinfektionen
US6042838A (en) * 1991-02-15 2000-03-28 Uab Research Foundation immunogenic compositions for mucosal administration of pneumococcal surface protein A (PspA)
NZ241954A (en) * 1991-03-15 1994-01-26 Amgen Inc Compositions of g-csf for pulmonary administration.
JPH06509704A (ja) 1991-04-18 1994-11-02 ザ　ソールク　インスチチュート　フォア　バイオロジカル　スタディズ 特定ｄｎａ配列に選択的に結合する蛋白質に対する偽構築体として有用なオリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
US5498410A (en) * 1991-04-22 1996-03-12 Gleich; Gerald J. Method for the treatment of eosinophil-associated conditions with anionic polymers
US5681555A (en) 1991-04-22 1997-10-28 Gleich; Gerald J. Method for the treatment of bronchial asthma by parenteral administration of anionic polymers
WO1994008003A1 (en) 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
AU2169992A (en) 1991-05-31 1993-01-08 Genta Incorporated Compositions and delivery systems for transdermal administration of neutral oligomers
US5582986A (en) 1991-06-14 1996-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene
US6030954A (en) * 1991-09-05 2000-02-29 University Of Connecticut Targeted delivery of poly- or oligonucleotides to cells
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
WO1993009789A1 (en) 1991-11-15 1993-05-27 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Treatment of melanoma with antisense oligonucleotides to c-myb proto-oncogene
JPH07501694A (ja) 1991-11-18 1995-02-23 タノックス　バイオシステムズ　インコーポレイテッド 免疫グロブリン生産のアイソタイプ特異的抑制のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド
US5858784A (en) * 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
ES2174845T3 (es) 1992-02-04 2002-11-16 Chiron Corp Terapeutica de la hepatitis.
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
US6498147B2 (en) 1992-05-22 2002-12-24 The Scripps Research Institute Suppression of nuclear factor-κb dependent processes using oligonucleotides
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
US5726518A (en) * 1992-07-22 1998-03-10 Nikon Corporation Supporting device of relative moving element of vibration actuator or vibration motor
US5585479A (en) 1992-07-24 1996-12-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Antisense oligonucleotides directed against human ELAM-I RNA
DE69316369D1 (en) 1992-07-27 1998-02-19 Hybridon Inc Oligonukleotid alkylphosphonothiate
US6107062A (en) * 1992-07-30 2000-08-22 Inpax, Inc. Antisense viruses and antisense-ribozyme viruses
WO1994004196A1 (en) 1992-08-14 1994-03-03 Imperial Cancer Research Technology Limited Tumour therapy
US5429199A (en) * 1992-08-26 1995-07-04 Kennametal Inc. Cutting bit and cutting insert
JPH08504570A (ja) 1992-10-05 1996-05-21 ハイブライドン インコーポレイテッド 治療用抗ｈｉｖオリゴヌクレオチドと薬剤
US5593972A (en) * 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
CA2159626C (en) * 1993-04-02 2001-10-02 Lingna Li Method for delivering beneficial compositions to hair follicles
US5567604A (en) * 1993-04-23 1996-10-22 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-viral guanosine-rich oligonucleotides
SG54115A1 (en) * 1993-04-27 1998-11-16 Gerber Scient Products Inc Thermal printing apparatus with improved power supply
EP0707653B1 (de) 1993-06-11 2004-09-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methode der spezifischen abschaltung von genen durch dna-methylierung
KR960703170A (ko) * 1993-06-23 1996-06-19 알버트 디. 프리센. 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 인간면역결핍바이러스감염에서 그것의 치료적이용(antisense oligonucleotides and therapeutic use thereof in human immunodeficiency virus infection)
AU688364B2 (en) 1993-07-19 1998-03-12 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides with activity against human immunodeficiency virus
US6004534A (en) 1993-07-23 1999-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Targeted polymerized liposomes for improved drug delivery
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US5830877A (en) 1993-08-26 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode antigens and immunostimulatory
US5849719A (en) 1993-08-26 1998-12-15 The Regents Of The University Of California Method for treating allergic lung disease
US5804566A (en) 1993-08-26 1998-09-08 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host through administration of naked polynucleotides with encode allergenic peptides
US5985847A (en) 1993-08-26 1999-11-16 The Regents Of The University Of California Devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
US20030109469A1 (en) 1993-08-26 2003-06-12 Carson Dennis A. Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen
US5679647A (en) 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
WO1995005853A1 (en) 1993-08-26 1995-03-02 The Regents Of The University Of California Method, compositions and devices for administration of naked polynucleotides which encode biologically active peptides
FR2711670B1 (fr) * 1993-10-22 1996-01-12 Pasteur Institut Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite.
DE4338704A1 (de) * 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
JPH09506770A (ja) 1993-12-23 1997-07-08 バイオグノステック・ゲゼルシャフト・フュア・バイオモレキュラーレ・ダイアグノスティック・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング ｃ−ｅｒｂＢの発現が関与する疾患を予防及び治療するためのアンチセンス核酸
US5712384A (en) 1994-01-05 1998-01-27 Gene Shears Pty Ltd. Ribozymes targeting retroviral packaging sequence expression constructs and recombinant retroviruses containing such constructs
US5728518A (en) * 1994-01-12 1998-03-17 The Immune Response Corporation Antiviral poly-and oligonucleotides
US5646126A (en) 1994-02-28 1997-07-08 Epoch Pharmaceuticals Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
AU710504B2 (en) 1994-03-15 1999-09-23 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
US5596091A (en) * 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6727230B1 (en) * 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
US5696248A (en) 1994-06-15 1997-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft 3'-modified oligonucleotide derivatives
US5741516A (en) 1994-06-20 1998-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US6207646B1 (en) * 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
PT772619E (pt) 1994-07-15 2006-10-31 Univ Iowa Res Found Oligonucleotidos imunomoduladores
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) * 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) * 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US20030050263A1 (en) * 1994-07-15 2003-03-13 The University Of Iowa Research Foundation Methods and products for treating HIV infection
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
WO1996002560A1 (en) 1994-07-18 1996-02-01 University Of North Carolina At Chapel Hill Oligonucleoside compounds and methods for inhibiting tumor growth, invasion and metastasis
US5646262A (en) * 1994-07-28 1997-07-08 Georgetown University Antisense oligonucleotides against hepatitis B viral replication
US5753613A (en) * 1994-09-30 1998-05-19 Inex Pharmaceuticals Corporation Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells
DE69527206T2 (de) * 1994-09-30 2003-02-27 Inex Pharmaceuticals Corp Mittel zum einbringen polyanionischer materialien in zellen
US6027726A (en) * 1994-09-30 2000-02-22 Inex Phamaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
WO1996012008A1 (en) 1994-10-13 1996-04-25 Merck & Co., Inc. Synthesis of methylase-resistant genes
US6630455B1 (en) 1995-01-13 2003-10-07 Vanderbilt University Methods for inducing mucosal immune responses
US5795587A (en) * 1995-01-23 1998-08-18 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US6008202A (en) * 1995-01-23 1999-12-28 University Of Pittsburgh Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
US5674483A (en) * 1995-01-31 1997-10-07 National Jewish Medical And Research Center Treatment for diseases involving inflammation
WO1996024380A1 (en) 1995-02-09 1996-08-15 Icn Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for regulation of cd28 expression
US5932556A (en) 1995-09-17 1999-08-03 Tam; Robert C Methods and compositions for regulation of CD28 expression
GB9505438D0 (en) 1995-03-17 1995-05-03 Sod Conseils Rech Applic Antisense oligonucleotides
US5703057A (en) 1995-04-07 1997-12-30 Board Of Regents The University Of Texas System Expression library immunization
CA2192674C (en) 1995-04-13 2001-02-13 John Mcmichael Methods for treating respiratory disease
US6096721A (en) * 1995-04-13 2000-08-01 Milkhaus Laboratory, Inc. Method for treating mucositis by sublingual administration of DNA
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5858987A (en) * 1995-05-05 1999-01-12 Mitotix, Inc. E6AP antisense constructs and methods of use
WO1996035782A1 (en) 1995-05-11 1996-11-14 Applied Research Systems Il-6 activity inhibitor
US5955059A (en) * 1995-06-06 1999-09-21 Trustees Of Boston University Use of locally applied DNA fragments
US6025339A (en) * 1995-06-07 2000-02-15 East Carolina University Composition, kit and method for treatment of disorders associated with bronchoconstriction and lung inflammation
US5994315A (en) 1995-06-07 1999-11-30 East Carolina University Low adenosine agent, composition, kit and method for treatment of airway disease
DE69634084T2 (de) 1995-06-07 2005-12-08 Inex Pharmaceuticals Corp. Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5705385A (en) * 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US7034007B1 (en) * 1995-06-07 2006-04-25 East Carolina University Low adenosine anti-sense oligonucleotide, compositions, kit & method for treatment of airway disorders associated with bronchoconstriction, lung inflammation, allergy(ies) & surfactant depletion
US5830878A (en) 1995-06-07 1998-11-03 Megabios Corporation Cationic lipid: DNA complexes for gene targeting
US6040296A (en) * 1995-06-07 2000-03-21 East Carolina University Specific antisense oligonucleotide composition & method for treatment of disorders associated with bronchoconstriction and lung inflammation
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
AU723325B2 (en) 1995-06-23 2000-08-24 President And Fellows Of Harvard College Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US6248720B1 (en) * 1996-07-03 2001-06-19 Brown University Research Foundation Method for gene therapy using nucleic acid loaded polymeric microparticles
JPH11510142A (ja) 1995-07-21 1999-09-07 ブラウン・ユニバーシティ・リサーチ・ファンデーション 核酸負荷ポリマー微粒子を使用した遺伝子治療法
US5968909A (en) 1995-08-04 1999-10-19 Hybridon, Inc. Method of modulating gene expression with reduced immunostimulatory response
US6667293B1 (en) * 1995-09-12 2003-12-23 Hybridon, Inc. Use of cyclodextrins to modulate gene expression with reduced immunostimulatory response
KR100676792B1 (ko) 1995-10-04 2007-02-02 임뮤넥스 코포레이션 수지상 세포 자극 인자
US5736152A (en) * 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
EP0879284B1 (de) 1996-01-30 2009-07-29 The Regents of The University of California Expressionsvektoren, die eine antigen-spezifische immunantwort induzieren, und methoden für ihre verwendung.
US20030078223A1 (en) * 1996-01-30 2003-04-24 Eyal Raz Compositions and methods for modulating an immune response
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
SE9600647D0 (sv) 1996-02-21 1996-02-21 Bror Morein Ny användning
SE9600648D0 (sv) * 1996-02-21 1996-02-21 Bror Morein Receptorbimdande enhet
US5843770A (en) 1996-03-11 1998-12-01 The Immune Response Corporation Antisense constructs directed against viral post-transcriptional regulatory sequences
US6620805B1 (en) 1996-03-14 2003-09-16 Yale University Delivery of nucleic acids by porphyrins
US6030955A (en) * 1996-03-21 2000-02-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York And Imclone Systems, Inc. Methods of affecting intracellular phosphorylation of tyrosine using phosphorothioate oligonucleotides, and antiangiogenic and antiproliferative uses thereof
US6121247A (en) 1996-03-29 2000-09-19 The Johns Hopkins University Therapy for allergic diseases
US6184037B1 (en) 1996-05-17 2001-02-06 Genemedicine, Inc. Chitosan related compositions and methods for delivery of nucleic acids and oligonucleotides into a cell
WO1998001538A1 (en) 1996-07-10 1998-01-15 Immunex Corporation Method of activating dendritic cells
EP0819758B1 (de) 1996-07-16 2006-09-20 Archibald James Mixson Kationisches Vehikel: DNS Komplexe und ihre Verwendung in Gentherapie
US5854418A (en) 1996-07-25 1998-12-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) viral macrophage inflammatory protein-1α II (vMIP-1α II) and uses thereof
US5856462A (en) 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
DE19637223A1 (de) * 1996-09-13 1998-04-09 Beiersdorf Ag Wiederlösbare, selbstklebende Vorrichtung
EP0930893B1 (de) 1996-10-11 2005-04-13 The Regents of The University of California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
US6562345B1 (en) * 1996-11-12 2003-05-13 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
US6797276B1 (en) * 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US20060002959A1 (en) * 1996-11-14 2006-01-05 Government Of The United States Skin-sctive adjuvants for transcutaneous immuization
US20060002949A1 (en) * 1996-11-14 2006-01-05 Army Govt. Of The Usa, As Rep. By Secretary Of The Office Of The Command Judge Advocate, Hq Usamrmc. Transcutaneous immunization without heterologous adjuvant
SE9604296D0 (sv) 1996-11-22 1996-11-22 Astra Ab New pharmaceutical formulation of polypeptides
AU5720098A (en) 1996-12-27 1998-07-31 Icn Pharmaceuticals, Inc. G-rich oligo aptamers and methods of modulating an immune response
FR2757876B1 (fr) 1996-12-27 1999-04-09 Biovector Therapeutics Sa Conjuges d'un vecteur particulaire et d'oligonucleotides, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques les contenant
EP0855184A1 (de) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmazeutisches Präparat das ein Polynukleotid und ein Antigen enthält, insbesondere zur Impfung
US20030064945A1 (en) * 1997-01-31 2003-04-03 Saghir Akhtar Enzymatic nucleic acid treatment of diseases or conditions related to levels of epidermal growth factor receptors
GB9702021D0 (en) 1997-01-31 1997-03-19 Imperial College Medicaments
US7517952B1 (en) * 1997-02-25 2009-04-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
JP2001513776A (ja) * 1997-02-28 2001-09-04 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6406705B1 (en) * 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
DE69841122D1 (de) * 1997-03-10 2009-10-15 Coley Pharm Gmbh Verwendung von nicht-methyliertem CpG Dinukleotid in Kombination mit Aluminium als Adjuvantien
US5965542A (en) 1997-03-18 1999-10-12 Inex Pharmaceuticals Corp. Use of temperature to control the size of cationic liposome/plasmid DNA complexes
US6426334B1 (en) 1997-04-30 2002-07-30 Hybridon, Inc. Oligonucleotide mediated specific cytokine induction and reduction of tumor growth in a mammal
US20030104044A1 (en) * 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
DE69841002D1 (de) * 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
EP0983289A4 (de) 1997-05-19 2001-04-25 Merck & Co Inc Oligonukleotidhilfsmittel
ATE370740T1 (de) 1997-05-20 2007-09-15 Ottawa Health Research Inst Verfahren zur herstellung von nukleinsäurekonstrukten
US6589940B1 (en) 1997-06-06 2003-07-08 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
US20040006034A1 (en) * 1998-06-05 2004-01-08 Eyal Raz Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
EP1003850B1 (de) * 1997-06-06 2009-05-27 The Regents of the University of California Inhibitoren von immunstimulatorischen dna sequenz aktivität
WO1999001154A1 (en) * 1997-07-03 1999-01-14 University Of Iowa Research Foundation Method for inhibiting immunostimulatory dna associated responses
US6110745A (en) 1997-07-24 2000-08-29 Inex Pharmaceuticals Corp. Preparation of lipid-nucleic acid particles using a solvent extraction and direct hydration method
US5877309A (en) * 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
ES2255732T3 (es) 1997-08-19 2006-07-01 Idera Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotidos especificos de vih y procedimientos para su utilizacion.
CA2302805A1 (en) 1997-09-05 1999-03-11 The Regents Of The University Of California Use of immunostimulatory oligonucleotides for preventing or reducing antigen-stimulated, granulocyte-mediated inflammation
US6749856B1 (en) 1997-09-11 2004-06-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
AU756828B2 (en) * 1997-12-02 2003-01-23 Powderject Vaccines, Inc. Transdermal delivery of particulate vaccine compositions
WO1999030686A1 (en) 1997-12-12 1999-06-24 Inex Pharmaceuticals Corp. Cationic drugs encapsulated in anionic liposomes
US7393630B2 (en) * 1997-12-16 2008-07-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions
CA2315695A1 (en) 1997-12-23 1999-07-08 Inex Pharmaceuticals Corporation Polyamide oligomers
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US20050031638A1 (en) * 1997-12-24 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine
JPH11209289A (ja) * 1998-01-22 1999-08-03 Taisho Pharmaceut Co Ltd 粘膜免疫誘起剤
ATE365050T1 (de) 1998-02-25 2007-07-15 Us Gov Sec Army Verwendung von hautpenetrationsförderern und für die zerstörung der oberen hautschichten geeigneten mitteln zur erhöhung der transkutanen immunantwort
ES2289224T3 (es) * 1998-03-12 2008-02-01 Lucite International Uk Limited Composicion polimerica.
AU760549B2 (en) 1998-04-03 2003-05-15 University Of Iowa Research Foundation, The Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
CA2325939A1 (en) 1998-04-09 1999-10-21 Martin Friede Vaccine
WO1999055743A1 (en) 1998-04-28 1999-11-04 Inex Pharmaceuticals Corporation Polyanionic polymers which enhance fusogenicity
JP2002513763A (ja) 1998-05-06 2002-05-14 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション Ｃｐｇオリゴヌクレオチドを使用して寄生生物感染および関連する疾患を予防および処置するための方法
WO1999058118A2 (en) 1998-05-14 1999-11-18 Cpg Immunopharmaceuticals Gmbh METHODS FOR REGULATING HEMATOPOIESIS USING CpG-OLIGONUCLEOTIDES
ES2628744T3 (es) 1998-05-22 2017-08-03 Ottawa Hospital Research Institute Métodos y productos para inducir inmunidad en mucosas
US6881561B1 (en) 1998-05-27 2005-04-19 Cheil Jedang Corporation Endonuclease of immune cell, process for producing the same and immune adjuvant using the same
US6248329B1 (en) * 1998-06-01 2001-06-19 Ramaswamy Chandrashekar Parasitic helminth cuticlin nucleic acid molecules and uses thereof
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
CA2334960C (en) 1998-06-10 2012-01-03 Biognostik Gesellschaft Fur Biomolekulare Diagnostik Mbh Combination of tgf-.beta. inhibition and immune stimulation to treat hyperproliferative diseases
WO1999066947A1 (en) * 1998-06-23 1999-12-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Adjuvant therapy
US20030022854A1 (en) * 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US20040247662A1 (en) 1998-06-25 2004-12-09 Dow Steven W. Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
US6693086B1 (en) * 1998-06-25 2004-02-17 National Jewish Medical And Research Center Systemic immune activation method using nucleic acid-lipid complexes
DE69906977T2 (de) 1998-07-20 2004-05-19 Protiva Biotherapeutics Inc., Burnaby In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe
EP1100807A1 (de) 1998-07-27 2001-05-23 University Of Iowa Research Foundation Stereoisomere von cpg oligonukleotiden und verwandte verfahren
GB9817052D0 (en) 1998-08-05 1998-09-30 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP0979869A1 (de) 1998-08-07 2000-02-16 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Kurze Oligonukleotide zur Hemmung von VEGF-Expression
US20010034330A1 (en) 1998-08-10 2001-10-25 Charlotte Kensil Innate immunity-stimulating compositions of CpG and saponin and methods thereof
DK1104306T3 (da) * 1998-08-10 2006-05-22 Antigenics Inc Præparater af CpG- og saponinadjuvanser og fremgangsmåder til anvendelse deraf
HUP0103694A3 (en) * 1998-08-20 2003-12-29 Du Pont Genes for plant fatty acid modifiyng enzymes associated with conjugated double bond formation
WO2000014217A2 (en) 1998-09-03 2000-03-16 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
US20020065236A1 (en) * 1998-09-09 2002-05-30 Yew Nelson S. CpG reduced plasmids and viral vectors
FR2783170B1 (fr) * 1998-09-11 2004-07-16 Pasteur Merieux Serums Vacc Emulsion immunostimulante
CA2343052A1 (en) 1998-09-18 2000-03-30 Dynavax Technologies Corporation Methods of treating ige-associated disorders and compositions for use therein
EP1671646A3 (de) 1998-09-18 2007-08-29 Dynavax Technologies Corporation Verfahren zur Behandlung von IgE- assoziierten Krankheiten und Zusammensetzungen zur Verwendung in diesen Verfahren
JP2002526425A (ja) 1998-10-05 2002-08-20 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 粘膜免疫を刺激するための方法およびアジュバント
WO2000021556A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Dynavax Technologies Corporation Anti hiv compositions comprising immunostimulatory polynucleotides and hiv antigens
EP1588714A2 (de) 1998-10-16 2005-10-26 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Adjuvanzsysteme und Impfstoffe
AUPP807399A0 (en) 1999-01-08 1999-02-04 Csl Limited Improved immunogenic lhrh composition and methods relating thereto
US6887464B1 (en) * 1999-02-02 2005-05-03 Biocache Pharmaceuticals, Inc. Advanced antigen presentation platform
AU2977500A (en) 1999-02-02 2000-08-25 Biocache Pharmaceuticals, Llc Advanced antigen presentation platform
AU2870300A (en) 1999-02-05 2000-08-25 Genzyme Corporation Use of cationic lipids to generate anti-tumor immunity
US6207819B1 (en) 1999-02-12 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds, processes and intermediates for synthesis of mixed backbone oligomeric compounds
WO2000054803A2 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
FR2790955B1 (fr) 1999-03-19 2003-01-17 Assist Publ Hopitaux De Paris Utilisation d'oligonucleotides stabilises comme principe actif antitumoral
PL355178A1 (en) 1999-03-19 2004-04-05 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine
US6625426B2 (en) * 1999-03-22 2003-09-23 Ronald Baratono Combined rear view mirror and telephone
EP1176966B1 (de) * 1999-04-12 2013-04-03 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Oligodeoxynukleotide und deren verwendung zur induktion einer immunreaktion
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
WO2000062787A1 (en) 1999-04-15 2000-10-26 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for use in potentiating antigen presentation by antigen presenting cells
US6558670B1 (en) * 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
CZ303515B6 (cs) 1999-04-19 2012-11-07 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Adjuvantní prostredek
EP1177439B1 (de) 1999-04-29 2004-09-08 Coley Pharmaceutical GmbH Screening nach modulatoren der funktion von immunstimulatorischer dna
AU4992900A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Immune Response Corporation, The Hiv immunogenic compositions and methods
US6737066B1 (en) * 1999-05-06 2004-05-18 The Immune Response Corporation HIV immunogenic compositions and methods
AU776268B2 (en) 1999-06-08 2004-09-02 Aventis Pasteur Immunostimulant oligonucleotide
EP1377554A1 (de) 1999-06-16 2004-01-07 University Of Iowa Research Foundation Antagonismus der immunostimulatorischen cpg-oligonukleotiden durch 4-aminochinolinen und sonstigen schwachen basen
US20050002958A1 (en) * 1999-06-29 2005-01-06 Smithkline Beecham Biologicals Sa Vaccines
ES2250151T3 (es) 1999-06-29 2006-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Uso de cpg como adyuvante de vacuna contra vih.
GB9915204D0 (en) 1999-06-29 1999-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6514948B1 (en) * 1999-07-02 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Method for enhancing an immune response
FR2795963A1 (fr) * 1999-07-08 2001-01-12 Pasteur Merieux Serums Vacc Polynucleotide immunostimulant
DE19935756A1 (de) * 1999-07-27 2001-02-08 Mologen Forschungs Entwicklung Kovalent geschlossenes Nukleinsäuremolekül zur Immunstimulation
MXPA02001610A (es) 1999-08-13 2003-07-21 Hybridon Inc Modulacion de estimulacion inmune mediada por oligonucleotido cpg mediante la modificacion posicional de nucleosidos.
EP1204425B1 (de) 1999-08-19 2009-01-07 Dynavax Technologies Corporation Methode zur modulierung eines immunantwortes mit immunstimulierenden sequencen und zusammensetzungen dafür
US20050249794A1 (en) 1999-08-27 2005-11-10 Semple Sean C Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
US6395678B1 (en) * 1999-09-01 2002-05-28 Aero-Terra-Aqua Technologies Corporation Bead and process for removing dissolved metal contaminants
GB9921147D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
GB9921146D0 (en) 1999-09-07 1999-11-10 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
SK287400B6 (sk) * 1999-09-25 2010-08-09 University Of Iowa Research Foundation Prostriedok s obsahom imunostimulačnej nukleovej kyseliny a jeho použitie na stimuláciu imunitnej reakcie
ES2265980T5 (es) * 1999-09-27 2010-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Metodos relacionados con interferón inducido por ácidos nucleicos inmunoestimuladores.
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
JP2003512826A (ja) * 1999-10-27 2003-04-08 カイロン コーポレイション Ｈｃｖ特異的ｔ細胞の活性化
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
WO2001037869A1 (en) 1999-11-19 2001-05-31 Csl Limited Vaccine compositions
US20010031262A1 (en) * 1999-12-06 2001-10-18 Michael Caplan Controlled delivery of antigens
WO2001045750A1 (en) 1999-12-21 2001-06-28 The Regents Of The University Of California Method for preventing an anaphylactic reaction
AU781812B2 (en) 2000-01-13 2005-06-16 Antigenics, Inc. Innate immunity-stimulating compositions of CPG and saponin and methods thereof
EP1322655B1 (de) * 2000-01-14 2007-11-14 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Oligodeoxynukleotide und ihre verwendung zur induktion einer immunreaktion
WO2001095935A1 (en) * 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
US6852705B2 (en) 2000-01-21 2005-02-08 Merial DNA vaccines for farm animals, in particular bovines and porcines
US6815429B2 (en) 2000-01-26 2004-11-09 Hybridon, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
AT409085B (de) 2000-01-28 2002-05-27 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung zur immunmodulation und herstellung von vakzinen
WO2001055341A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 The Regents Of The University Of California Immunomodulatory polynucleotides in treatment of an infection by an intracellular pathogen
MXPA02007413A (es) 2000-01-31 2004-07-30 Smithkline Beecham Biolog Vacuna para la inmunizacion profilactica o terapeutica contra el vih.
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
FR2805265B1 (fr) 2000-02-18 2002-04-12 Aventis Pasteur Oligonucleotides immunostimulants
US20030130217A1 (en) * 2000-02-23 2003-07-10 Eyal Raz Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation
AU2001241751B2 (en) * 2000-02-23 2005-09-01 Tel Aviv Sourasky Medical Center Method for treating inflammatory bowel disease and other forms of gastrointestinal inflammation
JP2003523398A (ja) 2000-02-24 2003-08-05 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 樹状細胞のインビボ活性化によるアジュバント治療
US20020156033A1 (en) * 2000-03-03 2002-10-24 Bratzler Robert L. Immunostimulatory nucleic acids and cancer medicament combination therapy for the treatment of cancer
US20040131628A1 (en) * 2000-03-08 2004-07-08 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the treatment of disorders associated with microorganisms
US7157437B2 (en) * 2000-03-10 2007-01-02 Dynavax Technologies Corporation Methods of ameliorating symptoms of herpes infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20020098199A1 (en) * 2000-03-10 2002-07-25 Gary Van Nest Methods of suppressing hepatitis virus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20020107212A1 (en) 2000-03-10 2002-08-08 Nest Gary Van Methods of reducing papillomavirus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20020028784A1 (en) * 2000-03-10 2002-03-07 Nest Gary Van Methods of preventing and treating viral infections using immunomodulatory polynucleotide sequences
US7129222B2 (en) * 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US6851845B2 (en) * 2000-03-10 2005-02-08 The Maitland Company, Inc. Method and apparatus for processing waste material
US20010046967A1 (en) 2000-03-10 2001-11-29 Gary Van Nest Methods of preventing and treating respiratory viral infection using immunomodulatory polynucleotide
AU2001249609A1 (en) 2000-03-28 2001-10-08 Department Of Veterans Affairs Methods for increasing a cytotoxic T lymphocyte response in vivo
US8246945B2 (en) * 2000-04-06 2012-08-21 University Of Arkansas Methods and reagents for decreasing clinical reaction to allergy
AU2001251407A1 (en) 2000-04-07 2001-10-23 The Regents Of The University Of California Synergistic improvements to polynucleotide vaccines
US7524826B2 (en) 2000-04-14 2009-04-28 Mcmaster University And Hamilton Health Sciences Corporation Method of inhibiting the generation of active thrombin on the surface of a cell within an atherosclerotic plaque
US6321873B1 (en) * 2000-04-21 2001-11-27 Tra-Lor-Mate, Inc. Ladder mounting system
PT1278761E (pt) 2000-05-01 2005-08-31 Hybridon Inc Modulacao da estimulacao imunitaria mediada por oligonucleotidos de cpg, por modificacao posicional de nucleosidos
WO2001085910A2 (en) * 2000-05-05 2001-11-15 The Regents Of The University Of California Agents that modulate dna-pk activity and methods of use thereof
WO2001085751A1 (en) 2000-05-09 2001-11-15 Reliable Biopharmaceutical, Inc. Polymeric compounds useful as prodrugs
WO2001087270A2 (en) * 2000-05-12 2001-11-22 Pharmacia & Upjohn Company Vaccine composition, method of preparing the same, and method of vaccinating vertebrates
GB0011903D0 (en) * 2000-05-18 2000-07-05 Astrazeneca Ab Combination chemotherapy
US6339630B1 (en) * 2000-05-18 2002-01-15 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Sealed drive screw operator
US20040052763A1 (en) * 2000-06-07 2004-03-18 Mond James J. Immunostimulatory RNA/DNA hybrid molecules
ES2332444T3 (es) * 2000-06-22 2010-02-05 University Of Iowa Research Foundation Combinacion de cpg y anticuerpos dirigidos contra cd19, cd20, cd22 o cd40 para el tratamiento o prevencion de cancer.
US20020165178A1 (en) * 2000-06-28 2002-11-07 Christian Schetter Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of anemia, thrombocytopenia, and neutropenia
BRPI0112928B1 (pt) 2000-07-27 2017-08-29 Children's Hospital & Research Center At Oakland A composition comprising preparations comprising outer membrane vesicles (OMV), microvesicles (MV) or both MVO and MV
AU8640501A (en) 2000-07-31 2002-02-13 Univ Yale Innate immune system-directed vaccines
US20020198165A1 (en) * 2000-08-01 2002-12-26 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of gastric ulcers
JP2004516821A (ja) 2000-09-01 2004-06-10 エピゲノミクス アーゲー ゲノムＤＮＡ上の、配列コンテクスト５−ＣｐＧ−３内の特定シトシンのメチル化度の定量方法
US20050064401A1 (en) * 2000-09-01 2005-03-24 Alexander Olek Diagnosis of illnesses or predisposition to certain illnesses
US20020091097A1 (en) * 2000-09-07 2002-07-11 Bratzler Robert L. Nucleic acids for the prevention and treatment of sexually transmitted diseases
WO2002022809A2 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Coley Pharmaceutical Gmbh PROCESS FOR HIGH THROUGHPUT SCREENING OF CpG-BASED IMMUNO-AGONIST/ANTAGONIST
GB0023008D0 (en) 2000-09-20 2000-11-01 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
US6787524B2 (en) * 2000-09-22 2004-09-07 Tanox, Inc. CpG oligonucleotides and related compounds for enhancing ADCC induced by anti-IgE antibodies
EP1322656B1 (de) 2000-09-26 2008-01-16 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation der immunostimulatorischen aktivität von immunostimulierenden oligonukleotidanaloga durch positionelle chemische veränderungen
SE0003538D0 (sv) * 2000-09-29 2000-09-29 Isconova Ab New immunogenic complex
US7537772B1 (en) * 2000-10-02 2009-05-26 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, gene sequence and the uses thereof
FR2814958B1 (fr) 2000-10-06 2003-03-07 Aventis Pasteur Composition vaccinale
ES2392943T3 (es) * 2000-10-18 2012-12-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vacunas antitumorales
GB0025577D0 (en) * 2000-10-18 2000-12-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1330520A2 (de) 2000-11-02 2003-07-30 Inex Pharmaceuticals Corp. Therapeutische oligonukleotide mit reduzierter toxizität
ATE398175T1 (de) * 2000-12-08 2008-07-15 Coley Pharmaceuticals Gmbh Cpg-artige nukleinsäuren und verfahren zu ihrer verwendung
AU3249802A (en) * 2000-12-08 2002-06-18 3M Innovative Properties Co Screening method for identifying compounds that selectively induce interferon alpha
US20030055014A1 (en) * 2000-12-14 2003-03-20 Bratzler Robert L. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
KR100881923B1 (ko) * 2000-12-27 2009-02-04 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 그것의 사용 방법
US7337306B2 (en) * 2000-12-29 2008-02-26 Stmicroelectronics, Inc. Executing conditional branch instructions in a data processor having a clustered architecture
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
US7713942B2 (en) 2001-04-04 2010-05-11 Nordic Vaccine Technology A/S Cage-like microparticle complexes comprising sterols and saponins for delivery of polynucleotides
US7105495B2 (en) 2001-04-30 2006-09-12 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US7176296B2 (en) 2001-04-30 2007-02-13 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of oligonucleotide CpG-mediated immune stimulation by positional modification of nucleosides
US20030129605A1 (en) 2001-05-04 2003-07-10 Dong Yu Immunostimulatory activity of CpG oligonucleotides containing non-ionic methylphosophonate linkages
WO2004030608A2 (en) * 2001-06-05 2004-04-15 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
JP2005509591A (ja) 2001-06-15 2005-04-14 リバファーム・インコーポレイテッド ヌクレオシドワクチンアジュバント
US7785610B2 (en) 2001-06-21 2010-08-31 Dynavax Technologies Corporation Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same—III
US20040132677A1 (en) 2001-06-21 2004-07-08 Fearon Karen L. Chimeric immunomodulatory compounds and methods of using the same-IV
CN100334228C (zh) 2001-06-21 2007-08-29 戴纳瓦克斯技术公司 嵌合免疫调制化合物及其使用方法
WO2003000232A2 (en) 2001-06-25 2003-01-03 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method for preparation of vesicles loaded with immunostimulator y oligodeoxynucleotides
US20030003970A1 (en) 2001-06-28 2003-01-02 Alan Johnson Portable communications device
CZ20033515A3 (cs) 2001-06-29 2005-01-12 Chiron Corporation Kompozice vakcíny HCV E1E2
US6982033B2 (en) * 2001-07-13 2006-01-03 Donald Hubbard H Aerobic treatment plant with filter pipe
WO2003040308A2 (en) 2001-07-27 2003-05-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver cpg oligonucleotides in vivo
US7666674B2 (en) 2001-07-27 2010-02-23 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver CPG oligonucleotides in vivo
US20030148316A1 (en) * 2001-08-01 2003-08-07 Lipford Grayson B. Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
US20030133988A1 (en) * 2001-08-07 2003-07-17 Fearon Karen L. Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
EP1414490A1 (de) 2001-08-10 2004-05-06 Dynavax Technologies Corporation Immunmodulatorische zusammensetzungen und verfahren zur ihre anwendung
US7354909B2 (en) * 2001-08-14 2008-04-08 The United States Of America As Represented By Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method for rapid generation of mature dendritic cells
ATE411054T1 (de) * 2001-08-17 2008-10-15 Coley Pharm Gmbh Kombinations-motif-immunstimulierende oligonukleotide mit verbesserter wirkung
CA2458876A1 (en) 2001-08-30 2003-03-13 3M Innovative Properties Company Methods of maturing plasmacytoid dendritic cells using immune response modifier molecules
US7514414B2 (en) * 2001-09-24 2009-04-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Suppressors of CpG oligonucleotides and methods of use
US20030119774A1 (en) 2001-09-25 2003-06-26 Marianna Foldvari Compositions and methods for stimulating an immune response
CA2461877A1 (en) 2001-09-28 2003-04-10 Purdue Research Foundation Method of treatment using ligand-immunogen conjugates
WO2003031573A2 (en) * 2001-10-05 2003-04-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 3 signaling agonists and antagonists
CN100438908C (zh) 2001-10-06 2008-12-03 梅瑞尔有限公司 CpG制剂及相关方法
DK1455593T3 (da) 2001-10-06 2013-08-26 Merial Ltd Fremgangsmåder og sammensætninger til fremme af vækst og medfødt immunitet hos unge dyr
US20030139364A1 (en) * 2001-10-12 2003-07-24 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for enhancing immune responses using imidazoquinoline compounds
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
US7276489B2 (en) * 2002-10-24 2007-10-02 Idera Pharmaceuticals, Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5′ ends
WO2003039595A2 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Mucosal adjuvants comprising an oligonucleotide and a cationic lipid
ATE416771T1 (de) 2001-11-16 2008-12-15 3M Innovative Properties Co N-ä4-(4-amino-2-ethyl-1h-imidazoä4,5-cüchinolin 1-yl)butylümethanesulfonamide, diese enthaltende pharmazeutische zusammensetzung und deren verwendung
TW200303759A (en) * 2001-11-27 2003-09-16 Schering Corp Methods for treating cancer
EP1455833A1 (de) * 2001-12-04 2004-09-15 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH &amp; HUMAN SERVICES Chimäre moleküle für die behandlung von th2-ähnlichen vermittelten krankheiten
DE10161755B4 (de) * 2001-12-15 2005-12-15 Infineon Technologies Ag Kontaktstift zum Testen mikroelektronischer Bauteile mit kugelförmigen Kontakten
AU2002366710A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
US8466116B2 (en) * 2001-12-20 2013-06-18 The Unites States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of CpG oligodeoxynucleotides to induce epithelial cell growth
JP5153990B2 (ja) 2001-12-21 2013-02-27 シーエスエル、リミテッド 免疫反応性試薬およびサポニンを含有する組成物、およびその使用方法
JP2005526497A (ja) 2002-02-04 2005-09-08 ビオミラ，インコーポレーテッド 免疫刺激性、共有結合性脂質化オリゴヌクレオチド
US8088388B2 (en) 2002-02-14 2012-01-03 United Biomedical, Inc. Stabilized synthetic immunogen delivery system
US20030232443A1 (en) 2002-06-18 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of centromere protein B expression
EP1499187B1 (de) 2002-04-04 2015-06-17 Zoetis Belgium S.A. Immunostimulatorische g,u-haltige oligoribonucleotide
JP2005535575A (ja) * 2002-04-11 2005-11-24 ザイモジェネティクス インコーポレイティッド 卵巣癌を治療するためのインターロイキン−２４の使用法
JP2006515266A (ja) * 2002-04-22 2006-05-25 バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド オリゴヌクレオチド組成物および免疫応答の調節のためのそれらの使用
US6948271B2 (en) * 2002-05-06 2005-09-27 Innovative Supply, Inc. Identification and tracking system for deceased bodies
AU2003267104A1 (en) * 2002-05-08 2003-11-11 Dana Corporation Plasma-assisted processing in a manufacturing line
EP1505942B1 (de) 2002-05-10 2008-08-13 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Pathogene impstoffe und verfahren zur deren verwendung
US20040009944A1 (en) 2002-05-10 2004-01-15 Inex Pharmaceuticals Corporation Methylated immunostimulatory oligonucleotides and methods of using the same
DE60324270D1 (de) 2002-05-10 2008-12-04 Tekmira Pharmaceuticals Corp Methylierte immunstimulierende oligodeoxynukleotide und verfahren zu deren verwendung
EP1507850A1 (de) 2002-05-28 2005-02-23 MERCK PATENT GmbH Verfahren zur erzeugung antigenpräsentierender zellen
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
WO2003103586A2 (en) * 2002-06-05 2003-12-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Method for treating autoimmune or inflammatory diseases with combinations of inhibitory oligonucleotides and small molecule antagonists of immunostimulatory cpg nucleic acids
US7605138B2 (en) 2002-07-03 2009-10-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040053880A1 (en) * 2002-07-03 2004-03-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US20040013688A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-22 Cambridge Scientific, Inc. Vaccines to induce mucosal immunity
US7807803B2 (en) * 2002-07-03 2010-10-05 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7569553B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-04 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
US7576066B2 (en) * 2002-07-03 2009-08-18 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid compositions for stimulating immune responses
WO2004007743A2 (en) 2002-07-17 2004-01-22 Coley Pharmaceutical Gmbh Use of cpg nucleic acids in prion-disease
CN1468957A (zh) 2002-07-19 2004-01-21 中国人民解放军第二军医大学 一种用作人用治疗性疫苗佐剂的质粒
US20050209183A1 (en) 2002-07-25 2005-09-22 Phenion Gmbh & Co. Kg Cosmetic or pharmaceutical preparations comprising nucleic acids based on non-methylated CPG motifs
EP1393745A1 (de) 2002-07-29 2004-03-03 Hybridon, Inc. Modulierung der immunstimulierenden Eigenschaften von Oligonukleotiden und Analoga durch optimale Darstellung der 5'-Enden
EP1575504A4 (de) * 2002-08-01 2009-11-04 Us Gov Health & Human Serv Verfahren zur behandlung von entzündlichen arthropathien mit suppressoren der cpg-oligonucleotide
JP2006505523A (ja) 2002-08-12 2006-02-16 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 免疫調節組成物、その製造方法および使用方法
AR040996A1 (es) * 2002-08-19 2005-04-27 Coley Pharm Group Inc Acidos nucleicos inmunoestimuladores
US6928476B2 (en) * 2002-08-23 2005-08-09 Mirra, Inc. Peer to peer remote data storage and collaboration
US6744084B2 (en) * 2002-08-29 2004-06-01 Micro Technology, Inc. Two-transistor pixel with buried reset channel and method of formation
US7186700B2 (en) * 2002-09-13 2007-03-06 Idenix Pharmaceuticals, Inc. β-L-2′-deoxynucleosides for the treatment of resistant HBV strains and combination therapies
US8263091B2 (en) * 2002-09-18 2012-09-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating and preventing infections in immunocompromised subjects with immunostimulatory CpG oligonucleotides
US6994870B2 (en) * 2002-09-18 2006-02-07 Jaw-Ji Tsai Local nasal immunotherapy with allergen strip for allergic rhinitis
WO2004026888A2 (en) 2002-09-19 2004-04-01 Coley Pharmaceutical Gmbh Toll-like receptor 9 (tlr9) from various mammalian species
US6988995B2 (en) * 2002-09-30 2006-01-24 Carl Zeiss Meditec, Inc. Method and system for detecting the effects of Alzheimer's disease in the human retina
US8043622B2 (en) * 2002-10-08 2011-10-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of treating inflammatory lung disease with suppressors of CpG oligonucleotides
BR0315810A (pt) * 2002-10-29 2005-09-13 Coley Pharmaceutical Group Ltd Uso de oligonucleotìdeos cpg no tratamento de infecção por vìrus da hepatite c
CA2504493C (en) * 2002-11-01 2015-12-29 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Method of preventing infections from bioterrorism agents with immunostimulatory cpg oligonucleotides
AU2003287332A1 (en) 2002-11-01 2004-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of treating pulmonary fibrotic disorders
CA2502015A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
KR100525321B1 (ko) 2002-12-13 2005-11-02 안웅식 파필로마바이러스 항원 단백질 및ＣｐＧ-올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하는파필로마바이러스 유발 질환의 예방 또는 치료용 약제학적조성물
NZ541027A (en) 2002-12-23 2008-04-30 Dynavax Tech Corp Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
JP2006516099A (ja) 2002-12-23 2006-06-22 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション 分枝状の免疫調節化合物及び該化合物の使用方法
MXPA05007652A (es) 2003-01-16 2006-02-22 Hybridon Inc Modulacion de propiedades inmunoestimulantes de compuestos basados en oligonucleotido mediante la utilizacion de dinucleotidos inmunoestimulantes modificados.
US7189781B2 (en) * 2003-03-13 2007-03-13 H.B. Fuller Licensing & Finance Inc. Moisture curable, radiation curable sealant composition
WO2004084937A1 (en) 2003-03-24 2004-10-07 Intercell Ag Use of alum and a th1 immune response inducing adjuvant for enhancing immune responses
AU2004224762B2 (en) 2003-03-26 2009-12-24 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
CA2521050A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-14 Coley Pharmaceutical Group, Ltd. Immunostimulatory nucleic acid oil-in-water formulations and related methods of use
WO2005016235A2 (en) * 2003-04-14 2005-02-24 The Regents Of The University Of California Combined use of impdh inhibitors with toll-like receptor agonists
WO2004094671A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and products for identification and assessment of tlr ligands
JP3887346B2 (ja) * 2003-04-28 2007-02-28 株式会社東芝 映像信号処理装置及び映像信号処理方法、映像表示装置
WO2004103301A2 (en) 2003-05-16 2004-12-02 Hybridon, Inc. Synergistic treatment of cancer using immunomers in conjunction with chemotherapeutic agents
EP1484336A1 (de) * 2003-06-02 2004-12-08 Pevion Biotech Ltd. Methode zur Herstellung von konformationseingeschränkten Peptiden, Peptidomimetika und deren Verwendung als synthetische Vaccine
MXPA05013658A (es) 2003-06-11 2006-03-02 Hybridon Inc Oligonucleotidos inmunomoduladores estabilizados.
US20070270337A1 (en) * 2003-06-13 2007-11-22 Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Th1-Mediated Immune Diseases
US20050079152A1 (en) * 2003-06-17 2005-04-14 Bot Adrian Ian Methods of elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes
JP2007524615A (ja) 2003-06-20 2007-08-30 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー 低分子トール様レセプター（ｔｌｒ）アンタゴニスト
US20040265833A1 (en) 2003-06-23 2004-12-30 Cathy Lofton-Day Methods and nucleic acids for the analysis of colorectal cell proliferative disorders
JP2009513532A (ja) 2003-07-10 2009-04-02 サイトス バイオテクノロジー アーゲー パッケージ化ウイルス様粒子
PL1648502T3 (pl) 2003-07-11 2011-05-31 Intercell Ag Szczepionki przeciwko HCV
US20050013812A1 (en) * 2003-07-14 2005-01-20 Dow Steven W. Vaccines using pattern recognition receptor-ligand:lipid complexes
MXPA06000619A (es) 2003-07-15 2006-04-11 Hybridon Inc Estimulacion sinergistica del sistema inmune usando oligonucleotidos inmunoestimuladores y/o compuestos inmunomeros en conjunto con citocinas y/o agentes quimioterapeuticos o terapia de radiacion.
US20060182793A1 (en) * 2003-07-22 2006-08-17 Cytos Biotechnology Ag Cpg-packaged liposomes
US20070253979A1 (en) 2003-08-28 2007-11-01 Moss Ronald B Immunogenic Hiv Compositions and Related Methods
NZ545536A (en) * 2003-09-05 2010-04-30 Anadys Pharmaceuticals Inc TLR7 ligands for the treatment of hepatitis C
US20070110714A1 (en) 2003-09-08 2007-05-17 Norio Hayashi Medicinal composition for treatment of chronic hepatitis c
GB0321615D0 (en) * 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
WO2005027920A1 (en) * 2003-09-19 2005-03-31 Pfizer Products Inc. 2-alkylidene-19-nor-vitamin d derivatives for the treatment of rickets or vitamin d deficiency
EP1663316A2 (de) 2003-09-25 2006-06-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleinsäure-lipophile konjugate
WO2005034979A2 (en) 2003-10-11 2005-04-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Methods and compositions for enhancing innate immunity and antibody dependent cellular cytotoxicity
US20050087538A1 (en) * 2003-10-23 2005-04-28 Wolfe Darrell R. Iceless multiple can cooler
US20050215501A1 (en) 2003-10-24 2005-09-29 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods and products for enhancing epitope spreading
UA88457C2 (ru) 2003-10-30 2009-10-26 Коли Фармасьютикал Гмбх Иммуностимулирующая нуклеиновая кислота с улучшенной иммуностимулирующей эффективностью
US20050239733A1 (en) 2003-10-31 2005-10-27 Coley Pharmaceutical Gmbh Sequence requirements for inhibitory oligonucleotides
US20050100983A1 (en) * 2003-11-06 2005-05-12 Coley Pharmaceutical Gmbh Cell-free methods for identifying compounds that affect toll-like receptor 9 (TLR9) signaling
JP4088246B2 (ja) * 2003-12-05 2008-05-21 富士通株式会社 リングネットワークのマスタ設定方法及び装置
EP2060269A3 (de) 2003-12-08 2009-08-19 Hybridon, Inc. Modulation der immunstimulatorischen Eigenschaften mittels kleiner oligonukleotidbasierter Verbindungen
US9090673B2 (en) 2003-12-12 2015-07-28 City Of Hope Synthetic conjugate of CpG DNA and T-help/CTL peptide
US20070172315A1 (en) * 2003-12-18 2007-07-26 Barrett Robert K Method and Apparatus for Creating Soil or Rock Subsurface Support
EP1550458A1 (de) 2003-12-23 2005-07-06 Vectron Therapeutics AG Synergisitische liposomale Adjuvantien
KR100558851B1 (ko) 2004-01-08 2006-03-10 학교법인연세대학교 면역조절능력이 증가된 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드변형체
US20080146488A1 (en) * 2004-02-06 2008-06-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Complexed Polypeptide and Adjuvant for Improved Vaccines
US20050181035A1 (en) 2004-02-17 2005-08-18 Dow Steven W. Systemic immune activation method using non CpG nucleic acids
AU2005230938A1 (en) 2004-02-19 2005-10-20 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides
WO2005080567A1 (de) 2004-02-20 2005-09-01 Mologen Ag Substituiertes, nicht-kodierendes nukleinsäuremolekül zur therapeutischen und prophylaktischen immunstimulation in menschen und höheren tieren
WO2005089231A2 (en) 2004-03-12 2005-09-29 Hybridon, Inc. Enhanced activity of hiv vaccine using a second generation immunomodulatory oligonucleotide
WO2005111057A2 (en) * 2004-04-02 2005-11-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing il-10 responses
US7303881B2 (en) * 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
WO2005115449A1 (en) * 2004-05-28 2005-12-08 Alk-Abelló A/S Method of treating allergy and infection by eliciting an iga antibody response
US8399025B2 (en) * 2004-06-04 2013-03-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyamine modified particles
WO2006080946A2 (en) 2004-06-08 2006-08-03 Coley Pharmaceutical Gmbh Abasic oligonucleotide as carrier platform for antigen and immunostimulatory agonist and antagonist
US7756043B1 (en) * 2004-06-09 2010-07-13 Sprint Communications Company L.P. Method for identifying high traffic origin-destination node pairs in a packet based network
US7427405B2 (en) 2004-06-15 2008-09-23 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory oligonucleotide multimers
KR20070028537A (ko) * 2004-06-15 2007-03-12 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 면역자극 올리고누클레오티드 다량체
EP1766610A1 (de) * 2004-06-25 2007-03-28 TC Electronic A/S Verfahren zur bewertung der wahrnehmungsintensität eines audiosignals und verfahren zur steuerung eines audioeingangssignals auf der basis der bewertung
US7534449B2 (en) * 2004-07-01 2009-05-19 Yale University Targeted and high density drug loaded polymeric materials
EP2484374A1 (de) 2004-07-18 2012-08-08 CSL Limited Immunstimulierender Komplex und Oligonucleotidformulierungen zur Induzierung verbesserter Interferon-Gamma-Antworten
JP2008506683A (ja) * 2004-07-18 2008-03-06 コーリー ファーマシューティカル グループ， リミテッド 先天免疫応答を誘導するための方法および組成物
WO2006015560A1 (de) 2004-08-09 2006-02-16 Mologen Ag Immunmodulierendes mittel in verbindung mit chemotherapeutischen massnahmen
US20060058261A1 (en) * 2004-09-15 2006-03-16 Andre Aube Chitin derivatives for hyperlipidemia
MY159370A (en) 2004-10-20 2016-12-30 Coley Pharm Group Inc Semi-soft-class immunostimulatory oligonucleotides
KR100721928B1 (ko) * 2004-11-05 2007-05-28 주식회사 바이오씨에스 ＣｐＧ 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유하는 피부질환의치료 또는 예방용 약학적 조성물
US20060105979A1 (en) 2004-11-08 2006-05-18 Hybridon, Inc. Synergistic inhibition of VEGF and modulation of the immune response
WO2006072251A1 (en) 2005-01-07 2006-07-13 Alk-Abellò A/S Method of preventive treatment of allergy by oromucosal administration of an allergy vaccine
CA2598992A1 (en) * 2005-02-24 2006-08-31 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory oligonucleotides
KR20080008350A (ko) 2005-04-08 2008-01-23 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 감염성 질환에 의해 악화된 천식의 치료 방법
US20060241076A1 (en) 2005-04-26 2006-10-26 Coley Pharmaceutical Gmbh Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity
US7325152B2 (en) * 2005-06-30 2008-01-29 Infineon Technologies Ag Synchronous signal generator
EA200800268A1 (ru) * 2005-07-07 2008-06-30 Коли Фармасьютикал Груп, Инк. КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ АНТИТЕЛОМ ПРОТИВ CTLA-4 И СОДЕРЖАЩИМ CpG-МОТИВ СИНТЕТИЧЕСКИМ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ
AU2006284889B2 (en) * 2005-08-31 2011-08-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods of altering an immune response induced by CpG oligodeoxynucleotides
WO2007088423A2 (en) 2005-09-16 2007-08-09 Coley Pharmaceutical Gmbh Immunostimulatory single-stranded ribonucleic acid with phosphodiester backbone
BRPI0616069A2 (pt) 2005-09-16 2011-06-07 Coley Pharm Gmbh modulação de propriedades imunomoduladoras de ácido ribonucléico interferente pequeno (sirna) através de modificação de nucleotìdeo
EP1928500A2 (de) 2005-09-27 2008-06-11 Coley Pharmaceutical GmbH Modulation von tlr-vermittelten immunantworten mit adapter-oligonukleotiden
EA200801045A1 (ru) * 2005-10-12 2008-10-30 Кэнсер Рисерч Текнолоджи Лтд. Способы и композиции для лечения иммунных нарушений
US20070093439A1 (en) 2005-10-25 2007-04-26 Idera Pharmaceuticals, Inc. Short immunomodulatory oligonucleotides
US20070243209A1 (en) * 2005-10-28 2007-10-18 Health Research, Inc. Compositions and methods for prevention and treatment of fungal diseases
WO2007050034A1 (en) * 2005-10-28 2007-05-03 Index Pharmaceuticals Ab Composition and method for the prevention, treatment and/or alleviation of an inflammatory disease
EP1951299B1 (de) 2005-11-04 2012-01-04 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Grippeimpfstoffe mit kombinationen aus teilchenförmigen adjuvantien und immunverstärkern
JP2009514839A (ja) 2005-11-04 2009-04-09 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル サイトカイン誘導剤を含むアジュバントインフルエンザワクチン
US7776834B2 (en) 2005-11-07 2010-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
JP5184366B2 (ja) 2005-11-07 2013-04-17 イデラ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 修飾された免疫刺激性ジヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドに基づく化合物の免疫刺激特性
US7470674B2 (en) 2005-11-07 2008-12-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds comprising modified immunostimulatory dinucleotides
MX2008006004A (es) 2005-11-07 2008-10-01 Idera Pharmaceuticals Inc Propiedades inmunoestimuladoras de compuestos a base de oligonucleotidos que comprenden dinucleotidos inmunoestimuladores modificados.
BRPI0618857B1 (pt) * 2005-11-25 2022-07-19 Zoetis Belgium S.A Oligonucleotídeo de rna isolado, e método para regular negativamente células reguladoras cd4+ imunossupressoras
CN101379195B (zh) 2005-12-20 2012-05-09 艾德拉药物股份有限公司 含有不同长度回文片段的回文免疫调节性寡核苷酸(imotm)的免疫刺激活性
ES2526879T3 (es) * 2006-02-15 2015-01-16 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Composiciones y procedimientos para formulaciones de oligonucleótidos
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
US20090081156A1 (en) * 2006-08-03 2009-03-26 William Soo Hoo Bioactive molecular matrix and methods of use in the treatment of disease
US20080124366A1 (en) * 2006-08-06 2008-05-29 Ohlfest John R Methods and Compositions for Treating Tumors
EP2056880A4 (de) * 2006-08-16 2010-10-13 Protiva Biotherapeutics Inc Nukleinsäuremodulation der durch den toll-artigen rezeptor vermittelten immunstimulation
US8027888B2 (en) 2006-08-31 2011-09-27 Experian Interactive Innovation Center, Llc Online credit card prescreen systems and methods
WO2008033432A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides
US20090181078A1 (en) * 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
PT2068918E (pt) * 2006-09-26 2012-08-06 Infectious Disease Res Inst Composição para vacina contendo adjuvante sintético
KR20090057468A (ko) 2006-09-27 2009-06-05 콜레이 파마시티컬 그룹, 인코포레이티드 톨-유사 수용체(ｔｌｒ) 리간드 및 항바이러스제의 조성물
KR101251707B1 (ko) 2006-09-27 2013-04-11 콜리 파마슈티칼 게엠베하 면역 자극 활성이 증강된 소수성 Ｔ 유사체를 함유하는 ＣｐＧ 올리고뉴클레오티드 유사체
EP2104738A2 (de) * 2006-10-26 2009-09-30 Coley Pharmaceuticals GmbH Oligoribonukleotide und ihre verwendung
WO2008057529A2 (en) * 2006-11-06 2008-05-15 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Peptide-based vaccine compositions to endogenous cholesteryl ester transfer protein (cetp)
BRPI0718360A2 (pt) * 2006-12-04 2013-11-12 Univ Illinois "composições e métodos para o tratamento do câncer com cupredoxinas e dna rico em cpg"
US8057804B2 (en) * 2006-12-28 2011-11-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Herpes simplex virus combined subunit vaccines and methods of use thereof
AU2007342345B9 (en) * 2006-12-28 2013-09-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Herpes Simplex Virus combined subunit vaccines and methods of use thereof
AR066405A1 (es) * 2007-04-20 2009-08-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna
US20100285041A1 (en) 2007-05-17 2010-11-11 Eugen Uhlmann Class A Oligonucleotides with Immunostimulatory Potency
JP2010536335A (ja) * 2007-08-13 2010-12-02 ファイザー・インク 活性が改善した組合せモチーフ免疫賦活性オリゴヌクレオチド
WO2009026465A2 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Dynavax Technologies Corporation Composition and methods of making and using influenza proteins
JP2010536907A (ja) * 2007-08-31 2010-12-02 ニューリミューン セラピューティクス エイジー 患者にアミロイドーシスおよびタンパク質凝集性障害における特異的免疫応答をもたらす方法
US7892567B2 (en) * 2007-10-01 2011-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for immunization against chlamydial infection and disease
RU2010112771A (ru) 2007-10-09 2011-11-20 Коули Фармасьютикал ГмбХ (DE) Иммуностимулирующие аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированные сахарные группировки
AR069704A1 (es) * 2007-12-18 2010-02-10 Alcon Res Ltd Sistema de administracion de rnai de interferencia y usos del mismo
US7720322B2 (en) * 2008-06-30 2010-05-18 Intuitive Surgical, Inc. Fiber optic shape sensor
TWI351288B (en) * 2008-07-04 2011-11-01 Univ Nat Pingtung Sci & Tech Cpg dna adjuvant in avian vaccines
US20100166782A1 (en) * 2008-07-25 2010-07-01 Martha Karen Newell Clip inhibitors and methods of modulating immune function
US8053422B2 (en) * 2008-12-04 2011-11-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Anti-cancer oligodeoxynucleotides

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US20090202575A1 (en) 2009-08-13
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