DE69731959T2

DE69731959T2 - Implantierbares acrylamidcopolymer-hydrogel für therapeutische anwendungen

Info

Publication number: DE69731959T2
Application number: DE69731959T
Authority: DE
Inventors: Stephane Woerly
Original assignee: NEUROGEL EN MARCHE; NEUROGEL EN MARCHE LOPEREC
Current assignee: NEUROGEL EN MARCHE, LOPEREC, FR
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1997-10-15
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2017-10-16
Also published as: AU4612697A; DE69731959D1; JP2000503884A; PL327454A1; RU2198686C2; ATE284717T1; IL124894A; BR9706835A; CA2240721C; KR100377520B1; HUP9902027A2; JP3542810B2; HUP9902027A3; IL124894A0; EP0929323B1; SK79698A3; WO1998016266A1; US5863551A; CZ187698A3; CN1211194A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Polymer-Hydrogel. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein poröses, implantierbares Polymer-Hydrogel, z.B. für die therapeutische Verwendung, das für Folgendes verwendet werden kann, nämlich, Ersetzen von innerem Gewebe irgendeines Teiles eines weichen Organs, zur Wundheilung, zur Geweberegeneration und zur Organreparatur im Allgemeinen insbesondere im sich entwickelnden und im erwachsenen Nervensystem und anderen ähnlichen Therapien. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Polymer-Hydrogel, das bei der Implantation zu einer porösen Matrix wird, die mit biologischen Fluiden und Molekülen gefüllt ist, um ein sogenanntes organoides Hydrogel zu bilden und das durch anschließendes Einwachsen von Gewebe und Blutgefäßen schrittweise in den Wirt integriert wird. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Einführen von lebenden Gewebezellen, Precursorzellen oder genetisch veränderten Zellen in ein solches Polymer-Hydrogel um Biohybridmaterialien herzustellen, die für dreidimensionale Zellkulturen oder zur Geweberekonstruktion nützlich sind. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung des Polymer-Hydrogels gemäß der Erfindung und Biohybridmaterialien, die durch das zuvor erwähnte Verfahren hergestellt wurden. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln von geschädigten Teilen des zentralen Nervensystems, insbesondere des Rückenmarks und des Sehnervs oder der periphe ren Nerven oder anderen Geweben durch Implantation des Polymer-Hydrogels oder des Biohybridmaterials gemäß der Erfindung darin.
STAND DER TECHNIK
Die Organtransplantation ist zur Zeit die einzige Alternative, um Organversagen zu mindern und um die Funktion und Leistung von Organen wiederherzustellen oder zu verbessern. Einige der Nachteile von Organtransplantationstherapien sind jedoch das Potential einer Spender-zu-Empfänger Krankheitsübertragung, der Mangel und die begrenzte Verfügbarkeit von Spenderorganen und mögliche immunologische Kreuzreaktionen.
So ist z.B. die Rückenmarkstransplantation weder klinisch noch biologisch machbar und als Konsequenz steht zur Zeit keine Behandlung für SCI-Patienten zur Verfügung, obwohl es in den Vereinigten Staaten allein 250.000 chronisch gelähmte Patienten gibt, mit einer Zunahme von 10.000 SCI-Patienten pro Jahr.
Auf der anderen Seite kann die Implantation, Transplantation oder Injektion von Zellen in den Körper, um fehlende Zellen oder Teile von gewebeartigen Organen zu ersetzen oder wiederherzustellen aufgrund des Fehlens einer unterstützenden extrazellulären Matrix als notwendiges Gewebegerüst zur Gewebeexpansion und -Organisationen eine integrierte Struktur, die mit dem Wirtsorgan in Kontakt steht, eine ordnungsgemäße Bildung von neuem Gewebe nicht erreichen. Zusätzlich dazu müssen die Zellen in eine physiologisch äquivalente Umgebung verbracht werden, die die Diffusion von Nährstoffen, Sauerstoff, humoralen und zellulären Komponenten erleichtert, um nach der Implan tation eine hohe Zelllebensfähigkeit und ein hohes Wachstumspotential zu erhalten.
Poröse Hydrogele der vorliegenden Erfindung sind deformierbare poröse Polymermatrizes, die mit interstitialem Fluid oder Wasser gesättigt sind und somit das notwendige Gewebegerüst und den hydratisierten Raum bereitstellen, indem die Zellen sich ausbreiten und sich zu suprazellulären Gewebearchitekturen mit einer histologisch korrekten Struktur zusammenfügen können, um funktionierendes Neogewebe zu erhalten.
Verschiedene experimentelle Strategien der intraspinalen Transplantation sind in der Literatur als Versuche beschrieben, Schäden im Rückenmark (tierische Modelle), unter Verwendung verschiedener Implantatmaterialien zu beheben, die in zwei grobe Kategorien von Implantaten eingeordnet werden können: (1) biologische Gewebe und (2) prosthetische Materialien.
In Kategorie (1) ist folgendes eingeschlossen, nämlich die Verwendung von Spendergewebetransplantaten, wie z.B. fötales Nervengewebe, entweder als syngenische Autotransplantate oder Homotransplantate, als Allotransplantate oder Xenotransplantate, um Läsionen des Rückenmarks zu überbrücken, entweder (a) als festes Transplantat (z.B. Bregman, Dev. Brain Res. 34, 265, 1987; Houlé und Reier, J. Comp. Neurol., 269, 535, 1988) oder (b) als Suspensionstransplantate, die folgendes einschließen, nämlich gemischte Nervengewebezellen (z.B. Goldberg und Bernstein, J. Neuroscience Res., 19, 34, 1988; Hoovler und Wrathall, Acta Neuropathol., 81, 303, 1991); Schwann-Zellen, die mit kultivierten sensiblen Neuronen rekombiniert wurden (Kuhlengel et al., J. Comp. Neurol., 293, 74, 1990); unreife Astrozyten (z.B. Bernstein und Goldberg, Res. Neurol. Neurosci., 2, 261, 1991); Precursor von Nervengewebezellen (Monteros et al., Dev. Neurosci., 14, 98, 1992) und immortalisierte etablierte Zelllinien (Zompa et al., Int. J. Dev. Neurosci., 11, 535, 1993); periphere Nervensegmente einschließlich von kultivierten nicht-neuronalen Zellen (Wrathall et al. Acta Neuropathol., 57, 59, 1982) oder mit embryonalem Nervengewebe (Horvat et al., Res. Neurol. Neurosci., 2, 289, 1991). Prosthetische Materialien, die in Kategorie (2) offenbart wurden, schließen folgendes ein, nämlich reine Kollagenmatrizes (de la Torre und Goldsmith, Brain Res. Bull. 35, 418, 1994; Marchand und Woerly, Neurosci., 36, 45, 1990; Gelderg, Brain Res. 511, 80, 1990), solche die neuroaktive Mittel enthalten (Goldsmith und de la Torre, Brain Res., 589, 217, 1992) oder solche die kultivierte Nerventransplantate einschließen (Bernstein und Goldberg, Brain Res. 377, 403, 1986); behandelte Nitrozelluloseimplantate (Schreyer und Jones, Dev. Brain Res., 35, 291, 1987; Houlé und Johnson, Neurosci. Lett. 103, 17, 1989); Kollagenimplantate (Paino et al., J. Neurocytol., 23, 433, 1991) und Polymerführungskanäle aus Poly(acrylonitril-vinylchlorid)(Xu et al., J. Comp. Neurol., 351, 145, 1995), die Schwann-Zellen einschließen.
Diese Ansätze konzentrieren sich sehr stark auf die Förderung der Axon Regeneration unter Verwendung von verschiedenen Gewebesubstraten als Quellen für neue Axone oder unter Verwendung von komplexen prosthetischen Substraten, um wachsende Axone zu unterstützen und zu führen und gehen nicht auf klinisch relevanten Punkte der Reparatur von Rückenmark oder Hirngewebe durch Regeneration der Hauptmasse des Wirtsgewebes und des Remodelling in der Wundheilung, z.B. nach dem Entfernen von nektrotischem oder Narbengewebe im Anschluss an eine Verletzung ein.
Polymer-Hydrogele sind als Implantate im Nervensystem offenbart worden (Woerly et al., Biomaterials, 11, 97, 1990; Woerly et al., Biomaterials, 12, 197, 1991; Woerly et al., J. Neural Transpl. Plast. 3, 21, 1992; Woerly et al., Cell Transpl., 2, 229, 1993; Woerly et al., J. Neural Transpl. Plast., 5, 245, 1995). Diese Hydrogele wurden durch eine Polymerisation mit freien Radikalen in Wasser unter Verwendung von Ammonium Persulfat und Natriummetabisulfit oder -persulfat und Ascorbinsäure als Redoxstarter entweder mit Hydroxyethylmethacrylat (pHEMA), Glycidylmethacrylacrylat (pGMA) oder N-Hydroxypropylmethacrylamid (pHPMA) oder mit einer Zusammensetzung hergestellt, die die zuvor genannten Monomere zusammen mit einem Vernetzungsmittel einschließt, bei dem es sich entweder um Ethylenglycol oder Tetraethylenglycoldimethacrylat oder Methylen-bis-acrylamid handelt. Diese Gele sind typischerweise homogen und optisch transparent mit einer bimodalen Porosität, die offene (zugängliches Porenvolumen) und geschlossene Poren einschließt, wie dies durch Quecksilberporosimetriedaten und Rasterelektronenmikroskopie gezeigt wurde; typischerweise wird die poröse Struktur dieser Gele aus parallelen zylindrischen Kapillaren mit einem kreisförmigen Querschnitt, mit einem durchschnittlichen Porendurchmesser von 7 bis 13 μm, gebildet, wie dies in 1 gezeigt ist. Die fraktionelle Porosität liegt im Bereich von 50 bis 85% für pHEMA Hydrogele, von 60 bis 65% für pGMA Hydrogele und von 70 bis 94% für pHPMA Hydrogele. Zumindest 50% des Porenvolumens des Hydrogels wird von Poren mit 1,2 bis 4 μm für pHEMA, 6 bis 13 μm für pGMA und 10 bis 14 μm für pHPMA besetzt. Es wurde herausgefunden, dass ihre biologische Aktivität von der Einführung oder Copolymerisation von Kollagen in das vernetzte Netzwerk abhängt. Der Anmelder hat experimentelle Implantationen im Gehirn durchgeführt, die gezeigt haben, dass ein gewisser Grad an Gewebereparatur in Abhängigkeit von dem Grad des Einwachsens von Gewebe in die homogenen Gelmatrizes erreicht werden kann. Diese Reaktion ist in Abhängigkeit von der Monomerzusammensetzung und den hinzugefügten funktionellen Gruppen variabel. Homogene Hydrogele induzieren jedoch häufig die Bildung von fibrösen Kapseln, die dazu tendieren, die Implantate von dem Wirt zu isolieren. Dies geht sowohl auf die mechanischen Eigenschaften dieser Gele, die nicht ausreichend mit denen von lebenden Nervengewebe übereinstimmen als auch auf den geringen Volumenanteil von Makroporen zurück. Im Rückenmark integrieren sich diese homogenen Hydrogele nicht in den Wirt und werden schnell und ohne Durchdringung durch Axone oder Gewebekomponenten durch Bindegewebe und Glialnarben verkapselt, wie dies in 2 gezeigt ist. Zusätzlich dazu gibt es physikalische Überlegungen, die die Oberfläche beschränken, die erzeugt werden kann, die einen wichtigen Parameter für eine erfolgreiche Gewebeinteraktion darstellt, die durch die zylindrischen Poren in solchen homogenen Gelen erzeugt wird. Bei einem festgelegten Volumen an Gel erreicht die Oberfläche eine Grenze, die dem maximalen Radius einer einzelnen Pore entspricht, die das Gesamtvolumen des Gels besetzt. Auf der anderen Seite führt ein Erhöhen der Oberfläche durch ein Verringern der Größe der Poren zu einer Abnahme des Gesamtporenvolumens, was mit dem Einwachsen von Gewebe und der Biomassenakkumulation inkompatibel ist.
Harvey et al., in Brain Res., 671, 119, 1995 offenbaren einen Polymerschwamm aus Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), der als Gehirnimplantat für die Geweberegeneration und das Axonwachstums verwendet wird. Diese Produkt wird am besten mit der Zugabe von Kollagen als Gewebebioklebstoff zu dem Polymernetzwerk und nach dem Einschließen von Schwann-Zellen verwendet.
Das US-Patent Nr. 4,902,295 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen eines künstlichen Gewebes aus Pankreasgewebezellen. Dieses Verfahren ist mit der Polymerisation von Matrixprecursoren, von Gelprecursoren und von Promotoren mit lebensfähigen Zellen in wässriger Phase verbunden. Sowohl alle Polymerprecursor als auch die Promotoren sind dabei biologische Verbindungen, die gegenüber einem schnellen biologischen Abbau im Körper anfällig sind und die nach der Implantation keine Langzeitstabilität aufweisen.
Bellamkonda, R.; Ranieri, J. P.; Bouche, N.; Aebischer, P. („Hydrogel-Based Three-dimensional Matrix for Neural Cells", J. Biomed. Mat. Res. 1995, 29, 663–671) beschreiben eine Technik zum Immobilisieren von Nervengewebezellen in Agarose und extrazellulär-äquivalenten (Matrigel^®) Gelen. Diese Materialien sind biologisch und sind biologisch abbaubar.
Krewson, C. E.; Chung, S. W.; Dai, W.; Saltzman, W. M. („Cell Aggregation and Neurite Growth in Gels of Extracellular Matrix Molecules". Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 555–562) beschreiben eine Technik, in der PC12-Zellen in Gelen aus Kollagen alleine oder Collagen kombiniert mit Fibronectin oder Laminin und in Gelen aus Agarose und Kollagen suspendiert sind. Diese Gele sind biologisch abbaubar.
Cascone, M. G.; Laus, M.; Ricci, D.; Sbarbati del Guerra, R. („Evaluation of Poly(vinyl alcohol) Hydrogels as a Component of Hybrid Artifical Tissues", J. Mat. Sci. Mat. Med. 1995, 6, 71–75) beschreiben eine Technologie unter Verwendung von Polyvinylalkohol-Hydrogelen, die physikalisch vernetzt sind und in die fibroblastische Zellen durch einen Einfrier- und Auftauzyklus eingeführt werden.
Wald, H. L.; Sarakinos, G.; Lyman, M. D.; Mikos, A. G.; Vacanti, J. P.; Langer, R. („Cell Seeding in Porous Transplantation", Biomat. 1993, 14, 270–278) beschreiben ein Verfahren zum Einschließen von Hepatozytenzellen in abbaubaren Polymerschäumen aus Poly(L-milchsäure) durch eine Mikroinjektionstechnik. Diese Technik stellt keine nicht abbaubare Matrix zur Verfügung und ermöglicht keine uniforme Zellverteilung in der Polymermatrix.
Mikos, A. G.; Bao, Y.; Cima, L. G.; Ingber, D. E.; Vacanti, J. P.; Langer, R. („Preparation of Poly(glycolic acid) Bonded Fiber Structures for Cell Attachment and Transplantation", J. Biomed. Mat. Res. 1993, 27, 183–189) beschreiben ein Verfahren zum Bilden von Netzwerken aus Polyglykolsäure mit verbundenen Fasern um Hepatozyten zu kultivieren. Dieses Polymer ist biologisch abbaubar und das Verfahren zum Einführen der Zellen in die Matrix unterscheidet sich von einem Einschließen.
Puerlacher, W. C.; Mooney, D.; Langer, R.; Upton, J.; Vacanti, J. P.; Vacanti, C. A. („Design of Nasoseptal Cartilage Replacements Synthezized from Biodegradable Polymers and Chondrocytes", Biomat. 1994, 15, 774–778) und Freed, L. E.; Marquis, J. C.; Nohria, A. Emmanual; Mikos, A. G.; Langer, R. („Neocartilage Formation In Vitro and In Vivo Using Cells Cultured on Synthetic Biodegradable Polymers", J. Biomed. Mat. Res. 1993, 27, 11–23). Diese Referenzen beschreiben ein Verfahren zum Einführen von Chondrozytenzellen in Polyglykolsäure (PGA) oder Polymilchsäure (PLLA) oder PGA-PLLA Matrizes durch Kapillarwirkung. Dieses Verfahren ergibt biologisch abbaubare Polymermaterialien während die Zellen nicht gleichförmig in dem Polymer verteilt sind und es ermöglicht es nicht, die Zelldichte zu steuern.
Cao, Y.; Vacanti, J. P.; Ma, X.; Paige, K. T.; Upton, J.; Chowanski, Z.; Schloo, B.; Langer, R.; Vacanti, C. A. („Generation of Neo-Tendon Using Synthetic Polymers Seeded with Tenocytes", Transpl. Proc. 1994, 26, 3390–3391) beschreiben ein Verfahren, um Tenozytenzellen in einem geprägten nicht-gewirkten Gewebe aus Polyglykolsäure anzusiedeln.
Mooney, D. J.; Park, S.; Kaufman, P. M.; Sano, K.; McNamara, K.; Vacanti, J. P.; Langer, R. („Biodegradable Sponge for Hepatocyte Transplantation", J. Biomed. Mat. Res. 1995, 29, 959–965) und Takeda, T.; Kim, T. H.; Lee, S. K.; Langer, R.; Vacanti, J. O. („Hepatocyle Transplantation in Biodegradable Polymer Scaffolds Using the Baltimatian Dog model of Hyperuricosuria", Transpl. Proc. 1995, 27, 635–636) beschreiben ein Verfahren, um Hepatozytenzellen durch Absorption und Kapillarwirkung in Bögen aus Polyglykolsäure-Polymervliesen oder in Polymerschwämme zu absorbieren, die aus Polymilchsäure und Polyvinylalkohol und aus Polymilchsäure-glykolsäure hergestellt wurden. Dieses Verfahren ergibt biologisch abbaubare Polymermaterialien, während die Zellen nicht gleichförmig in dem Polymer verteilt sind und es ermöglicht es nicht, die Zelldichte zu steuern.
Woerly, S.; Plant, G. W.; Harvey, A. R. („Cultured Rat Neuronal and Glial Cells Entrapped within Hydrogel Polymer Matrices: A Potential Tool for Neural Tissue Replacement", Neurosci. Lett. 1996, 205, 197–201) offenbaren ein Verfahren zum Einschließen von Nervengewebezellen in homogenen transparenten Polymergelen aus Poly[N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamid], die Kollagen als Anhaftungssubstrat enthalten können. Dieses Verfahren ist mit der Zugabe einer Zellsuspension zu der Polymermischung und der Polymerisation der Zellen-Polymermischung bei Raumtemperatur oder in einem bei 37°C gehaltenen Inkubator verbunden. Das resultierende Gel ist optisch transparent, und die Zellen sind zufällig in dem vernetzten Gel verteilt. Immunocytochemische Studien zeigen an, dass die Zelllebensfähigkeit nach 6 Tagen in vitro zwischen 0 und 6% variierte.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die Nachteile des Standes der Technik durch Verwendung einer nicht biologischen prosthetischen Vorrichtung, wie beispielsweise eines nicht abbaubaren Polymer-Hydrogels zu beheben, die als raumerfüllendes Material und als Gerüstbilder wirkt, und die die Geweberegeneration, Morphogenese und das Remodelling in eine integrierte Struktur-zu-Organ stimuliert.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, das Heilen von Gewebe in Richtung einer Gewebebildung zu verbessern, wobei dies durch das Steuern der Zellproliferation, der Zellinfiltration und der Gewebeorganisation in einer stabilen Polymermatrix erreicht werden kann.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Geweberegenerationen mittels von Polymermatrizes bereitzustellen, was einen großen Nutzen und wichtige klinische und wirtschaftliche Auswirkungen für Menschen hätte, die unter Rückenmarks-(SCI) oder Gehirnverletzungen oder unter Entwicklungsdefekten des Rückenmarks (Spina Bifida) leiden.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Polymermatrizes zur Regeneration des Sehnervs und der peripheren Nerven bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine nicht-abbaubare synthetische Polymer-Hydrogelmatrix mit folgendem bereitzustellen, nämlich einer anisotropen porösen Struktur, einer effektiven Oberfläche und einer guten Gewebeanhaftbarkeit und -kompatibilität, die dazu ausgelegt ist, in weiche Gewebestrukturen und insbesondere im Nervensystem implantiert zu werden, und die progressiv ein Teil des Organs wird.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, synthetische Polymermatrizes mit einer gesteuerten Porenstruktur, die oberflächenaktive Mittel tragen, für die therapeutische Verwendung bereitzustellen.
Es ist ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, eine Polymermatrix bereitzustellen, die aus einem neuen wasserunlöslichen Polymer-Hydrogel besteht das im gequollenen Zustand als prosthetische Vorrichtung zur Geweberegeneration für die Reparatur von weichen Organen verwendet wird.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines Hydrogelprodukts in einer Form bereitzustellen, die die Form der endgültigen prosthetischen Vorrichtung aufweist.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen oder mehrere Nachteile des Standes der Technik zu beheben und eine Polymerneuroprothese bereitzustellen, die unter Verwendung von üblichen chirurgischen Verfahren im Gehirn oder im Rückenmark implantiert werden kann.
Es ist ferner ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, durch das Zellen oder genetisch modifizierte Zellen in Polymernetzwerke eingeführt werden können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Polymermischung bereitzustellen, die mit lebenden Zellen vermischt werden kann, wodurch die physikalischen Eigenschaften einer Polymermatrix mit einem Verhalten vom Hydrogeltyp (Porosität, Stabilität, Führungsoberflächen, Permeabilität) und mit zellulären, biologischen Faktoren (z.B. Wachstumsfaktoren) kombiniert werden.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Biohybridvorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die dazu verwendet werden können, Teile von Geweben von weichen Organen zu ersetzen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ein dreidimensionales Kultursystem bereitzustellen, das dazu verwendet werden kann, unterschiedlichste Zellen für längere Zeiträume in vitro zu kultivieren.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Unterstützungsmatrizes zum Anbringen von biologisch-aktiven Molekülen an Geweben oder Organen bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, poröse Hydrogele bereitzustellen, die deformierbare poröse Polymermatrizes sind, die mit interstitialem Fluid oder Wasser gesättigt sind, wodurch das nötige Gewebegerüst und der nötige hydratisierte Raum bereitgestellt wird, durch welche sich die Zellen fortpflanzen und in einer histologisch richtigen Struktur zu superzellularen Architekturen zusammenfügen können, um funktionelles Gewebe zu ergeben.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Komponente für Systeme zur gesteuerten Abgabe von Medikamenten und Makromolekülen bereitzustellen, insbesondere für entzündungshemmende Substanzen wie beispielsweise Indomethacin, für Stimulatoren von Zytokinen wie beispielswese bakterielle Liposaccharide, für Steroide wie beispielsweise mit Methylprenisolon und für neuroaktive Faktoren, wie beispielsweise Fibroplastenwachstumsfaktoren.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Material bereitzustellen, das eine starke Bioanhaftung und hemostatische Eigenschaften aufweist, und das zum Einbringen in inneres weiches Gewebe, für ein schnelles Anhaften und zur gleichen Zeit zur Hämostase geeignet ist.
Es ist ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, eine Polymermatrix bereitzustellen, die eine mechanische und chemische Stabilität aufweist, um eine Langzeitimplantation im Kör per ohne Abbau auszuhalten, was ansonsten das Netzwerk von neuem Gewebe beschädigen kann, das in die Matrix zum Ersetzen eines Teil des Organs eingewachsen ist.
Es ist außerdem ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Matrix mit einer mechanischen Nachgiebigkeit bereitzustellen, die es ermöglicht, das die Polymermatrix durch den Operateur geschnitten, größenmäßig angepasst und gehandhabt wird, ohne die interne Struktur und die mechanischen Eigenschaften der Matrix zu verändern.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein quellbares Material mit einer hohen Quellkapazität in wässrigen Medien bereitzustellen, das signifikante Mengen von Substanzen absorbieren kann, die für den Zweck der vorliegenden Erfindung von biologischem Interesse sind, wie z.B. Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise CAM und L1 Moleküle oder Führungsmoleküle, wie beispielsweise Semaphorine oder Netrine, die in einer geeigneten Lösung gelöst sind, so dass diese Moleküle anschließend an der Oberfläche des Netzwerks der Polymermatrix absorbiert werden.
Gemäß der Erfindung werden neue hydrophile Polymer-Hydrogele bereitgestellt, die in der Lage sind, poröse, weiche, hochabsorbierende Polymermatrizes zu bilden, die elastisch deformierbar sind und einen Gleichgewichtswassergehalt von zumindest 80%, vorzugsweise zumindest 96% aufweisen.
Außerdem werden gemäß der Erfindung Polymermischungen bereitgestellt, die mit lebenden Zellen vermischt werden können.
Die Erfindung betrifft ein Polymer-Hydrogel zur therapeutischen Verwendung, das ein Copolymer aus Folgendem ist, nämlich (a) einem N-substituierten Methacrylamid oder Acrylamid, (b) einem Vernetzungsmittel, und (c) einem polymerisierbaren Material, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Zucker, einem Zuckerderivat, einem Gewebeanhaftungspeptid, Gewebedifferenzierungsmolekülproteinen wie knochenmorphogenetischen Proteinen und einem Polymerkonjugat mit Antikörpern gegen Lipidderivate, das elastisch deformierbar ist und einen Gleichgewichtswassergehalt von zumindest etwa 80% und vorzugsweise zumindest 96% aufweist.
Vorzugsweise ist das N-substituierte Methacrylamid oder Acrylamid (a) ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den N-Monoalkyl- und N,N-Dialkylmethacrylamiden und -acrylamiden, das Vernetzungsmittel (b) weist vorzugsweise ein Acrylamid oder Precursoren davon auf und das polymerisierbare Material, (c) ist vorzugsweise ein Zucker, der ausgewählt ist, aus der Gruppe bestehend aus Glucosamin, N-Acetylglucosamin und einem N-Acetylderivat von Neuraminsäure und deren polymeren Formen wie Polysialinsäure.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Herstellen eines Polymer-Hydrogels zur therapeutischen Verwendung, das folgendes aufweist, nämlich (a) Auflösen eines Vernetzungsmittels in einem porenbildenden Lösemittel mit einem Starter für eine freie Radikalpolymerisation, um eine Lösung zu bilden, (b) Zugeben eines N-substituierten Methacrylamids oder Acrylamids zu der in (a) erhaltenen Lösung, um eine Mischung zu bilden, und (c) Zugeben einer Lösung eines Zuckers, eines Zuckerderivats, eines Gewebeanhaftungspeptids, morphogenetischer Proteine oder bioaktiver Peptidderivate oder eines Polymerkonjugats mit Antikörpern gegen Lipidderivate zu der in (b) erhaltenen Mischung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist das Verfahren folgendes auf, nämlich Auflösen von Azobisisobutyronitril und Methylenbisacrylamid in dem Lösemittel, um eine Lösung zu bilden, Vermischen der Lösung mit N-2-(Hydroxypropyl)methacrylamid, Zugeben von Glucosamin oder N-Acetylglucosamin oder N-Acetylneuraminsäure und Entfernen der Restprodukte mit niederem Molekulargewicht und Spuren des Starters.
In Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform weist das Verfahren ferner das Zugeben von lebenden Gewebezellen oder genetisch modifizierten Zellen zu dem in (c) erhaltenen Produkt und das Durchführen der Polymerisation der Zellen in diesem Produkt auf.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform, weist das Polymer-Hydrogel gemäß der Erfindung Zellen oder genetisch modifizierte Zellen auf, die darin polymerisiert sind.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Behandeln von geschädigten Zerebralgeweben oder Rückenmarksverletzungen, das folgendes aufweist, nämlich Entfernen der geschädigten Zerebralgewebe oder des geschädigten Rückenmarks in einem menschlichen Wesen oder einem Tier und Ersetzen der geschädigten Zerebralgewebe oder des geschädigten Rückenmarks mit einem Polymer-Hydrogel gemäß der Erfindung.
Das Hydrogel gemäß der Erfindung ist ein kovalent vernetztes nicht-transparentes, heterogenes Material, das vorzugsweise eine klare phasengetrennte Struktur zeigt, die aus Polymerpartikeln von etwa 1 bis 10, vorzugsweise 3 bis 5 μm gebildet wird, um einen Bereich relativ grober Porosität (Makroporen), in dem das Hydrogel dazu vorgesehen ist, mit einem Wirtsgewebe in Verbindung zu stehen und einen Bereich relativ feiner Porosität (Mesoporen) zu schaffen, in dem es dazu vorgesehen ist, mit einem einwachsenden Gewebe in Verbindung zu stehen.
Dies resultiert in einer vorzugsweise schwammähnlichen Struktur mit einer makroporösen Struktur; in einer fraktionellen Porosität von z.B. zumindest 80 bis 90% (Volumen des Eindringens von Quecksilber zu dem Gesamtvolumen des Gels); in einer spezifischen Oberfläche, vorzugsweise im Bereich von Hunderten von Quadratmetern pro Gramm Gel; in einem mittleren Porendurchmesser (Volumen) von z.B. etwa 15 bis 35 μm; in einem Porenvolumen von Poren gleich oder größer als 10 μm gleich 100% der fraktionellen Porosität des Hydrogels; in einem hyperporösen Charakter (die fraktionelle Porosität des Gels beträgt zumindest 50% des Gelvolumens) von 20–30 μm.
Die Makrostruktur und Porosität des Hydrogels kann durch Steuern der Größe der Partikel und der porösen Struktur manipuliert werden, die von der Zusammensetzung und den Eigenschaften des verwendeten porenbildenden Lösemittels, dem Polymervolumenanteil, der Polymer-Lösemittel-Interaktion, der Polymerisationstemperatur und den Eigenschaften des verwendeten vernetzenden Monomers abhängt. Eine erfolgreiche Akkumulation von Biomasse und eine erfolgreiche Zelleninteraktion resultiert aus einer solchen optimalen Oberfläche-Volumen-Interaktion, wie diese durch Quecksilberporosimetriedaten gezeigt wird, die aus der Mikro- und Mesoporosität der Polymerpartikel resultiert.
Ein letzter wichtiger Aspekt des Materials ist seine offene Natur und seine untereinander Verbundenheit, was für die Biomassenzellakkumulation und die Zell/Molekülwechselwirkung mit lebendem Gewebe geeignet ist. Unter dem Rasterelektronenmikroskop, zeigen diese heterogenen Gele, wie in 3 gezeigt, typischerweise eine dreidimensionale Struktur vom Kolloidtyp mit nicht kreisförmigen Poren, wobei die Wände des Porensystems durch die Nähe der Oberflächen der Polymeraggregate gebildet werden, wie in den Zeichnungen gezeigt ist. Die effektive Oberfläche ist eine Funktion der Porosität der Partikeloberfläche. Im Gegensatz zu homogenen Gelen ist ein Hauptvorteil von solchen heterogenen Gelen, dass die durch die Partikel erzeugte Oberfläche virtuell unbegrenzt ist, da die Größe der Aggregate (1) abnimmt, so dass die Oberfläche invers proportional zu 1 ist. Außerdem zeigen die heterogenen Hydrogele der vorliegenden Erfindung im Vergleich mit homogenen Hydrogelen ein viel größeres Porenvolumen und sind daher effektiver für die Zellinfiltration und die Biomassenakkumulation. Zusätzlich dazu und im Vergleich mit homogenen Hydrogelen weisen die Hydrogele gemäß der Erfindung mechanische Nachgiebigkeitseigenschaften auf, die denen von erwachsenem und sich entwickelndem Nervengewebe entsprechen.
Diese Hydrogelmatrizes weisen echte gewebespezifische Architekturen auf, da die Zellinteraktion zu einem organisierten Gewebenetzwerk in den Gelstrukturen, einen sogenannten organoiden Hydrogel führt.
Die Polymermatrizes können durch gleichzeitige Präzipitation oder Präzipitatpolymerisation und vernetzende Polymerisation einer effektiven Menge eines jeden der folgenden Bestandteile gebildet werden: (i) N-substituierte Methacrylamide wie beispielsweise N-Monoalkylmethacrylamide oder N-substituierte Acrylamide, wie beispielsweise N-Monoalkylacrylamide oder N,N-disubstituierte Acrylamide, wie beispielsweise N,N-Dialkylacrylamide; (ii) ein Vernetzungsmittel wie beispielsweise Acrylamid oder Precursor davon oder Divinylverbindungen und ähnliche; (iii) ein Starter für eine freie Radikalpolymerisation wie beispielsweise Azobisisobutyronitril, verschiedene Peroxide, Ascorbinsäure, Peroxysulfate, substituierte Azoverbindungen und ähnliche, die dem Fachmann bekannt sind, in Mengen, die von 0,01 bis 2 Gew.-% bezogen auf das Copolymer oder Terpolymer variieren können; (iv) komplexe Zucker wie Glucosamin oder N-Acetylglukosamin oder N-Actylgalactosamin oder N-Acetylneuraminsäure oder Polysialinsäure oder andere Zuckerderivate oder Gewebeanhaftungsoligopeptide, die Sequenzen wie beispielsweise Arg-Gly-Asp, Ile-Lys-Val-Ala-Val, Ala-His-Ala-Val-Ser-Glu, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg aufweisen, Oligopeptide, die aus gewebedifferenzierenden Molekülen entstanden sind (z.B. knochenmorphogenetische Proteine) oder Polymerkonjugate mit Antikörpern gegen Myelin und Axon-assoziierte Lipide und deren Derivate in einem Lösemittel, vorzugsweise Aceton/Dimethylsulfoxid, Aceton oder Aceton/Ethanol.
Die Alkylgruppen weisen vorzugsweise ein bis zwei Kohlenstoffatome, z.B. C₁ bis C₂ Hydroxyalkyl und Aminoalkylreste auf. Der Ausdruck N-substituiert, wie er hierin verwendet wird, schließt C_1-8-Substituenten ein, die OH, eine Aminogruppe oder Kombinationen davon aufweisen können.
Die Reaktion wird im Allgemeinen bei einer Temperatur von 40 bis 60°C für ein Zeitraum von etwa 12 Stunden, in einem Polymerisationsgefäß durchgeführt, das aus versiegelten Ampullen besteht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine mikroskopische Ansicht eines homogenen Gels;
2 ist eine mikroskopische Ansicht eines homogenen Gels, das in Rückenmark implantiert wurde;
3 ist eine mikroskopische Ansicht eines heterogenen Gels aus HPMA;
4 ist eine mikroskopische Ansicht des Gels von 3, das in Nervengewebe implantiert wurde.
AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele weiter illustriert.
BEISPIEL 1
AIBN (Azobisisobutyronitril) (1,2% w/w) und Methylenbisacrylamid (1 mol-%) wurden in trockenem Aceton gelöst. Die Lösung wurde mit N-2-(Hydroxypropyl)methacrylamid in einem Volumenverhältnis von 30% HPMA mit einer Mischung aus Aceton/Dimethyl sulfoxid (93:7 v/v) vermischt. N-Methacryloylglucosamin (5 Gew.-%) oder 1-Methyl-2-methacryloylamidoethyl-2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucosid (6,5 Gew.-%) oder 2-[1-Methyl-2-methacryloylamidoethyl]-5-acetamido-3,5-didesoxy-D-glycero-α-D-galacto-2-nonulopyranosidonsäure (5,2 Gew.-%), oder Methacryloylglycylglycylarginylglycylasparaginsäure (1,4 Gew.-%), wurde in Dimethylsulfoxid gelöst und zu der Polymerisationsmischung zugegeben. Die Mischung wurde sorgfältig homogenisiert und in eine Spritze geladen und in Ampullen injiziert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Stickstoff gespült und die Ampullen wurden durch Abflammen versiegelt. Um ein Verdampfen des Lösemittels zu vermeiden, kann die Mischung vor dem Abflammen der Ampulle zuerst in einer Mischung aus Trockeneis und Ethanol einfroren werden. Die versiegelten Ampullen wurden dann 24 Stunden in ein Wasserbad mit 50°C eingetaucht.
Gemäß der Erfindung werden vorzugsweise die Restprodukte mit niederem Molekulargewicht wie beispielsweise unreagierte Monomere, Oligomere, die nicht in das Netzwerk eingeschlossen wurden und Spuren des Starters vor der Verwendung des Hydrogels aus diesem entfernt. Dieses kann durch Folgendes erreicht werden, nämlich Eintauchen des Xerogels in Ethanol für 20 Stunden, dann in eine Mischung aus Ethanol/Wasser (1:1 v/v) für 20 Stunden und destilliertes Wasser für eine Woche mit häufigen Wasserwechseln bis das Quellgleichgewicht erreicht ist und die Extraktionsgeschwindigkeit niedrig, vorzugsweise Null ist. Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, eine Kontamination zu vermeiden. Die Herstellung des Polymergels erfolgt vorzugsweise in einer Biohazardkammer mit einem gefilterten Luftfluss. Die Waschschritte werden vorzugsweise unter Verwendung von sterilen Materialien durchgeführt und die Gele werden bei 4°C in sterilem, destilliertem Wasser gelagert.
Um eine Hybridvorrichtung zu bilden, die sowohl die Polymervorrichtung als auch Spendergewebezellen einschließt, können Zellen durch Mikropunkturen des Polymernetzwerks unter Verwendung einer Hamiltonspritze, die die Zellsuspension enthält, in die poröse Struktur des Polymerhydrogels eingeimpft werden. Die Einführung von Zellen in das Polymerhydrogel kann entweder in vitro oder in vivo im Anschluss an eine ausreichende Zeit nach der Implantation des Hydrogels in den Zielorganbereich erfolgen. Die Zellen können aus menschlichem Gehirn- oder Muskelgewebe oder Autopsiematerial isoliert werden.
BEISPIEL 2: Einimpfen von Zellen in ein PHPMA Hydrogel in vitro.
Neuronen ohne Meningen und Blutgefäße wurden in DMEM aus den Cerebralhälften von Rattenembryonen isoliert und zu kleinen Gewebefragmenten zerkleinert. Die Gewebe wurden mit einer Pasteurpipette in einem Zentrifugenröhrchen, das DMEM enthielt, mechanisch dissoziiert. Der Überstand wurde aufgehoben und die abgesetzten Gewebefragemente wurden weiter mit einer Pasteurpipette aufgetrennt, die flammpoliert war, um die Spitze zu verengen. Nach mehreren Zyklen der Zellresuspension/-dissoziation wurden die vereinigten Überstände zentrifugiert und die Zellen wurden auf 10⁶ Zellen pro 100 μl Medium konzentriert. Die Fraktion wurde auf Eis gehalten bis sie für das Einschließen von Zellen verwendet wurde. Für ein effizientes und verlässliches Eindringen der Zellen in das Polymer-Hydrogel wurden die Zellen in eine Hamiltonspritze aufgenommen, die mit einer Mikromanipu latorvorrichtung verbunden war, und mit minimalem Druckschaden und der gewünschten Konzentration unter einem Binokularmikroskop und unter aseptischen Bedingungen in die gequollenen PHPMA Hydrogele eingeimpft. Die Zellen-enthaltenden Hydrogele wurden in einem minimalen Volumen von Kulturmedium aufbewahrt und bei 37°C und 5% CO₂ in einer angefeuchteten Atmosphäre inkubiert. Sobald die Zellen den geeigneten Grad an Wachstum erreichet haben, kann die Hybridvorrichtung in das Gehirn transplantiert werden, um die Rekonstruktion und Reparatur von Gewebe zu erleichtern.
Die Polymermischung kann mit lebenden Zellen vermischt werden, wodurch die physikalischen Eigenschaften der Polymermatrix mit einem Verhalten vom Hydrogeltyp (Porosität, Stabilität, Führungsoberflächen, Permeabilität) und zellulären biologischen Faktoren (z.B. Wachstumsfaktoren) kombiniert werden.
Das Einführen der Zellen in eine Polymermatrix wird durch ein Gel-Einschlussverfahren bei einer Temperatur unter Null, d.h. durch Cryopolymerisation, erreicht, das eine poröse Matrix ergibt, in der Zellen immobilisiert sind und eine Reorganisation, ein Wachstum und/oder eine Differenzierung für eine anschließende Transplantation erreichen können. Das Lösemittel sollte eine istonische Lösung oder ein Gewebekulturmedium von dem Typ sein, der üblicherweise in Zell- und Gewebekulturen verwendet wird, und zwar kombiniert mit einem geeigneten Kälteschutzmittel (Glycerin/Dimethylsufoxid oder Glycerin oder DMSO oder Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxyethylstärke, Carboxymethylcellulose). Das Verfahren ermöglicht es, die endgültigen Zelldichten zu steuern, die von einigen wenigen Zellen bis zu Zelldichten reichen, die sich der Zelldichte von Gewebe, etwa 10⁹ bis 10¹⁰ Zellen/cm³ annähern. Das Verfahren ermöglicht es außerdem, die Matrixporosität durch ein Variieren der Geschwindigkeit des Abkühlens und der Temperatur der Zellen-enthaltenden Polymerisationsmischung (flüssiger Stickstoff oder gekühltes Isopentan) zu variieren und zu steuern. Das Verfahren ergibt eine makroporöse schwammartige Struktur, die typisch ist für Cryogele mit einer Porengröße, die die Diffusion von Nährstoffen und Makromolekülen (z.B. Wachstumsfaktoren) zu und von den Zellen, die in der Polymergelmatrix eingeschlossen sind und Zellmigration ermöglicht, und mit einem Porenvolumen, das für eine effektive Biomassenakkumulation, Expansion (Zellteilung) und Organisation (Zelle-an-Zelle Berührung) während der Entwicklung und Reifung des Gewebes geeignet ist.
BEISPIEL 3: Geleinschluss von Astrozyten durch Cryopolymerisation von HPMA
Astrozyten wurden durch Inkubation von Hirnrinden von zwei Tage alten neugeborenen Ratten in einer Lösung, die 0,1% Trypsin-EDTA, 0,001% DNAse in Hepes gepuffertem DMEM enthielt, für 30 Minuten bei 37°C und mechanischer Dissoziation erhalten. Die Zellen wurden in Kunststoffflaschen mit 10⁶ Zellen/10 ml ausplatiert und in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum bei 37°C gehalten. Nach 7 Tagen in vitro wurden die Astrozyten geerntet und in Hank's ausgeglichener Salzlösung (HBSS, pH 7,4), die 20% Glycerin enthielt, suspendiert, auf 10⁶ pro 100 μl konzentriert und bei 6°C gehalten. Die Einschlussprozedur wurde in einer Laminarflusskammer und unter Verwendung von sterilen Materialien durchgeführt. Die Vorpolymerisationslösung bestand aus 0,69 g N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid und 0,01 g Methylenbisacrylamid, die in 2,3 ml HBSS mit 20% Glycerin gelöst waren und enthielt als Starter Ammoniumpersulfat (100 mg/ml HBSS; 4,3 × 10^–3 M) mit N,N,N',N'-Tetramethylethalen verdünnt in HBSS (1:1 v/v HBSS; 3,3 × 10^–5 M). Der pH wurde mit 0,1 N HCl auf 7,0 eingestellt und die Vorpolymerisationslösung wurde vor der Verwendung mit Stickstoff entgast und auf 4°C vorgekühlt. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 10⁶ Zellen/ml in der Prepolymermischung mit hoher Dichte suspendiert und die Mischung wurde innig vermischt und unter Verwendung einer Hamilton-Spritze zwischen zwei vorgekühlte Glasplatten, die mittels eine Silikonkautschukdichtung 0,75 mm voneinander getrennt waren, mit einem Endvolumen von 3 ml eingespritzt. Die Form wurde innerhalb von etwa 1 min durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff auf –170°C abgekühlt und wurde vor ihrem Transfer in ein auf –15°C abgekühltes Wasserbad 3 min in flüssigem Stickstoff belassen. Die Polymerisationsreaktion wurde in dem gekühlten Wasserbad 5 Stunden durchgeführt, anschließend wurden die Formen in einem 37°C-Bad aufgetaut. Nach dem Auflösen des Eises wurden die Gele aus der Form entfernt mit HBSS gewaschen, um das Kälteschutzmittel und die nicht-reagierten Reaktionsprodukte zu entfernen und zu kreisförmigen Scheiben mit einem Durchmesser von 0,8 mm zugeschnitten. Die Gel-Scheiben wurden bei 37°C und 5% CO₂ in einer angefeuchteten Atmosphäre in DMEM inkubiert, das mit 10% FBS und 1% Antibiotika (Streptomicin-Penicillin) ergänzt war.
Dieser Ansatz zur Herstellung von Polymerhydrogelhybridgeweben hat im Vergleich mit dem von Woerly et al. (1996) offenbarten Verfahren zwei Hauptvorteile: ein Verhindern von Zellmembranschaden durch eine Polymerisation bei niedriger Tempera tur und die Bildung von Eiskristallen um die Zellen, die zu einer erhöhten Porosität und einer festgelegten Porenstruktur (heterogenes Hydrogel) führt. Als Ergebnis davon werden die Zellen mit einer Gerüstarchitektur für die Organisation, mit einer großen inneren Oberfläche, mit ausreichenden Hohlräumen für die Zellexpansion und mit erhöhter Permeabilität in der Polymermatrix eingeschlossen. Zusätzlich dazu kann die Zellpolymermischung, sobald sie eingefroren ist, für eine anschließende Polymerisation, wie zuvor beschrieben, gelagert werden.
Zu jedem Zeitpunkt der Zellentwicklung besteht die entstehende Hybridmatrix aus einer festen Phase, die die poröse Matrix, die Zellen und die extrazelluläre Zellmatrix aufweist und einer Fluidphase, die dem Zellkulturmedium und den extrazellulären Fluiden entspricht.
Wie es dem Fachmann ersichtlich ist, unterscheidet sich dieses Verfahren von dem sogenannten „Zellverkapselungs"-Verfahren, das Mikro- oder Makroverkapselungstechniken verwendet und in dem die Zellen einfach in einer Polymermembran mit einer kugelförmigen Form mit variablem Durchmesser eingeschlossen werden.
Wie er hierin verwendet wird, soll der Ausdruck „Zelle(n)" folgendes einschließen, nämlich Gewebefragmente, Zellklumpen, genetisch modifizierte Zellen, entweder Primärzellen oder immortalisierte Zellen, immortalisierte Zelllinien entweder aus existierenden Tumorzelllinien oder immortalisierten Precursorzelllinien, Stamm- oder Vorläuferzellen, Wachstumsfaktorselektierte Precursorzelllinien aus irgendeinem Gewebe oder Organ. Das Verfahren und das Produkt dieser Erfindung sind zum Her stellen einer großen Vielfalt von künstlichen Geweben oder Organen für die Transplantation oder von dreidimensionalen Kultursystemen geeignet.
Um dieses zu erreichen wird z.B. eine Zellsuspension in Hank's ausgeglichener Salzlösung (sterile HBSS, pH 7,4) mit 10 bis 20% Glycerin als Kälteschutzmittel 10 min. bei 4°C inkubiert. Die Prepolymerisationslösung, die aus einer polymerisierbaren Zusammensetzung, wie in BEISPIEL 1 beschrieben, besteht, wird in HBSS gelöst, das 10 bis 20% Glycerin enthält. Die Lösung wird durch einen porösen Glasfilter gefiltert und unter Vakuum entgast und auf Eis vorgekühlt. Eine Polymerisation durch freie Radikale wird mittels von in HBSS gelöstem Ascorbinsäurepersulfat oder Tetramethylendiaminpersulfat gestartet. Der pH der Lösung wird mit 1 N HCl auf einen neutralen pH eingestellt. Die Zellen werden mit variabler Dichte, vorzugsweise mit 10⁶ Zellen/ml in der Polymerisationslösung suspendiert. Die Mischung wird innig vermischt und in eine Spritze geladen und in Ampullen oder in eine Form injiziert, die aus zwei Glasplatten besteht, die durch Silikonkautschukdichtungen verschiedener Größen getrennt sind. Die Form oder die Ampullen werden durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff schnell eingefroren und in ein auf –10 bis –30°C abgekühltes Wasserbad überführt. Die Cryopolymerisationsreaktion wird für zumindest 5 Stunden, vorzugsweise 12 Stunden durchgeführt. Nach der Polymerisation werden die Formen oder Ampullen in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut und die Gele werden entfernt, mit HBSS gewaschen und können in die geeigneten Formen gebracht werden. Die Gele werden in einen 5% CO₂ Inkubator mit dem bevorzugten Kulturmedium überführt, das Antibiotika und antifungale Medikamente enthält. Das Verfahren wird in einer Flusskammer und unter Verwendung von sterilen Instrumenten durchgeführt.
TEST 1
Die biologische Toleranz der Polymer-Hydrogele der Erfindung wurde durch Implantation in das transsektierte Rückenmark und in Gehirnläsionen von Ratten untersucht. Proben zum Testen wurden ab einer Woche bis zu 10 Monaten nach der Implantation entnommen. Die biologische Toleranz war hervorragend. Makroskopisch integrierten sich die Gele in das Wirtsgewebe, wobei sie eine gute Stabilität zeigten und in einigen Fällen erschienen die Wirtsorgane intakt. Mikroskopisch haben Studien gezeigt, dass diese Polymer-Hydrogelformulierung die Geweberestrukturierung und die Axonregeneration im Bereich der Implantation in dem hemi- und transsektierten Rattenrückenmark fördert und somit bis zu 100% Gewebekontinuierlichkeitswiederherstellung erreicht (4). Die Daten können wie folgt zusammengefasst werden: (i) Integration des Hydrogels und Wiederherstellung der Kontinuität des Organs; das Hydrogel hält das Volumen der Läsion konstant, so dass sich neues Gewebe entwickeln und die Läsion durch Anhaften seiner porösen Oberfläche an die Wunde ersetzen kann; (ii) eine glatte Schnittstelle mit der gesamten zur Verfügung stehenden Polymeroberfläche; (iii) minimale Narbenbildung und eine Abwesenheit von zystischer Kavernenbildung in dem benachbarten Wirtsgewebe; (iv) Einwachsen eines glial-basierenden Gewebenetzwerks in das Polymernetzwerk, was die Verbindung des Implantats mit dem Wirt verstärkt; (v) Einwachsen von Zellen von heterogenem Ursprung; (vi) Einwachsen von Kapillaren; (vii) Ablagern von extrazellulären Matrixmolekülen (Kollagen, Fibronectin und Laminin) an der Oberfläche des Poly mernetzwerkes, wie dieses durch Immunohistochemie zu sehen ist und (viii) Axonwachstum im gesamten Bioimplantat. Infrarotspektroskopische Studien von explantierten Hydrogelen zeigten, dass das Infrarotspektrum des nativen (nicht implantierten) Hydrogels durch typische Infrarotmerkmale von Lipid- und Proteinverbindungen, ähnlich zu denen des benachbarten Rückenmarksgewebes ersetzt wurde, was bestätigt, dass die Rückenmarksgewebselemente in das poröse Netzwerk des Hydrogels integriert wurden.
TEST 2
Das Cryopolymerisationsverfahren ermöglichte es, heterogene Gele mit einer festgelegten makroporösen Struktur zu erzeugen, in die Zellen immobilisiert werden. Studien unter Verwendung von Zellmarkierungstechniken wie Zellmarkieren oder Immunocytochemie zeigen, dass die Zellen gleichförmig in dem gesamten Polymernetzwerk verteilt sind, und dass sie auf verschiedenen Leveln in dem Gel entweder als individuelle isolierte Zellen oder in kleinen Clustern von wenigen Zellen angeordnet vorliegen. Die Zellen, die überlebten, wurden während einer in vitro Inkubation über 3 Wochen mit Antigenprofilen von sich entwickelnden Nervengewebezellen positiv immunangefärbt. Somit können aus dem neonatalen Gehirn von Ratten isolierte Astrozyten durch eine Cryopolymerisationsreaktion mit hohen Leveln an Retention in hydrophilen Hydrogelen eingeschlossen, werden und die eingeschlossenen Zellen können überleben und sich normal differenzieren, wie sie dies unter Monolayer-Kulturbedingungen tun: nach 10 Tagen in vitro liegt die Lebensfähigkeit der eingeschlossenen Zellen bei 90% unter Verwendung von Zellmarkierungstechniken. Zusätzlich dazu sind die Zellen funktionsfähig, da sie in der Polymermatrix Laminin und Fibronectin synthetisieren, wie sie dies in Monolayer-Kulturen tun.
Das Polymerhydrogel ist dazu vorgesehen, hauptsächlich als Gewebeexpander und als Vorlage zur Gewebebildung genutzt zu werden, um einen Gewebedefekt oder ein Gewebedefizit in weichen Organen des Körpers zu ersetzen, das entweder aus einem Trauma oder einer chirurgischen Manipulation oder einer kongenitalen Missbildung resultiert, und zwar durch Fördern der Bildung eines neuen, funktionell integrierten Gewebe-zu-Organs. Es ist außerdem dazu vorgesehen, dazu verwendet zu werden, um Wundheilung, Geweberemodelling, Geweberegeneration, Gewebeentwicklungen in weichen Organen, wie der Leber, der Pankreas, der Haut, Muskeln zu erreichen. Es kann außerdem in Kombination mit anderen Materialien zu Knochenregeneration und -reparatur verwendet werden.
Eine weitere Anwendung des Polymer-Hydrogels ist es, Verfahren zu entwickeln, um eine Therapie für spezifische, menschliche, neurologische Störungen bereitzustellen, und dieses Polymer-Hydrogel kann, abhängig vom Typ der Erkrankung und dem Umfang des funktionellen Defekts auf zwei verschiedene Weisen verwendet werden. Erstens kann es, nach der Einarbeitung eines Zelltransplantats, als Vorlage zur Geweberegeneration oder als Zellträger verwendet werden. Das Polymerhydrogel der Erfindung ist z.B. dafür vorgesehen, zum Behandeln von geschädigten oder kongenital defizienten spezifischen Bereichen des Gehirns und des Rückenmarks im sich entwickelnden Zustand oder im erwachsenen Zustand (z.B. Rückenmarksverletzung) verwendet zu werden. Typischerweise besteht das Verfahren aus dem Entfernen des geschädigten Gewebes oder von Narbengewebe oder jedem fehlfunk tionierenden Teil des Nervengewebes und Ersetzen des Hirngewebes oder des Rückenmarksgewebes mit dem zuvor beschriebenen Polymer-Hydrogel. Das Polymer-Hydrogel gemäß der Erfindung ist außerdem dazu nützlich, Neuronenschaltkreise wieder herzustellen, die mit Axonbahnen im zentralen Nervensystem in der sich entwickelnden Phase oder in der Erwachsenenphase verbunden sind. So z.B. die Septohippocampalschaltungen, die mit der Gedächtnisfunktion verbunden sind, die z.B. in der Alzheimer'schen Krankheit gestört ist oder die nigrostratialen Schaltungen, die mit der Parkinsonschen Krankheit verbunden sind oder ein Teil des Striatum in der Chorea Huntington oder in hormonellen/Reproduktionsfehlfunktionen, die mit dem Hypophyso-Hypothalamussystem verbunden sind. Dieses wird durch chirurgisches Entfernen des defekten Teils des Hirngewebes und Implantieren des Gels gemäß der Erfindung, vorzugsweise mit einem Nervenzellentransplantat erreicht, um die Bildung von neuen funktionsfähigen Axonenschaltungen zu induzieren. Auf gleicher Weise können Fehlbildungen, die zu Fehlfunktionen der Rückenmarksschaltungen (z.B. Spina Bifida) führen durch Entfernen des abnormal gebildeten Teils des Organs und Ersetzen des defekten Teils durch das Neurogel gemäß der Erfindung, vorzugsweise mit einem Nervenzellentransplantat behandelt werden. Eine weitere Verwendung des Hydrogels gemäß der Erfindung ist die Behandlung des Sehnervs und der peripheren Nerven durch Induzieren des Axonwachstums durch das Polymerhydrogel gemäß der Erfindung auf gleiche Weise.

Claims

Polymer-Hydrogel zur therapeutischen Verwendung, wobei das Hydrogel ein Copolymer aus Folgendem ist, nämlich (a) einem N-substituierten Methacrylamid oder Acrylamid, (b) einem Vernetzungsmittel und (c) einem copolymerisierbaren Material, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem komplexen Zucker, einem Zuckerderivat, einem Gewebeanhaftungspeptid und einem Polymerkonjugat mit Antikörpern gegen Lipidderivate, und wobei das Polymer-Hydrogel heterogen und elastisch deformierbar ist und einen Gleichgewichtswassergehalt von zumindest etwa 80% aufweist.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 1, wobei (a) das N-substituierte Methacrylamid oder Acrylamid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-Monoalkyl- und N,N-Dialkylmethacrylamiden und -acrylamiden, wobei (b) das Vernetzungsmittel Acrylamid oder Vorstufen davon aufweist, und wobei (c) das polymerisierbare Material ein Zucker ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucosamin, N-Acetylglucosamin und einem N-Acetylderivat von Neuraminsäure.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 2, wobei das Alkyl ein bis zwei Kohlenstoffatome aufweist.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 3, wobei das Alkyl ein Hydroxyalkyl- oder Aminoalkylrest ist.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 1, wobei der Gleichgewichtswassergehalt zumindest 96% beträgt.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 1, wobei das Hydrogel kovalent vernetzt und im Wesentlichen nicht transparent ist und ein heterogenes Material darstellt.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 6, wobei das Hydrogel eine klare phasengetrennte Struktur aufweist, die aus Polymerpartikeln von etwa 1 bis 10 μm gebildet wird, wodurch ein Bereich relativ grober Porosität, in dem das Hydrogel dazu vorgesehen ist, mit einem Wirtsgewebe in Verbindung zu stehen, und ein Bereich von einer relativ feinen Porosität geschaffen wird, in dem es dazu vorgesehen ist, mit einem einwachsenden Gewebe in Verbindung zu stehen.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 1, das Folgendes aufweist, nämlich eine makroporöse Struktur mit einer fraktionellen Porosität von zumindest 80 bis 90%, eine spezifische Oberfläche von zumindest 100 m²/g, einen mittleren Porendurchmesser von etwa 15 bis 35 μm, ein Porenvolumen von Poren mit einer Größe von zumindest 10 μm gleich 100% der fraktionellen Porosität des Hydrogels und einen hyperporösen Charakter im Bereich von 20 bis 30 μm.
Verfahren zum Herstellen eines Polymer-Hydrogels für die therapeutische Verwendung, das Folgendes aufweist, nämlich (a) Auflösen eines Vernetzungsmittels in einem porenbildenden Lösemittel mit einem Starter für eine freie Radikalpolymerisation, um eine Lösung zu bilden, (b) Zugeben eines N-substituierten Methacrylamids oder Acrylamids zu der in (a) erhaltenen Lösung, um eine Mischung zu bilden, (c) Zugeben einer Lösung eines polymerisierbaren Materials, das Folgendes aufweist, nämlich einen komplexen Zucker, ein Derivat eines komplexen Zuckers, ein Gewebeanhaftungspeptid oder ein Polymerkonjugat mit Antikörpern gegen Lipidderivate zu der in (b) erhaltenen Mischung, und zwar unter Bedingungen, die wirksam sind, ein heterogenes Polymergel zu ergeben.
Verfahren nach Anspruch 9, das Folgendes aufweist, nämlich, Auflösen von Azobisisobutyronitril und Methylenbisacrylamid in dem Lösemittel, um eine Lösung zu bilden, Vermischen der Lösung mit N-2-(Hydroxypropyl)methacrylamid, Zugeben von Glucosamin oder N-Acetylglucosamin oder N-Acetylneuraminsäure und Entfernen von Restprodukten mit niederem Molekulargewicht sowie von Spuren des Starters.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Vernetzungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, Vorstufen davon, und Divinylvernetzungsmitteln.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Polymerisationsstarter ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Azobisisobutyronitril, Peroxiden, Ascorbinsäure, Peroxysulfaten und substituierten Aza-Verbindungen und der in einer Menge von 0,01 bis 2 Gew.-% bezogen auf das gebildete Polymer-Hydrogel verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Lösung des polymerisierbaren Materials einen komplexen Zucker aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der komplexe Zucker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glucosamin, N-Acetylglucosamin, N-Acetylderivaten von Neuraminsäure, Polysialinsäure und Galactosan.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Lösung des polymerisierbaren Materials ein Gewebeanhaftungspeptid aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Lösung des polymerisierbaren Materials ein Polymerkonjugat mit Antikörpern gegen Lipidderivate aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, das bei einer Temperatur von 40 bis 60°C für etwa 12 Stunden durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, das den Schritt des Zugebens von lebenden Gewebezellen oder genetisch modifizierten Zellen zu dem in (c) erhaltenen Produkt und das Durchführen der Polymerisation dieser Zellen mit dem Produkt aufweist.
Copolymerisiertes Polymer-Hydrogel nach Anspruch 1, wobei lebende Gewebezellen oder genetisch modifizierte Zellen mitpolymerisiert sind.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 1, als Ersatzstück für geschädigtes Hirngewebe oder Rückenmark in einem menschlichen Wesen oder einem Tier.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 20 zur therapeutischen Verwendung beim Wiederherstellen von Neuronenschaltungen, die mit den Axonbahnen im zentralen Nervensystem verbunden sind.
Polymer-Hydrogel nach Anspruch 20 zum Behandeln von traumatischen Verletzungen des Sehnervs und peripherer Nerven.