DE69736293T2

DE69736293T2 - Verfahren und zusammensetzung zur auffindung von cervix-krebs

Info

Publication number: DE69736293T2
Application number: DE69736293T
Authority: DE
Inventors: K. Susan Harvard KEESEE; Robert Walpole OBAR; Ying-Jye Framingham WU
Original assignee: Matritech Inc
Current assignee: Matritech Inc
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-19
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2017-08-20
Also published as: US6027905A; WO1998009170A2; US20030157482A1; EP0923740A2; ATE332505T1; JP2001500609A; AU4073297A; WO1998009170A3; DE69736293D1; JP4116082B2; US5858683A; ES2268735T3; US20050164313A1; CA2263888C; US6803189B2; CA2263888A1; EP0923740B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren und Zusammensetzungen für den Nachweis von Gebärmutterhals-/Zervix-Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere mit Zervix-Krebs assoziierte Proteine, die als zelluläre Marker fungieren und (i) zum Nachweis von Zervix-Krebs, und (ii) als molekulare Ziele für eine Zervix-Krebstherapie nützlich sind.
Krebs des Gebärmutterhalses bzw. des Zervix ist einer der am häufigst vorkommenden, bösartigen Tumore bei Frauen und stellt ein signifikantes Problem der Volksgesundheit überall in der Welt dar. Allein in den Vereinigten Staaten ist invasiver Zervix-Krebs für ca. 19% aller gynäkologischen Krebserkrankungen (Miller et al. (1993) in "Surveillance Epidemiology, and End Results Program cancer Statistics Review: 1973-1990", NIH Pub. Nr. 93-2789, Bethesda, MD: National Cancer Institute) verantwortlich. Es wird geschätzt, dass 1996 14.700 neu diagnostizierte Fälle und 4900 Todesfälle auf diese Krankheit zurückzuführen sein werden (American Cancer Society, Cancer Facts & Figures 1996, Atlanta, GA: American Cancer Society, 1996). In vielen Entwicklungsländern, in denen breite Vorsorgeuntersuchungsprogramme nicht verbreitet verfügbar sind, ist das klinische Problem erheblicher. Die Zahl neuer Fälle wird weltweit auf 471000 geschätzt mit einer 4-Jahres-Überlebensrate von 40% (Munoz et al. (1989) "Epidemiology of Cervical Cancer" in "Human Papillomavirus", New York, Oxford Press, Seiten 9-39; und National Institutes of Health, Consensus Development Conference Statement on Cervical Cancer, April 1-3, 1996).
Die Vorstufe von Zervix-Krebs ist Dysplasie, dem Fachmann auch als zervikale intraepitheliale Neoplasie (CIN) oder als squamöse intraepitheliale Läsion (SIL) bekannt (Brinton et al. (1992) "Epidemiology of Cervical Cancer. Overview" in "The Epidemiology of Cervical Cancer and Human Papillomavirus", Lyon, Frankreich: International Agency for Research on Cancer; und Tabbara et al. (1992) "The Bethesda classification for squamous intraepithelial lesions: histologic, cytologic and viral correlates", Obstet. Gynecol. 79: 338-346). Obwohl es nicht verstanden ist, wie normale Zellen transformiert werden, wurde das Konzept eines kontinuierlichen Spektrums einer histopathologischen Veränderung eines normalen Plattenepithels über CIN zu invasivem Krebs weitgehend für viele Jahre anerkannt (siehe beispielsweise Mitchell et al. (1994) "The natural history of cervical intraephithelial neoplasia: an argument of intermediate endpoint biomarkers", Cancer Epidmiol. Biomark. Prev. 3: 619-626). Ein beträchtlicher Hauptteil epidemiologischer und molekularbiologischer Beweise wurde gesammelt, der eine Infektion mit einem menschlichen Papillomavirus (HPV) als einer in Zervix-Krebs ursächlichen Faktor etabliert hat (Munoz et al. (1992) in "The Epidemiology of Human Papillomavirus and Cervical Cancer", IRAC Publikation Nr. 119, Lyon, Frankreich: Int. Agency for Research on Cancer, Seiten 251-261). HPV wird in 85% oder mehr squamös Zell-invasiven Läsionen gefunden, was den häufigsten histologischen in Zervix-Karzinomen gesehenen Typ darstellt (Cox et al. (1995) Baillierre's Clin. Obstet Gynaecol. 91-37). Zusätzliche Kofaktoren umfassen beispielsweise durch Punktmutationen aktivierte Onkogene und chromosomale Translokationen von Deletionen (Spandidos et al. (1989) J. Pathol. 157: 1-10).
Gegenwärtig ist das Verfahren der Wahl zum Nachweis von Zervix-Krebs eine zytologische Untersuchung von Papanicolaou-gefärbten Zervix-Abstrichen bzw. Portioabstrichen (auch als Papanicolaou-Schmier bezeichnet). Trotz des historischen Erfolgs dieses Tests sind Bedenken aufgekommen, die seine Fähigkeit betreffen, das Verhalten von gleicheartigen prä-invasiven Läsionen sicher vorherzusagen (Ostor et al. (1993) Int. J. Gynecol. Pathol. 12: 186-192; und Genest et al. (1993) Human Pathol. 24: 730-736). Die Identifizierung eines Zervix-Krebs assoziierten Tumormarkers zum zuverlässigen Nachweis eines frühen Ausbruchs von Zervix-Krebs und/oder ein Bereitstellen früher prognostizierender Information wird bei der Handhabung von Zervix-Krebs bedeutend helfen.
Alle eukaryotischen Zellen weisen einen Zellkern, der DNA oder Chromatin enthält, das durch ein inneres als Kemmatrix (NM) bekanntes Gerüst organisiert ist. Die Kernmatrix wurde erstmals 1974 durch Berezney et al. beschrieben (Berezney et al. (1974) Biochem. Biophys. Res. Commun., 60: 1410-1417). Penman et al. beschreiben ein Verfahren zum selektiven Extrahieren unlöslicher innerer Kernmatrix-Proteine und ihrer assoziierten Nukleinsäuren aus Zellen und zum Bestimmen des jeweiligen Zelltyps durch Analysieren der Proteine durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (siehe beispielsweise; U.S.-Patente Nr. 4,882,268, erteilt am 21. November 1989, und 4,885,236, erteilt am 5. Dezember 1989). Die WO94100573 legt Gensequenzen offen und ihre kodierten Aminosäuresequenzen für zwei innere Kernmatrix-Proteine, die als Marker von bösartigen Zelltypen nutzbar sind.
Man nimmt an, dass die Kernmatrix an einer weiten Vielfalt von für die Kontrolle der Genexpression fundamentalen Kernfunktionen beteiligt ist. Für einen allgemeinen Überblick betrachte man beispielsweise Fey et al. (1991) Crit. Rev. Euk. Gene Express. 1: 127-143. Gewebsspezifische Kernmatrixproteine wurden in der Ratte, Maus und im Menschen identifiziert. Fey et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 121-125; Stuurman et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 5460-5465; und Getzenberg et al. (1990) Mol. Endocrinol. 4: 1336-1342. Veränderungen in dem Vorliegen oder Fehlen eines spezifischen Kernmatrixproteins wurden mit zellulärer Transformationen und Differenzierungen in Verbindung gebracht (Bidwell et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3162-3166; Brancolini et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6936-6940; and Greenfield et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11217-11221).
Mehrere neue ähnliche Methoden nutzende Studien haben tumorspezifische Kernmatrixproteine identifiziert bei Krebsen der Prostata (Partin et al. (1993) Cancer Res. 53: 744-746), der Brust (Khanuja et al. (1993) Cancer Res. 53: 3394-3398), Darmkrebs (Keesee et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1913-1916), der Knochen (Bidwell et al. (1994) Cancer Res. 54: 28-32), der Blase (Getzenberg et al. (1996) Cancer Res. 56: 690-694) und des Kehlkopfs (Donat et al. (1996) Otolaryngol. Head Neck Surg. 114: 387-393). Allerdings bleibt eine molekulare Charakterisierung der spezifischen Kernmatrixproteine wegen der geringen Menge dieser Proteine in der Zelle und ihrem im Allgemeinen unlöslichem Charakter schlecht definiert.
Es existiert jedoch im Fachgebiet einen Bedarf an spezifischen, zuverlässigen Markern, die in normalem und kanzerogenem Zervix-Gewebe verschieden exprimiert werden und die zum Nachweisen von Zervix-Krebs oder in der Vorhersage seines Ausbruchs verwendet werden können. Daher ist es ein Ziel dieser Erfindung Zervix-Krebs assoziierte Moleküle bereitzustellen, die als Marker für den frühen und/oder schnellen Nachweis von Zervix-Krebsen in einem Individuum nutzbar sind. Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Verfahren zum Nachweisen von Zervix-Krebsen in einem Individuum bereitzustellen. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung Verfahren und Zusammensetzungen zum Behandeln von Zervix-Krebsen in einem Individuum und zum Beobachten der Wirksamkeit einer derartigen Behandlung in dem Individuum bereitzustellen.
Die Erfindung stellt eine Vielzahl an Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen und/oder Prognostizieren von Zervix-Krebs in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe eines Individuums bereit, wie in den hier angefügten Ansprüchen definiert. Die Erfindung basiert in Teilen auf der Entdeckung von Zervix-Krebs assoziierten Proteinen, die, wie durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese bestimmt, in Zervix-Krebszellen in nachweisbaren Höhen bzw. Spiegeln vorhanden sind, die jedoch in normalen Zervix-Zellen nicht nachweisbar sind.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen von Zervix-Krebs in einem Menschen bereit. Das Verfahren umfasst den Schritt eines Nachweisens des Vorliegens eines Zervix-Krebs assoziierten Proteins in einer Gewebs- oder Körperflüssigkeitsprobe des Menschens, um dadurch das Vorliegen eines Zervix-Krebses oder eine Vorstufe von Zervix-Krebs anzuzeigen. Das mit Zervix-Krebs assoziierte Protein ist ein Zervix-Krebs assoziiertes Protein, welches eine kontinuierliche Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus: SEQ ID NR:1, SEQ ID NR:2; SEQ ID NR:3; SEQ ID NR:4; SEQ ID NR:5; SEQ ID NR:6; SEQ ID NR:7; SEQ ID NR:8 und SEQ ID NR:9. Alternativ kann das Verfahren der Erfindung den Schritt eines Nachweisens eines Zervix-Krebs assoziierten Proteins umfassen, welches die in SEQ ID NR: 10 dargelegte Aminosäuresequenz aufweist, welche vom Fachmann allgemein als IEF SSP 9502 bezeichnet wird. Siehe beispielsweise Honore et al. (1994) Gene 151: 291-296.
Der Begriff "Zervix-Krebs", wie hier verwendet, wird verstanden, jeden Krebs oder jede krebsartige Läsion zu bedeuten, welche mit Zervix-Gewebe oder Zervix-Zellen assoziiert ist und umfasst zusätzlich Vorstufen von Zervix-Krebs, beispielsweise Dysplasie (dem Fachmann auch bekannt als eine zervikale intraepitheliale Neoplasie oder als eine squamöse intraepitheliale Läsion).
Der Begriff "Zervix-Krebs assoziierte" Moleküle, wie hier verwendet, bezieht sich auf Moleküle, die von einer Zervix-Krebszelle oder -zellen stammen und isolierbar sind, und im Wesentlichen weder von einer normalen Zervix-Krebszelle oder -zellen stammen noch isolierbar sind. Es ist nicht notwendig, dass das Zielmolekül oder Zielprotein einzigartig für eine Zervix-Krebszelle ist; vielmehr ist es bevorzugt, dass das Zielmolekül oder -protein ein Signal-Hintergrund-Verhältnis aufweist, das hoch genug ist, um zwischen aus einem Zervix-Krebsgewebe oder Körperflüssigkeit stammenden Proben und aus normalem Zervix-Gewebe oder Körperflüssigkeit stammenden Proben zu unterscheiden.
Die Verfahren der Erfindung können an jeder relevanten Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe durchgeführt werden. So können beispielsweise erfindungsgemäße Verfahren an Zervix-Gewebe durchgeführt werden, vorzugsweise an zervikalem Biopsiegewebe und am bevorzugtesten an Papanicolaou-Schmier. Alternativ können die erfindungsgemäßen Verfahren in einer menschlichen Körperflüssigkeitsprobe durchgeführt werden, die ausgewählt aus einer Gruppe ist, bestehend aus: Blut, Serum, Plasma, Fäkalmaterial, Urin, Vaginalsekret, Rückenmarksflüssigkeit, Speichel, Ascitesflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Sputum und Brustexsudat. Allerdings ist in Erwägung gezogen, dass die erfindungsgemäßen Verfahren auch in Ansätzen bzw. Assays für metastasierenden Zervix-Krebszellen in anderen Gewebe- oder Körperflüssigkeitsproben verwendet werden können.
Mit Zervix-Krebs in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe assoziierte Markerproteine können unter Verwendung eines aus einer Anzahl an dem Fachmann verfügbaren Assay-Verfahren nachgewiesen werden. So kann beispielsweise in einer Ausführungsform das Marker-Zervix-Krebs assoziierte Protein mit einem markierten, bindenden Rest zur Reaktion gebracht werden, der in der Lage ist spezifisch an das Markerprotein zu binden, um dadurch einen markierten Komplex des bindenden Rests und des Markerproteins herzustellen. Der markierte Komplex kann danach unter Verwendung herkömmlicher dem Fachmann wohlbekannter Methoden nachgewiesen werden. Ein Nachweis des Vorliegens des markierten Komplexes kann ein Anzeichen für das Vorliegen von Zervix-Krebszellen oder vor-krebsartigen Zellen in dem untersuchten Individuum bereitstellen. Der Begriff "bindender Rest", wie hier verwendet, ist verstanden einen beliebigen bindenden Partner zu meinen, der in der Lage ist spezifisch an ein Zervix-Krebs assoziiertes Protein mit einer Bindungsaffinität größer als ungefähr 10⁵M^-1 zu binden. Die Begriffe "spezifische Bindung", "spezifisch gebunden" und "bindet spezifisch", wie hier verwendet, beziehen sich auf eine bindende Wechselwirkung mit einer Bindungsaffinität größer als ungefähr 10⁵M^-1. Wie hier verwendet, ist der bindende Rest mit einem nachweisbaren Rest markiert, beispielsweise einer radioaktiven, fluoreszierenden, spektroskopischen oder enzymatischen Markierung, wobei dem Fachmann wohl bekannte Techniken verwendet werden.
Es ist klar, dass bindende Reste, die spezifisch mit dem Zielprotein wechselwirken und binden, unter Verwendung herkömmlicher, dem Fachmann wohlbekannter Verfahren aufgebaut werden können. In der Erfindung kann der bindende Rest ein Antikörper sein, beispielsweise ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper. Monoklonale Antikörper werden bevorzugt. Jedoch ist zu berücksichtigen, dass andere nutzbare bindende Reste, welche in der Gebrauch der vorliegenden Erfindung nutzbar sind, beispielsweise umfassen können, biosynthetische Antikörper-bindende Stellen, vom Fachmann auch als BABS oder sFV's bezeichnet, und Antikörperfragmente, beispielsweise Fv-, Fab-, Fab'- und (Fab')₂-Fragmente. Verfahren zum Herstellen, Testen und Markieren von BABS und Antikörperfragmente sind dem Fachmann wohlbekannt, und werden daher hier nicht im Detail erläutert.
In einer anderen Ausführungsform, können ein oder mehrere Markerproteine in einer Probe nachgewiesen werden durch zunächst Isolieren der Proteine aus der Probe, und dann durch Trennen der Proteine durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese, um ein charakteristisches, zwei-dimensionales Gelelektrophorese-Muster herzustellen. Das Gelelektrophoresemuster kann dann mit einem Standard verglichen werden, beispielsweise einem Standard-Gelmuster, das von einer Datenbank von Gelelektrophorese-Mustern erhalten wurde. Somit stellt die Erfindung in einer anderen Ausführungsform Gelelektrophorese-Muster oder Elektropherogramme von Zervix-Krebs assoziierten Proteinen bereit, die zum Nachweisen von Zervix-Krebs in einem Individuum nutzbar sind.
Die erfindungsgemäßen, mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine können aus Zervix-Krebszellen gereinigt oder zusammen gereinigt werden, wobei Kernmatrixprotein-Isolationsverfahren verwendet werden, wie die in den US-P-4,885,236 und US-P-4,882,268 offenbarten.
Alternativ können die einmal identifizierten und charakterisierten Markerproteine aus einer Probe durch eine beliebige aus einer dem Fachmann wohl bekannten Auswahl von Proteinreinigungsprotokollen, wie beispielsweise Affinitätschromatographie, isoliert werden, um isolierte Proteine zu ergeben. Der Begriff "isoliert" soll, wie hier verwendet, im Wesentlichen frei von nicht-gewünschtem, verunreinigendem proteinösem Material bezeichnen.
Weiterhin kann der Fachmann, unter Verwendung von dem Fachmann gegenwärtig verfügbaren Verfahren, das vollständig isolierte Markerprotein oder Fragmente davon kodierende Nukleinsäuresequenzen herstellen (siehe beispielsweise Maniatis et al., Herausgeber (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press). So kann beispielsweise ein isoliertes, Zervix-Krebs assoziiertes Protein unter Verwendung herkömmlicher Peptidsequenzierungs-Protokolle sequenziert werden, und dann Oligonukleotid-Hybridisierungssonden aufgebaut werden, um eine cDNA-Sammlung bzw. –Bank zu durchmustern bzw. screenen. Die cDNA-Sammlung kann dann mit dem resultierenden Oligonukleotid durchmustert werden, um eine cDNA-Sequenz in vollständiger oder teilweiser Länge zu isolieren, die das isolierte Protein kodiert.
Weiterhin kann der Fachmann unter Verwendung der in den US-P-4,885,236 und 4,882,268 beschriebenen Verfahren ein Nukleinsäuremolekül aus einer Zellprobe isolieren, welches eine Sequenz aufweist, die erkennen kann und spezifisch durch einen Zervix-Krebs assoziiertes Protein gebunden wird. In einem derartigen Verfahren werden die löslichen Proteine von dem Zellkern und Zytoskelett getrennt durch Extrahieren von Säugetierzellen mit einer nicht-ionischen Detergenzlösung bei einem/einer physiologischen pH-Wert und Ionenstärke. Das unlösliche Protein und Nukleinsäuren werden dann mit DNAase verdaut und dann mit einer gepufferten Ammoniumsulfat-Lösung eluiert, um einem Nukleinsäuremolekül zu erhalten, welches erkennen kann und spezifisch durch ein Zervix-Krebs assoziiertes Protein gebunden wird. Dann werden jegliche verbleibende Proteine von dem Zielnukleinsäuremolekül getrennt.
Ein Nachweis der vorstehend aufgeführten Nukleinsäuremoleküle kann somit als ein Anzeichen des Vorliegens von Zervix-Krebs und/oder metastasierendem Zervix-Krebs in einem Individuum dienen. Dementsprechend stellt die Erfindung in einer weiteren AusführungsformAspekt ein weiteres Verfahren zum Nachweisen von Zervix-Krebs in einem Menschen bereit. Das Verfahren umfasst den Schritt eines Nachweisens eines Nukleinsäuremoleküls in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe, um dadurch das Vorliegen eines Zervix-Karzinoms in einem Individuum anzuzeigen. Das Nukleinsäuremolekül ist ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus (i) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz umfasst, die erkennen kann und spezifisch durch ein Zervix-Krebs assoziiertes Protein gebunden wird, und (ii) einem Nukleinsäuremolekül, welches eine ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein kodierende Sequenz umfasst. Wie hier definiert, ist das mit Zervix-Krebs assoziierte Protein gekennzeichnet Aminosäuresequenzen zu umfassen, welche ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 10.
Ein Zielnukleinsäuremolekül kann in einer Probe nachgewiesen werden, beispielsweise durch eine Northern-Blot-Analyse durch Reagieren der Probe mit einer markierten Hybridisierungssonde, beispielsweise einer ³²P-markierten Oligonukleotidsonde, die spezifisch mit mindestens einem Bereich des für das Markerprotein kodierenden Nukleinsäuremoleküls hybridisieren kann.
Somit kann ein Nachweis eines Nukleinsäuremoleküls, das entweder ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein kodiert oder spezifisch durch ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein gebunden werden kann, als ein Anzeichen des Vorliegens eines Zervix-Krebses in dem untersuchten Individuum dienen.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Kit zum Nachweisen des Vorliegens eines Zervix-Krebses oder zum Beurteilen der Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung eines Zervix-Krebses bereit. Derartige Kits können in Kombination umfassen, (i) einen Behälter zum Aufnehmen einer menschlichen Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe des Individuums, (ii) einen Bindungs-Partner, der spezifisch entweder an ein Epitop eines Zervix-Krebs assoziierten Markerproteins oder einer mindestens einen Bereich der Zervix-Krebs assoziierten Markerproteins kodierenden Nukleinsäuresequenz bindet, wie vorstehend definiert, (iii) Mittel zum Nachweisen des Bindens des bindenden Partners mit entweder dem Zervix-Krebs assoziierten Protein oder der Nukleinsäuresequenz, welche mindestens einen Bereich des Zervix-Krebs assoziierten Proteins kodiert, und (iv) eine Vergleichsprobe.
In einer Ausführungsform des Kits bindet, wie hier vorstehend definiert, der bindende Rest spezifisch an ein Zervix-Krebs assoziiertes Protein.
In einer anderen Ausführungsform des Kits kann die Vergleichsprobe eine negative und/oder positive Kontrolle umfassen. Die negative Kontrolle ist anzeigend für einen normalen Zervix-Zellentyp und die positive Kontrolle ist anzeigend für Zervix-Krebs.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Zervix-Krebs bereit. Das Verfahren umfaßt, Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, vorzugsweise eines Antikörpers, und am meisten bevorzugt eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch an ein Zervix-Krebs assoziiertes Zielprotein bindet, um dadurch das Protein zu inaktivieren an einen Patienten mit Zervix-Krebs. Das Zielprotein wird charakterisiert als eine Aminosäuresequenz umfassend, welche aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1-10 ausgewählt ist.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem anderen Verfahren zur Behandlung von Zervix-Krebs bereit. Das Verfahren umfasst den Schritt, Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung, die in vivo die Expression eines Zervix-Krebs assoziierten Zielproteins verringert, an einen Patienten, bei dem Zervix-Krebs diagnostiziert wurde, um die Expression des Zielproteins in vivo zu verringern.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung eine eine Nukleobase umfassende Sequenz, wie eine Antisense-Nukleinsäuresequenz oder ein Antisense-Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Molekül, komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz, die mindestens einen Bereich des Zielproteins kodiert. Nach Verabreichung bindet die Antisense-Nukleinsäuresequenz oder das antisense-PNA-Molekül an die Nukleinsäuresequenz, die mindestens teilweise das Zielprotein kodieren, um dadurch in vivo Expression des Zervix-Krebs assoziierten Proteins zu verringern.
Somit stellt die Erfindung einen großen Bereich an Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen und Behandeln von Zervix-Krebs in einem Individuum bereit. Insbesondere stellt die Erfindung Zervix-Krebs assoziierte Proteine bereit, die spezifischen und früh, vorzugsweise bevor Metastasen auftreten, einen Nachweis von Zervix-Krebs in einem Individuum erlauben. Zusätzlich stellt die Erfindung zum Nachweis von Zervix-Krebs in einem Individuum nutzbare Kits bereit. Zusätzlich stellt die Erfindung Verfahren bereit, welche Zervix-Krebs assoziierte Proteine als Ziele und Indikatoren zum Behandeln von Zervix-Krebs und zum Beobachten der Wirksamkeit einer derartigen Behandlung verwenden. Diese und zahlreiche andere zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden Abbildungen, der ausführlichen Beschreibung und den Ansprüchen, welche folgen, offensichtlich werden.
1a ist ein Muster einer hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophorese von aus einer Zervix-Krebsgewebeprobe isolierten Kernmatrixproteinen. Eingekreiste und mit den Bezugszeichen 1-5 markierte Tumor-assoziierte Proteine entsprechen in Tabelle 2 gelisteten Proteinen CvC-1 bis CvC-5.
1b ist ein Muster einer hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophorese von aus einer normalen Zervix-Gewebeprobe isolierten Kernmatrixproteinen. Als Bezug sind die relativen Positionen, die den Proteinen CvC-1 bis CvC-5 in 1a entsprechen, eingekreist und mit den Bezugszeichen 1-5 markiert.
2a ist ein Muster einer hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophorese von aus der Zervix-Karzinom abgeleiteten Zelllinie C33A isolierten Kernmatrixproteinen. Tumor assoziierte Proteine CvC-2 und CvC-5 sind eingekreist und mit den Bezugszeichen 2 und 5 markiert.
2b ist ein Muster einer hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophorese von aus CaSki Zellen isolierten Kernmatrixproteinen. Tumor assoziierte Proteine CvC-1 und CvC-3 sind eingekreist und mit den Bezugszeichen 1 und 3 markiert.
Für jede der vorstehend aufgeführten Figuren sind an den Ordinatenachsen (M_r × 10³) Molekulargewichtsstandards angegeben und an den Abszissen isoelektrische Punkte gezeigt. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis und zur Behandlung von Zervix-Krebs bereit. Die Erfindung basiert in Teilen auf der Entdeckung von Zervix-Krebs assoziierten Proteinen, die im Allgemeinen in krebsartigen Zervix-Zellen in höheren Spiegeln nachweisbar vorliegen, als in normalen Zervix-Zellen, wie mit zwei-dimensionaler Gelelektrophorese bestimmt wurde.
Die mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine können als Markerproteine fungieren, welche zum Nachweis von Zervix-Krebs oder Zielproteinen zur Therapie von Zervix-Krebs nutzbar sind. Beispielsweise ist es in Erwägung gezogen, dass die Markerproteine und bindende Reste, beispielsweise Antikörper, die an die Markerproteine binden oder Nukleinsäuresonden, die mit den die Markerproteine kodierenden Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, verwendet werden können, um das Vorliegen von Zervix-Krebs in einem Individuum nachzuweisen. Weiterhin ist es in Erwägung gezogen, das der Fachmann neue Therapeutika zum Behandeln von Zervix-Krebs herstellen kann, welche beispielsweise umfassen: Antikörper, die an ein Individuum verabreicht werden können und die binden an und die biologische Aktivität des Zielproteins in vivo verringern oder unterdrücken; Nukleinsäure- oder Peptid-Nukleinsäuresequenzen, die mit Genen oder Gentranskripten hybridisieren, welche die Zielproteine kodieren, um dadurch eine Expression der Zielproteine in vivo zu verringern; oder kleine Moleküle, beispielsweise organische Moleküle, welche mit den Zielproteinen oder anderen zellulären Resten, beispielsweise Rezeptoren für die Zielproteine, wechselwirken, um dadurch die biologische Aktivität der Zielproteine zu verringern oder zu unterdrücken.
Nachstehend sind Verfahren dargelegt zum Isolieren von Zervix-Krebs assoziierten Proteinen, Verfahren zum Nachweisen von Zervix-Krebs unter Verwendung von Zervix-Krebs assoziierten Proteinen als Marker, und Verfahren zum Behandeln von an Zervix-Krebs leidenden Individuen unter Verwendung von Zervix-Krebs assoziierten Proteinen als Ziele für eine Krebstherapie.
1. Identifizierung und Reinigung von mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen.
Erfindungsgemäße Markerproteine werde, wie hier offenbart, identifiziert durch (i) Isolieren von Proteinen aus normalen Zervix-Gewebe und aus Zervix-Krebsgewebe unter Verwendung eines Kernmatrixreinigungsprotokols, wie jene, die im Allgemeinen in den U.S. Patenten Nr. 4,882,268 und 4,885,236 oder Fey al al. (1986), vorstehend aufgeführt, beschrieben sind, (ii) Fraktionieren der so erhaltenen Kernmatrixproteinpräparationen durch 2-D-Gelelektrophorese, (iii) sichtbar machen der so erhaltenen Proteinmuster, beispielsweise durch Silberfärbung, und (iv) Identifizieren von Polypeptidpunkten in den so erhaltenen 2-D-Elektropherogrammen, welche im Allgemeinen in von Zervix-Krebszellen isolierten Proben nachweisbar sind, jedoch in von normalen Zervix-Zellen isolierten Proben nicht nachweisbar sind.
Mit Zervix-Krebsgewebe assoziierte Markerproteine wurden, wie hier beschrieben, isoliert, wobei eine Modifikation der Verfahrens von Fey et al. (Fey et al. (1986), vorstehend aufgeführt) verwendet wurde. In Kürze, Zervix-Krebsgewebe wird in kleine (1 mm³) Stücke zerkleinert und mit einem Teflon^®-Pistill auf Eis homogenisiert und mit einer gepufferten Lösung behandelt, welche umfasst 0,5% Triton^®-X-100, Vanadyl-Ribosid-Komplex zuzüglich eines Proteaseinhibitorcocktails (Phenylmethylsulfonylfluorid, Aprotinin und Leupeptin), um Fette und lösliche Proteine zu entfernen. Tumorzellen aus Zelllinien können durch Trypsinierung geerntet und auf dieselbe An und Weise behandelt werden, wie homogenisiertes Tumorgewebe. Bindegewebsaggregate werden durch Filtrieren des Homogenats durch ein 250 Micron Nylonsieb, gefolgt von einem Zentrifugationsschritt entfernt.
Lösliche Cytoskelettproteine werden durch Inkubieren des Pellets in einem Extraktionspuffer entfernt, der 250mM (NH₄)₂SO₄, 0,5% Triton -X-100, Vanadyl-Ribosid-Komplex und zuzüglich einen Proteaseinhibitorcocktail umfasst, für 10 Minuten auf Eis, gefolgt von Zentrifugation. Chromatin wird durch 45-minütiges Inkubieren des Pellets bei 25 °C in DNAase I in einer gepufferten Lösung, die einen Proteaseinhibitorcocktail enthält, entfernt.
Die verbleibende Pelletfraktion, welche die Zielproteine und dazwischenliegende Filamente umfasst, wird in einem Abbau-Puffer solubilisiert, der 8M Harnstoff, Proteaseinhibitorcocktail und zuzüglich 1% 2-Mercaptoethanol umfasst. Unlösliche Verunreinigungen, vor allem Kohlenhydrate und extrazellulare Matrix, werden durch Ultrazentrifugation entfernt. Dazwischenliegende Filamente dürfen sich wieder nach Entfernung des Harnstoffs durch Dialyse in einem Aufbau-Puffer, der Proteaseinhibitorcocktail enthält, wieder ordnen bzw. aufbauen und werden durch Ultrazentrifugation entfernt, wobei die Zielproteine in der Überstandfraktion verbleiben. Eine Proteinkonzentration kann durch den Coomassie Plus Protein Assay Kit (Pierce Chemicals, Rockford, IL) unter Verwendung eines bovinen gamma-Globulinstandards bestimmt werden. Die Proteine werden unverzüglich in 80% Ethanol gefällt und bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert.
Es wird daran gedacht, dass nach einer Identifizierung, die so erhaltenen, mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine durch Erstellen einer Kernmatrixprotein-Präparation, wie die vorstehend beschrieben, elektrophoretisches Trennen der so erhaltenen Proteine auf einem 2-D-Gel und nach einigen Mitteln zum sichtbar machen, Isolieren des interessierenden Proteins aus dem so erhaltenen 2-D-Gel isoliert werden können. Alternativ ist daran gedacht, dass das Markerprotein, einmal identifiziert, unter Verwendung von dem Fachmann wohlbekannten Standard-Proteinreinigungsverfahren, wie Affinitätschromatographie, isoliert werden kann, um zu im Wesentlichen reinen Markerproteinen zu führen. Der Begriff "im Wesentlichen rein", wie hier gebraucht, ist verstanden, eine Reinheit von mindestens 80%, wie durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt, zu meinen.
2. Nachweis von Zervix-Krebs.
Sind einmal Zervix-Krebs assoziierte Proteine identifiziert, können diese als Marker verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Individuum Zervix-Krebs und/oder eine zervikale Dysplasie aufweist, und wenn dem so, können geeignete Nachweisverfahren verwendet werden, um den Status der Krankheit zu beobachten.
Unter Verwendung der Markerproteine, kann der Fachmann eine Vielzahl an Nachweisverfahren zum Nachweisen von Zervix-Krebs in einem Menschen erstellen. Die Verfahren umfassen gewöhnlich die Schritte des Nachweisens des Vorliegens eines oder mehrerer mit Zervix-Krebs assoziierter Proteine in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe von einem Menschen durch einige Mittel. Die Genauigkeit und/oder Zuverlässigkeit des Verfahrens zum Nachweisen von Zervix-Krebs in einem Menschen kann weiter verbessert werden durch Nachweisen des Vorliegens mehrerer mit Zervix-Krebs assoziierter Proteine in einer vorgewählten Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe. Der Nachweisschritt kann einen oder mehrere der hier nachstehend beschriebenen Protokolls umfassen.
2.A. Proteinnachweisverfahren
Das Markerprotein in einer Probe kann mit einem bindenden Rest zur Reaktion gebracht werden, der spezifisch an das Markerprotein binden kann. Der bindende Rest kann beispielsweise umfassen ein Element eines Liganden-Rezeptor-Paars, d.h. ein Molekülpaar, welches eine spezifische bindende Wechselwirkung aufweisen kann. Der bindende Rest kann beispielsweise ein Element eines spezifischen bindenden Paars umfassen, wie Antikörper-Antigen, Enzym-Substrat, Nukleinsäure-Nukleinsäure, Protein-Nukleinsäure, Protein-Protein oder andere spezifische, dem Fachmann bekannte Bindungspaare. Es können bindende Proteine, die eine verbesserte Affinität zu einem Zielprotein aufweisen, erstellt werden. Wahlweise kann der bindende Rest mit einer nachweisbaren Markierung, wie einer enzymatischen, fluoreszierenden, radioaktiven, phosphoreszierenden oder gefärbten Teilchenmarkierung, verbunden sein. Der markierte Komplex kann beispielsweise visuell oder mit der Hilfe eines Spektrophotometers oder eines anderen Erfassungssystems nachgewiesen werden.
Die Markerproteine können ebenfalls unter Verwendung von dem Fachmann verfügbaren Gelelektrophoresetechniken nachgewiesen werden. Bei einer zweidimensionaler Gelelektrophorese werden die Proteine zuerst in einem pH-Gradienten-Gel entsprechend ihres isoelektrischen Punkts getrennt. Das so erhaltene Gel wird dann auf einem zweiten Polyacrylamidgel platziert, und die Proteine werden entsprechend des Molekulargewichts getrennt (siehe beispielsweise O'Farrell (1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-4021).
Ein oder mehrere Markerproteine können nachgewiesen werden, indem zuerst Proteine aus einer Probe, die von einem Individuum erhalten wird, der vermutetermassen Zervix-Krebs aufweist, isoliert werden, worauf dann die Proteine durch eine zwei dimensionale Gelelektrophorese getrennt werden, um ein charakteristisches zweidimensionales Gelelektrophorese-Muster herzustellen. Das Muster kann dann mit einem Standardgel-Muster verglichen werden, welches durch Trennung von aus normalen oder Krebszellen isolierten Proteinen unter den gleichen oder ähnlichen Bedingungen hergestellt wurde. Der Standard kann gelagert oder aus einer elektronischen Datenbank aus Elektrophoresemustern erhalten werden. Das Vorliegen eines Zervix-Krebs assoziierten Proteins in dem zwei-dimensionalen Gel stellt ein Anzeichen des Vorliegens eines Zervix-Krebses in der untersuchten Probe bereit. Der Nachweis von zwei oder mehreren Proteinen in dem zwei-dimensionalen Gelelektrophorese-Muster verbessert die Genauigkeit des Assays weiter. Das Vorliegen mehrerer, beispielsweise zwei bis fünf mit Zervix-Krebs assoziierter Proteine in dem zwei-dimensionalen Gel stellt ein starkes Anzeichen des Vorliegens eines Zervix-Krebses in der Probe bereit. Der Assay erlaubt daher den frühen Nachweis und die Behandlung von Zervix-Krebs.
2B. Immunoassav bzw. Immunotest
Ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Markerprotein kann ebenfalls unter Verwendung eines beliebigen, einer dem Fachmann verfügbaren großen Anzahl an Immunoassay-Techniken nachgewiesen werden. So kann der Fachmann beispielsweise das Sandwich-Immunoassay-Format nutzen, um Zervix-Krebs in einer Körperflüssigkeitsprobe nachzuweisen. Alternativ kann der Fachmann herkömmliche immuno-histochemische Verfahren zum Nachwiesen des Vorliegens des Zervix-Krebs assoziierten Proteins in einer Gewebeprobe, beispielsweise in einem Papanicolaou-Schmier, verwenden, wobei ein oder mehrere markierte bindende Proteine verwendet werden (siehe Beispiel 5, hier nachstehend aufgeführt).
In einem Sandwich-Immunoassay werden zwei Antikörper verwendet, die im Allgemeinen das Markerprotein binden können, beispielsweise einer auf einem festen Trägermaterial immobilisiert, und einer frei in Lösung und mit einer nachweisbaren chemischen Verbindung markiert. Beispiele für chemische Markierungen, die für den zweiten/sekundären Antikörper verwendet werden können, umfassen Radioisotope, fluoreszierende Verbindungen, und Enzyme oder andere Moleküle, die gefärbte oder elektrochemisch aktive Produkte erzeugen, wenn sie mit einem Reaktant oder Enzymsubstrat in Kontakt kommen. Wenn eine das Markerprotein enthaltende Probe in diesem System platziert wird, bindet das Markerprotein sowohl an den immobilisierten Antikörper als auch an den markierten Antikörper, um einen "Sandwich"-Immunokomplex auf der Oberfläche des Trägermaterials zu bilden. Das komplexierte Protein wird erfasst durch Wegwaschen von nicht-gebundenen Probenkomponenten und überschüssigen markierten Antikörpers, und Erfassen der Menge des markierten, an Protein auf der Oberfläche des Trägermaterial komplexierten Antikörpers.
Sowohl die Sandwich-Immunoassay als auch das immunohistochemische Gewebeverfahren sind hoch spezifisch und sehr sensitiv, sofern Markierungen mit guten Nachweisgrenzen verwendet werden. Ein ausführlicher Überblick über immunologische Assayanordnungen, Theorie und Protokolle können in zahlreichen Texten in dem Fachgebiet gefunden werden, umfassend "Practical Immunology", Butt, W.R., Herausgeber, (1984) Marcel Dekker, New York und "Antibodies, A Laboratory Approach" Harlow et al. Herausgeber, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory.
Im Allgemeinen umfassen Betrachtungen zu Immunoassay-Anordnungen die Herstellung von Antikörpern (beispielsweise monoklonale oder polyklonale Antikörper), die hinreichend hohe Bindungsspezifität für das Zielprotein aufweisen, um einen Komplex zu bilden, der zuverlässig von Produkten nicht-spezifischer Wechselwirkungen unterschieden werden kann. Der Begriff "Antikörper", wie hier verwendet, ist verstanden bindende Proteine zu meinen, beispielsweise Antikörper oder andere, eine Immunoglobulin-variable Bereichsähnliche bindende Domäne umfassende Proteine, welche die geeigneten Bindungsaffinitäten und -spezifitäten für das Zielprotein aufweisen. Je höher die Bindungsspezifität des Antikörpers, desto geringer ist die Zielproteinkonzentraion, die nachgewiesen werden kann. Eine bevorzugte Bindungsspezifität ist derart, dass das bindende Protein eine Bindungsaffinität zu das Zielprotein größer als ungefähr 10⁵ M^–1, vorzugsweise größer als ungefähr 10⁷ M^–1, aufweist.
Antikörper gegen mit Zervix-Krebs assoziierte Zielproteine, die in Assays zum Nachweisen von Zervix-Krebs in einem Individuum verwendet werden können, können unter Verwendung von immunologischen Standardverfahren hergestellt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt und beschrieben sind. Siehe beispielsweise, Practical Immunology, Butt, N.R., Herausgeber, Marcel Dekker, NY, 1984. In Kürze, ein isoliertes Zielprotein wird verwendet, um Antikörper in einem xenogenen Wirt, wie einer Maus, Ziege oder einem anderen geeigneten Säugetier, zu erhöhen.
Das Markerprotein wird mit einem geeigneten Hilfsstoff bzw. Adjuvans kombiniert, das die Antikörperproduktion in dem Wirt verstärken kann, und wird in den Wirt beispielsweise durch intraperitoneale Verabreichung injiziert. Jeder zum Stimulieren der Immunantwort des Wirts geeignete Hilfsstoff kann verwendet werden. Ein herkömmlich verwendeter Hilfsstoff ist vollständiges Freund's Adjuvans (Freund's complete adjuvant) (eine Emulsion, die getötete und getrocknete mikrobielle Zellen umfasst und beispielsweise von Calbiochem Corp., San Diego, or Gibco, Grand Island, NY bezogen werden kann). Wenn mehrfache Antigeninjektionen gewünscht sind, umfassen die nachfolgenden Injektionen das Antigen in Verbindung mit einem unvollständigen Hilfsstoff (beispielsweise einer zellfreien Emulsion).
Polyklonale Antikörper können von dem Antikörper-produzierenden Wirt durch Extrahieren von Antikörper für das interessierenden Protein umfassende Serum isoliert werden. Monoklonale Antikörper können hergestellt werden durch Isolieren von Wirtszellen, die den gewünschten Antikörper produzieren, Fusionieren dieser Zellen mit Myelomzellen unter Verwendung von in der Immunologie bekannten Standardverfahren und Durchmustern auf Hybridzellen (Hybridome), die spezifisch mit dem Zielprotein reagieren und die gewünschte Bindungsaffinität aufweisen.
Antikörper bindende Domänen können auch biosynthetisch hergestellt und die Aminosäuresequenz der bindenden Domäne kann manipuliert werden, um eine Bindungsaffinität an ein bevorzugtes Epitop des Zielproteins zu verbessern. Spezifische Antikörperverfahren sind gut verstanden und in der Literatur beschrieben. Eine ausführlichere Beschreibung ihrer Herstellung kann beispielsweise in "Practical Immunology" (1984), vorstehend aufgeführt) gefunden werden.
Zusätzlich können genetisch manipulierte biosynthetische Antikörper bindende Stellen, dem Fachmann auch bekannt als BABS oder sFv's, in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Verfahren zum Herstellen oder Verwenden von BABS, welche umfassen (i) nicht-kovalent assoziierte oder über Disulfidbrücken gebundene synthetische V_H- und V_L-Dimere, (ii) kovalent verknüpfte V_H-V_L Einzelketten bindende Stellen, (iii) individuelle V_H- oder V_L- Domainen oder (iv) Einzelkettenantikörper bindende Domänen, sind beispielsweise in den U.S.-Patenten Nr. 5,091,513; 5,132,405; 4,704,692; und 4,946,778 offenbart.
Weiterhin können eine erforderliche Spezifität für die mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine aufweisende BABS durch Phagenantikörperklonierung von kombinatorischen Gensammlungen erhalten werden, siehe beispielsweise Clackson et al. (1991) Nature 352. 624-628). In Kürze, eine Sammlung von Phagen, die jeweils auf der Hüllenoberfläche BABS exprimieren, welche variable Immunoglobulin-Bereiche aufweisen, die durch von Mäusen die mit isolierten, mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen oder Fragmenten davon vorimmunisiert wurden, erhaltenen Gensequenzen für variable Bereiche kodiert sind, werden auf Bindungsaktivität gegenüber eines immobilisierten Zervix-Krebs assoziierten Proteins durchmustert. Phagen, die an die immobilisierten Zervix-Krebs assoziierten Proteine binden, werden geerntet und die BABS kodierenden Gene werden sequenziert. Die so erhaltene, das interessierende BABS kodierende Nukleinsäuresequenz kann dann in einem herkömmlichen Expressionssystem exprimiert werden, um das BABS-Protein zu produzieren.
Das isolierte Zervix-Krebs assoziierte Protein kann auch zur Entwicklung von diagnostischen und andere Gewebe evaluierenden Kits und Assays verwendet werden, um die Menge der Proteine in einer Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe zu bestimmen. So kann der Kit beispielsweise Antikörper oder andere spezifisch bindende Proteine umfassen, die spezifisch an die Zervix-Krebs assoziierten Proteine binden und die erlauben, das Vorliegen und/oder die Konzentration der mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine in einer Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe nachzuweisen und/oder zu quantifizieren.
Geeignete Kits zum Nachweis von mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen sollen beispielsweise einen Behälter oder andere Mittel zum Aufnehmen einer zu evaluierenden Probe, und Mittel zur Nachweisen des Vorliegens und/oder der Quantität in der Probe von einer oder mehrerer der hier beschriebenen Zervix-Krebs assoziierten Proteine umfassen. Der Begriff "Mittel zum Nachweisen", wie hier verwendet, umfasst in einer Ausführungsform einen oder mehrere Antikörper, die für diese Proteine spezifisch sind und Mittel zum Nachweisen des Bindens der Antikörper an diese Proteinen durch beispielsweise, wie hier beschrieben, einen Standard-Sandwich-Immunoassay. Wenn das Vorliegen eines Proteins in einer Zelle nachgewiesen werden soll, wie beispielsweise in einer Gewebeprobe, kann der Kit auch Mittel zum Zerstören der Zellstruktur umfassen, um so intrazelluläre Proteine freizusetzen.
2.C. Auf Nucleinsäuren basierende Assays.
Das Vorliegen von Zervix-Krebs in einem Individuum kann weiter durch Nachweisen eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein kodiert, in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe bestimmt werden. Durch Verwendung von dem Fachmann wohlbekannter Verfahren können die erfindungsgemäßen mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine sequenziert werden, und dann können, basierend auf der bestimmten Sequenz, Oligonukleotidesonden zur Durchmusterung einer cDNA-Sammlung entwickelt werden (siehe beispielsweise Maniatis et al. (1989), vorstehend aufgeführt).
Ein Zielnukleinsäuremolekül, das ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Markerprotein kodiert, kann unter Verwendung eines markierten bindenden Rest, der die Zielnukleinsäure spezifisch bindet, nachgewiesen werden. Der bindende Rest kann beispielsweise umfassen, ein Protein, eine Nukleinsäure oder eine Peptid-Nukleinsäure. Zusätzlich kann ein Zielnukleinsäuremolekül, wie eine für ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein kodierende mRNA, beispielsweise nachgewiesen werden durch Ausführen einer Northern-Blot-Analyse unter Verwendung markierter Oligonukleotide, beispielsweise Nukleinsäurefragmente, die komplementär sind zu und mindestens mit einem Teil einer Zielnukleinsäure spezifisch hybridisieren können. Obwohl beliebige Längen an Oligonukleotiden zur Hybridisierung mit einem mRNA-Transkript verwendet werden können, sind gewöhnlich Oligonukleotide in dem Bereich von 8-100 Nukleotiden, vorzugsweise in dem Bereich von 15-50 Nukleotiden in Standard-Hybridisierungsassays am geeignetesten.
Die zur Hybridisierung an die Zielnukleinsäure ausgewählten Oligonukleotide, ob chemisch oder durch rekombinante DNA-Techniken synthetisiert, werden isoliert und unter Verwendung von Standardtechniken gereinigt und dann, unter Verwendung von Standardmarkierungsprotokollen vorzugsweise markiert (beispielsweise mit ³⁵S oder ³²P). Eine Probe, welche die Zielnukleinsäure umfasst, wird dann auf einem Elektrophorese-Gel laufen gelassen, die auseinadergezogenen Nukleinsäuren werden auf ein Nitrocellulose-Filter überführt und das markierte Oligonukleotid wird mit dem Filter unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen in Kontakt gebracht, beispielsweise 50% Formamid, 5 X SSPE, 2X Denhardt's Lösung, 0,1% SDS bei 42°C, wie in Maniatis et al. (1989), vorstehend, beschrieben. Andere dem Fachmann bekannte nutzbare Verfahren umfassen Hybridisieren in Lösung, und Dot- und Slot-RNA-Hybridisierung. Die in einer Probe vorhandene Menge an Zielnukleinsäure kann dann wahlweise durch Erfassen der Radioaktivität der hybridisierten Fragmente quantitativ erfasst werden, wobei dem Fachmann bekannte Standardverfahren zum Einsatz kommen.
Zusätzlich können zur Identifizierung weiterer Sequenzen Oligonukleotide verwendet werden, welche die Ziel-Proteinfamilie kodieren. Das Verfahren kann ebenfalls verwendet werden, genetische Sequenzen zu identifizieren, die mit den Nukleinsäuresequenzen assoziiert sind, welche die hier beschriebenen Proteine kodieren, um beispielsweise nichtkodierte Sequenzen zu identifizieren, die stromaufwärts oder stromabwärts der Proteinkodierenden Sequenz liegen und die eine funktionelle Rolle in einer Expression dieser Gene spielen können. Zusätzlich können Bindungs-Assays durchgeführt werden, um Proteine zu identifizieren und nachzuweisen, die zu einer spezifischen bindenden Wechselwirkung mit einer Nukleinsäure in der Lage sind, die ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein kodieren, das beispielsweise in der Gen-Regulation oder Gen-Expression des Proteins involviert sein kann. In einer weiteren Ausführungsform können die hier beschriebenen Assays verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle zu identifizieren und nachzuweisen, die eine Sequenz umfassen, die ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein erkennt und spezifisch davon gebunden werden kann.
Zusätzlich wird erwartet, dass durch Verwendung einer Kombination geeigneter Oligonukleotidprimer, d.h. mehr als ein Primer, der Fachmann den Grad der Expression eines Ziel-Gens durch Standard-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Verfahren in vivo bestimmen kann, beispielsweise durch quantitative PCR. Herkömmliche, auf PCR basierende Assays werden beispielsweise in Innes et al. (1990) „PCR Protocols; A guide to methods and Applications", Academic Press und Innes et al. (1995) "PCR Strategies", Academic Press, San Diego, CA erläutert.
3. Identifizierung von Proteinen, die in vivo mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen wechselwirken
Zusätzlich wird davon ausgegangen, dass der Fachmann unter Verwendung von Verfahren, wie nachstehend beschrieben, andere Moleküle identifizieren kann, die mit den hier beschriebenen, mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen in vivo wechselwirken. Derartige Moleküle können ebenfalls mögliche Ziele für eine Chemotherapie bereitstellen.
So kann beispielsweise cDNA, die Proteine oder Peptide kodiert, die mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen wechselwirken können, durch Verwenden eines Zwei-Hybrid-Assays nachgewiesen werden, wie in Durfee et al. (1993) Genes & Develop. 7: 555-559 berichtet wurde.
Das Prinzip des Zwei-Hybrid-Systems besteht darin, dass nicht-kovalente Wechselwirkung zweier Proteine einen Prozess (Transkription) einleiten, bei dem diese Proteine normalerweise keine direkte Rolle spielen, da sie kovalent an Domänen binden, die in diesem Prozess wirken. So tritt beispielsweise in dem Zwei-Hybrid-Assay eine nachweisbare Expression eines Reporter-Gens auf, wenn zwei Fusionsproteine wechselwirken, wobei eines eine DNA-bindende Domäne und eines eine Transkriptions-initierende Domäne umfasst.
Der Fachmann kann eine Wirtszelle verwenden, die ein oder mehrere Reporter-Gene umfasst, wie den Hefestamm Y153, in Durfee et al. (1993), vorstehend erläutert. Dieser Stamm trägt zwei chromosomal lokalisierte Reporter-Gene, deren Expression durch Gal4 gesteuert wird. Ein erstes Reporter-Gen ist das lacZ Gen von E. coli unter der Kontrolle des Gal4-Promoters. Ein zweites Reporter-Gen ist das wählbare HIS3-Gen. Andere nutzbare Reporter-Gene können beispielsweise das Luciferase-Gen, das LEU2-Gen und das GFP (grün fluoreszierendes Protein)-Gen umfassen.
In dem Zwei-Hybrid-System werden zwei Sätze an Plasmiden verwendet. Ein Satz an Plasmiden umfasst DNA, welche eine Gal4-DNA-bindende Domäne kodiert, die im Leseraster mit einer DNA fusioniert ist, die ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein kodiert. Der andere Satz an Plasmiden umfasst DNA, welche eine Gal4-Aktivierungsdomäne kodiert, die mit Teilen einer menschlichen cDNA-Bank, welche von menschlichen Lymphozyten abgeleitet wurde, fusioniert ist. Eine Expression des ersten Satzes an Plasmiden führt zu einem Fusionsprotein, das eine Gal4-DNA-bindende Domäne und ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein umfasst. Die Expression des zweiten Satzes an Plasmiden erzeugt ein Transkriptions-aktivierendes Protein, das mit einem Expressionsprodukt der LymphozytencDNA-Bank fusioniert ist. Werden beide Plasmide in eine gal-defiziente Wirtszelle, wie in die vorstehend beschriebenen Y153 Hefe-Zellen, transformiert, tritt eine Wechselwirkung der Gal-DNA-bindenden Domäne und der Transkriptions-aktivierenden Domäne nur dann auf, wenn das an die DNA-bindende Domäne fusionierte, mit Zervix-Krebs assoziierte Protein an ein Protein bindet, welches von der Lymphozyten-DNA-Bank fusioniert mit der Transkriptions-aktivierenden Domäne exprimiert wird. Als Ergebnis der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen dem mit Zervix-Krebs assoziierten Protein und seinem in vivo Bindungspartner tritt ein nachweisbarer Grad an Reporter-Gen-Expression auf.
Zusätzlich zur Identifizierung von Molekülen, die mit den mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen in vivo wechselwirken, kann der Fachmann auch Moleküle durchmustern, beispielsweise kleine Moleküle, welche eine spezifische Wechselwirkung zwischen einem mit Zervix-Krebs assoziierten Protein und seinem in vivo Bindungspartner ändern oder unterdrücken.
So kann beispielsweise eine Wirtszelle mit DNA transfiziert werden, welche ein geeignetes, DNA-bindende Domäne/Zervix-Krebs assoziiertes Protein-Hybrid und ein Translations-aktivierende Domäne/vermeintlicher Zervix-Krebs assoziiertes Protein bindender Partner, wie vorstehend offenbart, kodiert. Die Wirtszelle umfasst ebenfalls ein geeignetes Reporter-Gen in wirksamer Vereinigung mit einem cis-wirkenden Transkriptions-aktivierenden Element, welches von der Transkriptionsfaktor-DNA-bindenden Domäne erkannt wird. Der Grad an in dem System expressiertem Reporter-Gen wird untersucht. Dann wird die Wirtszelle einem Kandidatenmolekül ausgesetzt und der Grad an Reporter-Gen-Expression wird nachgewiesen. Eine Verringerung an Reporter-Gen-Expression zeigt die Fähigkeit des Kandidaten an, mit einer komplexen Anordnung oder Stabilität in Bezug auf das mit Zervix-Krebs assoziierte Protein und seines in vivo Bindungs-Partner zu interferieren. Als Kontrolle wird die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls mit anderen, nicht verwandten Protein-Protein-Komplexen zu interferieren ebenfalls untersucht. Moleküle, die spezifisch mit einer Zervix-Krebs assoziierten Proteinbindenden Partner-Wechselwirkung interferieren, jedoch nicht mit andere Protein-Protein-Wechselwirkungen, werden als Kandidaten zur Herstellung und weiteren Analyse identifiziert. Sobald ein möglicher Kandidat identifiziert wurde, kann seine Wirksamkeit in einer Modulation des Zellzyklus und der Zell-Replikation in einem Standard-Zellzyklus-Modellsystem untersucht werden.
Kandidatenmoleküle können wie nachstehend beschrieben hergestellt werden. So kann beispielsweise DNA, welche die Kandidatenmoleküle kodiert, unter Verwendung von in dem Fachgebiet beschriebenen herkömmlichen Techniken (siehe beispielsweise Maniatis (1989), vorstehend), in einem beliebigen einer Vielzahl von Expressionsvektoren eingefügt werden und in eine geeigneten Wirtszelle transfiziert werden, um rekombinante Proteine herzustellen, welche sowohl eine Volllängen- als auch eine verkürzte Form umfassen. Nutzbare Wirtszellen umfassen E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia patoris, das Insekten/Baculovirus-Zellsystem, Myelomzellen und verschiedene andere Säugetierzellen.
Die Volllängen-Formen derartiger Proteine werden vorzugsweise in Säugetierzellen, wie hier beschrieben, exprimiert. Die Nukleotidsequenzen umfassen vorzugsweise ebenfalls eine Sequenz, um die translatierte Sequenz zum (Zell)Kern zu bringen, beispielsweise durch Verwenden eine Sequenz, welche/die acht Aminosäuren der auf den Kerne zielenden Zielsequenz des grossen T Antigens, das im Stand der Technik charakterisiert ist, codiert. Der Vektor kann außerdem verschiedene Sequenzen zur Förderung der korrekten Expression des rekombinierten Proteins enthalten, einschließlich Transkriptionspromoter und Endsequenz, DNA-Sequenzen, die das Ablesen eines Gens verstärken (enhancer sequences), bevorzugte Ribosom-bindende Seitensequenzen, bevorzugte mRNA-Leadersequenzen bevorzugte Protein-Verarbeitungssequenzen, bevorzugte Signalsequenzen zur Proteinsekretion, und dergleichen. Die DNA-Sequenz, welche das interessierende Gen codiert, kann auch durch Verschiebung/Entfernung potentiell hemmender/blockierender Sequenzen oder durch Minimierung ungewünschter Ausbildung von Sekundärstrukturen manipuliert werden. Wie dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, kann das rekombinierte Protein auch als Fusionsprotein exprimiert werden.
Nach Translation kann das Protein aus den Zellen selbst aufbereitet oder aus dem Kulturmedium gewonnen werden. Die DNA kann auch Sequenzen beinhalten, die die Expression unterstützen und/oder die Aufreinigung des rekombinierten Proteins. Die DNA kann direkt exprimiert werden oder kann als Teil eines Fusionsproteins mit einer leicht spaltbaren Fusionsbindung exprimiert werden.
Die DNA kann auch in einem geeigneten Säugetierwirt exprimiert werden. Geeignete Wirte umfassen 3T3 Fibroblastenzellen (beispielsweise NIH 3T3 von CRL 1658) COS (Affenniere, ATCC, CRL-1650) oder CHO-Zellen (chinesischer Hamster Eierstock) (beispielsweise CHO-DXB11, von Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216-4222), Nerz Lungenepithel Zellen (MV1Lu), menschliche Präputium/Vorhaut Fibroblastzellen, menschliche Glioblastomazellen und Teratocarcinomazellen. Andere nützliche eukaryotische Zellsysteme umfassen/beinhalten Hefezellen, das Insekten/Baculovirus Zellsystem oder Myelomazellen.
Um ein Kandidatenmolekül zu exprimieren, wird die DNA in eine Insertionsstelle eines geeigneten, im Handel erhältlichen Vektors zusammen mit geeigneten Promotor-/Enhancer-Sequenzen und 3' Terminationssequenzen subkloniert. Brauchbare Kombinationen von Promotor-/Enhancersequenzen beinhalten den CMV Promoter (menschlicher Cytomegalovirus (MIE) Promoter), der beispielsweise in pCDM8 vorhanden ist, sowie den Brusttumor Virus Promotor (Brustkrebsvirus Promoter) (MMTV), der durch Rous Sarkom Virus (LTR) DNA-Enhancer-Sequenzen verstärkt ist (beispielsweise von Clonetech, Inc., Palo Alto). Ein geeigneter induzierbarer Promotor beinhaltet beispielsweise einen Zn²⁺ induzierbaren Promoter wie den Zn²⁺-Metallothionein Promoter (Wrana et al. (1992) Cell71: 1003-1014). Andere induzierbare Promotoren sind im Stand der Technik bekannt und können mit ähnlichem Erfolg eingesetzt werden. Die Expression kann weiter durch Verwendung trans-aktivierender Enhancer-Sequenzen erhöht werden. Das Plasmid umfasst weiter vorzugsweise einen amplifizierbaren Marker, wie DHFR, unter geeigneter Promaterkontrolle, beispielsweise SV40 früher Promoter (ATCC #37148). Die Bedingungen für Transfektion, Zellzüchtung, Genamplifizierung und Protein-Expression sind Standard-Bedingungen, bekannt aus dem Stand der Technik, sowie beschrieben beispielsweise in Ausubel et al., ed. (1989) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, NY. Kurz dargestellt werden transfektierte Zellen in einem Medium gezüchtet, das 5-10% dialysiertes fötales Kalbsserum (dFCS), wobei stabil transfizierte, hoch exprimierende Zelllinien erhalten werden durch Amplifizieren und Subklonen, und ausgewertet mit gewöhnlicher Western und Northern-Blot Analyse. Southern-Blots können weiter dafür eingesetzt werden, den Zustand der inserierten Sequenzen und deren amplifizierte Kopienanzahl.
Das exprimierte Kandidaten-Protein wird anschließend durch Verwendung von Standard-Verfahren aufgereinigt. Bei einer gegenwärtig bevorzugten Methode wird eine Affinitätssäule, wie eine Ligandenaffinitätssäule oder eine Antikörperaffinitätssäule eingesetzt. Die Säule wird dann gewaschen und das Kandidatenmolekül selektiv/gezielt auf einem Gradienten mit zunehmender Ionenkonzentration, durch die der pH-Wert geändert wird, eluiert oder durch Zugabe eines milden Detergens. Es ist klar, dass neben den Kandidatenmolekülen, die an das mit Zervikalkrebs assoziierte Protein binden, die mit Zervikalkrebs assoziierten Proteine selbst gleichermaßen produziert werden können durch Verwenden derartiger rekombinanter DNA-Technologien.
4. Zervikalkrebs-Therapie und Methoden zur Beobachtungstherapie
Der Fachmann kann nach Identifizierung des/der mit Zervikalkrebs assoziierten Proteins und Proteine, die mit den mit Zervikalkrebs assoziierten Proteine wechselwirken, verschiedene Therapien zur Behandlung von Zervikalkrebs entwickeln. Da die hier beschrieben Markerproteine gegenüber normalen Zervix-Zellen in nachweisbar höherem Maße vorhanden sind, kann der Durchschnittsfachmann Fachmann die Markerproteine und/oder Nukleinsäuren, welche die markierten Proteine codieren beispielsweise als Zielmoleküle für eine Krebs-Chemotherapie verwenden.
4.A. Auf anti-sense-basierende Therapie
Eine als besonders nützlich angesehene Krebstherapie ist eine Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär zu und unter physiologischen Bedingungen zur Hybridisierung an das gesamte Gen, welche das markierte Protein codiert, oder Teile davon, in der Lage ist, oder zur Hybridisierung an das gesamte Transkript, welche das markierte Protein codiert, oder Teile davon in der Lage ist, wobei die Transkription und/oder Translation des Markerprotein-Gens reduziert oder inhibiert wird. Alternativ kann die gleiche Technologie zur Reduzierung oder Inhibierung der Transkription und/oder Translation der Proteine eingesetzt werden, die mit den mit Zervikalkrebs-assoziierten Proteinen wechselwirken.
Anti-sense Oligonukleotide wurden verbreitet zum Einsatz gebracht, um Gen-Expression in normalen und abnormalen Zellen zu inhibieren. Siehe beispielsweise Stein et al. (1988) Cancer Res. 48: 2659-2668, für einen Überblick über die anti-sense Theorie und bekannte Protokolle. Ferner ist die Synthese und Verwendung von Peptid-Nukleinsäuren als anti-sense basierte Therapie in den PCT-Veröffentlichungen PCT/EP92/01219, veröffentlicht am 26. November 1992, PCT/US92/10921 veröffentlicht am 24. Juni 1993 und PCT/US94/013523 veröffentlicht am 1. Juni 1995, beschrieben.
Dementsprechend kann die anti-sense basierende Therapie als Teil der Chemotherapie genutzt werden, entweder allein oder in Kombination mit anderen Therapien.
Anti-sense Oligonukleotid- und Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen sind zur Hybridisierung mit einer Gen- und/oder mRNA-Kopie geeignet und kann daher verwendet werden, um Transkription und/oder Translation des Proteins wie hier beschrieben zu inhibieren. Es ist jedoch klar, dass Oligoribonukleotid-Sequenzen gewöhnlich gegenüber einem enzymatischen Angriff durch Ribonukleasen empfindlicher sind als Desoxyribonu kleotid-Sequenzen. Infolgedessen werden Oligodesoxyribonukleotide gegenüber Oligoribonukleotiden für therapeutische Zwecke in vivo bevorzugt. Es ist klar, dass die Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen im Gegensatz zu normalen Nukleinsäure-Sequenzen für Nuklease-Abbau nicht empfänglich sind und deshalb wahrscheinlich eine höhere Lebensdauer in vivo haben. Darüber hinaus ist klar, dass Peptid-Nukleinsäuresequenzen komplementäre einsträngige DNA- und RNA-Stränge stärker binden als entsprechende DNA-Sequenzen (siehe beispielsweise PCT/EP92/20702, veröffentlicht am 26. November 1992). Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen sind daher für therapeutische Zwecke im menschlichen Organismus bevorzugt.
Therapeutisch verwendbare anti-sense Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen können mit jeder der bekannten chemischen Oligonukleotid- und Peptid-Nukleinsäure-Synthese Methoden synthetisiert werden, die bekannt sind und ausführlich/ gründlich im Stand der Technik beschrieben sind. Alternativ kann eine komplementäre Sequenz ganz oder teilweise aus der natürlichen mRNA erzeugt/hervorgebracht werden durch Verwenden herkömmlicher rekombinanter DNA – Techniken.
Da die gesamte Nukleotid-Sequenz, die das gesamte Markerprotein codiert, sowie zusätzliche 5'- und 3'-nicht translatierte Sequenzen für jedes der Markerproteine bekannt ist und/oder leicht bestimmt werden kann durch Verwendung von im Stand der Technik bekannter Verfahren, können anti-sense Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen, welche mit einem beliebigen Teil der mRNA-Kopie oder nicht-codierten Sequenzen hybridisieren, durch Verwendung konventioneller Methodologien von Oligonukleotid- und Peptid-Nukleinsäure-Synthesen erstellt werden.
Oligonukleotide, die komplementär zu und hybridisierfähig mit einem beliebigen Teil der mRNA-Kopie sind, welche die markierten Proteine codiert, sind im Prinzip zur Inhibierung der Translation des Zielproteins wie hier beschrieben wirksam. So können beispielsweise, wie in der US-P-5,098,890, erteilt am 24. März 1992 beschrieben, Oligonukleotide, die komplementär zur mRNA bei oder nahe des Translationsstartcodons sind dazu verendet werden, die Translation zu blockieren. Außerdem wurde vorgeschlagen, dass Sequenzen, welche in der 3'-Richtung zu weit von der Translations-Startstelle entfernt sind, aufgrund eines eventuellen ribosomalen "read-through" (="durchlesen"), ein Phänomen, bei dem das Ribosom den anti-sense/sense Duplex entwirren soll, um eine Translation der Nachricht zu ermöglichen, weniger wirksam sind, mit mRNA-Kopien zu hybridisieren Eine Vielfalt an Sequenzlängen von Oligonukleotid- oder Peptid-Nucleinsäuren kann eingesetzt werden, um mit mRNA-Kopien zu hybridisieren. Sehr kurze Sequenzen (beispielsweise Sequenzen, welche weniger als 8-15- Nukleobasen beinhalten) können jedoch mit geringerer Spezifität binden. Außerdem können für die Verwendung im menschlichen Organismus kurze Oligonukleotidsequenzen besonders anfällig gegenüber enzymatischem Abbau sein. Peptid-Nucleinsäuren sind wie oben erwähnt wahrscheinlich gegenüber Nukleaseabbau resistent. Wenn Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen direkt an Zellen verabreicht werden sollen, können sehr lange Sequenzen aufgrund einer verminderten Aufnahme durch die Zielzelle weniger effizient hemmen. Infolgedessen sind, wenn die Oligonukleotid- oder die Peptid-Nukleinsäure direkt an Zellen verabreicht werden soll, Oligonukleotid- und/oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen, die mehr als 8-50 Nukleobasen und bevorzugter 15-30 Nukleobasen umfassen, vorteilhafter.
Ein alternatives Mittel zur Bereitstellung von anti-sense Oligonukleotid-Sequenzen für eine Zielzelle ist Gentherapie, bei der beispielsweise eine DNA-Sequenz, bevorzugt als Teil eines Vektors und verknüpft mit einem Promoter, im Wesentlichen konstitutiv in der Zielzelle exprimiert wird ist. Kürzlich beschrieben Oeller et al. (Oeller et al. (1992) Science 254: 437-539) die in vivo Hemmung des ACC-Synthase Enzyms, wobei eine konstitutiv exprimierbare DNA-Sequenz verwendet wurde, die eine anti-sense Sequenz der gesamten Länge der ACC-Synthase-Kopie codiert. Infolgedessen können, wenn die anti-sense Oligonukleotid-Sequenzen für eine Zielzelle indirekt bereitgestellt wird, beispielsweise als Teil einer exprimierbaren Gen-Sequenz, um innerhalb der Zelle exprimiert zu werden, längere Oligonukleotid-Sequenzen, einschließlich zu im Wesentlichen allen Protein codierenden Sequenzen komplementäre Sequenzen, vorteilhaft genutzt werden.
Schließlich umfassen potentiell therapeutisch nützliche Oligonukleotid-Sequenzen, nicht nur natürliche Oligomere, die aus natürlich vorkommenden Nukleotiden zusammengesetzt sind, sondern auch solche, die modifizierte Nukleotide beinhalten, um beispielsweise die Stabilität und Lipidlöslichkeit zu erhöhen und dadurch die zelluläre Aufnahme zu steigern. So ist beispielsweise bekannt, dass eine erhöhte Fettlöslichkeit/Lipidlöslichkeit und/oder Resistenz gegenüber Nuklease-Verdau von einer Substitution einer Methylgruppe oder eines Schwefelatoms durch ein Phosphat-Sauerstoff in der Internukleotid- Phosphodiester-Bindung hervorgerufen wird. Phosphorthionate ("S-Oligonukleotide", bei denen ein Phosphatsauerstoff durch ein Schwefelatom ersetzt ist), sind gewöhnlich gegenüber Nuklease-Abbau stabil, in Fetten löslich und bevorzugt, insbesondere für eine direkte Oligonukleotid-Verabreichung. S-Oligunukleotide können chemisch synthetisiert werden durch Verwendung herkömmlichre Synthesemethoden, die wohlbekannt und im Stand der Technik genau beschrieben sind.
Bevorzugte synthetische Internukleosid-Bindungen beinhalten Phosphorthionate, Alkylphosphonate, Phosphordithionate, Phosphatester, Alkylphosphorthinate, Phosphoramide, Carbamate, Carbonate, Phosphattriester, Acetamide und Carboxymethylester. Ferner kann eine oder mehrere der 5'-3' Phosphat-Gruppen kovalent an eine organische Gruppe mit niedrigen Molekulargewicht (beispielsweise 15-500 Da) gebunden sein, die beispielsweise kürzere Alkylketten oder aliphatische Gruppen (beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl), substituierte Alkyl- und aliphatische Reste (beispielsweise Aminoethyl, Aminopropyl, Aminohydroxyethyl, Aminohydroxypropyl), kleine Saccharide/Zucker oder Glykosylgruppen beinhalten. Andere niedermolekulare organische Änderungen beinhalten Zusätze an die internukleosiden Phosphat-Bindungen, wie Cholesterin- oder Diamin-Verbindungen mit wechselnder Anzahl an Kohlenstoff-Resten zwischen den Aminogruppen und endständiger Ribose. Oligonukleotide mit diesen Bindungen oder anderen Modifikationen können durch im Stand der Technik bekannten Methoden hergestellt werden (siehe beispielsweise US-P-5,149,798).
Geeignete Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen, welche die Transkription und/oder Translation des Marker-Proteins hemmen, können durch Verwendung von im Stand der Technik beschriebenen Standard in vivo Untersuchungen identifiziert werden. Vorzugsweise wird ein Bereich an Dosen eingesetzt, um effektive Konzentrationen zur Hemmung, sowie für die Spezifität der Hybridisierung zu bestimmen. So kann beispielsweise im Fall eines Oligonukleotids ein Dosisbereich von 0-100 μg Oligonukleotid/ml untersucht werden. Außerdem können die Oligonukleotide in die Zellen in einer einfachen Transfektion gebracht werden oder als Teil einer Reihe von Transfektionen. Die anti-sense Wirksamkeit kann durch Untersuchen der Veränderung der Zellproliferation im Zeitablauf nach Transfektion durch Verwendung gewöhnlicher Zellzähl-Methoden und/oder durch Überprüfung reduzierter Expression der Marker-Proteine, beispielsweise durch Immunfluoreszenz, bestimmt werden. Alternativ ist die Fähigkeit der Zellen, Thymidin aufzunehmen und zu verwenden ein anderes Standard-Mittel zur Untersuchung der Zellteilung und kann hier eingesetzt werden, beispielsweise unter Verwendung von ³H-Thymidin. Eine effektive anti-sense Hemmung sollte die Zellteilung ausreichend hemmen, um Thymidin-Aufnahme zu vermindern, die Zellproliferation zu hemmen und/oder feststellbare Marker-Proteine reduzieren.
Es wird davon ausgegangen, dass therapeutisch wirksame Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Konzentrationen in Anlehnung gemäß der Natur und des Grades an Tumoren, der speziell eingesetzten Nukleobasen-Sequenz, der relativen Empfindlichkeit des Neoplasmas (Tumors) gegenüber der Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenz und anderen Faktoren schwanken kann. Nützliche Bereiche für einen bestimmten Zelltyp und eine Oligonukleotid- und/oder Peptid-Nukleinsäure können mittels Durchführung gewöhnlicher Dosis-Bereich-Experimente (dosis range experiments) ermittelt werden. Dosis-Bereich-Experimente können auch zur Bestimmung der Toxizität gegenüber normalen und bösartigen Zellen durchgeführt werden. Es wird daran gedacht, dass nützliche Konzentrationen von etwa 1 bis 100 μg/mL pro 10⁵ Zellen reichen können.
Für die Verwendung im menschlichen Organismus können die Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen mit einem pharmazeutischen Träger kombiniert werden, wie einem geeigneten flüssigen Träger oder Exzipienten. Flüssige Träger und Exzipienten sind gebräuchlich und im Handel erhältlich. Beispiele dafür sind destilliertes Wasser, physiologische Salze, wässrige Lösungen von Dextrose und dergleichen. Für Krebstherapien im menschlichen Organismus, können die anti-sense Sequenzen vorzugsweise direkt an bösartige Zellen verabreicht werden, beispielsweise durch direkte Injektion in den Tumor. Alternativ kann die Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure systemisch verabreicht werden, vorrausgesetzt die anti-sense-Sequenz ist mit Mitteln zur Führung der Sequenzen zu den bösartigen Zielzellen verknüpft.
Zusätzlich zu der Verabreichung mittels herkömmlicher Träger, können anti-sense Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen durch eine Vielzahl spezialisierter Oligonukleotid-Zuführungs-Techniken verabreicht werden. So können beispielsweise Oligonukleotide in Liposomen/mit Liposomen verkapselt sein, wie in Mannino et al. (1988) BioTechnology 6: 682 und Felgner et al. (1989) Bethesda Res. Lab. Focus 11: 21 beschrieben. Lipide, welche zur Produktion liposomaler Rezepturen verwendbar sind, umfassen uneingeschränkt/ohne Einschränkung Monoglyceride, Diglyceride, Sulfatide, Lysolecithin, Phospholipide, Saponin, Gallensäuren und dergleichen. Eine Herstellung solcher liposomaler Rezepturen ist im Bereich des Fachwissens (siehe beispielsweise in den US-P-4,235,871; US-P-4,501,728; US-P-4,837,028 und US-P-4,737,323). Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann ferner Verbindungen wie Cyclodextrine und dergleichen einschließen, welche die Zuführung von Oligonukleotiden in Zellen erhöht. Wird die Zusammensetzung nicht systemisch verabreicht, sondern eher an die Stelle der Zielzellen injiziert wird, dann können kationische Detergentien (beispielsweise Lipofectin) zur Erhöhung der Aufnahme zugegeben werden. Ferner wurden wiederhergestellte Virushüllen erfolgreich eingesetzt, um RNA und DNA in Zellen zu bringen (siehe beispielsweise Arad et al. (1986) Biochem. Biophys. Acta. 859: 88-94).
Für therapeutische Zwecke in vivo, werden die anti-sense Oligonukleotid- und/oder Peptid-Nucleinsäure-Sequenzen dem Individuum in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht, beispielsweise in ausreichender Menge, um eine Expression des Zielproteins in bösartigen Zellen zu vermindern oder zu hemmen. Bei der verabreichten effektiven Dosierung kann berücksichtigt werden, die Art der Behandlung, ob prophylaktisch oder therapeutisch, das Alter, Gewicht, Gesundheit des Patienten, die Route der Verabreichung, die Größe und Art des bösartigen Tumors sowie andere Faktoren. Die tägliche Dosierung kann von etwa 0.01 bis 1,000 mg pro Tag reichen. Größere oder kleinere Mengen an Oligonukleotid- oder Peptid-Nukleinsäure-Sequenzen können wie nach Bedarf verabreicht werden. Wie den Fachleuten aus der Medizin, insbesondere der Chemotherapie klar ist, sind die Bestimmung geeigneter Dosierbereiche für eine in vivo Verabreichung für einen Krankenhausarzt Routineexperimente.
4.B. Auf Proteinbindung basierende Therapeutika
Wie vorstehend aufgeführt kann ein Krebsmarkerprotein oder ein Protein, das mit dem Krebsmarkerprotein wechselwirkt, als Ziel für die Chemotherapie verwendet werden. So kann beispielsweise bindendes Protein, welches gestaltet ist, das Markerprotein im Wesentlichen irreversibel zu binden, zu den bösartigen Zellen gebracht werden, beispielsweise durch Verbindung mit einem Liganden, der für die Zelle spezifisch ist und von dem bekannt ist, dass er von der Zelle absorbiert wird. Mittel zum Zielen von Molekülen auf bestimmte Zellen und Zelltypen sind in der Chemotherapie gut beschrieben.
Bindende Proteine können unter Verwendung von dem Fachmann wohlbekannten Techniken erhalten und getestet werden. So können beispielsweise die bindenden Bereiche von Antikörpern vorteilhaft verwendet werden. Jedoch ist auch zu bedenken, dass intakte Antikörper oder BABS, welche vorzugsweise humanisiert wurden, in der Praxis der Erfindung verwendet werden können. Wie hier verwendet, soll der Begriff "humanisiert" ein Verfahren bezeichnen, bei dem die Gerüstbereichsequenzen einer nicht-menschlichen variablen Immunoglobin-Region durch eine menschliche variable Bereichssequenz ersetzt ist. Dementsprechend sollen derartige humanisierte bindende Proteine eine schwächere Immunantwort als ihre nicht-humanen Gegenstücke auslösen. Insbesondere sind bindende Proteine nützlich, welche durch eine höhere Affinität für das Zielprotein, beispielsweise größer als ungefähr 10⁹ M^–1, gekennzeichnet sind. Alternativ kann DNA, die das bindende Protein kodiert, der Zielzelle als Teil eines exprimierbaren Gens bereitgestellt werden, welches in der Zelle exprimiert wird, wobei den in dem Fachgebiet wohl beschriebenen Gentherapieprotokollen gefolgt wird. Siehe beispielsweise die US-P-4,497,796 und "Gene Transfer", Vijay R. Baichwal, Herausgeber., (1986). Es wird erwartet, dass das Zielprotein, sobald es durch bindendes Protein gebunden ist, inaktiviert wird oder seine biologische Aktivität verringert wird, wodurch es inhibiert oder in der Zellteilung verzögert wird.
Wie vorstehend beschrieben, können zur in vivo-Verwendung geeignete bindende Proteine mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger, wie physiologische Kochsalzlösung oder andere in der Medizin gut charakterisierte nützliche Träger, kombiniert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzungen können den bösartigen Zellen direkt bereitgestellt werden, beispielsweise durch direkte Injektion, oder können systemisch bereitgestellt werden, vorausgesetzt das bindende Protein ist mit Mitteln zum Zielen des Proteins auf Zielzellen assoziiert. Schlussendlich können geeignete Dosisbereiche und Zelltoxizitätsniveaus unter Verwendung von Standard-Dosisbereich-Experimenten bewertet werden. Therapeutisch wirksame Konzentrationen können sich von ungefähr 0,01 auf ungefähr 1,000 mg pro Tag erstrecken. Wie vorstehend beschrieben können die tatsächlich verabreichten Dosierungen variieren in Abhängigkeit von beispielsweise der Natur des bösartigen Tumors, dem Alter, Gewicht und der Gesundheit des Individuums, so wie von anderen Faktoren.
4.C. Kleine Molekül-basierende Therapeutika
Nachdem mit Zervix-Krebs assoziierte Kemmatrix-Proteine isoliert wurden, kann der Fachmann unter Verwendung von in dem Fachgebiet wohlbekannten Methoden Banken kleiner Moleküle (entweder auf Peptiden oder auf Nicht-Peptiden-basierende Banken) überprüfen, um Kandidatenmoleküle zu identifizieren, welche die biologische Funktion der mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine verringern oder hemmen. Die kleinen Moleküle leisten diese Funktion vorzugsweise durch Verringern der in vivo Expression der Zielmoleküle oder durch Wechselwirkung mit dem Zielmolekül, wodurch entweder die biologische Aktivität des Zielmoleküls oder einer Wechselwirkung zwischen dem Zielmolekül und seinem in vivo bindenden Partner gehemmt wird.
Es wird davon ausgegangen, dass, sobald die Kandidaten kleiner Moleküle entschlüsselt wurden, der Fachmann die Wirksamkeit der kleinen Moleküle unter Verwendung vernünftiger, im Fachgebiet wohlbekannter Arzneimittelaufbau-Methoden verbessern kann. Alternativ kann der Fachmann eine Vielzahl an Computerprogrammen verwenden, welche den Fachmann unterstützen, quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (quantitative structure activity relationships, QSAR) zu entwickeln, die den Aufbau von zusätzlichen Kandidatenmolekülen de novo weiter unterstützen. Sobald identifiziert, können die kleinen Moleküle in handelüblichen Mengen hergestellt werden und den geeigneten Sicherheits- und Wirksamkeitsstudien unterzogen werden.
Es ist angedacht, dass die Selektions-Assays automatisiert werden können, wodurch die Untersuchung einer großen Anzahl an kleinen Molekülen zur gleichen Zeit erleichtert wird. Derartige Automationsverfahren befinden sich im fachmännischen Wissen für Arzneimitteluntersuchung und werden deshalb hier nicht erläutert.
Auf Kandidatenpeptid-basierende kleine Moleküle können durch Expression einer geeigneten Nukleinsäuresequenz in einer Wirtszelle oder unter Verwendung synthetischer organischer Chemie hergestellt werden. In gleichartiger Weise können Nicht-Peptidbasierende kleine Moleküle unter Verwendung herkömmlicher, in dem Fachgebiet wohlbekannter synthetischer organischer Chemie hergestellt werden.
Wie vorstehend beschrieben können zur in vivo Verwendung die identifizierten kleinen Moleküle mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger, wie physiologische Kochsalzlösung oder andere, in der Medizin gut charakterisierte nützliche Träger, kombiniert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzungen können den bösartigen Zellen direkt bereitgestellt werden, beispielsweise durch direkte Injektion, oder können systemisch bereitgestellt werden, vorausgesetzt das bindende Protein ist mit Mitteln zum Zielen des Proteins auf Zielzellen assoziiert. Schlussendlich können geeignete Dosisbereiche und Zelltoxizitätsniveaus unter Verwendung von Standard-Dosisbereich-Experimenten bewertet werden. Wie vorstehend beschrieben können die tatsächlich verabreichten Dosierungen variieren in Abhängigkeit von beispielsweise der Natur des bösartigen Tumors, dem Alter, Gewicht und der Gesundheit des Individuums, so wie von anderen Faktoren.
4.D. Methoden zum Beobachten des Status von Zervix-Krebs in einem Individumm
Das Fortschreiten von Zervix-Krebs oder die therapeutische Wirksamkeit einer Chemotherapie kann unter Verwendung von in Fachgebiet wohlbekannter Verfahren erfasst werden. So kann beispielsweise die Wirksamkeit eines speziellen chemotherapeutischen Mittels durch Erfassen der Menge an mit Zervix-Krebs assoziiertem Protein, welches von Zervix-Krebszellen beim Zelltod freigesetzt wird, bestimmt werden. Wie in der PCT-Veröffentlichung PCT/US92/09220, veröffentlicht am 13. Mai 1993, berichtet, werden durch Zellen nach Zelltod lösliche Kernmatrixproteine und Fragmente davon freigesetzt. Derartige lösliche Kernmatrixproteine können in einer Körperflüssigkeit quantifiziert werden und verwendet werden, das Ausmaß oder die Rate an Zelltod in einem Gewebe zu beobachten.
So wird beispielsweise die Konzentration eines in einer Körperflüssigkeit löslichen Kemmatrixproteins oder eines Fragments davon, die von Zellen freigesetzt werden, mit Richtwerten von gesunden, nicht behandeltem Gewebe verglichen. Flüssigkeitsproben werden in diskreten Intervallen während einer Behandlung gesammelt und mit dem Richtwert/Standard verglichen. Es ist angedacht, dass das Veränderungen in dem Spiegel eines in einer Körperflüssigkeit löslichen, mit Zervix-Krebs assoziierten Proteins für die Wirksamkeit einer Behandlung Indikativ sein wird (das heißt, die Rate an Tod von Krebszellen). Es ist abgedacht, dass die Freisetzung an in Körperflüssigkeit löslichen innerer Kernmatrix-Proteine im Blut, Plasma, Urin, Sputum, vaginalen Ausfluss und in Brustexudat erfasst werden kann.
Wenn der Assay verwendet wird eine Gewebelebensfähigkeit oder ein Fortschreiten von Zervix-Krebs zu beobachten, wird der Schritt eines Erfassens des Vorliegens oder des Fehlens der Markerproteine oder ihrer Transkripte in interessierenden Proben in Intervallen wiederholt und diese Intervalle werden dann verglichen, die Veränderungen in den erfassten Konzentrationen spiegeln Veränderungen in dem Zustand des Gewebes wieder. So kann beispielsweise eine Zunahme in dem Spiegel an mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen mit einem Fortschritt des Zervix-Krebs korrelieren. Wenn der Assay verwendet wird die Wirksamkeit einer Therapie zu bewerten, erfolgen die Beobachtungsschritte nach Verabreichung des therapeutischen Mittels oder Verfahrens (beispielsweise nach Verabreichen eines chemotherapeutischen Mittels oder nach einer Strahlenbehandlung). In gleichartiger Weise kann eine Abnahme des Spiegels an mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen mit einem Rückgang des Zervix-Krebs korrelieren.
Somit kann Zervix-Krebs durch das Vorliegen eines mit Zervix-Krebs assoziierten Proteins, wie hier gelehrt, identifiziert werden. Sobald identifiziert, kann der Zervix-Krebs unter Verwendung von Verbindungen behandelt werden, welche in vivo die Expression und/oder biologische Aktivität der mit Zervix-Krebs assoziierten Proteine verringern. Weiterhin können die hier bereitgestellten Verfahren verwendet werden das Fortschreiten der Krankheit und/oder Behandlung der Krankheit zu beobachten: Die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele stellen Details der Isolierung und Charakterisierung von mit Zervix-Krebs assoziierten Proteinen und Verfahren für ihre Verwendung in der Erfassung von Zervix-Krebs bereit.
Beispiel 1
Isolierung von mit Zervix-Krebs assoziierten Kernmatrix-Proteinen von Zervix-Krebs-Gewebeproben und Zellinien.
Mit Zervix-Krebs assoziierte Proteine wurden durch Vergleichen von silbergefärbten 2-D-Gel-Mustern von aus normalem und kanzerogenen Zervixzellen isolierten Proteinen identifiziert.
Es wurde frisches Zervixkarzinomgewebe von Patienten erhalten, die sich nach klinisch lokalisierten (Stadium IB, II oder III, Internationale Vereinigung von Gynäkologie und Geburtshilfe oder FIGO-Klassifizierung) Karzinomen des Gebärmutterhalses einer Entfernung der Gebärmutter unterzogen, von dem Instituto Nacional de Cancerologia in Mexiko City, Mexiko, in Übereinstimmung mit einer Zustimmung des Scientific and Ethics Committee Review Board. Eine geringe Anzahl an Tumorgewebe wurde unter Zustimmung des Institutional Review Boards von dem Krebszentrum Pittsburgh (Pittsburgh, PA) erhalten. Normales Zervixgewebe wurde unter Zustimmung des Institutional Review Boards von Patienten erhalten, die sich einer aus Gründen, die keine abnormale Zervixhistopathologie betrafen, einer Entfernung der Gebärmutter unterzogen, über das Cooperative Human Tissue Network (Columbus, OH). Klinische Daten und Tumorhistopathologie für zwanzig Patienten, die Gewebeproben zur Verwendung in diesen Experimenten bereitstellten, sind in Tabelle 1 gezeigt. Mit der Ausnahme eines Falles von XXX, waren alle Tumore XXX. Eine Mehrheit von diesen war von dem Großzell-nicht-keratinisierenden Typ. Alle Patienten wiesen eine lokalisierte Krankheit mit klinischen Stadien von IB bis IIIB auf (Tabelle 1). Tabelle 1: Alter des Patienten, klinisches Stadium und Histopathologie

⁺, Großzell-nicht-keratinisierendes Plattenepithelkarzinom
Großzell-keratinisierendes Platteneptihelkarzinom
*, Plattenepithelkarzinom, mäßig gut differenziert
Plattenepithelkarzinom, schwach differenziert

Während einer Operation wurde frisches Gewebe erhalten, in Transportmedium (RPMI 1640, mit Gentamicin und 10% fetalem Kälberserum (GIBCO) ergänzt), in Eis verpackt und mit einem Übernachtkurier zu Matritech, Inc. Transportiert. In einer kleinen Anzahl an Fällen, bei denen ein sofortiger Transport nicht möglich war, wurden Gewebeproben in flüssigem Stickstoff schockgefroren und auf Trockeneis durch einen Übernachtkurier zu Matritech, Inc. Gesendet. Eine minimale Größe der Gewebeproben betrug 0,2 Gramm. Eine Diagnose wurde von Pathologieberichten erhalten, welcher jede Probe begleitet hat.
Unter Verwendung einer nach Fey et al (1986), vorstehend erwähnt, veränderten Methode wurden aus zervikalem Krebsgewebe Kernmatrixproteine isoliert. Frische zervikale Krebsgewebeproben, welche sich in einer Größe von ungefähr 0,2 g bis ungefähr 1,0 g erstreckten, wurden von 20 verschiedenen Patienten erhalten. Die Gewebeproben wurde in kleine (1 mm3) Stücke zerkleinert und mit einem Teflon^®-Pistill auf Eis homogenisiert und mit einer gepufferten Lösung behandelt, welche 0,5% Triton^®-X-100, Vanadylribosidkomplex (RNAase-Inhibitor, Five Prime-Three Prime, Inc.), sowie einen Phenylmethylsulfonylfluorid (Sigma Chemical Co.), Aprotinin und Leupeptin (Boehringer Mannheim) umfassenden Proteaseinhibitorcocktail beinhaltet, um Lipide und lösliche Peptide zu entfernen.
Stromale Aggregate wurden durch Filtern des Homogenats durch ein 250 Micron Nitex-Nylon-Sieb (Tetko, Inc.) gefolgt von einem Zentrifugationsschritt (600 × g, 4 °C, 5 Minuten) entfernt. Lösliche Cytoskelettproteine wurden durch eine zehnminütige Inkubation des Pellets auf Eis in einem Extraktionsbuffer entfernt, welcher 250 mM (NH₄)₂SO₄, 0,5% Triton^®-X-100, Vanadylribosidkomplex und Proteaseinhibitorcocktail umfasst, gefolgt von einer Zentrifugation (600 × g, 4 °C, 5 Minuten).
Chromatin wurde durch Inkubation des Pellets in DNAase (100 mg/ml, Boehringer-Mannheim) in einer gepufferten, Proteaseinhibitorcocktail umfassenden Lösung für 45 Minuten bei 25 °C entfernt. Die verbleibende Pelletfraktion, welche Kernmatrixproteine und dazwischenliegende Filamente umfasste, wurde in Disassemblierungspuffer solubilisiert, welcher 8 M Harnstoff, Proteaseinhibitorcocktail und 1% (vol./vol.) 2-Mercaptoethanol umfasste. Unlösliche Fremdkörper, hautsächlich Kohlenhydrate und extrazelluläre Matrix, wurden durch Ultrazentrifugation (163 000 × g; 20 °C, 1 Stunde) entfernt. Dazwischenliegende Filamente konnten sich nach einem Entfernen von Harnstoff durch Dialyse in einem Assemblierungspuffer assemblieren, welcher 150 mM KCl, 24 mM Imidazol HCl, 5 mM MgCl₂, 0,125 mM EGTA und 2 mM Dithiothreitol (DTT) mit Proteaseinhibitoren umfasst, und wurden durch Ultrazentrifugation (109 000 × g, 15°C, 1,5 Stunden), wobei die Kernmatrixproteine in der Überstandsfraktion verblieben.
Zusätzlich wurden mit Zervikalkrebs assoziierte Proteine aus CaSki- ME-180-, C33A, Hela (S3-Unterlinie)-, SiHa-, C4-1-, C4-11- und HT3-Zervikaltumorzelllinien isoliert. Jede Zelllinie wurde von der „American Type Culture Collection" (ATCC) bezogen und bei 37°C in 5% CO2 in nach Dulbecco verändertem Eagles-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, Gentamicin, Fungizon und 0,12% SeraExtend (Irvine Scientific), gehalten. Für Kernmatrixextraktionsstudien wurden die Zellen auf ungefähr 80% Konfluenz in 10-Stadium-Zellkultur-Fabriken (Nunc) gezogen, durch Trypsinierung geerntet, gezählt und in der gleichartigen Weise wie homogenisiertes Tumorgewebe extrahiert. Die Proteinkonzentration an Kernmatrixproteinen wurde durch den Coomassie Plus Protein Assay Kit (Pierce Chemical) unter Verwendung eines bovinen gamma-Globulinstandards bestimmt. Die Proteine wurde unverzüglich in 80% Ethanol gefällt und bis zur Verendung bei –80°C gelagert.
Der so erhaltenen Kernmatrixproteine wurden weiter charakterisiert durch eine hochauflösende zwei-dimensionale Gelelektrophorese gemäß dem Vorgehen von O'Farrell(1975) J. Biol. Chem. 250: 4007-4021 (1975), in einem Investigator 2-D-System (Oxford Glycosystems, Bedford, MA). Kernmatrixproteine wurde zur isoelektrischen Fokussierungs (IEF)-Analyse in Probenpuffer solubilisiert, welcher 9 M Harnstoff, 65 mM 3-[(Cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propansulfat (CHAPS), 2,2% Ampholyte und 140 mM Dithiothreitol (DTT) umfasste. Pro Gel wurden zweihundert Mikrogramm an Kernmatrixproteinen geladen.
Ein-dimensionale isoelektrische Fokussierung wurde für 18 000 Voltstunden unter Verwendung von 1 mm × 18 mm Gelröhren durchgeführt. Nach einer Elektrophorese in einer ersten Dimension wurden die Gele von den Gelröhren ausgestoßen, für 2 Minuten in einem Buffer equilibriert, welcher 0,3 M Tris-Base, 0,075 M Tris-HCl, 3,0% SDS, 50 mM DTT und 0,01% Bromphenolblau umfasste, und auf einem 1 mm 10% Tris-Glycin-SDS-Duracryl (Oxford Glycosystems)-hoch reißfeste Polyacrylamid-Elektrophorese-Scheibengele platziert. Scheibengele für eine zweite Dimension wurden bei 16 Watt pro Gel und bei einer konstanten Temperatur von 12°C für ungefähr 5 Stunden einer Elektrophorese unterzogen. Molekulargewichtsstandards bestanden aus bovinem Albumin (M_r 66 000), Ovalbumin (M_r 45 000), Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (M_r 36 000), Kohlensäureanhydrase (M_r 29 000), bovines pankreatisches Trypsinogen (M_r 24 000) und Trypsininhibitor aus Sojabohne (M_r 20 100) (Sigma Chemical Co.). Die isoelektrischen Punkte wurden durch Verwendung internes Kontrollproteine mit gut charakterisierten isoelektrischen Punkten bestimmt. Nach einer Elektrophorese wurden die Gele in einer 40% Ethanol und 10% Essigsäure umfassenden Lösung fixiert, gefolgt von einer Behandlung mit einer 0,5% Glutaraladehyd umfassenden Lösung. Die Gele wurden ausführlich gewaschen und es wurde eine Silberfärbung gemäß der Methode von Rabillioud et al. ( Rabillioud et al. (1992) Electrophoresis 13: 429-439) unterzogen und zwischen Blättern von Cellophanpapier getrocknet.
Silbergefärbte Gele wurden unter Verwendung eines MasterScan Biological Imaging System (CSP, Inc., Billerica, MA) gemäß Herstellerangaben abgebildet. Es wurden digitale filternde Algorithmen verwendet, um sowohl einheitlichen als auch nicht einheitlichen Hintergrund ohne Entfernung kritischer Bilddaten zu entfernen. Es wurde eine Zwei-D-Scan ^TM zwei-dimensionale Gelanalyse und Datenbanksoftware (Version 3.1), welche mehrere Gauss Mindestquadratanpassungs-Algorithmen verwendet, um Punktmuster in optimale Passmodelle der Daten zu berechnen, wie bei Olson et al. (1980) Anal. Biochem. 169: 49-70 berichtet. Es wurde Triangulation von den internen Standards verwendet, um das Molekulargewicht und den isoelektrischen Punkt von jedem Zielprotein exakt zu bestimmen. Es wurde interpretierende Densiometrie unter Verwendung spezielle Softwareanwendungsmodulen durchgeführt, um die Daten in numerische und graphische Bereichte für jedes analysierte Gel zu integrieren.
Beispiele 2, 3 und 4 sind lediglich für beispielhafte Zwecke eingefügt und sollen kein Teil des Umfangs der beanspruchten Erfindung bilden.
Beispiel 2
Identifizierung von Zervix-Krebs-zugehörigen Kernmatrixproteine mit unterschiedlicher Erscheinung auf 2-D Gelen
Wie in dem vorstehend aufgeführten Beispiel beschrieben, wurden 2-D-Gelelektrophoresemuster durch Fraktionieren von aus entweder von normalen, oder kanzerogen Zervixzellen isolierten Proteinen erhalten. 1a zeigt eine typisches Proteinmuster von Zervix-Krebs-zugehörigen Kernmatrixprotein, welches durch von einer normalen Zervixgewebeprobe erhaltenen Kernmatrixproteine erzeugt wurde. Pro Gel wurden ungefähr 600 Proteine aufgetrennt. Die meisten der beobachteten Proteine lagen bereits vor, ungeachtet von dem Typ des untersuchten Zervixgewebes.
Ein Vergleich von 1 und 2 zeigt, dass, obwohl die meisten Proeteine in Krebs- und Nicht-Krebsgewebe identisch sind, dass fünf Proteine existieren, welche für die Zervix-Krebsprobe einzigartig sind (gekennzeichnet in 1). Die als CvC-1 bis CvC-5 bezeichneten Proteine wurden in 20 Gewebeproben erfasst, welche von mit Zervikalkarzinom diagonostizierten Patienten erhalten wurden, jedoch nicht in Zervikalgewebe erfasst wurden, welches von einer Gruppe von 10 normalen Individuen isoliert wurde. Tabelle 2 identifiziert die als CvC-1 bis Cvc-5 bezeichneten Proteine durch ihr ungefähres Molekulargewicht und ihren isoelektrischen Punkt. Sowohl das in Tabelle 1 aufgelistete Molekulargewicht und der isoelektrische Punkt sind ungefähr und genau bis auf 2 000 Dalton für das Molekulargewicht und bis auf 0,2 pI-Einheiten für den isolelektischen Punkt. Eine ausführliche Analyse der identifizierten Proteine, welche in normalen Zervikalgewebe vorliegen, jedoch in Zervikalkrebsgewebe fehlen, hat keine Proteine gezeigt, die speziell zu normalem Zervikalgewebe zugehörig sind.
Tabelle 2: Zervikalkrebs zugehörige Proteine
Zusätzlich wurde die Expression von Kernmatrixproteinen untersucht, die aus Zervix-Krebszelllinien isoliert wurden, wobei die Ergebnisse in nachstehend aufgeführter Tabelle 3 zusammengefasst sind. Es ist bekannt, dass Tumore von Epithelzellursprung durch das Vorliegen von Stroma und anderen Elementen, wie solche die vom einem Infiltrieren von eine Entzündungsreaktion fördernden Zellen resultieren. Ein Erfassen von Kernmatrix oder Matrix-zugehörigen Proteinen in von zervikalem Epithelzelltumoren abgeleiteten Tumor zelllinien verringert die Möglichkeit, dass die Proteine das Ergebnis von stromal oder anderen Arten einer Kontamination der Kernmatrix-Präparation sind.
Es wurden 2-D-Gel-Elektrophoresemuster von Proben erhalten, die Zervikalkrebszellen enthielten, welche von zervikalen Krebszelllinien abgeleitet wurden. 2a zeigt ein Zervikalkrebs-zugehöriges Kernmatrix-Proteinmuster, das von der Zervikalkrebszelllinie C33A erhalten wurde. In 2a sind die Tumor-zugehörigen Proteine CvC-2 und CvC-5 eingekreist und mit Zahlen 2 und 5 identifiziert. 2b zeigt ein Gelmuster, das von Kernmatrix-Proteinen erzeugt wurde, die von der Zervikalkrebszelllinie CaSki, einer normalen Zervikalgewebeprobe, erhalten wurde. In 2b sind die Tumor-zugehörigen Proteine CvC-1 und CvC-3 eingekreist und mit Zahlen 1 und 3 identifiziert.
Vier der fünf Tumor-zugehörigen Proteine (CvC-1 bis CvC-3 und CvC-5) wurden reproduzierbar in einer und in mehreren Zervikaltumor-Zelllinien erfasst (2, Tabelle 3), was den Epithelursprung der Proteine bestätigt. Eine Expression des fünften Proteins, CvC-4, war variable, konnte jedoch in der C33A-Tumorzelllinie (Tabelle 3) erfasst werden. Tabelle 3: Zervikalkarzinom-zugehörige Proteinexpression in Zervikaltumor-Zelllinien

* Kernmatrixproteine wurden unter Verwendung der Extraktionsmethode nach Fey und Penman von Tumorzellinien extrahiert, die von der „American Type Culture Collection" bezogen wurden.
⁺ Tumorzelllinien welche von einem metastasierenden Epidermoidkarzinom entstanden sind, welches vom Gebärmutterhals stammt.
Zeigt eine geringe Expression an, welche durch Silberfärbung nachgewiesen wurde.
Zeigt eine variable Expression an, welche durch Silberfärbung nachgewiesen wurde.

Zwei der Zervikalkrebs-zugehörigen Proteine, die für Zervikalkrebszellen spezifisch sind, wurden isoliert und für eine Mikrosequenzanalyse bearbeitet.
Beispiel 3
Charakterisierung von Zervikalkrebs-zugehörigen Kernmatrix-Proteinmarkern
Es wurden zwei auf einem 2-D-Gel erfassbare, färbende Proteinpunkt isoliert, welche CvC-3 und CvC-5 entsprachen, die Proteine wurden, wie hier nachstehend aufgeführt, geerntet und einer Mikrosequenzanalyse unterzogen.
Zum Sequenzieren wurden die Zervikalkrebs-zugehörigen Polypeptide CvC-3 und CvC-5, die Kernmatrixfraktion von HeLa-Zellen auf zwei-dimensionalen Gelen wie vorstehend aufgeführt elektrophoretisch getrennt. Jedes Gel wurde mit 300 Mikrogramm an Protein beladen, das durch das wie vorstehend aufgeführte Kernmatrix-Protein-Isolationsverfahren isoliert wurde. Nach der zweiten Dimension der Elektrophorese wurden die Proteine durch eine reverse/reversible Färbung sichtbar gemacht. In Kürze, es wurden Gele in 200 mM Imidazol für 10 Minuten getränkt, für 1 Minute in Wasser gespült, gefolgt von 1-2 Minuten in 300 mM Zinkchlorid (Fernandez-Patron et al., (1992) BioTechniques 12: 564-573). Nachdem die Protein-enthaltenden Punkte zu erscheinen begannen, wurden die Gele in Wasser platziert und die relevanten Gelpunkte herausgechnitten. Die isolierten Gelpunkte, die individuelle Zervikalkrebs-zugehörige Polypeptide repräsentieren, wurden vereinigt und durch ein 5-minütiges Waschen in 2% Zitronensäure entfärbt, gefolgt von mehreren Waschungen in 100 mM Tris Hydrochlorid bei einem pH-Wert von 7,0, um den pH-Wert in den Gelstücken anzuheben.
Jeder Satz an vereinigten Gelfragmenten wurde dann mit einem gleichen Volumen an 2 × Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Probenpuffer (250 mM Tris-HCl, 2% SDS, 20% Glycerin, 0,01% Bromphenolblau und 10% β-Mercaptoethanol, pH-Wert 6,8) verdünnt und bei 75°C für 3 Minuten inkubiert. Die Gel-Fragmentbeinhaltenden Proben wurden dann auf Eis gekühlt und auf ein 4% Polyacrylamid-Sammel/-11% Polyacrylamid Trenn-SDS-PAGE-Gel geladen und in 1 × Tankpuffer (24 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 1% SDS, pH-Wert 8,3) elektrophoretisch getrennt, um die Gelpunkte in Banden zu fokussieren. Auf jedem Gel wurden Molekulargewichtsmarker (BioRad # 161-0304) verwendet, um die auf den ein- und zwei-dimensionalen Gelen beobachteten Molekulargewichte in Beziehung zu setzen. Nach der elektrophoretischen Trennung wurden die Gele auf Immobilon PVDF-Membranen (Oxford Glycosystems, Inc.) elektrogeblottet (Towbin et al. (1979) Proc. Nat'1. Acod. Sci. USA 76: 4350-4354) wie durch Matsudaira für das Mini-Gelformat modifiziert (Matsudaira et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 10035). Die Membranen wurden dann für 1 Minute mit Buffalo-Schwarz (0,1% in 1% Essigsäure, 40% Methanol) gefärbt mit Wasser gespült. Membranbereiche, die Polypeptidbanden beinhalteten enthielten wurden mit einem sauberen Skalpell herausgeschnitten.
Die PVDF-gebundenen Polypeptide wurden dann einer tryptischen Peptid-Kartierung und einer Mikrosequenzierung (Fernandez et al. (1994) Analytical Biochem. 218: 112-117) an der Microchemistry Facility an der Worcester Stiftung für Biomedizinische Forschung unterzogen, wobei eine Hewlett Packard Modell 1090M HPLC verwendet wurde. Sequenzbestimmungen wurden an einem Applied Biosystems ProCise Sequenator durchgeführt, und wurden durch MALDI-TOF Massenspektroskopie von einzelnen Peptiden bestätigt. Andere Peptide wurden allein durch Massenanalyse oder Massenanalyse von Carboxypeptidasevedautem Material identifiziert.
Mikrosequenz-Analyse von CvC-3 Peptiden
Unter Verwendung der vorstehned aufgeführten Methode wurde CvC-3 von ungefähr 120 zwei-dimensionalen Gelen von HeLa-Kernmatrix isoliert und auf Immobilion-PVDF-Membranen zur Mikrosequenzanalyse refokussiert. Obwohl durch/mit Silberfärbung der als CvC-3 identifizierten Gelstelle lediglich ein Protein beobachtet wurde, führte ein Refokussiren des Proteins auf einem ein-dimensionalen 11% Minigel zu der Auflösung von zwei klar trennbaren Proteinbanden. Diese Proteine wurden als CvC-3H und CvC-3L markiert und getrennt einer Mikrosequenzanalyse unterzogen. Eine Analyse der tryptischen Karten deutet an, dass in den beiden auf dem refokussierenden Minigel gesehenen Banden zwei verschiedene Proteine beinhaltet waren, da in den Retentionszeiten der beiden Peptide wenig Überlagerung beobachtet wurde.
Durch Massenspektroskopie von sieben der CvC-3H-Spitzen wurden 10 Massen erfasst. Für 3 Peptide wurden Aminosäuresequenzen erhalten, zwei durch Edman-Abbau und eine durch Carboxypeptidae-MALDI-TOF-Analyse. Die in Tabelle 4 gezeigten für diese Peptide erhaltenen Sequenzen treffen ein als IEF SSP 9502 oder „neuartiges menschliches Kernphosphoprotein" bekanntes Protein (Honore et al. (1994), vorstehend aufgeführt; GenBank Accession Nr. L07758). Die vollständige Aminosäuresequenz für dieses Protein, wie von einer Gensequenz abgeleitet, ist in SEQ. ID Nr. 10 gezeigt. Sieben weitere Massen von in der CvC-3H tryptischen Karte getrennten Spitzenfraktionen, treffen ebenfalls jene von vorhergesagten tryptischen Fragmenten von diesem Protein. Massenkorrelationsdaten von tryptischen Peptiden von CvC-3H sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Das vorhergesagte Molekulargewicht des Kernphosphoproteins, basierend auf seiner Nukleotidsequenz, beträgt 55 kDa, wobei sein durch eine 2-D-Gel-Analyse beobachtetes Molekulargewicht 79 kDa beträgt. (Honore et al. (1994), vorstehend aufgeführt). Tabelle 4: Massenkorrelation von CvC-3H-abgeleiteten tryptischen Peptiden

* unterstrichene Sequenzen wurden durch Edman-Abbau bestätigt
** fett unterstrichene Sequenzen wurden durch Carboxypeptidase-Verdau bestätigt

Zusätzlich wurden durch Massenspektroskopie von vier von einem tryptischen Verdau von CvC-3L abgeleiteten Spitzen sieben Massen erfasst. Eine von diesen wurde direkt sequenziert und es wurde festgestellt, dass sie zu Cytokeratin 17 (Troyanoovsky et al. (1992), vorstehend aufgeführt; GenBank Accession Nr. Q04695) identisch ist. Sechs weitere Massen von Fraktionen, welche auf der CvC-3L tryptischen Karte getrennt wurden, treffen ebenfalls solche von vorhergesagten tryptischen Fragmenten von menschlichem Cytokeratin 17. Die Aminosäuresequenz für dieses Protein, von Troyanovsky et al. (1992), vorstehend aufgeführt, ist in SEQ ID Nr.: 18 gezeigt. In Tabelle 5 sind Massenkorrelationsdaten tryptischer Peptide von CvC-3L zusammengefasst. Das offensichtliche Molekulargewicht von CvC-3L (47,9 kDa) ist übereinstimmend mit der Erfassung eines Volllängenmoleküls von Cytokeratin 17 in Zervikaltumoren (vorhergesgates Molekulargewicht 48 kDa). Tabelle 5: Massenkorrelation von CvC-3L-abgeleiteten tryptischen Peptiden

* unterstrichene Sequenzen wurden durch Edman-Abbau bestätigt

Mikrosequenzanalyse von CvC-5 Peptiden
Es wurden zwei als CvC-5 identifizierte Gelpunkte von HeLa Kernmatrix von den gleichen praparativen zwei-dimensionalen Gelen gesammelt, die zur Sammlung von CvC-3 verwendet wurden. Es wurden ungefähr 100 Gelpunkte wie beschrieben gesammelt und auf Immobilion-PVDF-Membranen zur Mikrosequenzanalyse refokussiert. Während der anfänglichen Identifizierung von Tumor-zugehörigen Proteinen, wurde festgestellt, dass in einigen Zervikaltumoren zwei Proteine sehr eng zusammen in die als CvC-5 identifizierte Stelle zu wandern scheinen. Es war lediglich ein Protein klar offensichtlich. Wenn jedoch die Expression dieses Proteins in den Zervikaltumorzelllinien untersucht wurde, zeigten 3 von 8 Zelllinien das Vorliegen von mindestens zwei Proteinen in dem durch CvC-5 definierten Gebiet (Tabelle 3). Ohne zu wünschen durch Theorie gebunden zu sein, ist eine Erklärung für die offensichtliche Erfassung von lediglich einem Protein in dem CvC-5-Gelpunkt in vielen Tumoren, dass eines der Proteine reichlicher vorliegt, wobei dadurch das Vorliegen von anderen nah wandernden Proteinen maskiert wird. Wenn CvC-5-Gelpunkte vereinigt wurden und auf einem ein-dimensionalen Minigel refokussiert wurden, wurde lediglich eine zerstreut gefärbte Proteinbande erfasst.
Die tryptische Karte der zerstreuten, die Polypeptidkomponenten des CvC-5-Gelpunkts beinhalteten Bande beinhaltete ungefähr 30 aufgelöste Spitzen. Es wurde eine Massenanalyse von 12 dieser Spitzen durchgeführt und es wurden 30 Massen erhalten. Durch automatisierten Edman-Abbau wurden sechs Aminosäuresequenzen erhalten, welche das Vorliegen von drei verschiedenen Polypeptiden zeigen. Das erste von diesen ist ein als TDP-43 oder TAR DNA-bindendes Protein (Out et al. (1995), vorstehend aufgeführt; Gen Bank Accession Nr. U23731) bekannt. Die vollständige Aminosäuresequenz, wie von der Gensequenz für dieses Protein abgeleitet, ist in der SEQ. ID Nr. 26 gezeigt. Das apparente Molekulargewicht von 43 kDA schlägt eine Identifizierung des intakten Proteins in Zervikaltumoren vor. Sechs weitere Massen von auf der CvC-5 tryptischen Karte getrennten Fraktionen treffen ebenfalls solche von vorhergesgaten tryptischen Fragmenten dieses Proteins. Massenkorrelationsdaten und Peptidsequenzdaten von tryptischen Peptiden, die TDP-43 treffen, sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6: Massenkorrelation von CvC-5-abgeleiteten tryptischen Peptiden

* unterstrichene Sequenzen wurden durch Edman-Abbau bestätigt

Für drei Peptide erhaltene Sequenzinformation trafen ein Kernporenprotein, das als Nukleoporin oder Nup358 (Wu et al (1995) vorstehend aufgeführt, Gen Bank Accession Nr. L41840) bekannt ist. Die vollständige Aminosäuresequenz, wie von der Gensequenz abgeleitet, ist in SEQ ID Nr.: 34 gezeigt. Massenkorrelationsadten für fünf zusätzliche, von der CvC-5 tryptischen Karte identifiezierten Massen, welche die vorhergesagten tryptischen Fragmente von Nup358 treffen, sind in Tabelle 7 gezeigt. Die Stellen der Sequenzen, die Nup358 treffen, schlagen unsere Isolation eines C-terminalen Fragments des intakten Proteins (Mr 358 kDa) aus Zervikaltumoren vor. Tabelle 7: Massenkorrelation von CvC-5-abgeleiteten tryptischen Peptiden

* kennzeichnet ein Peptid, welches in zwei benachbarten HPLC-Fraktionen erschienen ist
** unterstrichene Sequenzen wurden durch Edman-Abbau bestätigt

Das dritte in dem CvC-5-Gelpunkt identifizierte Polypeptid ist ein Fragment von lamin A (Fisher et al. (1986), vorstehend aufgeführt; Gen Bank Accession Nr. M13452). Durch Edman-Abbau wurden zwei lamin A treffende Sequenzen erhalten (Tabelle 8). Neun zusätzliche Massen von Fragmenten der CvC-5 tryptischen Karte treffen vorhergesagte Massen eines tryptischen Fragments von lamin A. In Tabelle 8 sind Massenkorrelationsdaten für diese zusätzlichen Massen gezeigt. Die Aminosäuresequenz für dieses Protein, (Fisher et al. (1986), vorstehend aufgeführt, ist in SEQ. ID Nr.: 46 gezeigt. Tabelle 8: Massenkorrelation von CvC-5-abgeleiteten tryptischen Peptiden

Mit Zervikalkrebs-assoziierte Proteine können unter Verwendung wohlbekannter Techniken basierend auf der teilweisen vorstehend bereitgestellten Aminosäuresequenz identifiziert werden. Somit können die Zervikalkrebs-zugehörigen Proteine, welche gemäß den Methoden/Verfahren der Erfindung erfasst werden, als eine kontinuierliche Sequenz umfassend bezeichnet werden, welche in den vorstehend aufgeführten Sequenzfragmenten gezeigt ist. Es ist klar, dass der Fachmann, angesichts der vorstehend aufgeführten Offenbarung, in der Lage sein wird Antikörper herzustellen, welche gegen ein beliebiges Zervikalkrebs-zugehöriges Protein gerichtet ist, welches durch die hier beschriebenen Methoden/Verfahren identifiziert wurde. Weiterhin wird der Fachmann, angesichts der vorstehend aufgeführten Offenbarung, in der Lage sein Nukleinsäuresequenzen herzustellen, welche die vorstehende beschriebenen Fragmente kodieren, so wie dazu komplementäre Nukleinsäuresequenzen. Zusätzlich wäre der Fachmann unter Verwendung herkömmlicher rekombinater DNA-Methoden, beispielsweise durch Screenen einer cDNA-Bank mit einer derartigen Nukleinsäuresequenz, in der Lage Volllängen-Nukleinsäuresequenzen zu isolieren, welche Ziel-Zervikalkrebs-zugehörige Proteine kodieren. Derartige Volllängen- Nukleinsäuresequenzen, oder Fragmente davon, können verwendet werden Nukleinsäurebasierende Erfassungssysteme oder Therapeutika zu erzeugen.
Beispiel 4
Herstellung von Antikörpers, die spezifisch an Zervikalkrebs-zugehörige Proteine binden
Einmal identifiziert, kann ein mit Zervikalkrebs-assoziiertes Protein, wie CvC-1 bis CvC-5, in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeitsprobe unter Verwendung zahlreicher Bindungs-Assays, die dem Fachmann wohlbekannt sind, erfasst werden. So kann beispielsweise, wie vorstehend erläutert, ein mit Zervikalkrebs-assoziiertes Protein in entweder einer Gewebe- oder einer Körperflüssigkeitsprobe unter Verwendung eines Antikörpers erfasst werden, beispielsweise eines monoklonalen Antikörpers, der speziell an ein Epitop bindet, welches sich auf dem mit Zervikalkrebs assoziiertem Protein befindet. In derartiger Erfassungssystemen ist der Antikörper vorzugsweise mit einem erfassbaren Rest markiert.
Nachstehend ist ein beispielhaftes Protokoll für die Herstellung eines anti-mit Zervikalkrebs-assoziierten monoklonalen Antikörpers gezeigt. Andere Protokolle sind ebenfalls bekannt. Dementsprechend soll die spezielle Methode zum Herstellen von Antikörpern gegen Zielproteine nicht ein Aspekt der Erfindung sein.
Balb/c by J Mäuse (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) werden intraperitonal alle 2 Wochen mit dem Zielprotein, beispielsweise mit aus HeLa-Zell-Kernmatrix isoliertem CvC-3-Protein, injiziert, bis die immunisierten Mäuse den geeigneten Serumtiter erhalten. Danach werden die Mäuse mit 3 aufeinanderfolgenden intravenösen Boosten injiziert. Bei der ersten Injektion wird Freund's vollständiges Adjuvant (Gibco, Grand Island) verwendet, bei der zweiten Injektion unvollständiges Freunds; und für nachfolgende intravenöse Injektionen wird Kochsalzlösung verwendet. Das Tier wird dann getötet und seine Milz entfernt. Milzzellen (oder Lymphknotenzellen) werden dann mit einer Mausmyelom-Zelllinie fusioniert, beispielsweise unter Verwndung der Methode von Kohler et al. (1975) Nature 256: 495.
Hybridome, welche Antikörper erzeugen, die mit Zielproteinen reagieren werden dann geklont und als Aszites gewachsen. Hybridome werden gescreent durch Kernreaktivität gegen die Zelllinie, welche die Quelle des Immunogens ist, und durch Gewebehistochemie unter Verwendung von Standardverfahren, die in der Immunolgie bekannt sind. Ausführliche Beschreibungen von Screening-Protokollen, Ascites-Herstellung und Immunoassays sind ebenfalls der PCT/US92/09220, veröffentlicht am 13. Mai 1993 offenbart.
Beispiel 5
Antikörper-basierender Assay zum Erfassen von Zervikalkrebs in einem Individuum
Der folgende Assay wurde für Gewebeproben entwickelt, es ist jedoch klar, dass gleichartige Assays zum Testen von Flüssigkeitsproben ohne übermäßiges Experimentieren entwickelt werden können. Ein typischer Assay kann einen herkömmlichen Immunoerfassungs-Kit, beispielsweise den ABC Elite-Kit von Vector Laboratories, Inc., nutzen.
Eine Biopsie-Probe, beispielsweise ein Papanicolaou-Schmier wird vom zu untersuchenden Patienten gemäß der geeigneten medizinischen Richtlinien entfernt. Die Probe wird dann auf einen Glassobjekträger aufgebracht und die Probe wird für 10 Minuten in kaltem Aceton fixiert. dann wird der Objekträger in detilliertem Wasser gespült und mit einer Wasserstoffperoxid beinhaltenden Lösung (2 ml 30% H₂O₂ und 30 mL kaltes Methanol) vorbehandelt. Der Objektträger wird dann in einem Puffer A gespült, der Tris gepuffertes Kochsalzlösung (TBS) mit 0,1% Tween (R) und 0,1% Brij (R) beinhaltet. Es wird ein Maus anti mit Zervikalkrebs assoziiertes Protein- monoklonaler Antikörper in Puffer A zu dem Objektträger zugegeben und der Objektträger wird dann für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Objektträger wird dann mit Puffer A gewaschen, und ein sekundärer Antikörper (ABC Elie Kit, Vector Labs, Inc) in Puffer A wird dem Objektträger zugegeben. Der Objekträger wird dann für 15 Minuten bei 37 °C in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Objekträger werden wieder mit Puffer A gewaschen, und das ABC Reagent (ABC Elie Kit, Vector Labs, Inc) wird dann zu dem Objektträger zur Verstärkung des Signals zugegeben. Der Objekträger wird dann für weitere 15 Minuten bei 37 °C in der feuchten Kammer inkubiert.
Der Objektträger wird dann in destilliertem Wasser gewaschen, und ein Diaminobenzendine (DAB)-Substrat wird zu dem Objektträger für 4-5 Minuten zugegeben. Der Objekträger wird dann in destilliertem Wasser gespült, mit Hematoxylin counterstained, mit 95% Ethanol gespült, mit 100% Ethanol gespült, und dann mit Xylen gespült. Es wird dann ein Deckglas auf den Objektträger aufgebracht und das Ergebnis durch Lichtmikroskopie betrachtet. SEQUENCE LISTING

Claims

Verfahren zum Nachweis von Zervix-Krebs in einem Menschen, welches umfasst: Nachweisen in einer von dem Menschen isolierten Probe der Anwesenheit eines Proteins, welches eine Aminosäure-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10, wobei die Anwesenheit des Proteins Zervix-Krebs in dem Menschen anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:1 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:3 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:4 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:5 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:6 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:7 gezeigte Aminosäue-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch l, wobei das Protein die in SEQ ID NO:8 gezeigte Aminosäue-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:9 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Protein die in SEQ ID NO:10 gezeigte Aminosäure-Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Gewebe- oder eine Köperflüssigkeits-Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Biopsie-Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe eine Zervixzellen-Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe ein Papanicolaou-Schmier ist.
Verfahren zum Nachweis von Zervix-Krebs in einem Menschen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) In Kontakt bringen einer von dem Menschen erhaltenen Probe mit einer Bindungsgruppe, welche spezifisch an ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein bindet, unter Herstellung eines Bindungsgruppe-Zervix-Krebs assoziiertes Protein-Komplex, wobei die Bindungsgruppe dadurch gekennzeichnet ist, dass sie spezifisch an ein Protein binden kann, welches die in SEQ ID NO:10 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst; und (b) Nachweisen der Anwesenheit des Komplexes, wobei die Anwesenheit des Komplexes die Anwesenheit von Zervix-Krebs in dem Menschen zeigt.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Probe eine Gewebe- oder Körperflüssigkeits-Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Probe eine Biopsie-Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Probe ein Papanicolaou-Schmier ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Probe eine Zervixzellen-Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Bindungsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antikörper-Fragment und einer biosynthetischen Antikörper-Bindungsstelle.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Bindungsgruppe ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Antikörper mit einer nachweisbaren Gruppe markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der monoklonale Antikörper mit einer nachweisbaren Gruppe markiert ist.
Verfahren zum Nachweis von Zervix-Krebs in einem Menschen, umfassend: Nachweisen der Anwesenheit eines Nukleinsäure-Moleküls in einer Gewebe- oder Körperflüssigkeits-Probe des Menschen, um die Anwesenheit eines Zervix-Krebs in dem Menschen anzuzeigen, wobei das Nukleinsäure-Molekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Nukleinsäure-Molekül, welches eine Sequenz umfasst die spezifisch an ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein binden kann, welches eine Aminosäure-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10; und (b) einem Nukleinsäure-Molekül, welches eine Nukleotid-Sequenz umfasst, die ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein codiert, welches eine Aminosäure-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus, SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10.
Verfahren nach Anspruch 26, welches den zusätzlichen Schritt der Umsetzung der Probe mit einer markierten Hybridisierungs-Probe umfasst, welche mit mindestens einem Bereich des Nukleinsäure-Moleküls spezifisch hybridisieren kann.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Nukleinsäure-Molekül spezifisch an ein mit metastasierendem Zervix-Krebs assoziiertes Protein binden kann, und wobei die Anwesenheit des Nukleinsäure-Moleküls die Anwesenheit von metastasierendem Zervix-Krebs anzeigt.
Kit zum Nachweis der Anwesenheit von Zervix-Krebs oder zur Bewertung der Wirksamkeit einer therapeutischen Behandlung von Zervix-Krebs, wobei der Kit in Kombination umfasst: (a) einen Behälter zur Aufnahme einer menschlichen Gewebe- oder Körperflüssigkeits-Probe; und (b) eine Bindungs-Gruppe, welche spezifisch an ein mit Zervix-Krebs assoziiertes Protein binden kann, das eine Aminosäure-Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9 und SEQ ID NO:10.
Kit nach Anspruch 29, welcher weiter eine Referenz-Probe enthält, welche für eine normale Zervixzelle steht.
Kit nach Anspruch 29, wobei die Bindungs-Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, einem Antikörper-Fragment und einer biosynthetischen Antikörper-Bindungsstelle.