DE69720505T2

DE69720505T2 - Verfahren und vorrichtung zur identifizierung und charakterisierung von biomolekuelen

Info

Publication number: DE69720505T2
Application number: DE69720505T
Authority: DE
Inventors: Bhikhu Rajesh PAREKH; Robert Amess; Alexander James BRUCE; Barbara Sally PRIME; Edward Albert PLATT; Michael Richard STONEY
Original assignee: Oxford Glycosciences UK Ltd
Current assignee: Oxford Glycosciences UK Ltd
Priority date: 1996-11-29
Filing date: 1997-12-01
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2017-12-02
Also published as: EP0941477B1; ZA9710792B; DE69720505D1; CN1125981C; JP2001504938A; DK0941477T3; CN1242076A; AU5230098A; CA2272092C; AU713259B2; EP1302768A2; GB9624927D0; NO992583D0; US20020191825A1; EP0941477A1; US6278794B1; JP3462220B2; US6480618B1; EP1302768A3; NO992583L

Description

1. EINFÜHRUNG
Diese Erfindung betrifft computerunterstützte Verfahren und eine Vorrichtung zum leistungsfähigen und systema- tischen Untersuchen von Molekülen, die in biologischen Proben vorhanden sind, und zum Bestimmen ihrer Rolle bei Gesundheit und Krankheit. Insbesondere betrifft diese Erfindung das sich entwickelnde Gebiet der molekularen Erforschung der Protein-Genom-Wechselwirkung, das die systematische Identifikation und Charakterisierung von Proteinen, die in biologischen Proben vorhanden sind, einschließlich Proteinen, die glykosyliert sind oder andere posttranslationale Modifikationen zeigen, umfasst. Der Zugang der Protein-Genom-Wechselwirkung bietet große Vorteile für das Identifizieren von Proteinen, die für die Diagnose, die Prognose oder das Überwachen des Ansprechens auf eine Therapie nützlich sind, und beim Identifizieren von Proteinzielen für die Verhütung und Behandlung von Krankheiten.
2. ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Jüngste Fortschritte in der Molekulargenetik haben die Vorteile von Hochdurchlauf-Sequenzierungstechniken und systematischen Strategien zum Studieren von Nucleinsäuren, die in einer gegebenen Zelle oder einem Gewebe ausgedrückt sind, enthüllt. Diese Vorteile haben den Bedarf an bedienerunabhängigen computervermittelten Verfahren zum Identifizieren und Auswählen von Teilmengen oder einzelnen Molekülen aus komplexen Gemischen von Proteinen, Oligosacchariden und anderen Biomolekülen und zum Isolieren derartiger ausgewählter Biomoleküle für die weitere Analyse betont.
Strategien für die zielorientierte Medikamentenentdeckung und das vernünftige Medikamentendesign erfordern das Identifizieren von Schlüsselzellkomponenten wie etwa Proteinen, die kausal mit Krankheitsprozessen in Beziehung stehen, und die Verwendung derartiger Komponenten als Ziele für den therapeutischen Eingriff. Gegenwärtige Verfahren des Analysierens von Biomolekülen wie etwa Proteinen sind jedoch zeitaufwendig und teuer und sind mit einer mangelnden Leistungsfähigkeit bei der Feststellung, Abbildung, Reinigung und Analyse behaftet.
Obwohl der Zugang der molekularen Genomforschung unser Verstehen der genetischen Basis von biologischen Prozessen verbessert hat, weist er bedeutende Beschränkungen auf. Erstens sind die Funktionen von Produkten, die durch identifizierte Gene und insbesondere durch partielle cDNA-Sequenzen codiert werden, häufig unbekannt. Zweitens können Informationen über posttranslationale Modifikationen eines Proteins selten aus einer Kenntnis seiner Gensequenz abgeleitet werden, und es ist nun offensichtlich, dass ein großer Anteil von Proteinen posttranslationale Modifikationen (wie etwa eine Glykosylierung und eine Phosphorylierung) erlebt, die ihre biochemischen Eigenschaften einschneidend beeinflussen. Drittens ist die Proteinexpression häufig einer posttranslationalen Kontrolle unterworfen, so dass die Zellebene einer mRNA nicht notwendigerweise der Expressionsebene ihres Genprodukts entspricht. Viertens umfassen automatisierte Strategien für das zufällige Sequenzieren von Nucleinsäuren die Analyse großer Mengen von Nucleinsäuremolekülen, bevor bestimmt wird, welche, falls überhaupt, Anzeichen von klinischer oder wissenschaftlicher Bedeutung zeigen.
Aus diesen Gründen besteht ein Bedarf, genomische Daten durch Untersuchen der Muster der Protein- und Kohlehydratexpression und der posttranslationalen Modifikation im Allgemeinen in einem biologischen oder einem Krankheitsprozess durch direkte Analyse von Proteinen, Oligosacchariden und anderen Biomolekülen zu ergänzen. Technische Beschränkungen haben jedoch bisher die schnelle, kosteneffiziente, reproduzierbare, systematische Analyse von Proteinen und anderen Biomolekülen, die in biologischen Proben vorhanden sind, behindert.
Applied and Theoretical Electrophoresis (1995), 5, 25-29, offenbart eine Elektroelutionsvorrichtung, die zum Isolieren eines Proteins aus einem Band in einem eindimensionalen Elektrophoresegel geeignet ist.
US 5,073,963 offenbart ein computerisiertes Verfahren zum Vergleichen von Mustern von Polypeptidstellen, die durch zweidimensionale Elektrophorese abgetrennt wurden.
3. KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf leistungsfähige, computerunterstützte Verfahren und eine Vorrichtung zum Identifizieren, Auswählen und Charakterisieren von Biomolekülen in einer biologischen Probe. Gemäß der Erfindung wird durch Abtrennen von Biomolekülen, die in einem komplexen Gemisch vorhanden sind, eine zweidimensionale Anordnung erzeugt. Die Erfindung stellt ein computererzeugtes digitales Profil bereit, das die Identität und die relative Abundanz mehrerer Biomoleküle, die in der zweidimensionalen Anordnung festgestellt wurden, darstellt, wodurch ein computervermittelter Vergleich von Profilen von mehreren biologischen Proben gestattet wird. Diese automatisierbare Technologie zum Screenen von biologischen Proben und zum Vergleichen ihrer Profile gestattet eine schnelle und leistungsfähige Identifikation von einzelnen Biomolekülen, deren Anwesenheit, Fehlen oder geänderte Expression mit einer Krankheit oder einem Zustand von Interesse verbunden wird. Der- artige Biomoleküle sind als therapeutische Mittel, als Ziele für den therapeutischen Eingriff, und als Marker für die Diagnose, Prognose und Bewertung des An- Sprechens auf eine Behandlung nützlich. Diese Technologie gestattet auch eine schnelle und leistungsfähige Identifikation von Sätzen von Biomolekülen, deren Muster der Expression mit einer Krankheit oder einem Zustand von Interesse verbunden wird; derartige Sätze von Biomolekülen stellen Konstellationen von Markern für die Diagnose, Prognose und Bewertung des Ansprechens auf eine Behandlung bereit. Die automatisierbaren Hochdurchlauf-Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung gestatten ferner eine bedienerunabhängige Auswahl von einzelnen abgetrennten Biomolekülen (oder Teilmengen von abgetrennten Biomolekülen) gemäß vorherbestimmten Kriterien ohne jegliche Erfordernis der Kenntnis von Sequenzinformationen oder anderen strukturellen Merkmalen der Biomoleküle. Dies wiederum stellt eine automatisierte, benutzerunabhängige Isolierung und parallele Charakterisierung mehrerer ausgewählter Biomoleküle, die in einer biologischen Probe nachgewiesen wurden, bereit. Somit gestattet die vorliegende Erfindung vorteilhafterweise eine automatisierte Auswahl von Biomolekülen vor dem Sequenzieren oder der strukturellen Charakterisierung. In einer besonderen Ausführungsform verwendet die vorliegende Erfindung ein Gel, das für die Elektrophorese von Biomolekülen (wie etwa Proteinen) geeignet ist und an einen festen Träger gebunden ist, so dass das Gel eine zweidimensionale räumliche Stabilität aufweist, und ist der Träger im Wesentlichen in Bezug auf die Feststellung einer Markierung, die mit einem oder mehreren Biomolekülen im Gel verbunden wird (z. B. einer fluoreszierenden Markierung, die an ein oder mehrere Proteine gebunden ist), nichtstörend. In einer anderen besonderen Ausführungsform benutzt die Erfindung ein integriertes Computerprogramm, das digitale Profile vergleicht, um ein oder mehrere Biomoleküle, die in einer zweidimensionalen Anordnung festgestellt wurden, auszuwählen, und Befehle erzeugt, die eine Robotervorrichtung anweisen, derartige ausgewählte Biomoleküle aus der zweidimensionalen Anordnung zu isolieren. In noch einer weiteren Ausführungsform führt das Programm auch ein Laborinformationsmanagementsystem (LIMS) aus, das Laborproben und zugehörige Daten wie klinische Daten, an den Proben durchgeführte Vorgänge und durch Analyse der Proben erzeugte Daten verfolgt.
4. KURE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 ist ein Ablaufdiagramm von Vorgängen, die gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung an einem Gemisch von verschiedenen Proteinen durchgeführt werden.
2 ist ein Ablaufdiagramm, das Funktionen veranschaulicht, die in einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mittels eines Computers durchgeführt werden.
3 ist ein Diagramm einer Robotervorrichtung zum Isolieren von Biomolekülen aus dem Trägergel der vorliegenden Erfindung.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und eine Vorrichtung zum schnellen und leistungsfähigen Identifizieren und Charakterisieren von Biomolekülen, beispielsweise Proteinen, in einer biologischen Probe bereit. Bei dem Verfahren der Erfindung wird eine biologische Probe zwei aufeinander folgenden Abtrennschritten unterworfen. Im ersten Abtrennschritt werden die Biomoleküle gemäß einer physikalischen oder chemischen Eigenschaft abgetrennt, um eine eindimensionale Anordnung zu erzeugen, die die Biomoleküle enthält; beispielsweise werden Proteine durch isoelektrische Fokussierung entlang einer ersten Achse abgetrennt. Im zweiten Abtrennschritt werden die Biomoleküle in dieser eindimensionalen Anordnung gemäß eines zweiten physikalischen oder chemischen Merkmals abgetrennt, um eine zweidimensionale Anordnung von abgetrennten Biomolekülen zu erzeugen; beispielsweise werden Proteine, die durch isoelektrische Fokussierung abgetrennt wurden, entlang einer zweiten Achse, die rechtwinkelig zur ersten Achse ist, einer SDS-PAGE unterworfen. Die abgetrennten Biomoleküle werden für das anschließende Abbilden stabil in der zweidimensionalen Anordnung behalten. Die stabile zweidimensionale Anordnung kann für einen ausgedehnten Zeitraum (z. B. Monate oder Jahre) gelagert oder archiviert werden, und ausgewählte Biomoleküle können auf Basis einer automatisierten Computeranalyse der Daten, die aus dem Abbilden erhalten wurden, zu jedem gewünschten Zeitpunkt aus der Anordnung abgerufen wer- den.
Die zweidimensionale Anordnung wird- mit einem Detektor abgebildet, um ein computerlesbares Ausgangssignal zu erzeugen, das für jedes festgestellte Biomolekül einen Satz von x,y-Koordinaten und einen Signalwert enthält. Falls gewünscht, kann das computerlesbare Ausgangssignal vor oder nach der computervermittelten Analyse einem menschlichen Bediener als eine computererzeugte Abbildung auf einem Bildschirm oder jedwedem anderen geeigneten Medium dargestellt werden. Eine computervermittelte Analyse des computerlesbaren Ausgangssignals wird durchgeführt, was zu einem computerlesbaren Profil führt, das für mehrere festgestellte Biomoleküle die relative Abundanz jedes dieser Biomoleküle und ihre wie aus ihren x,y-Koordinaten in der zweidimensionalen Anordnung abgeleiteten Merkmale darstellt. Beispielsweise stellt ein Profil, das aus dem Abbilden eines Gels erhalten wurde, welches Proteine enthält, die durch isoelektrische Fokussierung gefolgt von SDS-PAGE abgetrennt wurden, den isoelektrischen Punkt (pI), das apparente Molekulargewicht (MW) und die relative Abundanz. mehrerer festgestellter Proteine dar.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten computerlesbaren Profile sind für die computervermittelte Analyse zum Identifizieren eines oder mehrerer Biomoleküle, die bestimmte Kriterien erfüllen, geeignet. In einer Ausführungsform wird ein erster Satz von Profilen mit einem zweiten Satz von Profilen verglichen, um Biomoleküle zu identifizieren, die in allen Profilen des ersten Satzes (oder in einem ersten Prozentsatz der Profile des ersten Satzes) vertreten sind und in den Profilen des zweiten Satzes fehlen (oder in einem zweiten Prozentsatz der Profile des zweiten Satzes fehlen, wobei der erste und der zweiten Prozentsatz unabhängig voneinander bestimmt sein können). In anderen Ausführungsformen werden Sätze von Profilen verglichen, um Biomoleküle zu identifizieren, die in einem bestimmten Prozentsatz von Profilen eines Probensatzes in einer bezeichneten höheren Ebene der Expression vorhanden sind, als in einem bestimmten Prozentsatz von Profilen eines anderen Probensatzes, oder um Biomoleküle zu identifizieren, deren posttranslationales Processing sich von einem Probensatz zum anderen unterscheidet.
Ein , oder mehrere auf diese Weise identifizierte Biomoleküle werden zur Isolierung ausgewählt. In einer Ausführungsform erfolgt diese Auswahl ohne weiteren menschlichen Eingriff gemäß vorherbestimmten programmierten Kriterien automatisch durch einen Computer. In einer anderen Ausführungsform überprüft ein menschlicher Bediener die Ergebnisse der computervermittelten Analyse und gibt dann eine Auswahl in einen Computer ein. Zur Isolierung jedes ausgewählten Biomoleküls erzeugt ein Computer maschinenlesbare Befehle, die eine Robotervorrichtung anweisen, (a) einen oder mehrere Teile der zweidimensionalen Anordnung, die das ausgewählte Biomolekül enthalten, zu entfernen, und (b), die entfernten Teile für die weitere Charakterisierung zu einem oder mehreren geeigneten Gefäßen zu führen. Beispielsweise kann ein ausgewähltes Protein analysiert werden, um seine gesamte oder einen Teil seiner Aminosäuresequenz zu bestimmen, jedwede zugehörigen Oligosaccharidanteile festzustellen und zu charakterisieren, und andere Gesichtpunkte des posttranslationalen Processing, z. B. die Phosphorylierung, Myristylierung u. ä., zu untersuchen. Die Erfindung gestattet vorteilhafterweise eine automatisierte parallele Verarbeitung von Biomolekülen, die aus der zweidimensionalen Anordnung entfernt wurden, wodurch die rasche und leistungsfähige Charakterisierung mehrerer ausgewählter Biomoleküle erleichtert wird. 1 zeigt ein Ablaufdiagramm, das das Verarbeiten einer Probe gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
Die vorliegende Erfindung ist zum Identifizieren und Analysieren von Proteinen nützlich, ist jedoch all- gemeiner auf die Identifikation und Analyse eines beliebigen Biomoleküls anwendbar. So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "Biomolekül" auf jedwedes organische Molekül, das in einer biologischen Probe vorhanden ist, und beinhaltet Peptide, Polypeptide, Proteine, Oligosaccharide, Lipide, Steroide, Prostaglandine, Prostacycline und Nucleinsäuren (einschließlich DNA und RNA). So, wie er hier verwendet wird, beinhaltet der Ausdruck "Protein" glykosylierte und nichtglykosylierte Proteine.
5.1. Biologische Proben
So, wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Ausdruck "biologische Probe" auf jedwede feste oder fluide Probe, die von einem beliebigen lebenden Organismus, einschließlich einzelliger Mikroorganismen (wie etwa Bakterien oder Hefepilze) und mehrzelliger Organismen (wie etwa Pflanzen und Tiere, beispielsweise ein Wirbeltier oder ein Säugetier und insbesondere ein gesunder oder anscheinend gesunder Mensch oder ein menschlicher Patient, der von einem zu diagnostizierenden oder zu untersuchenden Zustand oder einer solchen Krankheit betroffen ist) erhalten, ausgeschieden oder abgesondert wurde. Eine biologische Probe kann ein von beliebiger Stelle entnommenes biologisches Fluid (z. B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Galle, Zerebrospinalflüssigkeit, Kammerwasser oder Glaskörpergallerte oder sonstige körperliche Absonderung), ein Transsudat, ein Exsudat (z. B. ein Fluid, das aus einem Abszess oder einem anderen Infektions- oder Entzündungsherd erhalten wurde), oder ein Fluid, das aus einem Gelenk (z. B. einem normalen oder einem durch Krankheit wie etwa Rheumatoid-Arthritis, Osteoarthritis, Gicht oder septische Arthritis betroffenen Gelenk) erhalten wurde, sein. Alternativ kann eine biologische Probe aus einem beliebigen Organ oder Gewebe (einschließlich einer Biopsie- oder Autopsieprobe) stammen oder Zellen (entweder Primärzellen oder Kulturzellen) oder ein durch beliebige Zellen, Gewebe oder Organe konditioniertes Medium umfassen. Falls gewünscht, kann die biologische Probe einer Vorverarbeitung einschließlich Vorabtrennungstechniken unterzogen werden. Beispielsweise können Zellen oder Gewebe zur gesonderten Analyse von Biomolekülen in gesonderten subzellularen Fraktionen, beispielsweise Proteinen oder Medikamenten, die in verschiedenen Teilen der Zelle gefunden wurden, extrahiert und einer subzellularen Fraktionierung unterzogen werden. Siehe Deutscher (Hrsg.), 1990, Methods in Enzymology Bd. 182, Seite 147–238. In gleicher Weise kann eine Immunfällung durchgeführt werden, um bezüglich Antigenität verwandte Biomoleküle wie etwa Proteine zu identifizieren. Siehe Firestone & Winguth in Deutscher, op. cit. Seite 688-699 (worauf hiermit durch Verweis zur Gänze Bezug genommen wird).
Vorzugsweise werden relevante klinische Informationen, die für die Analyse nützlich sind, katalogisiert und der entsprechenden Probe zugeteilt; für diesen Zweck wird ein computerbasierendes Laborinformationsmanagementsystem (LIMS) bevorzugt. Derartige Informationen beinhalten vorzugsweise Patientendaten wie die .
Familienkrankengeschichte, die klinische Diagnose, das Geschlecht, das Alter, die Staatsangehörigkeit, den Wohnort, den Arbeitsplatz und die Krankengeschichte. Informationen, die mit der Probe selbst in Beziehung stehen, werden ebenfalls vorzugsweise im LIMS registriert; derartige Informationen können die Probenart, die genaue Entnahmestelle der Probe, den Tag und die Uhrzeit der Probenentnahme, die Zeit zwischen der Entnahme und der Lagerung, das Verfahren der Lagerung und die zum Erhalt der Probe benutzte Vorgangsweise beinhalten.
Verfahren des Zuteilens des Informationseintrags zur richtigen Probe können die Zuweisung von übereinstimmenden Nummern zu dem Eintrag und zur Probe beinhalten. Dieses Verfahren ist vorzugsweise durch die Verwendung von Strichcodes und einem Strichcodescanner automatisiert. Wenn jede Probe verarbeitet wird, wird der Scanner benutzt, um die Probenidentifikationsnummer in das LIMS einzutragen, durch die die Probe im Verlauf ihre verschiedenen Handhabungen mitverfolgt werden kann, wodurch die Verbindung zwischen dem Eintrag und der Probe gewahrt wird. Die Verwendung von Strichcodes gestattet auch ein automatisiertes Archivieren und Wiederauffinden von gespeicherten Proben und Gelen.
5.2. Analyse von Proteinen
In einer Ausführungsform werden die Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung benutzt, um ein oder mehrere Proteine in einer biologischen Probe bzw. biologischen Proben zu identifizieren und zu charakterisieren.
5.2.1. Erster Abtrennschritt
Eine breite Vielfalt von Techniken zum Abtrennen von Proteinen ist Fachleuten wohlbekannt, siehe z. B. Deutscher (Hrsg.), 1990, Methods in Enzymology Bd. 182, Seite 9–18 und 285–554, und kann gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispielsweise und nicht beschränkend können Proteine auf der Basis des isoelektrischen Punkts (z. B. durch Chromatofokussierung oder isoelektrische Fokussierung), der elektrophoretischen Beweglichkeit (z. B. durch eine nichtdenaturierende Elektrophorese oder eine Elektrophorese in Anwesenheit eines Denaturierungsmittels wie etwa Harnstoff oder Natriumdodecylsulfat (SDS) mit oder ohne vorherige Einwirkung eines Reduktionsmittels wie etwa 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol), durch Chromatographie einschließlich FPLC und HPLC, auf jedweder geeigneten Matrix (z. B. Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie oder Affinitätschromatographie, zum Beispiel mit einem immobilisierten Antikörper oder Lektin) oder durch Zentrifugierung (z. B. isopyknische Zentrifugierung oder Geschwindigkeitszentrifugierung) abgetrennt werden.
Im ersten Abtrennschritt kann jedwede Abtrenntechnik, einschließlich jeder der oben aufgezählten Techniken, benutzt werden. In einer Ausführungsform führt der erste Abtrennschritt zu einer diskontinuierlichen eindimensionalen Anordnung (z. B. Fraktionen, die während der Affinitätschromatographie gesammelt wurden). Insbesondere führt der erste Abtrennschritt zu einer kontinuierlichen eindimensionalen Anordnung; und die isoelektrische Fokussierung in einem Polyacrylamid-Streifengel das mit passenden Elektrolyten versehen ist, ist besonders bevorzugt.
5.2.2. Zweiter Abtrennschritt
Der zweite Abtrennschritt setzt eine Abtrenntechnik ein, die von der im ersten Abtrennschritt verschieden ist, um eine zweidimensionale Anordnung von abgetrennten Proteinen zu erzeugen. Jedwede Abtrenntechnik (einschließlich der oben aufgezählten) kann in jedem beliebigen Medium verwendet werden, sofern (a) die sich ergebende zweidimensionale Anordnung von Biomolekülen (z. B. Proteinen) abgebildet werden kann, um die physikalischen Positionen mehrerer abgetrennter Biomoleküle im Abtrennmedium festzustellen, und (b) ein oder mehrere ausgewählte Biomoleküle aus dem Medium, in dem der zweite Abtrennschritt durchgeführt wurde, isoliert werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform setzt der zweite Abtrennschritt Elektrophorese in einem Gel wie etwa einem Polyacrylamid-Plattengel ein; und die Polyacrylamidgelelektrophorese unter Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) ist besonders bevorzugt. Wenn der erste Abtrennschritt zu einer diskontinuierlichen eindimensionalen Anordnung führt, werden Fraktionen der eindimensionalen Anordnung (oder Aliquote davon) der zweiten Abtrenntechnik unterworfen. Beispielsweise werden Aliquote von Fraktionen aus der Affinitätschromatographie für die SDS-PAGE in Löcher eines Polyacrylamidgels geladen. Falls der erste.. Abtrennschritt zu einer kontinuierlichen eindimensionalen Anordnung führt, wird die Anordnung (oder ein Teil davon) der zweiten Abtrenntechnik unterworfen. Beispielsweise wird ein Streifengel, das Proteine enthält, die durch isoelektrische Fokussierung entlang einer ersten Achse abgetrennt wurden, für die SDS-PAGE entlang einer zweiten, zur ersten Achse rechtwinkeligen Achse auf ein Polyacrylamid-Plattengel geladen.
5.2.3. Polyacrylamid-Trägergele
Die vorliegende Erfindung benutzt vorzugsweise ein Trägergel, das zur Verwendung bei der Elektrophorese geeignet ist, wobei das Gel stabil an einen festen Träger gebunden ist, so dass das Gel eine zweidimensionale räumliche Stabilität aufweist, und der Träger starr und im Wesentlichen in Bezug auf die Feststellung einer Markierung, die an ein oder mehrere Biomoleküle im Gel gebunden ist oder diesen auf andere Weise zugehörig ist, nichtstörend ist. Vorzugsweise ist der Träger im Wesentlichen in Bezug auf die Feststellung einer fluoreszierenden Markierung nichtstörend; für diesen Zweck ist ein Glasträger geeignet, da Glas anders als Kunststoff frei von spektraler Aktivität ist, die eine Fluoreszenzabbildung beeinträchtigt oder verhindert.
Aufgrund der stabilen Bindung zwischen dem Gel und dem festen Träger ist nun eine Entfernung (z. B. durch Ausschneidung) eines oder mehrerer Teile des Gels ohne Lageverschiebung des Rests des Gels oder mit nur minimaler Verzerrung möglich, wodurch die Integrität der zweidimensionalen Anordnung von abgetrennten Proteinen während der Handhabung und der Lagerung beibehalten wird; vorzugsweise ist das Gel kovalent an den festen Träger gebunden. Im Anschluss an das Abbilden zur Bestimmung der x,y-Koordinaten der abgetrennten Proteine können ein oder mehrere Teile des Trägergels, das ausgewählte Proteine enthält, für eine weitere Analyse entfernt werden, während die verbleibenden Proteine für eine, falls gewünschte, spätere Entfernung stabil an ihren vorher abgebildeten Stellen gehalten werden. Die Trägergele stellen einen bedeutenden Fortschritt bei der Erleichterung der präzisen, reproduzierbaren Ausschneidung und Isolierung von abgetrennten Biomolekülen dar. Darüber hinaus kann das Trägergel mit einem Strichcode versehen werden, um eine untrennbare Verbindung zwischen der Identität der ursprünglichen Probe und der zweidimensionalen Anordnung von abgetrennten Biomolekülen bereitzustellen; eine derartige Verbindung kann unter Verwendung des oben beschriebenen LIMS im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beibehalten werden.
Um das Trägergel herzustellen, kann ein fester Träger beispielsweise mit einem bifunktionalen Linker wie y-Methacryl-oxipropyltrimethoxysilan funktionalisiert werden; das Gel wird dann auf den funktionalisierten Träger gegossen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Träger im Allgemeinen ebenflächig (z.B. eine im Allgemeinen ebenflächige Glasplatte); eine flache Glasplatte wird besonders bevorzugt. Falls gewünscht, kann das Trägergel beispielsweise bei einer verringerten Temperatur (z. B. bei 4°C, –20°C oder –70°C) gelagert werden. Ein geeignetes Verfahren zur Lagerung ist in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 98/01749 beschrieben. Für manche Vorgänge (z. B. die Ausschneidung eines Gels oder von Teilen des Gels) wird ein offenflächiges Trägergel bevorzugt, während das Gel für andere Vorgänge (z. B. eine Elektrophorese) wahlweise auch zwischen einen ersten festen Träger, an den das Gel stabil gebunden ist (z. B. eine mit einem bifunktionalen Linker behandelte Glasplatte), und einen zweiten festen Träger, an den das Gel nicht stabil gebunden ist (z. B. eine unbehandelte Glasplatte oder eine mit einem Silikonisierungsmittel behandelte Glasplatte) geschichtet sein kann.
5.2.4. Feststellung von abgetrennten Proteinen Die Proteine in der zweidimensionalen Anordnung können durch jedwede gewünschte Technik festgestellt werden. In einer Ausführungsform werden Proteine in einem Polyacrylamidgel mit einem geeigneten Farbstoff (wie etwa Coomassie-Blau oder einem fluoreszierenden Farbstoff) oder durch eine geeignete Färbetechnik (wie etwa Silberfärbung) markiert, wie in der Technik wohlbekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Prote ine in einem Polyacrylamidgel durch Imprägnieren des Gels mit einem Farbstoff, der fluoreszierend aktiv wird oder seine Fluoreszenzeigenschaften ändert, wenn er sich mit einem Protein verbindet oder damit in Kontakt tritt, markiert, wodurch das Entfernen von ungebundenem Farbstoff vor dem Abbilden nicht länger notwendig ist; für diesen Zweck ist Sypro-Rot (Molecular Biogrobes, Inc., Eugene, Oregon) geeignet. In einer anderen Ausführungsform können die Proteine durch Imprägnieren des Gels mit einem Antikörper, Lektin oder anderen geeigneten Liganden, der einer Reporterkomponente wie etwa einem Radionuklid, einem Enzym oder einer Bindungsspezies wie etwa Biotin zugehörig ist, markiert werden; nach der Entfernung des ungebundenen Antikörpers, Lektins oder anderen Liganden kann die Reporterspezies durch jedwede geeignete Technik festgestellt werden. In einer weiteren Ausführungsform werden Proteine vor der Abtrennung radioaktiv markiert, beispielsweise durch metabolische Markierung mit jedwedem. geeigneten Radionuklid (z. B. Tritium, einem Radionuklid von Schwefel oder einem Radionuklid von Kohlenstoff) oder durch chemische oder enzymatische. Markierung mit jedwedem geeigneten Radionuklid (z. B. radioaktivem Jod). In noch einer weiteren Ausführungsform werden die Proteine zu einer geeigneten Membran elektrotransferiert, um einen Abdruck der zweidimensionalen Anordnung zu bilden, der mit einem Antikörper, Lektin oder anderen geeigneten Liganden, der einer Reporterkomponente zugehörig ist, untersucht wird; Techniken für ein derartiges Western-Blotting sind in der Technik wohlbekannt.
Die markierten Proteine werden mit einem beliebigen Detektor abgebildet, der. in der Lage ist, die verwendete Reporterspezies festzustellen, beispielsweise durch Densitometrie, Spektroskopie oder durch Feststellen von Fluoreszenz oder Radioaktivität; und der ein computerlesbares Ausgangssignal erzeugt. In einer Ausführungsform ist der Detektor ein Laserfluoreszenzscanner, bei dem ein sich drehender Spiegel einen Laserstrahl entlang einer ersten Achse über ein Gel scannt, während das Gel entlang einer zweiten Achse, die rechtwinkelig zur ersten Achse verläuft, vorwärts bewegt wird. Ein solcher Scanner, bei dem ein Gel linear über einen fortlaufend scannenden Laser transportiert wird, ermöglicht, dass Gele automatisch von einem Trichter (z. B. einem Färbetank) auf den Transportmechanismus geladen werden, gescannt werden und automatisch verkapselt werden, nachdem das Scannen abgeschlossen wurde, wodurch der Durchlauf verbessert wird und die manuelle Handhabung der Gele verringert wird. Vorzugsweise tritt die durch die Gele abgegebene Fluoreszenz in einen Hohlleiter ein und wird zu einem Photodetektor wie etwa einer Photovervielfacherröhre geführt. In einer Ausführungsform wandert der Laserstrahl vom sich drehenden Spiegel entlang einer Ebene, die parallel zum Gel verläuft, bis er einen zweiten Spiegel mit einer Bogenform erreicht, der ihn zurückstrahlt, um das Gel in einem rechten Winkel zu treffen. Aufgrund des bogenförmigen Siegels bleibt die Weglänge des Laserstrahls konstant, während das Gel von einer Seite zur anderen gescannt wird. Diese konstante Weglänge erleichtert die phasenempfindliche Feststellung, bei der die Amplitude des Laserstrahls zyklisch moduliert wird; das durch einen Protein-Farbstoff-Komplex (Signal) abgegebene Fluoreszenzsignal zeigt eine Phasenverschiebung, die verwendet wird, um dieses Signal von der Hintergrundfluoreszenz (Rauschen), bei der keine Phasenverschiebung (oder eine geringere Phasenverschiebung) beobachtet wird, zu unterscheiden. Ein derartiger Laserfluoreszenzscanner ist in Basiji, 1997, Development of a High-Throughput Fluorescence Scanner Employing Internal Reflection Optics And Phase-Sensitive Detection (Dissertation, University of Washington, Seattle, WA) beschrieben.
Es ist wünschenswert, einen oder mehrere Bezugspunkte, die durch die Abbildungsvorrichtung feststellbar sind, zur Verwendung beim Bestimmen der x,y-Koordinaten jedweder Merkmale, die in der zweidimensionalen Anordnung von abgetrennten Proteinen festgestellt werden, bereitzustellen. Bezugspunkte können auf einem Träger (z. B. einer funktionalisierten, im Wesentlichen ebenflächigen Glasoberfläche), an dem 'ein Gel kovalent angebracht ist, bereitgestellt sein. Alternativ können Bezugspunkte an einem Rahmen, an dem ein Gel während des Abbildens fixiert ist, bereitgestellt sein; ein übereinstimmender Rahmen kann in einer Roboterisolierungsvorrichtung bereitgestellt sein.
5.3. Analyse von Oligosacchariden
Oligosaccharide (Glykane) in einer biologischen Probe können mit den Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung unter Verwendung etablierter Techniken zum Aufspalten, Markieren und Abtrennen von Oligosacchariden identifiziert und charakterisiert werden. Siehe z. B. Townsend & Hotchkiss (Hrsg.), 1997, Techniques in Glycobiology (Marcel Dekker, Inc., New York); Takahashi, 1996, J. Chromatography 720: 217–255. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Oligosaccharide fluoreszierend markiert (z. B. mit ortho-substituierten Anilinderivaten wie 2-Aminobenzamidin oder 2-Anthranilsäure) und durch zweidimensionale Polyacrylamidgelelektrophorese abgetrennt. Siehe Starr et al., 1996, J. Chromatography 720: 295–321; Bigge et al., 1995, Analyt. Biochem. 230: 229–238. Beispielsweise können fluoreszierend markierte Oligosaccharide einer Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) in einer ersten Dimension (z. B. unter Verwendung eines 15%igen Acrylamidgels und eines Tris(hydroxymethyl)aminomethan (*Tris)/N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropansulfonsäure (*TAPS)-Puffers, pH 7,4) unterzogen werden, um eine größtenteils auf dem intrinsischen Ladung-zu-Masse-Verhältnis der Oligosaccharide beruhende Abtrennung zu erreichen. Diese eindimensionale Anordnung von Oligosacchariden wird dann einer PAGE in einer zweiten Dimension unterzogen, wobei ein 20%iges Acrylamidgel und ein 20-mM-Tris/Borat-Puffer, pH 8,5, verwendet wird, um eine größtenteils auf der aus der nichtkovalenten Komplexbildung des Boratanions mit den Oligosacchariden stammenden induzierten Ladung beruhende Abtrennung zu erreichen. Die Oligosaccharide in der sich ergebenden zweidimensionalen Anordnung werden mit einem Fluoreszenzscanner abgebildet, um ein computerlesbares Ausgangssignal zu erzeugen.
5.4. Computeranalyse des Detektorausgangssignals
Die vorliegende Erfindung stellt vorteilhafterweise eine computervermittelte Analyse des Detektorausgangssignals bereit. Beispielhaft, aber nicht beschränkend, wird dieser Gesichtspunkt der Erfindung im Zusammenhang mit Proteinen, die zuerst durch isoelektrische Fokussierung und dann durch SDS-PAGE abgetrennt wurden, besprochen, doch wird es Fachleuten leicht ersichtlich sein, dass das Verfahren und die Vorrichtung, die hierin beschrieben werden, in gleicher Weise auf die Analyse des Ausgangssignals, das aus dem Abbilden einer beliebigen zweidimensionalen Anordnung von abgetrennten Biomolekülen abgeleitet wird, anwendbar sind.
Zum Übertragen des Ausgangssignals für die Analyse ist der Detektor betriebsfähig mit einem Computer verbunden. So, wie er hierin verwendet wird, beinhaltet der Ausdruck "betriebsfähig verbunden" entweder eine direkte Verbindung (z. B. eine dauerhafte oder periodische Verbindung über ein leitendes Kabel, eine Infrarot-Kommunikationsvorrichtung o. ä.) oder eine indirekte Verbindung, wobei die Daten über eine Zwischenspeichervorrichtung (z. B. einen Server oder eine Diskette) übertragen werden. Man wird ohne weiteres verstehen, dass das Ausgangssignal des Detektors in einem Format sein sollte, das durch den Computer akzeptiert werden kann. Für diesen Zweck wird ein Bitmap-Format (z. B. das GIF-Format) bevorzugt.
Nachdem das Ausgangssignal einmal zu einem entsprechend programmierten Computer übertragen wurde, kann es verarbeitet werden, um Bezugspunkte festzustellen; um Artefakte auszufiltern und zu entfernen; um Merkmale festzustellen und zu quantifizieren; und um Abbildungsdateien zu erstellen. Merkmale können durch einen computervermittelten Vergleich von möglichen Proteinstellen mit dem Hintergrund festgestellt werden. Beispielsweise kann das Computerprogramm Signale auswählen, die Bereichen des Gels entsprechen, die eine Färbung oder Fluoreszenz zeigen, welche einen gegebenen Schwellenwert übersteigt.
Darüber hinaus kann ein Computer verwendet werden, um die festgestellten Merkmale zu bearbeiten und Duplikatanalysen einer gegebenen Probe (oder jede beliebige Anzahl von Replikationen) übereinzustimmen. Die Ausgangssignale können bewertet und verglichen werden, um Abbildungsdateien zurückzuweisen, die grobe Abweichungen von der Norm, eine zu geringe Lade- und Gesamtintensität oder eine zu schwache Auflösung aufweisen, oder wenn Duplikate einander zu unähnlich sind. Wenn eine Abbildungsdatei eines Duplikats zurückgewiesen wird, wird unabhängig von der Abbildungsqualität auch die andere zum Duplikat gehörende Abbildungsdatei zurückgewiesen. Alle diese Funktionen können gemäß bedienerbestimmten Kriterien automatisch oder, nachdem die Abbildungsdatei einem menschlichen Bediener dargestellt wurde, interaktiv durchgeführt werden.
Eine Orientierungspunktidentifikation kann verwendet werden, um jegliche Veränderlichkeit beim Durchlauf des Gels zu korrigieren. Dieser Vorgang umfasst die Identifikation eines oder mehrerer Orientierungspunktproteine, von denen bekannt ist oder erwartet wird, dass sie in einer gegebenen biologischen Probe mit konstantem isoelektrischen Punkt und elektrophoretischer Beweglichkeit gefunden werden. Diese Orientierungspunktproteine können als endogene Standards zur Korrektur jedweder möglicher Gelveränderungen oder -verzerrungen dienen. Alternativ oder zusätzlich dazu können ein oder mehrere Proteine zur Probe hinzugefügt werden, um als exogene Standards zu dienen. Merkmale, die als Artefakte betrachtet werden, können aus der Analyse ausgefiltert werden; derartige Artefakte kommen wahrscheinlich vorwiegend an den Rädern des Gels und insbesondere am oder nahe dem Probenapplikationspunkt und der Farbstoff-Front vor.
Falls gewünscht, können die Ausgangssignale von zwei oder mehr Experimenten ausgerichtet und kombiniert werden, um eine panoramische Bilddatei zu bilden; beispielsweise kann eine Probe, die Proteine umfasst, durch zweidimensionale Elektrophorese unter Verwendung eines isoelektrischen Fokussierungsgradienten vom pH 4,0 bis 5,0 in einem Experiment und eines isoelektrischen Fokussierungsgradienten von 5,0 bis 6,0 in einem zweiten Experiment abgetrennt werden. Nun kann ein Computer verwendet werden, um die Ausgangssignale, die aus diesen Experimenten erhalten wurden, als eine einzelne panoramische Abbildung zur Betrachtung oder zur weiteren Analyse darzustellen.
Duplikatgele können anhand der Orientierungspunkte ausgerichtet werden, und ein Übereinstimmungsvorgang kann durchgeführt werden. Der Übereinstimmungsvorgang kann das paarweise Anordnen von entsprechenden Merkmalen auf den Duplikatgelen umfassen. Dies bietet eine erhöhte Gewissheit, dass nachfolgend gemessene isoelektrische Punkte und apparente Molekulargewichte genau sind, da paarweise angeordnete Merkmale die Reproduzierbarkeit der Abtrennung zeigen. Die bearbeitete Abbildungsdatei kann zur visuellen Prüfung auf einem Bildschirm dargestellt, als graphische Darstellung ausgedruckt und für eine nachfolgende Analyse verwendet werden.
In einer Ausführungsform wird ein Computer verwendet, um die x,y-Koordinaten aller festgestellten Proteine (oder einer Teilmenge, die interaktiv oder gemäß bedienererstellter Kriterien automatisch ausgewählt wurde) zu messen: Derartige Koordinaten werden unter Bezugnahme auf die experimentellen Parameter, die in den Abtrennschritten verwendet wurden, auf die Orientierungspunktproteine oder auf exogene Standards mit besonderen isoelektrischen Punkten und apparenten Molekulargewichten korreliert. Die Intensität des Signals, das die Proteinmerkmale darstellt, wird ebenfalls gemessen und gespeichert.
Geeignete Programme zur Abbildungsverarbeitung sind in der Technik wohlbekannt. Das von BioRad Laboratories, Hercules, Kalifornien unter der Handelsbezeichnung MELANIE^® (erschienen am 2. 2. 1997) vertriebene kommerzielle Programm ist für diesen Zweck geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird MELANIE^® verwendet, um am Detektorausgangssignal die folgenden Vorgänge durchzuführen: (a) Kalibrierung eines Gels, um Spalten- und Reihenkoordinaten unter Bezugnahme auf Orientierungspunktdefinitionen in Werte des isoelektrischen Punkts (pI) und des Molekulargewichts (MW) umzuwandeln; (b) Feststellung von Merkmalen in der Gelabbildung; (c) paarweises Anordnen der Merkmale zwischen Duplikatgelen; (d) Berechnen der absoluten Merkmalsintensität (Vol.), der relativen Merkmalsintensität (Vol.), des isoelektrischen Punkts pI und des Molekulargewichts MW für jedes der festgestellten Merkmale; und (e) paarweises Anordnen von Merkmalen zwischen Gelen, die aus unterschiedlichen Proben zum Durchlauf gebracht wurden. Das Ausgangssignal von MELANIE kann somit Merkmalsberichte, Orientierungspunktberichte und Paarberichte beinhalten.
5.5. Computererzeugung und -analyse von Profilen
Das Ausgangssignal des Abbildungsverarbeitungsprogramms (z. B. MELANIE^®) kann mit einem Computer weiterverarbeitet werden, um digitale Profile zu erzeugen, die für eine vergleichende Analyse geeignet sind.
5.5.1. Erst llung von Profilen
Nun kann für jede Abbildungsdatei, die durch MELANIE^® verarbeitet wurde, ein digitales Profil erstellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jede Probe in zwei oder mehr Replikaten (die als "Geschwister" bezeichnet werden) analysiert, wovon eines willkürlich als das "repräsentative" Gel für den Geschwistersatz bestimmt wird. Ein digitales Profil umfasst vorzugsweise für jedes identifizierte Merkmal: 1) einen einzigartigen willkürlichen Identifikationscode, 2) die x,y-Koordinaten, 3) den isoelektrischen Punkt, 4) das Molekulargewicht, und 5) die Fluoreszenzintensität.
Für jeden Satz von Geschwistergelen werden die Merkmalsberichte von Geschwisterabbildungen durch Bildung des Durchschnitts von %Vol., isoelektrischem Punkt und Molekulargewicht zwischen übereingestimmten Merkmalen zu einer künstlichen Zusammensetzung vereinigt. Diese besteht dann aus den gemittelten Merkmalsparametern, die Merkmalskennzeichnungen zugewiesen werden, welche vom repräsentativen Gel des Geschwistersatzes genommen wurden. Zusätzlich wird die Standardabweichung des Mittelwerts des %Vol. durch die folgende Formel berechnet (für Duplikatgele): D = 100*SQRT(sgr(<V> – V1) + sgr(<V> – V2))/<V> wobei <V> =(V₁ + V₂)/2 ist, und V₁ und V2 die %Vol.-Werte für ein Paar von Merkmalen sind.
Zusätzliche Informationen können auch mit der künstlichen Zusammensetzung verbunden werden, z.B. die gesamte Menge des auf das Gel aufgebrachten Proteins und der Strichcode des Gels. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die künstliche Zusammensetzung einen Merkmalsbericht im MELANIE^®-Format, der im Zusammenhang mit dem repräsentativen Gel steht und an den Strichcode des repräsentativen Gels angepasst ist.
Dieses Profil kann zu den tatsächlich gelagerten Gelen, die zur Erzeugung von Abbildungen benutzt wurden, aus denen die künstliche Zusammensetzungsabbildung erstellt wurde, zurückverfolgt werden, so dass Proteine, die durch Computeranalyse von Profilen festgestellt werden, wieder aufgefunden werden können. Das Profil kann auch zur ursprünglichen Probe oder zum Patienten zurückverfolgt werden. Die Reproduzierbarkeit des Gelsystems verbunden mit der Korrektur, die durch die Verwendung von Standards und Orientierungspunkten möglich gemacht wird, gefolgt von einem Übereinstimmen von Korrelatstellen mit einem Mastergel gestattet den Vergleich von vielen Gelen, die mit den gleichen oder unterschiedlichen Proben zu gleichen oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchlaufen. Darüber hinaus können die Daten, die während der Entnahme der ursprünglichen biologischen Probe erhoben wurden, wie in Abschnitt 5.1. beschrieben ist, mit den Geldaten wiedervereinigt werden, was die Analyse von computerausgewählten Querschnitten, der Proben auf Basis solcher Informationen wie Alter oder klinisches Ergebnis gestattet.
2 zeigt ein Ablaufdiagramm, das eine computervermittelte Analyse gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung veranschaulicht.
5.5.2. Übergreifende Übereinstimmung zwischen Proben
Daten, die aus der Analyse von verschiedenen Proben erzeugt wurden,.werden nun einer Computeranalyse unterzogen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird jedem bedeutenden Merkmal ein Index (der "Molekularclusterindex", "MCI") zugewiesen, der den molekularen Inhalt des Merkmals identifiziert und in übereinstimmenden Merkmalen in allen Gelen den gleichen Wert aufweist. Für jede Art von Probe wird eine "Molekularclustertabelle" erstellt, die das Koordinatensystem, auf dem jedes Gel aufeinander folgend kartiert wird, einzigartig definiert. Dieser Ansatz verhindert das NxN-Problem des Versuchens, jedes Gel mit allen anderen in einem Satz übereinzustimmen.
Um eine Molekularclustertabelle zu erstellen, wird ein repräsentatives Gel, vorzugsweise eines, das als für seine Probenart optimal betrachtet wird, willkürlich als Mastergel ausgewählt. Für jedes Merkmal (Molekularcluster) in der künstlichen Zusammensetzung des Geschwistersatzes, von der dieses repräsentative Gel ein Element ist, wird ein neuer Eintrag in die Molekularclustertabelle erstellt. Zusätzliche Molekularcluster können der Tabelle hinzugefügt werden, wenn sie in anderen Gelen beobachtet werden, jedoch nicht in der Mastertabelle vertreten sind. Derartige andere Gele sind als "sekundäre Master" bekannt.
In einer Ausführungsform wird der MCI durch eine hierarchische Vierer-Baumstruktur-Zerlegung des pI/MW-Raums aus dem isoelektrischen Punkt und dem Molekulargewicht des Merkmals berechnet. Zuerst wird ein 2D-Gitter berechnet, das den gesamten pI/MW-Raum einschließt. Beispielhaft und nicht beschränkend kann pI jeden Wert zwischen 0 und 14 und MW jeden Wert zwischen 1.000 und 1.000.000 annehmen. Da die Reihenposition eines. Proteins (die seine Verschiebung auf einem Gel darstellt) annähernd proportional zum Logarithmus seines Molekulargewichts ist, werden die Gitterpositionen in Bezug auf den natürlichen Logarithmus des Molekulargewichts berechnet, d. h. ln(MW). Der 2D-pI/1n(MW)-Raum kann durch serielle Zweiteilung horizontal und vertikal der Reihe nach in kleinere Quadranten geteilt werden, wobei jeder Quadrant weniger Merkmale als sein Vorgänger enthält, bis eine Auflösung erreicht ist, bei der es unwahrscheinlich ist, dass die Anzahl von Merkmalen in jeder Zelle des 2D-Raums größer als 1 ist.
In einer besonderen Ausführungsform werden neun aufeinander folgende Unterteilungen vorgenommen, so dass der gesamte pI/ln(MW)-Raum sowohl vertikal als auch horizontal in 512 Teilungen geteilt ist (RES = 512). Der MCI eines Merkmals in einem Mastergel wird nun durch die folgende Formel aus dem isoelektrischen Punkt und dem Molekulargewicht im Masterkoordinatensystem berechnet: MCI = ((int)((ln(MWmax) – ln(MW))/dM)*8192 + (int)(pI(dI))*8192/RES wobei ln(MW_max) = 14; ln(MW_min) = 7; dM = (ln(MW_max) – ln(MW_min))/RES = 0,013672;
und pI_max = 14; pI_min = 0; dI = (PI_max – pl_min)/RES = 0,027344
Die repräsentativen Gele aller anderen Proben einer gegebenen Art können nun (unter Verwendung von MELANIE^®) mit Master- und sekundären Mastergelen für diese Probenart übereingestimmt werden. Die digitalen Profile werden dann durch Hinzufügen des MCI des Merkmals im Master- oder sekundären Masterprofil für jedes übereingestimmte Merkmal mit Anmerkungen versehen.
5.5.3. Differentialanalyse von Profilen
Nachdem die Profile einmal mit MCI-Anmerkungen versehen wurden, kann eine Computeranalyse durchgeführt werden, um eines oder mehrere Merkmale, die Proteine oder andere Biomoleküle von Interesse darstellen, auszuwählen. Vorzugsweise wird die Analyse durch Vergleichen der künstlichen Zusammensetzungsprofile, die aus der Replikatanalyse von Geschwistergelen von einer einzelnen Probe stammen, durchgeführt.
Ein Abbildungssatz wird aus einer benutzerwählbaren Liste von Proben in der Datenbank erstellt. Jedes Element des Abbildungssatzes umfasst das künstliche Zusammensetzungsprofil des Geschwistersatzes und die Mastermolekularclustertabelle, die zum Übereinstimmen der Merkmale verwendet wurde.
Dann wird ein Merkmalssatz definiert, der den Satz der Merkmale, die über einen Abbildungssatz hinweg gefunden wurden, darstellt. Für den Merkmalssatz wird eine willkürliche Schwellenwertebene X bestimmt; ein gegebenes Merkmal wird als Teil des Satzes definiert, wenn es in mindestens X% der Elemente des Abbildungssatzes vorkommt (d. h. den gleichen MCI aufweist). Für jedes Element des Merkmalssatzes werden die folgenden Eigenschaften definiert: (1) der MCI, (2) der mittlere %Vol.-Wert (der durchschnittliche %Vol.-Wert für alle Elemente des Abbildungssatzes, in denen das Merkmal vorkommt), (3) der mediane %Vol.-Wert, und (4) die Anzahl von Abbildungen im Satz, in denen das Merkmal identifiziert wurde.
Nun können Binärsatzvorgänge durchgeführt werden, um Sätze von Merkmalen zwischen zwei Abbildungssätzen (die als "Hintergrund-" und "Vordergrund" satz bezeichnet werden) zu vergleichen. Der grundlegende Binärvorgang ist die Berechnung der Faltungsveränderung zwischen übereinstimmenden Merkmalen in zwei Merkmalssätzen. Die Faltungsveränderung (G) wird durch den folgenden Al-gorithmus bestimmt:
Wenn V2 und V2 als die mittleren %Vol.-Werte eines Merkmals im Hintergrund-Merkmalssatz F1 bzw. im Vordergrund-Merkmalssatz F2 (wobei ein fehlendes Merkmal durch v = 0 dargestellt wird) angenommen werden, dann gilt:
G = V2/V1(wenn V2 > V1)
G = V1/V2(wenn V1 > V2)
G = +MAX_G(wenn V1 = 0)
G = –MAX_G(wenn V2 = 0),
wobei MAX G eine beliebige, geeignet große Zahl ist.
Dieser Algorithmus kann optional unter Verwendung des medianen %Vol-Werts anstelle des mittleren %Vol.-Werts in der Faltungsveränderungsgleichung durchgeführt werden. Das Ergebnis kann als ein Balkendiagramm oder in jedwedem anderen passenden Format berichtet werden.
Serielle Satzvorgänge können durchgeführt werden, um die Schwankung in der Expression jedes Merkmals in einem Merkmalssatz als eine Funktion einer beliebigen Probenregistrierungsvariablen zu bestimmen. Beispielsweise können solche Vergleiche für (a) eine Zeitserienstudie der Expressionsschwankung in einem Satz von Probenspendern; (b) einen Vergleich der Expressionsschwankung für Sätze von Einzelpersonen mit unterschiedlichen Krankheiten; oder (c) einen Vergleich der Expressionsschwankung für Sätze von Einzelpersonen bei unterschiedlichen Behandlungen verwendet werden. Ein serieller Satzvorgang erzeugt eine Matrix von Ergebnissen, wobei die Reihen die einzelnen Elemente des Merkmalssatzes aufzählen und die Spalten unterschiedliche Abbildungssätze aufzählen und die Zellen in der Matrix Zahlen enthalten, die aus den mittleren %Vol.-Werten jedes Merkmals in jedem Abbildungssatz wie oben beschrieben berechnet wurden.
Beispielsweise werden zum Vergleich eines Merkmals, das mit MCI(F) bezeichnet wird, über drei Abbildungssätze, die als S1, S2 und S3 bezeichnet werden, die %Vol.-Werte von MCI(F) für jede Probe, V1, V2 und V3, als der mittlere %Vol.-Wert für MCI(F) im entsprechenden Abbildungssatz berechnet. Als nächstes wird der mittlere, mediane und maximale V1, V2 und V3 über die Reihe hinweg berechnet. Wenn ein Probensatz MCI(F) nicht enthält, wird der entsprechende %Vol.-Wert als Null angenommen. Der Benutzer wählt eine Referenzspalte, Vref, die jeder der Abbildungssätze, das Mittel oder der Median sein kann. Dann wird jede Zelle wie folgt berechnet:
P1 = (V1 – Vref)/Vmax
P2 = (V2 – Vref)/Vmax
P3 = (V3 – Vref)/Vmax
Diese Werte liegen alle im Bereich von –1,0 bis +1,0. Dieser Bereich kann in jede gewünschte Anzahl von Unterbereichen (z. B. sieben gleiche Unterbereiche) geteilt werden und das Resultat graphisch dargestellt werden, wobei die Werte in den Zellen durch ein Symbol für jeden Unterbereich dargestellt werden.
Ein computervermittelter Vergleich gemäß benutzerspezifizierten Kriterien erleichtert die rasche und leistungsfähige Analyse von großen Mengen von Profilen und gestattet die Identifikation von kleinen Unterschieden zwischen Profilen, die verglichen werden, auch wenn jedes Profil viele hundert oder tausend festgestellte Biomoleküle darstellen kann. Die Kapazität für die rasche und leistungsfähige Handhabung von großen Probensätzen erhöht die Wahrscheinlichkeit des Feststellens statistisch signifikanter Unterschiede.
Man sollte auch verstehen, dass Ausführende der Erfindung jedes neu erstellte Profil einer ständig wachsenden Datenbank hinzufügen können, was experimentübergreifende Vergleiche möglicherweise in von den ursprünglichen Forschern nicht erahnten Kombinationen gestattet. Profildatenbanken können die Durchführung virtueller Experimente gestatten, wobei Profile aus jeder beliebigen Studie mit Profilen aus allen anderen Studien verglichen werden können, ohne dass die tat sächlichen klinischen Daten reproduziert werden müssen. Beispielsweise kann jede Datenbank, die Molekulargewichte und isoelektrische Punkte für Proteine bereitstellt, mit einem Profil der Erfindung, das aus der Analyse von Proteinen stammt, verglichen werden.
Fachleute können die vielen Formen, die eine solche Analyse annehmen kann, verstehen, und die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung bereitgestellt.
Die Profile von erkrankten und normalen Einzelpersonen können verglichen werden, um Muster von Stellen zu identifizieren, die sich durchweg zwischen den beiden Populationen unterscheiden. Diese Stellen können Proteine von therapeutischer oder diagnostischer Bedeutung enthalten.
Die Profile von erkranktem und normalem Gewebe von einer einzelnen Person können verglichen werden, um Muster von Stellen zu identifizieren, die sich durchweg zwischen dem erkrankten und dem normalen Gewebe unterscheiden. Diese Stellen können Biomoleküle enthalten, die für therapeutische oder diagnostische Zwecke von Interesse sind. Dies weist den besonderen Vorteil der Kontrolle auf Schwankungen zwischen verschiedenen Einzelpersonen auf, da der Vergleich zwischen Proben vorgenommen wird, die von einer einzelnen Person genommen wurden.
Die Profile von behandelten und nicht behandelten Einzelpersonen können verglichen werden, um Muster von Stellen zu identifizieren, die mit einer bestimmten Therapie oder Medikamentenbehandlung korrelieren. Dies kann beim Aufklären der Wirkungsweisen von Medikamenten, beim Untersuchen von Medikamentenresistenzen oder bei der Medikamentenentwicklung hilfreich sein.
Ein Dreiwegs-Vergleich von gesunden, erkrankten und behandelten erkrankten Einzelpersonen kann identifizieren, welche Medikamente in der Lage sind, aus einem erkrankten Profil ein Profil, das einem normalen Profil viel ähnlicher ist, wiederherzustellen. Dies kann benutzt werden, um entweder in klinischen Studien oder bei einer Routinebehandlung Medikamente zu screenen, die Wirksamkeit einer Behandlung zu überwachen, und das Auftreten von Nebenwirkungen festzustellen oder vorherzusagen, und um zu identifizieren, welche Stellen für die Manifestation und die Behandlung einer Krankheit wichtiger sind.
Ein Dreiwegs-Vergleich von erkrankten Einzelpersonen, die nicht behandelt, mit einem Medikament A oder einem Medikament B behandelt werden, kann auch interessante Biomoleküle identifizieren. Wenn beispielsweise A als wirksam und B als unwirksam bekannt ist, sind Biomoleküle, die sich zwischen der Behandlungsgruppe A (einerseits) und sowohl der unbehandelten Gruppe als auch der behandelten Gruppe B (andererseits) unterscheiden, für die Prognose nützlich und sind Kandidaten zur Untersuchung als therapeutische Ziele.
5.6. Entfernung von ausgewählten Teilen eines Trägergels
Es ist ein charakteristisches Merkmal von Trägergelen, dass Biomoleküle, nachdem sie einmal abgetrennt sind, in einer stabilen Anordnung gehalten werden. Ein Teil des Gels, der ein einzelnes festgestelltes Merkmal enthält, kann nun ohne Beeinträchtigung der räumlichen Integrität des Rests der Anordnung entfernt werden. Beispielsweise kann die Entfernung durch Ausschneidung eines Teils des Gels, durch örtlich begrenzte Aufbringung eines Mittels, das das Gel verflüssigt, so dass die gewünschte Art durch Saugen entfernt werden kann oder ihr ein Austropfen gestattet wird, oder durch örtlich begrenzte Anwendung einer Elektroelutionsvor richtung erreicht werden. Die Entfernung von Teilen des Gels, die Arten enthalten, welche für eine Analyse benötigt werden, kann auf Basis des Profils genau und reproduzierbar durchgeführt werden; derartige Teile können von einem Gel, das abgebildet wurde, oder von einem Duplikat oder einem anderen Replikat eines abgebildeten Gels entfernt werden. Man wird leicht verstehen, dass dies für eine computergesteuerte Analyse und Auswahl sehr geeignet ist.
Vorzugsweise werden ausgewählte Gelteile unter Verwendung der Vorrichtung der Erfindung ausgeschnitten. Somit kann eine Robotervorrichtung unter Steuerung einer Software, die als ihren Bezug das biologische Molekülprofil benutzt, welches anschließend an die Abtrennung der Biomoleküle erhalten wurde, bereitgestellt werden. Diese Vorrichtung kann betriebsfähig mit einem Computer verbunden sein und durch maschinenlesbare Befehle angetrieben werden, um in einer bedienerunabhängigen Weise gemäß Befehlen, die durch eine computervermittelte Analyse mehrerer Profile, die aus der Analyse mehrerer Gemische von Biomolekülen stammen, erzeugt werden, Ausschneidungen und Handhabungen an einem Gel durchführen. Der Computer programmiert x- und y-Bewegungen und weist einen Schneidekopf der Robotervorrichtung an, einen einzelnen Einschnitt oder eine Serie von überlappenden Einschnitten vorzunehmen, um ein identifiziertes Merkmal zu isolieren und zu entfernen.
Eine derartige Vorrichtung kann Folgendes umfassen: (1) einen definierten Rahmen, der mit dem Rahmen, in dem das Gel während des Abbildens angeordnet war, identisch ist oder übereinstimmt; (2) ein Bett zur kontrollierten Anordnung des Rahmens mit Gel; und (3) einen beweglichen x,y-Koordinaten-Auffindungsmechanismus mit einem Antrieb, angebracht an einem austauschbaren Handhabungs- und Ausschneidungsbestandteil, der durch die Software angewiesen wird, durch einen Bediener vorgege bene Gelbereiche von Interesse aufzufinden, und in der Lage ist, die gewünschte(n) Handhabung(en) durchzuführen und das Gel oder aus dem Gel stammendes Material zu einer bestimmten Stehle in einer Aufnahmekammer zu liefern. Eine Ausführungsform einer derartigen Vorrichtung ist in 3 veranschaulicht.
Dieses Instrument ist fähig, Gelfragmente von einem glasgestützten Gel zu entfernen und die entfernten Fragmente in ein geeignetes Gefäß einzutragen. Für jedes Gelfragment kann ein gesondertes Reaktionsgefäß (z. B. eine Eppendorf-Phiole) verwendet werden; doch vorzugsweise werden Gelfragmente zu einem Gestell von Teströhrchen oder zu Kammern ineinem Mehrkapazitätsgefäß wie etwa einer 96-Loch-Sammelmikroplatte übertragen. Das zu handhabende glasgestützte Gel wird auf Führungen auf dem Bett des Instruments gesetzt, wodurch das Glas und somit das Gel mit dem Schneidemechanismus ausgerichtet wird. Das Instrument entfernt einen oder mehrere ausgewählte Teile des Gels gemäß maschinenlesbaren Befehlen. In einer Ausführungsform wird für jedes Merkmal eine neue Spitze ausgewählt und ein Vorgang des Kernschneidens, Scherens und Saugens angewendet, um die Bindung des Gels an das Glas zu brechen und das Gelfragment zu entfernen. Vorzugsweise umfasst der Schervorgang eine Spitzenbewegung von einer Seite zur anderen entlang einer ersten Achse gefolgt von einer Spitzenbewegung von einer Seite zur anderen entlang einer zweiten Achse in einem Winkel (ganz besondere bevorzugt einem rechten Winkel) zur ersten Achse. Jedes Gelfragment wird zur Sammelplatte übertragen und dann, vorzugsweise in eine Flüssigkeit, um die Entfernung des Gelfragments von der Spitze zu unterstützen, ausgestoßen. Vorzugsweise ist innerhalb der Spitze eine bewegliche Schleuse enthalten, die den doppelten Zweck des Verhinderns, dass das Gelfragment während des Schneidevorgangs in die Vakuumpumpe gesaugt wird, und des Ausstoßens des Gelfragments während des Ausstoßes aus der Spitze aufweist. Um ein Überschleppen zwischen unterschiedlichen Merkmalen auf ein Mindestmaß zu verringern, können die Schneidewerkzeuge in einer eingebauten automatisierten Reinigungsstation gereinigt werden. Besonders bevorzugt werden die Schneidewerkzeuge gewechselt, so dass für jedes Merkmal ein neues Schneidewerkzeug verwendet wird, wodurch jegliches Überschleppen verhindert wird.
Große Merkmale werden anhand mehrerer benachbarter oder überlappender Schnitte ausgeschnitten, und alle Teile desselben Merkmals werden im selben Loch der Sammelplatte angeordnet, oder verschiedene Teile des Merkmals werden in unterschiedlichen Löchern angeordnet. Alternativ wird ein Profil um den Umfang des großen Merkmals ausgeschnitten; das Gel wird dann angehoben, während ein Schneidevorgang unter dem Gel ausgeführt wird, um es vom Träger abzutrennen, und das gesamte Merkmal wird zum Sammelgefäß übertragen. Das System wurde so ausgeführt, dass es gestattet, dass sowohl mehrere Gele in eine Sammelplatte geschnitten werden, als auch, dass ein Gel in eine beliebige Anzahl von Sammelplatten geschnitten, wird, wodurch dass alle Merkmale weiterverarbeitet werden können. Nachdem die Sammelplatte voll oder vollständig ist, ist sie für die weitere Verarbeitung bereit oder kann sie gelagert werden. Nachdem ausgewählte Gelfragmente ausgeschnitten wurden, kann der Rest des Gels beispielsweise wie oben beschrieben bei einer verringerten Temperatur gelagert werden.
5.7. Verarbeitung entfernter Teile des Gels
Ein oder mehrere entfernte Teile des Gels werden zu einer Arbeitsstation, beispielsweise einer allgemeinen modularen Chemieeinheit geliefert, die voll programmierbar und für eine Proteolyse ausgelegt ist. Diese Arbeitsstation gestattet die Durchführung jedes Protokolls, das einen Reagenszusatz, eine Pipettierung und Übertragung, eine Inkubation, eine Mischung, eine Kühlung, eine Vakuumtrocknung und Feststoffextraktionstechniken oder jede andere Technik, für die ein Modul entwickelt werden kann, umfasst. Die Platten werden auf Träger gesetzt, die auf dem Bett des Instruments durch einen integrierten Trägermanipulator umpositioniert werden. Derartige Platten können jegliche Form, vorzugsweise eine rechtwinkelige Matrix von Löchern und besonders bevorzugt ein 9-mm-Schritt-Mikroplattenformat, annehmen. Eine Mikroplatte mit Düsen in der Basis jedes Lochs, die einen Flüssigkeitsdurchgang gestatten, wie etwa die von Porvair Ltd., Shepperton, Großbritannien, hergestellten, ist insbesondere bevorzugt. In einer derartigen Mikroplatte werden die Flüssigkeit und Gelstücke durch eine Teflonfritte zurückgehalten und wird die Flüssigkeit durch Luftdruck, der durch die Pipettierungseinheit von oben her ausgeübt wird, durch die Fritte extrahiert. Diese Flüssigkeit kann verworfen werden oder während einer Peptidelution in einer zweiten Platte, die während des Extraktionsvorgangs unter den Düsen angeordnet ist, gesammelt werden. Ein Protein, das gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert wurde, kann wie nachstehend beschrieben analysiert werden, oder kann einem Versuchstier wie etwa einer Maus, einer Ratte oder einem Kaninchen verabreicht werden, um polyklonaie oder monoklonale Antikörper gegen das Protein zu erzeugen. Derartige Antikörper sind in diagnostischen und prognostischen Versuchen und zur Reinigung von großen Mengen des Proteins, beispielsweise durch Antikörperaffinitätschromatographie, nützlich.
5.8. Analyse von Proteinen
Die Arbeitsstation kann zur chemischen Proteolyse oder enzymatischen Proteolyse unter Verwendung eines oder mehrerer geeigneter Enzyme (z. B. Trypsin oder Chymotrypsin) einzeln oder in Kombination programmiert werden. Siehe, z. B., Shevchenko et al., 1996, Analytical Chemistry 68: 850–858 und Houthaeve et al., 1995, FEBS Letters 376: 91–94. Falls gewünscht, kann wahlweise eine Elektroelution benutzt werden, um Proteine aus den Gelschnitten zu extrahieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Arbeitsstation so programmiert, dass jedes Protein in einem entfernten Gelfragment aufgespalten wird, um einen Pool von Peptiden zu erzeugen, die für die weitere Charakterisierung geeignet sind. So erhält die Arbeitsstation Proben von geschnittenem Gel in einem geeigneten Gestell, und diese Proben werden den Schritten eines Waschens, einer Reduzierung, einer Alkylierung, eines Waschens und einer Trypsinolyse unterzogen. Die sich ergebenden Peptide werden für eine weitere Reinigung oder zusätzliche Vorbereitung vor der Analyse in eine zweite Platte extrahiert. Siehe, z.B., Shevchenko, op. cit. Inkubationen können bei jedweder Temperatur bis zu 100°C und darüber durchgeführt werden; die Arbeitsstation beinhaltet einen Dichtungsmechanismus, um einen Flüssigkeitsverlust zu verhindern oder auf ein Mindestmaß zu verringern, wenn die Inkubation bei einer hohen Temperatur oder für einen längeren Zeitraum durchgeführt wird. Die Einheit ist ausgeführt, um unbeaufsichtigt und Idealerweise über Nacht zu arbeiten, und weist umfassende Mess-, Überwachungs- und Selbstüberprüfungsmechanismen auf, um zu gewährleisten, dass das programmierte Protokoll richtig durchgeführt wird, um etwaige Fehler zu berichten, und um die Verarbeitung beim Auftreten eines im voraus definierten Zwischenfalls zu unterbrechen. Mehrere Platten können . parallel verarbeitet werden, und können, falls gewünscht, gemäß unterschiedlichen Protokollen verarbeitet werden. Die Arbeitsstation ist auch in der Lage, eine Peptidreinigung und andere Vorgänge wie etwa eine Hydrazinolyse und eine Markierung durchzuführen.
5.8.1. Bestimmung von Aminosäuresequenzen
Die Aminosäuresequenzen eines oder mehrerer Peptide, die aus einem entfernten Protein stammen, können nun beispielsweise durch eine geeignete Massenspektrometrietechnik wie etwa eine matrixunterstützte Laserdesorption/-ionisation in Verbindung mit einer FlugzeitMassenanalyse (MALDI-TOF MS) oder eine Elektrosprühionisationsmassenspektrometrie (ESI MS) bestimmt werden. Siehe Jensen et al., 1977, Protein Analysis By Mass Spectrometry, in Creighton (Hrsg.), Protein Structure, A Practical Approach (Oxford University Press), Oxford, Seite 29–57; Patterson & Aebersold, 1995, Electrophoresis 16: 1791–1814; Figeys et al., 1996, Analyt. Chem. 68: 1822–1828. Vorzugsweise ist eine Abtrenntechnik wie Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder Kapillarelektrophorese direkt oder indirekt mit dem Massenspektrometer gekoppelt. Siehe Ducret et al., 1996, Electrophoresis 17: 866–876; Gevaert et al., 1996, Electrophoresis 17: 918–924; Clauser et al., 1995, Proc. Natl: Acad. Sci. USA 92: 5072– – 5076. Insbesondere bevorzugt ist die in der US-Patentanmeldung Nr. 08/877,605 beschriebene De-Novo-Sequenzierungstechnik. Bei der De-Novo-Sequenzierung wird die molekulare Masse des Peptids mittels jeder geeigneten Technik und vorzugsweise mit einem Massenspektrometer genau bestimmt. Ein Computer wird verwendet, um unter Bezugnahme auf den Wasserverlust bei der Bildung von Peptidbindungen, die Pronotation, andere Faktoren, die die gemessene Masse von Aminosäuren verändern, und experimentelle Erwägungen, die die zulässigen Kombinationen von Aminosäuren einschränken, alle möglichen Kombinationen von Aminosäuren, die sich zur gemessenen Masse des Peptids addieren können, zu bestimmen. Der Computer baut dann eine zulässige Bibliothek aller linearen Permutationen von Aminosäuren in den zulässigen Kombinationen auf. Dann werden theoretische Fragmentationsspektren für jedes Element der zulässigen Bibliothek von Permutationen berechnet und mit einem experimentellen Fragmentationsspektrum, das durch Massenspektro- metrie für das unbekannte Peptid erhältlich ist, verglichen, um die. Aminosäuresequenz des unbekannten Peptids zu bestimmen. Ganz besonders bevorzugt wird die Tandemmassensprektrometrie benutzt, um die Aminosäuresequenz des unbekannten Peptids zu bestimmen.
Sobald die gesamte oder ein Teil einer Aminosäuresequenz eines isolierten Proteins experimentell bestimmt wurde, kann ein Computer benutzt werden, um verfügbare Datenbanken nach einer übereinstimmenden Aminosäuresequenz oder einer Nucleotidsequenz, einschließlich einer ausgedrückten Sequenzmarkierung (EST), deren vorhergesagte Aminosäuresequenz mit der experimentell bestimmten Aminosäuresequenz übereinstimmt, zu durchsuchen. Falls keine übereinstimmende Nucleotidsequenz gefunden wird, kann durch in der Technik wohlbekannte Techniken ein degenerierter Satz von Nucleotidsequenzen, die die experimentell bestimmte Aminosäuresequenz codieren, durch Umkehrung hergestellt werden; ein derartiger degenerierter Satz von Nucleotidsequenzen ist zum Klonen des Gens, das das isolierte Protein codiert, und zum Ausdrücken des sequenzierten Proteins oder Peptidfragments nützlich. Alternativ kann eine Teilmenge des degenerierten Satzes von Nucleotidsequenzen durch Umkehrung hergestellt werden, wobei nur Codonen verwendet werden, die in der Art, von der das Protein erhalten wurde, bevorzugt werden (z. B. Codonen, die in Menschen bevorzugt werden, wenn das Protein ein menschliches Protein ist); falls gewünscht, kann diese Teilmenge auf die eine Nucleotidsequenz beschränkt werden, die in der relevanten Art am meisten bevorzugt wird.
Wenn ein Gen, das ein isoliertes Protein codiert, in einer öffentlichen oder privaten Datenbank identifiziert ist, kann das Gen geklont und in bakterielle, Hefepilz- oder Säugetierzellen eingebracht werden. Wenn ein derartiges Gen nicht in einer Datenbank identifiziert ist, kann das Gen unter Verwendung eines degenerierten Satzes von Proben, die eine Aminosäuresequenz des Proteins, wie sie durch die Verfahren und die Vor richtung der vorliegenden Erfindung bestimmt wurden, codieren, geklont werden. Wenn eine Datenbank eine oder mehrere teilweise Nucleotidsequenzen enthält, die eine experimentell bestimmte Aminosäuresequenz des Proteins codieren, dienen derartige teilweise Nucleotidsequenzen (oder deren Komplemente) als Proben zum Klonen des Gens, wodurch die Verwendung von degenerierten Sätzen nicht länger notwendig ist.
Zellen, die gentechnisch verändert sind, um ein derartiges rekombinantes Protein auszudrücken, können in einem Screeningprogramm verwendet werden, um andere Proteine oder Medikamente zu identifizieren, die spezifisch mit dem rekombinanten Protein Wechselwirken, oder um große Mengen des rekombinanten Proteins z. B. für die therapeutische Verabreichung herzustellen. Der Besitz des geklonten Gens gestattet eine Gentherapie, um ein Protein, dessen Abwesenheit oder herabgesetzte Expression mit einer Krankheit einher geht, zu ersetzen oder zu ergänzen. Der Besitz des geklonten Gens gestattet ebenso eine Antisense- oder Triple-Helix-Therapie, um die Expression eines Proteins, dessen Anwesenheit oder erhöhte Expression mit einer Krankheit einher geht, zu unterdrücken.
5.8.2. Analyse der posttranslationalen Verarbeitung
Viele Proteine erfahren eine posttranslationale Modifikation mit anderen chemischen Gruppen als Aminosäuren, z. B. Phosphatgruppen und Oligosacchariden. Das Vorhandensein, die Stelle und die chemische Identität derartiger Gruppen an einem Protein kann unter Verwendung der proteinspezifischen Peptidfragmente, die durch die Vorrichtung und die Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, analysiert werden. In einer Ausführungsform wird ein Peptidpool, der von einem isolierten Protein in einem Gelfragment erhalten wurde, geteilt. Ein Teil wird zur Identifikation des Proteins wie im obigen Abschnitt 5.8,.1. beschrieben verwendet.
Der andere Teil oder die anderen Teile werden verwendet, um individuelle posttranslationale Modifikationen durch Standardverfahren, die in der Technik bekannt sind, zu identifizieren. Beispielsweise ist die Phosphorylierungsanalyse in Carr et al., 1996, Analyt. Biochem. 239: 180–192 und in Townsend et al., 1996, Protein Science 5: 1865–1873 beschrieben. Die Glykananalyse ist in Dwek et al., 1993, Analyt. Biochem. 62: 65 – 100 und in den im obigen Abschnitt 5.3. angeführten Verweisen beschrieben.
6. BEISPIEL: PROTEINE AUS SERUM UND SYNOVIA VON
PATIENTEN MIT RHEUMATHOID-ARTHRITIS
Proteine im Serum und der Synovia von Patienten mit Rheumatoid-Arthritis (RA) wurden durch isoelektrische Fokussierung gefolgt von SDS-PAGE abgetrennt und verglichen.
6.1. Isoelektrische Fokussierung
Für die isoelektrische Fokussierung (IEF) wurde jede Probe unter Befolgung der in den Anweisungen des Herstellers beschriebenen Vorgehensweise, siehe Instructions for Immobiline^® DryStrip Kit, Pharmacia, # 18–1038–63, Edition AB, mit wahlweisen Abwandlungen wie durch Sanchez et al., 1997, Electrophoresis 18: 324–327, beschrieben auf ein Immobiline^® DryStrip Kit (Pharmacia BioTech) aufgebracht.
In bestimmten Fällen wurde zur Erhöhung der Auflösung in einem bestimmten pH-Bereich oder zum Laden einer größeren Menge eines Zielproteins auf das Gel gemäß dem in Westermeier, 1993, Electrophoresis in Practice (VCH, Weinheim, Deutschland), Seite 197–209 beschriebenen Verfahren ein Schmalbereichs-"Zoomgel", das einen pH-Bereich von 2 pH-Einheiten oder weniger aufwies, benutzt.
6.2. Gelgleichgewichtseinstehlung und SDS-PAGE
Die IEF-Gele wurden durch Gleichgewichtseinstellung in einem SDS-Puffersystem gemäß einem wie durch Sanchez et a1., id. beschriebenen Zwei-Schritt-Vorgang, der eine anfängliche Reduktion der Disulfidbindungen gefolgt von einer Alkylierung der freien Thiolgruppen umfasste, für die SDS-PAGE vorbereitet. Danach wurde die SDS-PAGE gemäß Hochstrasser et al., 1988, Analytical Biochemistry 173: 412–423 mit wie nachstehend angegebenen Modifikationen ausgeführt.
6.3. Herstellung der Trägergele
Die kovalente Anbringung der SDS-PAGE-Gele an einem Glasträger wurde durch Aufbringen einer 0,4%igen Lösung von y-Methacryloxypropyltrimethoxysilan in Ethanol auf die Glasplatte {"die untere Platte"), an der das Gel anzubringen war, erreicht. Überschüssiges Reagens wurde durch Waschen mit Wasser entfernt, und die untere Platte wurde trocknen gelassen. In diesem Stadium wurde sowohl. zur Identifikation für das Gel, als auch als Markierung zur Identifizierung der beschichteten Fläche der Platte ein selbstklebender Strichcode derart an einer Stelle der unteren Platte angebracht, dass er mit der Gelmatrix nicht in Berührung kommen würde.
Eine gegenüberliegende Glasplatte ("die obere Platte") wurde mit RepelSilane (Pharmacia Biotech) behandelt, um die Gelanbindung auf ein Mindestmaß zu verringern. Nach der Aufbringung des Reagens wurde die obere Platte durch Aufbringen eines Stroms von erhitzter Luft (z. B. aus einer Heißluftkanone) auf die Oberfläche der Platte erhitzt. Überschüssiges Reagens wurde erneut durch Waschen mit Wasser entfernt, und die obere Platte wurde trocknen gelassen.
Die getrockneten Platten wurden in einen Gießkasten mit einer Kapazität von 13 Gelsandwiches gesetzt. Mehrere Gießkästen können parallel zusammengesetzt werden, um mehr Gele unter den gleichen Bedingungen zu gießen. Die obere und die untere Platte waren durch Distanzstücke mit einer Dicke von 1 mm räumlich voneinander getrennt. Zwischen den Sandwiches waren Zwischenlagen von Acetatbögen vorhanden, um die Trennung der Sandwiches nach der Gelpolymerisation zu erleichtern. Das Gießen wurde dann gemäß Hochstrasser et al., op. cit. vorgenommen .
6.4. SDS-PAGE
Die Gelstreifen vom IEF-Schritt wurden auf die Oberseite des gegossenen SDS-PAGE-Gels aufgebracht und die Elektrophorese begonnen. Um eine gleichmäßige Kühlung des Gels während des Elektrophoresedurchlaufs zu gewährleisten, wurde ein im Wesentlichen wie durch Amess et al., 1995, Electrophoresis 16: 1255–1267 beschriebenes System entworfen. Eine gleichmäßige, leistungsfähige Kühlung ist wünschenswert, um thermale Schwankungen während der Elektrophorese auf ein Mindestmaß zu verringern und daher die Konsistenz der Wanderung der Proteine aufrechtzuerhalten. Die Elektrophorese wurde vorgenommen, bis der Markierungsfarbstoff den unteren Rand des Gels erreichte. Die Gele wurden dann sofort zur Färbung entfernt.
6.5. Färbung
Die obere Platte der Gelkassette wurde sorgfältig entfernt, wodurch das Gel an die untere Platte gebunden belassen wurde. Die untere Platte mit ihrem aufgebrachten Gel wurde dann in einer Färbevorrichtung angeordnet, die eine Kapazität zur Unterbringung von zwölf Gelen aufwies. Die Gele wurden über Nacht zur Gänze in eine Fixiermittellösung eingetaucht, die 40% (v/v) Ethanol, 10% (v/v) Essigsäure und 50% (v/v) Wasser umfasste. Das Fixiermittel wurde dann aus dem Tank abgelassen, und die Gele wurden durch 30minütiges Eintauchen in 7,5% (v/v) Essigsäure und 0,05% (w/v) SDS grundiert. Die Grundierlösung wurde dann abgelassen, und die Gele wurden durch vierstündiges vollständiges Eintauchen in die Färbelösung gefärbt. Eine Stammlösung aus fluoreszierendem Farbstoff wurde durch Verdünnen von Sypro-Rot (Molecular Bioprobes, Inc., Eugene, Oregon) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Die verdünnte Lösung wurde unter Vakuum durch ein 0,4-μm-Filter gefiltert.
Um einen fortlaufenden, gleichmäßigen Kreislauf der verschiedenen Lösungen über alle zwölf Gele zu erreichen, wurden die Lösungen über einen Verteilungsbalken, der sich entlang des Bodens des Tanks über seine gesamte Breite erstreckte und mit Löchern versehen war, die es der Lösung gestatteten, gleichmäßig über jedes der Gele zu fließen, in den Tank eingebracht.
6.6. Abbilden des Gels
Ein computerlesbares Ausgangssignal wurde durch Abbilden der fluoreszierend gefärbten Gele mit einem Storm-Scanner (Mohecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornien) gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Storm User's Guide, 1995, Version 4.0, Teil Nr. 149-355) mit wie nachstehend beschriebenen Modifikationen erzeugt. Da das Gel starr an eine Glasplatte gebunden war, wurde das Gel während des Abbildens in Kontakt mit dem Scannerbett gehalten. Um Interferenzmuster zu vermeiden, die aus einem nicht gleichförmigen Kontakt zwischen dem Gel und dem Scannerbett herrühren, wurde unter dem Gel ein Wasserfilm eingebracht und darauf geachtet, dass Lufteinschlüsse vermieden wurden. Darüber hinaus wurde das Gel in einem Rahmen angeordnet, der mit zwei fluoreszierenden Knöpfen versehen war, die zusammen mit dem Gel abgebildet wurden, um (mit M1 und M2 bezeichnete) Bezugspunkte zum Bestimmen der x,y-Koordinaten von anderen im Gel festgestellten Merkmalen bereitzustellen. Ein übereingestimmter Rahmen , wurde auf einer Robotergelausschneidungsvorrichtung bereitgestellt, um die genaue Ausrichtung des Gels zu bewahren. Nach dem Abbilden wurden die Gele in Polyethylenbeuteln, die eine geringe Menge an Färbelösung enthielten, versiegelt und bei 4 °C gelagert.
Das Ausgangssignal des Scanners wurde zuerst unter Verwendung von MELANIE^® verarbeitet, um die Registrierungspunkte M1 und M2 automatisch festzustellen; um die Abbildungen automatisch zu beschneiden (d. h., Signale, die von Bereichen der gescannten Abbildung stammen, welche außerhalb der Grenzen des Gels liegen, zu beseitigen, z. B. den Bezugsrahmen); um Artefakte aufgrund von Staub auszufiltern; um Merkmale festzu"stellen und zu quantifizieren; und um Abbildungsdateien im GIF-Format zu erstellen. Merkmale wurden durch einen computervermittelten Vergleich von möglichen Proteinstellen mit dem Hintergrund zur Auswahl von Bereichen des Gels, die mit einem Signal verbunden sind, das einen gegebenen, die Hintergrundfärbung darstellenden Schwellenwert übersteigt, festgestellt.
Ein zweites Programm wurde für die interaktive Bearbeitung der festgestellten Merkmale und zum Übereinstimmen von Duplikatgelen für jede Probe benutzt. Zuerst wurden die Abbildungen bewertet, um Abbildungen zurückzuweisen, die grobe Abweichungen von der Norm, eine zu geringe Lade- oder Gesamtintensität oder eine zu schwache Auflösung aufwiesen, oder wenn Duplikate einander zu unähnlich waren. Wenn eine Abbildung eines Duplikats zurückgewiesen wurde, wurde unabhängig von der Abbildungsqualität auch die andere zum Duplikat gehörende Abbildung zurückgewiesen. Zurückgewiesene Proben wurden für eine Wiederholungsanalyse vorgemerkt.
Eine Orientierungspunktidentifikation wurde benutzt, um jegliche Veränderlichkeit beim Durchlauf des Gels zu korrigieren. Dieser Vorgang umfasst die Identifizierung von bestimmten Proteinen, von denen erwartet wird, dass sie in jeder gegebenen biologischen Probe gefunden werden. Da diese gemeinsamen Proteine von Probe zu Probe identische isoelektrische Punkte und ein identisches Molekulargewicht zeigen, können sie als Standards zur Korrektur etwaiger möglicher Gelveränderung oder -verzerrung verwendet werden. Die Werte für den isoelektrischen Punkt und das Molekulargewicht für die Orientierungspunkte im Bezugsgel wurden durch einen nebenhergehenden Durchlauf einer Probe mit E. coli-Proteinen, die zuvor in Bezug auf bekanntes Protein in menschlichem Plasma kalibriert wurde, bestimmt. Merkmale, die als Artefakte betrachtet wurden, hauptsächlich an den Rändern der Gelabbildung, und insbesondere jene aufgrund des Probenaufbringungspunkts und der Farbstoff-Front, wurden entfernt. Duplikatgele wurden dann über die Orientierungspunkte ausgerichtet, und ein Übereinstimmungsvorgang wurde durchgeführt, um identische Stellen auf den Duplikatgelen paarweise anzuordnen. Dies stellte eine erhöhte Sicherheit bereit, dass nachfolgend gemessene isoelektrische Punkte und Molekulargewichte genau waren, da paarweise angeordnete Stellen die Reproduzierbarkeit der Abtrennung zeigten. Das korrigierte Gel wurde zusätzlich zur nachfolgenden Analyse zur visuellen Prüfung ausgedruckt.
Der Erzeugung der Abbildung folgte eine Computermessung der x,y-Koordinaten jedes Proteins, die mit besonderen isoelektrischen Punkten und Molekulargewichten unter Bezugnahme auf die bekannten Orientierungspunktproteine oder Standards korreliert wurden. Eine Messung der Intensität jeder Proteinstelle wurde vorgenommen und gespeichert. Für jede Proteinstelle erfolgte die Zuteilung eines Identifikationscodes und eine Übereinstimmung mit einer Stelle auf einem Mastergel, d. h., einem Bezugsgel, das die meisten oder alle in jeder Art von Probe erkannten Proteinstellen enthielt und als Schablone, mit der die Proteinstellen der anderen Proben übereingestimmt wurden, benutzt wurde. Dieser Schritt gestattete die Identifikation von vermeintlichen Korrelatstellen über viele verschiedene Gele hinweg. Die während der Entnahme der ursprünglichen biologischen Probe wie in Abschnitt 5.1. beschrieben erhobenen Daten wurden wieder mit den Geldaten kombiniert, wodurch die Analyse von computerausgewählten Querschnitten der Proben auf Basis von Informationen wie etwa dem Alter oder dem klinischen Ergebnis gestattet wurde.
Das Endergebnis dieses Gesichtspunkts der Analyse war die Erzeugung eines digitalen Profils, das für jede identifizierte Stelle 1) einen einzigartigen Willkürlichen Identifikationscode, 2) die x,y-Koordinaten, 3) den isoelektrischen Punkt, 4) das Molekulargewicht, 5) den Signalwert, 6) die Standardabweichung für jede der vorhergehenden Messungen, und 7) einen Zeiger zum MCI der Stelle auf dem Mastergel, mit dem diese Stelle übereingestimmt wurde, enthielt. Aufgrund des LIMS war dieses Profil zum tatsächlichen gelagerten Gel, aus dem es erzeugt wurde, zurückverfolgbar, so dass Proteine, die durch Computeranalyse von Gelprofildatenbanken identifiziert wurden, wieder abgerufen werden konnten. Das LIMS gestattete auch eine Rückverfolgung des Profils zur ursprünglichen Probe oder zum Patienten.
6.7. Digitale Analyse des Gels Nachdem das Profil erzeugt war, wurde die Analyse auf die Auswahl von interessanten Proteinen gerichtet.
Die Proteinmerkmale in den einzelnen Abbildungen von den paarweise angeordneten Serum- und Synoviaproben wurden elektronisch verglichen. Die molekulare Identität eines beliebigen Merkmals über den Satz von Abbildungen hinweg wird in dieser Analyse als Identität der Position in der 2D-Abtrennung definiert. Die quantitative Messung der Abundanz eines einzelnen Merkmals in einer einzelnen Abbildung beruhte auf der normierten Fluoreszenzintensität, die für dieses Merkmal in dieser Abbildung gemessen wurde. Jene Proteine, deren Abundanz sich zwischen den Sätzen der Serum- und Synoviaproben unterschied, wurden durch einen elektronischen Vergleich aller festgestellten Merkmale in allen relevanten Proben erkannt.
6.8. Rückgewinnung und Analyse von ausgewählten Proteinen
Differentiell ausgedrückte Proteine wurden robotisch ausgeschnitten und verarbeitet, um tryptische Peptide zu erzeugen; teilweise Aminosäuresequenzen dieser Peptide wurden durch Massenspektroskopie unter Verwendung des De-Novo-Sequenzierens bestimmt.
6.9. Ergebnisse
Diese anfänglichen Experimente identifizierten zwölf Proteine, die in der menschlichen RA-Synovia auf höheren Ebenen als in den übereingestimmten Serumproben vorhanden waren, und neun Proteine, die in der menschlichen RA-Synovia auf niedrigeren Ebenen als in den übereingestimmten Serumproben vorhanden waren. Für jedes dieser differentiell ausgedrückten Proteine wurden teilweise Aminosäuresequenzen bestimmt. Eine Computeranalyse von öffentlichen Datenbanken zeigte, dass sechzehn dieser teilweise sequenzierten Proteine in der Technik bekannt waren und fünf in keiner der untersuchten öffentlichen Datenbanken beschrieben waren.

Claims

Computerunterstütztes Verfahren. zum Auswählen und Anweisen der Isolierung eines oder mehrerer Biomoleküle, die in einer zweidimensionalen Anordnung vorhanden sind, welche durch einen Prozess, umfassend einen ersten Abtrennschritt, wobei eine Vielzahl von Biomolekülen gemäß einer ersten physikalischen oder chemischen Eigenschaft abgetrennt werden, um eine eindimensionale Anordnung von Biomolekülen zu bilden, und einen zweiten Abtrennschritt, wobei die eindimensionale Anordnung von Biomolekülen gemäß einer zweiten physikalischen oder chemischen Eigenschaft abgetrennt wird, um die zweidimensionale Anordnung zu bilden, hergestellt wird; wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Abbilden der zweidimensionalen Anordnung oder einer Nachbildung davon, um einen computerlesbares Ausgangssignal zu erzeugen, das für jedes der Vielzahl von Biomolekülen, die in der zweidimensionalen Anordnung festgestellt werden, ein Paar von x,y-Koordinaten und einen Signalwert umfasst; Verarbeiten des Ausgangssignals in zumindest einem Computer, um eines oder mehrere der festgestellten Biomoleküle gemäß im voraus bestimmten oder benutzerspezifizierten Gesichtspunkten auszuwählen; Erzeugen von maschinenlesbaren Befehlen, die eine Robotervorrichtung anweisen, zumindest eines der ausgewählten Biomoleküle aus der zweidimensionalen Anordnung zu isolieren; und Isolieren zumindest eines der ausgewählten Biomoleküle aus der zweidimensionalen Anordnung durch die Robotervorrichtung gemäß den maschinenlesbaren Befehlen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Abbilden der zweidimensionalen Anordnung durch eine erste Vorrichtung durchgeführt wird, und eine zweite, physisch getrennte Robotervorrichtung geleitet wird, um das (die) ausgewählte(n) Biomolekül e) zu isolieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei des computerlesbare Ausgangssignal für jedes einer Vielzahl von Biomolekülen, die in der zweidimensionalen Anordnung vorhanden sind, ein Paar von x,y-Koordinaten umfasst, und die maschinenlesbaren Befehle die x- und y-Bewegungen der Robotervorrichtung anweisen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Abbilden der zweidimensionalen Anordnung unter Verwendung eines Fluoreszenzscanners durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei maschinenlesbare Befehle erzeugt werden, die eine Robotervorrichtung anweisen, mehr als ein ausgewähltes Biomolekül aus der zweidimensionalen Anordnung zu isolieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vielzahl der Biomoleküle aus einer biologischen Probe stammt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Biomoleküle Oligosaccharide sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Biomoleküle Proteine sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Proteine Glykoproteine umfassen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweidimensionale Anordnung in einem Gel enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die zweidimensionale Anordnung in einem Polyacrylamidgel enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die zweidimensionale Anordnung durch isoelektrische Fokussierung, gefolgt von Elektrophorese in Anwesenheit von Natriumdodecylsulfat hergestellt . wird.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das Gel an einen im Allgemeinen flachen festen Träger gebunden ist, so dass das Gel zweidimensionale räumliche Stabilität aufweist, und der Träger im Wesentlichen nichtstörend in Bezug auf die Feststellung einer durch die Proteine Trägergeln feststellbaren Markierung ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei ein Polyacrylamidgel kovalent an den festen Träger gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei die feststellbare Markierung eine fluoreszierende Markierung ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der feste Träger Glas ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei die Isolierung eines ausgewählten Biomoleküls eine Ausschneidung eines Teils des Gels, der das ausgewählte Biomolekül enthält, umfasst.
Vorrichtung zur computerunterstützten Isolierung eines oder mehrerer ausgewählter Biomoleküle, die in einer zweidimensionalen Anordnung, enthalten in einem Polyacrylamidgel, vorhanden sind, welche durch einen Prozess, umfassend einen ersten Abtrennschritt, wobei eine Vielzahl von Biomolekülen gemäß einer ersten physikalischen oder chemischen Eigenschaft abgetrennt werden, um eine eindimensionale Anordnung von Biomolekülen zu bilden, und einen zweiten Abtrennschritt, wobei die eindimensionale Anordnung von Biomolekülen gemäß einer zweiten physikalischen oder chemischen Eigenschaft abgetrennt wird, um die zweidimensionale Anordnung zu bilden, hergestellt wird; wobei die Vorrichtung Folgendes umfasst: einen Detektor, der fähig ist, die zweidimensionale Anordnung abzubilden, um ein computerlesbares Ausgangssignal zu erzeugen, das für jedes der Vielzahl von Biomolekülen in der zweidimensionalen Anordnung ein Paar von x,y-Koordinaten und einen Signalwert umfasst; einen oder mehrere Computer, die programmiert sind, um eines oder mehrere Biomoleküle, die im Ausgangssignal dargestellt sind, gemäß im voraus bestimmten oder benutzerspezifizierten Gesichtspunkten auszuwählen, und maschinenlesbare Befehle zu erzeugen, die eine Robotervorrichtung anweisen, zumindest eines der ausgewählten Biomoleküle zu isolieren; und eine Robotervorrichtung, die fähig ist, gemäß den Befehlen durch Entfernung eines Teils des Gels, der das ausgewählte Biomolekül enthält, zumindest eines der ausgewählten Biomoleküle zu isolieren, wobei der Detektor betriebsfähig mit zumindest einem des einen oder der mehreren Computer verbunden ist, und zumindest einer des einen oder der mehreren Computer betriebsfähig mit der Robotervorrichtung verbunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Detektor physisch von der Robotervorrichtung getrennt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, wobei die Robotervorrichtung ausgelegt ist, unter der Anweisung der maschinenlesbaren Befehle x- und y-Bewegungen durchzuführen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Detektor ein Fluoreszenzscanner ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei die Biomoleküle wie in einem der Ansprüche 7 bis 9 definiert sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, wobei das Polyacrylamidgel an einen im Allgemeinen flachen festen Träger gebunden ist, so dass das Gel zweidimensionale räumliche Stabilität aufweist, und der Träger im Wesentlichen nichtstörend in Bezug auf die Feststellung einer durch die Proteine Trägergeln feststellbaren Markierung ist.
Vorrichtung nach Anspruch 23, wobei das Polyacrylamidgel kovalent an den festen Träger gebunden ist.
Vorrichtung nach Anspruch 23 oder 24, wobei der feste Träger Glas ist.