DE69636979T2

DE69636979T2 - Zellinien-gerichtete induktion der menschlichen mesenchymalen stammzelldifferenzierung

Info

Publication number: DE69636979T2
Application number: DE69636979T
Authority: DE
Inventors: Scott P. Moreland Heights BRUDER; Arnold I. Cleveland Heights CAPLAN; Stephen E. Cleveland HAYNESWORTH
Original assignee: Case Western Reserve University; Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Case Western Reserve University; Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1995-01-24
Filing date: 1996-01-05
Publication date: 2007-12-20
Anticipated expiration: 2016-01-06
Also published as: JP5173982B2; US5942225A; EP0805853B1; AU719098B2; PT805853E; JP2010012331A; MX9705612A; JP4454697B2; WO1996023059A1; DE69636979D1; CA2211120A1; ATE357508T1; ES2285710T3; EP0805853A1; JPH10512756A; DK0805853T3; EP1717310A1; US5736396A; AU4746996A; EP0805853A4

Description

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Dirigieren von in vitro gezüchteten mesenchymalen Stammzellen bereit, um eine Differenzierung zu spezifischen Zelllinienwegen vor oder zum Zeitpunkt der Implantation zu bewirken, um damit eine therapeutische Behandlung von pathologischen Zuständen bei Menschen und anderen Spezies zu erreichen.
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind die formativen, pluripotenten Blastzellen oder embryonenartigen Zellen, die in Knochenmark, Blut, Dermis und Periosteum auftreten und zur Differenzierung zu spezifischen Typen von Mesenchym- oder Bindegeweben einschließlich Fettgewebe, Knochengewebe, Knorpelgewebe, elastischem Gewebe, Muskelgewebe und faserartigem Bindegewebe, befähigt sind. Der spezifische Differenzierungsweg, den diese Zellen einschlagen, hängt von verschiedenen Einflüssen ab, z. B. von mechanischen Einflüssen und/oder endogenen bioaktiven Faktoren, wie Wachstumsfaktoren, Cytokinen und/oder lokalen Mikroumgebungsbedingungen, die sich durch Wirtsgewebe ergeben. Obgleich diese Zellen normalerweise in sehr geringer Häufigkeit im Knochenmark vorhanden sind, berichten Caplan et al. in den US-Patenten 5 197 985 und 5 226 914 über ein Verfahren zum Isolieren, Reinigen und mitotischen Expandieren der Population dieser Zellen in Gewebekultur.
In pränatalen Organismen ist die Differenzierung von MSCs zu spezialisierten Bindegewebezellen ausführlich belegt. Beispielsweise differenzieren embryonale mesenchymale Zellen zur Anlage von Gliedmaßen bei Hühnern, Mäusen oder Menschen zu Knorpel-, Knochen- und anderen Bindegeweben (1–5). Ferner wurde auch gezeigt, dass eine klonale Rattenfötus-Schädeldecken-Zelllinie zu Muskeln, Fett, Knorpeln und Knochen differenziert (6). Die Existenz von MSCs in postnatalen Organismen wurde noch nicht eingehend mit dem Ziel untersucht, die Differenzierung von postembryonalen Zellen zu mehreren mesodermalen Phänotypen nachzuweisen. Die wenigen Studien, die durchgeführt wurden, beinhalten die Bildung von Knochen und Knorpeln durch Knochenmarkzellen im Anschluss an ein Einschließen in Diffusionskammern und eine in vivo-Transplantation (7, 8). Kürzlich wurden von von Knochenmark abgeleiteten Zellen junger Kaninchen (800–1 000 g) gezeigt, dass sie in vivo adipozytische und osteogene Zellen bilden (9), und von klonierten Knochenmark-Stromazellen von postnatalen Mäusen wurde gezeigt, dass sie Adipozyten und osteogene Zellen bilden (10). Gleichermaßen wurden Zellen aus Hühner-Periosteum isoliert, in Kultur expandiert und in vitro unter hochdichten Bedingungen zur Differenzierung zu Knorpeln und Knochen gebracht (11). Von mesenchymalen Zellen, die sich von Ratten-Knochenmark ableiteten, wurde gezeigt, dass sie die Fähigkeit besitzen, bei in vivo-Implantation zu Osteoblasten und Chondrozyten zu differenzieren (12, 6). Bei Zellen aus verschiedenen Markquellen postnataler Organismen wurde nie festgestellt, dass sie myogene Eigenschaften aufweisen, wobei ein multinukleares Erscheinungsbild die am einfachsten erkennbare Eigenschaft in Kultur darstellt.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Bewirken der Linien-gesteuerten Induktion von isolierten, in Kultur expandierten, humanen, mesenchymalen Stammzellen bereit, welches das ex vivo-Inkontaktbringen von mesenchymalen Stammzellen mit einem bioaktiven Faktor oder einer Kombination von Faktoren, die wirksam sind, deren in vitro-Differenzierung in eine chondrogene, mesenchymale Linie zu induzieren, umfasst. Bei diesem Aspekt werden die Zellen ex vivo mit einem oder mehreren bioaktiven Faktoren in Kontakt gebracht, wodurch ein Verfahren bereitgestellt wird, das frei von allen Gefahren ist, die mit einer in vivo-Verabreichung von bioaktiven Faktoren verbunden sein können.
Gemäß einem weiteren Aspekt sorgt das erfindungsgemäße Verfahren für die Verabreichung von isolierten, in Kultur expandierten, humanen, mesenchymalen Stammzellen und eines bioaktiven Faktors, der wirksam ist, die Differenzierung derartiger Zellen zu einer chondrogenen, mesenchymalen Linie zu induzieren, an ein behandlungsbedürftiges Individuum. Vorzugsweise werden die mesenchymalen Stammzellen und der bioaktive Faktor zusammen verabreicht oder sie können alternativ getrennt voneinander verabreicht werden. Insbesondere umfasst dieser Aspekt des Verfahrens die Verabreichung des bioaktiven Faktors an ein Individuum, dem ein Präparat mit einem Gehalt an isolierten, autologen, humanen, mesenchymalen Stammzellen bereits verabreicht worden ist, gerade verabreicht wird oder in Zukunft zur Verabreichung ansteht.
Gemäß einem weiteren Aspekt sorgt die Erfindung für ein Verfahren zur Induktion der in vivo-Erzeugung von humanen Cytokinen in einem Individuum, das einen Bedarf daran hat, wobei bei dem Verfahren dem Individuum isolierte, in Kultur expandierte, humane, mesenchymale Stammzellen und ein bioaktiver Faktor, der bei derartigen Zellen eine Induktion zur Differenzierung zu einem Cytokin erzeugenden, mesenchymalen Linienabkömmling in einem derartigen Individuum bewirkt, verabreicht wird. Vorzugsweise werden die mesenchymalen Stammzellen und der bioaktive Faktor zusammen verabreicht oder sie können alternativ getrennt voneinander verabreicht werden.
Gemäß speziellen bevorzugten Beispielen dieser Aspekte handelt es sich beim bioaktiven Faktor um ein knochenmorphogenetisches Protein und die humanen MSCs werden zur chondrogenen Linie dirigiert.
1 zeigt in schematischer Weise das mesengene Verfahren, durch das mesenchymale Stammzellen zu verschiedenen Linienwegen differenzieren.
2 zeigt in schematischer Weise den osteogenen Differenzierungsweg.
3 ist eine graphische Darstellung der Zunahme der Aktivität von alkalischer Phosphatase als eine Funktion der Zeit in Kulturen, und zwar bei den in Referenzbeispiel 1 beschriebenen anfänglichen Studien.
4 zeigt die Ergebnisse anschließender Studien, über die in Referenzbeispiel 1 berichtet wird.
5 zeigt in schematischer Weise den chondrogenen Differenzierungsweg.
6 zeigt das Ausmaß der Cytokinexpression von humanen mesenchymalen Stammzellen mit und ohne Stimulation durch Interleukin-1, und zwar auf der Grundlage der Experimente von Referenzbeispiel 4.
7A und 7B:

(A) Phasenkontrastmikrogramm einer lebenden Kultur von MSCs zur Darstellung der multinukleierten Zellen, die sich nach Einwirkung von 5-aza-CR ergeben. Dieses Mikrogramm zeigt eine Kultur 2 Wochen nach Behandlung mit 10 μm 5-aza-CR. Zahlreiche Kerne (Pfeile) lassen sich in der Zelle beobachten, wobei Streifenbildungen nicht erkennbar sind.
(B) Phasenkontrastmikrogramm einer lebenden Kultur von normalen Rattenfötus-Muskelzellen bei Präparation aus den hinteren Gliedmaßen von Rattenföten im Alter von 17 Tagen. Wie bei den von Knochenmark-MSCs abgeleiteten Myotuben treten keine erkennbaren Streifenbildungen auf. Maßstabbalken: 50 μm.

8: Immunofluoreszenzfärbung für muskelspezifisches Myosin in Myotuben, die sich von Ratten-Knochenmark-MSCs nach Einwirkung von 5-aza-CR ableiten. Myosin-Antikörper machen keine Kreuzstreifenbildungen sichtbar, wobei aber die Antikörper klar longitudinale Fasern erkennbar machen. Maßstabbalken: 30 μm.
9A–9D: Myotuben, abgeleitet von Ratten-Knochenmark-MSCs 2 Wochen [(A) und (B)] und 5 Wochen [(C) und (D)] nach Einwirkung von 5-aza-CR. Phasenkontrastmikrogramm [(A) und (C)] und Immunofluoreszenzfärbung für Myosin [(B) und (D)]. Bei (A) und (B), (C) und (D) handelt es sich um die gleichen Gesichtsfelder. Myotuben 2 Wochen nach Einwirkung von 5-aza-CR färben sich mit anti-Myosin-Antikörper, jedoch solche 5 Wochen nach Belastung nicht. Maßstabbalken: 50 μm.
10A–10B: Mikrogramm der mit 5-aza-CR behandelten MSCs mit einem Gehalt an Tröpfchen in ihrem Cytoplasma; diese Kultur färbte sich mit Sudanschwarz. (A) Cluster von Adipozyten (Pfeile) wurden beobachtet; Maßstabbalken: 200 μm. (B) Tröpfchen färben sich braun bis schwarz (Pfeile), was darauf schließen lässt, dass es sich bei diesen Tröpfchen um Lipide handelt; Maßstabbalken: 100 μm.
11: Phasenkontrastmikrogramm einer lebenden Kultur von myogenen Zellen, die sich von Ratten-Knochenmark-MSCs nach Einwirkung von 5-aza-CR ableiten. Nach Einwirkung von 5-aza-CR wurden diese Zellen mit 4 ng/ml bFGF 10 Tage gezüchtet. Es sind große Myotuben ersichtlich; Maßstabbalken: 300 μm.
Die 12A–12D zeigen graphisch die Expression von G-CSF, GM-CSF, M-CSF und SCF gemäß Beobachtung in den in Referenzbeispiel 6 beschriebenen Experimenten.
Die 13A–13C erläutern in graphischer Weise die Expression von LIF, IL-6 und IL-11, die in den im Referenzbeispiel 6 beschriebenen Experimenten beobachtet wurde.
14 erläutert in graphischer Weise die dosisabhängige IL-1α-Induktion der GM-CSF-Expression, die bei dem in Referenzbeispiel 6 beschriebenen Experimenten beobachtet wurde.
Die Erfindung bietet zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten und Vorteile. Der erste Vorteil liegt in der Möglichkeit, die MSC-Differenzierung vor Rückimplantation in autologe Wirte zu dirigieren und zu beschleunigen. Beispielsweise synthetisieren MSCs, die in vitro zur Bildung von osteogenen Zellen gesteuert worden sind, Knochenmatrix an einer Implantationsstelle rascher und gleichmäßiger als MSCs, die zuerst zur Bildung der Zelllinie veranlasst werden müssen und anschließend die Schlüsseldifferenzierungsstufen durchlaufen. Eine derartige ex vivo-Behandlung sorgt auch für eine gleichmäßige und kontrollierte Anwendung von bioaktiven Faktoren auf gereinigte MSCs, was zu einer gleichmäßigen Linienfestlegung und -differenzierung führt. Die in vivo-Verfügbarkeit von endogenen, bioaktiven Faktoren lässt sich nicht leicht sicherstellen oder steuern. Eine Vorbehandlungsstufe, wie sie hier beschrieben wird, umgeht dieses Problem. Ferner werden durch die Vorbehandlung der MSCs vor der Implantation mögliche schädliche Nebenwirkungen, die mit einer systemischen oder lokalen Verabreichung von exogenen, bioaktiven Faktoren verbunden sind, vermieden. Eine weitere Anwendung dieser Technik liegt in der Möglichkeit, die Geweberegeneration auf der Grundlage der Differenzierungsstufe, in der sich die Zellen zum Zeitpunkt der Implantation befinden, zu dirigieren. Dies bedeutet, dass in Bezug auf Knochen und Knorpel der Zustand der Zellen bei der Implantation den letztendlich gebildeten Gewebetyp steuern kann. Hypertrophische Chondrozyten mineralisieren ihre Matrix und bereiten schließlich den Weg für eine vaskuläre Invasion, die schließlich zur Knochenneubildung führt. Es ist klar, dass MSCs, die zum Zweck der Wiederherstellung von normalem Hyalinknorpel implantiert werden, nicht die gesamte Linie durchlaufen müssen. Jedoch können Implantate, die zur Reparatur von Gelenkoberflächendefekten und des darunter liegenden subchondralen Knochens konzipiert sind, von einem Zweikomponentensystem profitieren, bei dem die Zellen im Bereich des zukünftigen Knochens ex vivo so gesteuert werden, dass sie zu hypertrophischen Chondrozyten werden, während die Zellen im Bereich der zukünftigen Gelenkoberfläche so gesteuert werden, dass daraus nur Chondroblasten entstehen. Im Bereich der stromalen Rekonstitution kann die ex vivo-Steuerung der Differenzierung MSC-Zellpopulationen optimieren, um stufenspezifische Cytokine zu entwickeln, die für die Bedürfnisse des Individuums erforderlich sind. Die Muskelmorphogenese kann gleichermaßen so gesteuert werden, dass je nach Indikation rasch oder langsam zuckende Fasern geschaffen werden.
Isolierung und Reinigung von humanen mesenchymalen Stammzellen
Die humanen mesenchymalen Stammzellen, die auf die vorstehend beschriebene Weise isoliert und gereinigt worden sind, leiten sich beispielsweise von Knochenmark, Blut, Dermis oder Periosteum ab. Bei Gewinnung aus Knochenmark kann es sich um Mark aus einer Anzahl verschiedener Quellen handeln, einschließlich Stopfen von schwammigen Knochenstücken des Oberschenkelkopfes, die von Patienten mit einer degenerativen Gelenkerkrankung bei Hüft- oder Knieoperationen erhalten worden sind, oder um abgesaugtes Knochenmark, das von normalen Spendern und von Krebspatienten, deren Knochenmark für eine spätere Knochenmarktransplantation gewonnen worden ist. Das gewonnene Mark wird sodann für die Zellkultur vorbereitet. Der Isolierungsvorgang beinhaltet die Verwendung eines speziell hergestellten Mediums, das Mittel enthält, die nicht nur das Wachstum von mesenchymalen Stammzellen ohne Differenzierung ermöglichen, sondern auch die direkte Haftung nur der mesenchymalen Stammzellen an der Kunststoff- oder Glasoberfläche des Kulturgefäßes. Durch Schaffung eines Mediums, das die selektive Haftung der angestrebten mesenchymalen Stammzellen, die in den mesenchymalen Gewebeproben nur in sehr winzigen Mengen vorhanden waren, ermöglicht, wird es anschließend möglich, die mesenchymalen Stammzellen von den übrigen Zellen (d. h. rote und weiße Blutkörperchen, andere differenzierte mesenchymale Zellen und dergl.), die im mesenchymalen Ursprungsgewebe vorhanden waren, zu trennen.
Knochenmark ist das weiche Gewebe, das in den medullären Kavitäten langer Knochen, einigen Havers-Kanälen und in Zwischenräumen zwischen Trabekeln von schwammigen Knochen enthalten ist. Es gibt zwei Typen von Knochenmark: rotes Knochenmark, das im frühen Lebensstadium in sämtlichen Knochen und im Erwachsenenalter nur an beschränkten Stellen (d. h. im schwammigen Knochen) vorkommt und mit der Erzeugung von roten Blutkörperchen (d. h. Hämatopoese) und Hämoglobin (die rote Farbe) befasst ist; und gelbes Knochenmark, das weitgehend aus Fettzellen (daher die gelbe Farbe) und Bindegewebe besteht.
Insgesamt handelt es sich bei Knochenmark um ein komplexes Gewebe aus hämatopoetischen Zellen, einschließlich den hämatopoetischen Stammzellen, und roten und weißen Blutzellen und deren Vorläufern; und einer Gruppe von Zellen, unter Einschluss von mesenchymalen Stammzellen, Fibroblasten, Retikulozyten, Adipozyten und Endothelzellen, die zum Bindegewebenetzwerk, das als "Stroma" bezeichnet wird, beitragen. Zellen des Stromas regulieren die Differenzierung von hämatopoetischen Zellen durch direkte Wechselwirkung über Zelloberflächenproteine und die Ausscheidung von Wachstumsfaktoren und sie sind an der Gründung und Unterstützung der Knochenstruktur beteiligt. Studien unter Einsatz von Tiermodellen lassen darauf schließen, dass Knochenmark "prästromale" Zellen enthält, die die Fähigkeit zur Differenzierung zu Knorpelzellen, Knochenzellen und anderen Bindegewebezellen besitzen (J. N. Beresford, Osteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow, Clin. Orthop., Bd. 240 (1989), S. 270). Neuere Erkenntnisse zeigen, dass diese Zellen, die als pluripotente, stromale Stammzellen oder mesenchymale Stammzellen bezeichnet werden, die Fähigkeit besitzen, sich zu mehreren verschiedenen Typen von Zelllinien zu entwickeln (d. h. Osteozyten, Chondrozyten, Adipozyten und dergl.), und zwar bei Aktivierung in Abhängigkeit vom Einfluss einer Anzahl von bioaktiven Faktoren. Jedoch sind die mesenchymalen Stammzellen im Gewebe in sehr winzigen Mengen zusammen mit einer großen Vielzahl anderer Zellen (d. h. Erythrozyten, Blutplättchen, Neutrophile, Lymphozyten, Monozyten, Eosinophile, Basophile, Adipozyten und dergl.) vorhanden.
Infolgedessen wurde ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von humanen mesenchymalen Stammzellen aus Geweben vor ihrer Differenzierung und zur anschließenden Kulturexpansion der mesenchymalen Stammzellen entwickelt, um ein wertvolles Werkzeug für die muskuloskelettale Therapie bereitzustellen. Das Ziel einer derartigen Manipulation besteht darin, die Anzahl der mesenchymalen Stammzellen stark zu erhöhen und diese Zellen dazu zu verwenden, das normale Reparaturvermögen des Körpers umzudirigieren und/oder zu verstärken. Die mesenchymalen Stammzellen werden auf eine große Anzahl expandiert und auf Bereiche von Bindegewebeschädigungen aufgebracht, um das in vivo-Wachstum zur Erzielung einer Regeneration und/oder Reparatur zu verstärken oder zu stimulieren, die Implantathaftung an verschiedenen Prothesevorrichtungen durch anschließende Aktivierung und Differenzierung zu verbessern oder die hämatopoetische Zellerzeugung zu verstärken und dergl.
Demgemäß werden verschiedene Verfahren zur Übertragung, Immobilisierung und Aktivierung der in Kultur expandierten, gereinigten mesenchymalen Stammzellen an der Stelle für die Reparatur, Implantation und dergl. in Betracht gezogen, einschließlich eine Injektion der Zellen an der Stelle eines Skelettdefekts, eine Inkubation der Zellen zusammen mit einer Prothese und eine Implantation der Prothese und dergl. Somit können durch Isolierung, Reinigung und starke Vergrößerung der Anzahl der Zellen vor ihrer Differenzierung und durch anschließende aktive Steuerung des Differenzierungsvorgangs aufgrund der Positionierung der Zellen an der Stelle der Gewebeschädigung oder durch in vitro-Vorbehandlung vor ihrer Transplantation die in Kultur expandierten, mesenchymalen Stammzellen für verschiedene therapeutische Zwecke verwendet werden, z. B. zur Linderung von zellulären, molekularen und genetischen Störungen bei einer großen Anzahl an metabolischen Knochenkrankheiten, Skelettdysplasien, Knorpeldefekten, Bänder- und Sehnenverletzungen und anderen muskuloskelettalen und Bindegewebestörungen.
Es wurden verschiedene Medien zubereitet, die sich besonders gut für die angestrebte selektive Haftung eignen und die hier als "Komplettmedien" bezeichnet werden, wenn sie gemäß den nachstehenden Angaben mit Serum ergänzt sind. Ein derartiges Medium ist eine verstärkte Version von DMEM-LG (gemäß Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium mit geringem Glucosegehalt), das bekannt und im Handel leicht erhältlich ist.
Die kommerzielle Zubereitung wird mit 3 700 mg/Liter Natriumbicarbonat und 10 ml/Liter 100 × Antibiotikum-Antimykotikum mit einem Gehalt an 10 000 Einheiten Penicillin (Base), 10 000 μg Streptomycin (Base) und 25 μg Amphotericin B/ml unter Verwendung von Penicillin G (Natriumsalz), Streptomycinsulfat und Amphotericin B in Form von FUNGIZONE^® in 0,85 % Kochsalzlösung ergänzt.
Das vorstehend beschriebene Medium wird hergestellt und in einer Menge von 90 ml pro 100 ml-Flasche oder von 450 ml pro 500 ml-Flasche bei 4 °C bis zur Verwendung aufbewahrt. Für die Verwendung werden 10 ml oder 50 ml fötales Kälberserum (aus ausgewählten Chargen) den Flaschen mit dem Medium in einem Endvolumen von 10 % Serum zugesetzt. Das Medium wird vor der Verwendung auf 37 °C erwärmt.
Diesbezüglich wurde ferner festgestellt, dass BGJ_b-Medium (Gibco, Grand Island, NY) mit getesteten und ausgewählten Chargen von 10 fötalem Kälberserum (J. R. Scientific, Woodland, CA, oder andere Lieferanten) für die erfindungsgemäße Verwendung gut geeignet ist. Dieses Medium, bei dem es sich ebenfalls um ein "komplettes Medium" handelte, enthielt Faktoren, die ebenfalls das Wachstum von mesenchymalen Stammzellen ohne Differenzierung stimulierten und die selektive Haftung durch spezifische Proteinbindungsstellen und dergl. nur der mesenchymalen Stammzellen an den Kunststoffoberflächen von Petri-Schalen ermöglichten.
Ferner wurde festgestellt, dass das Medium F-12-Nährstoffgemisch (Ham) (Gibco, Grand Island, NY) die erwünschten Eigenschaften für die selektive Abtrennung von mesenchymalen Stammzellen aufweist.
Wie vorstehend angegeben, kann das Komplettmedium in einer Anzahl von verschiedenen Isolierungsverfahren eingesetzt werden, und zwar in Abhängigkeit vom spezifischen Typ der anfänglichen Ernteverfahren, die zur Vorbereitung des geernteten Knochenmarks für die Zellkulturtrennung herangezogen werden. Wenn dabei Mark aus Propfen von schwammigen Knochen verwendet wurde, wurde das Mark zum Komplettmedium gegeben und zur Bildung einer Dispersion aufgewirbelt, die dann zentrifugiert wurde, um die Markzellen von Knochenstücken und dergl. zu trennen. Die Markzellen (vorwiegend bestehend aus roten und weißen Blutkörperchen und einer sehr geringen Menge an mesenchymalen Stammzellen und dergl.) wurden sodann zu einzelnen Zellen dissoziiert, indem man sequenziell das Komplettmedium, das die Markzellen enthielt, durch Spritzen passieren ließ, die mit einer Reihe von Nadeln mit 16, 18 und 20 gauge versehen waren. Es wird angenommen, dass der durch die Anwendung des mechanischen Trennverfahrens erzielte Vorteil (im Gegensatz zu etwaigen enzymatischen Trennverfahren) darin bestand, dass das mechanische Verfahren nur eine geringe zelluläre Veränderung hervorruft, während ein enzymatisches Verfahren eine Zellschädigung bewirken kann, insbesondere an den Proteinbindungsstellen, die für die Haftung und selektive Trennung der Kultur erforderlich sind, und/oder an den Proteinstellen, die für die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für die mesenchymalen Stammzellen sind, notwendig sind. Die Einzelzellsuspension (die aus etwa 50 – 100 × 10⁶ nukleierten Zellen bestand) wurde anschließend in 100 ml-Schalen ausgestrichen, um die mesenchymalen Stammzellen von den restlichen Zellen, die in der Suspension auftreten, selektiv abzutrennen und/oder zu isolieren.
Bei Verwendung von abgesaugtem Knochenmark als Quelle für mesenchymale Stammzellen wurden die Knochenmark-Stammzellen (die wenig oder gar keine Knochenstücke, jedoch eine große Menge an Blut enthielten) zum Komplettmedium gegeben und mit Gradienten von Percoll (Sigma, St. Louis, MO), die im nachstehenden Referenzbeispiel 1 ausführlich beschrieben sind, fraktioniert. Die Percoll-Gradienten trennten einen großen prozentualen Anteil der roten Blutkörperchen und der einkernigen hämatopoetischen Zellen von der Blutplättchenfraktion geringer Dichte, die die vom Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen enthielt. Diesbezüglich bestand die Blutplättchenfraktion, die etwa 30 – 50 × 10⁶ Zellen enthielt, aus einer unbestimmten Menge an Blutplättchen, 30 – 50 × 10⁶ nukleierten Zellen und nur etwa 50 – 500 mesenchymalen Stammzellen, und zwar in Abhängigkeit vom Alter des Knochenmarkspenders. Die Blutplättchenfraktion von geringer Dichte wurde sodann zur selektiven Trennung auf der Grundlage der Zellhaftung in der Petri-Schale ausgestrichen.
Dabei wurden die Knochenmarkzellen, die entweder aus schwammigen Knochen oder aus Ilium-Aspirat (d. h. die primären Kulturen) in Komplettmedium gezüchtet und 1 bis 7 Tage je nach den im Referenzbeispiel 1 angegebenen Bedingungen zur Haftung an der Oberfläche der Petri-Schalen gebracht. Da nach 3 Tagen eine minimale Zellhaftung beobachtet wurde, wurde der Wert von 3 Tagen als Standardzeitspanne gewählt, nach der die nicht-haftenden Zellen aus den Kulturen entfernt wurden, indem man das ursprüngliche Komplettmedium durch frisches Komplettmedium ersetzte. Anschließende Austauschvorgänge des Mediums wurden alle 4 Tage durchgeführt, bis die Kulturschalen einen konfluenten Zustand annahmen, was normalerweise 14 bis 21 Tage dauerte. Dies ergab eine 10³- bis 10⁴-fache Zunahme der Anzahl an undifferenzierten humanen mesenchymalen Stammzellen.
Die Zellen wurden sodann von den Kulturschalen abgelöst, wobei ein Trennmittel, wie Trypsin zusammen mit EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (0,25 % Trypsin, 1 mM EDTA (1X), Gibco, Grand Island, NY), verwendet wurde. Das Trennmittel wurde sodann inaktiviert und die abgelösten, gezüchteten, undifferenzierten, mesenchymalen Stammzellen wurden für die anschließende Verwendung mit Komplettmedium gewaschen.
Die Fähigkeit dieser undifferenzierten Zellen zum Eintritt in diskrete Linienwege wird als mesengener Prozess bezeichnet und ist schematisch in 1 dargestellt. Beim mesengenen Prozess werden MSCs zum Eintritt in spezifische, mehrstufige Linienwege veranlasst, die schließlich funktionell differenzierte Gewebe, wie Knochen, Knorpel, Sehnen, Muskeln, Dermis, Knochenmarkstroma und andere mesenchymale Bindegewebe, erzeugen. Beispielsweise ist ein ausführliches Schema für den Differenzierungsweg von knochenbildenden Zellen in 2 dargestellt. Diese Abstammungskarte impliziert die Existenz von individuellen Steuerelementen, die die MSCs in die osteogene Linie aufnehmen, die Präosteoblastenreplikation fördern und eine stufenweise Differenzierung auf der gesamten Strecke bis zu den Osteozyten der letzten Stufe dirigieren. Es gibt zahlreiche Arbeiten, die die Auffassung stützen, dass jede Stufe dieses komplexen Wegs durch verschiedene bioaktive Faktoren gesteuert wird.
Ein ähnliches Liniendiagramm wurde für die Chondrozytendifferenzierung entwickelt und ist in 5 dargestellt. Auch hier steht die Progression einer jeden Linienstufe unter der Steuerung besonderer bioaktiver Faktoren, einschließlich (ohne Beschränkung hierauf) der Familie von knochenmorphogenetischen Proteinen. Jeder Modulator des Differenzierungsprozesses (in Knochen-, Knorpel-, Muskel- oder beliebigen anderen mesenchymalen Geweben) kann die Geschwindigkeit der Linienfortentwicklung beeinflussen und/oder spezifisch die einzelnen Stufen entlang des Wegs beeinflussen. Dies bedeutet, dass die Frage, ob eine Zelle in naszierendem Zustand auf eine spezifische Linie festgelegt wird, sich in einem biosynthetischen aktiven Zustand befindet oder sich zu einem Endstadium-Phänotyp fortentwickelt, von der Vielzahl und dem zeitlichen Eingreifen der bioaktiven Faktoren in der lokalen Umgebung abhängt.
Die Knochen- und Knorpel-Linienpotentiale (d. h. osteochondrogenes Potential) von frischen und expandierten humanen mesenchymalen Stammzellen wurden unter Verwendung von zwei verschiedenen in vivo-Tests an Nacktmäusen bestimmt. Ein Test beinhaltete die subkutane Implantation von poröser Calciumphosphat-Keramik, die mit gezüchteten mesenchymalen Stammzellen beladen war; der andere Test beinhaltete eine peritoneale Implantation von Diffusionskammern, die mit gezüchteten mesenchymalen Stammzellen inokuliert waren. Vollständiges Knochenmark und mit einem Percoll-Gradienten abgetrennte Aspiratfraktionen wurden ebenfalls bei diesen in vivo-Tests analysiert. Eine histologische Bewertung zeigte eine Knochen- und Knorpelbildung in der implantierten Keramik mit den gezüchteten mesenchymalen Stammzellen, die sich vom Oberschenkelkopf und vom Darmbeinkamm ableiteten. Mit humanen mesenchymalen Stammzellen in einer Menge von 5 × 10⁶ Zellen/ml beladene Keramik bildete Knochen innerhalb der Poren, während mit humanen mesenchymalen Stammzellen in einer Menge von 10 × 10⁶ Zellen/ml beladene Keramik innerhalb der Poren Knorpel bildete. Während nunmehr gezeigt worden ist, dass vollständiges Knochenmark Knochen bildet, wenn es als Verbundtransplantat mit Keramik bei Nacktmäusen an eine subkutane Stelle gebracht wird, ist die Menge des gebildeten Knochens erheblich geringer als dann, wenn in Kultur expandierte, von Knochenmark abgeleite mesenchymale Stammzellen verwendet werden.
Diese Ergebnisse zeigten, dass unter bestimmten Bedingungen in Kultur expandierte, mesenchymale Stammzellen die Fähigkeit zur Differenzierung zu Knochen oder Knorpel besitzen, wenn sie in Form eines Transplantats in poröser Calciumphosphat-Keramik inkubiert werden. Die Umgebungsfaktoren, die die mesenchymalen Stammzellen zur Differenzierung zu Knochen- oder Knorpelzellen beeinflussen, scheinen teilweise in der direkten Zugänglichkeit der mesenchymalen Stammzellen zu Wachstums- und Nährstofffaktoren, die durch das Gefäßsystem in poröser Calciumphosphat-Keramik zugeführt werden, zu liegen. Zellen, die eng mit dem Gefäßsystem assoziiert sind, differenzieren zu Knochenzellen, während Zellen, die vom Gefäßsystem isoliert sind, zu Knorpelzellen differenzieren. Der Ausschluss des Gefäßsystems von den Poren der Keramik, die mit konzentrierten humanen mesenchymalen Stammzellen beladen ist, verhinderte eine osteogene Differenzierung und sorgte für Bedingungen, die eine Chondrogenese zulassen.
Infolgedessen können die isolierten und in Kultur expandierten mesenchymalen Stammzellen unter bestimmten spezifischen Bedingungen und/oder unter dem Einfluss bestimmter Faktoren zum angestrebten Zellphänotyp, der für die Reparatur oder Regeneration von Bindegewebe und/oder für die Implantation verschiedener prothetischer Vorrichtungen erforderlich ist, differenzieren und diesen erzeugen. Beispielsweise wurde unter Verwendung poröser Keramikwürfel, die mit in Kultur expandierten humanen mesenchymalen Stammzellen gefüllt waren, eine Knochenbildung im Innern der Poren der Keramik nach subkutaner Inkubation in immunokompatiblen Wirten erzeugt. In einer neueren Studie (13) wurde Ratten-Knochenmark in einem Verbundtransplantat mit poröser Keramik verwendet, um einen segmentalen Defekt im Oberschenkelknochen der Ratte auszufüllen. Es wurde gezeigt, dass Knochen die Poren der Keramik füllt und das Keramik-Knochenmark-Transplantat am Wirtsknochen verankert.
Faktoren, die die Osteogenese stimulieren (d. h. die osteoinduktiv sind), aus isolierten, humanen mesenchymalen Stammzellen sind in verschiedenen Klassen von Molekülen vorhanden, wozu folgende Klassen gehören: knochenmorphogenetische Proteine, wie BMP-2 (14) und BMP-3 (15); Wachstumsfaktoren, wie basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF); Glucocorticoide, wie Dexamethason (16); und Prostaglandine, wie Prostaglandin E1 (22). Ferner sind Ascorbinsäure und deren Analoge, wie Ascorbinsäure-2-phosphat (17); und Glycerinphosphate, wie R-Glycerophosphat (18), wirksame unterstützende Faktoren für eine fortgeschrittene Differenzierung, obgleich sie allein keine osteogene Differenzierung induzieren können.
Faktoren mit chondroinduktiver Aktivität auf humane MSCs sind ebenfalls in mehreren Klassen von Molekülen vorhanden, einschließlich die folgenden Klassen: Verbindungen innerhalb der Oberfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGF-β), wie (i) TGF-β1 (19), (ii) Inhibin A (20), (iii) chondrogener, stimulatorischer Aktivitätsfaktor (CSA) (21) und (iv) knochenmorphogenetische Proteine, wie BMP-4 (22); kollagenartige, extrazelluläre Matrixmoleküle, einschließlich Kollagen vom Typ I, insbesondere in Form eines Gels (23); und Vitamin A-Analoge, wie Retinoesäure (24).
Faktoren mit stromagener, induktiver Aktivität auf humane MSCs sind ebenfalls in mehreren Klassen von Molekülen vorhanden, insbesondere die Interleukine, wie IL-1α (25) und IL-2 (26).
Faktoren mit myogener, induktiver Aktivität auf humane MSCs sind ebenfalls in mehreren Klassen von Molekülen vorhanden, insbesondere Cytidin-Analoge, wie 5-Azacytidin und 5-Aza-2'-desoxycytidin.
Die Wirkung dieser modulierenden Faktoren auf humane MSCs wird hier erstmals beschrieben. Es handelt sich hier nicht um eine allumfassende Aufzählung potentiell geeigneter modulatorischer Faktoren zur Induktion einer Differenzierung zu einer speziellen Linie; es wird jedoch die Vielzahl von Verbindungen erläutert, die eine wertvolle biologische Aktivität zur Förderung der stufenweisen Fortentwicklung der Differenzierung von isolierten humanen mesenchymalen Stammzellen aufweisen.
Referenzbeispiel 1
In vitro induzierte osteogene Differenzierung von MSCs
Das Ziel der in diesem Beispiel beschriebenen Experimente bestand darin, den Nachweis zu erbringen, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs) in vitro entlang des osteogenen Linienwegs gesteuert wurden, indem man geeignete bioaktive Faktoren im Gewebekulturmedium bereitstellte. Dieser Satz von Experimenten erläutert nur ein Beispiel, wie MSCs entlang der osteogenen Linie dirigiert werden können.
Anfängliche Studie
Humane MSCs wurden gemäß den vorstehenden Ausführungen aus Knochenmark geerntet und isoliert. Diese Zellen wurden in Kultur in DMEM-LG-Medium mit einem Gehalt an vorher ausgewähltem, 10%igem fötalem Kälberserum (Komplettmedium) expandiert. Ein Austausch mit frischem Komplettmedium wurde alle 3 bis 4 Tage durchgeführt, bis die Kulturen einen nahezu konfluenten Zustand erreichten. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen mit Trypsin von den Platten freigesetzt und auf neue Schalen bei etwa 40%iger Konfluenz überimpft (400 000 Zellen pro 100 mm-Schale). Diese erneut ausgestrichenen MSCs ließ man über Nacht anhaften, wonach das Komplettmedium durch ein Medium aus DMEM-LG, 10 % fötalem Kälberserum und entweder 100 nM Dexamethason allein oder 100 nM Dexamethason zusammen mit 50 μM Ascorbinsäure-2-phosphat und 10 mM β-Glycerophosphat (osteogene Ergänzung) zusammengesetzt war. Die osteogene Ergänzung wurde alle 3 Tage ersetzt. Die Zellen wurden täglich auf morphologische Veränderungen geprüft. Ausgewählte Platten wurden sodann einem Test auf Zelloberflächen-alkalische Phosphatase (AP)-Aktivität unterzogen, einem Marker für Zellen, die in die osteogene Linie eingetreten sind. Diese Zellen waren anschließlich für die Synthese der osteoiden Matrix verantwortlich. Übliche Reagenzien der Enzymhistochemie und -biochemie wurden verwendet, um die Aktivität dieses Zelloberflächenproteins nachzuweisen. Zusätzliche Proben wurden auf das Vorliegen von mineralisierten, extrazellulären Matrixknoten bewertet, die mit der fortgesetzten Differenzierung und phänotypischen Expression einer reifen Osteoblastenpopulation korrelieren. Eine Silbernitrat-Fällung auf Calciumphosphatkristalle innerhalb des Knochenknotens wurde durch die übliche Färbungstechnik gemäß Von Kossa erreicht.
Die Ergebnisse zeigen, dass nach nur 3-tägiger Einwirkung von Dexamethason MSCs in Kultur auf ihrer Oberfläche bereits mit der Expression von alkalischer Phosphatase begonnen hatten. Am sechsten Züchtungstag waren etwa 80 % der Zellen AP-positiv. Die grobe Organisation der Kulturschale hatte sich von nahezu konfluenten Windungen von fibroblastenartigen Zellen am Tag 1 zu zahlreichen Bereichen von polygonalen Zellen, die übereinander gestapelt waren, verändert. Am neunten Tag waren zahlreiche kleine Knoten einer doppelbrechenden extrazellulären Matrix mit diesen Herden von schichtförmigen polygonalen Zellen assoziiert. Diese Bereiche wurden durch das Von Kossa-Verfahren positiv auf Mineralien gefärbt. Kontrollkulturen, die nur mit Komplettmedium versorgt worden waren, entwickelten niemals diese mineralisierten Knochenknoten und enthielten selten AP-positive Zellen. Im Gegensatz dazu entfalteten mit osteogener Ergänzung behandelte MSCs gleichmäßig AP-Aktivität und synthetisierten mineralisierte extrazelluläre Matrixknoten in der gesamten Schale. Obgleich Ascorbinsäure-2-phosphat und β-Glycerophosphat selbst nicht osteoinduktiv sind, unterstützt deren Anwesenheit in der kompletten osteogenen Ergänzung zusätzlich die Reifung der extrazellulären Matrix bzw. der Mineralabscheidung. 3 zeigt graphisch die Zunahme der Enzymaktivität von alkalischer Phosphatase als eine Funktion der Zeit in der Kultur. Am achten Tag und später wird eine erheblich höhere Enzymaktivität in den Zellen, die mit der osteogenen Ergänzung (OS) behandelt worden sind, als in den mit Kontrollmedium gezüchteten Zellen beobachtet.
Insgesamt belegen diese Studien, dass MSCs rasch und gleichmäßig in vitro zur Stimulation der Differenzierung entlang der osteogenen Linie stimuliert werden können. Ferner werden nicht nur die MSCs in die frühen Stufen innerhalb der Linie aufgenommen, wie durch AP-Expression belegt wird, sondern die MSCs entwickeln sich entlang der Linie zu reifen Osteoblasten, die eine knochenartige extrazelluläre Matrix sezernieren und mineralisieren. Ein weiterer Beweis hierfür ergibt sich aus der Beobachtung, dass dann, wenn Hühner-MSCs mit der osteogenen Ergänzung behandelt werden, sie die Stufen der osteogenen Linie, die in 2 dargestellt ist, durchlaufen, wie durch monoklonale Antikörperfärbung gegen stufenspezifische Zelloberflächenantigene festgestellt wird.
Anschließende Studie
Unter Anwendung von aus der Literatur bekannten Techniken wurden MSCs von drei unterschiedlichen Patienten (Alter 26–47) gereinigt, in Kultur expandiert (27) und über Nacht auf Kulturplatten mit 48 Vertiefungen bei 20%iger Konfluenz in DMEM-LG mit 10 % FBS ausgewählter Chargen überimpft. Zum Vergleich wurden folgende Medien herangezogen: DMEM-LG, BGJ_b, αMEM und DMEM/F-12 (1:1). Dreifachkulturen für jeden Test wurden in 10 % FBS in Abwesenheit oder Anwesenheit der "osteogenen Ergänzungen" (OS) (100 nM Dexamethason, 50 μM Ascorbinsäure-2-phosphat und 10 mM β-Glycerophosphat (28) gezüchtet. Die Medien wurden alle 3 Tage ausgetauscht. Jeder Satz von Kulturen wurde auf die Zellzahl durch den Kristallvioletttest, auf Zelloberflächen-alkalische Phosphatase (AP) durch ein histochemisches Verfahren und auf die Bildung von mineralisierten Knoten durch die Von Kossa-Färbung getestet. Die AP-Enzymaktivität wurde berechnet, indem lebende Kulturen mit 5 mM p-Nitrophenylphosphat in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH-Wert 9,0, inkubiert wurden und die kolorimetrische Reaktion durch Abtasten der Proben bei 405 nm an einem ELISA-Plattenlesegerät quantitativ bestimmt wurde. Die AP-Enzymaktivität wurde als Nanomol Produkt/Minute/10³ Zellen angegeben. Der prozentuale Anteil an AP-positiven Zellen in jeder Vertiefung wurde aus den gefärbten Kulturen ermittelt und die Anzahl an mineralisierten Knoten pro Vertiefung wurde gezählt. Tests wurden alle 4 Tage während der 16-tägigen Züchtungsperiode durchgeführt. Der zweiteilige Zweiproben-t-Test wurde an ausgewählten Proben vorgenommen. Die Daten in 4 gelten für einen Patienten, obgleich ähnliche Ergebnisse mit sämtlichen Proben erhalten wurden.
MSCs hafteten gleichmäßig an den Platten, nahmen ihre charakteristische spindelförmige Morphologie an und vermehrten sich unter Erreichen des konfluenten Zustands innerhalb von 8 Tagen. Während dieses Zeitraums und insbesondere danach entwickelten die OS-behandelten Zellen mit zunehmender Dichte eine kuboidale Morphologie unter Bildung von mehrfachen Schichten. Aus Gründen der Klarheit sind in 4 graphisch nur ausgewählte Aspekte der vorstehend beschriebenen Parameter wiedergegeben. Sämtliche in BGJb+OS gezüchteten Proben starben innerhalb von 3 Tagen ab, während BGJb-Kulturen während der Versuchsdauer überlebten. Aus diesem Grund wurden sämtliche BGJb-Daten in den Diagrammen weggelassen. Die Studie belegt insbesondere eine erheblich größere Proliferation in α-MEM, verglichen mit DMEM/F-12 oder DMEM allein (d. h. p < 0,01 und p < 0,05 am Tag 16). Die Zugabe von OS zu αMEM-Kulturen hemmte die Proliferation an den Tagen 8 und 12 (p < 0,04 und p < 0,03), jedoch nicht am Tag 16 (p > 0,05). αMEM+OS stimuliert ebenfalls einen erheblichen Anteil von Zellen zur Expression von AP auf ihrer Oberfläche, verglichen mit MSCs, die in DMEM gehalten werden (p < 0,02 am Tag 8, p < 0,01 am Tag 16). Jedoch wird kein signifikanter Unterschied im prozentualen Anteil an AP-Zellen zwischen αMEM mit und ohne OS beobachtet (p > 0,2 am Tag 8, p > 0,05 am Tag 16). Bemerkenswerterweise induziert αMEM+OS während der gesamten Züchtungsdauer eine höhere AP-Aktivität als sämtliche übrigen Medien, einschließlich αMEM oder DMEM (d. h. p < 0,004 und p < 0,002 am Tag 16). Jedoch bestand während der gesamten Dauer der Studie kein Unterschied in der AP-Aktivität zwischen αMEM und DMEM+OS (d. h. p > 0,2 am Tag 16). Von sämtlichen getesteten Medien ist die Anzahl an mineralisierten Knoten am Tag 16 in DMEM+OS am größten (p < 0,02, verglichen mit DMEM).
Diese Untersuchungen belegen, dass gereinigte, in Kultur expandierte, humane MSCs in vitro zu einer osteogenen Linie induziert werden können, wodurch ein Modell für die humane Osteoblasten-Differenzierung bereitgestellt wird. In einem frühen Stadium der Züchtungsperiode (Tag 8) induzierte nur αMEM+OS eine erhebliche Osteoblastenbildung von MSCs (>50 %), wie durch AP-Zelloberflächenfärbung festgestellt wird. Am Tag 16 enthielten jedoch sämtliche Kulturen, mit Ausnahme von DMEM, >60 % AP-gefärbte Zellen. In sämtlichen untersuchten Medien führte die Zugabe von OS nach dem 4. Tag zu einer höheren AP-Aktivität. Obgleich ein großer prozentualer Anteil an Zellen in den meisten Medien am Tag 16 eine AP-Färbung zeigte, spiegeln die erheblichen Unterschiede beim AP-Aktivitätstest wahrscheinlich die Enzymmenge an der Zelloberfläche wieder und somit den Grad der Fortentwicklung zur Osteoblastenlinie. Zumindest sind OS zur Hochregulierung der Expression dieses Osteoblasten-Zelloberflächenmarkers befähigt. Interessanterweise erzeugten DMEM+OS-Zellen trotz ihrer geringeren AP-Aktivität mehr mineralisierte Knoten als αMEM+OS. Diese Beobachtung lässt möglicherweise darauf schließen, dass innerhalb der 16-tägigen Züchtungsperiode DMEM+OS eine weitergehende osteogene Differenzierung von MSCs als αMEM+OS unterstützt. Es ist möglich, dass bei noch mehr Zeit αMEM+OS sogar mehr mineralisierte Herde als DMEM+OS fördert. Unterschiede in den Medien, die die Aufrechterhaltung des MSC-Phänotyps begünstigen (DMEM), die durch MSC-spezifische Immunofärbung oder maximale Rekrutierung und Induktion zur osteogenen Linie nachgewiesen wurden (αMEM+OS), was durch die prozentualen AP-positiven Zellen und die AP-Aktivität festgestellt wird, sind von Natur aus von Interesse und einer weiteren Prüfung wert. Die Verwendung verschiedener monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen spezifische Zell- und Matrixkomponenten während dieses induktiven Phänomens wird derzeit untersucht und wird weitere Erkenntnisse über die molekulare Natur des in vitro-Differenzierungsprozesses liefern.
Referenzbeispiel 2
Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern gegen humane osteogene Zellen ergibt in vivo eine embryonale Knochenbildung und in vitro eine Differenzierung von gereinigten mesenchymalen Stammzellen.
Es gilt als sicher, dass mesenchymale Vorläuferzellen, die sich von Knochenmark ableiten, zur Differenzierung zu Osteoblasten befähigt sind. Ferner ergeben diese mesenchymalen Stammzellen (MSCs) auch Knorpel-, Sehnen-, Bänder-, Muskel- und andere Gewebe. Jedoch sind die Kenntnisse über die bei der Festlegung und Differenzierung von MSCs entlang dieser verschiedenen Linien nur beschränkt, was zum Teil auf den Mangel an Sonden, die spezifisch für Zellen in verschiedenen Stufen innerhalb der osteogenen und anderen Differenzierungswege sind, zurückzuführen ist. Da monoklonale Antikörper wertvolle Sonden zum Untersuchen der Differenzierung sind, immunisierten wir Mäuse mit intakten lebenden Zellpräparaten von von humanem Knochenmark abgeleiteten MSCs, die in vitro zur osteogenen Linie induziert worden waren. Wir unterwarfen Hybridomkolonien einem Screening gegen gereinigte MSCs, gegen MSCs, die einer osteogenen Differenzierung unterliegen, und gegen gefrorene Schnitte von humanen embryonalen Gliedmaßen, bei denen sich lange Knochen um das Knorpelrudiment herum entwickeln. Dieses Screeningverfahren begünstigt die Auswahl von Antikörpern, die in vitro mit einer Differenzierung unterliegenden MSCs und in vivo mit humanen osteogenen Zellen reagieren. Auf diesem Weg erzeugten wir monoklonale Antikörper gegen in Bezug auf die Linienstufen spezifische Oberflächenantigene an osteogenen Zellen, die sich von humanen Knochenmark-MSCs ableiten.
Unter Verwendung von aus dem Stand der Technik bekannten Techniken reinigten wir MSCs von 5 verschiedenen Patienten (Alter 28–46), expandierten sie in Kultur (29) und züchteten sie in DMEM-LG mit 10 % FBS und "osteogenen Ergänzungen" (100 nM Dexamethason, 50 μM Ascorbinsäure-2-phosphat und 10 mM β-Glycerophosphat (28). Nach 3- bis 6-tägiger Züchtungszeit wurden die Zellen während der frühen Expression von alkalischer Phosphatase und vor der Bildung von mineralisierten Knoten (30) von den Platten mit 5 mM EGTA freigesetzt. Etwa 4 Millionen Zellen nach 3- und 6-tägiger Züchtung wurden für jede der 5 wöchentlichen Immunisierungen von Balbc/J-Mäusen vereinigt. Unter Anwendung üblicher Techniken wurden monoklonale Hybridome erzeugt und die Kulturüberstände wurden durch halbquantitativen ELISA-Test gegen gereinigte MSCs einem Screening unterzogen. MSCs wurden 3 oder 6 Tage mit osteogenen Ergänzungen gezüchtet. Kurz zusammengefasst, MSCs wurden auf Kulturplatten mit 96 Vertiefungen ausgestrichen, den osteogenen Ergänzungen ausgesetzt und sodann mit Kulturüberständen und anschließend mit Ziegen-anti-Maus-IgG, das mit Meerrettich-peroxidase konjugiert war, umgesetzt. Der sekundäre Antikörper wurde gespült und die Platten wurden mit o-Phenylendiamin-Substrat versetzt. Die Bindung von primärem monoklonalem Mäuse-Antikörper wurde durch kolorimetrische Reaktion quantitativ bestimmt, indem die Vertiefungen bei 490 nm mit einem ELISA-Plattenlesegerät einem Scanning unterzogen wurden. Kolonien von Interesse wurden auf der Grundlage der unterschiedlichen Bindung an Kontroll-MSCs und osteogene Zellen, die sich von MSCs ableiteten, ausgewählt. Ausgewählte Kolonien wurden ferner einem Screening durch Immunofluoreszenz an unfixierten, gefrorenen Schnitten von humanen embryonalen Gliedmaßen unterzogen. Hybridomkolonien von Interesse wurden kloniert und weitere immunozytochemische Analysen wurden an einer Vielzahl von normalen und durch experimentelle Maßnahmen gewonnenen Geweben von Menschen, Ratten, Kaninchen, Hühnern und Rindern durchgeführt.
Nahezu 10 000 Hybridomkolonien wurden einem Screening gemäß dem vorstehend beschriebenen modifizierten ELISA-Verfahren unterzogen. Auf der Grundlage der unterschiedlichen Bindung an gereinigte MSCs oder MSCs, die 3 und 6 Tage mit osteogenen Ergänzungen gezüchtet worden waren, wurden 224 Kolonien für das Immunofluoreszenz-Screening gegen embryonale (55–60 Tage) humane Gliedmaßen ausgewählt. Der Großteil dieser 224 Kolonien reagierte entweder mit multiplen Gewebetypen, die in den sich entwickelnden Gliedmaßen vorhanden waren, oder wurden im sich entwickelnden Knochen nicht nachgewiesen. Somit wurden 9 Kolonien identifiziert, die eine spezifische Immunoreaktivität an Zellen der osteogenen Linie zeigen. Die Reaktivitätsmuster variieren: einige Hybridomüberstände reagieren mit einer großen Population von Zellen innerhalb des osteogenen Randes und des Osteoprogenitorzellen enthaltenden Periosteums, während andere nur mit solchen Zellen reagieren, die offensichtlich aktiv an der Matrixsynthese beteiligt sind. Zwei Hybridomkolonien reagieren offensichtlich mit osteogenen Zellen sowie mit hypertrophen Chondrozyten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt die Immunoreaktivität von ausgewählten Hybridomkolonien gegen unbehandelte MSCs oder gegen MSCs, die 3 oder 6 Tage mit osteogenen Ergänzungen (OS) gezüchtet worden sind. Die Zahlen geben die relative Menge an Antikörper wieder, der beim vorstehend beschriebenen ELISA-Test gebunden wird.
Diese Untersuchungen zeigen das Vorliegen von Zelloberflächen-Differenzierungsmarkern, die für die humane osteogene Linie stufenspezifisch sind, ähnlich den Markern, über die bei osteogenen Vogelzellen ausführlich berichtet wird (31). Die Färbung von osteogenen Zellen in den sich entwickelnden Gliedmaßen stützt die Auffassung, dass MSCs, die mit osteogenen Ergänzungen gezüchtet worden sind, in Kultur zu "authentischen" Osteoblasten werden. Eine osteogene in vitro- Differenzierung wird somit durch Molekülsonden bestätigt, die sich über die herkömmlichen Kriterien der AP-Expression und die Bildung von mineralisierten Knoten hinaus erstrecken. Eine Korrelation von ausführlichen in vitro-Beobachtungen mit in vivo-Analysen der Antigenexpression eignet sich für weitere Studien der Osteogenese. Eine Charakterisierung der spezifischen Gewebekulturelemente, d. h. der bioaktiven Faktoren, die die Fortentwicklung der Zellen durch die Stufen der osteogenen Linie fördern, ist von entscheidender Bedeutung. Eine Identifizierung von osteogenen Zelloberflächen-Antigenen und/oder extrazellulären Matrix-Antigenen sollte somit weitere Erkenntnisse der Knochenzellphysiologie liefern. Diese und weitere monoklonale Antikörper, die derzeit untersucht werden, werden sich bei zukünftigen Studien der MSC-Differenzierung als wertvoll erweisen.
Beispiel 3
Induzierte chondrogene in vitro-Differenzierung von MSCs
Das Ziel der in diesem Beispiel beschriebenen Untersuchung bestand darin, den Nachweis zu erbringen, dass mesenchymale Stammzellen (MSCs) in vitro entlang der chondrogenen Linie dirigiert wurden, indem man geeignete bioaktive Faktoren im Gewebekulturmedium bereitstellte. Dieser Satz von Experimenten stellt nur ein Beispiel dafür dar, wie MSCs entlang der chondrogenen Linie dirigiert werden können. Humane MSCs wurden auf die vorstehend beschriebene Weise aus Knochenmark geerntet und isoliert. Die Zellen wurden in Kultur in DMEM-LG-Medium mit einem Gehalt an ausgewähltem 10%igem fötalem Kälberserum (Komplettmedium) expandiert. Alle 3 bis 4 Tage wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, bis die Kulturen einen nahezu konfluenten Zustand erreicht hatten. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen mit Trypsin von den Platten entfernt und auf neue Schalen bis zu etwa einer 50%igen Konfluenz überimpft (500 000 Zellen pro 100 mm-Schale). Diese erneut ausgestrichenen MSCs ließ man über Nacht anhaften, wonach das Komplettmedium durch DMEM-LG mit 10 % fötalem Kälberserum und 5 mg/ml partiell gereinigtem knochenmorphogenetischen Protein (chondrogene Ergänzung), das von Dr. Marshall R. Urist zur Verfügung gestellt wurde, ersetzt wurde. Diese chondrogene Ergänzung wurde alle 3 Tage ausgetauscht. Die Zellen wurden täglich auf morphologische Veränderungen geprüft. Ausgewählte Platten wurden sodann immunohistochemisch auf CSPG-M, einem Marker für Zellen, die in die chondrogene Linie eingetreten sind, analysiert. Es handelte sich um die Zellen, die anschließend zur Synthese von Typ II- Kollagenmatrix von Knorpeln veranlasst wurden. Übliche immunohistochemische Reagenzien wurden dazu verwendet, den Nachweis der Anwesenheit dieses extrazellulären Matrixproteins zu erbringen. Zusätzliche Proben wurden einer Bewertung auf die Anwesenheit mit Toluidinblau gefärbten Knoten bewertet, die eine Korrelation mit der fortgesetzten Differenzierung und Phänotyp-Expression einer reifen Chondrozytenpopulation ergab. Eine Von Kossa-Färbung auf die Anwesenheit von mineralisierten Knoten von hypertrophen Chondrozyten war negativ.
Die Ergebnisse zeigten, dass nach nur 3-tägiger Einwirkung der chondrogenen Ergänzung MSCs in Kultur bereits mit der Expression von CSPG-M in ihre extrazelluläre Matrix begonnen hatten. Die grobe Organisation der Kulturschale hatte sich von Windungen fibroblastenartiger Zellen am Tag 1 zu zahlreichen Herden von mehrschichtigen, runden oder polygonalen Zellen, die von einer dünnen Schicht von fibroblastischen Zellen, die einem Perichondrium glichen, umgeben waren, verändert. Die extrazelluläre Matrix dieser Knoten war stark in Bezug auf Typ II-Kollagen immunoreaktiv. Kontrollkulturen, die nur mit Komplettmedium gefüttert worden waren, entwickelten niemals diese Knorpelknoten. Insgesamt belegen diese Studien, dass MSCs zur in vitro-Differenzierung entlang der chondrogenen Linie stimuliert worden sind. Ferner wurden nicht nur die MSCs in die frühen Stufen innerhalb der Linie aufgenommen, was zur CSPG-M-Expression gezeigt wird, sondern die MSCs entwickelten sich entlang der Linie fort und wurden zu reifen Chondrozyten, die eine an Typ II-Kollagen reiche extrazelluläre Matrix sezernierten. Bisher wurde in vitro eine terminale Differenzierung von aus MSCs abgeleiteten Chondrozyten (bei Nachweis durch hypertrophe Zellen in einer calcifizierten Matrix) nicht beobachtet. Dieser Befund spricht für die Notwendigkeit einer Entwicklung einer chondrogenen Ergänzung, die spezifisch auf die Forderung dieser terminalen Differenzierungsstufe abzielt. Interessanterweise haben Pacifici und Mitarbeiter (32) ein Medium entwickelt, das Retinoesäure enthält, die die terminale in vitro-Differenzierung von Hühner-Chondrozyten stimuliert.
Das Additiv zum Komplettmedium, das im vorstehenden Beispiel die chondrogene Ergänzung darstellt, ist nur einer der Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie in vitro die chondrogene Zelldifferenzierung oder -proliferation stimulieren.
Referenzbeispiel 4
Induzierte in vitro Knochenmark-Stromazellen-Differenzierung von MSCs
Der Zweck der in diesem Beispiel beschriebenen Experimente bestand darin, den Nachweis zu erbringen, dass von humanem Knochenmark abgeleitete MSCs in vitro entlang der stromagenen Linie dirigiert wurden, indem man im Kulturmedium geeignete bioaktive Faktoren bereitstellte. Von humanem Knochenmark abgeleitete MSCs wurden auf die vorstehend beschriebene Weise aus Knochenmark isoliert und in Kultur expandiert. Um die Fähigkeit von humanen MSCs zur Induktion entlang der Knochenmark-Stromazelllinie nachzuweisen, wurde die spezifische Cytokinexpression als Marker der Differenzierung gemessen. MSCs wurden unter Bedingungen gezüchtet, die die MSC-Proliferation ohne Differenzierung begünstigen, wobei ein Medium verwendet wurde, das aus DMEM-LG mit einem Gehalt an ausgewähltem 10%igem fötalem Kälberserum (Komplettmedium) verwendet wurde, oder sie wurden unter Bedingungen gezüchtet, die die Expression und Differenzierung zum Knochenmark-Stromaphänotyp begünstigen, wobei ein Medium verwendet wurde, das Komplettmedium plus 10 U/ml Interleukin-1α (IL-1α) (stromagene Ergänzung (SS)) enthielt. Konditionierte Kulturmedien dieser Gewebekulturpopulationen wurden auf die Anwesenheit von Cytokinen analysiert, wobei man handelsübliche Sandwich-ELISA-Biotests heranzog (R&D Systems).
Bei den analysierten Cytokinen handelte es sich um solche, von denen bekannt war, dass sie durch Stromazellen sezerniert werden und die Hämatopoese beeinflussen. Hierzu gehören Interleukin-3 (IL-3), Interleukin-6 (IL-6), Granulozyten-Kolonienstimulationsfaktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonienstimulationsfaktor (GM-CSF), Stammzellfaktor (SCF), Leukämie-Inhibitorfaktor (LIF) und transformierender Wachstumsfaktor-β-2 (TGF-β2). In jedem Fall wurden MSCs der zweiten Passage auf 35 mm-Kulturplatten in einer Dichte entsprechend einer Konfluenz von etwa 30 % ausgestrichen (30 000 Zellen pro 35 mm-Platte). Nach Anhaften der Zellen über Nacht wurden die Kulturmedien entfernt und entweder durch Komplettmedium oder durch Komplettmedium plus stromagene Ergänzung ersetzt. 6 zeigt die Cytokin-Expression von humanen MSCs unter den beiden Ausstreichbedingungen. In Abwesenheit von IL-1α exprimierten MSCs die Bestandteile G-CSF, GM-CSF, LIF und SCF in sehr geringen Konzentrationen, exprimierten jedoch IL-6 in hohen Mengen. Im Vergleich dazu wurden nach 3-tägiger Stimulation mit IL-1-α erheblich höhere Konzentrationen an Cytokinen für sämtliche vorgenannten Spezies nachgewiesen. MSCs exprimierten unter den beiden Züchtungsbedingungen weder IL-3 noch TGF-β2. Diese Daten zeigen, dass IL-1-α die MSC-Expression eines Cytokinprofils verstärkt, von dem belegt worden ist, dass es die Differenzierung der hämatopoetischen Stammzelle unterstützt, und das für differenzierte Knochenmark-Stromazellen charakteristisch ist.
Referenzbeispiel 5
Induzierte myogene in vitro-Differenzierung von MSCs
Der Zweck der in diesem Beispiel beschriebenen Studie bestand darin, den Nachweis zu führen, dass 5-Azacytidin mesenchymale Stammzellen (MSCs) zur Differenzierung entlang der myogenen Linie induziert.
Die Verbindung 5-Azacytidin (5-Aza-CR; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), ein Cytidin-Analoges, verursacht eine Hypomethylierung von einigen Cytosinresten in DNA, die möglicherweise an der Aktivierung von phänotypspezifischen Genen beteiligt ist. Von den embryonalen Mäusezelllinien C3H/1OT1/2 C18 und Swiss 3T3 wurde gezeigt, dass sie nach Einwirkung von 5-Aza-CR in drei verschiedene mesodermale Zelllinien umgewandelt werden, nämlich Myoblasten, Adipozyten und Chondrozyten (33-34). Teilweise hat es den Anschein, dass der Mechanismus, gemäß dem 5-Aza-CR myogene Gene aktiviert, unter Beteiligung von MyoD1 abläuft (35-36). Unter Berücksichtigung dieses Sachverhalts ließen wir 5-Aza-CR auf von Ratten-Knochenmark abgeleitete MSCs einwirken und konzentrierten unsere Analyse auf die Umwandlung in myogene Phänotypen.
Oberschenkelknochen und Schienbeinknochen von männlichen Fisher-Ratten (Charles River, Indianapolis, IN) mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 100 g wurden gewonnen und von anhaftenden Weichgeweben befreit. Mehrere Isolate von Knochenmarkzellen stammten von Ratten mit einem Gewicht von 250 g. Eine sorgfältige Sektion der langen Knochen zur Entfernung von Weichgewebe wurde durchgeführt, um zu gewährleisten, dass myogene Vorläufer nicht in das Knochenmarkpräparat gelangten. Diesbezüglich wurden in unbehandelten MSC-Kulturen nie myogene Zellen beobachtet. Beide Knochenenden wurden mit Knochenscheren von den Diaphysen abgeschnitten. Die Knochenmarkpfropfen wurden hydrostatisch durch Einführen von Nadeln mit 18 gauge, die an 10 ml-Spritzen, die mit Komplettmedium gefüllt waren, befestigt waren, ausgetrieben. Das Komplettmedium bestand aus DMEM mit einem Gehalt an ausgewählten Chargen von 10 % fötalem Kälberserum (FCS; IR Scientific Inc., Woodland, CA), 5 Pferdeserum (HS; Hazleton Biologics Inc., Lenexa, KS) und Antibiotika (Gibco Laboratories; Penicillin G, 100 U/ml; Streptomycin, 100 μg/ml; Amphotericin B, 0,25 μg/ml). Die Nadeln wurden in die distalen Enden der Oberschenkelknochen und die proximalen Enden der Schienbeinknochen eingeführt und die Knochenmarkpfropfen wurden am gegenüberliegenden Ende ausgestoßen. Die Knochenmarkpfropfen wurden durch sequenzielle Passage durch Nadeln mit 18 gauge, 20 gauge und 22 gauge disaggregiert. Diese dispergierten Zellen wurden 2-mal zentrifugiert und in Komplettmedium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen in einem Hämozytometer gezählt. 5 × 10⁷ Zellen in 7–10 ml Komplettmedium wurden in 100 mm Petri-Schalen gegeben. 3 Tage später wurde das Medium ausgetauscht und nicht-haftende Zellen wurden verworfen. Das Medium wurde jeweils nach 3 Tagen vollständig ausgetauscht. Etwa 10 Tage nach dem Überimpfen hatten die Schalen einen nahezu konfluenten Zustand erreicht und die anhaftenden Zellen wurden von den Schalen mit 0,25 % Trypsin in 1 mM Natrium-EDTA (Gibco Laboratories, Grand Island, NY) abgelöst, 1:3 aufgeteilt und auf frische Platten überimpft. Nachdem diese der einmaligen Passage unterworfenen Zellen einen nahezu konfluenten Zustand erreicht hatten, wurden sie geerntet und für die nachstehend beschriebenen Experimente verwendet. Man bezeichnet diese Zellen als von Ratten-Knochenmark abgeleitete MSCs. Insgesamt wurden 8 separate, von Ratten-Knochenmark abgeleitete MSC-Präparate in dieser Studie verwendet. Die Zellen wurden routinemäßig in Komplettmedium bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ gezüchtet.
Die zweifach passagierten MSCs wurden auf 35 mm-Schalen in den drei Zelldichten 500, 5 000 und 50 000 Zellen/Schale überimpft. 24 Stunden nach der Überimpfung wurden diese Kulturen 24 Stunden mit myogenem Medium, das aus Komplettmedium mit einem Gehalt an verschiedenen Konzentrationen an 5-Aza-CR bestand, behandelt. Anschließend wurden die Kulturen 2-mal mit ausgewogener Tyrode-Salzlösung (Sigma Chemical Co.) gewaschen. Sodann wurde das Medium gegen Komplettmedium ohne Zusatz an 5-Aza-CR ausgetauscht und sodann 2-mal wöchentlich bis zur Beendigung des Experiments (40 Tage nach der Behandlung) ausgetauscht. Wie bei den Ergebnissen ausführlich beschrieben, wurden verschiedene Züchtungsbedingungen getestet, um die Einflüsse von 5-Aza-CR zu optimieren und um insbesondere die Myogenese zu optimieren.
Zweifach passagierte Ratten-Knochenmark-MSCs wurden auf 35 mm-Schalen mit 5 000 Zellen/Schale überimpft und mit vier Konzentrationen (0,1 μM, 0,3 μM, 1 μM und 10 μM) 5-Aza-2'-desoxycytidin (5-Aza-dCR; Sigma Chemical Co.) auf die gleiche Weise, wie es vorstehend für 5-Aza-CR beschrieben wurde, behandelt. Zu verschiedenen Zeitpunkten während der Behandlung wurde die Morphologie der Kulturen beobachtet.
Die lebenden Kulturen wurden täglich mit einem Phasenkontrastmikroskop (Olympus Optical Co., Ltd., Tokyo, Japan) geprüft und schließlich wurden einige der Kulturen für die histologische oder immunohistochemische Untersuchung fixiert. Muskelzellen wurden zuerst morphologisch im Phasenkontrastzustand durch die Anwesenheit von multinukleierten Myotuben und anschließend immunohistochemisch durch die Anwesenheit des für den Skelettmuskel spezifischen Proteins Myosin identifiziert. Eine Kontraktion der mutmaßlichen Muskelzellen wurde durch Zugabe von 1 Tropfen 1 mM Acetylcholin (Sigma Chemical Co.) in Tyrode-Medium stimuliert. Für die immunohistochemische Untersuchung wurden gezüchtete Zellen mit Methanol von –20 °C (Fisher Scientific Co., Fair Lawn, NJ) 10 Minuten fixiert und mit einem monoklonalen Mäuse-Antikörper gegen "fast twitch"-Rattenskelett-Myosin (Sigma Chemical Co.; Ascites-Flüssigkeit, 1/400 Verdünnung) in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an 0,1 % BSA (Rinderserumalbumin; Sigma Chemical Co.) inkubiert. Beim zweiten Antikörper handelte es sich um mit Biotin konjugiertem Schaf-anti-Maus-IgG (Organon Teknika Corp., West Chester, PA; 1/50 Verdünnung). Daran schloss sich eine Behandlung mit mit Texasrot konjugiertem Avidin (Organon Teknika Corp.; 1/4 000 Verdünnung) an. Sämtliche Inkubationen wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei jeweils eine 5-minütige Blockierbehandlung mit PBS mit einem Gehalt an 1 % BSA vorausging und zwei anschließende 5-minütige Waschvorgänge in PBS durchgeführt wurden. Die Zellen wurden in Fluoromount-G (Fisher Biotech, Pittsburgh, PA) montiert und mit einem Olympus-Mikroskop (BH-2), das für Fluoreszenzzwecke ausgerüstet war, betrachtet und mit Kodak TMAX 400-Film photographiert.
Ratten-Knochenmark-MSCs der zweiten Passage wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen in der Grenzverdünnung von 1 Zelle/Vertiefung ausgestrichen. Die Zellen wurden in Medium, das aus 50 % Komplettmedium und 50 % konditioniertem Medium, das aus Ratten-Knochenmarkzellen im nahezu konfluenten Zustand nach 2-tägigem Züchten in Komplettmedium erhalten worden war, bestand, ausgestrichen. Aus insgesamt 384 Vertiefungen wurden 50 Kolonien nachgewiesen. Diese wurden einer Subkultur unterzogen und aufrechterhalten. Schließlich überlebten 4 Kolonien. Diese 4 Klone wurden mit 5-Aza-CR auf die vorstehend erwähnte Weise behandelt und einer Bewertung ihrer myogenen oder adipozytischen Morphologien unterzogen.
Ratten-Knochenmarkzellen der ersten Passage wurden 24 Stunden mit 10 μM 5-Aza-CR behandelt und auf die vorstehend angegebene Weise auf Platten mit 96 Vertiefungen in einer Grenzverdünnung von 1 Zelle/Vertiefung ausgestrichen. Die Anzahl an Klonen, die eine Adipozyten-Morphologie (Sudanschwarz-positiv) oder eine myogene, multinukleierte Zellmorphologie aufwiesen, wurde bestimmt.
Zum Vergleich der Umwandlungskapazität von Knochenmark-MSCs in verschiedene mesodermale Phänotypen mit der Kapazität von reinen Fibroblasten behandelten wir Rattenhirn-Fibroblasten entweder mit 5-Aza-CR oder 5-Aza-CdR. Vollständige Großhirne von 3 männlichen Fisher-Ratten wurden aus dem Innenraum der Hirnschale gewonnen und mit einem scharfen Skalpell in kleine Stücke geschnitten. Diese Stücke wurden in ein 50 ml fassendes, konisches Zentrifugenröhrchen übertragen und 10 Minuten mit 500xg zentrifugiert, in 10 ml ausgewogene Tyrode-Salzlösung resuspendiert und mit einem locker sitzenden Dounce-Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 0,1 % Collagenase (CLS2, 247 U/mg; Worthington Biochemical Co., Freehold, NJ) 3 Stunden bei 37 °C inkubiert, wobei während dieser Zeitspanne alle 30 Minuten ein Aufwirbelvorgang für 30 Sekunden durchgeführt wurde. Nach der Behandlung wurden die freigesetzten Zellen durch ein 110 μm-Nitex-Filter gegeben, zentrifugiert, in 10 ml DMEM-LG mit geringem Glucosegehalt (Gibco Laboratories) mit einem Gehalt an 10 % FCS resuspendiert und bei 37 °C in drei 100 mm-Kulturschalen in einem CO₂-Inkubator gezüchtet. Das Medium wurde wöchentlich 2-mal ausgetauscht und die Zellen wurden gezüchtet, bis die Schalen den konfluenten Zustand erreicht hatten.
Rattenhirn-Fibroblasten der dritten Passage wurden auf 35 mm-Schalen in einer Dichte von 50 000 Zellen/Schale überimpft und mit 1 μM, 3 μM oder 10 μM 5-Aza-CR oder 0,1 μM, 0,3 μM oder 1 μM 5-Aza-CdR auf die gleiche Weise wie Ratten-Knochenmark-MSCs behandelt. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen DMEM-LG mit einem Gehalt an 10 % FCS, 5 % HS und 50 nM Hydrocortison ohne Zugabe von 5-Aza-CR oder 5-Aza-CdR ausgetauscht und anschließend 2-mal wöchentlich bis zur Beendigung des Experiments ausgetauscht.
Myogene Zellen, die von Ratten-Knochemark-MSCs abgeleitet waren, wurden mit normalen fötalen myogenen Rattenzellen verglichen, da für diese eine Datenbank mit erheblichem Umfang verfügbar ist. Muskelzellen aus Muskeln der hinteren Gliedmaßen von Föten von Fisher-Ratten mit einem Alter von 17 Tagen wurden mit 0,2 % Trypsin (Sigma Chemical Co.) in Tyrode-Medium, das frei von Calcium und Magnesium war, 35 Minuten bei 37 °C unter gelegentlichem Bewegen dissoziiert. Nach Passage durch einen 110 μm Nitex-Filter wurde die Konzentration an Fibroblasten durch 30-minütiges Inkubieren von Zellsuspensionen in Falcon-Kunststoffschalen verringert, was zu einer bevorzugten Haftung der Fibroblasten führte. Eine Suspension von 5 × 10⁵ Einzelzellen, die nicht an der unbeschichteten Schale hafteten, wurde in einer mit Kollagen beschichteten (1,5 ml 0,14 % Gelatine, J. T. Baker Chemical Co., Phillipsberg, NJ) 35 mm-Kunststoffkulturschale mit einem Gehalt an 2 ml 79 % DMEM, 10 % FCS, 10 % HS und 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren (Gibco Laboratories) ausgestrichen. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ gezüchtet.
Kulturen von von Ratten-Knochenmark abgeleiteten MSCs (5 000 Zellen/35 mm-Schale) wurden 24 Stunden nach dem Überimpfen der Zellen auf Kulturschalen verschiedenen Konzentrationen (0, 1, 3, 10, 20 und 50 μM) an 5-aza-CR ausgesetzt. Das Medium mit einem Gehalt an 5-aza-CR wurde nach der 24-stündigen Behandlungsdauer entfernt und durch Medium ohne 5-Aza-CR ersetzt. 7 Tage nach dieser Behandlung wurden in einigen der Schalen, die mit mehr als 3 μm 5-Aza-CR behandelt worden waren, lange, multinukleierte Zellen beobachtet (7A); die Zellen in diesen Kulturen wiesen eine Konfluenz von etwa 80 % auf. Die Anzahl derartiger multinukleierter Zellen nahm in Form von isolierten Kolonien oder Gruppierungen zu und erreichte ein Maximum (9 Kolonien in 10 35 mm-Schalen) 2 Wochen nach der anfänglichen Behandlung. Die Anzahl an derartigen Zellen nahm 5 Wochen nach der Behandlung ab (6 Kolonien in 10 35 mm-Schalen). 7 verschwanden vermutlich aufgrund ihrer Kontraktion und Ablösung von den Schalen und 4 neue Kolonien traten während dieser Zeitspanne auf. Ein wesentlicher Anteil der multinukleierten Zellen blieb bis zu 40 Tage nach der anfänglichen Behandlung, was die längste Beobachtungsperiode darstellte, erhalten. Die Morphologie der multinukleierten Zellen bei Betrachtung von lebenden Kulturen mit dem Phasenkontrastmikroskop (7A) war ähnlich wie die von Rattenmuskeln in Kultur. Wir beobachteten keine erkennbaren Streifenbildungen, wie sie routinemäßig bei embryonalen, myogenen Hühnerzellen in Kultur beobachtet werden, obgleich Myotuben, die von aus normalen fötalen Rattengliedmaßen erhaltenen myogenen Zellen abgeleitet waren, ebenfalls keine Streifenbildungen zeigten (7B). Somit weisen weder die von MSCs noch die von normalen Rattenembryos abgeleiteten Myotuben unter den in diesen Studien angewandten Bedingungen Streifenbildungen auf. Wellen von spontanen Kontraktionen oder Zuckungen von einigen dieser multinukleierten Zellen wurden bei Betrachtung der lebenden Kulturen beobachtet. Die Kontraktion dieser Zellen konnte auch stimuliert werden, indem man einen Tropfen einer Lösung von Acetylcholin auf diese Zellen brachte, was einen weiteren Hinweis dafür darstellt, dass diese Zellen myogen sind.
Um die Identität dieser multinukleierten Zellen zusätzlich zu bestätigen, wurde ein Antikörper gegen für Skelettmuskeln spezifisches Myosin einem fixierten Präparat dieser Kulturen präsentiert. 8 zeigt eine mit dem anti-Myosin-Antikörper positiv gefärbte Myotube; erneut konnten keine Kreuzstreifenbildungen festgestellt werden. Wir färbten auch Myotuben 2 und 5 Wochen nach 5-Aza-CR-Behandlung mit anti-Myosin-Antikörper. Myotuben ergaben 2 Wochen nach Behandlung eine stark positive Färbung (9A und 9B), obgleich Myotuben 5 Wochen nach der Behandlung nur eine schwache Färbung ergaben (9C und 9D).
Der Einfluss von 5-Aza-CR schien von der Konzentration, die den MSCs präsentiert worden war, abhängig zu sein. Keine Myotuben wurden in Schalen, die mit 0 oder 1 μm 5-Aza-CR behandelt worden waren, festgestellt, jedoch wurden in Schalen, die mit 3–50 μM 5-Aza-CR behandelt worden waren, Myotuben mit vergleichbarer Häufigkeit beobachtet (Tabelle 2).
Tabelle 2 Anzahl von Gruppierungen von Myotuben oder Adipozyten, die pro Kultur für mit verschiedenen Konzentrationen an 5-Aza-CR behandelten MSCs festgestellt wurden
Sekundäre Kulturen von Ratten-Knochenmarkzellen wurden mit 5 000 Zellen pro 35 mm-Schale ausgestrichen, mit der angegebenen Konzentration an 5-Aza-CR behandelt und 14 Tage nach der Behandlung beobachtet. Die Zahlenwerte für das Auftreten von Myotuben und Adipozyten geben die Gesamtzahl von phänotypisch unterscheidbaren Gruppierungen, die beobachtet wurden, und die Gesamtzahl der geprüften Kulturschalen wieder.
Zur Messung des Überlebensindex (SI*) in Anwesenheit von 5-Aza-CR wurden MSCs mit 200 Zellen/35 mm-Schale überimpft und 24 Stunden nach dem Ausstreichen mit 5-Aza-CR behandelt. Nach 14 Tagen wurden Kolonien mit einem Gehalt an mehr als 10 Zellen gezählt. Dieser Zahlenwert wurde mit 100 % multipliziert und durch 200 dividiert, um den Prozentwert zu erhalten.
Wenn Zellen mit höheren Konzentrationen an 5-Aza-CR behandelt wurden, nahm die Anzahl von Zellen auf der Platte ab, wobei 10 μM offensichtlich die wirksamste Konzentration im Hinblick auf die maximale Anzahl an myogenen Zellen und die Zellüberlebensrate war (Austreichwirkungsgrad von Tabelle 2). Somit wurden alle anschließenden Experimente mit 10 μM 5-Aza-CR durchgeführt.
Um den Einfluss von 5-Aza-2'-desoxycytidin (5-Aza-dCR), einem Desoxyanalogen von 5-Aza-CR, zu prüfen, wurden Ratten-Knochenmark-MSCs mit 0,3 μM, 1 μM und 10 μM 5-Aza-dCR auf die gleiche Weise wie mit 5-Aza-CR behandelt. Von den getesteten Konzentrationen ergab 0,3 μM 5-Aza-CdR das höchste Auftreten einer myogenen Umwandlung und das beobachtete Auftreten war wesentlich höher als für mit 10 μM 5-Aza-CR behandelte Zellen (Tabelle 3). Tabelle 3 Anzahl von Gruppierungen von Myotuben, die pro Kultur gefunden wurden, für MSCs, die mit verschiedenen Konzentrationen an 5-Aza-CdR und 5-Aza-CR behandelt wurden

*Überlebensindex

Sekundäre Kulturen von Ratten-Knochenmarkzellen wurden mit 5 000 Zellen pro 35 mm-Schale ausgestrichen, mit der angegebenen Konzentration an 5-Aza-dCR oder 5-Aza-CR behandelt und 14 Tage nach der Behandlung beobachtet. Die Zahlenwerte für das Auftreten von Myotuben geben die Gesamtzahl an phänotypisch unterscheidbaren Gruppierungen, die beobachtet wurden, und die Gesamtzahl der geprüften Kulturschalen wieder.
Zur Messung des Überlebensindex in Gegenwart von 5-Aza-CdR oder 5-Aza-CR wurden MSCs mit 200 Zellen/35 mm-Schale überimpft und 24 Stunden nach dem Ausstreichen mit 5-Aza-dCR oder 5-Aza-CR behandelt. Nach 14 Tagen wurden Kolonien mit einem Gehalt an mehr als 10 Zellen gezählt. Dieser Zahlenwert wurde mit 100 % multipliziert und mit 200 dividiert, um den prozentualen Anteil zu bilden.
Um die Möglichkeit einer Kontamination durch umgebende, von Muskeln abgeleitete Myoblasten zum Zeitpunkt der Ernte des Knochenmarks auszuschließen, wurden Ratten-Knochenmark-MSCs der zweiten Passage auf die hier beschriebene Weise kloniert. 4 Klone mit ununterscheidbaren Morphologien wurden bei diesem Verfahren erhalten und wurden 24 Stunden mit 5-Aza-CR behandelt. Es ist zu betonen, dass keine Zellen in diesen Klonen muskelartige Eigenschaften oder eine positive Immunofärbung auf muskelspezifisches Myosin vor Behandlung mit 5-Aza-CR zeigten. Von 4 mit 5-Aza-CR behandelten Klonen zeigte einer die unterscheidungskräftige Morphologie von Myotuben und Adipozyten, was wir als Hinweis interpretieren, dass Nichtmuskelzellen in Myoblasten oder Adipozyten umgewandelt worden waren oder in entsprechender Weise beeinflusst worden waren.
Von Ratten-Knochenmark abgeleitete MSCs der ersten Passage wurden 24 Stunden mit 10 μM 5-Aza-CR behandelt und kloniert. Aus insgesamt 768 Vertiefungen wurden 136 Kolonien nachgewiesen. Von diesen 136 Kolonien wiesen 7 (5 %) einen myogenen Phänotyp auf, 27 (20 %) einen adipozytischen Phänotyp und die übrigen Kolonien zeigten keine Morphologie mit einem offensichtlichen Zusammenhang mit unterscheidbaren Phänotypen.
Um den Einfluss von 5-Aza-CR und 5-Aza-dCR auf Nicht-MSC-Präparate zu testen, behandelten wir Hirnfibroblasten mit diesen gleichen Reagenzien. Rattenhirn-Fibroblasten wurden auf 35-mm-Schalen in einer Dichte von 50 000 Zellen/Schale überimpft und mit 1 μM, 3 μM oder 10 μM 5-Aza-CR oder 0,1 μM, 0,3 μM oder 1 μM 5-Aza-dCR auf die gleiche Weise wie bei Ratten-MSCs behandelt. Jede Gruppe wies 9 Schalen auf und Zellen wurden 14 Tage nach der Behandlung überwacht. Am 7. Tag erreichten sämtliche Schalen den konfluenten Zustand, ausgenommen die mit 10 μM 5-Aza-CR behandelte Gruppe. In keiner der Schalen konnten während der Beobachtungsdauer Fettzellen oder Myotuben festgestellt werden.
MSCs wurden aus dem Knochenmark von jungen (4 Wochen alt, 100 g) und erwachsenen (3 Monate alt, 250 g) Spenderratten gewonnen und passagiert.
Die Anzahl an Kolonien mit myogenem Phänotyp nach Behandlung mit 5-Aza-CR wurde verglichen (Tabelle 4).
Tabelle 4 Anzahl an Gruppierungen von Myotuben pro Kultur von mit 5-Aza-CR behandelten MSCs
Sekundäre Kulturen von Ratten-Knochenmark-MSCs wurden mit 5 000 Zellen pro 35 mm-Schale ausgestrichen und mit μM 5-Aza-CR behandelt. 24 Stunden später wurde ein Austausch gegen DMEM mit verschiedenen Konzentrationen an FCS, HS oder 50 μM HC vorgenommen. Die Beobachtungszeit wurde 14 Tage nach Behandlung mit 5-Aza-CR beendet. Die Zahlenwerte für das Auftreten von Myotuben geben die Gesamtzahl der geprüften Kulturschalen wieder.
MSCs von jungen Spenderratten wiesen mehr myogene Kolonien als die von erwachsenen Ratten auf. Kulturen der zweiten Passage von jungen Spender-MSCs, die mit 5-Aza-CR behandelt worden waren, erzeugten mehr myogene Kolonien als MSCs von älteren Spendern, die in Kulturen von der ersten bis zur vierten Passage getestet worden waren.
Eine Vielzahl von Kulturbedingungen wurde getestet, um die Expression des myogenen Phänotyps von gezüchteten, mit 5-Aza-CR behandelten MSCs zu optimieren. Behandelte Zellen wurden in Medium mit einem Gehalt an verschiedenen Konzentrationen an FCS, HS, basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und Hydrocortison gezüchtet. Tabelle 4 zeigt, dass Medium mit einem Gehalt an 10 % FCS, 5 % HS und Hydrocortison offensichtlich das optimale Medium für die MSC-Expression von myogenen Eigenschaften war. Medium mit einem Gehalt an bFGF schien die Expression des myogenen Phänotyps zu verstärken (Tabelle 5), obgleich dies mit einer Zunahme der Anzahl an Myoblasten aufgrund einer Myoblastenteilung und nicht auf eine erhöhte Umwandlung von Progenitorzellen zurückzuführen sein kann.
Tabelle 5 Vergleich von 5-Aza-CR-induzierten Myotuben durch Knochenmark-MSCs von jungen und alten Ratten (bei einzelnen Passagen)
Zellen wurden in DMEM mit 10 % FCS, 5 % HS und 50 μM HC mit oder ohne bFGF gezüchtet. Die Zahlenwerte für das Auftreten von Myotuben geben die Gesamtzahl an phänotypisch unterscheidbaren, beobachteten Kolonien oder Gruppierungen und die Gesamtzahl der geprüften Kulturschalen wieder. MSCs wurden von jungen (100 g) oder alten (250 g) Ratten gewonnen.
Zusätzlich wurden von Knochenmark abgeleitete MSCs mit 500 Zellen/Schale, 5 000 Zellen/Schale und 50 000 Zellen/Schale ausgestrichen und sodann mit 5-Aza-CR behandelt. Bei 500 Zellen/Schale wurden erstmals nach 20 Behandlungstagen myogene Zellen beobachtet, wobei die Zellen 25 Tage nach der Behandlung den konfluenten Zustand erreichten. 2 Cluster von myogenen Zellen wurden 29 Tage nach der Behandlung in 5 Schalen beobachtet. Bei 5 000 Zellen/Schale wurden erstmals nach 7 Tagen myogene Zellen beobachtet, wobei die Zellen 10 Tage nach der Behandlung den konfluenten Zustand erreichten. 14 Tage nach der Behandlung wurde 3 Cluster in 4 Schalen beobachtet. Bei 50 000 Zellen/Schale wurden nach 6 Tagen myogene Zellen beobachtet, wobei die Zellen nach 7 Behandlungstagen den konfluenten Zustand erreichten. 14 Tage nach der Behandlung wurden 10 Cluster in 5 Schalen beobachtet.
Die hier vorgelegten Beobachtungen zeigen, dass Ratten-Knochenmark-MSCs die Fähigkeit zur in vitro-Differenzierung zur myogenen Linie im Anschluss an eine kurze Belastung mit 5-Aza-CR besitzen. Die festgestellten myogenen Zellen wiesen die charakteristische multinukleierte Morphologie von Myotuben auf, kontrahierten spontan, kontrahierten bei Einwirkung von Acetylcholin und ergaben eine positive Färbung mit einem monoklonalen Antikörper gegen für Skelettmuskel spezifisches Myosin, obgleich diese Myotuben nie offensichtliche Streifenbildungen zeigten. Jedoch bildeten bei uns normale Rattenmyoblasten, die aus fötalem Rattenmuskel gewonnen worden waren, keine offensichtlich gestreiften Myotuben in Kultur. Wir versuchten die Möglichkeit einer Kontamination durch festgelegte myogene Zellen auszuschließen, indem wir zum Zeitpunkt der Ernte des Knochenmarks sorgfältig Weichgewebe von den Knochen entfernten. Von Bedeutung ist, dass wir bei Hunderten von Präparaten in keiner Kultur von Ratten-Knochenmark-MSCs Myotuben beobachteten, ausgenommen die, die mit ausreichenden Konzentrationen an 5-Aza-CR behandelt worden waren. Ferner wurde ein Klon von Ratten-Knochenmark-MSCs nach Behandlung mit 5-Aza-CR sowohl zu myogenen als auch zu adipozytischen Phänotypen umgewandelt, was wir so interpretieren, dass Nichtmuskel-Vorläuferzellen in diese beiden Phänotypen umgewandelt wurden. Da im Knochenmark kein Skelettmuskel festgestellt wurde, nehmen wir an, dass 5-Aza-CR diese vom Knochenmark abgeleiteten MSCs in die myogenen Zellen umwandelt.
Referenzbeispiel 6
In vitro-Cytokin-Expression durch von humanem Knochenmark abgeleitete mesenchymale Stammzellen: Einflüsse von IL-1α und Dexamethason
Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, die phänotypischen Eigenschaften von gezüchteten MSCs zusätzlich durch Identifikation eines Cytokin-Expressionprofils festzustellen. Wir bedienten uns handelsüblicher ELISA-Tests, um den Grad der Expression von Cytokinen (die bekanntlich für die Regulierung der Zellteilung, Differenzierung oder Expression einer Vielzahl von mesenchymalen Phänotypen von Bedeutung sind) zu identifizieren und zu messen. Wir identifizierten die MSC-Cytokin-Expression unter Züchtungsbedingungen, von denen wir früher berichtet hatten, dass sie die mitotische Expansion von MSCs ohne Differenzierung ermöglichen (konstitutives Kulturexpansionsmedium). Ferner testeten wir die Cytokin-Expression durch MSCs in Kulturmedium, das mit Dexamethason oder IL-1α ergänzt war. Von Dexamethason wurde berichtet, dass es die Differenzierung von Osteovorläufern zu Osteoblasten infiziert. Im Gegensatz dazu wurde von IL-1α, das durch eine Vielzahl von Zellen während der entzündlichen Reaktion in die Knochenmarkumgebung sezerniert wird, berichtet, dass es die Fähigkeit des Knochenmarkstromas zur Unterstützung der Hämatopoese verstärkt und somit eine Rolle bei der Steuerung der Differenzierung und/oder der Expression von stromalen Knochenmark-Fibroblasten spielen kann.
Die Daten dieser Analysen zeigen, dass gezüchtete MSCs ein einzigartiges Cytokin-Profil exprimieren. Ferner verändern Dexamethason und IL-1α das MSC-Cytokin-Expressionsprofil auf verschiedenen Wegen. Diese Daten ergänzen unsere Erkenntnisse über das besondere phänotypische Profil von MSCs und identifizieren ferner Makromoleküle, deren Expression entwicklungsmäßig reguliert wird, da MSCs ihren Phänotyp in Richtung zur osteogenen Linie oder zum Knochenmarkstroma-Phänotyp differenzieren oder modulieren.
Materialien und Methoden
Isolierung und Expansion in Kultur von MSC
Knochenmark wurde von sechs humanen Spendern unterschiedlichen Alters (3 männlich und 3 weiblich) gewonnen (Tabelle 6). Tabelle 6 Spendereigenschaften

*NHL = nicht-Hodgkin-Lymphom; AML = akute myelogene Leukämie

Die einzelnen Spender befanden sich im Krebs-Remissionsstadium und wurden einem Eingriff zur Gewinnung von Knochenmark für eine zukünftige autologe Knochenmarktransplantation unterzogen. Jeweils etwa 10 ml des gewonnenen unfraktionierten Knochenmarks wurden beim Test dieser Studie eingesetzt. MSCs wurden gereinigt und unter Modifikation von aus der Literatur bekannten Verfahren gezüchtet. Kurz zusammengefasst, Knochenmarkaspirate wurden aus den Spritzen in 50 ml fassende konische Röhrchen mit einem Gehalt an 25 ml Komplettmedium, das aus gemäß Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium unter Ergänzung mit fötalem Kälberserum (FBS) ausgewählter Chargen bestand, bis zu einem Endvolumen von 10 % übertragen. Die Röhrchen wurden mit 1 200 U/min in einer Beckman-Tischzentrifuge mit einem GS-6-Schwingbecherrotor 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu pelletisieren. Die oben auf den Proben gebildete Fettschicht und der Überstand wurden unter Verwendung einer Pipette für serologische Zwecke abgesaugt und verworfen. Die Zellpellets wurden mit Komplettmedium in einem Volumen von 5 ml resuspendiert und sodann oben auf vorher ausgebildete Gradienten von 70 % Percoll aufgesetzt. Sodann wurden die Proben in einen Sorvall GS-34-Rotor mit fixiertem Winkel gegeben und 15 Minuten mit 460 × g in einer Sorvall-Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert. Die Fraktion geringer Dichte mit einem Volumen von etwa 15 ml (Pooldichte = 1,03 g/ml) wurde von jedem Gradienten gewonnen und in 50 ml fassende konische Röhrchen, die mit 30 ml Komplettmedium versetzt wurden, übertragen. Die Röhrchen wurden zur Pelletisierung der Zellen mit 1 200 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und die Zellen wurden in 20 ml Komplettmedium resuspendiert und nach Lysis der roten Blutkörperchen mit 4 % Essigsäure mit einem Hämozytometer gezählt. Die Zellen wurden auf eine Konzentration von 5 × 10⁷ Zellen pro 7 ml eingestellt und auf 100 mm-Kulturplatten in einer Menge von 7 ml pro Platte überimpft.
Kultur und Passage von von Knochenmark abgeleiteten MSCs
Von Knochenmark abgeleitete MSCs wurden in Komplettmedium bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit einem Gehalt an 95 % Luft und 5 % CO₂ gezüchtet, wobei das Medium alle 3–4 Tage ausgetauscht wurde. Nachdem die primären Kulturschalen einen nahezu konfluenten Zustand erreicht hatten, wurden die Zellen mit 0,25 % Trypsin mit einem Gehalt an 1 mM. EDTA (GIBCO) 5 Minuten bei 37 °C abgelöst. Die enzymatische Aktivität von Trypsin wurde durch Zugabe von 1/2 Volumenteilen FBS gestoppt. Die Zellen wurden gezählt, im Verhältnis 1:3 aufgeteilt und in einer Menge von 7 ml wieder auf Komplettmedium ausgestrichen. Diese Zellen der ersten Passage überließ man 4–6 Tage einer Zellteilung, bis sie einen nahezu konfluenten Zustand erreicht hatten. Die Zellen der ersten Passage im nahezu konfluenten Zustand wurden trypsiniert und gemäß den nachstehenden Angaben für die Testformate ausgestrichen.
Quantitativer ELISA-Test
Der Grad der Cytokin-Expression durch MSCs wurde unter Anwendung eines quantitativen ELISA-Tests gemessen. ELISA-Kits (R&D Systems, Minneapolis, MN) mit Antikörperspezifitäten für die folgenden Cytokine wurden bezogen: Interleukin-3 (IL-3), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin-11 (IL-11), Granulozyten-Kolonienstimulationsfaktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonienstimulationsfaktor (GM-CSF), Makrophagen-Kolonienstimulationsfaktor (M-CSF), Stammzellfaktor (SCF), Leukämie-Inhibitorfaktor (LIF) und transformierender Wachstumsfaktor-β-2 (TGF-β-2). Nahezu konfluente MSCs der ersten Passage wurden auf 35 mm-Platten mit 50 000 Zellen pro Platte ausgestrichen und über Nacht zur Haftung gebracht. Sodann wurden die Kulturbedingungen auf eine der drei folgenden Testbedingungen umgestellt: frisches Komplettmedium; Komplettmedium mit osteogener Ergänzung; und Komplettmedium mit stromagener Ergänzung. Man inkubierte die Kulturen 24 oder 48 Stunden in den Testmedien, wonach die Überstände gewonnen, rasch in Trockeneis/Ethanol eingefroren und bei –70 °C in einem Revco-Gefrierschrank aufbewahrt, bis sämtliche Proben gemeinsam für die Analyse vorbereitet wurden. Die Tests wurden durchgeführt, indem 100 μl des Kulturüberstands auf die Vertiefungen der ELISA-Platte aufgetragen wurden, wonach die Platten nach den Anweisungen des Herstellers bearbeitet wurden. Eichkurven wurden unter Verwendung von Cytokin-Standards, die den Kits beilagen und auf die entsprechenden Konzentrationen verdünnt worden waren, aufgestellt. In einigen Fällen (insbesondere beim IL-6-Test) mussten die Überstände erheblich verdünnt werden, um ausreichend niedrige Absorptionsmessungen zu erzielen, deren genaue quantitative Bestimmung aus den Eichkurven möglich war.
Quantitative Bestimmung der Zellzahlen Ergebnisse
Konstitutiver Kultur-Expansionsmedium-Zustand
Nach 24-stündiger Einwirkung von konstitutiven Kultur-Expansionsbedingungen waren bei 6 der 9 getesteten Cytokine nachweisbare Konzentrationen vorhanden; vergl. die 12A–12D und 13A–13C und die nachstehenden Tabellen 7–10.
Tabelle 7 Nachgewiesene Cytokinkonzentrationen (24 Stunden)
Tabelle 8 Nachgewiesene Cytokinkonzentrationen (24 Stunden)
Tabelle 9 Nachgewiesene Cytokinkonzentrationen (48 Stunden)
Tabelle 10 Nachgewiesene Cytokinkonzentrationen (48 Stunden)
Folgende Cytokine wurden innerhalb von 24 oder 48 Stunden exprimiert (angegeben in pg/10 000 Zellen in der Reihenfolge vom niedrigsten zum höchsten Wert): G-CSF, SCF, LIF, M-CSF, IL-11 und IL-6. Drei Cytokine wurden in den Überständen unter konstitutiven Kultur-Expansionsbedingungen nicht nachgewiesen: GM-CSF, IL-3 und TGF-β2. Große Unterschiede wurden in der durchschnittlichen Cytokin-Expression der einzelnen Cytokine im Vergleich zu den durchschnittlichen Expressionsgraden anderer Cytokine festgestellt. Als Extremfall war der durchschnittliche nachweisbare Expressionsgrad von G-CSF (10 pg/10 000 Zellen/24 Stunden) 700-fach niedriger als der durchschnittliche Expressionsgrad von IL-6 (7421 pg/10 000 Zellen/24 Stunden).
Kulturbedingungen mit osteogener Ergänzung
Die Zugabe von osteogenen Ergänzungen zum Komplettmedium führte zu keinen nachweisbaren Veränderungen in Bezug auf G-CSF, M-CSF und SCF, verglichen mit der Kontrolle (12A–12D und 13A–13B; Tabellen 7–10). Im Gegensatz dazu bewirkte OS-Medium eine signifikante Herunterregelung der Expression von LIF (p < 0,01), IL-6 (p < 0,001) und IL-11 (p < 0,005), verglichen mit der Expression dieser Cytokine unter konstitutiven Kultur-Expansions-Mediumbedingungen nach 24 Stunden. Diese Konzentrationen blieben statistisch geringer als die Cytokin-Konzentrationen unter konstitutiven Kultur-Expansions-Mediumbedingungen nach 48 Stunden (12A–12D und 13A–13C; Tabellen 7–10). Der Betrag der durch das OS-Medium vermittelten Hemmung variierte für die drei Cytokine. Nach 24 Stunden ergaben sich die folgenden durchschnittlichen Werte der Cytokin-Expression im OS-Medium relativ zu konstitutiven Kultur-Expansions-Mediumbedingungen: LIF-Expression 55 % ± 54 %, IL-6 16 % ± 9 % und IL-11 1 % ± 3 %. Die hohe Standardabweichung bei der prozentualen Veränderung von LIF war vorwiegend auf die Messungen bei einem Spender (Spender #4) zurückzuführen, bei dem der Grad der LIF-Expression unter OS-Mediumbedingungen tatsächlich höher als unter konstitutiven Kultur-Expansionsbedingungen war (Tabelle 7). Für einen gegebenen Spender war die prozentuale Hemmung eines Cytokins relativ zum absoluten Mittelwert der Hemmung dieses Cytokins unabhängig von der prozentualen Hemmung der übrigen beiden Cytokine, relativ zu ihren absoluten Mittelwerten der Hemmung (Tabellen 7–10). Ferner war für jedes der Cytokine die prozentuale Hemmung für ein gegebenes Cytokin unter den 6 Individuen in der Population unabhängig von den anfänglichen Werten der Expression unter konstitutiven Kultur-Expansionsbedingungen (12A–12D und 13A–13C; Tabellen 7–10).
Kulturbedingungen unter stromagener Ergänzung
SS-Medium erhöhte die Expression mehrerer Cytokine durch MSCs in konzentrationsabhängiger Weise. 14 erläutert die 24 Stunden-Reaktion von MSCs der zweiten Passage auf steigende Konzentrationen von IL-1α, angegeben als Expression von GM-CSF. Es ergibt sich eine nahezu lineare Zunahme des Grads der GM-CSF-Sekretion durch MSCs mit steigenden Konzentrationen an IL-1α im Kulturmedium zwischen 0,1 und 10,0 U/ml. Zusätzliche logarithmische Zunahmen an IL-1α im Kulturmedium führen zu einer geringen weiteren Zunahme der GM-CSF-Expression. Diese Daten wurden dazu verwendet, die Konzentration von IL-1α zur Ergänzung der Kulturmedien in den nachstehend beschriebenen Experimenten zu identifizieren. Für alle anschließenden Tests wurden 10 U/ml IL-1α zu den Kulturmedien gegeben.
Kulturmedium, das mit 10 U/ml IL-1α ergänzt war, induzierte in statistisch signifikanter Weise eine Hochregulierung der Expression von G-CSF (p < 0,05), M-CSF (p < 0,02), LIF (p < 0,02), IL-6 (p < 0,01) und IL-11 (p < 0,06), verglichen mit Zellen, die im konstitutiven Kultur-Expansionsmedium gezüchtet wurden. Ferner induzierte IL-1α die Expression von GM-CSF, das im konstitutiven Kultur-Expansionsmedium nicht nachweisbar war. Im Gegensatz dazu hatte IL-1α keine statistisch signifikante Wirkung auf die Expression von SCF, verglichen mit dem Expressionsgrad unter konstitutiven Kultur-Expansionsmedium-Bedingungen. Der Faktor der Zunahme der Reaktion auf IL-1α variierte in Abhängigkeit vom Cytokin. IL-6 (25,1 ± 13,4-fache Zunahme) wurde am stärksten stimuliert, gefolgt von LIF (9,2 ± 6,9-fach), M-CSF (5,2 ± 1,7-fach) und IL-11 (4,9 ± 3,3-fach). Der durchschnittliche Faktor der Zunahme für G-CSF und GM-CSF wurde nicht berechnet, da diese Cytokine in einigen oder sämtlichen konstitutiven Kultur-Expansionsmedien nicht nachgewiesen wurden.
Diskussion
Unsere fortgesetzten Analysen von MSCs in dieser Studie hatten das Ziel, zusätzliche phänotypische Eigenschaften zu charakterisieren und festzustellen, wie dieser Phänotyp verändert wird, wenn MSCs regulatorischen Molekülen ausgesetzt werden, die eine Differenzierung oder phänotypische Modulation hervorrufen. In dieser Studie bedienten wir uns ELISA-Tests, um die Cytokin-Expression von MSCs unter konstitutiven Kultur-Expansionsbedingungen und in Gegenwart von OS oder SS zu charakterisieren.
MSCs exprimieren ein besonderes Profil von Cytokinen, die G-CSF, M-CSF, SCF, LIF, IL-6 und IL-11 unter konstitutiven Kultur-Expansionsbedingungen umfassen. Sie exprimieren unter diesen Bedingungen nicht GM-CSF, IL-3 und TGF-β2. OS reguliert die Expression von LIF, IL-6 und IL-11 nach unten, während es die Expression der übrigen Cytokine, die unter konstitutiven Züchtungsbedingungen exprimiert werden, nicht beeinträchtigt. Von OS wurde nicht festgestellt, dass es die Expression von einem der in dieser Studie getesteten Cytokine hochreguliert. Im Gegensatz dazu reguliert SS die Expression von G-CSF, M-CSF, LIF, IL-6 und IL-11 hoch und induziert die Expression von GM-CSF, das unter konstitutiven Kultur-Expansionsbedingungen nicht nachgewiesen wurde. SS hatte keinen Einfluss auf die SCF-Expression und es wurde nicht festgestellt, dass es eines der in dieser Studie getesteten Cytokine herunterreguliert. Durch diese Daten wurde ein besonderes Cytokin-Expressionsprofil erzeugt, das bei der Unterscheidung von MSCs von anderen mesenchymalen Phänotypen helfen kann. Die Identität des Cytokinprofils sollte Anhaltspunkte zur Bestimmung der Rolle liefern, die diese Zellen in der Mikroumgebung von Knochenmark spielen, das die induktiven und regulatorischen Informationen liefert, die die Hämatopoese unterstützen. Ferner identifizieren die Veränderungen in diesem Cytokinprofil in Reaktion auf OS und SS spezifische Cytokine, deren Expressionsgrade sich verändern, wenn MSCs einer Differenzierung oder Modulation ihres Phänotyps in Reaktion auf regulatorische Moleküle unterliegen.
IL-1α, das in der Mikroumgebung des Knochenmarks von einer Vielzahl von Zelltypen im Verlauf von entzündlichen Reaktionen freigesetzt wird, induziert MSCs zur Hochregulierung der Expression von Cytokinen, die die granulozytische (G-CSF und GM-CSF), monozytische/osteoklastische (GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-6) und megakaryozytische (IL-11) Differenzierung unterstützen. Von IL-1α wurde gezeigt, dass es das Knochenmark vor einer Radio- oder Hämoablation schützt. Die durch IL-1α induzierte Hochregulierung der Cytokinexpression durch MSCs spielt vermutlich eine Rolle bei den Mechanismen der Schutzwirkungen von IL-1.
Dexamethason, das MSCs zur Differenzierung zu Osteoblasten induziert, schwächt die Expression von monozytischen/osteoklastischen (LIF, IL-6) und megakaryozytischen (IL-11) unterstützenden Cytokinen und hat keinen Einfluss auf die Expression von Cytokinen, die granulozytische Vorläufer (G-CSF, GM-CSF) unterstützen. Die drei durch Dexamethason gehemmten Cytokine sind von Interesse, da jedes sein Signal durch einen Rezeptor übermittelt, der gp130 in seinem Signalgebungsweg verwendet.
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Claims

Verfahren zum Bewirken der Linien-gesteuerten Induktion von isolierten und kultivierten, menschlichen, mesenchymalen Stammzellen, welches das ex vivo in Kontakt bringen der mesenchymalen Stammzellen mit einem bioaktiven Faktor, der wirksam ist, deren in vitro Differenzierung in eine chondrogene, mesenchymale Linie zu induzieren, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen in einem festen, porösen Gefäß mit dem bioaktiven Faktor in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das feste, poröse Gefäß ein Keramikwürfel ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen in einem Kulturgefäß mit dem bioaktiven Faktor in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Kulturgefäß aus einem Material gebildet ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glas und Plastik.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zellen in einer injizierbaren Flüssigkeit mit dem bioaktiven Faktor in Kontakt gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Flüssigkeit zur intramuskulären, intravenösen oder intraartikulären Injektion geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches eine chondrogene Induktion umfasst und der bioaktive Faktor ein chondroinduktiver Faktor ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der chondroinduktive Faktor ein Mitglied der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mitglied der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β ein Knochen-morphogenes Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Knochen-morphogene Protein BMP-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mitglied der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β TGF-β1 ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mitglied der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β Inhibin A ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Mitglied der Superfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors β der chondrogene stimulierende Aktivitätsfaktor ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der chondroinduktive Faktor ein Bestandteil der Kollagen-enthaltenden, extrazellulären Matrix ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Bestandteil der Kollagen-enthaltenden, extrazellulären Matrix Kollagen I ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Kollagen I in der Form eines Gels vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der chondroinduktive Faktor ein Vitamin-A-Analog ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Vitamin-A-Analog Retinsäure ist.