DE69731080T2

DE69731080T2 - Kompartimentalisierungsverfahren zum screenen von mikroorganismen

Info

Publication number: DE69731080T2
Application number: DE69731080T
Authority: DE
Inventors: Volker Schellenberger
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2017-02-18
Also published as: DE69731080D1; CA2247351C; EP0892853B1; AU2052097A; ATE278802T1; CA2247351A1; WO1997037036A1; US6001586A; EP0892853A1; AU731935B2; DK0892853T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Verbesserungen in Durchmusterungsverfahren gerichtet, die verwendet werden, um Mikroorganismen, die einer Mutagenese unterzogen worden sind und dadurch wünschenswerte Merkmale entwickeln, welche sie von den Mikroorganismen vor der Mutagenese unterscheiden, nachzuweisen, zu amplifizieren und zu selektieren. Spezieller ist die vorliegende Erfindung auf neue Durchmusterungsverfahren gerichtet, welche das Wachstum gewisser gewünschter Mutanten in einem Reservoir von Organismen, das einer statistischen Mutagenese unterzogen worden ist, auf solche Weise verstärken, dass die Durchmusterung einer großen Zahl von potentiellen Mutanten effizient und wirksam ermöglicht wird.
2. Stand der Technik
Im Stand der Technik sind mehrere Verfahren zum Lenken der Evolution eines Reservoirs von Mikroorganismen, das einer statistischen Mutagenese unterzogen worden ist, entwickelt worden. Eine Weise, eine gerichtete Evolution eines Organismus zu bewirken, besteht darin, durch ortsspezifische Mutagenese neue Merkmale in Proteinprodukte einzuführen. Jedoch erfordern derartige Verfahren ein hohes Maß an Wissen über das betreffende Protein mit Bezug auf Struktur- und Funktionsbeziehungen und die gewünschten spezifischen Wirkungen. Als Ergebnis sind Verfahren entwickelt worden, die einen Vorteil aus statistischen Mutationsereignissen zur Produktion einer kleinen Zahl von gewünschten Mutationen bei einer großen Zellenpopulation und/oder über mehrere Generationen wahrnehmen. Derartige Verfahren, die im Allgemeinen als gerichtete Evolution bezeichnet werden, erfordern die Schritte, dass man ein Reservoir an Ausgangsmaterial-Mikroorganismen erhält, diese Mikroorganismen einer statistischen Mutagenese unterzieht und anschließend geeignete Selektionstechniken anwendet, um Mutanten mit den gewünschten Merkmalen zu selektieren.
Wesentlich für den Erfolg von gerichteten Evolutionstechniken sind Durchmusterungs- oder Selektionstechniken zur Isolierung gewünschter Mutanten. Eine übliche Selektionstechnik beinhaltet das Züchten der mutierten Organismen unter solchen Bedingungen, dass nur gewünschte Mutanten ein Wachstum zeigen. Eine derartige Technik besteht darin, die mutierten Organismen auf ein Medium zu plattieren, welches das Wachstum auf Mikroorganismen mit einem spezifischen (mutierten) Merkmal beschränkt. Beispielsweise erzwingt ein Medium, das ein Toxin einschließt, eine Selektion von Organismen mit einer Resistenz gegen das Toxin. Ähn lich beschränkt ein Medium, das ein Substrat einschließt, bei welchem es erforderlich ist, dass der mutierte Organismus dieses Substrat zum Überleben metabolisieren kann, das Wachstum auf diejenigen Organismen, welche die geeigneten Enzyme produzieren können. Weiter können die mutierten Organismen rigorosen Bedingungen unterzogen werden, um zu bestimmen, ob beispielsweise die mutierten Organismen besser für ein Überleben bei hoher Temperatur oder hohem pH geeignet sind.
Ein Beispiel für einen derartigen Selektionsdruck ist in Forney et al., Appl. Environ. Microb. Bd. 55, Nr. 10, S. 2550–2555 (1989) erläutert, worin mutierte Penicillinamidasen mit neuer Substrat-Spezifität durch Mutagenisieren eines Stammes von E. coli und Selektieren bezüglich der Fähigkeit der Mutanten, Glutaryl-(L)-leucin zu hydrolysieren und Leucin für Leu^–-Stämme bereitzustellen, erhalten wurden. Zellen, die das Wildtyp-Enzym beibehielten, wuchsen nicht auf dem minimalen Medium, das Glutaryl-(L)-leucin als die einzige Quelle von Leucin enthielt. Die Autoren berichteten, dass die Wachstumsgeschwindigkeiten der Leu^–-Zellen, die mutierte Amidasen exprimierten, zunahmen, wenn die Glutaryl-(L)-leucin-Konzentration zunahm oder wenn der pH des Mediums abnahm. Als Ergebnis war es den Autoren möglich, absichtlich die Substratspezifität von Penicillinamidase zu modifizieren und Mutanten mit Amidasen zu selektieren, die fortschreitend effizienter bei der Hydrolyse von Glutaryl-(L)-leucin waren.
Eine alternative Technik, die entwickelt wurde, um mutierte Proteine zu durchmustern, ist als Phagen-Display bekannt. Diese Technik ist bei der Isolierung von statistisch mutagenisierter DNA wertvoll, welche Proteine mit einer spezifischen gewünschten Bindungsaktivität kodiert. In der Phagen-Display-Technik wird ein lamda-Phage oder ein Äquivalent produziert, der ein mutagenisiertes Gen enthält, welches ein spezifisches bindendes Protein kodiert. Der Phage wird dann einem Ligandenbindungsverfahren, z. B. einer Säulenaffinitätsreinigung, unterzogen, in dem der Ligand auf der Grundlage der gewünschten Bindungsfähigkeit des mutierten bindenden Proteins selektiert wird und so selektiv an Phage binden und diesen einfangen kann, welcher das gewünschte mutierte bindende Protein auf seiner Oberfläche darbietet. Nach der Isolierung kann der eingefangene Phage verwendet werden, um geeignete Bakterienwirte zur Erzeugung größerer Mengen an Protein zu infizieren. Ein Beispiel für ein Phagen-Display ist die Anwendung als ein Werkzeug zur Isolierung von Proteasen mit neuen Protease-Selektivitäten, Corey et al., Gene, Bd. 128, S. 129–134 (1993), worin das Phagen-Display verwendet wurde, um mutierte Trypsin-Moleküle, welche ein Fusionsprodukt des Trypsin-Moleküls und des M13-Hüllproteins umfassten, durch Einfangen mittels immobilisierten Ecotins als Liganden zu identifizieren.
Die obigen Verfahren haben wirkungsvolle Mechanismen für die Anwendung von Selektionsdruck bereitgestellt, um eine Isolierung von spezifischen gewünschten Mutanten unter einer statistisch mutagenisierten Population zu bewirken. Jedoch verbleibt ein Problem bei der Durchmusterung großer Zahlen von Organismen auf effiziente Weise. Beispielsweise erfordert eine Platten-Durchmusterung Verdünnungsreihen von flüssigen Kulturen bis zu dem Ausmaß, dass nur eine kleine Zahl von Kolonien auf jeder Platte vorliegt. Wenn das Mutanten-Reservoir Millionen von Organismen umfasst, legt dies dem Forscher eine enorme experimentelle Bürde auf, um die gesamte Population zu analysieren.
Dieses Problem wird verstärkt, wenn weniger stringente Selektionskriterien verwendet werden, um gewisse Arten von Mutationen, z. B. eine verbesserte katalytische Aktivität, Temperatur- oder pH-Beständigkeit in einem Enzym, nachzuweisen. Ein Beispiel für eine derartige Selektionstechnik beinhaltet die Verwendung von Medium, das einen notwendigen zellulären Nährstoff einschließt, wobei der Zugang zu diesem eine spezifische Mutation in einem Enzym erfordert. In derartigen Fällen ist es häufig vorteilhaft, eine Population von Mikroorganismen wiederholt zu mutieren, wobei man zwischen jedem Mutationsereignis durchmustert, um bezüglich inkrementell verbesserter Mutanten zu selektieren. Da die Mutanten variierende Grade der Lebensfähigkeit auf dem Medium besitzen, im Gegensatz zu absoluter Lebensfähigkeit oder nicht, wird es erforderlich, eine viel größere Zahl von Organismen zu durchmustern, was so die experimentelle Bürde für den Forscher erhöht.
Falls das Selektionsverfahren die Produktion eines notwendigen Nährstoffs durch ein extrazelluläres mutiertes Enzym beinhaltet, erfahren darüber hinaus Organismen, denen die erforderliche Mutation fehlt, aufgrund der Nährstoffdiffusion durch das Medium einen Vorteil aus der Produktion von mutierten Enzymen durch andere Kolonien. Demgemäß ist es erforderlich, die Zahl der Kolonien auf einer Mediumplatte durch Verdünnungsreihen drastisch zu beschränken, während man gleichzeitig eine große Zunahme der Zahl von analysierten Mutanten beobachtet. Die Kombination dieser Effekte bedeutet, dass in der Größenordnung 50–100 Kolonien pro Platte ein Maximum werden. Aufgrund dieser Effekte plus des zusätzlichen Effekts des Mutagenisierens über mehrere Generationen wird die Bürde untragbar, wenn vollständige Populationen von Mikroorganismen zu durchmustern sind. Um eine solche mühsame Durchmusterung zu vermeiden, entscheiden sich viele Forscher dafür, nur ein kleineres Segment der vollständigen Population zu analysieren, was so das Potenzial für den Nachweis von gewünschten Mutanten verringert.
Aus dem Obigen ist ersichtlich, dass bei der Entwicklung von Durchmusterungstechniken zur genauen Identifizierung und Isolierung gewünschter Merkmale in Proteinen, die aus statistisch mutagenisierten Genen produziert werden, Fortschritte gemacht worden sind. Jedoch verbleibt ein Problem in der Technik, das mit der Durchmusterung von Mutanten im großen Maßstab, insbesondere auf dem Gebiet verbesserter Mutanten von extrazellulär produzierten Enzymen, in Beziehung steht. Im Hinblick auf den sehr kleinen Anteil an gewünschten mutierten Organismen, die bei der statistischen Mutagenese im Vergleich mit dem Gesamt-Reservoir an Mikroorganismen produziert werden, wäre es vorteilhaft, eine genaue Technik für die Durchmusterung im großen Maßstab und Isolierung von mutierten Organismen nach statistischer Mutagenese zu finden. So würde ein System, das eine einfache, rasche, genaue und effiziente Isolierung von mutierten Organismen aus einem mutagenisierten Reservoir in der Größenordnung von 10 000 bis 1000 000 Organismen ohne Crossover von Nährstoffen ermöglicht, die derzeitigen Techniken in großem Maß verbessern. Der Stand der Technik stellt jedoch kein derartiges System zur Verfügung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein effizientes und genaues Mittel zur Analyse großer Populationen von mutierten Organismen bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Mittel bereitzustellen, das für ein wirksames Mittel sorgt, um aufeinander folgende Generationen einer Mutagenese zu unterziehen, während gleichzeitig unerwünschte Mutanten ausgemustert werden.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, die Durchmusterung von großen Populationen von mutagenisierten Organismen auf wirksame und einfache Weise zu erleichtern.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein System der leichten Analyse und Durchmusterung einer großen Zahl von Mutanten in empfindlichen Selektionssystemen bereitzustellen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, ein System bereitzustellen, das eine genaue Durchmusterung von statistischen Mutationen in großen Zahlen von Organismen ermöglicht, die extrazelluläre Enzyme produzieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Durchmusterung von Mikroorganismen mit einem selektierbaren Merkmal: (a) Bereitstellen einer Züchtungskammer, die inerte Trägerperlen, ein Bündel oder eine Mehrzahl von hohlen Rohren, eine Dispersion des geimpften flüssigen Wachstumsmediums in einem nicht mischbaren Fluid, eingekapseltes flüchtiges Wachstumsmedium in einer festen Matrix oder Liposomen umfasst, welche eine Mehrzahl von diskreten Kompartimenten bilden, wobei das geimpfte Wachstumsmedium eine solche Konzentration aufweist, dass bei statistischer Verteilung der Mikroorganismen mindestens 25% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten, wodurch die Diffusion von Metaboliten oder Nährstoffen zwischen den Kompartimenten innerhalb der Züchtungskammer minimiert oder gehemmt wird; (b) Herstellen eines flüssigen Wachstumsmediums (oder Züchtungsmediums), welches durch seinen Mangel an oder die Zugabe von einem oder mehreren Metaboliten oder Nährstoffen die Züchtung von Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal zeigen, gegenüber Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal nicht zeigen, erleichtert; (c) Impfen des Wachstumsmediums mit einer Mehrzahl von Mikroorganismen, von denen ein Teil das selektierbare Merkmal umfasst; (d) Geben des geimpften Wachstumsmediums in die Züchtungskammer, um die Mikroorganismen statistisch unter den diskreten Kompartimenten in der Züchtungskammer zu verteilen; (e) Inkubieren der Züchtungskammer über eine geeignete Zeit und unter geeigneten Bedingungen, um eine nachweisbare Wachstumsungleichheit zwischen Mikroorganismen mit dem selektierbaren Merkmal und Mikroorganismen, denen das selektierbare Merkmal fehlt, zu erhalten; und (f) Selektieren von Mikroorganismen, die durch ein verstärktes Wachstum als das selektierbare Merkmal aufweisend identifiziert werden.
Die Erfindung selbst wird zusammen mit weiteren Zielen und damit verbundenen Vorteilen am besten mit Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung verstanden, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen genommen wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Ergebnisse von Experimenten, welche die optimale Beziehung zwischen Diffusion und Perlengröße gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nachweisen.
2 veranschaulicht die Ergebnisse von Experimenten, welche das Wachstumsmuster einer Population von Mikroorganismen zeigen, von denen 20% eine Protease-Produktionsfähigkeit zeigen und 80% nicht. In einem Beispiel wird die Mischung von Bakterien dem Verfahren der Erfindung unterzogen, welches die Kompartimentalisierung der Mischung unter Verwendung von Glasperlen umfasst. Im zweiten Beispiel wird die Mischung von Bakterien unter identischen Bedingungen wie im ersten Beispiel inkubiert, außer dass sie in einem einzigen Teströhrchen gezüchtet werden.
3 veranschaulicht die Ergebnisse von Experimenten, die das Wachstumsmuster einer Population von Mikroorganismen zeigen, von denen 20% eine Protease-Produktionsfähigkeit zeigen und 80% nicht. In einem Beispiel wird die Mischung von Bakterien dem Verfahren der Erfindung unterzogen, welches eine Kompartimentalisierung der Mischungen unter Verwendung einer Oxygenierapparatur oder einer Patrone mit hohlen Fasern umfasst. Im zweiten Beispiel wird die Mischung von Bakterien unter identischen Bedingungen wie im ersten Beispiel inkubiert, außer dass sie in einem einzigen Teströhrchen gezüchtet werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
„Selektierbares Merkmal" bedeutet ein identifizierbares Merkmal eines Mikroorganismus, welches als Grundlage für eine Durchmusterung eines spezifischen Mikroorganismus oder eine Gruppe von Mikroorganismen aus einem größeren Reservoir verwendet werden kann, welches Mikroorganismen einschließt, die das selektierbare Merkmal nicht zeigen. Zum Beispiel ist es wohlbekannt, derartige selektierbare Merkmale wie Antibiotikum-Resistenz, eine notwendige enzymatische Aktivität für die Produktion eines Nährstoffs oder einer anderen Verbindung, der bzw. die für ein Zellenwachstum oder eine Zellteilung erforderlich ist, zu verwenden. Jedoch ist jedes Merkmal, das eine Grundlage für eine Unterscheidung zwischen einem mutierten Organismus und einem nicht-mutierten Vorläufer-Organismus bereitstellen kann, ein annehmbares selektierbares Merkmal. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das selektierbare Merkmal die Fähigkeit eines Mikroorganismus, ein Enzym zu produzieren, das geänderte Verhaltens- oder Stabilitätsmerkmal zeigt. Derartige geänderte Verhaltens- oder Stabilitätsmerkmale können eine geänderte Substratspezifität, eine geänderte spezifische Aktivität, ein geändertes Temperatur/Aktivitätsprofil, eine geänderte Salz- oder Ionenanforderung oder jede Kombination dieser Merkmale umfassen. Das spezifische Enzym, das dem Verfahren der Erfindung unterzogen wird, kann irgendeine Hydrolase, Oxidoreduktase, Transferase, Lyase oder Ligase sein. Vorzugsweise umfasst das Enzym eine Protease, eine Lipase, eine Amylase, eine Galactosidase, eine Cellulase, eine Lactase, eine Polygalacturonase, eine Glucoamylase, eine Esterase, eine Hemicellulase, eine Peroxidase, eine Oxidase, eine Laccase, eine Glucoseoxidase, eine Ligninase, eine NADH-Reduktase oder eine 2,5-DKG-Reduktase.
„Züchtungskammer" bedeutet ein Gefäß oder eine Umgebung, das bzw. die das Wachstum oder die Aufrechterhaltung von Mikroorganismen unterstützen kann. Demgemäß werden Teströhrchen, Platten mit Vertiefungen, Schüttelkolben und andere wohlbekannte Kulturgefäße als Züchtungskammer angesehen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine Züchtungskammer eine Mehrzahl von diskreten Kompartimenten bilden, wobei jedes Kompartiment das Wachstum von Mikroorganismen aufrechterhalten oder ermöglichen kann. Die diskreten Kompartimente oder Kompartimente sollten von solcher Natur sein, dass sie die Diffusion von Nährstoffen oder Zellprodukten zwischen zwei oder mehr Kompartimenten minimieren.
Jedes System der Herstellung von diskreten Kompartimenten, welches die Herstellung von kleinen diskreten Mediumreservoirs oder -tropfen ermöglicht, die eine minimale oder keine Diffusion von Medium-Komponenten, wie Metaboliten oder Nährstoffen, zwischen den Reservoirs gestatten, ist als Züchtungskammer ausreichend. Kritisch für die vorliegende Erfindung ist, dass jedes diskrete Kompartiment durch eine Barriere gegenüber der Diffusion von Metaboliten oder Nährstoffen und Enzymen abgetrennt ist; wobei die Barriere aus irgendeiner Kombination von Luft, einem festen Material und/oder einer Flüssigkeit zusammengesetzt ist. Vorzugsweise erleichtert die Züchtungskammer die Entwicklung von mindestens etwa 5 000 Kompartimenten. Bevorzugter erleichtert die Züchtungskammer die Entwicklung von mindestens etwa 50 000 Kompartimenten und am bevorzugtesten von mehr als etwa 100 000 Kompartimenten. Obwohl es keine obere Grenze gibt, die für die Zahl der Kompartimente erforderlich ist, sollte eine bevorzugte Züchtungskammer weniger als etwa 1000 000 Kompartimente halten, um eine leichte Analyse zu ermöglichen. Die Größe der Kompartimente ist im Allgemeinen nicht größer als 1 ml. Vorzugsweise ist die Kompartimentgröße zwischen etwa 0,005 μl und etwa 50,0 μl, bevorzugter zwischen etwa 0,01 μl und etwa 10,0 μl und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,05 μl und etwa 1,0 μl. Die Konzentration der Mikroorganismen in dem Medium muss derart sein, dass bei statistischer Verteilung des Reservoirs von mutierten Mikroorganismen in der ganzen Züchtungskammer mindestens 25% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten. Vorzugsweise enthalten mindestens 50% der Kompartimente nur einen Organismus, und bevorzugter enthalten mindestens 75% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Konzentration der Mikroorganismen bei statistischer Verteilung derart, dass nur ein Mikroorganismus in jedem einzelnen Kompartiment anwesend ist.
Spezielle Beispiele für geeignete Züchtungskammern gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen: eine Kolonne, die mit inerten Trägerperlen (d. h. Glasperlen oder Perlen auf Polymer-Basis) gefüllt ist, welche „Reservoirs" von geimpftem Medium an den Oberflächen-Kontaktpunkten zwischen den Perlen einfangen; die Verwendung eines Bündels oder einer Mehrzahl von hohlen Rohren, die kleine Mengen von geimpftem Medium stützen können, das durch Luft in diskrete Kompartimente aufgetrennt wird; Dispergieren des geimpften Wachstumsmediums in einem nicht-mischbaren Fluid, um diskrete Tropfen von geimpftem Medium in dem gesamten nicht-mischbaren Fluid zu bilden, vorzugsweise dann Verfestigen des nicht-mischbaren Fluids, um den Austausch von Nährstoffen oder Zellprodukten zwischen Tröpfchen des Mediums zu verhindern; Einkapselung von Medium in Wachs oder anderen Substanzen, die sich verfestigen können, um eine Matrix oder Barriere zu bilden, die für ein Vermischen gewisser Nährstoffe zwischen Tröpfchen oder Kompartimenten von geimpftem Medium undurchlässig sind; oder Liposomen.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer Züchtungskammer unter Verwendung von Perlen umfasst das Füllen einer Säule mit Perlen und das Ermöglichen, dass eine geringe Menge an geimpftem Medium die Perlen-Matrizes vollständig penetriert, bevorzugt unter Vakuum. Die Verdünnung der Impfkultur sollte derart sein, dass ein signifikanter Teil der diskreten Mediumtröpfchen, die an den Kontaktpunkten der Perlen eingefangen sind, nur einen Mikroorganismus enthält. Im Allgemeinen können die Perlen aus irgendeiner geeigneten mikrobiell inerten Substanz sein, wie Acrylharz, silanisiertem Glas, Harz, Nylon, Polypropylen, Polyethylen, Polystyrol, Teflon oder irgendeiner anderen in der Technik anerkannten Substanz mit ähnlichen mikrobiell inerten Eigenschaften. Bevorzugt werden Glas- oder Acrylperlen verwendet, am bevorzugtesten silanisiertes Glas. Die Perlen können von jeder Größe sein, die für die Bildung von Kontakten zwischen den Perlen zur Einfangung von Medium geeignet ist. Bevorzugt beträgt die Größe der Perlen 0,25 mm bis 5 mm, bevorzugt 0,75 mm bis 3,0 mm und am meisten bevorzugt 1,0 mm bis 2,0 mm. Auf diese Weise ist es möglich, eine Säule zu bilden, die im Bereich von 10 000 bis 100 000 000 Reservoirs pro Liter Säulenvolumen aufweist. Bevorzugter sind zwischen 100 000 und 5 000 000 Reservoirs pro Liter Säulenvolumen eingefangen, und am bevorzugtesten sind zwischen 250 000 und 1000 000 Reservoirs pro Liter Säulenvolumen eingefangen.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht eine Züchtungskammer aus einem Bündel von hohlen Fasern mit porösen oder nicht-porösen Wänden. Beispielsweise sind übliche Oxygenierapparaturen für derartige Zwecke geeignet. In einer Abwandlung dieser Ausführungsform ist die Oxygenierapparatur mit geimpftem Medium gefüllt. Die Fasern sind von Luft umgeben, welche die Diffusion der meisten Verbindungen zwischen den einzelnen Fasern blockiert. Die Impfmaterialdichte des Mediums wird so gewählt, dass die Zellen innerhalb der Fasern weit getrennt vorliegen, um eine Diffusion zu verringern oder zu verhindern. Die Diffusion von Metaboliten oder Enzymen innerhalb der Fasern kann weiter verringert werden, indem man die Viskosität des Mediums erhöht. Beispielsweise kann eine einzige Faser von etwa 6 Inch 10 bis 40 einzelne Medium-„Kompartimente" aufweisen. Wenn eine Anordnung mit hohlen Rohren verwendet wird, weisen die Rohre bevorzugt einen Durchmesser von etwa 0,05 bis etwa 3 mm, bevorzugter von etwa 0,1 bis etwa 0,5 und am bevorzugtesten von etwa 0,2 bis etwa 0,3 auf. In einer bevorzugten Form ist bei Verwendung von viskosem Medium, wie MOPS, die Konzentration der Organismen derart, dass sie in den Fasern etwa 10 mm getrennt vorliegen, was so im Allgemeinen 1 bis 3 Tage gestattet, bevor wesentliche Nährstoffe über die volle Entfernung von 10 mm diffundieren.
„Wachstumsmedium" (bzw. Züchtungsmedium) bedeutet irgendeine Kombination von Nährstoffen, Salzen, Puffern und anderen Komponenten, die als vorteilhaft für das Züchten der speziellen Mikroorganismen anerkannt sind, welche einer gerichteten Evolution unterzogen werden. Jedoch sollte, wenn die Durchmusterung auf der Entwicklung eines selektierbaren Merkmals beruht, welches die Fähigkeit beinhaltet, einen Nährstoff zu verarbeiten oder gegen eine spezielle Verbindung resistent zu sein, das Wachstumsmedium diese Strategie widerspiegeln, entweder durch einen Mangel an oder eine Zusatz der speziellen Verbindung, welche die Selektion auf der Grundlage des selektierbaren Merkmals ermöglicht. Demgemäß kann, wenn das selektierbare Merkmal die Produktion einer mutierten Protease beinhaltet, welche die Fähigkeit aufweist, unter gewissen Temperatur- oder Umgebungsbedingungen zu wirken, das Wachstumsmedium eine Stickstoffquelle einschließen, welche eine proteolytische Aktivität für den Zugang durch den Mikroorganismus erfordert. Auf diese Weise wachsen Mikroorganismen, welche nach der Mutation nicht die geeignete proteolytische Aktivität besitzen, aufgrund des Mangels an einer verfügbaren Stickstoffquelle nicht.
„Mutationsereignis" bedeutet jedes Verfahren zum Induzieren der Mutation von DNA in einem Organismus. In der Technik anerkannte Mittel zur Bewirkung von Mutationen in DNA, wie die Einwirkung von Röntgenstrahl, Gammastrahl, Ultraviolettlicht, chemischen Mutagenen, wie Ethylmethylsulfonat-N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, sind alle annehmbare Mittel für die vorliegende Erfindung zur Erzeugung eines Mutationsereignisses. Mutationen können auch unter Verwendung von enzymatischen Verfahren, wie PCR, oder durch Transformation der DNA in Organismen, die eine hohe Mutationsfrequenz besitzen, und anschließende Extraktion der DNA eingeführt werden.
Der verallgemeinerte Aufbau eines Selektionssystems auf Anreicherungs-Basis, wie hierin beschrieben, erfordert in der Praxis mehrere Selektionsrunden: Nachdem die Zellen bis zu einer optimalen Dichte gewachsen sind – der Dichte, bei der die schneller wachsende Variante mit Bezug auf die Population am meisten angereichert ist – werden die Zellen aus der Züchtungskammer entfernt, und eine statistische Probe wird verdünnt, gegebenenfalls wieder mutagenisiert und für eine weitere Runde der Anreicherung in eine Züchtungskammer eingeführt. Nach einer Anzahl von Runden sollte ein durchweg schnell wachsender Organismus mit Bezug auf die Population signifikant angereichert sein. Die Stringenz der Selektionskriterien hängt von dem Merkmal ab, bezüglich dessen selektiert wird. Wenn es beispielsweise lediglich erforderlich ist, dass ein Enzym-produzierender Mikroorganismus einen nicht Enzym produzierenden Mikroorganismus kompetitiv verdrängt, kann eine signifikante Selektion in nur einer Runde erhalten werden. Mit Bezug auf andere Merkmale kann es jedoch erforderlich sein, mehrere Selektionsrunden zu verwenden. Unter derartigen Umständen ist es vorteilhaft, eine Züchtungskammer zu verwenden, die eine relativ große Zahl von Kompartimenten aufweist, um die Durchmusterung einer großen Zahl von Organismen zu erleichtern.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren zur Durchmusterung von Mikroorganismen mit einem selektierbaren Merkmal verwendet, um mutierte Organismen mit einem spezifischen selektierbaren Merkmal von mutierten und/oder nicht mutierten Organismen zu unterscheiden, die das spezifische selektierbare Merkmal nicht zeigen. So erfordert das Verfahren der Erfindung gemäß Anspruch 15, dass eine Züchtungskammer bereitgestellt wird, die eine Mehrzahl von diskreten Kompartimenten bilden kann. Die Kompartimente umfassen eine Barriere, welche die Diffusion von Metaboliten oder Nährstoffen zwischen den Kompartimenten innerhalb der Züchtungskammer hemmt, wobei die Barriere fester, flüssiger oder gasförmiger Natur sein kann. Die Kompartimente trennen dann ein Wachstumsmedium, das ein Reservoir von mutagenisierten Mikroorganismen enthält. In der Praxis kann das Wachstumsmedium mit bereits mutagenisierten Mikroorganismen geimpft sein, bevor es in die Züchtungskammer gegeben wird, oder Organismen können in die Züchtungskammer gegeben werden und anschließend einem Mutationsereignis unterzogen werden. In beiden Fällen erleichtert das Wachstumsmedium durch seinen Mangel an oder den Zusatz von einem oder mehreren Metaboliten oder Nährstoffen bevorzugt das Wachstum von Mikroorganismen, welche das selektierbare Merkmal zeigen, gegenüber Mikroorganismen, welche das selektierbare Merkmal nicht zeigen.
Das geimpfte Wachstumsmedium sollte so in die Züchtungskammer gegeben werden, dass die Mikroorganismen statistisch auf die diskreten Kompartimente in der Züchtungskammer verteilt werden. Es ist wichtig, dass die Verdünnung der Mikroorganismen in dem geimpften Wachstumsmedium überwacht wird, um sicherzustellen, dass die Konzentration nicht so groß ist, dass sie zur Folge hat, dass zu viele Mikroorganismen in Kompartimente gegeben werden, und nicht zu gering ist, um eine ineffiziente Durchmusterung zur Folge zu haben. Auf jeden Fall enthält bei statistischer Verteilung der Mikroorganismen auf die verschiedenen Kompartimente in der Züchtungskammer ein signifikanter Teil, d. h. mindestens 25%, der Kompartimente nur einen Organismus. Wenn sie auf diese Weise statistisch verteilt sind, wächst jeder Mikroorganismus nach Inkubieren über eine geeignete Zeit und unter geeigneten Bedingungen nur als Reaktion auf seine Fähigkeit, das selektierbare Merkmal zu zeigen. Die Inkubationsbedingungen hängen von dem spezifischen gezüchteten Mikroorganismus, der Auswirkungen der Bedingungen auf den Nachweis des selektierbaren Merkmals, der Größe des Kompartiments und anderen Faktoren ab, die leicht gemäß Routinepraktiken ermittelt werden.
Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal nicht zeigen, erleiden einen nachweisbaren Wachstumsmangel verglichen mit Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal aufweisen. Die Ungleichheit des Wachstums stellt sicher, dass, wenn die Mikroorganismen aus den Kompartimenten genommen werden, der Anteil von Mikroorganismen, der das selektierbare Merkmal zeigt, in der Gesamtpopulation signifikant angereichert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Inhalt der Kompartimente vereinigt und der resultierende Pool bezüglich der Fähigkeit analysiert, das selektierbare Merkmal zu zeigen. Es ist häufig vorteilhaft, die Population wiederum einer Mutagenese zu unterziehen und zu durchmustern, wie hierin beschrieben, um den Anteil an Mikroorganismen in dem Pool, der das selektierbare Merkmal aufweist, signifikant zu erhöhen.
Indem man den Lehren der Erfindung folgt, ist es möglich, die Effizienz, mit welcher die Evolution eines spezifischen Mikroorganismus auf ein gewünschtes Ergebnis gerichtet werden kann, in großem Maß zu verbessern. Um die überraschenden Ergebnisse zu erläutern, die von den Anmeldern hierin erzielt wurden und die mittels der Durchführung der hierin offenbarten Erfindung erzielbar sind, werden die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele bereitgestellt.
BEISPIELE
Beispiel 1
Kompartimentalisierung unter Verwendung von Glaskugeln – Diffusionsstudie
Glaskugeln verschiedener Größen im Bereich von 30 Mikrometern bis 2 Millimeter wurden von Jaygo, Inc. (NJ) erhalten. 1/8 Inch-Nylon-, Polypropylen-, Polyethylen- und Polystyrol-Kugeln wurden von United States Plastic Co. (Lima, OH) erhalten. 1/8''-Teflon-Kugeln wurden von Cole-Parmer (Niles, IL) erhalten. 1/16''-Acryl-Kugeln wurden von Salem Specialty Ball Co. (W. Simsbury, CT) erhalten, und 1/16''-Teflon-Kugeln wurden von Bal-Tec, Inc. (Los Angeles, CA) erhalten.
2 ml-Glassäulen wurden von Bio-Rad erhalten (Kat. Nr. 737-0706, Hercules, CA). 1,25 ml-Kunststoff-Bio-Spin-Säulen wurden von Bio-Rad erhalten (Kat. Nr. 732-6008).
Das verwendete Wachstumsmedium war Spizizen's Minimales Medium (SMM) bei halber Stärke (0,5 × SMM) mit 2,5 Gramm/Liter Rinder-Serumalbumin (BSA) (Sigma, ST. Louis, MO) als einziger zugesetzter Stickstoffquelle:
5 × SMM-Vorratslösung (pro Liter)

70 g K₂HPO₄
30 g KH₂PO₄
5 g Na₃-Citrat·2H₂O
1 g MgSO₄

100 × Mikronährstoffe (pro 50 ml)

20 ml 1 g/l FeSO₄
5 ml 1 g/l MnCl₂·2H₂O
5 ml 1 g/l ZnSO₄·7H₂O
5 ml 0,5 g/l CuCl₂·2H₂O
5 ml 1 g/l CoCl₂·6H₂O
5 ml 1 g/l NaMoO₄·2H₂O
5 ml 1 g/l Na₂B₄O₇·10H₂O

0,5 × SMM + 2,5 g/l BSA (pro Liter)

200 ml 5 × SMM
10 ml 1 M NH₄Cl
1 ml 0,1 M CaCl₂
10 ml 100 × Mikronährstoffe
14 ml 50%-ige Glucose
100 ml 25 g/l BSA
500 μl 10 mg/ml Chloramphenicol
Resultierender pH = 7,4

Um die Diffusionswirkung in dem Glaskugelsystem zu untersuchen, wurden Glaskugeln verschiedener Größen mit RBS-pF-Detergens (Pierce, Rockford, IL) gewaschen, erschöpfend gespült und in einem Ofen bei 92°C getrocknet. Die Kugeln wurden in halbtransparente 1,25 ml-Kunststoffsäulen bis 1 Millimeter unterhalb des oberen Endes des Säulenbetts überführt. Die Säulen wurden auf eine Vakuumverteilerleitung gegeben, das Wachstumsmedium wurde oben auf die Säule aufgetragen, und Vakuum wurde über variierende Zeitlängen angelegt, um den Großteil des Mediums zu entfernen. Ein Filter, das aus dem Boden einer nicht verwendeten Kunststoffsäule erhalten wurde, wurde dann oben auf die Kugeln gegeben, und 3 Mikroliter einer wässrigen 50 mg/ml-Lösung von Chlorphenolrot wurde mit einer Spritze auf das Filter aufgetragen. Die Säulen wurden verschlossen und bei 37°C inkubiert. Die Entfernung, die von dem purpurfarbenen Farbstoff in einer gegebenen Zeitspanne zurückgelegt wurde, wurde verzeichnet und als Maß der Diffusionsgeschwindigkeit in dem System angenommen.
Die Diffusion in einem System mit 1/8''-Kugeln aus verschiedenen Materialien wurde ähnlich durchgeführt, außer dass die Kugeln in 2 ml-Glassäulen gegeben wurden, der Farbstoff in der Mitte der Perlenmatrix zugeführt wurde und die Diffusion qualitativ durch makro- und mikroskopische Beobachtung bestimmt wurde.
Die Diffusion von Nährstoffen (veranschaulicht durch die Farbstoffdiffusion) durch das System hindurch wurde in Säulen mit Glaskugeln mit einem Bereich des mittleren Durchmessers von 30 Mikrometern bis 500 Mikrometer untersucht. Das Medium wurde durch Anlegen von Vakuum über Zeitspannen von 0,1 und 1,5 Minuten aus den Säulen entfernt. Die Diffusion, wie durch die vertikale Entfernung angezeigt, die vom Chlorphenolrot-Farbstoff zurückgelegt wurde, war bei Kugelgrößen bis zu 95 Mikrometer am ausgeprägtesten, nahm aber bei Kugeln mit 150 und 200 Mikrometer signifikant ab. Interessanterweise nahm die Diffusion bei 300 Mikrometer-Kugeln wieder zu, dann nahm sie bei 400 und 500 Mikrometer-Kugeln wieder ab. Wie in 1 gezeigt, zeigte das Diffusionsmuster bei allen drei Vakuumzeiten ein doppeltes Maximum, als es gegen den mittleren Kugeldurchmesser aufgetragen wurde.
Kugeln aus Glas, Nylon, Polyethylen, Polystyrol, Acrylharz, silanisiertem Glas, Polypropylen und Teflon mit einem Durchmesser von 1/8'' wurden in 2 ml-Glassäulen geladen, und die Diffusion wurde ähnlich untersucht, außer dass der Farbstoff in die Mitte der Kugelmatrix eingespritzt wurde und qualitative Beobachtungen durch Betrachten unter einem Präpariermikroskop vorgenommen wurden.
Das gewünschte Verhalten des Mediums ist es, Mikroreservoirs mit gleichförmiger Größe nur an den Kugelkontaktflächen zu bilden. Wenn sich größere Reservoirs über die Oberfläche von mehreren Kugeln bilden („Reservoirbildung"), ist die Größenverteilung größer, und das System ist schwieriger zu steuern: Einige Zellen können in kleineren Reservoirs und andere in größeren Reservoirs eingefangen sein, was das Wachstum einseitig beeinflussen kann. Ähnlich führen winzige Perlchen auf der Oberfläche der Kugeln entfernt von den Kontakten („Perlenbildung") zu einer größeren Größenverteilung. Eine Zusammenfassung der Beobachtungen ist in Tabelle 1 bereitgestellt. Tabelle 1

+++: sehr signifikant,
++: signifikant,
+: knapp signifikant,
–: nicht beobachtet
N. G.: In der Literatur nicht gefunden,
N. V.: nicht venrfügbar

Das verwendete Polyethylen war lineares Polyethylen. Die kritische Oberflächenspannung, die für Polyethylen mitgeteilt ist, wurde jedoch einer Literaturstelle entnommen, welche nicht den Typ anzeigt. Die primäre Silan-Komponente des Silikonisierungsmittels, Aquasil (Pierce, Rockford, IL), ist ein Octadecyltrialkoxysilan, CH₃(CH₂)₁₆CH₂Si(OR)₃, und wegen dessen Hydrophobie kann vernünftig erwartet werden, dass es eine niedrige kritische Oberflächenspannung aufweist, vorausgesetzt, dass es die Glaskugeloberfläche vollständig bedeckt.
Die Diffusion stand mit der kritischen Oberflächenspannung des Kugelmaterials in Beziehung. Die kritische Oberflächenspannung eines Materials ist als die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit definiert, unter welcher die Oberfläche des Materials nass wird. Diejenigen Materialien mit sehr niedrigen kritischen Oberflächenspannungen (z. B. Teflon, Polypropylen, silanisiertes Glas) waren bei der vollständigen Isolierung von Medium in kleine Tröpfchen wirksam, wobei sie die Diffusion vollständig verhinderten. Diese hydrophoben Materialien neigen jedoch auch dazu, eine größere Perlenbildung zu zeigen. Von den getesteten Materialien zeigte Acrylharz die idealsten Eigenschaften: das Medium war auf Kugelkontakte ohne signifikante Diffusion, Reservoirbildung oder Perlenbildung begrenzt.
Beispiel 2
Selektionsexperimente unter Verwendung von Glasperlen
2 mm-Glaskugeln wurden mit RBS-pF-Detergens gewaschen, erschöpfend gespült und in einem Ofen bei 92°C getrocknet. Die Kugeln wurden in 2 ml-Glassäulen bis zum oberen Ende des Säulenbetts überführt, und die Säulen wurden auf eine Vakuumverteilerleitung gegeben. 1,5 ml-Aquasil-Silikonisierungslösung (Pierce, Rockford, IL) wurde auf die Säulen aufgetragen und vollständig die Perlenmatrizes penetrieren gelassen. Wenn erforderlich, wurden Blasen durch Anstechen mit einem Metallstab entfernt. Nach 1 Stunde wurde durch Öffnen der Hähne an der Vakuumverteilerleitung und Anlegen von etwa 20 mm Hg Vakuum die Flüssigkeit aus den Säulen abgelassen, bis die Säulen vollständig getrocknet waren (etwa 1 Stunde).
Zwei Bacillus subtilis-Stämme wurden verwendet, um die Hypothese zu testen, dass die Diffusionskontrolle verwendet werden kann, um Stämme mit positiven Merkmalen gegenüber anderen negativen Stämmen bezüglich einer gewissen enzymatischen Aktivität zu selektieren. Bei beiden Stämmen waren deren zwei Haupt-Proteasen deletiert. Jedoch wurde einer der Stämme anschließend mit einem Plasmid transformiert, welches das Gen für GG36-Subtilisin aus Bacillus lentus trug. Der Protease-produzierende Stamm („positive" Stamm) und der Kontrollstamm („negative" Stamm) wurden jeweils getrennt in 0,5 × SMM mit NH₄Cl als Stickstoffquelle bis log Phase gezüchtet. Jede Kultur wurde dreimal mit Stickstoff-freiem 0,5 × SMM gewaschen und wieder in Stickstoff-freiem SMM suspendiert. Die Stämme wurden in einem Verhältnis von 30 : 70 gemischt, unter Begünstigung der Nicht-Protease-Produzenten gegenüber den Protease-Produzenten. Die gemischte Impfkultur wurde verdünnt und auf eine Reihe von Säulen mit Glaskugeln aufgetragen. Das verbleibende Impfmedium wurde in ein konisches 50 ml-Kunststoffrohr gegeben und bei 300 U/min auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung bei 37°C inkubiert. Zusätzlich wurden beide Stämme bei der ungefähren Dichte hergestellt, die in den Säulen erwartet wird, wenn sich Zellen in den Mikroreservoirs des Mediums befinden, und getrennt in Rohren bei 37°C und 300 U/min gezüchtet.
1 ml der gemischten Impfkultur wurde auf das obere Ende jeder Säule aufgetragen und durch Öffnen der Hähne an der Vakuumverteilerleitung lediglich unter Schwerkraft das Bett penetrieren lassen. Dann wurde ein leichtes Vakuum von etwa 200–700 mm Hg angelegt, um den Hauptteil des Mediums aus jeder Säule ohne Zurücklassung von Schaum ablaufen zu lassen, dann wurde 1 Minute ein volles Vakuum von etwa 20 mm Hg angelegt. Das Ziel war hier, das Medium an Kugelkontaktpunkten einzufangen und die „Reservoirbildung" des Mediums über der Oberfläche von mehreren Perlen zu minimieren, ohne das Medium am oberen Ende der Säulen austrocknen zu lassen. Die Säulen wurden dann verschlossen und in einen geschlossenen Polystyrol-Schaumstoffbehälter in einem Inkubator bei 37°C gegeben. Es wird geschätzt, dass das Volumen der an der Kontaktoberfläche der Perlen gebildeten Kompartimente durchschnittlich im Bereich von 0,01 bis 0,1 μl lag. Auf der Grundlage dieses Volumens und der Konzentration der Organismen in dem Medium wird geschätzt, dass jedes „Kompartiment" durchschnittlich 0,2–0,8 Organismen enthielt.
Säulenparameter

Glasbruchteil in der Kolonne = 56%
Luftbruchteil in der Kolonne = 41,7% (keine weitere Belüftung erforderlich)
Bruchteil des Mediums in der Kolonne = 2,3%
Zahl der Reservoirs pro Liter Säulenvolumen = 520 000 (geschätzt)

Zu geeigneten Zeitpunkten wurde eine Säule aus dem Inkubator entfernt. Die Stopfen wurden entfernt, der Boden der Säule wurde in ein konisches 15 ml-Kunststoffrohr gegeben, 1 ml 0,5 × SMM + NH₄Cl wurden am oberen Ende der Kolonne dazugegeben, und die Säule wurde in einem Eimer mit schwenkbarem Rotor etwa 1 Minute in schnelle Drehung versetzt, was die Sammlung von etwa 1 mm Medium in dem konischen 15 ml-Rohr zur Folge hatte. Zehnfache Reihenverdünnungen wurden aus dem gesammelten Medium hergestellt und auf Agar-Medium plattiert, das 1,6% Magermilch enthielt, und etwa 15 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zahl der Kolonien, die eine Klärzone produzierten, welche die Proteolyse des Magermilch-Substrats anzeigte, wurde gezählt, ebenso wie die Zahl ohne Klärzonen.
Der relative Prozentsatz der Protease-Produzenten zu Nicht-Protease-Produzenten wurde zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt und ist in 2 veranschaulicht.
Wie in 2 gezeigt, nahm der Prozentsatz des Protease-positiven Stamms in den Säulen vom Start des Experiments bis 9 Stunden von 30% auf 20% ab und nahm dann stetig bis zu etwa 90% bei 30 Stunden zu. So war der positive Stamm in diesem System signifikant angereichert. Die gleiche Impfkultur begünstigte das Wachstum des Protease-negativen Stamms, wenn sie in einem Rohr gezüchtet wurde, da der Prozentsatz an Positiven im Lauf der Zeit von 30% auf 5% bei 30 Stunden abnahm.
Beispiel 3
Selektionsexperiment unter Verwendung eine Oxygenierapparatur
Die beiden Stämme von Bacillus subtilis, wie oben in Beispiel 1 beschrieben, wurden in einem Verhältnis von 20 : 80 (Protease-positiv : Protease-negativ) in einem MOPS 1A-Medium gemischt, welches 2,5 g/l BSA, 100 μM NH4Cl und 3% (Gew./Vol.) Hydroxyethylcellulose (Aldrich, Milwaukee, WI) enthielt. Die Mischung wurde in drei verschiedene Oxy-1-Hohlfaser- Oxygenierapparaturen (Unisyn Technologies, Inc., Hopkinton, MA) sowie in ein Testrohr eingeimpft und über variierende Zeitlängen bei 37°C inkubiert. Die Oxygenierapparaturen wies 1800 hohle Fasern mit einem durchschnittlichen Faservolumen von 0,004 ml auf. Auf der Grundlage der Konzentration der Impfkultur wurde eine durchschnittliche Zahl von 3–8 Kolonien pro Faser erwartet. Die hohlen Fasern verhindern die Diffusion von Nährstoffen oder Hydrolyseprodukten nach der Seite, wobei die Verwendung des oben beschriebenen viskosen Mediums sicherstellte, dass die Diffusion entlang der Rohrlänge minimiert wurde.
Das Rohr und die Oxygenierapparaturen wurden auf ein rollendes Rad gegeben, um für eine Sauerstoffeintragung zu sorgen. Nach 20, 30 und 45 Stunden wurde eine Aliquote aus dem Rohr entfernt, und eine Oxygenierapparatur wurde aus der Inkubation entfernt. Das Medium wurde aus der Oxygenierapparatur entfernt und auf Magermilch enthaltende Agar-Platten plattiert. Wie in 3 gezeigt, war der Prozentsatz an Kolonien aus den Oxygenierapparaturen und aus den Rohren, welcher Klärzonen produzierte, gegen die Zeit deutlich unterschiedlich, als die Inkubation voranschritt. Beispielsweise war in einem Testrohr nach 30–45 Stunden der Prozentsatz an Protease-produzierenden Kolonien etwa 5%, wohingegen in der Oxygenierapparatur der Prozentsatz an Protease-produzierenden Kolonien etwa 85–90% betrug.
Natürlich versteht es sich, dass ein großer Bereich von Änderungen und Abwandlungen bei der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform vorgenommen werden kann. Es ist deshalb beabsichtigt, dass die vorangehende detaillierte Beschreibung so verstanden wird, dass es die folgenden Ansprüche, einschließlich aller Äquivalente, sind, die den Bereich dieser Erfindung definieren sollen.

Claims

Verfahren zur Duchmusterung von Mikroorganismen mit einem selektierbaren Merkmal, umfassend: (a) Bereitstellen einer Züchtungskammer, die inerte Trägerperlen, ein Bündel oder eine Mehrzahl von hohlen Rohren, eine Dispersion des geimpften flüssigen Züchtungsmediums in einem nicht mischbaren Fluid, eingekapseltes flüchtiges Züchtungsmedium in einer festen Matrix oder Liposomen umfasst, welche eine Mehrzahl von diskreten Kompartimenten bilden, wobei das geimpfte Züchtungsmedium eine solche Konzentration aufweist, dass bei statistischer Verteilung der Mikroorganismen mindestens 25% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten, wodurch die Diffusion von Metaboliten oder Nährstoffen zwischen den Kompartimenten innerhalb der Züchtungskammer minimiert oder gehemmt wird; (b) Herstellen eines flüssigen Züchtungsmediums, welches durch seinen Mangel an oder die Zugabe von einem oder mehreren Metaboliten oder Nährstoffen die Züchtung von Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal zeigen, gegenüber Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal nicht zeigen, erleichtert; (c) Impfen des Züchtungsmediums mit einer Mehrzahl von Mikroorganismen, von denen ein Teil das selektierbare Merkmal umfasst; (d) Geben des geimpften Züchtungsmediums in die Züchtungskammer, um die Mikroorganismen statistisch unter den diskreten Kompartimenten in der Züchtungskammer zu verteilen; (e) Inkubieren der Züchtungskammer über eine geeignete Zeit und unter geeigneten Bedingungen, um eine nachweisbare Wachstumsungleich heit zwischen Mikroorganismen mit dem selektierbaren Merkmal und Mikroorganismen, denen das selektierbare Merkmal fehlt, zu erhalten; und (f) Selektieren von Mikroorganismen, die durch ein verstärktes Wachstum als das selektierbare Merkmal aufweisend identifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem mindestens 50% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten.
Verfahren nach Anspruch 2, in dem mindestens 75% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten.
Verfahren nach Anspruch 3, in dem im Wesentlichen alle Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Kompartimente ein Volumen zwischen 0,1 und 1 Millilitern umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Kompartimente ein Volumen zwischen 0,001 und 0,1 Millilitern umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Kompartimente ein Volumen zwischen 0,0001 und 0,01 Millilitern umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem das selektierbare Merkmal ein mutiertes Enzym umfasst, das ein verändertes Verhalten zeigt.
Verfahren nach Anspruch 8, in dem das mutierte Enzym, das ein verändertes Verhalten zeigt, eine veränderte Substratspezifität, veränderte spezifische Aktivität, ein verändertes Temperatur/Aktivitätsprofil, ein verändertes pH/Aktivitätsprofil, veränderte Salz- oder Ionenanforderungen, eine veränderte Aktivität oder Stabilität in Anwesenheit von Tensiden, Lösungsmitteln oder anderen gelösten Stoffen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, in dem das Enzym eine Hydrolase, eine Oxidoreduktase, eine Transferase, eine Lyase oder eine Ligase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, in dem das Enzym eine Protease, Lipase, Amylase, β-Galactosidase, Cellulase, Lactase, Polygalacturonase, β-Glucoamylase, Esterase, Hemicellulase, Peroxidase, Oxidase, Laccase, Glucoseoxidase, Ligninase, NADH-Reductase oder 2,5 DKG-Reductase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Mikroorganismen Bakterien, faserige Pilze oder Hefe umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Mikroorganismen vor dem Impfen des Züchtungsmediums mit den Mikroorganismen einer Mutagenese unterzogen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Züchtungskammer hohle Fasern, Glasperlen, eine Dispersion des geimpften Mediums in einem nicht-mischbaren Fluid oder eine Einkapselung des Mediums in einer festen Matrix umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Isolierung von Mikroorganismen mit einem selektierbaren Merkmal, umfassend: (a) Herstellen einer Population von Mikroorganismen, für die das selektierbare Merkmal gewünscht wird, und Einwirkenlassen eines oder mehrerer Mutationsereignisse auf die Population, um mutierte Mikroorganismen zu erzeugen; (b) Bereitstellen einer Züchtungskammer, die inerte Trägerperlen, ein Bündel oder eine Mehrzahl von hohlen Rohren, eine Dispersion des geimpften flüssigen Züchtungsmediums in einem nicht-mischbaren Fluid, eingekapseltes flüssiges Züchtungsmedium in einer festen Matrix oder hergestellt werden Liposomen umfasst, welche eine Mehrzahl von diskreten Kompartimenten bilden, wobei das geimpfte Züchtungsmedium eine solche Konzentration aufweist, dass bei einer statistischen Verteilung der Mikroorganismen mindestens 25% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten, wodurch die Diffusion von Metaboliten oder Nährstoffen zwischen den Kompartimenten innerhalb der Züchtungskammer minimiert oder gehemmt wird; (c) Herstellung eines flüssigen Züchtungsmediums, das durch seinen Mangel an oder die Zugabe von einem oder mehreren Metaboliten oder Nährstoffen die Züchtung der mutierten Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal zeigen, gegenüber mutierten oder nicht mutierten Mikroorganismen, die das selektierbare Merkmal nicht zeigen, erleichtert; (d) Impfen des Züchtungsmediums mit den mutierten Mikroorganismen; (e) Geben des geimpften Züchtungsmediums in die Wachstumskammer, um die eingeimpften Mikroorganismen statistisch unter den diskreten Kompartimenten in der Züchtungskammer zu verteilen; (f) Inkubieren der Züchtungskammer über eine geeignete Zeit und unter geeigneten Bedingungen, um einen nachweisbaren Wachstumsunterschied zwischen mutierten Mikroorganismen mit dem selektierbaren Merkmal und Mikroorganismen, denen das selektierbare Merkmal fehlt, zu erhalten; und (g) Selektieren der mutierten Mikroorganismen, die durch ein erhöhtes Wachstum als das selektierbare Merkmal aufweisend identifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 15, in dem der Schritt (b) vor dem Schritt (c) stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 15, in dem der Schritt (b) gleichzeitig mit oder nach dem Schritt (c) stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 15, in dem mindestens 50% der Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten.
Verfahren nach Anspruch 18, in dem im Wesentlichen alle Kompartimente nur einen Mikroorganismus enthalten.