DE69734060T2 - Zubereitungen und verfahren zur behandlung oder prävention von krankheiten der körperpassagewege - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Hohlorganen („body passageways") und spezieller auf Zusammensetzungen, die therapeutische Agenzien umfassen, die an die äußeren Wände von Hohlorganen abgegeben werden können.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Es gibt viele Hohlorgane im Körper, die den Durchfluss essentieller Stoffe ermöglichen. Diese schließen zum Beispiel Arterien und Venen, die Speiseröhre, Magen, Dünn- und Dickdarm, Gallenwege, Harnleiter, Blase, Harnröhre, nasale Passagewege, Luftröhre und andere Luftwege und den männlichen und weiblichen Genitaltrakt ein. Eine Verletzung, verschiedene chirurgische Behandlungsmethoden oder eine Erkrankung können zur Verengung, Schwächung und/oder Verlegung solcher Hohlorgane führen, was gravierende Komplikationen und/oder auch den Tod zur Folge hat.
  • Zum Beispiel können viele Arten von Tumoren (sowohl gutartige als auch bösartige) zur Schädigung der Wand eines Hohlorgans oder zur Verlegung des Lumens führen und damit den Durchfluss von Stoffen durch das Hohlorgan verlangsamen oder verhindern. Es wurde geschätzt, dass es allein im Jahr 1996 in den Vereinigten Staaten über 11.200 Todesfälle aufgrund von Speiseröhrenkrebs geben würde, über 51.000 Todesfälle aufgrund von Dick- und Dünndarmkrebs und nahezu 17.000 Todesfälle aufgrund von Enddarmkrebs. Verlegungen von Hohlorganen, die von Krebs befallen sind, sind nicht nur an sich lebensbedrohlich, sie schränken auch die Lebensqualität des Patienten ein.
  • Die primäre Therapie für die Mehrzahl der Tumore, die eine neoplastische Verlegung verursachen, besteht in der chirurgischen Entfernung und/oder der Chemotherapie, der Strahlentherapie oder der Lasertherapie. Unglücklicherweise ist ein Tumor zu dem Zeitpunkt, an dem er eine Verlegung eines Hohlorgans verursacht, häufig inoperabel und wird im Allgemeinen nicht auf traditionelle Therapien ansprechen. Ein Versuch zur Lö sung dieses Problems bestand darin, endoluminale Stents einzusetzen. In Kürze sind Stents Vorrichtungen, die in das Lumen eines Hohlorgans eingebracht werden, um ein Hohlorgan, das durch einen Tumor oder andere Gewebe oder Substanzen blockiert wurde, physikalisch offen zu halten. Typische Beispiele von häufig eingesetzten Stents schließen den Wallstent, Stecker-Stent, Gianturco-Stent und Palmaz-Stent ein (siehe z.B. U.S. Patente Nr. 5.102.417, 5.195.984, 5.176.626, 5.147.370, 5.141.516, 4.776.337). Ein erheblicher Nachteil bei der Verwendung von Stents bei neoplastischer Blockierung ist jedoch, dass der Tumor oft durch die Zwischenräume des Stents in das Lumen hinein wachsen kann. Zusätzlich kann die Anwesenheit eines Stents im Lumen das Einwachsen von reaktivem oder inflammatorischem Gewebe (z.B. Blutgefäße, Fibroblasten oder weiße Blutkörperchen) auf die Oberfläche des Stents hervorrufen. Wenn dieses Einwachsen (bestehend aus Tumorzellen und/oder inflammatorischen Zellen) die innere Oberfläche des Stents erreicht und das Lumen beeinträchtigt, ist eine erneute Blockierung des Hohlorgans, zu dessen Korrektur der Stent eingesetzt wurde, das Ergebnis.
  • Andere Erkrankungen, die, obwohl sie nicht neoplastisch sind, dennoch eine Proliferation mit sich bringen, können gleichermaßen Hohlorgane blockieren. Zum Beispiel ist die Verengung der prostatischen Harnröhre aufgrund einer benignen Prostatahyperplasie ein ernstes Problem, das 60% aller Männer, die älter als 60 Jahre sind, betrifft und 100% aller Männer, die älter als 80 Jahre sind. Die derzeitigen pharmakologischen Therapien wie zum Beispiel 5-Alphareduktase-Hemmer (z.B. Finasterid) oder alphaadrenerge Blocker (z.B. Terazosin) sind im Allgemeinen nur bei einer begrenzten Patientenpopulation wirksam.
  • Darüber hinaus resultieren aus den chirurgischen Verfahren, die durchgeführt werden können (z.B. transurethrale Resektion der Prostata (TURP), offene Prostatektomie oder endo-urologische Verfahren wie zum Beispiel Laser-Prostatektomie, Verwendung von Mikrowellen, Hypothermie, Kryochirurgie oder Stent-Implantation), typischerweise zahlreiche Komplikationen wie zum Beispiel Blutung, Infektion, Inkontinenz, Impotenz und rezidivierende Erkrankung.
  • Zusätzlich zu neoplastischen oder proliferativen Erkrankungen können andere Krankheiten wie zum Beispiel eine Gefäßerkrankung zur Verengung, Schwächung und/oder Verlegung von Hohlorganen führen. Nach Schätzungen von 1993 (Quelle: Homepage der U.S. Heart and Stroke Foundation) hatten über 60 Millionen Amerikaner eine oder mehrere Formen einer Herzkreislauferkrankung. Im selben Jahr forderten diese Krankheiten 954.138 Menschenleben (41% aller Todesfälle in den Vereinigten Staaten).
  • Die Ballonangioplastie (mit oder ohne Stent-Implantation) ist eine der am verbreitetsten eingesetzten Behandlungsmethoden für eine Gefäßerkrankung; es sind auch andere Optionen wie zum Beispiel die Laser-Angioplastie verfügbar. Obwohl dies in vielen Fällen einer gravierenden Gefäßverengung die Therapie der Wahl ist, hat etwa ein Drittel der Patienten, die sich einer Ballonangioplastie unterziehen (Quelle: Homepage der Heart and Stroke Foundation), eine erneute Verengung (Restenose) der behandelten Arterien innerhalb von 6 Monaten nach der ursprünglichen Maßnahme, oft ernst genug, um weitere Interventionen erforderlich zu machen.
  • Solche Gefäßerkrankungen (einschließlich zum Beispiel Restenose) sind zumindest teilweise auf eine Verdickung der Intima, bedingt durch die Einwanderung von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC), die Proliferation der VSMC und die Ablagerung von extrazellulärer Matrix, zurückzuführen. In Kürze agiert das Gefäßendothel als eine nicht-thrombogene Oberfläche, über die das Blut gleichmäßig fließen kann, und als eine Schranke, welche die Blutkomponenten von den Geweben, die die Gefäßwand umfassen, trennt. Endothelzellen setzen auch Heparinsulfat, Prostacyclin, EDRF und andere Faktoren frei, welche die Adhäsion von Plättchen und weißen Blutkörperchen, die Kontraktion der VSMC, das Einwandern von VSMC und die Proliferation von VSCM hemmen. Jeglicher Verlust und jegliche Schädigung an Endothel, wie es zum Beispiel bei einer Ballonangioplastie, Atherektomie oder Stent-Implantation auftritt, kann zu einer Plättchen-Adhäsion, einer Plättchen-Aggregation und zur Thrombusbildung führen. Aktivierte Plättchen können Substanzen freisetzen, die eine Vasokonstriktion auslösen (Serotonin und Thromboxan) und/oder das Einwandern und die Proliferation von VSMC fördern (PDGF, epidermaler Wachstumsfaktor, TGF-β und Heparinase). Gewebsfaktoren, die von den Arterien freigesetzt werden, stimulieren die Bildung von Gerinnseln, was zu einer Fibrin-Matrix führt, in die glatte Muskelzellen einwandern und proliferieren können.
  • Diese Kaskade von Ereignissen führt zur Transformation von glatten Gefäßmuskelzellen von einem kontraktilen zu einem sekretorischen Phänotyp. Von Angioplastie verursachte Zelllyse und Matrixdestruktion führt zu einer lokalen Freisetzung von basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), der wiederum die VSMC-Proliferation direkt und indirekt durch die Induktion der PDGF-Produktion stimuliert. VSMC-Proliferation wird auch durch von Plättchen freisetzten EGF und Insulin-Wachstumsfaktor 1 stimuliert.
  • Glatte Gefäßmuskelzellen werden auch dazu angeregt, in die Media und Intima des Gefäßes einzuwandern. Dies wird durch die Freisetzung und Aktivierung von Matrix-Metalloproteasen ermöglicht, die für die VSMC einen Weg durch die extrazelluläre Matrix und die innere elastische Schicht der Gefäßwand bahnen. Nach dem Einwandern und der Proliferation lagern die glatten Gefäßmuskelzellen dann eine extrazelluläre Matrix ab, die aus Glykosaminoglykanen, Elastin und Kollagen besteht, was den größten Teil der Verdickung der Intima umfasst. Ein wesentlicher Teil des Prozesses der Restenosierung kann auf eine Umgestaltung der Gefäßwand zurückzuführen sein, die zu Änderungen der Gesamtgröße der Arterie führt, wovon zumindest ein Teil durch die Proliferation innerhalb der Adventitia (zusätzlich zur Media) bedingt ist. Das Nettoergebnis dieser Abläufe ist ein erneutes Auftreten der Verengung der Gefäßwand, die oft schwerwiegend genug ist, um eine erneute Intervention zu erfordern.
  • Zusammenfassend wird nahezu jede energische Manipulation im Lumen eines Blutgefäßes seine Endothelschicht beschädigen oder denudieren. Somit bleiben Behandlungsoptionen für Gefäßerkrankungen selbst und für Restenosierungen nach therapeutischen Interventionen Probleme in Hinblick auf die Langzeitergebnisse für solche Erkrankungen.
  • Es gibt zusätzlich zu neoplastischen Obstruktionen und Gefäßerkrankungen auch etliche akute und chronische entzündliche Erkrankungen, die zur Verlegung von Körperpassagen führen. Diese schließen zum Beispiel Vaskulitis, Erkrankungen des Gastrointesti naltraktes (z.B. Morbus Crohn, Colitis ulcerosa) und Erkrankungen der Atemwege (z.B. Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung) ein.
  • Jede dieser Erkrankungen kann mit unterschiedlichen Erfolgsraten mit Medikamenten wie zum Beispiel Entzündungshemmern oder Immunsuppressiva behandelt werden. Derzeitige Behandlungsregime bewirken jedoch oft keine Verlangsamung des Fortschreitens der Erkrankung und können zu systemischen toxischen Effekten und unerwünschten Nebenwirkungen führen. Es können auch chirurgische Verfahren anstelle von oder zusätzlich zu medikamentösen Therapien eingesetzt werden. Solche chirurgischen Verfahren haben aber eine hohe Rate von Lokalrezidiven aufgrund von Narbenbildung und können unter bestimmten Umständen (z.B. durch die Verwendung von Ballonkathetern) zu einem gutartigen, reaktiven übermäßigen Wachstum führen.
  • Andere Erkrankungen, die auch Hohlorgane verlegen können, schließen Infektionskrankheiten ein. In Kürze gibt es etliche akute und chronische infektiöse Prozesse, die zur Obstruktion von Hohlorganen führen können, einschließlich zum Beispiel Urethritis, Prostatitis und andere Erkrankungen des männlichen Genitaltrakts, verschiedene Erkrankungen des weiblichen Genitaltrakts, Zystitis und Urethritis (Erkrankungen des Harntrakts), chronische Bronchitis, Tuberkulose und andere Infektionen durch Mykobakterien und andere respiratorische Probleme und bestimmte kardiovaskuläre Erkrankungen.
  • Solche Erkrankungen werden derzeit entweder mit einer Vielzahl von verschiedenen medikamentösen Therapien und/oder mit chirurgischen Verfahren behandelt. Jedoch weisen, wie oben erwähnt, solche medikamentösen Therapien die Problematik von assoziierten systemischen toxischen Effekten auf, die zu unerwünschten Nebenwirkungen führen können. Weiterhin können, wie oben erwähnt, chirurgische Verfahren aufgrund von Narbenbildung zu Lokalrezidiven führen und können bei bestimmten Verfahren (z.B. Implantation kommerziell verfügbarer Stents) ein gutartiges, reaktives, übermäßiges Wachstum zur Folge haben.
  • Die vorhandenen Behandlungsmöglichkeiten für die obigen Krankheiten und Erkrankungen teilen zum größten Teil dieselben Einschränkungen. Die Verwendung therapeutischer Agenzien hat nicht zu einer Heilung dieser Erkrankungen geführt und immer, wenn eine Intervention zur Behandlung der Erkrankungen eingesetzt wird, besteht für den Patienten ein Risiko als Resultat der Reaktion des Körpers auf die Intervention. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen und Verfahren bereit, die zur Behandlung dieser oben im Allgemeinen behandelten Erkrankungen und Krankheiten geeignet sind. Diese Zusammensetzungen und Verfahren gehen auf die mit den vorhandenen Verfahren verbundenen Probleme ein, bieten im Vergleich mit den vorhandenen Verfahren wesentliche Vorteile und bieten zusätzlich weitere, ähnliche Vorzüge.
  • WOA/9319739 bezieht sich auf polymere Träger für Medikamente. USA/3797485 bezieht sich auf die Abgabe von Medikamenten in zirkulierendes Blut.
  • Reimer Riessen et al., J Am Coll Cardiol. Vol. 23, Nr. 5, 1994 1234–1244 ist eine Übersichtsarbeit über Mechanismen der Abgabe von Medikamenten.
  • WOA/9503036 bezieht sich auf die Verwendung von Paclitaxel zur Behandlung von Restenosen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Paclitaxel oder einem Analogon oder Derivat davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Hohlorganen oder von Erkrankungen, die mit der Verlegung oder Verengung von Hohlorganen verbunden sind, wobei das Medikament an einen äußeren Teil des besagten Hohlorgans abgegeben werden soll.
  • Weitere Ausführungsformen der Erfindung werden in den Ansprüchen beschrieben.
  • Die Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Hohlorganen, wofür die Erfindung dienlich ist, umfassen den Schritt, den therapeutischen Wirkstoff an die glatten Muskelzellen des besagten Hohlorgans über die Adventitia abzugeben. In dem die therapeutische Verbindung lokal an die Stelle der Erkrankung abgegeben wird, können systemische und unerwünschte Nebenwirkungen vermieden werden und die Gesamtdosierungen können möglicherweise verringert werden. Eine quadrantenweise oder ringförmige Abgabe um das erkrankte Hohlorgan vermeidet auch viele der Nachteile einer endoluminalen Manipulation, einschließlich einer Schädigung der Endothelschicht des Gewebes. Zum Beispiel kann eine Schädigung des Endothels zu einer Thrombose führen, zu Änderungen im laminaren Flussverhalten und/oder zu einer Fremdkörperreaktion auf eine endoluminale Vorrichtung, von denen jede einzelne die Kaskade der Restenosierung in Gang setzen kann. Im Falle einer Erkrankung der Prostata kann die Vermeidung von Manipulationen mit Instrumenten in der Harnröhre die Wahrscheinlichkeit von Strikturen vermindern und Kontinenz und Potenz erhalten.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können die therapeutischen Wirkstoffe weiterhin ein Polymer umfassen, wie zum Beispiel Poly(ethylenvinylacetat) (40% quervernetzt), Copolymere von Milchsäure und Glycolsäure, Poly(caprolacton), Poly(milchsäure), Copolymere von Poly(milchsäure) und Poly(caprolacton), Gelatine, Hyaluronsäure, Kollagen-Matrices und Albumin. Andere Träger (z.B. Liposomen) können gleichermaßen dazu eingesetzt werden, einen oder mehrere therapeutische Wirkstoffe aufzunehmen und/oder abzugeben.
  • Die therapeutischen Wirkstoffe können eingesetzt werden, um eine Vielzahl von Krankheiten zu behandeln oder zu verhindern, einschließlich zum Beispiel Gefäßkrankheiten, neoplastische Obstruktionen, Entzündungskrankheiten und infektiöse Erkrankungen. Typische Hohlorgane, die behandelt werden können, schließen zum Beispiel Arterien, die Speiseröhre, den Magen, das Duodenum, den Dünndarm, den Dickdarm, Gallenwege, den Harnleiter, die Blase, die Harnröhre, die Prostata, Tränengänge, die Luftröhre, Bronchien, Bronchiolen, nasale Luftwege, Eustachische Röhren, den äußeren Gehörgang, Uterus und Eileiter ein.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der therapeutische Wirkstoff einer Arterie durch direkte Injektion über eine äußere Wand der Arterie in die Adventitia zugeführt.
  • Lediglich zu Illustrationszwecken sind bestimmte Ausführungsformen, für die die Erfindung von Nutzen ist, Verfahren zur Behandlung von Gefäßkrankheiten (z.B. Stenose), von gastrointestinalen Erkrankungen, von Erkrankungen des Urogenitaltrakts (z.B. benigne Prostatahyperplasie oder Prostatakrebs) und von Lungenkrankheiten (spezifische Beispiele von allen oben genannten werden unten ausführlich behandelt) durch die Verabreichung von Paclitaxel oder Analoga oder Derivaten davon auf Hohlorgane, die von der Erkrankung betroffen sind.
  • Diese und andere Gesichtspunkte der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung und die beigefügten Abbildungen klar werden.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Opsonierung polymerer Mikrosphären mit Plasma auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (20 mg/ml Mikrosphären in 0,5 ml Zellen (Konzentration 5 × 106 Zellen/ml)) auf PCL-Mikrosphären zeigt.
  • 2 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma +/–2% Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PCL-Mikrosphären zeigt.
  • 3 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma +/–2% Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PMMA-Mikrosphären zeigt.
  • 4 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma +/–2% Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PLA-Mikrosphären zeigt.
  • 5 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit Plasma +/–2% Pluronic F127 auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf EVA:PLA-Mikrosphären zeigt.
  • 6 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2 mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PCL-Mikrosphären zeigt.
  • 7 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2 mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PMMA-Mikrosphären zeigt.
  • 8 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2 mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf PVA-Mikrosphären zeigt.
  • 9 ist ein Diagramm, das die Auswirkung der Vorbeschichtung mit IgG (2 mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend mit IgG (2 mg/ml) auf die Chemilumineszenz-Reaktion Neutrophiler (5 × 106 Zellen/ml) auf EVA:PLA-Mikrosphären zeigt.
  • 10A ist ein Diagramm, das die Auswirkung des EVA:PLA Polymer-Mischungsverhältnisses auf die Aggregation von Mikrosphären zeigt. 10B ist eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, welche die Größe "kleiner" Mikrosphären zeigt. 10C (die eine Ausschnittvergrößerung – mit "10C-inset" gekennzeichnet – enthält) ist eine rasterelektronenmikroskopische Aufnahme, welche die Größe "großer" Mikrosphären zeigt. 10D ist ein Diagramm, das den zeitlichen Verlauf der in vitro Paclitaxel-Freisetzung aus mit 0,6% (Gew./Vol.) Paclitaxel beladenen Mikrosphären einer 50:50 EVA:PLA Polymer-Mischung in Phosphat-gepufferte Salzlösung (pH 7,4) bei 37°C darstellt. Offene Kreise sind "kleine" Mikrosphären und geschlossene Kreise sind "große" Mikrosphären. 10E ist eine Photographie einer CAM, welche die Resultate der Paclitaxel-Freisetzung durch Mikrosphären ("MS") zeigt. 10F ist eine Photographie ähnlich wie 10E, aber mit einer höheren Vergrößerug.
  • 11A ist ein Diagramm, das die Profile der Freisetzungsraten aus Polycaprolacton-Mikrosphären, die 1%, 2%, 5% oder 10% Paclitaxel enthalten, in Phosphat-gepufferte Salzlösung bei 37°C zeigt. 11B ist eine Photographie, die eine mit Kontroll-Mikrosphären behandelte CAM zeigt. 11C ist eine Photographie, die eine CAM zeigt, die mit Mikrosphären, welche mit 5% Paclitaxel beladen wurden, behandelt wurde.
  • Die 12A beziehungsweise 12B sind zwei Diagramme, die die Freisetzung von Paclitaxel aus EVA Filmen und den Prozentsatz des in denselben Filmen verbleibenden Paclitaxels über die Zeit zeigen. 12C ist ein Diagramm, das die Quellung von EVA/F127 Filmen ohne Paclitaxel über die Zeit zeigt. 12D ist ein Diagramm, das die Quellung von EVA/Span 80 Filmen ohne Paclitaxel über die Zeit zeigt. 12E ist ein Diagramm, das Spannungs-Dehnungs-Kurven für verschiedene EVA/F127 Mischungen zeigt.
  • Die 13A und 13B sind zwei Diagramme, die den Schmelzpunkt von PCL/MePEG-Polymer-Mischungen als Funktion des Prozentanteils von MePEG in der Formulierung (13A) und den Prozentsatz der zusätzlichen Zeit, die benötigt wird, damit sich PCL-Paste ausgehend von 60°C verfestigt, als Funktion der MePEG-Menge in der Formulierung (13B) zeigen. 13C ist ein Diagramm, das die Weichheit verschiedener PCL/MePEG-Polymer-Mischungen zeigt. 13D ist ein Diagramm, das für Polymer-Mischungen mit verschiedenen MePEG-Konzentrationen die prozentuale Gewichtsänderung über die Zeit zeigt. 13E ist ein Diagramm, das die Rate der Freisetzung von Paclitaxel aus verschiedenen Polymer-Mischungen, die mit 1% Paclitaxel beladen sind, über die Zeit zeigt. Die 13F und 13G sind Diagramme, die Auswirkungen verschiedener Paclitaxel-Anteile auf die Gesamtmenge des aus einer 20% MePEG/PCL-Mischung freigesetzten Paclitaxels zeigen. 13H ist ein Diagramm, das die Auswirkungen von MePEG auf die Reißfestigkeit eines MePEG/PCL-Polymers zeigt.
  • 14 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von Paclitaxel aus verschiedenen polymeren Formulierungen zeigt.
  • 15 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von Paclitaxel aus PCL-Pasten in PBS bei 37°C über den Zeitverlauf zeigt. Die PCL-Pasten enthalten Mikropartikel aus Paclitaxel und verschiedenen Zusätzen, die unter Verwendung der Maschengröße #140 hergestellt wurden. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben dar.
  • 16 ist ein Diagramm, das die Zeitverläufe der Freisetzung von Paclitaxel aus Pasten aus Paclitaxel, Gelatine und PCL in PBS bei 37°C zeigt. Dieses Diagramm zeigt die Auswirkungen der Gelatine-Konzentration (Maschengröße #140) und der Größe der Mikropartikel aus Paclitaxel und Gelatine (1:1), die unter Verwendung der Maschengröße #140 oder der Maschengröße #60 hergestellt wurden. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben dar.
  • Die 17A und 17B sind Diagramme, welche die Auswirkungen von Zusätzen (17A; Maschengröße #140) und der Größe der Mikropartikel (17B; Maschengröße #140 oder #60) und des Anteils des Zusatzstoffes (Maschengröße #140) auf das Quellungsverhalten von PCL-Pasten, die 20% Paclitaxel enthalten, nach Suspension in destilliertem Wasser bei 37°C zeigen. Die Messungen für die Paste, die mit 270 μm-Mikropartikeln in Paclitaxel und Gelatine hergestellt worden war, und für die Paste, die 30% Gelatine enthielt, wurden nach 4 Stunden aufgrund des Aufbrechens der Matrix abgebrochen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 3 Proben dar.
  • Die 18A, 18B, 18C und 18D sind typische rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Pasten aus Paclitaxel, Gelatine und PCL (20:20:60) vor (18A) und nach (18B) dem Suspendieren in destilliertem Wasser bei 37°C für 6 Stunden. Die Mikroaufnahmen 18C und 18D sind höhere Vergrößerungen von 18B, welche die enge Verbindung von Paclitaxel (stabförmig) und der Gelatine-Matrx zeigen.
  • Die 19A und 19B sind typische mikroskopische Aufnahmen von CAM, die mit Pasten aus Gelatine und PCL (19A) und aus Paclitaxel, Gelatine und PCL (20:20:60; 19B) behandelt wurden und gefäßfreie Zonen in der mit Paclitaxel behandelten CAM zeigen.
  • 20 ist eine Tabelle, welche die Auswirkung einer um den Tumor herum erfolgenden Injektion einer Paste aus Paclitaxel, Gelatine und PCL in Mäuse mit gesicherten Tumoren zeigt.
  • 21 ist eine Tabelle, welche die Schmelztemperatur, die Enthalpie, das Molekulargewicht, die Polydispersität und die intrinsische Viskosität von PDLLA-PEG-PDLLA-Zusammensetzungen zeigt.
  • 22 ist ein Diagramm, das DSC-Thermogramme von PDLLA-PEG-PDLLA und von PEG zeigt. Die Aufheizgeschwindigkeit betrug 10°C/min. Schmelzpunkte und Enthalpien siehe 21.
  • 23 ist ein Diagramm, das die kumulative Freisetzung von Paclitaxel aus mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C zeigt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 4 Proben dar. Bei Zylindern mit 40% PEG wurde infolge von Auflösung nach 4 Tagen abgebrochen.
  • Die 24A, 24B und 24C sind Diagramme, welche die Veränderungen der Dimensionen Länge (A), Durchmesser (B) und Nassgewicht (C) von mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern während der in vitro Freisetzung von Paclitaxel bei 37°C zeigen.
  • 25 ist ein Diagramm, das Gelpermeations-Chromatographien von mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern (20% PEG, 1 mm Durchmesser) während der Freisetzung in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C zeigt.
  • 26 ist eine Tabelle, die den Verlust an Masse und die Veränderungen der Polymer-Zusammensetzung von PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern (beladen mit 20% Paclitaxel) während der Freisetzung in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C zeigt.
  • Die 27A, 27B, 27C und 27D sind SEM von getrockneten PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern (beladen mit 20% Paclitaxel, 1 mm im Durchmesser) vor und während der Freisetzung von Paclitaxel. A: 20% PEG, Tag 0; B: 30% PEG, Tag 0; C: 20% PEG, Tag 69; D: 30% PEG, Tag 69.
  • 28 ist ein Diagramm, das die kumulative Freisetzung von Paclitaxel aus mit 20% Paclitaxel beladenen PDLLA:PCL-Mischungen und PCL in PBS-Albumin-Puffer bei 37°C zeigt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von 4 Proben dar.
  • 29 ist eine Tabelle, welche die Wirksamkeit von mit Paclitaxel beladenen Formulierungen einer chirurgischen Paste, die lokal auf subcutane Tumore in Mäusen appliziert wird, zeigt.
  • 30 ist ein Diagramm, das die Auswirkungen einer Bestrahlung auf die Freisetzung von Paclitaxel zeigt.
  • 31 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für Kontroll-Mikrosphären (PLLA:GA – 85:15) zeigt.
  • 32 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für mit 20% Paclitaxel beladene Mikrosphären (PLLA:GA – 85:15) zeigt.
  • 33 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für Kontroll-Mikrosphären (PLLA:GA – 85-15) zeigt.
  • 34 ist ein Diagramm, das den Bereich der Partikelgrößen für mit 20% Paclitaxel beladene Mikrosphären (PLLA:GA – 85-15) zeigt.
  • Die 35A, 35B und 35C sind Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene Verhältnisse von PLLA und GA zeigen.
  • Die 36A und 36B sind Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene Verhältnisse von PLLA und GA zeigen.
  • Die 37A, 37B und 37C sind Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene Verhältnisse von PLLA und GA zeigen.
  • Die 38A und 38B sind Diagramme, die den Bereich der Partikelgrößen für verschiedene Verhältnisse von PLLA und GA zeigen.
  • 39 ist eine Tabelle, welche die Molekulargewichte, CMC und die maximalen Beladungen mit Paclitaxel von ausgewählten Diblock-Copolymeren zeigt.
  • Die 40A und 40B sind Diagramme, welche die Fähigkeit der Copolymere und von Cremophor EL, Paclitaxel-Kristalle in Wasser (37°C) löslich zu machen, zeigen. 40A; Wirkung der Konzentration des Copolymers auf Cremophor (20 Stunden Inkubation); 40B; Wirkung der Zeit (Konzentration von Copolymer oder Cremophor 0,5%).
  • Die 41A und 41B sind Diagramme, welche die Trübung (UV-vis-Absorption bei 450 nm) von mizellenhaltigen Paclitaxel-Lösungen bei Raumtemperatur (22°C) zeigen. Die Paclitaxel-Konzentration war 2 mg/ml in Wasser. Die Beladung mit Paclitaxel betrug 10% außer MePEG 5000-30/70, wo die Beladung 5% war.
  • 42 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von Paclitaxel aus Paclitaxel-Nylon-Mikrokapseln zeigt.
  • 43A ist ein Diagramm, das die Auswirkung von Paclitaxel/PCL auf das Tumorwachstum zeigt. Die 43B und 43C sind zwei Photographien, welche die Auswirkungen von Kontroll-Thermopaste und von mit 10% und mit 20% Paclitaxel beladener Thermopaste auf das Tumorwachstum zeigen.
  • 44 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung von Mikrosphären nach Anzahl (5% Poly(ethylenvinylacetat) mit 10 mg Natrium-Suramin in 5% PVA) zeigt.
  • 45 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung von Mikrosphären nach Gewicht (5% Poly(ethylenvinylacetat) mit 10 mg Natrium-Suramin in 5% PVA) zeigt.
  • 46 ist ein Diagramm, welches das Gewicht der Verkapselung von Natrium-Suramin in 50 mg Poly(ethylenvinylacetat) zeigt.
  • 47 ist ein Diagramm, das den Prozentsatz der Verkapselung von Natrium-Suramin in 50 mg Poly(ethylenvinylacetat) zeigt.
  • 48 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung nach Gewicht von 5% ELVAX-Mikrosphären, die 10 mg Natrium-Suramin enthalten, hergestellt in 5% PVA mit 10% NaCl, zeigt.
  • 49 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung nach Gewicht von 5% Mikrosphären, die 10 mg Natrium-Suramin enthalten, hergestellt in 5% PVA mit 10% NaCl, zeigt.
  • 50 ist ein Balkendiagramm, das die Größenverteilung nach Anzahl von 5% Mikrosphären, die 10 mg Natrium-Suramin enthalten, hergestellt in 5% PVA mit 10% NaCl, zeigt.
  • 51A ist eine Photographie von Suramin und Cortisonacetat auf einer CAM (Vergrößerung = 8×). In Kürze zeigt dieses Bild eine gefäßfreie Zone, die mit 20 μg Suramin und 70 μg Cortisonacetat in 0,5% Methylcellulose behandelt wurde. Man beachte die Blutgefäße in der Peripherie der gefäßfreien Zone, die von der Arzneimittelquelle weg abgelenkt sind. 51B ist eine Photographie, die den Gefäßausschnitt der betroffenen Region bei höherer Vergrößerung (Vergrößerung = 20×) zeigt. Man beachte die gefäßfreien Bereiche und den typischen "Abbieg-Effekt" der Blutgefäße, die an die gefäßfreie Zone angrenzen.
  • Die 52A, B, C, D und E zeigen die Wirkung der Freisetzung von MTX über die Zeit.
  • 53 ist eine Photographie von mit 10% Methotrexat beladenen Mikrosphären, die aus PLA:GA (50:50), inhärente Viskosität "IV" = 0,78, hergestellt sind.
  • 54 ist ein Diagramm, das die Freisetzung aus mit 10% Vanadylsulfat beladenem PCL zeigt.
  • 55 ist eine Photographie von Mikrosphären aus Hyaluronsäure, die Vanadiumsulfat enthalten.
  • 56 ist ein Diagramm, das die Freisetzung von organischem Vanadat aus PCL darstellt. 56B zeigt den Prozentsatz von organischem Vanadat, der über den Zeitverlauf zurückbleibt.
  • 57 ist eine Photographie, die Mikrosphären aus Poly(D,L)milchsäure zeigen, welche organisches Vanadat enthalten.
  • Die 58A und 58B sind Diagramme, die den Zeitverlauf der Freisetzung von BMOV aus PCL (150 mg Scheiben) zeigen. (A) μg freigesetztes Arzneimittel oder (B)% des in der Scheibe verbleibenden Arzneimittels. Der anfängliche BMOV-Gehalt in PCL ist angegeben mit (o) 5%; (•) 10%; (Δ) 15%; (
    Figure 00160001
    ) 20%; ( ) 30% und (∇) 35%.
  • Die 59A und 59B sind Diagramme, die den Zeitverlauf der Freisetzung von BMOV aus 150 mg Scheiben von PCL:MEPEG (80:20, Gew./Gew.) zeigen, angegeben als: (A) μg freigesetztes Arzneimittel oder (B)% des in der Scheibe verbleibenden Arzneimittels. Der anfängliche BMOV-Gehalt in PCL:MEPEG ist angegeben mit (O) 5%; (•) 10%; (Δ) 15%; (
    Figure 00160002
    ) 20%.
  • Die 60A, 60B und 60C sind rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von (60A: oben) BMOV-Kristallen; (60B: Mitte) Oberflächenmorphologie der PCL-Scheibe mit 20% BMOV zu Beginn der Untersuchung zur Arzneimittelfreisetzung und (60C: un ten) Oberflächenmorphologie der PCL-Scheibe mit 20% BMOV am Ende der Untersuchung zur Arzneimittelfreisetzung (72 Tage in PBS).
  • Die 61A und 61B sind zwei Diagramme, welche die Auswirkung einer Erhöhung der Konzentration des BMOV auf das Überleben der Zellen unter Verwendung einer Einwirkzeit des BMOV auf die Zellen von einer Stunde (61A) oder einer kontinuierlichen BMOV-Einwirkung (61B) zeigen. Die Zellen werden bezeichnet mit: (o) HAT-29 Colonzellen; (•) MCF-7 Brustzellen; (Δ) Skmes-1 nicht kleinzellige Lungenzellen und (
    Figure 00170001
    ) normale Knochenmarkzellen.
  • 62 ist eine Tabelle, welche die Auswirkungen von mit BMOV beladener Paste auf die Gewichte von MDAY-D2 Tumoren, die in Mäusen angezogen wurden, zeigt. In Kürze wurde PCL-Paste (150 mg) mit entweder 25%, 30% oder 35% BMOV Mäusen, die MDAY-2 Tumore trugen, subcutan injiziert. Die Gewichte der Tumore wurden nach 10 Tagen Behandlung ermittelt. Diese Tabelle zeigt die Ergebnisse von 2 separaten Untersuchungen, bei denen (obere Tabelle) 25% BMOV und (untere Tabelle) 30% oder 35% BMOV verwendet wurde. "Kontrolle" beschreibt Mäuse, die mit PCL, das kein BMOV enthielt, behandelt wurden.
  • 63 ist eine Tabelle, welche die Auswirkungen von mit BMOV beladener PCL:MePEG-Paste auf die Gewichte von RIF-1 Tumoren, die in Mäusen angezogen wurden, zeigt. In Kürze wurden RIF-1 Tumore für 5 Tage in Mäusen angezogen, wonach 90% des Tumors chirurgisch entfernt und die Resektionsstelle mit 150 mg PCL:MePEG-Paste (80:20, Gew./Gew.), die entweder kein BMOV (Kontrolle) oder 5% BMOV enthielt, behandelt wurden. Das Nachwachsen des Tumors wurde an den Tagen 4, 5 und 6 nach dieser Behandlung bestimmt.
  • Die 64A und 64B sind zwei Diagramme. 64A zeigt die Wirkung einer gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit BEMOV auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BEMOV. 64B zeigt auch die Wirkung einer gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit BEMOV auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BEMOV. Die Arzneimittelfreisetzung wird als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden BEMOV ausgedrückt.
  • Die 65A und 65B sind zwei Diagramme. 65A zeigt die Wirkung einer gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit V5 auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten V5. 65B zeigt auch die Wirkung einer gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit V5 auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten V5. Die Arzneimittelfreisetzung wird als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden V5 ausgedrückt.
  • Die 66A und 66B sind zwei Diagramme. 66A zeigt die Wirkung einer gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit PRC-V auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten PRC-V. 66B zeigt auch die Wirkung einer gesteigerten Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit PCR-V auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten PRC-V. Die Arzneimittelfreisetzung wird als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden PRC-V ausgedrückt.
  • Die 67A, 67B, 67C und 67D sind eine Reihe von Diagrammen, welche die Wirkung der Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit verschiedenen Konzentrationen von MePEG auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BMOV zeigen, mit 5% BMOV (67A), 10% BMOV (67B), 15% BMOV (67C) und 20% BMOV (67D).
  • Die 68A, 68B, 68C und 68D sind eine Reihe von Diagrammen, welche die Wirkung der Beladung von PCL-Thermopaste (150 mg Pellet) mit verschiedenen Konzentrationen von MePEG auf den Zeitverlauf des in 15 ml PBS/ALB freigesetzten BMOV zeigen; mit 0% MePEG (68A), 5% MePEG (68B), 10% MePEG (68C) und 15% MePEG (68D). Die Arzneimittelfreisetzung wird als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden BMOV ausgedrückt.
  • Die 69A und 69B sind Photographien von mit Fibronectin beschichteten PLLA-Mikrosphären auf Blasengewebe (69A) und von Poly(L-lysin)-Mikrosphären auf Blasengewebe.
  • Die 70A und 70B sind zwei Photographien von CAM, die einen mit Kontroll-Thermopaste (unbeladen) behandelten Tumor haben. In Kürze ist in 70A die zentrale weiße Masse das Tumorgewebe. Man beachte die Menge der Blutgefäße, die aus der CAM aus allen Richtungen in den Tumor eindringen. Durch die Produktion "angiogener Faktoren" ruft der Tumor das Einsprossen des Gefäßsystems aus dem Wirt hervor. Das Tumorgewebe dehnt sich distal entlang der Blutgefäße, die es versorgen, aus. 70B ist eine Ansicht der in 70A gezeigten CAM von unten. In Kürze zeigt diese Ansicht das strahlenförmige Erscheinungsbild der Blutgefäße, die wie die Speichen eines Rades in den Tumor eindringen. Man beachte, dass die Dichte der Blutgefäße in der Nachbarschaft des Tumors höher ist als im umgebenden normalen Gewebe der CAM. Die 70C und 70D sind zwei Photographien von CAM, die einen mit Thermopaste, die mit 20% Paclitaxel beladen ist, behandelten Tumor haben. In Kürze ist in Figur 70C die zentrale weiße Masse das Tumorgewebe. Man beachte den Mangel an Blutgefäßen in der Nachbarschaft des Tumorgewebes. Die anhaltende Freisetzung eines Hemmstoffs der Angiogenese kann den vom Tumor produzierten angiogenen Stimulus überwinden. Der Tumor selbst ist schlecht vaskularisiert und nimmt fortschreitend an Größe ab. 70D ist von der Unterseite der in 70C gezeigten CAM aus aufgenommen und zeigt im Vergleich zu Gewebe aus den Kontroll-Tumoren eine Unterbrechung des Blutflusses in den Tumor. Man beachte, dass die Dichte der Blutgefäße in der Nachbarschaft des Tumors vermindert und spärlicher ist als die des normalen, umgebenden Gewebes der CAM.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Vor der Darstellung der Erfindung kann es zu deren Verständnis hilfreich sein, Definitionen bestimmter, hier nachstehend verwendeter Begriffe darzulegen.
  • Hohlorgan" bezieht sich hier auf alle Passagewege, Schläuche, Röhren, Gänge, Kanäle, Sinus und Leitungen, die ein inneres Lumen haben und den Durchfluss von Stoffen im Körper ermöglichen. Typische Beispiele von Hohlorganen beinhalten Arterien und Venen, Tränengänge, die Luftröhre, Bronchien, Bronchiolen, Nasengänge (einschließlich der Nebenhöhlen) und andere Luftwege, Eustachische Röhren, den äußeren Gehörgang, Mundhöhlen, die Speiseröhre, den Magen, den Zwölffingerdarm, den Dünndarm, den Dickdarm, die Gallenwege, den Harnleiter, die Blase, die Harnröhre, die Eileiter, den Uterus, die Vagina und andere Hohlorgane des weiblichen Genitaltrakts, den Samenleiter und andere Hohlorgane des männlichen Genitaltrakts und das Ventrikelsystem (Cerebrospinalflüssigkeit) des Gehirns und des Rückenmarks.
  • „Therapeutischer Wirkstoff" bezieht sich hier auf Paclitaxel oder Analoga oder Derivate davon.
  • Wie oben erwähnt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Paclitaxel zur Herstellung eines Medikaments für Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen von Hohlorganen bereit, umfassend den Schritt, einem äußeren Teil des Hohlorgans (d.h. einer nicht-luminalen Oberfläche) ein Medikament zuzuführen, das Paclitaxel oder Analoga oder Derivate davon umfasst und im Rahmen von bevorzugten Ausführungsformen eine Zusammensetzung, die Paclitaxel oder Analoga oder Derivate davon und einen polymeren Träger umfasst. In Kürze umgeht die Zuführung eines therapeutischen Wirkstoffs zu einem äußeren Teil eines Hohlorgans (z.B. quadrantenweise oder ringförmig) viele Nachteile der herkömmlichen Zugänge, die mit einer endoluminalen Manipulation einhergehen. Weiterhin ermöglicht die Zuführung eines therapeutischen Wirkstoffes wie hier beschrieben die Verabreichung größerer Mengen des therapeutischen Wirkstoffs mit geringerer Einschränkung des zuzuführenden Volumens.
  • Wie unten ausführlicher erörtert können die therapeutischen Wirkstoffe entweder mit oder ohne Trägermittel (z.B. polymer) äußeren Teilen von Hohlorganen zugeführt werden, um eine Erkrankung, die mit dem Hohlorgan zusammenhängt, zu behandeln oder zu verhindern. Jeder dieser Aspekte wird unten ausführlicher erörtert.
  • Therapeutische Wirkstoffe
  • In der Erfindung ist der therapeutische Wirkstoff Paclitaxel, eine Verbindung, welche die Anordnung der Mikrotubuli unterbricht, indem sie an Tubulin bindet, um abnorme Mitosespindeln zu bilden. In Kürze handelt es sich bei Paclitaxel um ein hoch derivatisiertes Diterpenoid (Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93: 2325, 1971), welches aus der abgeschälten und getrockneten Rinde von Taxus brevifolia (Pazifische Eibe) und aus Taxomyces Andreanae und endophytischen Pilzen der pazifischen Eibe gewonnen worden ist (Stierle et al., Science 60: 214–216, 1993). „Paclitaxel (was hier einschließlich von Propharmaka, Analoga und Derivaten wie zum Beispiel TAXOL®, TAXOTERE®, 10-Desacetyl-Analoga von Paclitaxel und 3'N-Desbenzoyl-3'N-t-butoxycarbonyl-Analoga von Paclitaxel zu verstehen ist) kann unter Einsatz von Methoden, die den Fachleuten bekannt sind, leicht hergestellt werden (siehe WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076, WO 94/00156, WO 93/24476, EP 590267, WO 94/20089; U.S. Patente Nr. 5.294.637, 5.283.253, 5.279.949, 5.274.137, 5.202.448, 5.200.534, 5.229.529, 5.254.580, 5.412.092, 5.395.850, 5.380.751, 5.350.866, 4.857.653, 5.272.171, 5.411.984, 5.248.796, 5.248.796, 5.422.364, 5.300.638, 5.294.637, 5.362.831, 5.440.056, 4.814.470, 5.278.324, 5.352.805, 5.411.984, 5.059.699, 4.942.184; Tetrahedron Letters 35 (52): 9709–9712, 1994; J. Med. Chem. 35: 4230–4237, 1992; J. Med. Chem. 34: 992–998, 1991; J. Natural Prod. 57 (10): 1404–1410, 1994; J. Natural Prod. 57 (11): 1580–1583, 1994; J. Am. Chem. Soc. 110: 6558–6560, 1988) oder von einer Reihe kommerzieller Quellen bezogen werden, einschließlich zum Beispiel Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (T7402 – aus Taxus brevifolia).
  • Typische Beispiele solcher Derivate oder Analoga von Paclitaxel beinhalten 7-Deoxydocetaxol, 7,8-Cyclopropataxane, N-substituierte 2-Azetidone, 6,7-Epoxypaclitaxele, 6,7-modifizierte Paclitaxele, 10-Desacetoxytaxol, 10-Deacetyltaxol (aus 10-Deacetylbaccatin III), Phosphonooxy- und Carbonat-Derivate von Taxol, Taxol-2',7-di(natrium 1,2-benzendicarboxylat, 10-Desacetoxy-11,12-dihydrotaxol-10,12(18)-dien-Derivate, 10-Desacetoxytaxol, Protaxol(2'- und/oder 7-O-Ester-Derivate), (2'- und/oder 7-O-Carbonat-Derivate), asymmetrische Synthese der Taxol-Seitenkette, Fluoro-Taxole, 9-Deoxotaxan, (13-Acetyl-9-deoxobaccatin III, 9-Deoxotaxol, 7-Deoxy-9-deoxotaxol, 10-Des acetoxy-7-deoxy-9-deoxotaxol, Derivate, die Wasserstoff oder eine Acetylgruppe und ein Hydroxy und Tert-butoxycarbonylamino enthalten, sulfurierte 2'-Acryloyltaxol- und sulfurierte 2'-O-Acylsäure-Taxol-Derivate, Succinyltaxol, 2'-γ-Aminobutyryltaxol-formiat, 2'-Acetyltaxol, 7-Acetyltaxol, 7-Glycin-carbamat-taxol, 2'-OH-7-PEG(5000)-Carbamat-taxol, 2'-Benzoyl- und 2',7-Dibenzoyl-taxol-Derivate, andere Prophannaka (2'-Acetyltaxol; 2',7-Diacetyltaxol; 2'Succinyltaxol; 2'-(Beta-alanyl)-taxol); 2'Gamma-aminobutyryltaxolformiat; Ethylenglycoi-Derivate von 2'-Succinyltaxol; 2'-Glutaryltaxol; 2'-(N,N-Dimethylglycyl)taxol; 2'-[2-(N,N-Dimethylamino)propionyl]taxol; 2'Orthocarboxybenzoyltaxol; 2'-aliphatische Carbonsöurederivate von Taxol, Propharmaka {2'(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol, 2'(N,N-Dimethylglycyl)taxol, 7(N,N-Dimethylglycyl)taxol, 2',7-Di-(N,N-Dimethylglycyl)taxol, 7(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol, 2',7-Di(N,N-Diethylaminopropionyl)taxol, 2'-(L-Glycyl)taxol, 7-(L-Glycyl)taxol, 2',7-Di(L-Glycyl)taxol, 2'-(L-Alanyl)taxol, 7-(L-Alanyl)taxol, 2',7-Di(L-Alanyl)taxol, 2'-(L-Leucyl)taxol, 7-(L-Leucyl)taxol, 2',7-Di(L-Leucyl)taxol, 2'-(L-Isoleucyl)taxol, 7-(L-Isoleucyl)taxol, 2',7-Di(L-Isoleucyl)taxol, 2'-(L-Valyl)taxol, 7-(L-Valyl)taxol, 2'7-Di(L-Valyl)taxol, 2'-(L-Phenylalanyl)taxol, 7-(L-Phenylalanyl)taxol, 2',7-Di(L-Phenylalanyl)taxol, 2'-(L-Prolyl)taxol, 7-(L-Prolyl)taxol, 2',7-Di(L-Prolyl)taxol, 2'-(L-Lysyl)taxol, 7-(L-Lysyl)taxol, 2',7-Di(L-Lysyl)taxol, 2'-(L-Glutamyl)taxol, 7-(L-Glutamyl)taxol, 2',7-Di(L-Glutamyl)taxol, 2'-(L-Arginyl)taxol, 7-(L-Arginyl)taxol, 2',7-Di(L-Arginyl)taxol), Taxol-Analoga mit modifizierten Phenylisoserin-Seitenketten, Taxoter, (N-Debenzoyl-N-tert-(butoxycaronyl)-10-deacetyltaxol und Taxane (z.B. Baccatin III, Cephalomannin, 10-Deacetylbaccatin III, Brevifoliol, Yunantaxusin und Taxusin).
  • Paclitaxel sollte nicht nur als auf die übliche chemisch verfügbare Form des Paclitaxels bezogen aufgefasst werden, sondern auch auf Analoga (z.B. Taxoter, wie oben erwähnt) und Paclitaxel-Konjugate (z.B. Paclitaxel-PEG, Paclitaxel-Dextran oder Paclitaxel-Xylose). Zudem können mehrere als ein Wirkstoff gleichzeitig (d.h. in Kombination) eingesetzt oder nacheinander zugeführt werden.
  • Polymere
  • Wie oben erwähnt können therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zusätzlich ein Polymer umfassen. Eine Vielzahl von Polymeren kann zur Aufnahme oder Zuführung eines oder mehrerer der oben behandelten therapeutischen Wirk stoffe eingesetzt werden, einschließlich zum Beispiel sowohl biologisch abbaubarer als auch nicht biologisch abbaubarer Zusammensetzungen. Typische Beispiele biologisch abbaubarer Zusammensetzungen beinhalten Albumin, Kollagen, Gelatine, Stärke, Cellulose (Methylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat, Celluloseacetatsuccinat, Hydroxypropylmethylcellulosephthalat), Casein, Dextrane, Polysaccharide, Fibrinogen, Poly(D,L-lactid), Poly(D,L-lactid-co-glycolid), Poly(glycolid), Poly(hydroxybutyrat), Poly(alkylcarbonat) und Poly(orthoester), Polyester, Poly(hydroxyvaleriansäure), Polydioxanon, Poly(ethylenterephthalat), Poly(apfelsäure), Poly(tartronsäure), Polyanhydride, Polyphosphazene, Poly(aminosäuren) und ihre Copolymere (siehe allgemein Illum, L., Davids, S. S. (Hrsg.) "Polymers in controlled Drug Delivery" Wright, Bristol, 1987; Arshady, J. Controlled Release 17: 1–22, 1991; Pitt, Int. J. Phar. 59: 173–196, 1990; Holland et al., J. Controlled Release 4: 155–0180, 1986). Typische Beispiele nicht abbaubarer Polymere beinhalten EVA-Copolymere, Silikongummi, Acrylpolymere (Polyacrylsäure, Polymethylacrylsäure, Polymethylmethacrylat, Polyalkylcyanoacrylat), Polyethylen, Polypropylen, Polyamide (Nylon 6,6), Polyurethan, Poly(ester-urethane), Poly(ether-urethane), Poly(ester-harnstoff), Polyether (Poly(ethylenoxid), Poly(propylenoxid), Pluronics, Poly(tetramethylen-glycol)), Silikongummis und Vinylpolymere [Polyvinylpyrrolidon, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylacetatphthalat). Es können auch Polymere entwickelt werden, die entweder anionisch (z.B. Alginat, Carrageenin, Carboxymethylcellulose und Poly(acrylsäure), oder kationisch (z.B. Chitosan, Poly-L-Lysin, Polyethylenimin und Poly(allylamin)) sind (siehe allgemein Dunn et al., J. Applied Polymer Sci. 50: 353–365, 1993; Cascone et al., J. Materials Sci.: Materials in Medicine 5: 770–774, 1994; Shiraishi et al., Biol. Pharm. Bull. 16 (11): 1164–1168, 1993; Thacharodi und Rao, Int'I J. Pharm. 120: 115–118, 1995; Miyazaki et al., Int'I J. Pharm. 118: 257–263, 1995). Besonders bevorzugte polymere Trägermittel beinhalten Poly(ethylenvinylacetat) (40% quervernetzt), Oligomere und Polymere der Poly(D,L-milchsäure), Oligomere und Polymere der Poly(L-milchsäure), Poly(glycolsäure), Copolymere von Milchsäure und Glycolsäure, Poly(caprolacton), Poly(valerolacton), Polyanhydride, Copolymere von Poly(caprolacton) oder Poly(milchsäure) mit Polyethylenglycol und Mischungen davon.
  • Polymere Trägermittel können in verschiedenen Formen gestaltet werden, mit erwünschten Freisetzungscharakteristika und/oder mit spezifischen erwünschten Eigenschaften. Zum Beispiel können polymere Trägermittel so gestaltet werden, dass sie einen Wirkstoff nach Eintreten eines bestimmten, auslösenden Ereignisses wie zum Beispiel pH freisetzen (siehe z.B. Heller et al., "Chemically Self-Regulated Drug Delivery Systems," in Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1988, pp. 175–188; Kang et al., J. Applied Polymer Sci. 48: 343–354, 1993; Dong et al., J. Controlled Release 19: 171–178, 1992; Dong und Hoffman, J. Controlled Release 15: 141–152, 1991; Kim et al., J. Controlled Release 28: 143–152, 1994; Cornejo-Bravo et al., J. Controlled Release 33:223–229, 1995; Wu und Lee, Pharm. Res. 10 (10): 1544–1547, 1993; Serres et al., Pharm. Res. 13 (2): 196–201, 1996; Peppas, "Fundamentals of pH- and Temperature-Sensitive Delivery Systems," in Gurny et al. (Hrsg.), Pulsatile Drug Delivery, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, 1993, pp. 41–55; Doelker, "Cellulose Derivatives," 1993, in Peppas und Larger (Hrsg.), Biopolymers I, Springer-Verlag, Berlin). Typische Beispiele pH-sensitiver Polymere beinhalten Poly(acrylsäure) und ihre Derivate (einschließlich zum Beispiel Nomopolymere wie Poly(aminosäure); Poly(acrylsäure); Poly(methylacrylsäure)), Copolymere solcher Nomopolymere und Copolymere von Poly(acrylsäure) und Acrylmonomere wie zum Beispiel die oben erwähnten. Andere pH-sensitive Polymere beinhalten Polysaccharide wie zum Beispiel Celluloseacetatphthalat; Hydroxypropylmethylcellulosephthalat; Hydroxypropylmethylcelluloseacetatsuccinat; Celluloseacetattrimellitat und Chitosan. Weitere pH-sensitive Polymere beinhalten jede Mischung aus einem pH-sensitiven Polymer und einem wasserlöslichen Polymer.
  • Es können ebenso polymere Trägermittel hergestellt werden, die temperatursensitiv sind (siehe zum Beispiel Chen et al., "Novel Hydrogels of a Temperature-Sensitive Pluronic Grafted to a Bioadhesive Polyacrylic Acid Backbone for Vaginal Drug Delivery," in Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22:167-168, Controlled Release Society, Inc., 1995; Okano, "Molecular Design of Stimuli-Responsive Hydrogels for Temporal Controlled Drug Delivery," in Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 22: 111–112, Controlled Release Society, Inc., 1995; Johnston et al., Pharm. Res. 9 (3): 425–433, 1992; Tung, Int'J J. Pharm. 107: 85–90, 1994; Harsh und Gehrke, J. Controlled Release 17: 175–186, 1991; Bae et al., Pharm. Res. 8 (4): 531–537, 1991; Dinarvand und D'Emanuele, J. Controlled Release 36: 221–227, 1995; Yu und Grainger, "Novel Thermosensitive Amphiphilic Gels: Poly N-isopropylacrylamide-co-sodium acrylate-co-n-N-alkylacrylamide Network Synthesis and Physicochemical Characterization," Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 820–821; Zhou und Smid, "Physical Hydrogels of Associative Star Polymers," Polymer Research Institute, Dept. of Chemistry, College of Environmental Science and Forestry, State Univ. of New York, Syracuse, NY, pp. 822–823; Hoffman et al., "Characterizing Pore Sizes and Water 'Structure' in Stimuli-Responsive Hydrogels," Center for Bioengineering, Univ. of Washington, Seattle, WA, p. 828; Yu und Grainger, "Thermo-sensitive Swelling Behavior in Crosslinked N-isopropylacrylamide Networks: Cationic, Anionic and Ampholytic Hydrogels," Dept. of Chemical & Biological Sci., Oregon Graduate Institute of Science & Technology, Beaverton, OR, pp. 829–830; Kim et al., Pharm. Res. 9 (3): 283–290, 1992; Bae et al., Pharm. Res. 8 (5): 624–628, 1991; Kono et al., J. Controlled Release 30: 69–75, 1994; Yoshida et al., J. Controlled Release 32: 97–102, 1994; Okano et al., J. Controlled Release 36: 125–133, 1995; Chun und Kim, J. Controlled Release 38: 39–47, 1996; D'Emanuele und Dinarvand, Int'I J. Pharm. 118: 237–242, 1995; Katono et al., J. Controlled Release 16:215–228, 1991; Hoffman, "Thermally Reversible Hydrogels Containing Biologically Active Species," in Migliaresi et al. (Hrsg.), Polymers in Medicine III, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1988, pp. 161–167; Hoffman, "Applications of Thermally Reversible Polymers and Hydrogels in Therapeutics and Diagnostics," in Third International Symposium on Recent Advances in Drug Delivery Systems, Salt Lake City, UT, Feb. 24–27, 1987, pp. 297–305; Gutowska et al., J. Controlled Release 22: 95–104, 1992; Palasis und Gehrke, J. Controlled Release 18: 1–12, 1992; Paavola et al., Pharm. Res. 35 12 (12): 1997–2002, 1995).
  • Typische Beispiele von Polymeren, die unter Wärmeeinwirkung gelieren und ihre Entmischungstemperaturen (LCST(°C)) umfassen Homopolymere wie zum Beispiel Poly(N-methyl-N-n-propylacrylamid), 19,8; Poly(N-n-propylacrylamid), 21,5; Poly(N-methyl-N-isopropylacrylamid), 22,3; Poly(N-n-propylmethacrylamid), 28,0; Poly(N-isopropylacrylamid), 30,9; Poly(N,n-diethylacrylamid), 32,0; Poly(N-isopropylmethacrylamid), 44,0; Poly(N-cyclopropylacrylamid), 45,5; Poly(N-ethylmethyacrylamid), 50,0; Poly(N- methyl-N-ethylacrylamid), 56,0; Poly(N-cyclopropylmethacrylamid), 59,0; Poly(N-ethylacrylamid), 72,0. Ferner können Polymere, die unter Wärmeeinwirkung gelieren, durch Zubereitung von Copolymeren zwischen (aus) Monomeren der oben genannten oder durch Kombination solcher Homopolymere mit anderen wasserlöslichen Polymeren wie zum Beispiel Acrylmonomeren (z.B. Acrylsäure und Derivaten davon wie zum Beispiel Methylacrylsäure, Acrylat und Derivaten davon wie zum Beispiel Butylmethacrylat, Acrylamid und N-n-Butylacrylamid) hergestellt werden.
  • Weitere typische Beispiele von Polymeren, die unter Wärmeeinwirkung gelieren, umfassen Celluloseether-Derivate wie zum Beispiel Hydroxypropylceliulose, 41°C; Methylcellulose, 55°C; Hydroxypropylmethylcellulose, 66°C; Ethylhydroxyethylcellulose und Pluronics wie zum Beispiel F-127, 10–15°C; L-122, 19°C; L-92, 26°C; L-81, 20°C; und L-61, 24°C.
  • Von den polymeren Trägermitteln, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kann eine Vielzahl von Formen gebildet werden, einschließlich beispielsweise stabförmige Einheiten, Pellets, Platten oder Kapseln (siehe zum Beispiel Goodell et al., Am. J. Hosp. Pharm. 43: 1454–1461, 1986; Langer et al., "Controlled release of macromolecules from polymers", in Biomedical polymers, Polymeric materials and pharmaceuticals for biomedical use, Goldberg, E. P., Nakagim, A. (Hrsg.) Academic Press, pp. 113–137, 1980; Rhine et al., J. Pharm. Sci. 69: 265–270, 1980; Brown et al., J Pharm. Sci. 72: 1181–1185, 1983; und Bawa et al., J. Controlled Release 1:259–267, 1985). Therapeutische Wirkstoffe können durch Einschluss in die Matrices des Polymers gekoppelt sein, durch kovalente Bindungen gebunden sein oder in Mikrokapseln verkapselt sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden therapeutische Zusammensetzungen in nicht-kapsulären Formulierungen wie zum Beispiel Mikrosphären (in einem Größenbereich von Nanometern bis Mikrometern), Pasten, Fasern verschiedener Größe, Filmen und Sprays bereitgestellt.
  • Vorzugsweise werden die therapeutischen Zusammensetzungen in einer der beabsichtigten Verwendung angemessenen Art hergestellt. In bestimmten Gesichtspunkten der vorliegenden Erfindung sollte die therapeutische Zusammensetzung biokompatibel sein und einen oder mehrere therapeutische Wirkstoffe über einen Zeitraum von mehreren Tagen bis Monaten freisetzen. Zum Beispiel werden "schnell freisetzende" oder "burst"-Therapeutica bereitgestellt, die mehr als 10%, 20% oder 25% (Gew./Vol.) eines therapeutischen Wirkstoffes (z.B. Paclitaxel) über einen Zeitraum von 7 bis 10 Tagen freisetzen. Solche "schnell freisetzenden" Zusammensetzungen sollten in bestimmten Ausführungsformen in der Lage sein, chemotherapeutische Spiegel (wo anwendbar) eines gewünschten Wirkstoffes freizusetzen. In anderen Ausführungsformen werden "langsam freisetzende" therapeutische Zusammensetzungen, die weniger als 1% (Gew./Vol.) eines therapeutischen Wirkstoffes über einen Zeitraum vom 7 bis 10 Tagen freisetzen, bereitgestellt. Weiterhin sollten therapeutische Zusammensetzungen vorzugsweise mehrere Monate lang haltbar sein und unter sterilen Bedingungen hergestellt und aufbewahrt werden können.
  • In bestimmten Aspekten der vorliegenden Erfindung können therapeutische Zusammensetzungen abhängig von der jeweiligen Verwendung in jeder Größe zwischen 50 nm und 500 μm hergestellt werden. Alternativ können solche Zusammensetzungen auch leicht als "Spray", das sich zu einem Film oder einer Beschichtung verdichtet, angewandt werden. Solche Sprays können aus Mikrosphären mit einem breiten Größenspektrum einschließlich zum Beispiel von 0,1 μm bis 3 μm, von 10 μm bis 30 μm und von 30 μm bis 100 μm aufbereitet werden.
  • Therapeutische Zusammensetzungen, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, können auch in einer Reihe von "Pasten" oder Gelformen hergestellt werden. Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform der Erfindung therapeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die bei einer Temperatur (z.B. Temperatur über 37°C, wie zum Beispiel 40°C, 45°C, 50°C, 55°C oder 60°C) flüssig sind und bei einer anderen Temperatur (z.B. Umgebungstemperatur des Körpers oder jede Temperatur unter 37°C) fest oder halbfest sind. Solche "Thermopasten" können in Anbetracht der hier bereitgestellten Offenlegung leicht hergestellt werden.
  • In wieder anderen Aspekten der Erfindung können die therapeutischen Zusammensetzungen als ein Film ausgebildet sein. Vorzugsweise sind solche Filme im Allgemeinen weniger als 5, 4, 3, 2 oder 1 mm dick, bevorzugter weniger als 0,75 mm oder 0,5 mm dick und am meisten zu bevorzugen weniger als 500 μm bis 100 μm dick. Solche Filme sind vorzugsweise biegsam mit einer guten Reißfestigkeit (z.B. mehr als 50, vorzugsweise mehr als 100 und bevorzugter mehr als 150 oder 200 N/cm2), guten Adhäsionseigenschaften (d.h. haften leicht an feuchten oder nassen Oberflächen an) und haben eine kontrollierte Permeabilität.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können die therapeutischen Zusammensetzungen auch zusätzliche Bestandteile wie zum Beispiel Tenside (z.B. Pluronics wie zum Beispiel F-127, L-122, L-92, L-81 und L-61) umfassen.
  • In weiteren Aspekten der vorliegenden Erfindung werden polymere Trägermittel verwendet, die geeignet sind, eine hydrophobe Verbindung zu enthalten und freizusetzen, wobei das Trägermittel die hydrophobe Verbindung in Kombination mit einem Kohlenhydrat, Protein oder Polypeptid enthält. In bestimmten Ausführungsformen enthält oder umfasst das polymere Trägermittel Regionen, Taschen oder Granula einer oder mehrerer hydrophober Verbindungen. Zum Beispiel können in einer Ausführungsform der Erfindung hydrophobe Verbindungen in einer Matrix, die die hydrophobe Verbindung enthält, eingeschlossen werden, gefolgt von der Aufnahme der Matrix in das polymere Trägermittel. In diesem Zusammenhang kann eine Reihe von Matrices verwendet werden einschließlich zum Beispiel Kohlenhydrate und Polysaccharide wie zum Beispiel Stärke, Cellulose, Dextran, Methylcellulose und Hyaluronsäure, Proteine oder Polypeptide wie zum Beispiel Albumin, Kollagen und Gelatine. In alternativen Ausführungsformen können hydrophobe Verbindungen in einem hydrophoben Kern enthalten sein und dieser Kern kann in einer hydrophilen Hülle enthalten sein. Zum Beispiel kann, wie in den Beispielen beschrieben, Paclitaxel in einen hydrophoben Kern (z.B. von Poly-D,L-Milchsäure-PEG oder MePEG-Aggregat), der eine hydrophile Hülle hat, aufgenommen werden.
  • Es kann eine Vielzahl hydrophober Verbindungen aus den oben beschriebenen polymeren Trägermitteln freigesetzt werden einschließlich zum Beispiel: bestimmte hydrophobe Verbindungen, die die Funktion der Mikrotubuli beeinträchtigen, wie zum Beispiel Paclitaxel und Estramustin; hydrophobe Proteine wie zum Beispiel basisches Myelin-Protein, Proteolipid-Proteine des ZNS-Myelins, hydrophobes Zellwandprotein, Porine, Membranproteine (EMBO J. 12 (9): 3409–3415, 1993), Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein ("MOG") (Biochem. and Mol. Biol. Int. 30 (5): 945–958, 1993), P27 Cancer Res. 53 (17): 4096–4101, 1993, Bacterioopsin, humanes Surfactant Protein ("HSB"; J. Biol. Chem. 268 (15): 11160–11166, 1993) und SP-B oder SP-C (Biochimica et Biophysica Acta 1105 (1): 161–169, 1992).
  • Typische Beispiele der Aufnahme therapeutischer Wirkstoffe wie zum Beispiel der oben beschriebenen in polymere Trägermittel zur Bildung einer therapeutischen Zusammensetzung werden unten in den Beispielen ausführlicher beschrieben.
  • Andere Trägermittel
  • Andere Trägermittel, die gleichermaßen zur Aufnahme und/oder Freisetzung der hier beschriebenen therapeutischen Wirkstoffe verwendet werden können, beinhalten: Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (Cserhati und Hollo, Int. J. Pharm. 108: 69–75, 1994), Liposomen (siehe z.B. Sharma et al., Cancer Res. 53: 5877–5881, 1993; Sharma und Straubinger, Pharm. Res. 11 (60): 889–896,1994; WO 93/18751; U.S. Patent Nr. 5.242.073); Liposom/Gel (WO 94/26254), Nanokapseln (Bartoli et al., J. Microencapsulation 7 (2): 191–197, 1990), Mizellen (Alkan-Onyuksel et al., Pharm. Res. 11 (2): 206–212, 1994), Implantate (Jampel et al., Invest. Ophthalm. Vis. Science 34 (11): 3076–3083, 1993; Walter et al., Cancer Res. 54: 2207–2212, 1994), Nanopartikel (Violante und Lanzafame PAACR), Nanopartikel – modifiziert (U.S. Patent Nr. 5.145.684), Nanopartikel (Oberfläche modifiziert) (U.S. Patent Nr. 5.399.363), Taxol-Emulsion/Lösung (U.S. Patent Nr. 5.407.683), Micelle (Tensid) (U.S. Patent Nr. 5.403.858), synthetische Phospholipid-Verbindungen (U.S. Patent Nr. 4.534.899), Gasdispersion (U.S. Patent Nr. 5.301.664), flüssige Emulsionen, Schaumspray, Gel, Lotion, Creme, Salbe, dispergierte Bläschen, Teilchen oder Tröpfchen, Fest- oder Flüssigaerosole, Mikroemulsionen (U.S. Patent Nr. 5.330.756), polymere Hüllen (Nano- und Mikrokapseln) (U.S. Patent Nr. 5.439.686), Zu sammensetzungen auf der Basis von Taxoiden in einem oberflächenaktiven Wirkstoff (U.S. Patent Nr. 5.438.072), Emulsion (Tarr et al., Pharm Res. 4: 162–165, 1987) Nanosphären (Hagan et al., Proc. Intern. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 22, 1995; Kwon et al., Pharm Res. 12 (2): 192–195; Kwon et al., Pharm Res. 10 (7): 970–974; Yokoyama et al., J. Contr. Rel. 32: 269–277, 1994; Gref et al., Science 263: 1600–1603, 1994; Bazile et al., J. Pharm. Sci. 84: 493–498, 1994) und Implantate (U.S. Patent Nr. 4.882.168).
  • Wie unten ausführlicher erörtert wird, können therapeutische Wirkstoffe, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden und zur Bildung einer therapeutischen Zusammensetzung optional in eines der hier beschriebenen Trägermittel aufgenommen werden, zur Behandlung und Verhinderung einer Vielzahl vom Erkrankungen hergestellt und eingesetzt werden.
  • Krankheitsbehandlung oder -vorbeugung
  • Wie oben erwähnt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Paclitaxel und Analogen und Derivaten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung einer Vielzahl von Erkrankungen, die mit der Verlegung von Hohlorganen in Verbindung stehen, einschließlich zum Beispiel Gefäßkrankheiten, neoplastische Obstruktionen, Entzündungskrankheiten und infektiöse Erkrankungen.
  • Zum Beispiel können in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung die therapeutischen Zusammensetzungen, wie sie hier beschrieben sind, eingesetzt werden, um Gefäßkrankheiten, die Obstruktionen des Gefäßsystems verursachen, zu behandeln. Typische Beispiele solcher Erkrankungen schließen Atherosklerose aller Gefäße (um jede Arterie, Vene oder jedes Transplantat) ein, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: die Koronararterien, Aorta, Beckenschlagadern, Halsschlagadern, Oberschenkelarterien, oberflächliche Oberschenkelarterien, Arterien der Kniekehle und an der Stelle der Anastomose eines Transplantats; Vasospasmen (z.B. koronare Vasospasmen und Morbus Raynaud); Restenose (Verlegung eines Gefäßes an der Stelle einer früheren Intervention wie zum Beispiel Ballonangioplastie, Bypass-Chirurgie, Stent-Implantation und Implantation eines Transplantats); entzündliche Krankheiten und Autoimmunerkrankungen (z.B. Arteriitis temporalis, Vaskulitis).
  • In Kürze haften bei Gefäßerkrankungen wie zum Beispiel der Atherosklerose weiße Blutkörperchen, besonders Monocyten und T-Lymphocyten an Endothelzellen an, besonders an den Stellen, wo sich Arterien verzweigen. Nach dem Anhaften an das Endothel wandern die Leukocyten als Antwort auf chemotaktische Stimuli durch die Endothelzellschicht und sammeln sich zusammen mit glatten Muskelzellen in der Intima der Arterienwand an. Diese anfängliche Läsion in der Entwicklung von Atherosklerose ist als „Fettstreifen" bekannt. Monocyten im Fettstreifen differenzieren sich zu Makrophagen aus; und die Makrophagen und glatten Muskelzellen nehmen zunehmend Lipide und Lipoproteine auf, um sich zu Schaumzellen zu entwickeln.
  • Mit der Akkumulation von Makrophagen wird das darüber liegende Endothel mechanisch gesprengt und chemisch durch oxidiertes Lipid, Sauerstoffradikale und Proteasen, die von den Makrophagen freigesetzt werden, verändert. Schaumzellen fressen sich durch das oberflächliche Endothel und verursachen Mikroläsionen der Gefäßwand. Der Kontakt von potenziell thrombogenem subendothelialen Gewebe (wie zum Beispiel von Kollagen und anderen Proteinen) mit Komponenten des Blutstroms führt zum Anhaften von Plättchen im Bereichen des unterbrochenen Endothels. Das Anhaften von Plättchen und andere Ereignisse lösen die Herstellung und Freisetzung von Wachstumsfaktoren in diese Umgebung aus, einschließlich des Plättchen-Wachstumsfaktors (PDGF), Plättchen-aktivierenden Faktors (PAF) und der Interleukine 1 und 6 (IL-1, IL-6). Es wird vermutet, dass diese parakrinen Faktoren das Einwandern und die Proliferation glatter Gefäßmuskelzellen (VSMC) stimulieren.
  • In der normalen (nicht erkrankten) Blutgefäßwand besitzen die glatten Gefäßmuskelzellen einen kontraktilen Phänotyp und haben eine geringe Mitoseaktivität. Unter dem Einfluss von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, die von Blutplättchen, Makrophagen und Endothelzellen freigesetzt werden, durchlaufen die VSMC jedoch eine Änderung des Phänotyps von reifen, kontraktilen Zellen zu unreifen, sekretorischen Zellen. Die transformierten VSMC proliferieren in der Media der Blutgefäßwand, wandern in die Intima, proliferieren in der Intima weiter und sondern große Mengen von extrazellulärer Matrix ab. Dies wandelt die sich entwickelnde Gefäßläsion in eine fibröse Plaque um. Die von sekretorischen VSMC abgesonderte extrazelluläre Matrix schließt Kollagen, Elastin, Glykoprotein und Glykosaminoglykane ein, wobei Kollagen die hauptsächliche Komponente der extrazellulären Matrix der atherosklerotischen Plaque umfasst. Elastin und Glykosaminoglykane binden Lipoproteine und tragen auch zur Größenzunahme der Läsion bei. Die fibröse Plaque besteht aus einer fibrösen Abdeckung aus dichtem Bindegewebe unterschiedlicher Dicke, die glatte Muskelzellen und aufliegende Makrophagen, T-Zellen und extrazelluläres Material enthält.
  • Zusätzlich zu PDGF, IL-1 und IL-6 werden von den Zellen, die die Gefäßwand infiltrieren, weitere mitogene Faktoren produziert, einschließlich: transformierender Wachstumsfaktor beta (TGF-β), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), Thrombospondin, Serotonin, Thromboxan A2, Noradrenalin und Angiotensin II. Die führt zur Rekrutierung weiterer Zellen, Absonderung von weiterer extrazellulärer Matrix und zur Ansammlung von zusätzlichem Lipid. Dies vergrößert die atherosklerotische Läsion zunehmend, bis sie erheblich auf das Gefäßlumen übergreift. Zunächst verursacht behinderter Blutfluss durch die Gefäßröhre nur dann eine Ischämie des Gewebes distal der atherosklerotischen Plaque, wenn ein erhöhter Fluss benötigt wird – später, wenn die Läsion die Arterie zunehmend blockiert, tritt Ischämie in Ruhe auf.
  • Makrophagen in der sich vergrößernden atherosklerotischen Plaque setzen oxidiertes Lipid, freie Radikale, Elastasen und Kollagenasen frei, die eine Zellschädigung und Nekrose benachbarter Gewebe verursachen. Die Läsion entwickelt einen nekrotischen Kern und wird in eine komplexe Plaque umgewandelt. Komplexe Plaques sind instabile Läsionen, die aufbrechen und eine Embolisierung verursachen können; oder eine lokale Blutung (infolge einer Ruptur der Vasa vasorum, die die Plaque versorgen, was zu einer Verlegung des Lumens durch die schnelle Ausbreitung der Läsion führt); oder eine Ulceration und Bildung einer Fissur (dies bringt den thrombogenen nekrotischen Kern mit dem Blutstrom in Verbindung und erzeugt eine lokale Thrombose oder eine distale Embolisierung). Auch wenn keine der oben genannten Folgeerscheinungen auftreten sollte, kann sich der adhärente Thrombus organisieren und in die Plaque aufgenommen werden und somit ihr Wachstum beschleunigen. Weiterhin wird mit der Erhöhung der lokalen Konzentrationen von Fibrinogen und Thrombin die Proliferation glatter Gefäß muskelzellen in der Media und Intima stimuliert; ein Prozess, der schließlich auch zu einer zusätzlichen Verengung des Gefäßes führt.
  • Die Intima und die Media normaler Arterien werden aus dem Lumen der Arterie oder von den Vasa vasorum in der Adventitia mit Sauerstoff und Nährstoffen versorgt. Mit der Entwicklung einer atherosklerotischen Plaque sprossen Mikrogefäße, die aus den adventitiellen Vasa vasorum entspringen, in die verdickte Intima und Media ein. Dieses Gefäßgeflecht wird mit einer Verschlimmerung der Plaque weitreichender und verkleinert sich mit einem Rückgang der Plaque.
  • Eine Blutung aus diesen Mikrogefäßen kann eine plötzliche Ausdehnung und Ruptur der Plaque in Verbindung mit einer Dissektion der Arterie, einer Ulceration oder einer Thrombose herbeiführen. Es wurde auch postuliert, dass das Austreten von Plasmaproteinen aus diesen Mikrogefäßen entzündliche Infiltrate in diese Bereiche zieht und dass diese entzündlichen Zellen zum schnellen Wachstum der atherosklerotischen Plaque und den damit verbundenen Komplikationen beitragen (durch lokales Ödem und Entzündung).
  • In anderen Gesichtspunkten der Erfindung werden Paclitaxel und Analoga oder Derivate eingesetzt, um neoplastische Obstruktionen zu behandeln. In Kürze sollte, wie hier verwendet, eine neoplastische Obstruktion" so aufgefasst werden, dass sie jegliche neoplastische (benigne oder maligne) Verstopfung einer Röhre im Körper einschließt, ungeachtet der Lokalisation der Röhre oder des histologischen Typs des vorliegenden malignen Tumors. Typische Beispiele beinhalten gastrointestinale Erkrankungen (z.B. oropharyngeales Karzinom (Adenokarzinom), Ösophaguskarzinom (squamöses Karzinom, Adenokarzinom, Lymphom, Melanom), Magenkarzinom (Adenokarzinom, Linitis plastica, Lymphom, Leiomyosarkom), Dünndarmtumore (Adenome, Leiomyome, Lipome, Adenokarzinome, Lymphome, Karzinoi-Tumore), Dickdarmkrebs (Adenokarzinom) und anorektales Karzinom; Gallenwegserkrankungen (z.B. Neoplasmen, die zum Verschluß von Gallenwegen führen, wie zum Beispiel Pankreaskarzinom (duktales Adenokarzinom, Inselzelltumore, Cystadenokarzinom), Cholangiokarzinom und hepatozelluläres Karzinom); Lungenerkrankungen (z.B. Karzinome der Lunge und/oder der trachea len/bronchialen Hohlorgane (kleinzelliger Lungenkrebs, nicht kleinzelliger Lungenkrebs); Erkrankung des weiblichen Genitaltrakts (z.B. bösartige Tumore der Eileiter, Gebärmutterkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Scheidenkrebs); Erkrankungen des männlichen Genitaltrakts (z.B. Hodenkrebs, Krebs der Nebenhoden, Tumore des Samenleiters, Prostatakrebs, benigne Prostatahyperplasie); und Erkrankungen des Harntrakts (z.B. Nierenzellkarzinom, Nierenbeckentumore, Tumore des Harnableitungssystems wie zum Beispiel Übergangszellkarzinom, Blasenkarzinom und Verlegungen der Harnröhre aufgrund von benignen Strikturen oder malignen Tumoren).
  • Als Beispiel ist die benigne Prostatahyperplasie (BPH) eine als Reaktion auf eine verlängerte androgene Stimulation auftretende Vergrößerung der Prostata, besonders des zentralen Teils der Drüse, die die Harnröhre umgibt. Sie betrifft mehr als 80% der Männer in einem Alter über 50 Jahre. Diese Vergrößerung kann zur Kompression des Teils der Harnröhre führen, der durch die Prostata verläuft, was zu einer Verlegung des Blasenausflusstraktes führt, d.h. es ist ein unnormal hoher Blasendruck erforderlich, um einen Urinfluss hervorzurufen. 1980 wurden in den Vereinigten Staaten 367.000 transurethrale Resektionen der Prostata als Behandlung von BPH vorgenommen. Andere Therapien schließen medikamentöse Behandlung, transurethrale Sphinkterotomie, transurethrale Laser- oder Mikrowellenanwendung, transurethrale Hyperthermie, transurethralen Ultraschall, transrektale Mikrowellenanwendung, transrektale Hyperthermie, transrektalen Ultraschall und chirurgische Entfernung ein. Alle haben Nachteile einschließlich einer Unterbrechung des Sphinktermechanismus, was zu Inkontinenz und zur Bildung von Strikturen führt.
  • Um neoplastische Erkrankungen wie zum Beispiel die oben erörterten zu behandeln kann eine Vielzahl therapeutischer Wirkstoffe (entweder mit oder ohne polymeres Trägermittel) an den äußeren Teil des Hohlorgans oder an glatte Muskelzellen über die Adventitia des Hohlorgans abgegeben werden. In dieser Hinsicht besonders bevorzugte therapeutische Wirkstoffe schließen oben erörterte antiangiogene, antiproliferative oder antineoplastische Wirkstoffe ein, einschließlich zum Beispiel Verbindungen, die die Funktion der Mikrotubuli stören, wie zum Beispiel Paclitaxel und Derivate oder Analoga davon.
  • Zum Beispiel wird in einer bevorzugten Ausführungsform eine Nadel oder ein Katheter Ultraschall-gesteuert über den transrektalen Zugang (oder alternativ transperineal) in die an die Harnröhre angrenzende Prostata gelenkt und durch diese wird ein therapeutischer Wirkstoff vorzugsweise in mehrere Quadranten der Drüse, besonders um die Harnröhre, abgegeben. Die Nadel oder der Katheter kann auch unter direkter Palpation oder endoskopisch, fluoroskopisch, CT- oder MRI-gesteuert platziert werden und in Intervallen verabreicht werden. Als Alternative kann auch ein Einbringen von Pellets über einen Katheter oder Trokar durchgeführt werden. Die obigen Verfahren können allein oder in Verbindung mit einem in die prostatische Urethra eingelegten Stent durchgeführt werden. Dadurch, dass Manipulation mit Instrumenten in der Urethra oder eine Schädigung der Urethra vermieden werden, würde der Sphinktermechanismus intakt gelassen und Inkontinenz vermieden werden und eine Striktur ist weniger wahrscheinlich.
  • In anderen Gesichtspunkten ist die Erfindung zur Vorbeugung oder Behandlung entzündlicher Erkrankungen, die die Obstruktion eines Hohlorgans verursachen, nützlich. Entzündliche Erkrankungen schließen sowohl akute als auch chronische Entzündung, die zur Obstruktion einer Reihe von Körperröhren führen, ein. Typische Beispiele beinhalten Vaskulitis (z.B. Riesenzellarterütis (Arteriitis temporalis, Takayasu-Arteriitis), Polyarteriitis nodosa, allergische Angiitis und Granulomatose (Churg-Strauss-Syndrom), Polyangütis-Overlap-Syndrom, Hypersensitivität-Vaskulitis (Purpura Schoenlein-Henoch), Serumkrankheit, Arzneimittel-induzierte Vaskulitis, infektiöse Vaskulitis, neoplastische Vaskulitis, Vaskulitis in Verbindung mit Erkrankungen des Bindegewebes, Vaskulitis in Verbindung mit angeborenen Defekten des Komplementsystem), Wegener'sche Granulomatose, Kawasaki-Syndrom, Vaskulitis des Zentralnervensystems, Buerger-Syndrom und systemische Sklerose); Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes (z.B. Pankreatitis, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Proctitis ulcerosa, primär sklerosierende Cholangitis, benigne Strikturen jeglicher, einschließlich idiopathischer Ursache (z.B. Strikturen der Gallengänge, des Ösophagus, des Duodenums, des Dünndarms oder des Colons)); Krankheiten des Respirationstraktes (z.B. Asthma, Hypersensitivitäts-Pneumonie, Asbestose, Silikose und andere Formen der Pneumokoniose, chronische Bronchitis und chronisch obstruktive Atemwegserkrankung); Erkrankungen des Ductus nasolacrimalis (z.B. Strikturen aus allen, einschließlich idiopathischen Ursachen); und Erkrankungen der Tuba Eustachii (z.B. Strikturen aus allen, einschließlich idiopathischen Ursachen).
  • In wieder anderen Gesichtspunkten ist die Erfindung zur Vorbeugung oder Behandlung von Infektionskrankheiten, die mit der Obstruktion eines Hohlorgans in Verbindung stehen oder sie verursachen, nützlich. In Kürze schließen Infektionskrankheiten verschiedene akute und chronische infektiöse Prozesse ein, die zur Obstruktion von Hohlorganen führen können, einschließlich zum Beispiel Obstruktionen des männlichen Genitaltrakts (z.B. Strikturen aufgrund von Urethritis, Epididymitis, Prostatitis); Obstruktionen des weiblichen Genitaltrakts (z.B. Vaginitis, Cervicitis, entzündliche Beckenerkrankungen (z.B. Tuberkulose, Gonokokken, Chlamydien, Enterokokken und Syphilis); Obstruktionen des Harntrakts (z.B. Zystitis, Urethritis); Obstruktionen des Respirationstraktes (z.B. chronische Bronchitis, Tuberkulose, andere Infektionen durch Mykobakterien, (MAI etc.), anaerobe Infektionen, Pilzinfektionen und parasitäre Infektionen) und cardiovasculärer Obstruktionen (z.B. mykotische Aneurysmen und infektiöse Endocarditits).
  • Um Infektionskrankheiten wie zum Beispiel die oben erörterten zu behandeln kann eine Vielzahl therapeutischer Wirkstoffe (entweder mit oder ohne Trägermittel) an den äußeren Teil des Hohlorgans oder an glatte Muskelzellen über die Adventitia des Hohlorgans abgegeben werden.
  • Formulierung und Verabreichung
  • Wie oben erwähnt können von der vorliegenden Erfindung bereitgestellte therapeutische Zusammensetzungen in einer Reihe von Arten (z.B. Mikrosphären, Pasten, Filme oder Sprays) formuliert werden. Weiterhin können die Zusammensetzungen so formuliert werden, dass sie mehrere therapeutische Wirkstoffe enthalten, dass sie eine Reihe zusätzlicher Verbindungen enthalten, dass sie bestimmte physikalische Eigenschaften haben (z.B. Elastizität, einen besonderen Schmelzpunkt oder eine vorgegebene Freisetzungsrate). In bestimmten Ausführungsformen können Zusammensetzungen kombiniert werden, um einen erwünschten Effekt zu erzielen (z.B. können verschiedene Mikrosphären-Aufbereitungen kombiniert werden, um sowohl eine schnelle als auch eine langsame oder anhaltende Freisetzung von einem oder mehreren antiangiogenen Faktoren zu erreichen).
  • Die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellten therapeutischen Wirkstoffe und Zusammensetzungen können entweder allein oder in Kombination mit pharmazeutisch oder physiologisch akzeptablen Trägem, Vehikeln oder Verdünnungsmitteln verabreicht werden. Generell sollten solche Träger in den verabreichten Dosierungen und Konzentrationen für die Empfänger nicht toxisch sein. Gewöhnlich ist die Herstellung solcher Zusammensetzungen mit Kombinationen des therapeutischen Wirkstoffs mit Puffern, Antioxidantien wie zum Beispiel Ascorbinsäure, Polypeptiden mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen, Aminosäuren, Kohlenhydraten einschließlich Glucose, Saccharose oder Dextrinen, Chelatbildnern wie zum Beispiel EDTA, Glutathion und anderen Stabilisatoren und Vehikeln verbunden. Neutral gepufferte Salzlösung oder mit unspezifischem Serumalbumin gemischte Salzlösung sind beispielhaft geeignete Verdünnungsmittel.
  • Wie oben erwähnt können die hier bereitgestellten therapeutischen Wirkstoffe, therapeutischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen so zubereitet werden, dass sie über eine Reihe von verschiedenen Wegen verabreicht werden können, einschließlich zum Beispiel unmittelbar an ein Hohlorgan unter direkter Sicht (z.B. bei der Operation oder über endoskopische Verfahren) oder über perkutane Arzneimittelzufuhr zur äußeren (adventitiellen) Oberfläche des Hohlorgans (z.B. perivaskuläre Zufuhr). Andere typische Wege zur Verabreichung beinhalten Gastroskopie, ERCP und Coloskopie, die keine vollständigen operativen Maßnahmen und keine Hospitalisierung erfordern, aber die Anwesenheit von medizinischem Personal voraussetzen können.
  • In Kürze ist eine perivaskuläre Arzneimittelzufuhr mit einer perkutanen Verabreichung von lokal wirkenden (oft in Retardform) therapeutischen Formulierungen unter Verwendung einer Nadel oder eines Katheters, die über Ultraschall-, CT-, fluoroskopische, MRI- oder endoskopische Steuerung zur erkrankten Stelle dirigiert werden, verbunden. Alternativ kann die Maßnahme intraoperativ unter direkter Sicht oder mit zusätzlicher Steuerung durch Bildgebung vorgenommen werden. Solch eine Maßnahme kann auch im Zu sammenhang mit endovaskulären Verfahren wie zum Beispiel einer Angioplastie, Atherektomie oder dem Einbringen von Stents oder in Verbindung mit einem arteriellen Operationsverfahren wie zum Beispiel einer Endarteriektomie, einer Gefäß- oder Transplantatkonektur oder einer Implantation eines Transplantats vorgenommen werden.
  • Zum Beispiel können in einer Ausführungsform polymere Paclitaxel-Formulierungen in die Gefäßwand injiziert oder auf die adventitielle Oberfläche aufgebracht werden, womit höchste Arzneimittelkonzentrationen dort ermöglicht werden, wo die biologische Aktivität am meisten benötigt wird. Dies hat das Potenzial, den lokalen „Auswascheftekt" des Arzneimittels zu verringern, der durch den dauernden Blutfluss über die Oberfläche einer endovaskulären Vorrichtung zur Arzneimittelabgabe (wie zum Beispiel ein Arzneimittelbeschichteter Stent) zur Geltung kommen kann. Die Verabreichung wirksamer therapeutischer Wirkstoffe an die äußere Oberfläche einer Gefäßröhre kann die Obstruktion der Röhre vermindern und das Risiko von Komplikationen, die mit intravaskulären Maßnahmen verbunden sind (wie zum Beispiel Restenose, Embolisierung, Thrombose, Plaque-Ruptur und systemische Toxizität des Arzneimittels), verringern.
  • Zum Beispiel würde bei einem Patienten mit einer Verengung der Arteria femoralis superficialis eine Ballonangioplastie auf die herkömmliche Art durchgeführt werden (d.h. Durchfahren der Arterie mit einem Katheter zur Ballonangioplastie über einen Führungsdraht und Aufpumpen des Ballons über der Läsion). Vor, während und nach der Angioplastie würde eine Nadel Ultraschall-, fluoroskopisch oder CT-gesteuert durch die Haut eingeführt und ein therapeutischer Wirkstoff (z.B. in ein langsam freisetzendes Polymer imprägniertes Paclitaxel) würde durch die Nadel oder den Katheter ringförmig direkt um den Bereich der Einengung der Arterie infiltriert werden. Dies könnte um jede Arterie, jede Vene oder jedes Transplantat herum durchgeführt werden, aber ideale Kandidaten für diese Intervention schließen Erkrankungen der Halsschlagadern, der Koronarien, der Arteriae iliacae, femorales communes, femorales superficiales, popliteae und die Stellen einer Transplantatanastomose ein. Folgenchtige venöse Anwendungsstellen schließen eine Infiltration um Venen, in die Verweilkatheter eingelegt sind, ein.
  • Die hier bereitgestellten therapeutischen Wirkstoffe, therapeutischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen können zusammen mit Verpackungsmaterial, das Anweisungen für den Gebrauch solcher Materialien bereitstellt, in Behältern untergebracht werden. Im Allgemeinen beinhalten solche Anweisungen eine konkrete Aussage über die Konzentration der Reagenzien und in bestimmten Ausführungsformen auch über die jeweiligen Mengen von Vehikel-Bestandteilen oder Verdünnungsmitteln (z.B. Wasser, Salzlösung oder PBS), die zur Rekonstitution des antiangiogenen Faktors, der antiangiogenen Zusammensetzung oder der pharmazeutischen Zusammensetzung erforderlich sein können.
  • Die folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung aufgeführt, nicht als Einschränkung.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Herstellung von „Pasten"
  • Wie oben erwähnt verwendet die vorliegende Erfindung eine Reihe von Arzneimittelzusammensetzungen, die Polymere enthalten und in einer Reihe von klinischen Situationen eingesetzt werden können. Zum Beispiel können Zusammensetzungen hergestellt werden: (1) als „Thermopaste", die als Flüssigkeit auf eine gewünschte Stelle appliziert wird und sich bei einer bestimmten Temperatur (z.B. Körpertemperatur) zu einem Feststoff der gewünschten Form verfestigt; (2) als Spray (d.h. „Nanospray"), das entweder direkt oder durch eine spezialisierte Apparatur (z.B. Endoskopie) an eine gewünschte Stelle zugeführt werden kann und welches sich nachfolgend zu einem Feststoff verfestigt, der an dem Gewebe, auf das er appliziert wurde, anhaftet; (3) als anhaftender, biegsamer, elastischer, arzneimittelbeladener Polymerfilm, der entweder direkt oder durch eine spezialisierte Apparatur auf eine gewünschte Stelle appliziert wird und der vorzugsweise an der Stelle, auf die er appliziert wurde, anhaftet, und (4) als Flüssigkeit, die sich aus einer Suspension von Mikrosphären in einem geeigneten Trägermedium zusammensetzt und entweder direkt oder durch eine spezialisierte Apparatur auf eine gewünschte Stelle appliziert wird und eine Schicht von Mikrosphären auf der Applikati onsstelle zurücklässt. Typische Beispiele einer jeder der oben genannten Ausführungsformen werden unten ausführlicher dargelegt.
  • A. Verfahren zur Herstellung einer Thermopaste
  • Die im Rahmen dieser Experimente eingesetzten Reagenzien und Geräte beinhalten eine sterile Glasspritze (1 ml), einen Coming Heizplattenrührer, ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas, Gussformen (z.B. einen 50 μl DSC-Tiegel oder den inneren Teil des Deckels von einem 50 ml Zentrifugenröhrchen), Skalpell und Pinzette, Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht 10.000 bis 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania USA) und Paclitaxel (Sigma, Qualität mindestens 95% Reinheit).
  • Man wiege 5,00 g PCL direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas ein. Man gebe das Gefäß in einen 600 ml Becher mit 50 ml Wasser. Man erhitze den Becher behutsam auf 65°C und halte ihn für 20 Minuten bei dieser Temperatur. Dies ermöglicht es dem Polymer zu schmelzen. Man mische ein bekanntes Gewicht von Paclitaxel oder von einem anderen Hemmstoff der Angiogenese gründlich bei 65°C in das geschmolzene Polymer ein. Man gieße das geschmolzene Polymer in eine vorgewärmte (60°C-Ofen) Gussform. Man verwende einen Spatel, um den Vorgang des Gießens zu unterstützen. Man lasse die Gussform abkühlen, so dass das Polymer fest wird. Man schneide oder breche das Polymer in kleine Stücke (ungefähr in einer Größe von 2 mm mal 2 mm). Diese Stücke müssen in eine 1 ml Glasspritze passen. Man entferne den Kolben aus der 1 ml Glasspritze (man entferne nicht die Abdeckkappe von der Spitze) und lege sie auf eine Waage. Man setze die Waage auf Null.
  • Man wiege 0,5 g der Stücke direkt in das offene Ende der Spritze. Man stelle die Spritze aufrecht (mit der abgedeckten Spitze nach unten) in ein 500 ml Becherglas mit destilliertem Wasser bei 65°C (Coming Heizplattenrührer), so dass kein Wasser in das Gebinde eindringt. Das Polymer schmilzt innerhalb von 10 Minuten in dieser Apparatur vollständig. Wenn die Polymerstücke geschmolzen sind, entferne man das Gebinde aus dem Wasserbad, halte es horizontal und entferne die Abdeckkappe. Man führe den Kolben in das Gebinde ein und presse das geschmolzene Polymer zu einer klebrigen Masse an der Spitze des Gebindes zusammen. Man verschließe die Spritze und lasse sie auf Raumtemperatur abkühlen.
  • Zur Anwendung kann die Spritze erneut auf 60°C erhitzt und als Flüssigkeit, die sich bei Abkühlung auf Körpertemperatur verfestigt, verabreicht werden.
  • B. Verfahren zur Herstellung eines Nanosprays
  • Nanospray ist eine Suspension kleiner Mikrosphären in Salzlösung. Wenn die Mikrosphären sehr klein sind (d.h. unter 1 μm Durchmesser), bilden sie ein Kolloid, so dass die Suspension unter Schwerkraft nicht sedimentiert. Wie unten detaillierter beschrieben kann eine Suspension von 0,1 μm bis 1 μm Mikropartikeln hergestellt werden, die zur Ablagerung auf Gewebe durch ein handgepumptes Aerosol geeignet ist. Materialien und Geräte, die zur Herstellung von Nanospray eingesetzt werden können, beinhalten einen 200 ml wasserummantelten Becher (Kimax oder Pyrex), ein zirkulierendes Wasserbad von Haake, ein Rührwerk und einen Regler mit 2 Inch Durchmesser (4-Blatt-Propeller-Typ-Rührer aus rostfreiem Stahl; Marke Fisher), ein 500 ml Becherglas, einen Heizplattenrührer (Marke Corning), 4 × 50 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen (Nalgene), Szintillationsgefäße aus Glas mit Plastikeinsatzdeckeln, eine Tischzentrifuge (Beckman), eine Hochgeschwindigkeits-Standzentrifuge (JS 21 von Beckman), eine Analysenwaage von Mettler (AJ 100, 0,1 mg), eine von oben zu beladende Digitalwaage von Mettler (AE 163, 0,01 mg), ein automatisches Pipettiergerät (Gilson), sterile Pipettenspitzen, einen 20 ml Handzerstäuber (Pfeiffer pharmaceuticals), eine Abzugshaube mit Laminarfluss, Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht 10.000 bis 20.000; Polysciences, Warrington, Pennsylvania USA), "gewaschenes" (siehe oben) Ethylenvinylacetat ("EVA"), Poly(DL)milchsäure ("PLA" Molekulargewicht 15.000 bis 25.000; Polysciences), Polyvinylalkohol ("PVA" – Molekulargewicht 124.000 bis 186.000, 99% hydrolysiert; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI USA), Dichlormethan ("DCM" oder "Methylenchlorid"; HPLC-Qualität, Fisher scientific), destilliertes Wasser, sterile Salzlösung (Becton and Dickenson oder gleichwertig).
  • 1. Zubereitung von 5% (Gew./Vol.) Polymerlösungen
  • Abhängig von der Polymerlösung, die hergestellt wird, wiege man entweder 1,00 g PCL oder PLA oder jeweils 0,50 g PLA und gewaschenes EVA direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas ein. Unter Verwendung eines Messzylinders füge man 20 ml DCM zu und verschließe das Gefäß dicht. Man belasse das Gefäß für eine Stunde oder solange, bis sich das gesamte Polymer aufgelöst hat (gelegentliches Schütteln mit der Hand kann angewendet werden), bei Raumtemperatur (25°C). Die Auflösung des Polymers kann durch visuelle Überprüfung festgestellt werden; die Lösung sollte klar sein. Man kennzeichne das Gefäß mit dem Namen der Lösung und dem Datum, an dem sie hergestellt wurde. Man bewahre die Lösungen bei Raumtemperatur auf und verwende sie innerhalb von zwei Wochen.
  • 2. Zubereitung einer 3,5% (Gew./Vol.) PVA-Stammlösung
  • Die Lösung kann zubereitet werden, indem der unten angegebene Ablauf nachvollzogen wird oder indem die 5% (Gew./Vol.) PVA-Stammlösung, die für die Herstellung von Mikrosphären zubereitet wurde (siehe Beispiel 2), verdünnt wird. In Kürze werden 17,5 g PVA direkt in ein 600 ml Becherglas eingewogen und 500 ml destilliertes Wasser werden zugegeben. Man gebe einen 3 Inch Rührstab, der mit Teflon beschichtet ist, in den Becher. Man bedecke den Becher mit einem Abdeckglas, um Verluste durch Verdunstung zu reduzieren. Man platziere den Becher in ein 2000 ml Becherglas, das 300 ml Wasser enthält. Dies wird als Wasserbad wirken. Man rühre den PVA mit 300 Upm bei 85°C (Corning Heizplattenrührer) für 2 Stunden oder solange, bis er vollständig aufgelöst ist. Die Auflösung des PVA kann durch visuelle Überprüfung festgestellt werden; die Lösung sollte klar sein. Man verwende eine Pipette, um die Lösung in einen verschraubbaren Vorratsbehälter aus Glas zu überführen und bewahre sie für maximal zwei Monate bei 4°C auf. Diese Lösung sollte vor Verwendung oder Verdünnung auf Raumtemperatur erwärmt werden.
  • 3. Verfahren zur Herstellung von Nanospray
  • Man stelle den Rühr-Aufbau unter eine Abzugshaube. Man gebe 100 ml der 3,5% PVA-Lösung in den 200 ml wasserummantelten Becher. Man schließe das Haake-Wasserbad an den Becher an und lasse den Inhalt bei 27°C (+/–1°C) 10 Minuten äquilibrieren. Man stelle die Startgeschwindigkeit des Rührwerks auf 3.000 Upm (+/–200 Upm) ein. Man platziere das Blatt des Rührwerks in Höhe der Mitte der PVA-Lösung und starte das Rührwerk. Man lasse unter Verwendung eines automatischen 5 ml Pipettiergeräts 10 ml der Polymerlösung (die verwendete Polymerlösung basierend auf der Art des Nanosprays, das hergestellt wird) über einen Zeitraum von 2 Minuten in den gerührt werdenden PVA eintropfen. Nach 3 Minuten verstelle man die Rührgeschwindigkeit auf 2.500 Upm (+/–200 Upm) und belasse den Aufbau für 2,5 Stunden. Nach 2,5 Stunden entferne man das Rührblatt aus dem Nanospray-Ansatz und spüle es mit 10 ml destillierten Wassers ab. Man lasse die Spüllösung in den Nanospray-Ansatz fließen.
  • Man gieße den Mikrosphären-Ansatz in einen 500 ml Becher. Man spüle das ummantelte Wasserbad mit 70 ml destillierten Wassers. Man lasse die 70 ml Spüllösung in den Mikrosphären-Ansatz fließen. Man rühre den 180 ml Mikrosphären-Ansatz mit einem Glasstab und gieße gleiche Mengen davon in vier 50 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen. Man verschließe die Röhrchen. Man zentrifugiere die verschlossenen Röhrchen bei 10.000 g (+/–1.000 g) für 10 Minuten. Man ziehe unter Verwendung eines automatischen 5 ml Pipettiergeräts oder einer Vakuum-Saugung 45 ml der PVA-Lösung von jedem Mikrosphären-Pellet ab und verwerfe sie. Man gebe 5 ml destilliertes Wasser in jedes Zentnfugenröhrchen zu und verwende einen Vortex, um die Mikrosphären in jedem Röhrchen zu resuspendieren. Unter Verwendung von 20 ml destillierten Wassers vereinige man die vier Mikrosphären-Suspensionen in einem Zentrifugenröhrchen. Zum Waschen der Mikrosphären zentrifugiere man den Nanospray-Ansatz für 10 Minuten bei 10.000 g (+/–1.000 g). Man ziehe den Überstand vom Mikrosphären-Pellet ab. Man gebe 40 ml destilliertes Wasser hinzu und verwende einen Vortex, um die Mikrosphären zu resuspendieren. Man wiederhole diesen Vorgang zweimal zu insgesamt drei Waschgängen. Man führe einen vierten Waschgang durch, verwende aber nur 10 ml (nicht 40 ml) destilliertes Wasser, um die Mikrosphären zu resuspendieren. Nach dem vierten Waschgang fülle man den Mikrosphären-Ansatz in ein vorgewogenes Szintillationsgefäß aus Glas um.
  • Man verschließe das Gefäß und lasse es für 1 Stunde bei Raumtemperatur (25°C) ruhen, um die Mikrosphären von 2 μm und 3 μm Durchmesser unter Schwerkraft sedimen tieren zu lassen. Nach 1 Stunde ziehe man unter Verwendung eines automatischen 5 ml Pipettiergeräts 9 ml der Suspension ab. Man gebe die 9 ml in ein steriles, verschlossenes 50 ml Zentrifugenröhrchen. Man zentrifugiere die Suspension für 10 Minuten bei 10.000 g (+/–1.000 g). Man verwerte den Überstand und resuspendiere das Pellet in 20 ml steriler Salzlösung. Man zentrifugiere die Suspension für 10 Minuten bei 10.000 g (+/–1.000 g). Man verwerte den Überstand und resuspendiere das Pellet in steriler Salzlösung. Die Menge der verwendeten Salzlösung hängt von der endgültig erforderlichen Konzentration (üblicherweise 10% Gew./Vol.) der Suspension ab. Man spüle die Aerosol-Ausrüstung gründlich in steriler Salzlösung und gebe die Nanospray-Suspension zu dem Aerosol.
  • C. Herstellung eines mit Paclitaxel beladenen Nanosprays
  • Zur Herstellung von Nanospray, das Paclitaxel enthält, verwende man Paclitaxel (Sigma Qualität 95% Reinheit). Zur Zubereitung einer Polymer-Arzneimittel-Stammlösung wiege man die angemessene Menge Paclitaxel direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas ein. Die angemessene Menge wird auf Basis des Prozentsatzes Paclitaxel, der im Nanospray vorliegen soll, bestimmt. Zum Beispiel würde, wenn ein Nanospray, das 5% Paclitaxel enthält, benötigt würde, die Menge des abgewogenen Paclitaxels 25 mg betragen, weil die Menge des zugegebenen Polymers 10 ml einer 5%-Polymer-in-DCM-Lösung (siehe nächster Schritt) beträgt.
  • Man gebe 10 ml der geeigneten 5% Polymerlösung in das Gefäß, das das Paclitaxel enthält. Man verschließe das Gefäß und vortexe es oder mische es manuell, um das Paclitaxel aufzulösen (visuelle Überprüfung, um sicherzustellen, dass das Paclitaxel aufgelöst wurde). Man kennzeichne das Gefäß mit dem Herstellungsdatum. Dies soll an dem Tag, an dem es hergestellt wird, verwendet werden.
  • Man vollziehe man die oben beschriebenen Abläufe nach, mit der Ausnahme, dass die Polymerlösung durch die Polymer-Arzneimittel-Stammlösung (z.B. Paclitaxel) ersetzt wird.
  • D. Verfahren zur Herstellung eines Films
  • Der Begriff Film bezieht sich auf ein Polymer, das in einer von vielen geometrischen Formen ausgebildet ist. Der Film kann eine dünne, elastische Polymerbahn sein oder eine 2 mm dicke Polymerscheibe. Der Film ist dazu vorgesehen, auf offenes Gewebe aufgebracht zu werden, so dass jedes eingeschlossene Arzneimittel aus dem Polymer über eine lange Zeitspanne gewebsseitig freigesetzt wird. Die Filme können in verschiedenen Verfahren hergestellt werden, einschließlich zum Beispiel durch Guss oder Aufsprühen.
  • In der Gusstechnik wird das Polymer entweder geschmolzen und in eine Form gegossen oder in Dichlormethan gelöst und in eine Form gegossen. Das Polymer erstarrt jeweils dann, wenn es entweder abkühlt oder wenn das Lösungsmittel verdunstet. In der Aufsprühtechnik wird das Polymer in einem Lösungsmittel gelöst und auf Glas aufgesprüht. Mit dem Verdunsten des Lösungsmittels verfestigt sich das Polymer auf dem Glas. Wiederholtes Aufsprühen ermöglicht den Aufbau des Polymers zu einem Film, der vom Glas abgezogen werden kann.
  • Die im Rahmen dieser Experimente eingesetzten Reagenzien und Geräte beinhalten einen kleinen Becher, einen Heizplattenrührer von Corning, Gussformen (z.B. Deckel von 50 ml Zentrifugenröhrchen) und einen Halteapparat für die Gussformen, 20 ml Szintillationsgefäße aus Glas mit Deckel (Kunststoffeinsatz-Typ), TLC Vernebler, einen Stickstoffbehälter, Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht 10.000 bis 20.000; Polysciences), Paclitaxel (Sigma, Reinheit 95%), Ethanol, "gewaschenes" (siehe oben) Ethylenvinylacetat ("EVA"), Poly(DL)milchsäure ("PLA" – Molekulargewicht 15.000 bis 25.000; Polysciences), Dichlormethan (HPLC-Qualität, Fisher Scientific).
  • 1. Verfahren zur Herstellung von Filmen – Gießen in Schmelze
  • Man wiege ein bekanntes Gewicht von PCL direkt in ein kleines Becherglas ein. Man platziere den Becher in einen größeren Becher, der Wasser enthält (um als Wasserbad zu wirken) und stelle es bei 70°C für 15 Minuten oder solange, bis das Polymer komplett geschmolzen ist, auf die Heizplatte. Man gebe ein bekanntes Gewicht des Arzneimittels zum geschmolzenen Polymer und rühre die Mischung gründlich. Um die Dispersion des Arzneimittels im geschmolzenen PCL zu fördern, kann das Arzneimittel in einem kleinen Volumen (< 10% des Volumens des geschmolzenen PCL) von 100% Ethanol suspendiert/gelöst werden. Diese Ethanol-Suspension wird dann in das geschmolzene Polymer gemischt. Man gieße das geschmolzene Polymer in eine Form und lasse es abkühlen. Nach dem Abkühlen bewahre man den Film in einem Behälter auf.
  • 2. Verfahren zur Herstellung von Filmen – Gießen in Lösungsmittel
  • Man wiege ein bekanntes Gewicht von PCL direkt in ein 20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas ein und gebe ausreichend DCM hinzu, um eine 10%-Lösung (Gew./Vol.) zu erreichen. Man verschließe das Gefäß und mische die Lösung. Man gebe soviel Paclitaxel in die Lösung, wie erforderlich ist, um die gewünschte Endkonzentration von Paclitaxel zu erreichen. Man verwende manuelles Schütteln oder Vortexen zum Auflösen des Paclitaxels in der Lösung. Man lasse die Lösung eine Stunde lang ruhen (um die vorhandenen Luftblasen zu reduzieren) und gieße sie dann langsam in eine Gussform. Die verwendete Gussform beruht auf der erforderlichen Form. Man lege die Gussform über Nacht unter eine Abzugshaube. Dies wird die Verdunstung des DCM ermöglichen. Man lasse den Film zur Lagerung entweder in der Gussform oder ziehe ihn ab und bewahre ihn in einem abgedichteten Behälter auf.
  • 3. Verfahren zur Herstellung von Filmen – gesprüht
  • Man wiege ausreichend Polymer direkt in ein 20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas ein und gebe ausreichend DCM hinzu, um eine 2%-Lösung (Gew./Vol.) zu erreichen. Man verschließe das Gefäß und mische die Lösung, um das Polymer aufzulösen (manuelles Schütteln). Man montiere Formen in eine geeignete Apparatur zum Halten von Formen in der Abzugshaube. Man positioniere die Apparatur zum Halten der Formen 6 bis 12 Inches über dem Boden der Abzugshaube auf einer geeigneten Unterlage (z.B. ein umgedrehtes 2000 ml Becherglas), um ein horizontales Sprühen zu ermöglichen. Man fülle unter Verwendung einer automatischen Pipette ein geeignetes Volumen (mindestens 5 ml) der 2% Polymerlösung in ein separates 20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas um. Man gebe ausreichend Paclitaxel zur Lösung hinzu und löse es durch manuelles Schütteln des verschlossenen Gefäßes auf. Zum Vorbereiten auf das Sprühen entferne man den Verschluß von diesem Gefäß und tauche (nur) das Rohr eines TLC Verneblers in die Polymerlösung ein. Beachte: Das Reservoir des Verneblers wird bei diesem Verfahren nicht benutzt – das 20 ml – Szintillationsgefäß aus Glas agiert als Reservoir.
  • Man schließe den Stickstoffbehälter an die Gaszuleitung des Verneblers an. Man erhöhe allmählich den Druck, bis die Zerstäubung und das Sprühen beginnt. Man registriere den Druck und verwende diesen Druck während der Prozedur. Zum Besprühen der Formen wende man oszillierende Sprühstöße von 5 Sekunden mit einer Zeit zum Trocknen von 15 Sekunden zwischen den Sprühstößen an. Während der Zeit zum Trocknen knicke man die Gasleitung mit den Fingern ab, um eine Vergeudung des Sprays zu verhindern. Das Sprühen wird fortgesetzt, bis eine geeignete Dicke des Polymers auf der Form abgelagert ist. Die Dicke beruht auf den Anforderungen. Man lasse die aufgesprühten Filme auf den Formen und bewahre sie in abgedichteten Behältern auf.
  • D. Verfahren zur Herstellung einer Nanopaste
  • Nanopaste ist eine Suspension von Mikrosphären, die in einem hydrophilen Gel suspendiert sind. In einem Aspekt der Erfindung kann das Gel oder die Paste als Methode, mit Arzneimittel beladene Mikrosphären an das Zielgewebe heranzubringen, auf Gewebe aufgetragen werden. Da sie auf Wasser basiert, wird die Paste schnell mit Körperflüssigkeiten verdünnt werden, was eine Verringerung der Klebrigkeit der Paste und einen Hang der Mikrosphären, auf dem benachbarten Gewebe abgelagert zu werden, verursacht. Damit wird ein Vorrat von in Mikrosphären verkapseltem Arzneimittel nahe am Zielgewebe abgelagert.
  • Die im Rahmen dieser Experimente eingesetzten Reagenzien und Geräte beinhalten Bechergläser, Carbopol 925 (pharmazeutische Qualität, Goodyear Chemical Co.), destilliertes Wasser, Natrumhydroxid (1 M) in wässrger Lösung, Natriumhydroxid (5 M) in wässriger Lösung, Mikrosphären in der Größe von 0,1 μm bis 3 μm, die mit 20% (Gew./Vol.) in Wasser suspendiert sind (siehe oben).
  • 1. Zubereitung von 5% (Gew./Vol.) Carbopol Gel
  • Man gebe eine ausreichende Menge Carbopol zu 1 M Natriumhydroxid, um eine 5% (Gew./Vol.) Lösung zu erreichen. Um das Carbopol im 1 M Natriumhydroxid aufzulösen, lasse man die Mischung für etwa eine Stunde ruhen. Während dieser Zeitperiode rühre man die Mischung mit einem Glasstab. Nach einer Stunde messe man den pH-Wert der Mischung. Ein niedriger pH-Wert zeigt an, dass das Carbopol nicht vollständig gelöst ist. Der pH-Wert, den man erreichen will, ist 7,4. Man verwende 5 M Natriumhydroxid, um den pH-Wert einzustellen. Dies wird bewerkstelligt, indem man langsam Tropfen von 5 M Natriumhydroxid zu der Mischung gibt, die Mischung rührt und den pH-Wert der Mischung misst. Es dauert üblicherweise ungefähr eine Stunde, um pH-Wert auf 7,4 einzustellen. Wenn ein pH-Wert von 7,4 erst einmal erreicht ist, bedecke man das Gel und lasse es für 2 bis 3 Stunden ruhen. Nach dieser Zeitperiode prüfe man den pH-Wert, um sicherzustellen, dass er noch 7,4 beträgt. Wenn er sich geändert hat, stelle man ihn unter Verwendung von 5 M Natriumhydroxid wieder auf 7,4 ein. Man lasse das Gel für einige Stunden ruhen, um sicherzustellen, dass der pH-Wert stabil bei 7,4 bleibt. Man wiederhole den Arbeitsschritt bis der gewünschte pH-Wert erreicht und stabil ist. Man kennzeichne den Behälter mit dem Namen des Gels und dem Datum. Das Gel ist innerhalb der nächsten Woche zur Herstellung von Nanopaste zu verwenden.
  • 2. Verfahren zur Herstellung einer Nanopaste
  • Man gebe ausreichend Mikrosphären von 0,1 μm bis 3 μm zu Wasser, um eine 20% Suspension der Mikrosphären herzustellen. Man gebe 8 ml des 5% (Gew./Vol.) Carbopol-Gels in ein Becherglas. Man gebe 2 ml der 20% Mikrosphären-Suspension in den Becher zu. Man rühre die Mischung unter Verwendung eines Glasstabes oder eines Rührspatels, um die Mikrosphären gründlich im Gel zu verteilen. Dies dauert üblicherweise 30 Minuten. Wenn die Mikrosphären erst einmal im Gel verteilt sind, fülle man die Mischung in ein Vorratsgefäß. Man lagere das Vorratsgefäß bei 4°C. Es muss innerhalb einer Periode von einem Monat verwendet werden.
  • Beispiel 2
  • Herstellung von Mikrosphären
  • Die für die unten beschriebene Herstellung von Mikrosphären bevorzugte Ausrüstung beinhaltet: einen 200 ml wasserummantelten Becher (Kimax oder Pyrex), ein zirkulierendes Wasserbad von Haake, ein Rührwerk und einen Regler mit 2 Inch Durchmesser (4-Blätter, Propeller-Typ-Rührer aus rostfreiem Stahl – Marke Fisher), ein 500 ml Be cherglas, einen Heizplattenrührer (Marke Coming), 4 × 50 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen (Nalgene), Szintillationsgefäße aus Glas mit Plastikeinsatzdeckeln, eine Tischzentrifuge (GPR Beckman), eine Hochgeschwindigkeits-Standzentrifuge (JS 21 von Beckman), eine Analysenwaage von Mettler (AJ 100, 0,1 mg), eine von oben zu beladende Digitalwaage von Mettler (AE 163, 0,01 mg), ein automatisches Pipettiergerät (Gilson). Reagenzien beinhalten Polycaprolacton ("PCL" – Molekulargewicht 10.000 bis 20.000; Polysciences Warrington, Pennsylvania; USA), "gewaschenes" (Verfahren des "Waschens" siehe unten) Ethylenvinylacetat ("EVA"), Poly(DL)milchsäure ("PLA" – Molekulargewicht 15.000 bis 25.000; Polysciences), Polyvinylalkohol ("PVA" – Molekulargewicht 124.000 bis 186.000; 99% hydrolysiert; Aldrich Chemical Co., Milwaukee WI, USA), Dichlormethan ("DCM" oder "Methylenchlorid"; HPLC-Qualität, Fisher scientific) und destilliertes Wasser.
  • A. Herstellung von 5% (Gew./Vol.) Polymerlösungen
  • Abhängig von der Polymerlösung, die hergestellt wird, werden entweder 1,00 g PCL oder PLA oder jeweils 0,50 g PLA und gewaschenes EVA direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas eingewogen. Dann werden 20 ml DCM zugegeben und das Gefäß wird dicht verschlossen. Das Gefäß wird für eine Stunde (gelegentliches Schütteln kann angewendet werden) oder solange, bis sich das gesamte Polymer aufgelöst hat (die Lösung sollte klar sein), bei Raumtemperatur (25°C) gelagert. Die Lösung kann für mindestens zwei Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
  • A. Herstellung einer 5% (Gew./Vol.) PVA-Stammlösung
  • Fünfundzwanzig Gramm PVA werden direkt in ein 600 ml Becherglas eingewogen. Fünfhundert Milliliter destilliertes Wasser werden zugegeben, zusammen mit einem 3 Inch Rührstab, der mit Teflon beschichtet ist. Der Becher wird mit Glas abgedeckt, um Verluste durch Verdunstung zu reduzieren, und in ein 2000 ml Becherglas, das 300 ml Wasser (welches als Wasserbad wirkt) enthält, gestellt. Der PVA wird mit 300 Upm bei 85°C (Coming Heizplattenrührer) für 2 Stunden oder solange, bis er vollständig aufgelöst ist, gerührt. Die Auflösung des PVA kann durch visuelle Überprüfung festgestellt werden; die Lösung sollte klar sein. Die Lösung wird dann in einen verschraubbaren Vorratsbehälter aus Glas umgefüllt und bei 4°C für maximal zwei Monate aufbewahrt.
  • Diese Lösung sollte jedoch vor Verwendung oder Verdünnung auf Raumtemperatur erwärmt werden.
  • C. Verfahren zur Herstellung von Mikrosphären
  • Basierend auf der Größe der Mikrosphären, die hergestellt werden (siehe Tabelle 1), werden 100 ml der PVA-Lösung (Konzentration in Tabelle 1 angegeben) in den 200 ml wasserummantelten Becher gegeben. Das zirkulierende Wasserbad von Haake wird an diesen Becher angeschlossen und man lässt den Inhalt bei 27°C (+/–1°C) für 10 Minuten äquilibrieren. Basierend auf der Größe der Mikrosphären, die hergestellt werden (siehe Tabelle 1), wird die Startgeschwindigkeit des Rührwerks eingestellt und das Blatt des Rührwerks wird in Höhe der Mitte der PVA-Lösung platziert. Das Rührwerk wird dann gestartet und unter Verwendung eines automatischen 5 ml Pipettiergeräts lässt man dann 10 ml der Polymerlösung (die verwendete Polymerlösung basierend auf der Art der Mikrosphären, die hergestellt werden) über einen Zeitraum von 2 Minuten in den gerührt werdenden PVA eintropfen. Nach 3 Minuten wird die Rührgeschwindigkeit angepasst (siehe Tabelle 1) und die Lösung wird für weitere 2,5 Stunden gerührt. Das Rührblatt wird dann aus dem Mikrosphären-Ansatz entfernt und mit 10 ml destillierten Wassers abgewaschen, so dass die Spüllösung in den Mikrosphären-Ansatz läuft. Der Mikrosphären-Ansatz wird dann in einen 500 ml Becher gegossen und das ummantelte Wasserbad wird mit 70 ml destillierten Wassers, die man auch in den Mikrosphären-Ansatz fließen lässt, gespült. Der 180 ml Mikrosphären-Ansatz wird dann mit einem Glasstab gerührt und gleiche Mengen werden in vier 50 ml Polypropylen Zentrifugenröhrchen gefüllt. Die Röhrchen werden dann verschlossen und für 10 Minuten zentrifugiert (Kraft in Tabelle 1 angegeben). Es wird dann ein automatisches 5 ml Pipettiergerät oder eine Vakuum-Saugung eingesetzt, um 45 ml der PVA-Lösung von jedem Mikrosphären-Pellet abzuziehen.
  • Tabelle I Anforderungen an PVA-Konzentrationen, Rührgeschwindigkeiten und Zentrifugalkräfte für jeden Bereich der Mikrosphären-Durchmesser
    Figure 00510001
  • Fünf Milliliter destillierten Wassers werden dann in jedes Zentrifugenröhrchen zugegeben, die dann gevortext werden, um die Mikrosphären zu resuspendieren. Die vier Mikrosphären-Suspensionen werden dann mit 20 ml destillierten Wassers in einem Zentrifugenröhrchen vereinigt und für weitere 10 Minuten zentrifugiert (Kraft in Tabelle 1 angegeben). Dieser Vorgang wird noch zweimal zu insgesamt drei Waschgängen wiederholt. Die Mikrosphären werden dann ein letztes Mal zentrifugiert und in 10 ml destillierten Wassers resuspendiert. Nach dem letzten Waschgang wird der Mikrosphären-Ansatz in ein vorgewogenes Szintillationsgefäß aus Glas umgefüllt. Das Gefäß wird verschlossen und man lässt es über Nacht bei Raumtemperatur (25°C) ruhen, um die Mikrosphären unter Schwerkraft sedimentieren zu lassen. Mikrosphären, die in den Größenbereich von 0,1 μm bis 3 μm fallen, sedimentieren nicht unter Schwerkraft, so verbleiben sie in den 10 ml Suspension.
  • D. Trocknung von Mikrosphären mit einem Durchmesser von 10 μm bis 30 μm oder von 30 μm bis 100 μm
  • Nachdem sich die Mikrosphären bei Raumtemperatur über Nacht gesetzt haben, wird ein automatisches 5 ml Pipettiergerät oder eine Vakuum-Saugung verwendet, um den Überstand von den sedimentierten Mikrosphären abzuziehen. Man lässt die Mikrosphären im unverschlossenen Gefäß in einem Schubfach für die Dauer einer Woche oder solange, bis sie völlig trocken sind (konstantes Gewicht des Gefäßes), trocknen. Eine schnellere Trocknung kann bewerkstelligt werden, indem das unverschlossene Gefäß in der Abzugshaube unter einem langsamen Fluss von Stickstoff (Fluss etwa 10 ml/min) gelassen wird. Nach vollständiger Trocknung (konstantes Gewicht des Gefäßes) wird das Gefäß gewogen und verschlossen. Das gekennzeichnete und verschlossene Gefäß wird bei Raumtemperatur in einem Schubfach aufbewahrt. Mikrosphären werden normalerweise nicht länger als 3 Monate aufbewahrt.
  • E. Trocknung von Mikrosphären mit einem Durchmesser von 0,1 μm bis 3 μm
  • Mikrosphären dieses Größenbereichs werden nicht sedimentieren, somit bleiben sie bei 4°C für maximal vier Wochen in Suspension. Um die Mikrosphären-Konzentration in den 10 ml Suspension festzustellen, wird eine Probe von 200 μl der Suspension in ein vorgewogenes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Das Röhrchen wird dann bei 10.000 g zentrifugiert (Eppendorf Tisch-Mikrozentrifuge), der Überstand wird entfernt und man lässt das Röhrchen bei 50°C über Nacht trocknen. Das Röhrchen wird dann erneut gewogen, um das Gewicht der getrockneten Mikrosphären im Röhrchen zu bestimmen.
  • F. Herstellung von Mikrosphären, die mit Paclitaxel beladen sind
  • Um Mikrosphären, die Paclitaxel enthalten, herzustellen, wird eine angemessene Menge abgewogenen Paclitaxels (basierend auf dem Prozentsatz von Paclitaxel, das verkapselt werden soll) direkt in ein 20 ml Szintillationsgefäß aus Glas gegeben. Zehn Milliliter einer geeigneten Polymerlösung werden in das das Paclitaxel enthaltende Gefäß zugegeben, welches dann gevortext wird, bis das Paclitaxel aufgelöst ist.
  • Mikrosphären, die Paclitaxel enthalten, können dann im Wesentlichen so hergestellt werden, wie es oben in den Schritten (C) bis (E) beschrieben ist.
  • Beispiel 3
  • Tensid-beschichtete Mikrosphären
  • A. Materialien und Methoden
  • Mikrosphären wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben aus Poly(DL)milchsäure (PLA), Polymethylmethacrylat (PMMA), Polycaprolacton (PCL) und 50:50 Ethylenvinylacetat (EVA):PLA hergestellt. Die Größe reichte von 10 bis 100 μm mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 45 μm.
  • Menschliches Blut wurde von gesunden Freiwilligen gewonnen. Neutrophile (weiße Blutkörperchen) wurden unter Verwendung von Dextran-Sedimentierung und Ficoll-Hypaque-Zentrifugationstechniken aus dem Blut abgesondert. Neutrophile wurden mit 5 Millionen Zellen pro ml in Hanks Buffered Salt Solution ("HBSS") suspendiert.
  • Die Aktivierungsgrade der Neutrophilen wurden anhand der Generierung reaktiver Sauerstoffarten, wie sie durch Chemilumineszenz nachgewiesen wurden, bestimmt. Insbesondere wurde Chemilumineszenz durch Verwendung eines LKB Luminometers mit 1 μM Luminol-Verstärker bestimmt. Die Plasma-Vorbeschichtung (oder Opsonierung) vom Mikrosphären wurde durchgeführt, indem 10 mg Mikrosphären in 0,5 ml Plasma suspendiert und bei 37°C für 30 min gemischt wurden.
  • Die Mikrosphären wurden dann in 1 ml HBSS gewaschen und das zentrifugierte Mikrosphären-Pellet wurde bei 37°C zum Zeitpunkt t = 0 zur Neutrophilen-Suspension zugegeben. Die Oberflächen der Mikrosphären wurden unter Verwendung eines Tensids mit der Bezeichnung Pluronic F127 (BASF) modifiziert, indem 10 mg der Mikrosphären in 0,5 ml einer 2% Gew./Gew.-Lösung von F127 in HBSS für 30 min bei 37°C suspendiert wurden. Die Mikrosphären wurden dann zweimal in 1 ml HBSS gewaschen, bevor sie zu den Neutrophilen oder zu Plasma zum weiteren Vorbeschichten gegeben wurden.
  • B. Ergebnisse
  • 1 zeigt, dass die unbehandelten Mikrosphären Chemilumineszenz-Werte von weniger als 50 mV ergeben. Diese Werte repräsentieren niedrige Grade der Aktivierung von Neutrophilen. Zum Vergleich können inflammatorische Mikrokristalle Werte nahe bei 1000 mV ergeben, lösliche chemische Aktivatoren können Werte nahe bei 5000 mV ergeben. Wenn die Mikrosphären jedoch mit Plasma vorbeschichtet sind, werden alle Chemilumineszenz-Werte in den Bereich von 100 bis 300 mV verstärkt (siehe 1). Diese Grade der Neutrophilen-Reaktion oder -Aktivierung können als leicht entzündlich betrachtet werden. PMMA ergab die größte Reaktion und könnte als am meisten entzündlich betrachtet werden. Nach Plasma-Vorbehandlung (oder Opsonierung) zeigten sowohl PLA als auch PCL eine drei- bis viermal stärkere Aktivierung von Neutrophilen, aber es gibt in dieser Hinsicht keinen großen Unterschied zwischen den beiden Polymeren. EVA:PLA wird in Angiogenese-Formulierungen wahrscheinlich nicht verwendet, weil die Mikrosphären schwierig getrocknet und in wässrigem Puffer resuspendiert werden können. Dieser Effekt des Plasmas wird als Opsonierung bezeichnet und ist das Ergebnis der Adsorption von Antikörpern oder Komplement-Molekülen auf der Oberfläche. Die adsorbierten Arten interagieren mit Rezeptoren auf den weißen Blutkörperchen und verursachen eine verstärkte Zellaktivierung.
  • Die 25 beschreiben jeweils die Auswirkungen der Plasma-Vorbeschichtung von PCL, PMMA, PLA und EVA:PLA und zeigen auch die Auswirkung einer Pluronic-F127-Vorbeschichtung vor der Plasma-Vorbeschichtung der Mikrosphären. Diese Figuren zeigen alle die gleiche Auswirkung: (1) Plasma-Vorbeschichtung verstärkt die Reaktion; (2) Pluronic-F127-Vorbeschichtung hat allein keine Auswirkung; (3) die durch Plasma-Vorbeschichtung hervorgerufene verstärkte Reaktion der Neutrophilen kann durch Vorbehandlung der Oberfläche der Mikrosphären mit 2% Pluronic F127 stark inhibiert werden.
  • Die Natur der adsorbierten Proteinart wurde auch durch Elektrophorese untersucht. Unter Verwendung dieser Methode wurde gezeigt, dass die Vorbehandlung der polymeren Oberfläche mit Pluronic F127 die Adsorption von Antikörpern an die polymere Oberfläche hemmte.
  • Die 69 zeigen ebenso die Auswirkungen der Vorbeschichtung von PCL-, PMMA-, PLA- oder EVA:PLA-Mikrosphären (jeweils) entweder mit IgG (2 mg/ml) oder mit 2% Pluronic F127 und anschließend IgG (2 mg/ml). Wie man aus diesen Figuren ersehen kann, kann die durch das Vorbeschichten der Mikrosphären mit IgG verursachte verstärkte Reaktion durch eine Behandlung mit Pluronic F127 gehemmt werden.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass durch die Vorbehandlung der polymeren Oberfläche aller vier Mikrosphären-Arten mit Pluronic F127 die "inflammatorische" Reaktion von Neutrophilen auf Mikrosphären gehemmt werden kann.
  • Beispiel 4
  • Verkapselung von Paclitaxel
  • Fünfhundert Mikrogramm von entweder Paclitaxel oder Baccatin (ein Paclitaxel-Analogon, erhältlich bei Inflazyme Pharmaceuticals Inc., Vancouver, British Columbia, Canada) werden in 1 ml einer 50:50 ELVAX:Poly-L-Milchsäure-Mischung in dcm gelöst. Anschließend werden Mikrosphären in einer Dissolutionssapparatur (sechs-Spindel-Dissolutionstester, VanderKamp, Van Kell Industries Inc., U.S.A.) dreifach bei 200 Upm, 42°C, über 3 Stunden hergestellt. Die so hergestellten Mikrosphären werden zweimal in Wasser gewaschen und ihre Größe wird mit dem Mikroskop bestimmt.
  • Die Bestimmung der Paclitaxel-Verkapselung erfolgt in einem UV/vis-Test (UV/vis lambda max. bei 237 nm, Fluoreszenz-Test bei Excitation 237, Emission bei 325 nm; Fluoreszenz-Ergebnisse werden in eckigen Klammem [ ] dargestellt). Unter Einsatz der oben beschriebenen Verfahren können von insgesamt 500 μg Ausgangsmaterial 58 μg (+/–12 μg) [75 μg (+/–25 μg)] Paclitaxel verkapselt werden. Dies stellt 12% (+/–2,4%) [15% (+/–5%)] des Originalgewichts oder 1,2% (+/–0,25%) [1,5% (+/–0,5%)] des Polymer-Gewichts dar. Nach 18-stündigem Rotieren in einem Ofen bei 37°C wurden 10,3% (+/–10%) [6% (+/–5,6%)] des gesamten Paclitaxels aus den Mikrosphären freigesetzt.
  • Bei Baccatin können von insgesamt 500 μg Ausgangsmaterial 100 +/– 15 μg [83 +/– 23 μg] Baccatin verkapselt werden. Dies stellt 20% (+/–3%) [17% (+/–5%)] des Origi nalgewichts von Baccatin und 2% (+/–0,3%) [1,7% (+/–0,5%)] des Polymer-Gewichts dar. Nach 18-stündigem Rotieren in einem Ofen bei 37°C wurden 55% (+/–13%) [60% (+/–23%)) des Baccatins aus den Mikrosphären freigesetzt.
  • Beispiel 5
  • Kontrollierte Abgabe von Paclitaxel aus Mikrosphären, die sich aus einer Mischung aus Ethylenvinylacetat-Copolymer und Poly(D,L-milchsäure) zusammensetzen. In vivo Untersuchung der Mikrosphären im CAM-Test.
  • Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären, die sich aus einer Mischung aus einem biologisch abbaubaren Poly(D,L-milchsäure)-Polymer (PLA) und einem nicht abbaubaren Ethylenvinylacetat-Copolymer (EVA) zusammensetzen. Weiterhin werden die in vitro Freisetzungsrate und die antiangiogene Aktivität von Paclitaxel, das aus Mikrosphären, die auf eine CAM aufgebracht wurden, freigesetzt wird, gezeigt.
  • Die Reagenzien, die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, beinhalten Paclitaxel, welches von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen wird; PLA (Molekulargewicht 15.000–25.000) und EVA (60% Vinylacetat) (bezogen von Polysciences (Warrington, PA)); Polyvinylalkohol (PVA) (Molekulargewicht 124.000–186.000, 99% hydrolysiert, bezogen von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI)) und Dichlormethan (DCM) (HPLC-Qualität, erworben bei Fisher Scientific Co.). Es wird durchgehend destilliertes Wasser verwendet.
  • A. Herstellung von Mikrosphären
  • Mikrosphären werden im Wesentlichen unter Verwendung der Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. In Kürze werden 5% (Gew./Vol.) Polymerlösungen in 20 ml DCM hergestellt, wobei EVA:PLA-Mischungsverhältnisse zwischen 35:65 und 90:10 verwendet werden. Zu 5 ml von 2,5% (Gew./Vol.) PVA in Wasser in einem 20 ml Glasgefäß wird tropfenweise unter Rühren 1 ml der Polymerlösung zugegeben. Sechs ähnliche Gefäße werden in ein Sechsplatz-Rührwerk, Dissolutionstester (Vanderkamp), gestellt und bei 200 Upm gerührt. Die Temperatur der Gefäße wird über 15 min von Raumtemperatur auf 40°C angehoben und für 2 Stunden bei 40°C gehalten. Die Gefäße werden mit 500 × g zentrifugiert und die Mikrosphären werden dreimal in Wasser gewaschen. Bei manchen EVA:PLA Polymer-Mischungen aggregierten die Mikrosphären-Proben während der Waschphase infolge der Entfernung des dispergierenden oder emulgierenden Wirkstoffs, PVA. Dieser Aggregationseffekt könnte semiquantitativ ausgewertet werden, da sich die aggregierten Mikrosphären verbanden und die verbundene Polymermasse auf der Oberfläche des Waschwassers trieb. Diese Polymerschicht auf der Oberfläche wird während der Waschbehandlungen verworfen und die verbleibenden, pelletierten Mikrosphären werden gewogen.
  • Der Prozentsatz der Aggregation wird berechnet aus:
  • Figure 00570001
  • Mit Paclitaxel beladene Mikrosphären (0,6% (Gew./Gew.) Paclitaxel) werden hergestellt, indem das Paclitaxel in der 5% (Gew./Vol.) Polymerlösung in DCM gelöst wird. Das verwendete Polymer-Mischungsverhältnis beträgt 50:50 EVA:PLA. Es wird jeweils eine Mikrosphären-Fraktion mit "großen" und mit "kleinen" Größen hergestellt, indem die Paclitaxel/Polymerlösung tropfenweise zu 2,5% (Gew./Vol.) PVA beziehungsweise zu 5% (Gew./Vol.) PVA zugegeben wird. Die Dispersionen werden bei 40°C mit 200 Upm für 2 Stunden gerührt, zentrifugiert und 3 mal in Wasser gewaschen, wie oben beschrieben. Die Mikrosphären werden luftgetrocknet und die Größe von Proben wird unter Verwendung eines optischen Mikroskops mit einem Mikrometer bestimmt. Pro Probe werden mehr als 300 Mikrosphären betrachtet. Es werden Kontroll-Mikrosphären (ohne Paclitaxel) wie oben beschrieben hergestellt und ihre Größe wird gemessen.
  • B. Effizienz der Verkapselung
  • Bekannte Gewichte Paclitaxel-beladener Mikrosphären werden in 1 ml DCM gelöst, 20 ml 40% Acetonitril in Wasser werden bei 50°C zugegeben und gevortext, bis das DCM verdunstet ist. Die Paclitaxel-Konzentration im 40% Acetonitril wird durch HPLC unter Verwendung einer mobilen Phase von Wasser:Methanol:Acetonitril (37:5:58) bei einer Flussrate von 1 ml/min (isokratische Pumpe von Beckman), einer C8 reverse-Phase-Säule (Beckman) und von UV-Detektion bei 232 nm bestimmt. Um die Wiedergewinnungseffizienz dieser Extraktionsprozedur zu bestimmen, werden bekannte Gewichte Paclitaxel von 100–1000 μg in 1 ml DCM gelöst und dreifach derselben Extraktionsprozedur wie oben beschrieben unterzogen. Die Wiedergewinnungsraten sind immer höher als 85% und die Werte der Effizienz der Verkapselung werden entsprechend korrigiert.
  • C. Untersuchungen zur Arzneimittel-Freisetzung
  • In 15 ml Glasröhrchen mit Schraubverschluss werden 10 ml einer 10 mM Phosphatgepufferten Salzlösung (PBS), pH 7,4 und 35 mg mit Paclitaxel beladene Mikrosphären gegeben. Diese Röhrchen werden bei 37°C gemischt und in vorgegebenen Zeitintervallen bei 1500 × g für fünf Minuten zentrifugiert und der Überstand wird zur Untersuchung aufbewahrt. Die Mikrosphären-Pellets werden in frischer PBS(10 ml) resuspendiert und wieder inkubiert. Die Paclitaxel-Konzentrationen werden durch Extraktion in 1 ml DCM mit nachfolgender Verdunstung bis zur Trockenheit unter einem Stickstoffstrom, Rekonstitution in 1 ml 40% Acetonitril in Wasser und Analyse unter HPLC-Verwendung wie oben beschrieben bestimmt.
  • D. Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
  • Mikrosphären werden auf Objektträger gegeben, mit Gold bedampft und es werden unter Verwendung eines bei 15 kV arbeitenden Philips 501B SEM mikroskopische Aufnahmen angefertigt.
  • E. CAM-Untersuchungen
  • Befruchtete Hühnerembryonen werden vor der schalenlosen Kultivierung für 4 Tage inkubiert. Der Inhalt der Eier wird bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3% CO2 für 2 Tage inkubiert. Am Tag 6 der Inkubation werden 1 mg-Aliquots von mit 0,6% Paclitaxel beladenen Mikrosphären oder von Kontroll-Mikrosphären (frei von Paclitaxel) direkt auf die CAM-Oberfläche aufgetragen. Nach einer Einwirkzeit von 2 Tagen wird das Gefäßnetz unter Verwendung eines Stereomikroskops, das an eine Videokamera angeschlossen ist, untersucht; die Videosignale werden dann auf einem Computer angezeigt und ausgedruckt.
  • F. Ergebnisse
  • Mikrosphären, die aus 100% EVA hergestellt wurden, werden frei in PVA-Lösungen suspendiert, aber bei dem folgenden Waschen in Wasser, um den PVA zu entfernen, aggregierten sie in beträchtlichem Umfang, verbanden sich oder verschmolzen miteinander. Ein Mischen des EVA mit einem zunehmenden Anteil von PLA ergab Mikrosphären, die, wenn sie in Wasser gewaschen wurden, eine verminderte Tendenz dazu zeigten, zu aggregieren und sich zu verbinden, wie in 10A beschrieben. Eine 50:50 Mischung von EVA:PIA bildete Mikrosphären mit einer guten physikalischen Stabilität, das heißt, die Mikrosphären blieben voneinander getrennt und gut suspendiert mit einer vernachlässigbaren Aggregation und Verbindung.
  • Der Größenbereich für die Mikrosphären-Fraktion der "kleinen" Größe wird so festgelegt, dass > 95% der Mikrosphären-Probe (nach Gewicht) zwischen 10–30 mm sind und für die Mikrosphären-Fraktion der "großen" Größe so, dass > 95% der Probe (nach Gewicht) zwischen 30–100 mm sind. Typische rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von mit Paclitaxel beladenen 50:50 EVA:PLA Mikrosphären sind in den 10B beziehungsweise 10C dargestellt. Die Mikrosphären sind kugelförmig mit einer glatten Oberfläche und zeigen keinen Anhalt für festes Arzneimittel auf der Oberfläche der Mikrosphären. Die Effizienz der Beladung von 50:50 EVA:PIA Mikrosphären mit Paclitaxel ist zwischen 95–100% bei initialen Paclitaxel-Konzentrationen zwischen 100–1000 mg Paclitaxel pro 50 mg Polymer. Es gibt keinen signifikanten Unterschied (Student t-Test, p < 0,05) zwischen der Effizienz der Verkapselung von "kleinen" und "großen" Mikrosphären.
  • Der Zeitverlauf der Freisetzung von Paclitaxel aus mit 0,6% (Gew./Vol.) beladenen 50:50 EVA:PLA Mikrosphären wird in 10D für "kleine" (offene Kreise) und für "große" (geschlossene Kreise) Mikrosphären dargestellt. Die Untersuchungen zur Freisetzungsrate werden in dreifachen Röhrchen in drei gesonderten Experimenten vorgenommen. Die Freisetzungsprofile sind biphasisch mit einer anfänglichen schnellen Pacli taxel-Freisetzung oder "burst"-Phase, die in den ersten 4 Tagen aus Mikrosphären von beiden Größenbereichen auftritt. Dem folgt eine Phase von wesentlich langsamerer Freisetzung nach. Es gibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Freisetzungsraten aus "kleinen" oder "großen" Mikrosphären. Zwischen 10–13% des gesamten Paclitaxel-Gehalts der Mikrosphären werden in 50 Tagen freigesetzt.
  • Die mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären (0,6% Gew./Vol. Beladung) werden mit einem CAM-Test untersucht und die Ergebnisse werden in 10E dargestellt. Die Paclitaxel-Mikrosphären setzten ausreichend Arzneimittel frei, um eine gefäßfreie Zone im umgebenden Gewebe zu erzeugen (10F). Man beachte, dass es in unmittelbarer Nachbarschaft der Mikrosphären ("MS" in den 10E und 10F) einen Bereich gibt, in dem Blutgefäße vollständig fehlen (Zone 1); weiter von den Mikrosphären entfernt gibt es einen Bereich mit unterbrochenen, nicht funktionierenden Kapillaren (Zone 2); es ist nur ein Abstand von etwa 6 mm von den Mikrosphären, bis die Kapillaren wieder normal werden. In CAM, die mit Kontroll-Mikrosphären (ohne Paclitaxel) behandelt wurden, liegt eine normale Architektur des Kapillarnetzes vor (Figur nicht gezeigt).
  • Diskussion
  • Die peritubuläre Verabreichung von Arzneimitteln ist eine leicht invasive chirurgische Technik. Daher würde Idealerweise eine perivaskuläre Formulierung eines antiproliferativen Arzneimittels wie zum Beispiel Paclitaxel das Arzneimittel an der Stelle eines Tumors oder einer Erkrankung in einer für eine Aktivität ausreichenden Konzentration für eine verlängerte Zeitperiode in der Größenordnung einiger Monate freisetzen. EVA ist ein gewebeverträgliches, nicht abbaubares Polymer, das in beträchtlichem Umfang zur kontrollierten Abgabe von Makromolekülen über lange Zeitperioden (> 100 Tage) verwendet werden ist.
  • EVA wurde initial als polymeres Biomaterial zur Herstellung von Mikrosphären mit in der Polymermatrix verteiltem Paclitaxel ausgewählt. Jedoch aggregierten und verklumpten Mikrosphären, die aus 100% EVA hergestellt worden waren, während des Waschvorganges nahezu vollständig.
  • Polymere und Copolymere, die auf Milchsäure und Glycolsäure basieren, sind physiologisch inert und biokompatibel und werden durch Hydrolyse zu toxikologisch akzeptablen Produkten abgebaut. Copolymere der Milchsäure und von Glycolsäuren haben schnellere Abbauraten als PLA und mit Arzneimitteln beladene Mikrosphären, die unter Verwendung dieser Copolymere hergestellt wurden, sind für eine verlängerte, kontrollierte Freisetzung über mehrere Monate nicht geeignet.
  • 10A zeigt, dass ein ansteigender Anteil von PLA in einer EVA:PLA-Mischung das Ausmaß der Aggregation der Mikrosphären-Suspensionen reduzierte. Zumischungen von 50% oder weniger EVA in der EVA:PLA-Matrix ergaben physikalisch stabile Mikrosphären-Suspensionen in Wasser oder PBS. Es wird für alle nachfolgenden Untersuchungen ein Mischungsverhältnis von 50:50 EVA:PLA gewählt.
  • Es konnten durch Veränderung der Konzentration des Emulgators, PVA, in der wässrigen Phase Fraktionen von Mikrosphären mit unterschiedlichen Größenbereichen hergestellt werden. "Kleine" Mikrosphären werden bei der höheren PVA-Konzentration von 5% Gew./Vol. hergestellt, wohingegen "große" Mikrosphären bei 2,5% Gew./Vol. PVA hergestellt werden. Alle anderen Variablen bei der Herstellung sind dieselben für beide Mikrosphären-Größenfraktionen. Die höhere Konzentration des Emulgators ergab ein visköseres wässriges Dispersionsmedium und produzierte kleinere Polymer/Paclitaxel/DCM-Tröpfchen, die in der wässrigen Phase emulgiert waren, und somit kleinere Mikrosphären. Die mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären enthielten zwischen 95–100% des ursprünglichen Paclitaxels, das zur organischen Phase zugegeben worden war, in den festen Mikrosphären verkapselt. Die geringe Wasserlöslichkeit von Paclitaxel sprach für eine Aufteilung in eine organische Phase, die das Polymer enthielt.
  • Die Freisetzungsraten von Paclitaxel aus 50:50 EVA:PtA Mikrosphären sind sehr langsam, wobei weniger als 15% des Paclitaxels, mit dem beladen wurde, in 50 Tagen freigesetzt werden. Die anfängliche "burst-Phase" der Arzneimittelfreisetzung kann auf Diffusion des Arzneimittels aus dem oberflächlichen Bereich der Mikrosphären (nahe der Oberfläche der Mikrosphären) zurückzuführen sein.
  • Es wird vermutet, dass der Mechanismus der Arzneimittelfreisetzung aus nicht abbaubaren polymeren Matrices wie zum Beispiel EVA die Diffusion von Wasser durch die verteilte Arzneimittelphase im Polymer, die Auflösung des Arzneimittels und die Diffusion der Lösung durch eine Reihe verbindender, flüssigkeitsgefüllter Poren einbezieht. Es wurde gezeigt, dass Mischungen aus EVA und PLA in einem Bereich von 30 bis 70% EVA in PLA nicht mischbar oder bikontinuierlich sind. In Degradationsuntersuchungen wurde PLA in PBS-Puffer bei 37°C nach einer Induktions- oder Verzögerungsperiode hydrolytisch abgebaut und aus der Matrix der EVA:PLA-Polymer-Mischung ausgewaschen, wobei sie ein inaktives, schwammähnliches Skelett hinterließ. Obwohl die Induktionsperiode und die Rate des PLA-Abbaus und des Auswaschens aus den gemischten Matrices von dem PLA-Anteil in der Matrix und der Geschichte des Vorgangs abhängig war, gibt es durchweg wenig oder keinen PLA-Verlust innerhalb von 40–50 Tagen.
  • Obwohl eine gewisse PLA-Erosion aus den 50:50 EVA:PLA Mikrosphären innerhalb der 50 Tage der Untersuchung der in vitro Freisetzungsrate (10C) aufgetreten sein kann, ist es wahrscheinlich, dass der primäre Mechanismus der Arzneimittelfreisetzung aus der Polymer-Mischung in der Diffusion einer Lösung durch ein Porennetz in der Polyrnermatrix besteht.
  • Zum Abschluss der Untersuchung der Freisetzungsrate werden die Mikrosphären auf die Menge des verbleibenden Arzneimittels hin untersucht. Die Werte für die Prozentsätze des nach 50 Tagen Inkubation in den Mikrosphären-Proben verbleibenden Paclitaxels betragen 94% +/– 9% und 89% +/– 12% für die Mikrosphärenfraktionen der "kleinen" beziehungsweise der "großen" Größe.
  • Mikrosphären, die mit 6 mg pro mg Polymer (0,6%) beladen waren, ergaben eine ausgedehnte Hemmung der Angiogenese, wenn sie auf die CAM des Hühnerembryos aufgebracht wurden (10E und 10F).
  • Beispiel 6
  • Verkapselung von therapeutischem Wirkstoff in Poly(ε-caprolacton) Mikrosphären. Hemmung der Angiogenese im CAM-Test durch mit Paclitaxel beladene Mikrosphären.
  • Dieses Beispiel untersucht das Profil der in vitro Freisetzungsrate von Paclitaxel aus biologisch abbaubaren Mikrosphären aus Poly(ε-caprolacton) und zeigt die in vivo antiangiogene Aktivität von Paclitaxel, welches aus diesen Mikrosphären freigesetzt wird, wenn sie auf CAM aufgebracht werden.
  • Reagenzien, die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, beinhalten: Poly(ε-caprolacton) ("PCL") (Molekulargewicht 35.000–45.000; bezogen von Polysciences (Warrington, PA)); Dichlormethan ("DCM") von Fisher Scientific Co., Canada; Polyvinylalkohol (PVP) (Molekulargewicht 12.000–18.000, 99% hydrolysiert) von Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, Wis.) und Paclitaxel von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Soweit nicht anders angegeben werden alle Chemikalien und Reagenzien so benutzt, wie sie geliefert wurden. Es wird durchgehend destilliertes Wasser verwendet.
  • A. Herstellung von Mikrosphären
  • Mikrosphären werden im Wesentlichen unter Verwendung der Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt. In Kürze werden mit 5% (Gew./Gew.) Paclitaxel beladene Mikrosphären hergestellt, indem 10 mg Paclitaxel und 190 mg PCL in 2 ml DCM aufgelöst werden, zu 100 ml einer wässrigen 1% PVP-Lösung zugegeben und mit 1000 Upm bei 25°C für 2 Stunden gerührt werden. Die Mikrosphären-Suspension wird mit 1000 × g für 10 Minuten (Beckman GPR) zentrifugiert, der Überstand wird verworfen und die Mikrosphären werden dreimal mit Wasser gewaschen. Die gewaschenen Mikrosphären werden über Nacht luftgetrocknet und bei Raumtemperatur aufbewahrt. Kontroll-Mikrosphären (ohne Paclitaxel) werden wie oben beschrieben hergestellt. Es werden auch Mikrosphären, die 1% und 2% Paclitaxel enthalten, hergestellt. Die Größe der Mikrosphären wird unter Verwendung eines optischen Mikroskops mit Mikrometer bestimmt.
  • B. Effizienz der Verkapselung
  • Ein bekanntes Gewicht von mit Arzneimittel beladenen Mikrosphären (etwa 5 mg) wird in 8 ml Acetonitril gelöst und 2 ml destilliertes Wasser werden zugegeben, um das Polymer auszufällen. Die Mischung wird bei 1000 g für 10 Minuten zentrifugiert und die Menge des verkapselten Paclitaxels wird aus der Absorption des Überstandes, die in einem UV-Spectrophotometer (Hewlett-Packard 8452A Diode Array Spectrophotometer) bei 232 nm gemessen wird, berechnet.
  • C. Untersuchungen zur Arzneimittelfreisetzung
  • Etwa 10 mg mit Paclitaxel beladene Mikrosphären werden in 20 ml einer 10 mM Phosphat-gepufferten Salzlösung, pH 7,4 (PBS) in Röhrchen mit Schraubverschlüssen suspendiert. Die Röhrchen werden bei 37°C über ihre Enden geschwenkt und zu vorgegebenen Zeitintervallen werden 19,5 ml Überstand abgenommen (nachdem man den Mikrosphären Gelegenheit gegeben hat, sich am Boden abzusetzen), durch einen 0,45 μm Membranfilter gefiltert und zur Paclitaxel-Analyse zurückbehalten. Ein gleiches Volumen PBS wird ersatzweise in jedes Röhrchen nachgefüllt, um die Sinkbedingungen während der Untersuchung beizubehalten. Die Filtrate werden mit 3 × 1 ml DCM extrahiert, die DCM-Extrakte unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockenheit evaporisiert, wieder in 1 ml Acetonitril gelöst und mit HPLC unter Verwendung einer mobilen Phase von Wasser:Methanol:Acetonitril (37:5:58) bei einer Flussrate von 1 ml min–1 (isokratische Pumpe von Beckman), einer C8 reverse-Phase-Säule (Beckman) und von UV-Detektion (Shimadzu SPD A) bei 232 nm untersucht.
  • D. CAM-Untersuchungen
  • Befruchtete Hühnerembryonen werden vor der schalenlosen Kultivierung für 4 Tage inkubiert. Am Tag 6 der Inkubation werden 1 mg-Aliquots von mit 5% Paclitaxel beladenen Mikrosphären oder von Kontroll-Mikrosphären (frei von Paclitaxel) direkt auf die CAM-Oberfläche aufgetragen. Nach einer Einwirkzeit von 2 Tagen wird das Gefäßnetz unter Verwendung eines Stereomikroskops, das an eine Videokamera angeschlossen ist, untersucht; die Videosignale werden dann auf einem Computer angezeigt und ausgedruckt.
  • E. Rasterelektronenmikroskopie
  • Mikrosphären werden auf Objektträger gegeben, mit Gold bedampft und dann in ein bei 15 kV arbeitendes Philips 501B Rasterelektronenmikroskop gegeben.
  • F. Ergebnisse
  • Der Größenbereich der Mikrosphären liegt zwischen 30–100 μm, obwohl es Anzeichen dafür gibt, dass es in allen mit Paclitaxel beladenen oder Kontroll-Mikrosphären-Präparationen einige Mikrosphären gibt, die aus diesem Rahmen fallen. Die Effizienz der Beladung von PCL-Mikrosphären mit Paclitaxel ist immer höher als 95% für alle untersuchten Arzneimittelbeladungen. Die Rasterelektranenmikroskopie zeigte, dass alle Mikrosphären kugelförmig sind und dass viele eine raue oder zerklüftete Oberflächenmorphologie zeigten. Es gab keine Anhaltspunkte für festes Arzneimittel auf der Oberfläche der Mikrosphären.
  • Der Zeitverlauf der Paclitaxel-Freisetzung aus mit 1%, 2% und 5% beladenen PCL-Mikrosphären ist in 11A dargestellt. Die Profile der Freisetzungsraten sind biphasisch. Es gibt bei allen Arzneimittelbeladungen eine anfängliche schnelle Paclitaxel-Freisetzung oder "burst-Phase". Die burst-Phase trat bei den 1%-und 2%-Paclitaxel-Beladungen über 1–2 Tage und bei den mit 5% beladenen Mikrosphären über 3–4 Tage auf. Der anfänglichen Phase einer schnellen Freisetzung folgt eine Phase einer signifikant langsameren Arzneimittelfreisetzung. Bei Mikrosphären, die 1% oder 2% Paclitaxel enthalten, gibt es nach 21 Tagen keine weitere Paclitaxel-Freisetzung. Bei einer Beladung mit 5% Paclitaxel hatten die Mikrosphären nach 21 Tagen etwa 20% des gesamten Arzneimittelgehalts freigesetzt.
  • 11B zeigt CAM, die mit Kontroll-PCL-Mikrosphären behandelt wurden, und 11C zeigt die Behandlung mit Mikrosphären, die mit 5% Paclitaxel beladen waren. Die CAM mit den Kontroll-Mikrosphären zeigt eine normale Architektur des Kapillarnetzes. Die mit Paclitaxel-PCL-Mikrosphären behandelte CAM zeigt einen deutlichen Gefäßrückgang und Zonen, in denen das Kapillarnetz fehlt.
  • G. Diskussion
  • Die Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode zur Herstellung von mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären ergab sehr hohe Effizienzen der Paclitaxel-Verkapselung von zwischen 95–100%. Dies ist auf die schlechte Wasserlöslichkeit von Paclitaxel und seine hydrophobe Natur zurückzuführen, was für eine Aufteilung in eine organische Lösungsmittelphase, die das Polymer enthält, spricht.
  • Das biphasische Freisetzungsprofil für Paclitaxel ist für das Freisetzungsmuster für viele Arzneimittel aus biologisch abbaubaren Polymer-Matrices typisch. Poly(ε-caprolacton) ist ein aliphatischer Polyester, der unter physiologischen Bedingungen durch Hydrolyse abgebaut werden kann und nicht toxisch und gewebskompatibel ist. Der Abbau von PCL ist signifikant langsamer als der von umfassend untersuchten Polymeren und Copolymeren von Milch- und Glycolsäuren und ist daher zur Entwicklung von Systemen zur lange anhaltenden peritubulären Abgabe von Arzneimitteln geeignet. Man nimmt an, dass die anfängliche schnelle oder burst-Phase der Freisetzung von Paclitaxel auf Freisetzung des Arzneimittels aufgrund von Diffusion aus dem oberflächlichen Bereich der Mikrosphären (nahe der Oberfläche der Mikrosphären) zurückzuführen ist. Es ist nicht wahrscheinlich, dass die Freisetzung von Paclitaxel in der zweiten (langsameren) Phase der Freisetzungsprofile auf den Abbau oder das Auswaschen von PCL zurückzuführen ist, weil Untersuchungen gezeigt haben, dass es unter in vitro Bedingungen in Wasser über einen Zeitraum von 7,5 Wochen keinen signifikanten Gewichtsverlust und keine Oberflächenerosion von PCL gibt. Die langsamere Phase der Freisetzung von Paclitaxel ist wahrscheinlich auf die Auflösung des Arzneimittels in flüssigkeitsgefüllten Poren in der Polymermatrix und auf Diffusion durch die Poren zurückzuführen. Die höhere Freisetzungsrate bei einer höheren Beladung mit Paclitaxel ist wahrscheinlich das Ergebnis eines weiter verzweigten Porennetzes in der Polymermatrix.
  • Es wurde gezeigt, dass Paclitaxel-Mikrosphären mit einer 5% Beladung ausreichend Arzneimittel freisetzen, um eine ausgedehnte Hemmung der Angiogenese hervorzurufen, wenn sie auf die CAM aufgebracht werden. Die Hemmung des Wachstums der Blutgefäße führte zu einer gefäßfreien Zone wie in 11C gezeigt.
  • Beispiel 7
  • Mit therapeutischem Wirkstoff beladene peritubuläre polymere Filme, die aus Ethylenvinylacetat und einem Tensid bestehen.
  • Zwei Arten von Filmen werden in diesem Beispiel untersucht: reine EVA Filme, die mit Paclitaxel beladen sind, und Filme aus EVA/Tensid-Mischungen, die mit Paclitaxel beladen sind.
  • Die Tenside, die untersucht werden, sind zwei hydrophobe Tenside (Span 80 und Pluronic L101) und ein hydrophiles Tensid (Pluronic F127). Die Pluronic-Tenside sind selbst Polymere, was eine attraktive Eigenschaft darstellt, weil sie mit EVA gemischt werden können, um die verschiedenen Eigenschaften der Abgabe von Arzneimitteln zu optimieren. Span 80 ist ein kleineres Molekül, das auf gewisse Art in der Polymermatrix verteilt ist und keine Mischung bildet.
  • Tenside sind nützlich, um die Freisetzungsraten von Paclitaxel aus den Filmen zu modulieren und bestimmte physikalische Parameter der Filme zu optimieren. Ein Aspekt der mit Tensid gemischten Filme, der anzeigt, dass die Freisetzungsraten von Arzneimitteln gesteuert werden können, ist die Fähigkeit, die Geschwindigkeit und das Ausmaß, in dem die Verbindung in Wasser quellen wird, zu verändern. Die Diffusion von Wasser in eine Polymer-Arzneimittel-Matrix ist entscheidend für die Freisetzung des Arzneimittels aus dem Träger. Die 12C und 12D zeigen den Grad der Quellung der Filme in Abhängigkeit von Änderungen des Tensidgehalts in der Mischung. In mehr als zwei Monaten quellen reine EVA Filme in keinem wesentlichen Maß auf. Indem jedoch die Menge des dem EVA zugegebenen Tensids gesteigert wird, ist es möglich, den Grad der Quellung der Verbindung zu steigern und auch durch Steigerung der hydrophilen Eigenschaften kann die Quellung gesteigert werden.
  • Die Ergebnisse der Experimente mit diesen Filmen sind unten in den 12A–E dargestellt. In Kürze zeigt 12A die Freisetzung von Paclitaxel (in mg) aus reinen EVA Filmen in Abhängigkeit von der Zeit. 12B zeigt den Prozentsatz des verbleibenden Arzneimittels für dieselben Filme. Wie aus diesen beiden Figuren ersehen werden kann, steigen die Freisetzungsraten des Arzneimittels mit der Steigerung der Bela dung mit Paclitaxel (d.h. mit Erhöhung des Paclitaxel-Prozentsatzes nach Gewicht), was die erwartete Abhängigkeit von der Konzentration zeigt. Mit der Steigerung der Beladung mit Paclitaxel steigt auch der Prozentsatz des im Film verbleibenden Paclitaxels, was darauf hinweist, dass eine höhere Beladung attraktiver für Formulierungen für eine lang anhaltende Freisetzung sein kann.
  • Die physikalische Festigkeit und Elastizität der Filme werden in 12E bewertet. In Kürze zeigt 12E Spannungs-Dehnungs-Kurven für reine EVA-Filme und für Filme aus EVA-Tensid-Mischungen. Diese grobe Dehnungsmessung zeigt, dass die Elastizität der Filme mit der Zugabe von Pluronic F127 gesteigert wird und dass die Zugfestigkeit (Spannung beim Bruch) mit der Zugabe von Pluronic F127 konzentrationsabhängig steigt. Elastizität und Festigkeit sind wichtige Gesichtspunkte beim Entwickeln eines Films, der zu besonderen peritubulären klinischen Anwendungen gehandhabt werden kann ohne eine dauernde Deformierung der Verbindung zu verursachen.
  • Die obigen Daten zeigen die Fähigkeit bestimmter Tensidzusätze, die Freisetzungsraten von Arzneimitteln zu regulieren und die physikalischen Eigenschaften des Vehikels zu ändern.
  • Beispiel 8
  • Integration von Methoxypolyethylenglycol 350 (MePEG) in Poly(ε-caprolacton), um eine Formulierung zur kontrollierten Abgabe von therapeutischen Wirkstoffen aus einer Paste zu entwickeln.
  • Reagenzien und Ausrüstung, die in diesen Experimenten eingesetzt wurden, umfassen Methoxypolyethylenglycol 350 ("MePEG" – Union Carbide, Danbury, CT). MePEG ist bei Raumtemperatur flüssig und hat einen Gefrierpunkt von 10°C bis –5°C.
  • A. Herstellung einer MePEG/PCL-Paste, die Paclitaxel enthält
  • MePEG/PCL-Paste wird hergestellt, indem man zunächst eine Menge Paclitaxel in MePEG auflöst und dies dann in geschmolzenes PCL integriert. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass kein DCM benötigt wird.
  • B. Analyse des Schmelzpunkts
  • Die Schmelzpunkte von PCL/MePEG-Polymer-Mischungen können durch dynamische Differenzkalorimetrie von 30°C bis 70°C bei einer Aufheizgeschwindigkeit von 2,5°C pro Minute bestimmt werden. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in den 13A und 13B gezeigt. In Kürze wird, wie in 13A gezeigt, der Schmelzpunkt der Polymer-Mischung (wie durch die thermische Analyse bestimmt) konzentrationsabhängig erniedrigt. Die Schmelzpunkte der Polymer-Mischungen sind in 13A als Funktion der MePEG-Konzentration aufgetragen. Dieser niedrigere Schmelzpunkt wirkt sich auch als eine verlängerte Zeit, die das Polymer benötigt, um ausgehend von der Schmelze zu erstarren, aus, wie in 13B gezeigt. Eine 30:70 Mischung von MePEG:PCL braucht mehr als doppelt solange wie PCL allein, um ausgehend von der flüssigen Schmelze zu erstarren.
  • C. Messung der Sprödigkeit
  • Die Aufnahme von MePEG in PCL scheint einen Feststoff von geringerer Sprödigkeit, verglichen mit PCL allein, zu produzieren. Als "grober" Weg, dies zu quantifizieren, lässt man eine beschwerte Nadel aus gleicher Höhe auf Polymer-Mischungen, die von 0% bis 30% MePEG enthalten, fallen und misst dann die Strecke, über die die Nadel in den Feststoff eindringt. Das sich hieraus ergebende Diagramm ist in 13C abgebildet. Die Punkte sind als Durchschnitt +/–1 Std.Abw. aus vier Messungen angegeben.
  • Zum Vergleich wurde auch eine Probe aus Paraffinwachs untersucht und in diese drang die Nadel über eine Strecke von 7,25 mm +/– 0,3 mm ein.
  • D. Messung der Freisetzung von Paclitaxel
  • Pellets des Polymers (PCL enthaltend 0%, 5%, 10% oder 20% MePEG) werden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4) bei 37°C inkubiert und die prozentuale Änderung des Polymer-Gewichts wird über die Zeit gemessen. Wie aus 13D ersehen werden kann, steigt das Maß des Gewichtsverlustes mit der Konzentration des ursprünglich in der Mischung vorliegenden MePEG an. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Gewichtsverlust auf eine Freisetzung von MePEG aus der Polymermatnx in die Inkubationsflüssigkeit zurückzuführen ist. Dies würde darauf hindeuten, dass Paclitaxel leicht aus einer MePEG/PCL-Mischung freigesetzt werden wird, weil Paclitaxel vor der Aufnahme in PCL erst im MePEG gelöst wird.
  • E. Auswirkungen von Änderungen der MePEG-Anteile auf die Freisetzung von Paclitaxel
  • Es werden Thermopasten, die zwischen 0,3% und 20% MePEG in PCL enthalten, hergestellt. Diese werden mit 1% Paclitaxel beladen. Die Freisetzung von Paclitaxel aus 10 mg Pellets in PBS bei 37°C über die Zeit wird unter Verwendung von HPLC überwacht. Wie in 13E gezeigt wird, beeinflußt die Menge von MePEG in der Formulierung nicht die Menge des Paclitaxels, das freigesetzt wird.
  • F. Auswirkungen von Änderungen der Paclitaxel-Anteile auf die Gesamtmenge von Paclitaxel, die aus einer 20% MePEG/PCL-Mischung freigesetzt wird.
  • Es werden Thermopasten, die 20% MePEG in PCL enthalten, hergestellt und mit Paclitaxel zwischen 0,2% und 10% beladen. Die Freisetzung von Paclitaxel wird wie oben beschreiben gemessen. Wie in 13F gezeigt wird, steigt die über die Zeit freigesetzte Paclitaxel-Menge mit einer erhöhten Beladung mit Paclitaxel an. Wenn dies als freigesetzter Prozentsatz des gesamten Paclitaxels aufgetragen wird, wird diese Reihenfolge jedoch umgekehrt (13G). Dies gibt Auskunft über das in der Paste verbleibende restliche Paclitaxel und erlaubt eine Vorhersage der Zeitdauer, über die Paclitaxel aus der 20% MePEG Thermopaste freigesetzt werden kann.
  • G. Festigkeitsmessung verschiedener MePEG/PCL-Mischungen
  • Es wird ein CT-40 Testgerät für mechanische Festigkeit verwendet, um die Festigkeit von festen Polymer-"Tabletten" mit einem Durchmesser von 0,88 cm und einer durchschnittlichen Dicke von 0,560 cm zu messen. Die Polymer-Tabletten sind Mischungen von MePEG bei Konzentrationen von 0%, 5%, 10% oder 20% in PCL.
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in 13H gezeigt, in der sowohl die Reißfestigkeit als auch die Zeit bis zum Zerreißen als Funktion der Prozentanteils von MePEG in der Mischung aufgetragen sind. Eine ANOVA mit einer Variablen zeigte, dass sich die Dicken der Tabletten innerhalb jeder Gruppe nicht unterscheiden. Wie aus 13H ersehen werden kann, verringerte die Zugabe von MePEG in PCL die Härte des resultierenden Feststoffes.
  • H. Auswirkungen von γ-Bestrahlung auf die Freisetzung von Paclitaxel
  • Mit 20% Paclitaxel beladene PCL:MePEG (80:20) Paste wurde γ-bestrahlt und auf die Freisetzung von Paclitaxel über die Zeit hin untersucht. Die Ergebnisse sind in 30 wiedergegeben.
  • Zusammenfassend kann auf Basis der obigen Versuche die Schlußfolgerung gezogen werden, dass die Zugabe von MePEG das Polymer weniger spröde und wachsähnlicher macht, den Schmelzpunkt erniedrigt und die Verfestigungszeit des Polymers erhöht. Alle diese Faktoren verbessern die Anwendungseigenschaften der Paste. Bei geringen Konzentrationen (20%) hat MePEG keine Auswirkungen auf die Freisetzung von Paclitaxel aus PCL. Gamma-Bestrahlung scheint wenig Einfluß auf die Freisetzung von Paclitaxel zu haben.
  • Beispiel 9
  • Änderung der Freisetzung von therapeutischem Wirkstoff aus Thermopaste durch Verwendung von Poly(D,L-milchsäure) mit niedrigem Molekulargewicht
  • Wie oben erörtert können abhängig vom gewünschten therapeutischen Effekt polymere Träger mit entweder schneller oder langsamer Freisetzung gewünscht werden. Zum Beispiel ergeben Polycaprolacton (PCL) und Mischungen von PCL mit Poly(ethylenglycol) (PEG) Zusammensetzungen, die Paclitaxel über einen Zeitraum von mehreren Monaten freisetzen. Insbesondere die Diffusion von Paclitaxel in den Polymeren ist aufgrund seiner großen Molekülgröße und seinen extrem hydrophoben Eigenschaften sehr langsam.
  • Andererseits ergibt Poly(D,L-milchsäure) (PDLLA) mit niedrigem Molekulargewicht einen schnellen Abbau, der abhängig von ihrem ursprünglichen Molekulargewicht von einem Tag bis zu mehreren Monaten dauert. In diesem Fall wird die Freisetzung von Paclitaxel vom Abbau des Polymers dominiert. Ein anderes Charakteritstikum von PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht ist ihr niedriger Schmelzpunkt (d.h. 40°C–60°C), der sie zu ei nem geeigneten Material zur Herstellung von Thermopaste macht. Wie unten ausführlicher beschrieben können mehrere verschiedene Verfahren eingesetzt werden, um die Abbaurate des Polymers zu steuern, einschließlich zum Beispiel durch Änderung des Molekulargewichts der PDLLA und/oder durch Mischen mit PCL, PDLLA oder Poly(lactid-co-glycolid) (PLGA) mit hohem Molekulargewicht.
  • A. Materialien für die Experimente
  • D,L-Milchsäure wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erworben. PCL (Molekulargewicht 10–20.000) wurde von Polysciences, Warrington, PA bezogen. PDLLA mit hohem Molekulargewicht (intrinsische Viskosität 0,60 dl/g) und PLGA waren von Birmingham Polymers.
  • B. Synthese von PDLLA mit niedrigem Molekulargwicht
  • PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht wurde aus D,L-Milchsäure durch Polykondensation synthetisiert. In Kürze wurde D,L-Milchsäure in einem Becherglas bei 200°C mit Stickstoffspülung und magnetischem Rühren für eine gewünschte Zeit erhitzt. Die Viskosität erhöhte sich während der Polymerisation infolge des Ansteigens des Molekulargewichts. Mit unterschiedlichen Polymerisationszeiten wurden drei Arten herstellt, d.h. 40 min (Molekulargewicht 800), 120 min, 160 min.
  • C. Formulierung von Paclitaxel-Thermopasten
  • Folgende Materialien wurden durch manuelles Mischen bei einer Temperatur von etwa 60°C zu 20% mit Paclitaxel beladen:
    • 1. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, mit einer Polymerisationszeit von 40 min.
    • 2. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, mit einer Polymerisationszeit von 120 min.
    • 3. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, mit einer Polymerisationszeit von 160 min.
    • 4. Eine Mischung aus 50:50 PDLLA mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min.
    • 5. Eine Mischung aus 50:50 PLGA mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min.
    • 6. Mischungen aus PCL mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min, mit PCL:PDLLA von 10:90, 20:80, 40:60, 60:40 und 20:80.
  • Mischungen aus PDLLA oder PLGA mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht werden durch Auflösen der Materialien in Aceton mit nachfolgendem Trocknen hergestellt.
  • D. Untersuchung der Freisetzung
  • Die Freisetzung von Paclitaxel in PBS Albumin-Puffer bei 37°C wurde wie oben beschrieben mit HPLC zu verschiedenen Zeiten gemessen.
  • E. Ergebnisse
  • PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min, war ein weiches Material von hellgelber Farbe. Die Farbe ist vielleicht auf die Oxidation während der Polykondensation zurückzuführen. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 120 min (gelb) und 160 min (braun) waren bei Raumtemperatur spröde Feststoffe. Bei 60°C wurden alle geschmolzen. Mischungen von 50:50 aus PDLLA oder PLGA mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min, schmolzen auch bei 60°C.
  • Während der Freisetzung zerbrachen PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min und 120 min, innerhalb eines Tages in Fragmente, andere Materialien waren bis zu dieser Niederschrift (3 Tage) intakt.
  • Die Freisetzung von Paclitaxel aus den Formulierungen 2–5 ist in 14 dargestellt. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min und 120 min, ergaben die schnellste Freisetzung infolge des Zerbrechens der Paste. Die Freisetzung war möglicherweise löslichkeitslimitiert. PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 160 min, ergab auch eine schnelle Freisetzung, behielt aber noch ein intaktes Pellet bei. Zum Beispiel wurden 10% des Paclitaxels, mit dem beladen worden war, an einem Tag freigesetzt. Die Mischungen von 50:50 aus PDLLA oder PLGA mit hohem Molekulargewicht und PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht, 40 min, waren langsamer, d.h. 3,4% und 2,2% Freisetzung an einem Tag.
  • Obwohl oben nicht ausdrücklich dargelegt, kann eine Vielzahl anderer polymerer Träger hergestellt werden, einschließlich (1) Poly(D,L-milchsäure), Poly(L-milchsäure), Poly(glycolsäure), Poly(6-hydroxycapronsäure), Poly(5-hydroxyvaleriansäure), Poly(4-hydroxybuttersäure) mit niedrigem (500–10.000) Molekulargewicht und ihre Copolymere; (2) Mischungen aus den obigen (#1); (3) Mischungen aus den obigen (#1) mit Poly(D,L-milchsäure), Poly(L-milchsäure), Poly(glycolsäure), Poly(6-hydroxycapronsäure), Poly(5-hydroxyvalenansäure), Poly(4-hydroxybuttersäure) mit hohem Molekulargewicht und ihren Copolymeren; und (4) Copolymeren von Poly(ethylenglycol) und Pluronics mit Poly(D,L-milchsäure), Poly(L-milchsäure), Poly(glycolsäure), Poly(6-hydroxycapronsäure), Poly(5-hydroxyvaleriansäure), Poly(4-hydroxybuttersäure) und ihren Copolymeren.
  • Beispiel 10
  • Herstellung von polymeren Zusammensetzungen, die wasserlösliche Zusätze und Paclitaxel enthalten.
  • A. Herstellung von polymeren Zusammensetzungen
  • Es wurden Mikropartikel von Copräzipitaten von Paclitaxel/Zusatz hergestellt und anschließend zu PCL gegeben, um Pasten zu bilden. In Kürze wurde Paclitaxel (100 mg) in 0,5 ml Ethanol (95%) gelöst und mit dem Zusatz (100 mg), der vorher in 1 ml destillierten Wassers gelöst oder dispergiert worden war, gemischt. Die Mischung wurde zerrieben, bis sich eine glatte Paste bildete. Die Paste wurde auf einer Petrischale verteilt und über Nacht bei 37°C luftgetrocknet. Die getrocknete Masse wurde unter Verwendung eines Mörsers und eines Stößels pulverisiert und durch ein Sieb (Endecotts Test Sieves Ltd, London, England) mit Maschengröße #140 (106 μm) gedrückt. Die Mikropartikel (40%) wurden dann bei 65°C in geschmolzenes PCL (60%) integriert, entsprechend einer 20% Beladung mit Paclitaxel. Die in der Untersuchung verwendeten Zusätze waren Gelatine (Type B, 100 bloom, Fisher Scientific), Methylcellulose (British Drug Houses), Dextran, T500 (Pharmacia, Schweden), Albumin (Fisher Scientific) und Natriumchlorid (Fisher Scientific). Mikropartikel aus Paclitaxel und Gelatine oder Albumin wurden wie oben beschrieben hergestellt, aber durch ein Sieb (Endecotts Test Sieves Ltd, London, England) mit Maschengröße # 60 (270 μm) gedrückt, um die Auswirkungen der Größe der Mikropartikel auf die Freisetzung von Paclitaxel aus der Paste zu untersuchen. Es wurden auch Pasten mit 10, 20 oder 30% Gelatine und 20% Paclitaxel und PCL hergestellt, um die Auswirkungen des Anteils des Zusatzes auf die Freisetzung des Arzneimittels zu untersuchen. Soweit nicht anders angegeben, wurden Pasten, die 20%, Paclitaxel in PCL dispergiert enthielten, hergestellt um als Kontrollen für die Untersuchungen der Freisetzungsraten zu dienen.
  • B. Untersuchungen der Freisetzung von Arzneimittel
  • Etwa 2,5 mg Pellet einer mit Paclitaxel beladenen Paste wurden in 50 ml einer 10 mM Phosphat-gepufferten Salzlösung, pH 7,4 (PBS) in Röhrchen mit Schraubverschlüssen suspendiert. Die Röhrchen wurden bei 37°C über ihre Enden geschwenkt und zu vorgegebenen Zeitintervallen wurden 49,5 ml des Überstandes entfernt, durch einen 0,45 μm Membranfilter gefiltert und für die Paclitaxel-Untersuchung aufbewahrt. Ein gleiches Volumen PBS wurde ersatzweise in jedes Röhrchen nachgefüllt, um die Sinkbedingungen während der Untersuchung beizubehalten. Zur Untersuchung wurden die Filtrate mit 3 × 1 ml Dichlormethan (DCM) extrahiert, die DCM-Extrakte wurden unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockenheit evaporisiert und wieder in 1 ml Acetonitril gelöst. Die Untersuchung erfolgte durch HPLC unter Verwendung einer mobilen Phase von Wasser:Methanol:Acetonitril (37:5:58) bei einer Flussrate von 1 ml min–1 (isokratische Pumpe von Beckman), einer C18 reverse-Phase-Säule (Beckman) und durch UV-Detektion (Shimadzu SPD A) bei 232 nm.
  • C. Untersuchungen der Quellung
  • Paclitaxel/Zusatz/PCL-Pasten, die unter Verwendung von Paclitaxel/Zusatz-Mikropartikeln der Maschengröße # 140 (und #60 nur für Gelatine) hergestellt worden waren, wurden extrudiert, um Zylinder zu bilden, Stücke davon wurden abgeschnitten, gewogen und der Durchmesser und die Länge eines jeden Stückes wurden unter Verwendung eines Mikrometers (Mitutoyo Digimatic) gemessen. Die Stücke wurden in destilliertem Wasser (10 ml) bei 37°C suspendiert und zu vorbestimmten Intervallen wurde das Wasser verworfen und der Durchmesser und die Länge der zylindrischen Teile wurden gemessen und die Proben wurden gewogen. Die Morphologie der Proben (vor und nach dem Suspendieren in Wasser) wurde unter Verwendung der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) (Hitachi F-2300) untersucht. Die Proben wurden unter Verwendung eines Hummer Instruments (Technics, USA) mit 60% Au und 40% Pd beschichtet (Dicke 10–15 nm).
  • D. Untersuchungen an der Hühnerembryo-Chorioallantois-Membran (CAM)
  • Befruchtete Hühnerembryonen wurden vor der schalenlosen Kultivierung für 4 Tage inkubiert. Der Inhalt der Eier wurde bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3% CO2 inkubiert und am Tag 6 der Inkubation wurden 1 mg-Stücke von mit Paclitaxel beladener Paste (enthaltend 6% Paclitaxel, 24% Gelatine und 70% PCL) oder von Kontrollpaste (30% Gelatine in PCL) direkt auf die CAM-Oberfläche aufgetragen. Nach einer Einwirkzeit von 2 Tagen wurde das Gefäßnetz unter Verwendung eines Stereomikroskops, das an eine Videokamera angeschlossen war, untersucht; die Videosignale wurden dann auf einem Computer angezeigt und ausgedruckt.
  • E. In vivo Anti-Tumor-Aktivität
  • Wie oben beschrieben hergestellte (unter Verwendung der Maschengröße-140-Fraktionen der Paclitaxel-Gelatine-Mikropartikel) Pasten, die 20% Paclitaxel, 20% Gelatine und 60% PCL enthielten, wurden in 8 × 1 ml Spritzen (BD Insulinspritze, ½ cc) gefüllt, wobei jede Spritze 150 mg der Paste enthielt (entsprechend 30 mg Paclitaxel). Zehn Wochen alte weibliche DBA/2j-Mäuse (16), die 18–20 g wogen, wurden für 4 Tage nach Eintreffen akklimatisiert und am Tag 1 wurden jeder Maus in die posterolaterale Flanke MDAY-D2-Tumorzellen (10 × 106 ml–1) in Phosphat-gepufferter Salzlösung injiziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse in zwei Gruppen von acht aufgeteilt, die Stelle des Tumors wurde unter Narkose eröffnet und 150 mg der Paste, die vorher auf etwa 60°C erhitzt worden war, wurden an der Stelle des Tumors aus der Spritze gedrückt und die Wunde wurde verschlossen. Einer Gruppe wurde die mit Paclitaxel beladene Paste implantiert und der anderen Gruppe die Kontrollpaste, die nur Gelatine und PCL enthielt. Am Tag 16 wurden die Tiere getötet und das Gewicht der Mäuse und des excidierten Tumors wurde gemessen.
  • F. Ergebnisse und Diskussion
  • Mikropartikel aus copräzipitiertem Paclitaxel und Gelatine oder Albumin waren hart und spröde und waren leicht in PCL zu integrieren, während die anderen Zusätze weiche Partikel, die eine Tendenz zum Aufbrechen während der Herstellung der Paste zeigten, produzierten.
  • 15 zeigt die Zeitverläufe der Freisetzung von Paclitaxel aus Pasten, die 20% Paclitaxel in PCL oder 20% Paclitaxel, 20% Zusatz und 60% PCL enthielten. Die Freisetzung von Paclitaxel aus PCL mit oder ohne Zusätze folgte einem biphasischen Freisetzungsmuster; es gab anfänglich eine schnellere Freisetzungsgeschwindigkeit des Arzneimittels gefolgt von einer langsameren Freisetzung des Arzneimittels. Es wurde angenommen, dass die anfängliche Periode einer schnelleren Freisetzungsgeschwindigkeit von Paclitaxel aus den Pasten auf die Auflösung von auf der Oberfläche befindlichem Paclitaxel oder auf Diffusion von Paclitaxel aus den oberflächlichen Bereichen der Paste zurückzuführen war. Die nachfolgende langsamere Phase der Freisetzungsprofile kann einer Abnahme der effektiven, mit dem Lösungsmittel in Kontakt befindlichen Oberfläche der Arzneimittelpartikel, einem langsamen Einstrom des Lösungsmittels in die Polymermatrix oder einer Verlängerung der durchschnittlichen Diffusionswege des Arzneimittels durch die Polymermatrix zuzuschreiben sein.
  • Beide Phasen der Freisetzungsprofile von Paclitaxel aus PCL steigerten sich in Anwesenheit hydrophiler Zusatzstoffe, wobei Gelatine, Albumin und Methylcellulose den höchsten Anstieg der Freisetzungsraten des Arzneimittels ergaben (15). Es gab einen weiteren Anstieg der Freisetzung von Paclitaxel aus der Polymermatrix, wenn im Vergleich zu kleineren Partikeln (106 μm) aus Paclitaxel und Zusatz größere Partikel (270 μm) aus Paclitaxel und Zusatz zur Herstellung der Paste verwendet wurden (16). Erhöhungen der Menge des Zusatzstoffes (z.B. Gelatine) ergaben eine entsprechende Steigerung der Freisetzung des Arzneimittels (16). 17A zeigt das Quellungsverhalten von Pasten, die 20% Paclitaxel, 20% Zusatz und 60% PCL enthalten. Die Quellungsgeschwindigkeit folgte der Reihenfolge Gelatine > Albumin > Methylcellulose > Dextran > Natriumchlorid. Weiterhin stieg die Quellungsgeschwindigkeit, wenn der Paste ein höherer Anteil des wasserlöslichen Polymers zugegeben wurde (17B). Die Pasten, die Gelatine oder Albumin enthielten, quollen innerhalb der ersten 8–10 Stunden schnell auf und anschließend verlangsamte sich die Quellungsgeschwindigkeit, wenn die Änderung des Volumens der Probe mehr als 40% betrug. Die Paste, die unter Verwendung der größeren (270 μm) Partikel aus Paclitaxel und Gelatine hergestellt worden war, quoll schneller auf als die, die mit den kleineren (106 μm) Partikeln aus Paclitaxel und Gelatine hergestellt worden war. Alle Pasten bröckelten auseinander, wenn die Volumenvermehrung mehr als 50% betrug. Die rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigten, dass das Aufquellen der Pasten mit einem Aufbrechen der Matrix verbunden war (18). Bei hohen Vergrößerungen (18C und 18D) ergaben sich nach der Quellung Anhaltspunkte für nadel- oder stabförmige Paclitaxel-Kristalle auf der Oberfläche der Paste und in enger Verbindung mit Gelatine (18C und 18D).
  • Osmotische oder quellungsfähige hydrophile Agenzien, die als gesonderte Partikel in das hydrophobe Polymer eingebettet sind, führen durch eine Kombination von Erosion der Matrix, von Diffusion des Arzneimittels durch die Polymermatrix und/oder von Diffusion und/oder konvektivem Fluss durch die Poren, die in der Matrix durch die Auflösung der wasserlöslichen Zusatzstoffe geschaffen wurden, zur Freisetzung von Arzneimittel. In einem hydrophoben Polymer dispergierte osmotische Agenzien und quellungsfähige Polymere würden Wasser in sich aufnehmen (als aufsaugende Agenzien wirkend), sich auflösen oder quellen und einen Spannungsdruck ausüben, der die Septen (die Polymer-Schicht) zwischen benachbarten Partikeln sprengen und Mikrokanäle schaffen und so das Entweichen von Arzneimittelmolekülen in das umgebende Medium durch Diffusion oder konvektiven Fluss ermöglichen könnte. Das Aufquellen und Aufbrechen der Matrix der Paste (18) führte wahrscheinlich zur Bildung von Mikrokanälen durch das Innere der Matrix. Die unterschiedlichen Geschwindigkeiten und Ausmaße des Aufquellens der Polymere (17) können die Unterschiede, die bei den Freisetzungsraten von Paclitaxel beobachtet wurden (15 und 16), erklären.
  • 19 zeigt CAM, die mit Kontrollpaste aus Gelatine und PCL (19A) und mit Paste aus 20% Paclitaxel, Gelatine und PCL (19B) behandelt wurden. Die Paste auf der Oberfläche der CAM wird durch die Pfeile in den Figuren angezeigt. Die CAM mit der Kontrollpaste zeigt eine normale Architektur des Kapillarnetzes. Die mit Paste aus Paclitaxel und PCL behandelten CAM zeigten durchgehend einen Gefäßrückgang und Zonen, in denen das Kapillarnetz fehlte. Die Aufnahme von Zusatzstoffen in die Paste erhöhte den Durchmesser der gefäßfreien Zonen deutlich (19).
  • Die Ergebnisse der in vivo Untersuchung sind in 20 gezeigt. In Kürze zeigte eine um den Tumor herum erfolgende Injektion von Paste aus Paclitaxel, Gelatine und PCL in Mäuse mit gesicherten und palpablen Tumoren, dass dieses Präparat eine durchschnittliche Reduktion der Tumormasse von 63% im Vergleich mit Kontrollen ergab. Weiterhin gab es keine signifikante Auswirkung auf das Gewicht der Mäuse nach der Behandlung. Pasten aus Paclitaxel und PCL (ohne Zusatzstoffe) ergaben keine signifikante Reduktion der Tumormasse.
  • Diese Untersuchung zeigte, dass die in vitro Freisetzung von Paclitaxel aus PCL durch die Aufnahme von Mikropartikeln aus Paclitaxel und hydrophilem Polymer in die PCL-Matrix verstärkt werden konnte. in vivo Untersuchungen, welche die Wirksamkeit der Formulierung bei der Behandlung subcutaner Tumore bei Mäusen beurteilten, zeigten auch, dass die Paste aus Paclitaxel, Gelatine und PCL die Tumormasse signifikant reduzierte. Es wurde gezeigt, dass Faktoren wie zum Beispiel die Art des wasserlöslichen Agens, die Größe der Mikropartikel und der Anteil der Zusatzstoffe die Freisetzungscharakteristika des Arzneimittels beeinflussten.
  • Die peritubuläre Injektion einer chemotherapeutischen Paste in die Adventitia eines Gefäßes, das durch das Wachstums eines Malignoms eingeengt ist, kann die Größe des lokalen Tumors reduzieren und die Symptome der Obstruktion ohne invasive chirurgische Verfahren lindern.
  • Beispiel 11
  • Modifikation der Freisetzung von Paclitaxel aus Thermopaste unter Verwendung von PDLLA-PEG-PDLLA und von Poly(D,L-milchsäure) mit niedrigem Molekulargewicht.
  • A. Herstellung von PDLLA-PEG-PDLLA und von PDLLA mit niedrigem Molekulargewicht.
  • DL-Lactid wurde bei Aldrich erworben. Polyethylenglycol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 8.000, Zinn-Octoat und DL-Milchsäure wurden von Sigma bezogen. Poly-ε-caprolacton (PCL) mit einem Molekulargewicht von 20.000 wurde von Birmingham Polymers (Birmingham, AL) bezogen. Paclitaxel wurde bei Hauser Chemicals (Boulder, CO) erworben. Polystyren-Standards mit schmalen Verteilungen des Molekulargewichts wurden von Polysciences (Warrington, PA) erworben. Acetonitril und Methylenchlorid waren von HPLC-Qualität (Fisher Scientific).
  • Das Triblock-Copolymer von PDLLA-PEG-PDLLA wurde durch eine Ringöffnungspolymerisation synthetisiert. Monomere von DL-Lactid und PEG wurden in unterschiedlichen Verhältnissen vermischt und 0,5 Gew.-% Zinn-Octoat wurden zugegeben. Die Polymerisation wurde bei 150°C über 3,5 Stunden vorgenommen. PDLLA mit niedrigem Molekuiargewicht wurde durch Polykondensation von DL-Milchsäure synthetisiert. Die Reaktion wurde in einem Glaskolben unter den Bedingungen einer sanften Stickstoffspülung, mechanischem Rühren und Erhitzen auf 180°C über 1,5 Stunden vorgenommen. Das Molekulargewicht der PDLLA war etwa 800, gemessen durch Titration der Carbonsäure- Endgruppen.
  • B. Herstellung von Pasten-Formulierungen
  • Paclitaxel wurde zu Beladungen mit 20% oder 30% gründlich entweder in die PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymere oder in bei etwa 60°C geschmolzene Mischungen von PDLLA:PCL von 90:10, 80:20 und 70:30 eingemischt. Die mit Paclitaxel beladenen Pasten wurden in 1 ml Spritzen eingewogen und bei 4°C gelagert.
  • C. Charakterisierung von PDLLA-PEG-PDLLA und den Pasten-Mischungen
  • Die Molekulargewichte und die Verteilungen der PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymere wurden bei Raumtemperatur durch GPC unter Verwendung einer Shimadzu LC-10AD HPLC Pumpe und eines Shimadzu RID-6A Refraktionsindexdetektors (Kyoto, Japan), der an eine 104 Å Hewlett Packard PLgel Säule angeschlossen war, bestimmt. Die mobile Phase war Chloroform mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min. Das Injektionsvolumen der Probe betrug 20 μl bei einer Konzentration des Polymers von 0,2% (Gew./Vol.). Die Molekulargewichte der Polymere wurden in Relation zu Polystyren-Standards bestimmt. Die intrinsische Viskosität von PDLLA-PEG-PDLLA in CHCl3 bei 25°C wurde mit einem Cannon-Fenske-Viscometer bestimmt.
  • Die thermische Analyse der Copolymere wurde durch dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) unter Verwendung eines TA Instruments 2000 Steuergeräts und DuPont 910S DSC (Newcastle, Delaware) vorgenommen. Die Aufheizgeschwindigkeit betrug 10°C/min und die Proben des Copolymers und der Paclitaxel-Copolymer-Matrix wurden in gewellte offene Aluminium-Proben-Tiegel eingewogen (3–5 mg).
  • 1H kernmagnetische Resonanz (NMR) wurde eingesetzt, um die chemische Zusammensetzung des Polymers zu bestimmen. 1H NMR Spektren von mit Paclitaxel beladener PDLLA-PEG-PDLLA wurden in CDCl3 unter Verwendung eines NMR Instruments (Bruker, AC-200E) bei 200 MHz aufgenommen. Die Konzentration des Polymers betrug 1–2%.
  • Die Morphologie der Paste aus Paclitaxel und PDLLA-PEG-PDLLA wurde mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) (Hitachi F-2300) untersucht. Die Probe wurde mit 60% Au und 40% Pd (Dicke 10–15 nm) unter Verwendung eines Hummer Instruments (Technics, USA) beschichtet.
  • D. In vitro Freisetzung von Paclitaxel
  • Ein kleines Pellet von mit 20% Paclitaxel beladener Paste aus PDLLA:PCL (etwa 2 mg) oder ein Zylinder (hergestellt durch Herausdrücken von geschmolzener Paste aus einer Spritze ohne Nadel) von mit 20% Paclitaxel beladener Paste aus PDLLA-PEG-PDLLA wurde in verschlossene 14 ml Glasröhrchen, die 10 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, pH 7,4) mit 0,4 g/L Albumin enthielten, gegeben. Das Röhrchen wurde bei 37°C unter sanftem rotierenden Mischen inkubiert. Der Überstand wurde regelmäßig zur Paclitaxel-Analyse abgezogen und mit frischem PBS/Albumin-Puffer ersetzt. Der Überstand (10 ml) wurde mit 1 ml Methylenchlorid extrahiert. Die Wasserphase wurde dekantiert und die Methylenchloridphase wurde unter einem Stickstoffstrom bei 60°C getrocknet. Der getrocknete Rest wurde in einer 40:60 Wasser:Acetonitril-Mischung rekonstituiert und bei 10.000 g für etwa 1 min zentrifugiert. Die Menge des Paclitaxels im Überstand wurde dann mit HPLC bestimmt. Die HPLC-Untersuchung wurde unter Verwendung einer 110A Pumpe und einer C-8 Ultrasphärensäule (Beckman) und eines SPD-6A UV-Detektor-Sets bei 232 nm, eines SIL-9A Autoinjektors und eines C-R3A Integrators (Shimadzu) vorgenommen. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl und die Flussrate betrug 1 ml/min. Die mobile Phase war 58% Acetonitril, 5% Methanol und 37% destilliertes Wasser.
  • E. In vivo Tierstudien
  • Zehn Wochen alte weibliche DBA/2j-Mäuse wurden für 3–4 Tage nach Eintreffen akklimatisiert. Jeder Maus wurden am Tag 1 in die posterolaterale Flanke 10 × 105 MDAY-D2-Tumorzellen in 100 μl PBS subcutan injiziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse in zwei Gruppen randomisiert. Der Gruppe 1 wurde nur Paste (Kontrolle) implantiert, der Gruppe 2 wurde mit Paclitaxel beladene Paste implantiert. Unter Narkose wurde nahe dem Tumor chirurgisch eine subcutane Tasche gebildet und etwa 100 mg der geschmolzenen Paste (auf 50°C–60°C erwärmt) wurden in die Tasche gegeben und die Wunde wurde verschlossen. Am Tag 16 wurden die Mäuse getötet und die Tumore wurden entfernt und gewogen. Tag 16 wurde gewählt, um es dem Tumor zu ermöglichen, innerhalb der ethischen Grenzen zu einer leicht messbaren Größe heranzuwachsen.
  • F. Ergebnisse und Diskussion
  • Das Molekulargewicht und die Molekulargewichtsverteilung von PDLLA-PEG-PDLLA in Relation zu Polystyren-Standards wurden mit GPC (21) gemessen. Die intrinsische Viskosität des Copolymers in CHCl3 bei 25°C wurde unter Verwendung eines Canon-Fenske Viscometers bestimmt. Das Molekulargewicht und die intrinsische Viskosität nahmen mit steigendem PEG-Gehalt ab. Die Polydispersitäten von PDLLA-PEG-PDLLA mit PEG-Anteilen von 10%–40% reichten von 2,4 bis 3,5. Jedoch hatte das Copolymer mit 70% PEG eine schmale Verteilung der Molekulargewichte mit einer Polydispersität von 1,21. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass ein hoher PEG-Gehalt die Wahrscheinlichkeit von Nebenreaktionen reduzierte, wie zum Beispiel einer Umesterung, die zu einer breiten Verteilung der Molekulargewichte des Polymers führt. Alternativ kann eine gewundene Struktur der hydrophob-hydrophilen Block-Copolymere zu einem artifiziell niedrigen Wert der Polydispersität führen.
  • DSC-Untersuchungen von reinen PEG- und PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymeren werden in den 21 und 22 gezeigt. PEG und PDLLA-PEG-PDLLA mit PEG-Anteilen von 70% und 40% zeigten bei abnehmendem PEG-Gehalt des Copolymers endotherme Spitzen mit abnehmender Enthalpie und Temperatur. Die endothermen Spitzen in den Copolymeren mit 40% und 70% PEG waren wahrscheinlich auf das Schmelzen der PEG-Region zurückzuführen, was auf das Auftreten einer Phasenseparation hinweist. Während reines PEG einen scharfen Schmelzpeak hatte, zeigten sowohl die 70%- als auch die 40%-PEG-Copolymere breite Peaks mit einer deutlichen Schulter im Fall von 70% PEG. Die breiten Schmelzpeaks können ihre Ursache in der Interferenz von PDLLA mit der Kristallisation von PEG haben. Die Schulter im Fall von 70% PEG kann den Glasübergang der PDLLA-Region darstellen. In den Copolymeren mit PEG-Anteilen von 10%, 20% und 30% kam es zu keinen thermischen Veränderungen in einem Temperaturbereich von 10–250°C, was darauf hinweist, dass es zu keiner signifikanten Kristallisation (daher kann die Phasenseparation kommen) gekommen war.
  • DSC-Thermogramme von PDLLA:PCL (70:30, 80:20, 90:10) Mischungen ohne Paclitaxel oder mit 20% Paclitaxel zeigten eine endotherme Spitze bei etwa 60°C, die auf das Schmelzen des PCL zurückzuführen war. Aufgrund der amorphen Natur von PDLLA und ihres niedrigen Molekulargewichts (800) wurden Schmelzen und Glasübergänge von PDLLA nicht beobachtet. Es wurden keine thermischen Änderungen infolge von Rekristallisation oder Schmelzen von Paclitaxel beobachtet.
  • PDLLA-PEG-PDLLA-Copolymere mit einem PEG-Gehalt von 20% und 30% wurden aus folgenden Gründen als optimale Materialien zur Formulierung der Paste ausgewählt. PDLLA-PEG-PDLLA mit 10% PEG konnten bei einer Temperatur von etwa 60°C nicht geschmolzen werden. Die Copolymere mit 40% und 70% PEG wurden leicht bei 60°C geschmolzen und die Copolymere mit 20% und 30% PEG wurden zwischen 50°C bis 60°C zu einer viskösen Flüssigkeit. Die Quellung der Copolymere mit 40% und 70% PEG in Wasser war sehr hoch, was zu einer schnellen Dispersion der Pasten in Wasser führte.
  • Die in vitro Freisetzungsprofile von Paclitaxel aus PDLLA-PEG-PDLLA-Zylindern sind in 23 dargestellt. Das Experiment zum Messen der Freisetzung aus den Zylindern mit 40% PEG wurde abgebrochen, weil die Zylinder einen hohen Quellungsgrad hatten (etwa 200% Wasseraufnahme an einem Tag) und in wenigen Tagen auseinander brachen. Der freigesetzte Anteil von Paclitaxel aus den Zylindern mit 30% PEG stieg über 70 Tage allmählich an. Der freigesetzte Anteil aus den Zylindern mit 20% PEG stieg bis zu 30 Tagen langsam an und erhöhte sich dann abrupt, gefolgt von einer weiteren Periode eines langsamen Anstiegs. Es gab einen signifikanten Unterschied in dem Ausmaß, zu dem jeder einzelne Zylinder (20% PEG-Anteil) die abrupte Änderung der Freisetzung von Paclitaxel zeigte. Vor dem abrupten Anstieg war der freigesetzte Anteil von Paclitaxel für Copolymere mit niedrigerem PEG-Gehalt bei gleichem Durchmesser der Zylinder (1 mm) niedriger. Die Zylinder mit 40% und mit 30% PEG zeigten viel höhere Freisetzungsraten für Paclitaxel als die Zylinder mit 20% PEG. Zum Beispiel setzte der Zylinder mit 30% PEG 17% Paclitaxel in 30 Tagen frei gegenüber einer Freisetzung von 2% aus dem Zylinder mit 20% PEG. Die Zylinder mit kleineren Durchmessern führten zu schnelleren Freisetzungsraten, d.h. in 30 Tagen setzten die Zylinder mit 30% PEG und Durchmessern von 0,65 mm und 1 mm 26% beziehungsweise 17% Paclitaxel frei (23).
  • Die obigen Beobachtungen können mit dem Freisetzungsmechanismus von Paclitaxel aus den Zylindern erklärt werden. Es wurde durch optische Mikroskopie beobachtet, dass Paclitaxel in Form von Kristallen im Polymer dispergiert war. Die Kristalle begannen bei 170°C, sich in der Copolymer-Matrix aufzulösen und lösten sich bei 180°C voll ständig auf, wie im Heißphasen-Mikroskop beobachtet wurde. DSC-Thermogramme von mit 20% Paclitaxel beladener PDLLA-PEG-PDLLA-Paste (30% PEG) zeigten eine kleine Rekristallisations-Exotherme (16 J/g, 190°C) und eine Schmelz-Endotherme (6 J/g, 212°C) für Paclitaxel (21), was die Rekristallisation von Paclitaxel aus der Copolymer-Schmelze jenseits von 180°C anzeigt. Bei diesem Typ einer Arzneimittel-Polymermatrix könnte Paclitaxel über Diffusion und/oder Erosion des Polymers freigesetzt werden.
  • Im diffusionsgesteuerten Fall kann das Arzneimittel durch molekulare Diffusion im Polymer und/oder durch offene Kanäle, die von verbundenen Arzneimittelteilchen gebildet werden, freigesetzt werden. Daher wurden bei der Beladung mit 20% einige Paclitaxel-Partikel isoliert und Paclitaxel kann durch Auflösung im Copolymer gefolgt von Diffusion freigesetzt werden. Andere Paclitaxel-Partikel könnten Haufen bilden, die Kontakt zur Oberfläche gewinnen und durch Diffusion durch Kanäle freigesetzt werden. In beiden Fällen ergaben die kleiner dimensionierten Zylinder eine schnellere Freisetzung des Arzneimittels infolge des kürzeren Diffusionsweges (23).
  • Die Dimensionsänderungen und die Wasseraufnahme der Zylinder wurden während der Freisetzung aufgezeichnet (24). Die Änderungen der Länge, des Durchmessers und des Nassgewichtes der Zylinder mit 30% PEG stiegen innerhalb von 2 Tagen schnell auf ein Maximum, blieben für etwa 15 Tage unverändert und fielen dann allmählich ab. Der anfängliche Durchmesser des Zylinders hatte keinen Einfluss auf das Quellungsverhalten. Beim Zylinder mit 20% PEG nahm die Länge an einem Tag um 10% ab und pegelte sich ein, während der Durchmesser und die Wasseraufnahme mit der Zeit allmählich zunahmen. Da mehr PEG im Copolymer mehr Wasser aufnahm, um die Diffusion von Paclitaxel zu erleichtern, wurde eine schnellere Freisetzung beobachtet (23).
  • Die Abnahme des Molekulargewichts von PDLLA-PEG-PDLLA-Paste wurde mit GPC überwacht. Für den Zylinder mit 20% PEG stieg das Elutionsvolumen an der Position des Peaks mit der Zeit an, was ein vermindertes Molekulargewicht des Polymers während des Verlaufs des Freisetzungsexperiments anzeigte (25). Am Tag 69 wurde eine biphasische Verteilung des Molekulargewichts des Polymers beobachtet. Das Molekulargewicht des Polymers wurde auch bei den Zylindern mit 30% PEG (1 mm und 0,65 mm) reduziert. Es wurde jedoch keine biphasische Verteilung beobachtet.
  • NMR Spektren zeigten einen PEG-Peak bei 3,6 ppm und PDLLA-Peaks bei 1,65 ppm und 5,1 ppm. Die Peak-Flächen von PEG nahmen im Vergleich zu PDLLA im Copolymer nach 69 Tagen signifikant ab (26), was auf die Auflösung des PEG nach seiner Dissoziation aus PDLLA hinweist. Der Trockengewichtsverlust der Zylinder wurde ebenfalls aufgezeichnet (26) und zeigt eine Abbaurate, die in der Reihenfolge 30%PEG-0,65 mm > 30°1°PEG-1 mm > 20%PEG-1 mm > abnimmt.
  • Die morphologischen Veränderungen der getrockneten Zylinder vor und während der Freisetzung von Paclitaxel wurden mit SEM (27) beobachtet. In Kürze wurden vor der Freisetzung feste Paclitaxel-Kristalle und nicht poröse Polymer-Matrices gesehen (27A und 27B). Nach 69 Tagen Freisetzung wurden keine Paclitaxel-Kristalle beobachtet und die Matrices enthielten viele Poren infolge des Abbaus des Polymers und der Wasseraufnahme (27C und 27D).
  • Die Zylinder mit 30% PEG zeigten nach nur zwei Tagen im Wasser eine beträchtliche Quellung (24) und daher wurde die Diffusionshemmung des abgelösten wasserlöslichen PEG-Blocks und der abgebauten PDLLA (d.h. DL-Milchsäure-Oligomere) vermindert. Da der Verlust an Masse und der Abbau der Zylinder mit 30%PEG kontinuierlich waren, stieg der Anteil der Erosion an der Freisetzung allmählich an, was zu einer anhaltenden Freisetzung von Paclitaxel ohne jede abrupte Änderung führte (23). Bei den Zylindern mit 20% PEG war die Quellung anfänglich gering (24), was zu einer langsamen Diffusion der Abbauprodukte führte. Daher werden die Abbauprodukte im inneren Bereich anfänglich zurückgehalten, während es infolge des kurzen Diffusionswegs im äußeren Bereich viel weniger Abbauprodukte gibt. Die Abbauprodukte beschleunigten die Abbaugeschwindigkeit, weil die Carbonsäure-Endgruppen der Oligomere den hydrolytischen Abbau katalysierten. Dies führt zu einer Hülle mit hohem Molekulargewicht und einem inneren Bereich mit niedrigem Molekulargewicht, wie durch die biphasische Verteilung der Molekulargewichte des Copolymers angezeigt wird (25, Tag 69). Da das Aufbrechen der Hülle von Faktoren wie Festigkeit, Dicke und Schäden der Hülle und inneren Abbauprodukten abhing, waren das Einsetzen und das Ausmaß des Verlusts von inneren Abbauprodukten sehr variabel. Weil das Aufbrechen der Hülle nicht einheitlich ist und weil das Arzneimittel im Polymer nicht mikroskopisch homogen ist, waren die Zeitpunkte des Ausbruchs der Freisetzung und das Ausmaß des Ausbruchs für die 4 untersuchten Proben unterschiedlich (23).
  • Die Freisetzung von Paclitaxel aus Mischungen von PDLLA und PDA und aus reinem PCL ist in 28 dargestellt. In Kürze stieg der freigesetzte Anteil mit dem Gehalt von PDLLA in der Mischung an. Zum Beispiel wurden innerhalb von 10 Tagen aus 80:20, 70:30 und 0:100 PDLLA:PCL jeweils 17%, 11% und 6% Paclitaxel freigesetzt. Nach einem anfänglichen Ausbruch an einem Tag erfolgte eine annähernd konstante Freisetzung aus der 80:20 PDLLA:PCL-Paste. Es wurde kein signifikantes Ausmaß einer Quellung während der Freisetzung beobachtet. Bei den PDLLA:PCL-Mischungen wurde PDLLA, weil sie ein sehr niedriges Molekulargewicht von etwa 800 hatte, ohne eine lange Verzögerung des Verlustes an Masse schnell in wasserlösliche Produkte hydrolysiert. PCL diente als „haltendes" Material, um die Paste vor einer schnellen Auflösung zu bewahren. Daher stieg die Geschwindigkeit der Freisetzung mit dem Gehalt von PDLLA in der Mischung infolge des verstärken Abbaus an. Die kontinuierliche Erosion der PDLLA steuerte die Freisetzung von Paclitaxel und führte zu einer konstanten Freisetzung. Die Freisetzung von Paclitaxel aus reinem PCL war infolge der langsamen Geschwindigkeit des Abbaus von PCL (in 1–2 Jahren) wahrscheinlich diffusionsgesteuert.
  • Bei der Untersuchung der Freisetzung für mit 20% Paclitaxel beladene 90:10 PDLLA:PCL-Paste kam es infolge der Auflösung des Pellets der Paste innerhalb von 24 Stunden Inkubation zu Schwierigkeiten. In Kürze wurden während der ersten 12 Stunden der Inkubation zu jeder Stunde Proben genommen, um die Sinkbedingungen für die Freisetzung von Paclitaxel zu sichern. Aus der 90:10-Paste wurden innerhalb vom 10 Stunden 25–35% Paclitaxel freigesetzt.
  • Es wurde die Wirksamkeit der Pasten-Formulierungen beim Zurückdrängen von Tumorwachstum in Mäusen untersucht (29). In Kürze bestanden die untersuchten Pas ten aus PCL ± 20% Paclitaxel, 80:20 PDLLA:PCL ±20% Paclitaxel, 90:10 PDLLA:PCL ±20% Paclitaxel und PDLLA-PEG-PDLLA (30% PEG) ±20% Paclitaxel. Die Pasten-Formulierungen 90:10 PDLLA:PCL und PDLLA-PEG-PDLLA mit Paclitaxel reduzierten das Tumorwachstum in vivo um 54 beziehungsweise 40%. Im Gegensatz dazu hatten die Pasten-Formulierungen PCL und 80:20 PDLLA:PCL mit Paclitaxel wenig oder keine Auswirkungen auf das Tumorwachstum. Alle Kontrollpasten (ohne Arzneimittel) hatten keine signifikante Auswirkung auf das Tumorwachstum. Die Pasten-Formulierungen mit schnelleren Freisetzungsgeschwindigkeiten waren auch bei der Reduktion des Tumorwachstums wirksamer, was nahelegt, dass eine kritische lokale Paclitaxel-Konzentration an der Stelle des Tumors für eine Hemmung des Tumorwachstums erforderlich ist. Pasten-Formulierungen, die Paclitaxel langsam freisetzen, wie zum Beispiel PCL und 80:20 PDLLA:PCL waren nicht wirksam. Alle untersuchten Pasten-Formulierungen hatten keine signifikante Wirkung auf das Körpergewicht der Mäuse, was anzeigt, dass die mit Paclitaxel beladene Paste in vivo gut vertragen wurde.
  • Diese Daten deuten darauf hin, dass die lokale Anwendung von Paclitaxel an der Stelle eines Tumors eine wirksame Behandlungsstrategie zur Hemmung des lokalen Tumorwachstums ohne eine Erhöhung der systemischen Toxizität ist. Das Unvermögen von mit Paclitaxel beladenen Formulierungen, das Tumorwachstum komplett zu hemmen, ist höchstwahrscheinlich auf die unzureichende Freisetzung von Paclitaxel aus dem Polymer und auf das schnelle Tumorwachstum von MDAY-D2 Tumoren zurückzuführen. Die Leistungsfähigkeit von 90:10 PDLLA:PCL-Paste mit 30% Paclitaxel, die mehr Paclitaxel als 90:10 PDLLA:PCL-Paste mit 20% Paclitaxel freisetzte und das Tumorwachstum wirksamer hemmte, ist in dieser Hinsicht folgerichtig. Somit ist die Modulation der Freisetzungsgeschwindigkeit von Paclitaxel, die von den Eigenschaften des Polymers und der chemotherapeutischen Wirkstoffe reguliert wird, ebenso wie die Stelle der Anwendung ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung einer lokalen Therapie zur Hemmung des Tumorwachstums.
  • Beispiel 12
  • Herstellung von PCL-Mikrosphären: Untersuchungen zur Vergrößerung
  • Es wurden Mikrosphären (50 g) unter Verwendung von PCL (nominales Molekulargewicht 80.000) unter Einsatz der unten beschriebenen Lösungsmittel-Verdunstungs-Methode hergestellt.
  • A. Methode
  • Ein Ansatz von 500 ml 10% PCL in Methylenchlorid und 4000 ml 1% PVA-Lösung (Molekulargewicht 13.000–23.000; 99% hydrolysiert) wurden unter Verwendung eines mit einem Regelwiderstand bei Einstellung 40 gesteuerfen Homo Mixers über 10 Stunden emulgierf. Die Mischung wurde unter Verwendung eines Siebes #140 gesiebt, bis sich die Mikrosphären am Boden absetzten, anschließend wurde der Überstand dekantiert. Der Ansatz wurde dann 3× mit destilliertem Wasser gewaschen (unter Einsatz der Sedimentation gefolgt von der Methode des Dekantierens) und dann in 250 ml destillierten Wassers resuspendiert und gefiltert. Die Mikrosphären wurden über Nacht bei 37°C luftgetrocknet.
  • B. Ergebnisse
  • Die Mikrosphären-Ausbeuten waren wie folgt:
    Ursprüngliches Gewicht des PCL = 50,1 g
    Gewicht der erhaltenen Mikrosphären = 41,2 g
    % Ausbeute = (43,2/50.0) × 100 = 86,4
    Ausbeute (10–50 μm) etwa 72%
  • Durchschnittsgröße 21,4 μm, Median 22,0 μm Modus 24,7 μm.
  • Schmalere Größenbereiche (20–40 μm) können durch Sieben oder durch Separation unter Einsatz der Sedimentationsmethode erreicht werden.
  • Beispiel 13
  • Herstellung von PLGA-Mikrosphären
  • Es wurden Mikrosphären aus Copolymeren von (PLLA) Milchsäure – Glycolsäure (GA) hergestellt.
  • A. Methode:
  • Es wurden unter Einsatz von Standardmethoden (Polymer wurde in Dichlormethan gelöst und unter Rühren in einer Polyvinylalkohol-Lösung emulgiert wie oben bei den Methoden für die Herstellung von PCL- oder PDLLA-Mikrosphären beschrieben) Mikrosphären in den Größenbereichen 0,5 bis 10 μm, 10–20 μm und 30–100 μm hergestellt. Verschiedene Verhältnisse von PLLA zu GA wurden als Polymere mit unterschiedlichen Molekulargewichten [angegeben als intrinsische Viskosität (I.V.)] verwendet.
  • B. Ergebnis:
  • Aus den folgenden Ausgangspolymeren wurden erfolgreich Mikrosphären hergestellt:
  • Figure 00900001
  • In all diese Mikrosphären wurde Paclitaxel erfolgreich zu 10% oder 20% Beladungen integriert. Beispiele der Größenverteilungen für ein Ausgangspolymer (85:15, IV = 0,56) sind in den 3134 wiedergegeben. Es wurden Experimente zur Freisetzung von Paclitaxel unter Verwendung von Mikrosphären verschiedener Größen und verschiedener Zusammensetzungen durchgeführt. Die Freisetzungsgeschwindigkeiten werden in den 3538 gezeigt.
  • Beispiel 14
  • Diblock-Copolymere
  • Es wurden Diblock-Copolymere aus Poly(DL-lactid)-Block-Methoxypolyethylenglycol (PDLLA-MePEG), Polycaprolacton-Block-Methoxypolyethylenglycol (PCL-MePEG) und Poly(DL-lactid-co-caprolacton)-Block-Methoxypolyethylenglycol (PDLLACL-MePEG) unter Einsatz eines Massen-Schmelz-PolymerisationsverFahrens synthetisiert. In Kürze wurden gegebene Mengen von Monomeren, DL-Lactid, Caprolacton und Methoxypolyethylenglycol mit unterschiedlichen Molekulargewichten erhitzt (130°C), um unter Stickstoff-Begasung und Rühren zu schmelzen. Zinn-Octoat (0,2% Gew./Gew.) wurde als Katalysator zu den geschmolzenen Monomeren gegeben. Die Polymerisation wurde für etwa 4 Stunden durchgeführt. Die Molekulargewichte, kritischen Mizellen-Konzentrationen und die maximalen Beladungen mit Paclitaxel wurden jeweils mit GPC, Fluoreszenz und Solubilisationstestung untersucht (39). Es wurden hohe Aufnahmekapazitäten für Paclitaxel erzielt. Die Fähigkeit, Paclitaxel löslich zu machen, hängt von den Zusammensetzungen und Konzentrationen der Copolymere ab (39 und 40). PDLLA-MePEG ergab das stabilste lösliche Paclitaxel (40 und 41).
  • Beispiel 15
  • Verkapselung von Paclitaxel in Nylon-Mikrokapseln
  • A. Herstellung von mit Paclitaxel beladenen Mikrokapseln
  • Paclitaxel wurde unter Einsatz der Grenzflächen-Polymerisationstechniken in Nylon-Mikrokapseln verkapselt. In Kürze wurden 100 mg Paclitaxel und 100 mg Pluronic F-127 in 1 ml Dichlormethan (DCM) gelöst und 0,4 ml (etwa 500 mg) Adipoylchlorid (ADC) wurden zugegeben. Diese Lösung wurde in eine 2% PVA-Lösung für 15 Sekunden unter Verwendung eines Polytron Homogenisators (Einstellung 1) homogenisiert. Während der Homogenisierung wurde eine Lösung von 1,6-Hexandiamin (HMD) in 5 ml destillierten Wassers tropfenweise zugegeben. Nach der Zugabe von HMD-Lösung wurde die Mischung für weitere 10 Sekunden homogenisiert. Die Mischung wurde in einen Becher umgefüllt und mit einem magnetischen Rührer für 3 Stunden gerührt. Die Mischung wurde zentrifugiert, gesammelt und in 1 ml destillierten Wassers resuspendiert.
  • B. Effizienz der Verkapselung/Beladung mit Paclitaxel
  • Etwa 0,5 ml der Suspension wurden gefiltert und die Mikrosphären wurden getrocknet. Etwa 2,5 mg der Mikrosphären wurden abgewogen und in 10 ml Acetonitril für 24 Stunden suspendiert. Der Überstand wurde auf Paclitaxel analysiert und das Ergebnis wurde als Prozentsatz von Paclitaxel ausgedrückt. Vorbereitende Untersuchungen haben gezeigt, dass Paclitaxel mit einer hohen Beladung (bis zu 60%) und einer hohen Effizienz der Verkapselung (mehr als 80%) in Nylon-Mikrokapseln verkapselt werden kann.
  • C. Untersuchungen der Freisetzung von Paclitaxel
  • Etwa 2,5 mg der Paclitaxel-Nylon-Mikrosphären wurden in 50 ml Wasser, das jeweils 1 M Natriumchlorid und Harnstoff enthielt, suspendiert und regelmäßig untersucht. Die Freisetzung von Paclitaxel aus den Mikrokapseln erfolgte schnell, wobei mehr als 95% des Arzneimittels nach 72 Stunden freigesetzt wurden (42).
  • Beispiel 16
  • Paclitaxel in Polymer-Mizellen
  • PDLLA-MePEG ist ein Block-Copolymer mit hydrophoben (PDLLA) und hydrophilen (MePEG) Regionen. Bei geeigneten Molekulargewichten und chemischer Zusammensetzung bilden sie Mizellen mit hydrophobem PDLLA Kern und hydrophiler MePEG Hülle. Paclitaxel kann in den hydrophoben Kern geladen werden, womit Paclitaxel mit einer erhöhten "Löslichkeit" bereitgestellt wird.
  • A. Synthese von Diblock-Copolymer von PDLLA-MePEG
  • Monomere von Methoxypolyethylenglycol (z.B. M. W. 2000, 150 g) und DL-Lactid (100 g) werden in einen Kolben mit rundem Boden gegeben und die Temperatur wird auf 130–150°C erhöht. Nach dem Schmelzen der Monomere werden 0,6 g Zinn-Octoat als Katalysator zugegeben. Die Polymerisation ist innerhalb von 0 Stunden beendet. Die Reaktion erfolgt unter N2-Schutz und Rühren.
  • B. Herstellung von Paclitaxel in Mizellen
  • Das PDLLA-MePEG-Copolymer wird in Acetonitril oder 50:50 Ethanol:Aceton (Polymerkonzentration < 40%) gelöst. Die Polymerlösung wird für 5 min zentrifugiert (14000 Upm). Der Überstand (unlösliches Polymer verworfen) wird in ein Teströhrchen aus Glas umgefüllt. Paclitaxel wird in Acetonitril oder 50:50 Ethanol:Aceton gelöst und wird zu der gereinigten Polymerlösung gegeben. Nach Vortex-Mischung wird das Lösungsmittel bei 60°C unter einem Stickstoffstrom evaporisiert (dauert normalerweise für eine typische Paclitaxel-Portion von 40 mg 2 Stunden). Das restliche Lösungsmittel kann durch Anwendung von Vakuum und Hitze entfernt werden. Die Matrix wird auf etwa 60°C erhitzt, bis sie zu einem transparenten Gel wird. Dann wird ein bestimmtes Volumen von Wasser (> 4 mal das Gewicht der Matrix) zur Matrix zugegeben. Dem folgt unmittelbar eine Vortex-Mischung nach, bis die Paclitaxel-Polymermatrix löslich gemacht ist. Die Formulierungen sind in Tabelle II angegeben.
  • Tabelle II. Formulierungen von Paclitaxel/PDLLA-MePEG*
    Figure 00930001
  • C. Herstellung von Systemen zur Abgabe von Paclitaxel aus Mizellen/von Polymeren, die unter Wärmeeinwirkung gelieren.
  • Ein Polymer, das unter Wärmeeinwirkung geliert, wie zum Beispiel Poly(N-isopropylacrylamid) wird in destilliertem Wasser gelöst. Getrennt wird Wasser zu einer mizellenartigen Paclitaxel-Polymermatrix, z.B. mit 10% Paclitaxel beladendes PDLLA-MePEG 2000-40/60, gegeben, um eine Lösung von Paclitaxel in Mizellen zu bilden. Bei de Lösungen werden gekühlt (z.B. 4°C) und gemischt, um das unter Wärmeeinwirkung gelierende System zur Abgabe zu bilden.
  • Beispiel 17
  • Untersuchung der Freisetzung des Arzneimittels
  • Ein bekanntes Gewicht des Polymers (typischerweise ein 2,5 mg Pellet) wird in ein 15 ml Teströhrchen, das 14 ml eines Puffers mit 10 mM Na2HPO4-NaH2PO4, 0,145 M NaCl und 0,4 g/l Rinderserumalbumin enthält, gegeben. Die Röhrchen werden verschlossen und bei 37°C geschwenkt. Zu bestimmten Zeiten werden die gesamten 14 ml des flüssigen Puffers entfernt und mit frischem flüssigen Puffer ersetzt.
  • Der flüssige Puffer wird zu 1 Milliliter Methylenchlorid gegeben und für 1 Minute geschüttelt, um das gesamte Paclitaxel in das Methylenchlorid zu extrahieren. Die wässrige Phase wird dann entfernt und die Methylenchlorid-Phase wird unter Stickstoff getrocknet. Der Rest wird dann in 60% Acetonitril: 40% Wasser gelöst und die Lösung wird unter Einhaltung der folgenden Bedingungen auf ein HPLC-System gegeben: C8 Säule (Beckman Instruments USA), mobile Phase von 58%:5%:37% Acetonitril:Methanol:Wasser bei einer Flussrate von 1 Minute pro Minute.
  • Der gesammelte Puffer wird dann bei 232 nm auf Paclitaxel untersucht. Für MTX wird der gesammelte Puffer ohne die Notwendigkeit einer Extraktion in Methylenchlorid direkt auf die HPLC Säule gegeben. Es wird bei 302 nm auf MTX untersucht. Auf Verbindungen, die Vanadium enthalten, wird der flüssige Puffer unter Verwendung eines UV/VIS Spektrometers im Bereich von 200 bis 300 nm direkt untersucht.
  • Beispiel 18
  • Auswirkung von mit Paclitaxel beladener Thermopaste auf Tumorwachstum und Tumor-Angiogenese in vivo
  • Befruchtete Hühnerembryonen werden 3 Tage, bevor ihre Schalen entfernt werden, inkubiert. Die Inhalte der Eier werden entleert, indem man die Schale, die sich um die Luftkammer herum befindet, entfernt, die innere Membran der Schale ablöst, das gegenüber liegende Ende der Schale perforiert und den Inhalt des Eis sanft aus dem stumpfen Ende herausgleiten lässt. Die Inhalte werden in sterilisierte Glasschalen mit runden Böden entleert, mit Deckeln von Petrischalen abgedeckt und bei 90% relativer Feuchtigkeit und 3% Kohlendioxid inkubiert.
  • MDAY-D2-Zellen (ein lymphatischer Tumor der Maus) werden Mäusen injiziert und man lässt sie zu Tumoren, die 0,5–1,0 g wiegen, heranwachsen. Die Mäuse werden getötet, die Stellen der Tumore mit Alkohol abgewischt, excidiert, in sterile Kulturmedien gegeben und unter einer Abzugshaube mit Laminarfluss in Würfel von 1 mm geschnitten. Bevor die präparierten Tumore auf die 9 Tage alten Hühnerembryonen aufgebracht werden, werden die CAM-Oberflächen leicht mit einer 30-Gauge-Nadel geritzt, um die Implantation des Tumors sicherzustellen. Die Tumore werden dann nach 8 Tagen Inkubation (4 Tage nach dem Entfernen der Schale) auf die CAM aufgebracht und man lässt sie auf der CAM für vier Tage wachsen, damit sich eine Gefäßversorgung bilden kann. Vier Embryonen werden unter Einsatz dieser Methode präpariert, wobei jeder Embryo drei Tumore erhält. Bei diesen Embryonen erhält ein Tumor mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste, der zweite Tumor nicht beladene Thermopaste und der dritte Tumor keine Behandlung. Die Behandlungen werden vor der Aufzeichnung der Ergebnisse für zwei Tage fortgeführt.
  • Die explantierten MDAY-D2 Tumore sezernieren angiogene Faktoren, die das Einsprossen von Kapillaren (von der CAM stammend) in die Tumormasse induzieren und ihr erlauben, weiter an Größe zuzunehmen. Da sich alle Gefäße des Tumors von der CAM herleiten, während alle Tumorzellen von dem explantierten Gewebe stammen, ist es möglich, die Auswirkungen therapeutischer Interventionen auf diese beiden Prozesse voneinander unabhängig zu beurteilen. Dieser Test wurde verwendet, um die Wirksamkeit von mit Paclitaxel beladener Thermopaste auf (a) die Hemmung der Gefäßversorgung des Tumors und (b) die Hemmung des Wachstums der Tumorzellen selbst zu prüfen.
  • Direkte stereomikroskopische Untersuchung in vivo und histologische Untersuchen der fixierten Gewebe aus dieser Untersuchung ergaben Folgendes: In den Tumoren, die mit Thermopaste, die mit 20% Paclitaxel beladen war, behandelt worden waren, gab es im Vergleich zu Kontrolltumoren (70A und 70B) einen Rückgang der Zahl der den Tumor versorgenden Blutgefäße (siehe 70C und 70D), einen Rückgang der Zahl der Gefäße im Tumor und einen Rückgang der Zahl der Blutgefäße in der Peripherie des Tumors (dem Bereich, der in einem festen Tumor typischerweise der am höchsten vaskularisierte ist). Die Tumoren begannen, während der zwei Tage, an denen die Untersuchung durchgeführt wurde, an Größe und Masse abzunehmen. Zusätzlich sah man, dass zahlreiche Endothelzellen in der Zellteilung arretiert waren, was darauf hinweist, dass die Proliferation der Endothelzellen beeinträchtigt worden war. Es wurden auch häufig in der Mitose arretierte Tumorzellen gesehen. Alle 4 Embryonen zeigten ein einheitliches Muster mit einer Suppression der Gefäßversorgung des Tumors durch die mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste, während die nicht beladene Thermopaste keine Wirkung hatte.
  • Im Vergleich waren auf CAM, die mit nicht beladener Thermopaste behandelt worden waren, die Tumore gut vaskularisiert mit einem Anstieg der Zahl und Dichte von Gefäßen im Vergleich zum normalen umgebenden Gewebe und mit drastisch mehr Gefäßen als in Tumoren, die mit Paste, die mit Paclitaxel beladen war, behandelt worden waren, beobachtet wurden. Die neu gebildeten Gefäße drangen von allen Winkeln, erscheinend wie Speichen, die in der Mitte eines Rades befestigt sind, in den Tumor ein (siehe 70A und 70B). Die Kontrolltumore nahmen während des Verlaufs der Studie weiter an Größe und Masse zu. Histologisch sah man zahlreiche dilatierte dünnwandige Kapillaren in der Peripherie des Tumors und wenige Endothelien in der Zellteilung. Das Tumorgewebe war gut vaskularisiert und durchweg lebensfähig.
  • Zum Beispiel wurden von zwei Tumoren mit ähnlicher Größe (anfänglich, zum Zeitpunkt der Explantation), die auf dieselbe CAM aufgebracht worden waren, folgende Daten erhalten: Beim Tumor, der mit Thermopaste, die 20% Paclitaxel beladen war, behandelt worden war, maß der Tumor 330 mm × 597 mm; die unmittelbare Peripherie des Tumors hat 14 Blutgefäße, während die Tumormasse nur 3–4 kleine Kapillaren hat. Beim Tumor, der mit nicht beladender Thermopaste behandelt worden war, war die Tumorgröße 623 mm × 678 mm; die unmittelbare Peripherie des Tumors hat 54 Blutgefäße, während die Tumormasse 12–14 kleine Blutgefäße hat. Zusätzlich enthielt die umgeben de CAM selbst viel mehr Blutgefäße als vergleichsweise der Bereich, der den mit Paclitaxel behandelten Tumor umgab.
  • Diese Untersuchung zeigt, dass die Thermopaste ausreichende Mengen eines antiproliferativen Wirkstoffes (in diesem Fall Paclitaxel) freisetzt, um die pathologische Angiogenese, die mit dem Wachstum und der Entwicklung eines Tumors einhergeht, zu hemmen. Unter diesen Bedingungen wird die Angiogenese maximal von den Tumorzellen stimuliert, welche angiogene Faktoren, die das Einsprossen von Kapillaren aus dem umgebenden Gewebe in die Tumormasse hervorrufen können, produzieren. Die mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste kann diesen Prozess blockieren und Fähigkeit des Tumorgewebes eine ausreichende Blutversorgung aufrechtzuerhalten limitieren. Dies führt sowohl durch eine cytotoxische Wirkung auf die Tumorzellen selbst als auch dadurch, dass dem Gewebe die zu Wachstum und Ausbreitung benötigten Nährstoffe vorenthalten werden, zu einer Abnahme der Tumormasse.
  • Beispiel 19
  • Auswirkung von mit therapeutischem Wirkstoff beladener Thermopaste auf das Tumorwachstum in vivo in einem Tumormodell bei der Maus
  • Das MDAY-D2 Tumormodell bei der Maus kann eingesetzt werden, um die Wirkung von lokaler langsamer Freisetzung einer antiproliferativen Verbindung wie zum Beispiel Paclitaxel auf das Tumorwachstum, die Metastasierung des Tumors und das Überleben des Tieres zu untersuchen. In Kürze wird die MDAY-D2 Tumorzelllinie in einer Zellsuspension, die aus 5% fetalem Kälberserum in alpha-MEM Medium besteht, angezogen. Die Zellen werden bei 37°C in befeuchteter Atmosphäre, die mit 5% Kohlendioxid angereichert ist, inkubiert und alle 3 Tage um das 15fache verdünnt, bis eine ausreichende Zahl von Zellen erreicht wird. Nach der Inkubationsperiode werden die Zellen lichtmikroskopisch auf Lebensfähigkeit hin untersucht und dann bei 1500 Upm für 5 Minuten zentrifugiert. PBS wird zu den Zellen zugegeben, um eine Verdünnung von 1.000.000 Zellen pro ml zu erzielen.
  • Zehn Wochen alte weibliche DBA/2j-Mäuse werden für 3–4 Tage nach Eintreffen akklimatisiert. Jeder Maus werden dann in die posterolaterale Flanke 100.000 MDAY-D2- Zellen in 100 ml PBS subcutan injiziert. Vorhergehende Untersuchungen haben gezeigt, dass dies innerhalb von 3–4 Tagen an der Injektionsstelle einen sichtbaren Tumor erzeugt, der innerhalb von 14 Tagen eine Größe von 1,0–1,7 g erreicht, und 19–25 Tage nach der Injektion in der Leber sichtbare Metastasen produziert. Abhängig vom Ziel der Untersuchung kann zu jedem Punkt des Fortschreitens der Erkrankung eine therapeutische Intervention unternommen werden.
  • Unter Verwendung des obigen Tiermodells werden 20 Mäusen 140.000 MDAY-D2 Zellen s.c. injiziert und man lässt die Tumore wachsen. Am Tag 5 wurden die Mäuse in Gruppen von 5 aufgeteilt. Die Stelle des Tumors wurde unter Narkose chirurgisch eröffnet, der lokale Bereich wurde mit der mit Arzneimittel beladenen Thermopaste oder mit der Kontroll-Thermopaste behandelt, ohne das vorhandene Tumorgewebe zu kompromittieren, und die Wunde wurde verschlossen. Die Gruppen von 5 erhielten entweder keine Behandlung (Wunde lediglich verschlossen), Polymer (PCL) allein, mit 10% Paclitaxel beladene Thermopaste oder mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste (nur 4 Tieren injiziert) nahe der Stelle des Tumors eingesetzt. Am Tag 16 wurden die Mäuse getötet, die Tumore wurden präpariert, und (makroskopisch und histologisch) auf Tumorwachstum, Tumormetastasierung, lokale und systemische Toxizität als Ergebnis der Behandlung, Wirkung auf die Wundheilung, Wirkung auf die Gefäßversorgung der Tumore, und auf die Verfassung der an der Incisionsstelle verbliebenen Paste hin untersucht.
  • Der Gewichte der Tumore sind für jedes Tier in Tabelle IV unten angegeben.
  • Tabelle IV Tumorgewichte (g)
    Figure 00990001
  • Mit 20% Paclitaxel beladene Thermopaste reduzierte das Tumorwachstum um mehr als 85% (Durchschnittsgewicht 0,105) im Vergleich zu Kontrolltieren (Durchschnittsgewicht 0,681). Tiere, die nur mit Thermopaste oder mit Thermopaste, die 10% Paclitaxel enthielt, behandelt worden waren, hatten nur geringe Auswirkungen auf das Tumorwachstum; die Tumorgewichte wurden um nur 10% beziehungsweise 35% (43A) verringert. Daher war die Thermopaste, die 20% Paclitaxel enthielt, bei der Reduktion des Tumorwachstums wirksamer als Thermopaste, die 10% Paclitaxel enthielt (siehe 43C, siehe auch 43B).
  • Bei einigen Tieren wurde Thermopaste an der Stelle der Verabreichung gefunden. Bei 8 von 15 Mäusen wurde Polymer, dessen Gewicht zwischen 0,026 g bis 0,078 g variierte, nachgewiesen. Jedes Tier in der Gruppe mit Thermopaste, die mit 20% Paclitaxel beladen war, enthielt einiges an verbleibendem Polymer, was nahe legt, dass es weniger anfällig für Auflösung war. Histologisch enthielten die Tumore, die mit Thermopaste, die mit Paclitaxel beladen war, behandelt worden waren, weniger Zellgehalt und mehr Ge websnekrose als Kontrolltumore. Das Gefäßnetz war reduziert und man sah oft, dass Endothelzellen in der Zellteilung arretiert waren. Die mit Paclitaxel beladene Thermopaste schien keine Auswirkungen auf die Integrität und den Zellgehalt der Haut oder der den Tumor umgebenden Gewebe zu haben. Grob betrachtet war die Wundheilung unbeeinflusst.
  • Beispiel 20
  • Verwendung von mit Paclitaxel beladener chirurgischer Paste, um das Nachwachsen von teilweise resezierten RIF-1 Tumoren in Mäusen zu verzögern.
  • Es wurde die Wirksamkeit einer Formulierung von Paclitaxel in einer biologisch abbaubaren, polymeren, chirurgischen Paste in Retardform auf das Verzögern des Nachwachsens von teilweise resezierten RIF-1 Tumoren in C3H/HeJ-Mäusen untersucht.
  • A. Methoden
  • Paclitaxel (20%) wurde in eine 4:1 Mischung von Poly(ε-caprolacton) und Methoxypolyethylenglycol integriert. Das in vitro Freisetzungsprofil für diese Formulierung in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit Albumin (0,5 mg/ml) bei 37° wurde unter Verwendung eines HPLC-Tests für Paclitaxel untersucht. In Kürze wurden siebzehn Mäusen 100 μl einer RIF-1 Zellsuspension (1,0 × 106 Zellen) in Hanks Puffer injiziert. Man ließ die Tumore für 5 Tage wachsen, wonach mehr als 70% eines jeden Tumors chirurgisch reseziert und die verbliebene Tumormasse unbehandelt gelassen oder mit 20–30 μl von entweder 20% Paclitaxel in chirurgischer Paste oder von chirurgischer Paste allein (kein Arzneimittel) beschichtet wurde. Dies war Tag 0. Die Dimensionen der sichtbaren Tumormasse unter der Haut wurden an den Tagen 4 bis 7 und am Tag 9 gemessen. Es wurde gezeigt, dass die Fläche dieser sichtbaren zylindrischen Oberfläche des Tumors mit dem Volumen des Tumors korrelierte (r = 0,812).
  • B. Ergebnisse
  • Die in vitro Freisetzungskurve von Paclitaxel wurde durch eine anfängliche Ausbruchsphase von 1 Tag gefolgt von einer langen Periode einer langsamen, anhaltenden Freisetzung charakterisiert. Die Flächen der sichtbaren zylindrischen Oberflächen der Tumore jeder Maus von den Tagen 4 bis 9 sind in Tabelle V dargestellt. In den beiden Grup pen, die kein Paclitaxel erhielten, zeigten alle Mäuse mit Ausnahme von einer ein beträchtliches Nachwachsen des Tumors am Tag 4. Eine Maus, die Polymer allein erhalten hatte, zeigte ein verzögertes Nachwachsen des Tumors, während eine Maus, die keine Therapie erhalten hatte, kein Nachwachsen zeigte. Im Gegensatz dazu zeigten alle Mäuse, die mit chirurgischer Paste mit Paclitaxel behandelt worden waren, bis auf eine bis mindestens Tag 5 kein Nachwachsen des Tumors, und zwei Mäuse zeigten bis zum Tag 6 noch kein Nachwachsen.
  • C. Schlussfolgerung
  • Mit Paclitaxel beladene Paste hemmte das Nachwachsen des Tumors zwischen den Tagen 1 bis 5 signifikant. Nach Tag 6 trat infolge der Aggressivität der Zellline ein Nachwachsen auf. Tabelle V Größe von RIF-1 Zelltumoren (dargestellt als Fläche der durch die Haut sichtbaren Tumormasse in mm2), gemessen an Tagen nach der chirurgischen Tumorresektion
    Figure 01020001
    • * Tumor nicht gemessen oder Tier bereits getötet
  • Vergleichsbeispiel 21
  • Verkapselung von Suramin
  • Ein Milliliter von 5% ELVAX (Poly(ethylenvinylacetat) mit 5% Vinylacetat quervernetzt) in Dichlormethan ("DCM") wird mit einem festgesetzten Gewicht von im Submicron-Bereich gemahlenen Natrium-Suramin gemischt. Diese Mischung wird in 5 ml 5% Polyvinylalkohol ("PVA") in Wasser in einem 30 ml Teströhrchen mit flachem Boden injiziert. Röhrchen mit unterschiedlichen Gewichten des Arzneimittels werden dann in einem Multiprobenwasserbad bei 40°C für 90 Minuten mit automatisiertem Rühren suspendiert. Die Mischungen werden entnommen und Proben der Mikrosphären werden für die Größenbestimmung abgenommen. Die Röhrchen werden bei 1000g für 5 min zentrifugiert. Der PVA Überstand wird entfernt und zur Untersuchung (nicht verkapseltes Arzneimittel) aufbewahrt. Die Mikrosphären werden dann in 5 ml Wasser gewaschen (gevortext) und erneut zentrifugiert. Die 5 ml Waschlösung werden zur Untersuchung (oberflächengebundenes Arzneimittel) aufbewahrt. Die Mikrosphären werden dann in 50 μl Methanol angefeuchtet und in 1 ml DCM gevortext, um das ELVAX zu lösen. Die Mikrosphären werden dann auf 40°C erwärmt, und 5 ml von Wasser von 50°C werden langsam unter Rühren zugegeben. Dieser Arbeitsschritt führt zur sofortigen Verdunstung von DCM, was dadurch die Freisetzung des Natrium-Suramins in die 5 ml Wasser bewirkt.
  • Alle Proben wurden durch Fluoreszenzquantifizierung auf ihren Arzneimittelgehalt hin untersucht. In Kürze absorbiert Natrium-Suramin UV/vis mit lambda max von 312 nm. Diese Absorption ist sowohl in Wasser als auch in 5% PVA im Bereich von 0 bis 100 mg/ml linear. Natrium-Suramin fluoresziert auch stark mit einem Excitationsmaximum bei 312 nm und einem Emissionsmaximum bei 400 nm. Diese Fluoreszenz ist im Bereich von 0 bis 25 μg/ml quantifizierbar.
  • Die Ergebnisse dieser Experimente werden in den 4450 gezeigt. In Kürze scheint die Größenverteilung der Mikrosphären nach Anzahl (44) oder nach Gewicht (45) durch den Einschluss des Arzneimittels in das DCM nicht beeinflusst zu werden. Es können gute Ausbeuten von Mikrosphären im Bereich von 20 bis 60 μm erzielt werden.
  • Die Verkapselung von Suramin ist sehr gering (< 1%) (siehe 47). Jedoch erhöhte sich die Gesamtmenge des verkapselten Arzneimittels mit der Steigerung des Gewichts des Arzneimittels im DCM, obwohl der Prozentsatz der Verkapselung absank. Wie in 46 gezeigt wird, können 50 μg des Arzneimittels in 50 mg ELVAX verkapselt wer den. Die Verkapselung von Natrium-Suramin in 2,5% PVA mit 10% NaCl wird in 48 (Größenverteilung nach Gewicht) gezeigt. Die Verkapselung von Natrium-Suramin in 5% PVA mit 10% NaCl wird in den 49 und 50 (Größenverteilung jeweils nach Gewicht und Anzahl) gezeigt.
  • Um Suramin und Cortisonacetat als potenzielle antiangiogene Wirkstoffe zu beurteilen wurde jeder Wirkstoff mit 0,5% Methylcellulose gemischt und die getrockneten Scheiben mit dem Arzneimittel wurden auf die sich entwickelnden Blutgefäße der 6 Tage alten CAM aufgebracht. Eine Kombinationsbehandlung aus Suramin (70 μg) mit Cortisonacetat (20 μg) war in einem 48-Stunden-Test auf der CAM bei der Hemmung der Angiogenese erfolgreich. Die sich hieraus ergebende gefäßfreie Zone maß 6 mm im Durchmesser und zeigte einen fehlenden Blutstrom und das Auftreten von verstreuten Blutinseln (51A und 51B).
  • Vergleichsbeispiel 22
  • Mit Methotrexat beladene Paste
  • A. Herstellung von mit Methotrexat beladener Paste
  • Methotrexat ("MTX"; Sigma Chemical Co.) wird mit Stößel und Mörser gemahlen, um die Partikelgröße auf unter 5 Micron zu reduzieren. Es wird dann als trockenes Pulver mit Polycaprolacton (Molekulargewicht 18000 Birmingham Polymers, AL USA) gemischt. Die Mischung wird für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und die geschmolzene Mischung Polymer-Methotrexat wird für 5 Minuten zu einer glatten Paste gerührt. Die geschmolzene Paste wird dann in eine 1 ml Spritze gegeben und nach Bedarf herausgedrückt.
  • B. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in den 52A–E gezeigt. In Kürze zeigt 52A die Freisetzung von MTX aus PCL-Scheiben, die 20% MePEG und verschiedene Konzentrationen von MTX enthalten. 52B zeigt ein ähnliches Experiment mit Paste, die kein MePEG enthält. Die 52C, D und E zeigen die Menge von MTX, die in den Scheiben verbleibt.
  • Wie aus den obigen Resultaten ersehen werden kann, können beträchtliche Mengen MTX aus dem Polymer freigesetzt werden, wenn hohe MePEG-Konzentrationen eingesetzt werden.
  • Vergleichsbeispiel 23
  • Herstellung von Mikrosphären, die Methotrexat enthalten
  • A. Mikrosphären mit Methotrexat allein
  • Methotrexat (Sigma) wurde mit Stößel und Mörser gemahlen, um die Partikelgröße auf unter 5 Micron zu reduzieren. Einhundert Milliliter von 2,5% PVA (Gew./Vol.) (Aldrich oder Sigma) in Wasser wurde für 15 Minuten mit 500 mg von ungemahlenem MTX bei 25°C gerührt, um die Lösung mit MTX zu sättigen. Diese Lösung wurde bei 2000 Upm zentrifugiert, um ungelöstes MTX zu entfernen und der Überstand wurde zur Herstellung von Mikrosphären verwendet.
  • In Kürze wurden 10 ml einer 5% (Gew./Vol.) Lösung von Poly(DL)milchsäure (Molekulargewicht 500.000; Polysciences), Polymilch-:glycolsäure (50:50 IV 0,78 Polysciences) oder Polycaprolacton (Molekulargewicht 18.000, BPI) mit 10:90 (Gew./Gew.) MTX(gemahlen):POLYMER langsam und tropfenweise unter Rühren bei 600 Upm in 100 ml der mit MTX gesättigten 2,5% (Gew./Vol.) PVA-Lösung gegeben. Die Mischung wurde bei 25°C für 2 Stunden gerührt und die sich daraus ergebenden Mikrosphären wurden gewaschen und getrocknet.
  • Mit Einsatz dieser Methode können reproduzierbar mit MTX beladene Mikrosphären im Bereich von 30 bis 160 Micron (siehe 53) hergestellt werden.
  • B. Mikrosphären mit MTX und Hyaluronsäure
  • Mit MTX beladene Mikrosphären können wie unten im Wesentlichen beschrieben unter Verwendung von Hyaluronsäure ("HA") als Träger durch ein Herstellungsverfahren mit einer Wasser-in-Öl-Emulsion hergestellt werden. In Kürze werden 50 ml Paraffinöl (Leichtöl; Fisher Scientific) unter Rühren bei 200 Upm auf 60°C erhitzt. 5 ml einer Natriumhyaluronat-Lösung (20/ml); Herkunft = Hahnenkamm; Sigma) in Wasser, die verschiedene Mengen MTX enthält, werden dem Paraffinöl tropfenweise zugegeben. Die Mischung wird bei 200 Upm für 5 Stunden gerührt und bei 500 × g für 5 Minuten gerührt. Die sich hieraus ergebenden Mikrosphären werden viermal in Hexan gewaschen und man lässt sie trocknen.
  • Vergleichsbeispiel 24
  • Herstellung von polymeren Zusammensetzungen, die Vanadiumverbindungen enthalten
  • A. Polymere Paste, die Vanadylsulfat enthält
  • Vanadylsulfat (Fisher Scientific) wird zunächst mit Stößel und Mörser gemahlen, um die Partikelgröße zu verringern und wird dann in geschmolzenes PCL dispergiert, wie oben für MTX beschrieben. Es wird dann in eine Spritze aufgenommen, um fest zu werden, und ist gebrauchsfertig.
  • Die Freisetzung des Arzneimittels wurde im Wesentlichen wie oben in Beispiel 31 beschrieben ermittelt, mit den Ausnahmen, dass ein Pellet von 65 mg von 10% (Gew./Gew.) VOSO4:PCL in 10 ml Wasser suspendiert wurde und dass der Überstand unter Einsatz der UV/Vis-Absorptionsspektroskopie des Peaks im Bereich von 200 bis 300 nm auf freigesetztes Vanadylsulfat untersucht wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 54 gezeigt. In Kürze wurden aus einer polymeren Zusammensetzung, die 10% VOSO4 enthielt, in 6 Stunden 1 mg VOSO4 freigesetzt, 3 mg nach 2 Tagen und 5 mg am Tag 6.
  • B. Polymere Mikrosphären, die Vanadylsulfat enthalten
  • Vanadylsulfat wurde im Wesentlichen wie in Beispiel 23 beschrieben in Mikrosphären aus Polymilchsäure oder Hyaluronsäure integriert. Die Ergebnisse sind in 55 dargestellt.
  • C. Polymere Paste, die organisches Vanadat enthält
  • Organisches Vanadat wird einer PCL-Paste im Wesentlichen wie oben in Beispiel 22 beschrieben zugeführt. Die Freisetzung von Vanadat aus den Mikrosphären wurde wie oben beschrieben ermittelt. Die Ergebnisse sind in den 56A und 56B gezeigt.
  • D. Mikrosphären, die organisches Vanadat enthalten
  • Organisches Vanadat kann auch Mikrosphären im Wesentlichen wie in Beispiel 23 beschrieben zugeführt werden. Solche Mikrosphären sind in 57 für Poly(D,L)milchsäure (M. W. 500.000; Polysciences) abgebildet.
  • Vergleichsbeispiel 25
  • Polymere Zusammensetzung, die Bis(maltolato)oxovanadium (BMOV) enthält
  • A. Herstellung einer mit Bis(maltolato)oxovanadium beladenen Paste
  • Poly(ε-caprolacton) (Molekulargewicht 20000) (BPI Birmingham AL) und BMOV wurden in angemessenen Verhältnissen direkt in ein Becherglas eingewogen. In einigen Formulierungen wurde auch Methoxypolyethylenglycol (MEPEG) (Molekulargewicht 350) (Union Carbide, Danbury CT.) zu PCL und BMOV zugegeben. Becher und Inhalt wurden unter leichtem Rühren für 5 Minuten auf 55°C erwärmt, bis das BMOV gründlich im geschmolzenen Polymer dispergiert war. Die geschmolzene Mischung wurde dann in eine vorgewärmte Spritze aufgezogen und bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
  • B. Untersuchungen zur Arzneimittelfreisetzung
  • Zu Röhrchen, die 15 ml einer 10 mM Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS pH 7,4) und 100 μg/ml Rinderserumalbumin (Fraktion 5 Boehringer Mannheim, Deutschland) enthielten, wurden 150 mg scheibenförmiger Platten aus PCL-BMOV-Paste gegeben. Die Röhrchen wurden verschlossen und mit 30 Upm bei 37°C über ihre Enden geschwenkt. Zu angebrachten Zeiten ließ man die PCL-BMOV-Platte unter Schwerkraft für 5 Minuten absinken und entfernte den gesamten Überstand. In den Überständen wurde die Konzentration von BMOV durch Messung der Absorption bei 256 nm (A256) und bei 276 nm (A276) ermittelt. Der Überstand wurde mit 15 ml frischer PBL ersetzt und die Röhrchen wurden erneut geschwenkt. Durch Verwendung von BMOV-Standards im Bereich von 0 bis 25 μg/ml erhielt man eine lineare Kalibrationskurve von BMOC-Konzentration vs. A256 oder A276. Es wurde gezeigt, dass die Absorptionswerte dieser Standards bei 256 nm oder bei 276 nm durch die Lagerung in verschlossenen Röhrchen bei 37°C für 2–3 Tage (dieselben Bedingungen wie bei den Untersuchungen zur Arzneimittelfreisetzung) nicht beeinflusst wurden.
  • Am Ende der Untersuchungen zur Arzneimittelfreisetzung wurden Proben der PCL-BMOV-Matrix auf ihren Gehalt an verbliebenem Arzneimittel hin untersucht, indem ein bekanntes Trockengewicht der Matrix in 0,5 ml Dichlormethan (DCM) (Fisher) gelöst wurde. Zu dieser Lösung wurden unter Mischen 50 ml warmen (50°C) Wassers gegeben, um das DCM verdunsten zu lassen, wodurch das BMOV zur spektrophotometischen Untersuchung (A256) in Wasser zurückgelassen wurde.
  • C. Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
  • Proben der PCL-BMOV-Matrix, die in den 2 Monate dauernden Experimenten zur Arzneimittelfreisetzung verwendet worden waren, wurden mit SEM untersucht. Diese Proben wurden mit frisch hergestellten Kontrollproben verglichen. Polymerproben wurden beschichtet (60:40 Gold:Palladium) (Hummer instruments, Technics, USA) und mit einem Hitachi (Modell F-2300) Rasterelektronenmikroskop mit einem IBM-Datenerfassungssystem untersucht.
  • D. Ergebnisse
  • Die Freisetzung von BMOV aus der PCL-Matrix wird in den 58A und 58B gezeigt. Eine Steigerung der Beladung mit BMOV von 5% auf 35% in der PCL-Matrix steigerte die Geschwindigkeit der Freisetzung des Arzneimittels über die Periode von zwei Monaten (58A). Bei einer Beladung mit 35% BMOV stieg die Freisetzungsgeschwindigkeit drastisch. Die Freisetzungsprofile für Beladungen mit 20% bis 30% BMOV zeigten eine anfänglich schnellere Phase der Arzneimittelfreisetzung an den ersten beiden Tagen, gefolgt von einer geregelten, nahezu linearen Freisetzung über die nächsten 2 Monate.
  • Die Profile der Arzneimittelfreisetzung werden auch als Prozentsatz des im Pellet verbleibenden Arzneimittels ausgedrückt (58B). In Kürze war der Prozentsatz des in der PCL-Matrix verbleibenden BMOV zu allen Zeitpunkten für alle Beladungen mit BMOV bis zu (und einschließlich) 30% fast identisch, so dass nach zwei Monaten zwischen 65% und 80% des ursprünglichen BMOV noch in der Matrix vorhanden waren. (Zur Übersichtlichkeit werden nur die Daten für die Beladungen mit 25% und 30% BMOV in 58B gezeigt). Der Prozentsatz des in der Matrix verbleibenden Arzneimittels nahm bei einer Beladung mit 35% BMOV schneller ab, so dass nach einem Monat wenig mehr als 50% des ursprünglichen BMOV in der Matrix vorhanden war. Um die Daten der kumulativen Arzneimittelfreisetzung zu verifizieren, wurden Proben der PCL-BMOV-Matrix am Ende eines jeden Experiments zur Arzneimittelfreisetzung auf den Gehalt an verbliebenem Arzneimittel hin untersucht. Der Prozentsatz des Arzneimittels, der nach 70 Tagen verblieben war, war dieser Restuntersuchung zufolge wie folgt: 67% +/– 10% (5% BMOV), 56% +/– 10% (10% BMOV), 80% +/– 20% (15% BMOV), 84% +/– 20% (20% BMOV), 85% +/– 12% (25% BMOV), 77% +/– 14% (30% BMOV) und 57% +/– 15% (35% BMOV).
  • Die 59A und 59B zeigen die Wirkung des Zugebens von 20% MEPEG zur PCL-Matrix auf die Profile der Arzneimittelfreisetzung für verschiedene Konzentrationen der Beladung mit BMOV. Die Zugabe von MEPEG zur Matrix erhöht die Freisetzungsrate von BMOV im Vergleich mit der Freisetzung von BMOV aus dem PCL allein drastisch (58). Mehr als 50% des BMOV wurden aus der Polymermatrix innerhalb von 7 Tagen 1 Woche bei allen Konzentrationen der Beladung mit BMOV freigesetzt. Die Restuntersuchung der PCL-BMOV-MEPEG-Pellets ergab die folgenden Werte für den Prozentsatz von nach 7 Tagen in den Pellets verbliebenem BMOV: 24% (+/–9%), 5% BMOV; 25% (+/–8%), 10% BMOV; 22% (+/–4%), 15% BMOV; 27% (+/–7%), 20% BMOV.
  • 60A zeigt die Morphologie der BMOV-Kristalle unter hoher Vergrößerung. Die 60B und 60C zeigen die Morphologie der Polymer-Arzneimittel-Matrices sowohl vor als auch nach der zwei Monate dauernden Untersuchung zur Arzneimittelfreisetzung in wässrigem Puffer. Vor der Untersuchung der Freisetzung waren die PCL-BMOV-Matrices bei Beladungen mit 15%, 20% und 30% BMOV typischenroeise auf ihren äußeren Oberflächen glatt und eine typische SEM ist in 60B abgebildet. Nach der Inkubation für zwei Monate in wässrigem Puffer waren die äußeren Oberflächen rau und zerklüftet.
  • E. Diskussion
  • Es wurde festgestellt, dass diese Verbindung sehr langsam mit Freisetzungscharakteristika, die für die Aufrechterhaltung nachhaltiger Vanadium-Konzentrationen nahezu ideal sind, aus der PCL-Matrix freigesetzt wird. Diese Charakteristika beinhalteten nur einen kleinen Ausbruchseffekt der Arzneimittelfreisetzung in den ersten paar Tagen gefolgt von annähernd linearen Freisetzungskinetiken bei den meisten Arzneimittelbeladungen (58). BMOV ist weniger wasserlöslich als Vanadylsulfat oder Natriumorthovanadat und die Hydrophobizität des Moleküls erhöht wahrscheinlich der Affinität der BMOV Moleküle zur hydrophoben PCL-Matrix und erniedrigt die Freisetzungsrate des Arzneimittels in ein wässriges Inkubationsmedium.
  • Es wurde gezeigt, dass die Zugabe von 20% MEPEG zu PCL die thermischen Flusseigenschaften der Paste verbessert, indem die Viskosität der Matrix und die Temperatur, bei der das Polymer fest wird, erniedrigt werden. Diese Eigenschaften sind bei der Anwendung der Paste auf eine peritubuläre Tumorlokalisation wichtig, weil unter diesen Bedingungen eine bessere Abdeckung der Stelle erzielt wird. Es wurde gezeigt, dass im Vergleich zu den Freisetzungsraten von BMOV-PCL (kein MEPEG) (58) die Zugabe von MEPEG zur BMOV-PCL-Matrix der Paste die Freisetzungsraten von BMOV in vitro (59) bei allen Konzentrationen (5% bis 20%) der Beladung mit BMOV steigert. Es wurde gezeigt, dass die mit 5% BMOV beladene PCL-MEPEG-Paste zwischen 500 und 1000 μg BMOV pro Tag freisetzt (was der Freisetzungsrate von mit 35% BMOV beladenem PCL ähnlich war).
  • Vergleichsbeispiel 26
  • In vitro und in vivo Wirksamkeit von mit Bis(maltolato)oxovanadium beladener Thermopaste
  • Mit BMOV beladene polymere PCL-Thermopaste wurde wie oben beschrieben hergestellt und auf ihre Wirksamkeit gegen Tumorzelllinien sowohl in vitro als auch in vivo untersucht.
  • A. Menschliche Tumorzelllinien
  • Die menschlichen Tumorzelllinien HT-29 Colon-, MCF-7 Brust- und SKMES1 nicht kleinzelliger Lungentumor wurden von der American Type Culture Collection bezogen. Die HAT-29 Colon-Zellline wurde in RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (HIFBS) kultiviert, die MCF-7 Brust-Zellline in Iscove's modifiziertem Eagles Medium mit 5% HIFBS plus 10–9 M Insulin und die SKMES1 Lungen-Zelllinie in Eagle's minimalem essentiellen Medium mit 10% nicht hitzeinaktiviertem FBS.
  • B. Normale menschliche Knochenmarkzellen
  • Normales menschliches Knochenmark (auf Tumorzellen histologisch negativ) wurde von Patienten erhalten, die wegen ihrer soliden Tumore eine Knochenmarktransplantation erhalten sollten, aber starben, bevor das Mark verwendet wurde. Nach Zentrifugation wurde der buffy coat entfernt und die Zellen wurden mit Lysepuffer behandelt und zweimal mit RPMI 1640 mit 20% HIFBS gewaschen und dann darin resuspendiert. Die Zellen wurden durch eine 25 g-Nadel gezogen und gezählt.
  • C. Radiometrisches (Bactec) System
  • Das Bactec System (Johnston Laboratories, Towson, MD) basiert auf einem klinischen Instrument, das entwickelt wurde, um Bakterien in Blutkulturen zu ermitteln und verwendet wurde, um nach neuen antineoplastischen Wirkstoffen zu suchen. Das radiometrische System ist ein schnelles, semiautomatisiertes System, das die Hemmung der Umwandlung von 14C-Glucose zu 14CO2 als Index der Cytotoxizität einsetzt. Die Bactec-Maschine entleert das 14CO2 automatisch in eine Ionenkammer, wo das Signal des radioaktiv markierten CO2 in ein proportionales elektrisches Signal oder einen Wachstumsindexwert auf einer Skala von 1 bis 1000 umgewandelt wird. Zur kontinuierlichen Einwirkung wurden die Tumorzellen oder normalen Knochenmarkzellen zu 2 ml von geeignetem Wachstumsmedium, das 2 μC von 14C-Glucose plus BMOV mit endgültigen Konzentrationen von 0,01, 0,1, 1, 10, 25 und 50 μM enthielt, gegeben und in 20 ml Serumgefäße mit Gummistopfen injiziert, welche eine Mischung aus 5% CO2 und Luft enthielten, und bei 37°C für 24 Tage inkubiert. Zu einer Einwirkung von einer weiteren Stunde wurden die Zellen und BMOV in gleichen Endkonzentrationen in 15 ml konischen Gefäßen aus Polypropylen in einem 37°C Wasserbad für eine Stunde inkubiert. Die Zellen wurden dann zentrifugiert und in Medium gewaschen, dann in 2 ml des geeigneten Wachstumsmediums, das 2 μC von 14C-Glucose enthielt, resuspendiert und in 20 ml Serumgefäße mit Gummistopfen injiziert, welche eine Mischung aus 5% CO2 und Luft enthielten, und bei 37°C für 24 Tage inkubiert. An den Tagen 6, 9 und 12 bei den Tumorzelllinien und an den Tagen 6, 15 und 24 bei den Knochenmarkzellen wurden die Gefäße entfernt und zur Ermittlung der Menge von 14CO2, die von den Zellen durch die Metabolisierung der 14C-Glucose produziert worden war, in das Bactec-Instrument eingelegt. Die Wachstumsindexwerte der mit BMOV behandelten Zellen wurden mit den Wachstumsindexwerten von unbehandelten Zellen verglichen und es wurde der Prozentsatz des Überlebens im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen berechnet.
  • D. Tumorresektionsstudien
  • Für diese Untersuchungen wurden sieben Wochen alte, männliche C3H/HeJ Mäuse verwendet. RIF-1 (Strahlungsinduziertes Fibrosarkom der Maus) Zellen wurden in alpha-MEM-Medien mit 10% FBS (Gibco Canada) kultiviert. Die Zellen wurden in 1% Hanks gepufferter Salzlösung (HESS pH 7,4) (Gibco Canada) bei einer Konzentration von 1 × 107 Zellen/ml suspendiert. Einhundert Mikroliter dieser Zellen(1 × 106 Zellen) wurden in die rechte Flanke einer jeden Maus injiziert. Man ließ die Tumore für 5 Tage wachsen (zu dieser Zeit maßen die Tumore zwischen 6 und 8 mm im Durchmesser). Am Tag 5 wurden die Mäuse mit einer Kombination Ketamin:Rompom (70 mg/kg:10 mg/kg) anästhesiert (0,02 ml/g). 5 mm vom Tumorrand entfernt wurde eine Inzision gesetzt und etwa 90% von jedem Tumor wurden entfernt und 150 mg von geschmolzenem (50°C) PCL-BMOV oder PCL allein (Kontrolle) wurden aus einer 500 μl-Spritze auf die gesamte Oberfläche der resezierten Tumorstelle herausgedrückt. Das PCL wurde innerhalb von 30 Sekunden fest und der Bereich wurde mit 5–0 Prolenenähten verschlossen. Die Mäuse wurden an den Tagen 4, 5, 6 und 7 untersucht. An jedem Tag wurden die Tumore gemessen (langer und kurzer Durchmesser) und es wurden Bilder aufgenommen. Sobald die Tumore einen Maximaldurchmesser von 9 mm erreichten, wurden die Mäuse getötet und der Bereich mit dem Tumor wurde für weitere histologische Untersuchungen excidiert.
  • Die Ergebnisse werden in 63 dargestellt.
  • E. Tumorhemmungsstudien
  • Die MDAY-D2 hämatopoetische Zellline (erhalten von Dr. J Dennis, Mount Sinai Hospital, Toronto) wurde ausplattiert oder in Suspension in DMEM mit 5% FBS (Gibco Canada) angezogen. Jeder Maus wurden auf der posterolateralen Seite 4 × 105 Zellen in 100 μl PBS subcutan injiziert. Nach 5 Tagen Tumorwachstum wurden 150 mg der geschmolzenen PCL- oder PCL-BMOV-Paste in einen der Tumorlokalisation jeder Maus benachbarten Bereich implantiert. Nach 15 Tagen wurden die Mäuse getötet, gewogen und die Tumore wurden präpariert und gewogen. Die Ergebnisse sind in 62 dargestellt.
  • F. Ergebnisse und Diskussion
  • Gegen die normalen menschlichen Knochenmarkzellen hatte die einstündige Einwirkung von BMOV auch wenig Wirkung, auch bei einer Konzentration von 50 μM. Bei einer kontinuierlichen Einwirkung war die Wirkung des BMOV auf die Markzellen noch nicht sehr ausgeprägt, wobei eine Sensitivität (49% Überleben) nur bei der Konzentration von 50 μM beobachtet wurde. Somit schien die BMOV-Verbindung bei den untersuchten Konzentrationen und Einwirkzeiten nicht sehr myelosuppressiv zu sein.
  • In dieser Untersuchung wurde die antineoplastische Wirkung von BMOV in vitro gegen drei menschliche Krebszelllinien unter Bedingungen, die einen kontinuierlichen Kontakt zu dem Arzneimittel gewährleisten, gezeigt. in vivo kann jedoch die Wirksamkeit vom kontinuierlichen Kontakt der Tumorzellen zum BMOV abhängen. Das Hauptziel dieser Untersuchung war es, ein biologisch abbuubares, polymeres Freisetzungssystem zu entwerfen und zu testen (in vivo), das eine kontinuierliche Zufuhr von Vanadium (BMOV-Form) in niedrigen Konzentrationen bereitstellen kann.
  • In vivo Untersuchungen zeigten, dass eine Einzelverabreichung von PCL-BMOV-Paste subcutan das Tumorwachstum von MDAY D2 hemmte. 62 zeigt die Daten für Tumorgewichte von Kontrollmäusen (PCL – kein BMOV) und von Mäusen, die mit PCL, das mit 25%, 30% und 35% BMOV beladen war, behandelt wurden. Es gab eine Hemmung von 54% des Tumorwachstums bei mit 25% BMOV beladenem PCL (signifikant mit p < 0,05). Die Beladungen mit 30% und 35% BMOV ergaben eine Hemmung des Tu morwachstums von 76% beziehungsweise 80% und eine der sechs Mäuse in der Gruppe mit 35% BMOV zeigte eine vollständige Eradikation des Tumors.
  • Interessanterweise zeigten die in vivo Freisetzungsprofile des Arzneimittels, dass Paste, die aus 25% und 30% BMOV bestand, etwa 500 μg BMOV pro Tag freisetzte, was eine vorher gezeigte Wirksamkeit hat. Jedoch setzte mit 35% BMOV beladene PCL-Paste, die bei der Reduktion des Tumorwachstums am wirksamsten war, etwa das Doppelte dieser Arzneimittelmenge in vitro frei. Diese Daten veranschaulichen, dass die anhaltende Freisetzung geringer Mengen von Vanadiumverbindungen im Vergleich zu einem Regime mit täglicher Verabreichung von Vanadium ein gleich wirksames oder wirksameres Therapieregime sein wird.
  • Obwohl PCL-BMOV-Paste bei der Hemmung des Tumorwachstums gleich wirksam war, zeigten die Mäuse keine Zeichen von Stress oder Gewichtsverlust. Vermehrter Stress und Gewichtsverlust, was üblicherweise bei täglichen Injektionen hoher Dosen von Vanadat beobachtet wird, stehen höchstwahrscheinlich in Beziehung zu einer Toxizität, die von den hohen Vanadat-Spiegeln im Plasma unmittelbar nach der Verabreichung hervorgerufen wird. Die Verwendung von PCL-BMOV-Paste zum Bereitstellen einer anhaltenden Freisetzung von Vanadat über lange Zeiträume kann große Fluktuationen der Konzentrationen von Vanadat im Plasma reduzieren und eine von Vanadat verursachte Toxizität verhindern. Diese Daten stehen in Einklang mit unserer Hypothese, dass eine langsame, anhaltende Freisetzung von BMOV bei der Reduktion von Tumorwachstum gleich wirksam oder wirksamer ist und von Vanadat verursachte Toxizität verhindert.
  • Vergleichsbeispiel 27
  • Wirkung von BMOV-Mikrosphären auf das Tumorwachstum in Mäusen
  • Das Ziel dieser Untersuchung war es, die Fähigkeit von mit BMOV beladenen PLLA-Mikrosphären (20%), das Tumorwachstum in Mäusen zu reduzieren, zu untersuchen.
  • Zwanzig von vierundzwanzig Mäusen wurden subcutan 100 ml MDAY-D2 Zellen mit einer Dichte von 10 × 106/ml injiziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse in 6 Gruppen aufgeteilt. Gruppe 1: Leerkontrolle, Gruppe 2: Tumorkontrolle, der Gruppe 3 wurden 0,25 mg/100 μl BMOV zweimal am Tag injiziert. Der Gruppe 4 wurden 20 mg PLLA-Mikrosphären, die 5 mg BMOV enthielten, IP injiziert. Der Gruppe 5 wurden 10 mg BMOV-Mikrosphären jeweils am Tag 6 und am Tag 9 IP injiziert. Der Gruppe 6 wurden 10 mg BMOV-Mikrosphären am Tag 6 und am Tag 9 intramuskulär injiziert. Am Tag 16 wurden die Mäuse getötet und die Tumore wurden präpariert.
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in den Tabellen VI und VII unten gezeigt.
  • Tabelle VI Körpergewichte von Mäusen in Kontroll- und Therapiegruppen
    Figure 01150001
  • Tabelle VII Tumorgewichte in Kontroll- und Therapiegruppen
    Figure 01160001
  • Vergleichsbeispiel 28
  • Polymeres Arzneimittelabgabesystem mit gesteuerter Freisetzung: Vergleichsstudie der in vitro Arzneimittel-Freisetzungsprofile von organischen Vanadium-Komplexen aus Poly(ε-caprolacton) (PCL) Thermopasten und aus PCL-Methoxypolyethylenglycol (PCL-MePEG) Thermopasten
  • Diese Studie wurde durchgeführt, um die Verkapselung und die in vitro Freisetzungskinetiken der vier organischen Komplexformen des Vanadiums (BMOV, BEMOV, V5, PRC-V) in Poly(ε-caprolacton) (PCL) Thermopasten und/oder PCL-Methoxypolyethylenglycol (PCL-MePEG) Thermopasten zu erforschen.
  • A. Methode
  • Es wurden quantitative Analysen (UV/VIS spektrophotometische Analysen) mit verschiedenen Konzentrationen von Vanadium-Lösungen vorgenommen, um die Wellenlängen der Peak-Absorptionen und die Kalibrationsgleichungen zu erhalten. Die Löslichkeit des Vanadiums wurde in 10 mM Phosphat-gepufferter Salzlösung mit Albumin (PBS/ALB) (pH 7,4) untersucht. 1%, 5%, 10% und 20% (% Vanadium-Komplex in PCL) jeder organischen Komplexform des Vanadiums wurden in bisologisch abbaubares polymeres PCL und/oder in Mischungen von PCL mit MePEG (MW 350) verkapselt, um ein polymeres Produkt zur Arzneimittelfreisetzung, "Thermopaste" genannt, herzustellen. Untersuchungen zur Freisetzung der verschiedenen Formen des Vanadiums aus Thermopasten wurden in vitro bei 37°C in PBS/ALB vorgenommen, wobei die Freisetzung von Vanadium mit UV/VIS Absorptionsspektroskopie gemessen wurde.
  • B. Ergebnisse
  • Die Ergebnisse sind in den 64 bis 68 dargestellt. In Kürze trat die Peak-Absorption von BMOV, BEMOV und V5 bei 276 nm auf und die von PRC-V war bei 266 nm. Die Rate und das Ausmaß der Löslichkeit jeder Form des Vanadiums folgten der Reihenfolge von V5 > BMOV & BEMOV > PRC-V. In vitro Freisetzungsuntersuchungen zeigten, dass der Anteil des aus den Thermopasten freigesetzten Arzneimittels mit (1) steigender Löslichkeit des Arzneimittels, (2) steigender Konzentration des Arzneimittels und (3) steigender Menge des in die Thermopasten integrierten MePEG anstieg.
  • C. Schlussfolgerung
  • Eine kontrollierte Dosis von Vanadium kann aus PCL-Thermopasten freigesetzt werden, indem eine unterschiedliche Form des Vanadiums verwendet wird (als Arzneimittel), indem der Prozentsatz der Beladung des PCL mit der jeweiligen Form des Vanadiums geändert wird oder indem MePEG in das PCL eingelagert wird. Während eine Änderung des Prozentsatzes der Beladung mit einer bestimmten Form des Vanadiums die Freisetzungsrate kurzfristig steuern kann, kann die Abgabe einer kontrollierten Dosis die Implantation eines großen (und möglicherweise toxischen) Depots des Arzneimittels (in PCL) in das Tier bedingen. Daher können die Verwendung einer anderen Form des Vanadiums oder die Einlagerung von MePEG in das PCL eine alternative Methode zur Freisetzung einer kontrollierten Dosis von Vanadium bieten.
  • Vergleichsbeispiel 29
  • Verkapselung von Camptothecin in PCL-Thermopaste und Untersuchung auf antiangiogene Eigenschaften
  • A. Einlagerung von Camptothecin in PCL
  • Camptothecin wurde mit Stößel und Mörser gemahlen, um die Partikelgröße auf unter 5 Micron zu reduzieren. Es wurde dann als trockenes Pulver mit Polycaprolacton (Molekulargewicht 18.000 Birmingham Polymers, AL USA) gemischt. Die Mischung wurde für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und die geschmolzene Mischung Polymer-Wirkstoff wurde für 5 Minuten zu einer glatten Paste gerührt. Die geschmolzene Paste wurde dann in eine 1 ml Spritze gegeben und herausgedrückt, um Pellets von 3 mg zu bilden. Diese Pellets wurden dann auf die CAM aufgebracht, um ihre antiangiogenen Eigenschaften zu bewerten.
  • B. Ergebnisse
  • Mit Camptothecin beladene Thermopaste war bei der Hemmung der Angiogenese im Vergleich zu Kontroll-PCL-Pellets wirksam. Bei einer Beladung mit 5% Arzneimittel zeigten 4/5 der untersuchten CAM eine starke Hemmung der Angiogenese. Weiterhin zeigten bei einer Beladung von jeweils 1% und 0,25% 2/3 beziehungsweise ¾ der CAM eine Hemmung der Angiogenese. Es ist daher aus diesen Ergebnissen offenkundig, dass Camptothecin ausreichend aus der PCL-Thermopaste freigesetzt wurde und dass es eine therapeutische antiangiogene Wirkung hat.
  • Vergleichsbeispiel 30
  • Herstellung von mit S-Phosphonat beladender Thermopaste
  • In dieser Untersuchung zeigten wir, dass S-Phosphonat, ein Etherlipid mit antineoplastischer Aktivität, erfolgreich in PCL-Thermopaste integriert wurde und im CAM-Test Wirksamkeit zeigte.
  • A. Herstellung von mit S-Phosphonat beladender Paste
  • Polycaprolacton (Birmingham Polymers, Birmingham, AL) und S-Phosphonat wurden in geeigneten Verhältnissen bei 55°C für 2 Minuten verrieben. Die geschmolzene Mi schung wurde dann zu halbkugelförmigen Pellets von 3 mg pipettiert und man ließ sie bei 4°C aushärten.
  • B. CAM-Biotest
  • Befruchtete Hühnerembryonen (Fitzsimmons Consulting & Research Services Ltd., B. C.) wurden für 4 Tage inkubiert und dann gefenstert. In Kürze wurde ein kleines Loch (etwa 2 cm im Durchmesser messend) gebildet, indem die Schale und die innere Schalenmembran vom stumpfen Ende des Eis (Stelle des Luftraums) entfernt wurden und dann wurde die offene Stelle mit sterilisiertem Parafilm-Wachs verschlossen. Das Ei wurde dann bei 37°C für weitere 2 Tage mit dem Fenster aufrecht in einen Inkubator gelegt. Am Tag 6 der Inkubation wurden 3-mg-Pellets von mit S-Phosphonat beladenem Polymer oder Kontrollpolymer (kein Arzneimittel) auf der Oberfläche der wachsenden CAM-Gefäße aufgebracht. Nach 2 Tagen Einwirkzeit (Tag 8 der Inkubation) wurde das Gefäßsystem unter Verwendung eines Stereomikroskops, das mit einem Contax Kamerasystem ausgerüstet war, untersucht. Um den Kontrast der Gefäße zu erhöhen und jegliche Hintergrundinformation auszublenden, wurde der CAM vor den Aufnahmen 1 ml Intralipid-Lösung (Abbott Laboratories) injiziert.
  • C. Ergebnisse
  • PCL-Pellets, die mit 0%, 1%, 2%, 4% und 8% S-Phosphonat beladen waren, verursachten eine dosisabhängige antiangiogene Reaktion in der CAM. Die antiangiogene Reaktion wird durch die Abwesenheit von Blutgefäßen in der Region direkt unter dem mit S-Phosphonat beladenen Pellet charakterisiert. Das normale Wachstum eines dichten Kapillarnetzes, das bei Kontroll-CAM beobachtet wird, wurde bei den mit S-Phosphonat behandelten CAM offensichtlich gehemmt. Bei höheren Konzentrationen (4% und 8%) wurden die behandelten CAM in der Nachbarschaft des Arzneimittel-Polymer-Pellets strukturell verändert. Diese Veränderung beinhaltete eine deutliche Verdickung der unmittelbar an das S-Phosphonat-Polymer-Pellet angrenzenden CAM und eine Verdünnung der Membran unter dem Pellet. In allen CAM, die mit S-Phosphonat behandelt worden waren, war nach einer Einwirkzeit von zwei Tagen eine gefäßfreie Zone sichtbar; dies war als ein Bereich frei von einem Kapillarnetz mit einer Fläche von etwa 3 mm2 definiert.
  • Vergleichsbeispiel 31
  • Verkapselung von Tyrosinkinase-Hemmern in PCL-Thermopaste und Untersuchung unter Verwendung des CAM-Tests
  • Tyrosinkinase-Hemmer wurden mit Stößel und Mörser gemahlen, um die Partikelgröße auf unter 5 Micron zu reduzieren. Sie wurden dann als trockenes Pulver mit Polycaprolacton (Molekulargewicht 18.000 Birmingham Polymers, AL USA) gemischt. Die Mischung wird für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und die geschmolzene Mischung Polymer-Wirkstoff wird für 5 Minuten zu einer glatten Paste gerührt. Die geschmolzene Paste wird dann in eine 1 ml Spritze gegeben und herausgedrückt, um Pellets von 3 mg zu bilden. Diese Pellets wurden dann im CAM-Test untersucht. Die Tyrosinkinase-Hemmer, die im CAM-Test untersucht wurden, beinhalten Lavendustin C, Erbstatin, Herbimycin und Genistein. Beim Vergleich der Wirkungen der antiangiogenen Hemmung dieser Wirkstoffe war Herbimycin (2% in PCL) der am stärksten wirksame, welcher eine gefäßfreie Zone bei 4/4 der untersuchten CAM herbeiführte.
  • Vergleichsbeispiel 32
  • Verkapselung von Vinca-Alkaloiden in PCL-Thermopaste und
  • Untersuchung unter Verwendung des CAM-Tests
  • A. Integration der Hemmstoffe in PCL-Thermopaste
  • Vinca-Alkaloide (Vinblastin und Vincristin) und wurden mit Stößel und Mörser gemahlen, um die Partikelgröße auf unter 5 Micron zu reduzieren. Sie wurden dann als trockenes Pulver mit Polycaprolacton (Molekulargewicht 18.000 Birmingham Polymers, AL USA) gemischt. Die Mischung wird für 5 Minuten auf 65°C erhitzt und die geschmolzene Mischung Polymer-Wirkstoff wird für 5 Minuten zu einer glatten Paste gerührt. Die geschmolzene Paste wird dann in eine 1 ml Spritze gegeben und herausgedrückt, um Pellets von 3 mg zu bilden. Diese Pellets wurden dann im CAM-Test untersucht.
  • B. Ergebnisse
  • Als die Formulierungen auf der CAM untersucht wurden, war es klar, dass die Wirkstoffe in ausreichenden Mengen aus dem PCL-Pellet freigesetzt werden, um eine biologische Wirkung hervorzurufen. Sowohl Vinblastin als auch Vincristin führten im Vergleich zu Kontrollpellets aus PCL-Thermopaste antiangiogene Wirkungen im CAM-Test herbei.
  • Bei Konzentrationen einer Beladung mit 0,5% und 0,1% Arzneimittel rief Vincristin eine Hemmung der Angiogenese auf allen untersuchten CAM hervor. Wenn Konzentrationen, die 2% überschritten, getestet wurden, wurden toxische Arzneimittelspiegel erreicht und es kam zum unerwarteten Tod der Embryonen.
  • Auch Vinblastin war bei der Hemmung der Angiogenese auf der CAM bei Konzentrationen von 0,25%, 0,5% und 1% wirksam. Jedoch war auch Vinblastin bei Konzentrationen, die 2% überschritten, für den Embryo toxisch.
  • Beispiel 33
  • Bioadhäsive Mikrosphären
  • A. Herstellung von bioadhäsiven Mikrosphären
  • Es wurden aus 100 k g/mol PLLA Mikrosphären mit einem Bereich des Partikeldurchmessers von 10–60 μm hergestellt. Die Mikrosphären wurden in Natriumhydroxid-Lösung inkubiert, um auf der Oberfläche des Polyesters durch Hydrolyse Karbonsäuregruppen zu produzieren. Die Reaktion wurde hinsichtlich der Natriumhydroxid-Konzentration und der Inkubationszeit durch Messung der Oberflächenladung charakterisiert. Die Reaktion war nach 45 Minuten Inkubation in 0,1 M Natriumhydroxid abgeschlossen. Nach der Basenbehandlung wurden die Mikrosphären mit Dimethylaminopropylcarbodiimid (DEC), einem quervernetzenden Wirkstoff, beschichtet, indem die Mikrosphären in einer alkoholischen Lösung von DEC suspendiert wurden und man die Mischung zu einen streubaren Pulver trocknen ließ. Das Gewichtsverhältnis von Mikrosphären zu DEC war 9:1. Nachdem die Mikrosphären getrocknet waren, wurden sie unter Rühren in eine 2% (Gew./Vol.) Lösung von Poly(acrylsäure) dispergiert und man ließ das DEC mit PAA reagieren, um ein wasserunlösliches Netz von quervernetzter PAA auf den Oberflächen der Mikrosphären zu erzeugen. Es wurde Rasterelektronenmikroskopie eingesetzt, um das Vorhandensein von PAA auf den Oberflächen der Mikrosphären zu bestätigen.
  • Dynamische Differenzkalorimetrie der Mikrosphären vor und nach der Behandlung mit Base zeigte, dass keine Änderungen im Großteil der thermischen Eigenschaften (TG, Schmelzen und Grad der Kristallinität) mit Rasterelektronenmikroskopie beobachtet wurden
  • B. In vitro Freisetzungsraten von Paclitaxel
  • Es wurden mit Paclitaxel beladene Mikrosphären (Beladungen 10% und 30% Gew./Gew.) mit demselben Größenbereich des Partikeldurchmessers hergestellt und in vitro Freisetzungsprofile für eine Freisetzung von 10 Tagen in Phosphat-gepufterte Salzlösung bestimmt. Die Freisetzung war proportional zur Beladung mit Arzneimittel, wobei 400 μg Paclitaxel aus 5 mg der mit 30% beladenen Mikrosphären in 10 Tagen freigesetzt wurden und 150 μg aus mit 10% beladenen Mikrosphären in derselben Periode freigesetzt wurden. Die Effizienz der Verkapselung betrug etwa 80%. Die mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären wurden für 45 Minuten in 0,1 M Natriumhydroxid inkubiert und das Zeta-Potenzial wurde vor und nach der Inkubation in Natriumhydroxid gemessen. Sowohl vor als auch nach der Behandlung mit Base war die Oberflächenladung von mit Paclitaxel beladenen Mikrosphären niedriger als die von Mikrosphären ohne Paclitaxel.
  • C. Herstellung und in vitro Beurteilung von entweder mit Poly-lysin oder mit Fibronectin beschichteter PLLA
  • Es wurden PLLA-Mikrosphären hergestellt, die 1% Sudanschwarz (um die Mikrosphären anzufärben) enthielten. Diese Sphären wurden in einer 2% (Gew./Volumen) Lösung von entweder Poly-lysin (Sigma chemicals – Hydrobromell Form) oder Fibronectin (Sigma) für 10 Minuten suspendiert. Die Mikrosphären wurden einmal in Puffer gewaschen und auf die inneren Oberflächen von frisch präparierten Blasen von Ratten aufgebracht. Die Blase wurde für 10 Minuten belassen und dann dreimal in Puffer gewaschen. Es waren nach dem Vorgang verbleibende (gebundene) Mikrosphären an der Blasenwand vorhanden, was daher zeigt, dass sowohl bei mit Fibronectin als auch bei mit Poly-I-lysin beschichteten Mikrosphären eine Bioadhäsion aufgetreten war (69A und 69B).
  • Beispiel 34
  • Synthese von Poly(N-isopropylacrylamid)
  • Polyacrylamid und seine Derivate können leicht durch die Polymerisation freier Radikale und strahlungsinduzierte Polymerisation synthetisiert werden. Das Folgende ist ein Beispiel des Synthetisierens von Poly(N-isopropylacrylamid), wobei das Monomer N-Isopropylacrylamid durch Rekristallisation aus einem organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel Hexan und Toluol gereinigt wird.
  • In Kürze wird N-Isopropylacrylamid bei einer Temperatur von zum Beispiel 60°C in Toluol gelöst. Diese Lösung wird auf eine niedrigere Temperatur (z.B. 4°C) heruntergekühlt, um die Rekristallisation des Monomers zu ermöglichen. Das Monomer wird dann durch Filtration gesammelt und unter Vakuum getrocknet. Zur Synthese wird das gereinigte Monomer (20 g) in destilliertem Wasser (180 ml) in einem Kolben mit rundem Boden gelöst. Die Lösung wird für 30 Minuten mit Stickstoff gereinigt, um gelösten Sauerstoff zu verdrängen. Die Temperatur wird dann auf 65°C erhöht und eine kleine Menge (0,1 g) eines Starters wie zum Beispiel Ammoniumpersulfat und 2,2'-Azobisisobutyronitril wird zugegeben, um die Polymerisation einzuleiten. Die Polymerisation wird innerhalb von 10 Stunden abgeschlossen und findet unter Stickstoffschutz und Rühren statt. Schließlich wird Poly(N-isopropylacrylamid) durch Zugabe von Ethanol gefällt. Das Polymer wird getrocknet und aufbewahrt.
  • Beispiel 35
  • Synthese von Poly(acrylsäure)-Derivaten
  • Poly(acrylsäure) und ihre Derivate können durch die Polymerisation freier Radikale und strahlungsinduzierte Polymerisation synthetisiert werden. Das Folgende ist ein Beispiel des Synthetisierens von Poly(acrylsäure), wobei das Monomer Acrylsäure durch Destillation (z.B. 40°C) unter erniedrigtem Druck (z.B. 10 mmHg) gereinigt wird.
  • In Kürze wird das gereinigte Monomer (20 g) in Dioxan (180 ml) in einem Kolben mit rundem Boden gelöst. Die Lösung wird für 30 Minuten mit Stickstoff gereinigt, um gelösten Sauerstoff zu verdrängen. Die Temperatur wird dann auf 65°C erhöht und eine kleine Menge (0,1 g) des Starters 2,2'-Azobis-isobutyronitril wird zugegeben, um die Polymerisation einzuleiten Die Polymerisation wird innerhalb von 24 Stunden abgeschlossen und findet unter Stickstoffschutz und Rühren statt. Schließlich wird Poly(acrylsäure) durch Zugabe von n-Hexan gefällt. Das Polymer wird getrocknet und aufbewahrt.
  • Beispiel 36
  • Perivasculäre Verabreichung von Paclitaxel
  • WISTAR-Ratten, die 250–300 g wiegen, werden durch intramuskuläre Injektion von Innovar (0,33 ml/kg) betäubt. Nachdem sie einmal sediert sind, werden sie unter eine Halothan-Narkose gesetzt. Nachdem die Vollnarkose eingeleitet ist, wird das Fell über der Halsregion abrasiert, die Haut gespannt und mit Betadin betupft. Über der linken Arteria carotis wird ein vertikaler Schnitt gesetzt und die Arteria carotis externa wird dargestellt. Um die Arteria carotis externa werden zwei Ligaturen gelegt und es wird eine quere Arteriotomie angelegt. Ein Nummer 2 FRENCH FOGART Ballonkatheter wird dann in die Arteria carotis eingeführt und in die linke Arteria carotis communis vorgeschoben und der Ballon wird mit Salzlösung aufgepumpt. Der Katheter wird dreimal durch die Arteria carotis hin- und hergeschoben. Der Katheter wird dann entfernt und die Ligatur wird auf der linken Arteria carotis externa verknotet.
  • Es wird dann in zehn Ratten Paclitaxel (33%) in Ethylenvinylacetat (EVA) ringförmig um die Arteria carotis communis injiziert. In zehn weitere Ratten wird nur EVA um die Arteria carotis communis injiziert. Fünf Ratten aus jeder Gruppe werden nach 14 Tagen und die letzten fünf nach 28 Tagen getötet. Die Ratten werden auf Gewichtsverlust oder andere Anzeichen einer systemischen Erkrankung hin beobachtet. Nach 14 oder 28 Tagen werden die Tiere betäubt und die linke Arteria carotis wird in der Weise des anfänglichen Experiments freigelegt. Die Arteria carotis wird abgetrennt, in 10% gepufferten Formaldehyd fixiert und histologisch untersucht.
  • Beispiel 37
  • Behandlung von Atherosklerose
  • A. Atherosklerose
  • Atherosklerotische Läsionen werden bei weißen Neuseeland-Kaninchen nur durch die Emährungsweise geschaffen. In Kürze werden weiße Neuseeland-Kaninchen mit einem Gewicht von etwa 1,6 kg auf gepulvertes und mit 0,25% Cholesterin nach Gewicht ange reichertes Futter gesetzt. Das Gesamtcholesterin im Plasma wird wöchentlich gemessen, indem nach einer Injektion von Innovar (0,1 ml/kg), um die Blutgefäße zu erweitern, Proben aus einer marginalen Ohrvene entnommen werden. Die Proben werden mit EDTA gemischt, um eine Konzentration von 15% in der Probe zu erreichen und bis zur Plasmaseparation durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit auf Eis gelegt.
  • Eine Woche nach Beginn der vollen Cholesterin-Ernährung werden die Tiere in 3 Gruppen von 10 randomisiert. Nach Narkoseeinleitung mit Ketamin 35 mg/kg und Xylazin 7 mg/kg und dann Allgemeinnarkose über Intubation wird über dem Abdomen das Fell abrasiert und die Haut sterilisiert. Es wird eine Laparotomie vorgenommen und die Aorta abdominalis isoliert. Unter Verwendung einer 22 g Nadel werden Ethylenvinylacetat-Paste, Ethylenvinylacetat-Paste, die 5% Paclitaxel enthält, oder Ethylenvinylacetat-Paste, die 33% Paclitaxel enthält, ringförmig um die proximale Hälfte der infrarenalen Aorta abdominalis aufgetragen. Die sich bis zur Bifurkation der Aorta erstreckende distale Hälfte der Aorta wird nicht behandelt. Bei 10 Kontroll-Kaninchen wird die infrarenale Aorta abdominalis isoliert, aber es wird nichts um sie herum injiziert.
  • Das atherogene Futter wird für 24 Wochen weiter gegeben. Zu diesem Zeitpunkt werden die Tiere mit einer Injektion von Ketamin (350 mg/kg) und Xylazin (7 mg/kg) intramuskulär narkotisiert und dann mit einer intravenösen Überdosis von Euthanol (240 mg/ml, 2 ml/4,5 kg) getötet. Die Tiere werden dann über den linken Ventrikel bei 100 mm Quecksilber perfusionsfixiert, indem man sie mit Hank's balancierter Salzlösung mit 0,15 mmol/Liter N-2-hydroxyethylpaparazin-N'-2-ethansulfonsäure (pH 7,4), die Heparin (1 IU/ml) enthält, für zehn Minuten perfundiert, gefolgt von verdünnter Fixierlösung nach Karnovsky für 15 Minuten. Die Aorta thoracica, die Aorta abdominalis und die Arteriae iliacae werden en bloc entfernt und für weitere 30 Minuten in eine ähnliche Lösung gelegt.
  • Es werden dann fortlaufende Dünnschnitte durch die Aorta thoracica und besonders durch die infrarenale Aorta abdominalis durchgeführt. Movat-, H&E- und Masson-Färbungen werden durchgeführt und histologische Untersuchungen vorgenommen, um den Grad der Beeinträchtigung des Lumens, den Entwicklungsgrad der atheroskleroti schen Läsion und jegliche periluminare Reaktion auf die zirkumferenzielle arterielle Medikation zu untersuchen.
  • Beispiel 38
  • Behandlung von Restenose
  • WISTAR-Ratten, die 250–300 g wiegen, werden durch intramuskuläre Injektion von Innovar (0,33 ml/kg) betäubt. Nachdem sie einmal sediert sind, werden sie unter eine Halothan-Narkose gesetzt. Nachdem die Vollnarkose eingeleitet ist, wird das Fell über der Halsregion abrasiert und die Haut mit Betadin gereinigt. Über der linken Arteria carotis wird ein vertikaler Schnitt gesetzt und die Arteria carotis externa wird dargestellt. Um die Arteria carotis externa werden zwei Ligaturen gelegt und es wird eine quere Arteriotomie zwischen ihnen angelegt. Ein 2 Fr Fogarty Ballonkatheter wird in die Arteria carotis externa eingeführt und in die linke Arteria carotis communis vorgeschoben und der Ballon wird mit Salzlösung aufgepumpt. Der Katheter wird dreimal durch die Arteria carotis hin- und hergeschoben, um das Endothel zu denudieren. Der Katheter wird entfernt und die Ligaturen werden auf der linken Arteria carotis externa verknotet.
  • Die Tiere werden in Gruppen von 5 randomisiert. Die Subgruppen von 5 Ratten sind Kontrolle, Träger-Polymer allein, Träger-Polymer plus 1, 5, 10, 20 und 33% von Paclitaxel, das abgegeben wird. Es sind zwei Träger-Polymere zu untersuchen: EVA und eine Mischung aus EVA und PLA. Die Polymer-Mischung wird ringförmig um die Arteria carotis aufgetragen. Die Wunde wird dann verschlossen. In jeder Gruppe werden nach 14 und nach 28 Tagen Ratten getötet. In der Zwischenzeit werden die Ratten werden auf Gewichtsverlust oder andere systemische Anzeichen hin beobachtet. Nach 14 oder 28 Tagen werden die Tiere durch initiale Sedierung mit Innovar intramuskulär (0,33 ml/kg) getötet. Die Arterien werden dann histologisch untersucht.
  • Beispiel 39
  • Intimahyperplasie, die Transplantat-Stenosen verursacht
  • A. Tierversuche
  • Es wird beim Hausschwein eine Allgemeinnarkose eingeleitet. Die Halsregion wird rasiert und mit Reinigungslösung sterilisiert. Auf jeder Seite des Halses werden vertikale Schnitte gesetzt und die Arteria carotis wird dargestellt. Es wird ein 8 mm PTFE-Transplantat durch 2 End-zu-Seit-Anastomosen implantiert, bilateral mit der proximalen Anastomose an der Arteria carotis communis und der distalen Anastomose an der Arteria carotis interna. Die dazwischen liegende überbrückte Arterie wird ligiert. Die Tiere werden in Gruppen von 10 Schweinen, die nur auf der linken Seite in Nähe einer jeden chirurgisch geschaffenen Anastomose Träger-Polymer allein erhalten, von 10 Schweinen, die Träger-Polymer plus 5% Paclitaxel erhalten und von 10 Schweinen, die Träger-Polymer plus 33% Paclitaxel erhalten, randomisiert. Die rechtsseitigen Transplantate werden in jedem Tier als Kontrolle dienen. Die Wunden werden verschlossen und man lässt die Tiere sich erholen.
  • Es wird eine zweite Gruppe von Schweinen untersucht. Die Transplantate werden in ähnlicher Weise angelegt. Zum Zeitpunkt der Operation wird kein vasoaktiver Wirkstoff in der Nähe der Anastomosenstellen aufgebracht. Man lässt die Tiere sich erholen. Zwei Wochen, nachdem die Transplantation durchgeführt wurde, wird eine zweite Allgemeinnarkose eingeleitet und die linke Arteria carotis wird erneut exploriert. Nahe an den proximalen und distalen Anastomosen erhalten 10 Tiere jeweils Träger allein, Träger-Polymer plus 5% Paclitaxel und Träger-Polymer plus 33% Paclitaxel ringförmig in der Nähe sowohl der proximalen als auch der distalen Anastomosen. Die Wunden werden verschlossen und man lässt die Tiere sich erholen. Gegenüber dient das rechtsseitige Transplantat als Kontrolle.
  • Nach 3 Monaten erhalten alle Tiere eine Allgemeinnarkose. Es wird ein Schnitt auf der Femoralarterie angelegt und ein Pigtail-Katheter wird unter fluoroskopischer Führung in die Aorta ascendens eingelegt. Es wird eine Injektion in den Bogen mit Darstellung des Gefäßsystems der Carotiden vorgenommen. Besonders wird der Grad der Stenosen der proximalen und distalen Transplantate und der Arterie unmittelbar distal der distalen Anastomose gemessen und der Prozentsatz der Stenose wird berechnet. Falls nötig, werden selektive Injektionen in die Arteriae carotis communes vorgenommen.
  • In jeder Gruppe werden fünf Schweine getötet. Die Tiere werden dann über den linken Ventrikel bei 100 mm Quecksilber perfusionsfixiert, indem man sie mit Hank's balancier ter Salzlösung mit 0,15 mmol/Liter N-2-hydroxyethylpaparazin-N'-2-ethansulfonsäure (pH 7,4), die Heparin (1 IU/ml) enthält, für zehn Minuten perfundiert, gefolgt von verdünnter Fixierlösung nach Karnovsky für 15 Minuten. Die Aorta thoracica, die Aorta abdominalis und die Arteriae carotis werden en bloc entfernt und für weitere 30 Minuten in eine ähnliche Lösung gelegt.
  • Es werden histologische Schnitte durch die Arteria carotis unmittelbar proximal der proximalen Anastomose, an der proximalen Anastomose, an der distalen Anastomose und durch die Arteria carotis unmittelbar distal der distalen Anastomose angefertigt. Die Schnitte werden mit Movat- und H&E- und Masson-Farbstoffen gefärbt. Es werden histologische Untersuchungen der Reaktionen der Intima und der Adventitia wie auch der perivaskulären Reaktion vermerkt. Es wird eine morphometrische Analyse mit dem Grad der Lumeneinengung berechnet.
  • Die verbleibenden Schweine werden nach 6 Monaten untersucht und eine ähnliche Tötungsprozedur zur Angiographie wird durchgeführt.

Claims (20)

  1. Verwendung von Paclitaxel oder einem Analogon oder einem Derivat davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten von Hohlorganen oder von Krankheiten, die mit Verschluss oder Verengung von Hohlorganen verbunden sind, wobei das Medikament an einen äußeren Teil des besagten Hohlorgans abgegeben werden soll.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagtes Medikament weiterhin ein Polymer umfasst.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Medikament biologisch abbaubar ist.
  4. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Polymer Polyethylenvinylacetat ist (40% quervernetzt).
  5. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Polymer ein Copolymer aus Milchsäure und Glycolsäure ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Polymer Polycaprolacton ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Polymer Polymilchsäure ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Polymer ein Copolymer aus Polymilchsäure und Polycaprolacton ist.
  9. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Polymer ein Polyester ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Polymer ein Polyanhydrid ist.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei besagtes Medikament in Form einer Faser vorliegt.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei besagtes Medikament in Form eines Sprays vorliegt.
  13. Verwendung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei besagtes Medikament in Form eines Films vorliegt.
  14. Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagtes Hohlorgan ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arterien, der Speiseröhre, dem Magen, dem Zwölffingerdarm, dem Dünndarm, dem Dickdarm, Gallengängen, dem Harnleiter, der Harnblase, der Harnröhre, Tränengängen, der Luftröhre, Bronchien, nasalen Luftwegen, Eustachischen Röhren, dem äußeren Gehörgang und Eileitern.
  15. Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagtes Hohlorgan eine Arterie ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagtes Hohlorgan eine Vene ist.
  17. Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagtes Hohlorgan eine Stelle einer Transplantatanastomose ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagtes Medikament durch direkte Injektion durch die äußere Arterienwand in die Adventitia an die Arterie abgegeben wird.
  19. Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagte Erkrankung eine Reaktion auf eine endoluminale Vorrichtung ist.
  20. Verwendung nach einem der vorigen Ansprüche, wobei besagte Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gefäßkrankheiten, Magen-Darm-Erkrankungen, Krankheiten des Urogenitaltrakts und Lungenkrankheiten.
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