DE69722557T2

DE69722557T2 - Verwendung von Sericin als Antioxidantien und Tyrosinase-Inhibitoren

Info

Publication number: DE69722557T2
Application number: DE69722557T
Authority: DE
Inventors: Hideyuki Fukui-shi Yamada; Naozumi Sakai-gun Fuwa; Masakazu Takefu-shi Nomura
Original assignee: Seiren Co Ltd
Current assignee: Seiren Co Ltd
Priority date: 1996-11-08
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-11-08
Also published as: EP0841065A2; ES2201249T3; HK1005932A1; EP0841065B1; EP0841065A3; US6165982A; ATE242000T1; KR19980042150A; DE69722557D1; KR100478928B1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines neuen Antioxidans oder Tyrosinaseinhibitors, welcher auf verschiedenen Gebieten, zum Beispiel bei Nahrungsmitteln, Arzneimitteln und anderen eingesetzt werden kann. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines neuen Antioxidans oder Tyrosinaseinhibitors, welcher als aktiven Inhaltsstoff Sericin umfasst, ein aus dem Seidenraupenkokon oder Rohseide gewinnbares Protein.
Hintergrund der Erfindung
Vor kurzem wurde aus Forschungen auf dem Gebiet der Medizin, Biochemie und anderen vermutet, dass Krankheiten Erwachsener oder von den Gewohnheiten des täglichen Lebens verursachte Krankheiten, wie Herzinfarkt, Arteriosklerose, Zuckerkrankheit, Krebs, Gehirnschlag und dergleichen oder Hautkrankheiten, wie Hautflecken, Sommersprossen, Pusteln, Ekzeme und dergleichen zumindest teilweise von in vivo erzeugten und angereicherten Lipidperoxiden verursacht werden.
Um solche Probleme zu lösen wurden bislang durch Extraktion natürlicher Produkte, wie Pflanzen, Meeresprodukte, Mikroorganismen und dergleichen erhältliche Antioxidantien oder chemisch synthetisierte Antioxidantien vorgeschlagen. Als natürliche Antioxidantien wurden zum Beispiel Vitamin E (Tocopherol), Vitamin C (1-Ascorbinsäure) oder eine SOD (Superoxiddismutase; eines der in vivo Enzyme)-ähnliche Substanz, vorgeschlagen. Als synthetische Antioxidantien wurden auch phenolische Derivate, wie BHA (butyriertes Hydroxyanisol), BHT (butyriertes Hydroxytoluol) und dergleichen vorgeschlagen.
Im Falle natürlicher Antioxidantien jedoch, wie zum Beispiel SOD, hat dieses den Nachteil, dass es aufgrund seiner schwierigen Reinigung sehr teuer ist und als enzymatisches Protein beim Erhitzen deaktiviert werden kann. Obwohl auch andere antioxidative Proteine gefunden wurden, haben sie alle ähnliche Nachteile wie SOD. Es wurde angenommen, dass synthetische Antioxidantien bezüglich der Sicherheit Probleme haben. Es wurde insbesondere vermutet, dass BHA ein krebserregender Stoff ist. Bei der Verwendung für Nahrungsmittel wurden darüber hinaus viele von ihnen mengenmäßig ober der Umfang ihrer Verwendung beschränkt.
Viele der natürlichen und synthetischen Antioxidantien sind üblicherweise fettlöslich, und im Falle von natürlichen Antioxidantien, Vitamin E oder β-Carotin besitzen zum Beispiel eine starke Inhibitorwirkung für Lipidperoxide in vivo, haben aber wegen der geringen Löslichkeit in Wasser das Problem einer beschränkten Verwendung. Wasserlösliche Antioxidantien sind von ihrer Auswahl her beschränkt und es können zum Beispiel nur Vitamin C, Glutathion, Harnsäure, SOD, etc. aufgeführt werden.
Vitamin C und Glutathion können jedoch als Pro-Oxidans, d. h. als Oxidationspromotor in Gegenwart eine Metallions wirken, haben jedoch den Nachteil, dass sie dazu neigen unter bestimmten Bedingungen die Peroxidierung von Lipiden zu fördern. Harnsäure ist wasserlösfich, aber nur wenig wasserlöslich und kann, wenn sie sich in vivo anreichert, für Gicht oder Nierensteine verantwortlich sein.
Darüber hinaus war das Problem aufgetreten, dass nur wenige natürliche wasserlösliche Antioxidantien gefunden wurden, die eine hohe, mit Vitamin C vergleichbare, Peroxidinhibierung für Lipide aufweisen.
Tyrosinase ist ein Typ von Enzym, das die Aktivität von Monophenolmonooxygenase EC 1.14.18.1. aufweist. Das Enzym dieses Typs ist in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen weit verbreitet, typischerweise in Melanozyten, Stubenfliegen, Pilzen, Kartoffeln, Äpfeln, Neurospora, etc. Kürzlich wurde diese Art von Enzym aus verschiedenen Materialien hoch gereinigt und wird zum Beispiel aus dem Fruchtkörper von Pilzen durch Behandlung mit Aceton, Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Ionenaustausch oder Gelfiltration gereinigt. Das Molekulargewicht beträgt bei den vom Pilz abgeleiteten Enzym 119000, bei dem von häheren Pflanzen abgeleiteten Enzym 144000 oder beim von Neurospora abgeleiteten Enzym 33000 und sein Molekulargewicht kann je nach Herkunft beträchtlich schwanken. Alle diese Enzyme sind Kupfer-Enzyme, aber ihr Kupfergehalt kann unterschiedlich sein. Es ist gegenüber Substraten wie Monophenol oder o-Diphenol spezifisch, wobei insbesondere das von Tieren abgeleitete eine hohe Aktivität gegenüber DOPA aufweist und stark an der ersten Stufe der Biosynthese von Melanin beteiligt ist. Dies kann durch folgendes Reaktionsschema ausgedrückt werden: 1-Tyrosin + Dihydroxy-1-phenylalanin(DOPA) + O₂→ DOPA + DOPA-Chinon + H₂O
Melanin ist ein Pigment, das beim Menschen im Haar oder in der Haut verteilt und für die Bestimmung ihrer Färbung verantwortlich ist. Die Bildung von Melanin in der Haut ist eine der menschlichen Schutzfunktionen. Die Biosynthese von Melanin in Tieren kann wie folgt ablaufen: Bei der Aussetzung an Ultraviolette Strahlung wird zunächst die Tyrosinase, die sich in Melanosome von Melanozyten findet, aktiviert und als Folge davon DOPA und Dopa-Chinon biologisch synthetisiert, wie im vorstehenden Reaktionsschema dargestellt.
Anschließend wird das DOPA-Chinon seinerseits durch nicht-enzymatische Oxidation, Decarboxylierung und Kopplungsreaktion unter Bildung von Melanin polykondensiert. Nach der Entfernung aus dem ultravioletten Licht wird das Melanin infolge des Stoffwechsels in der Haut aus der Hornschicht abgetrennt um die Färbung der Haut zu erzeugen. Erfolgt zum Beispiel andererseits durch Aussetzen an eine hohe ultraviolette Strahlung eine Reizung, bleibt die Melanin bildende Funktion örtlich erhalten und die betreffenden Stellen der Haut bleiben geschwärzt und verursachen Pigmentierung und Flecken.
Auf dem Nahrungsmittelsektor verfärben sich zum Beispiel die Schalen von Schalentieren innerhalb kurzer Zeit, wenn die gefangenen Schalentiere tot sind. Werden Früchte und Gemüse, wie Äpfel, Yamwurzel oder Salat geschält oder geschnitten, verfärben sich ihre inneren Teile innerhalb kurzer Zeit. Diese Erscheinung wird durch die Aktivierung von Tyrosinase verursacht, die man in den Schalentieren oder Früchten und Gemüsen findet und die anschließende Bildung von Melanin als Reaktionsprodukt.
Um eine solche, durch Melaninbildung verursachte Pigmentierung und Fleckenbildung in der Haut zu verhindern, um eine kosmetische Bleichwirkung herbeizuführen oder die Verfärbung von Nahrungsmitteln zu verhindern, wurde bisher ein Inhibierungsmittel für die Tyrosinaseaktivität angewendet, um die Biosynthese von Melanin zu unterbinden. Als synthetische Tyrosinaseinhibitoren wurden zum Beispiel verschiedene Sulfitsalze und als natürliche Tyrosinaseinhibitoren Kojisäure, Placentaextrakt, Vitamin C, Cystein oder Extrakte mit Inhibitorwirkung für die Tyrosinaseaktivität, die sich von Pflanzen und dergleichen ableiten.
Es wurden jedoch einige Probleme für die Sicherheit des menschlichen Körpers vorhergesagt. Es besteht zum Beispiel die Gefahr, dass bei Sulfiten allergische Reaktionen beobachtet werden oder dass sich bei Verwendung von Sulfiten bei Schalentieren bei der Lagerung Formaldehyd entwickelt. Obwohl Natriumsulfit oder Natriumhydrogensulfit als Nahrungsmittelzusatzstoff zugelassen ist, wurden die Kriterien für seine Verwendung spezifiziert und auch ihr Rückstand in Nahrungsmitteln reglementiert.
Im Fall natürlicher Tyrosinaseinhibitoren, ist Kojisäwe zum Beispiel schwierig herzustellen und zu reinigen und daher teuer. Im Speziellen wird ein Stamm, welcher Kojisäure produzieren kann kultiviert, die Kojisäwe aus der Kulturbrühe, welche die Säure als Hauptbestandteil enthält, extrahiert und dann kristallisiert. Andererseits wurde beobachtet, dass manche Stämme, die Kojisäwe produzieren können, auch Aflatoxin produzieren könnten, welches eine stark krebserregende Aktivität besitzt und daher zu Sicherheitsproblemen führt. Placentaextrakt ist ebenfalls schwierig herzustellen und zu reinigen und daher auch teuer.
Im Fall von Vitamin C wird die enzymatische Oxidationsreaktion durch Tyrosinase (wie im vorstehenden Reaktionsschema dargestellt) durch die eigene Reduktionswirkung des Vitamins gesteuert. Danach wird Ascorbinsäure in Dehydroascorbinsäure umgewandelt und die Ascorbinsäure nimmt im Lauf der Zeit ab, so dass seine inhibierende Wirkung nicht aufrechterhalten werden kann. Im Fall von Cystein kann die inhibierende Wirkung nicht aufrechterhalten werden, weil Cystein selbst, in ähnlicher Weise wie Vitamin C, oxidiert wird und es den Nachteil hat, dass es sich schwarz verfärbt, wenn es oxidiert wird. Extrakte, die sich durch Extraktion von Pflanzen und dergleichen ableiten und die eine inhibierende Wirkung auf die Tyrosinaseaktivität ausüben sind aufgrund ihrer geringen Reinheit bezüglich ihrer chemischen Zusammensetzung schwierig zu identifizieren. Zusätzlich besteht die Möglichkeit, dass die Qualität des Extrakts von Charge zu Charge schwanken kann.
Darüber hinaus sind die meisten Inhibitoren für die Tyrosinaseaktivität fettlöslich und die wasserlöslichen Inhibitoren für die Tyrosinaseaktivität sind beschränkt verfügbar.
Zusammenfassung der Erfindung Die Erfindung hat die Verwendung einer Zusammensetzung zum Gegenstand, welche eine hohe Antioxidationswirkung und eine hohe Inhibitorwirkung für die Tyrosinaseaktivität besitzt, die eine hohe Sicherheit aufweist, weil sie von natürlichen Produkten abstammt, die selbst beim Erhitzen nicht deaktiviert wird, die leicht und preiswert hergestellt oder gereinigt werden kann und nur in einer einzigen hoher Reinheit wasserlöslich ist.
Gemäß dieser Erfindung wird für die Verwendung einer Zusammensetzung als Antioxidans und Inhibitor für die Tyrosinaseaktivität gesorgt, welche als aktiven Inhaltsstoff eine ausreichende Menge Sericin umfasst, um eine Antioxidationswirkung und eine Inhibitorwirkung auf die Tyrosinaseaktivität auszuüben.
Diese Erfindung hat auch die Verwendung von Sericin zur Herstellung eines Arzneimittels zum Gegenstand, welches eine Inhibitorwirkung auf Lipidperoxide bei der Behandlung von Herzinfarkt, Arteriosklerose, Zuckerkrankheit, Krebs oder Gehirnschlag ausübt.
Beschreibung der Erfindung im Einzelnen Als Sericin, das gemäß dieser Erfindung eingesetzt werden kann, wird vorzugsweise Sericin mit hoher Reinheit verwendet, das sich üblicherweise von Seidenraupenkokons oder Rohseide ableitet und ihre Hydrolysate einschließt.
Das Sericin, das gemäß dieser Erfindung eingesetzt werden kann, kann nach herkömmlichen Extraktionsverfahren aus Seidenraupenkokons oder Rohseide erhalten werden. Es kann zum Beispiel in Form eines einzelnen Proteins mit einer Reinheit von 90% oder höher nach folgendem Verfahren extrahiert werden.
Danach wird das in Seidenraupenkokons oder Rohseide enthaltene Sericin mit Wasser extrahiert und anschließend beispielsweise dem nachstehend detailliert beschriebenen Verfahren (1), (2) oder (3) unterworfen, um Sericin zu liefern.
Alternativ kann das erfindungsgemäß verwendbare Sericinhydrolysat aus Seidenraupenkokons oder Rohseide nach üblichen Extraktionsverfahren erhalten werden. Es kann zum Beispiel in Form eines einzigen Proteins (ein Peptid) mit einer Reinheit von 90% oder höher nach folgendem Verfahren extrahiert werden.
Danach wird das in Seidenraupenkokons oder Rohseide enthaltene Sericin extrahiert und mit einer Säure, einem Alkali oder einem Enzym teilweise hydrolysiert und dann zum Beispiel dem folgenden Verfahren (1), (2) oder (3) unterworfen, um ein Sericinhydrolysat zu liefern.

(1) Eine wässrige Sericinlösung wird mit einer organischen Säure oder einer anorganischen Säure, einem organischen Koagulierungsmittel oder einem anorganischen Koagulierungsmittel auf pH 3–5 eingestellt, um das Sericin auszufällen, das dann filtriert und getrocknet wird, um festes Sericin zu liefern.
(2) Eine wässrige Sericinlösung wird mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol oder Dioxan gemischt, um das Sericin auszufällen, das dann filtriert und getrocknet wird, um festes Sericin zu liefern.
(3) Eine wässrige Sericinlösung wird durch eine Dialysemembran geleitet, um die Substanzen, welche durch die Membran hindurch gehen zu entfernen, worauf die auf der Membran zurückbleibende Substanz getrocknet wird, um festes Sericin zu liefern.

Die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene freie Sericin-Base oder das Sericinhydrolysat können in beliebiger geeigneter Form verwendet werden, zum Beispiel in Form des angefallenen Feststoffs oder in Form einer in einem Lösungsmittel gelösten Lösung, vorzugsweise in einer in einem geeigneten Volumen Wasser gelösten wässrigen Lösung, gemäß der vorgesehenen Verwendung als Antioxidans oder Inhibitor für die Tyrosinaseaktivität.
Sericin oder sein Hydrolysat kann für Kosmetika, Nahrungsmittel, Nahrungsmittelzusatzstoffe, Arzneimittel für die äußerliche Anwendung, quasi-Arzneimittel, Arzneimittel, etc. verwendet werden, ähnlich den Antioxidantien oder Inhibitoren für die Tyrosinaseaktivität nach dem Stand der Technik.
Die zugesetzte Sericinmenge beträgt üblicherweise etwa 0 ~ 50 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,5 ~ 5 Gew.-%, zum Beispiel bei Kosmetika, Nahrungsmittelzusatzstoffen, Arzneimittel für die äußerliche Anwendung, quasi-Arzneimittel und dergleichen. Die zugesetzte Menge Sericin beträgt üblicherweise 0,1 ~ 100 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,5 50 Gew.% in Nahrungsmitteln. Sericin ist nicht giftig und besitzt eine überlegene Wasserlöslichkeit, so dass keinerlei Probleme bei der Spezifizierung auftreten würden, selbst wenn eine große Menge beigemischt oder eingenommen würde.
Eine Verabreichungsform für Kosmetika oder Arzneimittel kann zum Beispiel Cremes, Emulsionen, Grundlagen, Packungen, Lotionen, gel-, lösungs- oder stiftförmige Verabreichungsformen und dergleichen einschließen. Diese Verabreichungsformen können gegebenenfalls mit beliebigen geeigneten Komponenten abgewischt werden, die auf dem betreffenden Gebiet verwendet werden, wie Gleitmittel, Feuchthaltemittel, Verdicker, Konservierungsmittel, Emulgierhilfsmittel, Pigmente, pH-Regler, andere Wirkstoffe, Ultraviolettabsorber, Duftstoffe, etc.
Sericin oder sein Hydrolysat kann als Arzneimittel oral verabreicht werden. In diesem Fall ist die Dosis nicht besonders kritisch und es kann zum Beispiel eine Dosis von etwa 10 mg ~ 100 g/Tag verabreicht werden.
Als alternative Ausführungsform dieser Erfindung können zusammen mit Sericin oder seinem Hydrolysat in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung beliebige andere Wirkstoffe oder Zusatzstoffe verwendet werden, welche üblicherweise zu Antioxidantien oder Tyrosinaseaktivitätsinhibitoren nach dem Stand der Technik zugesetzt werden. Diese Komponenten sind nicht besonders kritisch und können gegebenenfalls zusätzlich zum Hauptwirkstaff, d. h. zu Sericin oder seinem Hydrolysat, zugesetzt werden.
Repräsentative Beispiele dieser Komponenten, welche auf dem Nahrungsmittelsektor zur Erzielung günstiger Ergebnisse begleitend eingesetzt werden können, werden hier nachstehend aufgeführt: Farbänderungsinhibitoren: Polyphosphorsäure oder ihre Salze, meta-Phosphorsäure oder ihre Salze, Phosphorsäure und ihre Salze, Zitronensäure oder ihre Salze, Kaliumaluminiumsulfat, Erythorbinsäure oder ihre Salze und dergleichen.
Antibakterielle Mittel und Konservierungsmittel: Benzoesäure oder ihre Salze, o-Phenylphenol und seine Salze, Biphenyl, Sorbinsäure und ihre Salze, Thiabenzazol, Dehydroessigsäure und ihre Salze, p-Oxybenzoesäurealkylester, Propionsäure und ihre Salze, Bleichpulver, unterchlorige Säure und ihre Salze, Fumarsäure, Glycin, Lysin, Anisextrakt und dergleichen.
Repräsentative Beispiele dieser Komponenten, welche auf dem Kosmetiksektor zur Erzielung günstiger Ergebnisse begleitend eingesetzt werden können, werden hier nachstehend aufgeführt:
Adstringierende Mittel: Zitronensäure und ihre Salze, Weinsäure und ihre Salze, Milchsäure und ihre Salze, Aluminiumchlorid, Kaliumaluminiumsulfat und dergleichen.
Antibakterielle Mittel und Konservierungsmittel; Benzoesäure, Natiumbenzoat, p-Oxybenzoesäureester, Distearylmethylammoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Lösungen von Alkyldiaminoethylglycinchlorid, Chlorhexidindihydrochlorid, o-Phenylphenol, Sensibilisierungsfarbstoff Nr. 101, Sensibilisierungsfarbstoff Nr. 201, Salicylsäure, p-Chlorphenol, Phenoxyethanol und dergleichen.
Kosmetische Bleichmittel: Ascorbinsäure und ihre Derivate, Schwefel, Placentaextrakt, Kojisäure und ihre Derivate, Glukosamin und seine Derivate, Hydroxyzimmtsäure und ihre Derivate, Glutathion und dergleichen.
Ultraviolettabsorber: β-Isopropylfuranonderivate, Urocaninsäure, Ethylurocanat, Oxybenzone, Oxybenzonsulfonsäure, Tetrahydrobenzophenon, Dihydroxydimethoxybenzophenon und dergleichen.
Feuchthaltemittel: Glycin, Threonin, Alanin, Kollagen, hydrolysiertes Kollagen, Vitronectin, Vibronectin, Keratin, Elastin, Gelee Royal, Chondroitinheparin und dergleichen.
Zellaktivatoren: Riboflavin oder seine Derivate, Pyridoxin oder seine Derivate, Nicotinsäure oder ihre Derivate, Pantothensäure oder ihre Derivate.
Entzündungshemmende Mittel und antiallergische Mittel: Azulen, Allantain, Aminocapronsäure, Indomethacin, Lysozymhydrochlorid, tert.-Aminocapronsäwe und dergleichen.
Fette und Öle: Sojabohnenöl, Leinsamenöl, Holzöl, Sesamöl und dergleichen.
Kohlenwasserstoffe: Flüssiges Paraffin, Vaseline, mikrokristalline Wachse und dergleichen.
Aliphatische Säuren: Stearinsäure, Linolsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure und dergleichen.
Alkohole: Laurylalkohol, Cetylalkohol, Stearylalkohol, Lanolinalkohol, hydrierter Lanolinalkohol, Oleylalkohol und dergleichen.
Ester: Decyloleat, Butylstearat, Myristylmyristat, Hexyllaurat, Isopropylpalmitat und dergleichen.
Grenzflächenaktive Mittel: Anionische Tenside, kationische Tenside, amphotere Tenside, nichtionische Tenside.
Duftstoffe: Menthol, Carvon, Eugenol, Anethol, Pfefferminzöl, Minzeöl und dergleichen.
Beschreibung spezieller bevorzugter Ausführungsformen
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele beschrieben:
Beispiel 1
1 kg aus Rohseide bestehendes Seidengewebe wurde in 50 l Wasser 2 Std. bei 95°C behandelt, um Sericin zu extrahieren Der resultierende Extrakt wurde durch ein Filter mit einer durchschnittlichen Porenweite von 0,2 μm filtriert, die Aggregate entfernt und das Filtrat durch eine Umkehrosmosemembran entsalzt, um eine farblose, klare Lösung von Sericin in Wasser mit einer Konzentration von 0,2% zu liefern. Diese wässrige Lösung wurde mittels eines Verdampfers auf eine Sericinkonzentration von etwa 2% konzentriert und dann gefriergetrocknet, um 100 g pulverförmiges Sericin (hier nachstehend als Sericin H bezeichnet) mit einer Reinheit von 95% oder höher und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100000 zu liefern.
Beispiel 2
1 kg aus Rohseide bestehendes Seidengewebe wurde in 50 l einer 0,2% wässrigen Natriumcarbonatlösung (pH 11 ~ 12) 2 Std. bei 95°C behandelt, um ein Sericinhydrolysat zu extrahieren. Der resultierende Extrakt wurde durch ein Filter mit einer durchschnittlichen Porenweite von 0,2 μm filtriert, die Aggregate entfernt und das Filtrat durch eine Umkehrosmosemembran entsalzt, um eine farblose, klare Lösung eines Sericinhydrolysats in Wasser mit einer Konzentration von 0,2% zu liefern. Dieser Extrakt wurde mittels eines Verdampfers auf eine Sericinkonzentration von etwa 2% konzentriert und dann gefriergetrocknet, um 100 g pulverförmiges Sericinhydrolysat (hier nachstehend als Sericin L bezeichnet) mit einer Reinheit von 90% oder höher und einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20000 zu liefern.
Prüfbeispiel 1
(1) Herstellung von Rattenhirn-Homogenisat
Zu 1 g unter Kühlung gelagertem Rattenhirn wurden 9 ml 0,075 M Phosphatpuffer (pH 7,5) zugegeben und das Gemisch unter Eiskühlung homogenisiert (hier nachstehend als Homogenisat bezeichnet).
(2) Inhibitorprüfung von in vivo Lipidperoxid
Zu 0,5 ml des oben erhaltenen Homogenisats wurden jeweils 3,5 ml 0,075 M Phosphatpuffer, welcher Sericin T bzw. Sericin H (pH 7,5) enthielt, zugegeben. Die Inkubation erfolgte 2 Std, bei 37°C, Nach Ablauf dieser Zeit wurden die betreffenden Sericinendkonzentrationen auf 0,02 ~ 0,5% eingestellt. Unmittelbar vor der Inkubation und nach der 2-stündigen Inkubation wurden jeweils 0,5 ml-Proben entnommen und dann mit TBARS(Thiobarbitursäure als Wirksubstanz), einem Indikator für den Lipidperoxidgehalt, dieser nach der TBA(Thiobarbitursäure Methode) bestimmt. Die oxidationsinhibierende Wirkung von Sericin wurde aus den ohne Sericinzugabe erhaltenen TBARS-Mengen und den bei Sericinzugabe erhaltenen TBARS-Mengen nach folgender Gleichung I berechnet und anhand der Inhibierungsrate bei der Zunahme des Lipidperoxids durch die Inkubation ausgedrückt. In allen Fällen dieses Prüfbeispiels und den folgenden Prüfbeispielen 2 ~ 5 wurden die Prüfungen 3-mal wiederholt und die Ergebnisse als Mittelwert des so erhaltenen numerischen Mittelwerts angegeben.
Gleichung I: Inhibierungsrate = (1 – A/B) × 100
A: Zunahme der TBARS-Menge bei Zugabe eines Lipidperoxidinhibitors (ein Antioxidans);
B: Zunahme der TBARS-Menge ohne Zugabe eines Lipidperoxidinhibitors (ein Antioxidans).
TBA-Methode
Einer 0,5 ml-Probe wurden 2,5 ml 8% Trichloressigsäurelösung und 2,0 ml Thiobarbitursäurelösung zugesetzt, das resultierende Gemisch gründlich gemischt und auf einem kochenden Wasserbad 15 min erwärmt. Das Gemisch wurde danach 10 min bei 2000xg zentrifugiert und zur Bestimmung der TBARS-Menge im Überstehenden die Absorption bei 535 nm bestimmt. Als Standard wurde 1,1,3,3-Tetraethoxypropan verwendet.
Täbelle 1
Wie Tabelle 1 zeigt, konnte nachgewiesen werden, dass sowohl Sericin L als auch Sericin H, Antioxidationswirkung besitzen. Es wurde nachgewiesen, dass Sericin mit beliebigem Molekulargewicht Antioxidationswirkung besitzt.
Prüfbeispiel 2
(1) Herstellung von Rattenhirn-Homogenisat.
Die Herstellung erfolgte in der gleichen Weise wie unter Prüfbeispiel 1 beschrieben.
(2) Inhibitorprüfung von in vivo Lipidperoxid
Zu 0,5 ml des vorstehend erhaltenen Homogenisats wurden jeweils 3,5 ml 0,075 M Phosphatpuffer, welcher Sericin L, Ascorbinsäure (Vitamin C) und Rinderserumalbumin enthielt, zugegeben. Die Inkubation erfolgte während 2 Std. bei 37°C. Die Endkonzentrationen von Sericin L, Acorbinsäure und Albumin wurde auf 0,01 ~ 1,0% eingestellt. Nach der Inkubation wurde nach der TBA-Methode eine TBARS-Menge bestimmt, ähnlich Prüfbeispiel 1, und Inhibitorraten anhand der Zunahme des Lipidperoxids bestimmt.
Tabelle 2
Wie Tabelle 2 zeigt, konnte bestätigt werden, dass der Grad der antioxidativen Wirkung von Sericin mit dem von Vitamin C vergleichbar ist, von dem man sagt, es habe eine intensive antioxidative Wirkung. Darüber hinaus wurde im Fall von Vitamin C als Nachteil festgestellt, dass die Oxidation im niedrigen Konzentrationsbereich von 0,01% beschleunigt werden kann, wohingegen eine solche Erscheinung im Fall von Sericin nicht beobachtet wurde.
Prüfbeispiel 3
(1) Herstellung von Rattenhirn-Homogenisat.
Die Herstellung erfolgte in der gleichen Weise wie unter Prüfbeispiel 1 beschrieben.
(2) Inhibitorprüfung von in vivo Lipidperoxid
Zu 0,5 ml des oben erhaltenen Homogenisats wurden jeweils 3,5 ml 0,075 M Phosphatpuffer, welcher Sericin L bzw. Sericin H (pH 7,5) enthielt, zugegeben. Die Inkubation erfolgte 2 Std. bei 37°C. Getrennt davon wurden zu 0,5 ml des vorstehend erhaltenen Homogenisats jeweils 3,5 ml 0,075 M Phosphatpuffer, welcher Sericin L und Sericin H (pH 7,5) enthielt, zugegeben, welches vorher im siedenden Wasserbad 2 Std. erhitzt wurden war und die Inkubation 2 Std. bei 37°C fortgesetzt. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Sericinendkonzentration auf 0,5% eingestellt. Die TBARS-Menge wurde nach der TBA-Methode bestimmt, ähnlich Prüfbeispiel 1, und Inhibierungsraten anhand der Zunahme des Lipidperoxids
Tabelle 3
Selbst wenn Sericin L oder Sericin H zwei Stunden im siedenden Wasserbad erwärmt und seine Oxidationswirkung bestimmt wurde, konnte kaum eine Änderung zwischen dieser Oxidationswirkung und der Oxidationswirkung vor dem Erwärmen festgestellt werden. Es hat sich erwiesen, dass die antioxidative Wirkung von Sericin durch Erwärmen nicht inaktiviert werden konnte.
Prüfbeispiel 4
(1) Herstellung von Rattenhirn-Homogenisat.
Die Herstellung erfolgte in der gleichen Weise wie unter Prüfbeispiel 1 beschrieben.
(2) Inhibitorprüfung von in vivo Lipidperoxid
Zu 0,5 ml des oben erhaltenen Homogenisats wurden jeweils 3,5 ml 0,075 M Phosphatpuffer (pH 7,5), welcher Sericin L enthielt, zugegeben und die Inkubation 2 Std. bei 37°C fortgeführt. Die Sericinendkonzentration wurde auf 0,1% oder 0,25% eingestellt. Nach der Inkubation wurde eine 0,5 ml-Probe entnommen, mit 2,5 ml Ether/Ethanol (1 : 3 Vol./Vol.) versetzt und das resultierende Gemisch dann 1 min kräftig geschüttelt. Das Gemisch wurde anschließend 15 min mit 1000xg zentrifugiert und die Absoption der oberen Schicht bei 234 nm gemessen, um einen Indikator für die oxidierte Menge (ein konjugiertes Dien) zu erhalten.
Bei diesem Prüfbeispiel wurde die antioxidative Wirkung von Sericin als Inhibierungsrate(%) für die Lipidperoxidzunahme ausgedrückt.
Tabelle 4
Bei den Prüfbeispielen 1–3 wurde TBARS als Indikator für die Lipidperoxidmenge verwendet, während bei Prüfbeispiel 4 ein konjugiertes Dien als Indikator verwendet wurde. Auch von diesen beiden unterschiedlichen Indikatoren wurde bestätigt, das Sericin eine starke antioxidative Wirkung ausüben kann.
Prüfbeispiel 5
1 ml 100 mM Carbonatpuffer (pH 7,4), welcher 160 μM Arachidonsäure, 150 μM FeCl₃, 1,0 mM Natriumascorbat und 0,3% Sericin enthielt, wurde ein Std. bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 2 ml eines Gemischs aus Trichloressigsäure und Thiobarbitursäure (enthaltend 15% Trichloressigsäure, 0,375% Thiobarbitursäure und 0,25-n Salzsäure) zugegeben und das Gemisch gut gemischt. Anschließend wurde 12 ml 0,1% Rinderserumalbumin zugegeben und das Gemisch 15 min auf dem siedenden Wasserbad erwärmt. Nach dem Zentrifugieren wurde zur Bestimmung der TBARS-Menge die Absorption des Überstehenden bei 535 nm gemessen.1,1,3,3-Tetraethoxypropan wurde als Standard verwendet. Bei diesem Prüfbeispiel wurde die antioxidative Wirkung von Sericin ähnlich ausgedrückt, wie in dem Fall, bei dem kein Sericin zugegeben worden war.
Tabelle 5
Die Prüfbeispiele 1–4 veranschaulichen die Beispiele, die ein System mit einer in vivo Komponente verwenden, während das Prüfbeispiel 5 das Beispiel veranschaulicht, bei dem als Versuchssystem ein System verwendet wurde, das rein aus chemischen Verbindungen zusammengesetzt war. Es bestätigte sich, dass Sericin selbst dann eine antioxidative Wirkung aufweisen kann, wenn derart unterschiedliche experimentelle Systeme angewendet werden.
Aus den Ergebnissen der Prüfbeispiele 4 und 5 wurde gefolgert, dass das Vorhandensein einer antioxidative Wirkung von Sericin viel zuverlässiger ist, und diese nicht nur den im speziellen Versuchssystem beobachteten Erscheinungen entspricht.
Prüfbeispiel 6
Zu 1/15 M Phosphatpuffer, welcher Sericin H oder Sericin L enthält, wurde 0,1 ml Tyrosinaselösung (abgeleitet von Pilzen, hergestellt von Sigma Chemical Co,) bei 0,5 mg/ml (1/15 M Phosphatpuffer, pH 6,8) und 0,9 ml 1/15 M Phosphatpuffer (pH 6,8) zugegeben und das Gemisch 10 min bei 25°C inkubiert. Danach wurde 1 ml 0,3 mg/ml DOPA (1/15 M Phosphatpuffer, pH 6,8) zugegeben, 5 min bei 25°C inkubiert und die Absorption bei 475 nm (D1) gemessen. Getrennt davon erfolgte ein ähnlicher Versuch unter Verwendung des durch Wärme inaktivierten Enzyms (D2), um die Menge an Sericin-freiem DOPA-Chrom (D3) zu bestimmen, worauf anschließend gemäß folgender Gleichung die Inhibierungsrate berechnet wurde: Inhibierungsrate (%) = [(D3 – D1)/(D3 – D2)] × 100
Wie Tabelle 6 zeigt, wurde bestätigt, üben beide, Sericin H als auch Sericin L, inhibierende Wirkung auf die Tyrosinaseaktivität aus. Die Tyrosinaseaktivität inhibierende Wirkung ist insbesondere bei der Endkonzentration von 0,5% oder höher gewährleistet.
Tabelle 6
Prüflieispiel 7
Der gleiche, wie in Prüfbeispiel 6 beschriebene Versuch, wurde wiederholt, außer dass eine Sericin H- und Sericin L-Endkonzentration von 0,5% angewendet wurde; Der gleiche Versuch wie oben wurde auch zum Vergleich wiederholt, außer dass Rinderserumalbumin (Endkonzentration 0,5%) verwendet wurde. Weiterhin wurde eine Lösung von Sericin oder Sericinhydrolysat in Phosphatpuffer 2 Std. gekocht und anschließend ebenfalls die Tyrosinaseaktivität inhibierende Wirkung bestimmt.
Beim Vergleich die Inhibierungsraten für die Tyrosinaseaktivität zwischen Sericin H oder Sericin L und anderen üblichen Proteinen (Rindersermalbumin) wurde bestätigt, dass Rinderserumalbumin kaum eine inhibierende Wirkung für die Tyrosinaseaktivität besitzt und Sericin und Sericinhydrolysat dem Albumin überlegen sind.
Andererseits blieb die inhibierende Wirkung von Sericin H oder Sericin L für die Tyrosinaseaktivität selbst beim Erhitzen im Wesentlichen unverändert. Folglich bestätigte sich, dass die inhibierende Wirkung von Sericin oder Sericinhydrolysat für die Tyrosinaseaktivität gegenüber dem Erhitzen beträchtlich stabil ist.
Tabelle 7
Sericin ist wasserlöslich, kann aber auch bei Produkten mit niedrigem Öl- und Fettgehalt als Antioxidans oder Inhibitor für die Tyrosinaseaktivität eingesetzt werden. Es besitzt weiterhin im Gegensatz zu Vitamin C keine steigernde Wirkung für Lipidperoxide in einem niedrigen Konzentrationsbereich.
Sericin besitzt weiterhin Eigenschaften, wie sie Proteine und Peptide aufweisen, die sich von natürlichen Produkten ableiten; Es besitzt eine gute Affinität zur Haut, weist keine Akkumulationseigenschaften auf, weil es von der Protease leicht hydrolysiert wird und besitzt eine hohe Sicherheit, so dass es auf einem ausgedehnten Gebiet eingesetzt werden kann, einschließend Arzneimittel, quasi-Arzneimittel, Kosmetika, Nahrungsmittel, etc. Zusätzlich weist es die Eigenschaft auf, dass es beim Erhitzen seine Aktivität nicht verliert und es eine verlängerte Inhibierungswirkung bei gleichzeitiger Sicherheit aufrechterhält.
Sericin kann weiterhin leicht aus einem Extrakt von Seidenraupenkokons oder Rohseide in hoher Reinheit als einziges Protein oder Peptid mit einem Lösungsmittel extrahiert werden und wird dadurch kostengünstig zugänglich, nachdem seine wässrige Lösung farblos und transparent ist, so dass keine Notwendigkeit für das Abstreifen und auch keine anderen komplizierten Verfahrensschritte besteht, was sehr vorteilhaft ist.

Claims

Verwendung von Sericin als Antioxidans mit der Maßgabe, dass die Verwendung nicht in der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers besteht.
Verwendung von Sericin als Antioxidans in einem kosmetischen Mittel.
Verwendung von Sericin gemäß Anspruch 2, wobei das kosmetische Mittel ein kosmetisches Mittel mit Bleichwirkung ist.
Verwendung von Sericin gemäß Anspruch 1 zur Verhinderung der Verfärbung eines Systems, dem es zugegeben wird.
Verwendung von Sericin gemäß Anspruch 1 oder 4 als Antioxidans in Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelzusatzstoffen.
Verwendung von Sericin gemäß Anspruch 1 als Inhibitor für Lipidperoxide.
Verwendung von Sericin gemäß Anspruch 1 als Inhibitor für die Tyrosinaseaktivität.
Verwendung von Sericin zur Herstellung eines Arzneimittels, welches bei der Behandlung von Herzinfarkt, Arteriosklerose, Zuckerkrankheit (Diabetes mellitus), Krebs oder Gehirnschlag eine Inhibitorwirkung auf Lipidperoxide ausübt.
Verwendung van Sericin gemäß Anspruch 8, wobei das Arzneimittel für die äußerliche Anwendung formuliert ist.
Verwendung von Sericin gemäß Anspruch 8, wobei das Arzneimittel für die orale Verabreichung formuliert ist.