DE69637011T2

DE69637011T2 - Herstellung enzymatisch aktiver, rekombinanter carboxypeptidase b

Info

Publication number: DE69637011T2
Application number: DE69637011T
Authority: DE
Inventors: Jacob Hartman; Netta Fulga; Simona Mendelovitch; Marian Gorecki
Original assignee: Ferring International Center SA
Current assignee: Ferring International Center SA
Priority date: 1995-01-25
Filing date: 1996-01-25
Publication date: 2007-12-13
Anticipated expiration: 2016-01-26
Also published as: HUP9800091A3; CA2210242A1; DK0871718T3; NZ302874A; HUP9800091A2; KR100566136B1; IL116696A; IL116696A0; AU698889B2; US5948668A; EP0871718B1; WO1996023064A1; PL183228B1; HK1014986A1; CN1144874C; CA2210242C; CN1177377A; ES2284167T3; ZA96515B; CZ225897A3

Description

Dies ist eine Teilfortführungsanmeldung der U.S.-Anmeldung Serien-Nr. 08/378,233, eingereicht am 25. Januar 1995, deren Inhalte hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
In dieser ganzen Beschreibung wird auf verschiedene Publikationen durch arabische Ziffern innerhalb runder Klammern verwiesen. Vollständige Literaturstellen für diese Quellenangaben können am Ende der Beschreibung unmittelbar vor den Patentansprüchen gefunden werden. Die Offenbarungen dieser Publikationen in ihren Gesamtheiten werden hiermit durch Bezugnahme in diese Beschreibung eingebunden, um vollständiger den Stand der Technik zu beschreiben, zu dem diese Erfindung gehört.
Natürlich vorkommende Carboxypeptidase B [Peptidyl-L-Lysin (-L-Arginin)-Hydrolase EC 3.4.17.2] ist eine Zink enthaltende pankreatische Exopeptidase, die spezifisch C-terminales Arg, Lys oder Orn von Peptiden entfernt (1,2).
Natürlich vorkommende Ratten-Carboxypeptidase B wird aus einem Vorläuferprotein, Pre-Pro-Carboxypeptidase B, hergestellt, das ein 108 Aminosäure langes N-terminales Fragment enthält, welches die Signalsequenz (13 Aminosäuren) und ein Aktivierungspeptid (95 Aminosäuren) beinhaltet. Pre-Pro-Carboxypeptidase B ist enzymatisch inaktiv.
Während des Transports der Pre-Pro-Carboxypeptidase B zum endoplasmatischen Retikulum wird das Signalpeptid abgespalten; der resultierende enzymatisch inaktive Pro-Carboxypeptidase B-Vorläufer wird aus der Zelle sezerniert. Die enzymatisch aktive Carboxypeptidase B wird dann durch Spaltung des Aktivierungspeptids durch Trypsin gebildet (7).
Reife Ratten-Carboxypeptidase B enthält 307 Aminosäuren (5) und hat ein offensichtliches Molekulargewicht von 35 kD. Sie enthält sieben Cystein-Reste, von denen sechs zu S-S-Bindungen gepaart sind.
Carboxypeptidase B wird weithin für kommerzielle und Forschungszwecke verwendet, wie bei der Herstellung von Insulin und anderen biologisch aktiven Polypeptiden, und bei der Proteinsequenz-Analyse.
Kommerziell erhältliche Carboxypeptidase B, gereinigt von Schweinepankreas, ist sehr teuer und ist nicht völlig frei von anderen Proteasen.
Die Teil-Aminosäuresequenz des Vorläufers Pro-Carboxypeptidase B vom Schwein und die vollständige Aminosäuresequenz der Carboxypeptidase B vom Rind wurden publiziert (3 bzw. 4). Zusätzlich wurden die vollständige Nucleotidsequenz des Rattengens und die menschliche cDNA publiziert (5 bzw. 6).
Yamamoto et al. (6) berichteten über die rekombinante Expression von enzymatisch inaktiver menschlicher Pro-Carboxypeptidase B, der die ersten 11 Aminosäuren des Aktivierungspeptids fehlten.
Sie berichteten auch über die rekombinante Expression eines enzymatisch inaktiven β-Galactosidase-Pro-Carboxypeptidase B-Fusionsproteins, worin der Pro-Carboxypeptidase die ersten 11 Aminosäuren des Aktivierungspeptids fehlen.
Die Europäische Veröffentlichungsnr. 588118 A2 offenbart ein Knochen-bezogenes Carboxypeptidase-ähnliches Protein, genannt OSF-5. Es wird spekuliert, dass OSF-5 als ein Adhäsionsmolekül oder ein Wachstumsfaktor wirkt und dass es als ein Mittel zur Behandlung von Knochen-Stoffwechselkrankheiten verwendet werden kann. Jedoch wurde keine eigentliche Funktion oder Aktivität für OSF-5 offenbart und keine Herstellung von entweder natürlich vorkommendem oder rekombinantem biologisch aktivem Protein wurde gezeigt.
Die Isolierung, die molekulare Clonierung und die Teilcharakterisierung einer neuen Carboxypeptidase B aus menschlichem Plasma werden in Eaton et al. (13) offenbart. Die Reinigung von natürlicher menschlicher Plasma-Carboxypeptidase B und die Clonierung und Expression davon werden in (14) offenbart. Ein Verfahren zum Reinigen der natürlichen Carboxypeptidase B aus Hummerhepatopankreas-Extrakt unter Verwendung von unter anderem Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallchelaten wird in (15) offenbart. Die Reinigung von natürlicher Pro-Carboxypeptidase B aus entfettetem Trockenpulvern von Rinderpankreas unter Verwendung von wiederholter Extraktion wird in (16) offenbart. Die Gewinnung, Reinigung und Teilcharakterisierung von nativer Carboxypeptidase B aus menschlichem Dünndarm unter Verwendung von unter anderem Ammoniumsulfatfällung und chromatographischen Verfahren werden in (17) offenbart. Die Isolierung und Strukturcharakterisierung von Carboxypeptidase B- cDNA und dem -Gen von Rattenpankreas werden in (18) ohne Bezugnahme auf die Expression des Gens mit anschließender Rückfaltung und Abspaltung der Prosequenz des Carboxypeptidase B-Proteins offenbart.
Andererseits wird die Desaktivierung einer Protease, welche eine Carboxypeptidase der Gattung Kluyveromyces sein kann, durch Einführung einer oder mehr genetischer Modifikationen, die dadurch die proteolytische Aktivität der Hefe reduzieren oder modifizieren, offenbart (19).
Mehrere Dokumente beziehen sich auf Verfahren zur Herstellung von Proteinen. So wird ein Prozess zum Reinigen von rekombinant hergestellten Proteinen allgemein offenbart, welcher das Auflösen von unlöslichen refraktilen Proteinen in einer stark denaturierenden Lösung und das Anwenden einer schwach denaturierenden Lösung für die weitere Reinigung der in einer stark denaturierenden Lösung bereits gelösten Proteine umfasst (20). Ein Überblick über Verfahren zum Reinigen von spezifischen eukaryontischen Polypeptidprodukten, die in E. coli exprimiert werden, wird von Marston (21) gegeben. Dieses Dokument weist nicht auf die pankreatische Säuger-Carboxypeptidase B oder die Proform davon hin. Die Trennung von nativen Proteinen, die im Rattenpankreassaft gefunden werden, durch hydrophobe Interaktionschromatographie wird in (22) offenbart; Pro-Carboxypeptidase B wird erwähnt.
Der Gegenstand der Erfindung offenbart die Herstellung von rekombinanter, hoch gereinigter, enzymatisch aktiver und kostengünstiger pankreatischer Säuger-Carboxypeptidase B. Die Herstellung von enzymatisch aktiver pankreatischer Säuger-Carboxypeptidase B wurde vorher nicht berichtet und die Offenbarung hier ist neu.
Der Gegenstand der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver, pankreatischer Säuger-Carboxypeptidase B bereit, umfassend das Behandeln einer rekombinanten Zelle, welche Pro-Carboxypeptidase B codierende DNA enthält, so dass die DNA die Expression der Pro-Carboxypeptidase B steuert, das Gewinnen der so exprimierten Pro-Carboxypeptidase B aus der Zelle, das Behandeln der gewonnenen Pro-Carboxypeptidase B unter Bedingungen, welche eine Faltung der Pro-Carboxypeptidase B ermöglichen, das Unterwerfen der gefalteten Pro-Carboxypeptidase B einer enzymatischen Spaltung, um enzymatisch aktive Carboxypeptidase herzustellen und das Reinigen der enzymatisch aktiven Carboxypeptidase B.
Die Restriktionskarten der Plasmide, gezeigt in den 2 und 3, identifizieren nicht alle auf den Plasmiden anwesenden Restriktionsorte. Jedoch werden jene Restriktionsorte, die für das vollständige Verständnis der Erfindung notwendig sind, gezeigt.
1: Aminosäure- und entsprechende cDNA-Nucleotidsequenz der pankreatischen Ratten-Procarboxypeptidase B
Die cDNA-Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der pankreatischen Ratten-Carboxypeptidase B, welche die Nucleotidsequenz der reifen Carboxypeptidase B und die Nucleotidsequenz des Aktivierungspeptids beinhaltet, werden gezeigt. Die DNA-Sequenz unterscheidet sich von der von Clauser et al. (5) publizierten DNA-Sequenz durch 4 Nucleotide, von denen zwei zu einer Änderung der Aminosäure: Lys¹⁴ → Asn und Arg¹⁴² → Asp führen.
Die DNA-Nucleotidsequenz der drei Primer, die während der Clonierung (Beispiel 1) verwendet werden, werden auch gezeigt (in Großbuchstaben): 5'-Ende-Primer der Pro-Carboxypeptidase B, 5'-Ende-Primer der reifen Carboxypeptidase B und 3'-Ende-Primer der Carboxypeptidase B.
Die Nummerierung der Aminosäuren wurde nach der Homologie zur Carboxypeptidase A aus Rinderpankreas ausgeführt (10, 12), wo die erste Aminosäure (Ala) der reifen Ratten-Carboxypeptidase als 4 nummeriert wurde. Das Sternchen (*) zeigt die zusätzliche Aminosäure (Leu) an, die die Ratten-Carboxypeptidase B im Vergleich zur Carboxypeptidase A hat.
2: Konstruktion von Plasmid pCBP und Plasmid pCPB-C
Das Plasmid pABN wurde mit BamHI und NcoI verdaut. Das 2500 bp-Fragment wurde isoliert und mit dem BamHI-NcoI-940-bp-Carboxypeptidase-B-cDNA-Fragment (erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben) ligiert. Das neu erhaltene Plasmid wurde pCPB genannt und wurde verwendet, um E. coli 4300 zu transformieren.
Das Plasmid pCPB wurde mit BamHI und NdeI verdaut, um das große Fragment zu isolieren. Das Plasmid pCPB wurde auch mit AseI und ScaI verdaut, um das große Fragment zu isolieren.
Ein Heteroduplex wurde durch Mischen der zwei großen Fragmente mit einem 5-terminal phosphorylierten Oligonucleotid, präpariert für ortsspezifische Mutagenese (Beispiel 1), und mit Polymerase-Ligase-Puffer (5 × Puffer: 32.5 mM Tris-HCl pH 7.5, 40 mM MgCl₂, 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0.5M NaCl) gebildet (9). Die Mischung wurde gekocht, um die DNA-Stränge zu denaturieren, und wurde allmählich abgekühlt, um die DNA zu renaturieren. Die Reaktionsprodukte wurden verwendet, um E. coli 1645 durch Elektroporation zu transformieren. Die Transformanten wurden durch Wachstum auf LB-Agar, der Ampicillin enthält, und durch in situ-Koloniedifferentielle Hybridisierung mit dem 5'-terminal phosphorylierten Oligonucleotid, präpariert für die Mutagenese, durchmustert.
Die Plasmid-DNA wurde aus den positiven Kolonien extrahiert und nach Restriktionsenzymanalyse und DNA-Nucleotidsequenzierung wurde ein Clon gewählt, der die Mutanten-SpeI-Stelle enthielt. Das neu erhaltene Plasmid wurde pCPB-C genannt, welches Carboxypeptidase B mit einer Mutation von Cystein zu Serin bei Aminosäure 290 codiert. Das Plasmid pCPB-C wurde verwendet, um E. coli 4300 zu transformieren.
3: Konstruktion des Plasmids pProCPB-C und des Plasmids pλProCPB
Die cDNA der Pro-Carboxypeptidase B, erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde mit NdeI und ClaI gespalten, um das 470 bp-Fragment zu isolieren, welches das Aktivierungspeptid und einen Teil der Carboxypeptidase B codiert.
Das Plasmid pCPB-C wurde mit BamHI und ClaI gespalten, um das 760 bp-Fragment zu isolieren, welches den Rest der Carboxypeptidase B codiert, welche die Cys²⁹⁰ → Ser-Mutation beinhaltet.
Das Plasmid pAB wurde mit NdeI und BamHI gespalten, um das 2500 bp-Fragment zu isolieren, welches alle die für die Expression in Bakterien notwendigen Elemente codiert (s. Beispiel 1).
Die voranstehenden drei Fragmente wurden ligiert und das neu erhaltene Plasmid wurde pProCPB-C genannt.
Die Plasmide pProCPB-C und pCPB wurden mit StuI und XhoI gespalten. Ein 3700 bp-Fragment, das alle für die Expression in Bakterien notwendigen Elemente codiert (Beispiel 1), das gesamte Aktivierungspeptid und ein Teil der Carboxypeptidase B wurde aus dem Plasmid ProCPB-C isoliert.
Ein 440 bp-Fragment, das den Rest der Carboxypeptidase B codiert, wurde aus dem Plasmid pCPB isoliert.
Die zwei Fragmente wurden ligiert und das neu gebildete Plasmid wurde pλProCPB genannt.
4: Vergleich der Aktivität der rekombinanten Carboxypeptidase B und der natürlich vorkommenden Carboxypeptidase B
Die Aktivität der kommerziellen Schweine-Carboxypeptidase B (Sigma) und der rekombinanten Carboxypeptidase B, hergestellt wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden nach dem Verfahren von Folk (11) unter Verwendung von Hippuryl-L-Arg-Substrat bestimmt. V₀ der katalytischen Reaktion wurde unter Verwendung von Substratkonzentrationen zwischen 0.025-1.0mM gemessen.
Das Plasmid pλProCPB wurde in E. coli entsprechend und unter Erfüllung der Anforderungen des Budapest Treaty an the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 69673 am 4. August 1994 hinterlegt.
Wie hierin verwendet, bedeutet „CPB" ein Polypeptid, ob durch rekombinante DNA-Verfahren oder auf andere Weise hergestellt, welches die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie eine beliebige natürlich vorkommende Säuger-Carboxypeptidase B hat. Demnach beinhaltet der Begriff CPB Polypeptide, die sich durch eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 Aminosäuren, von den natürlich vorkommenden Carboxypeptidasen B unterscheiden.
Wie hierin verwendet, meint „Pro-CPB" ein Polypeptid, ob durch rekombinante DNA-Verfahren oder auf andere Weise hergestellt, welches die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie eine beliebige natürlich vorkommende Säuger-Pro-Carboxypeptidase B hat. Demnach beinhaltet der Begriff Pro-CPB Polypeptide, die sich durch eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise nicht mehr als etwa 10 Aminosäuren, von den natürlich vorkommenden Pro-Carboxypeptidasen B unterscheiden.
Fachleute können leicht bestimmen, welche Aminosäurereste hinzugefügt, deletiert oder substituiert werden können (einschließlich, mit welchen Aminosäuren solche Substitutionen gemacht werden können) unter Verwendung etablierter gut bekannter Prozeduren, die zum Beispiel konventionelle Verfahren für den Entwurf und die Herstellung von DNA-Sequenzen, die für bakterielle Expression von Polypeptiden codieren, die Modifikation der cDNA und genomischer Sequenzen durch ortsgerichtete Mutagenese-Methoden, die Konstruktion von rekombinanten Proteinen und Expressionsvektoren, die bakterielle Expression der Polypeptide und die Messung der biochemischen Aktivität der Polypeptide unter Verwendung konventioneller biochemischer Assays beinhalten.
Wie hierin verwendet, meint eine „enzymatisch aktive" CPB eine CPB, welche die biologische Aktivität der natürlich vorkommenden Säuger-Carboxypeptidase B besitzt. Zum Zweck dieser Definition ist die biologische Aktivität einer natürlich vorkommenden Carboxypeptidase B die Fähigkeit, ein C-terminales Arginin, Lysin oder Ornithin von einem Peptid zu entfernen.
Im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wird hierin definiert als das Umfassen von Substitutionen und/oder Deletionen und/oder Additionen von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz und kann bis zu zehn (10) Reste in Übereinstimmung mit den homologen oder equivalenten Gruppen umfassen, beschrieben von z.B. Lehninger, Biochemistry, 2. Aufl. Worth Pub., N.Y. (1975), Kapitel 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, England (1989); und Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Bd. 5, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972), Kapitel 9. Solche Substitutionen sind Fachleuten bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Pro-Carboxypeptidase B oder Carboxypeptidase B codierende DNA von menschlicher, Ratten-, Rinder oder Schweineherkunft sein. Die DNA kann durch Reverstranskription, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), synthetische oder halbsynthetische Mittel oder durch mehr als eines dieser Verfahren oder durch andere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erhalten werden.
Die DNA, welche das Pro-Carboxypeptidase B- oder Carboxypeptidase B-Polypeptid codiert, kann durch Fachleuten bekannte Verfahren mutiert werden, z.B. Bauer et al. (1985), Gene 37: 73-81. Die mutierte Sequenz kann in geeignete Expressionsvektoren eingefügt werden, wie hierin beschrieben, welche in Zellen eingebracht werden, welche dann so behandelt werden, dass die mutierte DNA die Expression eines Polypeptids regelt.
Fachleute werden verstehen, dass das in Verbindung mit dieser Anmeldung hinterlegte Plasmid leicht durch bekannte Methoden (z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese oder durch Insertion von Linkern) verändert werden kann, um die Expression eines Polypeptids zu codieren. Solche Methoden werden zum Beispiel in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press beschrieben.
Beispiele von Vektoren, die verwendet werden können, um die Nucleinsäure zu exprimieren, welche die Carboxypeptidase B oder die Pro-Carboxypeptidase B codiert, sind Viren, wie bakterielle Viren, z.B. Bakteriophagen (wie der Phage Lambda), Cosmide, Plasmide und andere Vektoren. Pro-Carboxypeptidase B oder Carboxypeptidase B codierende cDNA wird in geeignete Vektoren durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren eingefügt. Zum Beispiel können unter Verwendung von konventionellen Restriktionsendonuclease-Enzymstellen Inserts und Vektor-DNA beide gespalten werden, um komplementäre Enden zu erzeugen, welche miteinander Basenpaarung eingehen, und dann mit einer DNA-Ligase zusammen ligiert werden. Anderenfalls können synthetische Linker, welche die zu einer Restriktionsstelle in der Vektor-DNA komplementäre Basensequenzen beherbergen, mit der Insert-DNA ligiert werden, welche dann mit dem Restriktionsenzym verdaut wird, welches an dieser Stelle schneidet. Andere Mittel sind auch verfügbar.
Vektoren der vorliegenden Erfindung, welche eine Sequenz, die Pro-Carboxypeptidase B oder Carboxypeptidase B codiert, umfassen, können für die Expression in einer Reihe von prokaryontischen und eukaryontischen Wirtszellen angepasst werden, z.B. Bakterien, Hefe, Pilze, Insektenzellen oder andere Säugerzellen wie CHO-, Hühnerembryo-, Fibroblasten-, Nieren- oder andere bekannte Zelllinien.
Diese Vektoren umfassen zusätzlich die regulatorischen Elemente, welche für die Expression des clonierten Gens in der Wirtszelle notwendig sind, so relativ zu der Nucleinsäure angeordnet, welche die Pro-Carboxypeptidase B oder Carboxypetidase B codiert, um die Expression davon zu bewirken.
Die für die Expression erforderlichen regulatorischen Elemente beinhalten Promotor- und Operatorsequenzen und eine Ribosomen-Bindungsstelle. Zum Beispiel kann ein bakterieller Expressionsvektor eine Promotor-Operator-Sequenz wie λP_LO_L- oder deo-Promotoren beinhalten. Für den Translationsbeginn können die λC_II- oder deo-Ribosomen-Bindungsstellen verwendet werden. Solche Vektoren können kommerziell erhalten werden oder zusammengefügt werden aus den beschriebenen Sequenzen durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren, zum Beispiel mit-übertragenes U.S.-Patent Nr. 4,831,120, erteilt am 16. Mai 1989, und mit-übertragenes U.S.-Patent Nr. 5,143,836, erteilt am 1. September 1992, welche Verfahren offenbaren, die den λP_L-Promotor betreffen, und mit-übertragene Europäische Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. 303,972, veröffentlicht am 22. Februar 1989, welches Verfahren offenbart, die den deo-Promotor betreffen. Zusätzliche geeignete Elemente wie Repressoren und Verstärker können auch anwesend sein. Fachleute wissen, wie sie regulatorische Elemente verwenden, die für verschiedene Expressionssysteme geeignet sind.
Die Expressionsplasmide dieser Erfindung umfassen geeignete regulatorische Elemente, die innerhalb des Plasmids relativ zu der DNA, welche das Pro-Carboxypeptidase B- oder das Carboxypeptidase B-Polypeptid codiert, positioniert sind, um die Expression des Pro-Carboxypeptidase B- oder Carboxypeptidase B-Polypeptids in einer geeigneten Wirtszelle zu bewirken. Solche regulatorischen Elemente sind Promotoren und Operatoren, z.B. deo-P₁P₂ und λP_L, und Ribosomen-Bindungsstellen, z.B. deo und C_II, sowie Repressoren und Verstärker.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden die regulatorischen Elemente nahe bei und stromaufwärts der DNA, welche Pro-Carboxypeptidase B oder Carboxypeptidase B codiert, positioniert.
Die Plasmide der Erfindung enthalten auch ein ATG-Startcodon. Die Pro-Carboxypeptidase B oder Carboxypeptidase B codierende DNA ist mit dem ATG-Startcodon in Phase.
Die Plasmide der Erfindung beinhalten auch eine DNA-Sequenz, welche einen Replikationsstartpunkt aus einem Bakterienplasmid umfasst, das zur unabhängigen Replikation in der Wirtszelle in der Lage ist. Geeignete Replikationsstartpunkte können aus zahlreichen Quellen, wie aus dem Plasmid pBR322 (ATCC-Hinterlegungsnummer 37017) erhalten werden.
Die Plasmide der vorliegenden Erfindung beinhalten auch eine DNA-Sequenz, welche ein Gen enthält, das mit einem auswählbaren oder identifizierbaren phänotypischen Merkmal assoziiert ist, welches manifestiert wird, wenn das Plasmid in der Wirtszelle anwesend ist, wie ein Arzneistoff-Resistenzgen, z.B. Resistenz gegen Ampicillin, Chloramphenicol oder Tetracyclin.
Bevorzugte bakterielle Wirtszellen sind E. coli-Zellen. Ein Beispiel einer geeigneten E. coli-Zelle ist der Stamm 4300, aber andere E. coli-Stämme und andere Bakterien können auch als Wirte für die Plasmide verwendet werden.
Die als Wirte verwendeten Bakterien können ein beliebiger Stamm sein, einschließlich auxotropher (wie A1645), prototropher (wie A4255) und lytischer Stämme; F⁺- und F^--Stämme; Stämme, welche die cI⁸⁵⁷-Repressorsequenz des λ-Prophagen (wie A1645 und A4255) beherbergen, und Stämme ohne die deo-Repressoren und/oder das deo-Gen (s. Europäische Patentanmeldung-Veröffentlichungsnr. 0303972, veröffentlicht am 22. Februar 1989). Der E. coli-Stamm 4300 wurde unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 69363 hinterlegt.
Alle die vorstehend beschriebenen E. coli-Wirtsstämme können von den Plasmiden, welche sie beherbergen, durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren „geheilt" werden, z.B. durch das Ethidiumbromid-Verfahren, beschrieben von R. P. Novick in Bacteriol. Review 33, 210 (1969).
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver Carboxypeptidase bereit, umfassend das Behandeln einer rekombinanten Zelle, welche Pro-Carboxypeptidase B codierende DNA enthält, so dass die DNA die Expression der Pro-Carboxypeptidase B regelt, das Gewinnen der so exprimierten Pro-Carboxypeptidase B aus der Zelle, das Behandeln der gewonnenen Pro-Carboxypeptidase B unter Bedingungen, welche eine Faltung der Pro-Carboxypeptidase B ermöglichen, das Unterwerfen der gefalteten Pro-Carboxypeptidase B einer enzymatischen Spaltung, um enzymatisch aktive Carboxypeptidase B herzustellen und das Reinigen der enzymatisch aktiven Carboxypeptidase B.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Gewinnen der Pro-Carboxypeptidase B aus der rekombinanten Zelle das Aufbrechen der Zellwand der rekombinanten Zelle oder Fragmenten davon, um ein Lysat herzustellen, das Isolieren des intrazellulären Präzipitats aus dem Lysat durch Zentrifugation und das Solubilisieren des intrazellulären Präzipitats in einem geeigneten Puffer.
In einer anderen Ausführungsform umfasst das Behandeln der gewonnenen Pro-Carboxypeptidase B die Inkubation der Pro-Carboxypeptidase B bei Raumtemperatur für eine Dauer von etwa 20-24 Stunden bei einem pH-Wert von etwa 9-9.5.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst das Behandeln der gewonnenen Pro-Carboxypeptidase B die Inkubation der Pro-Carboxypeptidase B bei Raumtemperatur für eine Dauer von etwa 20-24 Stunden bei einem pH-Wert von etwa 9-9.5 in Gegenwart von ZnCl₂, oxidiertem Glutathion (GSSG) und reduziertem Glutathion (GSH).
Es wird angenommen, dass das Unterwerfen der gefalteten Pro-Carboxypeptidase B einer enzymatischen Spaltung das Anpassen des pH-Werts auf etwa 8.5 und das Spalten der Pro-Carboxypeptidase B mit Trypsin bei 37°C für etwa 60 Minuten umfasst.
Es wird weiter angenommen, dass das Reinigen der enzymatisch aktiven Carboxypeptidase B Ionenaustauschchromatographie umfasst.
Es wird von den Fachmännern verstanden werden, dass ein beliebiges Ionenaustauschchromatographie-Verfahren verwendet werden kann. Eine schwache Anionenaustausch-Säule wie DEAE-Sepharose wird bevorzugt. Schwache Anionenaustausch-Säulen haben gewöhnlich als funktionelle Gruppe ein tertiäres Amin (Diethylaminoethyl), aber auch quartäres Aminoethyl oder quartäres Amin kann verwendet werden.
Die Matrix kann auf anorganischen Verbindungen, synthetischen Harzen, Polysacchariden oder organischen Polymeren basieren; mögliche Matrizes sind Agarose, Cellulose, Trisacryl, Dextran, Glaskügelchen, Oxiran-Acryl-Kügelchen, Acrylamid, Agarose/Polyacrylamid-Copolymer oder hydrophiles Vinylpolymer.
Es wird auch angenommen, dass das Reinigen der enzymatisch aktiven Carboxypetidase B Ionenaustauschchromatographie und hydrophobe Chromatographie umfasst.
Es wird von den Fachleuten verstanden werden, dass eine beliebige hydrophobe Säule verwendet werden kann. Phenyl-Sepharose ist bevorzugt. Die funktionelle Gruppe kann Phenyl, Benzyl, Octyl oder Butyl sein. Die Matrix kann eine beliebige von jenen vorstehend diskutierten sein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reinigen der enzymatisch aktiven Carboxypeptidase B Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie und Diafiltration.
In einer speziell bevorzugten Ausführungsform wird die Pro-Carboxypeptidase B von dem Plasmid pλProCPB exprimiert, welches unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 69673 hinterlegt ist.
Die vorliegende Erfindung offenbart weiter die enzymatisch aktive Carboxypeptidase B, frei von anderen Substanzen von Sängerherkunft.
Die Beispiele, welche folgen, werden dargelegt, um zum Verständnis der Erfindung beizutragen, aber sind nicht beabsichtigt und sollten nicht ausgelegt werden, um ihren Schutzbereich in irgendeiner Weise zu begrenzen. Die Beispiele beinhalten nicht die ausführlichen Beschreibungen für konventionelle Verfahren, die bei der Konstruktion von Vektoren, der Insertion von Polypeptide codierende Genen in solche Vektoren oder der Einführung der resultierenden Plasmide in die Wirte angewandt werden. Die Beispiele beinhalten auch nicht eine ausführliche Beschreibung für konventionelle Verfahren, die zum Testen der Polypeptide, welche von solchen Wirt-Vektor-Systemen hergestellt werden, angewandt werden. Solche Verfahren sind Fachleuten gut bekannt und werden in zahlreichen Publikationen beschrieben, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme in diese Beschreibung eingebunden werden, welche beispielsweise das Folgende beinhaltet:
Sambrook, H., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
BEISPIEL 1: Clonierung von Ratten-Carboxypeptidase B-cDNA durch PCR
I. DNA-Amplifikation
Gesamt-RNA wurde aus dem Pankreas von Sprague-Dawley-Ratten extrahiert. Aus der Gesamt-RNA wurden 40 μg Poly-A⁺-mRNA isoliert (durch eine Oligo-dT-Cellulose-Säule). Ein Aliquot (10 μg) der so erhaltenen PolyA⁺-mRNA wurde als Matrize in einer Reverstranskriptionsreaktion in Gegenwart eines synthetischen 3'-Ende-Primers der Carboxypeptidase B verwendet (5) (1).
Im Anschluss an die Synthese der einzelsträngigen komplementären DNA (ss-cDNA) wurde die mRNA mit Ethanol gefällt. Ein Aliquot der ss-DNA wurde dann der PCR-Amplifikation unterworfen:
Für die Amplifikation der DNA, welche die Carboxypeptidase B (940 bp) codiert, wurden ein synthetischer Primer, der dem 3'-Terminus der Carboxypeptidase B entspricht, und ein synthetischer Primer, der dem 5'-Terminus der reifen Carboxypeptidase B entspricht, verwendet (1).
Für die Amplifikation der DNA, welche die Pro-Carboxypeptidase B (1230 bp) codiert, wurden ein synthetischer Primer, der dem 3'-Terminus der Carboxypeptidase B, und ein synthetischer Primer, der dem 5'-Terminus der Pro-Carboxypeptidase B entspricht, verwendet (1).

Die PCR-Amplifikationsbedingungen waren, wie folgt:

1. 3'-Terminus-Primer	2μg
2. 5'-Terminus-Primer	2μg
3. ss-cDNA	5 μl
4. Puffer:
dNTP's	0.2mM
Tris-HCl	50mM
KCl	20mM
MgCl₂	8mM
5. Taq-Polymerase I	2.5 Einheiten
Gesamtvolumen:	100μl
6. Mineralöl (gegen Verdampfung)	50μl
7. 1 Zyklus × [1' bei 92°C; 2' bei 40°C und 4' bei 72°C]
8. 35 Zyklen × [1' bei 92°C; 2' bei 53°C und 3' bei 72°C]
9. 1 Zyklus × [1' bei 92°C; 2' bei 53°C und 15' bei 72°C]

Die PCR-Amplifikationsprodukte wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Nicht-amplifizierte Kontrollen und Größenmarker wurden auch eingeschlossen. Zwei ausgeprägte Banden von etwa 940 bp und 1230 bp wurden beobachtet. Die 940 bp-Bande repräsentiert die Carboxypeptidase B-Nucleotidsequenz und die 1230 bp-Bande repräsentiert die Pro-Carboxypeptidase B-Nucleotidsequenz, welche die Aktivierungspeptid-Nucleotidsequenz beinhaltet.
Im Anschluss an die PCR-Amplifikation wurde die DNA aus der Reaktionsmischung durch Chloroform- und Phenol-Extraktionen und Ammoniumacetat- und Isopropanol-Fällung gereinigt.
II. Plasmid pcPB
Das Plasmid pCPB (2) wurde durch Verdau der Carboxypeptidase B-cDNA mit BamHI und NcoI und anschließender Gelreinigung, Subclonierung der Fragmente in das 2500 bp-BamHI- und NcoI-Fragment von Plasmid pABN konstruiert, welches die folgenden Elemente codiert, die für die Expression in Bakterien notwendig sind:

(i) λP_L-Promotor, welcher die Genexpression aus E. coli-Zellen durch Induktion befähigt, d.h. durch Verschieben der Temperatur von 30°C auf 42°C, was den temperatursensitiven Repressor cI⁸⁵⁷ inaktiviert;
(ii) deo-Ribosomen-Bindungsstelle (rbs);
(iii) trp-Transkriptionsterminator (8);
(iv) Ampicillin-Resistenzgen aus dem Plasmid pBR322 und
(v) pBR322-Replikationsstartpunkt

III. Plasmid pCPB-C
Die Aminosäuresequenz der natürlich vorkommenden Carboxypeptidase B enthält 7 Cysteinreste, von denen sechs zu S-S-Bindungen gepaart sind und von denen eine (Cys²⁹⁰) ein freier Cysteinrest ist (1). Wir glaubten, dass dieser freie Cysteinrest unerwünschte inter- und intramolekulare S-S-Bindungen während der Neufaltung der rekombinanten Carboxypeptidase B bilden könnte. Cys²⁹⁰ ist weder in der katalytischen Stelle noch in der Substrat-Bindungsstelle der Carboxypeptidase B vorhanden und wird offenbar nicht für die enzymatische Aktivität des Enzyms gebraucht (1,2). Es wurde daher entschieden, eine Carboxypeptidase B herzustellen, worin dieses Cystein durch Serin ersetzt wird; diese Carboxypeptidase B wird CPB-C genannt.
Ein am 5'-Ende phosphoryliertes Oligonucleotid, welches 2 Nucleotidsubstitutionen enthielt, wurde präpariert:
Dieses Oligonucleotid wurde verwendet, um die Nucleotidsequenz, die Cys²⁹⁰ codiert, mit einer Nucleotidsequenz, die Serin codiert, im Plasmid pCPB durch ortsspezifische Mutagenese zu substituieren, wie in 2 beschrieben (9). Das neu erhaltene Plasmid wurde pCPB-C genannt.
IV. Plasmid pProCPB-C
Ein pProCPB-C genanntes Plasmid, welches die ProCPB-C-Nucleotidsequenz (welche die Cys²⁹⁰ → Ser-Mutation enthält) beherbergt, wurde konstruiert (3) und verwendet, um E.coli 4300 zu transformieren.
V. Plasmid pλProCPB
Ein pλProCPB genanntes Plasmid, welches die Pro-Carboxypeptidase B-Nucleotidsequenz enthält, wurde konstruiert (3) und verwendet, um E.coli 4300 zu transformieren. Dieses Plasmid wurde mit dem ATCC unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 69673 am 4. August 1994 hinterlegt.
Die Plasmid-DNA wurde aus den Plasmiden pCPB, pCPB-C, pλProCPB, pProCPB-C präpariert und wurde der Restriktionsenzym-Analyse und der Nucleotidsequenzierung unterworfen, um die Anwesenheit der korrekten Sequenzen zu bestätigen.
Beispiel 2: Fermentation, Wachstumsbedingungen und Reinigung von Pro-Carboxypeptidase B und Carboxypeptidase B.
I. Stammkulturen
Die Stammkultur von E.coli 4300, welcher das Plasmid pλProCPB beherbergt, wurde auf einem mit Ampicillin (100 μg/ml) ergänzten LB-Medium gezüchtet.
II. Inokulum
Das Inokulum wurde in 100 ml mit Ampicillin (100μg/ml) ergänztem LB-Medium bei 30°C vermehrt, bis die Zellkonzentration eine O.D.₆₆₀ von 2.0 erreichte.
Das Produktionsmedium (LB-Medium + Ampicillin (100μg/ml)) wurde beimpft, bei 30°C inkubiert, begast, gerührt und der pH-Wert wurde mit NH₃ bei 7.2 gehalten. Zwanzig Gramm Glucose wurden zu der Kultur während des Wachstums zugegeben. Sobald die Zellkonzentration eine O.D.₆₆₀ von 12 erreichte, wurde die Temperatur auf 42°C erhöht, um die Expression von Pro-Carboxypeptidase B zu ermöglichen. Nach zwei Stunden erreichte die Zellkonzentration eine O.D.₆₆₀ von 22-29 und die Bakterien wurden geerntet.
III. Reinigung
Die durch das Plasmid pλProCPB exprimierte Pro-Carboxypeptidase B reicherte sich in dem intrazellulären Präzipitat an, welches durch die folgende Prozedur isoliert wurde: 40 Gramm (Feuchtgewicht) des Bakterienkuchens wurden in 450 ml Puffer, der 1 mM PMSF (Sigma), 50mM Tris-HCl, pH 8, 10mM EDTA enthielt, suspendiert, und mit Lysozym (Sigma) zu einer Endkonzentration von 50μg/ml bei 37°C für 2 Stunden behandelt.
Die Mischung wurde dann mit Ultraschall behandelt und Triton X-100 (Merck) wurde zu einer Endkonzentration von 2% zugegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das rohe intrazelluläre Präzipitat wurde durch Zentrifugation (14000 rpm, 30 Min., 4°C) pelletiert und mit Wasser gewaschen.
Das intrazelluläre Präzipitat, welches die Pro-Carboxypeptidase B umfasst, wurde in Puffer B gelöst, der 25mM NaCl, 8M Harnstoff, 10mM DTT, 20mM Bis-Tris pH 7 enthielt. Die Lösung wurde auf einer DEAE-Sepharose-Fast-Flow-Säule, equilibiriert in Puffer B, chromatographiert, das Protein wurde mit etwa 100mM NaCl in Puffer B eluiert und die Pro-Carboxypeptidase B wurde mit (NH₄)₂SO₄ bei 40% Sättigung bei 0°C gefällt.
Es wurde später entdeckt, dass enzymatisch aktive Carboxypeptidase B nur über die Herstellung des Vorläuferproteins hergestellt werden konnte. Jedoch wurden zuerst die Polypeptide Carboxypeptidase B und CPB-C auf eine der Herstellung von Pro-Carboxypeptidase ähnliche Weise, vorstehend beschrieben, hergestellt; ProCPB-C wurde auch ähnlich hergestellt. Die verwendeten Plasmide waren jeweils pCPB, pCPB-C und pProCPB-C (wie in Beispiel 1 beschrieben). Die Wachstumsbedingungen von E.coli, der diese Plasmide beherbergt, und die Reinigung der Polypeptide waren im Wesentlichen wie für die Pro-Carboxypeptidase B beschrieben, abgesehen von dem verwendeten Puffer, um das intrazelluläre Präzipitat zu lösen, das rekombinante Carboxypeptidase B oder CBP-C umfasst, welcher 20mM Ethanolamin pH 9, 10mM DTT und 8M Harnstoff enthielt.
Beachten Sie, dass in jedem Fall die hergestellten und gereinigten Polypeptide, wie vorstehend beschrieben, keine enzymatische Aktivität hatten.
Die Faltung der Polypeptide in einem Versuch, um enzymatisch aktive Proteine herzustellen, wird in Beispiel 3 beschrieben.
Beispiel 3: Faltung und Aktivierung von ProCPB-C
Die Polypeptide Carboxypeptidase B und CPB-C wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben, aber es wurde gefunden, dass sie keine enzymatische Aktivität haben. Bekannte Faltungsverfahren (wie nachstehend beschrieben) wurden verwendet, aber es wurde kein enzymatisch aktives Protein erhalten.
Um das Problem der Unfähigkeit, enzymatisch aktives Problem zu erhalten, zu lösen, wurde eine alternative Prozedur entwickelt, welche Expression und Faltung des Vorläuferproteins einbezieht, gefolgt durch Behandlung, um den Anteil des Aktivierungspeptids des gefalteten Vorläuferproteins zu entfernen. Dies führte zu dem Prozess, wie nachstehend beschrieben.
ProCPB-C, hergestellt, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde zu 10mg/ml in 8M Harnstoff, 5mM HCl gelöst und zu 1 mg/ml in 100mM Glycin, 0.2mM ZnCl₂ bei pH 9, 10 und 11 verdünnt. Diese waren die Faltungslösungen.
Die Faltung wurde durch Inkubieren der vorstehenden Faltungslösungen für 17 Stunden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die so hergestellte ProCPB-C hatte bei dieser Stufe keine enzymatische Aktivität (s. Tabelle I).
Der pH-Wert der Lösung, welche die gefaltete ProCPB-C enthielt, wurde dann mit HCl zu etwa 8.5 angepasst und wurde mit Trypsin (1:200 w/w) für 30 Minuten bei 37°C behandelt, um das Aktivierungspeptid zu entfernen. Um die Reaktion zu beenden, wurde PMSF zu einer Endkonzentration von 0.1 mM zugegeben.
Die enzymatische Aktivität der so erhaltenen gefalteten CPB-C wurde nach Folk (1970) (11) getestet (Tabelle I): Eine Aktivitätseinheit (u) wird als die Enzymmenge definiert, welche die Hydrolyse von 1 μmol Hippuryl-L-Arg-Substrat pro Minute bei 25°C katalysiert, was eine Erhöhung in der Extinktion von 0.12 bei 254 nm und 1 cm Weglänge verursacht. Die spezifische Aktivität von kommerzieller Schweine-Carboxypeptidase B (Sigma) ist 230 μ/mg. Tabelle I: Spezifische Aktivität von ProCPB-C (und von CPB-C, davon abgeleitet) unter verschiedenen Bedingungen
Tabelle I zeigt an, dass enzymatisch aktive CPB-C nach Faltung von Pro-CPB-C und Trypsin-Behandlung der gefalteten ProCPB-C unter Verwendung der vorstehend beschriebenen vorausgehenden Bedingungen erhalten wurde.
Tabelle I zeigt weiter an, dass die spezifische Aktivität von CPB-C höher ist, wenn der pH-Wert in der Faltungsmischung 9 ist, als wenn der pH-Wert in der Faltungsmischung 10 oder 11 ist.
Beispiel 4: Verbesserte Faltungsbedingungen
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um optimale Faltungs- und Aktivierungsbedingungen zu etablieren.
Wir nahmen an, dass je höher die spezifische Aktivität der durch Trypsin-Spaltung der gefalteten ProCPB-C erhaltenen CPB-C, desto optimaler wären dann die Faltungsbedingungen der ProCPB-C. Die „nur Substrat"- und die „kommerzielle Schweine-Carboxypeptidase"-Kontrollen wurden zusätzlich zu den nachstehenden Experimenten ausgeführt.
Zuerst wurden die Ergebnisse (wie in Beispiel 3 beschrieben) verbessert, wenn die Faltung unter Verwendung von 0.05-0.1 mg/ml ProCPB-C bei einem pH-Wert von 9.5 durchgeführt wurde.
I. Der Temperatureffekt auf die Faltung von ProCPB-C
Die Faltung von ProCPB-C wurde durch Inkubation von 0.05 mg/ml Polypeptid in 100mM Glycin, pH 9.5 für 90 Stunden bei Temperaturen zwischen 10-37°C ausgeführt. Die Proben der gefalteten ProCPB-C wurden mit Trypsin (1:200 w/w) behandelt und die spezifische Aktivität der so erhaltenen CPB-C wurde gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die höchste spezifische Aktivität von CPB-C wurde erhalten, wenn die Faltung von ProCPB-C zwischen 20°C-30°C ausgeführt wurde.
II. Der Effekt von oxidiertem und reduziertem Glutathion auf die Faltung von ProCPB-C
Die Faltung von ProCPB-C wurde durch Inkubation von 0.05 mg/ml Polypeptid in 100 mM Glycin-Puffer pH 9.5, 0.01 mM ZnCl₂ bei 25°C in Gegenwart von oxidiertem und/oder reduziertem Glutathion (GSSG/GSH) oder Ascorbinsäure ausgeführt (Tabelle II). Anschließend wurden die inkubierten Lösungen mit Trypsin (1:200 w/w) für 1 Stunde bei 37°C behandelt und die spezifische Aktivität der so erhaltenen CPB-C wurde nach 18 und 45 Stunden gemessen (wie in Beispiel 3 beschrieben). Tabelle II: Spezifische Aktivität von CPB-C als eine Funktion der Anwesenheit von Oxidationsmittel/Reduktionsmittel in der Faltungslösung

• Ascorbinsäure wurde bei einer Konzentration von 2.5 Mol zu einem Mol SH-Gruppe zugegeben.

Tabelle II zeigt an, dass die kombinierte Zugabe von GSSG und GSH eine drastische Erhöhung in der spezifischen Aktivität von CPB-C und daher vermutlich in der Faltungseffizienz von ProCPB-C verursacht. GSSH alleine erhöhte auch die Faltungseffizienz von ProCPB-C und auch Ascorbinsäure, obwohl zu einem geringeren Ausmaß.
In einer anderen Experimentenserie wurde gefunden, dass die optimale Faltung von ProCPB-C durch die Zugabe von 0.1 mM GSSG und 0.5mM GSH zu der Faltungslösung erhalten wird.
III. Aktivierung der gefalteten ProCPB-C durch Trypsin
Es wurde etabliert, dass die aktivste CPB-C durch tryptische Spaltung von ProCPB-C erhalten wurde, um das Aktivierungspeptid zu entfernen, wenn die inkubierte Faltungslösung mit Trypsin 1:50 w/w für 1 Stunde bei 37°C behandelt wurde.
IV. Der Effekt des pH-Werts auf die Faltung der ProCPB-C
Der Effekt des pH-Werts auf die Faltung von ProCPB-C wurde in einer Serie von Reaktionen unter vorher optimierten Bedingungen bestimmt.
Die Faltung von ProCPB-C wurde bei 0.1 mg/ml in 100mM Glycin, 0.2mM ZnCl₂, 0.5mM reduziertem Glutathion (GSH), 0.1 mM oxidiertem Glutathion (GSSG) bei 25°C für 24 Stunden bei verschiedenen pH-Werten (zwischen 8.75-10.00) ausgeführt. Proben von gefalteter ProCPB-C wurden mit Trypsin (1:50 w/w; gelöst in 1 mM HCl, 10mMCaCl₂) behandelt und die spezifische Aktivität der so erhaltenen CPB-C wurde gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Die höchste spezifische Aktivität von CPB-C wurde erhalten, wenn die Faltung von ProCPB-C bei pH 9.25 ausgeführt wurde.
V. Der Effekt von ZnCl₂ auf die Faltung der ProCPB-C
Der Effekt der ZnCl₂-Konzentration in der Faltungslösung auf die Faltung von ProCPB-C wurde in einer Serie von Reaktionen unter vorher optimierten Bedingungen bestimmt. Bei einer ZnCl₂-Konzentration, die 2-20mal höher ist als die bestimmte CPB-C-Konzentration (mol/mol), war die spezifische Aktivität der hergestellten CPB-C am höchsten. Wenn die Faltung ohne Zugabe von ZnCl₂ ausgeführt wurde und EDTA zu der Faltungsmischung hinzugegeben wurde, um beliebige restliche zweiwertige Ionen zu chelatieren, nahm die spezifische Aktivität von CPB-C auf Null ab.
VI. Der Effekt der Proteinkonzentration auf die Faltung der ProCPB-C
Die Faltung der ProCPB-C wurde für 24 Stunden unter optimalen Bedingungen (wie vorstehend bestimmt) bei den in Tabelle III angezeigten Proteinkonzentrationen ausgeführt. Nach tryptischem Verdau wurde die Aktivität der CPB-C gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Tabelle III: Spezifische Aktivität der CPB-C als eine Funktion der Proteinkonzentration in der Faltungslösung
Tabelle III zeigt an, dass die spezifische Aktivität von hergestellter CPB-C am höchsten bei einer Proteinkonzentration von 0.05 mg/ml war.
VII. Faltungszeit als eine Funktion von der spezifischen Aktivität der CPB-C
Die optimale Faltungszeit der ProCPB-C wurde in einer Serie von Reaktionen unter vorher optimierten Bedingungen bestimmt.
Die Faltung der ProCPB-C wurde bei 0.1 mg/ml in 100mM Glycin, pH 9.25, 0.1 mM GSSG, 0.5 mM GSH und 0.01 mM ZnCl₂ ausgeführt. Die Proben von gefalteter ProCPB-C wurden mit Trypsin (1:50 w/w) behandelt und die spezifische Aktivität der so erhaltenen CPB-C wurde gemessen, wie in Beispiel 3 an verschiedenen Zeitpunkten (zwischen 0-40 Stunden) vom Beginn der Faltung beschrieben.
Die höchste Aktivität von CPB-C wurde erhalten, wenn die gefaltete ProCPB-C mit Trypsin nach 20 Stunden vom Beginn der Faltung gespalten wurde. Die Faltung für mehr als 20 Stunden änderte nicht die spezifische Aktivität von CPB-C.
Beispiel 5: Faltung und Aktivierung der unterschiedlichen Carboxypeptidase B-Proteine
Carboxypeptidase B, CPB-C, Pro-Carboxypeptidase B und ProCPB-C, hergestellt und gereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden jeweils bei 0.1 mg/ml in 100mM Glycin-Puffer, pH 9.25, 0.01 mM ZnCl₂, 0.5mM GSH, 0.1 mM GSSG bei Raumtemperatur für 24 Stunden gefaltet, d.h. die verwendeten Faltungsbedingungen waren im Wesentlichen die in Beispiel 4 etablierten optimalen Bedingungen.
Der pH-Wert jeder Lösung, welche die gefaltete Carboxypeptidase B, CPB-C, Pro-Carboxypeptidase B oder ProCPB-C enthielt, wurde auf 8.5 mit HCl angepasst und die Lösungen, welche Pro-Carboxypeptidase B und ProCPB-C enthielten, wurden mit Trypsin (1:50 w/w) für 1 Stunde bei 37°C behandelt, um das Aktivierungspeptid zu entfernen. Um die Reaktion zu beenden, wurde PMSF zu einer Endkonzentration von 0.1 mM zugegeben. Die spezifische Aktivität von Carboxypeptidase B, CPB-C, Pro-Carboxypeptidase B und ProCPB-C wurde gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Tabelle IV: Spezifische Aktivität von Carboxypeptidase B, CPB-C, Pro-Carboxypeptidase B und ProCPB-C nach Faltung und Aktivierung bei optimalen Bedingungen

¹Die Kontrolle „kein Trypsin" wurde nur für ProCPB-C ausgeführt.

Tabelle IV zeigt an, dass die enzymatisch aktive Carboxypeptidase B nur aus Zellen hergestellt werden kann, welche den Vorläufer exprimieren, der das Aktivierungspeptid enthält. Demnach ist das Aktivierungspeptid notwendig für die korrekte Faltung der Carboxypeptidase B.
Tabelle IV zeigt auch an, dass die Carboxypeptidase B mit optimaler spezifischer Aktivität aus der Faltung und Aktivierung der Pro-Carboxypeptidase B (exprimiert vom Plasmid pλProCPB), welche den freien Cys²⁹⁰-Rest enthält, hergestellt wird und nicht aus der Faltung und Aktivierung der ProCPB-C, welche die Cys²⁹⁰ → Ser-Mutation enthält. Demnach wird Cys²⁹⁰ offenbar für die optimale Faltung und/oder höchste Aktivität der Carboxypeptidase B benötigt.
Beispiel 6: Verbesserte Faltung der Pro-Carboxypeptidase B
I. Faltung der Pro-Carboxypeptidase B aus rohem intrazellulären Präzipitat
Es wurde gefunden, dass optimale Faltungsbedingungen für Pro-Carboxypeptidase B, im Wesentlichen identisch mit den optimalen Faltungsbedingungen für ProCPB-C, bestimmt in Beispiel 4, sind.
Ein vereinfachtes Verfahren für Faltung und Aktivierung der Pro-Carboxypeptidase B wurde durch Verwendung von rohem intrazellulärem Präzipitat, unter Auslassung des Bedarfs für den anfänglichen Reinigungsschritt ausgeführt, wie in Beispiel 2, Teil III, beschrieben.
Es wurde gefunden, dass das rohe intrazelluläre Präzipitat, welches Pro-Carboxypeptidase B (hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben) enthielt, bei hohen Proteinkonzentrationen (Tabelle V) in 100mM Glycin, pH 9.5 und 8M Harnstoff gelöst werden konnte.
Die Faltung wurde unter optimierten Bedingungen für 24 Stunden bei Raumtemperatur ausgeführt. Der pH-Wert wurde auf den optimalen pH-Wert von 9.5 (vorher bestimmt) angehoben. Die gefaltete Pro-Carboxypeptidase B wurde mit Trypsin (1:50 w/w) gespalten und die spezifische Aktivität der Carboxypeptidase B wurde gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Tabelle V: Spezifische Aktivität der Carboxypeptidase B als eine Funktion der Proteinkonzentration in der Faltungslösung, welche das rohe intrazelluläre Präzipitat umfasst
Tabelle V zeigt an, dass die enzymatisch aktive Carboxypeptidase B durch Faltung der Pro-Carboxypeptidase B aus dem rohen intrazellulären Präzipitat, gefolgt von tryptischem Verdau, erhalten werden kann. Außerdem ist die Carboxypeptidase B zu einem ähnlichen Niveau bei allen gemessenen Proteinkonzentrationen enzymatisch aktiv. Dies ist ein unerwartetes Ergebnis, da die spezifische Aktivität von Carboxypeptidase B, die vor der Faltung auf DEAE-Sepharose gereinigt wurde (Beispiel 2), abnahm, wenn die Proteinkonzentration in der Faltungsmischung sich erhöhte. Offenbar enthält das intrazelluläre Präzipitat Faktoren, welche die Faltung der Pro-Carboxypeptidase B unterstützen.
II. Maßstabsvergrößerung der Carboxypeptidase B durch Faltung der Pro-Carboxypeptidase B aus rohem intrazellulärem Präzipitat
(i) Herstellung
Die Carboxypeptidase B wurde zu beinahe Homogenität aus 42 Litern E.coli 4300, welcher das Plasmid pλProCPB beherbergt und Pro-Carboxypeptidase B exprimiert, gereinigt. Die Fermentation und Wachstumsbedingungen waren im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben.
Das rohe intrazelluläre Präzipitat wurde in Wasser gewaschen und wurde bei 20 mg/ml in 100mM Glycin, pH 9.5, 8M Harnstoff gelöst und wurde zu 1 mg/ml mit 100mM Glycin, pH 9.5 verdünnt. 0.1 mM ZnCl₂, 0.5mM GSH und 0.1 mM GSSG wurden zugegeben und die resultierende Faltungslösung wurde bei 25°C für 24 Stunden inkubiert. Der pH-Wert wurde dann auf 8.5 mit HCl angepasst und die gefaltete Pro-Carboxypeptidase B wurde mit Trypsin (20 μg/ml) bei 37°C für 1 Stunde verdaut. Trypsin wurde mit 0.1 mM PMSF inaktiviert.
(ii) Reinigung
Die enzymatisch aktive Carboxypeptidase B wurde auf eine DEAE-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia), equilibriert mit 20mM Tris-HCl, pH 8, bei 20 mg pro ml Harz geladen. Die Carboxypeptidase B wurde mit 80mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8 eluiert. Ammoniumsulfat (0.8M) wurde zu dem DEAE-Elutionsreservoir gegeben, welcher weiter auf einer Phenyl-Sepharose-Fast-Flow-Säule (Pharmacia), equilibriert mit 20mM Tris-HCl pH 8, 0.8M Ammoniumsulfat, chromatographiert wurde. Die Carboxypeptidase B wurde mit 0.4M Ammoniumsulfat eluiert, eingeengt, gegen 100mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 8 diafiltriert und bei -20°C gelagert.
Bei dem vorstehenden Reinigungsprozess wurden 42 Liter E.coli 4300, welcher das Plasmid pλProCPB beherbergt, bei O.D.₆₆₀ = 36 verarbeitet, wie voranstehend beschrieben, und 1,25 Gramm enzymatisch aktiver Carboxypeptidase B mit einer spezifischen Aktivität von 637 μ/mg wurden erhalten. Die gesamte Prozessausbeute war etwa 60%.
Die spezifische Aktivität der kommerziellen Schweine-Carboxypeptidase B, gemessen unter identischen experimentellen Bedingungen, war 298 μ/mg.
Beispiel 7: Charakterisierung enzymatisch aktiver Carboxypeptidase B
Die, wie in Beispielen 5 und 6 diskutiert, hergestellte Carboxypeptidase B hat biochemische und enzymatische Eigenschaften, die mit der Schweine-Carboxypeptidase B vergleichbar sind.
Der Extinktionskoeffizient der rekombinanten Carboxypeptidase B, der auf der Grundlage seiner Aminosäurezusammensetzung berechnet wurde, ist ε^1% ₂₈₀ = 19.7. Der Extinktionskoeffizient von kommerzieller Schweine-Carboxypeptidase B ist ε^1% ₂₈₀ = 21.4 (1).
Rekombinante Carboxypeptidase B hat eine spezifische Aktivität von 637 μ/mg (Hippuryl-L-Arg-Substrat) und enthält 1 Mol Zn pro Mol Enzym, wie durch Atomabsorption bestimmt.
Die N-terminale Aminosäuresequenz-Analyse offenbarte Ala-Ser-Gly-His-Ser, wie aus der Aminosäuresequenz-Analyse der reifen Ratten-Carboxypeptidase B erwartet (5).
Der optimale pH-Wert für die Aktivität der rekombinanten Carboxypeptidase B wurde unter Verwendung von 25mM der folgenden Puffer bestimmt: NaOAc, pH 4-6; Bis-Tris, pH 6-7.5; Tris-HCl pH 7.5-9 und Glycin, pH 9-12. Die spezifische Aktivität der Carboxypeptidase B wurde gemessen, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die optimale enzymatische Aktivität der Carboxypeptidase B wurde bei pH 8 erhalten. Die Inkubation der Carboxypeptidase B bei 55°C verursachte 50% Aktivitätsverlust und vollständige Inaktivierung geschah bei 65°C.
Die kinetische Analyse der rekombinanten Carboxypeptidase B wurde unter Verwendung des Hippuryl-L-Arg-Substrats durchgeführt (4). Es gab eine Hemmung der Carboxypeptidase B-Aktivität bei Substratkonzentrationen über 0.5mM.
Zusätzliche Studien offenbarten, dass die rekombinante Carboxypeptidase B durch das Katalyseprodukt Arginin, welches ein kompetitiver Inhibitor der Carboxypeptidase B ist, gehemmt wurde. Die entsprechende Lineweaver-Burk-Kurve zeigte einen Km-Wert von 0.38mM.
Die rekombinante Carboxypeptidase B wurde auch von 1,10-Phenanthrolin, einem starken zweiwertigen Ionen-Chelator, gehemmt, was so die Bedeutung von Zn-Ionen für die enzymatische Aktivität von Carboxypeptidase B zeigt. In Gegenwart von 1 mM 1,10-Phenanthrolin wird 50% Aktivtätsverlust von 1mg/ml rekombinanter Carboxypeptidase B beobachtet.
Beispiel 8: Umwandlung von Pro-Insulin zu Insulin durch Carboxypeptidase B
Mini-Proinsulin, wie in EP 347781 B1 beschrieben, kann durch Behandlung mit Trypsin und rekombinanter Carboxypeptidase B, wie in den Beispielen 5 und 6 hergestellt, zu Insulin umgewandelt werden.
Trypsin spaltet spezifisch zwischen dem Argininrest und der A-Kette. Die Carboxypeptidase B hydrolysiert anschließend spezifisch den Argininrest von dem C-Terminus der B-Kette.
Kommerzielles menschliches Insulin (Boehringer-Mannheim) kann als ein Standard verwendet werden, ebenso wie das Mini-Proinsulin, das durch Trypsin und kommerzielle Schweine-Carboxypeptidase B gespalten wird, und das Mini-Proinsulin, das durch Trypsin alleine gespalten, wird.
Literaturhinweise

1. Barrett und McDonald (1985), Mammalian proteases, a Glossary and Bibliography, Bd. 2, Academic Press, Orlando, Florida.
2. Coll et al. (1991), The Embo J. 10: 1-9.
3. Burgos et al. (1991), Biochemistry 30: 4082-4089.
4. Titani et al. (1975), P.N.A.S. 72: 1666-1670.
5. Clauser et al. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17837-17845.
6. Yamamoto et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 2575-2581.
7. Aviles et al. (1985), Biochem. and Bioph. Res. Comm. 130: 97-103.
8. Yanofsky et al. (1981), Nucleic Acid Res. 9: 6647-6668
9. Morinaga et al. (1984), Bio-Technology July: 636-639.
10. Bradshaw et al. (1969), P.N.A.S. 63: 1389-1394.
11. Folk (1970), Methods in Enzymology 19: 504-508.
12. Gardell et al. (1988), J. Biol. Chem. 263 (33): 17828-17836.
13. Eaton et al. (1991), J. Biol. Chem. 266(32): 21833-21838.
14. US 5,206,161 .
15. Márquez-Méndez (1992), J. Biochem. Biophys. Meth. 24: 51-61.
16. Folk und Gladner (1958), J. Biol. Chem. 231: 379-391.
17. Marinkovic et al. (1979), Biochem. Med. 22: 1-10.
18. Clauser et al. (1988), J. Biol. Chem. 263(33): 17837-17845.
19. WO 94/00579.
20. US 4,51 1,503 .
21. Marston (1986), Biochem. J. 240: 1-12.
22. Padfield und Case (1988), Anal. Biochem. 171: 294-299.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von enzymatisch aktiver, pankreatischer Säuger-Carboxypeptidase B umfassend: (a) Behandeln einer rekombinanten Zelle, welche Pro-Carboxypeptidase B codierende DNA enthält, so dass die DNA die Expression der Pro-Carboxypeptidase B regelt; (b) Gewinnen der so exprimierten Pro-Carboxypeptidase B aus der Zelle; (c) Behandeln der gewonnenen Pro-Carboxypeptidase B unter Bedingungen, welche eine Faltung der Pro-Carboxypeptidase B ermöglichen; (d) Unterwerfen der gefaltenen Pro-Carboxypeptidase B einer enzymatischen Spaltung, um enzymatisch aktive Carboxypeptidase B herzustellen; (e) Reinigen der enzymatisch aktiven Carboxypeptidase B.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Gewinnen in Schritt (b) umfasst: (i) Aufbrechen der Zellwand der recombinanten Zelle, um ein Lysat herzustellen; (ii) Isolieren des intrazellulären Präzipitats aus dem Lysat durch Zentrifugation; (iii) Solubilisieren des intrazellulären Präzipitats in einem geeignetem Puffer.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Behandeln in Schritt (c) das Inkubieren der Pro-Carboxypeptidase B bei Raumtemperatur für eine Dauer von etwa 20–24 Stunden bei einem pH-Wert von etwa 9–9,5 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Behandeln in Schritt (c) das Inkubieren der Pro-Carboxypeptidase B bei Raumtemperatur für eine Dauer von etwa 20–24 Stunden bei einem pH-Wert von etwa 9–9,5 in Gegenwart von ZnCl₂, oxidiertem Glutathion und reduziertem Glutathion umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Unterwerfen in Schritt (d) umfasst: (i) Anpassen des pH-Werts auf etwa 8,5; und (ii) Spalten der Pro-Carboxypeptidase B mit Trypsin.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reinigen in Schritt (e) Ionenaustauschchromatographie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reinigen in Schritt (e) Ionenaustauschchromatographie und hydrophobe Chromatographie umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reinigen in Schritt (e) Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie und Diafiltration umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Pro-Carboxypeptidase B durch das Plasmid pλProCPB exprimiert wird, welches unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 69673 hinterlegt ist.