DE69725866T2

DE69725866T2 - Festphasen-synthese

Info

Publication number: DE69725866T2
Application number: DE69725866T
Authority: DE
Inventors: Marek Kwiatkowski; Mats Nilsson; Ulf Landegren
Original assignee: Quiatech AB
Current assignee: Quiatech AB
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2017-08-28
Also published as: EP0925306B1; US20050027116A1; EP0925306A1; ES2210555T3; US20020177698A1; DE69725866D1; WO1998008857A1; JP2001505543A; US6291669B1; US20020035247A1; US6429309B1; CA2264154A1; US6646118B2; SE9603171D0; ATE253074T1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trägersystem für die Festphasensynthese von Oligomeren, wie Oligonucleotiden. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zu Synthese von Oligonucleotiden auf einem festen Träger.
Hintergrund der Erfindung
Oligonucleotide sind Polymere, die gebildet werden durch Polykondensation von Ribonucleosid(RNA)- oder Desoxyribonucleosid(DNA)phosphaten.
Oligonucleotide können zusammengesetzt werden durch wiederholte Addition von Nucleotidmonomeren unter Verwendung von Festphasenverfahren. Seit der Einführung der Festphasensynthese [R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) 2149], sind die folgenden Anforderungen ausgearbeitet worden: (1) Der feste Träger muss in dem verwendeten Lösungsmittel unlöslich und vorzugsweise nicht quellfähig sein. (2) Funktionelle Gruppen auf dem festen Träger müssen ein kovalentes Binden des ersten Nucleosids auf eine reproduzierbare Weise erlauben. (3) Der feste Träger muss chemisch inert sein gegenüber allen während der Synthese und des Entschützens verwendeten Reagenzien. Die am häufigsten üblicherweise verwendeten Träger sind porenkontrollierte Glasperlen (CPG), Siliciumdioxid oder Polystyrolperlen.
Nachfolgend wird der Synthesezyklus des üblicherweise verwendeten Phosporamidit-Verfahrens beschrieben

1. Entschützen der 5'-Hydroxylgruppe, um die Hydroxylstammverbindungen zu erzeugen. Dies wird normalerweise durch eine Behandlung des Trägers mit Di- oder Trichloressigsäure in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt (zur Entfernung von Schutzgruppen)
2. Der Träger wird gewaschen, um Spuren der Säure zu entfernen.
3. Die 5'-Hydroxylgruppe wird mit der 3'-Phosphoramidit-Gruppierung eines geeignet geschützten eintreffenden Nucleotids (A, C, G oder T) in der Anwesenheit eines Aktivators (z. B. Tetrazol) umgesetzt, um einen 3'-5'-Phosphittriester zu bilden.
4. Überschüssige Reagenzien werden entfernt, indem man mit einem geeigneten Lösungsmittel wäscht.
5. Nicht umgesetzte 5'-Hydroxylgruppen werden als Acetate blockiert (Capping).
6. Das Capping-Reagens wird durch Waschen entfernt.
7. Der Phosphittriester wird dann zu dem entsprechenden Phosphattriester oxidiert. Dies wird normalerweise durch die Wirkung von wässrigem Iod bewirkt.
8. Die Oxidationsreagenzien werden durch Waschen entfernt.

Das Verfahren wird wiederholt, bis die gewünschte Oligonucleotidsequenz synthetisiert worden ist. Nach der Synthese werden alle Schutzgruppen entfernt und das Oligonucleotid von dem festen Träger abgespalten.
Bei der Synthese werden defekte Oligonucleotide hergestellt als Folge mehrerer Effekte, hauptsächlich einer vorzeitigen Beendigung der Synthese, gefolgt von einem Capping, was zu 5'-abgetrennten Molekülen führt, und einer Depurinierung während der Synthesezyklen, gefolgt von einer Strangspaltung während des Entschützens. Kürzlich wurde die Aufmerksamkeit auch auf das Auftreten von kürzeren, intern gelöschten Produkten gerichtet – sogenannt n-1- und n-2-Fragmenten [Temsamani et al, (1995), Nucleic Acids Research 23 (11), 1841–1844]; [Fearon et al, (1995) Nucleic acids Res., 23 (14), 2754–2761].
Der Notwendigkeit für reine Oligonucleotide wird beispielhaft angegeben durch den Bedarf an Qualitätserzeugnissen in der Antisens-Therapie [Gelfi et al, (1996), Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 6, 47–53], in routinemäßigen Diagnostikanwendungen, oder für physikalisch-chemische und strukturelle Untersuchungen [Agback et al, (1994) Nucleic Acids Res, 22 (8), 1404–12]. Auch reduzieren verunreinigte Oligonucleotide häufig die Effizienz beim molekularen Klonen und komplizieren die Interpretation von Ergebnissen [McClain et al, (1986) Nucleic Acids Res. 14 (16), 6770]; [Nass al, (1988) Gene, 66 (2), 279–94].
Die präparative Gelelektrophorese stellt die beste Auflösung zur Reinigung von Oligonucleotiden zur Verfügung. Das Verfahren ist jedoch mühselig, führt oft zu erheblichem Verlust an Material und ist schlecht für eine Automation und Maßstabsvergrößerung geeignet.
Die chromatographische Trennung kann einige dieser Probleme lösen, bietet ein Potential zur Maßstabsvergrößerung mit minimalen Verlusten und unter Verwendung völlig automatisierter Instrumente. Diesem positiven Aspekte stehen die ziemlich schlechten Trennleistungen der meisten chromatographischen Systeme gegenüber. Als eine teilweise Lösung dieses Problems wurde die chromatographische Trennung von mit Affinity-Tags markierten Oligonucleotiden verwendet. Die üblicherweise verwendete Trityl- oder Oligonucleotid-Trennung auf Umkehrphasensäulen, oder der Einfang von 5'-Thiol-markierten oder biotinylierten Oligonucleotiden auf entsprehenden Thiolaffinitätssäulen [Bannwarth et al, (1990), Helv. Chim. Acta, 73, 1139–1147] oder Avidinsäulen [Olejnik et al, (1996), 24 (2), 361–366] bieten die Möglichkeit, Fragmente mit intaktem 5'-Enden zu isolieren. Jedoch verunreinigt der 5' Teil entpurinierter Moleküle notorisch die durch dieses Verfahren gereinigten Oligonucleotide.
Ein schwach basisches System wurde vorgeschlagen für das partielle Entschützen und die Abspaltung von apurinischenen Stellen, wobei die Oligonucleotide weiterhin am festen Träger gebunden sind. Auf diese Weise können die 5'-Enden der entpurinierten Moleküle verworfen werden bevor die Oligonucleotide vom Träger abgelöst werden, gefolgt von einer Isolierung von Molekülen mit intakten 5'-Enden [Horn et al, (1988), Nucleic acids Res, 16 (24), 11559–71]. In der Praxis wurde diese Strategie von einem wesentlichen Verlust an Produkten aufgrund ungewollter Freisetzung von Oligonucleotiden während der Abspaltung von entpurinierten Stellen begleitet.
In WO 92/09615 wird die Verwendung einer Alkoxysilylgruppe als ein Linker des Oligonucleotids an den Träger beschrieben.
Dieser Linker ist während der Synthesezyklen inert und widersteht Bedingungen, die apurinische Stellen abspalten. Der Linker wird schließlich mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) von dem festen Träger abgespalten, um nach einer Umkehrphasentrennung von DMTr-enthaltem Material ein Oligonucleotid zu erhalten, bei dem sowohl die 3'- als auch 5'-Enden intakt sind. Jedoch war die Synthese dieses Trägers umständlich und beschwerlich. Aufgrund einer geringen Reaktivität der funktionellen Gruppe des Linkers wird der Grad der Substitution des Trägers gering, was zu ungenügenden Nucleosidbelagungen des Trägers führt. Somit ist dieses Verfahren nicht zur Herstellung eines Trägers geeignet, der für eine Synthese im großen Maßstab brauchbar ist.
WO 93/13320 betrifft einen festen Träger für Oligomere, bestehend aus einem Siliciumdioxidträger, einem Linker, der eine Siliciumdioxidbindung Si-O-Si, die keine Disiloxylverknüpfung ist, umfasst, und einem Oligomer. Die Siliciumdioxidbindung wird nie abgespalten und es werden keine freien OH-Gruppen erzeugt.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Trägersystem zur Festphasensynthese von Oligomeren zur Verfügung. Das Trägersystem umfasst einen Träger, einen Linker und eine Ausgangsverbindung des Oligomers. Die Ausgangsverbindung wird über einer Disiloxylverknüpfung an den Träger gebunden. Die Disiloxyl-Funktion wird mit einer Hydroxylgruppe auf dem Träger verbunden. Die mit der Disiloxylgruppe verbundenen funktionellen Gruppen sind sehr reaktiv, was eine reproduzierbare und kontrollierte Beladung der Ausgangsverbindungen ermöglicht.
Das Trägersystem der Erfindung ist leichter herzustellen als vergleichsweise Systeme nach dem Stand der Technik, und stellt hohe Beladungen des Trägers zur Verfügung. Gemäß der Erfindung werden hohe Beladungswerte für das Ausgangsnucleosid erhalten. Diese Beladungen, die oft höher als 200 μmol/g betragen, sind für eine kosteneffiziente Synthese im großen Maßstab erforderlich.
Die Verknüpfung ist während der Synthesezyklen inert und widersteht Bedingungen, die apurinische Stellen abspalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Ausgangsverbindung ein Nucleosid und wird die Festphasensynthese zur Synthese von Oligonucleotiden verwendet.
Träger mit immobilisierten Oligonucleotiden können als Hybridisationsaffinitätsmatrizen verwendet werden. Einige Einsatzmöglichkeiten solcher Träger sind: Reinigung von DNA-Bindungsproteinen, Affinitätsreinigung von Plasmiden, als ein Träger zur Genmontage (aus Oligonucleotiden) und für Diagnosezwecke etc.
In dem neuen Trägersystem der vorliegenden Erfindung wird das erste Nucleosid an den Träger über einer Disiloxylverknüpfung gebunden, und das System wird vorzugsweise durch die folgende Formel (I) dargestellt
wobei
B eine Nucleosid- oder Desoxynucleosidbase ist;
R₂ gleich -H, -OH oder OR₇ ist, wobei R₇ eine Schutzgruppe ist;
R₁ eine Schutzgruppe ist;
R₃, R₄, R₅, R₆ für sich genommen jeweils Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, Alkenyl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, Alkyloxy, Aryloxy, Cycloalkyloxy, Alkenyloxy und Aralkyloxy darstellen;
Supp ein fester Träger ist;
X eine Ankergruppe ist, die für eine kovalente Bindung zum Träger verwendet wird;
(p-Y)_n und (p-Z)_m Oligophsphorsäuretriester-Linker sind, wobei p einen Phsphorsäuretriester darstellt, Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus einem Nucleosid und einem Rest eines Diols, A eine aliphatische oder aromatische Gruppe ist, n eine Zahl zwischen 0–50, vorzugsweise 0–10 ist und k, 1, m jeweils eine Zahl von 0 oder 1 sind, mit der Maßgabe, daß wenn m und n gleich 0 sind, 1 und k dann gleich 0 sind, und mit der Maßgabe, daß wenn m = 1, dann k gleich 0 ist und X gleich 0 oder S ist.
Die Schutzgruppen R₁ und R₇ sind Schutzgruppen, die üblicherweise zum Schutz der 5'- und 2'-Position von Ribo- und Desoxiribonucleosiden verwendet werden. R₁ kann ausgewählt werden aus Trityl-, Monomethoxytrityl-, Dimethoxytrityl-, Pixyl- oder anderen höheren alkoxysubstituierten Tritylschutzgruppen. R₇ kann ausgewählt werden aus Tertbutyldimehylsilyl (TBDMS), Methoxytetrahydropyranoyl (MTHP), Tetrahydropyraranoyl, Methyl oder Allyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind R₃, R₄, R₅, R₆ Isopropyl. Die Wahl von R₃, R₄, R₅, R₆ wird bestimmt durch die Anforderungen des Disiloxyl-Linkers hinsichtlich Stabilität gegenüber Labilität. Es ist bekannt, dass diese Eigenschaften leicht durch die Modifizierung von elektronenabgebenden Parametern der Substituenten kontrolliert werden können.
X kann eine Ankergruppe sein, vorzugsweise 0, S oder eine Amidfunktion, vorausgesetzt, dass sie stabil ist gegenüber den bei der Synthese verwendeten Bedingungen und dem Reagens zur Abspaltung von apurinischen Stellen.
Die gleiche Bedingung gilt auch für den (p-Y)_n-Linker und (p-Z)_m. Somit gibt es keine anderen Beschränkungen für Y und Z.
Z ist beispielsweise ein Tetraethylenglykol-Rest.
Ein weiter Bereich an porösen wie auch nichtporösen festen Trägern kann als Träger im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Gruppe von bevorzugten Trägern schließt vernetzte Polystyrole, Siliciumdioxid, Polysaccharide, vernetzte Polysaccharide und verschiedene Gläser ein.
Wenn der Oligophosphotriester-Linker (p-Y)_n in der obigen Formel vorhanden ist, wird ein Träger bereitgestellt, der zu einer noch größeren Oligonucleotid-Reinheit führt als ohne dem Linker. Indem man die Träger durch eine Reihe von Synthesezyklen vor Zugabe des spaltbaren Disiloxyl-Linkers und der Synthese des gewünschten Oligonucleotids herstellt, werden jegliche nichtspezifische Synthesestellen neutralisiert. Dieser Linker ergibt einen verbesserten Kontakt zwischen dem Ausgangsnucleosid und einem eintreffenden Reagens und stellt sicher, dass auch Oligonucleotide, die von Stellen ausgehend, die nicht für eine Synthese am Träger gedacht sind, dennoch zur Herstellung des gewünschten Oligonucleotids beitragen.
Entsprechend einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Oligonucleotidsynthese auf einem festen Träger Supp zur Verfügung. Das Verfahren umfasst die Schritte:

(i) Herstellen eines wie oben definierten Trägersystems;
(ii) Kondensieren eines Nucleotids an das erste Nucleosid des Trägersystems, um ein Oligonucleotid zu synthetisieren;
(iii) Entfernen von allen Schutzgruppen an dem Oligonucleotid, mit Ausnahme der 5'-Schutzgruppe, und Abspalten der apurinische Stellen, die während des säurekatalysierten Entschützens gebildet werden;
(iv) Abspalten des Produktes in voller Länge von dem Träger; und
(v) Reinigen des Oligonucleotids.

In Schritt (i) wird ein Oligophosphotriester-Linker (p-Y)_n auf dem festen Träger synthetisiert und wird ein Ausgangsnucleosid über einen (p-z)_m-Linker und eine Disiloxylgruppe an den Linker gebunden.
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens wird die Disiloxylverknüpfung entsprechend bekannter Verfahren vor Schritt (v) selektiv abgespalten (Markiewicz W. T., 1979, Journal of Chemical Reserche (M) 0181-0197) mit einer Verbindung, die Fluoridionen enthält. Eine bevorzugte Fluorid-enthaltende Verbindung ist Tetraalkylammoniumfluorid. Tritylammoniumhydrogenfluorid ist ebenfalls geeignet. Die Reinigung wird durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung der 5'-Schutzgruppe als ein Affinitäts-Handle durchgeführt.
Entsprechend einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird Schritt (v) durch eine Exonuklease-Behandlung ausgeführt, wodurch nichtgeschützte Oligonucleotide verdaut werden. Diese Ausführungsform ist insbesondere geeignet für ein Synthese in situ, wo eine Chromatographie nicht möglich ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung wird nachfolgend in Zusammenhang mit einem experimentellen Teil und den beiliegenden Zeichnungen näher beschrieben:
1 zeigt Ausgangspunkte für eine Oligonucleotidsynthese mit oder ohne einen Oligonucleotid-Linker (14 bzw. 13) und dem Träger nach vollendeter Synthese (15).
2 zeigt die Ergebnisse einer Synthese eines Purin-reichen (GA)40-Oligonucleotids. A) Ein Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramm, das das Trityl-enthaltende Material zeigt. Das Produkt von einem Standardträger erscheint als ein viel breiterer Peak mit einem großen Anteil an Material, der später erscheint verglichenen mit dem scharfen und symmetrischen Peak des neuen Trägers. B) Von den Peaks in A gesammelte Produkte wurden 5'-markiert und auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt. Ein Autoradiogramm, das das Oligonucleotid zeigt, welches erhalten wird unter Verwendung eines Standträgers auf der Spitze und Material, das an dem neuen Träger darunter synthetisiert wurde. C und D) Dasselbe Gel wie in B wurde auf einem Phosphorimager (Molecular Dynamics) gescannt. Die Daten werden als Liniendiagramme mit einem Standardträger in C und dem neuen Träger in D dargestellt. Die n-1 und n-2-Peaks sind in C markiert.
3 zeigt eine Zirkularisierung einer 91-mer Padlock-Sonde. Der Begriff "Padlock-Sonde" bedeutet eine Sonde, die in der Lage ist, auf ihrer Zielsequenz zu Zirkularisieren und wird beschrieben in Nilson, M., Malmgren, H., Samiotaki, M., Kwiatkowski, M., Chowdahry, B. P. und Landergren U. (1994) Science, 265 (5181), 2085– 8, worauf hiermit verwiesen wird. Das Oligonucleotid wurde am 5'-Ende markiert und die beiden Enden wurden ligiert unter Verwendung eines Überschusses eines komplementären Oligonucleotides als Schablone. Die Umsetzung wurde unter Verwendung einer thermostabilen Ligase für mehrere Zyklen der Denaturierung und Ligation durchgeführt. Lane 1: keine Ligase. Lanes 2, 3 und 4: 1, 2 bzw. 3 Ligationszyklen. Alle Oligonucleotide in voller Länge (n) wurden in der ersten Runde der Ligation zirkularisiert.
Die Herstellung des Trägersystems gemäß der Erfindung kann gemäß dem nachfolgend dargestellten Schema 1 durchgeführt werden:
Schema 1
Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

1. Sylilierung der 5'-Dimethoxy-tritylierten und entsprechend geschützten Nucleoside unter Verwendung von 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan in trocknem Pyridin unter Zusatz von Imidazol.
2. Umsetzen des gebildeten Monochlorderivats (3) mit einem Diol, z. B. Tetraethylenglykol, um ein Derivat (4) zu erhalten.
3. Einführung einer Phosphoramidit-Funktion bei der freien Hydroxylgruppe, die sich am Ende des 3'-Linkers befindet.

Gemäß der Erfindung wurde das homobifunktionale, einfach verfügbare Reagens 1,3-Dichlor-1,1,2,2-tetraisopropyldisiloxan (2) (Schema 1) verwendet. Mit anderen Worten, das in der vorliegenden Erfindung verwendete Reagens besitzt zwei reaktive Funktionen, die eine hohe und kontrollierbare Substitution ermöglichen.
Es wurde ein Disiloxylrest als eine stabile Linker-Funktion zwischen einem Nucleosid und einem festen Träger verwendet. Die reaktiven Zwischenprodukte (3) oder (5) wurden in einem oder drei Schritten synthetisiert, jeweils entsprechend dem obigen Schema 1.
Es wurden keine Versuche durchgeführt, um das Zwischenprodukt (3) zu isolieren, weswegen die Silylierung von entsprechend geschützten Nucleosiden (1) unter Verwendung von nur einem geringen Überschuss an (2) durchgeführt wurde. Die Zugabe eines Überschusses eines Diols mit einer 13-Atome langen Kette (Tetraethylenglykol) resultierte in der Bildung eines unsymmetrischen Disiloxyl-Derivats (4), das anschließend für die Synthese des Phosphoramidits (5) verwendet wurde.
Die Erfindung benötigt einen Träger, der funktionalisiert ist mit Hydroxylgruppen, die durch nichthydroly sierbare Bindungen mit dem Träger verbunden sind. Mono R, Hydroxyalkyl-derivatisierte Polystyrolteilchen (von Pharmacia) wurden ohne Modifikationen verwendet. Die Derivatisierung von CPG fand gemäß den nachfolgenden Schema 2 statt.
Schema 2

a) Thionylchlorid, Ethanol;
b) γ-Butyrolacton, Triethylamin;
c) Dimethoxytritylchlorid, Pyridin;
d) NaOH, Triethylamin;
e) Isobutylchlorformiat;
f) Aminopropyl-CPG

Dieses Schema schließt die folgenden Umsetzungen ein:

a) Unter Rückfluss halten von 6-Aminohexansäure in trockenem Ethanol mit Zusatz von Thionylchlorid, um eine Veresterung der Carboxylgruppe zu erreichen.
b) Acylierung der Aminogruppe mit γ-Butyrolacton, um Verbindung (8) zu bilden.
c) Schutz der eingeführten Hydroxylgruppe mit einer Dimethoxytritylgruppe, durchgeführt mit DMTrCl in trockenem Pyridin.
d) Hydrolyse der Estergruppe mit NaOH und Bildung des Triethylammoniumsalzes der resultierenden Säure.
e) Aktivierung der Carboxylgruppe durch Herstellen eines gemischten Anhydrids nach Zusatz von Isobutylchlorformiat.
f) Kopplung des aktivierten Reagens an den CPG-Träger, der mit Amino-Funktionen derivatisiert ist, um den Träger (12) zu bilden.

Das CPG wurde durch herkömmliche Aminopropylsilanisierung aktiviert [Pon, (1993) In Agraval, S. (ed.), Methods in Molecular Biology. Protocols for Oligonucleotides and Analogs. Humana Press Inc.]. Vor einer weiteren Derivatisierung wurde der Amino-CPG-Träger mit Trichloressigsäure in Dichlormethan entsprechend Pon [Pon, (1993), siehe oben] behandelt. Die Verbindung (10) wurde, ausgehend von einer billigen 6-Aminohexansäure und γ-Butyrolacton in hoher Ausbeute hergestellt. Es wurde geeignet umgewandelt in das gemischte Anhydrid (11) in einer Umsetzung mit Isobutylchlorformiat, und wurde unmittelbar zur Kopplung an CPG verwendet, siehe Schema 2. Unter Verwendung verschiedener Verhältnisse an (11) und eines festen Trägers wurden Beladungen erhalten, die von 15 bis 60 γmol/g reichten,. Der derivatisierte Träger wurde gründlich mit Essigsäureanhydrid gecappt und mit Trimethylsilylchlorid TMSCl silanisiert.
EXPERIMENTELLE VERFAHREN
Porenkontrolliertes Glass (CPG) (1000 A) wurde von CPG Inc. (Fairfield, USA) erhalten und wurde aminopropylsilanisiert gemäß Pon et al. [Pon, 1993, siehe oben]. Vernetzte Polystyrolteilchen (10 μm Durchmesser), derivatisiert mit Hydroxylalkyl-Funktionen (Mono R) (von Pharmacia, Uppsala, Schweden).
Die Oligonucleotidsynthesen wurden entweder auf einem ABI 394 DNA-Synthesizer (Perkin Elmer) oder einem Gene Assembler Plus (Pharmacia Biotech-AB) Instrument durchgeführt. Die analytische Flüssigkeitschromatographie der synthetisierten Oligonucleotide wurde auf ein Hitachi-Merck La Chrom HPLC-System, das mit einer LiChrospher RP 18 (5 mm) Säule (Merck) ausgestattet war, und unter Verwendung eines linearen Gradienten des Lösungsmittels A: Acetonitril 5% v/v in Triethylammoniumacetat 0,1 M, pH 7,0, und Lösungsmittel B: Acetonitril 40% v/v in Triethylammoniumacetat 0,1 M, pH 7,0, durchgeführt. Die präparativen Trennungen wurden auf einem FPLC-System (Pharmacia Biotech-AB) unter Verwendung einer Pep RPC 10/10 Umkehrphasensäule (Pharmacia) und des obigen Lösungsmittelgradienten durchgeführt.
Beispiel 1
Synthese von Nucleosid-Derivaten
5'-Dimethoxytrityl-3'-O-1,1,3,3-tetraisopropyl-3-tetraethylenglykoloxydisiloxylthymidin (4) (B=T)
5'-DMTr-thymidin (1) (1,30 g, 2,3 mmol) und Imidazol (0,32 g, 4,8 mmol) wurden durch Coverdampfung mit trockenem Pyridin getrocknet und in 20 ml trockenem Pyridin aufgelöst. Es wurde 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (2) (0,75 g, 2,4 mmol) zugegeben und die Mischung während 3 Stunden bei 20°C umgerührt, um einen vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials zu erreichen. Zu der gebildeten Verbindung (3) (siehe Schema 1) wurde Tetraethylenglykol (3,9 g, 23 mmol) gegeben und die Mischung wurde während 6 Stunden gerührt. Die reine Verbindung (4) wurde als ein Öl (1,62 g, 72%) isoliert, gefolgt von einem standardmäßiges Aufarbeiten mit Bikarbonat, einer Extraktion mit Dichlormethan, einem Verdampfen der organischen Phase und einer Flashsäulenchromatographie.
¹H-NMR (CDCl₃) in ppm: 0,85–1,05 (m, 28 H), 1,43 (s, 3 H), 2,25–2,42 (m, 2 H), 2,85 (s, breit, 1 H), 3,27–3,52 (dd, 2H) , 3,54–3,76 (m, 12H), 3,79 (s, 3H), 3,80–3,85 (m, 2H), 4,09 (m, 1H), 4,68 (m, 1H), 6,40 (t, 1H), 6,83 (d, 4H), 7,23–7,40 (m, 9H), 7,63 (d, 1H), 9,19 (s, breit, 1H).
Die anderen drei Nucleosidderivate wurden auf eine ähnliche Weise erhalten.
Beispiel 2
Synthese von Phosphoramiditen
Synthese eines (2-Cyanoethyl)-N,N-diisopropylphosphoramidit (5) (B=T).
Das Thymidin-Derivat (4) (1,50 g, 1,53 mmol) wurde durch Coverdampfung mit Toluol (20 ml) getrocknet und in wasserfreiem Dichlormethan (15 ml) aufgelöst. Zu dieser magnetisch gerührten Lösung wurde trockenes Triethylamin (0,85 ml, 6,0 mmol) gegeben, gefolgt von 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylaminophosphochloridat (710 mg, 3,0 mmol). Nach 15 Minuten Rühren bei 20°C zeigte eine TLC den Verbrauch des gesamten Ausgangsmaterials und die Bildung eines einzelnen Produktes. Die Reaktionsmischung wurde schnell zwischen gesättigtem, wässrigen Natriumbicarbonat und Dichlormethan getrennt und mit Dichlormethan (2 × 50 ml) extrahiert. Der nach der Verdampfung der organischen Phase erhaltene Rückstand wurde durch Coverdampfung mit Toluol getrocknet und auf einer kurzen Silicagelsäule gereinigt, präpariert und eluiert mit CH₂Cl₂/Et₃N 9/1 v/v. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum eingedampft, mit trockenem Triethylamin coverdampft und im Hochvakuum getrocknet, um 1,57 g (87%) eines Öles zu ergeben; ³¹P-NMR (CDLl₃ + 2 Tropfen an Triethylamin) 148,61 ppm.
Die übrigen Amidite wurden wie oben hergestellt.
Beispiel 3
Konstruktion von Hydroxyalkyl-derivatisiertem CPG-Träger (14) (siehe 1)
Zur Derivatisierung von aminopropyliertem CPG wurde ein unsymmetrisches Anhydrid (11) (siehe Schema 2) verwendet. Der Substitutionsgrad wurde analysiert, basierend auf der DMTr-Kationenfreisetzung, wie beschrieben in [Gait, (ed) (1984) Oligonucleotide synthesis; a practical approach.. IRL Press]. CPG, das bis zum Ausmaß von 28 μmol/g derivatisiert war, wurde für weitere Experimente gewählt. Einige DNA-Synthesesäulen wurden mit diesem Träger geladen (jeweils ca. 10 mg), und sie wurden 10 Kopplungszyklen mit einem standardmäßigen Thymidinamidit unterzogen, gefolgt von einem Koppeln von einem der Nucleosidamidite (5), um den Träger (14) zu erhalten. Diese Träger wurden für die Oligonucleotidsynthese verwendet.
Beispiel 4
Konstruktion eines derivatisierten Polystyrolträgers
Verfahren A: Konstruktion des Trägers (13), 1
Mehrere Abschnitte eines vernetzten Polystyrolträgers (Mono R) (von Pharmacia) (0,50 g) wurden durch Coverdampfung mit Pyridin getrocknet und in Pyridin (2 ml) suspendiert. Es wurden verschiedene Volumina von Verbindung (3) (Schema 1), die mit einer 1 mmol Skala in Pyridin (10 ml) hergestellt wurden, siehe Beispiel 1 oben, zu den obigen Suspensionen gegeben und die Mischungen wurden bei 20°C während 2 Stunden geschüttelt. Alle aktivierten Stellen, die sich theoretisch bei der Umsetzung von nicht umgesetztem (2) mit dem festen Träger bilden könnten, wurden durch Zugabe von Methanol (5 ml) gequenscht. Nach 1 Stunde Schütteln wurde die Mischung filtriert, durch Waschen mit trockenem Pyridin getrocknet und zurück zu dem mit einem Stopfen verschlossenen Kolben übertragen, wo nicht umgesetzte Hydroxylgruppen mit Ac₂O/DMAP (4-Dimethylaminopyridin)/Pyridin während 2 Stunden gecappt wurden. Die Mengen an DMTr-Thymidin, die über die Disiloxylbindung (13) direkt an den Träger gebunden sind, wurden wie oben spektralphotometrisch überprüft.
Verfahren B: Konstruktion des Trägers (14), 1
Ein Polystyrolträger (10 mg), der mit Hydroxyalkylgruppen derivatisiert ist, wurde in Kassetten zur Synthese von Oligonucleotiden auf einem Gen-Assembler Plus Instrument (Pharmacia) gepackt. Diese verpackten Träger wurden einem Kopplungszyklus unterzogen, der ein standardmäßiges Thymidinamidit verwendete, das 5 Mal mehr verdünnt war als beim standardmäßigen Kopplungsverfahren empfohlen. Der Träger wurde auf der Maschine, die in einem manuellen Modus lief, umfassend gecappt (10 min). Unter den obigen Bedingungen ergaben die DMTr-Freisetzungsexperimente Werte, die mit jenen aus den ursprünglichen 0,2 μmol Trägern vergleichbar sind. Alle Träger wurden weiter derivatisiert durch Koppeln von 9 aufeinanderfolgenden Thymidin-Nucleotiden, gefolgt vom Koppeln des entsprechenden Amidits (5) aus Beispiel 2 oben. Diese Kopplungen wurden unter Verwendung von standardmäßigen Amiditkonzentrationen und Syntheseprotokollen durchgeführt .
Beispiel 5
Festphasensynthese von Oligodesoxynukleotiden (15), 1
Unter Verwendung des ABI 394 DNA-Synthesizers und von CPG-Trägern
Für die Oligonucleotidsynthese wurde der oben beschriebene CPG-Träger (14) verwendet. Alle Kopplungen wurden durchgeführt unter Verwendung von Amiditen, die an den exocyclischen Aminfunktionen durch eine Benzoylgruppe geschützt sind, unter vom Hersteller empfohlenen Bedingungen für eine 0,2 μmol Skala Synthese, mit der Ausnahme, dass die Nucleosidamidite mit der halben empfohlenen Konzentrationen verwendet wurden. Die endgültigen DMTr-Gruppen ließ man auf dem synthetisierten Oligonucleotid.
Synthese auf einem Gen Assembler (Pharmacia) unter Verwendung des Polystyrolträgers
Alle Synthesen wurden unter Verwendung von PAC-Amiditen (Pharmacia Biotech-AB) bei der 0,2 μmol Skala durchgeführt, entsprechend den Anweisungen des Herstellers und ohne Änderungen der empfohlenen Amiditkonzentrationen. Es wurden Träger, die gemäß Verfahren A (13) oder B (14) in Beispiel 4 oben konstruierten wurden, verwendet, siehe auch 1.
Eine normale maßstabgetreue Umsetzung von standardmäßigen Nucleosidamiditen oder dem modifizierten Amidit (5) mit Hydroxyalkyl-Polystyrol-Träger resultierte in einer sehr hohen Beladung. Eine quantitative Analyse der freigesetzten DMTr-Gruppe ergab Beladungen von soviel wie 250 bis 290 μmol/g. Auch ergaben Funktionalisierungen, bei denen ein Überschuss an Reagens (3) beteiligt war, einen relativ hohen Grad der Substitution. Eine Umsetzung von 0,5 mmol an (3) pro 1 g an festem Träger bei 20°C während 2 Stunden resultierte in einem Träger, der mit 180 μmol/g geladen war. Diese verhältnismäßig großen Zahlen waren eine Folge der hohen Dichte von Hydroxylgruppen an dem Träger und von der hohen Reaktivität der verwendeten Reagenzien. Solche in hohem Maße derivatisierten Träger sind wertvoll zur Synthese von kurzen therapeutischen Oligonucleotiden in großem Maßstab. Für die Synthese von relativ langen Oligonucleotiden mussten Maßnahmen ergriffen werden, um diesen hohen Grad der Substitution zu beschränken. Eine zufriedenstellende Beladung (38 μmol/g) konnte erhalten werden indem man nur 0,1 mmol an (3) pro 1 g an Träger verwendet. Eine. mehrfache Verdünnung von (5) unter die empfohlene 0,1 M Konzentration war das beste Verfahren zum direkten Einbau von (5) an den Polystyrolträger. Das gleiche Verdünnungsverfahren wurde für das erste standardmäßige Amidit angewandt, das zur Syn these der Polystyrolversion des Trägers (14) verwendet wurde. Allen oben beschriebenen Kopplungsreaktionen wurde gefolgt von einem umfassenden Capping-Verfahren, um jegliche nichtumgesetzte Hydroxylgruppen zu blockieren.
Beispiel 6
Entschützen und Reinigen der synthetischen Oligodesoxynukleotide
Es wurden je nach der Art des Trägers, der in der Synthese angewendet wurde, verschiedene Entschützungsverfahren verwendet.
CPG-verankerte Oligonucleotide.
Eine Spritze, die mit einer Mischung aus Et₃N/EtOH 1 : 1 v/v gefüllt war, wurde mit einer Kassette verbunden, die einen Träger zur Oligonucleotidsynthese enthielt. Eine Behandlung des Trägers mit Base, fand während 3 Stunden bei 20°C statt, mit der gelegentlichen Zugabe eines neuen Aliquots des Lösungsmittels zur Kassette. Der Träger wurde gewaschen mit Ethanol (2 ml), Wasser (2 × 2 ml), mit Acetonitril (3 × 2 ml) getrocknet, und nach dem Öffnen der Kassette würde der feste Träger auf eine Sarstedt Röhre mit Schraubverschluss übertragen. Es wurde Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) 0,5 M in trockenem Tetrahydrofuran (THF) (200 μl) zugegeben und die Mischung während 4 Stunden bei 20°C inkubiert. Die Abspaltung des Disiloxyl-Linkers konnte alternativ durchgeführt werden, wenn man während 30 min bei 65°C 200 ml an 0,5 M TBAF in trockenem DMF verwendete. Es wurde konzentrierter wässriger NH₃ (2 ml) eingebracht und die Mischung während 12 Stunden in einen Ofen mit 65°C gegeben. Nach einer teilweisen Konzentrierung wurde das Oligonucleotid auf einer NAP 10 Sephadex-Säule (Pharmacia Biotech-AB) entsalzt und durch HPLC auf einer RP 18 Säule analysiert.
Präparative Läufe wurden an einer FPLC durchgeführt unter Verwendung einer Pep RPC Umkehrphasensäule. Es wurde sorgfältig darauf geachtet, das hydrophobe Trityl-enthaltende Produkt nicht zu fraktionieren, sondern vielmehr den ganzen Peak zu sammeln, was sehr ähnlich ist zu Trennungen auf wegwerfbaren RP-Patronen (Sep-Pak, C18, Waters, USA). Nach einem Verdampfen wurde die endgültige Entfernung der DMTr-Gruppen durchgeführt unter Verwendung von wässriger 80%iger Essigsäure während 20 Minuten bei 20°C, mit nachfolgendem Verdampfen der Säure. Alternativ dazu wurden Oligonucleotide, die an ihrer 5'-Position durch das Tr-S Pphosporylierungsreagens phosphoryliert waren, schließlich entschützt entsprechend dem veröffentlichten Verfahren [Connoly, (1987) Tetrahedron Lett., 28 (4) , 463–466].
Polystyrolträger-verankerte Oligonucleotide.
Nach abgeschlossener Synthese wurde der Träger von der Kassette in eine Sarstedtröhre übertragen und während 90 Minuten bei 65°C einer Behandlung mit konzentriertem wässrigem NH₃ unterzogen. Nach dem Abkühlen wurden die Teilchen kurz zentrifugiert und die obere flüssige Phase entfernt. Der feste Träger wurde 3 Mal mit 2 ml Wasser gewaschen und getrocknet, indem man mit Acetonitril wusch. Es wurden zweihundert μl an 0,5 M TBAF in THF zugegeben und die Mischung während 4 Stunden inkubiert Schließlich wurde die Mischung mit 0,8 ml Wasser verdünnt und das Oligonucleotid wurde auf einer NAP 10 Sephadexsäule entsalzt. Die weiteren Entschützungs- und Reinigungsschritte folgen genau jenen, die für CPG-gebundene Oligonucleotide beschrieben sind.
Beispiel 7
Elektrophoretische Analyse von Oligonucleotiden
Elektrophoretisch zu analysierende Oligonucleotide wurden an ihrem 5'-Ende mit ³²P markiert unter Verwendung von Polynucleotidkinase in einem 50 μl Reaktionsvolumen von 50 mM KAc, 10 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HAc (pH 7,5), 10 μCi (g-³²P)ATP (3000 Ci/mmol) und 10 U Polynucleotidkinase (Amersham) bei 37°C während 30 min. Die Markierungsreaktion wurde gestoppt durch Entsalzen auf einem Sephadex G-50 Spinsäule, gefolgt von einer Inkubation bei 65°C während 5 min. Alle in dieser Untersuchung elektrophoretisch analysierten Oligonucleotide wurden mit einem 5'-Phosphat synthetisiert, um sicherzustellen, dass die abgespaltenen apurinischen Oligonucleotide mit der gleichen Effizienz markiert werden, wie die Moleküle mit voller Länge. Nach Trennung auf einem denaturierenden 6 Polyacrylamidgel wurde die Radioaktivität mittels Autoradiographie (Amersham Hyperfilm) aufgezeichnet oder für quantitative Messungen von Bandintensitäten auf einem Phosphorimager-Instrument (Molecular Dynamics) gescannt.
Beispiel 8
Purinreiche Oligonucleotide
Das Risiko einer Depurinierung eines Oligonucleotides wächst mit der Anzahl an Purinen und der Gesamtlänge des Oligonucleotids an. Eine erhöhte Menge an Purinen in einem Oligodesoxynucleotid ergibt eine hohe Wahrscheinlichkeit für dessen Depurinierung und des darauf folgenden Zusammenbruchs. Um die Fähigkeit des neuen Verfahrens aufzuzeigen, diese kurzen Sequenzen zu eliminieren, wurden zwei 81-mer (AG)₄₀T-Sequenzen parallel synthetisiert unter Verwendung von standardmäßigen beziehungsweise neuen CPG-basierenden Träger (14). Teilweise ent schützte 5'-DMTr-substituierte Oligonucleotide wurden mittels HPLC analysiert und isoliert. Beide Produkte wurden detrityliert, 5'-³²P kinasiert und elektrophoretisch auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt. Die in 2 dargestellten Ergebnisse zeigen die Überlegenheit der Erfindung im Vergleich mit dem Stand der Technik auf. Diese Überlegenheit konnte schon vorausgesehen werden durch einen Vergleichen der Gestalt des HPLC-Chromatogramms (A). Der viel breiterer Peak, der in der standardmäßigen Synthese erhalten wird, spiegelt die Anwesenheit der kürzeren und deswegen hydrophoberen tritylierten Fragmente wieder. Anhand der gescannten Darstellung der Geltrennung (B) wird deutlich, dass das gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisierte Produkt praktisch frei von allen abgeschnittenen und entpurinierten Sequenzen ist. Zudem enthält dieses Material eine wesentlich geringere Menge an n-1-Fragmenten [(D) im Vergleich mit (C)].
Beispiel 9
Zirkularisierung einer Padlock-Sonde
Ein 91-mer Oligonucleotid (M13C91: 5'-P-GCCTGCAGGTCGACTCTAGR(T)50CGGCCAGTGCCAAGCTTGCA-3') wurde gemäß der Erfindung synthetisiert, um zu testen, wie es als eine Padlock-Sonde funktionieren würde [Nilsson et al. (1994), siehe oben], die in der Lage ist, in Anwesenheit eines Oligonucleotidtemplates (M1350comp: 5'-TTTTTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTTTTT-3') und einer DNA-Ligase zu Zirkularisieren. Die Ligationsreaktion wurde durchgeführt unter Verwendung von 0,3 pmol einer 5'-markierten Sonde und 5,5 pmol an Template in einem Volumen von 10 μl 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 25 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM NAD, 0,01% Triton X-100 und 10 U an Tth-DNA-Ligase. Die Probe wurde einem, zwei oder drei Zyklen von 94°C während 15 Sekunden und 55°C während 10 min unterzogen. Die Umsetzungen wurden auf Eis gekühlt und gestoppt, indem man 10 μl an Beladungspuffer, der 50% Formamid und 10 mM EDTA enthält, zugibt, gefolgt von einer Inkubation bei 65°C während 10 min. Die Umsetzungen wurden wie oben auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert.
Das Ergebnis der Ligation wird in 3 gezeigt, die deutlich aufzeigt, dass alle Oligonucleotide mit voller Länge ebenso wie die meisten n-1-Produkte ligierbar sind, wie dies zu erwarten ist, wenn die Löschungen gleichmäßig durch die Sequenz verteilt sind. Es zeigt auch die Anwesenheit vieler kürzerer Produkte, die ligierbar sind und somit intakte 5'- und 3'-Enden besitzen, wodurch Löschungsereignisse von mehr als einem Nucleotid offenbar werden. Folglich müssen alle nichtligierenden kürzeren Sequenzen Löschungen enthalten, die eine effektive Hybridisierung zur Ziel-DNA verhindern.
Die vorliegende Erfindung liefert Produkte, die frei von gekürzten und nach einer Depurinierung gespalteten Fragmenten sind, wobei zudem die isolierten Produkte viele weniger n-1-Fragmente enthalten. Die Menge dieses n-1-Materials wurde in einer Untersuchung, die an einer kurzen 5-mer Sequenz und unter Verwendung eines standardmäßigen Syntheseprotokolls durchgeführt wurde ([Iyer et al., (1995), 14(6) 1349–1357]), auf ungefähr 3 bis 5 abgeschätzt. Indem man Pre-Cap-Verfahren entsprechend Iyer et al. und eine kurze Kontaktzeit des Ammoniaks mit dem CPG-Träger verwendete, war es möglich, diese Figur auf 1,5 bis 2% zu verringern. Im Gegensatz dazu wurde eine Menge an verunreinigenden n-1 Sequenzen in einem Experiment gemäß der vorliegenden Erfindung zur Synthese eines 20-mer verwendenden CPG-Trägers (14) von 1,9 gefunden.
Das Trägersystem der vorliegenden Erfindung ist nicht auf die oben beschriebene Festphasensynthese von Oligonucleotiden beschränkt. Eine andere beabsichtigte Möglichkeit ist deren Verwendung als ein Linker zwischen Träger und Hydroxyl-enthaltenden Komponenten in der kombinatorischen Chemie ([Plunkett et al, (1995), J. Org. Chem., 60(19), 6006–6007]).

Claims

Trägersystem für die Festphasensynthese von Oligonucleotiden, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgende Formel besitzt:
wobei B eine Nucleosid- oder Desoxynucleosidbase ist; R₂ gleich -H, -OH oder OR₇ ist, wobei R₇ eine Schutzgruppe ist; R₁ eine Schutzgruppe ist; R₃, R₄, R₅, R₆ für sich genommen jeweils Alkyl, Aryl, Cycloalkyl, Alkenyl, Aralkyl, Cycloalkylalkyl, Alkyloxy, Aryloxy, Cycloalkyloxy, Alkenyloxy und Aralkyloxy darstellen; Supp ein fester Träger ist; X eine Ankergruppe ist, die für eine kovalente Bindung zum Träger verwendet wird; (p-Y)_n und (p-Z)_m Oligophsphorsäuretriester-Linker sind, wobei p einen Phsphorsäuretriester darstellt, Y und Z unabhängig ausgewählt sind aus einem Nucleosid und einem Rest eines Diols, A eine aliphatische oder aromatische Gruppe ist, n eine Zahl zwischen 0–50, vorzugsweise 0–10 ist und k, 1, m jeweils eine Zahl von 0 oder 1 sind, mit der Maßgabe, daß wenn m und n gleich 0 sind, 1 und k dann gleich 0 sind, und mit der Maßgabe, daß wenn m = 1, dann k gleich 0 ist und X gleich 0 oder S ist.
Trägersystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Ankergruppe 0, S oder eine Amidfunktion ist.
Trägersystem nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ eine Trityl-, Monomethoxytrityl-, Dimethoxytrityl-, Pixyl- oder andere mit höherem Alkoxy substituierte Trityl-Schutzgruppe ist und B gleich Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil, Thymin oder Inosin ist.
Trägersystem nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R₃, R₄, R₅, R₆ gleich Isopropyl sind.
Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem festen Träger, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: (i) Herstellen eines wie in Anspruch 1 definierten Trägersystems; (ii) Kondensieren eines Nucleotids an das erste Nucleosid des Trägersystems, um ein Oligonucleotid zu synthetisieren; (iii) Entfernen von allen Schutzgruppen an dem Oligonucleotid, mit Ausnahme der 5'-Schutzgruppe, und Abspalten der apurinischen Stellen, die während des säurekatalysierten Entschützens gebildet werden; (iv) Abspalten des Produktes in voller Länge von dem Träger; und (v) Reinigen des Oligonucleotids.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (i) ein Oligophsphorsäuretriester-Lin ker (p-Y)n an dem festen Träger synthetisiert wird und daß ein Start-Nucleosid über einen (p-z)_m Linker und eine Disiloxylgruppe an den Linker gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Disiloxylverknüpfung selektiv gespalten wird mit Tetraalkylammoniumfluorid vor dem Schritt (v) und die Reinigung durch eine Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer 5'-Schutzgruppe als ein Affinitäts-Handle durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (v) durchgeführt wird durch Exonucleasebehandlung, wobei nichtgeschützte Oligonucleotide verdaut werden.