DE69719220T2

DE69719220T2 - Neue nucleotidanaloga

Info

Publication number: DE69719220T2
Application number: DE69719220T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Imanishi
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-11-18
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2004-01-22
Anticipated expiration: 2017-11-19
Also published as: EP0963997A4; ATE232880T1; EP0963997A1; AU4966997A; WO1998022489A1; US6043060A; ES2192672T3; DE69719220D1; EP0963997B1

Description

Technischer Hintergrund
Diese Erfindung betrifft ein neues Nucleotidanalog und insbesondere ein Nucleotidanalog, das als ein Antisense-Molekül geeignet ist.
Stand der Technik
Im Jahr 1978 wurde zum ersten Mal berichtet, daß ein Antisense-Molekül eine Influenzavirusinfektion hemmte. Seitdem sind Berichte veröffentlicht worden, daß Antisense-Moleküle die Expression von Onkogenen und eine HIV-Infektion hemmten. In den letzten Jahren haben sich Antisense-Oligonucleotide zu einem der vielversprechendsten Arzneimittel entwickelt, da sie die Expression unerwünschter Gene spezifisch kontrollieren.
Die Antisense-Methode basiert auf der Idee, einen als das zentrale Dogma bezeichneten unidirektionalen Fluß, d.h. DNA → RNA → Protein, durch die Verwendung eines Antisense-Oligonucleotids zu kontrollieren.
Wenn bei dieser Methode jedoch ein natürlich vorkommendes Oligonucleotid als Antisense-Molekül verwendet wurde, wurde es durch Enzyme in vivo hydrolysiert oder seine Permeation durch die Zellmembran war gering. Um diese Probleme zu lösen, sind zahlreiche Nucleinsäurederivate synthetisiert und Studien darüber durchgeführt worden. Beispiele für synthetisierte Derivate schließen ein Phosphorthioat mit einem Schwefelatom, das ein Sauerstoffatom an dem Phosphoratom ersetzt, und ein Methylphosphonat mit einer substituierenden Methylgruppe ein. Vor kurzem sind Moleküle synthetisiert worden, worin auch das Phosphoratom durch ein Kohlenstoffatom ersetzt worden ist, oder worin die Ribose in ein acyclisches Grundgerüst umgewandelt worden ist (Eckstein F. et al., Biochem. 18 (1979), 592; Miler, P. S. et al., Nucleic Acids Res. 11 (1983), 5189; Herdewijn P. et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 (1993), 1567; und Nielsen P. E. et al., Science 254 (1991), 1497).
Sämtliche der erhaltenen Derivate waren jedoch im Hinblick auf die in vivo-Stabilität oder die Einfachheit der Oligonucleotidsynthese unzureichend.
Unter diesen Umständen bestand die Nachfrage nach der Bereitstellung eines Nucleotidanalogs für ein Antisense-Molekül, das ohne weiteres die Zellmembran in vivo durchdringt, das durch ein Enzym minimal hydrolysiert wird und dessen Synthese einfach ist.
Offenbarung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein Nucleinsäurederivat mit einem modifizierten Zuckeranteil einer Nucleinsäure entwickelt, das bei der Antisense-Methode nützlich wäre. Sie haben das Nucleinsäurederivat synthetisiert und seine Nützlichkeit bestätigt. Die vorliegende Erfindung wird nun beschrieben.
Ein erfindungsgemäßes Nucleotidanalog ist ein Oligo- oder Polynucleotidanalog, das eine oder mehrere monomere Einheiten enthält, die Nucleotidanaloga der folgenden allgemeinen Formel sind:

worin B identisch oder verschieden sein kann und eine Pyrimidin- oder Purinnucleinsäurebase oder ein Derivat davon ist.
Diese monomere Einheit ist ein Nucleosidanalog der allgemeinen Formel:

worin B eine Pyrimidin- oder Purinnucleinsäurebase oder ein Derivat davon ist, Y₁ und Y₂ identisch oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für eine Hydroxylgruppe sind; mit der Maßgabe, daß die Schutzgruppe eine allgemein bekannte Gruppe, vorzugsweise ein Alkylrest, Alkenylrest, Alkynylrest, Cycloalkylrest, Arylrest, Acylrest, Aralkylrest oder ein Silylrest, oder ein Amiditderivat davon sein kann.
In der vorstehenden Formel bedeutet der Alkylrest einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen. Beispiele davon schließen eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, i-Propyl, n-Butyl-, t-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- und Decylgruppe ein.
Der Alkenylrest bedeutet einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkenylrest mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen. Beispiele davon schließen eine Vinyl-, Allyl-, Butenyl-, Pentenyl-, Geranyl- und Farnesylgruppe ein.
Der Alkynylrest bedeutet einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkynylrest mit 2 bis 20 Kohlenstoffatomen. Beispiele davon schließen eine Ethynyl-, Propynyl- und Butynylgruppe ein.
Der Cycloalkylrest bedeutet einen Cycloalkylrest mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen und schließt zum Beispiel eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycloheptyl- und Cyclooctylgruppe ein. Ein anderes Beispiel ist eine heterocyclische Gruppe, worin eine oder mehrere beliebige Methylengruppen an dem Ring des Cycloalkylrestes durch ein Sauerstoffatom, Schwefelatom oder ein alkyl-substituiertes Stickstoffatom ersetzt worden sind. Diese ist zum Beispiel eine Tetrahydropyranylgruppe.
Der Arylrest verweist auf einen monovalenten Substituenten, der durch das Entfernen eines Wasserstoffatoms aus einem aromatischen Kohlenwasserstoffrest gebildet wird. Beispiele davon schließen eine Phenyl-, Tolyl-, Xylyl-, Biphenyl-, Naphthyl-, Anthryl- und Phenanthrylgruppe ein. Das Kohlenstoffatom an dem Ring des Arylrestes kann durch einen oder mehrere der folgenden Reste substituiert sein: ein Halogenatom, ein niederer Alkylrest, eine Hydroxylgruppe, ein Alkoxylrest, eine Aminogruppe, eine Nitrogruppe und eine Trifluormethylgruppe. Der Substituent ist in diesem Fall zum Beispiel ein Halogenatom, eine Hydroxylgruppe, eine Aminogruppe, ein Alkexyrest oder ein Aryloxyrest.
Als Acylrest können eine Acetyl-, Formyl-, Propionyl-, Benzoyl- und Benzyloxycarbonylgruppe als Beispiel dienen.
Ein Beispiel für den Silylrest ist ein Trialkylsilylrest, vorzugsweise eine Trimethylsilyl-, Triethylsilyl-, Triisopropylsilyl-, t-Butyldimethylsilyl- oder t-Butyldiphenylsilylgruppe und stärker bevorzugt eine Trimethylsilylgruppe.
Der Aralkylrest verweist auf einen Alkylrest, der durch einen aromatischen Kohlenwasserstoffrest substituiert ist, vorzugsweise eine Benzyl- oder Tritylgruppe. In diesem Fall kann jeder aromatische Ring substituiert sein. Ein noch stärker bevorzugter Aralkylrest ist eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe (DMTr).
Die Pyrimidin- oder Purinnucleinsäurebase in der vorliegenden Erfindung verweist auf Thymin, Uracil, Cytosin, Adenin, Guanin oder ein Derivat davon.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das den zeitlichen Verlauf der Ultraviolettabsorption (260 nm) eines natürlich vorkommenden Oligonucleotids zeigt, das durch eine Exonuclease abgebaut wurde; und
2 ist ein Diagramm, das den zeitlichen Verlauf der Ultraviolettabsorption (260 nm) des erfindungsgemäßen Oligonucleotids (X2) zeigt, das durch eine Exonuclease abgebaut wurde.
Verfahren zur Ausführung der Erfindung
Das erfidungsgemäße Nucleotidanalog kann in der nachstehend beschriebenen Art und Weise synthetisiert werden. Um die Erläuterung zu vereinfachen, wird eine Verbindung, worin B in der Formel Uracil bedeutet, als Beispiel verwendet. 1) Synthese der monomeren Einheit
Eine in der Literatur bekannte Verbindung, 2',3'-O-Cyclohexyliden-uridin (1), wird mit p-Toluolsulfonylchlorid umgesetzt, um Verbindung 2 zu erhalten. Anschließend wird diese Verbindung in TFA-H₂O gerührt, um Verbindung 3, 4'-(p-Toluolsulfonyloxymethyl)uridin, zu erhalten.
Verbindung 3 wird mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid umgesetzt, um Verbindung 4 zu erhalten, die eine geschützte Hydroxylgruppe in der 5'-Position aufweist. Verbindung 4 wird weiter mit NaHMDS umgesetzt, um Verbindung 5, 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3'-O,4'- methanouridin, zu erhalten.
2) Synthese des Oligonucleotidanalogs
Verbindung 5 wird mit 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit umgesetzt, um eine Amiditverbindung (Verbindung 6) zu erhalten, aus der unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts verschiedene Antisense-Oligomeranaloga synthetisiert werden. Anschließend wird das erhaltene Antisense-Oligomeranalog unter Verwendung einer Umkehrphasensäule gereinigt. Die Reinheit der gereinigten Verbindung wird durch eine Umkehrphasen-HPLC untersucht, wodurch die Bildung eines gereinigten Oligonucleotidanalogs bestätigt werden kann.
Mindestens eine monomere Einheit ist als Verbindung 5 in dem Oligonucleotidanalog enthalten. In einer anderen Ausführungsform können die monomeren Einheiten an zwei oder mehreren Stellen in dem Oligonucleotidanalog in einer solchen Art und Weise vorliegen, so daß sie voneinander durch ein oder mehrere natürlich vorkommende Nucleotide getrennt sind. Die vorliegende Endung ermöglicht die Synthese eines Antisense-Moleküls, das die erforderliche Anzahl der erfindungsgemäßen Nucleotidanaloga (die erforderliche Länge des Nucleotidanalogs) an einer erforderlichen Stelle einschließt. Die Länge des gesamten Nucleotidanalogs beträgt 2 bis 50, vorzugsweise 10 bis 30 Nucleosideinheiten.
Ein solches Antisense-Molekül wird durch eine Endonuclease sowie eine Exonuclease minimal abgebaut und kann in vivo für einen langen Zeitraum nach der Verabreichung existieren. Dieses Antisense-Molekül bildet zusammen mit einer Sinnstrang-RNA eine Doppelhelix, um die Bildung (Translation) einer pathogenen in vivo-Komponente (Protein) zu hemmen, oder bildet in Kombination mit einer doppelsträngigen DNA eine Dreifachhelix, um die Transkription in mRNA zu hemmen. Das Antisense-Molekül kann auch die Vermehrung eines infizierenden Virus hemmen. Im Hinblick auf diese Erkenntnisse wird erwartet, daß ein Antisense-Molekül unter Verwendung des erfindungsgemäßen Nucleotid analogs in Form von Arzneimitteln, einschließlich antineoplastischen und antiviralen Mitteln, zur Behandlung von Erkrankungen durch Hemmung der Wirkungen von Genen Verwendung findet.
Das Antisense-Molekül unter Verwendung des erfindungsgemäßen Nucleotidanalogs kann durch die Beimischung herkömmlicher Hilfsmittel wie Puffer und/oder Stabilisatoren zu parenteralen Präparaten formuliert werden. Zur topischen Anwendung kann es mit allgemein gebräuchlichen pharmazeutischen Trägern vermischt werden, um Salben, Cremes, Flüssigkeiten oder Pflaster herzustellen.
Die Synthese des erfindungsgemäßen Nucleotidanalogs wird durch die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben.
Beispiel 1: Synthese einer monomeren Einheit
(1) Synthese von 2',3'-O-Cyclohexyliden-4'-(p-toluolsulfonyloxymethyl)uridin
(Verbindung 2)
Zu einer wasserfreien Pyridinlösung (13,5 ml) der in der Literatur (Jones G. H. et al., J. Org. Chem. 44 (1979), 1309) bekannten Verbindung 1 (956 mg, 2,70 mmol) wurde p-Toluolsulfonylchlorid (771 mg, 4,05 mmol) bei Raumtemperatur in einem Stickstoffstrom zugegeben. Das Gemisch wurde für 5 Stunden bei 60°C gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung zugegeben, danach wurde das Reaktionssystem mit Benzol dreimal extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung einmal gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde dreimal einer Azeotropie mit Benzol unterzogen. Das erhaltene Rohprodukt wurde mittels Silicagelsäulenchromatographie (CHCl₃ : MeOH = 15 : 1) gereinigt und aus Benzol/Hexan wieder ausgefällt, wobei ein weißes Pulver (Verbindung 2) (808 mg, 1,59 mmol, 59%) erhalten wurde.
Smp.: 104–106°C (Benzol/Hexan)
IR (KBr): ν_max 3326, 2929, 2850, 1628, 1577, 1544, 1437, 1311, 1244 cm^–1. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 1.45–1.67 (10H, m, Cyclohexyl-), 2.45 (3H, s, Φ-CH₃), 3.71 (2H, ABq, J = 11.5 Hz, C5'-H₂), 4.20 (2H, ABq, J=10.5 Hz, C4'-CH₂OTs), 4.92 (1H, d, J₂'₃' = 6.4 Hz, C3'-H), 5.05, 5.06 (1H, dd, J₁'₂' = 3.7 Hz, J₂'₃' = 6.4 Hz, C2'-H), 5.60 (1H, d, J₄'₅' = 7.3 Hz, C4-H), 5.75 (1H; d, J₁'₂' = 3.7 Hz, C1'-H), 7.48 (2H, d, J = 8.2 Hz, Φ), 7.77 (1H, d, J₄'₅' = 7.8 Hz, C5-H), 7.81 (2H, d, J = 8.2 Hz, Φ), 10.10 (1H, s, NH).
¹³C-NMR (Aceton-d₆): δ 21.5, 24.1, 24.5, 25.5, 34.8, 36.9, 63.5, 69.7, 82.5, 84.7, 87.8, 92.9, 102.9, 115.4, 128.8, 130.8, 133.9, 142.7, 145.9, 151.3, 163.5.
Masse (EI): m/z 481 (M⁺-H₂O).
Analyse berechnet für C₂₃H₂₈N₂O₉S·1/3 H₂O: C = 53,69; H = 5,61; N = 5,44; S = 6,22.
Festgestellt: C = 53,99; H = 5,48; N = 5,42; S = 6,10.
(2) Synthese von 4'-(p-Toluolsulfonyloxymetyl)uridin (Verbindung 3)
Die vorstehende Verbindung 2 (107 mg, 0,21 mmol) wurde in THF-H₂O (98 : 2, 1 ml) für 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter vermindertem Druck abdestilliert, und zu dem Rückstand wurde Ethanol zugegeben, gefolgt von der Durchführung einer dreimaligen Azeotropie. Das erhaltene Rohprodukt wurde mittels Silicagelsäulenchromatographie (CHCl₃ : MeOH = 10 : 1) gereinigt, wobei ein weißes Pulver (Verbindung 3) (85,0 mg, 0,20 mmol, 94%) erhalten wurde.
Smp.: 119–120°C
IR (KBr): ν_max 3227, 3060, 2932, 2837, 1709, 1508, 1464, 1252, 978, 835, 763, 556 cm^–1.
1H-NMR (Aceton-d₆): δ 2.31 (3H, s, Φ-CH₃), 2.84 (3H, s, OH), 3.71 (2H, s, C5'-H₂), 4.13, 4.20 (2H, ABq, J = 10.9 Hz, C4'(CH₂OTs), 4.28, 4.31 (1H, dd, J₁'₂' = 8.6 Hz, J₂'₃' = 5.6 Hz, C2'-H), 4.36 (1H, d, J₂'₃' = 5.6 Hz, C3'-H), 5.54 (1H, d, J₄'₅' = 7.9 Hz, C4-H), 5.75 (1H, d, J₁'₂' = 6.6 Hz, C1'-H), 7.32 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.67 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.70 (1H, d, J₄'₅' = 8.3 Hz, C5-H), 10.14 (1H, s, NH).
¹³C-NMR (Aceton-d₆): δ 21.5, 63.7, 70.8, 72.7, 74.6, 86.8, 88.8, 103.1, 128.8, 130.7, 133.9, 141.7, 145.8, 151.8, 163.9.
Masse(EI): m/z 256 (M⁺-OTs).
(3) Synthese von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-4'-(p-toluolsulfonyloxymethyl)uridin (Verbindung 4)
Zu der vorstehenden Verbindung 3 (1,13 g, 2,64 mmol) wurde wasserfreies Pyridin zugegeben, und es wurde eine dreimalige Azeotropie durchgeführt, um eine wasserfreie Pyridinlösung (14,5 ml) zu bilden. Anschließend wurde 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (1,07 g, 3,17 mmol) bei Raumtemperatur in einem Stickstoffstrom zugegeben, und das Gemisch wurde für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Zu dem Reaktionsgemisch wurde eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung zugegeben, danach wurde das Reaktionssystem mit CH₂Cl₂ dreimal extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung einmal gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wurde einer zweimaligen Azeotropie mit Benzol unterzogen. Das erhaltene Rohprodukt wurde mittels Silicagelsäulenchromatographie (CHCl₃: Et₃N : MeOH = 60 : 2 : 0 → 60 : 2 : 4) gereinigt und aus Ethanol/Hexan wieder ausgefällt, wobei ein weißes Pulver (Verbindung 4) (868 mg, 1,06 mmol, 41%) erhalten wurde.
Smp.: 104–105°C (Et₂O/Hexan).
IR (KBr): ν_max 3396, 2937, 2737, 2675, 2493, 1691, 1474, 1397, 1173, 1035 cm^–1.
¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 2.41 (3H, s, Φ-CH₃), 3.22, 3.33 (2H, ABq, J = 9.9 Hz, C5'-H₂), 3.79 (6H, s, p-OCH₃-Φ), 4.29 (1H, dd, J₁'₂' = 6.3 Hz, J₂'₃' = 5.6 Hz, C2'-H), 4.34, 4.41 (2H, ABq, J = 11.2 Hz, C4'-CH₃OTs), 4.40 (1H, d, J₂'₃' = 5.6 Hz, C3'-H), 5.35 (1H, d, J₄'₅' = 8.3 Hz, C4-H), 5.82 (1H, d, J₁'₂' = 6.3 Hz, C1'-H), 6.89 (4H, d, J = 8.9 Hz, p-CH₃O-Φ), 7.26–7.41 (7H, m), 7.43 (1H, d, J₄'₅' = 8.3 Hz, C5-H), 7.70 (2H, d, J = 8.3 Hz).
¹³C-NMR (Aceton-d₆): δ 21.6, 55.5, 64.6, 70.7, 72.7, 74.3, 85.8, 87.8, 88.9, 102.8, 114.0, 127.7, 128.7, 128.8, 130.7, 130.9, 131.0, 133.9, 141.1, 145.5, 151.4, 159.7, 163.3.
Analyse berechnet für C₃₈H₃₈N₂O₁₁S·1/3 H₂O: C = 61,95; H = 5,29; N = 3,80; S = 4,34.
Festgestellt: C = 62,37; H = 5,26; N = 3,60; 5 = 4,15.
(4) Synthese von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3'-O,4'-methanouridin (Verbindung 5)
Zu Verbindung 4 (735 mg, 0,90 mmol) in wasserfreiem THF (11,1 ml) wurde eine wasserfreie Benzollösung (4 ml) von NaHMDS (8,96 mmol) bei Raumtemperatur in einem Stickstoffstrom zugegeben, und das Gemisch wurde für 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung zugegeben, danach wurde das Reaktionssystem mit CH₂Cl₂ dreimal extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung einmal gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet.
Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck abdestilliert, und das erhaltene Rohprodukt wurde mittels Silicagelsäulenchromatographie (CHCl₃: Et₃N : MeOH = 60 : 2 : 0 → 60 : 2 : 4) gereinigt. Das gereinigte Produkt wurde aus Ethanol/Hexan wieder ausgefällt, wobei ein weißes Pulver (Verbindung 5) (261 mg, 0,47 mmol, 52%) erhalten wurde.
Smp.: 120–121°C (Et₂O/Hexan).
IR (KBr): ν_max 3395, 3222, 3062, 2930, 1693, 1508, 1461, 1385, 1298, 1252, 1177, 1034 cm^–1. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 2.92 (1H, br s, OH), 3.47, 3.51 (2H, ABq, J = 10.3 Hz, C5'-H₂), 3.85 (6H, s, p-OCH₃-Φ), 4.36 (1H, dd, J₁'₂' = 4.3 Hz, J₂'₃' = 4.3 Hz, C2'-H), 4.52, 4.83 (2H, ABq, J = 7.7 Hz, C4'-CH₂O-), 5.11 (1H, d, J₂'₃' = 4.3 Hz, C3'-H), 5.57 (1H, d, J₄'₅' = 7.7 Hz, C4-H), 6.51 (1H, d, J₁'₂' = 7.7 Hz, C1'-H), 6.96 (4H, d, J = 8.6 Hz, p-CH₃O-Φ), 7.39–7.41 (7H, m, Φ), 7.52 (2H, d, J = 5.1 Hz, Φ), 7.71 (1H, d, J₄'₅' = 8.6 Hz, C5-H).
¹³C-NMR (Aceton-d₆): δ 55.4, 64.1, 75.5, 79.0, 85.5, 86.2, 87.1, 88.8, 103.3, 113.7, 113.9, 127.6, 128.4, 128.6, 128.8, 129.9, 130.9, 131.1, 136.3, 136.4, 141.2, 145.7, 151.6, 159.6, 163.4.
Masse (EI): m/z 558 (M⁺), 303 (DmTr⁺), 256 (M⁺-DmTr), 227 (M⁺-DmTrOCH₂).
(5) Synthese von 2'-O-[2-Cyanoethoxy(diisopropylamino)phosphino]-5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-3'-O,4'-methanouridin (Verbindung 6)
Verbindung 5 (261 mg, 0,47 mmol) und Düsopropylammoniumtetrazolid (39,9 mg, 0,23 mmol) wurden einer dreimaligen Azeotropie mit wasserfreiem CH₃CN unterzogen und anschließend in eine Lösung in wasserfreiem CH₃CN-wasserfreiem THF (5 : 1, 10 ml) überführt. Dann wurde 2-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit (0,18 ml, 0,56 mmol) in einem Stickstoffstrom zugegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Die Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck abdestilliert, und das erhaltene Rohprodukt wurde mittels Silicagelsäulenchromatographie (wasserfreies AcOEt : Et₃N = 100 : 4) gereinigt. Anschließend wurde das gereinigte Produkt aus wasserfreiem Diethylether/Hexan wieder ausgefällt, wobei ein weißes Pulver (Verbindung 6) (340 mg, 0,47 mmol, 100%) erhalten wurde.
Smp.: 94–96°C (Et₂O/Hexan).
IR (KBr): ν_max 2966, 2252, 2049, 1697, 1607, 1509, 1460, 1298, 1253, 1038 cm^–1.
³¹P-NMR (Aceton-d₆): δ 150,8, 151,2. Beispiel 2: Synthese von Oligonucleotidanaloga
(1) Synthese von 5'-GCGXTTTTTGCT-3' (XT5)
Eine Dimethoxytritylgruppe (DMTr-Gruppe) von 5'-O-Dimethoxytritylthymidin (0,2 μmol) mit einer 3'-Hydroxylgruppe, die an einen Träger gebunden ist, wurde mit Trichloressigsäure abgespalten. Die 5'-Hydroxylgruppe davon wurde unter Verwendung von Tetrazol mit einem 5'-O-Dimethoxytrityldesoxycytidin-2-cyanoethylphosphoamiditderivat kondensiert. Die nicht umgesetzte 5'-Hydroxylgruppe wurde mit Essigsäureanhydrid, 4-Dimethylaminopyridin und 2,4,6-Collidin acetyliert, und anschließend wurde das Phosphor mit Iod, 2,4,6-Collidin und Wasser oxidiert.
In ähnlicher Weise wurden die Abspaltung der Schutzgruppe, die Kondensation, Acetylierung und Oxidation wiederholt. (Ein Amiditderivat mit einem 4-gliedrigen Ring war ähnlich wie andere Amiditderivate auch verwendbar.) Das letzte 5'-O-Dimethoxytrityldesoxyguanosin-2-cyanoethylphosphoamiditderivat wurde kondensiert und oxidiert. Das erhaltene 12-Mer-Oligomer (die Schritte bis zur Bildung dieses Produkts wurden mit einem Pharmacia DNA-Synthesegerät, Gene Assembler Plus, durchgeführt) wurde unter Verwendung von 1 ml konzentriertem wäßrigem Ammoniak von dem Träger abgespalten. Zur gleichen Zeit wurde die Cyanoethylgruppe von dem Phosphor abgelöst, und die Schutzgruppen für das Adenin, Guanin und Cytosin wurden auch entfernt.
Das erhaltene 5'-O-Dimethoxytrityloligonucleotid wurde unter Verwendung von 5 ml Trifluoressigsäure über eine Umkehrphasensäule (Millipore, Oligo-Pak^TM SP) von den DMTr-Gruppen befreit und weiter gereinigt, um das gewünschte 5'-GCGXTTTTTGCT-3' (XT5) (0,02 mmol, 10%) zu erhalten. Die Reinheit des erhaltenen Oligonucleotidanalogs wurde mittels Umkehrphasen-HPLC bestätigt.
(2) Synthese von 5'-GCGTTXTTTGCT-3' (T2XT3)
Das gewünschte 5'-GCGTTXTTTGCT-3' (T2XT3) (0,04 mmol, 20%) wurde in der gleichen Art und Weise wie in (1) erhalten.
(3) Synthese von 5'-GCGTTTXTTGCT-3' (T3XT2)
Das gewünschte 5'-GCGTTTXTTGCT-3' (T3XT2) (0,03 mmol, 15%) wurde in der gleichen Art und Weise wie in (1) erhalten.
(4) Synthese von 5'-GCGTTTTTXGCT-3' (T5X)
Das gewünschte 5'-GCGTTTTTXGCT-3' (T5X) (0,02 mmol, 10%) wurde in der gleichen Art und Weise wie in (1) erhalten.
(5) Synthese von 5'-GCGXXTTTTGCT-3' (X2T4)
Das gewünschte 5'-GCGXXTTTTGCT-3' (X2T4) (0,03 mmol, 15%) wurde in der gleichen Art und Weise wie in (1) erhalten.
(6) Synthese von 5'-GCGTTXXTTGCT-3' (T2X2T2)
Das gewünschte 5'-GCGTTXXTTGCT-3' (T2X2T2) (0,03 mmol, 15%) wurde in der gleichen Art und Weise wie in (1) erhalten.
(7) Synthese von 5'-GCGTTTTXXGCT-3' (T4X2)
Das gewünschte 5'-GCGTTTTXXGCT-3' (T4X2) (0,03 mmol, 15%) wurde in der gleichen Art und Weise wie in (1) erhalten.
(8) Synthese von 5'-GCGXXXXXXGCT-3' (X6)
Das gewünschte 5'-GCGXXXXXXGCT-3' (X6) (0,03 mmol, 15%) wurde in der gleichen Art und Weise wie in (1) erhalten.
Versuchsbeispiel 1: Messung der Schmelztemperatur (Tm)
Die Tm-Werte von Anlagerungsprodukten zwischen Oligomersträngen (Antisense-Stränge), welche die verschiedenen in Beispiel 2 synthetisierten Antisense-Moleküle waren, und den entsprechenden Sense-Strängen wurden gemessen, um die Hybridisierungsfähigkeit der Antisense-Moleküle zu untersuchen.
Jede Probenlösung (500 μl) mit Endkonzentrationen von 100 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,2), 4 μM Antisense-Strang bzw. 4 μM Sense-Strang wurde in kochendem Wasser gebadet und über 10 Stunden auf Raumtemperatur gekühlt. Die Probenlösung wurde allmählich auf 5°C gekühlt, für einen weiteren Zeitraum von 20 Minuten bei 5°C gehalten und dann gemessen, wobei ein Stickstoffstrom durch eine Zellkammer eines Spektrophotometers (UV-2100PC, Shimadzu) geleitet wird, um die Bildung von Kondenswasser zu verhindern. Die Temperatur wurde in einer Rate von 0,2°C/Minute bis auf 90°C erhöht, und die Ultraviolettabsorption bei 260 nm wurde in Intervallen von 0,1 °C gemessen. Um Konzentrationsänderungen bei den Temperaturerhöhungen zu verhindern, wurde die Zelle mit einem Verschluß versehen, und während der Messung wurde ein Tropfen Mineralöl auf die Oberfläche der Probenlösung aufgebracht.
Die Sequenzen der bei den Messungen verwendeten Antisense-Stränge und der Sense-Stränge sind nachstehend tabellarisch aufgeführt.
Der Einfachheit halber werden in der Beschreibung dieser Anmeldung natürliche Nucleotide als Großbuchstaben wie T, C, A und G und die erfindungsgemäßen Analoga als Kleinbuchstaben wie t, c, a und g geschrieben.
Schmelztemperaturen von Oligomeren
Versuchsbeispiel 2: Messung der Enzymbeständigkeit
Ein natürliches Oligonucleotid und ein nicht-natürliches Oligonucleotid wurden auf die Beständigkeit gegen eine Exonuclease untersucht, die das Oligonucleotid beginnend am 3'-Ende abbaut.
Eine Pufferlösung (0,003 E/ml, 400 μl) einer Phosphodiesterase aus Schlangengift wurde mit einer Pufferlösung (10 μM, 400 μl) des für 15 Minuten bei 37°C gehaltenen Oligonucleotids gemischt. Erhöhungen der Ultraviolettabsorption (260 nm) infolge des Abbaus des Oligomeren wurden über die Zeit bei 37°C mit Hilfe einer Shimadzu UV-2100PC-Vorrich tung gemessen. Der verwendete Puffer umfaßte 0,1 M Tris-HCl (pH 8,6), 0,1 M NaCl und 14 mM MgCl₂ und wurde vor der Messung ausreichend entgast.
Die Sequenzen der zur Messung verwendeten Oligonucleotide waren wie folgt:
Messung der Halbwertszeit (t_1/2):
Die Ultraviolettabsorption (260 nm) wurde gemessen zu Beginn der Messung (t = 0) und zu dem Zeitpunkt, wo keine Erhöhung dieses Parameters aufgezeichnet wurde. Der Durchschnitt der gemessenen Werte wurde als die Halbwertszeit (t_1/2) bezeichnet. Die Ergebnisse sind nachstehend angegeben.

Oligonucleotid t_1/2 (Sekunden)

Natürlicher Strang 350

X2 1390
Diagramme, die den zeitlichen Verlauf der Ultraviolettabsorption zeigen, sind als 1 (natürlicher Strang) und 2 (X2) dargestellt. Die Ultraviolettabsorption erreichte in etwa 30 Minuten für den natürlichen Strang und in etwa 90 Minuten für X2 nach Einleitung der Enzymreaktion ein Plateau.

Claims

Oligo- oder Polynucleotidanalog, enthaltend eine oder mehrere monomere Einheiten der allgemeinen Formel:
worin B identisch oder verschieden sein kann und eine Pyrimidin- oder Purinnucleinsäurebase oder ein Derivat davon ist.
Oligo- oder Polynucleotidanalog nach Anspruch 1, umfassend eine Gesamtzahl von 2 bis 50 Nucleotideinheiten.
Nucleosidanalog der allgemeinen Formel:
worin B eine Pyrimidin- oder Purinnucleinsäurebase oder ein Derivat davon ist, und Y1 und Y2 identisch oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe für eine Hydroxylgruppe sind.
Nucleosidanalog nach Anspruch 3, wobei die Schutzgruppe ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Acyl-, Aralkyl-, oder Silylrest ist; oder ein Amiditderivat davon.
Verfahren zur Herstellung eines Nucleosidanalogs nach Anspruch 3 oder 4, wobei das Verfahren den Schritt der Umsetzung eines 4'-(p-Toluolsulfonyloxymethyl)-nucleosids oder eines 5'- und/oder 2'-Hydroxylgruppengeschütztes Derivats davon mit NaHMDS umfasst.
Arzneimittel umfassend das Oligo- oder Polynucleotidanalog nach Anspruch 1 oder 2 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.
Verwendung des Oligo- oder Polynucleotidanalogs nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von neoplastischen und/oder viralen Erkrankungen.