DE69735354T2 - Verbesserungen an oder in verbindung mit diagnostischen/therapeutischen verbindungen - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf diagnostische und/oder therapeutisch wirksame Mittel, insbesondere auf diagnostische und/oder therapeutisch wirksame Mittel, die Einheiten eingebaut haben, die wechselwirken mit oder eine Affinität haben für Stellen und/oder Strukturen innerhalb des Körpers derart, dass die diagnostische Bildgebung und/oder die Therapie bestimmter Stellen innerhalb des Körpers verbessert werden können. Von besonderem Interesse sind diagnostische Mittel zur Verwendung bei der Ultraschallbildgebung, die im folgenden als zielausgerichtete Ultraschallkontrastmittel bezeichnet werden.
  • Es ist gut bekannt, dass die Ultraschallbildgebung ein möglicherweise wertvolles Diagnosewerkzeug umfasst, z.B. in Studien des vaskulären Systems, insbesondere in der Kardiographie, und der Gewebe-Mikrovaskulatur. Eine Vielfalt von Kontrastmitteln wurde vorgeschlagen, um die so erhaltenen akustischen Bilder zu verstärken, einschließlich Suspensionen von Feststoffteilchen, emulgierte Flüssigkeitstropfen, Gasbläschen und eingekapselte Gase oder Flüssigkeiten. Es ist allgemein akzeptiert, dass Kontrastmittel niedriger Dichte, die auf einfache Weise komprimierbar sind, in Bezug auf die akustische Rückstreuung, die sie erzeugen, besonders effizient sind, und es wurde deshalb ein beträchtliches Interesse für die Herstellung von Gas-enthaltenden und Gas-erzeugenden Systemen gezeigt.
  • Gas-enthaltende Kontrastmedien sind auch als bei der Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung wirksam bekannt, z.B. wie Suszeptibilitäts-Kontrastmittel, die zum Reduzieren der MR-Signalintensität wirken werden. Sauerstoff-enthaltende Kontrastmedien repräsentieren auch möglicherweise nützliche paramagnetische MR-Kontrastmittel.
  • Außerdem wurde auf dem Gebiet der Röntgenstrahlungs-Bildgebung beobachtet, dass Gase, wie Kohlendioxid, als negative orale Kontrastmittel oder intravaskuläre Kontrastmittel verwendet werden können.
  • Die Verwendung von radioaktiven Gasen, z.B. radioaktive Isotope von inerten Gasen, wie Xenon, wurde auch in der Szintigraphie vorgeschlagen, z.B. für die Bloodpool-Bildgebung.
  • Zielausgerichtete Ultraschall-Kontrastmittel können betrachtet werden als umfassend (i) eine Reportereinheit, die zum Wechselwirken mit Ultraschallstrahlung fähig ist, um ein detektierbares Signal zu erzeugen; (ii) einen oder mehrere Vektoren mit einer Affinität für bestimmte Zielstellen und/oder -strukturen innerhalb des Körpers, z.B. für spezifische Stellen oder Gebiete von Pathologie; und (iii) einen oder mehrere Linker, die den Reporter und den (die) Vektor(en) verbinden, in dem Fall, dass diese nicht direkt verbunden sind.
  • Die Moleküle und/oder Strukturen, für die beabsichtigt ist, dass das Mittel daran bindet, werden im folgenden als das Ziel bezeichnet. Um eine spezifische Bildgebung einer oder einen therapeutischen Effekt bei einer ausgewählten Region/Struktur im Körper zu erhalten, muss das Ziel in dieser Region/Struktur vorhanden und verfügbar sein. Idealerweise wird es nur in dem Bereich von Interesse exprimiert werden, aber üblicherweise wird es auch an anderen Stellen im Körper vorhanden sein, was mögliche Untergrundprobleme erzeugt. Das Ziel kann entweder eine definierte molekulare Spezies (d.h. ein Zielmolekül) oder ein unbekanntes Molekül oder eine komplexere Struktur (d.h. eine Zielstruktur) sein, die im abzubildenden und/oder zu behandelnden Bereich vorhanden ist, und ist fähig, spezifisch oder selektiv an ein gegebenes Vektormolekül zu binden.
  • Der Vektor wird an die Reportereinheit geknüpft oder gebunden, um diese Einheiten an den Bereich/die Struktur, der/die abgebildet und/oder behandelt werden soll, zu binden. Der Vektor kann spezifisch an ein ausgewähltes Ziel binden, oder er kann nur selektiv binden, wobei er eine Affinität auch für eine begrenzte Anzahl von anderen Molekülen/Strukturen besitzt, was wiederum mögliche Untergrundprobleme erzeugt.
  • Es gibt einen begrenzten Teil des Stands der Technik, der sich auf zielausgerichtete Ultraschallkontrastmittel bezieht. So ist z.B. US-A-5531980 auf Systeme gerichtet, in denen der Reporter eine wässrige Suspension von Luft- oder Gasmikrobläschen umfasst, die durch einen oder mehrere film-bildende oberflächenaktive Mittel stabilisiert sind, die zumindest teilweise in lamellarer oder laminarer Form vorhanden sind, wobei das (die) oberflächenaktive Mittel an einen oder mehrere Vektoren gebunden ist (sind), die „bioaktive Spezies, bestimmt für spezifische Zielausrichtungs-Zwecke" umfassen. Es wird behauptet, dass die Mikrobläschen nicht direkt von einem oberflächenaktiven Material eingekapselt sind, sondern vielmehr, dass dies in Flüssigkeitsgefüllte Liposomen eingebaut ist, die die Mikrobläschen stabilisieren. Es wird anerkannt werden, dass lamellares oder laminares oberflächenaktives Material, wie Phospholipide, die in derartigen Liposomen vorhanden sind, unvermeidbar in der Form von einer oder mehreren Lipid-Bischichten vorhanden sind, wobei die lipophilen Schweife „Rücken-an-Rücken" und die hydrophilen Köpfe sowohl innerhalb als auch außerhalb sind (siehe z.B. Schneider, M. on „Liposomes as drug carriers: 10 years of research" in Drug targeting, Nyon, Schweiz, 3–5 Oktober 1984, Buri, P. und Gumma, A. (Hrsg.) Elsevier, Amsterdam 1984).
  • EP-A-0727225 beschreibt zielausgerichtete Ultraschallkontrastmittel, in denen der Reporter eine Chemikalie umfasst, die einen ausreichenden Dampfdruck derart besitzt, dass ein Anteil davon ein Gas bei der Körpertemperatur des Subjekts ist. Diese Chemikalie ist assoziiert mit einem oberflächenaktiven Mittel oder Albumin-Träger, der einen auf Protein, Peptid oder Kohlenhydrat basierenden Zelladhäsionsmolekül-Liganden als einen Vektor umfasst. Die Reportereinheiten in derartigen Kontrastmitteln entsprechen den Phasenverschiebungs-Kolloid-Systemen, die in WO-A-9416739 beschrieben sind; es wird nun erkannt, dass die Verabreichung derartiger Phasenverschiebungs-Kolloide zur Erzeugung von Mikrobläschen führen kann, die unkon trollierbar wachsen, möglicherweise in dem Ausmaß, bei dem sie möglicherweise eine gefährliche Embolisation von z.B. der Myokardvaskulatur und dem Gehirn verursachen (siehe z.B. Schwarz, Advances in Echo-Contrast [1994(3)], Seiten 48–49).
  • WO-A-9320802 schlägt vor, dass eine gewebespezifische Ultraschallbildverstärkung erreicht werden kann unter Verwenden von akustisch-reflektiven oligolamellaren Liposomen, die an gewebespezifische Liganden, wie Antikörper, Peptide, Lektine, etc. konjugiert sind. Die Liposomen können absichtlich als frei von Gas gewählt werden, und werden so die vorteilhaften echogenen Eigenschaften von auf Gas basierenden Ultraschallkontrastmitteln nicht aufweisen. Weitere Bezugnahmen auf diese Technologie, z.B. bei der Zielausrichtung auf Fibrin, Thrombi und atherosklerotische Gebiete werden gefunden in Veröffentlichungen von Alkanonyuksel, H. et al. in J. Pharm. Sci. (1996) 85(5), 486–490; J. Am. Coll. Cardiol. (1996) 27(2) Suppl A, 298A; und Circulation, 68 Sci. Sessions, Anaheim 13–16 November 1995.
  • Es gibt auch eine Anzahl von Publikationen, die Ultraschallkontrastmittel betreffen und die sich darauf beziehen, auf eine mögliche Verwendung monoklonaler Antikörper als Vektoren überzugehen, ohne signifikante praktische Details anzugeben, und/oder auf Reporter, die Materialien umfassen, die vom retikuloendothelialen System aufgenommen werden können und dadurch die Bildverstärkung von Organen, wie die Leber zu ermöglichen – siehe z.B. WO-A-9300933, WO-A-9401140, WO-A-9408627, WO-A-9428874, US-A-5088499, US-A-5348016 und US-A-5469854.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass Gas-gefüllte Mikrobläschen, die von Monolagen filmbildender oberflächenaktiver Materialien stabilisiert sind, besonders nützliche Reporter bei zielausgerichteten diagnostischen und/oder therapeutischen Mitteln sind. So verstärkt z.B. die Flexibilität und Deformierbarkeit derartiger dünner Monolagen-Membranen im wesentlichen die Echogenizität von derartigen Reportern im Verhältnis zu Liposomensystemen, die Lipid-Bilagen oder mehrere derartiger Bilagen enthalten. Dies kann die Verwendung von sehr niedrigen Dosierungen des Reportermaterials erlauben, um eine hohe Ultraschallkontrast-Wirksamkeit zu erreichen, mit nachfolgenden Sicherheitsvorteilen.
  • So wird gemäß eines Aspektes der vorliegenden Erfindung ein zielausrichtbares diagnostisches und/oder therapeutisch wirksames Mittel bereitgestellt, z.B. ein Ultraschallkontrastmittel, umfassend eine Suspension in einer wässrigen Trägerflüssigkeit, z.B. einer injizierbaren Trägerflüssigkeit, eines Reporters, der Gas-gefüllte Mikrobläschen umfasst, die von Monolagen eines film-bildenden oberflächenaktiven Materials stabilisiert sind, wobei das Mittel weiter mindestens einen Vektor umfasst.
  • Der Begriff „Monolage" wird hier verwendet, um anzugeben, dass die amphiphilen oberflächenaktiven Einheiten Monolagenfilme oder Membranen bilden, die den sogenannten Langmuir-Blodgett-Filmen an den Gas-Flüssigkeits-Grenzflächen ähnlich sind, wobei die lipophilen Teile der Amphiphile sich in Richtung der Gasphase ausrichten und die hydrophilen Teile mit der Wasserphase wechselwirken.
  • Wie in WO-A-9729783 angegeben, wird geglaubt, dass die elektrostatische Abstoßung zwischen geladenen Phospholipidmembranen die Bildung stabiler und stabilisierender Monolagen an Mikrobläschen-Trägerflüssigkeits-Grenzflächen fördert. Es wird geglaubt, dass die Flexibilität und Deformierbarkeit derartiger dünner Membranen die Echogenizität von Produkten gemäß der Erfindung, die hier offenbart sind, im Vergleich zu Gas-gefüllten Liposomen, die eine oder mehrere Lipid-Bischichten umfasst, verstärkt. Die Menge an Phospholipid, die zum Stabilisieren derartiger Mikrobläschen-enthaltender wässriger Suspensionen verwendet wird, kann so gering sein wie jene, die für die Bildung einzelner Monolagen von oberflächenaktivem Mittel um jedes Gas-Mikrobläschen notwendig ist, wobei die resultierende Film-artige Struktur die Mikrobläschen gegen Zusammenfallen oder Koaleszenz stabilisiert. Es wird geglaubt, dass Mikrobläschen mit einer Liposomen-artigen oberflächenaktiven Bilage nicht erhalten werden, wenn derartige niedrige Phospholipidkonzentrationen verwendet werden.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung basiert auf der zusätzlichen Erkenntnis, dass eine begrenzte Adhäsion an Ziele eine hochnützliche Eigenschaft von diagnostischen und/oder therapeutisch wirksamen Mitteln ist, wobei die Eigenschaft unter Verwenden von Vektoren erreicht werden kann, die eine temporäre Retention ergeben, eher als eine fixierte Adhäsion an ein Ziel. So können derartige Mittel, eher als fest an spezifischen Stellen zurückgehalten zu werden, z.B. effektiv eine Form eines verzögerten Flusses entlang des vaskulären Endotheliums aufgrund ihrer transienten Wechselwirkungen mit endothelialen Zellen zeigen. Derartige Mittel können so an den Wänden von Blutgefäßen konzentriert werden, wobei im Falle von Ultraschallkontrastmitteln eine verstärkte Echogenizität davon im Verhältnis zum Volumen des Blutstroms bereitgestellt wird, dem anatomische Merkmale fehlen. Sie können deshalb eine verstärkte Bildgebung des Kapillarsystems, einschließlich der Mikrovaskulatur erlauben, und können so die Unterscheidung zwischen normalem und unangemessen durchblutetem Gewebe, z.B. im Herzen erleichtern und können auch bei der Sichtbarmachung von Strukturen, wie Kupffer-Zellen, Thrombi und atherosklerotischen Läsionen oder zum Sichtbarmachen von neo-vaskularisierten und entzündeten Gewebegebieten nützlich sein. Die vorliegende Erfindung ist besonders geeignet, um Änderungen darzustellen, die in normalen Blutgefäßen auftreten, die in Gebieten von Gewebenekrose positioniert sind.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere Vektoren innerhalb des Reporters auf eine Weise verknüpft oder enthalten sein, dass die Vektoren nicht einfach dem Ziel oder Zielrezeptoren ausgesetzt sind. Eine vergrößerte Gewebespezifität kann deshalb erreicht werden durch Anwenden eines zusätzlichen Prozessen, um die Vektoren zu bestrahlen, z.B. durch Bestrahlen des Mittels nach der Verabreichung mit externem Ultraschall, um so die Diffundierbarkeit der Einheiten, die die Vektoren enthalten, zu modifizieren.
  • Ein beliebiges biokompatibles Gas kann im Reporter vorhanden sein, wobei der Begriff „Gas", wie hier verwendet, beliebige Substanzen (einschließlich Mischungen) im wesentlichen oder vollständig in gasförmiger (einschließlich Dampf-) Form bei der normalen Temperatur des menschlichen Körpers von 37°C zu umfassen. Das Gas kann deshalb z.B. umfassen Luft; Stickstoff; Sauerstoff; Kohlendioxid; Wasserstoff; ein inertes Gas, wie Helium, Argon, Xenon oder Krypton; ein Schwefelfluorid, wie Schwefelhexafluorid, Dischwefeldecafluorid oder Trifluormethylschwefelpentafluorid; Selenhexafluorid; ein gegebenenfalls halogeniertes Silan, wie Methylsilan oder Dimethylsilan; einen Kohlenwasserstoff eines niedrigen molekularen Gewichts (z.B. enthaltend bis zu 7 Kohlenstoffatomen), z.B. ein Alkan, wie Methan, Ethan, ein Propan, ein Butan oder ein Pentan, ein Cycloalkan, wie Cyclopropan, Cyclobutan oder Cyclopentan, ein Alken, wie Ethylen, Propen, Propadien oder ein Buten, oder ein Alkin, wie Acetylen oder Propin; einen Ether, wie Dimethylether; ein Keton, ein Ester, einen halogenierten Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts (z.B. enthaltend bis zu 7 Kohlenstoffatomen); oder eine Mischung von beliebigen der vorstehenden. Vorteilhafterweise sind mindestens einige der Halogenatome in halogenierten Gasen Fluoratome; so können biokompatible halogenierte Kohlenwasserstoffgase z.B. ausgewählt sein aus Bromchlordifluormethan, Chlordifluormethan, Dichlordifluormethan, Bromtrifluormethan, Chlortrifluormethan, Chlorpentafluorethan, Dichlortetrafluorethan, Chlortrifluorethylen, Fluorethylen, Ethylfluorid, 1,1-Difluorethan und Perfluorkohlenstoffe, z.B. Perfluoralkane wie Perfluormethan, Perfluorethan, Perfluorpropane, Perfluorbutane (z.B. Perfluor-n-Butan, gegebenenfalls in Zumischung mit anderen Isomeren, wie Perfluor-Isobutan), Perfluorpentane, Perfluorhexane und Perfluorheptane; Perfluoralkene wie Perfluorpropen, Perfluorbutene, (z.B. Perfluorbut-2-en) und Perfluorbutadien; Perfluoralkine wie Perfluorbut-2-in; und Perfluorcycloalkane wie Perfluorcyclobutan, Perfluormethylcyclobutan, Perfluordimethylcyclobutan, Perfluortrimethylcyclobutane, Perfluorcyclopentan, Perfluormethylcyclopentan, Perfluordimethylcyclopentane, Perfluorcyclohexan, Perfluormethylcyclohexan und Perfluorcycloheptan. Andere halogenierte Gase umfassen Methylchlorid, fluorierte (z.B. perfluorierte) Ketone wie Perfluoraceton und fluorierte (z.B. perfluorierte) Ether wie Perfluordiethylether. Die Verwendung von perfluorierten Gasen, z.B. Schwefelhexafluorid und Perfluorkohlenstoffen, wie Perfluorpropan, Perfluorbutanen und Perfluorpentanen kann besonders vorteilhaft im Hinblick auf die erkannte hohe Stabilität von Mikrobläschen, die derartige Gase enthalten, im Blutstrom sein.
  • Das Gas kann eine Substanz umfassen, wie Butan, Cyclobutan, n-Pentan, Isopentan, Neopentan, Cyclopentan, Perfluorpentan, Perfluorcyclopentan, Perfluorhexan oder eine Mischung, die eines oder mehrere derartiger Gase enthält, die flüssig sind bei Handhabungs- und/oder Verarbeitungstemperaturen, aber gasförmig bei Körpertemperatur, z.B. wie beschrieben in der zuvor erwähnten WO-A-9416739, da die filmbildenden oberflächenaktiven Monolagen in Reportereinheiten gemäß der Erfindung die resultierenden Mikrobläschen gegen unkontrollierbares Wachstum stabilisieren können.
  • Im Prinzip kann ein beliebiges geeignetes film-bildendes oberflächenaktives Mittel eingesetzt werden, um die Gas-einkapselnden Monolagen zu bilden, einschließlich nicht polymere und nicht-polymerisierbare Wand-bildende oberflächenaktive Materialien, z.B. wie beschrieben in WO-A-9521631; oberflächenaktives Polymermaterial, z.B. wie beschrieben in WO-A-9506518; und Pospholipide, z.B. wie beschrieben in WO-A-9211873, WO-A-9217212, WO-A-9222247, WO-A-9428780, WO-A-9503835 oder WO-A-9729783. Vorteilhafterweise sind 75%, bevorzugt im wesentlichen das gesamte des film-bildenden oberflächenaktiven Mittels, das in Mitteln gemäß der Erfindung vorhanden ist, in Monolagen an den Gas-Flüssigkeits-Grenzflächen eingebaut.
  • Repräsentative Beispiele nützlicher Phospholipide umfassen Lecithine, (d.h. Phosphatidylcholine), z.B. natürliche Lecithine, wie Eidotter-Lecithin oder Sojabohnen-Lecithin, und synthetische oder halbsynthetische Lecithine wie Dimyristoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin oder Distearoylphosphatidylcholin; Phosphatidsäuren; Phosphatidylethanolamine; Phosphatidylserine; Phosphatidylglycerine, Phosphatidylinositole; Cardiolipine; Sphingomyeline; fluorierte Analoga von beliebigen der vorstehenden; Mischung von beliebigen der vorstehenden und Mischungen mit anderen Lipiden wie Cholesterin.
  • Es wurde gefunden, dass die Verwendung von Phospholipiden, die überwiegend (z.B. mindestens 75%) Moleküle umfassen, die individuell eine Netto-Gesamtladung tragen, besonders vorteilhaft sein kann, speziell wenn sie als im wesentlichen die einzige amphiphile Komponente des Reporters verwendet werden, und können wertvolle Vorteile im Hinblick auf Parameter vermitteln, wie Produktstabilität und akustische Eigenschaften. Ohne durch theoretische Betrachtungen gebunden sein zu wollen, wird geglaubt, dass die elektrostatische Abstoßung zwischen geladenen Phospholipidmembranen die Bildung von stabilen Monolagen an den Gas-Flüssigkeits-Grenzflächen fördert; wie oben angemerkt wird die Flexibilität und Deformierbarkeit derartiger dünner Membranen die Echogenizität der gemäß der Erfindung verwendeten Reporter relativ zu Gas-gefüllten Liposomen mit einer oder mehreren Lipid-Bischichten verstärken.
  • Die Verwendung von geladenen Phospholipiden kann auch Reporter bereitstellen mit vorteilhaften Eigenschaften im Hinblick auf z.B. die Stabilität, Dispergierbarkeit und der Widerstandsfähigkeit gegenüber Koaleszenz ohne Rückgriff auf Additive, wie weitere oberflächenaktive Mittel und/oder Viskositäts-Verstärker, wodurch sichergestellt wird, dass die Anzahl von Komponenten, die an den Körper eines Subjektes verabreicht werden, bei der Injektion der Kontrastmittel auf ein Minimum gehalten wird. So können z.B. die geladenen Oberflächen der Mikrobläschen ihre Aggregation als eine Folge der elektrostatischen Abstoßung minimieren oder verhindern.
  • Erwünschterweise bestehen mindestens 75%, bevorzugt im wesentlichen das gesamte Phospholipidmaterial, das in Reportern im Mittel der Erfindung verwendet wird, aus Molekülen, die eine Nettogesamtladung unter den Bedingungen der Herstellung und/oder der Verwendung tragen, wobei die Ladung positiv oder, bevorzugterweise, negativ sein kann. Repräsentative positiv geladene Phospholipide umfassen Ester von Phosphatidsäuren, wie Dipalmitoylphosphatidsäure oder Distearoylphosphatidsäure mit Aminoalkoholen, wie Hydroxyethylethylendiamin. Beispiele negativ geladener Phospholipide umfassen natürlich auftretende (z.B. abgeleitet von Sojabohne oder Eigelb), halbsynthetische (z.B. teilweise oder voll hydrierte) und syn thetische Phosphatidylserine, Phosphatidylglycerine, Phosphatidylinositole, Phosphatidsäuren und Cardiolipine. Die Fettsäuregruppen derartiger Phospholipide werden typischerweise ungefähr 14 bis 22 Kohlenstoffatome enthalten, z.B. wie in Palmitoyl- und Stearoyl-Gruppen. Lyso-Formen derartiger geladener Phospholipide sind auch gemäß der Erfindung nützlich, wobei der Begriff „Lyso" Phospholipide bezeichnet, die nur eine Fettsäuregruppe enthalten, wobei diese bevorzugt Esterverknüpft am Kohlenstoffatom der 1-Position der Glyceryl-Einheit ist. Derartige Lyso-Formen von geladenen Phospholipiden können vorteilhafterweise in Zumischung mit geladenen Phospholipiden verwendet werden, die zwei Fettsäuregruppen enthalten.
  • Phosphatidylserine stellen besonders bevorzugte Phospholipide der Verwendung in Mitteln gemäß der Erfindung dar und bilden bevorzugt einen wesentlichen Teil, z.B. mindestens 80% des Phospholipidgehaltes davon, z.B. 85–92%. Während wir nicht wünschen, durch theoretische Betrachtungen gebunden zu sein, kann es sein, dass eine ionische Brückenbildung zwischen den Carboxyl- und Aminogruppen benachbarter Serineinheiten zur Stabilität derartiger Reportersysteme beiträgt. Bevorzugte Phosphatidylserine umfassen gesättigtes (z.B. hydriertes oder synthetisches) natürliches Phosphatidylserin und synthetisches Distearoylphosphatidylserin, Dipalmitoylphosphatidylserin und Diarachidoylphosphatidylserin.
  • Andere möglicherweise nützliche Lipide umfassen Phosphatidylethanolamine, gegebenenfalls vermischt mit einem oder mehreren Lipiden, wie Stearinsäure, Palmitinsäure, Stearylamin, Palmitylamin, Cholesterin, Bisalkylglycerine, Sphingoglycolipide, synthetische Lipide, wie N,N-Dimethyl-N-octadecyl-1-octadekanammoniumchlorid oder -bromid (DODAC, DODAB), und/oder Maleinsäurebisalkylester.
  • Zusätzliche beispielhafte Lipide, die zum Herstellen Gas-enthaltender Kontrastmittel verwendet werden können, umfassen Fettsäuren, Stearinsäure, Palmitinsäure, 2-n-Hexadecylstearinsäure, Oleinsäure und andere Säure-enthaltende Lipidstrukturen. Derartige Lipidstrukturen können durch Amidbindungsbildung an Aminosäuren gekoppelt sein, die eine oder mehrere Aminogruppen enthalten; die resultierenden Li pid-modifizierten Aminosäuren (z.B. Dipalmitoyllysin- oder Distearoyl-2,3-diaminopropionsäure) können nützliche Precursor für das Binden funktionalisierter Spacerelemente mit Kopplungsstellen für die Konjugation von einem oder mehreren Vektormolekülen sein.
  • Weitere nützliche Stabilisatoren umfassen Lipopeptide, die ein Lipid umfassen, das an einen Peptidlinkerteil gebunden ist, der auf geeignete Weise zum Koppeln eines oder mehrerer Vektormoleküle funktionalisiert ist. Eine besondere Bevorzugung ist der Einschluss eines positiv geladenen Peptidlinkerelements (z.B. umfassend zwei oder mehr Lysinreste), die zum Verankern durch elektrostatische Wechselwirkung mit Reportermikrobläschen fähig sind, die durch negativ geladene Phospholipid- oder andere oberflächenaktive Membrane stabilisiert sind.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung umfasst funktionalisierte Mikrobläschen, die eine oder mehrere reaktive Gruppen für die nicht-spezifische Reaktion mit Rezeptormolekülen, die auf Zelloberflächen lokalisiert sind, tragen. Mikrobläschen, die eine Thioleinheit umfassen, können z.B. an Zelloberflächenrezeptoren über Disulfid-Austauschreaktionen binden. Die reversible Natur derartiger Reaktionen bedeutet, dass der Mikrobläschenfluss durch Ändern der Redox-Umgebung kontrolliert werden kann. Auf ähnliche Weise können funktionalisierte Mikrobläschen mit Membranen, die aktivierte Ester wie N-Hydroxysuccinimidester umfassen, zum Reagieren mit Aminogruppen verwendet werden, die auf einer Vielzahl von Zelloberflächenmolekülen gefunden werden.
  • Zuvor vorgeschlagene Mikrobläschen-enthaltende Kontrastmittel, die auf Phospholipiden basieren, z.B. wie beschrieben in WO-A-9409829, werden typischerweise durch Inkontaktbringen eines pulverförmigen oberflächenaktiven Mittels, z.B. gefriergetrocknete vorgeformte Liposomen oder gefriergetrocknete oder sprühgetrocknete Phospholipidlösungen, mit Luft oder einem anderen Gas und dann mit einem wässrigen Träger, Rühren, um eine Mikrobläschensuspension zu erzeugen, die dann kurz nach ihrer Herstellung verabreicht werden muss, hergestellt. Derartige Prozesse un terliegen jedoch den Nachteilen, dass wesentliche Rührenergie übertragen werden muss, um die erforderliche Dispersion zu erzeugen, und dass die Größe und die Größenverteilung der Mikrobläschen von der Menge von verabreichter Energie abhängig sind und so in der Praxis nicht kontrolliert werden können.
  • Die Reporter oder Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung können andererseits vorteilhafterweise durch Erzeugen einer Gas-Mikrobläschen-Dispersion in einem geeigneten ein oberflächenaktives Mittel (z.B. Phospholipid) enthaltenden wässrigen Medium hergestellt werden, das, falls erwünscht, zuvor autoclaviert oder anders sterilisiert sein kann, und dann bevorzugt nach dem Waschen und/oder der Größen-Fraktionierung der so gebildeten Mikrobläschen Unterziehen der Dispersion einer Lyophilisierung, z.B. bei Vorhandensein von einem oder mehreren Kryoprotektionsmitteln/Lyoprotektionsmitteln, um ein getrocknetes Produkt zu ergeben, das auf einfache Weise in Wasser/wässrigen Lösungen auf die ursprüngliche Konzentration verdünnt werden kann, um konsistent reproduzierbare Mikrobläschen-Dispersionen zu erzeugen. Dieser Prozess wird in größerem Detail in WO-A-9729783 beschrieben; die Fähigkeit, Bläschen unerwünschter Größe und überschüssiges Oberflächenmaterial zu entfernen, machen diesen Prozeß wesentlich vorteilhafter gegenüber Prozessen, wie diejenigen, die in der zuvor genannten WO-A-9409829 und im Stand der Technik, wie WO-A-9608234, beschrieben sind (wo Bläschen vor Ort vor der Injektion durch Schütteln einer Suspension verschiedener Phospholipide und Viskositätsverstärker wie Propylenglykol und Glycerin erzeugt werden.)
  • Der oben beschriebene Prozess kann zum Erzeugen von Reporter-Mikrobläschen mit einer sehr engen Größenverteilung verwendet werden, z.B. derart, dass über 90% (z.B. mindestens 95%, bevorzugt mindestens 98%) der Mikrobläschen einen mittleren Volumendurchmesser im Bereich von 1 bis 7 μm besitzen, und weniger als 5% (z.B. nicht mehr als 3%, bevorzugt nicht mehr als 2%) der Mikrobläschen einen mittleren Volumendurchmesser über 7 μm besitzen. Der Waschschritt kann verwendet werden, um sicherzustellen, dass der Reporter im wesentlichen frei von unerwünschten Komponenten, wie überschüssige Lipide oder Viskositätsverstärker ist.
  • Mittel, die Reporter enthalten, die auf diese Weise hergestellt werden, können die folgenden Vorteile über Kontrastmittelmaterialien des Stands der Technik zeigen:
    Die Echogenizität pro Dosis kann stark verstärkt sein, da im wesentlichen das gesamte Oberflächenmaterial an der Stabilisierung der Mikrobläschen als Monolagen teilnimmt. In-vivo-Ultraschalltests in Hunden haben gezeigt, dass Ultraschallkontrastmittel, die wie oben hergestellt sind, einen Anstieg in der rückgestreuten Signalintensität vom Myokard von 15 dB nach der intravenösen Verabreichung von Dosen, die so gering sind wie 0,1 μl Mikrobläschen/kg Körpergewicht, erzeugen.
  • Die Sicherheit in vivo ist verbessert aus denselben Gründen, da derartige Mittel z.B. in Dosen derart verabreicht werden können, dass die Menge von injiziertem Phospholipid so niedrig ist wie 0,1 bis 10 μg/kg Körpergewicht, z.B. 1 bis 5 μg/kg. Die Verwendung derartig niedriger Gehalte von oberflächenaktivem Mittel kann klar von wesentlichem Vorteil beim Minimieren möglicher toxischer Nebenwirkungen sein.
  • Das hohe Verhältnis Wirksamkeit/Dosis ist auch besonders vorteilhaft bei Zielausrichtungs-Anwendungen, da es im allgemeinen verstanden wird, dass ziemlich niedrige Mengen des Reporters an Stellen von Interesse akkumulieren werden, wenn Produkte verwendet werden, die Vektoren mit einer Affinität für derartige Stellen umfassen. Diese bevorzugten Reporter gemäß der Erfindung können deshalb beträchtlich den Kontrast an Stellen von Interesse im Vergleich zu bekannten zielausrichtbaren Ultraschallkontrastmitteln verbessern. Ihre hohe Wirksamkeit kann es auf effektive Weise möglich machen, einzelne Mikrobläschen unter Verwenden von Ultraschall zu „sehen", was eine Empfindlichkeit nahe oder möglicherweise sogar höher als jener der Szintigraphie ergibt, die gegenwärtig wahrscheinlich die am meisten nützliche Technik bei der Zielausrichtung ist, obwohl die Auflösung in Szintigraphie-Bildern nicht beeindruckend ist.
  • Ein besonderer Vorteil von auf Phosphatidylserin basierenden Mitteln ist ihre Biokompatibilität; so wurden keine akuten toxischen Wirkungen, wie Änderungen in Blutdruck oder Puls beobachtet bei Tiertests mit Hunden, denen intravenöse Boli von auf Phosphatidylserin basierenden Kontrastmitteln injiziert wurden, die wie oben beschrieben mit Dosierungen von bis zu 10 mal einer normalen Bildgebungsdosis hergestellt sind.
  • Die Verwendung von geladenen Phospholipiden kann auch von Vorteil darin sein, dass sie funktionelle Gruppen enthalten werden, wie Carboxyl, oder Amino, die eine einfache Verbindung von Vektoren erlauben, falls erwünscht über Linkereinheiten. Es sollte beachtet werden, dass andere funktionelle Gruppen auch in derartige Systeme eingebaut werden können durch Mischen eines Lipids, das eine erwünschte funktionelle Gruppe enthält, mit dem film-bildenden oberflächenaktiven Mittel vor der Mikrobläschenerzeugung.
  • Es ist allgemein unnötig, Additive, wie Emulgatoren und/oder Viskositätsverstärker in die Mittel der Erfindung einzubauen, wie sie allgemein in vielen vorhandenen Kontrastmittelformulierungen eingesetzt werden. Wie oben angemerkt, ist es von Vorteil, die Anzahl der Komponenten, die an den Körper eines Subjektes verabreicht werden, auf einem Minimum zu halten, und sicherzustellen, dass die Viskosität der Mittel so gering wie möglich ist. Da die Herstellung der Mittel typischerweise einen Gefriertrocknungsschritt wie oben diskutiert beeinhaltet, kann es jedoch vorteilhaft sein, ein Kryoprotektionsmittel/Lyoprotektionsmittel oder einen Füllstoff einzubauen, z.B. einen Alkohol, z.B. einen aliphatischen Alkohol, wie t-Butanol; ein Polyol, wie Gycerol; ein Kohlenhydrat, z.B. einen Zucker, wie Saccharose, Mannitol, Trehalose, oder ein Cyclodextrin, oder ein Polysaccharid, wie Dextran; oder einen Polyglykol, wie Polyethylenglykol. Die Verwendung von physiologisch gut tolerierten Zuckern, wie Saccharose, ist bevorzugt.
  • Lyophilisierte, getrocknete Produkte, die wie oben beschrieben hergestellt sind, sind speziell einfach in Wasser zur ursprünglichen Konzentration verdünnbar, wobei nur eine minimale Bewegung erforderlich ist, wie sie z.B. durch sanftes Hand-Schütteln für ein paar Sekunden vermittelt wird. Die Größe der so erzeugten Mikrobläschen ist konsistent reproduzierbar und unabhängig von der Menge angewandter Bewegungsenergie, und wird in der Praxis durch die Größe der in der anfänglichen Mikrobläschendispersion gebildeten Mikrobläschen bestimmt; überraschenderweise wird dieser Größenparameter im wesentlichen im lyophilisierten und zur ursprünglichen Konzentration verdünnten Produkt beibehalten. So kann, da die Größe der Mikrobläschen in der anfänglichen Dispersion durch Prozessparameter wie das Verfahren, die Geschwindigkeit und die Dauer der Bewegung gesteuert werden kann, die schließliche Mikrobläschengröße auf einfache Weise gesteuert werden.
  • Es wurde auch bewiesen, dass die lyophilisierten, getrockneten Produkte für mindestens mehrere Monate speicherstabil unter Umgebungsbedingungen sind. Die bei der Wiederverdünnung zur ursprünglichen Konzentration in Wasser erzeugten Mikrobläschendispersionen sind für mindestens 8 h stabil, was eine beträchtliche Flexibilität erlaubt in Bezug auf wann das getrocknete Produkt vor der Injektion auf die ursprüngliche Konzentration verdünnt wird.
  • Die hohe Wirksamkeit dieser bevorzugten Reporter kann es möglich machen, kleinere Bläschen zu verwenden als üblicherweise, während noch Ultraschallkontrasteffekte signifikant oberhalb des minimalen Detektionsniveaus gegenwärtiger Ultraschallbildgebungsausrüstung erzeugt werden. Derartige kleinere Bläschen besitzen mögliche Vorteile, wie reduziertes Verstopfen von Gefäßen, längere Zirkulationszeiten, größere Fähigkeit, Ziele zu erreichen, und eine geringere Akkumulation in Lungen oder anderen Nicht-Zielorganen, und ihre Verwendung und Mittel, die sie enthalten, bilden weitere Merkmale der Erfindung.
  • Es kann auch möglich sein, derartige kleinere Bläschen zum Ausnutzen der verstärkten Ultraschallkontrasteffekte von Bläschenclustern zu verwenden. Es ist aus der Theorie bekannt, dass der Ultraschallkontrasteffekt einer spezifischen Anzahl von Bläschen mit dem Gesamtvolumen V in einer verdünnten Dispersion ansteigt, wenn die Bläschen aggregieren, um eine größere Gasphase mit demselben Gesamtvolumen V zu bilden. Es kann deshalb möglich sein, kleine Bläschen zu verwenden, die im wesentlichen keinen Ultraschallkontrast ergeben, bis sie geclustert sind (wie es in Zielgebieten bevorzugt gegenüber Nicht-Zielstellen, die niedrige Dichten von Zielmolekülen besitzen, auftreten kann). Derartige Bläschen können auch zum Fusionieren gestaltet werden, z.B. durch eine Zwischenbläschenbindung, die durch Wechselwirkung mit dem Ziel gefördert wird, damit der Kontrast in Zielgebieten verstärkt wird. Zwischenbläschenvernetzung und nachfolgendes Clustern kann auch bewirkt werden, falls der Reporter zusätzlich zum Tragen eines Vektors, der zu einer Retention an spezifischen Stellen führt, nicht umgesetzte Linkereinheiten besitzt, die zur Reaktion mit funktionellen Gruppen auf anderen Bläschen fähig sind.
  • Innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung wird die Reportereinheit üblicherweise an die Vektoren gebunden bleiben. Jedoch wird in einem Typ der Zielausrichtungsprozedur, manchmal genannt „Prä-Zielausrichtung", der Vektor (oft ein monoklonaler Antikörper) allein verabreicht; nachfolgend wird der Reporter verabreicht, an eine Einheit gekoppelt, die zum spezifischen Binden des Prä-Zielausrichtungs-Vektormoleküls fähig ist (wenn der Prä-Zielausrichtungsvektor ein Antikörper ist, kann der Reporter an ein Immunoglobulin-bindendes Molekül gekoppelt werden, wie ein Protein A oder einen Anti-Immunoglobulin-Antikörper). Der Vorteil dieses Protokolls ist es, dass eine Zeit für die Eliminierung der Vektormoleküle ermöglicht wird, die nicht ihre Ziele binden, wobei im wesentlichen die Untergrundprobleme, die mit dem Vorhandensein eines Überschusses des Reporter-Vektor-Konjugats verbunden sind, verringert werden. Innerhalb des Kontextes der vorliegenden Erfindung könnte eine Prä-Zielausrichtung mit einem spezifischen Vektor in Betracht gezogen werden, gefolgt von Reportereinheiten, die an einen anderen Vektor gekoppelt sind und eine Einheit, die den ersten Vektor bindet.
  • Wieder im Kontext der vorliegenden Erfindung, z.B. beim Bewerten von Blutperfusionsgeschwindigkeiten in zielausgerichteten Gebieten, wie das Myokard, ist es von Interesse, die Geschwindigkeit zu messen, mit der Kontrastmittel, die an das Ziel gebunden sind, verdrängt oder davon freigesetzt werden. Dies kann in einer gesteuerten Weise durch Verabreichung eines zusätzlichen Vektors und/oder einer anderen Substanz erreicht werden, die zum Verdrängen oder Freisetzen des Kontrastmittels von seinem Ziel fähig ist.
  • Ultraschallbildgebungsmodalitäten, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, umfassen zwei- und drei-dimensionale Bildgebungstechniken, wie B-Modus-Bildgebung (z.B. unter Verwenden der zeitvariierenden Amplitude der Signal-Hüllkurve, die aus der Grundfrequenz des emittierten Ultraschallpulses erzeugt wird, aus Unterschwingungen oder Oberschwingungen davon oder aus der Summen- oder Differenzfrequenz, die vom emittierten Puls und derartigen Schwingungen abgeleitet werden, wobei die aus den Grundfrequenzen oder der zweiten harmonischen Schwingung davon erzeugten Bilder bevorzugt sind), Farb-Doppler-Bildgebung und Doppler-Amplituden-Bildgebung und Kombinationen der zwei letzteren mit einer beliebigen der oben genannten Modalitäten. Überraschenderweise wurden ausgezeichnete Signale der zweiten harmonischen Schwingung aus zielausgerichteten Monolagen-stabilisierten Mikrokügelchen gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten. Um die Effekte der Bewegung zu reduzieren, können aufeinanderfolgende Bilder von Geweben, wie das Herz oder die Niere, mit Hilfe geeigneter Synchronisationstechniken gesammelt werden (z.B. EKG-Gating oder die Atmungsbewegung des Subjekts). Die Messung von Änderungen in der Resonanzfrequenz oder Frequenzabsorption, die eingefangene oder verzögerte Mikrobläschen begleiten, können auch nützlicherweise durchgeführt werden, um das Kontrastmittel zu detektieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Werkzeug für die therapeutische Arzneimittelverabreichung in Kombination mit Vektor-vermittelter Ausrichtung des Produktes auf die erwünschte Stelle bereit. Mit „therapeutisch" oder „Arzneimittel" ist ein Mittel mit einem günstigen Effekt auf eine spezifische Krankheit in einem lebenden Menschen oder nicht-menschlichen Tier gemeint. Während Kombinationen von Arzneimitteln und Ultraschallkontrastmitteln in z.B. WO-A-9428873 und WO-A-9507072 vorgeschlagen wurden, fehlen diesen Produkten Vektoren mit einer Affinität für bestimmte Stellen und zeigen dadurch eine vergleichsweise geringe spezifische Retention an erwünschten Stellen vor oder während der Arzneimittelfreisetzung.
  • Therapeutische Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können im Inneren der Mikrobläschen eingekapselt oder gebunden an oder eingebaut werden in den stabilisierenden Membranen. So kann die therapeutische Verbindung an einen Teil der Membran gebunden werden, z.B. durch kovalente oder ionische Bindungen, oder kann physikalisch in das stabilisierende Material gemischt werden, insbesondere, falls das Arzneimittel eine dem Membranmaterial ähnliche Polarität oder Löslichkeit hat, um es so davon abzuhalten, aus dem Produkt auszulaufen, bevor beabsichtigt ist, dass es im Körper wirkt. Die Freisetzung des Arzneimittels kann lediglich durch benässenden Kontakt mit Blut nach der Verabreichung oder als eine Konsequenz anderer innerer oder äußerer Einflüsse initiiert werden, z.B. Auflösungsprozesse, die durch Enzyme oder die Verwendung von Ultraschall katalysiert werden. Die Zerstörung von Gas-enthaltenden Mikroteilchen unter Verwenden von äußerem Ultraschall ist ein gut bekanntes Phänomen in bezug auf Ultraschallkontrastmittel, z.B. wie beschrieben in WO-A-9325241; die Geschwindigkeit der Arzneimittelfreisetzung kann abhängig vom Typ der therapeutischen Anwendung variiert werden unter Verwenden einer spezifischen Menge Ultraschallenergie vom Transducer.
  • Das Therapeutikum kann kovalent an die einkapselnde Membranoberfläche unter Verwenden eines geeigneten verbindenden Mittels gebunden werden, z.B. wie hier beschrieben. So kann man z.B. anfänglich ein Phospholipid oder Lipopeptidderivat herstellen, an das das Arzneimittel durch eine/einen bioabbaubare(n) Bindung oder Linker gebunden ist, und dann dieses Derivat in das Derivat einbauen, das zum Herstellen des Reporters verwendet wurde, wie oben beschrieben.
  • Repräsentative Therapeutika, die zur Verwendung in den vorliegenden Arzneimittelverabreichungs-Zusammensetzungen geeignet sind, umfassen beliebige bekannte therapeutische Arzneimittel oder aktive Analoga davon, die Thiolgruppen enthalten, die an Thiol-enthaltende Mikrobläschen unter oxidativen Bedingungen gekoppelt werden können, wodurch Disulfid-Gruppen erhalten werden. In Kombination mit ei nem Vektor oder Vektoren kann man derartigen Arzneimitteln/Vektor-modifizierten Mikrobläschen ermöglichen, im Zielgewebe zu akkumulieren; die Verabreichung eines Reduktionsmittels, wie reduziertes Glutathion, kann dann das Arzneimittelmolekül von dem zielausgerichteten Mikrobläschen in der Nachbarschaft der Zielzelle freisetzen, wodurch die Gesamtkonzentration des Arzneimittels vergrößert und sein therapeutischer Effekt verstärkt wird. Alternativ kann die Zusammensetzung anfänglich ohne das Therapeutikum hergestellt werden, das dann gekoppelt werden kann an oder beschichtet werden kann auf den Mikrobläschen unmittelbar vor der Verwendung; so kann z.B. ein Therapeutikum zu einer Suspension von Mikrobläschen in wässrigen Medien gegeben werden und geschüttelt werden, um das Therapeutikum an die Mikrobläschen zu binden oder anhaften zu lassen.
  • Andere Arzneimittelverabreichungssysteme umfassen Vektor-modifizierte Phospholipidmembranen, die mit Lipopeptidstrukturen dotiert sind, die eine Poly-L-Lysin oder Poly-D-Lysin-Kette in Kombination mit einem Zielausrichtungsvektor umfassen. Angewandt auf Gentherapie/Gegensinn-Technologien mit besonderer Betonung auf Rezeptor-vermittelter Arzneimittelverabreichung wird der Mikrobläschen-Träger mit DNA oder RNA über elektrostatische Wechselwirkung mit dem kationischen Polylysin kondensiert. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, dass der Vektor, oder die Vektoren, die für die zielausgerichtete Verabreichung verwendet werden, nicht direkt an die Polylysin-Trägereinheit gebunden sind. Die Polylysinkette wird auch fester in die Mikrobläschen-Membran aufgrund des Vorhandenseins der Lipidketten verankert. Die Verwendung von Ultraschall, um die Effektivität der Verabreichung zu vergrößern, wird auch als nützlich betrachtet.
  • Alternativ werden freie Polylysin-Ketten zuerst mit Arzneimittel- oder Vektormolekülen modifiziert, und dann auf die negative Oberfläche zielausgerichteter Mikrobläschen kondensiert.
  • Repräsentative und nicht-beschränkende Beispiele von Arzneimitteln, die gemäß der Erfindung nützlich sind, umfassen antineoplastische Mittel, wie Vincristin, Vinblastin, Vindesin, Busulfan, Chlorambucil, Spiroplatin, Cisplatin, Carboplatin, Methotrexat, Adriamycin, Mitomycin, Bleomycin, Cytosinarabinosid, Arabinosyladenin, Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazin, Dactinomycin (Antinomycin D), Daunorubicin, Doxorubicinhydrochlorid, Taxol, Plicamycin, Aminoglutethimid, Estramustin, Flutamid, Leuprolid, Megestrolacetat, Tamoxifen, Testolacton, Trilostan, Amsacrin (m-AMSA), Asparaginase (L-Asparaginase), Etoposid, Interferon a-2a und -2b, Blutprodukte, wie Hematoporphyrine oder Derivate der vorstehenden; Modifizierer der biologischen Respons, wie Muramylpeptide; Antipilzmittel, wie Ketoconazol, Nystatin, Griseofulvin, Flucytosin, Miconazol oder Amphotericin B; Hormone oder Hormonanaloga, wie das Wachstumshormon, Melanocyten-stimulierendes Hormon, Estradiol, Beclomethasondipropionat, Betamethason, Kortisonacetat, Dexamethason, Flunisolid, Hydrocortison, Methylprednisolon, Paramethasonacetat, Prednisolon, Prednison, Triamcinolon oder Fludrocortisonacetat; Vitamine, wie Cyanocobalamin oder Retinoide; Enzyme, wie alkalische Phosphatase oder Mangansuperoxid-Dismutase; antiallergische Mittel, wie Amelexanox; Inhibitoren des Gewebefaktors, wie monoklonale Antikörper und Fab-Fragmente davon, synthetische Peptide, Nicht-Peptide und Verbindungen, die die Gewebefaktorexpression herabregulieren; Inhibitoren von Blutplättchen, wie GPIa, GPIb und GPIIb–IIIa, ADP-Rezeptoren, Thrombin-Rezeptoren, von-Willebrand-Faktor, Prostaglandine, Aspirin, Ticlopidin, Clopigogrel und Reopro; Inhibitoren von Koagulationsprotein-Zielen, wie FIIa, FVa, FVIIa, FVIIIa, FIXa, FXa, Gewebefaktor, Heparine, Hirudin, Hirolog, Argatroban, DEGR-rFVIIa und Annexin V: Inhibitoren der Fibrin-Bildung und Promotoren der Fibrinolyse, wie t-PA, Urokinase, Plasmin, Streptokinase, rt-Plasminogen-Aktivator und rStaphylokinase; antiangiogene Faktoren, wie Medroxyprogesteron, Pentosanpolysulfat, Suramin, Taxol, Thalidomid, Angiostatin, Interferon-alpha, Metalloproteinase-Inhibitoren, Plättchenfaktor 4, Somatostatin, Thromobospondin; Kreislauf-Arzneimittel, wie Propranolol; metabolische Potentiatoren, wie Glutathion; Antituberkulosemittel, wie p-Aminosalicylsäure, Isoniazid, Capreomycinsulfat, Cyclosexin, Ethambutol, Ethionamid, Pyrazinamid, Rifampin oder Streptomycinsulfat; antivirale Mittel, wie Acyclovir, Amantadin, Azidothymidin, Ribavirin oder Vidarabin; Blutgefäß erweiternde Mittel, wie Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Erythritoltetranitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglycerin oder Pentaerythritoltetranitrat; An tibiotika, wie Dapson, Chloramphenicol, Neomycin, Cefaclor, Cefadroxil, Cephalexin, Cephradin, Erythromycin, Clindamycin, Lincomycin, Amoxicillin, Ampicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Dicloxacillin, Cyclacillin, Picloxacillin, Hetacillin, Methicillin, Nafcillin, Penicillin, Polymyxin oder Tetracyclin; entzündungshemmende Mittel, wie Diflunisal, Ibuprofen, Indomethacin, Meclefenamate, Mefenamsäure, Naproxen, Phenylbutazon, Piroxicam, Tolmetin, Aspirin oder Salicylate; Protozoen vernichtende Mittel, wie Chlorochin, Metronidazol, Chinin oder Megluminantimonat; Antirheumatika, wie Penicillamin; Narkotika, wie Paregoric; Opiate, wie Kodein, Morphin oder Opium; Herz-Glycoside, wie Deslanesid, Digitoxin, Digoxin, Digitalin oder Digitalis; neuromuskuläre Blocker, wie Atracuriummesylat, Gallamintriethiodid, Hexafluoreniumbromid, Metocuriniodid, Pancuroniumbromid, Succinylcholinchlorid, Tubocurarinchlorid oder Vecuroniumbromid; Sedativa, wie Amobarbital, Amobarbitalnatrium, Aprobarbital, Butabarbitalnatrium, Chloralhydrat, Ethchlorvynol, Ethinamat, Flurazepamhydrochlorid, Glutethimid, Methotrimeprazinhydrochlorid, Methyprylon, Midazolamhydrochlorid, Paraldehyd, Pentobarbital, Secobarbitalnatrium, Talbutal, Temazepam oder Triazolam; Lokalanästhetika, wie Bupivacain, Chloroprocain, Etidocain, Lidocain, Mepivacain, Procain oder Tetracain; allgemeine Anästhetika, wie Droperidol, Etomidat, Fentanylcitrat mit Droperidol, Ketaminhydrochlorid, Methohexital-Natrium oder Thiopental und pharmazeutisch annehmbare Salze (z.B. Säureadditionssalze, wie das Hydrochlorid oder Hydrobromid oder Basensalze, wie Natrium-, Kalzium- oder Magnesium-Salze) oder Derivate (z.B. Acetate) davon. Andere Beispiele von Therapeutika umfassen genetisches Material, wie Nukleinsäuren, RNA und DNA natürlichen oder synthetischen Ursprungs, einschließlich rekombinanter RNA und DNA. Bestimmte DNA-codierende Proteine können bei der Behandlung vieler verschiedener Typen von Krankheiten verwendet werden. Zum Beispiel können Tumornekrosefaktor- oder Interleukin-2-Gene bereitgestellt werden, um fortgeschrittene Krebsarten zu behandeln; Thymidinkinase-Gene können bereitgestellt werden, um Ovarkrebs oder Hirntumoren zu behandeln; Interleukin-2-Gene können bereitgestellt werden, um Neuroblastome, maligne Melanome oder Nierenkrebs zu behandeln; und Interleukin-4-Gene können zum Behandeln von Krebs bereitgestellt werden.
  • Lipophile Derivate von Arzneimitteln, die an die Mikrobläschenmembran durch hydrophobe Wechselwirkungen gebunden sind, können therapeutische Effekte als Teil des Mikrobläschens oder nach der Freisetzung des Mikrobläschens zeigen, z.B. durch Verwendung von Ultraschall. Falls das Arzneimittel nicht die erwünschten physikalischen Eigenschaften besitzt, kann eine lipophile Gruppe eingeführt werden zum Verankern des Arzneimittels an der Membran. Bevorzugt sollte die lipophile Gruppe auf eine Weise eingeführt werden, die nicht die in vivo-Leistungsfähigkeit des Moleküls beeinflusst, oder die lipophile Gruppe kann abgespalten werden unter Freisetzen des aktiven Arzneimittels. Lipophile Gruppen können durch verschiedene chemische Mittel eingeführt werden, abhängig von funktionellen Gruppen, die im Arzneimittelmolekül verfügbar sind. Kovalentes Koppeln kann bewirkt werden unter Verwenden funktioneller Gruppen im Arzneimittelmolekül, das zum Reagieren mit annähernd funktionalisierten lipophilen Verbindungen fähig ist. Beispiele lipophiler Einheiten umfassen verzweigte und unverzweigte Alkylketten, cyclische Verbindungen, aromatische Reste und kondensierte aromatische und nicht-aromatische cyclische Systeme. In einigen Fällen wird die lipophile Einheit aus einem auf geeignete Weise funktionalisierten Steroid bestehen, wie Cholesterin oder eine verwandte Verbindung. Beispiele funktioneller Gruppen, die besonders für die Derivatisierung geeignet sind, umfassen nukleophile Gruppen, wie Amino-, Hydroxy- und Sulfhydryl-Gruppen. Geeignete Prozesse für die lipophile Derivatisierung eines beliebigen Arzneimittels, das eine Sulfhydryl-Gruppe enthält, wie Captopril, können eine direkte Alkylierung umfassen, z.B. die Reaktion mit einem Alkylhalogenid unter basischen Bedingungen oder eine Thiolester-Bildung durch Reaktion mit einer aktivierten Carbonsäure. Repräsentative Beispiele der Derivatisierung eines beliebigen Arzneimittels mit Carboxylfunktionen, z.B. Atenolol oder Chlorambucil umfassen Amid- und Esterbildung durch entsprechendes Koppeln mit Aminen und Alkoholen, die geeignete physikalische Eigenschaften besitzen. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst die Bindung von Cholesterin an eine therapeutische Verbindung durch Bilden einer abbaubaren Esterbindung.
  • Eine bevorzugte Anwendung der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf Angiogenese, die die Bildung neuer Blutgefäße durch Verzweigung von vorhandenen Gefäßen ist. Der primäre Stimulus für diesen Prozess kann eine unangemessene Versorgung von Zellen in einem Gewebe mit Nahrungsmitteln und Sauerstoff (Hypoxie) sein. Die Zellen können durch Sekretieren angiogener Faktoren antworten, von denen es viele gibt; ein Beispiel ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor. Diese Faktoren initiieren die Sekretion proteolytischer Enzyme, die die Proteine der Basalmembran abbauen, wie auch Inhibitoren, die die Wirkung dieser möglicherweise schädlichen Enzyme begrenzen. Der kombinierte Effekt des Verlusts der Bindung und der Signale der Rezeptoren für angiogene Faktoren ist es, die endothelialen Zellen zu veranlassen, sich zu bewegen, zu vervielfachen und sich selbst umzuordnen, und schließlich eine Basalmembran um die neuen Gefäße zu synthetisieren.
  • Tumore müssen Angiogenese initiieren, wenn sie eine Millimeter-Größe erreichen, um ihre Wachstumsgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten. Da die Angiogenese von charakteristischen Änderungen in den endothelialen Zellen und ihrer Umgebung begleitet ist, ist dieser Prozess ein aussichtsreiches Ziel für eine therapeutische Intervention. Die Transformationen, die die Angiogenese begleiten, sind auch für eine Diagnose sehr vielversprechend, wobei ein bevorzugtes Beispiel die maligne Erkrankung ist, aber das Konzept ist auch vielversprechend bei der Entzündung und einer Vielfalt von Entzündungs-bezogenen Erkrankungen. Diese Faktoren sind auch in die Re-Vaskularisierung von von einem Infarkt betroffenen Teilen des Myokards involviert, die auftritt, wenn eine Stenose innerhalb einer kurzen Zeit aufgelöst wird.
  • Eine Anzahl bekannter Rezeptoren/Ziele, die mit Angiogenese in Verbindung stehen, sind in den nachfolgenden Tabellen angegeben. Unter Verwenden der Zielausrichtungs-Prinzipien, die in der vorliegenden Offenbarung beschrieben sind, kann Angiogenese durch die Mehrzahl der in der Medizin in Gebrauch stehenden Bildgebungsmodalitäten detektiert werden. Kontrast-verstärkter Ultraschall kann zusätzliche Vorteile besitzen, wobei das Kontrastmedium Mikrokügelchen sind, die auf das Innere der Blutgefäße beschränkt sind. Sogar falls die Zielantigene auf vielen Zelltypen gefunden werden, werden die Mikrokügelchen exklusiv an endotheliale Zellen binden.
  • Sogenannte Pro-Drugs können auch in Mitteln gemäß der Erfindung verwendet werden. Derartige Arzneimittel können derivatisiert werden, um ihre physiko-chemischen Eigenschaften zu ändern und sie für das Einschließen in den Reporter anzupassen; derartige derivatisierte Arzneimittel können als Pro-Drugs betrachtet werden, und sind üblicherweise inaktiv, bis die Spaltung der derivatisierenden Gruppe die aktive Form des Arzneimittels regeneriert.
  • Durch Zielausrichten Gas-gefüllter Mikrobläschen, die ein Pro-Drug-aktivierendes Enzym enthalten, auf pathologische Gebiete, kann man die Zielausrichtung des Enzyms abbilden, wodurch es möglich gemacht wird, sich ein Bild zu machen, wenn die Mikrobläschen genau auf das pathologische Gebiet zielausgerichtet werden und zur selben Zeit von Nicht-Zielgebieten verschwunden sind. Auf diese Weise kann man die optimale Zeit für die Injektion eines Pro-Drugs in individuelle Patienten bestimmen.
  • Eine andere Alternative ist es, das Pro-Drug, ein das Pro-Drug aktivierendes Enzym und einen Vektor in denselben Mikrobläschen in einem System einzubauen, in dem das Pro-Drug nur nach einigem externem Stimulus aktiviert werden wird. Ein derartiger Stimulus kann z.B. sein eine Tumor-spezifische Protease, wie oben beschrieben, oder Platzenlassen der Mikroblasen durch äußeren Ultraschall, nachdem die erwünschte Zielausrichtung erreicht worden ist.
  • Therapeutika können auf einfache Weise gemäß der Erfindung an erkrankte oder nekrotische Gebiete verabreicht werden, z.B. im Herz, in der allgemeinen Vaskulatur oder an die Leber, Milz, Nieren und andere Bereiche, wie das lymphatische System, Körperhöhlen oder das gastrointestinale System.
  • Produkte gemäß der vorliegenden Erfindung können zur zielausgerichteten therapeutischen Verabreichung entweder in vivo oder in vitro verwendet werden. Im letzteren Kontext können die Produkte in in vitro-Systemen, wie Kits für eine Diagnose verschiedener Krankheiten oder eine Charakterisierung verschiedener Komponenten im Blut oder in Gewebeproben nützlich sein. Techniken, die jenen ähnlich sind, die zum Binden bestimmter Blutkomponenten oder Zellen an Polymerteilchen (z.B. monodisperse magnetische Teilchen) in vitro verwendet werden, um sie von einer Probe zu trennen, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, unter Verwenden der niedrigen Dichte der Reportereinheiten in Mitteln der vorliegenden Erfindung, um die Trennung des Gas-enthaltenden Materials durch Flotation und wiederholtem Waschen zu bewirken.
  • Koppeln einer Reportereinheit an einen erwünschten Vektor (und/oder therapeutisches Arzneimittel) kann erreicht werden durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel, üblicherweise beinhaltend eine Wechselwirkung mit einer oder mehreren funktionellen Gruppen, die auf dem Reporter und/oder Vektor und/oder einer/einem beliebigen dazwischen liegenden Linkergruppe/Spacerelement lokalisiert sind. Beispiele chemischer reaktiver funktioneller Gruppen, die für diesen Zweck eingesetzt werden können, umfassen Amino-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Carboxyl- und Carbonyl-Gruppen, wie auch Kohlenhydratgruppen, vicinale Diole, Thioether, 2-Aminoalkohole, 2-Aminothiole, Guanidyl-, Imidazolyl- und Phenolgruppen.
  • Kovalentes Koppeln von Reporter und Vektor kann deshalb bewirkt werden unter Verwenden von verbindenden Mitteln, die reaktive Einheiten enthalten, die zur Reaktion mit derartigen funktionellen Gruppen fähig sind. Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Sulfhydrylgruppen fähig sind, umfassen α-Haloacetylverbindungen des Typs X-CH2CO- (wobei X = Br, Cl oder I), die eine besondere Reaktivität für Sulfhydrylgruppen zeigen, die aber auch zum Modifizieren von Imidazolyl-, Thioether-, Phenol- und Aminogruppen verwendet werden können, wie beschrieben von Gurd, F.R.N. in Methods Enzymol. (1967) 11, 532. N-Maleimid-Derivate werden auch als selektiv gegenüber Sulfhydrylgruppen betrachtet, können aber zusätzlich beim Kop peln an Aminogruppen unter bestimmten Bedingungen nützlich sein. N-Maleimide können in verbindende Systeme für eine Reporter-Vektor-Konjugation eingebaut werden, wie beschrieben von Kitagawa, T. et al. in Chem. Pharm. Bull. (1981) 29, 1130, oder verwendet werden als Polymer-Vernetzer für die Bläschenstabilisierung, wie beschrieben von Kovacic, P. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1959) 81 (1887). Reagenzien, wie 2-Iminothiolan, z.B. wie beschrieben von Traut, R. et al. in Biochemistry (1973) 12, 3266, die eine Thiolgruppe durch Umwandlung einer Aminogruppe einführen, können als Sulfhydryl-Reagenzien betrachtet werden, falls das Binden durch die Bildung von Disulfidbrücken erfolgt. Derartige Reagenzien, die reaktive Disulfidbindungen in entweder den Reporter oder den Vektor einführen, können nützlich sein, da das Binden durch Disulfid-Austausch zwischen dem Vektor und dem Reporter herbeigeführt werden kann; Beispiele derartiger Reagenzien umfassen Ellmans-Reagenz (DTNB), 4-4'-Dithiopyridin, Methyl-3-nitro-2-pyridyldisulfid und Methyl-2-pyridyl-disulfid (beschrieben von Kimura, T. et al. in Analyt. Biochem. (1982) 122, 271).
  • Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Aminogruppen fähig sind, umfassen alkylierende und acylierende Mittel. Repräsentative alkylierende Mittel umfassen:
    • i) α-Haloacetyl-Verbindungen, die eine Spezifität gegegenüber Aminogruppen bei Nicht-Vorhandensein reaktiver Thiolgruppen zeigen und vom Typ X-CH2CO- (wo X = Cl, Br oder I), sind, z.B. wie beschrieben von Wong, Y-H. H. in Biochemistry (1979) 24, 5337;
    • ii) N-Maleimid-Derivate, die mit Aminogruppen entweder durch eine Reaktion des Michael-Typs oder durch Acylierung durch Addition der Ringcarbonylgruppe reagieren können, wie beschrieben von Smyth, D. G. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1960) 82, 4600 und Biochem. J. (1964) 91, 589;
    • iii) Arylhalogenide, wie reaktive nitrohaloaromatische Verbindungen;
    • iv) Alkylhalogenide, wie beschrieben von McKenzie, J. A. et al. in J. Protein Chem. (1988) 7 (581);
    • v) Aldehyde und Ketone, die zur Schiff-Basen-Bildung mit Aminogruppen fähig sind, wobei die gebildeten Addukte üblicherweise durch Reduktion stabilisiert werden, um ein stabiles Amin zu ergeben;
    • vi) Epoxid-Derivate, wie Epichlorhydrin und Bisoxirane, die mit Amino-, Sulfhydryl- oder Phenol-Hydroxyl-Gruppen reagieren können;
    • vii) Chlor-enthaltende Derivate von s-Triazinen, die sehr reaktiv gegenüber Nukleophilen sind, wie Amino-, Sulfhydryl- und Hydroxyl-Gruppen;
    • viii) Aziridine, die auf s-Triazin-Verbindungen basieren, die oben im Detail angegeben sind, z.B. wie beschrieben von Ross, W. C. J. in Adv. Cancer Res. (1954) 2, 1, die mit Nukleophilen, wie Aminogruppen durch Ringöffnung reagieren;
    • ix) Quadratsäurediethylester, wie beschrieben von Tietze, L. F. in Chem. Ber. (1991) 124, 1215; und
    • x) α-Haloalkylether, die reaktivere Alkylierungsmittel sind als normale Alkylhalogenide, wegen der Aktivierung, die vom Ether-Sauerstoffatom verursacht wird, z.B. wie beschrieben von Benneche, T. et al. in Eur. J. Med. Chem. (1993) 28, 463.
  • Repräsentative Amino-reaktive acylierende Mittel umfassen:
    • i) Isocyanate und Isothiocyanate, insbesondere aromatische Derivate, die stabile Harnstoff- bzw. Thioharnstoffderivate bilden und für die Protein-Vernetzung verwendet worden sind, wie beschrieben von Schick, A. F. et al. in J. Biol. Chem. (1961) 236, 2477;
    • ii) Sulfonylchloride, die beschrieben worden sind von Herzig, D. J. in Biopolymers (1964) 2, 349, und die für die Einführung einer fluoreszierenden Reportergruppe in den Linker nützlich sein können;
    • iii) Säurehalogenide;
    • iv) aktive Ester, wie Nitrophenylester oder N-Hydroxysuccinimidylester;
    • v) Säureanhydride, wie gemischte, symmetrische oder N-Carboxyanhydride;
    • vi) andere nützliche Reagenzien für die Amidbindungs-Bildung, wie beschrieben von Bodansky, M. et al. in „Principles of Peptide Synthesis" (1984), Springer-Verlag;
    • vii) Acylazide, z.B. in denen die Azidgruppe aus einem vorgeformten Hydrazid-Derivat unter Verwenden von Natriumnitrit erzeugt wird, z.B. wie beschrieben von Wetz, K. et al. in Anal. Biochem. (1974) 58, 347;
    • viii) Azlactone, die an Polymere gebunden sind, wie Bisacrylamid, z.B. wie beschrieben von Rasmussen, J. K. in Reactive Polymers (1991) 16, 199; und
    • ix) Imidoester, die stabile Amidine bei der Reaktion mit Aminogruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Hunter, M. J. und Ludwig, M. L. in J. Am. Chem. Soc. (1962) 84, 3491.
  • Carbonylgruppen, wie Aldehydfunktionen können mit schwachen Proteinbasen bei einem derartigen pH umgesetzt werden, dass die nukleophilen Protein-Seitenkettenfunktionen protoniert werden. Schwache Basen umfassen 1,2-Aminothiole, wie jene, die in N-terminalen Cysteinresten gefunden werden, die selektiv stabile 5-gliedrige Thiazolidin-Ringe mit Aldehydgruppen bilden, z.B. wie beschrieben von Ratner, S. et al. in J. Am. Chem. Soc. (1937) 59, 200. Andere schwache Basen, wie Phenylhydrazone, können verwendet werden, z.B. wie beschrieben von Heitzmann, H. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71, 3537.
  • Aldehyde und Ketone können auch mit Aminen umgesetzt werden, um Schiff-Basen zu bilden, die vorteilhafterweise durch reduktive Aminierung stabilisiert werden können. Alkoxylamino-Einheiten reagieren leicht mit Ketonen und Aldehyden, um stabile Alkoxamine herzustellen, z.B. wie beschrieben von Webb, R. et al. in Bioconjugate Chem. (1990) 1, 96.
  • Beispiele reaktiver Einheiten, die zur Reaktion mit Carboxylgruppen fähig sind, umfassen Diazo-Verbindungen, wie Diazoacetatester und Diazoacetamide, die mit hoher Spezifität reagieren, um Estergruppen zu erzeugen, z.B. wie beschrieben von Herriot, R. M. in Adv. Protein Chem. (1947) 3, 169. Carbonsäure modifizierende Mit tel, wie Carbodiimide, die durch O-Acylharnstoff-Bildung gefolgt von Amidbindungs-Bildung reagieren, können auch nützlicherweise eingesetzt werden; das Binden kann durch Addition eines Amins vereinfacht werden oder kann zu einer direkten Vektor/Rezeptor-Kopplung führen. Nützliche wasserlösliche Carbodiimide umfassen 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimide (CMC) und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC), z.B. wie beschrieben von Zot, H. G. und Puett, D. in J. Biol. Chem. (1989), 264, 15552. Andere nützliche Carbonsäure modifizierende Reagenzien umfassen Isoxazolium-Derivate, wie Woodwards Reagenz K; Chloroformiate, wie p-Nitrophenyl-chloroformiat; Carbonyldiimidazol, wie 1,1'-Carbonyldiimidazole; und N-Carbalkoxydihydrochinoline, wie N-(Ethoxycarbonyl)-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin.
  • Andere möglicherweise nützliche reaktive Einheiten umfassen vicinale Dione, wie p-Phenylendiglyoxal, die zum Reagieren mit Guanidyl-Gruppen verwendet werden können, z.B. wie beschrieben von Wagner et al. in Nucleic acid Res. (1978) 5, 4065; und Diazonium-Salze, die elektrophile Substitutionsreaktionen durchlaufen können, z.B. wie beschrieben von Ishizaka, K. und Ishizaka T. in J. Immunol. (1960) 85, 163. Bis-diazonium-Verbindungen werden leicht durch Behandlung von Aryldiaminen mit Natriumnitrit in sauren Lösungen hergestellt. Es wird anerkannt werden, dass funktionelle Gruppen im Reporter und/oder Vektor, falls erwünscht, in andere funktionelle Gruppen von der Reaktion umgewandelt werden können, z.B. um zusätzliche Reaktivität oder Selektivität zu verleihen. Beispiele für Verfahren, die für diesen Zweck nützlich sind, umfassen die Umwandlung von Aminen zu Carbonsäuren unter Verwenden von Reagenzien, wie Dicarbonsäureanhydride; die Umwandlung von Aminen in Thiole unter Verwenden von Reagenzien, wie N-Acetylhomocysteinthiolacton, S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid, 2-Iminothiolan- oder Thiol-enthaltende Succinimidyl-Derivate; die Umwandlung von Thiolen in Carbonsäuren unter Verwenden von Reagenzien, wie α-Haloacetate; die Umwandlung von Thiolen in Amine unter Verwenden von Reagenzien, wie Ethylenimin oder 2-Bromoethylamin; die Umwandlung von Carbonsäuren in Amine unter Verwenden von Reagenzien, wie Carbodiimide, gefolgt von Diaminen; und die Umwandlung von Alkoholen in Thiole unter Verwenden von Reagenzien, wie Tosylchlorid, gefolgt von Umesterung mit Thioacetat und Hydrolyse zum Thiol mit Natriumacetat.
  • Vektor-Reporter-Kopplung kann auch bewirkt werden unter Verwenden von Enzymen, wie Null-Längen-verbindende Mittel; so können z.B. Transglutaminase, Peroxidase und Xanthinoxidase zum Herstellen verbundener Produkte verwendet werden. Reverse Proteolyse kann auch zum Binden durch Amidbindungs-Bildung verwendet werden.
  • Nicht-kovalente Vektor-Reporter-Kopplung kann z.B. durch elektrostatische Ladungs-Wechselwirkungen bewirkt werden, z.B. zwischen einem Polylysinyl-funktionalisiertem Reporter und einem Polyglutamyl-funktionalisiertem Vektor, durch Chelatierung in der Form von stabilen Metallkomplexen oder durch Hochaffinitäts-Bindungs-Wechselwirkung, wie Avidin/Biotin-Bindung. Polylysin, das nicht-kovalent auf einer negativ geladenen Membranoberfläche geschichtet ist, kann auch nicht-spezifisch die Affinität eines Mikrobläschens für eine Zelle durch Ladungswechselwirkungen vergrößern.
  • Alternativ kann ein Vektor an ein Protein gekoppelt werden, das dafür bekannt ist, Phospholipide zu binden. In vielen Fällen kann ein einzelnes Molekül Phospholipid an ein Protein, wie eine Translokase binden, während andere Proteine an Oberflächen binden können, die hauptsächlich aus Phospholipid-Kopfgruppen bestehen, und so zum Binden von Vektoren an Phospholipid-Mikrokügelchen verwendet werden können; ein Beispiel eines derartigen Proteins ist β2-Glykoprotein I (Chonn, A., Semple, S. C. und Cullis, P. R., Journal of Biological Chemistry (1995) 270, 25845–25849). Phosphatidylserin-bindende Proteine wurden beschrieben, z.B. von Igarashi, K. et al. in Journal of Biological Chemistry 270 (49), 29075–29078; ein Konjugat eines Vektors mit einem derartigen Phosphatidylserin-bindenden Protein kann deshalb zum Binden des Vektors an Phosphatidylserin-eingekapselte Mikrobläschen verwendet werden. Wenn die Aminosäuresequenz eines bindenden Proteins bekannt ist, kann der Phospholipid-bindende Teil synthetisiert oder isoliert werden und für die Konjugation mit einem Vektor verwendet werden, und so die biologische Aktivität vermeiden, die irgendwo im Molekül lokalisiert sein kann.
  • Es ist auch möglich, Moleküle zu erhalten, die spezifisch an die Oberfläche (oder in die „Membran") von Mikrokügelchen binden, durch direktes Screenen von molekularen Bibliotheken auf Mikrokügelchen-bindende Moleküle. Zum Beispiel können Phagen-Bibliotheken, die kleine Peptide zeigen, für eine derartige Selektion verwendet werden. Die Selektion kann erfolgen durch einfach Mischen der Mikrokügelchen und der Phagen-Display-Bibliothek, und Eluieren der Phagen, die an die flotierenden Mikrokügelchen binden. Falls erwünscht, kann die Selektion ausgeführt werden unter „physiologischen Bedingungen" (z.B. im Blut), um Peptide zu eliminieren, die mit Blutkomponenten kreuzreagieren. Ein Vorteil dieses Typs der Selektionsprozedur ist, dass nur bindende Moleküle, die nicht die Mikrokügelchen destabilisieren, ausgewählt werden sollten, da nur bindende Moleküle, die an intakte flotierende Mikrokügelchen binden, nach oben steigen werden. Es kann auch möglich sein, etwas „Spannung" während der Selektionsprozedur (z.B. Druck) einzuführen, um sicherzustellen, dass destabilisierende bindende Einheiten nicht selektiert werden. Außerdem kann die Selektion unter Scher-Bedingungen durchgeführt werden, z.B. durch zuerst Reagierenlassen der Phagen mit den Mikrokügelchen und dann Durchlaufenlassen der Mikrokügelchen durch eine Oberfläche, die mit Anti-Phagen-Antikörpern bedeckt sind, unter Flussbedingungen. Auf diese Weise kann es möglich sein, Binder zu selektieren, die Scher-Bedingungen, die in vivo vorhanden sind, widerstehen. Bindende Einheiten, die auf diese Weise identifiziert werden, können (durch chemische Konjugation oder durch Peptidsynthese, oder auf dem DNA-Niveau für rekombinante Vektoren) an ein Vektormolekül gekoppelt werden, das ein allgemeines Werkzeug zum Binden eines beliebigen Vektormoleküls an die Mikrokügelchen darstellt.
  • Ein Vektor, der einen Peptid-, Lipo-Oligosaccharid- oder Lipopeptid-Linker umfasst oder daran gekoppelt ist, der ein Element enthält, das zum Vermitteln einer Membraninsertion fähig ist, kann auch nützlich sein. Ein Beispiel ist beschrieben von Leenhouts, J. M. et al. in Febs Letters (1995) 370 (3), 189–192. Nicht-bioaktive Moleküle, die aus bekannten Membraninsertions-Anker/Signalgruppen bestehen, können auch als Vektoren für bestimmte Anwendungen verwendet werden, wobei ein Beispiel das hydrophobe H1-Segment der Na,K-ATPase-α-Untereinheit ist, die von Xie, Y. und Morimoto, T. in J. Biol. Chem. (1995) 270(20), 11985–11991 beschrieben ist. Die Ankergruppe kann auch Fettsäure(n) oder Cholesterin sein.
  • Koppeln kann auch bewirkt werden unter Verwenden von Avidin oder Streptavidin, die vier Hochaffinitäts-Bindungsstellen für Biotin besitzen. Avidin kann deshalb zum Konjugieren des Vektors an den Reporter verwendet werden, falls sowohl der Vektor als auch der Reporter biotinyliert sind. Beispiele werden beschrieben von Bayer, E. A. und Wilchek, M. in Methods Biochem. Anal. (1980) 26,1. Dieses Verfahren kann auch erweitert werden, um das Binden von Reporter an Reporter zu umfassen, ein Prozess, der die Bläschen-Assoziation und eine nachfolgend möglicherweise vergrößerte Echogenizität fördert. Alternativ kann Avidin oder Streptavidin direkt an die Oberfläche von Reporter-Mikroteilchen gebunden werden.
  • Nicht-kovalentes Koppeln kann auch die bifunktionelle Natur von bispezifischen Immunoglobulinen nutzen. Diese Moleküle können spezifisch zwei Antigene binden und sie so verbinden. Zum Beispiel können entweder bispezifisches IgG oder chemisch entworfene bispezifische F(ab)'2-Fragmente als verbindende Mittel verwendet werden. Es wurde auch berichtet von heterobifunktionellen bispezifischen Antikörpern für das Binden zweier verschiedener Antigene, z.B. wie beschrieben von Bode, C. et al. in J. Biol. Chem. (1989) 264, 944 und von Staerz, U. D. et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 1453. Auf ähnliche Weise kann ein beliebiger Reporter und/oder Vektor, der zwei oder mehr antigene Determinanten enthält (z.B. wie beschrieben von Chen, Aa et al. in Am. J. Pathol. (1988) 130, 216) durch Antikörpermoleküle vernetzt werden und zur Bildung von vernetzten Multi-Bläschen-Vereinigungen möglicherweise vergrößerter Echogenizität führen.
  • Verbindende Mittel, die gemäß der Erfindung verwendet werden, werden im allgemeinen das Binden des Vektors an den Reporter oder des Reporters an den Repor ter mit einigem Grad an Spezifität herbeiführen, und können auch zum Binden eines oder mehrerer therapeutisch wirksamer Mittel verwendet werden.
  • In einigen Fällen wird es als vorteilhaft betrachtet, eine PEG-Komponente als einen Stabilisator in Zusammenhang mit einem Vektor oder Vektoren oder direkt an den Reporter im selben Molekül einzuschließen, wo das PEG nicht als ein Spacer dient.
  • Sogenannte Null-Längen-verbindende Mittel, die ein direktes kovalentes Verknüpfen zweier reaktiver chemischer Gruppen ohne Einführen zusätzlichen verbindenden Materials induzieren (z.B. wie bei der Amidbindungs-Bildung, die unter Verwenden von Carbodiimiden oder enzymatisch induziert ist), können, falls erwünscht, gemäß der Erfindung verwendet werden, wie viele Reagenzien, wie Biotin/Avidin-Systeme, die nicht-kovalentes Reporter-Vektor-Binden induzieren, und Mittel, die hydrophobe oder elektrostatische Wechselwirkungen induzieren.
  • Am häufigsten wird jedoch das verbindende Mittel zwei oder mehr reaktive Einheiten umfassen, z.B. wie oben beschrieben, die durch ein Spacerelement verbunden sind. Das Vorhandensein eines derartigen Spacers erlaubt bifunktionellen Linkern, mit spezifischen funktionellen Gruppen innerhalb eines Moleküls oder zwischen zwei verschiedenen Molekülen zu reagieren, was zu einer Bindung zwischen diesen zwei Komponenten und Einführen extrinsischen, vom Linker abgeleiteten Materials in das Reporter-Vektor-Konjugat führt. Die reaktiven Einheiten in einem verbindenden Mittel können dieselben (homobifunktionelle Mittel) oder verschieden (heterobifunktionelle Mittel oder, wo mehrere unähnliche reaktive Einheiten vorhanden sind, heteromultifunktionelle Mittel) sein, was eine Vielfalt von möglichen Reagenzien bereitstellt, die das kovalente Binden zwischen beliebigen chemischen Spezien herbeiführen kann, entweder intramolekular oder intermolekular.
  • Die Natur extrinsischen Materials, das durch das verbindende Mittel eingeführt wird, kann einen entscheidenden Einfluss auf die Zielausrichtungsfähigkeit und allgemeine Stabilität des Endprodukts besitzen. So kann es erwünscht sein, labile Bindungen einzuführen, z.B. die Spacerarme enthalten, die bioabbaubar oder chemisch empfindlich sind oder die Stellen enzymatischer Spaltung einbauen. Alternativ kann der Spacer polymere Komponenten umfassen, z.B. um als oberflächenaktive Mittel zu wirken und die Bläschenstabilität zu verstärken. Der Spacer kann auch reaktive Einheiten enthalten, z.B. wie oben beschrieben, um das Oberflächen-Vernetzen zu verstärken, oder er kann ein Tracerelement, wie eine fluoreszierende Sonde, einen Spinmarker oder radioaktives Material enthalten.
  • Kontrastmittel gemäß der vorliegenden Erfindung sind deshalb bei allen Bildgebungsmodalitäten nützlich, da Kontrastelemente, wie Röntgenstrahlungskontrastmittel, Lichtbildgebungssonden, Spinmarker oder radioaktive Einheiten auf einfache Weise in die Reportereinheiten eingebaut oder daran gebunden werden können.
  • Spacerlemente können typischerweise aus aliphatischen Ketten bestehen, die die reaktiven Einheiten des Linkers durch Entfernungen zwischen 5 und 30 Å trennen. Sie können auch makromolekulare Strukturen umfassen, wie PEGs, denen viel Aufmerksamkeit in biotechnischen und biomedizinischen Anwendungen gegeben wurde (siehe z.B. Milton Harris, J. (Hsg.) „Poly(ethylene glycol) chemistry, biotechnical and biomedical applications" Plenum Press, New York, 1992). PEGs sind in den meisten Lösungsmitteln, einschließlich Wasser, löslich und sind in wässrigen Umgebungen stark hydratisiert, wobei zwei oder drei Wassermoleküle an jedes Ethylenglykolsegment gebunden sind; dies besitzt den Effekt des Verhinderns einer Adsorption entweder von anderen Polymeren oder von Proteinen an PEG-modifizierte Oberflächen. PEGs sind als nicht-toxisch und als nicht aktive Proteine oder Zellen schädigend bekannt, während kovalent gebundene PEGs dafür bekannt sind, dass sie nicht-immunogen und nicht-antigen sind. Außerdem können PEGs auf einfache Weise modifiziert und gebunden werden an andere Moleküle mit nur einem kleinen Effekt auf ihre Chemie. Ihre vorteilhafte Löslichkeit und die biologischen Eigenschaften sind offenbar von den vielen möglichen Verwendungen von PEGs und Copolymeren davon, einschließlich Blockcopolymeren, wie PEG-Polyurethanen und PEG-Polypropylenen.
  • Geeignete Molekulargewichte für PEG-Spacer, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können z.B. zwischen 120 Dalton und 20 kDalton betragen.
  • Der Hauptmechanismus zur Aufnahme von Teilchen durch die Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES) ist die Opsonisation durch Plasmaproteine im Blut; diese markieren Fremdteilchen, die dann vom RES aufgenommen werden. Die biologischen Eigenschaften von PEG-Spacerelementen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können zum Vergrößern der Kontrastmittel-Zirkulationszeit verwendet werden, auf eine ähnliche Weise zu jener, die für PEGylierte Liposomen beobachtet wird (siehe z.B. Klibanov A. L. et al. in FEBS Letters (1990) 268, 235–237 und Blume, G. und Cevc, G. in Biochim. Biophys. Acta (1990) 1029, 91–97). Ein vergrößerter Kopplungs-Wirkungsgrad an Gebiete von Interesse kann auch erreicht werden unter Verwenden von Antikörpern, die an die Termini von PEG-Spacern gebunden sind (siehe z.B. Maruyama, K. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1234, 74–80 und Hansen C. B. et al. in Biochim. Biophys. Acta (1995) 1239, 233–144).
  • In einigen Fällen wird es als vorteilhaft betrachtet, eine PEG-Komponente als einen Stabilisator in Zusammenhang mit einem Vektor oder Vektoren oder direkt am Reporter im selben Molekül einzuschließen, wobei das PEG nicht als ein Spacer dient.
  • Andere repräsentative Spacerelemente umfassen Polysaccharide des Strukturtyps, wie Polygalakturonsäure, Glykosaminoglykane, Heparinoide, Zellulose und marine Polysaccharide, wie Alginate, Chitosane und Carrageenans; Polysaccharide des Speichertyps, wie Stärke, Glykogen, Dextran und Aminodextrane; Polyaminosäuren und Methyl- und Ethylester davon, wie in Homo- und Copolymeren von Lysin, Glutaminsäure und Asparaginsäure; und Polypeptide, Oligosaccharide und Oligonukleotide, die Enzymspaltungsstellen enthalten können oder nicht.
  • Im allgemeinen können Spacerelemente spaltbare Gruppen enthalten, wie vicinale Glykol-, Azo-, Sulfon-, Ester-, Thioester- oder Disulfidgruppen. Spacer, die bioabbaubare Methylendiester- oder Diamidgruppen der Formel -(Z)m·Y·X·C·(R1R2)·X·Y·(Z)n- enthalten [wobei X und Z ausgewählt sind aus -O-, -S-, und -NR- (wobei R für Wasserstoff oder eine organische Gruppe steht); jedes Y eine Carbonyl-, Thiocarbonyl-, Sulfonyl-, Phosphoryl- oder eine ähnliche säurebildende Gruppe ist: m und n jeweils für 0 oder 1 stehen; und R1 und R2 jeweils für Wasserstoff, eine organische Gruppe oder eine Gruppe -X·Y·(Z)m- stehen, oder zusammen eine divalente organische Gruppe bilden], können auch nützlich sein, wie z.B. diskutiert in WO-A-9217436, wobei derartige Gruppen auf einfache Weise bei Vorhandensein von Esterasen bioabbaubar sind, z.B. in vivo, aber bei Abwesenheit derartiger Enzyme stabil sind. Sie können deshalb vorteilhafterweise an therapeutische Mittel gebunden werden, um die langsame Freisetzung davon zu ermöglichen.
  • Poly[N-(2-hydroxyethyl)methacrylamide] sind möglicherweise nützliche Spacermaterialien aufgrund ihres geringen Grades der Wechselwirkung mit Zellen und Geweben (siehe z.B. Volfová, I., Rihová, B. und V. R. und Vetvicka, P. in J. Bioact. Comp. Polymers (1992) 7, 175–190). Die Arbeit mit einem ähnlichen Polymer, das hauptsächlich aus dem nahe verwandten 2-Hydroxypropylderivat besteht, zeigte, dass es durch das mononukleare Phagocyten-System nur in einem ziemlich geringen Ausmaß endozytosiert wurde (siehe Goddard, P., Williamson, I., Bron, J., Hutchkinson, L. E., Nicholls, J. und Petrak, K. in J. Bioct. Compat. Polym. (1991) 6, 4–24.).
  • Andere möglicherweise nützliche polymere Spacermaterialien umfassen:
    • i) Copolymere von Methylmethacrylat mit Methacrylsäure; diese können erodierbar sein (siehe Lee, P. I. in Pharm. Res. (1993) 10, 980) und die Car boxylatsubstituenten können einen höheren Grad des Quellens verursachen, als mit neutralen Polymeren;
    • ii) Blockcopolymere von Polymethacrylaten mit bioabbaubaren Polyestern (siehe z.B. San Roman, J. und Guillen-Garcia, P. in Biomaterials (1991) 12, 236–241);
    • iii) Cyanoacrylate, d.h. Polymere von Estern von 2-Cyanoacrylsäure – diese sind bioabbaubar und wurden in der Form von Nanopartikeln für selektive Arzneimittelverabreichung verwendet (siehe Forestier, F., Gerrier, P., Chaumard, C., Quero, A. M., Courvreur, P. und Labarre, C. in J. Antimicrob. Chemoter. (1992) 30, 173–179);
    • iv) Polyvinylalkohole, die wasserlöslich sind und allgemein als biokompatibel betrachtet werden (siehe z.B. Langer, R. in J. Control. Release (1991) 16, 53–60);
    • v) Copolymere von Vinylmethylether mit Maleinsäureanhydrid, die als bioerodierbar genannt worden sind (siehe Finne, U., Hannus, M. und Urtti, A. in Int. J. Pharm. (1992) 78, 237–241);
    • vi) Polyvinylpyrrolidone, z.B. mit einem Molekulargewicht von weniger als ungefähr 25000, die schnell durch die Nieren gefiltert werden (siehe Hespe, W., Meier, A. M. und Blankwater, Y. M. in Arzneim.-Forsch./Drug Res. (1977) 27, 1158–1162);
    • vii) Polymere und Copolymere von kurzkettigen aliphatischen Hydroxysäuren, wie Glykol-, Milch-, Butter-, Valerian- und Capronsäure (siehe z.B. Carli in Chim. Ind. (Mailand) (1993) 75, 494–9), einschließlich Copolymere, die aromatische Hydroxysäuren eingebaut haben, um ihre Abbaugeschwindigkeit zu vergrößern (siehe Imasaki, K., Yoshida, M. Fukuzaki, H., Asano, M., Kumakura, M., Mashimo, T., Yamanaka, H. und Nagai. T. in Int. J. Pharm.(1992) 81, 31–38);
    • viii) Polyester, die aus alternierenden Einheiten von Ethylenglykol und Terephthalsäure bestehen, z.B. DacronR, die nicht abbaubar, aber hoch biokompatibel sind;
    • ix) Blockcopolymere, die bioabbaubare Segmente aliphatischer Hydroxysäurepolymere umfassen (siehe z.B. Younes, H., Nataf, P. R. Cohn, D., Appelbaum, Y. J., Pizov G. und Uretzky, G. in Biomater. Artif. Cells Artif. Organs (1988) 16, 705–719), z.B. in Zusammenhang mit Polyurethanen (siehe Kobayashi, H., Hyon, S. H. und Ikada, Y. in „Water-curable and biodegradable prepolymers"-J. Biomed. Mater. Res. (1991) 25, 1481–1494);
    • x) Polyurethane, von denen bekannt ist, dass sie in Implantaten gut toleriert werden und die mit flexiblen „weichen" Segmenten kombiniert werden können, z.B. umfassend Poly(tetramethylenglykol), Poly(propylenglykol) oder Poly(ethylenglykol) und aromatische „harte" Segmente, z.B. umfassend 4,4'-Methylenbis(phenylenisocyanat) (siehe z.B. 4,4'-Methylenbis(phenylenisocyanat) (siehe z.B. Ratner, B. D., Johnston, A. B. und Lenk, T. J. in J. Biomed. Mater. Res: Applied Biomaterials (1987) 21, 59–90; Sa Da Costa, V. et al. in J. Coll. Interface Sci (1981) 80, 445–452 und Affrossman, S. et al. in Clinical Materials (1991) 8, 25–31);
    • xi) Poly(1,4-dioxan-2-one), die als bioabbaubare Ester im Hinblick auf ihre hydrolysierbaren Esterbindungen betrachtet werden können (siehe z.B. Song, C. X., Cui, C. M. und Schindler, A. in Med. Biol. Eng. Comput. (1993) 31, S147–150), und die Glykolideinheiten umfassen können, um ihre Absorbierbarkeit zu verbessern, (siehe Bezwada, R. S., Shalaby, S. W. und Newman, H.D.J. in Agricultural and synthetic polymers: Biodegradability and utilization (1990) (Hsg. Glass, J. E. und Swift, G.), 167–174 – ACS symposium Series, #433, Washington D. C., U.S.A. – American Chemical Society);
    • xii) Polyanhydride, wie Copolymere von Sebacinsäure (Oktandisäure) mit Bis(4-carboxy-phenoxy)propan, für die in Kaninchenstudien (siehe Brem, H., Kader, A., Epstein, J. I., Tamargo, R. J., Domb, A., Langer, R. und Leong, K. W. in Sel. Cancer Ther. (1989) 5,55–65) und Rattenstudien (siehe Tamargo, R. J., Epstein, J. I., Reinhard, C. S., Chasin, M. und Brem, H. in J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23, 253–266) gezeigt wurde, dass sie für die gesteuerte Freisetzung von Arzneimitteln im Gehirn ohne evidente toxische Effekte nützlich sind;
    • xiii) bioabbaubare Polymere, die ortho-Estergruppen enthalten, die für eine gesteuerte Freisetzung in vivo eingesetzt worden sind (siehe Maa, Y. F. und Heller, J. in J. Control. Release (1990) 14, 21–28); und
    • xiv) Polyphosphazene, die anorganische Polymere sind, die aus alternierenden Phosphor- und Stickstoffatomen bestehen (siehe Crommen, J. H., Vandorpe, J. und Schacht, E. H. in J. Control. Release (1993) 24, 167–180).
  • Die folgenden Tabellen listen verbindende Mittel und Mittel für die Proteinmodifikation auf, die beim Herstellen von zielausrichtbaren Mitteln gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sein können.
  • Heterobifunktionelle verbindende Mittel
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Homobifunktionelle verbindende Mittel
    Figure 00400002
  • Figure 00410001
  • Biotinylierungs-Mittel
    Figure 00410002
  • Mittel für die Proteinmodifikation
    Figure 00420001
  • Andere möglicherweise nützliche Proteinmodifikationen umfassen die teilweise oder vollständige Deglykosilierung durch Neuraminidase, Endoglykosidasen oder Periodat, da die Deglykosilierung oft zu einer geringeren Aufnahme durch die Leber, Milz, Makrophagen etc. führt, wohingegen Neoglykosilierung von Proteinen oft zu einer vergrößerten Aufnahme durch die Leber und Makrophagen führt; Herstellung von verkürzten Formen durch proteolytische Spaltung, was zu einer verringerten Größe und einer kürzeren Halbwertszeit im Kreislauf führt; und Kationisierung, z.B. wie beschrieben durch Kumagi et al. in J. Biol. Chem. (1987) 262, 15214–15219; Triguero et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 4761–4765; Pardridge et al. in J. Pharmacol. Exp. Therap. (1989) 251, 821–826 und Pardridge und Boado, Febs Lett. (1991) 288, 30–32.
  • Vektoren, die nützlicherweise in zielausrichtbaren Mitteln gemäß der Erfindung eingesetzt werden können, umfassen die folgenden:
    • i) Antikörper, die als Vektoren für einen weiten Bereich von Zielen verwendet werden können, und die vorteilhafte Eigenschaften besitzen, wie eine sehr hohe Spezifität, hohe Affinität (falls erwünscht), die Möglichkeit des Modifizierens der Affinität wie notwendig etc. Ob Antikörper bioaktiv sein werden oder nicht, wird von der spezifischen Vektor/Ziel-Kombination abhängen. Sowohl konventionelle als auch genetisch konstruierte Antikörper können eingesetzt werden, wobei die Letzteren das Konstruieren von Antikörpern für besondere Notwendigkeiten erlaubt, z.B. im Hinblick auf die Affinität und Spezifität. Die Verwendung von menschlichen Antikörpern kann bevorzugt sein, um mögliche Immunreaktionen gegen das Vektormolekül zu vermeiden. Eine weitere nützliche Klasse von Antikörpern umfasst sogenannte bi- und multi-spezifische Antikörper, d.h. Antikörper mit einer Spezifität für zwei oder mehr verschiedene Antigene in einem Antikörpermolekül. Derartige Antikörper können z.B. beim Fördern der Bildung von Bläschenclustern nützlich sein, und können auch für verschiedene therapeutische Zwecke verwendet werden, z.B. zum Tragen toxischer Einheiten zum Ziel. Verschiedene Aspekte von bispezifischen Antikörpern werden beschrieben von McGuiness, B. T. et al. in Nat. Biotechnol. (1996) 14, 1149–1154; von George, A. J. in J. Immunol. (1994) 152, 1802–1811; von Bonardi et al. in Cancer Res. (1993) 53, 3015–3021; und von French R. R. et al. in Cancer Res. (1991) 51, 2353–2361.
    • ii) Zelladhäsionsmoleküle, ihre Rezeptoren, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Peptidhormone und Stücke davon. Derartige Vektoren beruhen auf normalen biologischen Protein-Protein-Wechselwirkungen mit Zielmolekül-Rezeptoren und werden so in vielen Fällen eine biologische Respons beim Binden mit den Zielen erzeugen und so bioaktiv sein; dies kann eine relativ unsignifikante Angelegenheit mit Vektoren sein, die auf Proteoglykane zielausgerichtet sind.
    • iii) Nicht-Peptid Agonisten/Antagonisten oder nicht-bioaktive Binder von Rezeptoren für Zelladhäsionsmoleküle, Cytokine, Wachstumsfaktoren und Peptidhormone. Diese Kategorie kann nicht-bioaktive Vektoren umfassen, die weder Agonisten noch Antagonisten sein werden, die aber nichtsdestotrotz eine wertvolle Zielausrichtungs-Fähigkeit zeigen.
    • iv) Oligonukleotide und modifizierte Oligonukleotide, die DNA oder RNA durch Watson-Crick oder andere Typen der Basenpaarung binden. DNA ist üblicherweise nur im extrazellulären Raum als eine Konsequenz der Zellzerstörung vorhanden, so dass derartige Oligonukleotide, die üblicherweise nicht bioaktiv sein werden, beim z.B. Zielausrichten auf nekrotische Bereiche nützlich sein können, die mit vielen verschiedenen pathologischen Zuständen assoziiert sind. Oligonukleotide können auch gestaltet sein, um an spezifische DNA- oder RNA-bindende Proteine zu binden, z.B. Transkriptionsfaktoren, die sehr oft stark überexprimiert sind oder in Tumorzellen oder in aktiven Immun- oder endothelialen Zellen aktiviert sind. Kombinatorische Bibliotheken können verwendet werden, um Oligonukleotide zu selektieren, die spezifisch an beliebige mögliche Zielmoleküle binden, und die deshalb als Vektoren zum Zielausrichten eingesetzt werden können.
    • v) DNA-bindende Arzneimittel können sich den Oligonukleotiden ähnlich verhalten, können aber eine biologische Aktivität und/oder toxische Effekte zeigen, falls sie von Zellen aufgenommen werden.
    • vi) Proteasesubstrate/Inhibitoren. Proteasen sind in vielen pathologischen Zuständen involviert. Viele Substrate/Inhibitoren sind nicht-peptidisch, sind aber, mindestens im Falle von Inhibitoren, oft bioaktiv.
    • vii) Vektormoleküle können aus kombinatorischen Bibliotheken erzeugt werden, ohne notwendigerweise das genaue molekulare Ziel zu kennen, durch funktionelles Selektieren (in vitro, ex vivo oder in vivo) nach Molekülen, die an die abzubildende Region/Struktur binden.
    • viii) Verschiedene kleine Moleküle, einschließlich bioaktive Verbindungen, die dafür bekannt sind, dass sie biologische Rezeptoren verschiedener Arten binden. Derartige Vektoren oder ihre Ziele können zum Erzeugen nicht-bioaktiver Verbindungen, die an dieselben Ziele binden, verwendet werden.
    • ix) Proteine oder Peptide, die an Glucosaminoglykan-Seitenketten binden, z.B. Heparansulfat, einschließlich Glucosaminoglykan-bindende Teile größerer Moleküle, da das Binden Glucosaminoglykane nicht zu einer biologischen Respons führt. Proteoglykane werden nicht auf roten Blutzellen gefunden, was eine unerwünschte Adsorption an diese Zellen eliminiert.
  • Andere Peptidvektoren und Lipopeptide davon von besonderem Interesse für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung werden unten aufgelistet: Peptide, die atherosklerotische Plaques binden, wie YRALVDTLK, YAKFRETLEDTRDRMY und RALVDTEFKVKQEAGAK; einen Thrombus bindende Peptide, wie NDGDFEEIPEEYLQ und GPRG, Plättchen bindende Peptide, wie PLYKKIIKKLLES; und Cholecystokinin, α-Melanocyt-stimulierendes Hormon, wärmestabiles Enterotoxin 1, vasoaktives intestinales Peptid, synthetisches alpha-M2-Peptid vom dritten Schwerketten-Komplementäts-bestimmenden Bereich und Analoga davon für Tumor-Zielausrichtung.
  • Die folgenden Tabellen identifizieren verschiedene Vektoren, die auf besondere Typen von Zielen zielausgerichtet werden können, und angezeigte Gebiete der Verwendung für die zielausrichtbaren diagnostischen und/oder therapeutischen Mittel gemäß der Erfindung, die derartige Vektoren enthalten.
  • Protein- und Peptidvektoren – Antikörper
    Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Literaturstellen
    • a) Heider, K. H., M. Sproll, S. Susani, E. Patzelt, P. Beaumier, E. Ostermann, H. Ahorn, und G. R. Adolf. 1996 „Characterization of a high-affinity monoclonal antibody specific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cell carcinomas". Cancer Immunology Immunotherapy 43: 245–253.
    • b) I. Roitt, J. Brostoff, und D. Male. 1985. Immunology, London: Gower Medical Publishing, p. 4.7
    • c) Stromblad, S., und D. A. Cheresh. 1996 „Integrins, angiogenesis and vascular cell survival". Chemistry & Biology 3: 881–885.
  • Protein- und Peptidvektoren – Zelladhäsionsmoleküle etc.
    Figure 00480001
  • Vektoren, umfassend Cytokine/Wachstumsfaktoren/Peptidhormone und Fragmente davon
    Figure 00490001
  • Verschiedene Protein- und Peptidvektoren
    Figure 00500001
  • Vektoren, umfassend Nicht-Peptid-Agonisten/Antagonisten oder nicht bioaktive Binder von Rezeptoren für Cytokine/Wachstumsfaktoren/Peptidhormonen/Zelladhäsionsmolekülen
    Figure 00510001
  • Vektoren, umfassend anti-angiogene Faktoren
    Figure 00520001
  • Vektoren, umfassend angiogene Faktoren
    Figure 00530001
  • Vektormoleküle mit Ausnahme von erkannten angiogenen Faktoren mit bekannter Affinität für Rezeptoren, die mit Angiogenese assoziiert sind
    Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Rezeptoren/Ziele, die mit Angiogenese in Zusammenhang stehen
    Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Oligonukleotid-Vektoren
    Figure 00580001
  • Modifizierte Oligonukleotid-Vektoren
    Figure 00590001
  • Nucleosid- und Nucleotid-Vektoren
    Figure 00590002
  • Rezeptoren, die DNA-bindende Arzneimittel umfassen
    Figure 00590003
  • Rezeptoren, umfassend Protease-Substrate
    Figure 00600001
  • Rezeptoren, umfassend Protease-Inhibitoren
    Figure 00600002
  • Vektoren von kombinatorischen Bibliotheken
    Figure 00610001
  • Kohlenhydrat-Vektoren
    Figure 00610002
  • (Glyco)Lipidvektoren
    Figure 00620001
  • Kleine Molekülvektoren
    Figure 00630001
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  • Die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung. Die Bestätigung der Mikroteilchen-förmigen Natur der Produkte wird unter Verwenden einer Mikroskopie ausgeführt, wie beschrieben in WO-A-9607434. Ultraschallübertragungs-Messungen können durchgeführt werden unter Verwenden eines Breitband-Transducers, um Mikrobläschen-Suspensionen anzuzeigen, was verglichen mit einer Standard-Durchflusszytometrie-Analyse von Produkten eine vergrößerte Schallstrahl-Dämpfung ergibt, und kann verwendet werden, um die Bindung von Makromolekülen daran zu bestätigen. Die Fähigkeit von zielausgerichteten Mikrobläschen, um spezifisch an Zellen zu binden, die ein Ziel expri mieren, kann in vitro durch Mikroskopie und/oder unter Verwenden einer Flusskammer, die immobilisierte Zellen enthält, studiert werden, z.B. unter Einsetzen einer Population von Zellen, die die Zielstruktur exprimieren und einer weiteren Population von Zellen, die das Ziel nicht exprimieren. Radioaktives, fluoreszierendes oder Enzym-markiertes Streptravidin/Avidin kann zum Analysieren der Biotin-Bindung verwendet werden.
  • Beispiel 1 – Adhäsion von Poly-L-Lysin beschichteten Phosphatidylserin eingekapselten Mikrobläschen an endotheliale Zellen
  • Poly-L-Lysin (8 mg) mit einem Molekulargewicht von 115 kDa wurde in Wasser (400 μl) aufgelöst. Frisch wieder dispergierte Mikrobläschen von Phosphatidylserin-eingekapseltem Perfluorbutan (40 μl) wurden in entweder Wasser (400 μl) oder der Poly-L-Lösung 15 Min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zeta-Potential-Messungen bestätigten, dass die Poly-L-Lysin-beschichteten Mikrobläschen positiv geladen waren, während die nicht beschichteten Bläschen negativ geladen waren. Eine Zelladhäsionsstudie unter Verwenden von menschlichen endothelialen Zellen, die in Kulturschälchen gezüchtet worden sind, wurde mit den oben beschriebenen Mikrobläschen ausgeführt, wobei die nicht beschichteten Mikrobläschen als eine Kontrolle verwendet wurden. Die Mikroskopie der endothelialen Zellen nach der Inkubation zeigte eine vergrößerte Anzahl von Poly-L-Lysin-beschichteten Mikrobläschen, die an endothelialen Zellen anhaften, im Vergleich zu den nicht beschichteten Mikrobläschen.
  • Beispiel 2 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, die Phosphatidylserin und RGDC-Mal-PEG3400-DSPE umfassen
  • a) Synthese von BOC-NH-PEG3400-DSPE (t-Butylcarbamatpoly(ethylenglykol)-distearoylphosphatidylethanolamin)
  • DSPE (Distearoylphosphatidylethanolamin) (31 mg, sygena Inc.) wurde zu einer Lösung von Boc-NH-PEG3400-SC (t-Butylcarbamatpoly(ethylenglykol)succimimidylcarbonat) (150 mg) in Chloroform (2 ml) gegeben, gefolgt von Triethylamin (33 μl). Die Mischung bildete eine klare Lösung nach Rühren bei 41°C für 10 Min. Das Lösungsmittel wurde rotationsverdampft und der Rückstand in Acetonitril (5 ml) aufgenommen. Die so erhaltene Dispersion wurde auf 4°C gekühlt und zentrifugiert, wonach die Lösung von dem nicht aufgelösten Material getrennt wurde und zum Trocknen verdampft wurde. Die Struktur des resultierenden Produktes wurde durch NMR bestätigt.
  • b) Synthese von H2N-PEG3400-DSPE (Aminopoly(ethylenglykol)-distearoylphosphatidylethanolamin)
  • Boc-NH-PEG3400-DSPE (167 mg) wurde in 4 M Salzsäure in Dioxan (5 ml) 2,5 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die Lösung wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand in Chloroform (1,5 ml) aufgenommen und mit Wasser (2 × 1,5 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. TLC (Chloroform/Methanol/Wasser 13:5:0,8) ergab das Titelprodukt mit Rf = 0,6; die Struktur des Produkts, die Ninhydrid-positiv war, wurde durch NMR bestätigt.
  • c) Synthese von Mal-PEG3400-DSPE (3-Maleimidopropionat-poly(ethylenglykol)distearoylphosphatidylethanolamin)
  • Eine Lösung von N-Succinimidyl-3-maleimidopropionat (5,6 mg, 0,018 mmol) in Tetrahydrofuran (0,2 ml) wurde zu H2N-PEG3400-DSPE (65 mg, 0,012 mmol), aufgelöst in Tetrahydrofuran (1 ml) und 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 (2 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wird auf 30°C erwärmt und man verfolgte die Reaktion bis zum Abschluss mit TLC, wonach das Lösungsmittel verdampft wird.
  • d) Synthese von RGDC-Mal-PEG3400-DSPE
  • Mal-PEG3400-DSPE (0,010 mmol) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 wird zum Peptid RGDC (0,010 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wird auf 37°C erwärmt, falls nötig, und man verfolgte die Reaktion mit TLC bis zum Abschluss, wonach das Lösungsmittel entfernt wird.
  • e) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, die von Phosphatidylserin und RGDC-Mal-PEG3400-DSPE eingekapselt sind
  • Zu einer Mischung (5 mg) von Phosphatidylserin (90–99,9 mol%) und Mal-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C für 5 min erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird dann in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 ausgetauscht. Das Peptid RGDC, aufgelöst in 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5, wird zu den gewaschenen Mikrobläschen gegeben, die auf dem Rollentisch angeordnet werden. Die Waschprozedur wird dann wiederholt.
  • f) Alternative Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, die von Phosphatidylserin und RGDC-Mal-PEG3400-DSPE eingekapselt sind
  • Zu Phosphatidylserin (5 mg) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das un ten Schwimmende mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 ausgetauscht. RGDC-Mal-PEG3400-DSPE, aufgelöst in 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 wird zu den gewaschenen Mikrobläschen gegeben, die dann auf dem Rollentisch angeordnet werden. Die Waschprozedur wird wiederholt nach dem Einbau des RGDC-Mal-PEG3400-DSPE in die Mikrobläschenmembrane.
  • Beispiel 3 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin und Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin
  • a) Synthese von Z-Ala-Cholesterin (3-O-(Carbobenzyloxy-L-alanyl)cholesterin)
  • Cholesterin (4 mmol), Z-Alanin (5 mmol) und Dimethylaminopyridin (4 mmol) wurden in Dimethylformamid/Tetrahydrofuran (20 ml + 5 ml) aufgelöst und Dicyclohexylcarbodiimid wurde zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Dicyclohexylharnstoff wurde abgefiltert und das Lösungsmittel wurde rotationsverdampft. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgenommen, nicht aufgelöster Dicyclohexylharnstoff wurde abgefiltert und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde auf einer Säule aus Silicagel angeordnet, und Z-Ala-Cholesterin wurde mit Toluol/Petrolether (20:2), gefolgt von Toluol/Diethylether (20:2) eluiert. Die Fraktionen, die die Titelverbindung enthielten, wurden kombiniert und das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. Die Struktur des Produktes wurde durch NMR bestätigt.
  • b) Synthese von Ala-Cholesterin (3-O-(L-Alanyl)-Cholesterin)
  • Z-Ala-Colesterin (0,48 mmol) wird in Tetrahydrofuran (20 ml) und Eisessig (3 ml) gegeben und in Anwesenheit von 5% Palladium auf Aktivkohle 2 h lang hydriert. Die Reaktionsmischung wird filtriert und in vacuo konzentriert.
  • c) Synthese von Boc-NH-PEG3400-Ala-Cholesterin
  • Ala-Cholesterin wird zu einer Lösung von Boc-NH-PEG3400-SC (t-Butylcarbamatpolyethylengykol)-succinimidylcarbonat) in Chloroform gegeben, gefolgt von Triethylamin. Die Suspension wird bei 41°C 10 min lang gerührt. Das rohe Produkt wird durch Chromatographie gereinigt.
  • d) Synthese von H2N-PEG3400-Ala-Cholesterin
  • Boc-NH-PEG3400-Ala-Cholesterin wird in 4 M Salzsäure in Dioxan 2,5 h lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird zum Trocknen rotationsverdampft. Das rohe Produkt kann durch Chromatographie gereinigt werden.
  • e) Synthese von Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin
  • Eine Lösung von Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimidester in Tetrahydrofuran wird zu H2N-PEG3400-Ala-Cholesterin gegeben, das in Tetrahydrofuran und 0,1 M Natriumphosphatpuffer aufgelöst ist, der einen pH von 7,5 (2 ml) besitzt. Die Reaktionsmischung wird auf 30°C erwärmt und die Reaktion wird bis zum Abschluss durch TLC verfolgt, wonach das Lösungsmittel verdampft wird.
  • f) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, die mit Phsophatidylserin, Phosphatidylcholin und Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin eingekapselt sind
  • Zu einer Mischung (5 mg) aus Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin (insgesamt 90–99,9 mol%) und Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin (10–0,1 mol%) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstempe ratur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird dann in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt.
  • g) Alternative Herstellung Gas-gefüllter Mikrobläschen, die mit Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin und Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin eingekapselt sind
  • Zu einer Mischung (5 mg) aus Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin werden 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Mischung wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird dann in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht. Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin, aufgelöst in Wasser, wird zu den gewaschenen Mikrobläschen gegeben, die auf einem Rollentisch für mehrere Stunden angeordnet werden. Die Waschprozedur wird nach dem Einbau des Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterins in die Mikrobläschenmembranen wiederholt.
  • Beispiel 4 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin und Arzneimittel-Cholesterin
  • a) Synthese von Arzneimittel-Cholesterin
  • Cholesterin (4 mmol), ein Arzneimittel mit einer Säuregruppe, und Dimethylaminopyridin (4 mmol) werden in Dimethylformamid/Tetrahydrofuran (20 ml + 5 ml) auf gelöst und Dicyclohexylcarbodiimid wird zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt. Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel wird rotationsverdampft. Die Titelverbindung wird durch Chromatographie gereinigt.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, die mit Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin, Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin und Arzneimittel-Cholesterin eingekapselt sind
  • Zu einer Mischung (5 mg) aus Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin (insgesamt 90 bis 99,9 mol%) und Biotinamidocaproat-PEG3400-Ala-Cholesterin (hergestellt wie in Beispiel 3) und Arzneimittel-Cholesterin (insgesamt 10–0,1 mol%) werden 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt.
  • Beispiel 5 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und thioliertem Anti-CD34-Mal-PEG3400-DSPE
  • a) Herstellung von thiolierten Anti-CD34-Antikörpern
  • Thiolierung von Anti-CD34-Antikörpern kann bewirkt werden, wie beschrieben von Hansen, C. B. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und thioliertem Anti-CD34-Mal-PEG3400-DSPE
  • Zu einer Mischung (5 mg) von Phosphatidylserin (90–99,9 mol%) und Mal-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%, hergestellt wie in Beispiel 2), werden 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit einem geeigneten Puffer ausgetauscht und das Koppeln des thiolierten Antikörpers an die Mikrobläschen wird ausgeführt, z.B. wie beschrieben von Goundalkar, A., Ghose, T. und Mezei, M. in J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36, 465–66 oder Hansen C. B. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144. Die Mikrobläschen werden dann auf einem Rollentisch für mehrere Stunden angeordnet und werden gewaschen. Durchflusszytometrie-Analyse der resultierenden Mikrobläschen (unter Einsetzen eines fluoreszierend markierten Sekundär-Antikörpers) wird verwendet, um das Binden des Anti-CD34-Antikörpers an die Bläschen zu bestätigen. Die Fähigkeit der Bläschen, spezifisch an CD-34 exprimierende Zellen zu binden, wird durch Mikroskopie unter Einsetzen einer Population von Zellen, die CD34 exprimieren, und einer Population, die CD34 nicht exprimieren, studiert.
  • Beispiel 6 – Biotin, gebunden an Gas-gefüllte Mikrobläschen
  • Biotin kann an Mikrobläschen in vielen verschiedenen Weisen gebunden werden, z.B. auf eine ähnliche Weise zu jener, die von Corley, P. und Loughrey, H. C. (1994) Biochim. Biophys. Acta 1195, 149–156 beschrieben ist. Die resultierenden Bläschen werden durch Durchflusszytometrie analysiert, z.B. durch Einsetzen eines fluoreszierenden Streptavidins, um das Binden von Biotin an die Bläschen zu detektieren. Alternativ wird radioaktives oder enzym-markiertes Streptavidin/Avidin zum Analysieren der Biotin-Bindung verwendet.
  • Beispiel 7 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Distearoylphosphatidylserin und Biotin-DPPE
  • Zu Distearoylphosphatidylserin (DSPS) (22,6 mg) wurde 4% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (4 ml) gegeben. Die Dispersion wurde auf nicht mehr als 80°C für 5 min erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Eine wässrige Dispersion von Biotin-DPPE (1,5 mg) in 4% Propylenglykol-Glycerin (1 ml) wurde zugegeben und die Probe wurde auf einem Rollentisch 1 bis 2 h lang angeordnet. Die Suspension wurde in Fläschchen gefüllt und die Kopfräume wurden mit Perfluorbutan gespült. Die Fläschchen wurden 45 Sekunden geschüttelt, wonach sie auf einem Rollentisch angeordnet wurden. Nach der Zentrifugation für 7 min wurde das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wurde zweimal wiederholt. Normalphasen-HPLC mit einem Evaporative Light Scattering Detector bestätigte, dass die Membranen der Mikrobläschen 4 mol% Biotin-DPPE enthielten. Der mittlere Teilchendurchmesser der Mikrobläschen betrug 4 μm, gemessen durch einen Coulter-Zähler. Ultraschall-Transmissionsmessungen unter Verwenden eines 3,5 MHz-Breitband-Transducers zeigten, dass eine Teilchendispersion von < 2 mg/ml eine Schallstrahl-Dämpfung von mehr als 5 dB/cm ergab.
  • Beispiel 8 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und biotinyliertem Antikörper, der nicht-kovalent an Streptavidin-Succ-PEG-DSPE gebunden ist
  • a) Synthese von Succ-PEG3400-DSPE
  • NH2-PEG3400-DSPE (hergestellt wie in Beispiel 2) wird unter Verwenden von Bernsteinsäureanhydrid carboxyliert, z.B. durch ein Verfahren, das jenem ähnlich ist, das von Nayar, R. und Schroit, A. J. in Biochemistry (1985) 24, 5967–71 beschrieben ist.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, die mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE eingekapselt sind
  • Zu einer Mischung (5 mg) von Phosphatidylserin (90–99.9 mol%) und Succ-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C für 5 min erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt. Alternativ können die Mikrobläschen wie in Beispiel 2(f) beschrieben hergestellt werden.
  • c) Koppeln von Streptavidin an Gas-gefüllte Mikrobläschen, die mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE eingekapselt sind
  • Streptavidin wird kovalent an Succ-PEG3400-DSPE in den Mikrobläschenmembranen durch Standardkopplungsverfahren unter Verwenden eines wasserlöslichen Carbodiimids gebunden. Die Probe wird auf einem Rollentisch während der Reaktion angeordnet. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt. Die Funktionalität des gebundenen Streptavidins wird durch Binden analysiert, z.B. an fluoreszierend markiertes Biotin, biotinylierte Antikörper (detektiert mit einem fluoreszierend markierten Sekundär-Antikörper) oder biotinylierten und Fluoreszenz- oder radioaktiv markierten Oligonukleotiden. Eine Analyse wird durch Fluoreszenzmikroskopie oder als Szintillationszählung ausgeführt.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin, das nicht-kovalent an Streptavidin-Succ-PEG3400-DSPE gebunden ist.
  • Mikrobläschen aus Beispiel 8(c) werden in einer Lösung inkubiert, die biotinylierte Vektoren enthält, z.B. biotinylierte Antikörper. Die Vektor-beschichteten Mikrobläschen werden wie oben beschrieben gewaschen.
  • Beispiel 9 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und biotinyliertem Oligonukleotid, das nicht-kovalent an Streptavidin-Succ-PEG-DSPE gebunden ist
  • a) Synthese von Succ-PEG3400-DSPE
  • NH2-PEG3400-DSPE (hergestellt wie in Beispiel 2) wird carboxyliert unter Verwenden von Bernsteinsäureanhydrid, z.B. durch ein Verfahren, dass jenem ähnlich ist, das von Nayar, R. und Schroit, A. J. in Biochemistry (1984) 24, 5967–71 beschrieben ist.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE
  • Zu einer Mischung (5 mg) Phosphatidylserin (90–99,9 mol%) und Succ-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt. Alternativ können die Mikrobläschen wie in Beispiel 2(f) beschrieben hergestellt werden.
  • c) Koppeln von Streptavidin an Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE
  • Streptavidin wird kovalent an Succ-PEG3400-DSPE in den Mikrobläschenmembranen durch Standardkopplungsverfahren unter Verwenden eines wasserlöslichen Carbodiimids gebunden. Die Probe wird auf einem Rollentisch während der Reaktion angeordnet. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt. Die Funktionalität des gebundenen Streptavidins wird durch Binden analysiert, z.B. an fluoreszierend markiertes Biotin, biotinylierte Antikörper (detektiert mit einem fluoreszierend markierten Sekundärantikörper) oder biotinylierte und Fluoreszenz- oder radioaktiv markierte Oligonukleotide. Eine Analyse wird durch Fluoreszenzmikroskopie oder Szintillationszählung ausgeführt.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und einem biotinylierten Oligonukleotid, das nicht-kovalent an Streptavidin-Succ-PEG3400-DSPE gebunden ist
  • Mikrobläschen des Beispiels 9(c) werden in einer Lösung inkubiert, die ein biotinyliertes Oligonukleotid enthält. Die mit Oligonukleotid beschichteten Bläschen werden wie oben beschrieben gewaschen. Binden des Oligonukleotids an die Bläschen wird detektiert, z.B. durch Verwenden von fluoreszierend markierten Oligonukleotiden durch die Bindung an die Bläschen oder durch Hybridisieren der gebundenen Oligonukleotide an ein markiertes (Fluoreszenz oder Radioaktivität) komplementäres Oligonukleotid. Die Funktionalität der Oligonukleotid-tragenden Mikrobläschen wird analysiert, z.B. durch Hybridisieren der Bläschen mit immobilisierten DNA-enthaltenden Sequenzen, die zu dem gebundenen Oligonukleotid komplementär sind. Als Beispiele können ein Oligonukleotid, das zu einer ribosomalen DNA (von der es viele Kopien pro haploidem Genom gibt) komplementär ist, und ein Oligonukleotid, das einem Oncogen (z.B. ras, von denen es eine Kopie pro haploidem Genom gibt) komplementär ist, verwendet werden.
  • Beispiel 10 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, die mit Phosphatidylserin und Folat-PEG-Succ-DSPE eingekapselt sind
  • a) Herstellung von Folat-PEG-Succ-DSPE
  • Folat-PEG-Succc-DSPE wird synthetisiert, wie beschrieben von Lee, R. J. und Low, P. S. in (1995) Biochimica. Biophysica. Acta 1233, 134–144.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Folat-PEG-Succ-DSPE
  • Zu einer Mischung (5 mg) aus Phosphatidylserin (90–99,9 mol%) und Folat-PEG-DSPE (10–0,1 mol%) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C 5 min lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wird wiederholt. Alternativ werden die Mikrobläschen hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 2(e) oder 2(f). Eine Analyse der Folat-Verbindung kann z.B. durch eine mikroskopische Studie der Bindung der Folat-enthaltenden Mikrobläschen an Zellen ausgeführt werden, die verschiedene Niveaus von Folat-Rezeptoren exprimieren.
  • Beispiel 11 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und thioliertem Anti-CD34-Mal-PEG3400-DSPE, thioliertem Anti-ICAM-1-Mal-PEG3400-DSPE und thioliertem Anti-E-Selectin-Mal-PEG3400-DSPE
  • a) Herstellung von thiolierten Anti-CD34-Antikörpern
  • Die Thiolierung von Anti-CD34-Antikörpern kann bewirkt werden, wie beschrieben von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144.
  • b) Herstellung von thiolierten Anti-ICAM-1-Antikörpern
  • Die Thiolierung von Anti-ICAM-1-Antikörpern kann bewirkt werden, wie beschrieben von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144.
  • c) Herstellung von thiolierten Anti-E-Selectin-Antikörpern
  • Die Thiolierung von Anti-E-Selectin-Antikörpern kann bewirkt werden, wie beschrieben von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und thioliertem Anti-CD34-Mal-PEG3400-DSPE, thioliertem Anti-ICAM-1-Mal-PEG3400-DSPE und thioliertem Anti-E-Selectin-Mal-PEG3400-DSPE
  • Zu einer Mischung (5 mg) von Phosphatidylserin (90–99,9 mol%) und Mal-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%, hergestellt wie in Beispiel 2) wird 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C für 5 min erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit einem geeigneten Puffer ausgetauscht und das Koppeln der Antikörper des Beispiels 11(a), 11(b) und 11(c) an die Mikrobläschen wird ausgeführt, z.B. wie beschrieben von Goundalkar, A., Ghose, T. und Mezei, M. in J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36, 465–466 oder von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Phiophys. Acta 1239, 133–144. Die Mikrobläschen werden auf einem Rollentisch für mehrere Stunden angeordnet und dann gewaschen.
  • Beispiel 12 – Das Peptid FNFRLKAGOKIRFGAAAWEPPRARI, gebunden an Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin
  • Das Peptid FNFRLKAGQKIRFGAAAWEPPRARI, umfassend Phosphatidylserin-bindende und Heparin-bindende Abschnitte, wird synthetisiert. Das Peptid wird zu vorgeformten Phosphatidylserin-eingekapselten Perfluorbutan-Mikrobläschen gegeben und gründlich gemischt.
  • Beispiel 13 – Fibronektin, kovalent gebunden an Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin
  • a) Mikrobläschenherstellung
  • DSPS (25 mg) und DSPE (5,0 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 5 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurden zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 min lang erwärmt. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Mikrobläschen wurden zwei Mal mit destilliertem Wasser gewaschen, dann in 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 9 resuspendiert.
  • b) Modifikation von Fibronectin
  • Fibronectin (1,0 mg) in 5 ml 0,01 M HEPES-Puffer, pH 8 wurde zu 0,1 mmol des Vernetzers SDBP gegeben. Die Mischung wurde auf Eis 2 h lang inkubiert.
  • c) Mikrobläschen-Modifikation
  • Zu der Proteinlösung aus (b) wurde die Mikrobläschen-Suspension aus (a) gegeben und man ließ die Inkubation 2 h lang bei Raumtemperatur auf einem Rollentisch fortschreiten. Nicht umgesetztes Material wurde entfernt, indem man den Mikrobläschen ermöglichte zu flotieren, und dann wurde der Puffer mit 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 9 ersetzt. Dieser Prozess wurde drei Mal wiederholt.
  • d) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay, der im Detail in Beispiel 21 beschrieben ist, getestet. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 14 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und 3β-[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin
  • a) Synthese von 3β-[N-(N'N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin (DC-chol) (Farhood. H. Gao. X. Barsoum. J. und Huan9. L. Anal. Biochem. 225. 89–93 (1995))
  • Zu einer gerührten Lösung von 2-Dimethylaminoethylamin (19,4 mg, 24:1, 0,22 mmol) und Triethylamin (310 μl, 2.23 mmol) in Dichlormethan (3 ml) bei Raumtemperatur wurde langsam eine Lösung von Cholesterylchloroformiat (100 mg, 0,22 mmol) in 1,4-Dioxan gegeben. Wenn die Reaktion abgeschlossen war, wurde die Mischung zum Trocknen verdampft und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie (CHCl3/MeOH, 4:1) gereinigt. Ein weißer Feststoff wurde erhalten, Ausbeute 105 mg (95%). Die Struktur wurde durch NMR und MALDI verifiziert.
  • b) Herstellung der Mikrobläschen-Dispersion
  • Monolagen-eingekapselte Mikrobläschen, die Perfluorbutan enthalten, werden aus einer Mischung von 90% Phosphatidylserin und 10% (DC-chol) durch Auswiegen von DSPS (4,5 mg) und (DC-chol) (0,5 mg) in ein 2 ml-Fläschchen erzeugt. 0,8 ml Propylenglykol/Glycerin (4%) in Wasser wurde zugegeben. Die Lösung wurde bei 80°C 5 min lang erwärmt und geschüttelt. Die Lösung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wurde auf einem Kappenmischer bei 4450 Oszillationen/Minute 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch angeordnet. Die Probe wurde dann durch Zentrifugieren bei 2000 Upm für 5 min gewaschen. Das unten Schwimmende wurde durch eine Spritze entfernt und destilliertes Wasser wurde auf dasselbe Volumen zugegeben. Der Kopfraum wurde wieder mit Perfluorbutan gespült und die Probe wurde auf einem Rollentisch gehalten, bis ein homogenes Erscheinungsbild erhalten wurde. Die Waschprozedur wurde wieder wiederholt.
  • Beispiel 15 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und WEPPRARI-PE
  • Phosphatidylethanolamin (PE) wird mit einer äquimolaren Menge des Vernetzers N-Hydroxysuccinimidyl-2,3-dibrompropionat in einer 1:1-Mischung von Dioxan und 0,02 M HEPES-Puffer, pH 8.0 umgesetzt. Nach der Inkubation für 2 h auf Eis wurde eine äquimolare Menge des Heparin-bindenden Peptids WEPPRARI zugegeben, der pH wird auf 9 durch die Zugabe von 0,2 M Dinatriumtetraborat gebracht, und die Inkubation wird 2 h lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird durch Chromatographie gereinigt. Monolagen-eingekapselte Mikrobläschen, die Perfluorbutan enthalten, werden aus einer Mischung von 80–95% Phosphatidylserin (PS) und 5–20% Peptid-substituiertem PE erzeugt.
  • Beispiel 16 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und inaktiviertem menschlichen Thrombin-Succ-PEG3400-DSPE
  • a) Inaktivierung des menschlichen Thrombins
  • Menschliches Thrombin wurde durch Inkubation mit einem 20%igen molaren Überschuss von D-Phe-L-Pro-L-Arg-Chlormethylketon in 0,05 M HEPES-Puffer, pH 8,0, bei 37°C 30 Minuten lang inaktiviert.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Succ-PEG3400-DSPE
  • Zu einer Mischung (5 mg) Phosphatidylserin (90–99,9 mol%) und Succ-PEG3400DSPE (10–0,1 mol%, hergestellt wie in Beispiel 9(a)) wurde 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) zugegeben. Die Dispersion wurde auf nicht mehr als 80°C für fünf Minuten erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wurde in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wurde. Nach der Zentrifugation wurde das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wurde wiederholt. Alternativ können die Mikrobläschen wie in Beispiel 2(f) beschrieben hergestellt werden.
  • c) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und inaktiviertem menschlichen Thrombin-Succ-PFG3400-DSPE
  • Inaktiviertes menschliches Thrombin wurde kovalent an Succ-PEG3400-DSPE in den Mikrobläschen aus Beispiel 16(b) durch Standardkopplungsverfahren unter Verwenden eines wasserlöslichen Carbodiimids gebunden. Die Probe wurde auf einem Rollentisch während der Reaktion angeordnet. Nach der Zentrifugation wur de das unten Schwimmende mit Wasser ausgetauscht und das Waschen wurde wiederholt.
  • Beispiel 17 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, die gebundenes Methotrexat und Prodrug-aktivierendes Enzym aufweisen
  • a) Methotrexat, gebunden über einen Peptid-Linker an Gas-gefüllte Mikrobläschen
  • Verfahren zum Binden von Aminosäuren an das Antikrebs-Arzneimittel Methotrexat (MTX) sind in der Literatur gut beschrieben (siehe z.B. Huennekens, F. M. (1994), TIBTECH 12, 234–239 und darin genannte Literaturstellen). Anstelle einer einzelnen Aminosäure kann ein Peptid an MTX unter Verwenden derselben Technologie gebunden werden. Ein derartiges Peptid kann einen Linker für die Bindung des MTX an die Oberfläche von Mikrobläschen darstellen. Eine Klasse derartiger Linker umfasst Peptide der allgemeinen Struktur (MTX)-F-K/R-X-R-Z-C, wobei X eine beliebige Aminosäure und Z eine hydrophobe Aminosäure ist. Ein spezifisches Beispiel für einen derartigen Linker ist (MTX)-F-K-L-R-L-C. Die SH-Gruppe im Cys-Rest wird für die Bindung des MTX-Peptids an die Mikrobläschen (z.B. zusammengesetzt aus Phosphatidylserin und Mal-PEG-DSPE) unter Verwenden einer Standardtechnologie eingesetzt, z.B. wie in Beispiel 2. Von einem Linker dieser Art wird erwartet, dass er durch das Enzym Cathepsin B gespalten wird, das oft selektiv außerhalb und auf der Oberfläche von Tumorzellen überexprimiert wird (Panchal, R. G. et. (1996), Nat. Biotechnol. 14, 852–856). So würde das mögliche Prodrug (MTX)-F-K/R-X-R selektiv in Tumoren freigesetzt werden. Dieses Prodrug kann weiter durch das aktive Arzneimittel MTX durch die Wirkung von Carboxypeptidasen aktiviert werden, entweder endogen vorhanden im Tumor oder zielausgerichtet auf dem Tumor, z.B. durch Tumor-assoziierte Antikörper (siehe unten).
  • b) Prodrug-aktivierendes Enzym, das kovalent an die Oberfläche von Gas-gefüllten Mikrobläschen gebunden ist
  • Ein Beispiel eines Prodrug-aktivierenden Enzyms ist Carboxypeptidase A (CPA), die an die Oberfläche von Mikrobläschen konjugiert werden kann, die z.B. durch eine Mischung von Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin eingekapselt sind, z.B. durch Verwenden einer 3400 Da-Poly(ethylenglykol)-Kette, die eine N-Hydroxysuccinimid-Gruppe an beiden Enden trägt (Perron, M. J. und Page, M., Br. J. Cancer 73, 281–287); die Mikrobläschen können durch Standardverfahren hergestellt werden. Mikrobläschen, die CPA enthalten, können auf pathologische Bereiche zielausgerichtet werden durch Einbauen eines geeigneten Zielausrichtungsvektors in die CPA-enthaltenden Bläschen. Alternativ kann CPA direkt an einen Vektor (z.B. einen Antikörper) gebunden werden, z.B. durch das Verfahren wie oben beschrieben. In diesem letzteren Fall wird das CPA-Vektor-Konjugat an die Oberfläche der Mikrobläschen gebunden werden, wie beschrieben in Hansen, C. B. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239 133–144. Beispiele der vielen möglichen Prodrug-Enzym-Paare sind beschrieben in z.B. Huennekens, F. M. (1994) TIB-TECH 12, 234–239.
  • Beispiel 18 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin, thioliertem Anti-CEA-Mal-PEG3400DSPE und dem Antikrebs-Prodrug 3',5'-O-Dipamitoyl-5-fluor-2'-desoxyuridin
  • a) Herstellung von thiolierten Anti-CEA-Antikörpern
  • Die Thiolierung von Anti-CEA-Antikörpern kann bewirkt werden wie beschrieben von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin, thioliertem Anti-CEA-Mal-PEG3400-DSPE und dem Antikrebs-Prodrug 3',5'-O-Dipamitoyl-5-fluor-2'-desoxyuridin
  • Zu einer Mischung (5 mg) aus Phosphatidylserin (90–99,9 mol%), Mal-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%, hergestellt wie in Beispiel 2) und dem Antikrebs-Prodrug 3',5'-O-Dipamitoyl-5-fluor-2'-desoxyuridin (Mori, A. et al. (1995) Cancer Chemother. Pharmacol. 35, 447–456) werden 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C für fünf Minuten erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer für 45 Sekunden geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit einem geeigneten Puffer ausgetauscht und das Koppeln des Antikörpers an das Mikrobläschen wird ausgeführt, z.B. wie beschrieben von Goundalkar, A., Ghose, T. und Mezei, M. in J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36, 465–466 oder von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144. Die Mikrobläschen werden auf einem Rollentisch für mehrere Stunden angeordnet und dann gewaschen.
  • Beispiel 19 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin, thioliertem Anti-CEA-Mal-PEG3400-DSPE und dem Antikrebs-Prodrug N-Trifluoracetyl-adriamycin-14-valerat
  • a) Herstellung von thiolierten Anti-CEA-Antikörpern
  • Die Thiolierung von Anti-CEA-Antikörpern kann bewirkt werden wie beschrieben von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin, thioliertem Anti-CEA-Mal-PEG3400-DSPE und dem Antikrebs-Prodrug N-Trifluoracetyl-adriamycin-14-valerat
  • Zu einer Mischung (5 mg) aus Phosphatidylserin (90–99,9 mol%), Mal-PEG3400-DSPE (10–0,1 mol%, hergestellt wie in Beispiel 2) und dem Antikrebs-Prodrug N-Trifluoracetyl-adriamycin-14-valerat (Mori, A. et al. (1993) Pharm. Res. 10, 507–514) werden 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wird auf nicht mehr als 80°C für fünf Minuten erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Die Dispersion (0,8 ml) wird in ein Fläschchen (1 ml) übertragen und der Kopfraum wird mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wird in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Probe auf einem Rollentisch angeordnet wird. Nach der Zentrifugation wird das unten Schwimmende mit einem geeigneten Puffer ausgetauscht und das Koppeln des Antikörpers an das Mikrobläschen wird ausgeführt, z.B. wie beschrieben von Goundalkar, A., Ghose, T. und Mezei, M. in J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36, 465–466 oder von Hansen, C. B. et al. in (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133–144. Die Mikrobläschen werden auf einem Rollentisch für mehrere Stunden angeordnet und dann gewaschen.
  • Beispiel 20, Verfahren der Verwendung
  • Ein Mittel, das Phosphatidylserin-eingekapselte Mikrobläschen mit in der einkapselnden Membran eingebauten inaktivierten menschlichen Thrombin-Succ-PEG3400-DSPE umfasst, wird aus 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,4 lyophilisiert. Das Produkt wird in sterilem Wasser wieder dispergiert und intravenös in einen Patienten mit Verdacht auf eine venöse Thrombose in einer Beinvene injiziert. Das Bein wird durch Standardultraschalltechniken untersucht. Der Thrombus wird durch vergrößerten Kontrast im Vergleich zum umgebenden Gewebe lokalisiert.
  • Beispiel 21 – Herstellung und biologische Bewertung von Gas-enthaltenden Mikrobläschen von DSPS „dotiert" mit einem Lipopeptid, umfassend ein Heparinsulfat-bindendes Peptid (KRKR) und ein Fibronectinpeptid (WOPPRARI)
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen gerichtet, die mehrfache peptidische Vektoren umfassen, die in einer linearen Sequenz angeordnet sind.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronectinpeptid (WOPPRARI) besteht
    Figure 00900001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ile-Wang-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und die Palmitinsäure wurden voraktiviert unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließge schwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 16 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01%, TFA/Wasser: Detektion – UV 260 und Fluoreszenz, Ex280. Em350 – Produktretentionszeit = 19,44 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwendung von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2198, gefunden bei 2199.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit einem mehrfach-spezifischen Lipopeptid, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und Fibronectinpeptid (WOPPRARI) besteht
  • DSPS (4,5 mg) und Lipopeptid von (a) (0,5 mg) wurden in jedes von zwei Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurden zu jedem Fläschchen gegeben. Die Mischungen wurden auf 80°C fünf Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und die Kopfräume mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden geschüttelt und über Nacht gerollt. Die resultierenden Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler [Größe: 1–3 Mikron (87%), 3–5 Mikron (11,5%)] und akustische Dämpfung (Frequenz bei maximaler Dämpfung: 3,5 MHz) analysiert. Die Mikrobläschen waren bei 120 mm Hg stabil. MALDI-Massenspektralanalyse wurde verwendet, um den Einbau des Lipopeptids in DSPS-Mikrobläschen zu bestätigen, wie folgt: ca. 0,05–0,1 ml der Mikrobläschen-Suspension wurde auf ein sauberes Fläschchen übertragen und 0,05–0,1 ml Methanol wurde zugegeben. Die Suspension wurde für 30 Sekunden beschallt und die Lösung wurde durch MALDI-MS analysiert. Positiver Modus ergab M + H bei 2200 (erwartet für Lipopeptid, 2198).
  • c) In-vitro-Studie von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit einem mehrfach-spezifischen Lipopeptid, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronectin-Peptid (WOPPRARI) besteht: Binden an endotheliale Zellen unter Fließ-Bedingungen
  • Die menschliche endotheliale Zelllinie ECV 304, erhalten aus einer normalen Nabelschnur (ATCC CRL-1998), wurde in 260 ml Nunc-Kultur-Kolben (Chutney 153732) in RPMI 1640-Medium kultiviert, zu dem L-Glutamin (200 mM), Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml und 10.000 μg/ml) und 10% fötales Rinderserum zugegeben wurden. Die Zellen wurden mit einem Split-Verhältnis von 1:5 bis 1:7 subkultiviert, wenn sie eine Konfluenz erreicht hatten. Deckgläser, 22 mm im Durchmesser, wurden sterilisiert und auf dem Boden von 12 Well-Kulturplatten angeordnet, wonach Zellen in 0,5 ml Complete-Medium mit Serum oberhalb der Platten zugegeben wurden. Wenn die Zellen eine Konfluenz erreichten, wurden die Deckgläser in einer zugeschnittenen Fließ-Kammer angeordnet, die aus einem Graben bestand, der in eine Glasplatte eingeschnitten worden war, auf der das Deckglas mit den Zellen angeordnet wurde, wobei die Zellen dem Graben gegenüber lagen, um so einen Fließkanal zu bilden. Mikrobläschen, wie in (b) hergestellt, wurden aus einem Reservoir, das bei 37°C gehalten wurde, durch die Fließ-Kammer durchgeleitet und zum Reservoir zurückgeleitet, unter Verwenden einer peristaltischen Pumpe. Die Fließgeschwindigkeit wurde eingestellt, um physiologisch relevante Scher-Raten zu simulieren. Die Fließ-Kammer wurde unter einem Mikroskop angeordnet und die Wechselwirkung zwischen den Mikrobläschen und den Zellen wurde direkt angesehen. Eine Kamera, die auf dem Mikroskop befestigt war, war mit einem Farbvideodrucker und einem Monitor verbunden. Eine allmähliche Akkumulierung von Mikrobläschen auf den Zellen fand mit einer Geschwindigkeit statt, die von der Fließgeschwindigkeit abhängig war. Bei weiterer Erhöhung der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen vom Deckglas abgelöst zu werden, aber die Mikrobläschen blieben an die Zellen gebunden. Kontrollbläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen und verschwanden aus der Kammer unter minimalen Fließbedingungen.
  • d) In-vivo-Experiment in einem Hund
  • Fall 1)
  • Ein Mischlingshund von 22 kg wurde anästhesiert mit Pentobarbital und mechanisch beatmet. Die Brust wurde durch eine Mittellinien-Sternotomie geöffnet, der vordere Herzbeutel wurde entfernt und ein 30 mm-Gel-Silikon-Kautschuk-Spacer wurde zwischen dem Herz und einem P5-3-Transducer eines ATL HDI-3000 Ultraschallscanners eingesetzt. Der Scanner wurde eingesetzt zur diskontinuierlichen Kurzachsen-Bildgebung einmal in jeder End-Systole durch verzögertes EGC-Triggern. Ein Nettovolumen von 2 ml Mikrobläschen von (b) wurde als ein schneller intravenöser Bolus injiziert, 3 Sekunden später wurde gesehen, dass das abgebildete rechte Ventrikel Kontrastmaterial enthielt, und weitere 3 Sekunden später wurde das linke Ventrikel auch gefüllt und ein transienter Dämpfungsschatten, der die Sicht der hinteren Teile des linken Ventrikels verschleierte, wurde beobachtet. Wesentliche Anstiege in der Helligkeit wurden im Myocard gesehen, wenn der Dämpfungsschatten abklang, in den Teilen des Herzens, die distal zum linken Ventrikel waren. Nach dem Durchlaufen des anfänglichen Bolus wurde der Ultraschall-Scanner auf kontinuierlich hohe Bildfrequenz, Hochleistungs-Power-Bildgebung gesetzt, eine Prozedur, die dafür bekannt ist, dass sie die Zerstörung von Ultraschall-Kontrastmittel-Mikrobläschen in den abgebildeten Gewebebereichen verursacht. Nach ein paar Sekunden wurde der Scanner auf seine anfängliche Einstellung zurückgestellt. Das Myocard war dann dunkler und näher am Untergrundswert. Das Bewegen des abgebildeten Stückes zu einer neuen Position führte zu einem Wiederauftauchen von Kontrasteffekten; Bewegen des Stückes zurück zur anfänglichen Position resultierte wieder in einer Gewebehelligkeit nahe der Untergrundslinie.
  • Fall 2) [vergleichend]
  • Ein Nettovolumen von 2 ml Mikrobläschen, hergestellt auf eine Weise identisch zu (b) oben, mit der Ausnahme, dass kein Lipopeptid in dem Präparat enthalten war, wurde injiziert, unter Verwenden derselben Bildgebungsprozedur wie oben. Die Myocard-Echoverstärkung war viel weniger intensiv und von kürzerer Dauer als jene, die im Fall 1 beobachtet wurde. Bei Abschluss der linksventrikulären Dämpfungsphase gab es auch einen fast vollständigen Verlust der Myocard-Kontrasteffekte, und die Myocard-Echo-Anstiege im hinteren Teil des linken Ventrikels, die im Fall 1 bemerkt wurden, wurden nicht beobachtet.
  • Beispiel 22 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS, umfassend thioliertes Anti-CD34-MAL-PEG2000PE
  • a) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und PE-PEG2000-Mal
  • DSPS (4,5 mg, 3,9 mmol) und PE-PEG2000-Mal aus Beispiel 50 (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C fünf Minuten lang erwärmt und dann durch einen 4,5 Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
  • b) Thiolierung von Anti-CD34-Antikörpern
  • Zu 0,3 mg Anti-CD34-Antikörpern, aufgelöst in 0,5 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7, wurden 0,3 mg Trauts Reagenz gegeben und die Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt. Überschüssiges Reagenz wurde vom modifizierten Protein auf einer NAP-5-Säule getrennt.
  • c) Konjugation eines thiolierten Anti-CD34-Antikörpers an Gas-gefüllte Mikrobläschen, die mit DSPS eingekapselt sind und DSPE-PEG2000-MAL umfassen
  • 0,5 ml des thiolierten Antikörper-Präparats von (b) wurde zu einer aliquoten Menge Mikrobläschen von (a) gegeben und man ließ die Konjugationsreaktion 30 Minuten lang auf einem Rollentisch fortschreiten. Nach der Zentrifugation bei 2000 Upm für 5 Minuten wurde das unten Schwimmende entfernt. Die Mikrobläschen wurden weitere drei Male mit Wasser gewaschen.
  • d) Detektion des Antikörpers, eingekapselt in den Mikrobläschen, unter Verwenden eines FITC-konjugierten Sekundär-Antikörpers
  • Zu der Mikrobläschen-Suspension von (c) wurde 0,025 ml FITC-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper gegeben. Die Mischung wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 30 Minuten lang auf einem Rollentisch inkubiert und wurde dann bei 2000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert. Das unten Schwimmende wurde dann entfernt und die Mikrobläschen wurden weitere drei Male mit Wasser gewaschen. Durchflusszytometrie-Analyse der Mikrobläschensuspension zeigte, dass 98% der Population fluoreszierend waren.
  • Beispiel 23 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS, umfassend thioliertes Anti-CD62-MAL-PEG2000-PE
  • Eine zu jener Prozedur, die in Beispiel 22 beschrieben ist, identische Prozedur wurde verwendet, um Mikrobläschen herzustellen, die Anti-CD-62-Antikörper umfassen.
  • Beispiel 24 – Herstellung Gas-gefüllter Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS, umfassend thiolierte Anti-ICAM-1-MAL-PEG2000-PE
  • Eine zu jener Prozedur, die im Beispiel 22 beschrieben ist, identische Prozedur wurde verwendet, um Mikrobläschen herzustellen, die Anti-ICAM-1-Antikörper umfassen.
  • Beispiel 25 – Herstellung Gas-gefüllter Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und thioliertem Anti-CD62-Mal-PEG2000-PE und thioliertem Anti-ICAM-1-Mal-PEG2000-PE
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen, die mehrfache Antikörper-Vektoren für zielgerichtete Ultraschallbildgebung umfassen.
  • a) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und PE-PEG2000-Mal
  • DSPS (4,5 mg) und PE-PEG2000-Mal aus Beispiel 2(a) (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch einen 4,5-Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Mikrobläschen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
  • b) Thiolierung von Anti-CD62- und Anti-ICAM-1-Antikörpern
  • Zu 0,3 mg von jeweils Anti-CD62- und Anti-ICAM-1-Antikörpern, aufgelöst in PBS-Puffer (pH 7, 0,5 ml) wurde Trauts Reagenz gegeben und die Lösungen wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde lang gerührt. Überschüssiges Reagenz wurde von dem modifizierten Protein auf einer NAP-5-Säule getrennt.
  • c) Konjugation thiolierter Anti-CD62- und Anti-ICAM-1-Antikörper an Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und DSPE-PEG2000-Mal
  • 0,5 ml des gemischten thiolierten Antikörper-Präparats von (b) wurde zu einer aliquoten Menge Mikrobläschen von (a) gegeben und man ließ die Konjugationsreaktion 30 Minuten lang auf einem Rollentisch fortschreiten. Nach der Zentrifugation bei 2000 Upm für 5 Minuten wurde das unten Schwimmende entfernt. Die Mikrobläschen wurden weitere 3 Male mit Wasser gewaschen.
  • Die PEG-Spacerlänge kann variiert werden, um längere (z.B. PEG3400 und PEG5000) oder kürzere (z.B. PEG600- oder PEG800-) Ketten zu enthalten. Eine Zugabe eines dritten Antikörpers, wie ein thiolierter Anti-CD34, ist auch möglich.
  • Beispiel 26 – Zielausgerichtete Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, nicht kovalent beschichtet mit Polylysin und einem Fusionspeptid, umfassend eine PS-bindende Komponente und eine Fibronektin-Peptid-Sequenz FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI
  • a) Synthese von PS-bindendem/Fibronektinfragment-Fusions-Peptid FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI
  • Das Peptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ile-Wang-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und den Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Phenol, 5% EDT und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 302 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 25 mg des rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 20 bis 40% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 10 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 20 bis 50% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 und 260 nm – Produktretentionszeit = 12,4 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2856, gefunden bei 2866.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, die nicht kovalent beschichtet sind mit Polylysin und dem PS-bindenden/Fibronektinfragment-Fusions-Peptid FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI
  • DSPS (5 mg) wurde in ein sauberes Fläschchen zusammen mit Poly-L-Lysin (0,2 mg) und dem Peptid von (a) oben (0,2 mg) eingewogen. Zu dem Fläschchen wurden 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt. Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Nach dem ausführlichen Waschen mit Wasser, PBS und Wasser wurde die schließliche Lösung auf den Polylysin- und Peptidgehalt unter Verwenden von MALDI MS untersucht. Es wurde kein Polypeptidmaterial in der schließlichen Waschlösung beobachtet. Acetonitril (0,5 ml) wurde dann zugegeben und die Mikrobläschen wurden durch Beschallung zerstört. Analyse der resultierenden Lösung auf Polylysin und PS-bindendes/Fibronektin-Fusions-Peptid wurde dann ausgeführt unter Verwenden von MALDI MS. Die Ergebnisse waren wie folgt:
  • Figure 00980001
  • Das Spacer-Element, das innerhalb des PS-bindenden/Fibronektin-Fusions-Peptids (-GGG-) enthalten ist, kann auch durch andere Spacer ersetzt werden, wie PEG2000 oder Polyalanin (-AAA-). Eine Form von Prä-Zielausrichtung kann auch eingesetzt werden, wodurch dem DSPS-bindenden/Fibronektin-Fragment-Fusions-Peptid zuerst ermöglicht wird, mit Zellen über Fibronektinpeptid-Bindung zu assoziieren, gefolgt von einer Verabreichung von PS-Mikrobläschen, die dann an das PS-bindende Peptid binden.
  • Beispiel 27 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-PEG3400-Alanyl-Cholesterin und funktionalisiert mit Streptavidin/Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp.OH) und Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendem Peptid (Biotin-GPRPPERHOS·NH2)
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Ultraschallmikrobläschen, wodurch Streptavidin als ein Linker zwischen biotinylierten Reporter(n) und Vektor(en) verwendet wird.
  • a) Synthese von Biotin-PEG3400-b-Alanin-Cholesterin
  • Zu einer Lösung von Cholesteryl-b-Alaninhydrochlorid (wie beschrieben in Beispiel 59) (15 mg, 0,03 mmol) in 3 ml Chloroform/nassem Methanol (2,6:1) wurde Triethylamin (42 ml, 0,30 mmol) gegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und eine Lösung von Biotin-PEG3400-NHS (100 mg, 0,03 mmol) in 1,4-Dioxan (1 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden wurde die Mischung zum Trocknen verdampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie gereinigt, um weiße Kristalle zu ergeben, Ausbeute 102 mg (89%). Die Struktur wurde durch MALDI-MS und NMR verifiziert.
  • b) Synthese von biotinyliertem Endothelin-1-Peptid (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp·OH)
  • Das Peptid wurde synthetisiert auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer, ausgehend von Fmoc-Trp(Boc)-Wang-Harz in einem 0,1 mmol- Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und den Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 75 mg ergab. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 20 mg des rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 30 bis 80% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) und einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung der reinen Fraktionen wurden 2 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 30–80% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 12,6 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1077, gefunden bei 1077.
  • c) Synthese des Biotinyl-Fibrin-Anti-polymerisierenden Peptids (Biotin-GPRPPERHOS·NH2)
  • Dieses Peptid wurde synthetisiert und gereinigt unter Verwenden von Protokollen, die jenen, die in (b) oben beschrieben sind, ähnlich sind. Das reine Produkt wurde durch HPLC und MALDI MS charakterisiert.
  • d) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-PEG3400-b-Alanin-Cholesterin
  • DSPS (4,5 mg) und Biotin-PEG3400-b-Alanin-Cholesterin von (a) (0,5 mg) wurden in ein Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer für 45 Sekunden geschüttelt und das Fläschchen wurde über Nacht gerollt. Die Mikrobläschen-Suspension wurde mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler und eine akustische Dämpfung analysiert.
  • e) Konjugation mit Fluorescein-markiertem Streptavidin und biotinylierten Peptiden von (b) und (c)
  • Zu dem Mikrobläschen-Präparat von (d) wurde Fluorescein-konjugiertes Streptavidin (0,2 mg), aufgelöst in PBS (1 ml), gegeben. Die Bläschen wurden auf einem Rollentisch 3 Stunden lang bei Raumtemperatur angeordnet. Nach ausführlichem Waschen mit Wasser und Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie wurden die Mikrobläschen in 1 ml PBS, das Biotinyl-Endothelin-1-Peptid (0,5 mg) und Biotinyl-Fibrin-anti-polymerisierendes Peptid (0,5 mg) von (b) beziehungsweise (c) enthielt, für zwei Stunden inkubiert. Ausführliches Waschen der Mikrobläschen wurde ausgeführt, um nicht-konjugiertes Peptid zu entfernen.
  • Beispiel 28 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-DPPE, verwendet, um ein Streptavidin-„Sandwich" mit einer Mischung von Biotinyl-Endothelin-1-Peptid-(Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp·OH) und Biotinyl-Fibrin-Anti-polymerisierendem Peptid (Biotin-GPRPPERHOS·NH2) herzustellen
  • a) Herstellung von Biotin-enthaltenden Mikrobläschen
  • Zu einer Mischung von Phosphatidylserin (5 mg) und Biotin-DPPE (0,6 mg) in einem sauberen Fläschchen wurde 5% Propylenglykol-Glycerin in Wasser (1 ml) gegeben. Die Dispersion wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt. Der Kopfraum wurde dann mit Perfluorbutan gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt. Nach der Zentrifugation wurde das unten Schwimmende entfernt und die Mikrobläschen wurden ausführlich mit Wasser gewaschen.
  • b) Konjugation von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und Biotin-DPPE, mit Streptavidin und einer Mischung von Biotinyl-Endothelin-1 (Biotin-D-Trp-Leu-Asp-Ile-Ile-Trp-OH) und Biotinyl-Fibrin-Anti-polymerisierendem Peptid (Biotin-GPRPPERHOS·NH2)
  • Man folgte der in Beispiel 27 im Detail ausgeführten Prozedur.
  • Beispiel 29 – PFB-Gas-enthaltende Mikrobläschen von DSPS, funktionalisiert mit Heparinsulfat-bindendem Peptid/Fibronektinpeptid/RGD-Peptid und Fluorescein a) Synthese eines Lipopeptids, das die RGD-Sequenz und eine Fluorescein-Reportergruppe enthält: Dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Lysfacetyl-Ara-Gly-Asp-Lys(fluorescein)Gly·OH
    Figure 01020001
  • Das Lipopeptid wurde wie in Beispiel 21(a) beschrieben unter Verwenden kommerziell erhältlicher Aminosäuren und Polymere synthetisiert. Das Lipopeptid wurde vom Harz in TFA, das 5% Wasser, 5% Phenol und 5% EDT enthielt, 2 Stunden lang gespalten. Nach dem Verdampfen in vacuo wurde das rohe Produkt ausgefällt und mit Diethylether verrieben. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 60 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisie rung 10 mg reines Material (analytische HPLC, Gradient 60–100% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion-UV 260-Produktretentionszeit = 20–22 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1922, gefunden bei 1920.
  • b) Synthese eines Lipopetids, das eine Heparinsulphat-bindende Sequenz und ein Fibronektinpeptid enthält
  • Die Synthese und Reinigung wurde ausgeführt wie beschrieben in Beispiel 21(a).
  • c-1 Herstellung von mehrfach-spezifischen gas-gefüllten Mikrobläschen von DSPS, funktionalisiert mit einem Heparinsulphat-bindenden Peptid, einem Fibronektin-Peptid, Acetyl-RGD-Peptid und Fluorescein
  • DSPS (4 mg, 3,9 mmol), das Lipopeptid von (a) (0,5 mg, 0,2 mmol) und das Lipopeptid von (b) (0,5 mg) wurden in jeweils zwei Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zu jedem Fläschchen gegeben. Die Mischungen wurden auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und die Kopfräume wurden mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann über Nacht gerollt. Die so erhaltenen Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch MALDI-Massenspektrometrie wie in Beispiel 21(b) beschrieben analysiert. Die Mikrobläschen wurden durch Mikroskopie untersucht und es wurde gesehen, dass sie einen Größenbereich zwischen 1 und 5 Mikron besaßen. Außerdem waren die Mikrobläschen fluoreszierend.
  • Beispiel 30 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, das kovalent mit CD71 FITC-markiertem Anti-Transferin-Rezeptor-Antikörper modifiziert ist und mit einem Lipopeptid mit einer Affinität für endotheliale Zellen „dotiert" ist
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von auf mehrere Vektoren zielausgerichtete Ultraschallmittel gerichtet.
  • a) Synthese eines Endothelial-Zellen-bindenden Lipopeptids: 2-n-Hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2
  • Das unten gezeigte Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer ausgehend von einem Rink-Amidharz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol Aminosäure-Kartuschen synthetisiert.
  • Figure 01040001
  • Alle Aminosäuren und 2-n-Hexadecylstearinsäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% EDT und 5% H2O enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Eine Reinigung von HPLC einer aliquoten Menge von 40 mg des rohen Materials wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 50 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 10 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 90–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2369, gefunden bei 2373.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikro-Bläschen, umfassend DSPS, das mit einem Endothelial-Zellen-bindenden Peptid und PE-PEG2000-Mal „dotiert" ist
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid von (a) (0,5 mg) zusammen mit PE-PEG2000-Mal aus Beispiel 50 (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch einen 4,5 Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.
  • c) Thiolierung von FITC-markiertem Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörper
  • FITC-markierter CD71-Anti-Transferrin-Rezeptor Ab (100 mg/ml in PBS, 0,7 ml) wurde mit Trauts Reagenz (0,9 mg) bei Raumtemperatur 1 Stunde lang umgesetzt. Überschüssiges Reagenz wurde vom modifizierten Protein auf einer NAP-5-Säule getrennt.
  • d) Konjugation von thioliertem FITC-markiertem Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörper an Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einem Endothelial-Zellen-bindenden Lipopeptid und DSPE-PEG2000-Mal „dotiert" ist
  • Eine aliquote Menge von 0,5 ml der Proteinfraktion (2 ml insgesamt) von (c) oben wurde zu den Mikrobläschen von (b) gegeben und man ließ die Konjugationsreaktion 10 Minuten lang auf einem Rollentisch fortschreiten. Nach der Zentrifugation bei 1000 Upm für 3 Minuten wurde die Proteinlösung entfernt und die Konjugation zweimal mehr mit aliquoten Mengen von 1 ml beziehungsweise 0,5 ml der Proteinlösung wiederholt. Bläschen wurden dann viermal in destilliertem Wasser gewaschen und eine Probe wurde auf das Vorhandensein von Antikörper-Durchflusszytometrie und Mikroskopie analysiert. Eine fluoreszierende Population von > 92% wurde beobachtet.
  • 1 der beigefügten Zeichnungen stellt den Durchflusszytometrie-Vergleich einer negativen Kontrolle von Mikrobläschen aus DSPS (linke Kurve) mit Bläschen dar, die mit CD71 FITC-markiertem Anti-Transferrin-Antikörper (gefüllte Kurve, rechts) konjugiert sind, was zeigt, dass 92% der Population fluoresziert.
  • Der Einbau von Lipopeptid in die Mikrobläschen wurde durch MALDI-Massenspektrometrie bestätigt, wie beschrieben in Beispiel 21(b).
  • Beispiel 31 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, ein Lipopeptid für Endothelial-Zellen-Zielausrichtung und ein Captopril-enthaltendes Molekül
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von Ultraschallmitteln für kombinierte Zielausrichtungs- und therapeutische Anwendungen gerichtet.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, das mit Captopril funktionalisiert ist
    Figure 01060001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde unter Verwenden einer manuellen Vorrichtung zum Durchperlenlassen von Stickstoff synthetisiert, ausgehend von mit Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz in einem 0,125 mmol-Maßstab. Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen.
  • Bromessigsäure wurde durch die Seitenkette von Lys als ein symmetrisches Anhydrid unter Verwenden einer DIC-Voraktivierung gekoppelt. Captopril, aufgelöst in DMF, wurde auf der Festphase unter Verwenden von DBU als eine Basis eingeführt. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% EDT, 5% Wasser und 5% Ethylmethylsulfid enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt. Eine aliquote Menge von 10 mg des rohen Materials wurde durch präparative Flüssigkeitschromatographie unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten gereinigt (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril), bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 2 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Min, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 26 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei 1265 ergab, wie erwartet.
  • Synthese eines Lipopeptids mit einer Affinität für endotheliale Zellen: Dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Ile-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH2
    Figure 01070001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer ausgehend von einem Rink-Amid-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol Aminosäure-Kartuschen synthetisiert. Alle Aminosäuren und Palmitinsäuren wurden voraktiviert unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 160 mg ergab. Die Reinigung durch präparative HPLC einer aliquoten Menge von 35 mg rohen Materials wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 20 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 und 260 nm – Produktretentionszeit = 16 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2050, gefunden bei 2055.
  • c) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, ein Lipopeptid für Endothelial-Zellen-Zielausrichtung und ein Captopril-enthaltendes Molekül für Arzneimittelverabreichung
  • DSPS (4,5 mg), das Produkt von (a) (0,5 mg) und das Produkt von (b) (0,5 mg) wurden in ein Fläschchen eingewogen und 1,0 mg einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde zuerst in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann eine Stunde lang gerollt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Es wurde kein detektierbarer Gehalt von Ausgangsmaterial in der schließlichen Waschlösung gefunden, wie durch MALDI MS bewiesen. MALDI-Massenspektralanalyse wurde verwendet, um den Einbau der Produkte von (a) und (b) in die Mikrobläschen zu bestätigen, wie beschrieben in Beispiel 21(b).
  • d) In-vitro-Studie von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, ein Lipopeptid für Endothelial-Zellen-Zielausrichtung und ein Captopril-enthaltendes Molekül für therapeutische Anwendungen
  • Der in Beispiel 21(c) beschriebene in-vitro-Assay wurde verwendet, um die Zellenbindung unter Fließbedingungen zu untersuchen. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen auf den Zellen fand statt, abhängig von der Fließgeschwindigkeit. Bei weiterer Erhöhung der Fließgeschwindigkeit begannen die Zellen, vom Deckglas abgelöst zu werden, aber die Mikrobläschen blieben an die Zellen gebunden. Kontroll-Mikrobläschen, die den Vektor nicht trugen, hafteten nicht an den endothelialen Zellen an, und verschwanden aus der Kammer unter minimalen Fließbedingungen.
  • Beispiel 32 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einem Lipopeptid beladen ist, das ein helikales Peptid mit einer Affinität für Zellmembranen und das Peptid-Antibiotikum Polymixin-B-Sulphat umfasst
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen gerichtet, die mehrfache peptidische Vektoren umfassen, die eine kombinierte Zielausrichtungs- und therapeutische Anwendung besitzen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, umfassend ein helikales Peptid mit einer Affinität für Zellmembranen: Hexadecylstearyl-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH2
  • Dieses wird wie in Beispiel 30(a) beschrieben hergestellt.
  • b) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • DSPS (5,0 mg), das Lipopeptid von (a) (0,3 mg) und Polymixin-B-Sulphat (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde 3–5 Minuten beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch einen 4,5 Mikronfilter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Die Mikrobläschen wurden mit Wasser gewaschen, bis kein Polymixin-b-Sulphat oder Lipopeptid im unten Schwimmenden durch MALDI-MS detektiert werden konnte. Die Mikroskopie zeigte, dass die Größenverteilung der Bläschen-Population im erwünschten Bereich von 1–8 Mikron lag. Zu den gewaschenen Bläschen (ca. 0,2 ml) wurde Methanol (0,5 ml) gegeben und die Mischung wurden in einem Ultraschallbad 2 Minuten lang angeordnet. Es wurde bei einer Analyse durch MALDI-MS gefunden, dass die resultierende klare Lösung sowohl Lipopeptid als auch Polymixin-B-Sulfat enthielt (erwartet 1203, gefunden 1207).
  • Beispiel 33 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, „dotiert" mit einem Lipopeptid, das eine IL-1-Rezeptor-Bindungssequenz umfasst, und modifiziert mit einer verzweigten Struktur, die das Arzneimittel Methotrexat enthält
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen, die mehrfache Vektoren für zielausgerichtete/therapeutische Anwendungen umfassen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, umfassend ein Interleukin-1-Rezeptor-bindendes Peptid: Dipalmitoyl-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-Gly-Leu-Trp-Arg-Gly-Ala-Ala, OH
    Figure 01100001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ala-Wang-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung von Lipopeptid vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% H2O, 5% Anisol, 5% Phenol und 5% EDT enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 30 mg des reinen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 4 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 90–100% B über 20 Minuten, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2083, gefunden bei 2088.
  • b) Synthese einer verzweigten Methotrexat-Kernstruktur, die eine Thioleinheit enthält
    Figure 01110001
  • Die Methotrexat-Struktur wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab. Die gleichzeitige Entfernung des Produktes vom Harz und die Entschützung von Schutzgruppen wurde in TFA, das 5% EDT und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 160 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 30 mg rohen Materials wurde ausgeführt durch präparative HPLC unter Verwenden eines Gradienten von 10 bis 30% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) und einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung der reinen Fraktionen wurden 9 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 5–50% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion-UV 214 nm – Produktretentionszeit = 9,5 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1523, gefunden bei 1523.
  • c) Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • DSPS (4,5 mg), Thiol-enthaltendes Lipopeptid von Beispiel 64(a) (0,5 mg) und Lipopeptid von (a) (0,2 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde 3 bis 5 Minuten lang beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch ein 4,5-Mikronfilter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert, wonach das unten Schwimmende entladen wurde.
  • d) Konjugation der verzweigten Methotrexat-Struktur an thiolierte Mikrobläschen
  • Die Methotrexat-Struktur von (b) oben (0,5 mg) wurde in PBS, pH 8,0, aufgelöst. Die Lösung wurde dann zu den Thiol-enthaltenden Mikrobläschen (c) gegeben und man ließ die Disulfidbindungs-Bildung 16 Stunden lang voranschreiten. Nach einem ausführlichen Waschen mit PBS und Wasser wurden die Bläschen durch Mikroskopie und MALDI MS analysiert.
  • Die Disulfidbindungs-Bildung der Methotrexat-Struktur an die Mikrobläschen kann in vivo reduziert werden, um das freie Arzneimittelmolekül freizusetzen, damit derartige Mikrobläschen in Kombination mit einem tumorspezifischen Vektor ein Arzneimittelverabreichungssystem umfassen. Ein physiologisch annehmbares Reduktionsmittel, wie Glutathion, kann verwendet werden, um eine derartige Arzneimittelfreisetzung herbeizuführen.
  • Beispiel 34 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, beschichtet mit Poly-L-Lysin, das an Fluorescein-markierte DNA-Fragmente aus dem Plasmid pBR322 komplexiert ist
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen für Gentherapie/Gegensinn-Anwendungen. Spezifische Zielausrichtung kann erreicht werden durch weitere Dotierung von Mikrobläschen-Membranen mit Vektor-modifizierten Lipidstrukturen, wie in Beispiel 21 beschrieben.
  • a) Herstellung von DSPS-eingekapselten, Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • DSPS (4,5 mg) wurde in ein sauberes Fläschchen eingewogen. 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben und die Mischung wurde 2 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt. Unmittelbar nach dem Erwärmen wurde die Lösung durch ein 4 Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt. Die resultierenden Mikrobläschen wurden dann einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen und das unten Schwimmende wurde entladen. Die Mikrobläschen wurden dann in 0,5 ml Wasser resuspendiert.
  • b) Herstellung eines Poly-L-Lysin/DNA-Komplexes und Beladen von DSPS-eingekapselten Mikrobläschen
  • Zu 1 mg Poly-L-Lysin (70–150 kD) in einem sauberen Fläschchen wurden 0,1 ml eines mit Fluorescein markierten Abbaus des Plasmids pBR322, aufgelöst in TE-Puffer (10 mM tris-HCl, pH 8), gegeben. Die Lösung wurde auf insgesamt 0,6 ml durch Zugabe von Wasser aufbereitet und der pH wurde auf 8 eingestellt. Man ließ das Komplexieren eine Stunde lang voranschreiten, wonach 0,05 ml der Polylysin-DNA-Lösung zur Mikrobläschensuspension von (a) oben zugegeben wurde. Nach einer Stunde wurde Mikroskopie verwendet, um zu zeigen, dass die Bläschen fluoreszierten, was das Vorhandensein von DNA bestätigte.
  • Beispiel 35 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, die ein verzweigtes Kernpeptid enthalten, das eine Bindungssequenz eines dabsylierten atherosklerotischen Plaques und RGDS umfasst
  • Dieses Beispiel ist auf die Herstellung von Mikrobläschen gerichtet, die eine Thiolgruppe auf der Oberfläche zur Modifikation mit Thiol-enthaltenden Vektoren für Zielausrichtungs/Arzneimittel-Verabreichung und Arzneimittel-Freisetzung aufweist.
  • a) Synthese des verzweigten Peptids Dabsyl-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Lys (NH2-Arg-Gly-Asp-Ser)-Gly-Cys, OH
    Figure 01140001
  • Das Peptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab, unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produkts von 160 mg ergab. Die Reinigung durch präparative HPLC einer aliquoten Menge von 30 mg rohen Materials wurde ausgeführt unter Verwen den eines Gradienten von 10 bis 60% B über 40 Minuten (wobei A = 0,1% TFA/Wasser und B = Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 2,5 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 10–50% B über 20 Minuten, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril und A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 und 435 nm – Produktretentionszeit = 21 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2070, gefunden bei 2073.
  • b) Herstellung von Thiol-enthaltenden, Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • Diese wurden hergestellt wie beschrieben in Beispiel 64(a).
  • c) Oxidative Kopplung thiolierter Mikrobläschen mit mehrfach-spezifischem Peptid via Disulfidbindungs-Bildung
  • Das unten Schwimmende der Mikrobläschen von (b) oben wurde entladen und mit einer Lösung des Dabsyl-Peptids von (a) (1 mg) in 0,7 ml verdünnter Ammoniaklösung (pH 8) ersetzt. Zu diesem wurden 0,2 ml einer Stammlösung gegeben, die 6 mg Kaliumferricyanat, aufgelöst in 2 ml Wasser, enthielt. Das Fläschchen wurde auf einem Rollentisch angeordnet und man ließ die Thiol-Oxidation 2 Stunden lang fortschreiten. Die Bläschen wurden dann ausführlich mit Wasser gewaschen bis das unten Schwimmende frei von Dabsyl-Peptid war, wie bewiesen durch HPLC und MALDI MS. Die Detektion von Mikrobläschen-gebundenem Peptid wurde ausgeführt durch Reduktion der Disulfidbindung unter Verwenden des wasserlöslichen Reduktionsmittels Tris-(2-Carboxyethyl)-Phosphin. Nach der Reduktion wurde gefunden, dass das unten Schwimmende freies Dabsyl-Peptid enthielt, wie bewiesen durch HPLC und MALDI MS.
  • Andere physiologisch annehmbare Reduktionsmittel, wie reduziertes Glutathion kann auch zum Initiieren der Freisetzung nützlich sein.
  • Beispiel 36 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und Biotin-PEG3400-Acyl-Phosphatidylethanolamin und funktionalisiert mit Streptavidin, dem Oligonukleotid Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und biotinyliertes Fibrin-Anti-polimerisierendes Peptid (Biotin-GPRPPERHOS·HH2)
  • a) Synthese von Biotin-PEG3400-Acyl-Phosphatidylethanolamin
  • Eine Mischung von Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, (21,00 mg, 0,03 mmol), Biotin-PEG-CO2-NHS, (100 mg, 0,03 mmol) und Triethylamin (42 μl, 0,30 mmol) in einer Lösung von Chloroform/Methanol (3:1) wurde bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel unter verringertem Druck wurde der Rückstand flash-chromatographiert (Methylenchlorid/Methanol/Wasser, 40:8:1). Das Produkt wurde als ein gelbes Gummi (112 mg, 94%) erhalten, und die Struktur wurde durch NMR und MALDI-MS verifiziert.
  • b) Binden von Fluorescein-konjugiertem Streptavidin an Gas-gefüllte Mikrobläschen
  • Gas-gefüllte Mikrobläschen wurden durch Mischen von DSPS und Biotin-PEG3400-Acyl-Phosphatidylethanolamin, wie in vorstehenden Beispielen beschrieben, hergestellt. Die Mikrobläschensuspension wurde in aliquote Mengen von 0,2 ml unterteilt und Fluorescein-konjugiertes Streptavidin wurde wie in der Tabelle unten gezeigt zugegeben. Die Proben wurden auf einem Rollentisch 15 oder 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur vor dem Entfernen von überschüssigem Protein durch Waschen in PBS inkubiert. Die Proben wurden durch Durchflusszytometrie und einem Coulter-Zähler analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten zusammengefasst.
  • Ergebnisse:
    Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • c) Konjugation von Streptavidin-beschichteten Mikrobläschen mit dem Oligonukleotid Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und biotinyliertem Fibrin-Anti-polymerisierendem Peptid Biotin-GPRPPERHOS
  • Die Teilchen des Aliquots Nr. 6 oben wurden zentrifugiert und der Überstand wurde mit 1 ml PBS-Puffer, pH 7,5, ersetzt, enthaltend 0,2 mg Biotin-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG und 0,2 mg Biotin-GPRPPERHQS (hergestellt wie in Beispiel 27(b) und (c)). Nach der Inkubation für 24 Stunden wurden die Teilchen ausführlich mit PBS und Wasser gewaschen.
  • Andere biotinylierte Vektoren oder therapeutische Mittel können an Streptavidin- oder Avidin-beschichtete Mikrobläschen unter Verwenden dieser Prozedur konjugiert werden.
  • Beispiel 37 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und funktionalisiert mit einem Thrombi-zielausrichtenden Lipopeptid und dem thrombolytischen Enzym-Gewebe-Plasminogenaktivator
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von auf Thrombus zielgerichteten Ultraschall-Kontrastmitteln, die ein therapeutisches thrombolytisches Mittel umfassen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids mit einer Affinität für Thrombi (Dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln·NH2)
    Figure 01180001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Rink-Amid-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 80 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 20 mg des rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt. Nach der Lyophilisierung wurden 6 mg reinen Materials erhalten. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie und analytische HPLC charakterisiert.
  • b) Modifikation des Gewebe-Plasminogenaktivators mit Sulfo-SMPB
  • Eine Lösung von 0,1 ml Amoniumcarbonat-Puffer, der 0,1 mg t-PA enthielt, wurde auf 0,2 ml durch die Zugabe von Wasser aufbereitet. Zu dieser Lösung wurden 0,4 mg Sulfo-SMPB (aufgelöst in 0,05 ml DMSO) zugegeben. Die Proteinlösung wurde bei Raumtemperatur 45 Minuten lang stehen gelassen, wonach eine Reinigung auf einer Superdex 200-Säule ausgeführt wurde. Das Produkt wurde in PBS eluiert und die modifizierte Proteinfraktion wurde gesammelt.
  • c) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS/Thrombi-bindendem Lipopeptid und Thiol-enthaltendem Lipopeptid und Konjugation des modifizierten Gewebe-Plasminogenaktivators
  • DSPS (5,0 mg) wurde in einem sauberen Fläschchen zusammen mit 0,5 mg des Lipopeptids von (a) und 0,5 mg des Thiol-enthaltenden Lipopeptids von Beispiel 64(a) eingewogen. Dazu wurden 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin gegeben und die Mischung wurde 2 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt. Unmittelbar nach dem Erwärmen wurde die Lösung durch einen 4 Mikron-Filter filtriert. Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Überstand wurde entladen und mit einer aliquoten Menge von 1 ml der Proteinlösung von (b) oben ersetzt. Man ließ die Konjugationsreaktion eine Stunde lang fortschreiten. Die Mikrobläschen wurden zentrifugiert und das unten Schwimmende wurde mit einem weiteren ml der Proteinlösung ausgetauscht. Der Inkubationsschritt wurde wiederholt, bis die gesamte Proteinlösung aufgebraucht war. Die Mikrobläschen wurden dann ausführlich mit Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler analysiert. Die Mikrobläschen wurden in einem Flusskammer-Assay, der in Beispiel 21(c) beschrieben ist, getestet. Es wurde gefunden, dass die mit Protein modifizierten Mikrobläschen in höheren Zahlen binden als jene, die entweder Lipopeptid/DSPS oder DSPS allein enthielten.
  • Die Zielausrichtungs-/therapeutischen/Ultraschall-Wirkungen dieser Mikrobläschen wurden in Modellen einer Thrombogenese sowohl in vitro als auch in vivo bewertet.
  • Beispiel 38 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassen DSPS, das mit einem Lipopeptid beladen ist, das ein helikales Peptid mit einer Affinität für Zellmembranen umfasst
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen, umfassend einen peptidischen Vektor zum Zielausrichten auf Zellmembranstrukturen.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, umfassend ein helikales Peptid mit einer Affinität für Zellmembranen
    Figure 01200001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von einem Rink-Amid-Harz in einem 0,2 mmmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und 2-n-Hexadecylstearinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Lipopeptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% H2O enthielt, für 2 Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 520 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 30 mg des rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1 TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 10 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 90 bis 100% B über 20 Minuten, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2369, gefunden bei 2375.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid von (a) (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde 3 bis 5 Minuten lang beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch ein 4,5 mm-Filter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Die Mikrobläschen wurden dann mit Wasser gewaschen, bis kein Lipopeptid durch MALDI-MS detektiert werden konnte. Coulter-Zähler, akustische Dämpfungs- und Druckstabilitäts-Studien wurden ausgeführt. Zu einer aliquoten Menge der gewaschenen Bläschen (ca. 0,2 ml) wurde Methanol (0,5 ml) gegeben und die Mischung wurde in einem Ultraschallbad 2 Minuten lang angeordnet. Es wurde bei einer Analyse durch MALDI-MS gefunden, dass die resultierende klare Lösung das Lipopeptid enthielt.
  • c) In-vitro und in-vivo-Tests
  • Die Mikrobläschen besaßen ähnliche Eigenschaften in vitro und in vivo, wie für die in Beispiel 21 erzeugten Mikrobläschen gefunden.
  • Beispiel 39 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit Phosphatidylserin und einem biotinylierten Lipopeptid
  • a) Synthese des Lipopeptids Diplomatoyl-lysinyl-tryptophanyl-lysinyl-lysinyl-lysinyl (biotinyl)-glycin
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Gly-Wang-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminsäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. nach der Lyophilisierung. 14 mg reines Material (analytische HPLC, Gradient 70–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 260 und Fluoreszenz, Ex 280, Em 350 – Produktretentionszeit = 22 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1478, gefunden bei 1471.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit der biotinylierten Lipopeptidsequenz von (a) „dotiert" ist
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid von (a) (0,5 mg, 0,2 mmol) wurden in jedes von zwei Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol, 2,4% Glycerin wurde in jedes Fläschchen gegeben. Die Mischungen wurden auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (die Fläschchen wurden während des Erwärmens geschüttelt). Die Proben wurden auf Raumtemperatur gekühlt und die Kopfräume wurden mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann über Nacht gerollt. Die resultierenden Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und durch einen Coulter-Zähler und eine akustische Dämpfung analysiert. MALDI-Massenspektralanalyse wurde verwendet, um den Einbau des Lipopeptids in DSPS-Mikrobläschen zu bestätigen, wie folgt: ca. 50 bis 100 mg der Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen und 50 bis 100 ml Wasser wurden zugegeben. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und auf einer sauberen Ziel scheibe (1 ml + 0,5 ml ACH-Matrix) in Spots aufgebracht. Der positive Modus ergab M + H bei 1474, erwartet für das Lipopeptid bei 1478.
  • Beispiel 40 – Herstellung von mehrfach-spezifischen Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einem Lipopeptid beladen ist, umfassend ein nicht-bioaktives Interleukin-1-Rezeptor-bindendes Peptid
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen, umfassend einen nicht-bioaktiven peptidischen Vektor zum Zielausrichten auf den IL-1-Rezeptor, der nicht die Signaltranduktion induziert oder die IL-1-Bindung verhindert.
  • a) Synthese eines Lipopeptids, umfassend ein nicht-bioaktives Interleukin-1-Rezeptor-bindendes Peptid
    Figure 01230001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ala-Wang-Harz in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Lipopeptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% H2O, 5% Anisol, 5% Phenol und 5% EDT enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 30 mg rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 40 Minuten (A = TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 4 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 90 bis 100% B über 20 Minuten, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2083, gefunden bei 2088.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid von (a) (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde 3 bis 5 Minuten lang beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch ein 4,5 Mikron-Filter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Die Mikrobläschen wurden dann mit Wasser gewaschen, bis kein Lipopeptid durch MALDI-MS detektiert werden konnte. Zu den gewaschenen Mikrobläschen (ca. 0,2 ml) wurde Methanol (0,5 ml) gegeben und die Mischung wurde in einem Ultraschallbad 2 Minuten lang angeordnet. Es wurde bei der Analyse durch MALDI-MS gefunden, dass die resultierende klare Lösung Lipopeptid enthielt (erwartet 2083, gefunden 2088).
  • Beispiel 41 – Herstellung von Perfluorpropan-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPC, DSPS und Endothelialzellen-bindendes Lipopeptid für eine zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Zu 0,8 ml einer Lösung, die DSPC:DSPS (3:1) (5 mg/ml) in Propylenglykol/Glycerin (4% in Wasser) enthielt, wurde 0,5 mg des Lipopeptids von Beispiel 31(b) gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und geschüttelt. Die Lösung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorpropan gespült. Das Fläschchen wurde auf einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch 5 Minuten lang angeordnet. Die Probe wurde bei 2000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert und das unten Schwimmende wurde entfernt und mit destilliertem Wasser ersetzt. Der Kopfraum wurde wieder mit Perfluorpropan gespült und die Probe wurde auf einem Rollentisch gehalten, bis ein homogenes Erscheinungsbild erhalten wurde. Die Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende Ultraschall-Kontrastmittel wurde durch Coulter-Zähler-Analyse, akustische Dämpfungs-Messungen und Widerstand gegenüber äußerem Druck charakterisiert. Die Mikrobläschen wurden in dem in-vitro-Assay, wie er in Beispiel 21 detailliert erläutert ist, getestet. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 42 – Herstellung von Schwefelhexafluorid-enthaltenden Mikrobläschen, umfassend DSPC, DSPS und Endothelialzellen-bindendes Lipopeptid für eine zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Zu 0,8 ml einer Lösung, die DSPC, DSPS (3:1) (5 mg/ml) in Propylenglykol/Glycerin (4% in Wasser) enthielt, wurde 0,5 mg des Lipopeptids aus Beispiel 31(b) gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und geschüttelt. Die Lösung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Schwefelhexafluorid-Gas gespült.
  • Das Fläschchen wurde auf einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch 5 Minuten lang angeordnet. Die Probe wurde bei 2000 Upm 5 Minuten lang zentrifugiert und das unten Schwimmende wurde entfernt und durch destilliertes Wasser ersetzt. Der Kopfraum wurde wieder mit Schwefelhexafluorid gespült und die Probe wurde auf einem Rollentisch gehalten, bis ein homogenes Erscheinungsbild erhalten wurde. Die Waschprozedur wurde wiederholt.
  • Das resultierende Ultraschall-Kontrastmittel wurde durch Coulter-Zähler, akustische Dämpfungs-Messungen und Widerstand gegenüber äußerem Druck bestätigt.
  • Beispiel 43 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPG und Endothelialzellen-bindendes Lipopeptid für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Zu 0,8 ml einer Lösung, die DSPG (5 mg/ml) in Propylenglykol/Glycerin (4% in Wasser) enthielt, wurde 0,5 mg des Lipopeptids aus Beispiel 31(b) gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und geschüttelt. Die Lösung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und der Kopfraum mit Perfluorbutan gespült. Das Fläschchen wurde auf einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch 5 Minuten lang angeordnet. Die Probe wurde bei 2000 Upm fünf Minuten lang zentrifugiert und das unten Schwimmende wurde entfernt und durch destilliertes Wasser ersetzt. Der Kopfraum wurde wieder mit Perfluorbutan gespült und die Probe wurde auf einem Rollentisch gehalten, bis ein homogenes Erscheinungsbild erhalten wurde. Die Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende Ultraschall-Kontrastmittel wurde durch Coulter-Zähler-Analyse, akustische Dämpfungs-Messungen und Widerstand gegenüber äußerem Druck charakterisiert. Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay, wie er in Beispiel 21 detailliert erläutert ist, getestet. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 44 – Herstellung von Perfluorpropan-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPG und Endothelialzellen-bindendes Lipopeptid für eine zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Zu 0,8 ml einer Lösung, die DSPG (5 mg/ml) in Propylenglykol/Glycerin (4% in Wasser) enthielt, wurde 0,5 mg des Lipopeptids aus Beispiel 31(b) gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und geschüttelt. Die Lösung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und der Kopfraum mit Perfluorpropan gespült. Das Fläschchen wurde auf einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch 5 Minuten lang angeordnet. Die Probe wurde bei 2000 Upm fünf Minuten lang zentrifugiert und das unten Schwimmende wurde entfernt und durch destilliertes Wasser ersetzt. Der Kopfraum wurde wieder mit Perfluorbutan ge spült und die Probe wurde auf einem Rollentisch gehalten, bis ein homogenes Erscheinungsbild erhalten wurde. Die Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende Ultraschall-Kontrastmittel wurde durch Coulter-Zähler-Analyse, akustische Dämpfungs-Messungen und Widerstand gegenüber äußerem Druck charakterisiert. Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay, wie er in Beispiel 21 detailliert erläutert ist, getestet: Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 45 – Herstellung von Schwefelhexafluorid-enthaltenden Mikrobläschen, umfassend DSPG und Endothelialzellen-bindendes Lipopeptid für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Zu 0,8 ml einer Lösung, die DSPG (5 mg/ml) in Propylenglykol/Glycerin (4% in Wasser) enthielt, wurde 0,5 mg des Lipopeptids aus Beispiel 31(b) gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und geschüttelt. Die Lösung wurde dann auf Umgebungstemperatur gekühlt und der Kopfraum mit Schwefelhexafluorid-Gas gespült. Das Fläschchen wurde auf einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch 5 Minuten lang angeordnet. Die Probe wurde bei 2000 Upm fünf Minuten lang zentrifugiert und das unten Schwimmende wurde entfernt und durch destilliertes Wasser ersetzt. Der Kopfraum wurde wieder mit Schwefelhexafluorid gespült und die Probe wurde auf einem Rollentisch gehalten, bis ein homogenes Erscheinungsbild erhalten wurde. Die Waschprozedur wurde wiederholt. Das resultierende Ultraschall-Kontrastmittel wurde durch Coulter-Zähler-Analyse, akustische Dämpfungs-Messungen und Widerstand gegenüber äußerem Druck charakterisiert.
  • Beispiel 46 – zielausgerichtete, Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, nicht-kovalent mit Polylysin beschichtet
  • DSPS (5 mg) wurde in ein sauberes Fläschchen zusammen mit Poly-L-Lysin (0,2 mg) eingewogen. In das Fläschchen wurden 1,0 ml einer Lösung von 1,4% Propy lenglykol/2,4% Glycerin gegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt. Die Probe wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutan-Gas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden bei 1000 Upm 3 Minuten lang zentrifugiert. Nach ausführlichem Waschen mit Wasser, PBS und Wasser wurde die schließliche Lösung auf den Polylysingehalt unter Verwenden von MALDI MS untersucht. Es wurde kein Polypeptid-Material in der schließlichen Waschlösung beobachtet. Acetonitril (0,5 ml) wurde dann zugegeben und die Mikrobläschen wurden beschallt, bis alle Bläschen geplatzt waren. Eine Analyse der resultierenden Lösung auf Polylysin wurde wieder ausgeführt unter Verwenden von MALDI MS. Die Resultate waren wie folgt:
  • Figure 01280001
  • Beispiel 47 – Herstellung von funktionalisierten Gas-gefüllten Mikrobläschen für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen mit einer reaktiven Gruppe auf der Oberfläche für nicht-spezifische Zielausrichtung, hauptsächlich nutzend Disulfid-Austauschreaktionen, um die Bindung an eine Vielzahl von zellulären Zielen zu bewirken.
  • a) Synthese eines Thiol-funktionalisierten Lipidmoleküls
    Figure 01280002
  • Die oben gezeigte Lipidstruktur wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Wang-Harz in einem 0,25 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU-Kopplungschemie voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und die Entschützung von Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5e EDT und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 250 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 50 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 24 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit – 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1096, gefunden bei 1099.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einer Thiol-enthaltenden Lipidstruktur „dotiert" ist
  • DSPS (4,5 mg) und die Lipidstruktur von (a) oben (0,5 mg, 0,4 mmol) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung, die 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin im Wasser enthielt, wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und durch ein 40 ml-Filter filtriert, während sie noch heiß war. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann auf einem Rollentisch über Nacht angeordnet. Die resultierenden Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und auf Thiol-Gruppen-Einbau unter Verwenden von Ellmanns Reagenz analysiert.
  • Beispiel 48 – Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einem Thrombus-bindenden Lipopeptid dotiert ist
  • a) Synthese eines Lipopeptids mit einer Affinität für Thrombi (Dipalmitoyl-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln·NH2)
    Figure 01300001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von einem Rink-Amid-Harz, in einem 0,1 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 80 mg ergab. Die Reinigung einer aliquoten Menge von 20 mg rohen Materials wurde durch präparative HPLC ausgeführt. Nach der Lyophilisierung wurden 6 mg reines Material erhalten. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie und analytische HPLC charakterisiert.
  • b) Herstellung von Thrombi-zielausrichtenden Ultraschall-Mikrobläschen
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid von (a) (1,0 mg) wurden in ein Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch einen 4 Mikron-Filter filtriert. Nach dem Kühlen auf Raumtemperatur wurde der Kopfraum mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Mikrobläschen wurden durch Mikroskopie und Coulter-Zähler-Analyse charakterisiert. MALDI-MS wurde verwendet, um das Vorhandensein des Lipopeptids zu bestätigen, wie in vorstehenden Beispielen beschrieben.
  • Beispiel 49 – Herstellung von Transferrin-beschichteten, Gas-gefüllten Mikrobläschen für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung a) Synthese eines Thiol-funktionalisierten Lipidmoleküls
    Figure 01310001
  • Die oben gezeigte Lipidstruktur wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Wang-Harz, in einem 0,25 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und die Entschützung der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 250 mg ergab. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg rohen Materials wurde durch präparative HPLC ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 50 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 24 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretenti onszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1096, gefunden bei 1099.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, das mit einer Thiol-enthaltenden Lipidstruktur „dotiert" ist
  • DSPS (4,5 mg) und die Lipidstruktur von (a) oben (0,5 mg, 0,4 mmol) wurden in ein sauberen Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung aus 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und durch ein 40 mm-Filter filtriert, während sie noch heiß war. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann auf einem Rollentisch über Nacht angeordnet. Die resultierenden Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und auf den Thiol-Gruppen-Einbau unter Verwenden von Ellmanns Reagenz analysiert.
  • c) Modifikation von Transferrin mit Fluorescein-NHS und Sulfo-SMPB
  • Zu 4 mg Transferrin (Holo, menschlich) in PBS (1 ml) wurde 0,5 ml DMSO-Lösung gegeben, die 1 mg Sulfo-SMPB und 0,5 mg Fluorescein-NHS enthielt. Die Mischung wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und man ließ sie dann durch eine Sephadex 200-Säule unter Verwenden von PBS als Eluenten laufen. Die Proteinfraktion wurde gesammelt und bei 4°C vor der Verwendung gespeichert.
  • d) Mikrobläschen-Konjugation mit Transferrin
  • Zu den Thiol-enthaltenden Mikrobläschen aus (b) wurde 1 ml der modifizierten Transferrin-Protein-Lösung aus (c) gegeben. Nach dem Einstellen des pH der Lösung auf 9 ließ man die Konjugationsreaktion 2 Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreiten. Nach einem ausführlichen Waschen mit entionisiertem Wasser wurden die Mikrobläschen durch Coulter-Zähler (97% zwischen 1 und 5 mm) und Fluoreszenzmikroskopie (stark fluoreszierende Mikrobläschen) analysiert.
  • Beispiel 50 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, das PE-PEG2000-Mal eingebaut hat, das an thioliertes Trypsin-Fluorescein konjugiert ist
  • a) Synthese von Boc-NH-PEG2000-DSPE (t-Butyl-carbamat-polyethylenglykol)distearoylphosphatidylethanolamin
  • DSPE (31 mg) wurde zu einer Lösung Boc-NH-PEG2000-SC (150 mg) in Chloroform (2 ml) gegeben, gefolgt von Triethylamin (33 μl). Die Mischung wurde auf 41°C 10 Minuten lang gerührt, bis das Ausgangsmaterial aufgelöst war. Das Lösungsmittel wurde rotationsverdampft und der Rückstand wurde in Acetonitril (5 ml) aufgenommen. Die resultierende Dispersion wurde auf 4°C gekühlt und zentrifugiert, wonach die Lösung filtriert wurde und zum Trocknen verdampft wurde. Die Struktur des resultierenden Produktes wurde durch NMR bestätigt.
  • b) Synthese von H2N-PEG2000-DSPE (Amino-poly(ethylenglykol)distearoylphosphatidylethanolamin)
  • Boc-NH-PEG2000-DSPE (167 mg) wurden in 4 M Salzsäure in Dioxan (5 ml) 2,5 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der Rückstand wurde in Chloroform (1,5 ml) aufgenommen und mit Wasser (2 × 1,5 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde in vacuo verdampft. TLC-Analyse (Chloroform/Methanol/Wasser 13:5:0,8) ergab einen einzelnen positiven Ninhydrin-Spot mit Rf = 0,6; eine Bestätigung der Struktur wurde durch NMR erhalten.
  • c) Synthese von Mal-PEG2000-DSPE (3-Maleimidopropionat-poly(ethylenglykol)distearoylphosphatidylethanolamin)
  • Eine Lösung von N-Succinimidyl-3-maleimidopropionat (5,6 mg, 0,018 mmol) in Tetrahydrofuran (0,2 ml) wurde zu H2N-PEG2000-DSPE (65 mg, 0,012 mmol), aufgelöst in Tertrahydrofuran (1 ml) und 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 (2 ml) gegeben. Die Mischung wurde auf 30°C erwärmt und man verfolgte die Reaktion bis zum Abschluss mit TLC, wonach das Lösungsmittel in vacuo entfernt wurde. Das Titel-Material wurde auf einer Flash-Silicasäule unter Verwenden von 80:20 Chloroform:Methanol als Eluenten gereinigt. Die Struktur des reinen Produkts wurde durch NMR und Massenspektrometrie bestätigt.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen aus DSPS, „dotiert" mit PE-PEG2000-Mal
  • DSPS (4,5 mg) und PE-PEG2000-Mal aus (c) oben (0,5 mg) wurden in ein sauberes Fläschchen eingewogen und 1 ml einer Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt und dann durch einen 4,5 mm-Filter filtriert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen.
  • e) Herstellung von Fluorescein-markiertem Trypsin
  • Zu 5 mg Trypsin in PBS (1 ml) wurde 0,2 ml DMSO-Lösung gegeben, die 1 mg Fluorescein-NHS enthielt. Die Mischung wurde 45 Sekunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Sephadex-200-Säule wurde dann mit der modifizierten Proteinmi schung beladen und das Produkt wurde bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. unter Verwenden von PBS eluiert. Die Proteinfraktion (5 ml) wurde gesammelt und bei 4°C geladen.
  • f) Herstellung von thioliertem Fluorescein-markiertem Trypsin
  • Zu der Proteinfraktion aus (e) wurde 1 mg Trauts Reagenz gegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur eine weitere Stunde lang gerührt. 4 ml des mit Trauts modifizierten Produktes wurde auf eine Sephadex 200-Säule geladen und das Produkt wurde mit PBS eluiert. Die Proteinfraktion, die die maximale Fluoreszenzintensität enthielt, wurde in einem Gesamtvolumen von 6 ml gesammelt.
  • g) Konjugation von Mikrobläschen mit thioliertem, Fluorescein-markiertem Trypsin
  • Mikrobläschen aus (d) wurden auf einem Rollentisch in 1 ml der Proteinlösung aus (f) oben inkubiert. Man ließ die Konjugation bei pH 7,3–7,8 10 Minuten lang fortschreiten, vor der Zentrifugation und Entfernung des unten Schwimmenden. Der Prozess wurde weiter 3 Male wiederholt, wonach die Bläschen viermal mit Wasser gewaschen wurden, um unkonjugiertes Protein zu entfernen.
  • D. Bläschen enthielten aktives Enzym, wie bewiesen durch die Spaltung eines Arg-pNA-Derivats in PBS. E. Analyse der Bläschen durch Coulter und Messung der Echogenizität wurde ausgeführt.
    Figure 01350001
  • Figure 01360001
  • Die Bläschen waren druck-stabil.
  • 2 der beigefügten Zeichnungen zeigt Durchflusszytometrie-Daten, die einen Vergleich mit Bläschen einer negativen Kontrolle (linke Kurve) zeigen. 98% der Bläschen wurden als fluoreszierend berechnet.
  • Beispiel 51 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Captopril-enthaltendes Molekül für diagnostische und therapeutische Anwendungen a) Synthese eines Lipopeptids, funktionalisiert mit Captopril
    Figure 01360002
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle „Bubbler"-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz in einem 0,125 mmol-Maßstab. Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden des Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokolls. Bromessigsäure wurde durch die Seitenkette von Lys als ein symmetrisches Anhydrid unter Verwenden von DIC-Voraktivierung gekoppelt. In DMF aufgelöstes Captopril wurde auf der festen Phase unter Verwenden von DBU als eine Basis eingeführt. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützung der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT, 5% Wasser und 5% Ethylmethylsulfid enthielt, für 2 Stunden. Eine aliquote Menge von 10 mg des rohen Materials wurde gereinigt durch präparative Flüssigkeitschromatographie, unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 2 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1 TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Min., Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 26 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei 1265 wie erwartet ergab.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und eine Verbindung, die Captopril enthält
  • Eine Lösung 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und des Produkts aus (a) (0,5 mg) in ein Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Das Fläschchen wurde dann gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die resultierenden Mikrobläschen wurden ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen. MALDI-Massenspektrometrie zeigte kein detektierbares Niveau der Verbindung aus (a) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau von Captopril-enthaltendem Lipopeptid in die Mikrobläschen wurde durch MALDI-MS wie folgt bestätigt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das 100 μl 90%-igen Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-Massenspektrometrie analysiert, was einen M + H-Peak entsprechend dem Lipopeptid von (a) ergab.
  • Beispiel 52 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und einen Vektor mit einer Affinität für adrenerge Rezeptoren für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasen-Kopplung geeignet ist
  • i) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]-phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,030 mol), Epichlorohydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurden bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-NMR (75 MHz)-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • ii) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergaben eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse verifiziert.
  • iii) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde bei 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab ein M + H bei 268, wie erwartet.
  • iv) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,6 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung von Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5) und Teile des Di-tert-butyldicarbonats wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, gegossen und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • b) Synthese eines Lipopeptids, das mit Atenolol funktionalisiert ist
    Figure 01400001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden der Verbindung aus (a). Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Rohes Material wurde aus Ether ausgefällt und gereinigt durch präparative Flüssigkeitschromatographie unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1 TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 38 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B über 20 Minuten, A = 0–1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 25 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was M + H bei 1258 ergab, erwartet 1257.
  • c) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Atenolol enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung aus DSPS (4,5 mg) und dem Produkt aus (b) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt, auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und dann ge kühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (b) in der schließlichen Waschlösung. Einbau von Atenolol-enthaltendem Lipopeptid in die Mikrobläschen wurde durch MALDI-MS wie folgt bestätigt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was einen M + H-Peak bei 1259 ergab, der dem Lipopeptid (b) entspricht.
  • d) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden in dem in-vitro-Assay getestet, wie in Beispiel 21 detailliert erläutert ist. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 53 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronectinpeptid (WOPPRARI) zum Zielausrichten besteht, und ein Lipopeptid, das Atenolol für eine therapeutische Anwendung enthält a) Synthese eines Lipopeptids, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR) und einem Fibronectinpeptid (WOPPRARI) besteht
    Figure 01410001
  • Das Lipopeptid wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Ile-Wang-Harz, in einem 0,1 mmol-Maßstab, unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU vor dem Koppeln voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% Phenol, 5% EDT, 5% Anisol und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 150 mg ergab. Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg rohen Materials wurde durch präparative HPLC ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 40 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 16 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B, wobei B = MeOH, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 260 und Fluoreszenz, Ex280, Em350 – Produktretentionszeit = 19,44 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 2198, gefunden bei 2199.
  • b) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasenkopplung geeignet ist
  • i) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,030 mol), Epichlorhydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurde bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-NMR (75 MHz)-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • ii) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergaben eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H- und 13C-NMR-Analyse.
  • iii) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde bei 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab einen M + H bei 268, wie erwartet.
  • iv) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,6 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung aus Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Voranschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5), und Teile des Di-tert-butyldicarbonats wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, gegossen und das organische Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Materi al zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • c) Synthese eines Lipopeptids, das mit Atenolol funktionalisiert ist
    Figure 01440001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren, Palmitinsäure und der Verbindung aus (a). Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und Entschützung der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Das rohe Material wurde aus Ether ausgefällt und gereinigt durch präparative Flüssigkeitschromatographie, unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1 TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 38 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70–100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 25 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was M + H bei 1258 ergab, erwartet 1257.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das aus einem Heparinsulfat-bindenden Peptid (KRKR), einem Fibronectin-Peptid (WOPPRARI) besteht, und ein Lipopeptid, das Athenolol enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung aus DSPS (5,0 mg), dem Produkt aus (a) (0,5 mg) und dem Produkt aus (c) (0,5 mg) in ein Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Lösung wurde filtriert und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Der Einbau des Atenolol-enthaltenden Lipopeptids in die Mikrobläschen wurde durch MALDI-MS wie folgt bestätigt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was zwei M + H-Peaks bei 2202 und 1259 ergab, was dem Lipopeptid (a) beziehungsweise dem Lipopeptid (c) entspricht.
  • e) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden in dem in-vitro-Assay getestet, wie er in Beispiel 21 detailliert erläutert ist. Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 54 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein lipophiles Derivat von Athenolol mit einer Affinität für adrenerge Rezeptoren für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese von N-Hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetamid
  • i) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,030 mol), Epichlorhydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurde bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-NMR (75 MHz)-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • ii) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergaben eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H- und 13C-NMR-Analyse.
  • iii) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-((1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde bei 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR- Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab einen M + H bei 268, wie erwartet.
  • iv) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,60 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung aus Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Voranschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5), und Portionen des Di-tert-butyldicarbonats wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulphat gesättigt war, gegossen und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • v) Synthese von N'-Boc, N-Hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetamid
  • Eine Lösung von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäure (92 mg, 0,25 mmol) und Hexadecylamin (60 mg, 0,25 mmol) in DMF (5 ml) wurde auf 0°C gekühlt. HOBt (39 mg, 0,25 mmol) und N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (wasserlösliches Carbodiimid) (48 mg, 0,25 mmol) wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 0°C eine Stunde lang gerührt und dann bei Raumtemperatur über Nacht. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser (25 ml) gegossen, das Natriumcarbonat (2,5 g) und Natriumchlorid (4,0 g) enthielt.
  • Ausgefälltes Material wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in Chloroform aufgenommen. Die Chloroformphase wurde mit 5% Natriumcarbonat und Wasser gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert, um 150 mg gelb-weißes rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie gereinigt (Silica, Chloroform/Methanol 95:5), um 118 mg (80%) weißes Material zu ergeben. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR. Das Produkt wurde weiter charakterisiert durch MALDI-Massenspektrometrie, was einen M + Na-Peak bei 614 wie erwartet ergab.
  • vi) Synthese von N-Hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetamid
  • Zu einer Lösung von N'-Boc-N-hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetamid (10 mg) in Dichlormethan (9 ml) wurde Trifluoressigsäure (1 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. TLC (Silica, Chloroform/Methanol 95:5) zeigte eine vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials. Die Lösungsmittel wurden abgedampft und der Rückstand wurde in Wasser/Acetonitril aufgenommen und lyophilisiert, um eine quantitative Ausbeute von weißem festen Material zu ergeben. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz)-NMR-Analyse und weiter charakterisiert durch MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei 492 und M + Na bei 514 wie erwartet ergab.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und N-Hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetamid für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und N-Hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetamid (0,5 mg) in ein Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Lösung wurde filtriert und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Der Einbau der Verbindung aus (a) in die Mikrobläschen wurde durch MALDI-MS wie folgt bestätigt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS analysiert, was einen M + H-Peak bei 492 ergab, der dem N-Hexadecyl-4-[2-hydroxy-3-((1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetamid entsprach.
  • Beispiel 55 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, eingekapselt mit DSPS und einer Verbindung, die Folsäure enthielt, für diagnostische Anwendungen a) Synthese eines Lipopeptids, das Folsäure enthält
    Figure 01490001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren, Palmitinsäure und Folsäure. Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Rohes Material wurde aus Ether ausgefällt und analysiert durch MALDI-Massenspektrometrie, was einen M + H-Peak entspre chend der Struktur bei 1435, erwartet 1430, ergab. Das Material wurde weiter charakterisiert durch analytische HPLC, Gradient von 70 bis 100% B über 20 Minuten, wobei A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1 TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute, was einen Produktpeak mit einer Retentionszeit von 27 Minuten, detektiert bei UV 368 nm, ergab.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Folsäure enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und dem Produkt aus (a) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Verdünnter Ammoniak (auf pH 8) und DMSO (40 μl) wurden zugegeben und die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Lösung wurde filtriert und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Der Einbau der Struktur aus (a) in die Bläschen wurde durch MALDI-MS wie folgt bestätigt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was einen M + H-Peak bei 1238 ergab, entsprechend der Struktur aus (a).
  • c) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay, wie er in Beispiel 21 detailliert erläutert ist, getestet. Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 56 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Cholesterylester von Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese von Cholesteryl-4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butanoat
  • DIC (170 μl, 1,10 mmol) wurde zu einer Lösung von Chlorambucil (669 mg, 2,20 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 0,5 Stunden gerührt und zu einer Lösung von Cholesterin (387 mg, 1,00 mmol) und DMAP (122 mg, 1,00 mmol) in Dichlormethan (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann auf 5%-iges Natriumbicarbonat gegossen. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde filtriert und das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silica, Chloroform) gereinigt, um 560 mg (83%) farbloses Öl zu ergeben. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie charakterisiert, was M + H bei 674 wie erwartet ergab. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Analyse, was Spektren in Übereinstimmung mit der Struktur ergab.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Cholesterylester von Chlorambucil für diagnostische und/oder therapeutische Anwendungen
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und dem Produkt aus (a) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (a) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau von Chlorambucil-Cholesterylester in die Bläschen wurde durch MALDI-MS wie folgt bestätigt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS analysiert, was einen M + H-Peak bei 668 ergab, entsprechend der Struktur aus (a).
  • Beispiel 57 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Atenolol und ein Cholesterinderivat von Chlorambucil enthält, für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für die Festphasenkopplung geeignet ist
  • i) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]-phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,030 mol), Epichlorhydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurde bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-(75 MHz) NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • ii) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergaben eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H- und 13C-NMR-Analyse.
  • iii) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl-4-(2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde bei 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab einen- M + H bei 268, wie erwartet.
  • iv) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,6 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung von Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Voranschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5), und Portionen von Di-tert-butyldicarbonat wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, gegossen und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • b) Synthese eines Lipopeptids, das mit Atenolol funktionalisiert ist
    Figure 01540001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren, Palmitinsäure und der Verbindung aus (a). Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Rohes Material wurde aus Ether präzipitiert und gereinigt durch präparative Flüssigkeitschromatographie unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Minute. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 38 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 25 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was M + H bei 1258 ergab, erwartet 1257.
  • c) Synthese von Cholesteryl-4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butanoat
  • DIC (170 μl, 1,10 mmol) wurde zu einer Lösung von Chlorambucil (669 mg, 2,20 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 0,5 Stunden lang gerührt und zu einer Lösung von Cholesterin (387 mg, 1,00 mmol) und DMAP (122 mg, 1,00 mmol) in Dichlormethan (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann auf 5%-iges Natriumbicarbonat gegossen. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert und das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silica, Chloroform) gereinigt, um 560 mg (83%) farbloses Öl zu ergeben. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie charakterisiert, was M + H bei 674 wie erwartet ergab. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Analyse, was Spektren in Übereinstimmung mit der Struktur ergab.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Atenolol und ein Cholesterylester von Chlorambucil enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (5,0 mg), dem Produkt aus (b) (0,5 mg) und dem Produkt aus (c) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt). Die Lösung wurde filtriert und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. Der Einbau der Verbindungen (b) und (c) in die Mikrobläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS wie folgt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was einen M + H-Peak ergibt, der dem Lipopeptid aus (b) und dem Cholesterylester aus (c) entspricht.
  • e) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay getestet, wie im Detail in Beispiel 21 erläutert. Eine allmähliche Akkumulierung der Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 58 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Atenolol für Zell-Zielausrichtung und ein lipophiles Thiolester von Captopril für therapeutische Verwendung enthält
  • a) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasenkopplung geeignet ist
  • i) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]-phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,030 mol), Epichlorhydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurde bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-NMR (75 MHz)-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • ii) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergab eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H- und 13C-NMR-Analyse.
  • iii) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde bei 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab einen M + H bei 268, wie erwartet.
  • iv) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,6 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung von Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5), und Portionen von Di-tert-butyldicarbonat wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, gegossen und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • b) Synthese eines Lipopeptids, das mit Atenolol funktionalisiert ist
    Figure 01580001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren, Palmitinsäure und der Verbindung von (a). Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Rohes Material wurde aus Ether ausgefällt und gereinigt durch präparative Flüssigkeitschromatographie unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 38 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 25 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was M + H bei 1258 ergab, erwartet 1257.
  • c) Synthese des Cholansäurethiols von Captopril
  • Eine Mischung von 5-β-Cholansäure (361 mg, 1,00 mmol) und DIC (77 μl, 0,50 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde 10 Minuten lang gerührt und dann zu einer Lösung von Captopril (130 mg, 0,600 mmol) und DBU (180 μl, 1,20 mmol) in Dichlor methan (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann auf verdünnte Salzsäure gegossen. Chloroform (30 ml) wurde zugegeben. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Nach der Filtration und Konzentrierung wurde das rohe Material chromatographiert (Silica, Chloroform/Methanol/Essigsäure 95:4:1). Das Produkt wurde lyophilisiert aus einer Acetonitril/Wasser/Ethanol-Mischung. Ausbeute 137 mg (49%) cremefarbener Feststoff. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Spektroskopie. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was einen M + Na-Peak im positiven Modus bei m/z 584 ergab.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid-enthaltendes Atenolol zum Zell-Zielausrichten und ein lipophiles Thiolester von Captopril zur therapeutischen Verwendung
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (5,0 mg), den Produkten aus (b) (0,5 mg) und (c) (0,5 mg) in ein Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von ausführlichem Waschen mit entionisiertem Wasser. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung von (b) und (c) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau der Verbindungen (b) und (c) in die Mikrobläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS wie folgt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was Peaks ergab, die mit den Strukturen von (b) beziehungsweise (c) in Übereinstimmung waren.
  • e) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden in dem in-vitro-Assay getestet, wie in Beispiel 21 im Detail erläutert ist. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 59 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend Phosphatidylserin und Biotinamid-PEG-β-Ala-Cholesterin und ein Cholesterylester von Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese von Cholesteryl-N-Boc-β-alaninat
  • DIC (510 μl) wurde zu einer Lösung von Boc-β-Ala-OH (1,25 g, 6,60 mmol) in Dichlormethan (15 ml) unter einer inerten Atmosphäre gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang gerührt und dann in einen Kolben übertragen, der eine Lösung von Cholesterin (1,16 g, 3,00 mmol) und DMAP (367 mg, 3,00 mmol) in Dichlormethan (15 ml) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang gerührt und dann auf eine wässrige Lösung aus Kaliumhydrogensulfat gegossen. Nach der Phasentrennung wurde die wässrige Phase mit Chloroform extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit wässrigem Kaliumhydrogensulfat und Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO4). Nach der Filtration und dem Verdampfen wurde das rohe Produkt chromatographiert (Silica, Chloroform/Methanol 99:1), um 1,63 g (97%) eines weißen Feststoffs zu ergeben. Die Struktur wurde bestätigt durch 1H-NMR (500 MHz).
  • b) Synthese von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid
  • Eine Lösung der Verbindung aus (a) (279 mg, 0,500 mmol) in 1 M Salzsäure in 1,4-Dioxan (5 ml) wurde bei Raumtemperatur 4 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um eine quantitative Ausbeute von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid zu ergeben. Die Struktur wurde bestätigt durch 1H-NMR-(500 MHz) Analyse und durch MALDI-Massenspektrometrie, was einen M + Na-Peak bei 482 ergab, erwartet 481.
  • c) Biotin-PEG3400-β-Ala-Cholesterin
  • Zu einer Lösung von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid (15 mg, 0,03 mmol) in Chloroform/nassem Methanol (2:6:1, 3 ml) wurde Triethylamin (42 μl, 0,03 mmol) gegeben. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und eine Lösung von Biotin-PEG3400-NHS (100 mg, 0,03 mmol) in 1,4-Dioxan (1 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Nach dem Rühren bei Raumtemperatur für drei Stunden wurde die Mischung zum Trocknen verdampft und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie gereinigt, um weiße Kristalle zu ergeben, Ausbeute 102 mg (89%). Die Struktur wurde verifiziert durch MALDI-MS und durch NMR-Analyse.
  • d) Synthese von Cholesteryl-4-[4-[bis(2-chlorethyl)amino]phenyl]butanoat
  • DIC (170 μl, 1,10 mmol) wurde zu einer Lösung von Chlorambucil (669 mg, 2,20 mmol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 0,5 Stunden lang gerührt und zu einer Lösung von Cholesterin (387 mg, 1,00 mmol) und DMAP (122 mg, 1,00 mmol) in Dichlormethan (10 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann auf 5% Natriumbicarbonat gegossen. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert und das Produkt wurde durch Säulenchromatographie (Silica, Chloroform) gereinigt, um 560 mg (83%) Ausbeute eines farblosen Öls zu ergeben. Das Produkt wurde durch MALDI-Massenspektrometrie charakterisiert, was M + H bei 674 wie erwartet ergab. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Analyse, was Spektren in Übereinstimmung mit der Struktur ergab.
  • e) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (5,0 mg), den Produkten aus (c) (0,5 mg) und (d) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (c) und (d) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau der Verbindungen aus (c) und (d) in die Mikrobläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS wie folgt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was M + H-Peaks ergab, die den Verbindungen aus (c) und (d) entsprachen.
  • Beispiel 60 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das ein Derivat von Bestatin für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält a) Synthese eines Lipopeptids, das ein Derivat von Bestatin enthält
    Figure 01620001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren und Palmitinsäure. Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Rohes Material wurde aus Ether ausgefällt und gereinigt durch präparative Flüssigkeitschromatographie, unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 12 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 25 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was M + H bei 1315 ergab, erwartet 1314.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das ein Derivat von Bestatin für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und dem Produkt aus (a) (0,5 mg) in ein Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und die Inhalte wurden ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (b) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau von Atenolol-enthaltendem Lipopeptid in die Mikrobläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS wie folgt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthält. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was einen M + H-Peak bei 1320 ergab, erwartet bei 1314, entsprechend dem Lipopeptid aus (a).
  • c) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay getestet, wie in Beispiel 21 detailliert erläutert. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 61 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält a) Ein Lipopeptid enthaltendes Chlorambucil
    Figure 01640001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren und Palmitinsäure. Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden eines Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokolls. Chlorambucil wurde durch die Seitenkette von Lys als ein symmetrisches Anhydrid unter Verwenden einer DIC-Voraktivierung gekoppelt. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT, 5% Wasser und 5% Ethylmethylsulfid enthielt, für 2 Stunden. Eine aliquote Menge von 10 mg des rohen Materials wurde durch präparative Flüssigkeitschromatographie gereinigt, unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 30 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 26,5 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei 1295 ergab, erwartet 1294.
  • b) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das Chlorambucil für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und dem Produkt aus (a) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (a) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau von Chlorambucil-enthaltendem Lipopeptid in die Bläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS wie folgt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was einen M + H-Peak bei 1300, erwartet bei 1294, und einen M + Na-Peak bei 1324, erwartet bei 1317, ergab.
  • c) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay getestet, wie in Beispiel 21 detailliert erläutert ist. Eine allmähliche Akkumulation der Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 62 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS, ein Lipopeptid, das Atenolol und ein lipophiles Derivat von Captopril für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • a) Synthese eines geschützten Atenolol-Derivats, das für Festphasen-Koppeln geeignet ist
  • i) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,030 mol), Epichlorhydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurde bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-NMR-(75 MHz) Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • ii) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergab eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H- und 13C-NMR-Analyse.
  • iii) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde bei 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab einen M + H bei 268, wie erwartet.
  • iv) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,60 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung von Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Voranschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5), und Portionen von Di-tert-butyldicarbonat wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulphat gesättigt war, gegossen und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • b) Synthese eines Lipopeptids, das mit Atenolol funktionalisiert ist
    Figure 01680001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde durch das manuelle Bubbler-Verfahren synthetisiert, ausgehend von Fmoc-geschütztem Rink-Amid-MBHA-Harz, in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren, Palmitinsäure und der Verbindung aus (a). Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde ausgeführt in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, für 2 Stunden. Das rohe Material wurde aus Ether ausgefällt und durch präparative Flüssigkeitschromatographie gereinigt, unter Verwenden eines Gradienten von 70 bis 100% B über 60 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril), bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurde eine Ausbeute von 38 mg reinen Materials erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Minute, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 25 Minuten). Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was M + H bei 1258 ergab, erwartet 1257.
  • c) Synthese von N-[(S)-3-Hexadecylthio-2-methylpropionyl]prolin
  • DIEA (188 μl, 1,10 mmol) wurde zu einer Lösung von 1-Iodhexadecan (176 mg, 0,500 mmol), Captopril (120 mg, 0,0550 mmol) und DBU (165 μl, 1,10 mmol) in Tetrahydrofuran (5 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei 70°C 2 Stunden lang erwärmt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde auf Wasser gegossen, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, und organisches Material wurde in Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO4). Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5) und lyophilisiert, um 105 mg (48%) eines weißen festen Materials zu ergeben. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H-(500 MHz) und 13C-(125 MHz) NMR-Analyse, und weiter charakterisiert durch MALDI-Massenspektrometrie, was ein M – H im negativen Modus bei m/z 440 ergab, wie erwartet.
  • d) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS, ein Lipopeptid, das Atenolol und ein lipophiles Derivat von Captopril für diagnostische und therapeutische Anwendungen enthält
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und den Produkten aus (b) (0,5 mg) und (c) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (b) oder (c) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau der Verbindungen (b) und (c) in die Mikrobläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS, wie folgt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und durch MALDI-MS (ACH-Matrix) analysiert, was M + H-Peaks ergab, die den Strukturen (b) beziehungsweise (c) entsprachen.
  • e) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay getestet, wie im Beispiel 21 detailliert erläutert. Eine allmähliche Akkumulation von Mikrobläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 63 – Gas-gefüllte Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Cholesterin-Derivat von Atenolol für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • a) Synthese von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-hydroxyphenylacetat (4,98 g, 0,030 mol), Epichlorhydrin (23,5 ml, 0,30 mol) und Pyridin (121 μl, 1,5 mmol) wurde bei 85°C 2 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde gekühlt und überschüssiges Epichlorhydrin wurde abdestilliert (Rotationsverdampfer). Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen, mit Salzlösung gewaschen und getrocknet (Na2SO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert. Der dunkle Rückstand wurde chromatographiert (Silica, Hexan/Ethylacetat 7:3), um 2,25 g (34%) eines farblosen Öls zu ergeben. 1H-(300 MHz) und 13C-(75 MHz) NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur.
  • b) Synthese von Methyl-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetat
  • Eine Mischung von Methyl-4-[(2,3-epoxy)propoxy]phenylacetat (2,00 g, 9,00 mmol), Isopropylamin (23 ml, 0,27 mol) und Wasser (1,35 ml, 74,7 mmol) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der ölige Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und getrocknet (Na2SO4). Filtration und Konzentration ergab eine quantitative Ausbeute eines gelben Öls, das im nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H- und 13C-NMR-Analyse.
  • c) Synthese von 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorid
  • Eine Lösung von Methyl 4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetat (563 mg, 2,00 mmol) in 6 M Salzsäure (15 ml) wurde auf 100°C vier Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert (Rotationsverdampfer) und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. 1H- und 13C-NMR-Spektren waren in Übereinstimmung mit der Struktur und MALDI-Massenspektrometrie ergab einen M + H bei 268, wie erwartet.
  • d) Synthese von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäure
  • Eine Lösung des 4-[2-Hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylessigsäurehydrochlorids (2,0 mmol) in Wasser (2 ml) wurde zu einer Lösung von Natriumbicarbonat (0,60 g, 7,2 mmol) in Wasser/Dioxan (2:1, 15 ml) gegeben. Eine Lösung von Di-tert-butyldicarbonat (0,48 g, 2,2 mmol) in Dioxan (5 ml) wurde zugegeben. Das Voranschreiten der Reaktion wurde durch TLC-Analyse überwacht (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5), und Portionen von Di-tert-butyldicarbonat wurden zugegeben, bis die Umwandlung abgeschlossen war. Die Reaktionsmischung wurde auf Wasser, das mit Kaliumhydrogensulfat gesättigt war, gegossen und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und filtriert, um 0,6 g rohes Material zu ergeben. Das Produkt wurde durch Chromatographie gereinigt (Silica, CHCl3/MeOH/AcOH 85:10:5). Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 415 mg (56%), weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H- und 13C-NMR-Analyse bestätigt.
  • e) Synthese von Cholesteryl-N-Boc-β-alaninat
  • DIC (510 μl) wurde zugegeben zu einer Lösung von N-Boc-β-Ala-OH (1,25 g, 6,60 mmol) in Dichlormethan (15 ml) unter einer inerten Atmosphäre. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten lang gerührt und dann in einen Kolben übertragen, der eine Lösung von Cholesterin (1,16 g, 3,00 mmol) und DMAP (367 mg, 3,00 mmol) in Dichlormethan (15 ml) enthielt. Die Reaktionsmischung 2 Stunden lang gerührt und dann auf eine wässrige Lösung von Kaliumhydrogensulfat gegossen. Nach der Phasentrennung wurde die wässrige Phase mit Chloroform extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit wässrigem Kaliumhydrogensulfat und Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO4). Nach der Filtration und dem Verdampfen wurde das rohe Produkt chromatographiert (Silica, Chloroform/Methanol 99:1), um 1,63 g (97%) weißen Feststoff zu ergeben. Die Struktur wurde bestätigt durch 1H-NMR (500 MHz).
  • f) Synthese von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid
  • Eine Lösung der Verbindung aus (a) (279 mg, 0,500 mmol) in 1 M Salzsäure in 1,4-Dioxan (5 ml) wurde auf bei Raumtemperatur vier Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um eine quantitative Ausbeute von Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid zu ergeben. Die Struktur wurde bestätigt durch 1H-NMR (500 MHz)-Analyse und durch MALDI-Massenspektrometrie, was einen M + Na-Peak bei 482 ergab, erwartet 481.
  • g) Synthese von Cholesteryl-N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetyl-β-alaninat
  • Zu einer Lösung von N-Boc-4-[2-hydroxy-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylessigsäure (55 mg, 0,15 mmol) und Cholesteryl-β-alaninathydrochlorid (74 mg, 0,15 mmol) in DMF (5 ml) wurde DIEA (26 ml, 0,15 mmol) gegeben. HOBt (23 mg, 0,15 mmol) und wasserlösliches Carbodiimid (WSC) (29 mg, 0,15 mmol) wurden zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und dann auf Wasser (25 ml) gegossen, das Natriumcarbonat (2,5 g) und Natriumchlorid (4,0 g) enthielt. Ausgefälltes Material wurde in Chloroform extrahiert. Die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet (MgSO4). Nach Filtration und Konzentrieren wurde das rohe Material (132 mg) durch Säulenchromatographie (Silica, Chloroform/Methanol/Essigsäure, 95:4:1) gereinigt. Gesammelte Fraktionen wurden konzentriert, in Eisessig aufgenommen und lyophilisiert. Ausbeute 83 mg (69%), gelb-weißer Feststoff. Die Struktur wurde durch 1H-NMR-Analyse bestätigt.
  • h) Synthese von Cholesteryl-4-(2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)-amino]propoxy]phenylacetyl-β-alaninattrifluoracetat
  • Zu einer Lösung von N-Boc-4-[2-hydroxy-3-[(1-methylethyl)amino]propoxy]phenylacetyl-β-alaninat (40 mg, 0,05 mmol) in trockenem Dichlormethan (4 ml) wurde Trifluoressigsäure (2 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden lang gerührt und dann konzentriert. Das Produkt wurde aus einer Acetonitril/Wasser-Mischung lyophilisiert, um eine quantitative Ausbeute des weißgelben Materials zu ergeben. Das Produkt wurde charakterisiert durch MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei 708 ergab, wie erwartet.
  • i) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Cholesterinderivat von Atenolol für diagnostische und therapeutische Anwendungen
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung von DSPS (4,5 mg) und dem Produkt aus (h) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, wonach die Inhalte ausführlich mit entionisiertem Wasser gewaschen wurden, MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (b) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau der Verbindung aus (h) in die Mikrobläschen wurde bestätigt durch MALDI-Massenspektrometrie.
  • j) In-vitro-Analyse
  • Die Mikrobläschen wurden im in-vitro-Assay getestet, wie im Beispiel 21 detailliert erläutert. Eine allmähliche Akkumulation der Bläschen, die an die Zellen banden, wurde beobachtet.
  • Beispiel 64 – Herstellung von mehrfach-spezifischen Transferrin-Avidin-beschichteten, Gas-gefüllten Mikrobläschen für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von Mikrobläschen, die Vektoren zielausgerichteten/zielausgerichtete Ultraschall/Therapie enthielten
  • a) Synthese eines Thiol-funktionalisierten Lipidmoleküls: Dipalmitoyl-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys-OH
    Figure 01740001
  • Die oben gezeigte Lipidstruktur wurde auf einem automatischen ABI 433A-Peptidsynthetisierer synthetisiert, ausgehend von Fmoc-Cys(Trt)-Wang-Harz, in einem 0,25 mmol-Maßstab unter Verwenden von 1 mmol-Aminosäure-Kartuschen. Alle Aminosäuren und Palmitinsäure wurden unter Verwenden von HBTU- Kopplungschemie voraktiviert. Die gleichzeitige Entfernung des Peptids vom Harz und die Entschützung von Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA ausgeführt, das 5% EDT und 5% H2O enthielt, für zwei Stunden, was eine Ausbeute des rohen Produktes von 250 mg ergab. Eine Reinigung einer aliquoten Menge von 40 mg rohen Materials durch präparative HPLC wurde ausgeführt unter Verwenden eines Gradienten von 90 bis 100% B über 50 Minuten (A = 0,1% TFA/Wasser und B = MeOH) bei einer Fließgeschwindigkeit von 9 ml/Min. Nach der Lyophilisierung wurden 24 mg reines Material erhalten (analytische HPLC, Gradient 70 bis 100% B, wobei B = 0,1% TFA/Acetonitril, A = 0,01% TFA/Wasser: Detektion – UV 214 nm – Produktretentionszeit = 23 Minuten). Eine weitere Produktcharakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie: erwartet M + H bei 1096, gefunden bei 1099.
  • b) Herstellung von Gas-enthaltenden Mikrobläschen, umfassend DSPS, „dotiert" mit einer Thiol-enthaltenden Lipidstruktur
  • DSPS (4,5 mg) und die Lipidstruktur aus (a) oben (0,5 mg) wurden in ein sauberen Fläschchen eingewogen und 0,8 ml einer Lösung, die 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin in Wasser enthielt, wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und durch einen 40 Mikron-Filter filtriert, während sie noch heiß war. Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült. Das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt und dann auf einem Rollentisch über Nacht angeordnet. Die resultierenden Mikrobläschen wurden mehrere Male mit entionisiertem Wasser gewaschen und auf Thiol-Gruppen-Einbau unter Verwenden von Ellmanns Reagenz analysiert.
  • c) Modifikation von Transferrin und Avidin mit Fluorescein-NHS und Sulfo-SMPB
  • Zu einer Mischung von 2 mg Transferrin (Holo, menschlich) und 2 mg Avidin in PBS (1 ml) wurden 0,5 ml DMSO-Lösung gegeben, die 1 mg Sulfo-SMPB und 0,5 mg Fluorescein-NHS enthielt. Die Mischung wurde 45 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und man ließ sie dann durch eine Sephadex 200-Säule unter Verwenden von PBS als Eluenten laufen. Die Proteinfraktion wurde gesammelt und bei 4°C vor der Verwendung gelagert.
  • Mikrobläschen-Konjugation mit modifiziertem Transferrin/Avidin
  • Zu den Thiol-enthaltenden Mikrobläschen aus (b) wurde 1 ml der modifizierten Transferrin/Avidin-Protein Lösung aus (c) gegeben. Nach dem Einstellen des pH der Lösung auf 9 ließ man die Konjugationsreaktion 2 Stunden lang bei Raumtemperatur voranschreiten. Nach ausführlichen Waschen mit entionisiertem Wasser wurden die Mikrobläschen durch einen Coulter-Zähler (81% zwischen 1 und 7 Mikron) und Fluoreszenzmikroskopie (hoch fluoreszente Mikrobläschen wurden beobachtet) analysiert.
  • Beispiel 65 – Gentransfer durch Gas-gefüllte Mikrobläschen
  • Dieses Beispiel ist gerichtet auf die Herstellung von zielausgerichteten Mikrobläschen für Gentransfer.
  • a) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend DSPS und ein Lipopeptid, das mit Poly-L-Lysin beschichtet ist
  • DSPS (4,5 mg) und das Lipopeptid des Beispiels 41 (0,5 mg) wurden in zwei 2 ml-Fläschchen eingewogen. In jedes Fläschchen wurde 0,8 ml Propylenglykol/Glycerin (4%) in Wasser gegeben. Jede Lösung wurde bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt, geschüttelt und dann auf Umgebungstemperatur gekühlt, wonach die Kopfräume wurden mit Perfluorbutan gespült wurden. Die Fläschchen wurden in einem Kappenmischer bei 4450 Schwingungen/Minute 45 Sekunden lang geschüttelt und auf einem Rollentisch 5 Minuten lang angeordnet. Der Inhalt der Fläschchen wurde gemischt und die resultierende Probe wurde durch Zentrifugation bei 2000 Upm 5 Minuten lang gewaschen. Das unten Schwimmende wurde entfernt und dasselbe Volumen destilliertes Wasser wurde zugegeben. Die Waschprozedur wurde einmal wiederholt. Poly-L-Lysin-HBr (20,6 mg) wurde in 2 ml Wasser aufgelöst, dann wurde eine aliquote Menge (0,4 ml) auf 2 ml mit Wasser ergänzt. Zu 1,2 ml der verdünnten Poly-L-Lysin-Lösung wurden 0,12 ml der DSPS-Lipopeptid-Mikrobläschen-Suspension gegeben. Nach der Inkubation wurde überschüssiges Polylysin durch ausführliches Waschen mit Wasser entfernt.
  • b) Transfektion von Zellen
  • Endotheliale Zellen (ECV 304) wurden in 6 Well-Platten zu einer einförmigen subkonfluenten Schicht kultiviert. Eine Transfektionsmischung, bestehend aus 5 μg DNA (einen Enhanced Green Fluorescent Protein-Vektor von CLONTECH) und 50 μl Mikrobläschen-Suspension aus (a) in RPMI-Medium bei einem Endvolumen von 250 μl, wurde hergestellt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen, dann wurde 1 ml vollständiges RPMI-Medium zugegeben. Das Medium wurde aus der Zellkulturschale entfernt und die DNA-Mikrobläschen-Mischung wurde zu den Zellen gegeben. Die Zellen wurden in einem Zellkulturinkubator (37°C) inkubiert.
  • c) Ultraschallbehandlung
  • Nach 15 Minuten der Inkubation wurden ausgewählte Wells kontinuierlichen Ultraschallwellen von 1 MHz, 0,5 W/cm2, 30 Sekunden lang ausgesetzt.
  • d) Inkubation und Untersuchung
  • Die Zellen wurden weiter im Zellkulturinkubator (37°C) annähernd 4,5 Stunden lang inkubiert. Das Medium, das DNA-Mikrobläschen enthielt, wurde dann durch Ansaugen entfernt und 2 ml vollständiges RPMI-Medium wurde zugegeben. Die Zellen wurden 40–70 Stunden lang vor der Untersuchung inkubiert. Das meiste des Mediums wurde dann entfernt und die Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen von Kontrollexperimenten verglichen, bei denen DNA oder DNA-Polylysin zu den Zellen gegeben wurden.
  • Beispiel 66 – Flotation von endothelialen Zellen durch Mikrobläschen mit Vektoren, die spezifisch an die endothelialen Zellen binden
  • Dieses Experiment wurde ausgeführt, um zu zeigen, dass die vorliegende Erfindung für die Trennung von Zellen verwendet werden kann, auf die die Mikrobläschen zielausgerichtet werden. Die menschliche Endothelialzellen-Linie ECV304, erhalten aus einem normalen Nabelschnur-Stamm (ATCC CRL-1998) wurde in Nunc-Kulturkolben (chutney 153732) in RPMI-1640-Medium kultiviert, zu dem L-Glutamin (200 mM), Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml und 10,00 μg/ml) und 10% fötales Kälberserum gegeben. Die Zellen wurden subkultiviert nach einer Trypsinisierung mit einem Split-Verhältnis von 1:5 bis 1:7, wenn die Konfluenz erreicht wurde. 2 Millionen Zellen von trypsinisierten konfluenten Kulturen wurden zu jedem Satz von fünf zentrifugen Röhrchen gegeben. Dann wurden Kontroll-Mikrobläschen oder Mikrobläschen, die an endotheliale Zellen banden, erzeugt wie beschrieben in Beispiel 21 und in Beispiel 38, zu 2, 4, 6, 8 oder 10 Millionen Bläschen pro Röhrchen gegeben. Die Zellen am Boden der Röhrchen nach der Zentrifugation bei 400 g für 5 Minuten wurden mit einem Coulter-Zähler gezählt. Es wurde gefunden, dass die 4 oder mehr Mikrobläschen, die an eine Zelle banden, die Zellen an das obere Ende des Fluids im Zentrifugationsröhrchen brachten. Alle Zellen wurden durch die Mikrobläschen aus Beispiel 38 flotiert, wohingegen ungefähr 50% mit den Mikrobläschen aus Beispiel 21 flotiert wurden.
  • Beispiel 67 – Gas-gefüllte Mikrobläschen aus Distearoylphosphatidylserin, umfassend ein Lipopeptid, das einen Vektor mit einer Affinität für Endothelin-Rezeptoren für zielausgerichtete Ultraschallbildgebung enthielt
  • a) Synthese von 4'-[3,4-Dimethyl-5-isoxazoyl)-sulfamoyl]succinanilsäure
  • Zu einer Lösung von Sulfisoxazol (267 mg, 1,00 mmol) in DMF (10 mg) in DMF (10 ml) wurden Bernsteinsäureanhydrid (1,00 g, 10,0 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (122 mg, 1,00 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 80°C 2 Stunden lang gerührt und dann konzentriert. Der Rückstand wurde in 5%-iger wässriger Natriumbicarbonatlösung aufgenommen und mit Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Lösung wurde mit verdünnter Salzsäure angesäuert und organisches Material wurde in Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde mit verdünnter Salzsäure, Wasser und Salzlösung gewaschen, mit Aktivkohle behandelt und getrocknet (MgSO4). Die Lösung wurde filtriert und konzentriert, um 280 mg (76%) weißen Feststoff zu ergeben. Die Struktur wurde verifiziert durch 1H (300 MHz) und 13C-(75 MHz) NMR-Spektroskopie. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie (ACH-Matrix), was einen M + Na-Peak bei m/z 390 und einen M + H-Peak bei m/z bei 406 ergab, wie erwartet.
  • b) Synthese eines Lipopeptids, das mit Sulfisoxazol funktionalisiert ist
    Figure 01790001
  • Die oben gezeigte Struktur wurde synthetisiert auf einer manuellen Stickstoff-Bubbler-Vorrichtung, ausgehend von Fmoc-beschütztem Rink-Amid-BMHA-Harz in einem 0,125 mmol-Maßstab, unter Verwenden geeigneter Aminosäuren, Palmitinsäure und der Verbindung aus (a). Das Koppeln wurde ausgeführt unter Verwenden von Standard-TBTU/HOBt/DIEA-Protokollen. Gleichzeitiges Entfernen des Peptids vom Harz und Entschützen der Seitenkettenschutzgruppen wurde in TFA, das 5% EDT und 5% Wasser enthielt, 2 Stunden lang ausgeführt. Rohes Material wurde aus Ether ausgefällt. Das Produkt wurde durch analytische HPLC analysiert, Gradient 70 bis 100% B über 20 Minuten, A = 0,1% TFA/Wasser und B = 0,1% TFA/Acetonitril, Fließgeschwindigkeit 1 ml/Min, Detektion UV 214 nm, Retentionszeit 27 Minuten. Eine weitere Charakterisierung wurde ausgeführt unter Verwenden von MALDI-Massenspektrometrie, was M + H bei m/z 1359 ergab, erwartet 1356.
  • c) Herstellung von Gas-gefüllten Mikrobläschen, umfassend die Verbindung aus (b)
  • Eine Lösung von 1,4% Propylenglykol/2,4% Glycerin (1,0 ml) wurde zu einer Mischung aus DSPS (4,5 mg) und dem Produkt aus (b) (0,5 mg) in einem Fläschchen gegeben. Die Mischung wurde 5 Minuten lang beschallt und dann bei 80°C 5 Minuten lang erwärmt (das Fläschchen wurde während des Erwärmens geschüttelt) und gekühlt. Der Kopfraum wurde mit Perfluorbutangas gespült und das Fläschchen wurde in einem Kappenmischer 45 Sekunden lang geschüttelt, gefolgt von ausführlichem Waschen mit entionisiertem Wasser. MALDI-Massenspektrometrie zeigte keinen detektierbaren Gehalt der Verbindung aus (b) in der schließlichen Waschlösung. Der Einbau des Isoxazol-enthaltenden Lipopeptids in die Mikrobläschen wurde bestätigt durch MALDI-MS, wie folgt: ca. 50 μl Mikrobläschen wurden in ein sauberes Fläschchen übertragen, das ca. 100 μl 90%-iges Methanol enthielt. Die Mischung wurde 30 Sekunden lang beschallt und analysiert durch MALDI-MS (ACH-Matrix), was einen M + H-Peak bei m/z 1359 ergab, entsprechend dem Lipopeptid (b).

Claims (34)

  1. Zielausrichtbares diagnostisches und/oder therapeutisch wirksames Mittel, umfassend eine Suspension eines Reporters, umfassend gasgefüllte Mikrobläschen, die durch Monolagen film-bildender oberflächenaktiver Mittel stabilisiert sind, in einer wässrigen Trägermittelflüssigkeit, wobei das Mittel weiter mindestens einen Vektor umfasst.
  2. Mittel nach Anspruch 1, bei dem das Gas Luft, Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid, Wasserstoff, ein inertes Gas, ein Schwefelfluorid, Selen-hexafluorid, einen Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts, ein Keton, ein Ester, einen halogenierten Kohlenwasserstoff niedrigen Molekulargewichts, oder eine Mischung von beliebigen der Vorstehenden umfasst.
  3. Mittel nach Anspruch 2, bei dem das Gas ein perfluoriertes Keton, perfluorierten Ether, oder Perfluorkohlenstoff umfasst.
  4. Mittel nach Anspruch 2, bei dem das Gas Schwefelhexafluorid oder ein Perfluorpropan, Perfluorbutan oder Perfluorpentan umfasst.
  5. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das film-bildende oberflächenaktive Material ein nicht-polymeres und nicht-polymerisierbares wand-bildendes oberflächenaktives Material, ein oberflächenaktives Polymermaterial oder ein Phospholipid umfasst.
  6. Mittel nach Anspruch 5, bei dem mindestens 75% des film-bildenden oberflächenaktiven Materials Phospholipidmoleküle umfasst, die individuell eine Netto-Gesamtladung tragen.
  7. Mittel nach Anspruch 6, bei dem mindestens 75% des film-bildenden oberflächenaktiven Materials eines oder mehrere Phospholipide umfasst, ausgewählt unter Phosphatidylserinen, Phosphatidylglycerolen, Phosphatidylinositolen, Phosphatidsäuren und Cardiolipinen.
  8. Mittel nach Anspruch 7, bei dem mindestens 80% des Phospholipids Phosphatitdylserine umfassen.
  9. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das film-bildende oberflächenaktive Material ein Lipopeptid umfasst.
  10. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Vektor ausgewählt ist unter Antikörpern, Zelladhäsionsmolekülen, Zelladhäsionsmolekül-Rezeptoren, Cytokinen, Wachstumsfaktoren, Peptidhormonen und Stücken davon, Nicht-Peptid-Agonisten/Antagonisten und nicht bioaktiven Bindern von Rezeptoren für Zelladhäsionsmoleküle, Cytokinen, Wachstumsfaktoren und Peptidhormonen, Oligonukleotiden und modifizierten Oligonukleotiden, DNA-bindenden Arzneimitteln, Protease-Substraten/Inhibitoren, Molekülen, die aus kombinatorischen Bibliotheken erzeugt sind und kleinen bioaktiven Molekülen.
  11. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Vektor oder die Vektoren eine Affinität für Ziele mit einer derartigen Stärke besitzen, dass das Mittel mit den Zielen wechselwirkt, aber nicht fest an die Ziele bindet.
  12. Mittel nach Anspruch 11, bei dem der Vektor oder die Vektoren unter Liganden für Zelladhäsionsproteine und Zelladhäsionsproteinen, die entsprechende Liganden an endothelialen Zelloberflächen besitzen, ausgewählt sind.
  13. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Vektor oder die Vektoren derart lokalisiert sind, dass sie nicht einfach dem Ziel ausgesetzt werden.
  14. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Vektor kovalent an den Reporter gekoppelt oder gebunden ist.
  15. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem der Vektor an den Reporter durch elektrostatische Ladungswechselwirkungen gekoppelt oder gebunden ist.
  16. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 13, bei dem der Vektor an den Reporter mittels Avidin-Biotin- und/oder Streptavidin-Biotin-Wechselwirkungen gekoppelt oder gebunden ist.
  17. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, das weiter Einheiten enthält, die radioaktiv oder als Röntgenkontrastmittel, Lichtbildgebungs-Sonden oder Spin-Marker wirksam sind.
  18. Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, weiter umfassend eine therapeutische Verbindung.
  19. Mittel nach Anspruch 18, bei dem die therapeutische Verbindung ein antineoplastisches Mittel, ein Blutprodukt, ein Immunmodulator, ein antifungales Mittel, ein Hormon oder Hormonanalogon, ein Vitamin, ein Enzym, ein antiallergisches Mittel, ein Gewebefaktor-Inhibitor, ein Blutblättchen-Inhibitor, ein Koagulationsproteinziel-Inhibitor, ein Fibrin-Bildungs-Inhibitor, einen Fibrinolyse-Promoter, ein antiangiogenes, zirkulatorisches Arzneimittel, ein Stoffwechselverstärker, ein antituberkuläres Mittel, ein antivirales Mittel, ein Vasodilator, ein Antibiotikum, ein antientzündliches Mittel, ein antiprotozoisches Mittel, ein Antirheumatikum, ein Narkotikum, ein Opiat, ein Herzglycosid, ein neuromuskulärer Blocker, ein Sedativum, ein lokales Anästhetikum, ein allgemeines Anästhetikum oder ein genetisches Material ist.
  20. Mittel nach Anspruch 18 oder 19, bei dem die therapeutische Verbindung durch Disulfidgruppen kovalent an den Reporter gekoppelt oder gebunden ist.
  21. Mittel nach Anspruch 18 oder 19, bei dem eine lipophile oder lipophil derivatisierte therapeutische Verbindung an die Monolagen aus oberflächenaktivem Mittel, die die gasgefüllten Mikrobläschen des Reporters stabilisieren, durch hydrophobe Wechselwirkungen gebunden ist.
  22. Kombinierte Formulierung, umfassend: i) eine erste verabreichbare Zusammensetzung, umfassend einen prä-zielausrichtenden Vektor mit einer Affinität für ein ausgewähltes Ziel; und ii) eine zweite verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Mittel nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Mittel einen Vektor mit einer Affinität für den prä-zielausrichtenden Vektor umfasst.
  23. Kombinierte Formulierung nach Anspruch 22, bei der der prä-zielausrichtende Vektor ein monoklonaler Antikörper ist.
  24. Kombinierte Formulierung, umfassend: i) eine erste verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 21; und ii) eine zweite verabreichbare Zusammensetzung, umfassend eine Substanz, die zum Verdrängen oder Freisetzen des Mittels von seinem Ziel fähig ist.
  25. Kombinierte Formulierung, umfassend: i) eine erste verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Mittel nach Anspruch 20; und ii) eine zweite verabreichbare Zusammensetzung, umfassend ein Reduktionsmittel, das zum reduktiven Spalten der Disulfidbrücken fähig ist, die die therapeutische Verbindung und den Reporter in dem Mittel der ersten verabreichbaren Zusammensetzung koppeln oder verbinden.
  26. Verfahren zur Herstellung eines zielausrichtbaren diagnostischen und/oder therapeutisch wirksamen Mittels nach Anspruch 1, umfassend entweder Koppeln oder Binden mindestens eines Vektors an einen Reporter, der gasgefüllte Mikrobläschen umfasst, die durch Monolagen eines film-bildenden oberflächenaktiven Mittels stabilisiert sind, oder Erzeugen gasgefüllter Reporter-Mikrobläschen unter Verwenden eines film-bildenden oberflächenaktiven Mittels mit mindestens einem daran gebundenen Vektor.
  27. Verfahren nach Anspruch 26, bei dem auch eine therapeutische Verbindung mit dem Reporter kombiniert wird.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, bei dem eine therapeutische Verbindung, die Thiolgruppen enthält, an Thiolgruppen-enthaltende Monolagen aus oberflächenaktiven Mitteln, die die gas-gefüllten Mikrobläschen des Reporters stabilisieren, durch Reaktion unter solchen oxidativen Bedingungen, dass Disulfidgruppen erzeugt werden, gebunden wird.
  29. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Verwendung als Kontrastmittel.
  30. Mittel nach Anspruch 29 zur Verwendung als ein zielausrichtbares Kontrastmittel.
  31. Mittel nach einem der Ansprüche 29 bis 30 zur Verwendung als zielausrichtbares Ultraschall-, Magnetresonanz-, Röntgen-, radiographisches oder Lichtbildgebungs-Kontrastmittel.
  32. Mittel nach einem der Ansprüche 18 bis 21 zur Verwendung in einer therapeutischen Zusammensetzung.
  33. Verfahren für die In-Vitro-Untersuchung der Zielausrichtung durch ein Mittel nach einem Ansprüche 1 bis 21, bei dem Zellen, die ein Ziel exprimieren, fest in einer Flusskammer angeordnet werden, eine Suspension des Mittels in einer Trägermittelflüssigkeit durch die Kammer geleitet wird, und das Binden des Mittels an die Zellen untersucht wird.
  34. Verfahren nach Anspruch 33, bei dem die Strömungsgeschwindigkeit der Trägermittelflüssigkeit geregelt wird, um Schergeschwindigkeiten zu simulieren, die in vivo angetroffen werden.
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