DE69729283T2

DE69729283T2 - GLYKOSYLIERTE IgG ANTIKÖRPER

Info

Publication number: DE69729283T2
Application number: DE69729283T
Authority: DE
Inventors: Shui-On Leung; Hans Hansen; Zhengxing Qu
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1996-03-20
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2017-03-20
Also published as: CA2249320C; US20030035800A1; AU705063B2; JP3904238B2; WO1997034632A1; DE69729283D1; US6254868B1; EP0888125B1; EP0888125A1; CA2249320A1; EP0888125A4; JP2000507818A; US20040258682A1; AU2531897A; ATE267610T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Immunkonjugate für diagnostische und therapeutische Verwendungen bei Krebs. Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinant hergestellte humanisierte monoklonale Antikörper, die gegen B-Zellen-Lymphome und Leukämiezellen gerichtet sind, wobei Antikörper ohne Verlust der Antikörperbindung und Verinnerlichung der Funktion mit einer reduzierten Herstellung von menschlichem Anti-Mäuse-Antikörpern kovalent an ein diagnostisches oder therapeutisches Reagenz konjugiert werden können.
Bei Lymphomen, die nicht vom Hodgkin-Typ sind (NHL), und chronischer lymphozytischer Leukämie handelt es sich um bösartige B-Zellen-Tumore, die zur Sterblichkeit durch Krebs beitragen. Die Reaktion dieser bösartigen Tumore auf verschiedene Behandlungsformen ist uneinheitlich. Sie reagieren einigermaßen gut auf Chemotherapie und in Fällen, in welchen wie für Patienten mit lokaler Erkrankung eine klinische Behandlung von NHL möglich ist kann unter Verwendung von Feldbestrahlungstherapie eine zufrieden stellende Behandlung bereitgestellt werden (Hall et al., Radiology for the Radiologist, Lippincott, Philadelphia, 1989, S. 365–376). Jedoch beschränken die mit einer Chemotherapie verbundenen toxischen Nebenwirkungen und die Toxizität gegenüber dem Hämopoesesystem durch lokale sowie ganzkörperliche Radiotherapie die Verwendung dieser therapeutischen Verfahren. Etwa die Hälfte der Patienten sterben an der Erkrankung (Posner et al., Blood, 61: 705 (1983)).
Die mit Radionukliden oder anderen zytotoxischen Mitteln verbundene Verwendung von monoklonalen Ziel-Antikörpern bietet die Möglichkeit der Abgabe sol cher Mittel direkt an die Tumorstelle, wodurch sie den Kontakt normalen Gewebes mit toxischen Mitteln beschränken (Goldenberg, Semin. Nucl. Med., 19: 332 (1989)). In den letzten Jahren wurde das Potential einer Therapie auf Antikörperbasis und ihre Genauigkeit bei der Lokalisierung von mit Tumoren verbundenen Antigenen sowohl im Labor als auch in klinischen Studien aufgezeigt (siehe z.B. Thorpe, TIBTECH, 11: 42 (1993); Goldenberg; Scientific American, Science & Medicine, 1: 64 (1994); Baldwin et al., U.S. 4,925,922 und 4,916,213; Young, U.S. 4918163; U.S. 5,204,095; Irie et al., U.S. 5,196,337; Hellstrom et al., U.S. 5,134,075 und 5,171,665). Im Allgemeinen war die Verwendung von radiomarkierten Antikörpern oder Antikörperfragmenten gegen mit Tumoren verbundene Markierungen teilweise aufgrund der Geringfügigkeit der Antikörperaufnahme von dem Tumor im Allgemeinen im Bereich von nur 0,01% bis 0,001% der injizierten Gesamtdosis für die Lokalisierung von Tumoren erfolgreicher als für die Therapie (Vaughan et al., Brit. J. Radiol., 60: 567 (1987)). Eine Zunahme der Konzentration der Radiomarkierung zur Erhöhung der Dosierung für den Tumor ist im Allgemeinen kontraproduktiv, da dadurch auch der Kontakt von gesundem Gewebe mit der Radioaktivität erhöht wird.
Bei LL2 (EPB2) handelt es sich um ein hochspezifisches Anti-B-Zellen-Lymphom und einen monoklonalen Mäuse-Antikörper (mAb) der antilymphozytischen Leukämiezelle, der leicht von solchen Zellen verinnerlicht wird und einige der vorstehenden Schwierigkeiten bewältigen kann (Shih et al., Int. J. Cancer, 56: 538 (1994)). LL2, bei welchem es sich um den IgG2a-Antikörpertyp handelt, wurde unter Verwendung der Raji-B-Lymphom-Zellreihe als Antigenquelle entwickelt (Pawlak-Byczkowska et al., Cancer Res., 49: 4568 (1989)). Es ist bekannt, dass Mäuse-LL2 (mLL2) mit einem Epitop von CD22 reagiert (Belisle et al., Proc Amer. Assn. Clin. Res., 34: A2873 (1993)). CD22-Moleküle werden in das Vorläufer-Zytoplasma und in frühe Prä-B-Zellen exprimiert und erscheinen in der Zelloberfläche von reifen B-Zellen.
Durch Immunfärben von Gewebeabschnitten zeigte es sich, dass mLL2 mit 50 von 51 getesteten B-Zellen-Lymphomen reagiert. mLL2 stellt, wie bestimmt durch ein Radioimmunnachweisverfahren, ein hochempfindliches Mittel zum Nachweisen einer B-Zellen-Lymphomzelle in vitro bereit (Murthy et al., Eur. J. Nucl. Med., 19: 394 (1992)). Das mit ^99mTc markierte Fab'-Fragment von mLL2 ist an 63 von 65 bekannten Läsionen bei Versuchspatienten der Phase II mit B-Zellen-Lymphom lokalisiert (Mills et al., Proc., Amer. Assn., Cancer Res., 14: A2857 (1993)). Zudem war mit ¹³¹I-markiertes mLL2 bei Patienten mit B-Zellen-Lymphomen therapeutisch wirksam (Goldenberg et al., J. Clin. Oncol., 9: 548 (1991)). Das an das Exotoxin PE38KDEL konjugierte mLL2-Fab' induzierte eine vollständige Remission von messbaren menschlichen Lymphom-Xenograften (CA-46), die in Nacktmäusen wuchsen (Kreitman et al., Cancer Res., 53: 819 (1993)).
Die klinische Verwendung von mLL2 war genau wie mit den meisten anderen versprechenden Mäuse-Antikörpern durch die Entwicklung einer menschlichen Anti-Mäuse-Antikörperreaktion (HAMA) beim Menschen beschränkt. Während eine HAMA-Reaktion in Folge einer Injektion von mLL2 nicht ausnahmslos beobachtet wird, entwickelten Patienten in einer bedeutenden Anzahl an Fällen HAMA in Folge einer einzelnen Behandlung mit mLL2. Dies kann die diagnostische und therapeutische Nützlichkeit der Antikörper-Konjugate nicht nur aufgrund des möglichen anaphylaktischen Problems beschränken, sondern es kann auch ein Hauptteil des zirkulierenden Konjugats an die zirkulieren Anti-Mäuse-Antikörper komplexiert und durch diese maskiert werden. Dies ist durch eine Studie veranschaulicht, in welcher etwa 30% der Patienten infolge einer Einzelinjektion von etwa 6 mg mLL2 ¹³¹I-IgG eine geringfügige HAMA-Reaktion und nahezu alle eine starke HAMA-Reaktion mit zusätzlichen Injektionen entwickelten. Andererseits wurde mit mit ^99mTc markiertem mLL2 Fab' markiert keine HAMA-Reaktion beobachtet. Solche HAMA-Reaktionen stellen im Allgemeinen ein mögliches Hindernis der Realisierung des vollen diagnostischen und therapeutischen Potentials des mLL2-Antikörpers dar.
Wie vorstehend angemerkt, verringert/umgeht die Verwendung von mLL2-Fragmenten wie F(ab')₂ und Fab' diese Probleme der Immunogenität teilweise. Jedoch liegen einige Fälle vor, wie beim Ziel einer Einbringung von zellulärer Immunität zur Therapie oder bei Notwendigkeit von Antikörpern mit verbesserter Überlebenszeit, in welchen vollständiges IgG erwünschter ist.
Zur Funktion von monoklonalen Antikörpern als Freisetzungsvehikeln für Arzneimittel und Radionuklide ist es von primärer Wichtigkeit, Verfahren für ihre stellenspezifischen Konjugationen mit minimaler Störung der erhaltenen Immunreaktivitäten zu entwickeln. Am herkömmlichsten wird die Konjugation von Arzneimitteln und Radionukliden durch ihre kovalenten Anlagerungen an Seitenketten der Aminosäurereste erzielt. Aufgrund der nicht-stellenbeschränkten Natur dieser Reste ist es schwierig, unerwünschte Kopplungen an innerhalb oder in der engen Umgebung des ABS liegende Reste zu vermeiden, was zu reduzierter Affinität und heterogenen Antigen-Bindungseigenschaften führt. Alternativ dazu kann die Konjugation auf Sulfhydrylgruppen gerichtet sein. Jedoch ist das direkte Markieren mit dem möglichen Risiko einer Proteinfragmentierung auf die Reduktion von S-S-Bindungen angewiesen.
WO 96/04925 offenbart ein humanisiertes mAb mit einer natürlich vorkommenden N-gebundenen Glykosylierungsstelle, die an den Aminosäurepositionen 18–20 der LL2-VK-Domäne für stellenspezifische Arzneimittel zu finden ist, oder Chelatkonjugation. Die angelagerte Kohlenhydrateinheit wurde davon wegpositioniert und zeigte keine physikalischen Kontakte mit der Antigen-Bindungsstelle (ABS). Die Immunreaktivität des Antikörpers wurde nicht beeinflusst, als Chelate wie DTPA an das Kohlenhydrat konjugiert wurden.
Jedoch ist die Nützlichkeit dieses Antikörpers beschränkt. Erstens ist es nicht klar, welche Größe und welcher Typ von Chelaten angelagert werden kann, bevor die Immunreaktivität beeinflusst wird. Wir bestimmten, dass eine Anlagerung von größeren Chelaten die Bindungsaffinität beeinflusst. Folglich reduziert die Anlagerung eines Dox-Dextrans mit 18 kD an das Kohlenhydrat an Position 18–20 der LL2-VK-Domäne die Immunreaktivität um etwa 50%. Weiterhin wäre es sehr vorteilhaft, andere Antikörper so umzubauen, dass sie aktive Glykosylierungsstellen enthalten. Der Umbau von anderen Antikörpern in der Weise, dass Glykosylierungssequenzen in der variablen Region vorliegen, ist schwierig, da die Umbauschritte für jeden Antikörper wiederholt werden müssen. Weiterhin könnte die Immunreaktivität des Konstrukts beeinflusst werden.
Eine IgG-Glykosylierung an Asn-297 in der CH2-Fc-Domäne wurde für den Beibehalt von Antikörperstabilität und der geeigneten Struktur für genaue Effektor-Funktionen als wichtig charakterisiert. Siehe Tao und Morrison, J. Immunol. 143: 2595 (1989). Aufgrund der eingeschränkten Lokalisierung von fern von dem ABS liegenden Immunglobulin-Glykosylierungsstellen wurde eine Oligosaccharidmodifikation von monokonalen Antikörpern zur Herstellung von Konjugaten verwendet. Konjugate, die mit an ein tyrosinhaltiges Peptid gekoppeltem ¹³¹I modifiziert sind, das dann stellenspezifisch an oxidierte Oligosaccharide angelagert wurde, zeigten verglichen mit den nicht selektiv an Tyrosin modifizierten Konjugaten eine größere Zieleffizienz. Da die Verwendung von mit Asn-297 verbundenem Kohlenhydrat die Gegenwart des Fc-Teils des Antikörpers erfordert, ist seine Verwendung beschränkt. Es gibt verschiedene Anwendungen, die Antikörperfragmente einsetzen, in welchen der Fc-Teil nicht vorliegt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf diejenigen Zugänge durch Umbau von N-gebundenen Glykosylierungsstellen in die konstant schweren (CH1) Domänen von IgG-Antikörpern. Dies weist die folgenden Vorteile auf:

1. Die Glykosylierung erfolgt an einer anderen Domäne, die physikalisch von der den das ABS bildenden variierbaren Domänen entfernter ist;
2. Es wäre zu erwarten, dass eine Konjugation mit hoher Dosierung von Chelaten oder sogar sperrigen Gruppen, die die feine Struktur der CH1-Domäne beeinflussen könnten, sehr geringe Wirkungen, wenn überhaupt, auf die das ABS bildenden VH- und VK-Domänen zeigen;
3. Antikörperfragmente, ein bevorzugtes Format in einigen klinischen Anwendungen, enthalten sowohl die CH1- und CK-Domänen, und ihre Konjugationsstelle sollte zur Verwendung in Antikörperfragmenten (z.B. Fab, F(ab')₂) geeignet sein;
4. Im Gegensatz zur an VK angehängten Glykosylierungsstelle, die in verschiedene Antikörper auf einer Basis des fallweisen Vorgehens (z.B. durch stellengerechte Mutagenese) eingebracht werden müssten, kann die die Kohlenhydrat-Additionsstellen enthaltende CH1-Domäne leicht an verschiedene variierbare Domänen mit verschiedenen Antigenspezifitäten gebunden werden, wenn sie erst einmal als effizienter Konjugationsumgang identifiziert wurde.

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, humanisierte Antikörper mit einer Glykosylierung in der CH1-Domäne bereitzustellen, die Antigen-Bindungsspezifität beibehalten.
Es ist eine andere Aufgabe dieser Erfindung, Konjugate der glykosylierten mAbs bereitzustellen, die therapeutische oder diagnostische Modalitäten enthalten.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Therapie- und Diagnoseverfahren bereitzustellen, die die humanisierten mAbs der Erfindung verwenden.
Zum Erzielen dieser Aufgaben wurde in einem Aspekt der Erfindung ein monoklonaler IgG-Antikörper oder ein monoklonales IgG-Antikörperfragment bereitgestellt, das so umgebaut ist, dass es eine Glykosylierungsstelle in der nicht-Fc-konstanten schwerkettigen Region enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper oder Antikörperfragment um einen hu manisierten Antikörper oder um ein humanisiertes Antikörperfragment. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem humanisierten spezifischen monoklonalen Antikörper um einen Antikörper oder ein humanisiertes B-Zellen-spezifisches Antikörperfragment. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Glykosylierung an einer Stelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den HCN1-, HCN2-, HCN3-, HCN4- und HCN5-Stellen von 12 lokalisiert. In besonders bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Glykosylierungsstelle um die HCN5-Stelle oder die HCN1-Stelle von 12. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper, der so umgebaut ist, dass er eine Glykosylierungsstelle enthält, um einen Antikörper mit der Spezifität des hLL2-Antikörpers.
In einem anderen Aspekt der Erfindung wurde ein isoliertes DNA-Molekül bereitgestellt, das ein schwerkettiges IgG-Antikörpergen umfasst, das eine Sequenz in der CH1-Region umfasst, die beim gemeinsamen Exprimieren des Gens mit einem zweiten Gen für eine leichte Antikörperkette in einer eine Glykosylierung tragenden Zelle einen in der CH1-Region glykosylierten Antikörper herstellt.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wurde ein Verfahren zu Herstellung eines Antikörpers oder eines in der IgG-CH1-Region glykosylierten Antikörperfragments bereitgestellt, das das gemeinsame Exprimieren von leicht- oder schwerkettigen Genen oder Teilen davon, die mit einer Mutation so umgebaut wurden, dass eine Glykosylierungsstelle in der CH1-Region des schwerkettigen Gens oder von Teilen davon in einer Glykosylierung gewährenden Zelle so gebildet wird, dass der Antikörper oder das Antikörperfragment in der CH1-Region hergestellt wird, und Isolieren des Antikörpers oder Antikörperfragments umfasst.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wurde ein Verfahrung zur Diagnose oder Behandlung eines Patienten bereitgestellt, wobei ein monoklonaler IgG-Antikörper oder ein monoklonales IgG-Antikörperfragment zum Zielen auf eine spezifisches Antigen verwendet wird, wobei der Antikörper oder das Antikörper fragment als solches oder in an ein diagnostisches oder therapeutisches Mittel konjugierter Form verwendet wird, wobei es sich bei der Verbesserung des Antikörpers oder Fragments um einen humanisertern monoklonalen Antikörper oder ein humanisiertes monoklonales Antikörperfragment handelt, das so umgebaut wurde, dass es eine Gykosylierungsstelle in der nicht-Fc-konstanten schweren Kette enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Antikörper oder Antikörperfragment um einen B-Zellen-spezifischen Antikörper oder um ein B-Zellen-spezifisches Antikörperfragment.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt einen Vergleich von Mäuse- und humanierten LL2-VK-Domänen (1A) und -VH-Domänen (1B). Nur hFR-Sequenzen (bezeichnet als REIHuVK und EUHuVH), die von mFR-Sequenzen (bezeichnet als Mäuse-) verschieden sind, sind dargestellt und durch Sternchen gekennzeichnet. CDRs sind in Kästchen dargestellt. Die durch Computermodellieren zum Kontaktieren eines CDRs dargestellten FR-Reste sind unterstrichen.
2 zeigt die Nachbarbeziehungen von LL2-CDRs mit ihren Gitterregionen (FRs). Einzelne Energie-minimierte Modelle für die VL- und VH-Domänen von mLL2 wurden konstruiert und alle FR-Reste innerhalb eines Radius von 4,5 Å oder jedes beliebige CDR-Atom wurden als mögliche CDR-FR-Kontakte identifiziert. CDRs der leichten (L1, L2, und L3, 2A) und der schweren (H1, H2, und H3, 2B) Ketten sind als „Kugel- und Stäbchen"-Darstellungen dargestellt, die ihre jeweiligen raumfüllenden FRs überlagern.
3A zeigt die leichte Ketten stützenden Vektoren (VKpBR) der Säugerexpression (pKH) und 3B zeigt die schwere Ketten stützenden Vektoren (VKpBS) der Säugerexpression (pG1g).
4 zeigt die Doppelstrang-DNA und Aminosäuresequenzen der LL2-VK-Domäne (4A) und die LL2-VH-Domäne (4B). Durch die entsprechenden DNA-Sequenzen kodierte Aminosäuresequenzen sind als einbuchstabige Codes angegeben. CDR-Aminosäuresequenzen sind in Kästchen dargestellt. Die in FR1 oder LL2VK lokalisierte Asn-Glykosylierungsstelle (4A) ist als die unterstrichene NVT-Sequenz dargestellt.
5A zeigt die Doppelstrang-DNA und entsprechende Aminosäurereste der hLL2-VK-Domäne. CDR-Aminosäuresequenzen sind in Kästchen dargestellt. Die entsprechenden Daten für die VH-Domäne sind in 5B dargestellt.
6 ist eine schematische Diagrammdarstellung der PCR/Gensynthese der humanisierten VH-Region und des Subklonens in den Stützvektor VHpBS.
7 zeigt die Ergebnisse eines vergleichbaren Raji-Zell-Konkurrenz-Antikörperbindungstests, der das Konkurrieren von mLL2- und cLL2-Antikörpern für die Bindung an Zellen gegen Spuren radiomarkiertes mLL2 beinhaltet.
8 zeigt die Ergebnisse eines vergleichbaren Raji-Zell-Konkurrenz-Antikörperbindungstests, in welchem gemischte humanisierte/chimäre LL2s mit cLL2 (8A) und zwei Versionen von hLL2 mit cLL2 (8B) verglichen werden.
9 zeigt einen Vergleich der Bindungsverhältnisse von Antikörperverinnerlichung: Oberfläche als Zeitfunktion für cLL2-, cLL2- (Q-zu-V-Mutagenese), hLL2- und mLL2-Antikörpern.
10 zeigt die Wirkung der Deglykosylierung von mLL2 auf seine Bindungsaffinität an Raji-Zellen.
11 zeigt einen Konkurrenzbindungstest, wobei eine Peroxidasekonjugierte mLL2-Bindung an WN gemessen wurde. hLL2 und glykosylierte Derivate in den schwerkettigen konstanten Regionen mit den angegebenen Konzentrationen wurden zum Konkurrieren mit mLL2 verwendet.
12 zeigt die N-Glycan-Akzeptor-Sequenzen und Positionen, die in die CH₁- und C_K-Domänen von hLL2 eingebracht wurden. Stellengerichtete Mutagenesen wurden zum Bilden der Tripeptid-Akzeptor-Sequenzen (dargestellt in fett gedruckten Buchstaben) verwendet. Teilpeptid-Sequenzen der CH₁-Domänen (H-Kette) und C_K-Domänen (K-Kette) von hLL2 sind dargestellt und auf die Sequenz- und Strukturhomologie zum Anzeigen der Lokalisierungen von umgebauten möglichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen (HCN1–HCN5 und KCN1–KCN4) abgestimmt. Die β-Strang-Sequenzen (C–F) sind in Kästchen dargestellt. Die Reste wurden gemäß dem Kabat-System nummeriert; Sternchen (*) zeigen diese schwerkettigen aa-Reste an, die diskontinuierlich vom vorhergehenden aa-Rest nummeriert wurden. Die aa-Reste, die durch * angegeben sind, sind von links nach rechts als 156, 162, 171, 182, 203 bzw. 205 nummeriert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Glykosylierungsstellen werden in CH1-Immunglobulin-IgG-Domänen zum Bereitstellen von humanisiertem Immunglobulin mit umgebauten Glykosylierungsstellen umgebaut. Unter Verwendung von stellengerichteter Mutagenese werden die Glykosylierungsstellen in die konstanten Regionen der schweren Ketten, insbesondere in die CH1-Domänen eingebaut. CH1-Nukleotid-Sequenzen werden dann in leichtkettige bzw. schwerkettige Expressionsvektoren subgeklont. Der CH1-mutierte schwerkettige Expressionsvektor wird gemeinsam mit einem leichtkettigen Expressionsvektor exprimiert, um mutierte, humanisierte Antikörper mit abgewandelten Glykosylierungsstellen in der CH1-Domäne zu erzeugen.
Es sollte angemerkt werden, dass nicht alle möglichen Kohlenhydrat-Additionssequenzen zur Oligosaccharidanlagerung verwendet werden können. Eine Reihe an Glykosylierungsmutanten wurde durch Einbringen von neuen N-gebundenen Glykosylierungssequenzen an die schwerkettige Komplementaritätbestimmende Region 2 (CDR2-Region) von Anti-Dextran- bzw. Anti-Dansyl-Antikörpern gebildet. Während eine Glykosylierung an Asn 54 und Asn 60 des Anti-Dextran-Antikörpers gefunden wurde, wurde jedoch die in einer ähnlichen Position (Asn 55) im Anti-Dansyl-Antikörper platzierte Kohlenhydrat-Additionsstelle nicht verwendet. Dieser „Positions-Effekt" ist nicht gut nachzuvollziehen, jedoch ist es äußerst wahrscheinlich, dass er mit der Proteinkonformation und Zugänglichkeit der Kohlenhydrat-Akzeptorsequenz für Glycolyl-Transferase verbunden ist.
In dieser Beschreibung sollen die Expressionen „hLL2" oder „hLL2-mAb" den monoklonalen Antikörper bedeuten, der durch Verbinden oder Subklonen der Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) von Mäuse-VK und -VH-Regionen an menschliche Gitterregionen (FRs) und Verbinden oder Subklonen dieser mit menschlichen konstanten leichten bzw. schweren Ketten konstruiert wird.
Kovalente Konjugate zwischen den mutierten Antikörpern der Erfindung und einem diagnostischen oder chemotherapeutischen Reagenz, das in pharmazeutisch verträglichen Vehikeln (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) formuliert ist, können hergestellt werden. B-Zellen-Lymphome und Leukämie-spezifische Antikörper, die glykosylierte CH1-Domänen umfassen, die an ein zu humanisierten mAbs führendes diagnostisches oder therapeutisches Reagenz konjugiert sind, weisen weiterhin die Fähigkeit zum Verinnerlichen in Zielzellen und zur schnellen intrazellulären Abgabe des diagnostischen oder chemotherapeutischen Reagenzes auf (wodurch die Wirksamkeit des Reagenzes erhöht wird), wobei zudem der Vorteil einer Reduktion der HAMA-Reaktion im menschlichen Patienten erzielt wird.
Da die Kohlenhydrateinheit der umgebauten Antikörper der Erfindung nicht an der Bindung des Antigens beteiligt ist, können Konjugate verwendet werden, in welchen ein Reagenz durch Kohlenhydrateinheiten an den Antikörper gebunden ist. Zum Beispiel kann ein Reagenz an ein oxidiertes Kohlenhydratderivat konjugiert sein. Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate und deren Verwendung in diagnostischen und therapeutischen Mitteln sind z.B. in Shih et al., U.S.-Patent Nr. 5,057,313, Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988), und in der gleichzeitig anhängigen und auch Hansen et al. zugewiesenen USSN 08/162,912 bereitgestellt. Eine direkte Bindung eines Reagenzes an oxidiertes Kohlenhydrat ohne die Verwendung eines polymeren Trägers ist in McKearn et al., U.S.-Patent Nr. 5,156,840 beschrieben.
Eine breite Vielfalt an diagnostischen und therapeutischen Reagenzien kann vorteilhaft an die Antikörper der Erfindung konjugiert werden. Diese schließen ein: chemotherapeutische Arzneimittel wie Dexorubicin, Methotrexat, Taxol und dergleichen; Chelatbildner wie DTPA, an welche nachweisbare Markierungen, wie Fluoreszenzmoleküle oder zytotoxische Mittel wie Schwermetalle oder Radionuklide komplexiert werden können; und Toxine wie Pseudomonas exotoxin und dergleichen. Verschiedene Ausführungsformen dieser Konjugate sind in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
Zusätzliche oder alternative Glykosylierungsstellen (NXT/S) können aufgebaut und in die VK-, CK- und CH-Domänen eines beliebigen erfindungsgemäßen Antikörpers, z.B. hLL2, eingebracht werden (hier steht X für eine beliebige Aminosäure außer für Prolin oder Aspartat). Diese Wirkungen auf die Bindungsspezifität, Bioverteilung in vivo, in Testtieren, und Effizienz der Konjugation von Arzneimitteln und Chelaten der glykosylierten Einheiten kann zum Bestimmen von nützlichen Glykosylierungsstellen getestet werden. Wahrscheinliche Stellen zur Glykosylierung können durch Vergleich mit Glykosylierungsstellen von bekanntem Ab von verschiedenen Spezies oder Isotypen durch Analyse der bekannten Strukturen von menschlichen CK- und CH1-Domänen durch Computermodellieren zum Identifizieren von frei gelegten Positionen oder durch statistische Zielschussmutagenese identifiziert werden.
In der vorliegenden Erfindung verwendete Zellreihen und Kulturmedien schließen LL2-Hybridomzellen (EPB-2) (Pawlak-Byczkowska et al., 1989, vorstehend), Sp2/0-Ag12-Myelomzellen (ATCC, Rockville, MD) und Raji-Zellen ein. Diese Zellen werden vorzugsweise in Dulbeco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% FCS (Gibco/BRL, Gaithersburg, MA), 2 mM L-Glutamin und 75 μg/ml Gentamicin (vollständiges DMEM) gezüchtet. Man lässt Transfektome in Hybridomserum-freiem Medium, HSFM, (Gibco/BRL, Gaithersburg, MA), enthaltend 10% FCS und 75 μg/ml Gentamicin (vollständiges HSFM) oder, wo angezeigt, in nur Antibiotika enthaltendem HSFM wachsen. Die Selektion der Transfektome kann in vollständigem HSFM, enthaltend 500 μg/ml Hygromycin (Calbiochem, San Diego, CA) durchgeführt werden. Alle Zellreihen werden vorzugsweise bei 37°C in 5% CO₂ gehalten.
Aufbau von Glyosylierungsstellen in CH1 und CK
Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist es, dass Antikörperkonformationen durch Computermodellieren (siehe z.B., Dion, in Goldenberg et al., Hg., Cancer Therapy With Radiolabelled Antibodies, CRC Press, Boca Raton, FL, 1994, hier unter Bezugnahme eingebracht) modelliert werden können. Im Allgemeinen werden die 3-D-Strukturen am besten durch Homologie modelliert, die durch die Verfügbarkeit von kristallographischen Daten von der Proteindatenbank (PDR Code 1REI, Bernstein et al., J. Mol. Biol. 112: 535 (1977), hier unter Bezugnahme eingebracht) erleichtert wird. Gleichermaßen können die Antikörper-EU-(VH)-Sequenzen (Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5. Ausg., US Dept. of Health und Human Services, US Gov. Printing Office (1991)) als modellierende Gegenstücke für FR1 bis FR3 der schweren mLL2-Kette ausgewählt werden; FR4 basierte auf NEWM. Id. Da Röntgenkoordi nationsdaten gegenwärtig für das Fehlen der EU-Sequenz verwendet werden, können NEWM-Strukturdaten (PDR Code 3FAB) für die FRs 1 bis 4 verwendet werden, und Aminosäurenebengruppen können ersetzt werden, dass sie nach Bedarf mLL2 oder EU (hLL2) zu entsprechen. Das CDR der leichten Kette kann aus der entsprechenden Sequenz der 1MCP-Proteindatenbank (L1 und L2) und 1REI (L3) modelliert werden. Für schwerkettige CDRs können H1 und H2 auf der Basis der 2HFL-Proteindatenbank bzw. 1MCP vorliegen, während H3 de novo modelliert werden kann. Wo immer es möglich ist, sollten Nebengruppenersetzungen so durchgeführt werden, dass der Drehwinkel zwischen Cα und Cβ beibehalten wird. Eine Energieminimierung kann durch das AMBER-Kraftfeld (Weiner et al., J. Amer. Chem. Soc. 106: 765 (1984) unter Verwendung des Konvergenzverfahrens erzielt werden. Möglicherweise kritische FR-CDR-Wechselwirkungen können durch anfängliches Modellieren der leichten und schweren variablen mLL2-Ketten bestimmt werden. Alle FR-Reste innerhalb eines Radius von 4,5 Å aller Atome innerhalb der CDRs können dadurch identifiziert und im letztendlichen Aufbaumodell von hLL2 beibehalten werden.
Das homologe Molekülmodell des Fab-Fragments von hLL2 wurde mit der QUANTA-Protein-Modellierpackung unter Verwendung der Röntgenstruktur von humanisierten Anti-p185her2-Antikörperfragmenten (1FVD) als Haupttemplat gebildet. Siehe Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4285 (1992); Eizenbrot et al., J. Mol. Biol. 229: 969 (1993). Die Sequenzidentität zwischen den zwei Antikörpern beträgt etwa 80%. Die Einfügungsregionen wurden durch Durchsuchen von verfügbaren Proteindatengenbanken modelliert. Nachdem alle Koordinaten gebildet und Verbindungsregionen normalisiert wurden, wurden eine Reihe von Energieminimierungen auf das Modell angewandt. Dies schließt 100 Stufen steilsten Abfalls (SD) nur für die Nebenkettenatome, dann 100 Stufen SD und CG EM für alle außer Cα-Atome und schließlich 100-stufige SD und EM für alle Atome ein. Ein mit der dielektrischen Konstante verbundener Abstand 4r (r ist die Atom-Atom-Abstand in Å) wurde für elektrostatische Wechselwirkungen verwendet. Der RMS der Atomposition für äquivalente Hauptketten- und Nebenket tenatome zwischen 1FVD und hLL2 betrug 1,46 Å bzw. 2,11 Å. Punktmutationen wurden dann auf hLL2 aufgebracht, um die Modelle der Mutant-Antikörpern hLL2HCN1 und hLL2HCN5 zu bilden. Komplexartige Oligosaccharide wurden unter Verwendung desselben Programms mit den durch das Sequenzieren von Kohlenhydraten aufgeklärten Zusammensetzungen und Strukturen modelliert.
Jede gebildete Oligosaccharidkette wurde dann mit der entsprechenden N-gebundenen Glykosylierungsstelle verankert, wobei das 01 des terminalen GlcNac das N_d des Asn und die 01Cl-Bindung des mit einem der Nd-H-Bindungen des Asn zusammengereihten GlcNac überlagerte. Die Konformation der angelagerten Oligosaccharidkette wurde sequentiell so manipuliert, dass die längste Verzweigung nahe an der variablen Region der schweren Kette von hLL2 lag. Nach jeder Einstellung wurden 100 Stufen SD und CG EM an Zuckeratomen mit fixierten Ankeratomen und hLL2-Atomen angewandt.
Die Ausbauten für die CK- und CH1-Glykosylierungsstellen basieren auf den folgenden Prinzipien:

1. Eine Kohlenhydrat-Additionsstelle mit der Sequenz NXS/T wurde ausgewählt. Bei X kann es sich um eine beliebige Aminosäure außer Prolin und Aspartat handeln. Wo immer es möglich ist, wurden nur einzelne Aminosäureveränderungen zum Installieren von möglichen Glykosylierungsstellen an einer ausgewählten Position getestet, so dass die Störung der Domänenstruktur minimiert wurde.
2. Mögliche CK- oder CH1-verbundene Glykosylierungsstellen können aus einer bekannten Antikörpersequenz von verschiedenen Spezies oder Isotypen identifiziert werden.
3. Analysen der bekannten Strukturen von menschlichen CK- und CH1-Domänen durch Computermodellieren zum Identifizieren von frei gelegten Positionen, in welchen potentielle Asn-Glykosylierungsstellen eingepflanzt werden können.

Auf der Basis von Computermodellstudien wurde der engste Zugangsabstand zwischen dem VK-angehängten Oligosaccharid und dem CDRs als 20 Å bestimmt. Ein Abstand von größer als 4,1 Å wird als frei von Wechselwirkungen betrachtet. Folglich sind um 4,1 Å oder weiter weg von der Antigen-Bindungsstelle liegende Glykosylierungsstellen wahrscheinliche Kandidaten zur Verwendung als Konjugationsstellen für Antikörperfragmente. Wo immer es möglich ist, sind die in die CH1- und CK-Domänen eingebrachten Mutationen von Natur aus bewahrend, so dass die endgültige tertiäre Struktur der Proteindomänen beibehalten wird. Eine bewahrende Mutation beinhaltet im Allgemeinen die Substitution von einer durch eine andere mit ähnlicher Größe und klinischen Eigenschaften. Speziell handelt es sich bei der gewünschten Sequenz um NXT/S. Zum Beispiel wäre durch einen Ersatz eines Glutamins (Q) in der ursprünglichen Sequenz mit Asparagen (N) eine bewahrende Substitution anzunehmen. Auf diese Weise können verschiedene CH1- und CK-Domänenmutationen zur Erzeugung von erfinderischen Glykosylierungsstellen aufgebaut werden.
Nur freigelegte Stellen haben die Möglichkeit, glykosyliert zu werden. Deshalb wurde Computermodellieren zur Unterstützung der Lokalisierung von zusätzlichen an möglicherweise vorteilhaften Positionen vorliegenden Stellen eingesetzt. Es wurde vorhergesagt, dass die Glykosylierungsstelle HCN5 weiter weg von dem ABS und an der Oberflächenposition liegt; die HCN5-Stelle ist an der zwischen den E- und F-Strängen gebildeten unteren Schleife lokalisiert. Andere Stellen, die entlang der CK- und CH1-Domänensequenzen „gleichmäßig" verteilt sind, wurden statistisch selektiert. In allen Fällen wurden mögliche Störungen der endgültigen tertiären Struktur durch umsichtiges Auswählen von Sequenzen minimiert, die nur eine einzelne Aminosäuresubstitution erfordern, um zu einer möglichen Glykosylierungsstelle zu werden. Insgesamt 5 CH₁-, (HCN1–5) und vier C_k-, (KCN1–4)-anhängige Stellen wurden an die CH₁- bzw. C_k-Domänen eingebracht. Keine dieser Stellen schien, wie durch Computermodellanalysen bestimmt, „verdeckt" zu sein oder an der Grenzfläche zwischen zwei nebeneinander gestellten Domänen vorzuliegen.
Die N-Glykosylierung wurde nur als Beispiel beschrieben. Die beteiligten Prinzipien sind gleichermaßen auf O-Glykosylierung anwendbar. Der Fachmann versteht leicht die Anwendung des Modellierens, den Aufbau von Glykosylierungsstellen und die Abwandlung von konstanten K-, CH-, und VK-Regionen zur Gewährung von O-Glykosylierung. Es ist bekannt, dass die O-Glykosylierung entweder an Threonin oder an Serin stattfindet. Die Akzeptorsequenz für eine O-gebundene Glykosylierung ist relativ schlecht definiert (Wilson et al., Biochem. J. 275: 526 (1991). Dies könnte eine Vorliebe für einen höheren Gehalt von Prolin, Serin und Threonin in diesen Regionen darstellen, jedoch bestimmt eine Zugänglichkeit eher als die genaue Primärsequenz, ob ein bestimmter Threonin- oder Serinrest O-glykosyliert wird. Nichtsdestotrotz können mögliche O-Glykosylierungssequenzen wie diejenigen, die in anderen Antikörpern identifiziert sind, von welchen bekannt ist, dass die O-Glykosylierung aufweisen (Chandrashekarkan et al., J. Biol. Chem. 259: 1549 (1981); Smyth und Utsumi, Nature 216: 322 (1967); Kim et al., J. Biol. Chem. 269: 12345 (1994)), als die Standardsequenzen zum Pfropfen in verschiedene Positionen in den Antikörpern von Interesse verwendet werden. Diejenigen, von welchen festgestellt wurde, dass sie extensive O-Glykosylierung enthalten, können dann als Konjugationsstelle getestet werden.
Ein anderer wichtiger Aspekt der Erfindung ist es, dass nach Identifikation einer Glykosylierungsstelle eine weitere Identifikation von anderen möglichen Glykosylierungsstellen erleichtert wird. Dies erfolgt auf Grund von zwei Phänomenen. Erstens bestätigt und unterstützt eine erfolgreiche Glykosylierung weiter das Verfeinern des Modellierens der relevanten Regionen. Zweitens ist es klar, dass die konstanten K- und CH1-Regionen eine deutliche Symmetrie aufweisen. Deshalb führt eine Identifikation einer Stelle, an welcher eine Glykosylierung an dem CH1 stattfindet, zu der Erwartung, dass die äquivalente CK-Position eine gute Glykosylierungsstelle wäre.
Leichtkettige Mutationen
Potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen wurden in den Kappa-konstanten Regionen von Kaninchen-Antikörpern an der aa-Position 161–163 und 174–176 identifziert. Ähnliche Stellen können in die CK-Domäne von hLL2 eingebracht werden. Siehe z.B. 12.
Schwerkettige Mutationen
In CH1 wurde eine Kohlenhydrat-Additionssequenz, Asn-Asn-Ser, an den a.a.-Positionen 161–163 (Kabat-Numerierung; Kabat et al., 1991) in einigen der menschlichen IgM-CH1-Domänen identifiziert. Gleichermaßen war die Sequenz Asn-Val-Thr in a.a.-Positionen 168–170 in der CH1-Domäne von menschlichem IgA positioniert. Beispiele für Sequenzen, die zum Erzeugen von abgewandelten Glykosylierungsstellen modifiziert werden können, sind: Mutieren der menschlichen IgG1-Sequenz Asn-Ser-Gly an Asn-Ser-Val an Positionen 162–164, Ala-Leu-Thr an Asn-Leu-Thr an den a.a.-Positionen 165–167 bzw. Leu-Thr-Ser an Asn-Thr-Ser an den a.a.-Positionen 166–168. Diese 3 möglichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen sind zu denjenigen von IgM und IgA analog und können mit Ausnahme einer minimalen Störung der erhaltenen Struktur in die CH1-Domäne von menschlichem IgG1 eingebracht werden. Solche Glykosylierungsstellen können folglich in einer „natürlichen" Position verbleiben. Der Aufbau von ähnlichen Mutationen ist dem Fachmann auf der Basis der Lehren in der Beschreibung bekannt.
Stellengerichtete Mutagenese
Detaillierte Protokolle für Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese und verwandte Techniken zur Mutagenese von geklonter DNA sind bekannt. Siehe z.B. Sambrook et al., vorstehend, und Ausubel et al., vorstehend.
Asn-gebundene Glykosylierungsstellen können unter Verwendung von herkömmlichen stellengerichteten Oligonukleotid-Mutagenese-Reaktionen in Antikörper eingebracht werden. Zum Beispiel kann man zum Einbringen eines Asn in Position 18 eines Kappa-Proteins Kodon 18 von AGG zu AAC abwandeln. Zum Erzielen dessen wird ein die leichtkettige Antikörpersequenz enthaltendes Einzelstrang-DNA-Templat von einem geeigneten Stamm von E. coli (z.B. dut^– ung^–) hergestellt, um ein DNA-Molekül zu erhalten, das eine geringe Anzahl an Uracilen anstelle von Thymidin enthält. Ein solches DNA-Templat kann durch M13-Klonen oder durch eine Transkription in vitro unter Verwendung eines SP6-Promoters erhalten werden. Siehe z.B. Ausubel et al., Hg., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1987. Ein Oligonukleotid, das zu der Einzelstrang-DNA komplementär ist und die mutierte Sequenz umfasst, wird herkömmlich synthetisiert, zu dem Einzelstrangtemplat annealed und das Produkt mit T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase behandelt, um ein Doppelstrang-DNA-Molekül herzustellen. Eine Transformation von E. coli vom Wildtyp (dut⁺ ung⁺)-Zellen mit Doppelstrang-DNA gewährt die Gewinnung von mutierter DNA.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Asn-gebundene Glykosylierungsstelle in eine leichte Antikörperkette unter Verwendung eines die gewünschte Mutation enthaltenden Oligonukleotids, beliebiges Amplifizieren des Oligonukleotids durch PCR und dessen Klonen in variable Regionen für die VL-Kette oder unter Verwendung von RNA von den Antikörper von Interesse als Templat erzeugenden Zellen eingebracht werden. Siehe auch, Huse, in ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, Boenebaeck, Hg., W. H. Freeman & Co., S. 103–120, 1992. Eine stellengerichtete Mutagenese kann z.B. unter Verwendung des TRANSFORMER^TM-Bausatzes (Clontech, Palo Alto, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform kann eine Glykosylierungsstelle durch Synthetisieren einer Antikörperkette mit mutmaßlich primierenden Oligonukleotiden, wobei ein solcher die gewünschte Mutation enthält, eingebracht werden. Siehe z.B. Uhlmann, Gene 71: 29 (1988); Wosnick et al., Gene 60: 115 (1988); Ausubel et al., vorstehend, hier unter Bezugnahme eingebracht.
Obwohl die vorstehende Beschreibung sich auf die Einbringung einer Asn-Glykosylierungsstelle in Position 18 der leichten Kette eines Antikörpers bezog, ist es dem Fachmann klar, dass es möglich ist, Asn-gebundene Glykosylierungsstellen überall in den leichtkettigen oder in den schwerkettigen variablen Regionen oder in den konstanten Regionen einzubringen.
Die Gegenwart einer Glykosylierungsstelle oder die Abwesenheit einer solchen Stelle in einem humanisierten Ab, in welchem die Stelle im Mäuse-Gegenstück glykosyliert wurde, kann die Bindungsaffinität oder Spezifität des Antikörpers beeinflussen oder nicht. Glykosylierungsstellen können deshalb durch die vorstehend beschriebenen Verfahren eingebracht oder entfernt werden, jedoch muss ihr Einfluss auf die Aktivität bestimmt werden. Aus den vorstehend erörterten Gründen wird ein Umbau von Glykosylierungsstellen in den CH1- oder CK-Regionen bevorzugt.
Allgemeine Techniken zur RNA-Isolierug, cDNA-Synthese und Amplifikation
Die RNA-Isolation, cDNA-Synthese und Amplifikation können wie folgt durchgeführt werden. Gesamt-Zellen-RNA kann aus einer LL2-Hybridom-Zellreihe unter Verwendung von insgesamt 10⁷ Zellen gemäß Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Press, 1989), hier unter Bezugnahme eingebracht, hergestellt werden. Einzelstrang-cDNA kann aus Gesamt-RNA in herkömmlicher Weise, wie unter Verwendung des SuperScript-Präamplifikationssystems (Gibco/BRL., Gaithersburg, MD), umkehrtranskribiert werden. Kurz gesagt, können in einem Reaktionsvolumen von 20 μl 50 ng statistische Primer auf 5 μg RNA in Gegenwart von 2 μl 10X Synthesepuffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA], 1 μl 10 mM- dNTP-Gemisch, 2 μl 0,1 M-DTT, und 200 Einheiten SuperScript-Umkehrtranskriptase annealed werden. Man lässt den Erweiterungsschritt anfänglich bei Raumtemperatur für eine Dauer von 10 Minuten verlaufen, gefolgt von Inkubation bei 42°C für eine Dauer von 50 Minuten. Die Reaktion kann durch Erwärmen des Reaktionsgemischs bei 90°C für eine Dauer von 5 Minuten beendet werden.
Konstruktion von Antikörpern mit umgebauten Glykosylierungsstellen in den VL- und VH-Regionen
cDNAs, die die VL- und VH-Regionen des mLL2-mAb kodieren, wurden isoliert und rekombinant in Säugerexpressionsvektoren, enthaltend die Kappa- bzw. IgG₁-konstante Regionen kodierenden Gene von menschlichen Körpern, subgeklont. Eine gemeinsame Transfektion von Säugerzellen mit diesen zwei rekombinanten DNAs exprimierten ein cLL2-mAb, das wie das parentale mLL2-mAb schnell daran gebunden und schnell von B-Lymphomzellen verinnerlicht wurde.
Die CDRs der VK- und VH-DNAs wurden gleichermaßen an die Gerüst-(FR)-Sequenzen der menschlichen VK- bzw. VH-Regionen rekombinant gebunden, die anschließend jeweils an die menschlichen Kappa- und IgG₁-konstanten Regionen gebunden wurden und hLL2 in Säugerzellen exprimierten.
Nach dem Aufbau der Sequenzen für die hLL2-VK- und VH-Domänen kann ein CDR-Propfen durch Gensynthese unter Verwendung von langen synthetischen DNA-Oligonukleotiden als Template und Amplifizieren der langen Oligonukleotide durch PCR unter Verwendung von kurzen Oligonukleotiden als Primer erzielt werden. In den meisten Fällen ist die die VK- oder VH-Domänen kodierende DNA etwa 350 Basenpaare (bp) lang. Durch Vorteilnahme der Kodon-Degeneration kann leicht eine einzelne Restriktionsstelle ohne Veränderung der kodierten Aminosäuren an Regionen nahe der Mitte der V-Gen-DNA-Sequenz eingebracht werden. Zum Beispiel kann an den DNA-Nukleotid-Positionen 157– 162 (Aminosäurepositionen 53 und 54) für die hLL2-VH-Domäne eine einzelne AvrII-Stelle eingebracht werden, während die ursprünglich aufgebaute Aminosäuresequenz (4B) beibehalten werden kann. Zwei lange, nicht überlappende Einzelstrang-DNA-Oligonukleotide (~ 150 bp) stromaufwärts und stromabwärts der AvrII-Stelle (siehe z.B. Oligo A und Oligo B in nachstehendem Beispiel 3) können durch eine automatische DNA-Oligonukleotid-Syntheseapparatur (Cyclone Plus DNA Synthesizer, Milligen-Biosearch) gebildet werden. Es ist zu erwarten, dass die Ausbeuten von DNA-Nukleotiden mit voller Länge wie Oligos A und Oligos B gering sind. Jedoch können sie durch zwei Paare von eingrenzenden Oligonukleotiden in einer PCR-Reaktion amplifiziert werden. Die Primer können mit den nötigen Restriktionsstellen zum Erleichtern von anschließendem Subklonen aufgebaut werden. Primer für Oligo A und Oligo B sollten überlappende Sequenzen an der AvrII-Stelle enthalten, so dass das erhaltene PCR-Produkt für Oligo A bzw. Oligo B innerhalb des Gerüsts an der AvrII-Stelle gebunden werden kann, um eine die hLL2-VH-Domäne kodierende DNA-Sequenz mit voller Länge (ca. 350 bp) zu bilden. Die Bindung der PCR-Produkte für Oligo A (restriktionsaufgeschlossen mit PstI und AvrII) und B (restriktionsaufgeschlossen mit AvrII und BstEII) an der AvrII-Stelle und ihr Subklonen in die PstII/BstEII-Stellen des Stützvektors VHpBS kann in einem einzelnen Dreifragment-Bindungsschritt vollendet werden. Siehe Beispiel 3. Das Subklonen der korrekten Sequenz in VHpBS kann zuerst durch Restriktionsaufschlussanalyse erfolgen und dann durch Sequenzreaktion gemäß Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977) bestätigt werden.
Das HindIII/BamHI-Fragment, das den Ig-Promoter, die Leadersequenz und die hLL2-VH-Sequenz enthält, kann aus dem Stützvektor exzidiert und in die entsprechenden Stellen in einem Vektor auf pSVgpt-Basis, pG1g, der die Genomsequenz der menschlichen IgG-konstanten Region, einen Ig-Verstärker und eine gpt-Selektionsmarkierung enthält, unter Bilden des endgültigen Expressionsvektors hLL2pG1g subgeklont werden. Ähnliche Strategien können für die Konstruktion der hLL2-VK-Sequenz eingesetzt werden. Bei der für die Bindung der PCR-Produkte für die langen Oligonukleotide (Oligos C und D, siehe nachstehende Beispiele) ausgewählte Restriktionsstelle kann es sich in diesem Falle um NruI handeln.
Die DNA-Sequenz, die den Ig-Promoter, die Leadersequenz und die hLL2-VK-Sequenz enthält, kann durch Behandlung mit BamH1/HindIII aus dem Stützvektor VKpBR exzidiert und in die entsprechenden Stellen eines Vektors auf pSVhyg-Basis pKh der die genomische Sequenz von menschlichen Kappa-Ketten-konstanten Regionen, eine Hygromycin-Selektierungsmarkierung, einen Ig- und einen Kappa-Verstärker enthält, unter Bildung des endgültigen Expressionsvektors hLL2pKh subgeklont werden.
Eine Humanisierung führt manchmal zu einer Reduktion oder sogar einem Verlust der Antikörperaffinität. Deshalb kann eine zusätzliche Modifikation erforderlich sein, um die ursprüngliche Affinität zu bewahren. Siehe z.B., Tempest et al., Bio/Technology 9: 266 (1991); Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), hier unter Bezugnahme eingebracht. Unter der Kenntnis, dass cLL2 eine Bindungsaffinität zeigt, die mit derjenigen seines Mäuse-Gegenstücks vergleichbar ist (siehe nachstehendes Beispiel 5), können fehlerhafte Aufbauten, wenn überhaupt, in der ursprünglichen Version von hLL2 durch Mischen und Abgleichen der leichten und schweren Ketten von cLL2 mit denjenigen der humanisierten Version identifiziert werden. Eine SDS-PAGE-Analyse der verschiedenen humanisierten chimären Misch-und-Abgleich-LL2 unter nicht-reduzierenden (die Disulfid-L-H-Kettenverbindungen bleiben intakt) und reduzierenden Bedingungen (die Ketten trennen sich) gewährt die Analyse der Beziehungen der verschiedenen Typen von leichten und schweren Ketten auf die Eigenschaften des Moleküls. Zum Beispiel kann eine Migration wie multiple Banden oder wie eine höhere sichtbare Molekülgröße aufgrund einer Glycan-Gruppe an der N-gebundenen Glykosylierungsstelle vorliegen, die in den FR1-Region der Mäuse-VK-Domäne von LL2 zu finden ist. Eine einzelne Bande, die bei etwa 25 kDa migriert, ist die erwartete Molekulargröße für eine nicht-glykosylierte leichte Kette.
Im Allgemeinen können zur Herstellung von cLL2-mAb-VH- und -VK-Ketten von mLL2 durch PCR-Klonen unter Verwendung von DNA-Produkten und Primern erhalten werden. Orlandi et al., vorstehend, und Leung et al., vorstehend. Die VK-PCR-Primer können in einen wie vorstehend beschriebenen Stützvektor auf pBR327-Basis (VKpBR) subgeklont werden. Die VH-PCR-Produkte können in einen ähnlichen wie vorstehend beschriebenen Stützvektor auf pBluescript-Basis (VHpBS) subgeklont werden. Die Fragmente, die die VK- und VH-Sequenzen zusammen mit den Promoter- und Signalpeptidsequenzen enthalten können unter Verwendung von HindIII- und BamHI-Restriktionsendonukleasen aus den Stützvektoren exzidiert werden. Die etwa 600 bp langen VK-Fragmente können in einen Säugerexpressionsvektor, z.B. pKh durch herkömmliche Verfahren subgeklont werden. Bei pKh handelt es sich um einen Expressionsvektor auf pSVhyg-Basis, der die Genomsequenz der humanen Kappa-konstanten Region, einen Ig-Verstärker, einen Kappa-Verstärker und das Hygromycin-Resistenzgen enthält. Gleichermaßen können die VH-Fragmente mit etwa 800 bp in pG1g, einen Expressionsvektor auf pSVgpt-Basis, der die Genomsequenz der humanen IgG1-konstanten Region, einen Ig-Verstärker und das Xanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase-(gpt)-Gen enthält, subgeklont werden. Die zwei Plasmide können in Säugerexpressionszellen wie Sp2/0-Ag14-Zellen durch Elektroporation transfektiert und auf Hygromycin-Resistenz selektiert werden. Man lässt die Selektion überlebende Kolonien anwachsen, und überstehende Fluids zur Herstellung von cLL2-mAb durch ein ELISA-Verfahren werden überwacht. Eine Transfektionseffizienz von 1–10 × 10⁶ Zellen ist erwünscht. Ein Antikörperexpressionsgehalt zwischen 0,10 und 2,5 μg/ml ist mit diesem System zu erwarten.
Allgemeine Techniken zur RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und Amplifikation
Die RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und Amplifikation können wie folgt durchgeführt werden. Gesamt-Zellen-RNA kann aus einer LL2-Hybridom-Zellreihe unter Verwendung von insgesamt etwa 10⁷ Zellen gemäß Sambrook et al., (Mole cular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Press, 1989, hier unter Bezugnahme eingebracht), hergestellt werden. Einzelstrang-cDNA kann herkömmlich aus Gesamt-RNA, wie unter Verwendung des SuperScript-Präamplifikationssystems (Gibco/BRL., Gaithersburg, MD), umkehrtranskribiert werden. Kurz gesagt, können in einem Reaktionsvolumen von 20 μl 50 ng statistische Primer auf 5 μg RNAs in Gegenwart von 2 μl 10 × Synthesepuffer [200 mM Tris-HCl (pH 8,4), 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 1 mg/ml BSA], 1 μl 10 mM dNTP-Gemisch, 2 μl 0,1 M-DTT, und 200 Einheiten SuperScript-Umkehrtranskriptase annealed werden. Man lässt den Erweiterungsschritt anfänglich bei einer Raumtemperatur von 10 Minuten verlaufen, gefolgt von Inkubation bei 42°C für eine Dauer von 50 Minuten. Die Reaktion kann durch Erwärmen des Reaktionsgemischs bei 90°C für eine Dauer von 5 Minuten beendet werden.
Amplifikation von VH- und VK-Sequenzen
Die VK- und VH-Sequenzen für cLL2 oder hLL2 können durch PCR wie von Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989), hier unter Bezugnahme eingebracht, beschrieben, amplifiziert werden. VK-Sequenzen können unter Verwendung der Primer CK3BH und VK5-3 (Leung et al., BioTechniques, 15: 286 (1993), hier unter Bezugnahme eingebracht, amplifiziert werden, während VH-Sequenzen unter Verwendung des Primers CH1B amplifiziert werden können, der die CH1-Region von Mäuse-IgG und VHIBACK annealed (Orlandi et al., 1989, vorstehend). Die PCR-Reaktionsgemische, enthaltend 10 μl des Einzelstrang-cDNA-Produkts, 9 μl 10 × PCR-Puffer [500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 15 mM MgCl2, und 0,01% (G/V) Gelatine] (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), können 30 PCR-Zyklen unterzogen werden. Jeder PCR-Zyklus besteht vorzugsweise aus der Denaturierung bei 94°C für eine Dauer von 1 Minute, Annealen bei 50°C für eine Dauer von 1,5 Minuten und Polymerisation bei 72°C für eine Dauer von 1,5 Minuten. Amplifizierte VK- und VH-Fragmente können auf 2%iger Agarose (BioRad, Richmond, CA) gereinigt werden. Siehe Beispiel 3 für ein Verfahren zur Synthese eines Oligos A (149-mers) und eines Oligos B (140- mers) auf einer automatischen DNA-Syntheseapparatur des Typs Cyclone Plus (Milligan-Biosearch).
Die PCR-Produkte für VK können in einen Stützvektor wie einen Stützvektor auf pBR327-Basis VKpBR, der einen Ig-Promoter, eine Signalpeptidsequenz und eine günstige Restriktionsstelle zum Erleichtern einer Bindung innerhalb des Gerüstes VK-PCR-Produkts enthält, subgeklont werden. PCR-Produkte für VH können in einen ähnlichen Stützvektor, wie dem VHpBS auf pBluescript-Basis subgeklont werden. Einzelne die jeweiligen PCR-Produkte enthaltende Kolonien können z.B. durch das Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463 (1977), hier unter Bezugnahme eingebracht, sequenziert werden.
Weiterhin wurde gefunden, dass die Gegenwart von Glykosylierungsstellen und deshalb von angehängten Kohlenhydrateinheiten (CHO) eine wirksame und herausragende Konjugation von Arzneimitteln und Chelaten bewirkt. Dies gilt insbesondere bei Verwendung von Antikörperfragmenten ohne CH2-angehängte CHOs.
Die hier beschriebenen DNA-Sequenzen schließen alle Allele, Mutanten und Varianten davon, egal ob natürlich vorkommend oder experimentell gebildet, ein.
Herstellung von Antikörpern mit mutiertem CH1- und CK-Regionen
Durch Methoden, die denjenigen für die VK- und VH-Sequenzen ähneln, können CH1- und CK-DNA-Sequenzen isoliert, die Proteinsequenz modelliert und die DNA mutiert werden. Wurde die CH1- oder CK-Nukleotidsequenz aus einem leicht- oder schwerkettigen Klon exzidiert und eine Glykosylierungsstelle über Mutagenese eingefügt, kann die mutierte CH1- oder CK-Sequenz wieder in den entsprechenden schwer- oder leichtkettigen Vektor eingefügt werden. Im Falle eines CH1-Mutanten kann er gemeinsam mit einem Kappa-Ketten-Expressionsvektor wie hLL2pKh in eine geeignete Zelle, z.B. Sp2/0-Ag14- Myelom exprimiert werden, und Kolonien können auf Hygromycin-Resistenz selektiert werden. Die überstehenden Fluids können zur Erzeugung von cLL2, hLL2 oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen, z.B. durch einen wie nachstehend beschriebenen ELISA-Test überwacht werden.
Die Transfektion und der Test für Antikörper-sekretierende Klone durch ELISA können wie folgt durchgeführt werden. Etwa 10 μg hLL2pKh (leichtkettiger Expressionsvektor) und 20 μg hLL2pG1g (schwerkettiger Expressionsvektor) können zur Transfektion von 5 × 10⁶ SP2/0-Myelomzellen durch Elektroporation (BioRad, Richmond, CA) gemäß Co et al., J. Immunol., 148: 1149 (1992), hier unter Bezugnahme eingebracht, verwendet werden. Nach der Transfektion kann man die Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Mulden in vollständigem HSFM-Medium (Gibco, Gaithersburg, MD) bei 37°C, 5% CO₂ wachsen lassen. Das Selektionsverfahren kann durch Zugabe von Hygromycin-Selektionsmedium (Calbiochem, San Diego, CA) mit einer Endkonzentration von 500 μg/ml Hygromycin nach zwei Tagen initiiert werden. Die Kolonien treten typischerweise 2 bis 3 Wochen nach der Elektroporation auf. Die Kulturen können dann zur weiteren Analyse verlängert werden.
Die Expressionsgehalte eines den Klon enthaltenden Ig-Gens könnten durch Amplifizieren der Kopiezahl vergrößert werden. Dies wird typischerweise durch Selektion einer selektierbaren Markierung durchgeführt, die an das Gen von Interesse, hier das Ig-Gen, gebunden ist. Der Fachmann ist mit der Verwendung einer solchen Selektion vertraut. Häufig ist die selektierbare Markierung das Dihydrofolat-Reduktasegen (dhfr). Typischerweise wird ein Klon, der eine amplifizierte Kopieanzahl des Gens zu enthalten scheint, durch seine Expression und Amplifikation identifiziert und durch Nukleinsäure-Hybridisierungs-Experimente bestätigt. Mehrfache Selektionstest- und Bestätigungsrunden durch Hybridisierung werden typischerweise unternommen.
Transfektom-Klone, die für die Sekretion von cLL2, hLL2, oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen, positiv sind, können durch einen ELISA-Test identifiziert werden. Kurz gesagt, werden überstehende Proben (100 μl) von den Transfektom-Kulturen in dreifacher Ausführung den ELISA-Mikrotiterplatten, beschichtet mit Ziegen-antihumanem (GAH)-IgG, F(ab')₂-fragmentspezifischen Antikörper (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), zugesetzt. Die Platten werden für eine Dauer von einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Ungebundene Proteine werden durch dreimaliges Waschen mit Waschpuffer (PBS, enthaltend 0,05% Polysorbat 20) entfernt. Mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierte GAH-IgG, Fc-fragmentspezifische Antikörper (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) werden den Mulden zugesetzt (100 μl Antikörper-Stammlösung, verdünnt ×10⁴, ergänzt mit den unkonjugierten Antikörper auf eine Endkonzentration von 1,0 μg/ml). Nach der Inkubation für eine Dauer von einer Stunde werden die Platten typischerweise drei Mal gewaschen. Eine Reaktionslösung [100 μl, enthaltend 167 μg Orthophenylen-Diamin (OPD) (Sigma, St. Louis, MO), 0,025% Wasserstoffperoxidase in PBS] wird den Mulden zugesetzt. Man lässt die Farbe im Dunklen für eine Dauer von 30 Minuten entwickeln. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 50 μl 4 N-HCl-Lösung zu jeder Mulde vor dem Messen der Absorption bei 490 nm in einem automatischen ELISA-Lesegerät (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gestoppt. Gebundene Antikörper werden dann in Bezug auf einen irrelevanten chimären Antikörperstandard (erhältlich von Scotgen, Ltd., Edinburgh, Schottland) bestimmt.
Antikörper können aus Zellkulturmedien wie folgt isoliert werden. Transfektom-Kulturen werden für serumfreies Medium angepasst. Zur Herstellung von chimären Antikörpern lässt man Zellen als Kultur mit 500 ml in Rollflaschen unter Verwendung von HSFM wachsen. Die Kulturen werden zentrifugiert und der Überstand durch eine Membran mit 0,2 Mikron filtriert. Das filtrierte Medium wird mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min durch eine Protein-A-Säule (1 × 3 cm) geleitet. Das Harz wird dann mit etwa 10 Säulenvolumen PBS gewaschen und der Protein-A-gebundene Antikörper aus der Säule mit 0,1 M Glycinpuffer (pH 3,5) enthaltend 10 mM EDTA, eluiert. Fraktionen mit 1,0 ml werden in Röhrchen, enthaltend 10 μl 3 M Tris (pH 8,6) aufgefangen und die Proteinkonzentrationen von den Absorptionen bei 280/260 nm bestimmt. Spitzenfraktionen werden gepoolt, gegen PBS dialysiert und der Antikörper z.B. mit dem Centricon 30 (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. Die Antikörperkonzentration wird wie vorstehend durch ELISA bestimmt und ihre Konzentration auf etwa 1 mg/ml unter Verwendung von PBS eingestellt. Natriumazid, 0,01% (g/v), wird günstigerweise der Probe als Konservierungsmittel zugesetzt.
Vergleichbare Bindungsaffinitäten der so isolierten Antikörper können durch einen direkten Radioimmuntest bestimmt werden. Ein cLL2, hLL2 oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen, kann verwendet werden. Antikörper können unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens mit ¹³¹I oder ¹²⁵I markiert werden (siehe z.B., Greenwood et al., Biochem. J., 89: 123 (1963), hier unter Bezugnahme eingebracht). Die spezifische Aktivität des iodierten Antikörpers wird typischerweise auf etwa 10 μCi/ μg eingestellt. Unmarkierte und markierte Antikörper werden unter Verwendung von Reaktionsmedium (HSFM, ergänzt mit 1% Pferdeserum und 100 μg/ml Gentamicin) auf die entsprechenden Konzentrationen verdünnt. Die geeigneten Konzentrationen sowohl von markierten als auch von unmarkierten Antikörpern werden zusammen den Reaktionsröhrchen mit einem Gesamtvolumen von 100 μl zugesetzt. Eine Kultur von Raji-Zellen wird als Probe verwendet und die Zellkonzentration bestimmt. Die Kultur wird zentrifugiert und die aufgefangenen Zellen ein Mal in Reaktionsmedium gewaschen, gefolgt von Resuspension in Reaktionsmedium auf eine Endkonzentration von etwa 10⁷ Zellen/ml. Alle Verfahren werden in der Kälte bei 4°C durchgeführt. Die Zellsuspension, 100 μl, wird dann den Reaktionsröhrchen zugesetzt. Die Reaktion wird bei 4°C für eine Dauer von 2 Stunden unter periodischem sanftem Schütteln der Reaktionsröhrchen zum Resuspendieren der Zellen durchgeführt. Nach der Reaktionsdauer werden jedem Röhrchen 5 ml Waschpuffer (PBS, enthaltend 1% BSA) zugesetzt. Die Suspensi on wird zentrifugiert und das Zellpellet zwei Mal mit weiteren 5 ml Waschpuffer gewaschen. Nach der Zentrifugation wird die Menge von im Zellpellet verbliebener Radioaktivität in einem Gammazähler (Minaxi, Packard Instruments, Sterling, VA) bestimmt.
Die Antigenbindungseigenschaft der Antikörper der Erfindung kann durch Konkurrenzbindung mit markiertem mLL2 für einen LL2-Anti-Iod-Typ-Antikörper (WN) bewertet werden.
Die Antigenbindungsaffinitäten der Raji-Zelloberiläche von Misch-und-Abgleich- und voll humanisierten Antikörpern kann unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen von mLL2 F(ab')₂-Fragmenten ohne den Fc-Teil als Konkurrenzpartner, wie bewertet durch Fließzytometrietest, mit derjenigen von cLL2 verglichen werden. Restliche oberflächengebundene LL2-Antikörper, die die humanen Fc-Teile (cLL2 und Misch-und-Abgleich-LL2) tragen, können durch einen FITC-markierten anti-humanen Fc-spezifischen Antikörper in einem Fließzytometrietest nachgewiesen werden. Wo Misch-und-Abgleich-LL2-Antikörper Antigenbindungsaffinitäten zeigen, die denjenigen von cLL2 ähneln, kann gefolgert werden, dass die ursprünglichen Aufbauten für die Humanisierung sowohl der leichten als auch der schweren Ketten die mLL2-Immunreaktivität beibehalten.
Die Verinnerlichung von cLL2, hLL2 oder LL2, erfindungsgemäß umgebaut mit Glykosylierungsstellen in den nicht-Fc-konstanten Regionen in Zielzellen kann durch Fluoreszenzmarkieren im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Pirker et al., J. Clin. Invest., 76: 1261 (1985), hier unter Bezugnahme eingebracht, durchgeführt werden. Gezüchtete Raji-Zellen werden zentrifugiert und die Zellen in frischem Medium auf eine Konzentration von etwa 5 × 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Jeder Mulde einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden werden 100 μl der Zellsuspension zugesetzt. Die Antikörper, 40 μg/ml, in einem Volumen von 100 μl werden dem Reaktionsmulden mit zeitlichen Intervallen so zugesetzt, dass alle Reaktionen gleichzeitig beendet sind. Die Platte wird bei 37°C in einem CO₂- Zellkulturinkubator inkubiert. Ungebundene Antikörper werden durch dreimaliges Waschen der Zellen mit kaltem 1%igem FCS/PBS am Ende der Inkubation entfernt. Die Zellen werden dann mit 1 ml Formaid-Fresh (10% Formalin-Lösung (Fisher, Fair Lawn, NJ)) für eine Dauer von 15 Minuten bei 4°C behandelt. Nach dem Waschen werden entweder auf der Zelloberfläche oder innerhalb der Zellen vorliegende Antikörper durch Behandlung mit FITC-markiertem Ziege-Anti-Mäuse-Antikörper (Tago, Burlingame, CA) oder FITC-markiertem Ziege-Antihumanem Antikörper (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), abhängig davon, ob der Antikörper auf mäuseartig, chimär beziehungsweise humanisiert getestet wird, nachgewiesen. Fluoreszenzverteilungen werden unter Verwendung eines BH-2-Fluoreszenz-Mikroskops (Olympus, Lake Success, NY) bewertet.
Die Geschwindigkeit der Antikörperverinnerlichung kann gemäß Opresko et al., (J. Biol. Chem., 262: 4116 (1987)) unter Verwendung von radioiodiertem Antikörper als Tracer bestimmt werden. Kurz gesagt, werden radiomarkierte Antikörper (1 × 10⁴ cpm) mit den Raji-Zellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) bei 4°C für eine Dauer von 2 Stunden in 0,5 ml DMEM-Medium, enthaltend 1% humanes Serum, inkubiert. Nach der Reaktionsdauer werden nicht-spezifisch gebundene Antikörper durch dreimaliges Waschen mit 0,5 ml DMEM-Medium entfernt. Jedem der Reaktionsröhrchen werden 0,5 ml DMEM-Medium zugesetzt, und die Suspension wird bei 37°C zur Bestimmung der Verinnerlichung inkubiert. Zu zeitlichen Intervallen werden dreifache Ausführungen von Zellen entfernt und unmittelbar in einem Eisbad zum Stoppen von weiterer Verinnerlichung abgekühlt. Zellen werden bei 1000 × g für eine Dauer von 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und auf Radioaktivität gezählt. Die oberflächengebundene Radioaktivität wird durch Behandlung mit 1 ml 0,1 M-Acetat/0,1 M-Glycinpuffer bei pH 3,0 für eine Dauer von 8 Minuten in der Kälte entfernt. Die Radioaktivität wird durch Säurebehandlung entfernt und diejenige, die mit den Zellen verbunden blieb, bestimmt. Das Verhältnis des CPM_{Verinnerlichung}/CPM_Oberfläche wird gegenüber der Zeit graphisch dargestellt, um die Geschwindigkeit der Verinnerlichung aus der Neigung zu bestimmen.
Die nachstehend beschriebenen repräsentativen Ausführungsformen werden einfach zur Veranschaulichung der Erfindung verwendet. Der Fachmann erkennt, dass Abweichungen von den vorliegenden Materialien in den breiten allgemeinen Umfang der beanspruchten Erfindung fallen. Die Inhalte aller hier erwähnten Literaturangaben sind hier unter Bezugnahme eingebracht.
Beispiel 1
Wahl eines menschlichen Gerüsts und Sequenzaufbau für die Humanisierung von LL2-monoklonalem Antikörper
Durch Vergleich von Mäuse-variierbaren (V) Sequenzen des Regiongerüsts (FR) von LL2 mit denjenigen von menschlichen Antikörpern in der Kabat-Datenbank (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Ausg., U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C.), hier unter Bezugnahme eingebracht, wurde gefunden, dass die menschlichen REI-Sequenzen (1A) und EU-Sequenzen (1B) mit den FRs von VK- bzw. VH-Domänen von LL2 den höchsten Grad an Sequenzhomologie zeigen. Deshalb wurden die REI- und EU-FRs als das menschliche Gerüst ausgewählt, auf welches die CDRs für LL2-VK bzw. -VH gepfropft wurden. Die FR4-Sequenz von NEWM wurde jedoch eher als diejenige von EU zum Ersetzen der EU-FR4-Sequenz für die Humanisierung von LL2-schweren Ketten verwendet. Auf der Basis der Ergebnisse von Computermodellstudien (2A und 2B) wurden Mäuse-FR-Reste mit möglichen CDR-Kontakten, die die Affinität und Spezifität des erhaltenen Antikörpers beeinflussen könnten, beim Ausbau der humansierten FR-Sequenzen (1) beibehalten.
Zwei Versionen von humanisierten schweren Ketten wurden konstruiert. In der ersten Version (hLL2-1) wurde das Glutamin (Q) an Aminosäureposition 5 (Kabat-Nummerierung) eingebracht, um zum Erleichtern ihres Klonens in den Stütz vektor (3) eine PstI-Restriktionsstelle einzuschließen. Dieser Mäuse-Rest wurde durch Oligo-gerichtete Mutagenese zu dem menschlichen EU-Rest Valin (V) in hLL2-2 umgewandelt. Es sollte angemerkt werden, dass die ursprüngliche variable Sequenz der Mäuse-Kappa-Ketten eine mögliche N-gebundene Glykosylierungsstelle an den Positionen 18–20 identifiziert und zur Kohlenhydrataddition verwendet wurde. Diese Glykosylierungsstelle war nicht in der zur Humanisierung der leichten LL2-Ketten verwendeten REI-FR-Sequenz eingeschlossen.
Beispiel 2
PCR-Klonen und Sequenzaufklärung für schwer- und leichtkettige variable LL2-Regionen
Die variablen Regionen für sowohl schwere (VH) als auch leichte (VK) Ketten von mLL2 (IgG2a) wurden durch PCR-Klonen unter Verwendung von wie im allgemeinen vorstehend und in größerem Detail in nachstehendem Beispiel 3 beschriebenen DNA-Primern erhalten. Da eine PCR für Mutationen anfällig ist, wurde die variable Regionsequenz von multiplen einzelnen Klonen entweder für die schweren oder die leichten Ketten für sechs Klone bestimmt, und es wurde bestätigt, dass sie vor der Verwendung für die Konstruktion des chimären Antikörpers identisch sind.
Die PCR-Produkte für VK wurden in einen Stützvektor auf pBR327-Basis, VKpBR, der einen Ig-Promoter, eine Signalpeptidsequenz und günstige Restriktionsstellen zum Erleichtern einer Bindung innerhalb des Gerüsts des VK-PCR-Produkte (3A) enthielt, subgeklont. Die PCR-Produkte für VH wurden in einen ähnlichen Stützvektor auf pBluescript-Basis, VHpBS, (3B) subgeklont.
Wie vorstehend angemerkt, wurden mindestens sechs einzelne die jeweiligen PCR-Produkte enthaltende Klone gemäß dem Verfahren von Sanger et al., 1977, vorstehend, sequenziert. Es zeigte sich, dass alle identische Sequenzen tragen, und ihre jeweiligen Sequenzen wurden, wie in 4A für LL2-VK und in 4B für LL2-VH dargestellt, aufgeklärt. Keine fehlerhaften Mutationen wurden in dem die VK- und VH-Regionen kodierenden Sequenzen identifiziert. Ein Vergleich der PCR-amplifizierten variablen Regionssequenzen von LL2 mit der Kabat-Datenbank (Kabat et al., vorstehend) legte nahe, dass die VK- und VH-Sequenzen von LL2 zu der Untergruppe 5 bzw. 2B gehören. Wichtige Reste wie Cys für die Intradomän-Disulfid-Bindung wurden an geeigneten Positionen zurückgehalten.
In der FR1-Gerüstregion von VK wurde eine N-gebundene Kohlenhydrat-Anlagerungsstelle, Asn-Val-Thr, an Position 18–20 (4A) identifiziert, was nahe legte, dass das VK von LL2 glykosyliert sein könnte. Wie nachstehend detailliert beschrieben, zeigte eine SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen, dass diese als N-Glykosylierungsstelle tatsächlich zur Kohlenhydrat-Addition verwendet wird. Die Gegenwart der Glykosylierungsstelle in der variablen Region scheint jedoch die Immunreaktivität des Antikörpers nicht zu beeinflussen. Ein Vergleich der Immunreaktivität von mLL2 mit derjenigen von cLL2 in einer Konkurrenz-RIA zeigte, dass die beiden Antikörper nahezu identische Aktivitäten aufweisen.
Beispiel 3
PCR/Gen-Synthese der humanisierten V-Gene
Die aufgebaute Sequenz für die hLL2-VH-Domäne, die Konstruktion der hLL2-VH-Domäne durch lange Oligonukleotide und PCR und der Stützvektor VHpBS, enthaltend die hLL2-VH-Domäne, sind in der in 6 dargestellten Umrisszeichnung zusammengefasst.
Für die Konstruktion der hLL2-VH-Domäne wurden Oligo A (149-mer) und Oligo B (140-mer) auf einer automatischen DNA-Syntheseapparatur des Typs CYCLONE PLUS (Milligen Bioresearch) synthetisiert.
Oligo A stellt den Minusstrang der hLL2-VH-Domäne komplementär zu den Nukleotiden 24 bis 172 dar: 5'-TAT AAT CAT TCC TAG GAT TAA TGT ATC CAA TCC ATT CCA GAC CCT GTC CAG GTG CCT GCC TGA CCC AGT GCA GCC AGT AGC TAG TAA AGG TGT AGC CAG AAG CCT TGC AGG AGA CCT TCA CTG ATG ACC CAG GTT TCT TGA CTT CAG CC-3' dar.
Oligo B stellt den Minusstrang der hLL2-VH-Domäne komplementär zu nt 180 bis 320 dar:
5'-CCC CAG TAG AAC GTA GTA ATA TCC GCA CAA AAA TAA AAT GCC GTG TCC TCA GAC CTC AGG CTG CTC AGC TCC ATG TAG GCT GTA TTG GTG GAT TCG TCT GCA GTT ATT GTG GCC TTG TCC TTG AAG TTC TGA TT-3' dar.
Die Oligos A und B wurden von dem Träger abgespalten und durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid entschützt. Nach Vakuumtrocknen (SpeedVac, Savant, Farmingdale, NY) der Proben und Resuspendieren in 100 μl Wasser wurden durch Zentrifugation durch eine CHROMOSPIN-100^TM-Säule (Clontech, Palo Alto, CA) vor dem Amplifizieren durch PCR der DNA-Oligomere unvollständige Oligomere (weniger als 100-mer) entfernt. Alle eingrenzenden Primer für die getrennten Amplifikationen und das PCR-Klonen von Oligos A und B wurden durch SDS-PAGE im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Sambrook et al., 1988, vorstehend, gereinigt. Von den mit CHROMASPIN gereinigten Oligo A wurde 1 μl Probestammlösung in einem Reaktionsvolumen von 100 μl durch Zugabe von 5 μl 5 μM Oligo: 5'-CCA GCT GCA GCA ATC AGG GGC TGA AGT CAA GAA ACC TG-3' und von Oligo: 5'-AAG TGG ATC CTA TAA TCA TTC CTA GGA TTA ATG-3' in Gegenwart von 10 μl 10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, 15 mM MgCl₂) und 5 Einheiten AMPLITAQ^TM-DNA-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Ct.) PCR-amplifiziert. Dieses Reaktionsgemisch wurde 30 Zyklen PCR-Reaktion, bestehend aus der Denaturierung bei 94°C für eine Dauer von 1 Minute, Annealen bei 50°C für eine Dauer von 1,5 Minuten und Polymerisation bei 72°C für eine Dauer von 1,5 Minuten, unterzogen.
Oligo B wurde durch die Primerpaare: 5'-TAA TCC TAG GAA TGA TTA TAC TGA GTA CAA TCA GAA CTT CAA CGA CCA G-3' und: 5'-GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GAA CGT AGT AA-3' unter ähnlichen Bedingungen PCR-amplifiziert.
Doppelstrang-PCR-amplifizierte Produkte für Oligos A und B wurden gelgereinigt, mit PstI/AvrII (PCR-Produkt von Oligo A) und BstEII/AvrII (PCR-Produkt von Oligo B) restriktionsaufgeschlossen, und in die komplementären PstI/BstEII-Stellen des schwerkettigen Stützvektors VHpBS geklont. Die humanisierte VH-Sequenz wurde in den pG1g-Vektor subgeklont, was zu dem endgültigen humanen IgG1 schwerkettigen Expressionsvektor hLL2pG1g führte.
Zur Konstruktion der DNA mit voller Länge der humanisierten VK-Sequenz wurden Oligo E (150-mer) und Oligo F (121-mer), wie vorstehend beschrieben, synthetisiert. Oligo E umfasst:
5'-CCT AGT GGA TGC CCA GTA GAT CAG CAG TTT AGG TGC TTT CCC TGG TTT CTG GTG GTA CCA GGC CAA GTA GTT CTT GTG ATT TGC ACT GTA TAA AAC ACT TTG ACT GGA CTT ACA GCT CAT AGT GAC CCT ATC TCC AAC AGA TGC GCT CAG-3'. Er stellt den Minusstrang der humanisierten VK-Domäne komplementär zu nt 31 bis 180 dar und diese Sequenz wurde durch Oligo: 5'-GAC AAG CTT CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCA TCT CTG AGC GCA TCT GTT GGA G-3' und Oligo: 5'-AGA GAA TCG CGA AGG GAC ACC AGA TTC CCT AGT GGA TGC CCA GTA-3' PCR-amplifiziert.
Die Oligo-F-Sequenz lautet 5' CCA GCT TGG TCC CTC CAC CGA ACG TCC ACG AGG AGA GGT ATT GGT GAC AAT AAT ATG TTG CAA TGT CTT CTG GTT GAA GAG AGC TGA TGG TGA AAG TAA AAT CTG TCC CAG ATC CGC TGC C-3'. Sie stellt den Minusstrang der humanisierten LL2-VK-Domäne komplementär zu nt 208 bis 328 dar. Sie wurde durch Oligo: 5'-GAC AAG CTT TCG CGA TTC TCT GGC AGC CGA TCT GGG ACA G-3' und Oligo: 5'-GAC CGG CAG ATC TGC ACC TTG GTC CCT CCA CCG-3' PCR-amplifiziert.
Gelgereinigte PCR-Produkte für Oligos E und F wurden mit PvuII/NruI bzw. NruI/BglIII restriktionsaufgeschlossen. Die zwei PCR-Fragmente E und F wurden dann an die NruI-Stelle gebunden und an die komplementären PvuI/BcII-Stellen des leichtkettigen Stützvektors VKpBR gebunden. Die humanisierte VK-Sequenz wurde in Vektor pKh subgeklont, um den endgültigen humanen Kappa-Ketten-Expressionsvektor hLL2pKh zu bilden.
Zum Exprimieren der humanisierten Antikörper wurden etwa 10 μg linearisiertes hLL2pKh und 20 μg linearisiertes hLL2pG1g zum Transfektieren von 5 × 10⁶ SP2/0-Zellen durch Elekroporation verwendet. Die Transfektome wurden mit Hygromycin mit 500 μg/ml selektiert und der sekretierte Antikörper auf einer Säule mit 1 × 3 cm von Protein A gereinigt. Nach Konzentrieren des gereinigten Antikörpers durch Zentrifugation mit Centricon 30 wurde die Antikörperkonzentration durch ELISA bestimmt. Die Endkonzentration des Antikörpers wurde in PBS-Puffer, enthaltend 0,01% (G/V) Natriumazid als Konservierungsmittel, auf 1 mg/ml eingestellt.
1 vergleicht die Aminosäuresequenz zwischen Mäuse- und humanisierten LL2-VK-Domänen (1A) und zwischen Mäuse- und humanisierten LL2-VH-Domänen (1B). In der VK-Kette wurden REI-Gerüstsequenzen für alle FRs verwendet. In der VH-Kette wurden humane EU-Gerüstsequenzen für FR 1–3 verwendet, und NEWM-Sequenzen wurden für FR-4 verwendet. Nur humane FR-Sequenzen, die von denjenigen der Maus verschieden waren, sind dargestellt. Die Sternchen zeigen Mäuse-FR-Sequenzen an, die sich von derjenigen der humanen FR an den entsprechenden Positionen unterscheiden. Mäuse-Reste an diesen Positionen wurden in der humanisierten Struktur beibehalten. CDRs sind in Kästchen dargestellt.
In 4A sind die Doppelstrang-DNA und entsprechenden Aminosäuresequenzen (dargestellt durch einzelne Buchstabencodes) der Mäuse-LL2-VK-Domäne dargestellt. Aminosäuresequenzen der CDR 1–3 sind in Kästchen dargestellt. Die entsprechende Anzeige für VH ist in 4B dargestellt.
In 5A und 5B sind Doppelstrang-DNA-Sequenzen und Aminsäuresequenzen von humanisiertem LL2-VK bzw. LL2-VH dargestellt. Aminosäuresequenzen sind durch einzelne Buchstabencodes und CDR-Aminosäuresequenzen in Kästchen dargestellt.
Beispiel 4
Konstruktion, Expression und Reinigung von chimären LL2-Antikörpern
Die die VK- und VH-Sequenzen von LL2 zusammen mit den Promoter- und Signalpeptidsequenzen enthaltenden Fragmente wurden von LL2VKpBR bzw. LL2VHpBS durch Doppelrestriktionsaufschluss mit HindIII und BamHI exzidiert. Die VK-Fragmente mit etwa 600 bp wurden dann in die HindIII/BamHI-Stelle eines Säugerexpressionsvektors, pKh, (3A) subgeklont. pKh ist ein Expressionsvektor auf pSVhyg-Basis, enthaltend die Genomsequenz der humanen Kappa-konstanten Region, einen Ig-Verstärker, einen Kappa-Verstärker und das Hygromycin-Resistenzgen. Gleichermaßen wurden die VH-Fragemente mit ca. 800 bp in die entsprechende HindIII/BamHI-Stelle von pG1g (3B), einem Expressionsvektor auf pSVgpt-Basis, der die Genomsequenz der humanen IgG1-konstanten Region, einen Ig-Verstärker und das Xanthin-Guanin- Phosphoribosyltransferase-(gpt)-Gen trägt, subgeklont. Die endgültigen Expressionsvektoren werden als LL2pKh bzw. LL2pG1g bezeichnet.
Die zwei Plasmide wurden gemeinsam durch Elektorporation in Sp2/0-Ag14-Zellen transfektiert und auf Hygromycin-Resistenz selektiert. Der Überstand von die Selektion überlebenden Kolonien wurde zur chimären Antikörpersekretion durch einen ELISA-Test (siehe vorstehend) überwacht. Die Transfektionseffizienz betrug etwa 1–10 × 10⁶ Zellen. Es wurde gefunden, dass der Antikörperexpressionsgrad in einer endgültigen Kultur als im Bereich zwischen < 0,10 und 2,5/μg/ml variierte.
Durch Protein A gereinigtes mLL2 und cLL2 wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Die leichten Ketten sowohl von mLL2 als auch von cLL2 zeigten ein höheres als zu erwartendes scheinbares Molekulargewicht. Da es bekannt ist, dass die humane Kappa-konstante Region von cLL2 keine mögliche Glykosylierungsstelle enthält, kann gefolgert werden, dass die mögliche in der FR1-Region von LL2-VK-Domäne identifizierte Glykosylierungsstelle verwendet wurde. Verschiedene Versionen von hLL2- und cLL2-Antikörpern wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Bei einer hLL2-Version handelte es sich um hLL2-1 (mit sieben Mäuse-FR-Resten in der VH-Domäne). Bei einer anderen hLL2-Version handelte es sich um hLL2-2 mit sechs Mäuse-FR-Resten in der VH-Domäne. Die humanisierten leichten Ketten migrierten schneller, und die Banden waren verglichen mit den chimären leichten Ketten stärker getrennte Banden.
Misch-und-Abgleich-cLL2- und -hLL2-Antikörper wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. Bei den analysierten Misch-und-Abgleich-Versionen handelte es sich um das (hL/cH)LL2, das (cL/hH)LL2-1, und das (cL/hH)LL-2. (cL/hH)LL2-1 und (cL/hH)LL-2 enthalten 7 bzw. 6 Mäuse-Reste in den FR-Regionen der schweren Kette. Die für das (hL/cH)LL2 beobachtete Migation legte nahe, dass sich die humanisierte leichte LL2-Kette keiner Glykosylierung unterzog.
Beispiel 5
Bindung von cLL2-Antikörper an Raji-Zelloberflächen-Antigene
Ein Konkurrenz-Zellbindungstest wurde zum Testen der Immunreaktivität von cLL2 in Bezug auf das parentale mLL2 durchgeführt. Unter Verwendung von ¹³¹I-markiertem mLL2 (0,025 μg/ml) als Sonde, wurden Raji-Zellen mit den Antikörpern inkubiert und die relative Bindung an die Zellen aus der Menge an zellgebundenem markiertem mLL2 bestimmt (siehe vorstehend). Wie durch die in 7 beschriebenen Konkurrenz-Tests dargestellt, zeigten sowohl mLL2- als auch cLL2-Antikörper ähnliche Bindungsaktivitäten.
Die Ergebnisse wurden durch einen zweiten Konkurrenz-Test auf der Basis von Fließzytometrie bestätigt. Kurz gesagt, wurde unter Verwendung von Raji-Zellen wie vorstehend und unter Variieren der Konzentration eines Antikörpers in Bezug auf einen anderen, wie vorstehend, die Menge an gebundenem mLL2 oder cLL2 mit FITC-markiertem Anti-Mäuse-Fc oder Anti-Human-Fc-Antikörpern, gefolgt von Analyse unter Verwendung von Fließzytometrie bestimmt.
Beispiel 6
Bindung von hLL2-Antikörpern an Raji-Zellen
In Experimenten, die denjenigen von Beispiel 5 ähnelten, wurden die Antigenbindungsaffinitäten der drei verschiedenen Kombinationen von Misch-und-Abgleichoder humanisiertem LL2 mit denjenigen von cLL2 im Fließzytometrietest verglichen.
Kurz gesagt, wurde 1 μg cLL2-, Misch-und-Abgleich-LL2-, hLL2-1- oder hLL2-2-Antikörper mit 10⁸ Raji-Zellen in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von mLL2-F(ab')₂-Fragmenten als Konkurrenzpartner in einem Endvolumen von 100 μl PBS-Puffer, ergänzt mit 1% FCS und 0,01% Natriumazid, inkubiert. Das Gemisch wurde für eine Dauer von 30 Minuten bei 4°C inkubiert und drei Mal mit PBS zum Entfernen von ungebundenen Antikörpern gewaschen. Durch Vorteilziehen aus der Gegenwart von humanen Fc-Teilen in den Antikörpern wurden die Bindungsgrade der Antikörper durch Zugabe von 20 × verdünnten FITC-markierten Ziegen-Anti-humanen IgG1-, Fc-Fragment-spezifischen Antikörpern (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) getestet. Die Zellen wurden drei Mal mit PBS gewaschen und die Fluoreszenzintensitäten durch eine Fluoreszenzaktivierte Zell-Sortierapparatur des Typs FACSAN (Becton-Dickinson, Bedford, MA) gemessen. Die Ergebnisse sind in 8A dargestellt. Unter Verwendung desselben Verfahrens wurde cLL2 mit zwei Versionen von hLL2 verglichen (8B).
Die in den 8A und 8B dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Immunreaktivität von cLL2 mit denjenigen von humanisierten oder Misch-und-Abgleich-Antikörpern ähnlich oder identisch ist. Zusammen mit dem Vergleich von cLL2 mit mLL2 (7) wird die Authentizität der Sequenzen für erhaltenes chimäres und humanisiertes VK und VH festgestellt und die Funktionalität von cLL2 und hLL2 bestätigt.
Beispiel 7
Verinnerlichung von mLL2- und cLL2 durch Raji-Zellen
Bei einer der einzigartigen Eigenschaften des LL2-Antikörpers handelt es sich um seine schnelle Verinnerlichung durch Bindung an Raji-Zellen (Shih et al., 1994, vorstehend). Mäuse-LL2 wird nach der Verinnerlichung wahrscheinlich schnell in den Golgi-Apparat und von dort aus zu dem Lysosom, die Organelle, die für die Degradierung einer breiten Vielzahl von Biochemikalien verantwortlich ist, transferiert (Keisari et al., Immunochem., 10: 565 (1973)).
Die Geschwindigkeiten der Antikörper-Verinnerlichung wurden gemäß Opresko et al., 1987, vorstehend, bestimmt. Das Verhältnis von CPM_{intracellulär}/CPM_Oberfläche wurde als Zeitfunktion bestimmt.
Die Geschwindigkeiten der LL2-Antikörper-Verinnerlichung wurden durch Inkubieren von radiomarkiertem LL2-Antikörper (1 × 10⁶ cpm) mit 0,5 × 10⁶ Raji-Zellen in 0,5 ml DMEM-Puffer, enthaltend 1% humanes Serum, für eine Dauer von zwei Stunden bei 4°C bestimmt. Überschüssiges humanes Serum war eingeschlossen, um die Raji-Zelloberflächen-Fc-Rezeptoren zu sättigen, um eine durch die Fc-Rezeptoren vermittelte nicht-Antigen-spezifische Verinnerlichung auszuschließen oder zu minimieren. Ungebundene, radio-markierte LL2-Antikörper wurden durch dreimaliges Waschen mit Portionen von 0,5 ml DMEM bei 4°C von den Zellen entfernt. Die Zellen wurden dann bei 37°C inkubiert, und zu zeitlichen Intervallen wurden Aliquote der Zellsuspension auf Eis überführt, um die Verinnerlichung zu stoppen. Die Zellen in diesen Aliquoten wurden durch Zentrifugation bei 1.000 × g für eine Dauer von 5 Minuten bei 4°C isoliert und das oberflächengebundene, radio-markierte LL2 mit 1 ml 0,1 M-Glycin-Acetat-Puffer, pH 3, für eine Dauer von 8 Minuten bei 4°C von den Zellen abgezogen. Die so erhaltene Radioaktivität (CPM_Oberfläche) und die in den Zellen verbliebene Radioaktivität (CPM_{intracellulär}) wurden bestimmt. Die Verinnerlichungsgeschwindigkeiten wurden aus der Neigung der graphischen Darstellung der Verhältnisse der Radioaktivität von intrazellulär : Oberflächen als Zeitfunktion berechnet.
Wie in 9 dargestellt, wurden mLL2-, cLL2-, cLL2Q- und hLL2-Antikörper mit ähnlicher Geschwindigkeit (Ke = 0,107 (mLL2) bis 0,1221 (cLL2Q, NVT zu QVT-Mutation) verinnerlicht. Diese Zahlen legen nahe, dass etwa 50% des oberflächengebundenen Antikörpers innerhalb von 10 Minuten verinnerlicht werden konnte. Die Ergebnisse zeigen, dass weder eine Chimärisierung noch eine Humanisierung noch eine Deglykosyrlierung durch Mutagenese von mLL2-Antikörpern die Verinnerlichungsgeschwindigkeiten verschlechtern.
Das Verinnerlichungsmuster für mLL2, cLL2 und hLL2 wurde ebenso durch Fluoreszenzmikroskopie auf Zeitverlaufsbasis unter Verwendung einer wie in der Beschreibung beschriebenen FITC-markierten zweiten Antikörpersonde überwacht. Die Verinnerlichung von beiden Antikörpern wurde zum frühesten messbaren Zeitpunkt beobachtet. Nach 5 Minuten waren Antikörper sowohl auf der Zelloberfläche als auch in den unmittelbar zu der Membran als zytoplasmische Mikrovesikel benachbarten Bereichen zu sehen. 15 Minuten nach der Inkubation begannen sich die um die Zwischenmembran verteilten feinen Punkte zu einer Gruppe von Körnchen an Lokalisierungen, von welchen angenommen wurde, dass sie der Golgi-Apparat sind, zusammenzuschließen. Da mehrere Antikörper nach 30-minütiger Inkubation verinnerlicht waren, wurde eine Wiederverteilung der gruppierten Antikörper zu gestreuten Lokalisierungen, möglicherweise dem Lysosom, in welchem die Antikörper zersetzt wurden, beobachtet. Zwei Stunden nach der Inkubation waren die meisten der Antikörper innerhalb der Zelle zu finden. Nur ein starkes Oberflächenfärben wurde beobachtet, als LL2 für eine Dauer von 20 Minuten auf Eis inkubiert wurde. Sowohl mLL2 als auch cLL2 wurden mit einem ähnlichen Muster verinnerlicht. Die Verinnerlichung von LL2 war spezifisch mit der Antigen-Antikörper-Bindung verbunden, da der irrelevante Kontroll-humanisierte Antikörper nur eine bedeckte Oberflächenfärbung zeigte.
Der A103-Antikörper (ein IgG2a-Antikörper, der an die Oberfläche von allen humanen Epithelial-Zellen bindet, jedoch nicht effizient verinnerlicht wird (Mattes et al., Hybridoma, 2: 253 (1983)) zeigte ein starkes Membranfärben innerhalb bis zu zwei Stunden, während der Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörper (5F9) genauso schnell verinnerlicht wurde wie LL2.
Beispiel 8
Rolle der Glykosylierungsstelle in der FR1-Region der LL2-VK-Sequenz
Ein besonders erfinderisches Interesse stellt die Identifikation einer Asn-Glykosylierungsstelle an Position 18–20 innerhalb der FR1-Region der leichten LL2-NVT-Kettensequenz (4A) dar. Wie vorstehend dargestellt, legt eine SDS-PAGE-Analyse unter reduzierenden Bedingungen nahe, dass die Asn-Glykosylierungsstelle zur Kohlenhydrat-Addition verwendet wird. In diesem Beispiel wurde der Einfluss der Kohlenhydrat-Einheit an Position 18–20 an den funktionellen Aktivitäten der leichten Ketten geprüft.
Mäuse- und chimäre leichte LL2-Ketten, mit Endoglycosidase F behandelt oder unbehandelt, wurden durch SDS-PAGE unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen geprüft. Es lag kein Unterschied zwischen den Antikörpern wie im elektrophoretischen Verhalten vor. In beiden Fällen reduzierte die Deglykosylierung die Geschwindigkeit der Migration der leichten Kette.
Die Wirkung der Deglykosylierung auf die Bindungsaffinität an Raji-Zellen des mLL2-Antikörpers ist in 10 dargestellt. Eine Entfernung des Kohlenhydrats durch Endoglycosidase F beeinflusste die Bindungsaktivität nicht.
Eine Mutation wurde an Position 18 der leichten Kette so eingebracht, dass das Asn mit Gln zur Erzeugung von LL2Q-VK-FR1 ersetzt wurde. SDS-PAGE-Analysen zeigten, dass die NVT-zu-QVT-Mutation eine Glykosylierung des Antikörpers beseitigte. Ein Vergleich der Raji-Zell-Bindungsaffinität für cLL2 mit und ohne leichtkettiger VK-Glykosylierung zeigte, dass die Kohlenhydrat-Einheit die Bindung des Antikörpers an diese Zellen nicht beeinflusste.
Es kann gefolgert werden, dass die Gegenwart von Kohlenhydratstellen in der variablen Region die Immunreaktivität des Antikörpers nicht beeinflusst. Computermodellstudien legten nahe, dass die VK-Kohlenhydrat-Einheit in LL2 am entferntesten von den CDRs positioniert ist und eine „Abdeckung" über den Bodenschlingen der FR-verbundenen β-Zylinder, die die CDRs tragen, bildet. Eine Humanisierung ohne Einschluss der ursprünglichen Glykosylierungsstelle führte zu einem CDR-gepfropften LL2-Antikörper mit einer Immunreaktivität, die mit derjenigen seines Mäuse-Gegenstücks vergleichbar ist. Diese Eigenschaften zei gen an, dass die Glykosylierungsstelle zum Konjugieren von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln an LL2 ohne Beeinträchtigen der Fähigkeit des Antikörpers, an B-Lymphom oder Leukämiezellen zu binden oder von ihnen verinnerlicht zu werden, verwendet werden kann.
Beispiel 9
Konjugation von LL2 an seiner VK-Region-Kohlenhydrat-tragenden Stelle
Der offensichtliche Mangel an Beteiligung der variable-Region-Kohlenhydrat-Einheit in den funkionellen Aktivitäten von mLL2, cLL2 und hLL2-mAbs zeigt an, dass diese Einheit als die Anlagerungsstelle von zytotoxischen Mitteln oder Nachweismitteln wie Radionuklide oder Toxine profitabel verwendet werden könnten und dadurch die mögliche Störung der Bindung des Konjugats an eine Zelloberfläche vermeiden.
Unter Verwendung der in Shih et al., U.S.-Patent Nr. 5,057,313 (hier unter Bezugnahme eingebracht) beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Antikörper-Konjugaten durch eine oxidierte Kohlenhydrat-Einheit des Antikörpers und einer primären Alkylamingruppe eines polymeren Trägers, an welche ein oder mehrere einer Vielzahl an Arzneimitteln, Toxinen, Chelatbildnern und Nachweismarkierungen gebunden ist, wurde ein Doxorubicin-Dextran-LL2-Antikörperfragment ohne angehängtes Glycan hergestellt, das mehrfache Kopien des Arzneimittels enthielt. Die beteiligten Kohlenhydrateinheiten der cLL2-VK-FR1-Region waren diejenigen, die kovalent an die Asn-Glykosylierungsstelle gebunden sind.
In einer Synthese wurde Dextran (18–40 kDa) durch Oxidation des Dextrans durch NaIO₄, Schiffsche-Basebitdung mit NH₂-CH₂-CHOH-CH₂-NH₂ und Reduktion mit NaBH₄ zu einem Aminodextran umgewandelt. Das Aminodextran wurde dann mit Doxorubicin (DOX) in Gegenwart von Bernsteinsäureanhydrid und 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid zur Herstellung von DOX- Aminodextran kondensiert. Letzteres wurde dann mit einer Aldehydgruppe an LL2-VK-FR-1, hergestellt durch Oxidieren der Kohlenhydrat-Einheit des Antikörperfragments mit NaIO₄, kondensiert.
Bei einer Herstellung von DOX-LL2 betrug die Molzahl von an das Dextran angelagertem DOX 14 Mol pro Mol Dextran und die Molzahl an Doxorubicin pro Mol F(ab')₂ 8,9. Die Immunreaktivität im vorstehenden Raji-Zell-Bindungstest betrug etwa 80% der Kontrollwerte. Dieses Konjugationssystem ist auf den mLL2-Antikörper nicht beschränkt. In einer vergleichbaren Studie wurden 15–19 Mol DOX pro Mol cLL2 gebunden.
Die Konjugationsmöglichkeiten sind auf die Verwendung eines Dextranträgers, wie im vorstehenden Beispiel, nicht beschränkt. Zum Beispiel kann die Kohlenhydrateinheit der LL2-VK-FR1-Region zur Herstellung von Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese können wiederum mit einer Aminogruppe auf einem beliebigen Arzneimittel zur Herstellung einer Schiffschen Base umgesetzt werden, die über Reduktion mehrfache Kopien des Arzneimittels erzeugt, das stabil an den Antikörper über Alkylamin-Gruppen gebunden ist.
Zum Beispiel wird, wenn es sich bei dem Arzneimittel um Aminohexyl DTPA (einen Chelatbildner) handelt, ein LL2 kovalent an einen Chelatbildner gebunden. Der Chelatbildner kann zum Freisetzen von Zielgeweben, z.B. eines Radionuklids oder von paramagnetischen Metallionen mit einem Potential für diagnostische und therapeutische Verwendungen verwendet werden. DTPA-LL2-Konjugate wurden hergestellt, die 5,5 Mol des Chelatbildners pro Mol Antikörper enthielten, die wiederum 47,3% Y-90 und 97,4% In-111 chelatierten.
Beispiel 10
Verbesserte Herstellung eines humanisierten Anti-B-Zellen-Lymphom- Antikörpers
Trotz einer gezeigten Effizienz für Mäuse-LL2 bei der Behandlung und Diagnose von B-Zell-Lymphomen, die nicht vom Hodgkin-Typ sind, war jedoch eine gründliche Studie der klinischen Bedeutung seiner humanisierten Version (hLL2) aufgrund der geringen hLL2-Produktivität des ursprünglichen Transfektoms (ca. 1 mg/Liter in einer endgültigen Kultur) erschwert. Durch Wiederbinden der schwer- und leichtkettigen hLL2-Sequenzen in einen Expressionsvektor, enthaltend ein amplifizierbares Dihydrofolat-Reduktasegen, (dhfr)(hLL2pdHL2), war es uns möglich, den Vektor durch Elektroporation in SP2/0-Zellen zu transferieren und ein Methotrexat(MTX)-resistentes und hLL2-produzierendes Klon zu bilden. Mit einer MTX-Konzentration von 0,1 μM wurden 1,4 mg hLL2 von einer Endkultur mit einem Liter gereinigt. Der Grad der hLL2-Herstellung stieg mit stufenweiser Erhöhung der Konzentration von MTX im Kulturmedium an und erreichte ein Produktionsplateau von 70 +/– 5 mg/Liter bei 3 μM MTX. Der so gereinigte hLL2 zeigte einen PI von 10,3 mit bewahrter Immunreaktivität. Weiterhin schien die vollständige Entfernung von MTX-Selektion und Einfrieren und Auftauen den hohen Produktivitätsgrad des aufgebauten Klons nicht zu beeinflussen, was nahe legte, dass die amplifizierten Gene stabil in das Chromosom integriert waren.
Beispiel 11
Konstruktion von N-gebundenen Glykosylierungsstellen in die konstante Region eines hLL2-Antikörpers
1. Aufbau von N-gebundenen Glykosylierungsstellenmutationen
(1) Leichtkettige Mutationen
Mögliche N-gebundene Glykosylierungssequenzen wurden in den Kappa-konstanten Regionen von Kaninchen-Antikörpern an a.a.-Position 161–163 und 174–176 identifiziert. Ähnliche Stellen können in die CK-Domäne von hLL2, bezeichnet als die Stellen KCNI bzw. KCN2, eingebracht werden. Zudem wurden drei andere CK-Mutanten, nämlich KCN3, KCN4 und KCN5, wie in 12 aufgelistet, aufgebaut.
(2) Schwerkettige Mutationen
Humanes IgM enthält die mögliche Kohlenhydrat-Additionssequenz NNS in der CH1-Domäne an Aminosäureposition 161–163. Gleichermaßen wurde die Sequenz NVT an den Resten 168–170 in der CH-Domäne von humanem IgA positioniert. Durch dasselbe Prinzip, das bei den Aufbauten von leichtkettigen Mutationen verwendet wurde, wurden auch schwerkettige Mutationen eingebracht (12).
Die Kohlenhydrat-Additionssequenz Asn-Asn-Ser wurde an den a.a.-Positionen 161–163 (Kabat-Numerierung; Kabat et al., 1991) in einigen der humanen IgM-CH1-Domänen identifiziert. Gleichermaßen war die Sequenz Asn-Val-Thr in den a.a.-Positionen 168–170 in der CH1-Domäne von humanem IgA positioniert. Durch Mutieren der humanen IgG1-Sequenz Asn-Ser-Gly zu Asn-Ser-Val an den a.a.-Positionen 162–164, Ala-Leu-Thr zu Asn-Leu-Thr an den a.a.-Positionen 165–167, bzw. Leu-Thr-Ser zu Asn-Thr-Ser an den a.a.-Positionen 166–168 wurden drei mögliche N-gebundene Glykosylierungsstellen, die zu derjenigen von IgM und IgA besonders analog waren, in die CH1-Domäne von humanem Igel mit einer minimalen Störung der erhaltenen Struktur eingebracht. Solche Glykosylierungsstellen können in einer „natürlichen" Position verbleiben. Andere Glykosylierungsakzeptorsequenzen wurden auf der Basis ihrer Oberflächenzugänglichkeit wie durch Computermodellieren vorhergesagt (z.B. HCM5), eingebracht. Noch andere Stellen wurden durch Erleichtern der Mutation der Sequenz ohne Modellieren statistisch ausgewählt.
2. Umbau von Mutationskonstrukten zur Expression
(1) Aufbau und Synthese von Primern zur Mutagenese
Eine Oligonukleotid-gerichtete stellenspezifische Mutagenese wurde zum Einbringen der bestimmten möglichen N-gebundenen Glykosylierungsstellen in hLL2-Antikörper verwendet. Die jeweils einer CK- und CHI-Mutation entsprechenden Oligonukleotidprimer wurden synthetisiert und zur Mutagenese in vitro verwendet. Jeder dieser Primer brachte auch in das Ziel-DNA-Fragment eine Restriktionsspaltungsstelle (Tabelle 1, unterstrichene Sequenzen) ein, um das anschließende Screening-Verfahren zu erleichtern. In Tabelle 1 geben die fett gedruckten Buchstaben die mutierten Basen an.
Tabelle 1
(2) Konstruktion von Expressionsvektoren
Durch stellenspezifische Mutagenese in vitro wurden mögliche N-gebundene Glykosylierungssequenzen in die die leichten und schweren Ketten von hLL2 kodierende Gene gebunden. Die Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Jedes mutierte Gen wurde dann in den entsprechenden Expressionsvektor (hLL2pKh für die Kappa-Kette und hLL2pG1g für die schwere Kette) subgeklont.
Die CH1-Domäne von humanem IgG1 wurde zuerst aus dem Expressionsvektor LL2pG1g, enthaltend die menschliche Genom-IgG1-konstante Regionsequenz (Leung et al., 1994b), durch Aufschluss mit den Restriktionsenzymen BamHI und BstXI, exzidiert und in die entsprechenden Stellen des pBluescript-SK-Vektors (Stratagene, La Jolla, CA) zur weiteren Manipulationen subgeklont. Der erhaltene Vektor wird als CH1pBS bezeichnet.
Mutationen wurden unter Verwendung des Bausatzes für stellengerichteten Mutagenese Transformer^TM (CLONTECH, Palo Alto, CA) gemäß den Anweisungen des Hersteller erzielt. Der Selektionsprimer MutKS (5'-ACG GTA TCG ATA TGC ATG ATA TCG AAT T-3') ist in allen Fällen zur Verbindung mit den jeweiligen Mutationsprimern bestimmt. Er wurde ausgewählt, um die HindIII-Restriktionsstelle in der Klonsequenz von pBluescript zu einer NsiI-Restriktionsstelle (unterstrichen) umzuwandeln.
Zum Mutieren von Asn-Ser-Gly zu Asn-Ser-Thr an den a.a.-Positionen 162 – 164 wurde der Selektionsprimer MutKS und der Primer CHO162 (5'-GTG TCG TGG AAT TCA ACC GCC CTG ACC AGC GGC-3') zum Ersetzen des Gly an Position 164 zum Mutieren zu Thr verwendet. Eine EcoRI-Stelle (unterstrichen) ist ebenso in dem mutagenen Primer als diagnostische Stelle eingeschlossen.
Zum Mutieren von Ala-Leu-Thr zu Asn-Leu-Thr an den a.a.-Positionen 165–167 werden der Selektionsprimer MutKS und der Mutationsprimer CHO165 (5'-GTG TCG TGG AAT TCA GGC AAC CTG ACC AGC GGC -3') zum Ersetzen des Ala-165 in Asn-165 verwendet. Eine EcoRI-Stelle (unterstrichen) ist in dem mutagenen Primer als diagnostische Stelle eingeschlossen.
Zum Mutieren von Leu-Thr-Ser zu Asn-Thr-Ser an den a.a.-Positionen 166–168 werden der Selektionsprimer MutKS und der Mutationsprimer CHO166 (5'-TGG AAC TCA GGC GCG AAT ACC AGC GGC GTG CAC-3') zum Ersetzen des Leu-166 zu Asn-166 verwendet. Die KasI-Stelle (GGC GCC) in der ursprünglichen CH1-Sequenz von humanem IgG1 wird freisetzbar durch Ersetzen des 3'C mit einem G für diagnostische Zwecke eliminiert.
Die phosphorylierten Primerpaare (Selektions- und die entsprechenden Mutationsprimer) mit 100 ng werden jeweils an 100 ng des Stützvektors CH1pBS in 20 mM Tris-CH1 (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl in einem Endvolumen von 20 μl durch Inkubation bei 95°C für eine Dauer von 3 Minuten, und dann Abkühlen auf Eis für eine Dauer von 5 Minuten annealed. Dem Gemisch werden 2 bis 4 Einheiten T4-DNA-Polymerase, 4 bis 6 Einheiten T4-DNA-Ligase zusammen mit 3 l 10 × Synthesepuffer (CLONTECH, Palo Alto, CA) zugesetzt. Nach einer Inkubationsdauer von 2 Stunden bei 37°C werden die Polymerisations- und Bindungsreaktionen durch Erwärmen bei 65°C für eine Dauer von 5 Minuten in Gegenwart von 3 l vorgewärmter Stopplösung (0,25% SDS, 5 mM EDTA) beendet. DNA aus dem Gemisch wird zum Transformieren von elektrokompetenten Zellen von E. coli, BMH71-18 mutS (Reparieren von Fehlerstellen) durch das Elektroporationsverfahren verwendet. Transformanten werden dann gepoolt, und man lässt sie über Nacht in SOC (20 mg/ml Bacto-Trypton, 5 mg/ml Bacto-Hefe-Extrakt, 8,6 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM Glucose) mit 50 g/ml Ampicillin bei 37°C wachsen. Mini-plasmid-DNA-Präparate von den gepoolten Transformanten werden mit HindIII zum Linearisieren von nicht mit den Selektionsprimern mutierter DNA aufgeschlossen. Nach Entfernen der Enzyme durch Phenolextraktion wird die DNA für eine zweite Transformation mit kompetenten DH5-Zellen verwendet. Plasmid-DNA, die beim Aufschluss mit HindIII versagt, wird auf die Gegenwart von diagnostischer ecoRI- Stelle (im Fall von Gly-zu-Thr- und Ala-zu-Asn-Mutationen) oder die Abwesenheit der diagnostischen KasI-Stelle (im Fall von Leu-zu-Asn-Mutation) geprüft. Eine Endbestätigung der Mutation wird durch Dideoxy-Sequenzieren von Sauger (Sauger et al., 1977) erzielt. Die CH1-Region, von welcher bestätigt wurde, dass sie die gewünschten Mutationen aufweist, wird dann mit BamHI/BstXI-Enzymen exzidiert und in die entsprechende Stelle der endgültigen schwerkettigen Expressionsvektoren für hLL2, hLL2pG1g geklont.
(3) Expressionsvektor zur Genamplifikation
Zum Erleichtern des Stromabwärts-Verfahrens der Antikörperherstellung ist es erwünscht, ein Genamplifikations-System zur Antikörperexpression zu verwenden. Nachdem es sich erwies, dass eine Antikörpervariante ein industrielles Potential aufweist, könnte eine hochgradige Herstellung durch Genamplifikation erzielt werden. Unter dieser Voraussetzung planten wir, diese Mutanten mit N-gebundener Glykosylierungsstelle in dem hochgradigen Expressionsvektor hLL2pdHL2, einem Amplifikationssystem auf dhfr-mini-Gen-Basis, zu konstruieren. Die schwerkettigen Mutationen HCN3, HCN4 und HCN5 wurden in diesem Vektor zur Expression subgeklont.
Die endgültigen Expressionskonstrukte für diese Mutationen wurden als hLL2HCN3pdHL2, hLL2HCN4 bzw. hLL2HCN5pdHL2 bezeichnet.
3. Expression von Mutant-hLL2 und Glykosylierung an umgebauten Stellen
Die die umgebauten Glykosylierungsstellen enthaltenden konstanten Domänen wurden an die jeweiligen variablen (V) Regionen von hLL2 gebunden. Die verschiedenen Glykosylierungsmutanten wurden in Mäuse-SP2/0-Myelomzellen exprimiert, die mit den schwer- und leichtkettigen Expressionsvektoren durch Elektroporation transfektiert wurden. Die umgebauten Antikörper wurden aus dem Kulturüberstand der stabilen Antikörper-herstellenden Zellen durch Protein-A-Säulen gereinigt und die gereinigten Proteine auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen analysiert. Die schweren Ketten der Glykosylierungsmutanten migrierten verglichen mit denjenigen des Kontroll-Antikörpers hLL2, dessen CHI-Domäne keine möglichen Glykosylierungsstellen enthielt, mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Da die SDS-PAGE-Migrationsgeschwindigkeit umgekehrt proportional zu der Molekülgröße der umgebauten Oligosaccharide ist, sollte der Glykosylierungsgrad an den verschiedenen Stellen in der Ordnung von HCN5 > HCN1 > HCN3 > HCN2 > HCN4 liegen, wobei hLL2HCN5 und hLL2HCN1 die zwei am höchsten glykosylierten Abs sind. Im Gegensatz dazu schlossen wir aus dem Bewerten des Fehlens der Migrationsverzögerung in den leichten Ketten für die Mutanten KCN1–4, dass diese CK-verbundenen Stellen entweder insgesamt nicht glykosyliert oder nur mit einem unbedeutenden Grad glykosyliert waren.
4. hLL2HCN1 und hLL2HCN5 sind in der CH1-Domäne N-glykosyliert
Die Antikörper hLLHCN1, hLL2HCN5 und hLL2 wurden mit N-Glycosidase F (PNGase F), die spezifisch alle Typen von Asn-gebundenem Glycan von Peptiden abspaltet, behandelt, und durch reduzierende SDS-PAGE analysiert. Die höhere scheinbare Molekülmasse für die schweren Ketten von hLL2HCN1 und hLL2HCN5 reduzierten wir zu derjenigen von hLL2 nach PNGase F-Aufschluss, was anzeigte, dass der Größenunterschied zwischen diesen Abs den mit den schweren Ketten verbundenen N-gebundenen CHOs zugeschrieben wurde. Es sollte angemerkt werden, dass alle humanen IgG₁-Abs in der CH₂-Domäne an Asn297 natürlich glykosyliert sind. Die beobachteten Größenunterschiede können aufgrund der unterschiedlichen Glykosylierung an der CH2-Stelle eher als an den umgewandelten Stellen als Ergebnis von Variationen in den Kulturbedingungen vorliegen. Wir stellten deshalb F(ab')2-Fragmente von hLL2HCN1, hLL2HCN5 und hLL2 her und analysierten diese Fragmente durch reduzierende SDS-PAGE.
Es zeigte sich, dass die Größenunterschiede zwischen den Abs mit den ohne den Fc-Teil und die anhängigen Oligosaccharide vorliegenden Fd-Fragmenten (VH-CH₁) verbunden sind, wobei die Molekülgröße für Fd-Fragmente von hLL2HCN5 größer als diejenige von hLL2HCN1 ist. Wurden Fragmente durch Behandlung mit PNGcase F deglykosyliert, wurden diese Größenunterschiede eliminiert und alle Fd-Fragmente migkierten an dieselbe Position wie das unglykosylierte hLL2, was nahe legt, dass die umgebauten Stellen tatsächlich zur Glykosylierung verwendet wurden und der Glykosylierungsgrad für die HCN5-Stelle größer als derjenige für HCN1 war.
Die N-gebundenen Oligosaccharid-Einheiten in der CH1-Domäne von hLL2HCN1 wurden direkt durch CHO-spezifisches Markieren visualisiert. Die daran angelagerten Oligosaccharid-Einheiten wurden zuerst durch Periodat oxidiert. Die gebildeten Aldehyd-Gruppen wurden dann kovalent mit Biotin konjugiert, das als Probe verwendet und durch Streptavidin-Peroxidase in einer Western-Blot-Analyse visualisiert wurde. Wie wir erwarteten, waren nur die schweren Ketten, jedoch nicht die leichten Ketten sowohl von hLL2 und hLL2HCN1 mit CHO-Markierung sichtbar. Bei der densidometrischen Quantifizierung betrug die Intensität der markierten CHOs in hLL2HCN1 etwa das 2,5-fache von derjenigen in hLL2. Die Proteingehalte der verschiedenen analysierten Abs waren vergleichbar, wie durch Coomassie-blaugefärbte SDS-PAGE dargestellt. Wir schrieben diesen Unterschied in der Intensität als das Ergebnis von zusätzlicher Glykosylierung in der umgebauten HCN1-Stelle zu. Dies wurde bestätigt, als die F(ab')₂-Fragmente derselben Analyse unterzogen wurden: nur das Fd-Fragment von hLL2HCN1, jedoch nicht das von hLL2 zeigte eine CHO-spezifische Markierung. Im Gegensatz dazu wurde keine möglichen CK-Glykosylierungsstellen als glykosyliert befunden.
Es sollte angemerkt werden, dass im Gegensatz zur VK-anhängigen Glykosylierungsstelle, die Heterogenität im Glykosylierungsgrad zeigte, nur eine einzelne Bande in der SDS-PAGE-Analyse für hLL2(HCN1) Fd-Fragment beobachtet wurde. Es wird vermutet, dass fast alle der Fd-Fragmente von hLL2(HCN1) glykosyliert wurden und der Glykosylierungsgrad relativ homogen war, eine erwünschte Eigenschaft, die ihre anschließenden Charakterisierungen und Anwendungen erleichtern könnten.
5. WN-konkurrierender Bindungstest
Die Antigenbindungseigenschaft dieser zwei Antikörper wurde durch Konkurrenzbindung mit mLL2 an einen LL2-Anti-Idiotyp-Antikörper (WN) bewertet. Dieser Test zeigt, dass die Bindungsaktivität von hLL2HCN1 und hLL2HCN2 an WN von derjenigen von hLL2 unterscheidbar ist (11).
Beispiel 12
Stellenspezifische Konjugation von Aminobenzyl-DTPA und Dextran-Doxorubicin an hLL2HCN1 und hLL2HCN5
Die stellenspezifische Modifizierung der F(ab')₂-Fragmente von Antikörpern mit DTPA erfolgte wie beschrieben. Siehe Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995). Das F(ab')₂-Fragment (~ 1 mg/ml) wurde mit 15 mM Natriummetaperiodat bei 4°C für eine Dauer von 1 Stunde oxidiert. Das oxidierte Material wurde gereinigt, mit einem 545-fachen molaren Überschuss an Aminobenzyl-DTPA gemischt und der pH-Wert auf 5,97 eingestellt. Das Gemisch wurde im Dunklen bei Umgebungstemperatur für eine Dauer von 5 Stunden inkubiert und dann bei 4°C für eine Dauer von 18 Stunden aufbewahrt. Die Konjugate wurden mit 10 mM Natriumcyanoborhydrid stabilisiert, gereinigt und konzentriert. Das Verhältnis von Chelatbildner : F(ab')₂ wurde durch Metallbindungstests und Verwendung von Indiumacetat, befestigt an ¹¹¹In bestimmt. Siehe Meares et al., Anal. Biochem., 142: 68 (1984). Das Radiomarkieren wurde wie beschrieben durchgeführt. Siehe Leung et al., 1995, vorstehend. Die Anzahl von an das F(ab')₂-Fragment konjugierten DTPA-Molekülen wurde durch Metallbindungstest unter Verwendung des In/In-111-Systems bestimmt. Kurz gesagt, wurden 40 μg der Konjugate für eine Dauer von 30 Minuten mit einem bekannten Überschuss an Indiumacetat, befestigt an In-111-Acetat inkubiert. Die Lösung wurde in EDTA auf 10 mM eingestellt und für eine Dauer von weiteren 10 Minuten inkubiert. Die Markierung wurde durch ITLC unter Verwendung von 10 mM EDTA zur Entwicklung analysiert. DOX-Dextran-Konjugat wurde wie von Shih et al., Cancer Res. 51: 4192 (1991) unter Verwendung von Aminodextran mit 18 kDa als Zwischenträger hergestellt. Das Zwischenkonjugat besaß einen Substitutionsgrad von 10,5 DOX-Molekülen pro Dextranpolymer. DOX-Dextran wurde dann mit dem F(ab')₂-Fragment von hLL2HCN1 oder hLL2HCN5 konjugiert. Kurz gesagt, wurde das Antikörperfragment auf 10 mg/ml in 0,1 M Natriumacetat-Puffer, pH 5,5, konzentriert und mit 20 mM Natriummetaperiodat im Dunklen bei 4°C für eine Dauer von 60 Minuten behandelt. Der oxidierte Antikörper wurde auf einer Bio-Spin-Säule (Bio-Rad), die mit in 0,05 M-HEPES-Puffer, pH 8,0, enthaltend 0,1 M NaCl, voräquilibriert war, gereinigt und dann mit DOX-Dextran (4 Äquivalenten) bei Raumtemperatur für eine Dauer von 24 Stunden behandelt. Nach Reduktion mit Natriumborhydrid wurde das konjugierte Produkt auf einer Bio-Gel-A-Gel-Säule mit 0,5 m (Bio-Rad) gereinigt. Die Protein-Fraktionen wurden gepoolt und in einer Konzentrationsapparatur des Typs Centricon-50 (Amicon, Beverly, MA) konzentriert. Die Spurenmenge an Zwischenverbindungen in den Proteinkonjugaten wurde durch wiederholtes Waschen mit dem Konjugationspuffer, wie durch HPLC über einer Bio-Sil-Sec-Größenausschlusssäule (Bio-Rad) bewertet, entfernt.
Beispiel 13
CH₁-anhängige Oligosaccharide können als ausreichende Konjugationsstellen für Chelate und/oder Arzneimittel verwendet werden
Unter milden chemischen Bedingungen wurden ein Mittelwert von 1,6 und 2,97 Molekülen von DTPA an jedes F(ab')2-Fragment von hLL2HCN1 bzw. hLL2HCN5 konjugiert (Tabelle 2). Beide Konjugate zeigten hohe Effizienzen bei der ¹¹¹In-Einbringung (92% für hLL2HCN1, 91% für hLL2HCN5). Keine deutli chen Veränderungen in den Immunreaktivitäten wurden vor und nach der DTPA-Konjugation für die Glykosylierungsmutant-Fragmente, wie bewertet in einem WN-Konkurrenz-Blocktest, beobachtet. HCN5-anhängiges CHO schien verglichen mit dem HCN1-anhängigen CHO für die Chelatbildung reaktiver zu sein; nahezu zwei Mal so viel DTPA-Moleküle konnten in die HCN5-Stelle eingebracht werden.
Leung et al., (1995) vorstehend, zeigte, dass das in Mäuse-LL2 zu findende VK-anhängige CHO als eine stellenspezifische Konjugationsstelle für kleine Chelate ohne Reduzieren der Ag-Bindungseigenschaft des Ab verwendet werden kann. Die Wirkung des Konjugierens dieses VK-anhängigen CHO mit Dextran-DOX-Komplex über Immunreaktivität wurde geprüft. Der Dextran-DOX-Komplex wurde durch chemisches Einbringen von durchschnittlich 10 DOX-Molekülen auf einem Amino-Dextran-Polymer mit 18 kDa gebildet. Unter Verwendung des Aminodextrans als Träger für DOX wurden etwa 5,1 DOX-Moleküle im Durchschnitt auf dem VK-anhängigen CHO von Mäuse-LL2 eingebracht und eine Reduktion von nahezu 60% der Immunreaktivität, wie bewertet durch Zellbindung und ELISA-Tests, wurde beobachtet. Siehe Tabelle 3. Die Konjugation von einer leicht höheren Anzahl an DOX-Molekülen (6,8) auf dem HCN1-CHO war jedoch in Bezug auf ihre Wirkung auf die Immunreaktivität vergleichsmäßig weniger nachteilig, eine Reduktion von nur 30% in der erhaltenen Bindungsaffinität war zu bemerken. Im Gegensatz dazu waren keine deutlichen Veränderungen in der Ag-Bindungseigenschaft (weniger als eine 5%ige Reduktion) ersichtlich, als eine ähnliche Anzahl an DOX-Molekülen (7,2) an die HCN5-CHO konjugiert wurde. Siehe Tabelle 3.
Die Molekülmassen der F(ab')₂-Fragmente von hLL2, hLL2HCN1 und hLL2HCN5, bestimmt durch Massenspektronomieanalyse (Mass Consortium, San Diego, CA) betrugen 99.000, 102.400 bzw. 103.800, da diese Fragmente in den Sequenzen identisch sind, außer an der umgebauten Stelle (ein Aminosäureunterschied) und die Fragmente trugen nicht den glykosylierten Fc-Teil, der Molekül massenunterschied zwischen dem F(ab')₂ von hLL2 und dem Glykosylierungsmutanten sollte die Molekulargewichte der verschiedenen CH1-anhängigen CHOs, d.h., 3,4 bzw. 4,8 kD für die CHOs an den HCN1- bzw. den HCN5-Stellen darstellen.
Durch PNGase-F-Aufschluß wurden die CH1-anhängigen CHOs von hLL2HCN1 und hLL2HCN5 für Profilierungs- und Sequenzierungsanalysen unter Verwendung von Fluorpor-assistierter Kohlenhydrat-Elektrophorese (FACE) freigesetzt. Heterogene Populationen von CHI-anhängigen CHO-Spezies wurden identifiziert. Etwa 60% der Oligosaccharide der HCN5-Stelle waren von größerer tri-antennären Struktur, während diejenige von HCN1 hautpsächlich bi-antennär (> 90%) war. Diese Ergebnisse stimmen mit den Massenspektrometriestudien überein, was verglichen mit derjenigen von HCN1 auf eine größere mittlere Molekulargröße des CHOs an den HCN5-Stellen hinweist.
Es sollte betont werden, dass die vorstehend beschriebenen Beispiele nur verschiedene spezifische Ausführungsformen der Erfindung beschreiben und die Anmelder nicht beabsichtigen, den Umfang der Ansprüche durch diese spezifischen Beispiele zu beschränken. Tabelle 2 Stellenspezifische Konjugation von DTPA und Radiomarkieren
Tabelle 3 Stellengerichtete Konjugation von Doxorubicin

ND: nicht bestimmt

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Monoklonaler/s IgG-Antikörper oder IgG-Antikörperfragment vom Isotyp, der/das so umgebaut ist, dass er/es eine Glykosylierungsstelle in der nicht-Fc-konstanten schwerkettigen Region enthält.
Monoklonaler/s Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 1, der/das ein humanisierte/s Antikörper oder Antikörperfragment ist.
Monoklonaler/s Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 1 oder 2, der/das ein humanisierter/s B-Zellen-spezifischer/s Antikörper oder Antikörperfragment ist.
Monoklonaler/s Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 3, wobei die Glykosylierungsstelle an der HCN1-, HCN2-, HCN3-, HCN4- oder HCN5-Stelle von 12 lokalisiert ist und wobei die Glykosylierungsstelle vorzugsweise an der HCN1- oder der HCN5-Stelle von 12 lokalisiert ist.
Monoklonaler/s Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 3 oder 4, der/das die Spezifität des hLL2-Antikörpers aufweist.
Isoliertes DNA-Molekül, umfassend einen IgG-Antikörper mit einem schwerkettigen Gen, das eine umgebaute Glykosylierungsstelle in der CH1-Region des schwerkettigen Antikörpergens umfasst, das beim Coexprimieren des Gens mit einem zweiten Gen für eine leichte Antikörperkette in einer eine Glykosylierung tagenden Zelle einen IgG-Antikörper erzeugt, der in der CH1-Region der schweren Kette des Antikörpers glykosyliert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers oder Antikörperfragments, der/das in der CH1-Region glykosyliert ist, umfassend das Coexprimieren eines leichtkettigen Gens oder eines Teils davon, das mit einer Mutation so manipuliert wurde, dass eine Glykosylierungsstelle in der CH1-Region des schwerkettigen Gens oder eines Teils davon gebildet wird, in einer Zelle, die Glykosylierung gewährt, so dass der Antikörper oder das Antikörperfragment, der/das in der CH1-Region glykosyliert ist, erzeugt wird, und Isolieren des Antikörpers oder Antikörperfragments.
Monoklonaler/s Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit einem diagnostischen oder therapeutischen Mittel, das an ein Kohlenhydrat auf dem monoklonalen Antikörper oder Antikörperfragment konjugiert ist.
Monoklonaler/s Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 8 zur Verwendung in einem Diagnose- oder Behandlungsverfahren für einen Patienten, wobei ein monoklonaler/s Antikörper oder Antikörperfragment zum Zielen auf ein spezifisches Antigen verwendet wird.