DE69636733T2

DE69636733T2 - Antikörperreinigung durch hydrophobe wechselwirkungchromatografie bei niedrigem ph

Info

Publication number: DE69636733T2
Application number: DE69636733T
Authority: DE
Inventors: H. Ernst San Carlos RINDERKNECHT; A. Gerardo Foster City ZAPATA
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1995-04-20
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2016-04-06
Also published as: EP1752465A3; ZA962885B; WO1996033208A1; IL117942A; AU5534996A; US6214984B1; DE69636733D1; EP0821695B1; JPH11504007A; ES2365929T3; US6066719A; JP4091087B2; EP0821695A1; NZ334211A; AU721736B2; US8012754B2; JP2006262906A; CA2214633A1; US5641870A; EP1752465A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die Reinigung von Antikörpern. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Antikörperfragments aus Varianten, Unreinheiten und Verunreinigungen, die damit assoziiert sind.
Beschreibung der Literatur nach dem Stand der Technik
Die Hydrophobchromatographie (HIC) ist ein nützliches Werkzeug für die Trennung von Molekülen basierend auf ihrer Hydrophobizität. Im Allgemeinen werden Probemoleküle in einem Puffer mit hoher Salzkonzentration auf die HIC-Säule aufgegeben. Das Salz im Puffer wechselwirkt mit den Wassermolekülen, um die Solvatisierung der Moleküle in der Lösung zu verringern, wodurch die hydrophoben Regionen in den Probemolekülen freigelegt werden, die anschließend von der HIC-Säule adsorbiert werden. Je größer die Hydrophobizität des Moleküls, desto weniger Salz ist für die Förderung der Bindung notwendig. Normalerweise wird ein abnehmender Salzgradient verwendet, um Proben aus der Säule zu eluieren. Mit der abnehmenden Ionenstärke erhöht sich der Grad der Aussetzung der hydrophilen Regionen der Moleküle, und die Moleküle eluieren in ansteigender Hydrophibizität aus der Säule. Das Eluieren der Proben kann auch durch das Hinzufügen von milden organischen Modifikatoren oder Detergenzien zum Elutionspuffer erreicht werden. HIC wird in Protein Purification, 2. Auflage, 176–179, Springer-Verlag, New York (1988), beschrieben.
HIC wurde von verschiedenen Forschern zur Reinigung von Antikörpern verwendet. Danielsson et al., Journal of Immunological Methods 115, 79–88 (1988), fanden heraus, dass die HIC besonders für die Reinigung von monoklonalen Antikörpern aus Maus-Asciten nützlich war, wenn der isoelektrische Punkt der Antikörper unter 7,2 lag. Die HIC wurde mit einer Alkyl-Superose-HR^TM-Säule durchgeführt. Das Puffersystem war 0,1 M Phosphat mit der Zugabe von Ammoniumsulfat. Normalerweise enthielt der Startpuffer 2 M Ammoniumsulfat. Bridonneau et al., Journal of Chroma tography 616, 197–204 (1993), waren daran interessiert, zu bestimmen, ob verschiedene HIC-Säulen für die selektive Reinigung der menschlichen Immunglobulin-G-(IgG-)Subklassen verwendet werden konnten oder nicht. Die Antikörper wurden auf Phenyl-, Butyl- oder Octyl-Sepharose^TM-Säulen in 1 M Ammoniumsulfat (pH 7,0) adsorbiert und mit abnehmendem Salzgradienten eluiert. Das Octyl-Sepharose^TM-Medium ergab eine schlecht adsorbierten Fraktion, die etwas mit IgG_2a angereichert war. Siehe auch Berkowitz et al., Journal of Chromatography 389, 317–321 (1987); Gagnon et al., 90. Jahrestreffen, American Society for Microbiology, Anaheim, 13.–17. Mai 1990, Abstract Nr. 0–4; Johansson et al., Biol. Recombinant Microorg. Anim. Cells (34. Treffen, Oholo), 409–414 (1991); Pavlu et al., Journal of Chromatography 359, 449–460 (1986), und Abe et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 27, 215–227 (1993), bezüglich der HIC von Antikörpern.
Die HIC wurde auch zur Reinigung von Antikörperfragmenten verwendet. Inouye et al., Protein Engineering, S. 6, 8 und 1018–1019 (1993); Inouye et al., Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects 5, 609–616 (1993); Inouye et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 26, 27–39 (1993), und Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107–117 (1992), stellten F(ab')₂-Fragmente aus Pepsin-Verdauen von monoklonalen Maus-IgM-Antikörpern unter Verwendung einer TSK-Gel-Ether-5PW^TM-HIC-Säule her. Die Antikörper-Fragmente wurden mit 60 % Ammoniumsulfat ausgesalzt, und die Präzipitate wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH 7,4), die 1 M Ammoniumsulfat enthielt, aufgelöst. Diese Lösung wurde auf die HIC-Säule aufgegeben, die mit PBS, ebenfalls enthaltend 1 M Ammoniumsulfat, äquilibriert worden war. Die F(ab')₂-Fragmente, die an die Säule adsorbiert wurden, wurden durch Reduktion der Ammoniumsulfatkonzentration im Eluierungspuffer auf 0 M eluiert. Inouye et al. fanden heraus, dass jene Fraktion, die das F(ab')₂ enthielt, sowohl nach SDS-PAGE als auch nach Gel-Filtrations-HPLC homogen war. Das Verfahren wurde als geeignet für die großtechnische Reinigung von F(ab')₂-Fragmenten angesehen. Auf ähnliche Art und Weise evaluierten Rea et al., Journal of Cell. Biochem. Suppl. 0, Abstract Nr. X1-206 (17 Teil A), 50 (1993), HIC für die Reinigung eines F(ab')₂-Fragments, das mittels peptischem Verdau eines mu rinen monoklonalen IgG_2a-Antikörpers hergestellt wurde. Die Protein-A-Reinigung zur Entfernung des restlichen intakten Antikörpers ging dem HIC-Schritt voraus. Die Reinigungsleistung von drei verschiedenen HIC-Säulen wurde bei mehreren verschiedenen Salzen und pH-Werten getestet. POROS-PE^TM (Phenylether) ergab sich als die beste Säule, und phosphatgepuffertes Natriumsulfat bei einem pH von 8 ergab die beste Lösung des F(ab')₂-Fragments.
WO 95/22389 beschreibt die Anwendung einer Hydrophobchromatographie-Kombinationschromatographie für die Reinigung von Antikörper-Molekülen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen HIC-Verfahren, die im Allgemeinen bei einem in etwa neutralen pH in der Gegenwart von hohen Salzkonzentrationen (unter Verwendung eines Salzgradienten, um den Antikörper zu eluieren) durchgeführt werden, betrifft die vorliegende Erfindung die Hydrophobchromatographie mit niedriegm pH („low pH hydrophobic interaction chromatography", LPHIC) zur Reinigung von Antikörpern. Vorzugsweise wird die LPHIC bei niedrigen Salzkonzentrationen, d.h. etwa 0–0,25 M Salz, vorzugsweise etwa 0–0,1 M Salz und noch bevorzugter 0–50 mM Salz, durchgeführt. Diese geringe Salzkonzentration trifft ebenso auch auf den Ladepuffer zu. Vorzugsweise wird kein Salzgradient verwendet, um den Antikörper zu eluieren.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung eines Antikörpers von einer Verunreinigung, das das Aufgeben eines Gemischs, das den Antikörper und den Verunreinigungsstoff enthält, auf eine Hydrophobchromatographie-Säule und das Eluieren des Antikörpers aus der Säule mit einem Puffer mit einem pH von etwa 2,5–4,5 umfasst. Vorzugsweise besitzt der Puffer einen pH von etwa 2,8–3,5 und noch bevorzugter einen pH von etwa 3,1. Normalerweise besitzt das auf die Säule aufgegebene Gemisch etwa denselben pH wie der Elutionspuffer.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung eines Antikörpers bereit, welches das Aufgeben eines Gemischs, das den Antikörper sowie fehlgefaltete und/oder disulfidgebundene Antikörper enthält, auf eine Hydrophobchromatographie-Säule und das Eluieren des Antikörpers aus der Säule mit einem Puffer mit einem pH von etwa 2,5–4,5 umfasst, wobei der pH des Puffers bewirkt, dass fehlgefaltete und/oder disulfidgebundene Antikörper in der Säule zurückgehalten werden.
Das Verfahren ist besonders nützlich für die Reinigung von Antikörper-Fragmenten, insbesondere von korrekt gefalteten und disulfidgebundenen Antikörper-Fragmenten (z.B. Fab-Fragmenten), von kontaminierenden Antikörper-Fragmenten, die nicht korrekt gefaltet und/oder disulfidgebunden sind. Die Erfindung beruht, zumindest in Teilen, auf der Identifikation eines Problems, das mit der Bildung von rekombinanten Immunglobulinen assoziiert ist. Es wurde beobachtet, dass diese Produktion zu der Bildung von funktionellen F(ab')₂-Antikörpern sowie einer Reihe an inkorrekt assoziierten leichten und schweren Fragmenten führt. Die am schwierigsten zu entfernende Verunreinigung wurde hierin als ein korrekt gefaltetes Antikörper-Fragment charakterisiert, dessen leichte und schwere Ketten sich durch Disulfidbindung nicht binden können. Diese Antikörper-Verunreinigung kann mittels SDS-PAGE-Gelen und Umkehrphasen-HPLC als schwere und leichte Ketten detektiert werden. Die hierin beschriebene LPHIC stellt ein Verfahren zur im Wesentlichen erfolgenden Entfernung dieser Verunreinigung aus teilweise gereinigten Zusammensetzungen bereit, die von Wirtszellen stammen, die das rekombinante Antikörper-Fragment produzieren, obwohl dies nicht auf die Reinigung rekombinanter Produkte beschränkt ist.
Die Erfindung betrifft ebenso die Formulierung von Antikörpern, die durch das Verfahren hergestellt werden, sowie Verwendungen dieser Antikörper-Formulierung.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein typisches Durchflusschromatogramm einer Hydrophobchromatographie mit niedrigem pH (siehe Beispiel 1). Die Säule wurde im Durchflussmodus betrieben. Korrekt gefaltete, disulfidgebundene Antikörper-Fragmente fließen durch.
Leichtketten-, Schwerketten-, Leicht-Schwer-Aggregate und nicht disulfidgebundene Antikörper-Fragmentspezies bleiben an die Säule gebunden. Peak 1 zeigt den Durchfluss nach dem Waschschritt mit Wasser, während Peak 2 den Harnstoff-Waschschritt der gebundenen Spezies darstellt.
2 zeigt eine Umkehrphasen-HPLC-Analyse von ABX^TM- und Phenyl-Sepharose^TM-Fast-Flow-(FF-)Pools eines Anti-CD18-MHM23-Antikörperfragments. Chromatogramm 1: ABX^TM-Pool, der Leicht- und Schwerketten-Kontaminanten enthält, die vor der LPHIC-Reinigung vorhanden sind. Chromatogramm 2: LPHIC-Reinigung. Chromatogramm 3: Umkehrphasen-Analyse des Säulen-Regenerationspuffers, der Leicht- und Schwerketten-Verunreinigungen und Antikörper-Fragmente enthält, die von der Phenyl-Sepharose^TM-Fast-Flow-Säule zurückgehalten werden.
Die 3A–3D zeigen nahe und ferne UV-Spektren von zwei Antikörper-Fragmenten, rhuMAb H52OZG1 und rhuMAb H52OZG2, erhalten durch Zirkulardichroismus. 3A zeigt nahe UV-Spektren von rhuMAb H52OZG2, und 3B zeigt ferne UV-Spektren von rhuMAb N52OZG2. Dieser Antikörper ist ein Mutant von rhuMAb H52OZG1, in dem die Cystein-Reste 215 und 228, die in die Disulfidbindung zwischen den Schwer- und Leichtketten involviert sind, zu Serin-Resten mutiert wurden. Die Zirkulardichroismus-Spektren sowohl in den fernen als auch in den nahen UV-Regionen zeigten einen Umschlagspunkt bei einem pH von etwa 3,2 (dicke Linie). Ein Umschlagspunkt steht für eine Veränderung eines gefalteten Antikörper-Fragments hin zu dessen ungefaltetem Zustand. 3C zeigt ein nahes UV-Spektrum von rhuMAb H52OZG1, und 3D zeigt ein fernes UV-Spektrum von rhuMAb H52OZG1. Dieses Antikörper-Fragment zeigte einen unterschiedlichen Umschlagspunkt bei einem pH von 2,5 (dicke Linie).
4 zeigt ein Balkendiagramm, das die Auswirkungen des Veränderns des pH der HIC auf die Produktausbeute zeigt. ABX^TM-gereinigte Antikörper-Fragment-Pools, die bindunglose Antikörper-Verunreinigung enthalten (d.h. ohne Disulfidbindung zwischen der Schwer- und der Leichtkette), wurden auf einer Phenyl-Sepharose^TM-Fast- Flow-Säule weiter gereinigt. Die Reinigung wurde bei pH-Werten zwischen 3,0 und 6,5 durchgeführt, um den besten pH-Wert für den Erhalt der maximalen Ausbeute und der maximalen Reinheit zu bestimmen. Es wurde eine Analyse des Durchflusses durch die Pools unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC durchgeführt. Aus dem Balkendiagramm geht hervor, dass der pH von 3,1 den besten Wert zur Maximierung von sowohl Reinheit als auch Ausbeute in der Reinigung des rhuMAb-H52OZG1-Antikörper-Fragments darstellt.
Die 5A und 5B zeigen das Design von L-F(ab')₂ und die Expressionskassette, wie hierin in Beispiel 2 beschrieben. 5A zeigt eine schematische Darstellung von L-F(ab')₂-Varianten (v1, v2 und v3), in der variable (V) Domänen des Anti-p185^HER2-Ab, huMAb4D5-8, und des Anti-CD18-Ab, huMAb H52OZG1, durch leere bzw. durch gefüllte Kästchen dargestellt sind. 5B zeigt eine schematische Darstellung des dicistronischen Operons für die Expression von Anti-p185^HER2-L-F(ab')₂-Varianten, die vom Plasmid pAK19 abstammen. Die Expression erfolgt unter der Transkriptionssteuerung des Alkalischen Phosphatase-Promotors (phoA) aus E.coli, der durch Phosphat-Aushungerung induzierbar ist. Jeder Antikörper-(Ab-)Kette geht die wärmestabile Enterotoxin-II-(stlI-)Signalsequenz aus E. coli voraus, um die Sekretion zum periplasmatischen Raum von E. coli zu steuern. Die humanisierten V_L- und V_H-Domänen (beide Kopien) sind an ihrer 3'-Seite genau an die konstanten menschlichen κ₁-C_L- bzw. IgG₁-C_H1-Domänen fusioniert. Die H-Kette umfasst tandemduplizierte Segmente, in denen die 5'-C_H1-Domäne im Leseraster an ein V_H-kodierendes Segment gebunden ist. Die 3'-C_H1-Domäne wird vom Bakteriophagen-Lambda-t₀-Transkriptionsterminator (ter) gefolgt.
Die 6A–6C zeigen eine FPLC-Größenausschlusschromatographie-Analyse von Anti-p185^HER2. 6A zeigt L-F(ab')₂-v1; 6B zeigt thioethergebundenes F(ab')₂, und 6C zeigt die Fab-Titration mit der extrazellulären p185^HER2-Domäne (ECD).
7 zeigt die Inhibierung der Proliferation von BT474-Zellen durch Anti-p185^HER2-L-F(ab')₂-, F(ab')₂- und Fab-Fragmente. Die gezeigten Daten werden als ein Prozentsatz der Resultate mit unbehandelten Kulturen dargestellt (Mittelwert von doppelten Messungen und für drei separate Experimente repräsentativ). Einwertige und zweiwertige Fragmente, wie sie durch Titration mit der p185^HER2-ECD und Gel-Filtration bewertet werden, werden durch leere bzw. gefüllte Symbole dargestellt.
8 zeigt die Pharmakokinetik von Anti-p185^HER2-L-F(ab')₂-v1, Fab- und thioethergebundenen F(ab')₂-Fragmenten in normalen Mäusen. Die Serumproben wurden aus Gruppen von 45 weiblichen CD-1-Mäusen nach einer einzigen Schwanzveneninjektion (10 mg/kg) gewonnen. Die durchschnittlichen Serumkonzentrationen (C_t ± SD), geschätzt durch Antigen-(Ag-)Bindungs-ELISA, werden zusammen mit der nicht linearen Anpassung der kleinsten Quadrate (–) gezeigt: Ct = 155e–1,73t + 190e–0,042t, L-F(ab')2-v1; Ct = 239e–0,704t + 38,4e–0,264t, F(ab')2; Ct = 440e–4,99t + 2,69e–0,442t, Fab.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Definitionen
Der Begriff „Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und deckt spezifisch intakte monoklonale Antikörper (unter anderem Agonisten- und Antagonisten-Antikörper), polyklonale Antikörper, multispezifische Antikörper (z.B. bispezifische Antikörper), die aus zumindest zwei intakten Antikörpern gebildet sind, und Antikörper-Fragmente, so lange sie die gewünschte biologische Aktivität zeigen, ab.
„Antikörper-Fragmente" umfassen einen Teil eines intakten Antikörpers, im Allgemeinen die antigenbindende oder die variable Region des intakten Antikörpers. Beispiele der Antikörper-Fragmente umfassen Fab-, Fab'-, F(ab')₂-, und Fv-Fragmente; Diakörper; lineare Antikörper (siehe unten stehendes Beispiel 2); Einzelketten-Antikörper-Moleküle; und multispezifische Antikörper, die aus Antikörper-Fragmenten gebildet sind.
Der Begriff „monoklonaler Antikörper", wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d.h. die einzelnen Antikörper, die die Population umfasst, sind identisch, mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommender Mutationen, die in geringer Anzahl vorkommen können. Monoklonale Antikörper sind hochgradig spezifisch, da sie gegen eine einzelne antigene Stelle gerichtet sind. Weiters ist, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörper-Präparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität haben die monoklonalen Antikörper den Vorteil, dass sie durch die Hybridom-Kultur synthetisiert werden, unkontaminiert durch andere Immunglobuline. Der Modifikator „monoklonal" weist auf die Art des Antikörpers hin und drückt aus, dass dieser aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern stammt, und ist nicht als eine Produktion des Antikörpers durch ein bestimmtes Verfahren erfordernd zu verstehen. Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden monoklonalen Antikörper können z.B. durch das zuerst von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschriebene Hybridom-Verfahren hergestellt werden, oder sie können durch DNA-Rekombinationsverfahren (siehe z.B. US-Patent Nr. 4.816.567 [Cabilly et al.]) erzeugt werden. Die „monoklonalen Antikörper" können z.B. aus Phagen-Antikörper-Bibliotheken unter Verwendung der in Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschriebenen Verfahren isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper umfassen hierin spezifisch „chimäre" Antikörper (Immunglobuline), bei denen ein Teil der Schwer- und/oder Leichtkette identisch mit oder homolog zu korrespondierenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer bestimmten Spezies stammen oder zu einer bestimmten Antikörper-Klasse oder -Subklasse gehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu korrespondierenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer anderen Spezies stammen oder zu einer anderen Antikörper-Klasse oder -Subklasse gehören, sowie Fragmente dieser Antikörper, solange sie die gewünschte biologische Aktivität auf weisen (Cabilly et al., s.o.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 [1984]).
"Humanisierte" Formen nicht menschlicher (z.B. muriner) Antikörper sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere antigenbindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine minimale Sequenz enthalten, die von nicht menschlichem Immunglobulin stammt. Zumeist sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), bei denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nicht menschlichen Spezies (Spender-Antikörper), z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen, ersetzt werden, die die gewünschte Spezifität, Affinität und Kapazität aufweisen. In einigen Fällen werden Fv-Gerüst-Reste des menschlichen Immunglobulins durch korrespondierende nicht menschliche Reste ersetzt. Weiters können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüst-Sequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden gemacht, um die Leistung des Antikörpers weiter zu verfeinern und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Sequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc), typischerweise eines menschlichen Immunglobulins. Für weitere Details siehe: Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992). Der humanisierte Antikörper umfasst einen Primatized^TM-Antikörper, worin die antigenbindende Region des Antikörpers von einem Antikörper stammt, der durch die Immunisierung von Makakenaffen mit dem Antigen von Interesse hergestellt wurde.
Der Begriff „Diakörper" bezieht sich auf kleine Antikörper-Fragmente mit zwei Antigenbindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable Schwerketten-Domäne (V_H) umfassen, die mit einer variablen Leichtketten-Domäne (V_L) auf derselben Polypeptidkette (V_H-V_L) verbunden ist. Durch Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den zwei Domänen auf derselben Kette zu ermöglichen, paaren sich die Domänen zwangsweise mit den komplementären Domänen einer anderen Kette und erzeugen zwei Antigenbindungsstellen. Diakörper werden z.B. ausführlicher im EP 404.097 ; WO 93/11161; und in Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Puffer" auf eine gepufferte Lösung, die Veränderungen des pH durch die Wirkung ihrer Säure-Basen-Konjugatkomponenten widersteht. Der Puffer für den Hydrophobchromatographie-Aspekt dieser Erfindung besitzt einen pH im Bereich von etwa 2,5–4,5, vorzugsweise etwa 2,8–3,5. Beispiele für Puffer, die den pH innerhalb dieses Bereichs kontrollieren, umfassen Phosphat-, Acetat-, Citrat- oder Ammoniumpuffer oder mehr als einen. Die bevorzugten dieser Puffer sind Citrat- und Ammoniumpuffer, insbesondere Ammoniumsulfat- oder Ammoniumcitratpuffer. Der „Ladepuffer" ist jener, der verwendet wird, um das Gemisch des Antikörpers und des verunreinigenden Stoffs auf die HIC-Säule aufzugeben, und der „Elutionspuffer" ist jener, der verwendet wird, um den Antikörper aus der Säule zu eluieren. Oftmals sind der Ladepuffer und der Elutionspuffer derselbe.
Mit „korrekt disulfidgebunden" ist gemeint, dass alle Cystein-Reste im Antikörper kovalent als Disulfidbindungen assoziiert sind, und diese Disulfidassoziationen entsprechen den Disulfidassoziationen des nativen Immunglobulins. Der in Beispiel 1 beschriebene Zirkulardichroismus kann verwendet werden, um durch Folgen der Strukturintegrität des Moleküls nach der Säuredenaturierung zu bestimmen, ob ein Antikörper korrekt disulfidgebunden ist oder nicht. Ein Antikörper ist „inkorrekt disulfidgebunden" wenn einer oder mehrere Cystein-Reste nicht kovalent als Disulfidbindungen assoziiert sind oder kovalent mit Cystein-Resten assoziiert sind, mit denen sie normalerweise nicht im nativen Immunglobulin assoziiert sind.
Arten der Durchführung der Erfindung
Das hierin beschriebene Verfahren umfasst die Reinigung eines Antikörpers von seinen verwandten Varianten, normalerweise nachdem der Antikörper bereits von den meisten anderen Verunreinigungen gereinigt wurde. Dieser Reinigungsschritt kann der letzte vor der therapeutischen Formulierung sein oder kann von (einem) anderen Reinigungsschritten) gefolgt sein. Während der Antikörper im Gemisch aus Varianten aus einer beliebigen Quelle hergestellt werden kann (z.B. peptische Spaltung von intakten Antikörpern), wird er doch vorzugsweise rekombinant hergestellt. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, unter anderem Antikörper-Fragmente, folgen.
1. Antikörper-Herstellung
(i) Polyklonale Antikörper
Polyklonale Antikörper werden im Allgemeinen in Tieren durch multiple subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens und eines Adjuvans gezüchtet. Es kann nützlich sein, das relevante Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Keyhole-Limpet-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Agens, z.B. Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cystein-Reste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysin-Reste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N=C=NR, wobei R und R¹ verschiedene Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen das Antigen, die immunogenen Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg oder 1 μg des Peptids oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina des kompletten Freundschen Adjuvans und durch intradermale Injektion der Lösung an mehrfachen Stellen immunisiert. Einen Monat später erhalten die Tiere mittels subkutaner Injektion an mehrfachen Stellen eine Booster-Dosis mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge des Peptids oder Konjugats in komplettem Freundschem Adjuvans. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren eine Blutprobe entnommen, und das Serum wird auf einen Antikörper-Titer getestet. Die Tiere erhalten Boster-Dosen, bis der Titer einen gleichbleibend hohen Wert erreicht. Das Tier wird vorzugsweise mit dem Konjugat desselben Antigens geboostet, jedoch an ein anderes Protein und/oder durch ein unterschiedliches vernetzendes Reagens konjugiert. Konjugate können ebenso in rekombinanter Zellkultur als Fusionsproteine hergestellt werden. Ebenso werden geeigneterweise aggregierende Agenzien, wie z.B. Alaun, verwendet, um die Immunantwort zu verstärken.
(ii) Monoklonale Antikörper
Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten, d.h. die einzelnen Antikörper, die die Population umfasst, sind identisch, mit Ausnahme von möglichen natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Daher deutet der Modifikator „monoklonal" auf die Art des Antikörpers hin und sagt aus, dass dieser kein Gemisch diskreter Antikörper ist.
Die monoklonalen Antikörper können z.B. unter Verwendung des Hybridomverfahrens, zuerst von Kohler und Milstein, Nature 256, 495 (1975), beschrieben, hergestellt werden, oder sie können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (Cabilly et al., s.o.).
Im Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z.B. ein Hamster, wie hierin oben stehend beschrieben immunisiert, um Lymphozyten zu erzeugen, die Antikörper, die spezifisch an das für die Immunisierung verwendete Protein binden, produzieren oder dazu in der Lage sind. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden anschließend unter Verwendung eines geeigneten Fusionsagens, wie z.B. Polyethylenglykol, mit Myelomzellen fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59–103 [Academic Press (1986)]).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden beimpft und in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten, parentalen Myelom-Zellen inhibiert/inhibieren. Falls z.B. den parentalen Myelom-Zellen das Enzym Hypoxanthinguanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT) fehlt, so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), wobei diese Substanzen das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die wirksam fusionieren, eine stabile hochgradige Produktion der Antikörper durch die ausgewählten antikörperproduzierenden Zellen unterstützen und auf ein Medium, wie z.B. das HAT-Medium, empfindlich reagieren. Unter diesen sind bevorzugte Myelomzelllinien murine Myelomlinien, wie z.B. jene, die aus MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren stammen, erhältlich beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, sowie SP-2-Zellen, die bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelomzelllinien wurden ebenso für die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 [1984]; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51–63 [Marcel Dekker, Inc. New York (1987)]).
Das Kulturmedium, in dem die Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf die Produktion monoklonaler Antikörper getestet, die gegen das Antigen gerichtet sind. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler Antikörper, die von Hybridomzellen produziert werden, durch Immunpräzipitation oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. einen Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt.
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann z.B. durch die Scatchard-Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem Hybridomzellen identifiziert wurden, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert werden und mittels Standardverfahren gezüchtet werden (Goding, s.o.). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen z.B. D-MEM oder RPMI-1640-Medium. Zusätzlich dazu können die Hybridomzellen in vivo als Ascites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die von den Subklonen sekretierten monoklonalen Antikörper werden vom Kulturmedium, der Ascites-Flüssigkeit oder dem Serum durch herkömmliche Immunglobulin-Reinigungsverfahren, wie z.B. Protein-A-Sepharose^TM, Hydroxylapaptitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, auf geeignete Weise getrennt.
Die für die monoklonalen Antikörper kodierende DNA ist unter Verwendung herkömmlicher Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, die für die Schwer- und Leichtketten muriner Antikörper kodieren) leicht zu isolieren und zu sequenzieren. Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die anschließend in Wirtszellen, wie z.B. E.-coli-Zellen, Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eizellen (CHO-Zellen) oder Myelomzellen, die andernfalls kein Immunglobulinprotein produzieren, transfiziert werden, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Übersichtsartikel zum Thema der rekombinanten Expression in Bakterien von für den Antikörper kodierender DNA umfassen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5, 256–262 (1993), und Plückthun, Immunol. Revs. 130, 151–188 (1992).
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörper-Fragmente aus Antikörper-Phagen-Bibliotheken isoliert werden, die unter Verwendung der in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschriebenen Verfahren erzeugt wurden, und zwar unter Verwendung des geeigneten Antigens, wie z.B. CD11a, CD18, IgE oder HER-2, um einen geeigneten Antikörper oder ein geeignetes Antikörper-Fragment auszuwählen. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben die Isolierung von murinen bzw. menschlichen Antikörpern unter Verwendung von Phagen-Bibliotheken. Darauf folgende Publikationen beschreiben die Produktion von hochgradig affinen (nM-Bereich) menschlichen Antikörpern durch Ketten-Shuffling (Mark et al., Bio/Technology 10, 779–783 [1992]) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion von sehr großen Phagen-Bibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res. 21, 2265–2266 [1993]). Diese Verfahren sind daher umsetzbare Alternativen zu traditionellen monoklonalen Antikörper-Hybridomverfahren zur Isolierung von „monoklonalen" Antikörpern.
Die DNA kann z.B. auch durch Substituieren der kodierenden Sequenz für menschliche konstante Schwer- und Leichtketten-Domänen anstatt der homologen murinen Sequenzen modifiziert werden (Cabilly et al., s.o.; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 [1984]) oder durch kovalente Bindung der gesamten oder eines Teils der kodierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid an die Immunglobulin-Kodierungssequenz.
Typischerweise werden solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide für konstante Domänen eines Antikörpers dubstituiert, oder sie werden für die variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines Antikörpers substituiert, um einen chimären zweiwertigen Antikörper zu schaffen, der eine Antigenkombinationsstelle mit einer Spezifität für ein Antigen und eine andere Antigenkombinationsstelle mit einer Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder Hybridantikörper können ebenso in vitro unter Verwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie hergestellt werden, unter anderem jener, die Vernetzungsagenzien umfassen. Immuntoxine können z.B. unter Verwendung einer Disulfidaustausch-Reaktion oder durch Bildung einer Thioetherbrücke konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-Mercaptobutyrimidat.
Für diagnostische Anwendungen sind die hierin von Antikörpern abstammenden Varianten typischerweise mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Die detektierbare Gruppierung kann eine beliebige sein, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu produzieren. Die detektierbare Gruppierung kann z.B. ein Radioisotop, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I; eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; radioaktive isotopische Markierungen, wie z.B. ¹²⁵I, ³²P, ¹⁴C oder ³H, oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettich-Peroxidase, sein.
Es kann jedes beliebige nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur separaten Konjugation der Polypeptidvariante an die detektierbare Gruppierung verwendet werden, unter anderem jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben wurden.
(iii) Humanisierte und menschliche Antikörper
Verfahren zur Humanisierung nicht menschlicher Antikörper sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt. Im Allgemeinen besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste, die in ihn aus einer nicht menschlichen Quelle eingeführt wurden. Diese nicht menschlichen Aminosäurereste werden oftmals als „Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne entnommen werden. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter und dessen Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 [1986]; Riechmann et al., Nature 332, 323–327 [1988]; Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 [1988]) durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder -CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Dementsprechend sind solche „humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly et al., s.o.), in denen im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die korrespondierende Sequenz einer nicht menschlichen Spezies ersetzt wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste analoger Stellen in Nagetier-Antikörpern ersetzt wurden.
Die Wahl menschlicher variabler Domänen, sowohl leichter als auch schwerer, die in der Herstellung der humanisierten Antikörper zu verwenden sind, ist sehr wichtig, um die Antigenität zu reduzieren. Gemäß der sog. Methode der optimalen Anpassung wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetier-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek von bekannten menschlichen variablen Domänen-Sequenzen gescreent. Die menschliche Sequenz, die am ehesten der des Nagetiers entspricht, wird dann als das menschliche Gerüst (FR) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 [1993]; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 [1987]). Ein anderes Verfahren verwendet ein besonderes Gerüst, das von der Konsensus-Sequenz von allen menschlichen Antikörpern einer bestimmten Untergruppe der Leicht- oder Schwerketten abstammt. Dasselbe Gerüst kann für mehrere verschiedene humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 [1992]; Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 [1993]).
Weiters ist es wichtig, dass die Antikörper mit Beibehaltung einer hohen Affinität für das Antigen und anderen positiven biologischen Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden humanisierte Antikörper gemäß einem bevorzugten Verfahren durch einen Analyseprozess der parentalen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Verwendung von dreidimensionalen Modellen der parentalen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind leicht erhältlich und sind dem Fachmann nach dem Stand der Technik bekannt. Es sind Computerprogramme erhältlich, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Kandidaten-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen. Die Inspektion dieser Darstellungen ermöglicht eine Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste in der Funktion der Kandidaten-Immunglobulinsequenz, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins, sein Antigen zu binden, beeinflussen. Auf diese Art und Weise können FR-Reste ausgewählt werden und aus den Konsensus- und Importsequenzen kombiniert werden, so dass das gewünschte Antikörper-Merkmal, wie z.B. eine erhöhte Affinität für das/die Ziel-Antigen(e), erreicht wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und sehr wesentlich in die Beeinflussung der Antigen-Bindung involviert.
Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) zu erzeugen, die fähig sind, nach der Immunisierung ein ganzes Repertoire menschlicher Antikörper im Falle des Fehlens der endogenen Immunglobulin-Produktion zu produzieren. Es wurde z.B. beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Bindungsregion-(J_H-)Gens in chimären und Keimbahn-Mutanten-Mäusen zu der vollständigen Inhibierung der endogenen Antikörper-Produktion führt. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solchen Keimbahn-Mutanten-Mäusen führt zu der Produktion von menschlichen Antikörpern bei Antigen-Exposition. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551–255 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993). Menschliche Antikörper können ebenso in Phagendisplay-Bibliotheken hergestellt werden (Hoogenboom und Winter, J. Mol. Biol. 227, 381 [1991]; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 [1991]).
(iv) Antikörper-Fragmente
Es wurden verschiedene Verfahren für die Produktion von Antikörper-Fragmenten entwickelt. Traditionellerweise entstanden diese Fragmente durch den proteolytischen Verdau intakter Antikörper (siehe z.B. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24, 107–117 [1992], und Brennan et al., Science 229, 81 (1985]). Diese Fragmente können jedoch nun direkt durch rekombinante Wirtszellen hergestellt werden. Die Antikörper-Fragmente können z.B. aus den oben beschriebenen Antikörper-Phagen-Bibliotheken isoliert werden. Alternativ dazu können Fab'-SH-Fragmente direkt aus E. coli gewonnen werden und chemisch gebunden werden, um F(ab')₂-Fragmente zu bilden (Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 [1992]). Alternativ dazu können F(ab')₂-Fragmente direkt aus rekombinanten Wirtszellenkulturen isoliert werden. Andere Verfahren für die Produktion von Antikörper-Fragmenten sind dem Fachmann bekannt.
(v) Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper (BsAbs) sind Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene besitzen. Bispezifische Antikörper können von Antikörpern voller Länge oder Antikörper-Fragmenten abstammen (z.B. bispezifische F(ab')₂-Antikörper).
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind nach dem Stand der Technik bekannt. Die herkömmliche Produktion von bispezifischen Antikörpern voller Länge basiert auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtkettenpaaren, wobei die beiden Ketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Millstein und Cuello, Nature 305, 537–539 [1983]). Aufgrund der Zufallsverteilung der Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potentielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur besitzt. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die normalerweise durch Affinitätschromatographieschritte erfolgt, ist eher mühsam, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren sind in WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
Gemäß einem anderen und stärker bevorzugten Ansatz werden variable Antikörper-Domänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) an konstante Immunglobulin-Domänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerketten-Domäne, die zumindest einen Teil der Gelenk-, C_H2- und C_H3-Regionen umfasst. Diese umfasst vorzugsweise die erste konstante Schwerketten-Region (C_H1), die die für die Leichtkettenbindung notwendige Stelle enthält, die in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerketten-Fusionen kodieren und, falls gewünscht, für die Immunglobulin-Leichtkette, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies bietet eine große Flexibilität bei der Anpassung der gegenseitigen Proportionen der drei Polypeptid-Fragmente in Ausführungsformen, wenn ungleiche Verhältnisse der drei Polypeptidketten, die in der Konstruktion verwendet wurden, die optimalen Ausbeuten ergeben. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu hohen Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse keine besondere Bedeutung haben.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (das eine zweite Bindungsspezifität bereitstellt) im anderen Arm. Es wurde herausgefunden, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von ungewollten Immunglobulin-Kettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls einen leichten Weg der Trennung bietet. Dieser Ansatz wurde in WO 94/04690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart. Für weitere Details der Erzeugung bispezifischer Antikörper siehe z.B. Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986).
Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder „Heterokonjugat"-Antikörper. Einer der Antikörper im Heterokonjugat kann z.B. an Avidin gekoppelt werden, der andere an Biotin. Diese Antikörper wurden z.B. vorgeschlagen, um mit Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu zielen (US-Patent Nr. 4.676.980) und zur Behandlung einer HIV-Infektion (WO 91/00360, WO 92/200373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Verwendung beliebiger passender Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Vernetzungs-Agenzien sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und sind im US-Patent Nr. 4.676.980, zusammen mit einer Reihe an Vernetzungsverfahren, offenbart.
Verfahren zur Erzeugung bispezifischer Antikörper aus Antikörper-Fragmenten wurden in der Literatur ebenso beschrieben. Bispezifische Antikörper können z.B. unter Verwendung einer chemischen Bindung hergestellt werden. Brennan et al., Science 229, 81 (1985), beschreiben ein Verfahren, worin intakte Antikörper proteolytisch ge spalten werden, um F(ab')₂-Fragmente zu erzeugen. Diese Fragmente werden in Gegenwart des Dithiol-Komplexbildners Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren und um eine intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die erzeugten Fab'-Fragmente werden dann in Thionitrobenzoat-(TNB-)Derivate umgewandelt. Eines der Fab'-TNB-Derivate wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin zum Fab'-Thiol zurück umgewandelt und mit einer äquimolaren Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats gemischt, um den BsAb zu bilden. Die erzeugten BsAbs können als Agenzien für die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
Vor kurzem erzielte Fortschritte hat die direkte Gewinnung von Fab'-SH-Fragmenten aus E. coli erleichtert, die chemisch gebunden werden können, um bispezifische Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Produktion eines vollständig humanisierten BsAb-F(ab')₂-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde separat aus E. coli sekretiert und in vitro einer gerichteten chemischen Bindung unterzogen, um den BsAb zu bilden. Der so gebildete BsAb war in der Lage, an Zellen, die den HER2-Rezeptor überexprimierten, und normale menschliche T-Zellen zu binden und die lytische Aktivität der menschlichen zytotoxischen Lymphozyten gegen menschliche Brusttumorziele auszulösen. Siehe auch Rodriguez et al., Int. J. Cancers (Suppl.) 7, 45–50 (1992).
Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolierung von BsAb-Fragmenten direkt aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenso beschrieben. Es wurden z.B. bispezifische F(ab')₂-Heterodimere unter Verwendung von Leucin-Zippern hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5), 1547–1553 (1992). Die Leucin-Zipperpeptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden durch Genfusion an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörper gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gelenkregion reduziert, um Monomere zu bilden, und schließlich re-oxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschriebene „Diakörper"-Technologie stellte ein Alternativverfahren zur Herstellung von BsAb-Fragmenten dar. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (V_H), die an eine variable Leichtketten-Domäne (V_L) durch einen Linker gebunden ist, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen auf derselben Kette zu ermöglichen. Dementsprechend paaren sich die V_H- und die V_L-Domänen eines Fragments zwangsweise mit den komplementären V_L- und V_H-Domänen eines anderen Fragments, wodurch zwei Antigenbindungsstellen erzeugt werden. Es wurde ebenso über eine weitere Strategie zur Herstellung von BsAb-Fragmenten durch die Verwendung von Einzelketten-Fv-(sFv-)Dimeren berichtet. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994). Diese Forscher haben einen Antikörper kreiert, der die V_H- und die V_L-Domänen eines ersten Antikörpers umfasste, der durch einen 25-Aminosäurerest-Linker an die V_H- und die V_L-Domänen eines zweiten Antikörpers gebunden wurde. Das neugefaltete Molekül band an Fluorescein und den T-Zellen-Rezeptor und steuerte die Lyse menschlicher Tumorzellen neu, die Fluorescein kovalent an ihre Oberfläche gebunden hatten.
2. Antikörper-Reinigung
Werden Rekombinationsverfahren verwendet, so kann der Antikörper intrazellulär produziert werden, im periplasmatischen Raum, oder direkt in das Medium sekretiert werden. Wird der Antikörper intrazellulär hergestellt, so werden als erster Schritt die Partikeltrümmer, entweder Wirtszellen oder lysierte Fragmente, entfernt, z.B. durch Zentrifugation oder Ultrafiltration. Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992), beschreiben ein Verfahren zur Isolierung von Antikörpern, die in den periplasmatischen Raum von E. coli sekretiert werden. Kurz gesagt, wird die Zellpaste in Gegenwart von Natriumacetat (pH 3,5), EDTA und Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) für einen Zeitraum von etwa 30 Minuten aufgetaut. Zelltrümmer können mittels Zentrifugation entfernt werden. Wo der Antikörper in das Medium sekretiert wird, werden Überstände solcher Expressionssysteme im Allgemeinen zuerst unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters konzentriert, z.B. mit einer Amicon- oder Millipore-Pellicon-Ultrafiltrationseinheit. Ein Protease-Inhibitor, wie z.B. PMSF, kann in jeden der vorangehenden Schritte inkludiert werden, um die Proteolyse zu inhibieren, und Antibiotika können inkludiert werden, um das Wachstum von zufällig auftretenden Verunreinigungen zu verhindern.
Die Antikörperzusammensetzung, die aus den Zellen hergestellt wird, wird vorzugsweise zumindest einem Reinigungsschritt vor der LPHIC unterzogen. Beispiele geeigneter Reinigungsschritte umfassen die Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse und Affinitätschromatographie, wobei die Affinitätschromatographie das bevorzugte Reinigungsverfahren ist. Die Eignung des Proteins A als ein Affinitätsligand hängt von der Art und dem Isotyp einer beliebigen Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die im Antikörper vorhanden ist. Protein A kann verwendet werden, um Antikörper zu reinigen, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ4-Schwerketten basieren (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 [1983]). Protein G wird für alle Maus-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 [1986]). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden ist, ist in den meisten Fällen Agarose, es sind jedoch auch andere Matrizen erhältlich. Mechanisch stabile Matrizen, wie z.B. „Controlled Pore Glass" oder Poly(styroldivinyl)benzol, ermöglichen schnellere Durchflussraten und kürzere Verarbeitungszeiten als sie mit Agarose erreicht werden können. In Fällen, in denen der Antikörper eine C_H3-Domäne umfasst, ist das Bakerbond-ABX^TM-Harz (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) für die Reinigung nützlich. Andere Verfahren zur Reinigung von Proteinen, wie z.B. die Fraktionierung auf einer Ionenaustauschsäule, Ethanolfällung, Umkehrphasen-HPLC, Chromatographie an Silica, Chromatographie an Heparin-Sepharose^TM, Chromatographie an einem Anionen- oder Kationenaustauschharz (wie z.B. eine Polyasparaginsäure-Säule), Chromatofokussierung, SDS-PAGE und Ammoniumsulfatfällung, sind in Abhängigkeit von dem zu gewinnenden Antikörper ebenso erhältlich.
Nach (einem) beliebigen Vorreinigungsschritt(en) wird das Gemisch, das den Antikörper von Interesse und die Verunreinigung(en) umfasst, einer LPHIC unterzogen. Oftmals ist die zu reinigende Antikörperzusammensetzung in einem Puffer aus dem vorigen Reinigungsschritt vorhanden. Es kann jedoch notwendig sein, vor dem LPHIC einen Puffer zu der Antikörperzusammensetzung hinzuzufügen. Es sind zahlreiche Puffer erhältlich und können durch Routine-Experimente ausgewählt werden. Der pH des Gemisches, das den zu reinigenden Antikörper und zumindest eine Verunreinigung in einem Ladepuffer umfasst, wird auf einen pH von etwa 2,5–4,5 unter Verwendung von entweder einer Säure oder einer Base in Abhängigkeit vom Ausgangs-pH angepasst. Vorzugsweise besitzt der Ladepuffer eine geringe Salzkonzentration (d.h. weniger als etwa 0,25 M Salz).
Das Gemisch wird auf die HIC-Säule aufgegeben. HIC-Säulen umfassen normalerweise eine Basenmatrix (z.B. vernetzte Agarose oder synthetisches Copolymermaterial), an die hydrophobe Liganden (z.B. Alkyl- oder Arylgruppen) gebunden sind. Die bevorzugte HIC-Säule umfasst ein Agaroseharz, das mit Phenylgruppen substituiert ist (z.B. eine Phenyl-Sepharose^TM-Säule). Es sind viele HIC-Säulen im Handel erhältlich. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Phenyl-Sepharose^TM-6-Fast-Slow-Säule mit geringer oder hoher Substitution (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Schweden); Phenyl-Sepharose^TM-Hochleistungssäule (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Schweden); Octyl-Sepharose^TM-Hochleistungssäule (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Schweden); Fractogel^TM-EMD-Propyl- oder Fractogel^TM-EMD-Phenyl-Säulen (E. Merck, Deutschland); Macro-Prep^TM-Mehyl- oder Macro-Prep^TM-t-Butyl-Supporter (Bio-Rad, Kalifornien); WP-HI-Propyl(C₃)^TM-Säule (J.T. Baker, New Jersey); und Toyopearl^TM-Ether-, -Phenyl- oder -Butyl-Säulen (TosoHaas, PA).
Der Antikörper wird unter Verwendung eines Elutionspuffers aus der Säule eluiert, der normalerweise derselbe ist wie der Ladepuffer. Der Elutionspuffer kann unter Verwendung von Routine-Experimenten ausgewählt werden. Der pH des Elutionspuffers liegt zwischen etwa 2,5–4,5 und besitzt eine niedrige Salzkonzentration (d.h. weniger als etwa 0,25 M Salz). Es wurde herausgefunden, dass es nicht notwendig ist, einen Salzgradienten zu verwenden, um den Antikörper von Interesse zu eluieren; das gewünschte Produkt wird in der Durchflussfraktion gewonnen, die sich nicht signifikant an die Säule bindet.
Der LPHIC-Schritt stellt einen Weg dar, um einen korrekt gefalteten und disulfidgebundenen Antikörper von unerwünschten Verunreinigungen zu entfernen (z.B. inkorrekt assoziierte leichte und schwere Fragmente). Das Verfahren stellt insbesondere ein Mittel zur im Wesentlichen stattfindenden Entfernung einer Unreinheit bereit, die hierin als ein korrekt gefaltetes Antikörper-Fragment charakterisiert ist, dessen Leicht- und Schwerketten sich nicht durch Disulfidbindung assoziieren können. Es wurde herausgefunden, dass die unter Verwendung der hierin beschriebenen LPHIC hergestellte Antikörperzusammensetzung zumindest zu 95 % rein ist. Reinheiten von mehr als 98 % wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens erreicht.
Die durch LPHIC hergestellte Antikörperzusammensetzung kann weiter wie gewünscht unter Verwendung von nach dem Stand der Technik wohlbekannten Verfahren gereinigt werden. Diagnostische oder therapeutische Formulierungen des gereinigten Proteins können durch Bereitstellung der Antikörperzusammensetzung in einem physiologisch annehmbaren Träger, für den unten stehend Beispiele angeführt sind, hergestellt werden.
Um Verunreinigungen (z.B. ungefaltete Antikörper- und inkorrekt assoziierte Leicht- und Schwer-Fragmente) aus der HIC-Säule zu entfernen, so dass sie wiederverwendet werden kann, kann eine Zusammensetzung, die Harnstoff umfasst (z.B. 6,0 M Harnstoff, 1 % MES-Puffer, pH 6,0, 4 mM Ammoniumsulfat), durch die Säule durchfließen gelassen werden.
3. Verwendungen für den gereinigten Antikörper
Es wurden zahlreiche Verwendungen für Antikörper, die unter Verwendung des offenbarten Verfahrens gereinigt wurden, betrachtet, unter anderem diagnostische und therapeutische Verwendungen. Verschiedene diagnostische und therapeutische Verwendungen für Antikörper wurden z.B. in Goldenberg et al., Semin. Cancer Biol. 1 (3), 217–225 (1990), Beck et al., Semin. Cancer Biol. 1 (3), 181–188 (1990), Niman, Immunol. Ser. 53, 189–204 (1990), und Endo, Nippon Igaku Hoshasen Gakkai Zasshi (Japan) 50 (8), 901–909 (1990), beschrieben.
Die hierin beschriebenen Antikörper können in Immuntests, wie z.B. Enzym-Immuntests, verwendet werden. BsAbs sind besonders für diese Art Test nützlich: ein Arm des BsAb kann so kreiert werden, dass er an ein spezifisches Epitop auf dem Enzym bindet, so dass die Bindung keine Enzyminhibierung hervorruft, der andere Arm des Antikörpers kann so kreiert werden, dass er an eine immobilisierende Matrix bindet, wodurch an der gewünschten Stelle eine hohe Enzymdichte sichergestellt wird. Beispiele solcher diagnostischer BsAbs umfassen jene, die eine Spezifität für IgG sowie Ferritin aufweisen, und jene, die z.B. Bindungsspezifitäten für Meerrettich-Peroxidase (HRP) sowie ein Hormon aufweisen.
Die Antikörper können für die Verwendung in Zwei-Stellen-Immuntests kreiert werden. Zwei Antikörper werden z.B. so hergestellt, dass sie an zwei separate Epitope auf dem Analytenprotein binden; ein Antikörper bindet den Komplex an eine nicht lösliche Matrix, während der andere ein Indikatorenzym bindet.
Antikörper können ebenso für die In-vitro- oder In-vivo-Immundiagnose verschiedener Krankheiten, wie z.B. Krebs, verwendet werden. Um diese diagnostische Verwendung zu erleichtern, kann ein Antikörper, der an ein tumorassoziiertes Antigen bindet, mit einem detektierbaren Marker (z.B. einem Chelatbildner, der an ein Radionuclid bindet) konjugiert werden. Ein Antikörper mit z.B. einer Spezifität für das tumorassoziierte Antigen CEA kann für die bildliche Darstellung von kolorektalen und Schilddrüsen-Karzinomen verwendet werden. Der hierin offenbarte Anti-p185^HER2-Antikörper kann für die Detektion von Krebsarten verwendet werden, die durch die Amplifikation des HER2-Protooncogens charakterisiert sind. Andere nicht therapeutische diagnostische Verwendungen für den Antikörper sind dem Fachmann bekannt.
Für diagnostische Anwendungen wird der Antikörper typischerweise direkt oder indirekt mit einer detektierbaren Gruppierung markiert. Die detektierbare Gruppierung kann eine beliebige sein, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt ein detektierbares Signal zu produzieren. Die detektierbare Gruppierung kann z.B. ein Radioisotop sein, wie z.B. ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I; eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; oder ein Enzym, wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder HRP.
Es kann jedes nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur separaten Konjugation des Antikörpers an die detektierbare Gruppierung verwendet werden, unter anderem jene Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. und Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben wurden.
Die Antikörper können in jedem bekannten Versuchsverfahren eingesetzt werden, wie z.B. kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunpräzipitationstests. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC Press, Inc. (1987).
Kompetitive Bindungstests basieren auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Test-Probenanalyten um die Bindung mit einer limitierten Menge des Antikörpers zu konkurrieren. Die Menge des Analyten in der Testprobe ist umgekehrt proportional zu der Menge des Standards, der an den Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge des Standards, der gebunden wird, zu erleichtern, wird der Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenz unlöslich gemacht, so dass der Standard und der Analyt, die an den Antikörper gebunden werden, leicht vom Standard und dem Analyten getrennt werden können, die ungebunden bleiben.
BsAbs sind besonders für Sandwichtests nützlich, die die Verwendung von zwei Molekülen umfassen, von denen jedes fähig ist, an einen anderen immunogenen Abschnitt oder ein anderes immunogenes Epitop der zu detektierenden Probe zu binden. In einem Sandwichtest ist der Test-Probenanalyt durch einen ersten Arm des Antikörpers gebunden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist, danach bindet ein zweiter Arm des Antikörpers an den Analyten, wodurch ein unlöslicher dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Arm des Antikörpers kann selbst mit einer detektierbaren Gruppierung markiert werden (direkte Sandwichtests), oder er kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der mit einer detektierbaren Gruppierung markiert ist, gemessen werden (indirekter Sandwichtest). Eine Art des Sandwichtests ist z.B. ein ELISA-Test, wobei in diesem Fall die detektierbare Gruppierung ein Enzym ist.
Die Antikörper sind ebenso nützlich für die Affinitätsreinigung eines Antigens von Interesse aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen.
Therapeutische Verwendungen für die unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens gereinigten Antikörper werden ebenso in Betracht gezogen. Der Antikörper kann z.B. für die neu gesteuerte Zytotoxizität (z.B. um Tumorzellen abzutöten) verwendet werden sowie als ein Impfstoffadjuvans, zur Anlieferung thrombolytischer Agenzien zu Blutgerinnseln, zur Anlieferung von Immuntoxinen zu Tumorzellen, zur Umwandlung enzymaktivierter Prodrugs an einer Zielstelle (z.B. einem Tumor), zur Behandlung infektiöser Krankheiten oder zum Abzielen auf Zelloberflächenrezeptoren mit Immunkomplexen. Therapeutische Formulierungen des Antikörpers werden zur Lagerung hergestellt, und zwar durch Mischen des Antikörpers mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflage, A. Osol (Hrsg.) [1980]) in der Form von lyophilisiertem Kuchen oder wässrigen Lösungen. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer, wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, unter anderem Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, unter anderem Glukose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z.B. Natrium; und/oder nicht ionische Tenside, wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
Der Antikörper kann ebenso in Mikrokapseln eingeschlossen werden, z.B. durch Koazervationsverfahren oder Grenzflächenpolymerisation hergestellt (z.B. Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly[methylmethacrylat]-Mikrokapseln), in kolloidalen Wirkstoffanlieferungssystemen (z.B. Liposomen, Albumin-Mikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln) oder in Makroemul sionen. Diese Verfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o., offenbart.
Der für die In-vivo-Verabreichung zu verwendende Antikörper muss steril sein. Dies ist durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach der Lyophilisierung und Rekonstruktion leicht zu erreichen. Der Antikörper wird normalerweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert.
Therapeutische Antikörperzusammensetzungen werden im Allgemeinen in einem Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung platziert, z.B. einem Beutel für intravenöse Lösungen oder einer Phiole mit einem Stöpsel, der mit einer subkutanen Injektionsnadel zu durchstechen ist.
Der Verabreichungsweg des Antikörpers erfolgt gemäß der bekannten Verfahren, z.B. durch Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg, oder, wie unten stehend angeführt, durch Systeme mit verzögerter Freisetzung. Der Antikörper wird kontinuierlich durch eine Infusion oder mittels einer Bolusinjektion verabreicht.
Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen von festen hydrophoben Polymeren, die das Protein enthalten, wobei die Matrizen in Form von Formartikeln vorliegen, z.B. als Filme oder Mikrokapseln. Beispiele für Matrizen mit verzögerter Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele [z.B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben, oder Poly(vinylalkohol)], Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919, EP 58.481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 [1983]), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere, wie z.B. das Lupron-Depot^TM (injizierbare Mikroku geln, die aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat bestehen), und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure ( EP 133.988 ).
Während Polymere, wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von mehr als 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine für kürzere Zeitspannen frei. Bleiben eingekapselte Antikörper für eine lange Zeit im Körper, so können sie denaturieren oder als Resultat der Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37 °C aggregieren, was zu einem Verlust der biologischen Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Es können rationale Strategien zur Stabilisierung der Antikörper in Abhängigkeit von dem involvierten Mechanismus ausgearbeitet werden. Wird z.B. herausgefunden, dass der Aggregationsmechanismus eine intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch ist, so kann die Stabilisierung durch Modifizieren der Sulfhydryl-Reste, durch Lyophilisieren aus sauren Lösungen, durch Kontrollieren des Feuchtigkeitsgehalts, durch Verwendung geeigneter Additive und durch Entwicklung spezifischer Polymer-Matrixzusammensetzungen erreicht werden.
Antikörperzusammensetzungen mit verzögerter Freisetzung umfassen ebenso liposomal eingeschlossene Antikörper. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch per se bekannte Verfahren hergestellt: DE 3.218.121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030–4034 (1980); EP 52.322 ; EP 36.676 ; EP 88.046 ; EP 143.949 ; EP 142.641 ; Japanische Patentanmeldung 83-118008; US-Patent Nr. 4.485.045 und 4.544.545 und EP 102.324 . Normalerweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200–800 Angstrom) unilamellaren Typ, bei dem der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei die ausgewählte Proportion für die optimale Antikörper-Therapie angepasst wird.
Eine wirksame Menge des Antikörpers, die therapeutisch zu verwenden ist, hängt z.B. von den therapeutischen Zielen, der Verabreichungsroute und dem Zustand des Patienten ab. Dementsprechend wird es notwendig sein, dass der Therapeut die Dosierung titriert und den Verabreichungsweg wie erforderlich modifiziert, um die opti male therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische tägliche Dosis könnte eine Bandbreite von etwa 1 μg/kg bis zu 10 mg/kg oder mehr aufweisen, in Abhängigkeit von den oben genannten Faktoren. Typischerweise verabreicht der Kliniker den Antikörper, bis eine Dosierung erreicht wird, die die gewünschte Wirkung erbringt. Der Fortschritt dieser Therapie ist durch herkömmliche Tests leicht zu beobachten.
Die folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung angegeben und dienen nicht der Einschränkung.
BEISPIEL 1
HYDROPHOB-CHROMATOGRAPHIE BEI NIEDRIGEM PH (LPHIC)
Es wurde ein Verfahren zur bevorzugten Entfaltung von nicht disulfidgebundenem Antikörper durch Säuredenaturierung entwickelt. Während der Säuredenaturierung trägt die intermolekulare Ladungsrepulsion zum Entfalten bei, und das Ausmaß der Entfaltung hängt von den Ansäuerungsbedingungen sowie von der Proteinstruktur ab. Bei einem niedrigen pH können ungefaltete Antikörper und inkorrekt assoziierte leichte und schwere Fragmente mittels LPHIC (Durchflussmodus) getrennt werden. Ungewollte Antikörperspezies binden an die Säule, während die gewünschten Antikörper-Fragmente durchfließen. Unreinheiten können aus der Säule mit 6,0 M Harnstoff, 1 % MES-Puffer (pH 6,0), 4 mM Ammoniumsulfat entfernt werden.
Die folgenden Antikörper wurden einer LPHIC unterzogen:

(a) humanisierte Anti-CD18-Fab' und -F(ab')₂;
(b) chimäre Anti-CD18-Fab' und -F(ab')₂;
(c) lineare humanisierte Anti-CD18-F(ab')₂; und
(d) lineare humanisierte Anti-p185^HER2-F(ab')₂.

MATERIALIEN UND VERFAHREN
Zellmaterial. Transformierte E.-coli-Stämme wurden verwendet, um humanisierte Anti-CD18-Fab'-H52, Version OZ (rhuMAb H52OZG1), herzustellen, wie in Eigenbrot et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 18, 49–62 (1994), beschrieben. Eine chimäre Version von Anti-CD18-MAb, MHM23 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13, 202–208 [1983]), wurde mit der Leichtkettensequenz Seq.-ID Nr. 1 und der Schwerketten-Sequenz Seq-ID Nr. 2 hergestellt. Die für das Fab kodierenden Sequenzen wurden in einen Vektor basierend auf pAK19 subkloniert, der zuvor von Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 (1992), beschrieben wurde. Lineare humanisierte Anti-CD18-huMAbH52- und Anti-p185^HER2huAb4D5-8-F(ab')₂-Fragmente wurden, wie untenstehend in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt.
Umkehrphasenchromatographie-Analyse. Es wurde eine Umkehrphasenchromatographie auf einer 4,6-x-50-mm-Umkehrphasen-PLRP-STM-Säule, 8 mm Teilchengröße, durchgeführt (Polymer Laboratories, Shropshire, UK) und bei 50 °C gehalten. Die Proteine wurden unter Verwendung eines ansteigenden linearen Gradienten von 31 % Puffer B auf 41 % Puffer B eluiert. Puffer A enthielt 0,1 % Trifluoressigsäure in entionisiertem Wasser, und Puffer B enthielt 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril mit HPLC-Reinheit. Die Durchflussgeschwindigkeit wurde bei 2 ml/min gehalten, und die Detektionswellenlänge lag bei 214 nm.
Extraktion von Fab'-Antikörper-Fragmenten aus E. coli und Schutz von freiem Sulfhydryl mit 4,4-DTP. Es wurden Antikörper-Fragmente aus gefrorenen E.-coli-Zell-Pellets extrahiert, die aus 10-Liter-Fermentationen erhalten wurden. Da die Zellen vollständig zerstört waren, wurde 4,4-Dithiodipyridin (4,4-DTP) hinzugefügt, um das freie Cystein im Fab'-Antikörper-Fragment zu schützen, das verändert wurde, um ein freies Thiol in der Gelenkregion zu enthalten (Anti-CD18-huMAb H52OZG1 und Anti-CD18-MAb MHM23). Lineare F(ab')₂-Versionen ohne veränderte freie Cysteine in der Gelenkregion (lineare Versionen von Anti-CD18-huMAbH52 und huMAb4D5-8) wurden ohne 4,4-DTP extrahiert, wie unten stehend in Beispiel 2 beschrieben.
Extraktion. Gefrorene Zellpellets wurden bei Raumtemperatur in 20 mM MES-Puffer, pH 6,0, enthaltend 5 mM EDTA und 20 mM 4,4'-DTP, zuvor in Ethanol aufgelöst (3 Liter Puffer/kg an Zellpellets), resuspendiert. Die suspendierten Zellen wurden durch zwei Passagen durch einen Mantin-Gaulin-Homogenisator bei 5500 bis 6500 PSI zerstört. Das Homogenisat wurde auf 0,25 Vol.-% mit Polyethylenimin (PEI) eingestellt und mit einer gleichen Menge an gereinigtem Wasser mit 2–8 °C verdünnt. Das verdünnte Homogenisat wurde anschließend zentrifugiert. Das Antikörper-Fragment war im Überstand zu finden.
Reinigung der geschützten Fab'-TP-Antikörper-Fragmente. Die ABX^TM-Chromatographie wurde für die anfängliche Reinigung der Antikörper-Fragmente aus E.-coli-Proteinen verwendet. Um die Antikörper-Fragmente weiter von Antikörperspezies zu reinigen, denen eine Disulfidbindung zwischen den Leicht- und Schwerketten fehlt, wurde der Schritt einer Nydrophob-Chromatographie bei niedrigem pH eingeführt.
ABX^TM-Chromatographie. Der das Antikörper-Fragment enthaltende Überstand wurde mit gereinigtem Wasser auf eine Leitfähigkeit von 2 Millisiemens oder weniger verdünnt. Der verdünnte Überstand wurde nacheinander durch 0,5- und 0,22-Mikron-Filter gepumpt und auf eine ABX^TM-Säule aufgegeben (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), die in 50 mM MES/5 mM EDTA, pH 6,0 (Puffer A), äquilibriert worden war. Der Abfluss wurde bei 280 nm beobachtet. Nach dem Aufgeben wurde die Säule mit 2 Säulen-Volumina Puffer A gewaschen. Die Antikörper wurden mit einem 20-Säulenvolumen-Gradienten von 0 auf 50 mM Ammoniumsulfat in Puffer A eluiert. Die Fraktionen wurden mittels HPLC analysiert und entsprechend gepoolt.
Hydrophob-Chromatographie bei niedrigem pH (LPHIC). Die ABX^TM-gereinigten Fab'-Pools (humanisierte und chimäre Anti-CD18) wurden auf 20 mM NaPO₄ angepasst, und der pH der Pools wurde auf 3,1 unter Verwendung von 6 N HCl unmittelbar vor dem Aufladen auf eine Phenyl-Sepharose^TM-Fast-Flow-Säule (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) angepasst. Chemisch gebundene F(ab')₂-(humanisierte und chimäre Anti-CD18-) und lineare F(ab')₂-(Anti-CD18- und Anti-p185^HER2-) ABX^TM- Pools wurden auf dieselbe Art und Weise hergestellt, außer dass sie zu 20 mM in Ammoniumsulfat hergestellt wurden. In 1 ist ein typisches Durchflusschromatogramm der LPHIC dargestellt. Der pH des LPHIC-gereinigten Antikörpers wurde sofort mit 10 % NaOH auf einen pH von 5 angepasst.
pH-Analyse. Es wurde ein Experiment kreiert, um zu bestimmen, bei welchem pH eine maximale Reinigung sowie eine maximale Ausbeute erreicht werden konnte. ABX^TM-Pools wurden 25 mM in NaPO₄ hergestellt, und der pH wurde unter Verwendung von 6 N HCl angepasst. Nachdem der gewünschte pH erhalten wurde, wurden die Proben durch eine Phenyl-Sepharose^TM-Fast-Flow-Säule fließen gelassen, und die Pools wurden unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC analysiert, um die Reinheit und Ausbeute zu bestimmen.
Zirkulardichroismus. Es wurden Spektren auf einem AVIV-Modell-60DS-Instrument bei 60 °C aufgenommen. Zellen mit einer Weglänge von 1 mm wurden für ferne UV-Messungen und Zellen mit einer Weglänge von 10 mm für nahe UV-Messungen verwendet. Die gereinigten rhuMAb-H52OZG1- und rhuMAb-H52OZG2-Antikörperproben wurden in 10 mM KPO₄-Puffer mittels Gelpermeationschromatographie auf Sephadex G25^TM (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) pufferausgetauscht. Die Proben wurden mit Phosphorsäure titriert, um den gewünschten pH zu erreichen, bevor die CD-Spektren gemessen wurden.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
CD-Spektroskopie von rhuMAb H52OZG1 und rhuMAb H52OZG2. Der ABX^TM-gereinigte Pool scheint kleine Mengen an Antikörper-Fragmenten zu enthalten, deren Leicht- und Schwerketten korrekt gefaltet sind, es jedoch nicht schaffen, sich durch eine Disulfidbindung kovalent zu binden. Diese Unreinheit kann auf SDS-Gelen und mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC detektiert werden (2). Die nicht kovalent assoziierten Antikörper-Fragmente können vom gewünschten Produkt mittels bevorzugter Säuredenaturierung, gefolgt von LPHIC, getrennt werden. Um die Säu redenaturierungsunterschiede zwischen den disulfidassoziierten und nichtdisulfidassoziierten Spezies zu bestimmen, wurden zwei gereinigte Antikörper-Fragmente verwendet; rhuMAb H52OZG2 und rhuMAb H52OZG1. rhuMAb H52OZG2 ist ein Mutant von rhuMAb H52OZG1, in dem die Cystein-Reste 215 und 228 in den Leicht- bzw. in den Schwerketten zu Serin-Resten geändert wurden. Dieser Mutant sollte das Säuredenaturierungsverhalten von nicht disulfidgebundenen Antikörpern imitieren. Nahe UV- und ferne UV-Spektren von rhuMAb H52OZG2 und rhuMAb H52OZG1 bei unterschiedlichen pH-Werten zeigen verschiedene Denaturierungs-Übergangspunkte (3A–3D). Ein, Übergangspunkt stellt eine Veränderung eines korrekt gefalteten Antikörper-Fragments zu dessen ungefaltetem Zustand dar. Nichtdisulfidassoziierte Fragmente können bei einem pH von etwa 3,2 denaturiert werden, wobei die disulfidassoziierten Fragmente pH-Werte unter 2,5 für die Denaturierung erforderten.
LPHIC-pH-Analyse. Es kann aus der Säuredenaturierungsanalyse geschlossen werden, dass bei einem pH von etwa 3,0 die nichtdisulfidassoziierten Fragmente denaturiert werden können und dann bevorzugt an eine Phenyl-Sepharose^TM-Fast-Flow-Säule gebunden werden können. Um die Wirkung von variierenden niedrigen pHs auf den LPHIC-Schritt evaluieren zu können, wurden ABX^TM-gereinigte Antikörper-Pools bei verschiedenen pH-Werten LPHIC-gereinigt. Es wurde unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC eine Analyse der gereinigten Pools durchgeführt. Es wurde ein Balkendiagramm generiert, in dem Reinheits-, Ausbeute- und Leichtketten-Prozentsätze aus den LPHIC-Reinigungen bestimmt wurden (4). Es wurde aus dem Balkendiagramm bestimmt, dass ein pH von 3,1 der beste Wert für einen Ausgleich der Reinheit und der Ausbeute zur Reinigung des rhuMAb-H52OZG1-Antikörpers ist. Es wurden Reinigungen der ABX^TM-Pools in großem Maßstab bei einem pH von 3,1 durchgeführt.
ZUSAMMENFASSUNG
LPHIC ermöglichte die Reinigung von Fab'-, L-F(ab')₂- und chemisch gebundenen F(ab')₂-Antikörper-Fragmenten von ungewünschten Antikörper-Spezies zu einem Reinheitsgrad von mehr als 98 %. Das Durchfließenlassen der Proben durch eine Phenyl-Sepharose^TM-Fast-Flow-Säule bei einem niedrigen pH entfernte Antikörper, denen Disulfidbrücken zwischen Schwer- und Leichtketten fehlten, sowie inkorrekt assoziierte Leicht- und Schwerkettenspezies. Zirkulardichroismus-Studien über disulfidgebundene und nichtdisulfidgebundene Anti-CD18-F(ab')₂-Antikörper (rhuMAb H52OZG1 und rhuMAb H52OZG2) zeigten, dass der nichtdisulfidgebundene Antikörper (rhuMAb H52OZG2) bei einem pH von 3,2 in Leicht- und Schwerkettenmoleküle denaturierte. Der disulfidgebundene Antikörper (rhuMAb H52OZG1) denaturierte bei einem pH von 2,5. Chromatographieexperimente bei unterschiedlichen pH-Werten zeigten, dass ein pH von 3,1 den besten Wert für eine Balance zwischen Reinheit und Ausbeute für die Reinigung von Anti-CDl8-rhuMAb H52OZG1 ist.
BEISPIEL 2
LINEAR-ANTIKÖRPERPRODUKTION
Dieses Beispiel beschreibt die Produktion von zweiwertigen linearen (L-)F(ab')₂-Fragmenten (umfassend Tandem-Wiederholungen eines Schwerketten-Fragments, V_H-C_H1-V_H-C_H1, mit einer Leichtkette cosekretiert), die einer LPHIC unterzogen wurden (siehe oben stehendes Beispiel 1).
MATERIALIEN UND VERFAHREN
Konstruktion von (L-)F(ab')₂-Varianten. Das Expressionsplasmid, pAK19, zur Sekretion des huMAb4D5-8-Fab'-Fragments wurde zuvor bereits beschrieben (Carter et al., Bio/Technology 10, 163–167 [1992]). Die Plasmide pLA1, pLA2 und pLA3 wurden kreiert, um die L-F(ab')₂-Varianten v1, v2 bzw. v3 zu sekretieren (5A). Das Plasmid pLA1 wurde aus pAK19 durch Modifizieren der Schwerkette konstruiert, um für die Tandem-huMAb4D5-8-Fd-Segmente, V_H-C_H1-V_H-C_H1, zu die Tandem-huMAb4D5-8-Fd-Segmente, V_H-C_H1-V_H-C_H1, zu kodieren. L-F(ab')₂-v2 und -v3 wurden aus pLA1 konstruiert, und zwar durch genaues Ersetzen der 5'- bzw. 3'-Kopien von V_H in pLA1 mit jener aus dem humanisierten Anti-CD18-Ab, huMAb-H52OZ (Eigenbrot et al., s.o.). Es wurde ein Plasmid kreiert, um L-F(ab')₂-Anti-CD18 zu sekretieren. Es wurde ein Plasmid aus Anti-CD18-Ab kreiert, huMAb-H52OZ (Eigenbrot et al., s.o.), und zwar durch Modifizieren der Schwerkette, um für die Tandem-Fd-Segmente V_H-C_H1-V_H-C_H1 zu kodieren.
E.-coli-Expression und Reinigung von L-F(ab')₂-Varianten. Die Produktion von huMAb4D5-8-Fab- und thioethergebundenen F(ab')₂-Fragmenten aus E. coli wurde zuvor von Kelley et al., Biochemistry 31, 5434–5441 (1992), und Rodriguez et al., J. Immunol. 151, 6954–6961 (1993), beschrieben. L-F(ab')₂-Varianten wurden aus dem E.-coli-Stamm 33B6 sekretiert (Rodriguez et al., Cancer Res. 55, 63–70 ([1995]), enthaltend entsprechende Expressionsplasmide, die 40 Stunden lang bei 30 °C in einem belüfteten 10-l-Fermentor gezüchtet wurden, wie zuvor beschrieben (Carter et al., s.o.). Expressionstiter wurden durch Antigen-(Ag-)Bindungs-ELISA geschätzt (Carter et al., s.o.). L-F(ab')₂-Varianten wurden aus 400 g korrespondierenden Fermentationspasten gereinigt, aufgetaut in der Gegenwart von 2 Litern 20 mM MES, 5 mM EDTA, pH 6,0 (ME-Puffer). Die resuspendierten Zellen wurden durch drei Passagen durch einen Mikroverflüssiger zerstört (Microfluidics Corporation, Newton, MA) und auf 0,25 Vol.-% Polyethylenimin angepasst. Feste Trümmer wurden mittels Zentrifugierung entfernt (7.300g, 30 min, 4 °C). Der Überstand wurde mit einer gleichgroßen Menge an destilliertem Wasser verdünnt und auf eine 20-ml-Bakerbond-ABX^TM-Säule (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) aufgegeben, die mit ME-Puffer voräquilibriert worden war. L-F(ab')₂ wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 0–50 mM NH₄SO₄ in ME-Puffer eluiert. Gepooltes L-F(ab')₂ wurde auf 25 mM Na₂HPO₄, pH 3,0, angepasst und über eine 20-ml-Phenyl-Sepharose^TM-Fast-Flow-Säule („high sub") fließen gelassen (Pharmacia, Piscataway, NJ), die mit 25 mM Na₂HPO₄, 20 mM (NH₄)₂SO₄, pH 3,0, äquilibriert worden war. Die Durchflussfraktionen, die L-F(ab')₂ enthielten, wurden gepoolt und auf einen pH von 6,0 eingestellt.
Alle Antikörper-Fragmente wurden in PBS mittels S100-HR^TM-Größenausschlusschromatographie (2,5 cm × 100 cm) (Pharmacia) pufferausgetauscht. Verbleibendes Endotoxin wurde durch wiederholte Passage durch PyroBind-ST^TM-Filter (Sepracor, Marlborough, MA) entfernt. Der Endotoxinspiegel jedes Präparats wurde durch den Limulus-Amöbocyten-Lysat-Test (Associates of Cape Cod Inc., Woods Hole, MA) geschätzt. Die gereinigten Antikörper-(Ab-)Fragmente wurden durch einen 0,2-mm-Filter passiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70 °C gelagert, bis sie benötigt wurden.
Analyse der Ab-Fragmentbindung an p185^HER2-ECD. Die Affinität und Kinetik der Bindung von huMAb4D5-8-Ab-Fragmenten an p185^HER2-ECD (Fendly et al., J. Biol. Resp. Mod. 9, 449–455 [1990]) wurde mittels Oberflächen-Plasmonresonanz unter Verwendung des BIAcore-Systems (Pharmacia) bestimmt, wie von Kelley und O'Connell in Biochemistry 32, 6828–6835 (1993), beschrieben. Die Stöchiometrie der Bindung von Ab-Fragmenten an Ag wurde in Lösung bestimmt. Kurz gesagt, wurden variierende Mengen an p185^HER2-ECD (Fendly et al., s.o.) in PBS zu einer fixen Menge des Ab-Fragments hinzugefügt (15–20 mg), und das Gemisch wurde anschließend mittels Größenausschluss-FPLC unter Verwendung einer Superose-12^TM-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit 0,1 M NaH₂HPO₄, pH 6,7, analysiert.
Zellproliferationstest. Die Wirkung von huMAb4D5-8-Ab-Fragmenten (0–30 mg/ml) auf die Proliferation der menschlichen Mamma-Adenokarzinomzelllinie, BT474, wurde, wie zuvor beschrieben, untersucht (Hudziak et al., Molec. Cell. Biol. 9, 1165–1172 [1989]).
Pharmakokinetik von Ab-Fragmenten in normalen Mäusen. Gruppen von weiblichen CD-1-Mäusen (20–32 g, n = 45) von Hanlen Sprague Dawley (Indianapolis, IN) erhielten eines der huMAb4D5-8-Ab-Fragmente (3–4 mg/ml in PBS) mittels schneller Schwanzveneninjektion (10 mg/kg). Es wurden pro Zeitpunkt drei Mäuse zu festgelegten Zeiten, die von 1 Minute zu 24 Stunden nach der Injektion reichten, getötet, und es wurden Proben ihres Serums gesammelt und gefroren gelagert. Es wurden Serumkonzentrationen eines jeden Ab-Fragments mittels Ag-Bindungs-ELISA bestimmt, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung von korrespondierenden Fragmenten als Standards (Rodriguez et al., s.o.). Nur das thioethergebundene F(ab')₂ war 24 Stunden nach der Injektion detektierbar (0,7 mg/ml).
Es wurden Daten jeder Behandlungsgruppe durch Anpassen einer biexponentiellen Funktion, C(t) = Ae^–at + Be^–bt, an die Mittelwerte der Serumkonzentrationen zu jedem Zeitpunkt analysiert. Exponentielle Komponenten wurden durch ein nicht lineares Verfahren der kleinsten Quadrate unter Verwendung des Gauss-Newton-Marquardt-Levenberg-Verfahrens (Press et al., In Numerical Recipies in C, Cambridge University Press, Cambridge, UK [1988]) und einem Abwägen von y^–2, wobei y die gemessene Serumkonzentration ist, geschätzt. Das anfängliche Volumen der Verteilung (V₁), das Volumen der Verteilung in stationärem Zustand (V_SS), die Clearance-Zeit (CL) plus anfängliche und terminale Halbwertszeiten (t_1/2) wurden danach, wie beschrieben, aus den geschätzten Parametern berechnet (Wagner, J. Pharmacokin. Biopharm. 4, 443–467 [1976]): C0 = A + B V1 = Dosis/C0 VSS = (A/a2 + B/b2)/(AUC)2 CL = Dosis/AUC Anfängliche t1/2 = In2/a Terminale t1/2 = In2/bwobei Co die extrapolierte anfängliche Konzentration ist und AUC die Fläche unter der angepassten Plasmakonzentration versus Zeitkurve ist. Die Zeit der Beständigkeit (T), die das erwartete Zeitintervall des Wirkstoffs in all seinen Passagen durch eine Abteilung (in diesem Fall Serum) ist, wurde wie folgt geschätzt (Mordenti und Rescigno, Pharm. Res. 9, 17–25 [1992]): T = AUC/C0.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION
Design von L-F(ab')₂. L-F(ab')₂-Varianten wurden kreiert, um eine schwere (H) Kette der Tandem-Fd-Fragmente, V_H-C_H1-V_H-C_H1, zu umfassen, die mit zwei Kopien der korrespondieren leichten (L) Kette assoziiert ist (5A). An der Fd-Fd-Verbindungsstelle ist der C-Terminus von C_H1 (... THT) direkt mit dem N-Terminus von V_H (EVQ ...) verbunden, ohne irgendwelche fremden Linker-Proteinsequenzen. Dies war ein Versuch, die potentiellen Risiken der Immunogenität sowie der Anfälligkeit für Serum-Proteasen in Patienten zu minimieren. Ein möglicher Nachteil dieser Strategie des Auslassens von Linkern ist, dass die Zugänglichkeit der C-terminalen Bindungsstelle an das Antigen (Ag) behindert sein könnte.
Die huMAb4D5-8-L-F(ab')₂-Variante, v1, wurde kreiert, um zwei funktionelle Bindungsstellen für das Ag, p185^HER2-ECD, zu haben (5A). Im Gegensatz dazu wurden huMAb4D5-8-L-F(ab')₂-v2 und -v3 kreiert, um eine einzelne Ag-Bindungsstelle aufzuweisen. Dies wurde durch Ersetzen von entweder 5'- oder 3'-Kopien von V_H in L-F(ab')₂-v1 mit jener aus dem Anti-CD18-Ab, huMAbH52OZ (Eigenbrot et al., s.o.), erreicht. Ein Fab, das die L-Kette aus huMAb4D5-8 und das H-Ketten-Fd-Fragment aus huMAbH52OZ umfasst, wurde exprimiert und gereinigt, und es wurde herausgefunden, dass es p185^HER2-ECD nicht wie angenommen an sich band.
Herstellung und In-vitro-Charakterisierung der Antikörper-(Ab-)Fragmente. L-F(ab')₂-Varianten wurden in E. coli mittels Cosekretion der L-Kette mit den Tandem-H-Ketten-Fd-Fragmenten aus einem dicistronischen Operon exprimiert (5B). Titer von ≥ 100 mg/l funktionellem (Ag-bindendem) huMAb4D5-8-L-F(ab')₂ wurden nach dem Züchten von E. coli, das korrespondierende Expressionsplasmide enthielt, zu hoher Zelldichte in dem Fermenter erreicht. L-F(ab')₂ wurde direkt aus E. coli gewonnen, und zwar mittels vollständiger Zerstörung der Fermentationspasten, gefolgt von ABX^TM-, Hydrophob-Chromatographie bei niedrigem pH und Größenausschlusschromatographie. Die Endotoxinkonzentration wurde auf ≤ 0,32 Endotoxineinheiten pro mg gereinigtem Protein geschätzt.
Gereinigte huMAb4D5-8-L-F(ab')₂-Varianten zusammen mit F(ab')₂ und Fab wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Unter nicht reduzierenden Bedingungen zeigen die drei huMAb4D5-8-L-F(ab')₂-Varianten (M_r ~ 96 kDa) und das Fab-Fragment (M_r ~ 48 kDa) eine Hauptbande mit der erwarteten elektrophoretischen Mobilität. Das thioethergebundene F(ab')₂-Fragment (M_r ~ 96 kDa) zeigt eine abnormal verzögerte Mobilität im Vergleich zu dem 97-kDa-Standard.
Unter reduzierenden Bedingungen kommt es bei allen huMAb4D5-8-Ab-Fragmenten zu der Entstehung einer Bande von ~ 23 kDa scheinbarem Molekulargewicht, das für die freie L-Kette erwartet wurde. Zusätzlich dazu kommt es bei L-F(ab')₂ und F(ab')₂ zu der Entstehung einer Bande von ~ 48 kDa, wie aufgrund der Gegenwart von tandem- bzw. thioethergebundenen H-Kettendimeren erwartet wurde. Die reduzierten Hund L-Ketten für das Fab-Fragment werden unter den verwendeten elektrophoretischen Bedingungen nicht aufgelöst.
Analyse der Bindung von Ab-Fragmenten an p185^HER2-ECD. Die Stöchiometrie der Ab-Ag-Wechselwirkung wurde mittels Titration von huMAb4D5-8-Ab-Fragmenten mit p185^HER2-ECD untersucht, gefolgt von Größenausschlusschromatographieanalyse (6A–6C). huMAb4D5-8-L-F(ab')₂-v1 und F(ab')₂ zeigen sehr ähnliche Titrationsprofile wie p185^HER2-ECD und binden zwei Antigen-Äquivalente (6A und 6B). Wie erwartet, bindet das Fab-Fragment ein Äquivalent von Ag (6C). L-F(ab')₂-v2 und -v3 bindet nur ein einziges Äquivalent des Ag.
Die Affinität und Kinetik der Bindung von huMAb4D5-8-Ab-Fragmenten an Ag wurde mittels Oberflächen-Plasmonresonanz unter Verwendung von immobilisierter p185^HER2-ECD untersucht. Siehe unten stehende Tabelle 1. Tabelle 1 Bindungsanalyse von Anti-p185^HER2-Ab-Fragmenten an p185^HER2-ECD^a

^aDaten, die mittels Oberflächen-Plasmonresonanz erhalten wurden.
^bSE der Schätzwerte ≤ ± 3 %.

Die zweiwertige L-F(ab')₂-Variante, v1, bindet Ag mit 3fach geringerer Affinität als dies F(ab')₂ tut. Dies reflektiert hauptsächlich einen kleinen Rückgang in der Assoziationsrate zwischen F(ab')₂ bzw. L-F(ab')₂. Die einwertigen L-F(ab')₂-Varianten v2 und v3 zeigen etwa eine 3fach und 12fach schwächere Bindung als die zweiwertige L-F(ab')₂-Variante, v1. Daher sind beide Bindungsstellen des L-F(ab')₂ für die Bindung von p185^HER2-ECD kompetent, obwohl die Wirksamkeit der Ag-Bindung offenbar für die C-terminale Stelle leicht beeinträchtigt ist. Wie erwartet, ist die Bindungsaffinität von L-F(ab')₂-v2 dem korrespondierenden Fab-Fragment sehr ähnlich.
Antiproliferative Aktivität von Ab-Fragmenten. Die antiproliferative Aktivität von huMAb4D5-8-Ab-Fragmenten wurde unter Verwendung der p185^HER2-überexprimierenden Brusttumor-Zelllinie, BT474, untersucht (siehe 7). Die Proliferation von BT474 in Gegenwart von sättigenden Mengen von L-F(ab')₂-v1 und thioethergebundenem F(ab')₂ liegt etwa bei 40 % bzw. 55 % der unbehandelten Kontrollwerte. Daher ist L-F(ab')₂-v1 bezüglich des Blockierens der Proliferation der BT474-Zellen stärker als dies beim thioethergebundenen F(ab')₂-Fragment der Fall ist. Die antiproliferativen Aktivitäten der einwertigen L-F(ab')₂-Varianten, v2 und v3, kommen nahe an jene der zweiwertigen L-F(ab')₂-Variante, v1, heran und sind um vieles größer als für das Fab-Fragment.
Pharmakokinetische Charakterisierung von Ab-Fragmenten in normalen Mäusen. Der Zeitverlauf von huMAb4D5-8-Fab-, F(ab')₂- und L-F(ab')₂-Varianten im Serum normaler Mäuse wurde aus Reihentötung mehrerer Tiere bestimmt (8) und für die Berechnung pharmakokinetischer Parameter verwendet. Siehe unten stehende Tabelle 2. Tabelle 2 Pharmakokinetische Parameter für Anti-p185^HER2-Ab-Fragmente in normalen Mäusen^a

^aPharmakokinetische Parameter wurden aus den in 3 enthaltenen Daten berechnet.
^bDie terminate Halbwertszeit trägt 83 %, 30 % bzw. 6,5 % zu dem totalen AUC für L-F(ab')₂-v1, F(ab')₂ bzw. Fab bei.

L-F(ab')₂ und thioethergebundenes F(ab')₂ sind bezüglich ihrer pharmakokinetischen Parameter sehr ähnlich, während beim Fab-Fragment die Clearance schneller erfolgt. Die Beständigkeitszeiten in Serum für L-F(ab')₂-v1 und thioethergebundene F(ab')₂-Fragmente sind 7fach bzw. 8fach größer als für das Fab-Fragment.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Reinigung eines Antikörpers, umfassend das Aufgeben eines Gemischs, das den Antikörper sowie fehlgefalteten Antikörper und/oder Antikörper mit fehlerhaften Disulfidbindungen enthält, auf eine Hydrophobchromatographie-Säule und das Eluieren des Antikörpers aus der Säule mithilfe eines Puffers mit einem pH von etwa 2,5 bis 4,5, wobei der pH des Puffers bewirkt, dass fehlgefaltete Antikörper und/oder Antikörper mit fehlerhaften Disulfidbindungen in der Säule zurückgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das auf die Säule aufgegebene Gemisch einen pH von etwa 2,5 bis 4,5 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das auf die Säule aufgegebene Gemisch eine Salzkonzentration von etwa 0 bis 0,25 M aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das auf die Säule aufgegebene Gemisch eine Salzkonzentration von etwa 0 bis 0,1 M aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Puffer eine Salzkonzentration von etwa 0 bis 0,25 M aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der Puffer eine Salzkonzentration von etwa 0 bis 0,1 M aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Antikörper chimär ist.
Verfahren nach Anspruch 7, worin der Antikörper humanisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Antikörper ein Antikörperfragment umfasst, das ein Antikörperfragment mit den richtigen Disulfidbindungen, ein F(ab')₂-Fragment, ein Fab-Fragment oder ein lineares F(ab')₂-Fragment ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Antikörperfragment HER-2 oder CD18 bindet.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin das Antikörperfragment ein F(ab')₂-Fragment umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, worin der Puffer einen pH von etwa 2,8 bis 3,5 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der Puffer einen pH von etwa 3,1 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Hydrophobchromatographie-Säule eine Phenylagarose-Säule ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin der gereinigte Antikörper die richtigen Disulfidbindungen aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin der Antikörper von einem Antikörper mit fehlerhaften Disulfidbindungen gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, worin der Antikörper mit fehlerhaften Disulfidbindungen ein Antikörperfragment ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, das weiters das Vermischen des aus der Säule gewonnenen Antikörpers mit einem physiologisch annehmbaren Träger, Arzneimittelträger oder Stabilisator umfasst.
Verfahren nach Anspruch 18, das weiters die Herstellung eines lyophilisierten Präparats des Antikörpers umfasst.