DE69732535T2

DE69732535T2 - Oligonucleotidzusammenstellung und verfahren zur regulierung der protein b7 expression

Info

Publication number: DE69732535T2
Application number: DE69732535T
Authority: DE
Inventors: Frank C. Bennett; A. Timothy VICKERS
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1997-12-16
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2017-12-17
Also published as: KR100452105B1; CA2274581A1; KR20000062274A; ATE289200T1; DE69732535D1; JP2000507833A; EP0957926A1; US6077833A; CA2274581C; AU720969B2; JP3471025B2; EP0957926B1; WO1998029124A1; EP0957926A4; AU5705198A; ES2238083T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Diagnostika, Forschungsreagentien und Therapeutika für Krankheitszustände, die auf eine Modulation der T-Zellenaktivierung ansprechen. Insbesondere betrifft die Erfindung Antisense-Oligonucleotid-Wechselwirkungen mit bestimmten Messenger-Ribonucleinsäuren (mRNA) oder mit DNA, die an der Synthese von Proteinen, die die T-Zellenaktivierung modulieren, teilhat. Es werden Antisense-Oligonucleotide, die zur Hybridisierung an Nucleinsäuren ausgelegt sind, die B7-Proteine kodieren, bereitgestellt. Es wurde festgestellt, dass diese Oligonucleotide eine Modulation der Aktivität der RNA oder DNA und somit eine Modulation der T-Zellenaktivierung bewirken. Das Ergebnis sind palliative, therapeutische und prophylaktische Wirkungen. Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein Antisense-Oligonucleotid zu einem B7-Protein in Kombination mit einem zweiten entzündungshemmenden Mittel, wie einem zweiten Antisense-Oligonucleotid zu einem Protein, das interzelluläre Wechselwirkungen vermittelt, z.B. zu einem interzellulären Adhäsionsmolekül (ICAM)-Protein, umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Entzündung ist eine lokale, durch Gewebe fixierte Schutzreaktion als Antwort auf eine Verletzung, Infektion oder Gewebezerstörung, die zur Zerstörung des infektiösen oder verletzenden Mittels und zur Isolierung des verletzten Gewebes führt. Eine typische Entzündungsreaktion läuft wie folgt ab: Erkennung eines Antigens als fremd oder Erkennung von Gewebeschäden, Synthese und Freisetzung von löslichen Entzündungsmediatoren, Zusammenziehen von Entzündungszellen an der Stelle der Infektion oder des Gewebeschadens, Zerstörung und Entfernung des eindringenden Organismus oder des beschädigten Gewebes und Desaktivierung des Systems nach Auflösung des eindringenden Organismus oder des Schadens. Bei vielen menschlichen Krankheiten mit einer entzündlichen Komponente sind die normalen homöostatischen Mechanismen, die die entzündlichen Reaktionen abschwächen, fehlerhaft und führen zur Beschädigung und Zerstörung von gesundem Gewebe.
In jedem der vorstehend beschriebenen Stadien sind an der Aktivierung der Immunantwort Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligt. Eines der frühesten nachweisbaren Ereignisse bei einer normalen Entzündungsreaktion ist die Adhäsion von Leukozyten an das Gefäß-Endothel und die anschließende Migration der Leukozyten aus dem Gefäßsystem zur Infektions- oder Verletzungsstelle. Im Allgemeinen sind die ersten Entzündungszellen, die an der Entzündungsstelle erscheinen, Neutrophile, gefolgt von Mono- und Lymphozyten. Die Zell-Zell-Wechselwirkungen sind auch für die Aktivierung sowohl der B-Lymphozyten (B-Zellen) als auch T-Lymphozyten (T-Zellen) mit den daraus resultierenden verstärkten humoralen bzw. zellulären Immunantworten kritisch.
Das Kennzeichen des Immunsystems ist seine Fähigkeit, zwischen eigen (Wirt) und nicht eigen (Fremdeindringlinge) zu unterscheiden. Diese bemerkenswerte, vom Immunsystem gezeigte Spezifität wird hauptsächlich durch die T-Zellen vermittelt. Die T-Zellen nehmen an der Abwehr der Infektion durch den Wirt teil, allerdings lösen sie auch Organschäden an transplantierten Geweben aus und tragen bei der Graft-versus-host-Krankheit (GVHD) und einigen Autoimmunerkrankungen zum Zellangriff bei. Zur Auslösung einer Antigen-spezifischen Immunantwort muss eine T-Zelle Signale empfangen, die von einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC) abgegeben werden. Die T-Zellen-APC-Wechselwirkungen können in drei Stadien unterteilt werden. Zelladhäsion, T-Zellen-Rezeptor (TCR)-Erkennung und Co-Stimulation. Mindestens zwei diskrete Signale sind zur Induktion der T-Zellenaktivierung aus einer APC erforderlich. Das erste Signal ist Antigen-spezifisch und wird bereitgestellt, wenn der TCR mit einem Antigen im Zusammenhang mit einem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Protein oder einem MHC-verwandten CD1-Protein wechselwirkt, das auf der Oberfläche einer APC exprimiert wird ("CD" steht für "Differenzierungscluster" und ist ein Begriff, der zur Bezeichnung verschiedener T-Zellen-Oberflächenmoleküle eingesetzt wird). Das zweite (co-stimulatorische) Signal umfasst die Wechselwirkung des T-Zellen-Oberflächenantigens, CD28, mit seinem Liganden auf der APC, der ein Mitglied der B7-Familie der Proteine ist.
CD28, ein Disulfid-verknüpftes Homodimer eines 44-kD-Polypeptids und ein Mitglied der Immunglobulin-Superfamilie, ist einer der hauptsächlichen co-stimulatorischen Signalrezeptoren auf der Oberfläche einer ruhenden T-Zelle zur T-Zellenaktivierung und Cytokinproduktion (Allison, Curr. Opin. Immunol., 1994, 6, 414; Linsley und Ledbetter, Annu. Rev. Immunol., 1993, 11, 191; June et al., Immunol. Today, 1994, 15, 321). Die Signaltransduktion über CD28 wirkt mit der TCR-Signaltransduktion synergistisch, unter Steigerung sowohl der Interleukin-2 (IL-2)-Produktion als auch der Proliferation von nativen T-Zellen. B7-1 (auch bekannt als CD80) war der erste für CD28 identifizierte Ligand (Liu und Linsley, Curr. Opin. Immunl., 1992, 4, 265). B7-1 wird auf den APCs normalerweise in niedrigen Konzentrationen exprimiert, allerdings wird es nach Aktivierung durch Cytokine oder Ligation von Zelloberflächenmolekülen, wie CD40, aufreguliert (Lenschow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 11054; Nahavi et al., Nature, 1992, 360, 266). Erste Studien legten nahe, dass B7-1 der CD28 Ligand war, der die Co-Stimulation vermittelte (Reiser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1992, 89, 271; Wu et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1789; Harlan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1994, 91, 3137). Allerdings führte der spätere Beleg, dass monoklonale Anti-B7-1-Antikörper (mAbs) auf primäre, gemischte Lymphozytenreaktionen minimalen Wirkungen besaßen und dass B7-1-defiziente Mäuse normalerweise auf Antigene reagierten (Lenschow et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 11054; Freemann et al., Science, 1993, 262, 909) zu der Entdeckung eines zweiten Liganden für den CD86-Rezeptor, B7-2 (auch als CD28 bekannt). Im Gegensatz zu anti-B7-1-mAbs, sind anti-B7-2-mAbs potente Inhibitoren der T-Zellenproliferation und Cytokinproduktion (Wu et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1789; Chen et al., J. Immunol., 1994, 152, 2105; Lenschow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1993, 90, 11054). Die B7:CD28-Signalisierung kann eine notwendige Komponente von anderen T-Zellen-costimulatorischen Wegen sein, wie die CD40:CD40L (CD40-Ligand)-Signalisierung (Yang et al., Science, 1996, 273, 1862).
Zusätzlich zum Binden von CD28 binden B7-1 und B7-2 das cytolytische T-Lymphozyten-assoziierte Protein CTLA4. CTLA4 ist ein Protein, das mit CD28 strukturell verwandt ist, allerdings auf T-Zellen nur nach Aktivierung exprimiert wird (Linsley, et. al., J. Exp. Med., 1991, 174, 561). Eine lösliche rekombinante Form von CTLA4, CTLA4-Ig, wurde als wirksamerer Inhibitor der B7:CD28-Wechselwirkung als die monoklonalen Antikörper, die gegen CD28- oder ein B7-Protein gerichtet sind, bestimmt. Die in vivo Behandlung mit CTLA4-Ig führt zur Hemmung der Antikörperbildung gegen Schaf-Erythrozyten oder lösliches Antigen (Linsley et al., Science, 1992, 257, 792), zur Verlängerung der Lebensdauer eines Herz-Homotransplantats und eines Pankreas-Inselzellen-Xenotransplantats (Lin et. al., J. Exp. Med., 1993, 178, 1801; Lenschow et al., 1992, Science, 257, 789; Lenschow et al., Curr. Opin. Immunol., 1993, 5(5), 747–52) und zu einer wesentlichen Unterdrückung der Immunreaktionen bei der GVHD (Hakim et al., J. Immun., 1995, 155, 1760). Es wurde vorgeschlagen, dass CD28 und CTLA4, obwohl beide über gemeinsame B7-Rezeptoren wirken, gegensätzlichen co-stimulatorischen bzw. inhibitorischen Funktionen dienen (Allison et. al., Science, 1995, 270, 932).
Die europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 600 591 , veröffentlicht am B. Juni 1994 (A2), offenbart ein Verfahren zur Hemmung des Tumorzellenwachstums, wobei Tumorzellen aus einem Patienten ex vivo durch DNA-Rekombinationstechnik hergestellt werden, um ein B7-1-Protein zu exprimieren, und anschließend wieder in einen Patienten eingebracht werden. Als Ergebnis wird eine immunologische Reaktion sowohl gegen B7-transfizierte als auch nicht-transfizierte Tumorzellen stimuliert.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/03408, veröffentlicht am 2. Februar 1995, offenbart Nucleinsäuren, die neue CTLA4/CD28-Liganden kodieren, die die T-Zellen-Aktivierung co-stimulieren, einschließlich von B7-2-Proteinen. Ebenfalls offenbart sind Antikörper auf B7-2-Proteine und Verfahren zur Herstellung von B7-2-Proteinen.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/05464, veröffentlicht am 23. Februar 1995, offenbart ein Polypeptid, das anders ist als B7-1, das an CTLA4, CD28 oder CTLA4-Ig bindet. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zum Erhalt einer Nucleinsäure, die ein solches Polypeptid kodiert.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/06738, veröffentlicht am 9. März 1995, offenbart Nucleinsäuren, die B7-2 (auch als B70 bekannt)-Proteine kodieren. Ebenfalls offenbart sind Antikörper auf B7-2-Proteine und Verfahren zur Herstellung von B7-2-Proteinen.
Die europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 643 077 , veröffentlicht am 15. März 1995 (A1), offenbart einen monoklonalen Antikörper, der ein B7-2 (auch als B70 bekannt)-Protein spezifisch bindet. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die ein B7-2-Protein spezifisch binden.
Die U.S.-Patentschrift Nr. 5,434,131, ausgegeben am 18. Juli 1995, offenbart das CTLA4-Protein als Ligand für B7-Proteine. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Herstellung von CTLA4-Fusionsproteinen (z.B. CTLA4-Ig) und Verfahren zur Regulierung der Immunreaktionen unter Verwendung von Antikörpern auf B7-Proteine oder CTLA4-Proteine.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/22619, veröffentlicht am 24. August 1995, offenbart auf B7-1-Proteine spezifische Antikörper, die nicht an B7-2-Proteine binden. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Regulierung der Immunreaktionen unter Verwendung von Antikörpern auf B7-1-Proteine.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/34320, veröffentlicht am 21. Dezember 1995, offenbart Verfahren zur Hemmung der T-Zellen-Reaktionen, unter Verwendung eines ersten Mittels, das ein co-stimulatorisches Mittel hemmt, wie ein CTLA4-Ig-Fusionsprotein, und eines zweiten Mittels, das die Zelladhäsion hemmt, wie ein Anti-LFA-1-Antikörper. Solche Verfahren sind als besonders geeignet zur Hemmung der Abstoßung von transplantierten Geweben Ader Organen angegeben.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 95/32734, veröffentlicht am 7. Dezember 1995, offenbart FcγRII-Verbrückungsmittel, die entweder die Aufregulierung von B7-Molekülen verhindern oder die Expression von ICAM-3 auf Antigen-präsentierenden Zellen beeinträchtigen. Solche FcγRII-Verbrückungsmittel umfassen Proteine, wie aggregierte menschliche IgG-Moleküle oder aggregierte Fc-Fragmente von menschlichen IgG-Molekülen.
Die internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/11279, veröffentlicht am 18. April 1996 (A2) und am 17. Mai 1996 (A3), offenbart rekombinante Viren, die Gensequenzen umfassen, die (1) ein oder mehrere immunstimulatorische Mittel, einschließlich B7-1 und B7-2, und (2) Antigene aus einem Krankheitsverursachenden Mittel kodieren. Ebenfalls offenbart sind Verfahren zur Behandlung von Krankheiten unter Verwendung solcher rekombinanter Viren.
Bisher sind keine therapeutischen Mittel bekannt, die die Expression von B7-Proteinen, wie B7-1 und B7-2, wirksam regulieren und verhindern. Somit besteht seit langem ein Bedarf an Verbindungen und Verfahren, die die kritischen co-stimulatorischen Moleküle, wie die B7-Proteine, wirksam modulieren. Es wird vermutet, dass Oligonucleotide, die in der Lage sind, die Expression von B7-Proteinen zu modulieren, eine neue therapeutische Klasse von entzündungshemmenden Mitteln mit Aktivität gegenüber einer Vielzahl von entzündlichen und Autoimmunerkrankungen oder Störungen oder Krankheiten mit einer entzündlichen Komponente, wie Asthma, juveniler Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Basedow-Krankheit, rheumatoide Arthritis, Homotransplantat-Abstoßung, entzündliche Darmerkrankung, multiple Sklerose, Psoriasis, Lupus erythematodes, systemischer Lupus erythematodes, Diabetes, multiple Sklerose, Kontaktdermatitis, Rhinitis und verschiedene Allergien, bereitstellen. Zusätzlich stellen die Oligonucleotide, die in der Lage sind, die Expression von B7-Proteinen zu modulieren, ein neues Mittel zur Manipulation der ex vivo Proliferation von T-Zellen bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß werden Oligonucleotide bereitgestellt, die spezifisch mit Nucleinsäuren hybridisieren, die B7-1 oder B7-2 kodieren. Bestimmte erfindungsgemäße Oligonucleotide sind dazu ausgelegt, entweder direkt an mRNA zu binden, die von oder zu einem ausgewählten DNA-Teil des B7-1- oder B7-2-Gens transkribiert wird, wodurch die Menge des Proteins, das von einer B7-1- oder B7-2-mRNA translatiert wird, bzw. die Menge an mRNA, die von einem B7-1- oder B7-2-Gen transkribiert wird, moduliert wird.
Die Oligonucleotide können Nucleotidsequenzen umfassen, die in Identität und Anzahl ausreichen, um eine spezifische Hybridisierung mit einer bestimmten Nucleinsäure zu bewirken. Solche Oligonucleotide werden allgemein als "Antisense" beschrieben. Antisense-Oligonucleotide werden in der Regel als Forschungsreagentien, diagnostische Hilfsmittel und therapeutische Mittel verwendet.
Es wurde festgestellt, dass die B7-1- und B7-2-Gene, die die B7-1- bzw. B7-2-Proteine kodieren, diesem Weg besonders zugänglich sind. Als Folge der Assoziierung zwischen B7-Expression und T-Zellen-Aktivierung und -Proliferation bewirkt die Hemmung der Expression von B7-1 oder B7-2 die Hemmung der Synthese von B7-1 bzw. B7-2 und dadurch die Hemmung der T-Zellen-Aktivierung und -Proliferation. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Oligonucleotide zur Hemmung der Expression von einer oder mehreren alternativ gesplicten mRNAs eines B7-Transkripts verwendet werden, was zu einer verstärkten Expression von anderen alternativ gesplicten B7-1-mRNAs führt. Eine solche Modulation ist zur Behandlung verschiedener entzündlicher Erkrankungen oder Autoimmunerkrankungen oder Erkrankungen oder Störungen oder Krankheiten mit einer entzündlichen Komponente, wie Asthma, juveniler Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Basedow-Krankheit, rheumatoide Arthritis, Homotransplantat-Abstoßung, entzündliche Darmerkrankung, multiple Sklerose, Psoriasis, Lupus erythematodes, systemischer Lupus erythematodes, Diabetes, multiple Sklerose, Kontaktdermatitis, Rhinitis, verschiedene Allergien und Krebsarten und ihre Metastasen, wünschenswert. Weiterhin ist eine solche Modulation zur Verhinderung oder Modulierung der Entwicklung solcher Krankheiten oder Störungen in einem Tier erwünscht, das vermutlich oder bekanntlich für solche Krankheiten oder solche Störungen anfällig ist.
Es werden hier Verfahren bereitgestellt, die das Zusammenbringen von Tieren mit Oligonucleotiden, die mit Nucleinsäuren, die B7-Proteine kodieren, spezifisch hybridisierbar sind, umfassen. Die Verfahren sind als Werkzeuge, beispielsweise beim Nachweis und bei der Bestimmung der Rolle der B7-Proteinexpression bei verschiedenen Zell-Funktionen und physiologischen Prozessen und Zuständen und zur Diagnose von Zuständen, die mit einer solchen Expression zusammenhängen, geeignet. Solche Verfahren können zum Nachweis der Expression von B7-Genen (z.B. B7-1 oder B7-2) eingesetzt werden, und somit wird angenommen, dass sie sowohl therapeutisch als auch diagnostisch brauchbar sind. Es werden hier Verfahren zur Modulierung der Expression von B7-Proteinen, die das Zusammenbringen von Tieren mit Oligonucleotiden, die mit einem B7-Gen spezifisch hybridisierbar sind, umfassen, bereitgestellt. Es wird angenommen, dass diese Verfahren als Folge der Assoziation zwischen B7-Expression und T-Zellenaktivierung und -proliferation sowohl therapeutisch als auch diagnostisch brauchbar sind. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren zur Hemmung der B7-assoziierten Aktivierung von T-Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonucleotide. Verfahren zur Behandlung von Zuständen, in denen eine abnorme oder exzessive T-Zellenaktivierung und Proliferation auftritt, werden ebenfalls bereitgestellt. Die Verfahren setzten die erfindungsgemäßen Oligonucleotide ein, und sie werden sowohl als therapeutische als auch als klinische Forschungs- und Diagnosewerkzeuge als brauchbar betrachtet. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können auch zu Forschungszwecken verwendet werden. Somit kann die spezifische Hybridisierung, die von den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden gezeigt wird, für Tests, Reinigungen, Zellprodukt-Präparationen und andere Methoden, die der Fachwelt bekannt sein könnten, verwendet werden.
Die hier offenbarten Verfahren sind beispielsweise auch als klinische Forschungswerkzeuge beim Nachweis und bei der Bestimmung der Rolle der B7-1- oder der B7-2-Expression bei verschiedenen Immunsystemfunktionen und physiologischen Prozessen und Zuständen und zur Diagnose von Zuständen, die mit ihrer Expression einhergehen, brauchbar. Die spezifische Hybridisierung, die von den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden gezeigt wird, kann für Tests, Reinigungen, Zellproduktpräparationen und andere Methoden, die der Fachwelt bekannt sein könnten, verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen Oligonucleotide beispielsweise mit Nucleinsäuren, die B7-Proteine kodieren, spezifisch hybridisieren, können unter Ausnutzung dieser Tatsache leicht Sandwich- und andere Tests konzipiert werden. Der Nachweis der spezifischen Hybridisierung eines erfindungsgemäßen Oligonucleotids mit einer Nucleinsäure, die ein B7-Protein kodiert, das in einer Probe vorhanden ist, kann routinemäßig erzielt werden. Ein solcher Nachweis kann das nachweisbare Markieren eines erfindungsgemäßen Oligonucleotids durch Enzymkonjugation, radioaktives Markieren oder jedes andere beliebige geeignete Nachweissystem umfassen. Eine Anzahl von Tests kann unter Verwendung der vorliegenden Erfindung formuliert werden, wobei die Tests üblicherweise das Zusammenbringen einer Gewebe- oder Zellprobe mit einem nachweisbar markierten erfindungsgemäßen Oligonucleotid unter Bedingungen, die gewählt sind, um die Hybridisierung zu ermöglichen, und Messen einer solchen Hybridisierung durch Nachweis der Markierung, wie es der Fachwelt bekannt ist, umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Balkendiagramm und zeigt die inhibitorische Wirkung der angegebenen Oligonucleotide auf die B7-1-Proteinexpression in COS-7-Zellen.
2 ist eine Dosis-Reaktionskurve und zeigt die inhibitorische Wirkung der Oligonucleotide auf die Zelloberflächenexpression des B7-1-Proteins. Durchgezogene Linie, ISIS 13812; gestrichelte Linie, ISIS 13800; gepunktete Linie, ISIS 13805.
3 ist ein Balkendiagramm und zeigt die inhibitorische Wirkung der angegebenen Oligonucleotide auf die Zelloberflächenexpression von B7-2 in COS-7-Zellen.
4 ist ein Balkendiagramm und zeigt die inhibitorische Wirkung der angegebenen Oligonucleotide, einschließlich ISIS 10373 (ein 20-mer) und ISIS 10996 (ein 15-mer), auf die Zelloberflächenexpression von B7-2 in COS-7-Zellen.
5 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Spezifität der Hemmung der B7-1- oder B7-2-Proteinexpression durch Oligonucleotide. Rechtsschraffierte Balken, B7-1-Konzentrationen; linksschraffierte Balken, B7-2-Konzentrationen.
6 ist eine Dosis-Reaktionskurve und zeigt die inhibitorische Wirkung von Oligonucleotiden mit Antisense-Sequenzen zu ICAM-1 (ISIS 2302) oder B7-2 (ISIS 10373) auf die Zelloberflächenexpression der ICAM-1 und B7-2-Proteine. Durchgezogene Linien mit X, Konzentrationen des B7-1-Proteins auf Zellen, die mit ISIS 10373 behandelt wurden, gestrichelte Linie mit Sternchen, Konzentrationen an ICAM-1-Protein auf Zellen, die mit ISIS 10373 behandelt wurden; durchgezogene Linie mit Dreiecken, Konzentrationen an B7-1-Protein auf Zellen, die mit ISIS 2302 behandelt wurden; durchgezogene Linie mit Rechtecken, Konzentrationen von ICAM-1-Protein auf Zellen, die mit ISIS 10373 behandelt wurden.
7 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Wirkung der angegebenen Oligonucleotide auf die T-Zellen-Proliferation.
8 ist eine Dosis-Reaktionskurve und zeigt die inhibitorische Wirkung der Oligonucleotide auf die murine B7-2-Proteinexpression in COS-7-Zellen. Durchgezogene Linie mit Sternchen, ISIS 11696; gestrichelte Linie mit Dreiecken, ISIS 11866.
9 ist ein Balkendiagramm und zeigt die Wirkung der Oligonucleotide ISIS 11696 und ISIS 11866 auf die Zelloberflächen-Expression von murinem B7-2-Protein in IC-21-Zellen. Linke (schwarze) Balken, kein Oligonucleotid; mittlere Balken, angegebenes Oligonucleotid 3 μm; rechte Balken, angegebenes Oligonucleotid 10 μm.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung setzt zur Verwendung bei der Antisense-Hemmung der Funktion von RNA und DNA, die B7-Proteine, einschließlich von B7-1 und B7-2, kodieren, Oligonucleotide ein. Die vorliegende Erfindung setzt auch Oligonucleotide ein, die dazu ausgelegt sind, mit DNA oder Messenger-RNA (mRNA), die solche Proteine kodiert, spezifisch hybridisierbar zu sein und schließlich die Menge solcher Proteine, die aus ihren entsprechenden Genen transkribiert wurden, zu modulieren. Eine solche Hybridisierung mit mRNA beeinträchtigt die normale Rolle der mRNA und verursacht eine Modulation ihrer Funktion in den Zellen. Die Funktionen der mRNA, die beeinflusst werden sollen, umfassen sämtliche vitalen Funktionen, wie Translokation der RNA an die Stelle der Protein-Translation, tatsächliche Translation von Protein aus der RNA, Splicen der RNA unter Erhalt von einer oder mehreren mRNA-Spezies und möglicherweise auch eine unabhängige katalytische Aktivität, an der die RNA beteiligt sein könnte. Die Gesamtwirkung einer solchen Beeinflussung der mRNA-Funktion ist die Modulierung der Expression eines B7-Proteins, wobei "Modulation" entweder eine Zunahme (Stimulierung) oder Abnahme (Hemmung) der Expression eines B7-Proteins bedeutet. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine Hemmung die bevorzugte Form der Modulation der Genexpression.
Die Oligonucleotide können Nucleotidsequenzen umfassen, die in der Identität und Anzahl ausreichen, um die spezifische Hybridisierung mit einer speziellen Nucleinsäure herbeizuführen. Solche Oligonucleotide, die mit einem Teil des Sense-Strangs eines Gens spezifisch hybridisieren, werden allgemein als "Antisense" beschrieben. Antisense-Oligonucleotide werden üblicherweise als Forschungsreagentien, diagnostische Hilfsmittel und therapeutische Mittel verwendet. Beispielsweise werden Antisense-Oligonucleotide, die in der Lage sind, die Genexpression mit ausgezeichneter Spezifität zu hemmen, oft von der Fachwelt verwendet, um die Funktion von bestimmten Genen aufzuklären, beispielsweise zur Unterscheidung zwischen den Funktionen verschiedener Elemente eines biologischen Weges. Diese spezifische inhibitorische Wirkung hat sich die Fachwelt darum für Forschungszwecke zu Nutze gemacht.
Die Spezifität und Sensitivität der Oligonucleotide wird von der Fachwelt auch für therapeutische Anwendungen genutzt. Beispielsweise zeigen die folgenden U.S.-Patentschriften palliative, therapeutische und andere Verfahren unter Verwendung von Antisense-Oligonucleotiden. Die U.S.-Patentschrift 5,135,917 stellt Antisense-Oligonucleotide bereit, die die menschliche Interleukin-1-Rezeptorexpression hemmen. Die U.S.-Patentschrift 5,098,890 betrifft Antisense-Oligonucleotide, die zu dem c-myb-Oncogen komplementär sind, und Antisense-Oligonucleotidtherapien für bestimmte kanzeröse Leiden. Die U.S.-Patentschrift 5,087,617 stellt Verfahren zur Behandlung von Krebspatienten mit Antisense-Oligonucleotiden bereit. Die U.S.-Patentschrift 5,166,195 stellt Oligonucleotid-Inhibitoren für HIV bereit. Die U.S.-Patentschrift 5,004,810 stellt Oligomere bereit, die in der Lage sind, mit der Herpes simplex-Virus-Vmw65-mRNA zu hybridisieren und die Replikation zu hemmen. Die U.S.-Patentschrift 5,194,428 stellt Antisense-Oligonucleotide mit antiviraler Aktivität gegen das Influenza-Virus bereit. Die U.S.-Patentschrift 4,806,463 stellt Antisense-Oligonucleotide und Verfahren, wobei sie verwendet werden, zur Hemmung der HTLV-III-Replikation bereit. Die U.S.-Patentschrift 5,286,717 stellt Oligonucleotide mit einer zu einem Teil eines Oncogens komplementären Basensequenz bereit. Die U.S.-Patentschrift 5,276,019 und die U.S.-Patentschrift 5,264,423 betreffen Phosphorothioat-Oligonucleotid-Analoge, die zur Verhinderung der Replikation von Fremdnucleinsäuren in Zellen eingesetzt werden. Die U.S.-Patentschrift 4,689,320 betrifft Antisense-Oligonucleotide als antivirale Mittel, die auf CMV spezifisch sind. Die U.S.-Patentschrift 5,098,890 stellt Oligonucleotide bereit, die zu mindestens einem Teil des mRNA-Transkripts des menschlichen c-myb-Gens komplementär sind. Die U.S.-Patentschrift 5,242,906 stellt Antisense-Oligonucleotide bereit, die bei der Behandlung von latenten EBV-Infektionen geeignet sind.
Es ist bevorzugt, den Antisense-Angriff auf spezielle Gene zu richten. Das "Ausrichten" eines Oligonucleotids auf die dazugehörige Nucleinsäure ist in diesem Zusammenhang ein mehrstufiges Verfahren. Das Verfahren beginnt im Allgemeinen mit der Identifizierung einer Nucleinsäuresequenz, deren Funktion moduliert werden soll. Diese kann beispielsweise ein zelluläres Gen (oder mRNA, die aus dem Gen transkribiert worden ist), dessen Expression mit einer bestimmten Störung oder einem Krankheitszustand zusammenhängt, oder eine fremde Nucleinsäure aus einem infektiösen Mittel sein. Bei der vorliegenden Erfindung ist das Ziel ein zelluläres Gen, das mit mehreren Immunsystemstörungen und -krankheiten (wie Entzündung und Autoimmunerkrankungen), sowie mit offensichtlich "normalen" Immunreaktionen (wie die Wirtstier-Abstoßung von transplantiertem Gewebe), für die in bestimmten Fällen die Modulation erwünscht ist, zusammenhängt. Das Ausrichtungsverfahren umfasst auch die Bestimmung einer Region oder von Regionen innerhalb dieses Gens, so dass die Oligonucleotid-Wechselwirkung so erfolgt, dass die gewünschte Wirkung, entweder Nachweis oder Modulation der Expression des Proteins, bewirkt wird. Nach Identifizierung der Zielregion werden Oligonucleotide ausgewählt, die zu dem Ziel komplementär genug sind, d.h. gut genug und mit ausreichender Spezifität hybridisieren, um die gewünschte Wirkung zu ergeben.
Im Allgemeinen existieren fünf Regionen eines Gens, die Ziel der Antisense-Modulation sein können: die untranslatierte 5'-Region (im Folgenden "5'-UTR"), die Translations-Startcodonregion (im Folgenden "tIR") und das offene Leseraster (im Folgenden hier "ORF"), die Translations-Stoppcodonregion (im Folgenden die "tTR") und die untranslatierte 3'-Region (im Folgenden die "3'-UTR"). Wie aus der Technik bekannt, sind diese Regionen in einem typischen Messenger-RNA-Molekül in der folgenden Reihenfolge (von links nach rechts, 5' nach 3') angeordnet: 5'-UTR, tIR, ORF, tTR, 3'-UTR. Wie es aus der Technik bekannt ist, enthalten viele ORFs, obwohl einige eukaryotische Transkripte direkt translatiert werden, eine oder mehrere Sequenzen, die als "Intron" bekannt sind, die aus einem Transkript ausgeschnitten werden, bevor es translatiert wird; die exprimierten (nicht ausgeschnittene) Teile des ORF werden als "Exons" bezeichnet (Albert et al., Molecular Biology of the Cell, 1983, Garland Publishing Inc., New York, Ss. 411–415). Da zudem viele eukaryotische ORFs tausend Nucleotide lang sind, ist es oft zweckmäßig, das ORF zu unterteilen, z.B. die 5'-ORF-Region, die zentrale ORF-Region und die 3'-ORF-Region. In einigen Fällen enthält ein ORF eine oder mehrere Stellen, die aufgrund einer gewissen funktionellen Signifikanz in vivo als Ziel herangezogen werden können. Beispiele für die letzteren Typen von Stellen umfassen intragene Stamm-Schleifen-Strukturen (siehe z.B. U.S.-Patentschrift Nr. 5,512,438) und unbearbeitete mRNA-Moleküle, Intron/Exon-Splicestellen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist eine bevorzugte intragene Stelle die Region, die das Translations-Startcodon des offenen Leserasters (ORF) des Gens umfasst. Da, wie aus der Technik bekannt, das Translations-Startcodon typischerweise 5'-AUG (in transkribierten mRNA-Molekülen; 5'-ATG im entsprechenden DNA-Molekül) ist, wird das Translations-Startcodon auch als "AUG-Codon", Startcodon oder "AUG-Startcodon" bezeichnet. Eine Minderheit der Gene weist ein Translations-Startcodon mit der RNA-Sequenz 5'-GUG, 5'-UUG oder 5'-CUG auf, und 5'-AUA, 5'-ACG und 5'-CUG haben gezeigt, dass sie in vivo funktionieren.
Außerdem funktioniert 5'-UUU als Translations-Startcodon in vitro (Brigstock et al., Growth Factors, 1990, 4, 45; Gelbert et al., Somat. Cell. Mol. Genet., 1990, 16, 173; Gold und Stormo, in: Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology, Bd. 2, 1987, Neidhardt et al., Hrsg. American Society for Microbiology, Washington, D. C., S. 1303). Somit können die Begriffe "Translations-Startcodon" und "Startcodon" viele Codonsequenzen umfassen, obwohl die Starter-Aminosäure in jedem Fall typischerweise Methionin (in Eukaryoten) oder Formylmethionin (Prokaryoten) ist. Es ist aus der Technik auch bekannt, dass eukaryotische und prokaryotische Gene zwei oder mehrere alternative Startcodons aufweisen können, wovon eines vorzugsweise zum Translationsstart in einem bestimmten Zelltyp oder in einem bestimmten Gewebe oder unter einer bestimmten Serie von Zuständen verwendet werden kann, um verwandte Polypeptide mit verschiedenen Amino-terminalen Sequenzen zu erzeugen (Markusen et al., Development, 1995, 121, 3723; Gao et al., Cancer Res., 1995, 55, 743; MC Dermott et al., Gene, 1992, 117, 193; Perri et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 12536; French et al., J. Virol., 1989, 63, 3270; Pushpa-Rekha et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 26993; Monaco et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 347; DeVirgilio et al., Yeast, 1992, 8, 1043; Kanagasundaram et al., Biochim. Biophys. Acta, 1992, 1171, 198; Olsen et al., Mol. Endocrinol., 1991, 5, 1246; Saul et al., Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56, 3117; Yaoita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 7090; Rogers et al., EMBO J., 1990, 9, 2273). Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeuten "Startcodon" und "Translations-Startcodon" das oder die Codons, die in vivo zum Start der Translation eines mRNA-Moleküls verwendet werden, das von einem Gen, das ein B7-Protein kodiert, ohne Rücksicht auf die Sequenz(en) eines solchen Codons transkripiert wird. Es ist auch aus der Technik bekannt, das ein Translations-Startcodon (oder "Stoppcodon") eines Gens eine der drei Sequenzen aufweisen kann, d.h. 5'-UAA, 5'-UAG und 5'-UGA (die entsprechenden DNA-Sequenzen lauten 5'-TAA, 5'-TAG bzw. 5'-TGA). Die Begriffe "Startcodonregion" und "Translations-Startregion" beziehen sich auf einen Teil einer solchen mRNA oder eines Gens, das etwa 25 bis etwa 50 zusammenhängende Nucleotide in einer Richtung (d.h. 5' oder 3') ab einem Translations-Startcodon umfasst. Gleichermaßen bedeuten die Begriffe "Stoppcodonregion" und "Translations-Stoppregion" einen Teil einer solchen mRNA oder eines solchen Gens, das etwa 25 bis etwa 50 zusammenhängende Nucleotide in einer Richtung (d.h. 5' oder 3') ab einem Translations-Stoppcodon umfasst.
Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet der Begriff "Oligonucleotid" ein Oligomer oder Polymer einer Ribonucleinsäure oder Deoxyribonucleinsäure. Der Begriff umfasst Oligonucleotide, bestehend aus natürlich vorkommenden Nucleobasen, Zuckern und kovalenten Interzucker (Hauptkette)-Verknüpfungen, sowie Oligonucleotide mit nicht natürlich vorkommenden Teilen, die ebenso funktionieren. Solche modifizierten oder substituierten Oligonucleotide sind oft aufgrund erwünschter Eigenschaften, wie beispielsweise verstärkte Zellaufnahme, verstärkte Bindung an das Ziel und erhöhte Stabilität in Gegenwart von Nucleasen, gegenüber den nativen Formen bevorzugt.
Spezielle Beispiele für einige bevorzugte modifizierte Oligonucleotide, die bei der Erfindung betrachtet werden, umfassen diejenigen, die Phosphorothioate, Phosphortriester, Methylphosphonate, kurzkettige Alkyl- oder Cycloalkyl-Interzuckerverknüpfungen oder kurzkettige heteroatomare oder heterocyclische Interzuckerverknüpfungen enthalten. Besonders bevorzugt sind Oligonucleotide mit Phosphorothioaten und diejenigen mit CH₂-NH-O-CH₂-, CH₂-N(CH₃)-O-CH₂- [als Methylen(methylimino)- oder MMI-Hauptkette bekannt], CH₂-O-N(CH₃)-CH₂-, CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-CH₂- und O-N(CH₃)-CH₂-CH₂-Hauptketten, wobei die native Phosphodiesterhauptkette als O-P-O-CN₂ dargestellt ist). Ebenfalls bevorzugt sind Oligonucleotide mit Morpholinohauptkettenstruktur (Summerton und Weller, U.S.-Patent 5,034,506). Weiterhin bevorzugt sind Oligonucleotide mit NR-C(*)-CH₂-CH₂-, CH₂-NR-C(*)-CH₂-, CH₂-CH₂-NR-C(*)-, C(*)-NR-CH₂-CH₂- und CH₂-C(*)-NR-CH₂-Hauptketten, wobei "*" O oder S darstellt (als Amidhauptketten bekannt, DeMesmaeker et al., WO 92/20823, veröffentlicht am 26. November 1992). Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen, wie die Peptid-Nucleinsäure (PNA)-Hauptkette, ist die Phosphodiesterhauptkette des Oligonucleotids durch eine Polyamidhauptkette ersetzt, wobei die Nucleobasen direkt oder indirekt an die Azastickstoffatome der Polyamidhauptkette gebunden sind (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497; U.S.-Patent Nr. 5,539,082). Weitere bevorzugte modifizierte Oligonucleotide können eine oder mehrere substituierte Zuckergruppierungen enthalten, die eines der folgenden an der 2'-Position umfassen: OH, SH, SCH₃, F, OCN, OCH₃OCH₃, OCH₃O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nNH₂ oder O(CH₂)_nCH₃, wobei n 1 bis etwa 10 ist; C₁-C₁₀-Niedrigalkyl, Alkoxyalkoxy, substituiertes Niedrigalkyl, Alkaryl oder Aralkyl; Cl; Br; CN; CF₃; OCF₃; O-, S- oder N-Alkyl; O-, S- oder N-Alkenyl; SOCH₃; SO₂CH₃; ONO₂; NO₂; N₃; NH₂; Heterocycloalkyl; Heterocycloalkaryl; Aminoalkylamino; Polyalkylamino; substituiertes Silyl; eine RNA-Spaltungsgruppe; eine Reportergruppe; einen Interkalator; eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonucleotids oder eine Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids und andere Substituenten mit ähnlichen Eigenschaften. Eine bevorzugte Modifikation umfasst 2'-Methoxyethoxy [2'-O-CH₂CH₂OCH₃, das auch als 2'-O-(2-Methoxyethyl) bekannt ist] (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486). Weitere bevorzugte Modifikationen umfassen 2'-Methoxy(2'-O-CH₃), 2'-Propoxy(2'-OCH₂CH₂CH₃) und 2'-Fluor (2'-F). Ähnliche Modifikationen können auch an anderen Positionen am Oligonucleotid, insbesondere in der 3'-Position des Zuckers am 3'-terminalen Nucleotid und an der 5'-Position des 5'-terminalen Nucleotids vorgenommen werden. Die Oligonucleotide können auch Zucker-Mimetica, wie Cyclobutyle, anstelle der Pentofuranosylgruppe aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können zusätzlich oder alternativ Nucleobase-Modifikationen oder -Substitutionen umfassen. Wie hier verwendet, umfassen "unmodifizierte" oder "natürliche Nucleobasen" Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U). Modifizierte Nucleobasen umfassen Nucleobasen, die nur gelegentlich oder vorübergehend in natürlichen Nucleinsäuren vorkommen, z.B. Hypoxanthin, 6-Methyladenin, 5-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin (HMC), Glycosyl HMC und Gentiobiosyl HMC, sowie synthetische Nucleobasen, z.B. 5-Bromuracil, 5-Hydroxymethyluracil, 8-Azaguanin, 7-Deazaguanin, N⁶(6-Aminohexyl)adenin und 2,6-Diaminopurin (Kornberg, A., DNA-Replikation, 1974, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1974, Ss. 75–77; Gebeyehu, G., et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4513).
Eine weitere bevorzugte zusätzliche oder alternative Modifikation der erfindungsgemäßen Oligonucleotide umfasst das chemische Verknüpfen mit dem Oligonucleotid einer oder mehrerer lipophiler Gruppierungen, die die Zellaufnahme des Oligonucleotids verstärken. Solche lipophilen Gruppierungen können mit einem Oligonucleotid an mehreren verschiedenen Positionen am Oligonucleotid verknüpft sein. Einige bevorzugte Positionen umfassen die 3'-Position des Zuckers des 3'-terminalen Nucleotids, die 5'-Position des Zuckers des 5'-terminalen Nucleotids und die 2'-Position des Zucker eines Nucleotids. Die N⁶-Position einer Purinnucleobase kann ebenfalls zur Verknüpfung einer lipophilen Gruppierung mit einem erfindungsgemäßen Oligonucleotid verwendet werden (Gebeyehu, G., et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4513). Solche lipophilen Gruppierungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine Cholesterylgruppierung (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553), Cholinsäure (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053), einen Thioether, z.B. Hexyl-S-tritylthiol (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765), ein Thiocholesterin (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), eine aliphatische Kette, z.B. Dodecandiol- oder Undecylreste (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), ein Phospholipid, z.B. Di-Hexadecyl-rac-glycerin oder Triethylammonium-1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonat (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), eine Polyamin- oder eine Polyethylenglycolkette (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969) oder Adamantanessigsäure (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651), eine Palmitylgruppierung (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229) oder eine Octadecylamin- oder Hexylaminocarbonyloxycholesteringruppierung (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), Oligonucleotide, die lipophile Gruppierungen umfassen, und die Verfahren zur Herstellung solcher Oligonucleotide, wie in den U.S.-Patentschriften Nr. 5,138,045, Nr. 5,218,105 und Nr. 5,459,255 offenbart.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Oligonucleotide, die chimäre Oligonucleotide sind. "Chimäre" Oligonucleotide oder "Chimäre" sind im Zusammenhang mit der Erfindung Oligonucleotide, die zwei oder mehrere chemisch distinkte Regionen enthalten, die jeweils aus mindestens einem Nucleotid aufgebaut sind. Diese Oligonucleotide enthalten typischerweise mindestens eine Region, wobei das Oligonucleotid so modifiziert ist, dass es zu erhöhter Beständigkeit gegenüber einem Nucleaseabbau, erhöhter Zellaufnahme und/oder erhöhter Bindungsaffinität für die Zielnucleinsäure beiträgt. Eine zusätzliche Region des Oligonucleotids kann als Substrat für Enzyme dienen, die in der Lage sind, RNA:DNA- oder RNA:RNA-Hybride zu spalten. Beispielsweise ist die RNase H eine zelluläre Endonuclease, die den RNA-Strang einer RNA:DNA-Doppelhelix spaltet. Die Aktivierung von RNase H führt darum zur Spaltung des RNA-Ziels, wodurch die Wirksamkeit der Antisense-Hemmung der Genexpression stark verstärkt wird. Die Spaltung des RNA-Ziels kann routinemäßig durch Gelelektrophorese und falls notwendig durch die damit zusammenhängenden, aus der Technik bekannten Nucleinsäure-Hybridisierungstechniken nachgewiesen werden. Beispielsweise können solche "Chimäre" "Spalt-mere" sein, d.h. Oligonucleotide, in denen ein zentraler Teil (der "Spalt") des Oligonucleotids als Substrat z.B. für RNase H dient und die 5'- und 3'-Teile (die "Flügel") auf eine solche Weise modifiziert sind, dass sie gegenüber dem Ziel-RNA- Molekül eine größere Affinität aufweisen, allerdings nicht in der Lage sind, die Nucleaseaktivität zu unterstützen (z.B. 2'-Fluor- oder 2'-Methoxyethoxy-substituiert). Weitere Chimäre umfassen "Flügel-mere", d.h. Oligonucleotide, in denen der 5'-Teil des Oligonucleotids als Substrat für z.B. RNase H dient, wobei der 3'-Teil auf eine solche Weise modifiziert wurde, dass er für das Ziel-RNA-Molekül eine größere Affinität besitzt, allerdings nicht in der Lage ist, die Nucleaseaktivität zu unterstützen oder umgekehrt (z.B. 2'-Fluor- oder 2'-Methoxyethoxy-substituiert).
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide umfassen vorzugsweise etwa 8 bis etwa 30 Nucleotide. Es ist mehr bevorzugt, dass solche Oligonucleotide etwa 15 bis 25 Nucleotide umfassen. Wie es aus der Technik bekannt ist, ist ein Nucleotid eine Base-Zucker-Kombination, die zweckmäßigerweise über eine Phosphodiester-, Phosphorothioat- oder eine andere kovalente Bindung an ein angrenzendes Nucleotid gebunden ist.
Die erfindungsgemäß verwendeten Oligonucleotide können zweckmäßigerweise und routinemäßig durch die gut bekannte Technik der Festphasensynthese hergestellt werden. Die Ausrüstung für eine solche Synthese ist von mehreren Anbietern, einschließlich Applied Biosystems (Foster City, CA), im Handel. Zusätzlich oder alternativ kann ein weiteres Mittel für eine solche aus der Technik bekannte Synthese eingesetzt werden. Bekannt ist auch der Einsatz ähnlicher Techniken zur Herstellung anderer Oligonucleotide, wie die Phosphorthioate und die alkylierten Derivate.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können als therapeutische Verbindungen, diagnostische Werkzeuge und als Forschungsreagentien und Kits eingesetzt werden. Der Begriff "therapeutische Anwendungen" soll prophylaktische, palliative und kurative Anwendungen einschließen, wobei die erfindungsgemäßen Oligonucleotide entweder in vivo oder ex vivo mit tierischen Zellen kontaktiert werden. Bei Kontakt mit tierischen Zellen ex vivo umfasst die therapeutische Anwendung die Einschleusung solcher Zellen in ein Tier nach Behandlung mit einem oder mehreren erfindungsgemäßen Oligonucleotiden. Obwohl nicht gewünscht ist, an eine bestimmte Anwendungsmöglichkeit gebunden zu sein, kann die ex vivo Modulation z.B. der T-Zellen-Proliferation durch die erfindungsgemäßen Oligonucleotide beispielsweise bei potentiellen therapeutischen Modalitäten eingesetzt werden, wobei es erwünscht ist, die Expression eines B7-Proteins in APCs zu modulieren. Als Beispiele verstärken erwartungsgemäß Oligonucleotide, die die Expression der B7-1-Proteine hemmen, die Verfügbarkeit der B7-2-Proteine auf der Oberfläche der APCs und erhöhen somit die co-stimulatorische Wirkung von B7-2 auf den T-Zellen ex vivo (Levin et al., Science, 1996, 272, 1939).
Für therapeutische Anwendungen wird ein Tier, von dem vermutet wird, dass es eine Krankheit oder Störung aufweist, die durch Modulieren der Expression oder Aktivität eines B7-Proteins behandelt oder verhindert werden kann, beispielsweise durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Oligonucleotide behandelt. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können in pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Zugabe einer wirksamen Menge eines Oligonucleotids zu einem geeigneten pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Träger verwendet werden. Die Fachleute haben Antisense, Triplex und andere Oligonucleotidzusammensetzungen identifiziert, die in der Lage sind, die Expression von Genen, die an viralen, fungalen und metabolischen Krankheiten beteiligt sind, zu hemmen. Antisense-Oligonucleotide wurden bisher sicher an Menschen verabreicht, und derzeit laufen mehrere klinische Versuche. Es ist somit erwiesen, dass Oligonucleotide geeignete therapeutische Instrumentarien darstellen können, die so konfiguriert sein können, dass sie bei Behandlungsplänen zur Behandlung von Zellen, Geweben und Tieren, insbesondere Menschen, geeignet sind.
Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide können außerdem zum Nachweis des Vorliegens von B7-spezifischen Nucleinsäuren in einer Zell- oder Gewebeprobe verwendet werden. Beispielsweise können radioaktiv markierte Oligonucleotide durch ³²P-Markieren eines 5'-Endes mit Polynucleotidkinase hergestellt werden (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Bd. 2, Ss. 10.59). Sodann wurden die radioaktiv markierten Oligonucleotide mit Zell- oder Gewebeproben kontaktiert, von denen vermutet wird, dass sie B7-Message-RNAs (und somit B7-Proteine) enthalten, und die Proben werden zur Entfernung von ungebundenem Oligonucleotid gewaschen. Die Radioaktivität, die in der Probe verbleibt, zeigt die Gegenwart von gebundenem Oligonucleotid an, das wiederum die Gegenwart von Nucleinsäuren anzeigt, die zu dem Oligonucleotid komplementär sind und unter Verwendung eines Scintillationszählers oder eines anderen Routinegeräts quantitativ bestimmt werden können. Somit ist die Expression von Nucleinsäuren, die diese Proteine kodieren, nachgewiesen.
Die erfindungsgemäßen radioaktiven markierten Oligonucleotide können auch zur Durchführung der Autoradiographie von Geweben zur Bestimmung der Lokalisierung, Verteilung und Menge von B7-Proteinen zu Forschungszwecken, diagnostischen Zwecken oder therapeutischen Zwecken verwendet werden. Bei solchen Studien werden Gewebeschnitte mit radioaktiv markiertem Oligonucleotid behandelt und wie vorstehend beschrieben gewaschen, dann nach den routinemäßigen Autoradiographieverfahren einer photographischen Emulsion ausgesetzt. Die Emulsion ergibt bei der Entwicklung ein Bild von Silberkeimen in den Regionen, die ein B7-Gen exprimieren. Die quantitative Bestimmung der Silberkeime gestattet den Nachweis der Expression der mRNA-Moleküle, die diese Proteine kodieren, und gestattet die Ausrichtung der Oligonucleotide auf diese Bereiche als Ziel.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oligonucleotide, die mit Fluorescein oder anderen fluoreszierenden angehängten Markern konjugiert sind, können, statt des radioaktiven Markierens, analoge Tests zum Fluoreszenznachweis der Expression von B7-Nucleinsäuren entwickelt werden. Solche Konjugationen werden routinemäßig während der Festphasensynthese unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Amiditen oder kontrollierten Porenglas (CPG)-Säulen erzielt. Fluorescein-markierte Amidite und CPG sind beispielsweise von Glen Research, Sterling VA, erhältlich.
Die vorliegende Erfindung verwendet Oligonucleotide, die auf Nucleinsäuren als Ziele gerichtet sind, die B7-Proteine kodieren, und Oligonucleotide, die auf Nucleinsäuren gerichtet sind, die solche Proteine kodieren. Kits zum Nachweis des Vorliegens oder Fehlens der Expression eines B7-Proteins können ebenfalls hergestellt werden. Solche Kits umfassen ein Oligonucleotid, das auf ein entsprechendes Gen gerichtet ist, d.h. ein Gen, das ein B7-Protein kodiert. Entsprechende Kit- und Testformate, wie z.B. der "Sandwich"-Tests, sind aus der Technik bekannt und können leicht zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden übernommen werden. Die Hybridisierung der erfindungsgemäßen Oligonucleotide mit einer Nucleinsäure, die ein B7-Protein kodiert, kann durch aus der Technik bekannte Mittel nachgewiesen werden. Solche Mittel können die Konjugation eines Enzyms mit dem Oligonucleotid, das radioaktive Markieren des Oligonucleotids oder alle anderen geeigneten Nachweissysteme umfassen. Kits zum Nachweis des Vorliegens oder Fehlens eines B7-Proteins können ebenfalls hergestellt werden.
Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet "Hybridisierung" eine Wasserstoffbindung, die eine Watson-Crick-, Hoogsteen- oder eine reverse Hoogsteen-Wasserstoffbindung zwischen komplementären Nucleotiden sein kann. Beispielsweise sind Adenin und Thymin komplementäre Nucleobasen, die sich durch die Bildung von Wasserstoffbindungen paaren. "Komplementär", wie hier verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit zum exakten Paaren zwischen zwei Nucleotiden. Wenn zum Beispiel ein Nucleotid an einer bestimmten Position eines Oligonucleotids zur Wasserstoffbindung mit einem Nucleotid an der gleichen Position eines DNA- oder RNA-Moleküls in der Lage ist, werden das Oligonucleotid und die DNA oder RNA als komplementär zueinander an dieser Position betrachtet. Das Oligonucleotid und die DNA oder RNA sind komplementär zueinander, wenn eine ausreichende Anzahl von entsprechenden Positionen in jedem Molekül durch Nucleotide besetzt ist, die untereinander Wasserstoffbindungen bilden können. Somit sind "spezifisch hybridisierbar" und "komplementär" Begriffe, die eingesetzt werden, um einen ausreichenden Komplementaritätsgrad oder ein exaktes Paaren, derart, dass eine stabile und spezifische Bindung zwischen dem Oligonucleotid und dem DNA- oder RNA-Ziel auftritt, zu bezeichnen. Es ist in der Technik selbstverständlich, dass ein Oligonucleotid nicht zu 100% komplementär zu seiner Ziel-DNA-Sequenz zu sein braucht, um spezifisch hybridisierbar zu sein. Ein Oligonucleotid ist spezifisch hybridisierbar, wenn das Binden des Oligonucleotids an das Ziel-DNA- oder Ziel-RNA-Molekül mit der normalen Funktion der Ziel-DNA- oder Ziel-RNA unter Herbeiführung einer Abnahme oder eines Verlusts der Funktion interferiert und wenn ein ausreichender Grad an Komplementarität besteht, um eine nicht-spezifische Bindung des Oligonucleotids an Nicht-Zielsequenzen unter Bedingungen, wobei ein spezifisches Binden erwünscht ist, d.h. unter physiologischen Bedingungen im Falle von in vivo Tests oder therapeutischer Behandlung oder im Falle von in vitro Tests unter Bedingungen, unter denen die Tests durchgeführt werden, zu vermeiden.
Die Formulierung von therapeutischen Zusammensetzungen und ihre spätere Verabreichung werden als der Fachwelt bekannt angenommen. Im Allgemeinen wird für Therapeutika einem Patient, der einen solchen Therapie bedarf, ein erfindungsgemäßes Oligonucleotid, im Allgemeinen in ein pharmazeutisch verträglichen Träger in Dosen im Bereich von 0,1 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht, in Abhängigkeit vom Alter des Patienten und der Schwere der Störung oder des Krankheitszustands, der behandelt wird, verabreicht. Außerdem kann die Behandlungsvorgabe für eine Zeit andauern, die in Abhängigkeit von der Natur der bestimmten Krankheit oder Störung, ihrer Schwere und dem Gesamtzustand des Patienten variiert und sich von einmal täglich bis einmal alle 20 Jahre erstrecken kann. Nach der Behandlung wird der Patient auf Änderungen in seinem/ihrem Zustand und auf Linderung der Symptome der Störung oder des Krankheitszustands überwacht. Die Dosis des Oligonucleotids kann in dem Fall, dass der Patient nicht ausreichend auf die derzeitigen Dosierungsniveaus anspricht, entweder erhöht werden, oder die Dosis kann herabgesetzt werden, wenn eine Linderung der Symptome der Störung oder des Krankheitszustands festgestellt wird, oder wenn die Störung oder der Krankheitszustand beseitigt worden ist.
In einigen Fällen kann es effektiver sein, einen Patienten mit einem erfindungsgemäßen Oligonucleotid in Verbindung mit anderen therapeutischen Modalitäten zu behandeln, um die Wirksamkeit einer Behandlungsvorgabe zu erhöhen. Im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet der Begriff "Behandlungsvorgabe", dass therapeutische, palliative und prophylaktische Modalitäten eingeschlossen sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Gligonucleotide in Verbindung mit einem oder mehreren Antisense-Oligonucleotiden verwendet, die auf ein interzelluläres Adhäsionsmolekül (ICAM), vorzugsweise ICAM-1, als Ziel gerichtet sind. Weitere entzündungshemmende und/oder immunsuppressive Mittel, die in Kombination mit den erfindungsgemäßen Oligonucleotiden verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, lösliche ICAM-Proteine (z.B. sICAM-1), Antikörper-Toxin-Konjugate, Prednison, Methylprednisolon, Azathioprin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Interferone, Sympathomimetika, herkömmliche Antihistamine (Histamin H₁-Rezeptorantagonisten, einschließlich beispielsweise Brompheniraminmaleat, Chlorpheniraminmaleat, Dexchlorpheniraminmaleat, Tripolidin HCl, Carbinoxaminmaleat, Clemastinfumarat, Dimenhydrinate, Diphenhydramin HCl, Diphenylpyralin HCl, Doxylaminsuccinat, Tripelennamincitrat, Tripelennamin HCl, Cyclizin HCl, Hydroxyzin HCl, Meclizin HCl, Methdilazin HCl, Promethazin HCl, Trimeprazintartrat, Azatadinmaleat, Cyproheptadin HCl, Terfenadin, etc.), Histamin H₂-Rezeptorantagonisten (z.B. Ranitidin). Siehe allgemein The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15. Ausg., Berkow et al., Hrsg. 1987, Rahway, N. J., Seite 302–336 und 2516–2522). Bei Verwendung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen können solche Mittel einzeln, nacheinander oder in Kombination mit einem oder mehreren solcher Mittel verwendet werden.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Antisense-Oligonucleotid, das auf eine B7-mRNA-Spezies (d.h. B7-1) gerichtet ist, in Kombination mit einem Antisense-Oligonucleotid, das auf eine zweite B7-mRNA-Spezies (z.B. B7-2) gerichtet ist, verwendet, um die co-stimulatorische Wirkung der B7-Moleküle zu einem ausgedehnteren Ausmaß zu hemmen als es mit einem einzeln verwendeten Nucleotid erreicht werden kann. Bei einer verwandten Version dieser Ausführungsform werden zwei oder mehrere erfindungsgemäße Oligonucleotide, die jeweils auf eine alternativ gesplicte B7-1- oder B7-2-mRNA als Ziel gerichtet sind, miteinander kombiniert, um die Expression von beiden Formen der alternativ gesplicten mRNAs zu hemmen. Es ist aus der Technik bekannt, dass in Abhängigkeit von der Spezifität des eingesetzten modulierenden Mittels die Hemmung von 1 Form einer alternativ gesplicten mRNA nicht zu einer ausreichenden Reduktion der Expression für einen gegebenen zu manifestierenden Zustand führen kann. Somit können solche Kombinationen in einigen Fällen erwünscht sein, um die Expression eines bestimmten B7-Gens in dem Maße zu hemmen, das zur Durchführung von einem der erfindungsgemäßen Verfahren notwendig ist.
Nach einer erfolgreichen Behandlung kann es erwünscht sein, dass man den Patienten eine Erhaltungstherapie zur Verhinderung des Wiederauftretens des Krankheitszustands durchlaufen lässt, wobei das Oligonucleotid in Erhaltungsdosen im Bereich von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht, einmal oder mehrmals täglich bis einmal alle 20 Jahre, verabreicht wird. Im Falle eines Individuums, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es gegenüber einem autoimmunen oder entzündlichen Zustand empfindlich ist, können durch Verabreichung von präventiven Dosen im Bereich von 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht ein oder mehrmals täglich bis einmal alle 20 Jahre prophylaktische Wirkungen erreicht werden. Gleichermaßen kann ein Individuum gegenüber einem entzündlichen Zustand, der erwartungsgemäß als Ergebnis einer medizinischen Behandlung auftritt, z.B. Graft-versus-host-Reaktion aufgrund der Transplantation von Zellen, Gewebe oder einem Organ in das Individuum weniger empfindlich gemacht werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf einer Anzahl von Wegen, in Abhängigkeit davon, ob eine lokale oder systemische Behandlung gewünscht wird, und von dem Bereich, der zu behandeln ist, verabreicht werden. Die Verabreichung kann topisch (einschließlich ophthalmisch, vaginal, rektal, intranasal, transdermal), oral oder parenteral erfolgen. Die parenterale Verabreichung umfasst intravenöser Tropf, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion oder intrathekale oder intraventrikuläre Verabreichung.
Die Formulierungen zur topischen Verabreichung können Transdermalpflaster, Salben, Lotionen, Cremes, Gele, Tropfen, Suppositorien, Sprays, Flüssigkeiten und Puder umfassen. Herkömmliche pharmazeutische Träger, wässrige, puderige oder ölige Grundlagen, Verdicker und dergleichen können notwendig oder erwünscht sein. Beschichtete Kondome, Handschuhe und dergleichen können ebenfalls geeignet sein.
Die Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung umfassen Pulver oder Granulatkörner, Suspensionen oder Lösungen in Wasser oder in nichtwässrigen Medien, Kapseln, Tütchen oder Tabletten. Verdicker, Aromastoffe, Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Dispersionshilfen oder Bindemittel können erwünscht sein.
Die Zusammensetzungen zur parenteralen, intrathekalen oder intraventrikulären Verabreichung können sterile wässrige Lösungen einschließen, die auch Puffer, Verdünnungsmittel und andere geeignete Hilfsstoffe enthalten können.
Die Dosierung ist von der Schwere und von der Ansprechbarkeit des zu behandelnden Krankheitszustands abhängig, wobei der Verlauf der Behandlung von mehreren Tagen bis mehreren Monaten oder bis eine Heilung herbeigeführt oder eine Minderung des Krankheitszustands erreicht wurde, dauert. Die optimalen Dosierungspläne können aus den Messungen der Arzneimittelakkumulation im Körper des Patienten berechnet werden. Die Fachwelt kann die optimalen Dosierungen, Dosierungsverfahren und Wiederholungsraten leicht bestimmen. Die optimalen Dosierungen können in Abhängigkeit von der relativen Potenz der individuellen Oligonucleotide variieren und können bezogen auf die ECs₅₀ allgemein abgeschätzt werden, die bei in vitro und in vivo Tiermodellen als wirksam befunden wurden. Im Allgemeinen beträgt die Dosis 0,01 μg bis 100 g pro kg Körpergewicht und kann ein oder mehrmals täglich, wöchentlich, monatlich oder jährlich oder sogar einmal alle zwei bis 20 Jahre verabreicht werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Synthese der Nucleinsäuren
Oligonucleotide
Die Oligonucleotide wurden auf einem automatischen DNA-Synthesegerät unter Verwendung der Phosphoramidit-Standardchemie mit Oxidation unter Verwendung von Iod synthetisiert. Die B-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite wurden von der Firma Applied Biosystems (Foster City, CA) bezogen. Für die Phosphorothioat-Oligonucleotide wurde die Oxidationsstandardflasche durch eine 0,2 M Lösung von 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Acetonitril zur schrittweisen Thiierung der Phosphitverknüpfungen ersetzt. Der Thiierungscyclus-Warteschritt wurde auf 68 s erhöht, worauf der Kappungsschritt folgte.
Die erfindungsgemäßen 2'-Fluorphosphorothioatoligonucleotide wurden unter Verwendung von 5'-Dimethoxytrityl-3'-phosphoramiditen synthetisiert und wie in der U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennummer 463,358, eingereicht am 11. Januar 1990, und mit der Seriennummer 566,977, eingereicht am 13. August 1990, die dem gleichen Anmelder zugeordnet sind wie die vorliegende Anmeldung und die unter Bezugnahme mit umfasst sind, hergestellt. Die 2'-Fluoroligonucleotide wurden unter Anwendung der Phosphoramiditchemie und einer leichten Abänderung des DNA-Synthese-Standardprotokolls hergestellt: die Schutzgruppenentfernung wurde unter Verwendung von methanolischem Ammoniak bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die erfindungsgemäßen 2'-Methoxy(2'-O-methyl)oligonucleotide wurden unter Verwendung von 2'-Methoxy-β-cyanoethyldiisopropylphosphoramiditen (Chemgenes, Needham, MA) und des Standardcyclus für unmodifizierte Oligonucleotide, mit der Ausnahme, dass der Warteschritt nach der gepulsten Abgabe von Tetrazol und Base auf 360 s erhöht wird, synthetisiert. Weitere 2'-Alkoxyoligonucleotide werden durch eine Modifikation dieses Verfahrens unter Anwendung entsprechender 2'-modifizierter Amidite, wie diejenigen, die von Glen Research, Inc., Sterling, VA im Handel sind, synthetisiert. Die 3'-Base, die zum Start der Synthese verwendet wird, war ein 2'-Deoxyribonucleotid. Die erfindungsgemäßen 2'-O-Propyloligonucleotide werden durch eine leichte Abänderung des Verfahrens hergestellt.
Die erfindungsgemäßen 2'-Methoxyethoxy-(2'-O-CH₂CH₂OCH₃)-Oligonucleotide wurden nach dem Verfahren von Martin, Helv. Chim. Acta 1995, 78, 486, hergestellt. Zur leichten Synthese war das letzte Nucleotid ein Desoxynucleotid. Sämtliche 2'-O-CH₂CH₂OCH₃-Cytosine waren 5- Methylcytosine, die nach den folgenden Verfahrensweisen synthetisiert wurden.
Synthese der 5-Methylcytosinmonomere:
2,2'-Anhydro[1-(β-D-arabinofuranosyl)-5-methyluridin]
5-Methyluridin (Ribosylthymin, im Handel erhältlich von Yamasa, Choshi, Japan) (72,0 g, 0,279 M), Diphenylcarbonat (90,0 g, 0,420 M) und Natriumbicarbonat (2,0 g, 0,024 M) wurden zu DMF (300 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Rühren zum Rückfluss erhitzt, wobei das kontrollierte Entweichen des entwickelten Kohlendioxidgases ermöglicht wurde. Nach 1 h wurde die leicht verdunkelte Lösung unter reduziertem Druck konzentriert. Der resultierende Sirup wurde unter Rühren in Diethylether (2,5 l) gegossen. Das Produkt bildete einen Gummi. Der Ether wurde abdekantiert, und der Rückstand wurde in einer möglichst geringen Menge Methanol (ca. 400 ml) gelöst. Die Lösung wurde unter Erhalt eines starren Gummis in frischen Ether (2,5 l) gegossen. Der Ether wurde abdekantiert, und der Gummi wurde in einem Vakuumofen (60°C bei 1 mmHg für 24 h) unter Erhalt eines Feststoffs getrocknet, der zu einem hellbraunen Pulver (57 g, 85 Rohausbeute) zerkleinert wurde. Das Material wurde wie es ist für die weiteren Reaktionen eingesetzt.
2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin
2,2'-Anhydro-5-methyluridin (195 g, 0,81 M), Tris(2-methoxyethyl)borat (231 g, 0,98 M) und 2-Methoxyethanol (1,2 l) wurden einem 2-l-Edelstahl-Druckkessel zugesetzt und in ein vorgeheiztes Ölbad bei 160°C verbracht. Nach 48 h Erhitzen bei 155–160°C wurde das Gefäß geöffnet und die Lösung zur Trockene eingedampft und mit MeOH (200 ml) verrieben. Der Rückstand wurde in heißem Aceton (1 l) suspendiert. Die unlöslichen Salze wurden abfiltriert, mit Aceton (150 ml) gewaschen und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand (280 g) wurde in CH₃CN (600 ml) gelöst und eingedampft. Eine Kieselgelsäule (3 kg) wurde in CH₂Cl₂/Aceton/MeOH (20:5:3), enthaltend 0,5% Et₃NH, gepackt. Der Rückstand wurde in CH₂Cl₂ (250 ml) gelöst und vor dem Laden auf die Säule an Kieselgel (150 g) adsorbiert. Das Produkt wurde mit dem Packungslösungsmittel unter Erhalt von 160 g (63%) Produkt eluiert.
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
2'-O-Methoxyethyl-5-methyluridin (160 g, 0,506 M) wurde mit Pyridin (250 ml) co-eingedampft und der getrocknete Rückstand in Pyridin (1,3 l) gelöst. Ein erstes Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 h gerührt. Ein zweites Aliquot von Dimethoxytritylchlorid (94,3 g, 0,278 M) wurde zugesetzt und die Reaktion für eine weitere Stunde gerührt. Sodann wurde Methanol (170 ml) zum Stoppen der Reaktion zugesetzt. HPLC zeigte das Vorliegen von etwa 70% Produkt. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und mit CH₃CN (200 ml) verrieben. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (1,5 l) gelöst und mit 2 × 500 ml gesättigtem NaHCO₃ und 2 × 500 ml gesättigtem NaCl extrahiert. Die organische Phase wurde über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft. Es wurden 275 g Rückstand erhalten. Der Rückstand wurde über eine 3,5-kg-Kieselgelsäule, gepackt und eluiert mit EtOAc/Hexan/Aceton (5:5:1), enthaltend 0,5% Et₃NH, gereinigt. Die reinen Fraktionen wurden unter Erhalt von 164 g Produkt eingedampft. Aus den unreinen Fraktionen wurden zusätzlich etwa 20 g, unter Erhalt einer Gesamtausbeute von 183 g (57%), erhalten.
3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin (106 g, 0,167 M), DMF/Pyridin (750 ml eines 3:1 Gemisches, hergestellt aus 562 ml DMF und 188 ml Pyridin) und Essigsäureanhydrid (24,38 ml, 0,258 M) wurden kombiniert und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch TLC überwacht, indem zuerst die TLC-Probe durch Zugabe von MeOH gestoppt wurde. Nach Abschluss der Reaktion, wie durch TLC beurteilt, wurde MeOH (50 ml) zugesetzt und das Gemisch bei 35°C, eingedampft. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (800 ml) gelöst und mit 2 × 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 2 × 200 ml gesättigtem NaCl extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden mit 200 ml CHCl₃ rückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Natriumsulfat getrocknet und unter Erhalt von 122 g Rückstand (etwa 90% Produkt) eingedampft. Der Rückstand wurde über eine 3,5-kg-Kieselgelsäule gereinigt und unter Verwendung von EtOAc/Hexan (4:1) eluiert. Die reinen Produktfraktionen wurden unter Erhalt von 96 g (84%) eingedampft.
3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin
Eine erste Lösung wurde durch Auflösen von 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyluridin (96 g, 0,144 M) in CH₃CN (700 ml) hergestellt und stehen gelassen. Triethylamin (189 ml, 1,44 M) wurde einer Lösung von Triazol (90 g, 1,3 M) in CH₃CN (1 l) zugesetzt, auf –5°C abgekühlt und unter Verwendung eines Overheadrührers 0,5 h gerührt. der Der gerührten, bei 0–10°C gehaltenen Lösung wurde POCl₃ in einem Zeitraum von 30 min zugetropft, und das resultierende Gemisch wurde weitere 2 h gerührt. Die erste Lösung wurde der letzteren Lösung während eines Zeitraums von 45 min zugetropft. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde über Nacht in einem kalten Raum aufbewahrt. Die Salze wurden von dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und die Lösung wurde eingedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (1 l) gelöst, und die unlöslichen Feststoffe wurden durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde mit 1 × 300 ml NaHCO₃ und 2 × 300 ml gesättigtem NaCl gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde unter Erhalt der Titelverbindung mit EtOAc verrieben.
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin
Eine Lösung von 3'-O-Acetyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methyl-4-triazoluridin (103 g, 0,141 M) in Dioxan (500 ml) und NH₄OH (30 ml) wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Dioxanlösung wurde eingedampft und der Rückstand mit MeOH (2 × 200 ml) azeotropiert. Der Rückstand wurde in MeOH (300 ml) gelöst und in ein 2-l-Edelstahl-Druckgefäß übergeführt. MeOH (400 ml), gesättigt mit NH₃-Gas, wurde zugesetzt und das Gefäß 2 h auf 100°C erhitzt (TLC zeigte die vollständige Umwandlung). Der Gefäßinhalt wurde zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wurde in EtOAc (500 ml) gelöst und einmal mit gesättigtem NaCl (200 ml) gewaschen. Die organischen Stoffe wurden über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter Erhalt von 85 g (95%) der Titelverbindung eingedampft.
N⁴-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-amidit
2'-O-Methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin (85 g, 0,134 M) wurde in DMF (800 ml) gelöst und Benzoesäureanhydrid (37,2 g, 0,165 M) wurde unter Rühren zugesetzt. Nach 3 h Rühren zeigte TLC, dass die Reaktion zu etwa 95% beendet war. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und der Rückstand mit MeOH (200 ml) azeotropiert. Der Rückstand wurde in CHCl₃ (700 ml) gelöst und mit gesättigtem NaHCO₃ (2 × 300 ml) und gesättigtem NaCl (2 × 300 ml) extrahiert, über MgSO₄ getrocknet und unter Erhalt eines Rückstandes (96 g) eingedampft. Der Rückstand wurde über eine 1,5-kg-Kieselgelsäule unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1:1), enthaltend 0,5% Et₃NH, als Elutionsmittel chromatographiert. Die reinen Produktfraktionen wurden unter Erhalt von 90 g (90%) der Titelverbindung eingedampft.
N⁴-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-amidit
N⁴-Benzoyl-2'-O-methoxyethyl-5'-O-dimethoxytrityl-5-methylcytidin-3'-amidit (74 g, 0,10 M) wurde in CH₂Cl₂ (1 l) gelöst. Tetrazoldiisopropylamin (7,1 g) und 2-Cyanoethoxy-tetra-(isopropyl)phoshit (40,5 ml, 0,123 M) wurden unter Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 20 h bei Raumtemperatur gerührt (TLC zeigte, dass die Reaktion zu 95% beendet war). Das Reaktionsgemisch wurde mit gesättigtem NaHCO₃ (1 × 300 ml) und gesättigtem NaCl (3 × 300 ml) extrahiert. Die wässrigen Waschlösungen wurden mit CH₂Cl₂ (300 ml) rückextrahiert, und die Extrakte wurden vereinigt, über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde über eine 1,5-kg-Kieselgelsäule unter Verwendung von EtOAc/Hexan (3:1) als Elutionsmittel chromatographiert. Die reinen Fraktionen wurden unter Erhalt von 90,6 g (87%) der Titelverbindung vereinigt.
Reinigung:
Nach der Abspaltung von der kontrollierten Porenglassäule (Applied Biosystems) und Entblockieren in konzentriertem Ammoniumhydroxid, 18 h bei 25°C, wurden die Oligonucleotide durch zweimaliges Ausfällen aus 0,5 M NaCl mit 2,5 Volumina Ethanol gereinigt. Die analytische Gelelektrophorese wurde in 20% Acrylamid, 8 M-Harnstoff, 45 mM Tris-Boratpuffer, pH 7,0, durchgeführt. Die Oligonucleotide und ihre Phosphorothioat-Analoge wurden gemäß Elektrophorese zu mehr als 80% als Volllängen-Material beurteilt.
Eine Serie der Oligonucleotide mit Sequenzen, die dazu ausgelegt waren, an die veröffentlichten menschlichen B7-1 (hB7-1)- und murinen (mB7-1)-mRNA-Sequenzen (Freeman et al., J. Immunol., 1989, 143, 2714 bzw. Freeman et al., J. Exp. Med., 1991, 174, 625) zu hybridisieren, wurde synthetisiert. Die Sequenzen und Modifikationen dieser Oligonucleotide und die Lage ihrer jeweiligen Zielstellen auf der hB7-1-mRNA sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Gleichermaßen wurde eine Serie von Oligonucleotiden mit Sequenzen, die zur Hybridisierung an die veröffentlichten menschlichen B7-2 (hB7-2)- und murinen B7-2 (mB7-2)-mRNA-Sequenzen (Azuma et al., Nature, 1993, 366, 76; Chen et al., J. Immunol., 1994, 152, 4929) ausgelegt waren, synthetisiert. Die Sequenzen und Modifikationen dieser Oligonucleotide und jeweils die Lage ihrer Zielstellen auf der hB7-2-mRNA sind in den Tabellen 3 und 4 beschrieben. Antisense-Oligonucleotide, die auf ICAM-1 als Ziel gerichtet waren, einschließlich ISIS-2302 (SEQ-ID-NR. 17), wurden bereits in der U.S.-Patentschrift Nr. 5,514,788, ausgegeben am 7. Mai 1996, beschrieben. ISIS 1082 (SEQ-ID-NR. 102) und ISIS 3082 (SEQ-ID-NR. 101) wurden bereits beschrieben (Stepkowski et al., J. Immunol., 1994, 153, 5336).
Im Anschluss an ihr Klonieren zu Beginn wurden alternative Splicing-Ereignisse der B7-Transcripte beschrieben. Das beschriebene alternative Splicing für B7-1 ist insofern relativ einfach, als es Botschaften ergibt, die relativ zu dem 5'-Terminus der menschlichen und murinen B7-1-cDNA-Sequenzen, die ursprünglich beschrieben wurden (Borriello et al., J. Immunol., 1994, 153, 5038; Inobe et al., J. Immunol., 1996, 157, 588), 5' verlängert sind. Um die Nummerierung der B7-1-Sequenzen beizubehalten, die in den Druckschriften gefunden wird, die ursprünglich die B7-1-Sequenzen beschreiben, wurden in den Tabellen 1 und 2 den Positionen innerhalb dieser 5'-Extensionen der ursprünglich beschriebenen Sequenzen negative Zahlen gegeben (beginnen mit Position 1, der am meisten 3' gelegenen Base der 5'-Extension). Die Bearbeitung der murinen B7-2-Transkripte ist beträchtlich komplexer als bisher für B7-1 beschrieben; beispielsweise können mindestens fünf distinkte murine B7-2-mRNAs und mindestens zwei distinkte menschliche B7-2-mRNAs durch alternatives Splicing-Ereignisse hergestellt werden (Borriello et al., J. Immunol., 1995, 155, 5490; Freeman et al., WO 95/03408, veröffentlicht am 2. Februar 1995; siehe auch Jellis et al., Immunogenet., 1995, 42, 85). Die Natur dieser Splicing-Ereignisse ist so, dass verschiedene 5'-Exons zur Herstellung distinkter B7-2-mRNAs verwendet werden, die jeweils eine einzigartige 5'-Sequenz aufweisen, allerdings einen 3'-Teil, bestehend aus einem Teil oder aus der gesamten ursprünglich beschriebenen B7-2-Sequenz, gemeinsam haben. Als Ergebnis können die Positionen innerhalb der 5'-Extensionen der B7-2-Botschaften nicht ausschließlich mit einer Position innerhalb der ursprünglich beschriebenen Sequenz in Zusammenhang gebracht werden. Demnach wird in Tabelle 3 eine verschiedene Serie von Koordinaten (entsprechend denjenigen der SEQ-ID. NR. 1 der WO 95/03408) und in Tabelle 4 die Exon-Zahl (wie bei Borriello et al., J. Immunol., 1995, 155, 5490 angegeben) eingesetzt, um die Lage der Zielsequenzen zu spezifizieren, die nicht in der ursprünglich beschriebenen B7-2-Sequenz eingeschlossen sind. Obwohl diese 5'-verlängerten Botschaften potentielle Raster-interne Startcodons stromaufwärts von denjenigen enthalten, die in den ursprünglich beschriebenen Sequenzen angegeben sind, sind zur Vereinfachung solche zusätzlichen potentiellen Startcodons nicht in der Beschreibung der Zielstellen in den Tabellen 1–4 angegeben.
In den Tabellen 1–4 werden die folgenden Abkürzungen verwendet: UTR, untranslatierte Region; ORF, offenes Leseraster; tIR, Translations-Startregion; tTR, Translations-Stoppregion; FITC, Fluoresceinisothiocyanat. Die chemischen Modifikationen sind wie folgt bezeichnet. Reste mit den Modifikationen 2'-Fluor (2'F), 2'-Methoxy (2'MO) oder 2'-Methoxyethoxy (2'ME) sind in Großbuchstaben angegeben, wobei der Typ der Modifikation durch die entsprechenden Abkürzungen angeben ist. Wenn nicht anderweitig angegeben, sind die Verknüpfungen zwischen den Resten Phosphodiester-Bindungen; die Phosphorothioat-Bindungen sind durch ein "S" in der hochgestellten Position (z.B. T^SA) angegeben. Die Zielpositionen sind nach Freeman et al., J. Immunol., 1989, 143: 2714 (menschliche B7-1-cDNA-Sequenzen; Tabelle 1), Freeman et al., J. Exp. Med., 1991, 174, 625 (murine B7-1-cDNA-Sequenz; Tabelle 2), Azuma et al., Nature, 1993, 366: 76 (menschliche B7-2-cDNA-Sequenz; Tabelle 3) und Chen et al., J. Immunol., 1994, 152: 4929 (murine B7-2-cDNA-Sequenz; Tabelle 4) nummeriert. Die Nucleotidbasen-Codes sind wie in 37 C. F. R. § 1.822 (b) (1) angegeben.
cDNA-Klone:
Eine cDNA, die die Sequenz für menschliches B7-1 kodiert, wurde unter Verwendung der reversen Transkription/Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) isoliert. Poly A+ RNA aus Daudi-Zellen (ATCC-Zugangs-Nr. CCL 213) wurde unter Verwendung von Oligo-dT-Primer unter Standardbedingungen revers transkribiert. Nach 30 min Umsetzung bei 42°C und Wärmeinaktivierung wurde das Reaktionsgemisch (20 μl) mit Wasser auf 100 μl gebracht. Ein 10-μl-Aliquot der RT-Reaktion wurde sodann in einer 50-μl-PCR-Reaktion unter Verwendung des 5'-Primers
5'-GAT-CAG-GGT-ACC-CCA-AAG-AAA-AAG-TGA-TTT-GTC-ATT-GC-3' (Sense, SEQ-ID. NR. 20),
und des 3'-Primers
5'-GAT-AGC-CTC-GAG-GAT-AAT-GAA-TTG-GCT-GAC-AAG-AC-3' (Antisense, SEQ-ID. NR. 21) modifiziert.
Die Primer umfassten einzigartige Restriktionsstellen zum Subklonieren des PCR-Produkts in den Vector pcDNA-3 (Invitrogen, San Diego, CA). Der 5'-Primer war so ausgelegt, dass er mit den Basen 1 bis 26 der veröffentlichten menschlichen B7-1-Sequenz Identität (Freeman et al., J. Immunol., 1989, 143, 2714; Positionen 13–38 des Primers) aufwies und eine KpnI-Restriktionsstelle (Positionen 7–12 des Primers) zur Verwendung beim Klonieren einschloss. Der 3'-Primer war so ausgelegt, dass er zu den Basen 1450 bis 1471 der veröffentlichten Sequenz für B7-1 (Positionen 14–35 des Primers) komplementär ist und eine XhoI-Restriktionsstelle (Positionen 7–12 des Primers) einschließt. Nach der PCR wurde die Reaktion mit Phenol extrahiert und unter Verwendung von Ethanol ausgefällt. Das Produkt wurde mit den entsprechenden Restriktionsenzymen abgebaut und das Volllängenfragment durch Agarosegel gereinigt und in den Vector pcDNA-3 (Invitrogen, San Diego, CA), hergestellt durch Abbau mit den gleichen Enzymen, ligiert. Das resultierende Konstrukt pcB7-1 wurde durch Restriktionskartieren und DNA-Sequenzanalyse unter Anwendung von Standardverfahren bestätigt. Ein Maus-B7-1-Klon, pcmB7-1, wurde auf ähnliche Weise durch RT-PCR von RNA, isoliert aus einer murinen B-Lymphozytenzelllinie 70Z3, isoliert.
Eine cDNA, die die Sequenz für menschliches B7-2, Position 1 bis 1391, kodiert, wurde ebenfalls durch RT-PCR isoliert. Poly A+ RNA aus Daudi-Zellen (ATCC-Zugangs-Nr. CCL 213) wurde unter Verwendung von Oligo-dT-Primer unter Standardbedingungen revers transkripiert. Im Anschluss an eine 30 min Reaktion bei 42°C und Wärmeinaktivierung wurde das Reaktionsgemisch (20 μl) mit Wasser auf 100 μl gebracht. Ein 10-μl-Aliquot der RT-Reaktion wurde sodann in einer 50-μl-PCR-Reaktion unter Verwendung des 5'-Primers
5'-GAT-CAG-GGT-ACC-AGG-AGC-CTT-AGG-AGG-TAC-GG-3' (Sense, SEQ-ID. NR. 1), und des 3'-Primers
5'-GAT-AGC-CTC-GAG-TTA-TTT-CCA-GGT-CAT-GAG-CCA-3' (Antisense, SEQ-ID. NR. 2) amplifiziert.
Der 5'-Primer war so ausgelegt, dass er mit den Basen 1–20 der veröffentlichten B7-2-Sequenz (Azuma et al., Nature, 1993, 366, 76 und Genbank Zugangs-Nr. L25259; Positionen 13–32 des Primers) Identität aufweist und eine KpnI-Stelle (Positionen 7–12 des Primers) zur Verwendung beim Klonieren einschließt. Der 3'-Primer war so ausgelegt, dass er Komplementarität zu den Basen 1370–1391 der veröffentlichten Sequenz für B7-2 (Positionen 13–33 des Primers) aufweist und eine XhoI-Restriktionsstelle (Positionen 7–12 des Primers) einschließt. Nach der PCR-Reaktion wurde die Reaktion mit Phenol extrahiert und unter Verwendung von Ethanol ausgefällt. Das Produkt wurde mit XhoI und KpnI abgebaut und das Volllängenfragment durch Agarosegel gereinigt und in den Vector pcDNA-3 (Invitrogen, San Diego, CA), hergestellt durch Abbau mit den gleichen Enzymen, ligiert. Das resultierende Produkt, pcB7-2, wurde durch Restriktionskartieren und DNA-Sequenzanalyse unter Anwendung von Standardverfahren bestätigt.
Ein Maus-B7-2-Klon, pcmB7-2, wurde auf ähnliche Weise durch RT-PCR von RNA, isoliert aus P388D1-Zellen, unter Verwendung des 5'-Primers
5'-GAT-CAG-GGT-ACC-AAG-AGT-GGC-TCC-TGT-AGG-CA (Sense, SEQ-ID. NR. 99)
und des 3'-Primers
5'-GAT-AGC-CTC-GAG-CTA-GAA-TTC-CAA-TCA-GCT-GA (Antisense, SEQ-ID. NR. 100) isoliert.
Der 5'-Primer wies mit den Basen 1–20 Identität auf, wohingegen der 3'-Primer zu den Basen 1096–1115 der veröffentlichten murinen B7-2-Segeunz (Chen et al., J. Immun., 1994, 152, 4929) komplementär ist. Beide Primer umfassen die jeweiligen Restriktionsenzymstellen, die in den anderen 5'- und 3'-Primern festgestellt wurden, die zur Herstellung von cDNA-Klonen eingesetzt wurden. Das RT-PCR-Produkt wurde mit XhoI und KpnI geschnitten und in pcDNA-3 (Invitrogen, San Diego, CA) ligiert.
Weitere cDNA-Klone, entsprechend den mRNAs aus alternativen Splicing-Ereignissen, werden auf die gleiche Weise unter Verwendung von Primern, die die entsprechenden Restriktionsstellen enthalten und Identität mit (5'-Primern) oder Komplementarität zu (3'-Primern) der gewählten B7-mRNA aufweisen, kloniert.
Beispiel 2: Modulation der hB7-1-Expression durch die Oligonucleotide
Die Fähigkeit der Oligonucleotide zur Hemmung der B7-1-Expression wurde durch Messen der Zelloberflächenexpression von B7-1 in transfizierten COS-7-Zellen durch Flowcytometrie bewertet.
Verfahren:
Eine T-175-Flasche wurde mit 75%iger Konfluenz mit COS-7-Zellen (ATCCF-Zugangs-Nr. CRL 1651) angeimpft. Das Plasmid pcB7-1 wurde durch Calciumphosphat-Standardtransfektion in die Zellen eingeschleust. Nach 4 h Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und mit 80%iger Konfluenz auf 12-well-Platten ausgesät. Die Adhäsion der Zellen an dem Kunststoff wurde für 1 h ermöglicht, und sodann wurden sie mit Sulfatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. OptiMEM^TM (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD)-Medium wurde zusammen mit 15 μg/ml Lipofectin^TM (GIBCO-BRL-Gaithersburg, MD) und dem Oligonucleotid in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Nach vier zusätzlichen Stunden wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit frischem Oligonucleotid bei der gleichen Konzentration in DMEM (Dulbecco et al., Virol., 1959, 8, 396; Smith et al., Virol, 1960, 12, 185) mit 10% fetalem Kälberserum (FCS) inkubiert.
Zur Aufzeichnung der Wirkungen der Oligonucleotide auf die Zelloberflächenexpression von B7-1 wurden die behandelten COS-7-Zellen durch kurzes Trypsinisieren 24–48 h nach der Oligonucleotid-Behandlung geerntet. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen, anschließend in 100 μl Anfärbepuffer (PBS, 0,2% BSA, 0,1% Azid) mit 5 μl konjugiertem Anti-B7-1-Antikörper (d.h. Anti-hCD80-FITC, Ancell, Bayport, MN; FITC: Fluoresceinisothiocyanat) resuspendiert. Die Zellen wurden 30 min bei 4°C angefärbt, mit PBS gewaschen, in 300 μl, enthaltend 0,5% Paraformaldehyd, resuspendiert. Die Zellen wurden geerntet, und die Fluoreszenzprofile wurden unter Verwendung eines Flowcytometers bestimmt.
Ergebnisse:
Die in Tabelle 1 gezeigten Oligonucleotide wurden in COS-7-Zellen, die vorübergehend B7-1-cDNA exprimieren, auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der B7-1-Expression bewertet. Die Ergebnisse (1) identifizierten ISIS 13805, gerichtet auf die Translations-Startcodonregion als Ziel, und ISIS 13812, gerichtet auf die 3'-untranslatierte Region (UTR) als Ziel, als besonders aktive Oligonucleotide mit einer Hemmung von mehr als 50% der B7-1-Expression. Diese Oligonucleotide sind somit stark bevorzugt. ISIS 13799 (gerichtet auf die 5'-untranslatierte Region als Ziel), ISIS 13802 (gerichtet auf die 5'-untranslatierte Region als Ziel), ISIS 13806 und ISIS 13807 (beide gerichtet auf die 5'-Region des ORF als Ziel) und ISIS 13810 (gerichtet auf den zentralen Teil des ORF als Ziel) zeigten eine Hemmung von 35% bis 50% der B7-1-Expression. Diese Sequenzen sind darum ebenfalls bevorzugt.
Das Oligonucleotid ISIS 13800, das im Wesentlichen keine Hemmung der B7-1-Expression bei dem Flowcytometrietest zeigte, und ISIS Nrn. 13805 und 13812 wurden sodann auf ihre Fähigkeit bewertet, die Zelloberflächenexpression von B7-1 bei verschiedenen Oligonucleotid-Konzentrationen zu hemmen. Die Ergebnisse dieser Tests sind in Tabelle 2 gezeigt. ISIS 13812 war ein überlegener Inhibitor der B7-1-Expression mit einer IC₅₀ von etwa 150 nM. ISIS 13800, gerichtet auf die 5'-UTR als Ziel, war im Wesentlichen inaktiv.
Beispiel 3: Modulation des hB7-2-Proteins durch die Oligonucleotide
Bei einem ersten Screening wurde die Fähigkeit der hB7-2-Oligonucleotide zur Hemmung der B7-2-Expression durch Messen der Zelloberflächenexpression von B7-2-intransfizierten COS-7-Zellen durch Flowcytometrie bewertet. Die angewandten Verfahren entsprachen denjenigen, die in Beispiel 2 angegeben sind, mit den Ausnahmen, dass (1) die COS-7-Zellen mit den Plasmiden pbcB7-2- oder BBG-58, einem menschlichen ICAM-1 (CD54)-Expressionsvektor (R&D-Systems, Minneapolis, MN), eingeschleust in Zellen durch Calciumphosphat-Standardtransfektion, transfiziert wurden, (2) die Oligonucleotide, die verwendet wurden, diejenigen waren, die in Tabelle 2 beschrieben sind und (3) ein konjugierter Anti-B7-2-Antikörper (d.h. Anti-hCD86-FITC oder Anti- CD86-PE, PharMingen, San Diego, CA; PE: Phycoerythrin) während der Flowcytometrie verwendet wurde.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Bei einer Konzentration von 200 nM zeigten ISIS 9133, ISIS 9139 und ISIS 10373 eine inhibitorische Aktivität von 50% oder mehr, und sie sind darum stark bevorzugt. Diese Oligonucleotide sind auf die 3'-untranslatierte Region (ISIS 9133), die Translations-Startcodonregion (ISIS 9139) und die 5'-untranslatierte Region (ISIS 10373) als Ziele gerichtet. Bei der gleichen Konzentration zeigten ISIS 10715, ISIS 10716 und ISIS 10721, die Mischkontrollen für ISIS 9133, ISIS 9139 bzw. ISIS 10373 sind, keine inhibitorische Aktivität. Die Behandlung mit ISIS 10367 und ISIS 10369 führte zu einer mehr als 25%igen Hemmung, und diese Oligonucleotide sind somit ebenfalls bevorzugt. Diese Oligonucleotide sind auf die 5' (ISIS 10367)- und 3' (ISIS 10369)-untranslatierten Regionen als Ziele gerichtet.
Beispiel 4: Modulation von hB7-2-mRNA durch Oligonucleotide
Verfahren:
Für die Ribonuclease-Schutztests wurden die Zellen 18 h nach Abschluss der Oligonucleotidbehandlung unter Verwendung eines Totally-RNA^TM-Kit (Ambion, Austin, TX) geerntet. Die Sonden für den Test wurden aus den Plasmiden pcB7-2 (linearisiert durch Abbau mit BglII) und pTRI-b-Actin (Ambion Inc., Austin, TX) hergestellt. Es wurde eine in vitro Transkription des linearisierten Plasmids aus dem SP6-Promotor in Gegenwart von α-³²p-UTP (800 Ci/mmol) unter Erhalt einer zu dem 3'-Ende von B7-2 (Position 1044–1391) komplementären Antisense-RNA durchgeführt. Die Sonde wurde nach Behandlung mit DNaseI zur Entfernung des DNA-Templats Gel-gereinigt. Die Ribonuclease-Schutztests wurden unter Verwendung eines RPA-II^TM-Kits (Ambion) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Gesamt- RNA (5 μg) wurde über Nacht bei 42°C mit 10⁵ cpm der B7-2-Sonde oder einer β-Actin-Kontrollsonde hybridisiert. Die Hybridisierungsreaktion wurde dann 30 min bei 37°C mit 0,4 Einheiten RNase A und 2 Einheiten RNase T1 behandelt. Die geschützte RNA wurde ausgefällt, in 10 μl Gel-Ladepuffer resuspendiert und auf einem 6%igen Acrylamidgel mit 50% Gew./Vol. Harnstoff bei 20 W elektrophoresiert. Das Gel wurde sodann exponiert, und die Spuren unter Verwendung eines PhosphorImager (Mnlecular Dynamics, Sunnyvale, CA) im Wesentlichen nach den Anweisungen des Herstellers quantifiziert.
Ergebnisse:
Das Ausmaß der Oligonucleotid-vermittelten hB7-2-mRNA-Modulation, verlief im Allgemeinen parallel zu den Wirkungen, die für das hB7-2-Protein (Tabelle 5) festgestellt wurden. Wie bei den Proteinexpressions (Flowcytometrie)-Tests waren die besonders aktiven Oligonucleotide ISIS 9133, ISIS 9139 und ISIS 10373. Keines der getesteten Oligonucleotide besaß eine inhibitorische Wirkung auf die Expression der b-Actin-mRNA in den gleichen Zellen.
TABELLE 5 Aktivitäten der auf hB7-2-mRNA gerichteten Oligonucleotide
Beispiel 5: Weitere hB7-1- und hB7-2-Oligonucleotide
Oligonucleotide mit Strukturen und/oder Sequenzen, die relativ zu den Oligonucleotiden modifiziert waren, die während des ersten Screenings identifiziert wurden, wurden hergestellt. Diese Oligonucleotide wurden auf ihre Fähigkeit zur Modulation der menschlichen B7-2-Expression unter Anwendung der in den vorherigen Beispielen beschriebenen Verfahren bewertet.
ISIS 10996, ein Oligonucleotid mit einer 15-Nucleotidsequenz, die aus der 20-Nucleotidsequenz von ISIS 10373 stammt, wurde ebenfalls hergestellt und bewertet. ISIS 10996 umfasst 15 Nucleotide, 5'-GCG-AGC-TCC-CCG-TAC (SEQ-ID. NR. 90), die in der Sequenz von ISIS 10373 enthalten sind. Sowohl ISIS 10373 als auch 10996 überlappen mit einer potentiellen Stamm-Schleifenstruktur, die in der B7-2-Botschaft lokalisiert ist und die Basen 1–67 der Sequenz von hB7-2 umfasst, die von Azuma et al. (Nature, 1993, 366, 76) angegeben sind. Obgleich nicht die Absicht besteht, im Hinblick auf ihre Wirkungsweise(n) auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu werden, besitzen ISIS 10373 und ISIS 10996 das Potential zur Bindung als Schleifen-1-Pseudohalbknoten an einer Sekundärstruktur innerhalb der Ziel-RNA. Die U.S.-Patentschrift 5,5152,438, ausgegeben am 30. April 1996, beschreibt Verfahren zur Modulation der Genexpression durch Bildung von Pseudohalbknoten. Ohne Rücksicht auf ihre Wirkungsweise(n), trotz des Aufweisens einer kürzeren Länge als ISIS 10373, ist das 15-mer ISIS 10996 in dem B7-2-Proteinexpressionstest so aktiv wie das 20-mer, von dem es abstammt, (oder aktiver) (4; ISIS 10721 ist eine Mischkontrolle für ISIS 10373). Ein verwandtes 16-mer, ISIS 10889, war bei dem B7-2-Proteinexpressionstest ebenfalls aktiv. Allerdings zeigten ein strukturell verwandtes 14-mer (ISIS 10995), 13-mer (ISIS 10994), 12-mer (ISIS 10993), 11-mer (ISIS 10992) und 10-mer (ISIS 10991) bei diesen Tests wenig oder keine Aktivität. ISIS 10996 wurde außerdem durch die folgenden Wege weiter derivatisiert.
ISIS 10996-Derivate mit 2'-Methoxyethoxy-Substitutionen, einschließlich eines vollkommen substituierten Derivats (ISIS 11539), "Spalt-mere" (ISIS 11541 und 11543) und "Flügel-mere" (ISIS 11545 und 11547) wurden hergestellt. Wie in Beispiel 5 erklärt, verhindert die 2'-Methoxyethoxy-Substitution die Wirkung einiger Nucleasen (z.B. RNase N), allerdings verstärkt sie die Affinität des modifizierten Oligonucleotids gegenüber seinem Ziel-RNA-Molekül. Die Oligonucleotide werden auf ihre Fähigkeit zur Modulation der hB7-2-Botschaft oder -Funktion nach dem Verfahren der Beispiele 3, 4, 7 und 8, getestet.
ISIS 10996-Derivate wurden hergestellt, um auf ihre Fähigkeit zur Rekrutierung von RNase L auf ein Ziel-RNA-Molekül, z.B. hB7-2-Botschaft, bewertet zu werden. RNase L bindet an und wird aktiviert durch (2'-5') (A)_n, das seinerseits aus ATP durch (2'-5') (A)_n-Synthetase bei Aktivierung, z.B. durch Interferon, produziert wird. RNase L wurde bei antiviralen Mechanismen und auch bei der Regulierung des Zellwachstums als beteiligt vermutet (Sawai, Chemica Scripta, 1986, 21, 169; Charachon et al., Biochemistry, 1990, 29, 2550). Die Kombination von Anti-B7-Oligonucleotiden, konjugiert mit (2'-5') (A)_n, ergibt erwartungsgemäß die Aktivierung von RNase L und ihre Ausrichtung auf die B7-Botschaft komplementär zu der Oligonucleotidsequenz. Die folgenden Oligonucleotide besitzen identische Sequenzen (d.h. diejenige von ISIS 10996) und identische (2'-5') (A)₄-"Kappungen" an ihren 5'-Termini: ISIS 12492, 12495, 12496 und 13107. Die Adenosylreste besitzen 3'-Hydroxylgruppen und sind über Phosphorothioatbindungen miteinander verknüpft. Der (3'-5')-Teil des Oligonucleotids, der eine Sequenz komplementär zu einem Teil der menschlichen B7-2-RNA aufweist, ist mit der (2'-5') (A)₄-"Kappung" über eine Phosphorothioatbindung vom 5'-Rest des (3'-5')-Teils des Oligonucleotids zu einem n-Aminohexyllinker, der an die "Kappung" über eine weitere Phosphorothioat-Bindung gebunden ist, konjugiert. Zum Testen einer Vielzahl von chemisch verschiedenen Oligonucleotiden dieses Typs auf ihre Fähigkeit, RNase L für eine spezifische Botschaft zu rekrutieren, wurden an dieser Serie von vier Oligonucleotiden verschiedene chemische Modifikationen wie folgt vorgenommen. ISIS 12496 besteht aus unmodifizierten Oligonucleotiden im (3'-5')-Teil des Oligonucleotids. In ISIS 13107 ersetzen Phosphorothioat-Bindungen die Phosphat-Bindungen, die in natürlich vorkommenden Nucleinsäuren festgestellt werden. Die Phosphorothioat-Bindungen werden auch in ISIS 12492 und 12495 eingesetzt, die zusätzlich 2'-Methoxyethoxy-Substitutionen aufweisen. Diese Oligonucleotide werden auf ihre Fähigkeit getestet, die hB7-2-Botschaft oder -Funktion nach den Verfahren der Beispiele 3, 4, 7 und 8 zu modulieren.
Derivate von ISIS 10996 mit Modifikationen an der 2'-Position wurden hergestellt und bewertet. Die modifizierten Oligonucleotide umfassten ISIS 11539 (komplett 2'-O-Methyl), ISIS 11541 (mit 2'-O-Methyl-"Flügeln" und einem zentralen 7-Base-"Spalt", ISIS 11543 (2'-O-Methyl-Flügel mit einem 9-Basen-Spalt), ISIS 11545 (mit einem 5'-2'-O-Methyl-Flügel) und ISIS 11547 (mit einem 3'-2'-O-Methyl-Flügel). Die Ergebnisse der Tests der 2'-O-Methyl-Oligonucleotide waren wie folgt. ISIS 11539, die vollkommen 2'-O-methylierte Version von ISIS 10996, war bei den Proteinexpressionstest überhaupt nicht aktiv. Die Oligonucleotide mit Spalt und Flügel (ISIS 11541, 11543, 11545 und 11547) zeigten jeweils eine Aktivität bei 200 nM (d.h. 60 bis 70% Expression, relativ zu den unbehandelten Zellen), allerdings weniger als die von der Stammverbindung, ISIS 10996 (d.h. etwa 50% Expression), gezeigte. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den RNA-Expressionstests festgestellt.
ISIS 10782, ein Derivat von ISIS 10373, an das über einen 5'-n-Aminohexyllinker Cholesterin konjugiert war, wurde hergestellt. Es wurde berichtet, dass lipophile Gruppierungen, wie Cholesterin, die Aufnahme der Oligonucleotide durch die Zellen in einigen Fällen verstärken, obwohl das Ausmaß, um das die Aufnahme verstärkt wird, wenn überhaupt, unvorhersagbar bleibt. ISIS 10782 und die anderen Oligonucleotide, die lipophile Gruppierungen umfassen, werden auf ihre Fähigkeit zum Modulieren der B7-2-Botschaft oder -Funktion nach dem Verfahren der Beispiele 3, 4, 7 und 8 getestet.
Eine Serie von 2'-Methoxyethoxy (hier "2'ME")- und 2'-Fluorid (hier "2'F")-"Spalt"-Derivate der hB7-1-Oligonucleotide ISIS 12361 (ISIS-Nrn. 12348 bzw. 12473), ISIS 12362 (ISIS-Nrn. 12349 und 12474), ISIS 12363 (ISIS-Nrn. 12350 und 12475), ISIS 12364 (ISIS-Nrn. 12351 und 12476), ISIS 12365 (ISIS-Nrn. 12352 und 12477), ISIS 12366 (ISIS-Nrn. 12353 und 12478), ISIS12367 (ISIS-Nrn. 12354 und 12479), ISIS 12368 (ISIS-Nrn. 12355 und 12480), ISIS 12369 (ISIS-Nrn. 12356 und 12481) und ISIS 12370 (ISIS-Nrn. 12357 und 12482) wurden hergestellt. Die zentralen, nicht-2'-modifizierten Teile ("Spalte") dieser Derivate unterstützen die RNase-H-Aktivität, wenn das Oligonucleotid an seine Ziel-RNA gebunden ist, obwohl sich die 2'-modifizierten Teile nicht so verhalten. Allerdings verstärken die 2'-modifizierten "Flügel" dieser Oligonucleotide ihrer Affinität gegenüber ihrem RNA-Zielmolekül (Cook, Kapitel 9, in: Antisense Research and Applications, Crooke et al., Hrsg, CRC Press, Boca Raton, 1993, Ss. 171–172).
Eine weitere 2'-Modifikation ist der Einbau einer Methoxy (MO)-Gruppe an dieser Position. Wie 2'ME- und 2'F-modifizierte Oligonucleotide verhindert diese Modifikation die Wirkung der RNase H auf die Doppelhelices, die aus solchen Oligonucleotiden und ihren RNA-Zielmolekülen gebildet werden, verstärkt allerdings die Affinität eines Oligonucleotids gegenüber seinem RNA-Ziel-Molekül. ISIS 12914 und 12915 umfassen Sequenzen komplementär zu der 5'-untranslatierten Region der alternativen hB7-1-mRNA-Moleküle, die aus alternativen Splicing-Ereignissen des primären hB7-1-Transkript hervorgehen. Die Oligonucleotide umfassen 2'-Methoxy-Modifikationen, und die verstärkte Zielaffinität, die sich daraus ergibt, kann eine größere Aktivität gegen alternativ gesplicte B7-1-mRNA-Moleküle ermöglichen, die in einigen Geweben in geringem Überschuss vorhanden sein können (Inobe et al., J. Immun., 1996, 157, 582). Gleichermaßen umfassen ISIS 13498 und 13499, die Antisense-Sequenzen zu anderen alternativen hB7-1-mRNAs umfassen, 2'-Methoxyethoxy-Modifikationen zur Verstärkung ihrer Affinität gegenüber diesen Zielmoleküle, und die 2'-Methoxyethoxy- oder 2'-Methoxy-Substitutionen werden in die hB7-2-Oligonucleotide ISIS 12912, 12913, 13496 und 13497 eingebaut. Diese Oligonucleotide werden auf ihre Fähigkeit zur Modulation von hB7-1 im Wesentlichen nach den Verfahren von Beispiel 2 oder hB7-2 nach den Verfahren der Beispiele 3, 4, 7 und 8 getestet, mit der Ausnahme, dass die Zielzellen gegebenenfalls mit einem cDNA-Klon, entsprechend dem geeigneten alternativ gesplicten B7-Transkript, transfiziert werden.
Beispiel 6: Spezifität der Antisense-Modulation
Mehrere erfindungsgemäße Oligonucleotide wurden in einem Zelloberflächenexpressions-Flowcytometrietest zur Bestimmung der Spezifität der Oligonucleotide für B7-1 im Gegensatz zur Aktivität gegen B7-2 getestet. Die bei diesem Test getesteten Oligonucleotide umfassten ISIS 13812, einen Inhibitor der B7-1-Expression (1; Beispiel 2) und ISIS 10373, einen Inhibitor der B7-2-Expression (3; Beispiel 3). Die Ergebnisse dieses Tests sind in 5 gezeigt. ISIS 13812 hemmt die B7-1-Expression mit geringer oder ohne Wirkung auf die B7-2-Expression. In 5 wird auch festgestellt, dass ISIS 10373 die B7-2-Expression mit geringer oder ohne Wirkung auf die B7-1-Expression hemmt. ISIS 13872 (SEQ-ID-NR. 37, AGT-CCT-ACT-ACC-AGC-CGC-CT), eine Mischkontrolle von ISIS 13812, und ISIS 13809 (SEQ-ID-NR. 51) waren in diesen Test eingeschlossen und zeigt im Wesentlichen keine Aktivität gegen B7-1 oder B7-2.
Beispiel 7: Modulation der hB7-2-Expression durch die Oligonucleotide in Antigen-präsentierenden Zellen
Die Fähigkeit von ISIS 10373 zur Hemmung der Expression aus dem nativen B7-2-Gen in Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) wurde wie folgt bewertet.
Verfahren:
Monozyten wurden kultiviert und wie folgt mit Oligonucleotiden behandelt. Für dendritische Zellen wurde EDTA-behandeltes Blut auf Polymorphprep^TM (1,113 g/ml; Nycomed, Oslo, Norwegen) geschichtet und bei 500 × g 30 min bei 20°C sedimentiert. Die mononukleären Zellen wurden von der Grenzfläche geerntet. Die Zellen wurden mit PBS-Medium, mit serumfreiem RPMI-Medium (Moore et al., N.Y. J. Med., 1968, 68, 2054) und sodann mit RPMI, enthaltend 5% fetales Rinderserum (FBS), gewaschen. Die Monozyten wurden durch Adhäsion auf Kunststoff-Zellkulturschalen 1 h bei 37°C selektiert, nach der Adhäsion wurden die Zellen in serumfreiem RPMI-enthaltendem Lipofectin^TM (8 μg/ml) mit den Oligonucleotiden behandelt. Nach 4 h wurden die Zellen gewaschen. Anschließend wurden den Zellen RPMI, enthaltend 5% FBS, und Oligonucleotide zusammen mit Interleukin-4 (IL-4; R&D-Systems, Minneapolis, MN) (66 ng/ml) und dem Granulozyten-Macrophagenkolonien-stimulierenden Faktor (GM-CSF; R&D Systems, Minneapolis, MN) (66 ng/ml) zur Stimulierung der Differenzierung (Romani et al., J. Exp. Med., 1994, 180, 83, 1994) zugesetzt. Die Zellen wurden 48 h inkubiert, wonach die Zelloberflächenexpression der verschiedenen Moleküle durch Flowcytometrie gemessen wurde.
Die mononukleären Zellen, die aus frischem Blut isoliert wurden, wurden mit dem Oligonucleotid in Gegenwart von kationischem Lipid zur Beschleunigung der Zellaufnahme behandelt. Als Kontroll-Oligonucleotid wurde auch ISIS 2302 (ein Inhibitor der ICAM-1-Expression; SEQ-ID. NR. 17) an die Zellen verabreicht. Die Expression von B7-2-Protein wurde durch Flowcytometrie nach den Verfahren von Beispiel 2 gemessen.
2. Monoklonale Antikörper, die nicht in den vorherigen Beispielen beschrieben wurden, umfassten Anti-hCD3 (Ancell, Bayport, MN) und Anti-HLA-DR (Becton Dickinson, San Jose, CA).
Ergebnisse:
Wie in 6 gezeigt, besitzt ISIS 10373 eine nennenswerte inhibitorische Wirkung auf die B7-2-Expression mit einer IC₅₀ von etwa 250 mM. ISIS 10373 besaß nur eine leichte Wirkung auf die ICAM-1-Expression, auch bei einer Dosis von 1 μm. ISIS 2302 (SEQ-ID-NR. 17), ein Kontroll- Oligonucleotid, das sich als Inhibitor der ICAM-1-Expression erwiesen hat, besaß keine Wirkung auf die B7-2-Expression, allerdings verminderte es die ICAM-1-Spiegel signifikant, mit einer IC₅₀ von etwa 250 nM. Unter ähnlichen Bedingungen beeinflusste ISIS 10373 die Zelloberflächenexpression von B7-1, HLA-DR oder CD3 nicht, wie gemessen durch Flowcytometrie.
Beispiel 8: Modulation der T-Zellen-Proliferation durch die Oligonucleotide
Die Fähigkeit von ISIS 2302 und ISIS 10373 zur Hemmung der T-Zellen-Proliferation wurde wie folgt bewertet. Monozyten, die mit Oligonucleotid und Cytokinen (wie in Beispiel 6) behandelt wurden, wurden als Antigen-präsentierende Zellen in einem T-Zellenproliferationstest verwendet. Die differenzierten Monozyten wurden mit CD4+ T-Zellen aus einem getrennten Spender kombiniert. Nach 48 h wurde die Proliferation durch [³H]-Thymidineinbau gemessen.
Verfahren:
Für die T-Zellenproliferationstests wurden die Zellen aus EDTA-behandeltem Vollblut wie vorstehend beschrieben isoliert, mit der Ausnahme, dass ein schneller wanderndes Band, das die Lymphozyten enthielt, unmittelbar unterhalb der Grenzfläche geerntet wurde. Die Zellen wurden wie in Beispiel 6 beschrieben gewaschen, wonach die Erythrozyten durch NH₄Cl-Lyse entfernt wurden. Die T-Zellen wurden unter Verwendung einer T-Zellen-Anreicherungssäule (R&D Systems, Minneapolis, MN) im Wesentlichen nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die CD4+ T-Zellen wurden weiterhin aus der T-Zellen-Gesamtpopulation durch Abreicherung an CD8+ Zellen mit Anti-CD8-konjugierten Magnetperlen (AMAC, Inc., Westbrook, ME) nach den Vorgaben des Herstellers angereichert. Durch Flowcytometrie unter Verwendung von Cy-Chrome-konjugiertem Anti-CD4-mAb (PharMingen, San Diego, CA) wurde festgestellt, dass die T-Zellen zu > 80% CD4+ Zellen waren.
Die Antigen-präsentierende Zellen (APCs) wurden wie in Beispiel 6 beschrieben isoliert und 1 h mit Mitomycin-C (25 μg/ml) behandelt und anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Die APCs (10⁵ Zellen) wurden sodann mit 4 × 10⁴ CD4+ T-Zellen in 350 μl Kulturmedium kombiniert. Wo angegeben, wurde auch gereinigtes CD3-mAb bei einer Konzentration von 1 μg/ml zugesetzt. Während der letzten 6 h der 48 h Inkubationsdauer wurde die Proliferation durch Bestimmung der Aufnahme von 1,5 μCi [³H]-Thymidin pro Vertiefung gemessen. Die Zellen wurden auf Filter geerntet, und die Radioaktivität durch Scintillationszählen gemessen.
Ergebnisse:
Wie in 7 gezeigt, induzierten die mononukleären Zellen, die nicht Cytokin-behandelt wurden, die T-Zellenproliferation etwas, vermutlich aufgrund der niedrigen Niveaus von co-stimulatorischen Molekülen, die auf den Zellen exprimiert wurden. Wenn allerdings die Zellen mit Cytokinen behandelt und zur Differenzierung zu dendritartigen Zellen veranlasst wurden, war die Expression sowohl von ICAM-1 als auch B7-2 stark aufreguliert. Dies ergab eine starke proliferative T-Zellantwort, die entweder mit dem Anti-ICAM-1 (ISIS 2302)- oder Anti-B7-2 (ISIS 10373)-Oligonucleotid vor Induktion der mononukleären Zellen blockiert werden konnte. Die Kontroll-Oligonucleotide (ISIS 10721) besaßen auf die T-Zellenproliferation eine insignifikante Wirkung. Eine Kombinationsbehandlung sowohl mit dem Anti-ICAM-1 (ISIS 2302)- als auch Anti-B7-2 (ISIS 10373)-Oligonucleotid ergab eine weitere Abnahme der T-Zellen-Antwort.
Beispiel 9: Modulation von murinen B7-Genen durch die Oligonucleotide
Die Oligonucleotide (siehe Tabelle 4), die in der Lage waren, die Expression von murinem B7-2, das vorübergehend in COS-7-Zellen exprimiert wurde, zu hemmen, wurden auf folgende Weise identifiziert. Eine Serie von Phosphorothioat-Oligonucleotiden, die zu muriner B7-2 (mB7-2)-cDNA komplementär waren, wurde auf ihre Fähigkeit zur Reduktion der mB7-2-Niveaus (gemessen durch Flowcytometrie wie in Beispiel 2, z.B. mit der Ausnahme, dass ein konjugierter Anti-mB7-2-Antikörper (d.h. Anti-mCD86-PE, PharMingen, San Diego, CA) in COS-7-Zellen, die mit einem mB7-2-cDNA-Klon transfiziert waren, verwendet wurde. Der Anti-mB7-2-Antikörper kann auch aus den bei der ATCC unter der Zugangsnummer HB-253 hinterlegten Hybridomzellen erhalten werden. Die Oligonucleotide (siehe Tabelle 2), die in der Lage sind, die murine B7-1-Expression zu modulieren, werden auf die gleiche Weise isoliert, mit der Ausnahme, dass ein konjugierter Anti-mB7-1-Antikörper in Verbindung mit den COS-7-Zellen verwendet wird, die mit einem mB7-1-cDNA-Klon transfiziert wurden.
Für das murine B7-2 war das aktivste Oligonucleotid, das identifiziert wurde, ISIS 11696 (GGA-TTG-CCA-AGC-CCA-TGG-TG, SEQ-ID. NR. 18), das zu den Positionen 96–115 der cDNA komplementär ist, eine Stelle, die das Translationsstart (AUG)-Codon einschließt. 8 zeigt eine Dosis-Reaktionskurve für ISIS 11696 und eine Mischkontrolle, ISIS 11866 (CTA-AGT-AGT-GCT-AGC-CGG-GA, SEQ-ID NR. 19). ISIS 11696 hemmte die Zelloberflächenexpression von B7-2 in COS-7-Zellen mit einer IC₅₀ im Bereich von 200–300 nM, während ISIS 11866 bei der höchsten getesteten Konzentration (1000 nM) weniger als 20% Hemmung zeigte.
Um die murinen B7-2-Antisense-Oligonucleotide weiter zu bewerten, wurde die IC-21-Zelllinie verwendet. Die IC-21-Monozyten/Macrophagen-Zelllinie exprimiert sowohl B7-1 als auch murines B7-2 (mB7-2) konstitutiv. Eine zweifache Induktion der Expression kann durch Inkubation der Zellen in Gegenwart von Lipopolysaccarid (LPS; GIBC-BRL, Gaithersburg, MD) (Hathcock et al., Science, 1993, 262, 905) erzielt werden.
Die IC-21-Zellen (ATCC-Zugangsnummer TIB 186) wurden mit 80%iger Konfluenz in 12-well-Platten in DMEM-Medium mit 10% FCS ausgesät. Die Zellen wurden an der Platte über Nacht anhaften gelassen. Am folgenden Tag wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden mit PBS gewaschen. Anschließend wurden jeder Vertiefung 500 μl OptiMEM^TM (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), angereichert mit 15 μg/ml Lipofectin^TM (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), zugesetzt. Die Oligonucleotide wurden anschließend direkt dem Medium in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Nach 4 h Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und über Nacht in Kulturmedium, angereichert mit 15 μg/ml LPS, inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Zellen durch Abschaben geerntet und anschließend auf die Zelloberflächenexpression durch Flowcytometrie analysiert.
ISIS 11696 und ISIS 11866 wurden in Gegenwart von Lipofectin^TM (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) an die IC-21-Zellen verabreicht. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Bei einer Konzentration von 10 μm hemmte ISIS 11696 die mB7-2-Expression vollständig (und senkte die mB7-2-Niveaus unter das konstitutive Expressionsniveau), während das Mischkontroll-Oligonucleotid ISIS 11866 nur eine 40%ige Reduktion des Niveaus der induzierten Expression hervorrief. Bei einer Konzentration von 3 μm wurden die Niveaus der induzierten Expression durch ISIS 11696 stark herabgesetzt, während ISIS 11866 eine geringe Wirkung aufwies.
Modifizierte Oligonucleotide, die 2'-Substitutionen (z.B. 2'-Methoxy, 2'-Methoxyethoxy) umfassten und deren Ziel alternative Transkripte von murinem B7-1 (ISIS 12914, 12915, 13498, 13499) oder murinem B7-2 (ISIS 13100, 13100 und 13102) waren, wurden hergestellt. Die Oligonucleotide werden auf ihre Fähigkeit zur Modulation von murinem B7 im Wesentlichen nach den obigen Verfahren unter Verwendung von IC-21-Zellen oder COS-7-Zellen, die mit einem cDNA-Klon, entsprechend dem entsprechenden alternativ gesplicten B7-Transkript, transfiziert waren, getestet.
Beispiel 10: Modulation der Homotransplantat-Abstoßung durch die Oligonucleotide
Zur Bewertung der Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Herz-Homotransplantat-Abstoßung wurde bereits ein murines Modell beschrieben (Stepkowski et al., J. Immunol., 1994, 153, 5336). Dieses Modell wurde zur Bewertung der immunsupressiven Fähigkeit der Antisense-Oligonucleotide gegenüber B7-Proteinen allein oder in Kombination mit Antisense-Oligonucleotiden auf das interzelluläre Adhäsionsmolekül 1 (ICAM-1) verwendet.
Verfahren:
Die Herz-Homotransplantat-Abstoßungsstudien und die Oligonucleotid-Behandlungen von BALB/C-Mäusen wurden im Wesentlichen wie bereits beschrieben (Stepkowski et al., J. Immunol., 1994, 153, 5336) durchgeführt. Die verwendeten Antisense-Oligonucleotide umfassten ISIS 11696, ISIS 3082 (gerichtet auf ICAM-1) und ISIS 1082 (ein Kontroll-Oligonucleotid, gerichtet auf die Herpesvirus-UL-13-Gensequenz). Die verwendeten Dosierungen waren 1, 2, 2,5, 5 oder 10 mg/kg individuelles Oligonucleotid (wie nachstehend angegeben); wurden Kombinationen von Oligonucleotiden verabreicht, wurde jedes Oligonucleotid in einer Dosis von 1, 5 oder 10 mg/kg (Oligonucleotid-Gesamtdosierungen von 2, 10 bzw. 20 mg/kg) gegeben. Die Überlebensdauer der transplantierten Herzen und ihrer Wirte wurden überwacht und aufgezeichnet.
Ergebnisse:
Die mittlere Überlebensdauer für unbehandelte Mäuse betrug 8,2 ± 0,8 Tage (7, 8, 8, 8, 9, 9 Tage). Die Behandlung der Mäuse für 7 Tage mit ISIS 1082 (SEQ-ID-NR. 125, nicht verwandtes Kontrolloligonucleotid) verminderte die mittlere Überlebensdauer leicht auf 7,1 ± 0,7 Tage (5 mg/kg/Tag; 6, 7, 7, 7, 8, 8) oder 7,0 ± 0,8 Tage (10 mg/kg/Tag; 6, 7, 7, 8). Die Behandlung der Mäuse für 7 Tage mit dem murinen B7-2-Oligonucleotid ISIS 11596 (SEQ-ID. NR. 108) erhöhte die mittlere Überlebensdauer auf 9,3 Tage bei zwei Dosen (2 mg/Tag 9,3 ± 0,6 Tage, 9, 9, 10 10 mg/kg/Tag, 9,3 ± 1,3 Tage, 8, 9, 9, 11). Die Behandlung der Mäuse für 7 Tage mit einem ICAM-1-Oligonucleotid, ISIS 3082, erhöhte ebenfalls das mittlere Überleben der Mäuse bei mehreren Dosen. Insbesondere betrug die mittlere Überlebensdauer (MSD) bei 1 mg/kg/Tag 11,0 ± 0,0 (11, 11, 11); bei 2,5 mg/kg/Tag betrug die MSD 12,0 ± 2,7 (10, 12, 13, 16); bei 5 mg/kg/Tag betrug die MSD 14,1 ± 2,7 (10, 12, 12, 13, 16, 16, 17, 17); und bei 10 mg/kg/Tag betrug die MSD 15,3 ± 5,8 (12, 12, 13, 24). Eine gewisse synergistische Wirkung wurde festgestellt, wenn die Mäuse 7 Tage lang mit 1 mg/kg/Tag jeweils von ISIS 3082 und 11696 behandelt wurden: die MSD betrug 13,8 ± 1,0 (13, 13, 14, 15).
Beispiel 11: Nachweis der Nucleinsäuren, die die B7-Proteine kodieren
Die Oligonucleotide werden nach der Synthese durch ³²P-Markierung am 5'-Ende mit Polynucleotidkinase radioaktiv markiert. Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Bd. 2, S. 11.31. Das radioaktiv markierte Oligonucleotid, das in der Lage ist, mit einer Nucleinsäure, die ein B7-Protein kodiert, zu hybridisieren, wird unter Bedingungen, wobei die spezifische Hybridisierung auftreten kann, mit einer Gewebe- oder Zellprobe in Kontakt gebracht, von der eine B7-Proteinexpression vermutet wird, und die Probe wird zur Entfernung von ungebundenem Oligonucleotid gewaschen. Eine ähnliche Kontrolle wird erhalten, wobei das radioaktiv markierte Oligonucleotid mit einer normalen Gewebe- oder Zellprobe unter Bedingungen zusammengebracht wird, die die spezifische Hybridisierung erlauben, und die Probe wird zur Entfernung von ungebundenem Oligonucleotid gewaschen. Die in den Proben verbleibende Radioaktivität zeigt gebundenes Oligonucleotid an und wird unter Verwendung eines Scintillationszählers oder eines anderen routinemäßigen Mittels quantifiziert. Eine größere Menge an Radioaktivität, die in den Proben zurückbleibt, im Vergleich zu den Kontrollgeweben oder Kontrollzellen, zeigt eine erhöhte Expression eines B7-Gens an, wohingegen eine geringere Menge an Radioaktivität in den Proben relativ zu den Kontrollen eine herabgesetzte Expression eines B7-Gens anzeigt.
Die erfindungsgemäßen radioaktiven Oligonucleotide sind auch bei der Autoradiographie geeignet. Ein Schnitt von Geweben, die vermutlich ein B7-Gen exprimieren, wird mit radioaktiv markiertem Oligonucleotid behandelt und wie vorstehend beschrieben gewaschen, anschließend nach den Autoradiographie-Standardverfahren einer photographischen Emulsion ausgesetzt. Auch eine Kontrolle eines normalen Gewebeschnittes wird erhalten. Die Emulsion ergibt nach der Entwicklung ein Bild von Silberkörnchen über die Regionen, die ein B7-Gen exprimieren, das quantifiziert wird. Das Ausmaß der B7-Expression wird durch Vergleich der festgestellten Silberkörnchen mit einer Kontroll- und Testprobe bestimmt.
Analoge Tests zum Fluoreszenznachweis der Expression eines B7-Gens verwenden die erfindungsgemäßen Oligonucleotide, die mit Fluorescein oder mit anderen angehängten fluoreszenten Markern markiert sind. Die markierten Oligonucleotide werden auf einem automatischen DNA-Synthesegerät (Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Anwendung der Phosphoramidit-Standardchemie synthetisiert. b-Cyanoethyldiisopropylphosphoramidite werden von Applied Biosystems (Foster City, CA) bezogen. Fluorescein-markierte Amidite werden von Glen Research (Sterling, VA) bezogen. Die Inkubation des Oligonucleotids und der biologischen Proben wird wie vorstehend beschrieben für die radioaktiv markierten Oligonucleotide durchgeführt, mit der Ausnahme, dass an Stelle eines Scintillationszählers ein Fluoreszenzmikroskop zum Nachweis der Fluoreszenz eingesetzt wird. Eine größere Menge an Fluoreszenz in den Proben, im Vergleich zu Kontrollgeweben oder -zellen, zeigt eine erhöhte Expression eines B7-Gens an, wohingegen eine geringere Menge an Fluoreszenz in den Proben relativ zu den Kontrollen eine verminderte Expression eines B7-Gens anzeigt.
Sequenzlistung

Claims

Oligonucleotid, umfassend 20 bis 30 Nucleotide, die über kovalente Bindungen verknüpft sind, wobei das Oligonucleotid eine Sequenz aufweist, die spezifisch hybridisierbar ist mit einer Nucleinsäure, die menschliches B7-1-Protein kodiert, und das Oligonucleotid die Expression des menschlichen B7-1-Proteins moduliert, wobei die Oligonucleotidsequenz die SEQ-ID. Nr. 36 umfasst.
Oligonucleotid, umfassend 20 bis 30 Nucleotide, die über kovalente Bindungen verknüpft sind, wobei das Oligonucleotid eine Sequenz aufweist, die spezifisch mit einer Nucleinsäure hybridisierbar ist, die menschliches B7-2-Protein kodiert, und das Oligonucleotid die Expression des menschlichen B7-2-Proteins moduliert, wobei die Oligonucleotidsequenz die SEQ-ID. Nr. 3, SEQ-ID. Nr. 9 oder die SEQ-ID. Nr. 16 umfasst.
Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei mindestens eine der kovalenten Bindungen eine modifizierte kovalente Bindung ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 3, wobei die modifizierte kovalente Bindung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Phosphorothioatbindung, einer Phosphotriesterbindung, einer Methylphosphonatbindung, einer Methylen(methylimino)-Bindung, einer Morpholinobindung, einer Amidbindung, einer Polyamidbindung, einer kurzkettigen Alkyl-Interzuckerbindung, einer Cycloalkyl-Interzuckerbindung, einer kurzkettigen heteroaromatischen Interzuckerbindung und einer heterocyclischen Interzuckerbindung.
Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei mindestens eines der Oligonucleotide eine modifizierte Zuckergruppierung aufweist.
Oligonucleotid nach Anspruch 5, wobei die modifizierte Zuckergruppierung eine Modifikation der 2'-Position eines Nucleotids, der 3'-Position des 3'-terminalen Nucleotids oder der 5'-Position des 5'-terminalen Oligonucleotids ist.
Oligonucleotid nach Anspruch 6, wobei die Modifikation aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Substitution einer 3'-Hydroxylgruppe durch eine Azidogruppe und einer Substitution einer 3'- oder 5'-Hydroxylgruppe durch ein Wasserstoffatom.
Oligonucleotid nach Anspruch 6, wobei die Modifikation eine Substitution oder eine Addition an der 2'-Position einer Gruppierung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus -OH, -SH, SCH3, -F, -OCN, -OCH30CH3, -OCH30(CH2)nCH3-O(CH,),NH oder O(CH2n)CH3, wobei n 1 bis etwa 10 ist, einer C1- bis C-Niederalkylgruppe, einer Alkoxyalkoxygruppe, einer substituierten Niederalkylgruppe, einer substituierten Alkarylgruppe, einer substituierten Aralkylgruppe, -Cl, -Br, -CN, -CF3, -OCF3, einer O-Alkylgruppe, einer S-Alkylgruppe, einer N-Alkylgruppe, einer O-Alkenylgruppe, einer S-Alkenylgruppe, einer N-Alkenylgruppe, -SOCH3, -SO2CH3, -ONO2, -NO2, -N3, -NH2 einer Heterocycloalkylgruppe, einer Heterocycloalkarylgruppe, einer Aminoalkylaminogruppe, einer Polyalkylaminogruppe, einer substituierten Silylgruppe, einer RNA-Spaltungsgruppe, einer Reportergruppe, einer DNA-Interkalationsgruppe, einer Gruppe zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Oligonucleotids, einer Gruppe zur Verbesserung der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Oligonucleotids, einer Methoxyethoxygruppe und einer Methoxygruppe.
Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei mindestens eines der Nucleotide eine modifizierte Nucleobase aufweist.
Oligonucleotid nach Anspruch 9, wobei die modifizierte Nucleobase aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Hypoxanthin, 5-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, Glycosyl-5-hydroxymethylcytosin, Gentiobiosyl-5-hydroxymethylcytosin, 5-Bromuracil, 5-Hydroxymethyluracil, 6-Methyladenin, N6-(6-Aminohexyl)adenin, 8-Azaguanin, 7-Deazaguanin und 2,6-Diaminopurin.
Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Oligonucleotid mindestens eine lipophile Gruppierung umfasst, die die zelluläre Aufnahme des Oligonucleotids verbessert.
Oligonucleotid nach Anspruch 11, wobei die lipophile Gruppierung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einer Cholesteringruppierung, einer Cholesterylgruppierung, Cholsäure, einem Thioether, einem Thiocholesterin, einer aliphatischen Kette, einem Phospholipid, einer Polyaminkette, einer Polyethylenglycolkette, Adamantanessigsäure, einer Palmitylgruppierung, einer Octadecylamingruppierung und einer Hexylamino-carbonyloxycholesteringruppierung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Oligonucleotid nach Anspruch 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: a) ein antiinflammatorisches oder immunsuppressives Mittel, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem löslichen ICAM-Protein, einem Antikörper-Toxin-Konjugat, Prednison, Methylprednisolon, Azathioprin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, einem Interferon, einem Sympathomimetikum, einem Histamin-H₁-Rezeptorantagonisten und einem Histamin-H₂-Rezeptorantagonisten; b) ein Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2; und c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: a) ein Oligonucleotid, umfassend 8 bis 30 Nucleotide, die über kovalente Bindungen verknüpft sind, wobei mindestens eine der kovalenten Bindungen eine Bindung ist, die anders ist als eine Phosphodiesterbindung, wobei das Oligonucleotid eine Sequenz aufweist, die spezifisch hybridisierbar ist mit einer Nucleinsäure, die ein ICAM-Protein kodiert, und das Oligonucleotid die Expression des ICAM-Proteins moduliert; b) ein Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2; und c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: a) ein Oligonucleotid nach Anspruch 1; b) ein Oligonucleotid nach Anspruch 2; und c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend: a) ein antiinflammatorisches oder immunsuppressives Mittel, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem löslichen ICAM-Protein, einem Antikörper-Toxin-Konjugat, Prednison, Methylprednisolon, Azathioprin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, einem Interferon, einem Sympathomimetikum, einem Histamin-H₁-Rezeptorantagonisten, einem Histamin-H₂-Rezeptorantagonisten und einem Oligonucleotid, das die Expression eines ICAM-Proteins moduliert; b) ein Oligonucleotid nach Anspruch 1; c) ein Oligonucleotid nach Anspruch 2; und d) einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Oligonucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung eines Oligonucleotids nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Inflammation oder einer Autoimmunerkrankung bei einem Tier.