DE69733605T2 - In vivo gentransfermethoden zur wundheilung - Google Patents

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Description

  • 1. EINFÜHRUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine biokompatible Matrix umfasst, die DNA-Moleküle zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Regulation der Angiogenese, besonders zur Förderung der Blutgefäßbildung oder zur Hemmung der Blutgefäßbildung enthält. Es basiert auf der Präsentation und der direkten Übertragung von DNA, die für ein entsprechendes therapeutisches Agens kodiert, in Säugetierreparaturzellen. Reparaturzellen, die normalerweise lebendem Gewebe, das eine Wunde umgibt, entstammen, proliferieren und migrieren in die genaktivierte Matrix, wo sie zusammentreffen, DNA aufnehmen und exprimieren. Transfizierte Reparaturzellen agieren daher als in situ-Bioreaktoren (lokalisiert innerhalb der Wundstelle), die Agenzien herstellen (DNA, die für RNA's, Proteine, etc. kodiert), die die gewünschte therapeutische Wirkung haben.
  • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 2.1 WUNDHEILUNG
  • Derzeit verfügbare Wundheilungstherapien schließen das Verabreichen von therapeutischen Proteinen ein. Solche therapeutischen Proteine können regulatorische Faktoren, die beim normalen Heilungsprozess eingeschlossen sind, wie zum Beispiel systemische Hormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren und andere Proteine, welche die Proliferation und Differenzierung der Zellen regulieren, einschließen. Wachstumsfaktoren, Cytokine und Hormone von denen berichtet wurde, dass sie solche Kapazitäten zur Wundheilung aufweisen, schließen zum Beispiel die transformierende Wachstumsfaktor-β-Superfamilie (TGF-β) von Proteinen (Cox, D. A., 1995, Cell Biology International, 19: 357–371), den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) (Slavin, J., 1995, Cell Biology International, 19: 431–444), den Makrophagen koloniestimulierender Faktor (Macrophage-Colony Stimulating Factor, M-CSF) und calciumregulierende Agenzien, wie zum Beispiel das Parathyroidhormon (PTH), ein.
  • Eine Vielzahl von Problemen ist mit der Verwendung von therapeutischen Proteinen, d.h. Cytokinen, bei Therapien zur Wundheilung verbunden. Als erstes ist die Reinigung und/oder rekombinante Herstellung von therapeutischen Proteinen häufig ein teures und zeitraubendes Verfahren. Trotz der größten Mühen sind gereinigte Proteinzubereitungen jedoch häufig instabil, was die Lagerung und Verwendung mühsam macht, und die Proteininstabilität kann zu unerwarteten Entzündungsreaktionen (Blutproteinabbauprodukten) führen, die für den Wirt toxisch sind.
  • Als Zweites kann die systemische Abgabe von therapeutischen Proteinen, d.h. Cytokinen, mit ernsten, unerwünschten Nebenwirkungen im nicht verwundeten Gewebe verbunden sein. Infolge der ineffizienten Abgabe an spezifische Zellen und Gewebe im Körper ist die Verabreichung von hohen Dosen an Protein erforderlich, um sicherzustellen, dass ausreichende Mengen des Proteins das dazugehörige Zielgewebe erreichen. Aufgrund der kurzen Halbwertszeit im Körper infolge des proteolytischen Abbaus, müssen die Proteine auch wiederholt verabreicht werden, was zu einer Immunreaktion gegen die therapeutischen Proteine führen kann. Die Zirkulation hoher Dosen an therapeutischen Proteinen ist infolge von pleiotropen Wirkungen des verabreichten Proteins häufig toxisch und kann zu ernsten Nebenwirkungen führen.
  • Als Drittes ist die exogene Abgabe von rekombinanten Proteinen ineffizient. Es sind Versuche angestellt worden, durch Immobilisation von therapeutischem Protein an der Zielstelle, das Verabreichen von großen Proteinmengen zu begrenzen. Dieser therapeutische Versuch kompliziert jedoch die Widerverabreichung des Proteins für ein wiederholtes Zumessen.
  • Als Viertes hängt für verschiedene Proteine, wie zum Beispiel Membranrezeptoren, Transkriptionsfaktoren und intrazelluläre Bindungsproteine, die biologische Aktivität von der richtigen Expression und Lokalisation in der Zelle ab. Bei vielen Proteinen findet die richtige zelluläre Lokalisation statt, wenn das Protein innerhalb der Zelle posttranslational modifiziert wird. Daher können solche Proteine exogen nicht auf solche Weise verabreicht werden, wie sie innerhalb der Zelle aufgenommen und ordnungsgemäß lokalisiert werden.
  • Wie diese Probleme bestätigen, leiden die gegenwärtigen Therapien mit rekombinanten Proteinen zur Wundheilung an Mängeln, da sie kein rationales Verfahren zur Abgabe von exogenen Proteinen darstellen. Diese Proteine, d.h. Cytokine, werden normalerweise an ihrer Wirkstelle in physiologischen Mengen hergestellt und wirksam an Signalrezeptoren an der Zelloberfläche abgegeben.
  • 2.2. GENTHERAPIE
  • Die Gentherapie wurde ursprünglich als eine spezifische Genaustauschtherapie zur Korrektur von erblichen Defekten erdacht, um funktionelle, aktive, therapeutische Gene in Zielzellen abzugeben. Anfängliche Bestrebungen in Richtung somatischer Gentherapie waren auf indirekte Mittel zum Einführen von Genen in Gewebe angewiesen, ex vivo Gentherapie genannt, z.B. werden Zielzellen aus dem Körper entfernt, mit Vektoren, die rekombinante Gene tragen, transfiziert oder infiziert und in den Körper reimplantiert („autologe Zellübertragung"). Verschiedene Transfektionstechniken sind gegenwärtig verfügbar und werden zur Übertragung von DNA in vitro in Zellen verwendet; einschließlich der Calciumphosphat-DNA-Präzipitation, der DEAE-Dextrantransfektion, der Elektroporation, der Liposomen vermittelten DNA-Übertragung oder der Transduktion mit rekombinanten viralen Vektoren. Solche ex vivo Behandlungsprotokolle sind vorgeschlagen worden, um DNA in verschiedene unterschiedliche Zelltypen, die Epithelzellen (US-Patent 4,868,116; Morgan und Mulligan WO87/00201; Morgan et al., 1987, Science 237: 1476–1479; Morgan und Mulligan; US-Patent Nr. 4,980,286), Endothelzellen (WO89/05345), Hepatocyten (WO89/07136; Wolff et al., 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3344–3348; Ledley et al., 1987 Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5335–5339; Wilson und Mulligan, WO89/07136; Wilson et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 8437–8441), Fibroblasten (Palmer et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1055–1059; Anson et al., 1987, Mol. Biol. Med. 4: 11–20; Rosenberg et al., 1988, Science 242: 1575–1578; Naughton & Naughton, U.S. Patent 4,963,489), Lymphozyten (Anderson et al., U.S. Patent Nr. 5,399,346; Blaese, R. M. et al., 1995, Science 270: 475–480) und hämopoetische Stammzellen (Lim, B. et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8892–8896; Anderson et al., U.S. Patent Nr. 5,399,346) einschließen, zu übertragen.
  • Die direkte in vivo Genübertragung ist vor kurzem mit Formulierungen von DNA, die in Liposomen (Ledley et al., 1987, J. Pediatrics 110: 1) oder in Proteoliposomen, die virale Hüllrezeptorproteine enthalten (Nicolau et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1068), eingeschlossen sind, und DNA, die mit einem Polylysin-Glycoprotein-Trägerkomplex verbunden ist, versucht worden. Zusätzlich hat man „Genkanonen" für die Genabgabe in Zellen verwendet (Australisches Patent Nr. 9068389). Es wurde sogar spekuliert, dass nackte DNA oder DNA, die mit Liposomen verbunden ist, in flüssigen Trägerlösungen für die Injektion in den interstitiellen Raum zur Übertragung von DNA in Zellen (Felgner, WO90/11092) formuliert werden kann.
  • Vielleicht eines der größten Probleme, das mit den gegenwärtig ersonnenen Gentherapien ob ex vivo oder in vivo verbunden ist, ist die Unfähigkeit, DNA wirksam in eine Zielzellpopulation zu übertragen und ein hohes Expressionsniveau des Genproduktes in vivo zu erreichen. Virale Vektoren werden als das wirksamste System erachtet, und rekombinante, replikationsgestörte virale Vektoren sind verwendet worden, um Zellen sowohl ex vivo als auch in vivo zu transduzieren (d.h., infizieren). Solche Vektoren beinhalteten retrovirale-, adenovirale-, und adenoassoziierte- und Herpesvirus Vektoren. Während sie bei der Genübertragung sehr wirksam sind, schließen die Hauptnachteile, die mit der Verwendung von viralen Vektoren verbunden sind, die Unfähigkeit vieler viraler Vektoren, nicht teilende Zellen zu infizieren, Probleme, die mit der Insertionsmutagenese zusammenhängen, Entzündungsreaktionen gegenüber Viren und die Herstellung von möglichen Helferviren und/oder die Produktion und Übertragung von gesundheitsgefährdenden Viren auf andere menschliche Patienten, ein.
  • Zusätzlich zur geringen Wirksamkeit der meisten Zelltypen, fremde DNA aufzunehmen und zu exprimieren, sind viele Zielzellpopulationen in solch geringer Anzahl im Körper zu finden, dass die Wirksamkeit der Präsentation der DNA gegenüber den spezifischen Zielzelltypen sogar noch weiter abnimmt. Zurzeit existiert kein Protokoll oder Verfahren, um die Wirksamkeit zu erhöhen, mit der DNA zur Zielzellpopulation gesteuert wird.
  • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine biokompatible Matrix umfasst, die DNA-Moleküle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Regulation der Angiogenese, besonders zur Förderung der Blutgefäßbildung oder zur Hemmung der Blutgefäßbildung in Übereinstimmung mit den Ansprüchen 1, 2 und 3 enthält. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 4 bis 9 offenbart und beansprucht.
  • Die Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, dass Reparaturzellen, die im Wundheilungsprozess aktiv sind, aus dem umliegenden Gewebe in den Bereich der Wunde proliferieren und migrieren und die genaktivierte Matrix infiltrieren. Die Matrix fungiert als ein Gerüst, die das Zelleinwachsen und dies wiederum den Gentransfer durch die lokale Ansammlung von Reparaturzellen nahe der DNA fördert. Während sie in der Matrix sind, sind Reparaturzellen überraschend wirksam bei der Aufnahme der DNA und bei deren Expression als Translationsprodukte, d.h. Proteine, oder Transkriptionsprodukte, d.h. Antisense und Ribozyme. Die transfizierten Reparaturzellen dienen dann als lokale Bioreaktoren, welche die Produktion des Genprodukts in vivo vervielfachen.
  • Während irgendeine Anzahl von DNA-Sequenzen im Verfahren verwendet werden kann, sind bevorzugte DNA-Sequenzen solche, die für Translationsprodukte (d.h. Proteine) oder Transkriptionsprodukte (d.h. Antisense oder Ribozyme) kodieren, die (a) die Gewebereparatur fördern; oder (b) einen Erkrankungsprozess stören können (wodurch die normale Gewebsheilung stattfinden kann).
  • Die Erfindung überwindet die Mängel der Verfahren, die derzeit zur Wundheilung verwendet werden, einschließlich der Verabreichung der therapeutischen Proteine. Als erstes kann DNA, die sowohl stabil als auch nicht toxisch ist, sicher in hohen Dosen in vivo verabreicht werden. Als zweites ist die wiederholte Verabreichung, obwohl möglich, nicht erforderlich. Die Zellen, welche die DNA aufnehmen und exprimieren, ermöglichen eine Versorgung mit dem Genprodukt an der Wundstelle. Als drittes kann die Erfindung auf eine Weise praktiziert werden, die die zeitlichen Anforderungen der Dosierung berücksichtigt. Zum Beispiel kann die DNA in Vektoren präsentiert werden, die in das Genom der Zielzelle integrieren. In diesem Fall werden alle Tochterzellen die übertragene DNA enthalten und exprimieren, wodurch sie als fortwährende Quelle für das therapeutische Agens fungieren. Im Gegensatz dazu können nicht integrierende Systeme verwendet werden, wobei die DNA sich nicht in das Genom integriert und das Gen nicht an die Tochterzellen weitergegeben wird. In einem solchen Beispiel wird, wenn der Wundheilungsprozess beendet ist und das Genprodukt nicht länger benötigt wird, das Genprodukt nicht länger exprimiert.
  • Die Erfindung wird anhand von Beispielen dargestellt, die zeigen, das Gene in verschiedenen verwundeten Weich- und Hartgeweben in vivo reproduzierbar übertragen und exprimiert werden können. Es wird besonders gezeigt, dass das Verfahren der Erfindung die Probleme, die mit derzeit verfügbaren Gentherapieprotokollen verbunden werden, überwindet. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht eine Genübertragung auf eine geeignete Anzahl von Reparaturzellen, um funktionelle Wirkungen zu erzielen, d.h. in Abwesenheit irgendeiner weiteren Steuerung oder zellulären Identifikation durch den Fachmann. Die in vivo Verfahren zur Gentherapie erfordern irgendeine Form der Steuerung, die sehr häufig nicht funktioniert. Im Verfahren der Erfindung ist die Steuerung kein Problem. Als Analogie betrachtet, fungiert die DNA ähnlich einem „Köder" in einer „Falle": die DNA trifft unwissentlich auf Reparaturzellen, die sich proliferiert haben und dann in die genaktivierte Matrix migriert sind. Diese Zellen sind wiederum überraschenderweise dazu in der Lage, DNA aufzunehmen und sie als ein therapeutisches Agens zu exprimieren.
  • Das Verfahren kann als ein Arzneimittelabgabesystem bis einschließlich der Übertragung von DNA in Säugetierreparaturzellen zum Zwecke der Stimulierung der Weich- und Hartgewebereparatur und Geweberegeneration verwendet werden. Die Reparaturzellen werden solche Zellen sein, die sich normalerweise im zu behandelnden Wundbereich einfinden. Demgemäß gibt es keine Schwierigkeit, die mit dem Erhalt von geeigneten Zielzellen, an die die vorliegenden therapeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden sollen, in Verbindung steht. Alles, was erforderlich ist, ist die Implantation einer genaktivierten Matrix an der Wundstelle. Die Natur dieser biologischen Umgebung ist dergestalt, dass die geeigneten Reparaturzellen die „Köder"-DNA in Abwesenheit irgendeiner weiteren Steuerung oder zellulären Identifikation durch den Fachmann aktiv aufnehmen und exprimieren werden.
  • Die Erfindung, die sowohl biologische als auch synthetische Matrizes verwendet, kann verwendet werden, um DNA in Säugetierreparaturzellen zu übertragen, um die Blutgefäßreparatur zu stimulieren.
  • Die im Verfahren der Erfindung zu verwendende DNA kann jede DNA einschließen, die für Translationsprodukte (d.h. Proteine) oder Transkriptionsprodukte (d.h. Antisense oder Ribozyme) kodiert, welche die Gewebereparatur fördert oder einen Entzündungsprozess stören kann. Zum Beispiel kann die DNA Gene umfassen, die für therapeutisch verwendbare Proteine, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren, Cytokine, Hormone, etc. kodieren. Zusätzlich kann die DNA für Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren, die die Translation von mRNA's hemmen, die für Proteine kodieren, welche die Wundheilung hemmen oder eine Entzündung induzieren.
  • Die DNA, die für das entsprechende therapeutische Produkt kodiert, ist mit einer Matrix verbunden oder innerhalb einer Matrix imprägniert, um eine genaktivierte Matrix zu bilden. Sobald sie einmal hergestellt ist, wird die genaktivierte Matrix innerhalb des Säugetiers an der Wundstelle eingebracht.
  • Die Erfindung wird anhand von Beispielen dargestellt, wobei die wirksame in vivo Übertragung und Expression der Gene in/im Gewebe, das eine Reparatur und Regeneration durchläuft, dargestellt wird.
  • 3.1 DEFINITIONEN
  • Wie hierin verwendet, werden die folgenden Begriffe die weiter unten angegebenen Bedeutungen haben.
  • Eine genaktivierte Matrix (GAM) wird hierin als irgendein Matrixmaterial definiert, das DNA enthält, die für ein entsprechendes therapeutisches Agens kodiert. Zum Beispiel werden genaktivierte Matrizes innerhalb von Wundstellen im Körper eines Säugetierwirtes eingebracht, um die Wundheilung zu verstärken.
  • Eine Reparaturzelle wird hierin als irgendeine Zelle definiert, die stimuliert wird, um als Reaktion auf eine Gewebsverletzung zu migrieren und zu proliferieren. Reparaturzellen sind eine Komponente der Wundheilungsreaktion. Solche Zellen schließen Fibroblasten, Kapillarendothelzellen, Kapillarperizyten, mononukleäre Entzündungszellen, segmentierte Entzündungszellen und Granulationsgewebezellen ein.
  • Eine Wundstelle ist als irgendein Ort im Wirt definiert, der sich aus einer traumatischen Gewebsverletzung ergibt oder alternativ dazu aus einem Gewebeschaden, der eine Folge von chirurgischen Verfahren ist oder durch sie induziert wurde.
  • 4. BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die Figuren zeigen schematische Beispiele von DNA-Konstrukten, wie sie in Zusammensetzungen für die Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Regulation von Angiogenese verwendet werden können.
  • 1. Schematisches Diagramm des pGAM1-Konstruktes, das für Mäuse BMP-4 kodiert. Die Position des CMV-Promotors, der BMP-4 kodierenden Sequenz, des HA-Epitops und des Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignals werden gezeigt.
  • 2 Schematisches Diagramm des pGAM2-Konstruktes, das für humanes PTH1-34 kodiert. Die Position einer stromaufwärts liegenden langen terminalen Wiederholung, die die PTH1-34-Expression (Pfeil) steuert, die PTH1-34 kodierende Sequenz, der SV40-Promotor, der die Neo-Expression (Pfeil) steuert, die Neo kodierende Sequenz, die pBR-Sequenzen, und die stromabwärts liegende lange terminale Wiederholung werden gezeigt.
  • 5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine biokompatible Matrix umfasst, die ein oder mehrere DNA-Moleküle enthält, die für therapeutische Proteine, Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren, wobei die Matrix als ein Gerüst fungiert, das die Infiltration von Zellen für die Herstellung von Arzneimitteln für die Verwendung zur Regulation der Angiogenese, zur Förderung der Blutgefäßbildung oder Hemmung der Blutgefäßbildung, fördert. Angiogenese, Blutgefäßbildung oder Hemmung der Blutgefäßbildung sind physiologische Ereignisse, die eine Rolle, inter alia, bei der Wundheilung spielen.
  • Die Wundheilung ist für gewöhnlich eine koordinierte, stereotypisierte Sequenz von Ereignissen, die (a) den Gewebeabbau und den Verlust der normalen Gewebearchitektur; (b) die Zellnekrose und Hämorrhagie; die Hämostase (Gerinselbildung); (c) die Infiltration von segmentierten und mononukleären Entzündungszellen mit Gefäßkongestion und Gewebeödem; (d) das Auflösen des Gerinsels als auch beschädigter Zellen und Geweben durch mononukleäre Zellen (Makrophagen); (e) die Bildung von Granulationsgewebe (Fibroplasie und Angiogenese) einschließt. Diese Sequenz zellulärer Ereignisse ist in Wunden aller Gewebe und Organe, die in einer großen Anzahl von Säugetierspezies erzeugt werden, beobachtet worden (Gailet et al., 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 717–725). Daher ist die oben beschriebene zelluläre Sequenz ein universeller Aspekt der Reparatur aller Säugetiergewebe.
  • Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, das Reparaturzellen, die am Wundheilungsprozess beteiligt sind, natürlicherweise an die Stelle der Gewebsverletzung proliferieren und migrieren werden und die genaktivierte Matrix infiltrieren werden. Überraschenderweise sind diese Reparaturzellen, die sich für gewöhnlich schwierig wirksam transfizieren lassen, entweder in vitro oder in vivo, extrem wirksam bei der Aufnahme und Expression von DNA, wenn sie durch den Wundheilungsprozess zur Proliferation aktiviert werden.
  • Den Vorteil dieses Merkmals ausnutzend, ist die vorliegende Erfindung so ausgestaltet, dass sie ein oder mehrere DNA-Moleküle, die für therapeutische Agenzien kodieren, wirksam auf die proliferierenden Reparaturzellen übertragen. Die aktivierte Matrix, die DNA enthält, die für Translationsprodukte (d.h. therapeutische Proteine) oder Transkriptionsprodukte (d.h. Antisense oder Ribozyme) kodiert, wird innerhalb eines Säugetierwirtes an der Wundstelle eingebracht. Die Wunde kann durch eine traumatische Gewebsverletzung, oder alternativ dazu durch einen Gewebeschaden, der entweder eine Folge von chirurgischen Verfahren ist oder durch sie induziert wird, entstehen.
  • Während die proliferierenden Reparaturzellen in eine genaktivierte Matrix migrieren und diese kontaktieren, nehmen sie die entsprechende DNA auf und exprimieren sie, wodurch die Menge des therapeutischen Agens, Proteins oder RNA, vervielfältigt wird. Die transfizierten Reparaturzellen dienen dabei als örtliche Bioreaktoren, die therapeutische Agenzien herstellen, die die örtliche Reparaturumwelt beeinflussen. Zum Beispiel werden Wachstumsfaktoren oder Cytokine, die durch die transfizierten Reparaturzellen hergestellt werden, die angesteuerten Effektorzellen, die verwandte Zelloberflächenrezeptoren exprimieren, binden und stimulieren, wodurch die Kaskade von physiologischen Ereignissen, die normalerweise mit dem Wundheilungsprozess verbunden sind, stimuliert und vervielfacht werden.
  • Alternativ dazu können Reparaturzellen DNA, die für Proteine kodiert, die die Aktivität von Antagonisten des Wundheilungsprozesses hemmen, aufnehmen und exprimieren. Die DNA kann auch für Antisense- oder Ribozym-RNA-Moleküle kodieren, die für die Hemmung der Translation von mRNA's, die für Entzündungsproteine oder andere Faktoren kodieren, die die Wundheilung hemmen oder eine exzessive Fibrose verursachen, verwendet werden.
  • Die genaktivierte Matrix, die in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet wird, kann mittels verschiedener Techniken auf den Patienten übertragen werden. Zum Beispiel werden, wenn die Wundheilung und Regeneration stimuliert wird, die Matrizes direkt an die Wundstelle, d.h. des frakturierten Knochens, des beschädigten Bindegewebes, etc., übertragen. Für die Verwendung bei der Hautreparatur werden die Matrizes topisch verabreicht. Für die Verwendung bei der Organregeneration werden die Matrizes chirurgisch in eine in einem Organ erzeugte Wunde eingebracht.
  • Da die Erfindung auf der natürlichen Migration und Proliferation von Reparaturzellen in einer Wundstelle und der Infiltration in die genaktivierte Matrix, die an der Wundstelle lokalisiert ist, gefolgt von der Aufnahme der DNA basiert, wird verständlich, dass die Matrizes an eine Stelle im Körper übertragen werden müssen, an der der Wundheilungsprozess induziert worden ist.
  • Ein besonders wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass der Reparaturprozess manipuliert werden kann, um entweder zur Bildung von Narbengewebe und/oder zur Geweberegeneration zu führen. Zum Beispiel kann die Überexpression der therapeutischen Proteine an der Wundstelle zur Regeneration des verletzten Gewebes führen, ohne die Bildung von Narbengewebe. In vielen Fällen, zum Beispiel bei der Knochenreparatur, ist eine solche Regeneration wünschenswert, da Narbengewebe nicht optimal strukturiert ist, um normale mechanische Funktionen zu unterstützen. Alternativ dazu kann es um eine Narbe herum wünschenswert sein, Narbengewebe zu bilden, um inhärent schwaches Gewebe zusammenzuhalten. Daher können die Verfahren der Erfindung verwendet werden, um die Wundheilung entweder mit oder ohne die Bildung von Narbengewebe abhängig vom Typ und dem Niveau des exprimierten therapeutischen Proteins zu stimulieren.
  • Die direkte Plasmid-DNA-Übertragung aus einer Matrix in eine Säugetierreparaturzelle durch Stimulation des Wundheilungsprozesses bietet eine Vielzahl von Vorteilen. Als erstes lässt sich die Einfachheit der Herstellung und Reinigung von DNA-Konstrukten positiv mit den traditionellen Proteinherstellungsverfahrenskosten vergleichen. Als zweites können Matrizes als strukturelle Gerüste fungieren, die in und auf sich selbst den Zelleinwuchs und die Proliferation fördern. Daher erleichtern sie das Steuern von Reparaturzellen für die Genübertragung. Als drittens kann die direkte Genübertragung ein vorteilhaftes Verfahren zur Arzneimittelabgabe für Moleküle sein, die normalerweise eine komplexe biosynthetische Prozessierung durchlaufen, oder für Rezeptoren, die in der zellulären Membran genau platziert werden müssen. Diese Molekültypen würden nicht funktionieren, wenn sie exogen an die Zellen abgegeben werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Matrizes umfassen, die DNA zur Regulation der Angiogenese enthalten. Die Zusammensetzungen bestehen im Allgemeinen aus einem biokompatiblen Matrimaterial, das DNA enthält, die für ein entsprechendes therapeutisches Protein kodiert.
  • Die Erfindung überwindet Mängel, die mit derzeitigen rekombinanten-Protein-Therapien für Wundheilungsanwendungen spezifisch zusammenhängen. Als erstes ist die direkte Genübertragung eine rationelle Strategie, die es transfizierten Zellen ermöglicht, (a) physiologische Mengen eines therapeutischen Proteins herzustellen, das in einer Gewebe- und Kontext-spezifischen Art und Weise modifiziert wurde und (b) dieses Proteins an den geeigneten Zelloberflächensignalrezeptor unter den geeigneten Umständen abzugeben. Aus den oben genannten Gründen erwartet man, dass die exogene Abgabe solcher Moleküle mit signifikanten Dosierungs- und Abgabeproblemen verbunden ist. Als zweites ist die wiederholte Verabreichung, obwohl möglich, mit der genaktivierten Matrix-Technologie nicht erforderlich: Die Zellaufnahme von DNA kann mit gut etablierten Langzeitabgabetechnologien präzise kontrolliert werden oder, alternativ dazu, kann die Integration von transfizierter DNA mit langfristiger rekombinanter Proteinexpression verbunden werden.
  • Die Erfindung kann universell auf Wunden, die viele verschiedene Zellen, Gewebe und Organe einschließen, angewendet werden; die Reparaturzellen des Granulationsgewebes (Gailet et al., 1994, Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 717–725) werden „gesteuert", wenn das Verfahren der Erfindung verwendet wird. Die Erfindung wird hierin in einem Tiermodell (Hase) unter Verwendung von alkaliner Phosphatase als Markergen veranschaulicht.
  • 5.1 DIE GENAKTIVIERTE MATRIX
  • Jedes biokompatible Matrixmaterial, das DNA enthält, die für ein entsprechendes therapeutisches Agens kodiert, wie zum Beispiel ein Translationsprodukt, d.h. therapeutische Proteine, oder Transkriptionsprodukte, d.h. Antisense oder Ribozyme, kann in Übereinstimmung mit der Erfindung formuliert und verwendet werden.
  • Die genaktivierten Matrizes der Erfindung können von jedem biokompatiblen Material abstammen. Solche Materialien können beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf biologisch abbaubare oder nicht biologisch abbaubare Materialien, die in Gerüste, die die Zellanbindung und das Wachstum unterstützen, Pulver oder Gele formuliert werden. Matrizes können von synthetischen Polymeren oder natürlich auftretenden Proteinen, wie zum Beispiel Kollagen, anderen extrazellulären Matrixproteinen oder anderen strukturellen Makromolekülen abstammen.
  • Die in die Matrix eingebaute DNA kann für alle einer Vielzahl von therapeutischen Proteinen abhängig von der gewünschten therapeutischen Verwendung kodieren. Solche Proteine können Wachstumsfaktoren, Cytokine, Hormone oder alle anderen Proteine, die das Wachstum, die Differenzierung oder physiologische Funktion der Zellen regulieren können, einschließen. Die DNA kann auch für Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren, die die Translation von Proteinen hemmen, die die Wundreparatur hemmen und/oder eine Entzündung induzieren.
  • Die übertragene DNA braucht nicht in das Genom der Zielzelle integriert zu werden; in der Tat ist die Verwendung von nicht integrierender DNA in der genaktivierten Matrix die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Auf diese Weise wird, wenn der Wundheilungsprozess beendet ist und das Genprodukt nicht länger benötigt wird, das Genprodukt nicht exprimiert.
  • Therapeutische Kits, die eine biokompatible Matrix und DNA enthalten, bilden einen anderen Aspekt der Erfindung. In einigen Fällen werden die Kits vorgefertigte genaktivierte Matrizes enthalten, die es dem Arzt ermöglichen, die Matrix innerhalb des Körpers direkt zu verabreichen. Alternativ dazu können die Kits die Komponenten, die zur Bildung einer genaktivierten Matrix erforderlich sind, enthalten. In solchen Fällen kann der Arzt die Komponenten kombinieren, um die genaktivierten Matrizes zu bilden, die dann durch Einsetzen innerhalb des Körpers therapeutisch verwendet werden kann. In einer Ausführungsform der Erfindung können die Matrizes verwendet werden, um chirurgische Vorrichtungen, wie zum Beispiel Nahtmaterialien oder Implantate, zu beschichten. In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung können genaktivierte Matrizes Fertigtupfer, Röhrchen, Verbandshilfen, lyophilisierte Komponenten, Gele, Pflaster, oder Pulver und Telfa-Schutzabdeckungen einschließen.
  • 5.1.1 DIE MATRIXMATERIALIEN
  • In einem Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen hergestellt, in der die DNA, die für das entsprechende therapeutische Agens kodiert, mit einer Matrix verbunden ist oder innerhalb einer Matrix imprägniert ist, um eine genaktivierte Matrix zu bilden. Die Matrixzusammensetzungen fungieren, (i) um das Einwachsen von Reparaturzellen (Steuerung) zu erleichtern; und (ii) um DNA aufzunehmen (Abgabe). Sobald die genaktivierte Matrix einmal hergestellt worden ist, wird sie für die weitere Verwendung gelagert oder sofort an der Wundstelle eingebracht.
  • Der Matrixtyp, der in den Zusammensetzungen, Vorrichtungen und Verfahren der Erfindung verwendet werden kann, ist praktisch unbegrenzt und kann sowohl biologische als auch synthetische Matrizes einschließen. Die Matrix wird alle Eigenschaften aufweisen, die für gewöhnlich mit „biokompatibel" sein in Verbindung gebracht werden, insofern sie in einer Form vorliegt, die keine nachteilige, allergische oder andere ungewollte Reaktion erzeugt, wenn sie an ein Säugetierwirt verabreicht wird. Solche Matrizes können sowohl aus natürlichen als auch aus synthetischen Materialen gebildet werden. Die Matrizes können nicht biologisch abbaubar sein, in Fällen, in denen es wünschenswert ist, dauerhafte Strukturen im Körper zu hinterlassen; oder biologisch abbaubar, wenn die Expression des therapeutischen Proteins nur für einen kurzen Zeitraum erforderlich ist. Die Matrizes können die Form von Tupfern, Implantaten, Röhrchen, Telfa-Schutzabdeckungen, Verbandshilfen, Bandagen, Schutzabdeckungen, lyophilisierten Komponenten, Gelen, Pflastern, Pulvern oder Nanopartikeln annehmen. Zusätzlich können Matrizes entworfen werden, die eine fortwährende Abgabe der DNA über längere Zeiträume ermöglicht.
  • Die Wahl des Matrixmaterials wird sich gemäß den besonderen Umständen und der zu behandelnden Wundstelle ändern. Matrizes, wie sie im U.S. Patent 5,270,300, das hiermit hierin aufgenommen wird, beschriebenen werden, können verwendet werden. Physikalische und chemische Charakteristika, wie z.B. Biokompatibilität, biologische Abbaubarkeit, Stärke, Steifheit, Schnittstelleneigenschaften und sogar kosmetisches Erscheinen, könnten bei der Auswahl einer Matrix berücksichtigt werden, wie dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt ist. Geeignete Matrizes werden sowohl das DNA-Molekül abgeben, als auch als ein in situ-Gerüst fungieren, durch das Säugetierreparaturzellen migrieren können.
  • Wenn die Matrizes für ausgedehnte Zeiträume erhalten bleiben müssen, können nichtbiologisch abbaubare Matrizes, wie zum Beispiel gesintertes Hydroxylapatit, Bioglas, Aluminate, andere biokeramische Materialien und metallische Materialien, besonders Titan, verwendet werden. Ein geeignetes keramisches Abgabesystem ist das im U.S. Patent 4,596,574 beschriebene, das hiermit hierin aufgenommen wird. Die Biokeramiken können in der Zusammensetzung verändert werden, wie zum Beispiel in Calcium-Aluminat-Phosphat; und sie können bearbeitet werden, um bestimmte physikalische und chemische Eigenschaften zu modifizieren, wie zum Beispiel die Porengröße, die Partikelgröße, die Partikelform und die biologische Abbaubarkeit. Polymermatrizen können ebenfalls verwendet werden, einschließlich Acrylesterpolymere und Milchsäurepolymere, wie in den U.S. Patenten 4,521,909 beziehungsweise 4,563,489 offenbart, die beide hiermit hierin aufgenommen werden. Besondere Beispiele für verwendbare Polymere sind die von Orthoestern; Anhydriden, Propylen-Cofumaraten oder ein Polymer eines oder mehrerer γ-Hydroxylcarboxylsäuremonomeren, z.B. γ-Hydroxylessigsäure (Glycolsäure) und/oder γ-Hydroxylpropionsäure (Milchsäure).
  • Ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ihre Verwendung in Verbindung mit orthopädischen Implantaten, und Schnittstellen und künstlichen Gelenken, einschließlich eigenen Implantaten und funktionellen Teilen eines Implantates, wie z.B. chirurgischen Schrauben, Stiften und ähnlichem. In bevorzugten Ausführungsformen wird in Erwägung gezogen, dass die Metalloberflächen, oder Oberflächen eines Implantates oder eines Teiles davon, wie zum Beispiel einer Titanoberfläche, mit einem Material beschichtet werden, das eine Affinität für Nukleinsäuren aufweist, am meisten bevorzugt mit Hydroxylapatit, und dann wird das beschichtete Metall weiter mit dem Gen oder der Nukleinsäure, das man zu übertragen wünscht, beschichtet. Die verfügbaren chemischen Gruppen des absorbierenden Materials, wie zum Beispiel Hydroxylapatit, können bereits manipuliert sein, um seine Affinität für Nukleinsäuren zu kontrollieren, wie es dem Fachmann auf diesem Gebiet bereits bekannt ist.
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird in Erwägung gezogen, dass eine biologisch abbaubare Matrix wahrscheinlich am nützlichsten sein wird. Eine biologische abbaubare Matrix wird im Allgemeinen als eine Matrix definiert, die vom Körper resorbiert werden kann: Mögliche biologische abbaubare Matrizes für die Verwendung in Verbindung mit den Zusammensetzungen, Vorrichtungen und Verfahren dieser Erfindung schließen zum Beispiel biologisch abbaubare und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polymilchsäure, Polyanhydride, Matrizes von gereinigten Proteinen und halbgereinigte extrazelluläre Matrixzusammensetzungen ein.
  • Andere biokompatible, biologisch abbaubare Polymere, die verwendet werden können, sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen beispielhaft und nicht begrenzend Polyester, wie zum Beispiel Polyglykolide, Polylaktide und Polylaktid-Polyglykolsäure-Copolymere („PLGA") (Langer und Volkmann, 1976, Nature 263: 797–800); Polyether, wie zum Beispiel Polycaprolakton („PCL"); Polyanhydride; Polyalkylcyanoacrylate, wie zum Beispiel n-Butylcyanoacrylat und Isopropylcyanoacrylat; Polyacrylamide; Poly(orthoester); Polyphosphazene; Polypeptide; Polyurethane und Mischungen solcher Polymere ein.
  • Es soll deutlich werden, dass praktisch jedes Polymer, das bekannt ist oder das später entwickelt werden wird und für die anhaltende oder kontrollierte Freigabe von Nukleinsäuren geeignet ist, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das biokompatible biologisch abbaubare Polymer ein Copolymer der Glykolsäure und der Milchsäure („PLGA") mit einem Verhältnis zwischen den Milchsäure/Glykolsäureeinheiten, das von etwa 100/0 bis etwa 25/75 variiert. Das durchschnittliche Molekulargewicht („MW") des Polymers wird üblicherweise von etwa 6.000 bis 700.000 und bevorzugt von etwa 30.000 bis 120.000 variieren, wie es die Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von kommerziell erhältlichem Polystyren mit Standardmolekulargewicht bestimmt, und eine intrinsische Viskosität aufweisen, die von 0,5 bis 10,5 variiert.
  • Die Länge des Zeitraums der ständig andauernden oder kontrollierten Freigabe von Nukleinsäuren aus der Matrix gemäß der Erfindung wird zum großen Teil vom MW des Polymers und des Zusammensetzungsverhältnisses von Milchsäure/Glykolsäure abhängen. Im Allgemeinen wird ein höheres Verhältnis von Milchsäure/Glykolsäure, wie zum Beispiel 75/25, für einen längeren Zeitraum eine kontrollierte, fortdauernde Freisetzung der Nukleinsäuren ermöglichen, wohingegen ein niedrigeres Verhältnis von Milchsäure/Glykolsäure eine schnellere Freisetzung der Nukleinsäuren ermöglichen wird. Das Milchsäure/Glykolsäure-Verhältnis liegt bevorzugt bei 50/50.
  • Die Länge des Zeitraums der fortdauernden oder kontrollierten Freigabe hängt auch vom MW des Polymers ab. Im Allgemeinen wird ein höheres MW-Polymer einen längeren Zeitraum zur kontrollierten oder fortdauernden Freisetzung ermöglichen. Im Falle der Herstellung, zum Beispiel von Matrizes, die eine kontrollierte oder fortdauernde Freisetzung für über drei Monate ermöglichen, wenn das Zusammensetzungsverhältnis der Milchsäure/Glykolsäure bei 100/0 liegt, variiert das bevorzugte durchschnittliche MW des Polymers von etwa 7.000 bis 25.000; wenn 90/10 von etwa 6.000 bis 30.000; und wenn 80/20 von etwa 12.000 bis 30.000.
  • Ein anderer Biomaterialtyp, der verwendet werden kann, ist die Dünndarmsubmucosa (SIS). Das SIS-Transplantatmaterial kann aus einem Segment des Jejunum eines ausgewachsenen Schweines hergestellt werden. Die Isolation von Gewebeproben kann unter Verwendung von Routinegewebskulturtechniken, wie den von Badybak et al., 1989, J. Surg. Res. 47: 74–80 beschriebenen, durchgeführt werden. Das SIS-Material wird durch das Entfernen von Mesenterialgewebe, Inversion des Segmentes gefolgt vom Entfernen der Mucosa und der oberflächlichen Submucosa mittels einer mechanischen Abschürftechnik hergestellt. Nach dem Wiedereinsetzen des Segments in seine ursprüngliche Orientierung werden die Serosa- und Muskelschichten gewaschen und für die weitere Verwendung gelagert.
  • Ein anderes besonderes Beispiel eines geeigneten Materials ist das fibröse Kollagen, das nach der Extraktion und partiellen Reinigung vom Gewebe und anschließender Sterilisierung lyophilisiert werden kann. Matrizes können auch aus Sehnen oder dermalem Kollagen hergestellt werden, wie man sie von verschiedenen kommerziellen Quellen, z.B. Sigma und der Collagen Corporation erhalten kann. Kollagenmatrizes können, wie in den U.S. Patenten 4,394,370 und 4,975,527 beschrieben, wobei beide hiermit hierin aufgenommen werden, ebenfalls hergestellt werden.
  • Zusätzlich können Gitter, die aus Kollagen und Glycosaminoglycan (GAG) gemacht sind, wie zum Beispiel dem, das von Yannas & Burke im U.S. Patent 4,505,266 beschrieben wird, bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden. Die Kollagen/GAG-Matrix könnte wirksam als Unterstützung oder "Gerüst"-Struktur, in die Reparaturzellen migrieren könnten, dienen. Eine Kollagenmatrix, wie zum Beispiel denen, die von Bell im U.S. Patent Nr. 4,485,097 offenbart werden, könnte ebenfalls als Matrixmaterial verwendet werden.
  • Die verschiedenen Kollagenmaterialien können auch in Form von mineralisiertem Kollagen vorliegen. Zum Beispiel kann das fibröse Kollagenimplantatmaterial, das UltraFiberTM genannt wird, wie es bei Norian Corp. erhalten werden kann (1025 Terra Bella Ave., Mountain View, CA, 94043), für die Bildung der Matrizes verwendet werden. Das U.S. Patent 5,231,169, das hiermit hierin aufgenommen wird, beschreibt die Herstellung von mineralisiertem Kollagen durch die Bildung eines Calciumphosphatminerals unter mildem Rühren in situ, in Gegenwart von dispersierten Kollagenfibrillen. Solch eine Formulierung kann im Kontext der Abgabe eines Nukleinsäuresegments an eine Knochengewebsstelle verwendet werden. Mineralisiertes Kollagen kann verwendet werden, zum Beispiel als Teil eines therapeutischen Kits mit genaktivierter Matrix für die Reparatur von Frakturen.
  • Mindestens 20 unterschiedliche Formen von Kollagen sind identifiziert worden und jedes dieser Kollagene kann bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann Kollagen aus hyalinem Knorpel, wie es aus Diarthrosen oder Wachstumsplatten isoliert wird, aufgereinigt werden. Typ II-Kollagen, das aus hyalinem Knorpel aufgereinigt wurde, ist kommerziell verfügbar und kann, z.B. bei Sigma Chemical Company, St. Louis, bezogen werden. Typ I-Kollagen aus der Rattenschwanzsehne kann, z.B. bei der Collagen Corporation, bezogen werden. Jede Form des rekombinanten Kollagens kann genauso verwendet werden, wie man es auch aus einer Kollagen-exprimierenden rekombinanten Wirtszelle, einschließlich bakterieller Hefe-, Säugetier- und Insektenzellen, erhalten kann. Wenn Kollagen als Matrixmaterial verwendet wird, kann es von Vorteil sein, das zu entfernen, was als „Telopeptid" bezeichnet wird, und das am Ende des Kollagenmoleküls lokalisiert ist und dafür bekannt ist, dass es eine Entzündungsreaktion induziert.
  • Das in der Erfindung verwendete Kollagen kann, wenn es gewünscht wird, mit zusätzlichen Mineralien, wie zum Beispiel Calcium, z.B. in Form von Calciumphosphat, zugesetzt werden. Sowohl natives- als auch Kollagen vom rekombinanten Typ kann durch Zumischen, Absorbieren oder anderweitig, mit zusätzlichen Mineralien auf diese Weise in Verbindung bringen, zugesetzt werden.
  • 5.1.2 DIE DNA
  • Die vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen können eine Vielzahl von unterschiedlichen DNA-Molekültypen verwenden. Die DNA-Moleküle können genomische, cDNA's, einzelsträngige DNA, doppelsträngige DNA, dreisträngige DNA, Oligonukleotide und Z-DNA einschließen.
  • Die DNA-Moleküle können für eine Vielzahl von Faktoren kodieren, die die Wundheilung fördern, einschließlich extrazellulärer-, Zelloberflächen-, und intrazellulärer RNA's und Proteine. Beispiele für extrazelluläre Proteine schließen Wachstumsfaktoren, Cytokine, therapeutische Proteine, Hormone und Peptidfragmente von Hormonen, Cytokinhemmer, Peptidwachstums- und Differenzierungsfaktoren, Interleukine, Chemokine, Interferone, Koloniestimulierende Faktoren und angiogenetische Faktoren ein. Beispiele für solche Proteine schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die Superfamilie von TGF-β-Molekülen, einschließlich der fünf TGF-β-Isoformen und der knochenbildenden Proteine (Bone Morphogenetic Proteins, BMP), den latenten TGF-β-bindende Proteinen, LTBP; den Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF); den Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF); den Plättchenwachstumsfaktor (Platelet Derived Growth Factor, PDGF); die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (insuline like growth factor, IGF); die Basisfibroblasten-Wachstumsfaktoren (Basic Fibroblast Growth Factors, FGF-1, FGF-2 etc.), den Gefäßendothelwachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF); den Faktor VIII und den Faktor IX; das Erythropoiethin (EPO), den Gewebeplasminogenaktivator (tissue plasminogen activator, TPA); die Aktivine und die Inhibine. Hormone, die bei der Anwendung der Erfindung verwendet werden können, schließen das Wachstumshormon (GH) und das Parathyroidhormon (PTH) ein. Beispiele für extrazelluläre Proteine schließen auch die extrazellulären Matrixproteine, wie zum Beispiel Kollagen, Laminin und Fibronektin ein. Beispiele für Zelloberflächenproteine schließen die Familie der Zelladhäsionsmoleküle (z.B. die Integrine, Selektine, Ig- Familienmitglieder, wie zum Beispiel N-CAM und L1 und Cadherine); Cytokinsignalrezeptoren, wie zum Beispiel die Typ I und Typ II TGF-β-Rezeptoren und der FGF-Rezeptor; und nicht signalisierende Corezeptoren, wie zum Beispiel Betaglycan und Syndecan, ein. Beispiele für intrazelluläre RNA's und Proteine schließen die Familie der signaltransduzierenden Kinasen, Cytoskelettproteine, wie zum Beispiel Talin und Vinculin, cytokinbindende Proteine, wie zum Beispiel die Familie der latenten TGF-β-Proteine und nukleäre trans-agierende Proteine, wie zum Beispiel Transkriptionsfaktoren und verstärkende Faktoren, ein.
  • Die DNA-Moleküle können auch für Proteine kodieren, die pathologische Prozesse blockieren, wodurch das Eintreten des ungehinderten Wundheilungsprozesses ermöglicht wird. Beispiele für blockierende Faktoren schließen Ribozyme ein, die die RNA-Funktion und DNA's, die zum Beispiel für Gewebehemmer von Enzymen kodieren, welche die Gewebeintegrität zerstören, z.B. Hemmer der mit Arthritis in Verbindung stehenden Metalloproteinasen, zerstören.
  • Man kann das DNA-Segment, das für das entsprechende Protein kodiert, unter Verwendung von verschiedenen molekularbiologischen Techniken, die dem Fachmann im Allgemeinen bekannt sind, erhalten. Zum Beispiel können cDNA- oder genomische Bibliotheken unter Verwendung von Primern oder Sonden mit Sequenzen, die auf den bekannten Nukleotidsequenzen basieren, durchsucht werden. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) kann ebenfalls verwendet werden, um das DNA-Fragment, das für das entsprechende Protein kodiert, zu erzeugen. Alternativ dazu kann das DNA-Fragment aus einer kommerziellen Quelle erhalten werden.
  • Gene mit Sequenzen, die sich von denen unterscheiden, die in der Literatur beschrieben werden, werden ebenfalls von der Erfindung umfasst, solange das veränderte oder modifizierte Gen immer noch für ein Protein kodiert, das bei der Stimulation der Wundheilung auf irgendeine direkte oder indirekte Weise wirkt. Diese Sequenzen schließen die ein, die durch Punktmutationen erzeugt wurden, solche infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes, oder natürlich auftretende allele Varianten und weitere Modifikationen, die durch genetische Manipulation, d.h. durch die Hand eines Menschen, eingeführt wurden.
  • Techniken zum Einführen von Veränderungen in Nukleotidsequenzen, die entworfen wurden, um die funktionellen Eigenschaften der kodierten Proteine oder Polypeptide zu verändern, sind im Stand der Technik gut bekannt. Solche Modifikationen schließen die Deletion, Insertion oder Substitution von Basen ein, was zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz führt. Die Veränderungen können durchgeführt werden, um die Aktivität eines kodierten Proteins zu erhöhen, um seine biologische Stabilität oder Halbwertszeit zu erhöhen, um sein Glykosilierungsmuster zu verändern, um die Temperaturempfindlichkeit zu konferieren oder um das Expressionsmuster des Proteins verändern und ähnliches. Alle diese Modifikationen an den Nukleotidsequenzen sind durch diese Erfindung umfasst.
  • Die DNA, die für die entsprechenden Translations- oder Transkriptionsprodukte kodieren, können in verschiedene Vektorsysteme eingearbeitet werden, die die Replikation der DNA für die Herstellung von genaktivierten Matrizes im großen Maßstab ermöglichen. Diese Vektoren können so entworfen werden, dass sie die notwendigen Elemente zum Steuern der Transkription und/oder Translation der DNA-Sequenz, die durch die Reparaturzellen an der Wunde in vivo aufgenommen wird, enthalten.
  • Vektoren, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf solche, die von rekombinanter Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA abstammen. Zum Beispiel können Plasmidvektoren, wie zum Beispiel pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 und die M13 mp-Serie von Vektoren verwendet werden. Bakteriophagenvektoren können γgt10, γgt11,-γgt18-23, γZAP/R und die EMBL-Serie von Bakteriophagenvektoren einschließen. Cosmidvektoren, die verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 und die Charomid-9-Serie von Vektoren. Vektoren, die die in vitro-Transkription von RNA ermöglichen, wie zum Beispiel die SP6-Vektoren, können ebenfalls verwendet werden, um große Mengen an RNA, die in Matrizes eingebaut werden kann, herzustellen. Alternativ dazu können rekombinante Virusvektoren, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf solche, die von Viren abstammen, wie zum Beispiel dem Herpesvirus, den Retroviren, den Vakziniaviren, den Adenoviren, den Adeno-verbundenen Viren oder den Rinder-Papillomaviren, manipuliert werden. Während integrierende Vektoren verwendet werden können, werden nicht integrierende Systeme, die das Genprodukt nicht für viele Generationen auf Tochterzellen übertragen, für die Wundheilung bevorzugt. Auf diese Weise wird das Genprodukt während des Wundheilungsprozesses exprimiert und, da das Gen in nachkommenden Generationen ausgedünnt wird, wird die Menge des exprimierten Genproduktes abnehmen.
  • Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, welche die proteinkodierende Sequenz in operativer Verbindung mit geeigneten Transkriptions/Translations-Kontrollsignalen enthalten. Diese Verfahren schließen in vitro rekombinante DNA-Techniken und synthetische Techniken ein. Siehe zum Beispiel die Techniken, die bei Sambrook, et al., 1992, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N. Y. beschrieben werden.
  • Die Gene, welche für die entsprechenden Proteine kodieren, können mit einer Vielzahl von verschiedenen Promotor/Enhancer-Elementen operativ verbunden sein. Die Expressionselemente dieser Vektoren können in ihrer Stärke und Spezifitäten variieren. Abhängig vom verwendeten Wirt/Vektor-System kann jeder beliebige von etlichen geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Der Promotor kann in der Form des Promoters vorliegen, der natürlicherweise mit dem entsprechenden Gen verbunden ist. Alternativ dazu kann die DNA unter der Kontrolle eines rekombinanten oder heterologen Promotors, d.h. ein Promotor, der normalerweise nicht mit dem Gen verbunden ist, positioniert werden. Zum Beispiel können gewebespezifische Promotor/Enhancer-Elemente verwendet werden, um die Expression der übertragenen DNA in spezifischen Zelltypen zu regulieren. Beispiele für Transkriptionskontrollregionen, die eine Gewebespezifität aufweisen, die beschrieben worden ist und verwendet werden kann, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf: Elastase-I-Genkontrollbereich, der in pankreatischen Acinuszellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515); Insulin-Genkontrollbereich, der in pankreatischen Betazellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122); Immunoglobulin-Genkontrollbereich, der in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adams et al., 1985, Nature 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444); Albumin-Genkontrollbereich, der in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276); alpha-Fetoprotein-Genkontrollbereich, der in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58); alpha-1-Antrypsin-Genkontrollbereich, der in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171; beta-Globin-Genkontrollbereich, der in Myeloidzellen aktiv ist (Magram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94); Myelinbasisprotein-Genkontrollbereich, der in Oligodendrozytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); Myosin leichte Kette-2-Genkontrollbereich, der in Skelettmuskeln aktiv ist (Shani, 1985, Nature 314: 283–286) und gonadotropisches Freisetzungshormon-Genkontrollbereich, der im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378). Promotoren, die aus dem Genom von Viren isoliert wurden, die in Säugetierzellen wachsen, (z.B. RSV, Vakziniavirus 7,5K, SV40, HSV, die Adenoviren MLP, MMTV, LTR und CMV-Promotoren), können verwendet werden, als auch Promotoren, die durch rekombinante DNA- oder synthetische Techniken erzeugt wurden.
  • In einigen Fällen können die Promotorelemente konstitutive oder induzierbare Promotoren sein und können unter den geeigneten Bedingungen verwendet werden, um zu großen Mengen zu führen oder zur regulierten Expression des entsprechenden Gens. Die Expression von Genen unter der Kontrolle von konstitutiven Promotoren erfordert nicht die Anwesenheit eines spezifischen Substrates, um die Genexpression zu induzieren und wird unter allen Bedingungen des Zellwachstums stattfinden. Im Gegensatz dazu ist die Expression von Genen, die durch induzierbare Promotoren kontrolliert werden, reaktiv gegenüber der Anwesenheit oder Abwesenheit eines induzierbaren Agens.
  • Spezifische Initiationssignale sind ebenfalls für die ausreichende Translation von inserierten Protein-kodierenden Sequenzen erforderlich. Diese Signale schließen das ATG-Initiations-Codon und benachbarte Sequenzen ein. In Fällen, in denen die gesamte kodierende Sequenz einschließlich des Initiationscodons und benachbarter Sequenzen in die geeignete Expressionsvektoren inseriert werden, sind keine zusätzlichen Translationskontrollsignale erforderlich. In Fällen jedoch in denen nur ein Teil der kodierenden Sequenz inseriert wird, müssen exogene Translationskontrollsignale einschließlich des ATG Initiationscodons bereitgestellt werden. Darüber hinaus muss das Initiationscodon mit dem Leserahmen der Protein kodierenden Sequenzen in Phase sein, um die Translation des gesamten Inserts sicherzustellen. Diese exogenen Translationskontrollsignale und Initiationscodons können verschiedenen Ursprungs sein, sowohl natürlichem als auch synthetischen. Die Wirksamkeit und Kontrolle der Expression kann durch den Einschluss der Transkriptionsattenutionssequenzen, Enhancerelementen etc. verstärkt werden.
  • Zusätzlich zu den DNA-Sequenzen, die für entsprechende therapeutische Proteine kodieren, schließt der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Ribozymen oder Antisense-DNA-Molekülen ein, die in die Säugetierreparaturzellen übertragen werden können. Solche Ribozyme und Antisense-Moleküle können verwendet werden, um die Translation von RNA-kodierenden Proteinen von Genen, die einen Krankheitsprozess oder den Wundheilungsprozess hemmen, wodurch ermöglicht wird, das die Gewebereparatur stattfindet, zu hemmen.
  • Die Expression der Antisense-RNA-Moleküle wird so wirken, dass die Translation von mRNA durch Binden an Ziel-mRNA und Unterbinden der Proteintranslation direkt blockiert wird. Die Expression von Ribozymen, die enzymatische RNA-Moleküle darstellen, die die spezifische Spaltung von RNA katalysieren können, können ebenfalls verwendet werden, um die Proteintranslation zu blockieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung schließt die sequenzspezifische Hybridisation des Ribozymmoleküls an die komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von einer endonukleolytischen Spaltung, ein. Innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegen bearbeitete Hammerkopfmotiv-Ribozymmoleküle, die die endonukleolytische Spaltung von RNA-Sequenzen spezifisch und wirksam katalysieren. Die RNA-Moleküle können durch Transkription von DNA-Sequenzen, die für das RNA-Molekül kodieren, hergestellt werden.
  • Es liegt auch innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung, das mehrere Gene, die auf einem einzelnen genetischen Konstrukt unter Kontrolle eines oder mehrerer Promotoren kombiniert werden oder als separate Konstrukte des gleichen oder unterschiedlicher Typen hergestellt werden, verwendet werden können. Dadurch kann eine fast endlose Kombination von unterschiedlichen Genen und genetischen Konstrukten verwendet werden. Bestimmte Genkombinationen können entworfen werden, oder ihre Verwendung auf andere Weise dazu führen, dass synergistische Wirkungen bei der Zellstimulation und der Regeneration erzielt werden, wobei jede und alle dieser Kombinationen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen sollen. In der Tat sind viele synergistische Wirkungen in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben worden, so dass der Fachmann bereits dazu in der Lage wäre, ähnliche synergistische Genkombinationen oder sogar Gen-Proteinkombinationen zu identifizieren.
  • 5.1.3 HERSTELLUNG DER GENAKTIVIERTEN MATRIZES
  • In bevorzugten Ausführungsformen wird Matrix- oder Implantatmaterial mit der DNA, die für ein entsprechendes therapeutisches Produkt kodiert, durch Aufsaugen des Matrixmaterials in einer rekombinanten DNA-Vorratslösung in Kontakt gebracht. Die Menge an DNA und der Umfang der Kontaktzeit, die für das Einbauen der DNA in die Matrix erforderlich sind, werden vom Typ der verwendeten Matrix abhängen und können von einem Fachmann ohne übermäßiges experimentieren einfach bestimmt werden. Alternativ dazu kann die DNA innerhalb einer Matrix aus synthetischen Polymeren, wie zum Beispiel Blockcopolymeren der Polymilch-Polyglykolsäure (siehe Langer und Folkmann, 1976 Nature, 263: 797–800, das hiermit hierin aufgenommen wird) eingekapselt werden. Diese Parameter können wiederum durch einen Fachmann ohne übermäßiges Experimentieren einfach bestimmt werden. Zum Beispiel wird die Menge des DNA-Konstruktes, das auf der Matrix aufgebracht wird, unter Berücksichtigung verschiedener biologischer und medizinischer Faktoren bestimmt werden. Man würde das bestimmte Gen, die Matrix, die Wundstelle, das Alter des Säugetierwirtes, das Geschlecht und die Ernährung und jeden weiteren klinischen Faktor, der die Wundheilung beeinflussen könnte, wie zum Beispiel die Serummengen verschiedener Faktoren und Hormone, berücksichtigen.
  • In zusätzlichen Ausführungsformen der Erfindung können Zusammensetzungen sowohl von biologischen als auch synthetischen Matrizes und DNA zusammen lyophilisiert werden, um ein trockenes pharmazeutisches Pulver zu bilden. Die genaktivierte Matrix kann vor der Implantation in den Körper rehydriert werden oder, alternativ dazu, kann die genaktivierte Matrix auf natürliche Weise rehydriert werden, wenn sie in den Körper eingebracht wird.
  • In einigen Beispielen können medizinische Vorrichtungen, wie zum Beispiel Implantate, Nahtmaterialien, Wundabdeckungen, etc. mit den Nukleinsäurezusammensetzungen der Erfindung unter Verwendung von konventionellen Beschichtungstechniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind, beschichtet werden. Solche Verfahren schließen beispielhaft und nicht begrenzend das Eintauchen der Vorrichtung in die Nukleinsäurezusammensetzung, Bestreichen der Vorrichtung mit der Nukleinsäurezusammensetzung und/oder Besprühen der Vorrichtung mit der Aerosol-Nukleinsäurezusammensetzung der Erfindung. Die Vorrichtung wird dann entweder bei Raumtemperatur oder mit der Hilfe eines Trockenofens, gegebenenfalls bei verringertem Druck, getrocknet. Ein bevorzugtes Verfahren zum Beschichten von Nahtmaterialien wird in den Beispielen bereitgestellt.
  • Für Nahtmaterial, das mit einer polymerischen Matrix, die Plasmid-DNA enthält, beschichtet ist, haben. die Anmelder herausgefunden, dass das Anwenden einer Beschichtungszusammensetzung, die insgesamt etwa 0,01 bis 10 mg Plasmid-DNA und bevorzugt etwa 1 bis 5 mg Plasmid-DNA enthält, auf Nahtmaterial von 70 cm Länge unter Verwendung von etwa 5 bis 100, bevorzugt etwa 5 bis 50 und noch bevorzugter etwa 15 bis 30 Beschichtungsanwendungen, eine therapeutisch wirksame und gleichmäßige Beschichtung erbringt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung beschichtete Nahtmaterialien bereit, besonders Nahtmaterialien, die mit einer Polymermatrix, die Nukleinsäuren enthält, die für therapeutische Proteine kodieren, die die Wundheilung in vivo stimulieren, beschichtet.
  • Nahtmaterialien, die in Übereinstimmung mit den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung beschichtet werden, schließen alle Nahtmaterialien natürlichen oder synthetischen Ursprungs ein. Typische Nahtmaterialien schließen beispielhaft und nicht begrenzend Seide, Baumwolle, Leinen, Polyolefine, wie zum Beispiel Polyethylen und Polypropylen; Polyester, wie zum Beispiel Polyethylenterephtalat; homopolimere und copolimere der Hydroxylcarbonsäureester; Kollagen (einfach oder chromiert); Katgut (einfach oder chromiert) und Ersatznahtmaterialien, wie zum Beispiel Cyanoacrylate, ein. Die Nahtmaterialien können jede geeignete Form annehmen, wie zum Beispiel Zöpfe oder Spiralen, und können einen breiten Größenbereich aufweisen, wie er im Stand der Technik für gewöhnlich verwendet wird.
  • Die Vorteile von beschichteten Nahtmaterialien, besonders Nahtmaterialien, die mit einer Polymermatrix beschichtet sind, die Nukleinsäuren enthalten, die für therapeutische Proteine kodieren, die die Wundheilung stimulieren, decken praktisch jedes Gebiet der chirurgischen Anwendung bei Menschen und Tieren ab.
  • 5.2 ANWENDUNGEN DER GENAKTIVIERTEN MATRIX
  • Die Erfindung ist bei einer großen Vielzahl von Zuständen der Wundheilung in der Humanmedizin anwendbar. Dies schließt die Blutgefäßreparatur ein. Zum Beispiel werden unter Verwendung der genaktivierten Matrixtechnologie Cytokinwachstumsfaktoren, die durch transfizierte Reparaturzellen hergestellt werden, andere Zellen in der Wunde durch das Binden von Zelloberflächensignalrezeptoren beeinflussen, wodurch die Kaskaden von physiologischen Ereignissen, die normalerweise mit dem Prozess der Wundheilung verbunden sind, stimuliert und vervielfältigt wird. Das Endergebnis ist die Zunahme der Gewebereparatur und der Regeneration.
  • Das Verfahren der Erfindung ist auch verwendbar, wenn es klinisches Ziel ist, einen Krankheitsprozess zu blockieren, wodurch man das Ablaufen der natürlichen Gewebeheilung ermöglicht, oder wenn es das Ziel ist, eine genetisch defekte Proteinfunktion zu ersetzen.
  • Wunden können sich aus traumatischen Verletzungen ergeben oder alternativ dazu; aus Gewebeschäden, die entweder durch ein chirurgisches Verfahren induziert wurden oder sich aus diesem ergeben. Die genaktivierte Matrix der Erfindung kann unter Verwendung verschiedener Techniken auf den Patienten übertragen werden. Zum Beispiel können Matrizes durch die Hand des Arztes direkt an die Wundstelle übertragen werden, entweder als ein therapeutisches Implantat oder als eine beschichtete Vorrichtung (z.B. Nahtmaterial, Stent, beschichtetes Implantat, etc.). An einer normalen Gewebestelle können Matrizes entweder topisch verabreicht oder chirurgisch eingebracht werden, um erkanntes Gewebe in einiger Entfernung zu behandeln.
  • Der Prozess der Wundheilung ist eine koordinierte Sequenz von Ereignissen, welche die Hämorrhagie, Gerinnselbildung, Auflösung des Gerinnsels bei gleichzeitiger Entfernung von beschädigtem Gewebe und das Absetzen von Granulationsgewebe als anfängliches Reparaturmaterial, einschließt. Das Granulationsgewebe ist eine Mischung aus Fibroblasten und kapillaren Blutgefäßen. Der Wundheilungsprozess schließt diverse Zellpopulationen ein, einschließlich Endothelzellen, Stammzellen, Makrophagen und Fibroblasten. Die regulatorischen Faktoren, die bei der Wundreparatur beteiligt sind, sind bekannt dafür, dass sie systemische Hormone, Cytokine, Wachstumsfaktoren, extrazelluläre Matrixproteine und andere Proteine, die das Wachstum und die Differenzierung regulieren, einschließen.
  • Die DNA-Übertragungsverfahren und Matrixzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden einen breiten Anwendungsbereich haben, wie zum Beispiel ein Arzneimittelabgabeverfahren zur Stimulation der Gewebereparatur und der Regeneration in einer Vielzahl von verschiedenen Gewebetypen. Diese schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die Knochenreparatur, Hautreparatur, Bindegewebsreparatur, Organregeneration oder die Regulation der Vaskulogenese und/oder Angiogenese. Die Verwendung von genaktivierten Matrizes kann auch verwendet werden, um Patienten mit beeinträchtigter Heilungskapazität, die sich zum Beispiel aus den Wirkungen des Alterns oder Diabetes ergeben, zu behandeln. Die Matrizes können auch zur Behandlung von Wunden, die aufgrund natürlicher Gründe, z.B. bei den Älteren und jenen, die auf existierende Therapien nicht reagieren, wie zum Beispiel in jenen Individuen mit chronischen Hautwunden, langsamer heilen, verwendet werden.
  • Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass die Bildung von Narbengewebe an der Wundstelle durch die selektive Verwendung der genaktivierten Matrizes reguliert werden kann. Die Bildung von Narbengewebe kann durch Kontrollieren der Mengen des exprimierten therapeutischen Proteins reguliert werden. In Fällen, wie zum Beispiel der Behandlung von Verbrennungen oder Bindegewebsschäden, ist es besonders wünschenswert, die Bildung von Narbengewebe zu hemmen.
  • Die Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen das Grafting oder Transplantieren der Matrizes, die die entsprechende DNA enthalten, in den Wirt ein. Verfahren zum Transplantieren der Matrizes können das chirurgische Einbringen oder die Injektion der Matrizes in den Wirt einschließen. In Fällen, in denen die Matrizes injiziert werden sollen, werden die Matrizes in eine Spritze aufgezogen und an der Wundstelle in einen Patienten injiziert. Mehrfache Injektionen können im Bereich der Wunde durchgeführt werden. Alternativ dazu können die Matrizes chirurgisch an der Wundstelle eingebracht werden. Die Menge der Matrizes, die für das Erreichen des Ziels der vorliegenden Erfindung, d.h. die Stimulation der Wundreparatur und der Regeneration erforderlich ist, ist variabel, abhängig von der Größe, dem Alter und dem Gewicht des Wirtes.
  • Es ist ein wesentliches Merkmal der Erfindung, dass, wann immer eine genaktivierte Matrix in den Wirt übertragen wird, durch Injektion oder Chirurgie, der lokale Gewebeschaden ausreichend ist, um den Wundheilungsprozess zu induzieren. Dies ist ein notwendiges Erfordernis für die Induktion der Migration und Proliferation der Säugetierzielreparaturzellen an die Stelle der genaktivierten Matrix.
  • Spezifische Ausführungsformen werden in den Abschnitten die folgen beschrieben.
  • 5.3 REGULATION DER ANGIOGENESE
  • Die vorliegende Erfindung wird zur Regulation der Bildung und der Ausbreitung der Blutgefäße, oder Vasculogenese beziehungsweise Angiogenese verwendet. Diese beiden physiologischen Prozesse spielen eine wichtige Rolle bei der Wundheilung und der Organregeneration.
  • Zunächst wird an der Wundstelle Granulationsgewebe, das eine Mischung aus Kollagen, Matrix und Blutgefäßen darstellt, abgelagert und stellt die Wundverstärkung während der Gewebereparatur bereit. Die Bildung neuer Blutgefäße schließt die Proliferation, Migration und Infiltration von Gefäßendothelzellen ein, und es ist bekannt, dass sie durch eine Vielzahl von Polypeptidwachstumsfaktoren reguliert wird. Zahlreiche Polypeptide mit wachstumsfördernder Aktivität für Endothelzellen sind identifiziert worden, wobei dies die Säure- und Basisfibroblasten-Wachstumsfaktoren (Basic Fibroblast Growth Factors, FGF), den Gefäßendothelwachstumsfaktor (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) und den Plazentawachstumsfaktor (Placental Derived Growth Factor, PIGF) einschließt.
  • Um die Bildung und Ausbreitung von Blutgefäßen zu stimulieren, kann DNA, die für solche Wachstumsfaktoren kodiert, in Matrizes eingebaut werden, und diese Matrizes können in den Wirt implantiert werden. In einigen Fällen kann es erforderlich sein, den Wundheilungsprozess durch Gewebsverletzung zu induzieren.
  • Es kann wünschenswert sein, die Proliferation der Blutgefäßbildung, wie bei der Angiogenese, die mit dem Wachstum von festen Tumoren, die für das Wachstum von der Vaskularisierung abhängen, in Verbindung stehen, zu hemmen. Die Tumorangiogenese kann durch die Übertragung von DNA's, die für negative Hemmer der Angiogenese, wie zum Beispiel Thrombospondin oder Angiostatin, kodieren, gehemmt werden. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung kann DNA, die für, zum Beispiel, Thrombospondin oder Angiostatin kodiert, in eine Matrix eingebaut werden und anschließend kann die Matrix in einen Patienten an der Tumorstelle implantiert werden.
  • 6. BEISPIEL: IN VIVO-PROTEINDETEKTION NACH DER TRANSGENEXPRESSION
  • 6.1 β-GALACTOSIDASETRANSGEN
  • Die bakterielle β-Galactosidase kann immunohistochemisch detektiert werden. Gewebeproben von einer Osteotomie wurden in Bouins-Fixiermittel fixiert, demineralisiert und dann entlang der Längsebene hälftig geteilt. Eine Hälfte jeder Probe wurde für die nachfolgende immunohistochemische Identifikation des bakteriellen β-Galactosidaseproteins in Paraffin eingebettet.
  • Für die Immunohistochemie wurden Querschnitte (2–3 mm dick) auf Poly-L-Lysin beschichtete Mikroskop-Objektträger übertragen und in Aceton bei 0°C für mindestens 20 Minuten fixiert. Die Schnitte wurden in PBS rehydriert. Die endogene Peroxydaseaktivität wurde durch Immersion von Gewebeschnitten in 0,1% Wasserstoffperoxyd (in 95% Methanol) bei Raumtemperatur für 10 Minuten gequenscht und gequenschte Schnitte wurde 3 × mit PBS gewaschen. In einigen Fällen wurde geschnittenes Calvaria durch Immersion in 4% EDTA, 5% Polyvinylpyrrolidon und 7% Saccharose bei pH 7,4 für 24 h bei 4°C demineralisiert. Demineralisierte Schnitte wurden vor der Anwendung mit Antikörpern 3 × gewaschen. Primäre Antikörper wurden ohne Verdünnung in Form des Hybridomüberstandes verwendet. Gereinigte Antikörper wurden auf Gewebsschnitte in einer Konzentration von 5 mg/ml angewendet. Primäre Antikörper wurden mit biotinyliertem Hasen-Antimaus-IgG und Peroxydase konjugiertem Streptavidin (Zymed Histostain-SPkit) detektiert. Nach der Peroxydasefärbung wurden die Schnitte mit Hämotoxylin gegengefärbt.
  • Bakterielles β-gal wurde ebenfalls durch Substrat verwendende Assays unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits (z.B. Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers detektiert.
  • 6.2 LUCIFERASETRANSGEN
  • Luciferase wurde durch Substrat verwendende Assays unter Verwendung von kommerziell verfügbaren Kits (z.B. Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers detektiert.
  • 6.3 PTH-TRANSGENE
  • Rekombinantes PTH, wie zum Beispiel das hPTH1-34-Peptid, wurde in Homogenaten des Osteotomielückengewebes, zum Beispiel unter Verwendung von zwei kommerziell verfügbaren Radioimmunoassay-Kits, gemäß den Protokollen des Herstellers (Nichols Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA) untersucht.
  • Ein Kit ist das Intact-PTH-Parathyroidhormon-100T-Kit. Dieses Radioimmunoassay verwendet einen Antikörper gegen das Carboxylende des intakten Hormons, und dieses wird zum Messen von endogenen Mengen des Hormons in Osteotomielückengewebe verwendet. Dieses Assay kann verwendet werden, um einen Basiswert der PTH-Expression in der Ratte des Osteotomie-Modells zu etablieren.
  • Das zweite Kit ist ein zweiseitiges immunoradiometrisches Kit zur Messung des Ratten-PTH. Dieses Kit verwendet affinitätsgereinigte Antikörper, die für das Aminoende des intakten Rattenhormons (PTH1-34) spezifisch sind und daher die endogene PTH-Produktion als auch das rekombinante Protein messen werden. vorherige Studien haben gezeigt, dass dieser Antikörper mit humanem PTH kreuzreagiert und diese in der Lage sind, rekombinante Moleküle in vivo zu erkennen.
  • Werte, die mit Kit #1 erhalten wurden (Antikörper gegen das Carboxylende) wurden von den Werten abgezogen, die mit Kit #2 erhalten wurden (Antikörper gegen das Aminoende), um genaue und empfindliche Messwerte zu erhalten. Die Menge an rekombinantem Peptid wurde dadurch mit dem Grad der Knochenneubildung korreliert.
  • 6.4 BMP-TRANSGEN
  • BMP-Proteine, wie zum Beispiel das murine BMP-4 transgene Peptidprodukt wurden immunohistochemisch unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers detektiert, der das HA-Epitop erkennt (Majmudar et al., 1991, J. Bone and Min. Res. 6: 869–881), wie zum Beispiel der monoklonale Antikörper, der bei Boehringer-Mannheim erhältlich ist. Antikörper gegen BMP-Proteine selber können ebenfalls verwendet werden. Solche Antikörper zusammen mit verschiedenen Immunoassayverfahren werden im U.S. Patent 4,857,456, das hierin aufgenommen wird, beschrieben.
  • Gewebeproben von einer Osteotomie wurden in Bouins-Fixiermittel fixiert, demineralisiert und dann entlang der Längsebene hälftig geteilt. Eine Hälfte jeder Probe wurde für die nachfolgende immunohistochemische Identifikation des rekombinanten murinen BMP-4-Moleküls in Paraffin eingebettet.
  • 7. METHODIK
  • 7.1 IMMUNOHISTOCHEMIE
  • Die Gewebe wurden für die Lichtmikroskopie vorbereitet, und die Immunohistochemie wurde wie beschrieben durchgeführt (Wong et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5592–5598). Histologische Schnitte wurden mit einem kommerziell verfügbaren anti-β-gal-Antikörper (1:200 Verdünnung, 5 Prime 3 Prime) und mit einem kommerziell verfügbaren anti-HA.11 polyklonalen Antikörper (1:500 Verdünnung, BAbCO) inkubiert.
  • 7.2 LUCIFERASE UND β-GAL-ENZYMASSAYS
  • Die Luciferase- und β-gal-Aktivität wurde unter Verwendung des Luciferaseassaysystems (Promega) und β-Galactosidaseenzymassaysystems (Promega) entsprechend den durch die Hersteller gelieferten Protokollen bestimmt.
  • 7.3 pGAM1-EXPRESSIONSPLASMID
  • Um pGAM1 zusammenzubauen, wurde mRNA aus Tag 13,5 p.c. CD-1-Mausembryos unter Verwendung von Kitreagenzien und Protokollen vorbereitet (Poly-AT-Tract-mRNA-Isolationssystem I, Promega). Ein Aliquot der mRNA wurde verwendet, um cDNA unter Verwendung kommerzieller Reagenzien zu erzeugen (Reverse Transcriptase System, Promega). Eine volllängen Mäuse-BMP-4 cDNA kodierende Sequenz wurde mittels der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter folgenden Bedingungen erzeugt: 94°C, 4 Min., 1 Zyklus; 94°C, 1 Min., 65°C, 1 Min. 72°C, 1 Min., 30 Zyklen; 72°C, 8 Min., 1 Zyklus. Die Sequenz der PCR-Primer basierte auf der bekannten Mäuse-BMP-4-Sequenz (Genbank): Stromaufwärtsprimer-5' CCATGATTCCTGGTAACCGAATGCTG 3'; Stromabwärtsprimer-5' CTCAGCGGCATCCGCACCCCTC 3'. Ein einzelnes PCR-Produkt der erwarteten Größe (1,3 kb) wurde durch Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und in den TA-Klonierungsvektor (Invitrogen) kloniert. Das 5'-Ende des BMP-4-Inserts wurde weiterhin durch Anfügen einer 27-Nukleotidsequenz, die für das HA-Epitop kodiert, modifiziert (PCR), und das BMP-4-Insert wurde in den pcDNA3-Expressionsvektor (InVitrogen) kloniert. Die Plasmid-DNA wurde zubereitet und sequenziert (beide Stränge), um die Orientierung und Integrität des BMP-4-Inserts sicherzustellen.
  • Das pGAM1-Plasmid wurde unter Verwendung eines in vitro Transkriptions- und Translationskits (TNT T7 gekoppeltes Retikulozyten-Lysatsystem, Promega) gemäß den durch die Hersteller beigefügten Protokollen exprimiert. Proteinradiomarkierung, Immunopräzipitation, Probenvorbereitung und SDS-Page, Autoradiographie, Transiententransfektion und Westernanalysen wurden wie beschrieben durchgeführt (Yin et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 10147–10160).
  • 7.4 pGAM2-EXPRESSIONSPLASMID
  • Die humanen Parathyroidhormon-cDNA-Fragmente, die für die Aminosäuren Prepol-34 kodieren, wurden durch PCR erzeugt. Die Sequenz der PCR-Primer basierte auf der bekannten humanen PTH-Sequenz (Genbank): Stromaufwärtsprimer-5' GCGGATCCGCGATGATACCTGCAAAAGACATG 3'; Stromabwärtsprimer-5' GCGGATCCGCGTCAAAAATTGTGCACATCC 3'. Dieses Primerpaar erzeugte BamHI-Stellen an beiden Enden des PCR-Fragmentes. Das Fragment wurde mit BamHI verdaut und in die BamHI Klonierungsstelle im PLJ-Retrovirusvektor kloniert (Wilson et al., 1992, Endocrinol. 130: 2947–2954). Ein Klon mit dem Insert in der kodierenden Orientierung (pGAM2) wurde letztendlich isoliert und durch DNA-Sequenzanalysen charakterisiert.
  • Um retrovirale Vorräte zu erzeugen, wurde die φ CRIP-Verpackungszelllinie (Wilson, J. M., et al., 1992, Endocrinology 130: 2947–2954) mit 10 μg rekombinanter Vektor-DNA unter Verwendung des Calciumphosphat-Verfahrens transfiziert. Nach einer Inkubation über Nacht wurde das Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 10% fötales Rinderserum, Penicillin (100 Units/ml) und Streptomycin (100 mg/ml) (alle Reagenzien von Gibco-BRL Life Technologies, Inc.) wurden zugesetzt), das Retrovirionpartikel enthält, wurde geerntet und zu kultivierten Rat-1-Zellen gegeben. Unabhängige Klone und erfolgreich transduzierte Rat-1-Zellen wurden durch Standardinfektions- und Selektionsverfahren erhalten. In aller Kürze, kultivierte Rat-1-Zellen wuchsen bis zur Konfluenz, wurden 1:10 geteilt und in G418 selektiert (1 mg/ml Gibco-BRL Life Technologies, Inc.). In einigen Fällen wurden antibiotikaresistente Kolonien in einer einzelnen Kultur zusammengefasst. In anderen Fällen wurden einzelne Kolonien von resistenten Zellen behalten. Ähnliche Verfahren wurden verwendet, um Klone von Rat-1-Zellen zu erzeugen, die mit dem BAGT-Retrovirus, der für das bakterielle b-gal-Enzym kodiert, transduziert wurden.
  • Die hPTH1-34-Konzentration im Zellkulturmedium wurde unter Verwendung eines kommerziellen Radioimmunoassaykits (INS-PTH, Nichols) und gemäß dem Protokoll des Herstellers abgeschätzt. Die biologische Aktivität des Peptids, das durch pGAM2 kodiert wird, wurde wie beschrieben evaluiert (McCauley, et al., 1994, Mol. Cell. Endocrinol. 101: 331–336).
  • 7.5 HERSTELLUNG VON GENAKTIVIERTEN KOLLAGENTUPFERN
  • Für jede Osteotomielücke, wurde lyophilisiertes Rindertrachealkollagen (10 mg, Sigma) in einer sterilen Lösung aus 0,5–1,0 mg Plasmid-DNA gründlich befeuchtet und zur Inkubation bei 4°C für 1–16 Stunden vor der Implantation stehen gelassen.
  • 7.6 RADIOGRAPHIE
  • Wöchentlich wurden einfache Röntgenbilder (posterior-anterior Ansicht) gemacht, während die Säugetierwirte bei Verwendung eines transportablen Röntgengerätes (GE, Model 100) wach waren. Sie wurden 1/10 Sek. bei 57 kV und 15 ma bestrahlt.
  • 7.7 HERSTELLUNG DER DNA-PLGA BESCHICHTUNGSZUSAMMENSETZUNG
  • Zu 1,5 ml einer PLGA/Chloroformlösung (3% (w/v) 50/50 Polymilch-Polyglycolsäure PLGA Copolymer, durchschnittliches MW 90.000, inhärente Viskosität 1,07) wurden 0,2 ml einer Lösung, die Marker-DNA enthält, die für die humane Plazenta-Alkaline-Phosphatase kodiert (1 mg DNA, 0,5 mM Tris-EDTA, 0,5 mM EDTA, pH 7,3), zugegeben. Die Lösung wurde durch zweiminütiges Vortexen emulsifiert, gefolgt durch eine 30 Sek. Beschallung bei etwa 0°C unter Verwendung eines Mikrochip-Sondentyp-Beschallers bei 55 Watt Output. Dieser Prozess ergab eine Emulsion, die sehr milchig aussah.
  • 9. BEISPIEL: ÜBERTRAGUNG VON GENEN AUF BLUTGEFÄßE
  • Es gibt einen klinischen Bedarf für die Vorbeugung gegen eine exzessive Fibrose (Restenose), wie sie zum Beispiel während der Blutgefäßreparatur im Anschluss an eine Angioplastie auftreten kann. Dies kann zum Beispiel durch Abgabe von Genen, die für Lysyloxidasehemmer kodieren, oder durch Übertragung von Genen, die für bestimmte TGF-β kodieren, erreicht werden. Es gibt zusätzlich einen klinischen Bedarf für die Regulation der Angiogenese, wie zum Beispiel bei Gefäßmangelerkrankungen, bei denen es das Ziel wäre, die Gefäßneubildung zu stimulieren, um einer Gewebehypoxie und dem Zelltod vorzubeugen. Ein Modelsystem ist entwickelt worden, in dem Reparaturzellen in großen Blutgefäßen im Hasen mit einem Präparat aus langfristig freisetzbaren PLGA-Partikeln und Plasmid-DNA transfiziert werden. Reparaturzellen sind vorhanden, da diese Hasenblutgefäße eine Xanthomzellläsion aufweisen, die klinische Arteriosklerose in Menschen mimt. Das vorliegende Beispiel stellt die Fähigkeit dar, Markergenkonstrukte in große Blutgefäßreparaturzellen abzugeben und zu exprimieren.
  • 9.1 MATERIALIEN UND METHODEN
  • New Zealand White rabbits beiden Geschlechts, die 3,1 bis 3,5 kg wiegen, wurden für diese Studie verwendet. Die Hasen wurden mittels Ketamin (35 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg), das intramuskulär verabreicht wurde, anästhesiert, und die andauernde Anästhesie wurde mit intravenösem Ketamin (8 mg/kg), das über eine Vena Marginalis verabreicht wurde, erreicht. Etwa 2 cm Segmente sowohl der Iliac-Arterien zwischen der absteigenden Aortengabelung als auch im Leistenband wurden isoliert, proximal abgebunden und alle kleinen Äste dieses arteriellen Segments wurden abgebunden. Lokalen Blutgerinseln wurde durch die Verabreichung von Heparin (100 mg) durch die Vena Marginalis des Ohrs vorgebeugt. Über eine Iliac-Arteriotomie wurde ein Ballonangioplastiekatheter (2,0 mm Ballon) in die Iliac Arteriensegmente eingeführt und der Ballon wurde für eine Minute mit einem Druck von 8 atm aufgeblasen.
  • Nach der Ballondilatation wurde der Angioplastiekatheter entfernt, 20 mg Heparin wurden intraarterial injiziert, um einem distalen Blutgerinsel vorzubeugen. Beide Enden der Iliacarterie wurden mit 10,0 Seide abgedichtet, die 5 mg/ml DNA-Nanopartikelsuspension wurde in jede Iliacarterie über 3 Minuten bei 0,5 atm infundiert. Die Wunde wurde genäht. Die Hasen wurden zwei Wochen nach der Ballonangioplastie und Nanopartikelabgabe getötet. Durch einen vertikalen niedrigeren Abdominaleinschnitt wurden beide Iliacarterien isoliert. Ein 2 cm Segment der Iliacarterie wurde bilateral ausgeschnitten. Die Halsschlagadern vom Hasen wurden als Kontrollprobe herausgenommen. Das Gewebe wurde im flüssigen Stickstoff für das alkaline Phosphataseassay konserviert.
  • 9.2 ERGEBNISSE
  • Die Ergebnisse des Phosphatase-Expressionsassays zeigten, dass eine Nanopartikel plus DNA-Formulierung in der Lage war, Nukleinsäuren an Reparaturzellen in den Iliacarterien von erwachsenen Hasen, die mit einem Ballonkatheter verletzt wurden, abzugeben. Sowohl die rechten als auch die linken Iliacarterien zeigten eine positive Phosphataseaktivität nach dem Aussetzen gegenüber Nanopartikel plus DNA-Formulierungen. In der Kontrollaorta wurde keine Phosphataseaktivität detektiert. Diese positiven Ergebnisse zeigen nach dem Aussetzen gegenüber einer genaktivierten Matrix Reparaturzellen in großen Blutgefäßen Nukleinsäuremoleküle aufnehmen und exprimieren können.
  • Die vorliegende Erfindung soll in ihrem Schutzumfang durch die exemplarischen Ausführungsformen, die als Illustration einzelner Aspekte der Erfindung dienen sollen, nicht begrenzt werden, und alle Klone, DNA- oder Aminosäuresequenzen, die funktionelle Äquivalente darstellen, liegen innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung. In der Tat werden dem Durchschnittsfachmann verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zur vorhergehenden Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen deutlich werden. Solche Modifikationen sollen innerhalb des Schutzumfangs der beigefügten Ansprüche fallen.
  • Es sollte auch deutlich werden, dass alle Basenpaargrößen, die für Nukleotide gegeben werden, Annäherungen sind und zum Zwecke der Beschreibung verwendet wurden.

Claims (9)

  1. Verwendung einer Zusammensetzung, die eine biokompatible Matrix umfasst, welche ein oder mehrere DNA-Moleküle enthält, die therapeutische Proteine, Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Regulation der Angiogenese, wobei die Matrix als ein Gerüst fungiert, das die Infiltration von Zellen begünstigt.
  2. Verwendung einer Zusammensetzung, die eine biokompatible Matrix umfasst, welche ein oder mehrere DNA-Moleküle enthält, die therapeutische Proteine, Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Förderung der Blutgefäßbildung, wobei die Matrix als ein Gerüst fungiert, das die Infiltration von Zellen begünstigt.
  3. Verwendung einer Zusammensetzung, die eine biokompatible Matrix umfasst, welche ein oder mehrere DNA-Moleküle enthält, die therapeutische Proteine, Antisense- oder Ribozym-Moleküle kodieren, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Verwendung zur Hemmung der Blutgefäßbildung, wobei die Matrix als ein Gerüst fungiert, das die Infiltration von Zellen begünstigt.
  4. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eines der DNA-Moleküle für einen Wachstumsfaktor oder ein Cytokin kodiert.
  5. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei mindestens eines der DNA-Moleküle für einen Antiangiogenesefaktor kodiert.
  6. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens eines der DNA-Moleküle für einen Fibroblast Growth Factor (FGF-1, FGF-2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) oder Platelet Derived Growth Factor (PDGF) kodiert.
  7. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei mindestens eines der DNA-Moleküle für Thrombospondin, TGF-β oder Angiostatin kodiert.
  8. Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Matrix kollagenartig, ein Metall, biologisch abbaubares und chemisch definiertes Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxylapatit, Polymilchsäure, ein Polyanhydrid, Bioglas, Aluminat, aus biokeramischen Materialien, aus metallischen Materialien, biokompatiblen und biologisch abbaubaren Polymeren, gereinigten Proteinen oder halbgereinigten extrazellulären Matrixzusammensetzungen ist/besteht.
  9. Verwendung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zellen Gefäßendothelzellen sind.
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