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Hintergrund der Erfindung
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1. Umfeld der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Schweine-Polypeptid, welches als Leptin bezeichnet
wird, und das durch Adipozyten oder andere Zelltypen sekretiert
wird und das die Energieaufnahme und den Metabolismus, die Fettablagerung
und die Gewichtszunahme in Schweinen beeinflusst. Weiterhin betrifft
die Erfindung auch eine Nukleotidsequenz, die das Schweine-Polypeptid Leptin
kodiert, und auf Antikörper,
die sich gegen das Schweine-Polypeptid Leptin richten.
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2. Beschreibung des technologischen
Umfelds
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Fettleibigkeit
wurde von National Institutes of Health als eine Gefahr für die öffentliche
Gesundheit erkannt und hat die Nahrungsnutztier-Industrie dazu veranlasst,
nach Verfahren zur Begrenzung der Fetteinlagerung in Nahrungsnutztieren
zu suchen. Zudem sind bei der Entwicklung von Technologien zusätzlich motivierend
die mit der Umwandlung von Futterenergie in Nahrungsnutztieren in
Fett anstelle magerem Gewebes verbundenen Energiekosten. Die Technologien
sollen es erlauben, die Produktion effizienter in Richtung magerer
Fleischprodukte zu lenken und die Nahrungsbestandteile der Diät mit den
Ernährungsbedürfnissen
der Tiere ausgewogener abstimmen. Um diesem Gesundheits- und Herstellungsproblem
genüge
zu tun, ist sowohl eine prophylaktische, als auch eine therapeutische
Herangehensweise notwendig. Für
prophylaktische Zwecke wäre
es nützlich,
wenn eine Neigung oder der Hang zur übermäßigen Fetteinlagerung vorausgesagt
oder gemessen werden könnte.
Für therapeutische
Zwecke wäre
es ein großer
Vorteil, wenn bestehende Verfahren zur Minimierung der Einlagerung
von Futterenergie als Fett in die Adi pozyten verbessert würden. Bis
zum gegenwärtigen
Zeitpunkt wurde noch keines der wünschenswerten Ziele vollständig erreicht.
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Proteine
von Genen, die nur (oder überwiegend)
in adiposem Gewebe expremiert werden, und für die der Expressionsgrad mit
der Fetteinlagerung in Bezug gesetzt werden kann, sind ideale Objekte
für Ansätze zur
Voraussage des Fettwachstumspotentials und der Kontrolle der Fetteinlagerung.
Adipozyt-spezifische Polypeptide von Säugetieren, wie p154, werden
zum Beispiel, wie im US-Patent 5,268,295 von Serrero berichtet und
hiermit vollumfänglich
durch Bezugnahme einbezogen, in großen Umfang in adipogenen Zelllinien
nach der Zelldifferenzierung expremiert und sind reichlich in den
Fettpolstern normaler und genetisch fettleibiger Mäuse vorhanden.
Bis heute liegen jedoch keine Berichte über adipozyt-spezifische Proteine
vor, die in unterschiedlichem Umfang in fetten Schweinen im Vergleich
zu einer normalen Kontrollgruppe expremiert werden.
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Leptin,
das Protein das durch das Leptin (ob) Gen hergestellt wird, steht
möglicherweise
mit der Fetteinlagerung in Schweinen im Zusammenhang, da Forschungsergebnisse
gezeigt haben, dass' Mutationen
in genetisch (ob/ob) fettleibigen Mäusen zu einer verstärkten Fetteinlagerung
führen
und mit einer erhöhten
Expression des Leptin-Gens einhergehen. Darüber hinaus wurde wenigstens
ein Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)
entdeckt und mit dem Fett-Phenotyp in Verbindung gebracht (Zhang
et al., 1994, Nature 317: 425). Das Leptin-Gen wird spezifisch in
terminal differenzierten Adipozyten expremiert (Maffei et al., 1995,
Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6957; Leroy et al., 1996, J. Biol. Chem.
271(5): 2365). Weiterhin ist Leptin ein Regulator der Nahrungsaufnahme
(Pellymounter et al., 1995, Sci. 269: 540; Halaas et al., 1995,
Sci. 269: 543; Campfield et al., 1995, Sci. 269: 546).
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Obgleich
das Leptin-Gen der Maus abschnittweise kloniert wurde und eine cDNA-Sequenz
veröffentlicht
wurde (Nature 371: 425), ist weder die cDNA des Leptins des Schweins
noch eine genomische Sequenz zu gänglich.
Jedoch sind die Erkenntnisse, die über den Schweine-Metabolismus gewonnen
wurden nicht auf das System Schwein übertragbar. Darüber hinaus
ist das biologisch aktive, gereinigte Schweineprotein (d. h. Leptin)
bisher nicht zugänglich.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Gensequenz bereit, Peptide und
Antikörper,
die es erlauben eine Voraussage und Anpassung der Fetteinlagerung
und Regulation der Nahrungsaufnahme (d. h. des Appetits) in schweineartigen
Spezies zu erreichen.
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Ein
erster Aspekt der Erfindung bezieht sich auf schweine-adipozyte
Polypeptide, das Leptinprotein des Schweins, das im wesendlichen
frei von anderem Schweineprotein ist, oder funktionale Derivate
derselben. Die vorliegende Erfindung umfasst ein schweine-adipozytes
Polypeptid mit wenigstens etwa acht Aminosäuren der Aminosäuresequenz,
die in 1 dargestellt ist, vorzugsweise der Aminosäuresequenz,
die in 2 dargestellt ist, besonders bevorzugt, der Aminosäuresequenz,
die in 3 dargestellt ist, oder ein funktionales Derivat
derselben.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich zudem auf ein einfach- oder doppelsträngiges DNA-Molekül oder ein
RNA-Molekül,
das im wesentlichen aus einer Nukleotidsequenz besteht, die das
obige Polypeptid oder ein funktionales Derivat desselben kodiert,
wobei das DNA- oder RNA-Molekül im wesentlichen
frei von anderen DNA- oder RNA-Sequenzen des Schweins ist. Das DNA-Molekül ist vorzugsweise
ein einfach- oder doppelsträngiges
DNA-Molekül
mit einer Nukleotidsequenz, die wenigstens etwa 20 Nukleotide der
Nukleotidsequenz umfasst, wie sie in 1 dargestellt
ist, vorzugsweise einer Nukleotidsequenz, wie sie in 2 dargestellt
ist, besonders bevorzugt einer Nukleotidsequenz, wie sie in 3 dargestellt
ist, oder einer Sequenz, die komplementär zu den in den 1 bis 3 dargestellten
Nukleotidsequenzen ist, wobei diese im wesentlichen frei von anderen
DNA-Sequenzen des Schweins ist. Das DNA-Molekül ist vorzugsweise eine mRNA-Sequenz,
die das obige schweine-adipozyte Polypeptid oder ein funktionales
Derivat desselben kodiert.
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Die
Erfindung umfasst ein DNA-Molekül,
wie obig beschrieben, das als cDNA oder genomische DNA vorliegt,
vorzugsweise in Form eines expremierbaren Trägers oder Plasmids.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich zudem auf transformierte oder
transfizierte Wirtszellen mit dem obigen DNA-Molekül und umfasst
prokaryotische Wirtszellen, vorzugsweise ein Bakterium, eukaryotische Wirtszellen,
wie zum Beispiel Hefezellen, oder eine Säugetierzelle.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen polyklonalen oder auch
monoklonalen Antikörper,
der spezifisch für
ein Epitop des schweine-adipozyten Polypeptids oder eines funktionalen
Derivats desselben ist.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnung
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1 gibt
die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 des Leptin-Gens des Schweins und
das Aminosäureübersetzung
der das Schweineleptin kodierenden Sequenz wieder.
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2 gibt
die Nukleotidsequenz und die Aminosäureübersetzung (Sequenz ID No.
2) des kodierenden Bereichs der vollständigen Leptin-cDNA des Schweins
wieder (d. h. das Signalpeptid und das sekretierte Protein).
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3 gibt
die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 3 und die Aminosäureübersetzung SEQ ID No. 4 der
Leptin-cDNA des Schweins wieder, die mit dem sektretierten Leptinprotein
des Schweins korrespondiert.
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4 zeigt
einen Vergleich der Schweineleptin-cDNA-Sequenz, die zum gesamten
Schweineleptinprotein gehört,
mit den Mäusesequenzen
(SEQ ID No. 6) und menschlichen Sequenzen (SEQ ID No. 5).
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5 zeigt
eine Northern blot Analyse der Schweineleptin-mRNA.
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6 zeigt
die Isolation einer genomischen Klon-DNA für Schweineleptin.
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7 zeigt
eine Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese eines Schweineleptin-Proteins
und deren Reinigung in Escherichia coli.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein DNA- und RNA-Moleküle, die
ein schweine-adipozytes Polypeptid namens Leptin oder ein funktionelles
Derivat desselben kodieren, sowie auf das Schweineleptin-Protein
selbst oder ein funktionelles Derivat desselben. Das Schweineleptin-Protein ist zur Regulation
der Nahrungsaufnahme, des Energiemetabolismus und der Fettablagerung
im Schwein nützlich.
Diese Dinge können
durch Applikation rekombinanten oder gereinigten Schweineleptins, Änderung
der Expression der Schweineleptin-Gene oder Applikation eines Antikörpers, der
sich gegen das Schweineleptin-Protein durch dessen Neutralisation
richtet, in Abhängigkeit
von dem gewünschten
Ergebnis erreicht werden. Die Schweineleptin-DNA, -RNA und das Protein
oder ein funktionales Derivat desselben und ein spezifischer Antikörper für das Protein
werden experimentell zur Voraussage des Potentials der Fetteinlagerung
in Schweinen genutzt. Diese Moleküle können weiterhin zur Entwicklung
kommerziell wertvoller Technologien zur Variation der Nahrungsaufnahme
und Regulation der Fetteinlagerung in Schweinen sowie zur Abstimmung
des Nährstoffgehalts
der Diät
mit dem Nährstoffbedarf
des Schweins genutzt werden.
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Nach
einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein schweine-adipozytes Polypeptid
namens Leptin zur Verfügung
gestellt. Der Begriff „Polypeptid", wie er vorliegend
verwendet wird, soll nicht nur das Schweineleptin-Protein und seine
funktionalen Derivate umfassen, sondern auch Aminosäuresequenzen mit
zusätzlichen
Bestandteilen, zum Beispiel Aminosäuresequenzen mit zusätzlichen
Bestandteilen wie einem Zucker, einem Glycopeptid oder einer anderen
modifizierten und aus dem Stand der Technik bekannten Proteinstruktur.
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Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung weist die in den 1 und 2 dargestellte
und vorzugsweise die in 3 dargestellte, Aminosäuresequenz
auf. Es ist weiterhin beabsichtigt, dass die Reichweite der vorliegenden
Erfindung sich auf jedes Peptid mit wenigstens etwa 8 Aminosäuren der
zuvor genannten Sequenzen bezieht. Sequenzen dieser Länge sind
als Antigene nutzbar und zur Herstellung von immunogenen Konjugaten
mit Trägern
für die
Erzeugung von spezifischen Antikörpern
für verschiedene
Epitope des gesamten Proteins tauglich. Die Peptide sind weiterhin
nützlich
für das
Auffinden derartiger Antikörper
und für
die Verfahren der vorliegenden Erfindung, die sich auf die Bestimmung
des Leptinproteins in biologischen Proben beziehen. Aus dem Stand
der Technik ist wohl bekannt, dass Peptide mit etwa 8 Aminosäuren zur
Herstellung von Antikörpern
von größeren Proteinen
biologischem Interesses nützlich
sind.
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Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind ausreichend groß, um einen
antigenetisch eindeutigen Faktor oder ein Epitop zu liefern, das
als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern gegen Schweineleptin
oder ein funktionelles Derivat desselben sowie zur Überprüfung derartiger
Antikörper
nützlich
ist. Das Polypeptid dieser Erfindung kann auch an andere Moleküle kovalent
oder nicht-kovalent gebunden vorliegen. Zum Beispiel kann es an
ein oder mehrere weitere Polypeptide über ein oder mehrere Peptidbindungen
gebunden sein (d. h. als verbundenes Protein).
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Nach
einer Ausführungsform
ist das Polypeptid im wesentlichen frei von anderen Schweinepeptiden. Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann biochemisch oder auf
immunochemischem Wege von Zellen, Gewebe oder einer biologischen
Flüssigkeit
gereinigt werden. Alternativ kann das Polypeptid auf rekombinantem
Wege in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen hergestellt
werden.
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"Im wesentlichen frei
von anderen Schweinepolypeptiden" reflektiert
den Umstand, dass das Polypeptid, sofern gewünscht, in einem prokaryotischen
oder eukaryotischen Organismus expremiert werden kann, weil das
interessierende Gen für
das schweine-adipozyte Polypeptid geklont werden kann. Verfahren
zur Synthese von Polypeptiden der gewünschten Sequenz auf Festphasenträgern und
deren nachfolgende Trennung von dem Träger sind ebenfalls wohlbekannt.
Alternativ kann das Protein aus dem Gewebe oder Flüssigkeiten des
Schweins gereinigt werden, in denen es natürlicherweise auftritt, und
zwar so, dass wenigstens 90% (an Gewichtsanteil) und, sofern gewünscht, wenigstens
99% der weiteren Schweinepolypeptide abgetrennt werden und daher
im wesentlichen frei von diesen ist. Dies kann dadurch erreicht
werden, dass das Gewebe oder die Flüssigkeit standardmäßigen Proteinreinigungsverfahren
wie immunabsorbierenden Kolonnen mit monoklonalen, proteinreaktiven
Antikörpern
ausgesetzt werden. Alternativ kann die Aufreinigung aus derartigen
Geweben oder Flüssigkeiten
durch Kombination herkömmlicher
Verfahren, wie Ammoniumsulfat-Ausfällung, Molekulartsieb-Chromatographie
und Ionenaustauch-Chromatograpie erreicht werden.
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Alternativ
zum natürlich
aufgereinigten oder rekombinanten schweine-adipozyten Polypeptidmolekül können funktionale
Derivate des schweine-adipozyten
Polypeptids eingesetzt werden. Vorliegend wird der Begriff „funktionale
Derivate" auf jedwedes „Fragment", „Variante", „Analogon" oder „chemisches
Derivat" des schweine-adipozyten
Polypeptids bezogen, welches wenigstens einen Abschnitt beinhaltet,
der die Funktion des schweine-adipozyten Polypeptids im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung ermöglicht.
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Ein „Fragment" des schweine-adipozyten
Polypeptids, wie es vorliegend genutzt wird, bezieht sich auf jede
Teilstruktur des Moleküls,
die kürzer
als das Peptid ist.
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Eine „Variante" des schweine-adipozyten
Polypeptids, wie sie vorliegend genutzt wird, bezieht sich auf ein
Molekül,
das im Wesentlichen entweder zum gesamten Peptid oder einem Fragment
desselben gleich ist. Variierende Peptide können in konventioneller Weise
durch direkte chemische Synthese der variierenden Peptide unter
Einsatz von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren erhalten
werden. Alternativ können Aminosäuresequenz-Variationen
der Peptide durch Mutationen in der DNA, die das synthetisierte
Peptid kodiert, hergestellt werden (wieder unter Verwendung von
aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren). Derartige Varianten
umfassen zum Beispiel das Streichen, das Einfügen oder das Ersetzten von
Resten innerhalb der Aminosäuresequenz.
Jedwede Kombination des Streichens, Einsetzens und Ersetzens kann
auch eingesetzt werden, um ein entgültiges Konstrukt zu erhalten,
vorausgesetzt, dass das entgültige
Konstrukt die gewünschten
Aktivitäten
noch zeigt. Offensichtlich dürfen
die Mutationen in der DNA, die die variierenden Peptide kodiert,
nicht zu einer Änderung
des Leserasters führen
und sollten vorzugsweise nicht zur Ausbildung komplementärer Bereiche
führen,
die sekundäre
mRNA-Strukturen bilden können.
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Ein „Analogon" des schweine-adipozyten
Polypeptids, wie es vorliegend genutzt wird, bezieht sich auf ein
künstliches
Molekül,
das im wesentlichen entweder zum gesamten Molekül oder zu einem Fragment desselben ähnlich ist.
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Ein „chemisches
Derivat" des schweine-adipozyten
Polypeptids oder eines Peptids, wie es vorliegend genutzt wird,
beinhaltet zusätzliche
chemische Anteile, die normalerweise nicht Teil des Polypeptids
sind. Kovalente Modifikationen liegen im Anwendungsbereich der Erfindung.
Derartige Modifikationen können
durch gezielte Reaktion mit Aminosäureresten mit einem organischen
Derivativ, das befähigt
ist mit den ausgewählten
Sei tenketten oder terminalen Resten zu reagieren, in das Molekül eingeführt werden.
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Das
Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert,
dessen Einzelstrang der in 1 dargestellten
Nukleotidsequenz, vorzugsweise der in 2 dargestellten,
und besonders bevorzugt, der in 3 dargestellten
Nukleotidsequenz entspricht. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf
eine DNA-Sequenz, die das Polypeptid oder ein funktionelles Derivat
desselben, welches im wesentlichen frei von anderen Schweine-DNA-Sequenzen
ist, kodiert. Die DNA kann als Einzelstrang (d. h. sense-Strang, antisense-Strang
oder cDNA-Sequenz) oder als Doppelstrang vorliegen. Die DNA-Sequenz
sollte vorzugsweise etwa 20 oder mehr Nukleotide aufweisen, um eine
Hybridisierung mit einem weiteren Polynukleotid zu ermöglichen.
Eine Länge
von wenigsten etwa 50 Nukleotiden ist bevorzugt, um eine größere Spezifität bei der Hybridisierung
zu erreichen, die sich durch das Fehlen der Hybridisierung von Sequenzen
auszeichnet, die anders sind als die, die die Polypeptide oder ein
funktionales Derivat desselben kodieren.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich zudem auf ein RNA-Molekül, das eine
mRNA-Sequenz umfasst, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung
oder ein funktionales Derivat desselben kodiert.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf obige DNA-Moleküle, die
funktional in rekombinanten Expressionssystemen vorliegen, die als
mit dem Träger
transfiziert oder transformiert sowie zur Expression der Polypeptide
befähigt
in Wirtszellen Einsatz finden. Derartige Wirtszellen können prokaryotisch oder
eukaryotisch sein. Die DNA kann durch Transformation, Transduktion,
Transfektion oder ein ähnliches aus
dem Stand der Technik bekanntes Verfahren in den Wirtsorganismus
eingebracht werden.
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Ferner
werden ergänzend
zu den DNA- und mRNA-Sequenzen, die das schweine-adipozyte Polypeptidmolekül kodieren,
Verfahren zur Expressi on der Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt.
Weiterhin ermöglichen
die genetischen Sequenzen und Oligonukleotide der Erfindung die
Identifikation und das Klonen zusätzlicher, bisher unentdeckter
adipozyter Polypeptide mit homologen Sequenzen zu dem vorliegend
beschriebenen adipozyten Polypeptid.
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Das
rekombinante DNA-Molekül
der vorliegenden Erfindung kann über
eine Vielzahl von verschiedenen Wegen hergestellt werden, wie zum
Beispiel DNA- oder RNA-Synthese oder vorzugsweise durch Anwendung
rekombinanter DNA-Techniken. Techniken zur Synthese derartiger Moleküle werden
beispielsweise beschrieben von Wu, R., et al., Prog. Nucl. Acid.
Res. Molec. Biol. 21: 101–141
(1978), dessen Inhalt durch Bezugnahme hiermit umfasst wird. Verfahren
zur Herstellung rekombinanter Moleküle gemäß den oben beschriebenen Verfahren
werden von Sambrook et al. offenbart in Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,
N.Y. (1989), dessen Gegenstand durch Verweis einbezogen wird.
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Oligonukleotide,
die einen Bereich des schweine-adipozyten Polypeptids aufweisen,
sind für
die Suche nach Genen, die derartige Proteine kodieren, und für das Klonieren
von schweine-adipozyten Polypeptid-Genen nützlich. Verfahren zur Herstellung
derartiger Oligonukleotide werden beispielsweise offenbart von Wu,
R., et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101–141 (1978).
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Ein
geeignetes Oligonukleotid oder ein Satz von Oligonukleotiden, der
tauglich ist, ein Fragment des schweine-adipozyten Polypeptid-Gens
zu kodieren (oder ein Komplementär
zu einem derartigen Oligonukleotid oder Satz von Oligonukleotiden)
wird identifiziert, synthetisiert und auf aus dem Stand der Technik
bekanntem Wege gegen ein DNA- oder bevorzugt ein cDNA-Präparat, das
aus Zellen isoliert wurde, die das schweine-adipozyte Polypeptidgen expremieren
können,
hybridisiert. Einzelsträngige
Oligonukleotidmoleküle,
die komplementär
zu den vermutlich das schweine-adipozyte Polypeptid kodierenden
Sequenzen sind, können un ter
Einsatz von Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden
(siehe z. B.
US 5,268,295 ). Weiterhin
kann eine DNA-Synthese unter Einsatz automatisierter Generatoren
durchgeführt
werden. Verfahren zur Nukleinsäure-Hybridisierung
werden durch Sambrook et al. (siehe oben) offenbart.
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Nach
einem alternativen Weg des Klonens der schweine-adipozyten Polypeptid-Gene
wird eine Bibliothek von Expressionsvektoren durch Klonierung von
DNA oder bevorzugt cDNA (aus einer Zelle, die zur Expression der
schweine-adipozyten Polypeptide befähigt ist) in einem Expressionsvektor
hergestellt. Die Bibliothek wird dann nach Mitgliedern durchsucht,
die fähig
sind, ein Protein zu expremieren, das an einen anti-schweine-adipozyten Polypeptid-Antikörper bindet,
und das eine Nukleotidsequenz besitzt, die es ermöglicht,
ein Polypeptid zu kodieren, das dieselbe Aminosäuresequenz wie das schweine-adipozyte
Polypeptid oder ein Fragment desselben hat. Nach dieser Ausführungsform
wird DNA oder vorzugsweise cDNA aus einer Zelle, die geeignet ist,
das schweine-adipozyte
Polypeptid-Gen zu expremieren, extrahiert und aufgereinigt. Die
aufgereinigte cDNA wird fragmentiert (durch Zerschneiden, Endonuklease
Aufschluss etc.), um einen Fundus von DNA oder cDNA-Fragmenten zu bilden.
Die DNA oder cDNA-Fragmente dieses Fundus werden dann in Expressionsvektoren
geklont, um eine genomische Bibliothek von Expressionsvektoren zu
erzeugen, dessen Mitglieder jeweils ein gleiches DNA oder cDNA-Fragment
aufweist.
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Ein „Expressionsvektor" ist ein Vektor,
der (aufgrund der Anwesenheit geeigneter Transkriptions- und/oder
Translations-Kontrollsequenzen) zur Expression eines DNA-(oder cDNA-)Moleküls befähigt ist,
das in einen Vektor geklont wurde und ein Polypeptid oder Protein
produziert. Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung können prokaryotisch
oder eukaryotisch sein. Beispiele geeigneter prokaryotischer Expressionsvektoren
umfassen pASK75 (Biometra) oder pET 21a-d (Novagen). Beispiele geeigneter
eukaryotischer Expressionsvektoren umfassen pcDNA3 oder pRc/RSV
(In Vitrogen, Inc.).
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Eine
DNA-Sequenz, die das schweine-adipozyte Polypeptid der vorliegenden
Erfindung oder ein funktionales Derivat hiervon kodiert, kann mit
Vektor DNA unter Einsatz herkömmlicher
Verfahren, wie sie durch Sambrook et al. (siehe oben) offenbart
werden, rekombiniert werden.
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Ein
Nukleinsäuremolekül, wie DNA,
wird als „zur
Expression einer Polypeptidfrequenz befähigt" angesehen, wenn es Nukleotidsequenzen
enthält,
die transkriptions- und translations-regulatorische Informationen enthalten,
und diese Sequenzen ausführbar
mit Nukleotidsequenzen verknüpft
sind, die das Polypeptid kodieren. Eine „ausführbare Verbindung" ist eine Verbindung,
bei der die regulatorische DNA-Sequenz und die zu exprämierende
DNA-Sequenz derart verbunden sind, dass eine Genexpression ermöglicht wird.
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Die
genaue Beschaffenheit der zur Genexpression benötigten Regulatorregion kann
von Organismus zu Organismus variieren, sollte jedoch in der Regel
eine Promotorregion umfassen, die bei Prokaryoten sowohl den Promoter
(der den Einsatz der RNA-Transkription festlegt) als auch die DNA-Sequenz
enthält,
die, wenn sie in RNA umgeschrieben wird, den Beginn der Proteinsynthese
bestimmt. Ein Promotor ist ein doppelsträngiges DNA- oder RNA-Molekül, das fähig ist,
an RNA-Polymerasen zu binden und die Transkription der ausführbar verbundenen
Nukleinsäuresequenz
vorantreibt. Die Promotersequenz nach der vorliegenden Erfindung
kann prokaryotisch, eukaryotisch oder viral sein. Starke Promoter
werden bevorzugt. Geeignete Promoter sind repressibel oder vorzugsweise
konstitutiv. Beispiele geeigneter prokaryotischer Promoter umfassen Tetracycline
(TetA) Promoter für
pASK75 und T7lac für
pET21. Beispiele geeigneter eukaryotischer Promoter umfassen Alpha
Actin oder Beta Actin. Beispiele für geeignete virale Promoter
umfassen Rous sarcoma oder cyotmegala.
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Ebenfalls
bereitgestellt wird ein für
ein Epitop des schweine-adipozyten Polypeptids spezifischer Antikörper und
der Einsatz derartiger Antikörper
zur Erfassung des Vorhandenseins oder Messung der Menge oder Kon zentration
des Polypeptids oder eines funktionellen Derivats desselben in einer
Zelle, einem Zellextrakt oder Gewebeextrakt oder einer biologischen
Flüssigkeit.
Vorliegend wird der Begriff „Epitop" auf einen Bereich
jedweden Moleküls
bezogen, der befähigt
ist, an den Antikörper
zu binden oder von dem Antikörper
erkannt zu werden. Epitope oder „antigene Faktoren" bestehen in der
Regel aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen, wie
Aminosäuren
oder Zuckerseitenketten, und haben spezifische dreidimensionale Struktureigenschaften
als auch spezifische Ladungseigenschaften. Ein Antikörper wird
als „zum
Anbinden an ein Molekül
befähigt" angesehen, wenn
er fähig
ist, spezifisch mit dem Molekül
unter Anbindung des Moleküls an
den Antikörper
zu reagieren.
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Das
schweine-adipozyte Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein
funktionales Derivat desselben, vorzugsweise mit wenigstens etwa
8 Aminosäuren,
wird als Antigen zur Induktion eines polyklonalen Antikörpers oder
monoklonalen Antikörpers
eingesetzt (mAb). Unter „Antigen" wird hier ein Molekül oder ein
Bereich eines Moleküls
verstanden, der an einen Antikörper
binden kann, und zudem befähigt
ist, ein Tier dazu zu veranlassen Antikörper herzustellen, die an das
Epitop des Antigens binden können.
Von der zuvor beschriebenen spezifischen Reaktion kann angenommen
werden, dass sie in hochselektiver Art und Weise anzeigen, dass
das Antigen mit dem korrespondierenden Antikörper reagiert und nicht mit
der Vielzahl anderer Antikörper,
die durch andere Antigene hervorgerufen werden.
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Der
Begriff „Antikörper" umfasst polyklonale
Antikörper,
monoklonale Antikörper
(mAbs) und chimäre Antikörper. Polyklonale
Antikörper
sind ein heterogener Bestand von Antikörper-Molekülen, die aus dem Serum von
Tieren erhalten werden, die mit dem Antigen immunisiert wurden.
Monoklonale Antikörper
bilden einen im wesentlichen homogenen Bestand von Antikörpern eines
spezifischen antigenen Epitops. MAbs sind durch den Fachmann bekannte
Verfahren erhältlich
(siehe z. B. Kohler und Milstein, Nature 256: 495–497 (1975)
und U.S. Pat. No. 4,376,100; de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol.
Methods, 35: 1–21
(1980); und Hartlow, E. et al., Antibodies: A Loboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988).
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Chimäre Antikörper sind
Moleküle
mit verschiedenen Bereichen, die von verschiedenen Tierspezies erhalten
wurden, wie die variierenden Bereiche, die aus Schweine-mAb und
einem Mäuse-Immonoglobin
konstanten Bereich erhältlich
sind. Chimäre
Antikörper
und Verfahren zu deren Herstellung sind aus dem Stand der Technik
bekannt (Cabilly et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273–3277 (1984);
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855 (1984);
Boulianne et al., Nature 312: 643–646 (1984); Neuberger et al.,
Nature 314: 268–270
(1985); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443 (1987);
Better et al., Science 240: 1041–1043 (1988)). Die Zitate werden
hiermit durch Verweis mit einbezogen.
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Der
Begriff „Antikörper" wird zudem derart
aufgefasst, dass er ganze Moleküle,
aber auch Fragmente derselben umfasst, wie beispielsweise Fab und
F(ab')2,
die Antigene binden können.
Fab und F(ab')2-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines
vollständigen
Antikörpers
und sie verschwinden sehr viel schneller aus dem Kreislauf und können eine
weniger spezifische Gewebsbindung als vollständige Antikörper besitzen (Wahl et al.,
J. Nucl. Med. 24: 316–325
(1983)). Derartige Fragmente werden üblicherweise durch proteolytische
Spaltung unter Verwendung von Enzymen wie Papain (zur Herstellung
von Fab-Fragmenten) oder Pepsin (zur Herstellung von F(ab')2-Fragmenten)
hergestellt.
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Die
Reaktion der Antikörper
und Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden durch aus dem
Stand der Technik bekannte immunologische Methoden erfasst (siehe
z. B. Hartlow et al., siehe oben). Die Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, die
Einsatz in der vorliegenden Erfindung finden, können zur quantitativen oder
qualitativen Bestimmung von Zellen genutzt werden, die das schweine-adipozyte
Polypeptidprotein expremieren. Dies kann durch Immun-Fluoreszenzverfahren
erreicht werden, bei denen ein fluoreszenzmarkierter Antikörper im
Zusammenspiel mit Mikro skopie, Fluss-Cytometrie oder fluorometrischen
Bestimmungen eingesetzt wird.
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Die
Antikörper
(oder Fragmente), die in der vorliegenden Erfindung nutzbar sind,
können
histologisch, über
Immun-Fluoreszenz oder Immun-Elektronenmikroskopie
zur in situ Detektion des schweine-adipozyten Polypeptids eingesetzt
werden. Eine in situ Untersuchung kann derart durchgeführt werden,
dass histologische Proben aus einem Schwein entfernt werden und
markierte Antikörper
der vorliegenden Erfindung derartigen Proben zugeführt werden.
Der Antikörper
(oder das Fragment) wird vorzugsweise derart bereitgestellt, dass die
markierten Antikörper
(oder Fragmente) einer biologischen Probe zugeführt oder appliziert werden.
Mit Hilfe eines derartigen Verfahrens ist es möglich, nicht nur das Vorhandensein
von schweine-adipozyten Polypeptiden zu erfassen, sondern es kann
auch deren Verteilung im untersuchten Gewebe bestimmt werden. Dem Fachmann
wird bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung gewahr sein,
dass er ein breites Spektrum an histologischen Verfahren (wie z.
B. Schnittverfahren) variieren kann, um derartige in situ Untersuchungen durchzuführen.
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Derartige
Untersuchungsverfahren für
schweine-adipozyte Polypeptide umfassen üblicherweise den Schritt der
Inkubation eines biologischen Präparats,
wie einer biologischen Flüssigkeit,
einem Gewebeextrakt, frisch präparierter
oder kultivierter Zellen, die adipogene oder adipozyte Zellen enthalten,
in der Gegenwart eines detektierbaren markierten Antikörpers, der
befähigt
ist, ein schweine-adipozytes Polypeptid zu identifizieren. Das Untersuchungsverfahren
umfasst auch den Schritt der Bestimmung des Antikörpers mittels
einer aus dem Stand der Technik bekannten Vielzahl von Verfahren,
wie Enzym-Immun-Untersuchungen (EIA oder ELISA) oder Radio-Immun-Untersuchungen
(RIA).
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Die
Antikörpermoleküle der vorliegenden
Erfindung können
auch dem Einsatz in immunometrischen Untersuchungen angepasst werden,
die auch als „two-site" oder „sandwich" Untersuchungen bekannt
sind. In ei ner typischen immunometrischen Untersuchung wird eine
Menge an unmarkierten Antikörpern
(oder Fragmenten des Antikörpers)
an einen festen Träger
gebunden (d. h. jeder Träger,
der befähigt
ist eine Bindung zum Antigen oder Antikörper aufzubauen) und eine Menge
an detektierbaren markierten löslichen
Antikörpern wird
zugesetzt, um eine Detektion und/oder Quantifizierung eines ternären Komplexes
zu ermöglichen,
der zwischen dem Festphasen-Antikörper, Antigen und markierten
Antikörper
gebildet wird.
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Die
Bindungsaktivitäten
einer gegebenen Anzahl von Antikörpern
zum schweine-adipozyten Polypeptid können mit Hilfe von bekannten
Verfahren bestimmt werden. Der Fachmann ist durch Abarbeitung routinemäßiger Experimente
bei jeder Bestimmung in der Lage optimale Bedingungen für die Durchführung und
Untersuchung zu finden.
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Bei
Einsatz von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren können Antikörper in
immun-affinitiven Säulen
zur Aufreinigung der schweine-adipozyten
Polypeptide der Erfindung in einem ,ein-Schritt'-Verfahren genutzt werden.
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Ein
Schwein, das zur Fettanlagerung neigt, kann mit dem schweine-adipozyten Protein
der vorliegenden Erfindung behandelt werden, um eine derartige Fetteinlagerung
zu limitieren. Die Behandlung kann im Zusammenspiel mit anderen
anti-adipogenen Therapien Anwendung finden. Eine typische Versuchsanordnung zur
Behandlung von Schweinen mit einer Neigung zur Fetteinlagerung umfasst
die Verabreichung einer effektiven Dosis eines schweine-adipozyten
Polypeptids über
einen Zeitraum.
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Die
schweine-adipozyten Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auf
jedem Wege, der das gewünschte
Ziel, vorzugsweise einer Veränderung
der Nahrungsaufnahme oder einer Beschränkung der Fetteinlagerung des
Objekts, erreicht, verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Verabreichung über verschiedene
parenterale Routen erfolgen, die nicht abschließend subkutane, intravenöse, intradermale,
intramuskuläre und intraperitoneale
Routen umfassen. Alternativ oder gleichzeitig kann die Verabreichung
auf oralem Wege erfolgen, z. B. durch den Einsatz von genetisch
veränderten
Futtermitteln, in welche das Leptin-Gen des Schweins insertiert
und expremiert wurde. Parenterale Verabreichung kann durch Bolusinjektion
oder graduale Perfusion über
die Zeit als auch durch Implantation einer osmotischen Abgabequelle
erfolgen. Präparate
für die
parenterale Verabreichung umfassen steriles Wasser oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen
die Hilfswirkstoffe oder Arzneistoffträger enthalten können, die
aus dem Stand der Technik bekannt sind. Pharmazeutische Zusammensetzungen,
wie Tabletten und Kapseln, können
ebenfalls entsprechend den üblichen
Verfahren hergestellt werden.
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Es
dürfte
klar sein, dass die Dosierung des verabreichten schweine-adipozyten Polypeptids
vom Alter, Geschlecht, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, der
Art der gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und
der Natur des gewünschten
Effekts abhängen
kann. Die am meisten bevorzugte Dosierung wird, so wie der Fachmann
die Sache erfasst und bestimmt, auf das individuelle Objekt zugeschnitten
sein. Die Gesamtdosis, die für
jede Behandlung benötigt
wird, kann in mehreren Dosierungen oder in einer einzigen Dosis
verabreicht werden. Das schweine-adipozyten Polypeptid der vorliegenden
Erfindung kann alleine oder in Kombination mit anderen Therapeutika
verabreicht werden, die in die Regulation der Fettablagerung eingreifen.
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Nach
einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Konzentration der schweine-adipozyten Polypeptide oder
mRNA dieser Erfindung in Zellpräparaten,
Gewebextrakten oder biologischen Flüssigkeiten des Objekts gemessen
und dient als ein Maß zur
Bestimmung der Anfälligkeit
oder der Neigung des Objekts zur Fetteinlagerung. Die Prädisposition
des Objekts steht im Bezug zum Gehalt des schweine-adipozyten Polypeptids oder
seiner mRNA. Zusätzlich
wird der Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus der
schweine-adipozyten Gene zur Vorhersage der Fetteinlagefähigkeit
genutzt.
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Die
Auswertung der Effektivität
eines Arzneimittels oder eines anderen Wirkstoffs – durch
Bezugnahme auf die Zunahme oder die Abnahme der Nahrungsmittelaufnahme
durch Messung der Fähigkeit
des Arzneimittels oder Wirkstoffs zur Stimulation oder Suppression
des schweine-adipozyten
Polypeptids oder von mRNA dieser Erfindung auf eine Zelle oder eine
Zelllinie, die befähigt
ist, derartige Polypeptide oder mRNA herzustellen – wird offenbart.
Bevorzugte Zellen, sind Zellen aus einer adipogenen Zelllinie. Die
Antikörper, cDNA
Proben oder Riboproben der vorliegenden Erfindung sind für Verfahren
zur Auswertung dieser Arzneimittel oder anderer Wirkstoffe nützlich,
da sie dazu eingesetzt werden können
die Menge der schweine-adipozyten Polypeptide oder mRNA's unter Einsatz einer
der oben genannten Immun-Untersuchungen zu bestimmen.
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Untersuchungen
zur Erfassung der Prädisposition
eines Schweins zur Fetteinlagerung werden offenbart, und basieren
auf der Erfassung der Menge der vorliegenden mRNA-Sequenzen, die
das schweine-adipozyten Polypeptid oder ein funktionelles Derivat
desselben kodieren, in einem Gewebe und in einer Flüssigkeit
des Objekts, vorzugsweise unter Einsatz von RNA-DNA Hybridisierungs-Untersuchungen.
Die Prädisposition
zur Fetteinlagerung steht in Beziehung mit der Menge derartiger
vorliegender mRNA-Sequenzen. Die Quelle der mRNA-Sequenzen für derartige
Untersuchungen ist vorzugsweise eine adipogene Zelle eines Schweins.
Eine bevorzugte Messtechnik zur Erfassung der mRNA-Menge ist eine
Hybridisierungs-Untersuchung von RNA (z. B. Ribonuclease Protection
Assay) und DNA (z. B. Northern oder Southern Blot-Untersuchungen)
mit komplementären
Basensequenzen.
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Untersuchungen
zur Nukleinsäurebestimmung,
insbesondere Hybridisierungs-Untersuchungen können für jedwede Eigenschaft des Nukleinsäuremoleküls, wie
seine Größe, Sequenz,
Neigung zum Aufschluss durch restriktive Endonuklease usw. vorhergesagt
werden. Die Sensivität
derartiger Untersuchungen kann durch Änderung der Wiedergabe oder
Signalweiterleitungen an den Untersucher erhöht werden. So kann z. B. die
Sensitivität
der Untersuchung durch den Einsatz detektierbarer markierter Reagenzien
erhöht
werden. Eine große
Vielzahl derartiger Marker wurde für diese Zwecke eingesetzt.
Kourilsky et al. (U.S. Pat. No. 4,581,333) beschreibt den Einsatz
von Enzymmarkern zur Erhöhung
der Sensitivität
in einer Bestimmungsuntersuchung. Radioisotope Marker werden von
Falkow et al. (U.S. Pat. No. 4,358,535) und ebenfalls durch Berninger
(U.S. Pat. No. 4,446,237) offenbart. Fluoreszenzmarker (Albarella
et al.,
EP 144 914 ),
chemische Marker (Sheldon III et al., U.S. Pat. 4,582,789; Albarella
et al., U.S. Pat. No. 4,563,417), modifizierte Basen (Miyoshi et
al.,
EP 119 448 ), etc.
wurden ebenso zur Steigerung der Effektivität derartiger Detektionen eingesetzt.
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Ein
Verfahren zur Überwindung
der Sensitivitätsbeschränkungen
bei Nukleinsäurekonzentrationen besteht
darin, vor der Durchführung
der Untersuchung selektiv die Nukleinsäuren zu verstärken, deren
Bestimmung erwünscht
ist. Rekombinante DNA-Verfahren, die dazu genutzt werden können gereinigte
Nukleinsäurefragmente
zu verstärken,
sind seit langem bekannt. Üblicherweise
beinhalten derartige Verfahren das Einschleusen des Nukleinsäurefragments
in einen DANN- oder RNA-Vektor, das klonale Verstärken des
Vektors und die Rückgewinnung
des verstärkten
Nukleinsäurefragments.
Beispiele für
derartige Verfahren werden von Cohen et al. (U.S. Pat. No. 4,237,224),
Maniatis, T. et al. etc. beschrieben.
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Kürzlich wurde
eine in vitro enzymatische Methode zur Erhöhung der Konzentration derartiger
gewünschter
Nukleinsäuremoleküle beschrieben.
Dieses Verfahren wird als Polymerase-Kettenreaktion oder „PCR" bezeichnet (Mullis,
K. et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263–273 (1986);
Erlich H. et al.,
EP 50 424 ;
EP 84 796 ,
EP 258 362 ; Mullis, K.
EP 201 184 , Mullis K. et al. U.S. Pat.
No. 4,683,202; Erlich, H. U.S. Pat. No. 4,582,788; und Saiki, R.
et al.; U.S. Pat. No. 4,683,194). Die Polymerase-Kettenreaktion
ist ein Verfahren zur selektiven Erhöhung der Konzentration bestimmter
Nukleinsäuresequenzen,
selbst wenn diese Sequenz nicht zuvor aufgereinigt wurde und lediglich
nur in einer einzigen Kopie in einer bestimmten Probe vorliegt.
Das Verfahren kann also sowohl zur Verstärkung von Einzel- als auch
von Doppelstrang-DNA genutzt werden. Der Kern des Verfahrens schließt den Einsatz
von zwei Oligonukleotid-Proben ein, die als Primer für die templat-abhängige, polymerase-vermittelte
Replikation eines erwünschten
Nukleinsäuremoleküls dienen.
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Nachdem
nun allgemein die Erfindung beschrieben wurde, soll dieselbige noch
eingehender unter Bezugnahme auf die folgenden Ausführungsbeispiele
erläutert
werden, die zur lediglich Illustration und nicht dazu dienen sollen
die vorliegende Erfindung zu beschränken, sofern nicht explizit
ausgeführt.
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Beispiel I
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Isolation
der Leptin cDNA des Schweins
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Das
mutmaßliche
Sekret des Schweineleptin-Produkts wurde unter Einsatz reverser
Transkriptions-Polymerasen-Kettenreaktionen aus adiposer Gewebs
mRNA verstärkt.
Es wurden unter Einsatz von 1–2 μg einer schweine-adiposen
Gewebs-RNA oder 1–2 μg einer Poly
A + mRNA, 150 pmol eines randomisierten hexameren Oligonukleotid,
500 nM dNTP, 200 U von MMLV RNase H– reverser
Transkriptase (Life Technologies, Inc.) in 20 μl eines bereitgestellten Puffers
vier separate cDNA-Synthesereaktionen
durchgeführt.
Die Reaktionen wurden für
eine Stunde bei 37°C
durchgeführt
und durch 10 Minuten langes Aufheizen auf 70°C beendet. Das Leptin cDNA Produkt
wurde mittels PCR vermehrt, wobei die folgenden degenerativen Oligonukleotid-Primer
mit restriktiven Seitenkettenverknüpfern für BamHI/Bsa I und EcoRI/Eco47
III eingesetzt wurden:
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-
-
Die
Oligonukleotid-Primer wurden unter multiplen Sequenzabgleich mit
Maus und Human cDNA-Sequenzen erhalten. Etwa 100 ng der adiposen
Gewebs-cDNA wurde als Vorlage einem 50 μl PCR Reaktionsgemisch zugegeben,
das im Herstellerpuffer 100 pmol jedes Primers und 2,5 U der Taq
DNA Polymerase (Life Technologies, Inc.) enthielt. Eine dreistufige
Verstärkungssynthese
wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Stufe 1 – 95°C, 3 min;
52°C, 1
min, 72°C,
1 min, 1 Zyklus; Stufe 2 – 94°C, 45 s;
52°C, 45
s, 72°C, 1
min, 4 Zyklen; Stufe 3 – 94°C, 45 s;
55°C, 30
s, 72°C
1 min. 28 Zyklen. Die cDNA-Vorlage aus drei von vier cDNA-Reaktionen
lieferte ein 466 bp Produkt.
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Das
PCR-Produkt wurde für
die Einbindung in den Protein-Expressionsvector
pASK75 (Biometra Inc.) durch vollständigen Aufschluss mit Eco47III
und teilweisen Aufschluss mit Bsa 1 vorbereitet. Das durch die Restriktionsenzyme
aufgeschlossene PCR-Produkt wurde mittels Elektrophorese in niedrig
schmelzender Agarose aufgereinigt und ein 437 bp Produkt wurde aus
dem Gel isoliert und in den Vektor eingebunden. Die Einbindungen
wurden in E. coli XL1-Blue (Stratagene Inc.) transformiert und auf
LB-Platten aufgebracht, die 50 μg/ml
Ampicillin zur Plasmidselektion beinhalteten. Zwölf E. coli Kolonien wurden
isoliert, die die cDNA der Schweineleptins enthielten und das DNA-Plasmid
wurde für
die DNA-Sequenzierung isoliert.
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1 gibt
die Nukleotidsequenz des Schweineleptin Gens mit 5.917 Basenpaaren
sowie die Aminosäurenübersetzung
der Leptin codierenden Sequenz wieder. Die Nukleotidsequenz und
die Aminosäuren-Sequenz
der gesamten Schweineleptid cDNA (d. h. das Signalpeptid und die
sekretierten Proteine) umfasst 501 Basenpaare und 167 Aminosäuren und
ist in 2 abgebildet. 3 zeigt
die Nukleotidsequenz und die Aminosäuren-Sequenz der Schweineleptin
cDNA, die sich allein auf das korrespondierende sekretierte Protein
bezieht und 435 Basenpaare sowie 145 Aminosäuren umfasst.
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Es
wurde eine 83%ige Übereinstimmung
zwischen der cDNA-Sequenz des Schweins und des Menschen und eine
76%ige Übereinstimmung
zwischen der cDNA-Sequenz des Schweins und der Maus, wie sie in 4 dargestellt
ist, gefunden.
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Beispiel II
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Isolation
einer mit der Schweineleptin cDNA korrespondierenden mRNA
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Die
Schweineleptin cDNA wurde als Probe zur Bestimmung der vollständigen Länge der
mRNA genutzt. Ein Northern-Blot, enthaltend schweine-adipose und rinder-adipose
poly A + mRNA, wie auch ob/ob mäuse-adipose RNA, wurde
von Dr. M. Spurlock von Purina Mills Inc. bereitgestellt. Der Blot
wurde mit einer [32P] dCTP markierten Schweineleptin
cDNA in einer Hybridisierungslösung
(HY; 0,9 M NaCl, 0,09 M Natriumcitrat, 0,05% ficoll, 0,05% Polyvinylpyrolidon,
0,05 BSA, 0,5% SDS, 0,1% Natriumpyrophosphat, 10 mM EDTA und 100
mg/ml ultraschallbehandelter Lachssamen DANN) bei 60°C für 15 Stunden
hybridisiert. Der Blot wurde gewaschen und zu einer 0,2 × SSC (0,03
M NaCl, 0,003 M Natriumcitrat) 0,1% SDS bei 60°C reduziert und auf einen Röntgenfilm
aufgetragen. Eine 3.090 pb Leptin mRNA wurde im schweine- und rinder-adiposen Gewebe und
eine 3.240 bp Leptin mRNA im ob/ob mäuse-adiposen Gewebe gefunden. Wie in 5 dargestellt, beinhalten
die Banden 1 und 2 die schweine-adipose Poly A + mRNA, die Bande
3 die gesamte adipose RNA eine Kontrollmaus und die Banden 4 und
5 die gesamte adipose RNA einer ob/ob Maus und Bande 6 die rinder-adipose
Poly A + mRNA.
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Beispiel III
-
Isolation eines mit dem
Schweineleptin korrespondierenden genomischen DNA-Klons
-
Die
Schweineleptin cDNA wurde ferner zum Screening einer Schweinegenom
DNA-Bibliothek eingesetzt. Insbesondere wurde eine Bibliothek des
Schweinegenoms, die 4,64 × 105 Rekombinate enthielt, die zuvor im SuperCos
1 (Stratagene, Inc.) hergestellt wurden, nach dem Schweineleptin
durchsucht. Es wurden insbesondere zwei Sätze replikater Filter für 2 h bei
60°C vorab
hybridisiert. Die Filter wurden über
Nacht mit [–32P] dCTP
markierten Proben bei 5 × 105 cpm pro ml einer Hybridisierungslösung bei
65°C hybridisiert.
Die Filter wurden nacheinander mit 2 × SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M Natriumcitrat),
0,5% SDS, 1 × SSC,
0,5% SDS und 0,2 × SSC
0,5% SDS gewaschen, wobei jeder Waschvorgang bei 60°C und für 30 min
durchgeführt
wurde. Positive Klone, die Signale auf beiden replikaten Filtern
zeigten, wurden aus den Agarplatten aufbereitet und einzelne Kolonien
wurden durch einen zweiten, niederdichtem Replikations-Beschichtungs-Schritt
und einen Hybridisierungsschritt isoliert. Ein Cosmid, bezeichnet
als Obg-361, wurde isoliert und hybridisierte mit der Schweine ob
cDNA Probe und hatte im Wesentlichen das gleiche Restriktionsenzym-Aufschlussmuster,
wie es in der Schweinegenom DNA gefunden wurde.
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6 gibt
das isolierte Cosmid Obg-361 wieder. Konkret geben die Banden 1
bis 4 das Agarosegel wieder, das Kb Molekularleitermassenmarker
(Bande 1), das durch Eco RI aufgeschlossene Cosmid Obg-361 (Bande
2), Hind III (Bande 3) sowie biotin-funktionalisierte Lambda/Hind
III Molekularmassenmarker (Bande 4) enthält.
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Eine
Southern-Blot Analyse des Gels der Banden 2 bis 4 wurde mit Schweineleptin
cDNA durchgeführt und
zeigte, dass die EcoRI Fragmente (Bande 5) und die Hind III Fragmente
(Bande 6) Leptinsequenzen enthalten. Bande 7 ist ein Lambda/Hind
III Molekularmassenmarker.
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Schweinegenom
DNA, die mit BAM HI (Bande 8), EcoRI (Bande 9) und Hind III (Bande
10) aufgeschlossen und mit einem Bsa I Fragment (300 bp) der Schweineleptin
cDNA hybridisiert wurde, zeigte äquivalente
Ban den, die Leptinsequenzen enthielten, und darauf hinwiesen, dass
das Schweineleptin-Gen im Cosmid Obg-361 isoliert wurde.
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Das
5.917 bp Hind III Fragment wurde in Bluescript II SK+ (Stratagene,
Inc.) subkloniert. Beide Stränge
der Sequenz wurden durch progressiv geschachtelte Aufschlüsse unter
Einsatz von Exonuclease III und Sojabohnen-Nuclease bestimmt. Die
Sequenzierungsreaktionen wurden mit Sequenase V2.0 durchgeführt. Diese
Sequenz hatte eine Länge
von 5.917 bp und enthielt den gesamten kodierenden Bereich in zwei
Exons (1). Es wurde eine 78,6%ige Übereinstimmung der Nukleotide
zwischen Schwein und Menschen sowie eine 71,2%ige Übereinstimmung
der Nukleotide zwischen schwein- und maus-kodierenden Sequenzen
gefunden. Die Bindestellen der beiden Exons wurden durch die cDNA-Sequenz bestätigt. Die
cDNA-Sequenz der protein-kodierenden Regionen ist in 2 dargestellt.
Die 501 bp Sequenz kodiert ein 166 Aminosäurereste langes Leptin-Polypeptid
mit einer geschätzten
Molekularmasse von 18.334 Da.
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Bei
der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Md. 20852-1776 am 11. Juli 1996 unter der ATCC Nr. 97653
ein Klon Obg H3-15, der unter Einsatz des zuvor beschriebenen Verfahrens
erhalten wurde, deponiert. Die Mikroorganismen wurden entsprechend
den Regelungen des Budapester Übereinkommens
für die
internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen
für die Zwecke
des Patentverfahrens hinterlegt. Alle Zugangsbeschränkungen
für die Öffentlichkeit
zum deponierten Material werden unwiderruflich mit Erteilung eines
Patentes fallen gelassen. Die Hinterlegung wird für einen Zeitraum
von 30 Jahren nach der Hinterlegung oder 5 Jahre nach der letzten
Nachfrage und nach dem Material, je nachdem welcher Zeitraum länger ist,
aufbewahrt.
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Beispiel IV
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Aufreinigung des Schweineleptin-Gen-Produkts
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Die
Polypeptidsequenz, die von der Schweineleptin cDNA kodiert wird,
wurde synthetisiert und unter Einsatz des Strep-Tag-Systems (Biometra,
Inc.) aufgereinigt. Das pASK-Plasmid enthält die ompA Kopfsequenz zur
Sekretion des Proteins in den periplasmischen Raum von E. coli,
als auch eine 10 Aminosäure-carboxyl-Endstelle,
die an Strepavidin zur Affinitäts-Chromatographie bindet.
Die Synthesen des Schweineleptin-Proteins in E. coli strain XL1-Blue
wurde mit 200 μg/l
Anhydrotetracyclin induziert und die Zellen wurden nach 3 h geerntet.
Die Proteine im periplasmischen Raum wurden durch osmotischen Schock
isoliert, indem die Zellen in 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM Sucrose,
1 mM EDTA und 0,02% NaN3 für 30 min.
bei 4°C
eingebracht wurden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation entfernt
und das Schweineleptin-Protein wurde von den periplasmischen Proteinen
durch die Strepavidin Affinitäts-Chromatographie,
wie in 5 dargestellt, getrennt.
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7 zeigt
eine Polyacrylamidgel-Elektrophorese des Schweineleptin-Proteins nach Induktion
und Aufreinigung in E. coli. Die Molekularmassenmarker befinden
sich in Bande 1. Bande 2 enthält
das gesamte Protein von XL-1 Blue und einer pASK/Ob Zell-Linie vor
(Bande 3) und nach (Bande 4) Induktion mit Anhydrotetracyclin. Das
durch Affinität
gereinigte Schweineleptin-Protein befindet sich in Bande 6.
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Beispiel V
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Antikörper für das Schweineleptin-Protein
und deren Verwendung zur Bestimmung des Schweineleptins in adipogenen
Zellen
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Polyklonale
und/oder monoklonale Antikörper
werden mit dem rekombinanten Schweineleptin-Protein hergestellt.
Die Verfahren zur Herstellung, Suche, Detektion und/oder Vermehrung
von Antikörpern
für Schweineleptin
sind ausführlich
dargestellt in „Antibodies:
a Laboratory Manual" (Harlow
et al., 1988, Cold Spring Harbor laboratory). Alle Medien oder Medienkomponenten,
Mäuse-
oder Zellstämme
(d. h. BALB/C Maus, sp2/0 Myloma-Zellen, JA744A.1 Makrophagen usw.)
sind kommerziell erhältlich.
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A. Immunisierung von Tieren
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1. Kaninchen
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Aufgereinigtes
Schweineleptin-Protein wird zur Produktion polyklonaler Antikörper in
Kaninchen injiziert. Konkret erhält
jedes Kaninchen subkutane Injektionen mit Freund's vollständigen Antigen-Hilfsmitteln, gefolgt
von wenigstens einer Verstärkungsinjektion
mit etwa 200 μg–1 mg. Wenn
der Titer des Serums der immunisierten Kaninchen bei Tests mit dem
Schweineleptin als Antigen ausreichend hoch ist, wird das Kaninchenserum
als polyklonales Antiserum für
Schweineleptin geerntet.
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2. BALB/C Maus (4 Wochen
alt)
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Das
aufgereinigte Schweineleptin-Protein wird in die BALB/C Maus zur
Herstellung monoklonaler Antikörper
injiziert. Konkret wird jeder Maus etwa 50 mg des Schweineleptin-Proteins
mit Ribi's S-TDCM
Hilfsmitteln (RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana)
injiziert. Die Anzahl der Injektionen hängt von dem Titer der Antikörper im
Serum der immunisierten Maus ab und wird nach ELISA unter Nutzung
des Schweineleptins als Antigen bestimmt. Während der Produktion monoklonaler
Antikörper
gegen das Schweineleptin-Protein wird die Milz der immunisierten
Mäuse zur
Herstellung von Spleenocyten verwendet. Hybridoma-Zellen werden
durch Einleiten der Spleenocyten mit sp2/0 Myoloma-Zellen (behandelt
mit 8-azaguanin-haltigem
Medium) in Gegenwart von 50% PEG-1500
erzeugt. Hybridoma-Zellen werden in einem HAT-Selektionsmedium (Hypoxanthin, Aminopterin
und Thymidin) inkubiert. Nachfolgendes Screening nach positiven Klonen
erfolgt nach dem ELISA-Verfahren unter Verwendung des rekombinanten
Schweineleptins als Antigen. Positive Klone, die starke Anti-Schweinleptin-Antikörper bilden,
wurden bezüglich
Spezifität,
Subtype, Affinität, Bindestellen
usw. charakterisiert.
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Sofern
große
Mengen aufgereinigter Antikörper
benötigt
werden, können
die positive Klone im großen Maßstab kultiviert
werden und die Antikörper
können
aus dem Kulturüberstand
gereinigt oder in die intraperitoneale Kavität der BALB/C Maus zur Herstellung
von Asziten injiziert werden. Für
das letztere Verfahren werden etwa 1–2 × 106 Hybridomazellen
pro Maus benötigt
und dauert etwa 7–14
Tage. Größere Mengen
der Antikörper
können
dann aus dem Hydroperitoneum durch Ammoniumsulfat-Zusatz und Ionenaustausch-Chromatographie
(z. B. DEAE-Trisacryl M) aufgereinigt werden.
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Nachdem
die vorliegende Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, dürfte dem
Fachmann klar sein, das gleiche Ergebnisse über einen breiten Bereich äquivalenter
Parameter, Konzentrationen und Bedingungen ohne wesentliches Abweichungen
vom Kern und Umfang der vorliegenden Erfindung sowie ohne unzulässig hohen
Experimentalaufwand erreichbar sind.
